JP4206420B2

JP4206420B2 - 核タンパク質／核レセプターの相互作用のインヒビター

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Publication number: JP4206420B2
Application number: JP2007143973A
Authority: JP
Inventors: マイケルヒーリーデイヴィッド; ジョージパーカーマルコルム
Original assignee: インペリアルキャンサーリサーチテクノロジーリミテッド
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 2007-05-30
Publication date: 2009-01-14
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: PT980526E; CY1105809T1; EP0980526A1; GB9708676D0; EP0980526B1; ATE338276T1; JP2007304102A; AU7220798A; DE69835741D1; ES2271993T3; DE69835741T2; WO1998049561A1; DK0980526T3; JP2002512690A

Description

本発明は、核タンパク質および核レセプター間の相互作用の役割を担う主要な構造要素の同定を通じた該相互作用の阻害に関する。

親油性のホルモン、レチノイドおよびビタミンの核レセプター（ＮＲ）スーパーファミリーへの結合（リガンド結合レセプターを形成）は、そのＤＮＡ結合特性および転写特性を変化させ、標的遺伝子の活性化または抑制を引き起こす^1,2。リガンドの結合は、ＮＲに構造変化をもたらし、コアクチベーターとして機能するＳＲＣ−１／ｐ１６０^3,4,5、ＴＩＦ２^6,7およびＣＢＰ／ｐ３００^4,5,8,9ならびに機能が知られていないＲＩＰ−１４０¹⁰、ＴＩＦ１¹¹およびＴＲＩＰ１／ＳＵＧ１^12,13を含む核タンパク質の種々のグループとの会合を促進する。

ＮＲによる核タンパク質（コアクチベーターおよび／または他のいわゆる架橋タンパク質）のリクルートは、そのリガンド誘起性転写因子としての機能に不可欠であると思われる。３種の異なる核ホルモンレセプターのレチノイドＸレセプターα（ＲＸＲα）¹⁵、レチノイン酸レセプターγ（ＲＡＲγ）¹⁶および甲状腺ホルモンレセプターβ（ＴＲβ）¹⁷のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の構造研究によって、リガンドの結合が保存された両親媒性α−ヘリックスのヘリックス１２（Ｈ１２）の再配列を引き起こし、その際コアクチベーターの結合に必要な新規の表面を生じ、その結果としてアクチベーターファンクション２（ＡＦ２）依存性トランス作用を生ずるという提案が導かれた。そのためＡＦ２^14,18-20を低下させるＨ１２中の保存されている疎水性残基の突然変異は、ＮＲのコアクチベーター^4,6,10,11,13を結合する能力を低下させる。ＮＲとの相互作用を媒介するコアクチベーターの配列についてはほとんど知られていないが、数種のタンパク質は多数のＮＲ結合部位^5,8,21を有していると思われる。ＥＭＢＯジャーナル（EMBO Journal, 15, 6701-6715)においてレ・ドウアリン他（Le Douarin et al）（１９９６）は３種のコアクチベーター（ＴＩＦ１、ＲＩＰ１４０およびＴＲＩＰ３）中にロイシンリッチ領域を同定して"ＮＲボックス"と名付けた；第３Ｄ図参照。しかしながら、現行の知識状況ではリガンド結合核レセプターが正確にどのようにしてある種の核タンパク質と相互作用して、そのＤＮＡ結合特性および転写特性が変化し、標的遺伝子の活性化または抑制を引き起こすかは完全に解っていない。更には、この分野のコメンテーターは、本発明の当初出願日の後に、"ホルモン刺激に応じて核因子が転写装置を結合する機構を特徴付けることは長い間克服できない課題であると思われていた"と述べている（Marc Montminy in Nature, 12th June, 1997, 387, 654-655,その第１行目参照）。
EMBO Journal, 15, 6701-6715 Marc Montminy in Nature, 12th June, 1997, 387, 654-655

本発明は、核タンパク質中に存在する短い配列モチーフ（signature motif）がリガンド結合ＮＲへのその結合を媒介するために必要かつ十分であることを見出すことである。

本発明の１つの態様においては、
ａ）核タンパク質の配列モチーフである第１の領域、
ｂ）該配列モチーフに結合することによって核タンパク質と相互作用することが可能である核レセプターの部分である第２の領域
の間の相互作用を低下させることが可能なインヒビター化合物を同定するにあたり、
その際、核タンパク質は、遺伝子発現の制御に関係するリガンド結合核レセプターと転写開始複合体間の相互作用を担う架橋因子であり、
核レセプターは転写因子であり、
配列モチーフは、標的遺伝子の活性化または抑制のプロセスの一環としてリガンド結合核レセプターに結合する核タンパク質の重要な構造要素であるアミノ酸残基の短配列であり、
ｉ）候補となるインヒビター化合物、
ｉｉ）リガンド結合核レセプターまたは前記のｂ）中で定義した第２の領域を含むその断片、
ｉｉｉ）核タンパク質の配列モチーフを含む核タンパク質断片を使用し、
ｉｖ）ｉｉ）とｉｉｉ）間の相互作用の阻害の有無を検出する方法を提供している。

"核タンパク質"という用語は遺伝子発現の制御に関係するリガンド結合核レセプターと転写開始複合体間の相互作用を担う架橋因子（コアクチベーターを含む）を意味する（Beato, M., Herrlich, P.&Schutz, G.Cell 83, 851-857(1995)においてステロイドホルモンレセプターに関して概説された）。架橋因子という用語は転写開始複合体それ自体の一部を含むこともある。"核レセプター"という用語は、例えばＭａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ８３，８３５〜８３９（１９９５）に記載のような核レセプターのファミリーを意味する。"配列モチーフ"という用語は、標的遺伝子の活性化または抑制のプロセスの一環としてリガンド結合核レセプターに結合する核タンパク質の重要な構造要素である、一般に少なくとも約５アミノ酸残基、有利には４〜１０アミノ酸残基、殊には５〜１０アミノ酸残基の短配列を意味する。"リガンド結合核レセプター"という用語は、例えば結合したリガンドにより活性化した核レセプターを意味する。リガンドは、種々の形、例えばホルモン、低分子化合物またはペプチドをとることができる。例えば幾つかの核レセプター（例えばＰＲＡＲ）の場合には、非ホルモン性ペプチドリガンド、例えばロイコトリエンがある。一般に核レセプターはリガンドの結合によって活性化されるが、幾つかのレセプター、例えばオーファンレセプター（orphan receptor）はリガンドを必要とせずに活性であり、かつ／またはリガンド非依存性経路で活性化し、かつこれらのレセプターも、有利さにおいて劣っている態様として本発明の範囲内にある。

"断片"という用語は、不完全な部分を意味する。本発明以前に、核タンパク質の断片または複数の断片が活性を保持しうることは当業者には知りえなかった。全タンパク質に比べて断片を使用することは、スクリーニングのアッセイにおいて特に有利である。有利な態様においては、核タンパク質の有利な断片のサイズは、例えば図１Ａに示されるような８〜１０アミノ酸である。有利には、リガンド結合核レセプターは断片の形である。一般に断片は少なくとも８アミノ酸を有している。

有利には、配列モチーフはＢ¹ＸＸＬＬとして示され、その際Ｂ¹は任意の天然疎水性アミノ酸であり、Ｌはロイシンであり、Ｘは任意の天然アミノ酸である。配列モチーフのＸの値は独立に選択される、すなわちＸは同一または異なってもよい。有利にはＢ¹はロイシンまたはバリンであり、その際ロイシンが最も有利である。幾つかの例においては、有利な配列モチーフは、更にＢ²Ｂ¹ＸＸＬＬとして定義され、その際、"Ｂ²"はＢ¹として定義されるような疎水性アミノ酸残基である。"天然の疎水性のアミノ酸"とは、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンの任意の１つである。有利には該配列モチーフは、ヘリックス、有利には両親媒性ヘリックスの構造であり、かつロイシン残基はその疎水性表面を形成する。有利には配列モチーフは、分子内にその表面でタンパク質と相互作用するために有効なように位置する。有利にはＸは、ＣｙｓまたはＰｒｏを含まない。有利には、Ｘの少なくとも１つは天然疎水性アミノ酸またはプロリンではない。有利にはＸの１つは、独立してＡｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＡｌａから選択され、より有利にはＸの１つは、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓから選択される。理論的考慮に制限されることなく、有利なＸは両親媒性ヘリックスを形成する配列モチーフに有利であると考えられている。

本発明の当初出願日の後に、２グループ（その内１グループは本発明の発明者である）によってＬＸＸＬＬモチーフの同定が同時に公表された（Heery et al, Nature, 12th June 1997, 387,733-736&Torchia et al, Nature, 12th June 1997, 387,677-684）。

本明細書においては、核タンパク質（ＳＲＣ１）の核レセプター（リガンド結合ＥＲ）を結合する能力およびその転写活性を高める能力が配列モチーフ（ＬＸＸＬＬ：ＳＥＱＩＤＮＯ：１）の核タンパク質中の完全性、ならびにそのリガンド誘起性アクチベーションファンクション（ＡＦ−２）¹⁴のために必要なＮＲの保存されたヘリックス（ヘリックス１２）中の重要な疎水性残基に依存していることを示している。また、配列モチーフは、ＴＩＦ１、ＴＩＦ２、ｐ３００、ＲＩＰ１４０およびＴＲＩＰタンパク質中に見出され、ＮＲと相互作用するのに十分であると知られているこれらのタンパク質の領域中に存在する。このように、ＬＸＸＬＬモチーフ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）は、種々のタンパク質と核レセプターとの相互作用を容易にする配列であり、従って核タンパク質の新規ファミリーの重要部分である。

有利な核タンパク質はコアクチベーターであり、特に核タンパク質は、ＲＩＰ１４０、ＳＲＣ−１、ＴＩＦ２、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＩＦ１、Ｔｒｉｐ１、Ｔｒｉｐ２、Ｔｒｉｐ３、Ｔｒｉｐ４、Ｔｒｉｐ５、Ｔｒｉｐ８またはＴｒｉｐ９を含む。更に有利な核タンパク質は、ｐ／ＣＩＰ、ＡＲＡ７０およびＴｒｉｐ２３０を含む。

本明細書においては、核タンパク質または核レセプターとは、特に記載がない限りそのイソ型を含み、その他の場合には分脈から明らかである。イソ型とは、一つの遺伝子から得られる関連タンパク質のファミリーまたは集合の１つである。従ってイソ型は、例えば転写後のエキソンの特異スプライシング（defferrntial splicing）によってそのアミノ酸配列が僅かに異なることがある。ＳＲＣ１ａは、ＳＲＣ１のイソ型の例である。２種のＳＲＣのイソ型、すなわちＳＲＣ１ａおよびＳＲＣ１ｅは、数個の配列モチーフに差異を有し、かつＥＲに媒介される転写において異なる役割をはたすと思われるので、機能的に異なる（Kalkhoven et al, 1998, EMBO Journal, 17, 232-243）。

核レセプターは転写因子である。有利な転写因子は、少なくとも１部分の保存された両親媒性α−ヘリックスを有し、その際、特に有利にはレチノイン酸レセプターまたはステロイドホルモンレセプターである。有利なステロイドホルモンレセプターは、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、アンドロゲンレセプターおよびグルココルチコイドレセプターであり、その際エストロゲンレセプターが殊に有利である。

有利には、前記の第２の領域は、少なくとも１部分の保存された両親媒性α−ヘリックス、例えばエストロゲンレセプター中のヘリックス１２を有し、これは殊に有利である。

核レセプターと核タンパク質の殊に有利な組合せは、核レセプターがエストロゲンレセプターであり、核タンパク質がＳＲＣ１、ＴＩＦ２、ＣＢＰおよびｐ３００から選択されるものであり、その際ＳＲＣ１、特にＳＲＣ１ａが最も有利である。

有利な方法は２−ハイブリッドアッセイ系の形である。かかるアッセイ系はこの分野においてよく知られており、適当な参考文献は、Ｆｉｅｌｄｓ＆Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ（１９９４）ＴＩＧ，Ａｕｇｕｓｔ１９９４，１０，２８６〜２９２および米国特許第５２８３１７２３号明細書である。

任意の適当なアッセイ方法、例えば放射性同位体アッセイ、シンチレーション近接アッセイ（scintillation proximity assay）（ND Cook, 1996, Drug Discovery Today, 1, 287-294によって概説された）または蛍光アッセイ、特に時間分解蛍光アッセイ（time resolved fluorescence assay）（MV Rogers, 1997, Drug Discovery Today, 2, 156-160によって概説された）を使用してもよい。高処理量（high-throughput）のスクリーニング技術は、ＨｏｕｓｔｏｎおよびＢａｎｋｓによってＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９９７，８，７３４〜７４０で概説されている。

本発明の有利な態様においては、候補となるインヒビターは、配列モチーフに基づくペプチドライブラリーの形である。

コードされるペプチドライブラリーは一般に任意の１つの部位で最大２０種の可能なアミノ酸を有する。実際には、現行の技術を使用して、１０⁷〜１０⁸より多い要素のライブラリーをスクリーニングすることは困難であり、これはペプチド中で６カ所より多い部位を無作為化することが困難であることを意味する。従って、核タンパク質結合領域をシグナルモチーフに短縮することは、ペプチドライブラリーによるアプローチを使用すべき場合には非常に有利である。

ペプチドライブラリーは種々の配列のペプチドの集合である。一般に、ペプチドライブラリーを作成する方法は２通りある（Scott, 1992;Birnbaum and Mosbach, 1992;Houghten, 1993によって概説された;Abelson, 1996も参照のこと）。第１のアプローチは、陽性のペプチドをそのペプチド自体の配列決定によって同定してライブラリーを作成することである。ペプチドの混合物は、ペプチドをビーズに結合させる方法で各ビーズが唯一のペプチドを有するように合成してもよい。陽性のペプチドを有するビーズを同定する際に、ビーズを回収し、ペプチドを化学的配列決定によって同定してよい。まず、このアプローチは混合物から特異的な６アミノ酸ペプチドを同定する抗体の能力を使用して証明された（Lam et al, 1991）。ビーズを使用する重要性は、同定イベント（この場合には抗体：ペプチドの相互作用）により、抗体自体が結合するペプチドより大量のペプチドを含有するビーズの回収が導かれることである。関連のアプローチにおいては、遊離ペプチドの混合物をプール中で合成およびスクリーニングでき、デコンボリューション法（deconvolution process）を使用することによって陽性のペプチドが同定される（Houghten et al, 1991）。

第２のアプローチは、陽性のペプチドを幾つかの点で該ペプチドと関連している分子の配列決定によって同定してライブラリーを作成することである。ペプチドおよび幾つかの他の分子、例えば核酸はビーズ上で同時に合成でき、それぞれの核酸は同じビーズ上に見られるペプチドの標識となる。陽性のビーズを同定する場合に、核酸の配列決定によって該ビーズ上のペプチドが同定される（Brenner and Lerner, 1992）。選択的に、ペプチドライブラリーは、生存生物の遺伝子発現機構を使用して作成することができる。このアプローチでは、ペプチド分子のライブラリーを作成する必要はない。代わりに各分子が異なる配列を有するペプチドをコードするようにＤＮＡ分子のライブラリーを作成する。次いでこのコードされたライブラリーを、ペプチドライブラリーの作成のために適当な宿主生物中で発現させねばならない。次いでライブラリーをスクリーニングする。ライブラリーをコードする核酸が幾つかの様式でタンパク質に物理的に結合していることは不可欠であり、結果として活性ペプチドの回収または同定により、これらのペプチドをコードするＤＮＡの回収がもたらされる。活性ペプチドの配列は、それらをコードするＤＮＡの配列決定によって予想することができる。このアプローチの幾つかの変法は記載されている。

このアプローチにおいて大抵広範に使用される変法は、ウイルス、例えばＭ１３のコートタンパク質の一部としてペプチドを発現させることである。該ウイルスは、このコートタンパク質が標的タンパク質（例えば抗体（Devlin et al, 1990;Scott and Smith, 1990;Cwirla et al, 1990））またはレセプター（心房性ナトリウム排泄増加ペプチドレセプター：Cunningham et al(1994)およびトロンボポイエチンレセプター（Cwirla et al, 1997））を結合する能力によってスクリーニングできる。また、該アプローチは、プロテアーゼインヒビターをそのプロテアーゼへの結合能力によって見出すために（Roberts et al;1992;Markland et al, 1996）、ならびにプロテアーゼのために最適な基質、例えばストロメリシンおよびマトリリシン（Smith et al, 1995）およびサブチリシン（Matthews and Wells, 1993）を見出すために使用してもよい。

一定のタンパク質を認識するペプチドの作成のための細胞内アプローチは、酵母の２−ハイブリッド系の使用である。２−ハイブリッド系において、相互作用するタンパク質は、転写因子のドメインに融合する。タンパク質：タンパク質の相互作用が起こると、リポーター遺伝子の転写が誘導される（Fields and Song, 1989）。２−ハイブリッド系の１種の構成要素であるペプチドライブラリーの作成およびリポーター遺伝子の産物が存在する細胞の選択によって、標的タンパク質に結合するペプチドを単離することが可能であり、このアプローチは網膜芽細胞腫タンパク質に結合するペプチドを同定するために使用される（Yang et al, 1995）。同様のアプローチにおいて、Ｃｏｌａ他（１９９６）は、ペプチドライブラリーをＥ．ｃｏｌｉのＴｒｘＡタンパク質の表面にループとして発現させ、かつサイクリン依存性キナーゼ２（Ｃｄｋ２）に結合するペプチドを単離した。

本発明の別の態様においては、
ａ）核タンパク質上の配列モチーフである第１の領域および
ｂ）配列モチーフへの結合を通じて核タンパク質と相互作用することが可能な核レセプターの一部分である第２の領域
の間の相互作用を低下させるにあたり、核レセプターおよび核タンパク質の存在下にインヒビターを添加し、その際インヒビターが、核タンパク質の第１の領域と核レセプターの第２の領域間の相互作用を低下させることを特徴とする方法を提供することである。

本発明の別の態様においては、前記の新規インヒビターを提供することである。有利には、インヒビターはペプチドであり、より有利には前記の配列モチーフを有するペプチドであり、かつより有利には１５個未満のアミノ酸残基を有するペプチドである。殊に有利には以下のペプチドの任意の１種である：ＰＱＡＱＱＫＳＬＬＱＱＬＬＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、ＫＬＶＱＬＬＴＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＩＬＨＲＬＬＱＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）またはＬＬＱＱＬＬＴＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）。ペプチドは慣用の技術を使用して、例えば固相合成およびＦｍｏｃ化学を使用して製造できる。これらのペプチドはエストロゲン感受性腫瘍（oestrogen responsive tumor）の治療に有用であると期待されている。本発明のインヒビターは、核タンパク質および核レセプター上の配列モチーフの相互作用によって媒介される任意の疾患の治療に有用であると期待されている。例えば、適当なインヒビターは癌または炎症の治療に有用であると期待されている。

新規のインヒビターは、例えば配列モチーフに対する抗体または通常の生物学的活性を妨げるような配列モチーフまたはその相補的結合標的（核レセプターの第２の領域）に結合する新規の小さい分子であってよい。小さい分子の例は、小さいペプチドまたはペプチド状分子を含むがそれに制限されるものではない。

本明細書中では配列モチーフは、ある種の核タンパク質全体に該当すると実証されるが、但し異なる核レセプターはコアクチベーターと配列モチーフの両者に選択性を示し、これらはホルモン応答の特異性をもたらし（Ding et al, 1998, Molecular Endocrinology, 12, 302-313）、また選択的な製薬的介入の機会を示している。以下の図１Ａおよび図５は、個々のモチーフの核レセプターへの結合強度が異なることを示している。

レ・ドウアリン他のＮＲボックスの論文（前述した）は、本発明の目的の範囲内で配列モチーフを開示していない。それというのも、例えばレ・ドウアリンの目的の範囲内のＮＲは、本発明により同定された図３Ａおよび図４（以下参照）中の３９個の配列モチーフの多くて僅か４個に存在するだけである。更に、レ・ドウアリン他は、核レセプター−核タンパク質の相互作用の阻害を示唆していない。

抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および、例えばＦ（ａｂ′）₂、Ｆａｂおよび単鎖Ｆｖを構成する種々の型の抗体であることを意味する。抗体は、約１０⁷Ｍ⁻¹より大きいかまたは等しいＫ_aで結合するのであれば特異的結合であると定義する。結合の親和性は慣用の技術、例えばスカッチャード他（Scatchard et al., Ann.N.Y.Acad.Sci., 51:660(1949)）によって記載される方法を使用して測定できる。

ポリクローナル抗体は、種々の動物、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットからこの分野においてよく知られている方法を使用して容易に製造することができる。一般に、イムノゲンを典型的に非経口の注入によってホスト動物に適用する。イムノゲン性をアジュバント、例えばフロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバントを使用して高めることができる。追加抗原刺激免疫化の後に、血清の少量の試料を回収し、反応性を試験する。かかる測定に有用な種々のアッセイの例は、ラボマニュアル：抗体（Antibodies:A Laboratory Manual, Harlow and Lane(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988）に記載されるアッセイならびに方法、例えば交差免疫電気泳動法（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ法、放射免疫沈殿法、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ法およびサンドイッチアッセイ法である（米国特許第４，３７６，１１０号明細書および米国特許第４，４８６，５３０号明細書参照）。

モノクローナル抗体は、公知法を使用して容易に製造することができる（例えば米国特許第４，９０２，６１４号明細書、同第４，５４３，４３９号明細書および同第４，４１１，９９３号明細書；Monoclonal Antibodies, Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol(eds.), (1980)に記載される方法を参照のこと）。

モノクローナル抗体は、選択的な技術、例えば本明細書中で参考文献に記載されているＡｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ他の"モノクローナル抗体発現ライブラリー：ハイブリドーマの迅速な代替物"（Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries:A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9(1990)に記載の技術を使用して製造することができる。同様に、結合パートナーを組み換えＤＮＡ技術を使用して構成し、特異的に結合する抗体をコードする遺伝子の種々の領域を導入することができる。かかる技術はラリック他のバイオテクノロジー（Larrick et al., Biotechnology, 7:394(1989)）に記載されている。

本発明の更なる特徴によれば、本発明の新規のインヒビターまたはその製薬学的に認容性の塩を製薬学的に認容性の希釈剤またはキャリヤーと一緒に含有する医薬品組成物を提供する。

該組成物は、経口的使用に適当な形状、例えば錠剤、カプセル剤、水溶液もしくは油溶液または懸濁液もしくはエマルジョン；局所的使用に関しては、例えばクリーム、軟膏、ゲルまたは水溶液もしくは油溶液または懸濁液；経鼻的使用に関しては、吸い込み剤、点鼻スプレーまたは点鼻流；経膣的または経直腸的使用に関しては、坐剤；吸入による適用のためには、例えば微粉末、例えば乾燥粉末、微結晶形または液状のエアロゾル；舌下またはバッカル的使用に関しては、例えば錠剤またはカプセル剤；非経口使用に関しては（静脈内、皮下、筋肉内、血管内または注入を含む）、無菌の水溶液もしくは油溶液または懸濁液の形であってよい。一般に、前記の組成物を、慣用の方法で慣用の賦形剤を使用して製造することができる。ペプチド性のインヒビターに関しては非経口的組成物が有利である。

一回の用量形を製造するために１種以上の賦形剤と組み合わせる有効成分の量は、治療されるホストおよび特定の適用経路に依存して必然的に変化する。例えばヒトへの経口投与を意図する製剤は、一般に例えば有効成分０．５ｍｇ〜２ｇと配合して適当かつ有利な量の賦形剤を組成物の全質量に対して約５〜９８質量％で変化させて含有している。用量単位形は一般に有効成分を約１ｍｇ〜約５００ｍｇ含有する。

本発明の他の態様によれば、核タンパク質の核レセプター相互作用ドメインをマッピングするにあたり、相互作用ドメインまたは候補となる相互作用ドメインを同定するために本明細書中で定義されるような配列モチーフの存在に関して核タンパク質の配列を分析することを特徴とする方法を提供している。有利には更に分析はα−らせん性および／または表面接触性（surface accessibility）に関してそこで定義される任意の候補となる相互作用ドメインの分析を含んでいる。

本発明を詳細に説明するが、以下の実施例によって制限されるものではない。特に記載がなければ、温度は摂氏温度で表現し、ペプチド配列はＮ末端からＣ末端方向に示す。

図１ａ／１ｂはコアクチベーターから得られたＬＸＸＬＬモチーフとＥＲとの相互作用を示す。

図１ａ：ＲＩＰ１４０、ＳＲＣ１ａおよびＣＢＰタンパク質から得られたＬＸＸＬＬモチーフと野生型もしくは変異型のＥＲのＬＢＤとの酵母２−ハイブリッド相互作用。ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合タンパク質中のＬＸＸＬＬモチーフの配列を示した。ＤＢＤ−ＬＸＸＬＬタンパク質を、それぞれが野生型のＥＲもしくは転写的に欠失したＥＲ変異型のＬＢＤに融合した酸性活性化ドメイン（ＡＡＤ）からなるＡＡＤ−ＥＲまたはＡＡＤ−ＥＲ変異型と一緒に発現させた。リポーター活性を１０⁻⁷Ｍの１７−β−エストラジオール（Ｅ２）の存在または不在下に測定し、β−ガラクトシダーゼ活性の単位として示した。図１ａ中の上から下までの配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：６〜２３としてリストにしてある。

図１ｂ：アミノ酸９３５〜９４３に位置するＲＩＰ１４０のＬＸＸＬＬモチーフの突然変異によるＡＤＤ−ＥＲの結合の影響。保存されているロイシン残基を四角で囲い、変異残基は円で囲った。リポーター活性を１０⁻⁷ＭのＥ２の存在（黒線）または不在（白線）下に測定した。図１ｂ中の上から下までの配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：２４〜３２としてリストにしてある。

図２ａ／２ｂ／２ｃは、ＬＸＸＬＬモチーフが試験管内でのＳＲＣ１とＥＲのＬＢＤとの結合および生体内でのＳＲＣ１のＥＲ活性を高める能力のために必要であると示している。

図２ａ：野生型ＳＲＣ１タンパク質（ＳＲＣ１ａ）および変異型ＳＲＣ１タンパク質（ＳＲＣ１ａ−Ｍ１２３４）を図解した。黒線は直線ＳＲＣ１ａ配列中のＬＸＸＬＬ結合モチーフのおおよその位置を示し、かつ陰付の円は保存されているロイシン残基からアラニンへの置換によるＬＸＸＬＬ結合モチーフの変異を示している（方法参照）。１０⁻⁶ＭのＥ２の存在（＋）または不在（−）下での野生型ＳＲＣ１ａまたは変異型ＳＲＣ１ａ−Ｍ１２３４とグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）単独との結合、ＳＲＣ１ａまたはＳＲＣ１ａ−Ｍ１２３４とＥＲのリガンド結合ドメイン（アミノ酸３１３〜５９９）との結合（ＧＳＴ−ＡＦ２）、ＳＲＣ１ａまたはＳＲＣ１ａ−Ｍ１２３４とＣＢＰのＳＲＣ１結合ドメイン（アミノ酸２０５８〜２１６３）との結合（ＧＳＴ−ＣＢＰ）。［³⁵Ｓ］−標識した野生型および変異型ＳＲＣ１タンパク質の投入量の１０％によって得られたシグナルを示した。

図２ｂ：ペプチドＰ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）およびＰ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）の量を増加させた場合のリガンドの存在下における野生型のＳＲＣ１ａとＧＳＴ−ＡＦ２との結合に対して競合する能力を示している。Ｐ−１およびＰ−２ペプチドの配列は図２ｂの下部に示し、保存されているロイシンとアラニン置換を四角で囲った。

図２ｃ：変異型のＳＲＣ１ｅＭ１２３でない野生型は一過性に感染させたＨｅｌａ細胞中のリポーター遺伝子２ＥＲＥ−ｐＳ２−ＣＡＴのＥＲによる活性化を増強する。リポーター活性を、リガンド（１０⁻⁸ＭのＥ２）の不在（白の棒）または存在（黒の棒）下に生育した感染細胞の抽出物から得た。感染で使用したＥＲ、ＳＲＣ野生型およびＳＲＣ変異型の発現プラスミドの量をグラフの下部に示した。示されている活性は２つの値の平均である。

図３ａ／３ｂおよび図４は、ＬＸＸＬＬ配列がＮＲのＬＢＤを結合するタンパク質中の配列モチーフであることを示している。

図３ａ：列記したＬＸＸＬＬモチーフ配列はヒトのＲＩＰ１４０¹⁰、ヒトのＳＲＣ１ａ、マウスのＴＩＦ２⁶、マウスのＣＢＰ^23,24、ｐ３００³³、マウスのＴＩＦ１¹¹およびヒトのＴＲＩＰタンパク質¹²中に存在する。保存されているロイシンは四角で囲い、それぞれのモチーフに関してアミノ酸番号をつけた。図３Ａに記載した上から下までの配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：３３〜６１としてリストにしてある。

図３ｂ：ＮＲを結合するタンパク質の配列中のＬＸＸＬＬモチーフ（黒い棒）の存在頻度の図解。公知のＮＲ結合部位のアミノ酸の範囲も示した。

図４：列記したＬＸＸＬＬモチーフの配列はＣＢＰ、Ｐ３００、ｐ／ＣＩＰ、ＡＲＡ７０およびＴＲＩＰ２３０中に存在する。保存されているロイシンは四角で囲い、アミノ酸番号を各モチーフに関して示した。図４に記載した上から下までの配列はそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：６２〜７１としてリストにしてある。

図５は、適切な形態のＬＸＸＬＬ配列モチーフがＳＲＣ−１ａとＥＲα、ＥＲβおよびＧＲのＬＢＤとの相互作用の強度に影響することを示す。

図５ａ：ＥＲαのＬＢＤはＳＲＣ−１ａの４個の配列モチーフに結合し、その際、酵母２−ハイブリッドアッセイにおいて異なる親和性を有した（ＳＲＣ−１ａモチーフ１〜４＝ＳＥＱＩＤＮＯ：７３〜７６）。順序（親和性の高い順）は、ＳＲＣ−１ａモチーフ２＞ＳＲＣ−１ａモチーフ４＞ＳＲＣ−１ａモチーフ１＞ＳＲＣ−１ａモチーフ３である。

図５ｂ：ＥＲβのＬＢＤはＳＲＣ−１ａの配列モチーフに結合し、その際、ＥＲαと同様の相対親和性を有する。順序（親和性の高い順）は、ＳＲＣ−１ａモチーフ２＞ＳＲＣ−１ａモチーフ４＞ＳＲＣ−１ａモチーフ１＞ＳＲＣ−１ａモチーフ３である。

図５ｃ：ＧＲのＬＢＤはＳＲＣ−１の配列モチーフに異なる親和性で結合し、親和性の順位はＥＲαおよびＥＲβの場合と異なる。順序（親和性の高い順）は、ＳＲＣ−１ａモチーフ４＞ＳＲＣ−１ａモチーフ１＝ＳＲＣ−１ａモチーフ２＝ＳＲＣ−１ａモチーフ３である。

図５においては、ｙ軸単位は相対的なβ−グルコシダーゼ活性を示している。図５においてｘ軸のモチーフ番号は、実際に使用した配列の一部分だけを示しており、配列は以下のものである：６２７〜６４０、６８４〜６９６、７４３〜７５５および１４２８〜１４４１。

以下の略語を使用した。

標準的なアミノ酸の略語を使用している。
アラニンＡｌａＡ
アルギニンＡｒｇＲ
アスパラギンＡｓｎＮ
アスパラギン酸ＡｓｐＤ
システインＣｙｓＣ
グルタミン酸ＧｌｕＥ
グルタミンＧｌｎＱ
グリシンＧｌｙＧ
ヒスチジンＨｉｓＨ
イソロイシンＩｌｅＩ
ロイシンＬｅｕＬ
リジンＬｙｓＫ
メチオニンＭｅｔＭ
フェニルアラニンＰｈｅＦ
プロリンＰｒｏＰ
セリンＳｅｒＳ
トレオニンＴｈｒＴ
トリプトファンＴｒｐＷ
チロシンＴｙｒＹ
バリンＶａｌＶ
任意のアミノ酸ＸａａＸ
点突然変異を以下のように示す：天然アミノ酸（１単語の用語を使用する）、位置、新しいアミノ酸。例えば"Ｌ６３６Ａ"は、位置６３６番目のロイシン（Ｌ）がアラニン（Ａ）に変わったことを示す。多数の突然変異は、大括弧間に示す。

例１
核レセプターと核タンパク質間の相互作用部位のマッピング
１４０ｋＤａのレセプター相互作用タンパク質（ＲＩＰ１４０）が直接、該タンパク質のＮ−末端およびＣ−末端に位置する少なくとも２個の特異的部位によってＮＲに結合することは以前に立証されている²¹。これらの相互作用部位をより詳細にマッピングするために、２ハイブリッド系でのＮＲとの相互作用のためにフレーム内で異種のＤＢＤと融合された一連の２０種の異なるＲＩＰ１４０コーディング配列のＰＣＲ合成断片を試験した。異なる構成がＲＩＰ１４０配列の１１５８アミノ酸全体に及ぶが、２個を除く全てはＥＲとのリガンド依存性相互作用を示し、その際、重複していない５種のＲＩＰ１４０配列を含む。最短の相互作用断片の比較によって、全ての相互作用断片に共通の短いモチーフ（ＬＸＸＬＬ）を同定した。合計でＲＩＰ１４０配列中に該モチーフが９種類同定されたが、該モチーフは本明細書の試験において結合活性を有さない断片には存在しない。

これらの短い断片がＮＲに結合するのに十分であるかどうかを決定するために、９種のそれぞれのＬＸＸＬＬモチーフの１種類を導入している８〜１０個のアミノ酸に融合させたＤＢＤからなる一連のタンパク質を構成した。図１ａに示されるように、ＲＩＰ１４０中に存在する９種のそれぞれのモチーフは、ＥＲのＬＢＤと強いリガンド依存性相互作用を示すが、ＤＢＤ単独では結合能力を示さない（ＲＩＰ１４０に関して列記した１０個のモチーフの結合能力を示す、１０番目は９番目の繰り返しである）。ＲＡＲのＬＢＤを使用して比較可能な結果が得られた（データは示していない）。Ｈ１２中の疎水性残基の突然変異はＡＦ２活性を無くし、ＲＩＰ１４０¹⁰、ＴＩＦ１¹¹、ＴＩＦ２⁶、ＳＵＧ１¹³およびＳＲＣ１のリクルートを妨げる。同様にＥＲ中のＨ１２のＭ５４３およびＬ５４４残基の突然変異は、全ての９種のＬＸＸＬＬモチーフとＥＲとのリガンド依存性相互作用を無くした（図１ａ）。これらの結果を共に考慮して、８個程度のアミノ酸からなる短い保存されたモチーフが転写活性ＮＲに結合するために十分であると結論づけている。このような比較的小さなモチーフが２個の比較的大きな分子間の相互作用に影響を与えうるということを見出したことはこの分野においては前例がない。

Ｐｈｄプログラム²²を使用する第２構造分析によって、ＲＩＰ１４０中の該モチーフの９種それぞれが通常α−ヘリックスであると予想される領域内に存在することが判明し、その際保存されているロイシンが疎水性表面を形成する。

例２
配列モチーフの突然変異による分析
機能的相互作用を観察するために必要な配列の制約を決定するために、１種のＲＩＰ１４０モチーフ（アミノ酸９３５〜９４５；図１ｂ）の部分突然変異による分析を実施した。ウエスタンブロット分析は野生型および変異型の融合タンパク質（データは示してない）の発現において大きな変化を示さないが、バリン９３５からアラニンへの突然変異は、リガンドの存在下でリポーター活性の約１０倍の低下を惹起し、その際、ＲＩＰ１４０中の９種のＬＸＸＬＬモチーフの７種において第１のアミノ酸が疎水性であるとの観察と組み合わせて、この部位においては疎水性残基が有利であると示される。顕著には、３個の保存されているロイシン残基Ｌ９３６、Ｌ９３９またはＬ９４０の任意の１個のアラニンへの突然変異は、ＥＲのＬＢＤへの結合（図１ｂ）およびＲＡＲ（データ示さず）のＬＢＤへの結合の完全な低下を引き起こし、その際、ＮＲとの相互作用を媒介するために重要であると強調される。反対に、Ｌ９４１（このモチーフ間で保存されていない；図３ａ参照）のアラニンへの突然変異は、この配列のＥＲのＬＢＤに結合する能力に影響を与えない。保存されているロイシン残基とバリンとの置換はＬ９３６では許容されるが、Ｌ９３９またはＬ９４０では許容されず、その際、疎水的性質だけではＥＲとの相互作用を維持するのに十分でないと示している（図１ｂ）。アミノ酸Ｋ９３７、Ｑ９３８、Ｓ９４２およびＥ９４３においては、これらが同定したモチーフ中に保存されないような突然変異誘発は実施されない（図３ａ参照）。

例３
核タンパク質中の配列モチーフの分析
リガンド依存性転写活性を誘導するステロイドレセプターのコアクチベーターＳＲＣ１は、元来１９６アミノ酸のＣ−末端³によってプロゲステロンレセプターと相互作用することができるタンパク質をコードする部分ｃＤＮＡとして同定された。８種のほとんどのＣ−末端アミノ酸はＬＸＸＬＬコンセンサスを有し、まさにこの配列（ＤＢＤ−ＳＲＣ１ａ１４３４〜１４４１）がＥＲへの強いリガンド誘起性結合を示すが、ＥＲのＨ１２変異型（図１ａ）に対しては示さないと記載した。その後の研究によって、マウスからの全長ＳＲＣ１（ＳＲＣ１ａ）（１４５９アミノ酸）^4,5およびヒト組織からのＳＰＣ１（１４４１アミノ酸）が同定されている。マウスおよびヒトのＳＲＣ１ａタンパク質の両者は多数のＮＲと相互作用し、残基５６９〜７８９⁵および５７０〜７８０間にそれぞれ付加的な相互作用領域を有している。３種のＬＸＸＬＬモチーフがヒトＳＲＣ１ａの中心相互作用ドメイン中で同定され（図３ａおよび図３ｂ参照）、これらそれぞれは２−ハイブリッドアッセイにおいてＥＲ（図１ａ）およびＲＡＲ（データ示さず）の両者にリガンド依存性結合を示すが、ＥＲのＨ１２変異型にはリガンド依存性結合を示さない。興味のあることに、ＳＲＣ１ａの中心ドメイン中の３個のモチーフの配列および相対位置は関連のコアクチベータータンパク質である転写介在因子２（Transcripional Intermediary Factor 2）（ＴＩＦ２）（図３ａ＋ｂ）に保存されており、ＮＲ6に結合すると知られているＴＩＦの領域に一致する。しかしながら、ＳＲＣ１ａと異なって、ＴＩＦ２はそのＣ−末端において欠失がある。更に、ＳＲＣ１はＬＸＸＬＬコンセンサスに相応する３個の他の配列を有すると記載した。残基４５〜５３におけるモチーフはＰｈｄプログラムによってα−ヘリックスであると予想され、かつこれらはＳＲＣ１ａ⁵における基本的なヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン内に存在するが、これらは酵母２−ハイブリッドアッセイにおいてはリガンド結合ＥＲ（図１ａ）またはＲＡＲ（示さず）と非常に弱い相互作用（６倍）を示すだけである。これはＳＲＣ１のＮ−末端に関連する強いＮＲ−活性の不在が観察されることに一致する。残基１１１〜１１８および９１２〜９２０の両者中の他の２種のモチーフはプロリン残基を有し、Ｐｈｄプログラムによってα−ヘリックス構造が認められそうもない。確かに、これらの配列は本発明の結合アッセイ（図１ａ）においてはＮＲとの検出可能な相互作用は示さず、このことはＬＸＸＬＬ配列のＮＲに対する結合のために適当な第２構造に関する選択を示唆している。

最近の報告では、元来ＣＲＥＢ^23,24に関するコアクチベーターとして同定されたＣＢＰ／ｐ３００タンパク質は、ＮＲ^4,5,8,9を含む多数の転写因子に関するコアクチベーターであり、これらは幾つかのシグナル伝達経路のインテグレーターとしてはたらくこともある⁴。ＣＢＰはそのＮ−末端の１０１個のアミノ酸⁴を介して直接ＮＲに特異的に結合することを示し、その際残基３５６〜４９５⁸間にＲＸＲ特異的結合部位を有する。我々の分析は、ＣＢＰ配列がｐ３００配列（アミノ酸８０〜９０および３４１〜３５１：図３ａ）中に保存されている位置６８〜７８および３５６〜３６４内の複数種のＬＸＸＬＬモチーフが存在する。確かに、２−ハイブリッド系で試験する際に、ＣＢＰのＮ−末端（アミノ酸１〜１０１；データを示した）およびＣＰＢ配列の残基６８〜７５のＬＸＸＬＬモチーフ（図１ａ）はＥＲにリガンド依存性結合を示すが、転写的に不完全なＥＲ変異型にはリガンド依存性結合を示さない（図１ａ）。

例４
ＮＲへのコアクチベータータンパク質の結合は配列モチーフに依存する。

ＮＲへのコアクチベータータンパク質の結合がＬＸＸＬＬモチーフに依存することを証明するために、ＳＲＣ１ａにおいて残基［Ｌ６３６Ａ、Ｌ６３７Ａ、Ｌ６９３Ａ、Ｌ６９４Ａ、Ｌ７５２Ａ、Ｌ７５３Ａ、Ｌ１４３８Ａ、Ｌ１４３９Ａ］の保存されているロイシン対でアラニン置換基を導入し、このように効果的に、４つの機能的結合モチーフが全て無効である変異型タンパク質（ＳＲＣ１ａ−Ｍ１２３４）を作成した。次いで、試験管内で翻訳したＳＲＣ１ａおよびＳＲＣ１ａ−Ｍ１２３４のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合したマウスのエストロゲンレセプター（ＧＳＴ−ＡＦ２）のリガンド結合ドメインに結合する能力をＧＳＴプルダウン試験（GST pulldown experiment）において比較した（Maniatis et al., (1982)Molecular Cloning.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York.)。図２ａに示されるように、野生型ＳＲＣ１ａタンパク質はＧＳＴ−ＡＦ２にリガンド依存性結合を示すが、ＳＲＣ１ａ−Ｍ１２３４はリガンドの存在または不在においてもＧＳＴ−ＡＦ２に結合できない。突然変異がＳＲＣ１ａ−Ｍ１２３４の大部分の構造的崩壊を誘導しないことを確認するために、試験管内で翻訳したタンパク質が、ＳＲＣ１結合ドメイン⁴として前記に定義したＣＢＰのアミノ酸２０５８〜２１６３と相互作用する能力を比較した。両方のタンパク質は、ＧＳＴ−ＣＢＰ（図２ａ）への強い結合を維持しており、その際ＳＲＣ１のファンクションは野生型および変異型タンパク質の両者においてインタクトであることを示している。更に、野生型ＳＲＣ１ａとＧＳＴ−ＡＦ２との結合がＳＲＣ１ａ（図２ｂ）のＣ−末端のモチーフに相応の短いペプチド（Ｐ１）の濃度増加によって競合することを示している。反対に、ＬＸＸＬＬモチーフが突然変異した類似のペプチド（Ｐ２）またはＬＸＸＬＬモチーフに関連していないペプチド（図示せず）は、ＳＲＣ１ａとＧＳＴ−ＡＦ２との結合を競合しなかった（図２ｂ）。

最終的に、ＬＸＸＬＬモチーフが生体内でのＳＲＣ１のファンクションのために必要であることを証明するために、野生型ＳＲＣ１および変異型タンパク質の能力を比較し、その際全てのＬＸＸＬＬモチーフは一過性トランスフェクション実験においてマウスのＥＲの活性を高めることは不可能であった。図２ｃに示されるように、野生型ＳＲＣ１は濃度に依存してＥＲの活性を高めた。反対に、ＥＲに結合できないＳＲＣ変異型（図２ａ）は誘起作用を有さないが、最も高い濃度の５０％以下でＥＲ活性が低下した。変異型ＳＲＣ１の前記の明らかな顕著なネガティブな特性は恐らくＮＲと相互作用せずにＣＢＰとの相互作用を維持する能力のためである（図２ａ）。この結果は、ＮＲとＣＢＰ間の相互作用がＳＲＣ１ａ変異型タンパク質とＮＲとの結合不可能性を補うのに不十分であると我々のデータが示唆するように、ＳＲＣ１とＣＢＰ／ｐ３００とが生体内では複合体として存在し⁹、少なくともこれらの条件下ではＣＢＰもＮＲ結合活性^4,8を有しているという新しい事実を立証するために興味のあることである。ＮＲが独立または複合体として機能してｐ１６０およびｐ３００タンパク質を同時に結合するかどうかを測定すべきである。

ＮＲに結合することが知られている他のタンパク質の配列の調査により、１種以上のＬＸＸＬＬモチーフを有する配列が示された。ＴＩＦ１は、ＮＲ^11,25との相互作用のために必要であると知られている最少限の領域内に１つのモチーフ（残基７２２〜７３２）を有している。ＴＲ相互作用タンパク質¹²に関しての２−ハイブリッドスクリーニングで単離した欠けたタンパク質ＴＲＩＰ２〜５、ＴＲＩＰ８およびＴＲＩＰ９は、それぞれＬＸＸＬＬモチーフを少なくとも１種有しているが（図３ａ）、該モチーフはＴＲとの相互作用がリガンド依存性であるＴＲＩＰには存在しない。これらの配列のセレクションを図３ａに列記し、一方図３ｂはＲＩＰ１４０、ＳＲＣ１ａ、ＴＩＦ１、ＴＩＦ２、ＣＢＰおよびｐ３００の配列中の該モチーフの出現率およびこれらのタンパク質中の公知のレセプター相互作用ドメインの範囲を示している。興味のあることに、モチーフは他の幾つかのタンパク質においても同定され、そのためＡｒａ７０²⁶、ＳＷ１３²⁷およびＮＦκ−ＢのＲｅｌＡ（ｐ６５）サブユニットを含むＮＲ²⁸との相互作用の事実が存在するが、これらのタンパク質中のレセプター相互作用ドメインはマッピングされていない。ＬＸＸＬＬモチーフを有する他のタンパク質とＮＲとの結合能力は非細胞性の局在（subcellular localisation）ならびに該モチーフのα−ヘリックス性および表面接触性に依存している。保存されているロイシン残基はモチーフの機能のために必須であることが明らかであると同時に、他のアミノ酸もＳＲＣ１／ＴＩＦ２またはＣＢＰ／ｐ３００における同等のモチーフの配列の保存度を与えるために重要である。

多数のＮＲ結合タンパク質が多種のＬＸＸＬＬモチーフを有するので、このことがＮＲのホモダイマーおよびヘテロダイマーの個々のパートナーの同時の接触を容易にするか、または異なるレスポンスエレメントとのＮＲの結合によってもたらされる立体構造変化に対応する選択的な相互作用表面を提供するのに役立つかが立証すべきことである。コアクチベーター、例えばＳＲＣ１およびＣＢＰ中のＬＸＸＬＬモチーフの系統的な突然変異は、異なるシグナル変換経路間のクロストーク（crosstalk）または相乗作用を分断することを可能にし、これによりコアクチベーターおよびインテグレーターとしてのその指定された役割の良好な理解を提供する。

例５
２−ハイブリッド相互作用アッセイ
全ての２−ハイブリッドアッセイのために使用される酵母リポーター株は、３種のエストロゲンレスポンスエレメント（ＥＲＥ）²⁹によって作動するｌａｃＺリポーター遺伝子を有するプラスミドｐＲＬΔ２１−Ｕ３ＥＲＥを有するＷ３０３−１Ｂ（ＨＭＬαＭＡＴα
ＨＭＲａｈｉｓ３−１１、１５ｔｒｐ１−１ａｄｅ２−１ｃａｎ１−１００ｌｅｕ２−３、１１、ｕｒａ３）である。ヒトのＥＲのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびＶＰ１６酸性活性化ドメイン（ＡＡＤ）をそれぞれ発現³⁰するプラスミドｐＢＬ１およびｐＡＳＶ３を、２−ハイブリッド相互作用分析のためにＤＢＤまたはＡＡＤ融合タンパク質を産生させるために使用した。ＤＢＤ−ＬＸＸＬＬモチーフ融合タンパク質を、ｐＢＬ１ベクター中へのアニーリングしたリン酸化オリゴヌクレオチドのライゲーションによって産出した。ＡＡＤ−ＥＲをヒトのＥＲのアミノ酸２８２〜５９５をコードするＰＣＲフラグメントをｐＡＳＶ３にクローニングすることによって構築した。ＡＡＤ−ＥＲ変異型は通常の方法で、但しアミノ酸Ｍ５４３およびＬ５４４またはＥＲを組み換えＰＣＲ（recombinant PCR）によってアラニンに変異させて構築した。全ての融合構成物を完全に配列決定した。所望のプラスミドを有している組換体を適当なプラスミドマーカーに関する選択によって得、１０⁻⁷Ｍの１７−β−エストラジオール（Ｅ２）の存在または不在において選択培地（１％グルコースならびに適当なサプリメントを含有するイースト窒素ベース）１５ｍｌ中で後期の対数期まで生育した。

イースト細胞不含の抽出物中でのＤＢＤ−およびＡＡＤ−融合タンパク質の発現を、ヒトＥＲを認識するモノクローナル抗体（P.Chambon,Strasbourgから寄贈）を使用する免疫検出法によって検査した。該抗体はヒトＥＲ中のＬＤＢの"Ｆ"領域およびＤＢＤ融合タンパク質³⁰のＮ−末端での"Ｆ"領域タグも認識する。等量のタンパク質をポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースにトランスファーしてウエスタンブロッティングをした。ガラスビーズ法による細胞不含抽出物の製造および該抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定を以前に記載されているように実施した²⁹。２−ハイブリッド試験を数回繰り返し、１ａおよび１ｂ図に示したデータは一回の代表的な実験において測定されたリポーター活性を示す。β−ガラクトシダーゼ活性はナノモル／分／μｇタンパク質として表した。

例６
試験管内の結合およびペプチド阻害アッセイ
ＧＳＴ−ＡＦ２はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合したマウスのＥＲ（アミノ酸３１３〜５９９）のリガンド結合ドメインからなり、以前から記載されている³¹。ＧＳＴ−ＣＢＰは、ＣＢＰのＳＲＣ１結合ドメインと融合したＧＳＴからなり、マウスのＣＢＰの残基２０５８〜２１６３をコードするＰＣＲ断片をベクターｐＧＥＸ２ＴＫ（ファルマシア）にクローニングすることによって構築した。ヒトのＳＲＣ１ａおよびＳＲＣ１ｅのｃＤＮＡをヒトのＢ細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離し、発現ベクターｐＳＧ５の改変型にクローニングした。ＳＲＣ１ａＭ１２３４およびＳＲＣ１ｅＭ１２３を組み換えＰＣＲによって構築し、突然変異［Ｌ６３６Ａ、Ｌ６３７Ａ、Ｌ６９３Ａ、Ｌ６９４Ａ、Ｌ７５２Ａ、Ｌ７５３Ａ、Ｌ１４３８Ａ、Ｌ１４３９Ａ］または［Ｌ６３６Ａ、Ｌ６３７Ａ、Ｌ６９３Ａ、Ｌ６９４Ａ、Ｌ７５２Ａ、Ｌ７５３Ａ］をそれぞれ導入した。全てのＳＲＣ１構成物を完全に配列決定した。ＧＳＴ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^TMビーズに細菌細胞不含の抽出物から調製したＧＳＴ単独またはＧＳＴ融合タンパク質を負荷させた。［³⁵Ｓ］標識したＳＲＣ１タンパク質を生体内翻訳によって産生し、以前に記載されているように１０⁻⁶Ｍのエストラジオール（Ｅ２）の存在または不在下にＧＳＴタンパク質との相互作用に関して試験した。結合は３時間、４℃で緩慢に撹拌しながらプロテアーゼインヒビターを含有するＮＥＴＮ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、２０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０）中で最終容量１ｍｌで実施した。ペプチドＰ−１およびＰ−２を水中に濃度４ｍｇ／ｍｌで溶解させ、かつＧＳＴ結合反応に添加してから直ちにリガンドを添加した。競合試験で添加したペプチドの増加量は２．５、５、１２．５および２５μＭに一致する。

類似の方法論を使用して、ペプチドＫＬＶＱＬＬＴＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＩＬＨＲＬＬＱＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）およびＬＬＱＱＬＬＴＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）がインヒビターであると示すことができる。

例７
一過性リポーターアッセイ
Ｈｅｌａ細胞を、リポーター２ＥＲＥ−ｐＳ２−ＣＡＴ³²１μｇ、β−ガラクトシダーゼ発現プラスミド（内部コントロール）１５０ｎｇ、ＥＲ発現プラスミド１０ｎｇならびにＳＲＣ１発現プラスミドまたは空のベクター５０ｎｇもしくは２００ｎｇを全く同様に２４ウェルプレートの１ウェルあたりに使用して形質移入させた。形質移入した細胞をフェノールレッド不含でありかつ１０％の活性炭処理したＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地中で一晩インキュベートし、新しい培地で洗浄してからリガンド（１０⁻⁸Ｍ^E2）またはビヒクル（vehicle）を添加した。４０時間後に細胞を回収し、抽出物をＣＡＴおよびβ−ガラクトシダーゼ活性に関して分析した14,21。β−ガラクトシダーゼ活性を形質移入効率の差異に関する調整に使用した。

例８
医薬品組成物
以下にペプチドインヒビターを含有する代表的な医薬品剤形を示す、かつこれらは治療のために使用することができる。

注射可能の溶液
ペプチドＰ−１５．０ｍｇ
酢酸ナトリウム三水和物６．８ｍｇ
塩化ナトリウム７．２ｍｇ
Ｔｗｅｅｎ２００．０５ｍｇ
を溶液１ｍｌあたりに含有する注射用の無菌水溶液。

成人のためのペプチドの典型的用量は３０ｍｇである。

例９
コアクチベーターの配列モチーフとＮＲとの相互作用の強度は正確なモチーフ配列に依存して変化する。

ＥＲαのＬＢＤと他のＬＸＸＬＬモチーフ融合タンパク質の範囲との間の相互作用により、異なるリポーター遺伝子活性が得られることは明らかであり、その際、ＥＲαのＬＢＤは異なる親和性を有するＬＸＸＬＬモチーフと相互作用し（例５参照）、従ってこれらの相互作用の強度はより詳細に調査される。ＳＲＣ−１ａのモチーフをそのグルココルチコイドレセプターおよびエストロゲンレセプターのイソ型αおよびβとの相対的な相互作用の特異性に関して酵母２−ハイブリッドアッセイにおいて試験した。

ＳＲＣ−１ａモチーフ１〜４（ＳＥＱＩＤＮＯ：７３〜７６）をＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質として発現させた。モチーフの融合タンパク質をＬｅｘＡのＤＢＤベクターＹＣｐ１４−ＡＤＨ−ＬｅｘＡを作動させるＡＤＨプロモーター中に、アニーリングしたオリゴヌクレオチドペアのフレーム内でのライゲーションによって産生した。ＹＣｐ１４ＡＤＨ１−ＬｅｘＡはプラスミドであり、これからＬｅｘＡをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ１プロモーターのコントロール下に発現させた。このベクターの基はプラスミドＲＳ３１４（Sikorski and Hieter, 1989）である。このベクターのポリリンカー中のＳａｃＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位の間に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ１遺伝子のプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのＬｅｘＡ遺伝子のコーディング領域ならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ１遺伝子の転写終結領域を有する発現カセットを付帯させた。ＡＤＨ１のプロモーター領域はプラスミドｐＡＤＮＳ（Colicelli et al, 1989）からの１．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片からなる。ＨｉｎｄＩＩＩ部位の後にＥ．ｃｏｌｉのＬｅｘＡのコーディング領域（アミノ酸１〜２０２）がある（Horii et al, 1981;Miki et al, 1981;Markham et al,1981）。Ｅ．ｃｏｌｉのＬｅｘＡ断片はプラスミドｐＢＸＬ１（Martin et al, 1990）からＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片として得られる。この配列はＧｅｎｂａｎｋのエントリーｇ１４６６０７のヌクレオチド９５−７１０に一致する。以下の配列はポリリンカーをコードする領域である（ＳＥＱＩＤＮＯ：７７）。
ＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＧＡＣＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣ
このポリリンカーはＬｅｘＡのカルボキシ末端にアミノ酸ＥＦＬＱＰＧＶＤＴＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８０）を付加する。このリンカーの末端にあるＮｏｔＩ部位はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ１遺伝子の転写終結因子領域を含むＤＮＡ断片に結合する。この断片はプラスミドｐＡＤＮＳ（Colicelli et al, 1989）からの０．６ｋｂのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩである。

ＮＲのＬＢＤをＧａｌ４の転写的ＡＤとの融合として発現する。ＬＢＤ融合はＬＢＤと相応のアミノ酸をコードするＰＣＲ断片をＹＣｐ１５Ｇａｌ１−１１にクローニングすることによって構築した。ＹＣｐ１５Ｇａｌ１−ｒ１１はプラスミドであり、これからＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧａｌ４タンパク質の活性化領域の融合はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１プロモーターのコントロール下に発現することができる。このベクターの基はプラスミドＲＳ３１５（Sikorski and Hieter, 1989）である。このベクターのポリリンカー中のＳａｃＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位間に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１遺伝子のプロモーター、融合タンパク質のコーディング領域ならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ１遺伝子の転写終結部位を有する発現カセットを付帯させた。ＧＡＬ１プロモーター（Johnson and Davis, 1984;Yocum et al, 1984;West et al, 1984）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノム断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅によって得られた。この断片はＧｅｎｂａｎｋデータベースのエントリーｇ１７１５４６のヌクレオチド１７７〜８０９に相当する。これに引き続き配列
ＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＧＴＡＡＡＧＴＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７８）がある。

この配列は翻訳開始コドンおよびアミノ酸ＭＶＰＫＫＫＲＫＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８１）をコードする配列を提供する。このペプチドの最後の７残基は、ＳＶ４０Ｔ抗原中の核局在シグナル（nuclear localisation signal）として同定される領域（Ｇｅｎｂａｎｋのエントリーｇ３１０６７８のアミノ酸１２６−１３２；Fiers et al, 1978;Reddy et al, 1978）に相当する。この領域は、ＭａおよびＰｔａｓｈｎｅ（１９８７）によって記載されるようなＧａｌ４の領域ＩＩ転写活性化ドメイン（region II transcription activation domain）（アミノ酸７６８〜８８１）をコードする配列に結合している。該配列は、酵母の発現ベクターｐＭＡ２３６（Ma and Ptashne, 1987）の哺乳類用であるプラスミドｐＢＸＧａｌＩＩ（P.Broad unpublished）からＰＣＲによって単離し、これはＧｅｎｂａｎｋのエントリーｇ１７１５５７のヌクレオチド２７４４〜３０８５に相当する（Laughon and Gesteland（1984））。この配列に引き続きポリリンカー
ＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７９）がある。

全ての融合構成物を完全に配列決定した。ベクターＹＣｐ１４−ＡＤＨ−ｌｅｘＡおよびＹＣｐ１５Ｇａｌ１−ｒ１１は酵母（ＡＲＳ−ＣＥＮ）中で単一コピーのプラスミドとして複製し、それぞれＴＲＰ１およびＬＥＵマーカーを有する。

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＥＹ１３２（M.Egerton, Zeneca Pharmaceuticals, unpublished, genotype(Mata leu2-3, 112 ura3-52 trp1 his4 rme1）をホストの株として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子からなる、ｌｅｘＡタンパク質の結合部位を２個有するプロモーターのコントロール下のリポーター遺伝子をこの株のｕｒａ３座で組み込んだ。リポーター遺伝子プラスミドＪＰ１５９−ｌｅｘＲＥを基にしたプラスミドＪＰ１５９を使用して構築した（J.Pearlberg, Ph.D.Thesis(1994)Harvard University）。これはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３をマーカーとして有するシャトルベクターである。該プラスミドは、ＴＡＴＡボックスならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬプロモーターからの転写開始部位を有する最少限のプロモーターのコントロール下のＥ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有している（Dixon et al 1997）。このプロモーターの上流はＧＡＬ１１遺伝子からのターミネーターである。このプラスミド中のＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位の間で、３５ヌクレオチド配列がコリシンＥ１遺伝子のプロモーター中のＬｅｘＡタンパク質のための天然に存在する結合部位に相当する（（Ebina et al, 1983）該配列はＧｅｎｂａｎｋのエントリーｇ１４４３４５の残基２０〜５４に相当する）。この配列は２つのＬｅｘＡオペレーターを有しており、従って２ｌｅｘと呼称する。このリポータープラスミドをＵＲＡ３遺伝子内で直鎖状にし、ＭＥＹ１３２のｕｒａ３座中に組み込み、酵母株ＭＥＹ１３２−ｌｅｘＲＥを得た。

２−ハイブリッド融合構成物を有する形質転換体を２０ｍｌの選択培地（２％グルコースおよび適当なサプリメント）中で後期の対数期まで生育した。次いでこれらをリガンドの存在または不在下に２％のガラクトース含有培地に希釈した。コントロールとして、各ＬＢＤ融合をコアクチベーターのモチーフを欠失しているＬｅｘＡのＤＢＤと一緒に発現させ、同様に各モチーフＬｅｘＡＤＢＤ融合をＮＲのＬＢＤを欠失しているＧａｌ４ＡＤと一緒に発現させた。ＤＢＤ融合タンパク質の相対的な発現レベルをＬｅｘＡを認識するモノクローナル抗体を使用して免疫検出法によって測定した。

ＳＲＣ−１ａの４個のモチーフに関するエストロゲンレセプターイソ型αおよびβの相対的な相互作用の特異性は以下のように順位付けされる：２＞４＞１＞３（図５参照）。グルココルチコイドレセプター特異性は以下の通りである：４＞１＝２＝３。

本願の実施例において使用される酵母２−ハイブリッド系は単一コピーの組み込まれたリポーター遺伝子構成物を使用する。これは異なるＳＲＣ１ａモチーフを有する異なる酵母株間での量的な比較を可能にする。図５に示されるデータは、モチーフ３（ＳＲＣ１ａ、７４８〜７５３）がこの系を使用してＥＲと非常に弱く相互作用することを示唆している。しかしながら、エストラジオールへのより長期の暴露（示していない）により著しい相互作用が表される。本明細書中の図１Ａはモチーフ３とＥＲとの相互作用を明白に示しているが、この相互作用は他のモチーフに見られる相互作用よりも極めて弱いことを示している。この点に関する図５および１Ａ間のいずれの差異も実験方法の特徴によって説明できる。例えば図５のデータを得るために使用されるベクターは低コピー数ベクター（セントロメア含有）であるが、一方図１Ａのデータを得るために使用されるベクターは多コピーベクター（２ミクロン）である。

参考文献

配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：インペリアルキャンサーリサーチテクノロジーリミテッド
（Ｂ）町：サルディニアハウス、サルディニアストリート
（Ｃ）市：ロンドン
（Ｄ）州：イギリス
（Ｅ）国：英国
（Ｆ）郵便コード：ＷＣ２Ａ３ＮＬ
（Ｇ）電話：０１７１２４２１１３６
（Ｈ）テレファックス：０１７１８３１４９９１
（ｉｉ）発明の名称：核タンパク質／核レセプターの相互作用のインヒビター
（ｉｉｉ）配列の数：７９
（ｉｖ）コンピューター読み取り可能形：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃１．０、バージョン＃１．３０（ＥＰＯ）
（ｖｉ）優先権データ
（Ａ）出願番号：ＧＢ９７０８６７６．３
（Ｂ）優先日：１９９７年４月３０日
（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１４：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１５：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１７：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１８：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１９：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２０：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２１：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２２：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２３：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２４：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２５：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２６：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２７：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２８：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２９：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３０：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３１：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３２：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３３：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３４：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３５：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３６：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３７：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３８：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３９：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４０：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４１：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４２：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４３：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４４：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４５：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４６：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４７：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４８：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４９：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５０：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５１：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５２：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５３：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５４：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５５：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５６：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５７：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５８：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５９：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６０：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６１：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６２：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６３：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６４：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６５：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６６：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６７：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６８：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６９：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７０：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７１：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７２に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７２：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７３に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７３：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７４に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７４：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７５に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７５：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７６に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７６：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７７に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：他の核酸
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７７：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７８に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：他の核酸
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７８：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７９に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：他の核酸
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７９：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：８０に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８０：

（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：８１に関する情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８１：

図１Ａは、ＲＩＰ１４０、ＳＲＣ１ａおよびＣＢＰタンパク質から得られたＬＸＸＬＬモチーフと野生型もしくは変異型のＥＲのＬＢＤとの酵母２−ハイブリッド相互作用を図解した図１Ｂは、アミノ酸９３５〜９４３に位置するＲＩＰ１４０のＬＸＸＬＬモチーフの突然変異によるＡＤＤ−ＥＲの結合の影響を図解した図２Ａは、野生型ＳＲＣ１タンパク質（ＳＲＣ１ａ）および変異型ＳＲＣ１タンパク質（ＳＲＣ１ａ−Ｍ１２３４）を図解した図２Ｂは、ペプチドＰ−１（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）およびＰ−２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）の量を増加させた場合のリガンドの存在下における野生型のＳＲＣ１ａとＧＳＴ−ＡＦ２との結合に対して競合する能力を図解した図２Ｃは、変異型のＳＲＣ１ｅＭ１２３でない野生型は一過性に感染させたＨｅｌａ細胞中のリポーター遺伝子２ＥＲＥ−ｐＳ２−ＣＡＴのＥＲによる活性化を増強することを図解した図３Ａは、列記したＬＸＸＬＬモチーフ配列がヒトのＲＩＰ１４０、ヒトのＳＲＣ１ａ、マウスのＴＩＦ２、マウスのＣＢＰ、ｐ３００、マウスのＴＩＦ１およびヒトのＴＲＩＰタンパク質中に存在することを図解した図３Ｂは、ＮＲを結合するタンパク質の配列中のＬＸＸＬＬモチーフ（黒い棒）の存在頻度を図解した図４は、列記したＬＸＸＬＬモチーフの配列がＣＢＰ、Ｐ３００、ｐ／ＣＩＰ、ＡＲＡ７０およびＴＲＩＰ２３０中に存在することを図解した図５は、適切な形態のＬＸＸＬＬ配列モチーフがＳＲＣ−１ａとＥＲα、ＥＲβおよびＧＲのＬＢＤとの相互作用の強度に影響することを図解した

Claims

ａ）核タンパク質の配列モチーフである第１の領域および
ｂ）前記の配列モチーフに結合することにより核タンパク質との相互作用を可能にする核レセプターの一部である第２の領域間の相互作用を低下させることを可能にするインヒビター化合物を同定する方法において、
核タンパク質は遺伝子発現の制御に関係するリガンド結合核レセプターおよび転写開始複合体間の相互作用の役割を担う架橋因子であり、
核レセプターは転写因子であり、
配列モチーフは標的遺伝子の活性化または抑制のプロセスの一部としてリガンド結合核レセプターに結合する核タンパク質の重要な構造要素である短いアミノ酸配列であり、かつ配列モチーフはＢ ¹ ＸＸＬＬ（式中Ｂ ¹ は任意の天然疎水性アミノ酸であり、Ｌはロイシンであり、かつＸは独立に任意の天然アミノ酸である）であり、その際
ｉ）候補となるインヒビター化合物、
ｉｉ）リガンド結合核レセプターまたはこの請求項中の前記のｂ）で定義した第２の領域を有するその断片、
ｉｉｉ）核タンパク質の配列モチーフを有する断片を使用し、かつ
ｉｖ）ｉｉ）およびｉｉｉ）間の相互作用の阻害の存在または不在を検出することを特徴とする、インヒビター化合物の同定方法。
Ｂ¹ はロイシンまたはバリンである請求項１記載の方法。
Ｂ¹はロイシンである請求項２記載の方法。
配列モチーフが更にＢ²Ｂ¹ＸＸＬＬ（式中、Ｂ²は疎水性アミノ酸である）である請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
Ｂ²はイソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択される請求項４記載の方法。
核タンパク質はコアクチベーターである請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
コアクチベーターはＲＩＰ１４０、ＳＲＣ−１、ＴＩＦ２、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＩＦ１、Ｔｒｉｐ１、Ｔｒｉｐ２、Ｔｒｉｐ３、Ｔｒｉｐ４、Ｔｒｉｐ５、Ｔｒｉｐ８、Ｔｒｉｐ９、ｐ／ＣＩＰ、ＡＲＡ７０およびＴｒｉｐ２３０からなる群から選択される請求項６記載の方法。
転写因子はステロイドホルモンレセプターである請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
ステロイドホルモンレセプターはエストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、アンドロゲンレセプターおよびグルココルチコイドレセプターからなる群から選択される請求項８記載の方法。
ステロイドホルモンレセプターはエストロゲンレセプターである請求項９記載の方法。
方法は２−ハイブリッドアッセイ系の形である請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
候補となるインヒビターは請求項１から５までのいずれか１項記載の配列モチーフに基づくペプチドライブラリーの形である請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。