JP2002510051A - リガンド依存性核内受容体とコアクチベーターの相互作用を検出するための組成物および方法 - Google Patents

リガンド依存性核内受容体とコアクチベーターの相互作用を検出するための組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、核内受容体の相互作用を調べるためのツーハイブリッドシステムに基づく方法を提供する。本発明は更に、このアッセイに使用するための組成物、並びに核内受容体およびそのコアクチベータまたはリプレッサタンパク質のリガンドを同定する方法に向けられている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、分子遺伝学および薬理学の分野に関する。本発明は、化合物、巨大
分子種、または刺激性エフェクターの、前以て決定された核内受容体および／ま
たはその補助タンパク質（群）のコンフォメーション変化を引き起こす、典型的
には核内受容体のリガンド誘導活性化に作用または拮抗する能力について決定す
るための方法および組成物を提供する。本発明の一つの側面は、一以上の前以て
決定された核内受容体種について、薬理学的アゴニストまたはアンタゴニストで
ある物質を同定する手段を提供できる。本発明の一つの側面は、一以上の核内受
容体種と複数のコアクチベーターおよび／またはコリプレッサー種との間、また
は類似の界面間の相互作用に影響を及ぼす各化合物の能力に関して、一連の化合
物を順位付ける方法に関し；順位付けは、薬理学的に活性なアゴニスト、アンタ
ゴニスト、部分的アゴニスト、増強剤等の同定のためのデータベースを提供する
。
【０００２】
【発明の背景】
様々な核内受容体が動物細胞には存在し、一般に、一以上のサブセットの調節
遺伝子に対して転写調節を行う。核内受容体は、一以上の疎水性リガンド種と高
親和性の結合性相互作用を示すことが最も多い。これらのリガンド結合性相互作
用は、核内受容体のコンフォメーション変化を引き起こし得る。リガンド結合に
より誘導されたコンフォメーション変化は、核内受容体がある特異的な受容体結
合性ＤＮＡ配列と相互作用する能力、および／または他の核タンパク質（例えば
、転写因子、コアクチベーター、コリプレッサー）と相互作用する能力を修飾し
、遺伝子の転写に影響を及ぼすように位置する特異的受容体結合性ＤＮＡ配列（
群）を有する遺伝子の転写を調節する。ステロイド受容体作用の１つのモデルに
おいて、リガンド結合ドメインにおけるリガンド誘導性のコンフォメーション変
化は、ステロイド受容体タンパク質の別の構造ドメインにおけるＤＮＡ結合活性
をマスキング解除する。リガンド誘導性コンフォメーション変化がない場合、リ
ガンド結合ドメインは、連結した構造ドメインのＤＮＡ結合活性を抑圧する。近
年、「コアクチベーター」および「コリプレッサー」と呼ばれる、タンパク質の
一以上のスーパーファミリーが、それぞれ核内受容体とリガンド依存的に相互作
用し、転写活性化を行う（コアクチベーター）か、または核内受容体により転写
調節されている遺伝子の転写を阻止または不活性化させる（コリプレッサー）こ
とが示された。
【０００３】 核内ホルモン受容体は、４０以上の転写因子のスーパーファミリーを含む。そ
の約半分は、ステロイドおよびビタミンなどの親油性リガンドの古典的受容体で
ある。核内ホルモン受容体遺伝子スーパーファミリーは、標的遺伝子の転写を調
節する構造的に関連したタンパク質をコードする。これらの巨大分子は、ステロ
イドおよび甲状腺ホルモン、ビタミン、レチノイド、脂肪酸の受容体、およびリ
ガンドが発見されていない他の核内受容体タンパク質受容体、いわゆる「オーフ
ァン受容体」を含む。これらの受容体は、容易に同定できる構造特徴および配列
モチーフをもつモジュラードメインを有する。ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」
）は、受容体の、モノマー、ホモダイマー、またはヘテロダイマーなどの特異的
ＤＮＡ配列への結合を指示する。リガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）は、同族
ホルモンの結合に応答し；このドメインおよびアミノ末端ドメインは、他の転写
因子、およびコアクチベーターおよび／またはコリプレッサーと相互作用する。
核内受容体特異的作用は、リガンド、受容体、および非受容体因子の利用能；標
的部位の構造；一般的な転写因子などの他のタンパク質、および非常に重要なこ
とにコアクチベーターおよび／またはコリプレッサータンパク質との相互作用を
含む、多様な要素の組合せに由来する。
【０００４】 リガンド活性化転写因子のステロイド／甲状腺ホルモン受容体スーパーファミ
リーは、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンＤの受容体だ
けでなく、その機能および／またはリガンドが分からない、従ってオーファン受
容体と呼ばれる多くのタンパク質をも包含する。このファミリーの転写因子は、
リガンド並びにシグナル伝達経路からのシグナルを組込み、受け取った複雑なシ
グナルに独特なｍＲＮＡおよびタンパク質発現の変化を生じる。これらの核内受
容体は、多種多様な生理学的応答の制御、並びに細胞分化、新形成、細胞代謝の
制御、および神経機能を含むホメオスタシス状態に関与している。ステロイドホ
ルモン受容体スーパーファミリーの概説については、Ｒｉｂｉｅｒｏ ＲＣ（１
９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４６：４４３−４５３を参照されたい。
【０００５】 核内受容体と相互作用し、これらの核内受容体により媒介される生物学的効果
を調節するリガンドの同定にかなりの関心が集まった。かかるリガンドは、受容
体の天然の生理学的リガンドに対してアゴニスト作用であろうとアンタゴニスト
作用であろうと、核内受容体媒介転写制御の生理学的効果およびそれにより生じ
る付随する生理学的効果の制御のための候補医薬として役立つ。残念なことに、
可能性あるリガンドを同定するための最も慣用的なアッセイは、精製核内受容体
種へのその結合定数（例えばスキャッチャード解析による）について試験する、
放射標識化合物のライブラリーの使用に依拠する。かかる放射標識化合物ライブ
ラリーを得て、次いで、結合アッセイを使用してライブラリーをスクリーニング
するのは困難で労力がかかる。さらに、化合物の結合定数は、必ずしもリガンド
としてのその生物活性を予測するものではないことが判明した。リガンド機能の
より良好な代替物として、核内受容体のリガンド誘導転写活性化をアッセイする
ために、核内受容体応答エレメントおよびプロモーターに機能的に連結させたリ
ポーター配列の転写により検出する転写アッセイが開発された。
【０００６】 残念なことに、リガンド活性化された核内受容体により産生される多くの転写
応答は僅かであり、豊富に転写されない遺伝子発現のモニタリングには比較的感
度の低い慣用的な転写アッセイ法では、検出および／または定量がしばしば困難
である。さらに、多くの慣用的な転写アッセイ法は、実施が困難で且つアッセイ
する細胞の溶解が必要などの問題のある工程を包含する。高い特異性、感度、お
よび選択性をもって、前以て決定された核内受容体のリガンドを検出する方法を
有することが望ましい。特に、正当なシグナルをわかりにくくし得る読み出しバ
ックグラウンド雑音を減少させる方法は、核内受容体リガンドである新規医薬の
同定において、並びに、核内受容体（例えばＴＣＤＤ）を活性化する環境汚染物
質であるリガンドを検出および定量するための感度の高いアッセイの提供におい
て、当該分野で非常に有用である。
【０００７】 さらに、多くの核内受容体リガンド、特にステロイドおよびステロイド様化合
物が、しばしば、核内受容体を通して、多面発現性の生物学的効果を示す。例え
ば、エストラジオールおよびタモキシフェンは両方共エストロゲン受容体に結合
するが、各化合物は、関与する組織および細胞型に応じて、異なる生物学的効果
および転写プロフィル（すなわち、リガンドの存在により転写調節される遺伝子
のセット）を生じることができる。
【０００８】 従って、核内受容体機能を調節する物質を効率的に同定する方法が当分野で必
要である。かかる方法が、真正な核内受容体アゴニストおよび／またはアンタゴ
ニストの同定に必要なレベルの感度および特異性を有することは重要である。本
発明は、当分野におけるこれらおよび他の必要性を充足する。
【０００９】 本明細書で議論した参考文献は、本出願の提出日前の開示についてのみ提供さ
れる。これらは、発明者がかかる先行発明の開示に対して先行性がないことを是
認したものと解釈されるべきでない。
【００１０】
【発明の概要】
上記に従い、本発明の１つの側面においては、前以て決定した核内受容体のリ
ガンド誘導活性化のアゴニストまたはアンタゴニストである物質を同定する方法
が提供される。様々なフォーマットの本発明が存在し、複数のフォーマットを、
順次または平行して多重化し得、被検薬剤の識別プロフィルを作成し、よって、
被検薬剤の薬理学的性質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニ
スト、混合アゴニスト／アンタゴニスト等）に分類し、核内受容体リガンドの多
面発現性の生物学的効果を分析し、個々の効果を化学構造と関連づけることがで
きる。
【００１１】 （正ハイブリッド系：コアクチベーター） 本発明の方法は、（１）前以て決定された転写因子の転写活性化ドメイン（「
ＡＤ」）または別にＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）に（一般的に、ＡＤおよ
びＤＢＤは便宜のために「ＴＲＸ」と呼ぶ）、典型的にはポリペプチド連鎖で共
有結合した前以て決定された核内受容体のリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）
を含む、リガンドで活性化可能な融合タンパク質（本明細書では「ＬＢＤ−ＴＲ
Ｘ」と呼ぶ）をコードおよび発現するＬＢＤ−ＴＲＸポリヌクレオチド配列、（
２）前以て決定された転写因子の転写活性化ドメインまたは別にＤＮＡ結合ドメ
イン（まとめて「ＴＲＸ」）に、典型的にはポリペプチド連鎖で連結した前以て
決定された核内受容体の該ＬＢＤに結合できる核内受容体コアクチベータータン
パク質（「ＣＡ」）のドメインを含む、コアクチベーター融合タンパク質（本明
細書では「ＣＡ−ＴＲＸ」と呼ぶ）をコードおよび発現するＣＡ−ＴＲＸポリヌ
クレオチド配列、および（３）直鎖状の順序で、前以て決定された該転写因子に
応答性の転写調節配列、並びにシグナルまたは検出可能な表現型を付与する配列
をコードするレポーターカセットを含むレポーターポリヌクレオチド配列を含む
、典型的には無傷真核宿主細胞を含む、正ハイブリッド核内受容体シグナル伝達
系を典型的には使用する。ＬＢＤ−ＴＲＸタンパク質およびＣＡ−ＴＲＸタンパ
ク質のＴＲＸ成分は、機能的に補完的であり；すなわち、１つの融合物のＴＲＸ
がＤＢＤである場合、他の融合物のＴＲＸはＡＤであり、およびその逆もある。
ＬＢＤのアゴニストリガンドである物質と系を接触させる前は、レポーターポリ
ヌクレオチドに関するＬＢＤ−ＴＲＸおよびＣＡ−ＴＲＸの転写活性は実質的に
なく、系は実質的にレポーターポリヌクレオチドのコード配列の機能発現を欠失
している。系を、ＬＢＤ−ＴＲＸ融合タンパク質におけるＬＢＤの活性化コンフ
ォメーションを生じるアゴニスト物質と接触させた後、ＣＡ−ＴＲＸ融合タンパ
ク質は機能的に会合し、レポーターポリヌクレオチドに関して転写活性であるＬ
ＢＤ−ＴＲＸ／ＣＡ−ＴＲＸ複合体を形成し、この上でレポーターカセットは、
転写調節配列の制御下で転写および機能的に発現され得る。従って、レポーター
カセットの機能的発現は、系が、ＬＢＤの活性化コンフォメーションを誘導する
物質と接触したかを報告するのに役立つ。有利には、１つの変形において、レポ
ーターカセットは、細胞膜表面上でのその存在を基に、検出および／または選択
され得る、細胞表面レポータータンパク質をコードする。核内受容体シグナル伝
達系が、ＬＢＤ−ＴＲＸ融合物、ＣＡ−ＴＲＸ融合物をコードするポリヌクレオ
チド配列、およびレポーターポリヌクレオチド配列を有する代謝活性細胞からな
る実施形態において、系は、ＣＡ−ＴＲＸレポーター細胞と呼ばれる。
【００１２】 本発明の核内受容体シグナル伝達系は、一以上の被検薬剤を、前以て決定され
た核内受容体のＬＢＤを活性化する能力について評価するために使用できる。典
型的には、ＬＢＤを活性化する能力は、核内受容体の生理学的リガンドに比して
アゴニスト活性を示す。本発明のこの側面において、被検薬剤は、核内受容体シ
グナル伝達系に適用し、物質がシグナルをＬＢＤに伝達するに統計学的に十分で
あると予期される適切なインキュベート期間でインキュベートした。インキュベ
ート期間後、レポーターカセットの発現を、レポーターの存在を検出することに
より決定する。バックグラウンド（例えばプラセボ）と比較して実質的に有意な
リポーターの増加を生じる被検薬剤を受容体ゴニストとしてスコアをつける。核
内受容体シグナル伝達系が代謝活性無傷レポーター細胞を含む実施形態において
、典型的には、レポーター細胞の個体群を、被検薬剤と接触させ、被検薬剤が受
容体ゴニストとして機能する能力を、該被検薬剤の非存在下の実質的に等価な条
件下でのレポーター細胞の基準個体群と比較して、バックグラウンド以上の検出
可能なレポーターの相対的な発現により決定する。用量反応データは、様々な異
なる濃度の被検薬剤を使用してこのように作成できる。
【００１３】 １つの変形において、この方法を使用して、単一用量の前以て決定されたＬＢ
Ｄの活性化リガンドの、被検薬剤の非存在下で起こるリポーターの発現量の産生
能を阻止することにより、被検薬剤がレポーターの発現の統計学的に有意な減少
を引き起こす能力を決定することにより、前以て決定された核内受容体ＬＢＤの
アンタゴニストを同定し得る。
【００１４】 （正ハイブリッド系：コリプレッサー） 本発明はまた、ＬＢＤへのコリプレッサーの結合を誘導するリガンドを同定す
る組成物および方法を使用できる。これらの系は典型的には、（１）前以て決定
された転写因子の転写活性化ドメイン（「ＡＤ」）または別にＤＮＡ結合ドメイ
ン（「ＤＢＤ」）に（一般的に、ＡＤおよびＤＢＤは便宜のために「ＴＲＸ」と
呼ぶ）、典型的にはポリペプチド連鎖で共有結合した前以て決定された核内受容
体のリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）を含む、リガンドで活性化可能な融合
タンパク質（本明細書では「ＬＢＤ−ＴＲＸ」と呼ぶ）をコードおよび発現する
ＬＢＤ−ＴＲＸポリヌクレオチド配列、（２）前以て決定された転写因子の転写
活性化ドメインまたは別にＤＮＡ結合ドメイン（まとめて「ＴＲＸ」）に、典型
的にはポリペプチド連鎖で連結した前以て決定された該核内受容体の該ＬＢＤに
結合できる核内受容体コリプレッサータンパク質（「ＣＲ」）のドメインを含む
、コリプレッサー融合タンパク質（本明細書では「ＣＲ−ＴＲＸ」と呼ぶ）をコ
ードおよび発現するＣＲ−ＴＲＸポリヌクレオチド配列、および（３）直鎖状の
順序で、前以て決定された該転写因子に応答性の転写調節配列、並びにシグナル
または検出可能な表現型を付与する配列をコードするレポーターカセットを含む
レポーターポリヌクレオチド配列を含む、無傷真核宿主細胞を含む、正ハイブリ
ッド核内受容体シグナル伝達系（「ＣＲ−ＴＲＸ」系）を使用する。ＬＢＤ−Ｔ
ＲＸタンパク質およびＣＲ−ＴＲＸタンパク質のＴＲＸ成分は、機能的に補完的
であり；すなわち、１つの融合物のＴＲＸがＤＢＤである場合、他の融合物のＴ
ＲＸはＡＤであり、およびその逆もある。ＬＢＤのアゴニストリガンドである物
質と系を接触させる前は、レポーターポリヌクレオチドに関するＬＢＤ−ＴＲＸ
およびＣＲ−ＴＲＸの転写活性は実質的になく、系は実質的にレポーターポリヌ
クレオチドのコード配列の機能発現を欠失している。系を、ＬＢＤ−ＴＲＸ融合
タンパク質におけるＬＢＤの活性化コンフォメーションを生じるアゴニスト物質
と接触させた後、ＣＲ−ＴＲＸ融合タンパク質は機能的に会合し、レポーターポ
リヌクレオチドに関して転写活性であるＬＢＤ−ＴＲＸ／ＣＲ−ＴＲＸ複合体を
形成し、この上でレポーターカセットは、転写調節配列の制御下で転写および機
能的に発現され得る。従って、レポーターカセットの機能的発現は、系が、ＬＢ
Ｄの活性化コンフォメーションを誘導する物質と接触したかを報告するのに役立
つ。有利には、１つの変形において、レポーターカセットは、細胞膜表面上での
その存在を基に、検出および／または選択され得る、細胞表面レポータータンパ
ク質をコードする。核内受容体シグナル伝達系が、ＬＢＤ−ＴＲＸ融合物、ＣＲ
−ＴＲＸ融合物をコードするポリヌクレオチド配列、およびレポーターポリヌク
レオチド配列を有する代謝活性細胞からなる実施形態において、系は、ＣＲ−Ｔ
ＲＸレポーター細胞と呼ばれる。
【００１５】 本発明の核内受容体シグナル伝達系は、一以上の被検薬剤を、前以て決定され
た核内受容体のＬＢＤを活性化し、コリプレッサー結合を誘導する能力について
評価するために使用できる。典型的には、ＬＢＤをこのように活性化する能力は
、核内受容体の生理学的リガンドに比してアンタゴニストまたは部分的（混合）
アンタゴニスト活性を示す。本発明のこの側面において、被検薬剤は、ＣＲ−Ｔ
ＲＸ系に適用し、物質がシグナルをＬＢＤに伝達するに実質的に十分であると予
期される適切なインキュベート期間でインキュベートした。インキュベート期間
後、レポーターカセットの発現を、レポーターの存在を検出することにより決定
する。バックグラウンド（例えばプラセボ）と比較して統計学的に有意なリポー
ターの増加を生じる被検薬剤を受容体ンタゴニストまたは部分的（混合）アンタ
ゴニストとしてスコアをつける。核内受容体シグナル伝達系が代謝活性無傷レポ
ーター細胞を含む実施形態において、典型的には、レポーター細胞の個体群を、
被検薬剤と接触させ、被検薬剤が受容体ゴニストとして機能する能力を、該被検
薬剤の非存在下の実質的に等価な条件下でのレポーター細胞の基準個体群と比較
して、バックグラウンド以上の検出可能なレポーターの相対的な発現により決定
する。用量反応データは、様々な異なる濃度の被検薬剤を使用してこのように作
成できる。
【００１６】 １つの変形において、この方法を使用して、単一用量の前以て決定されたＬＢ
Ｄの活性化リガンドの、被検薬剤の非存在下で起こるリポーターの発現量の産生
能を阻止することにより、被検薬剤がレポーターの発現の統計学的に有意な減少
を引き起こす能力を決定することにより、前以て決定された核内受容体ＬＢＤの
アゴニストまたは部分的（混合）アゴニストを同定し得る。
【００１７】 （逆ハイブリッド系：コリプレッサー） １つの変形において、本発明は、（１）転写因子のＤＢＤまたはＡＤにポリペ
プチド連結した核内受容体のリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質をコー
ドするＬＢＤ−ＴＲＸポリヌクレオチド配列；（２）前以て決定された転写因子
の転写活性化ドメインまたは別にＤＮＡ結合ドメイン（ＴＲＸ）に、典型的には
ポリペプチド連鎖で連結した前以て決定した該核内受容体の該ＬＢＤに結合でき
る核内受容体コリプレッサータンパク質（「ＣＲ」）のドメインを含む、コリプ
レッサー融合タンパク質（本明細書では「ＣＲ−ＴＲＸ」と呼ぶ）をコードおよ
び発現するＣＲ−ＴＲＸポリヌクレオチド配列、および（３）ＣＲ−ＴＲＸへの
ＬＤＢ−ＴＲＸの結合の結果として転写活性複合体として効率的に発現されるタ
ンパク質をコードするリレー（シグナル変換）遺伝子、および（４）直鎖状の順
序で、該転写活性複合体に応答性の転写調節配列、およびリポーターをコードす
るリポーターカセットを含むリポーター遺伝子（ここで、リポーター遺伝子が効
率的に発現されると、リレー（またはシグナル変換）遺伝子の産物は実質的に存
在せず、リレー（またはシグナル変換）遺伝子が効率的に発現されるとあまり発
現されないか、または発現されない）を含む、「逆ハイブリッド」レポーター宿
主細胞を含む、核内受容体シグナル伝達系を提供する。１つの側面において、Ｌ
ＢＤは、活性化リガンドの非存在下でコリプレッサータンパク質に結合でき、お
よび、既知のアゴニストリガンドに結合などの、刺激誘導コンフォメーション変
化を受けることができ、よってコリプレッサーへの結合を減少または抑止する、
ステロイドホルモンスーパーファミリー受容体の機能的部分である。逆ハイブリ
ッド系は、ＬＢＤへのコリプレッサーの結合を解放する被検薬剤の同定を容易に
する。
【００１８】 本発明の逆ハイブリッド核内受容体シグナル伝達系は、一以上の被検薬剤を、
コリプレッサー結合を解放することにより、前以て決定された核内受容体のＬＢ
Ｄを活性化する能力について評価するために使用できる。典型的には、ＬＢＤを
活性化する能力は、核内受容体の生理学的リガンドに比してアゴニスト活性を示
すが、多くの核内受容体リガンドの多面発現性から、いくつかのかかる物質はあ
る効果的関してはアゴニスト作用であり、他の効果に関してはアンタゴニスト作
用であることが可能である。本発明のこの側面において、被検薬剤は、逆ハイブ
リッド核内受容体シグナル伝達系に適用し、物質がシグナルをＬＢＤに伝達する
に実質的に十分であると予期される適切なインキュベート期間でインキュベート
した。インキュベート期間後、レポーターカセットの発現を、レポーターの存在
を検出することにより決定する。バックグラウンド（例えばプラセボ）と比較し
て統計学的に有意なリポーターの増加を生じる被検薬剤を受容体ゴニストとして
スコアをつける。逆ハイブリッド核内受容体シグナル伝達系が代謝活性無傷レポ
ーター細胞を含む実施形態において、典型的には、レポーター細胞の個体群を、
被検薬剤と接触させ、被検薬剤が受容体ゴニストとして機能する能力を、該被検
薬剤の非存在下の実質的に等価な条件下でのレポーター細胞の基準個体群と比較
して、バックグラウンド以上の検出可能なレポーターの相対的な発現により決定
する。用量反応データは、様々な異なる濃度の被検薬剤を使用してこのように作
成できる。
【００１９】 １つの変形において、この方法を使用して、単一用量の前以て決定されたＬＢ
Ｄの活性化リガンドの、被検薬剤の非存在下で起こるリポーターの発現量の産生
能を阻止することにより、被検薬剤がレポーターの発現の統計学的に有意な減少
を引き起こす能力を決定することにより、前以て決定された核内受容体ＬＢＤの
アンタゴニストを同定し得る。
【００２０】 （逆ハイブリッド系：コアクチベーター） 逆ハイブリッド系の変形において、コアクチベーター（ＣＡ）ドメインは、コ
リプレッサー（ＣＲ）ドメインの代わりに使用し得、系を使用して、例えば、Ｌ
ＢＤとコアクチベータードメインの機能的相互作用を阻止、抑止、混乱、減弱、
妨害、または別様に拮抗する物質を同定できる。かかる物質は、必ずしもＬＢＤ
のリガンド結合ポケットに相互作用する必要はなく、例えば、コアクチベーター
ないしＬＤＢの結合界面、または他の部位で相互作用し得る。この方法を使用し
て、単一用量の前以て決定されたＬＢＤの活性化リガンドの、被検薬剤の非存在
下で起こるリポーターの発現量の産生能を阻止することにより、被検薬剤がレポ
ーターの発現の統計学的に有意な減少または相対的阻止を引き起こす能力を決定
することにより、前以て決定された核内受容体ＬＢＤの機能的アンタゴニストを
同定し得る。
【００２１】 本発明はまた、ＬＢＤないしコアクチベーターまたはコリプレッサーの結合相
互作用を、正または負に調節する物質を同定するために修飾でき、ここで、該物
質は必ずしもＬＢＤの真正リガンド結合ドメインと相互作用するわけではない。
一般に、これらのフォーマットは、コアクチベーターまたはコリプレッサー、ま
たはその結合断片への結合に、ＬＢＤ、またはその結合部分（これは機能的に構
成的である（すなわちリガンド依存性ではない）を使用する。かかる構成的ＬＢ
Ｄ種は、天然変異体として見出され得るか、突然変異および構成的機能の選択に
より産生できるか、または高濃度の高親和性真正リガンドを使用するか、または
リガンド結合ポケット（例えば、光親和性標識により）に共有結合させることに
より、または当業者には公知の他の方法により製造され得る。かかる系において
、構成的ＬＢＤおよびコアクチベーター（またはコリプレッサー）を、逆ハイブ
リッド系でＬＢＤ−ＴＲＸおよびＣＡ−ＴＲＸ（またはＣＲ−ＴＲＸ）融合物に
使用し、レポーター遺伝子の正の読み出しにより測定して、構成的ＬＢＤ：ＣＡ
（またはＬＢＤ：ＣＲ）を阻止する能力についてスクリーニングする。
【００２２】 （直接的相互作用法） 本発明の変形において、リガンド存在の結果としてのＬＢＤドメインないしＣ
Ａドメイン（またはＣＲドメイン）の結合として測定した、直接的な物理的相互
作用を決定できる。１つの側面において、ＬＢＤドメインを捕獲表面上に固定し
、可溶性で標識またはエピトープタグ化されたＣＡまたはＣＲドメインを、水性
生理学的条件下で、既知のリガンドまたは被検薬剤の非存在下または存在下で導
入する。典型的なフォーマットの直接法は、例えば、エリザであり得る。固定Ｌ
ＢＤ、ないし可溶性で標識またはエピトープタグ化されたＣＡ（またはＣＲ）に
リガンド誘導結合を生じさせ、よって、表面を濯ぎ溶液で洗浄し、実質的に可溶
性で標識またはエピトープタグ化されたＣＡ（またはＣＲ）を欠いた後、ＣＡ（
またはＣＲ）は捕獲表面上に固定および保持され、従って、捕獲表面上に保持さ
れ、適切な手段により検出できる物質を候補リガンドとして同定できる。
【００２３】 １つの変形において、ＣＡ（またはＣＲ）は、捕獲表面上に固定でき、ＬＢＤ
は標識またはエピトープタグ化できる。エピトープタグ化されたタンパク質は、
一般に、エピトープと特異的に反応する少なくとも１つの抗体種を使用して免疫
化学的方法により検出できる。
【００２４】 変形において、ＬＢＤ種（またはその多重種）を捕獲表面に固定し、可溶性で
標識ＣＡおよび／またはＣＲ種（またはその多重種）を使用して、リガンド誘導
結合相互作用、またはＬＢＤないしＣＡまたはＣＲ（またはその複数の組合せ）
の結合相互作用のリガンド依存性解放を同定できる。かかる変形において、通常
、ＣＡおよび／またはＣＲの各種について特有の標識またはエピトープタグを使
用することが好ましく、これは、捕獲表面上の各標識またはタグの独特な検出に
基づき、ＣＡまたはＣＲのどちらの種（群）がＬＢＤ種（またはＬＢＤ種の集合
）に結合したかを識別するための基本を提供できる。逆に、ＣＡまたはＣＲ（ま
たはその複数の種）を、捕獲表面上に固定でき、独特に標識またはタグ化したＬ
ＢＤの複数の種を使用し得る。各場合において、被検薬剤を、ＬＢＤないしＣＡ
またはＣＲ種の濃度依存的結合を生じさせる能力について評価し、物質を欠失し
た平行反応および／または物質を欠失し、既知のリガンド、アゴニストまたはア
ンタゴニストを含む平行反応と比較できる。複数の種のＬＢＤを使用する変形は
、「ＬＢＤ多重化」と呼ばれ、複数の種のＣＡまたはＣＲを使用する変形は、そ
れぞれ「ＣＡ多重化」または「ＣＲ多重化」と呼ばれる。被検薬剤は、ＬＢＤお
よびＣＡまたはＣＲの各組合せに関して、アゴニスト、アンタゴニストとしての
その効果、または、そのような効果のないことに基づいて分類される。濃度依存
性およびＥＣ５０またはＩＣ５０値は、特定の終点に関して、アゴニストまたは
アンタゴニストとしての被検薬剤の分類における追加のパラメーターであり得る
。
【００２５】 （フォーマットの多重化） 本発明は、記載したような数個のフォーマットを使用する。これらのフォーマ
ットは、多重化フォーマットアッセイを提供するために平行して使用できる。本
発明の多重化フォーマットアッセイは、以下：（１）正ハイブリッド系：コアク
チベーター、（２）正ハイブリッド系：コリプレッサー、（３）逆ハイブリッド
系：コアクチベーター、（４）逆ハイブリッド系：コリプレッサー、（５）直接
的相互作用アッセイ、または（６）核内受容体のアンタゴニストまたはアゴニス
トとしての、リガンドの効力および／または強度の同定および／または定量のた
めの他の当分野で公知のアッセイの、少なくとも２つを含む。好ましい多重アッ
セイは、（１）と（５）の組合せである。さらに、個々の型のフォーマットは、
使用したＬＢＤ種および／または使用したＣＡまたはＣＲ種に関して多重化でき
る（例えば、エストロゲン受容体ＬＢＤを用いた正ハイブリッド系、および甲状
腺ホルモン受容体ＬＢＤを用いた第二正ハイブリッド系）。フォーマット多重化
およびＬＢＤ多重化、ＣＡ多重化、および／またはＣＲ多重化系の組合せおよび
方法は、個々の方法の実施形態で使用して、核内受容体のアゴニストおよびアン
タゴニストの同定の感度および／または選択性を増強できる。
【００２６】 細胞を基にしたアッセイを多重化する実施形態において、しばしば、各アッセ
イチャンバー（例えば、細胞培養プレートのウェル）でレポーター細胞の複数の
別個の種を使用することが好ましく、各種のレポーター細胞は、識別可能かつ検
出可能な読み出しを提供する。細胞を基にしたアッセイを使用する変形において
、フローサイトメトリー（これはキャピラリーサイトメトリーを含み得る）を使
用して、読み出しシグナルを検出し、読み出しが蛍光シグナルを含む場合、しば
しばダイオードレーザーまたは整調照明源を使用する。
【００２７】 （生物効果フィンガープリントの特異性） １つの側面において、本発明は、被検薬剤のライブラリーから候補医薬を同定
する方法を提供し、ここで、候補医薬は所望の生物学的効果プロフィル（「生物
効果フィンガープリント」）を有する。該方法は、（１）ライブラリーの各々別
々の被検薬剤（これは混合物でもよい）を個々に使用して、ｎ個（ｎは、２以上
、好ましくは３以上で、１００億以下の数である）の別個の本発明のアッセイを
実施し、各個々の被検薬剤測定について、別々のアッセイでリガンド誘導コンフ
ォメーション変化または結合相互作用変化として検出される、少なくともｎ個の
生物学的効果を得、（２）検出された各生物学的効果について、各アッセイにお
けるリガンド誘導コンフォメーション変化または結合相互作用の検出（またはそ
の欠失）に基づき、スコア値（二進数または定量的）を割り当て、別々に各物質
のスコア行列（「生物効果フィンガープリント」）を作成し、および（３）各物
質のスコア行列を、一以上の前以て決定されたアゴニスト（群）および／または
アンタゴニスト（群）における等価な（すなわち、類似条件下で同アッセイを示
す）スコア行列と比較し、よって、前以て決定された該アゴニスト（群）または
アンタゴニスト（群）のスコア行列とかなり類似したスコア行列を有する物質を
同定することを含む。実質的同一性の決定は、一般知識および当業者の経験を基
になされ得、および／または行列類似性の順位付け（すなわち、マッチの全数）
を基になされ得、および／または訓練されたニューラルネットワークを使用した
電子計算により（例えば、類似のアッセイで複数の前以て決定されたアゴニスト
および／またはアンタゴニストからのデータで訓練したウィンドウズプラットフ
ォームで作動しているブレインメーカー）、または他の方法によりなされ得る。
この方法は、イン・ビトロアッセイおよび／または細胞培養アッセイを使用して
作成した生物効果測定に基づき、新規な受容体リガンドの同定およびその特徴を
提供する。一般に、かかるマルチパラメーター法のイン・ビボでの予測される生
物学的効果の数値は、スコア行列サイズ（すなわち、少なくとも５つの細胞また
はエレメントを有するスコア行列（各々が別個のアッセイ型を示す）が好ましい
）と共に増加する。
【００２８】 １つの側面において、本発明はまた、（１）核タンパク質には天然に存在せず
、（２）典型的には天然に存在するコアクチベーターおよび／またはコリプレッ
サーが結合する核内受容体の結合界面との相互作用により、核内受容体に結合す
ることが前以て決定されている、結合アミノ酸配列を含む新規なポリペプチドを
提供する。これらのポリペプチドおよびその組成物は、コアクチベーターまたは
コリプレッサー結合の候補アンタゴニスト（例えば競合的阻害剤）であり、ＣＡ
−ＴＲＸ融合物のＣＡ部分として、またはＣＲ−ＴＲＸ融合物のＣＲ部分として
、本発明のアッセイの使用に（かかる使用は、試薬などの商業的な販売を含み得
る）および当業者には明らかな他の使用に利用できる。かかる結合アミノ酸配列
は、一般に、ＬＸＸＬＬモチーフ（ここで、Ｌはロイシンであり、Ｘは慣用的な
アミノ酸のいずれかである）を含み、ヒトエストロゲン受容体のＬＢＤに関して
、図１６で示す配列を含む。新規なポリペプチドは、一般に、５−５０，０００
アミノ酸長、最も通例には１０−５００アミノ酸長であり、１つまたは複数の種
のかかる結合アミノ酸配列（これは反復していてもよい）を含み得、残りのポリ
ペプチドは、他の天然に存在する配列（例えば、既知のタンパク質への融合物）
を含み得、および／またはランダム、偽ランダム、または確定配列ケマル（ｋｅ
ｍａｌ）アミノ酸配列（群）を含み得る。新規結合配列への構造相同性を有する
ペプチド擬似体もまた、当分野で公知の方法に従って提供され；かかるペプチド
擬似体または束縛ペプチドは、一以上の核内受容体リガンドのアゴニスト作用ま
たはアンタゴニスト作用を提供する新規な治療薬物を提供できる。
【００２９】 １つの側面において、核内受容体シグナル伝達系は、レポーター細胞である全
部またはいくつかの体細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物を含み得る。
この側面において、トランスジェニック非ヒト動物に、間接的に（すなわちＬＢ
Ｄへの結合以外により）またはＬＢＤリガンドとして作用し得る被検薬剤を投与
し得る。一以上の該体細胞型における統計学的に有意なレベルのレポーター発現
の検出は、被検薬剤のアゴニスト活性を示す。１つの実施形態において、該トラ
ンスジェニック動物のリンパ球は、レポーター細胞であり、被検薬剤をトランス
ジェニック動物に投与し、適切なインキュベート期間後に該トランスジェニック
動物から集め、被検薬剤の投与を行わない以外は類似の条件下の非処置トランス
ジェニック動物からのリンパ球と比べた、レポータータンパク質を発現している
リンパ球の相対量を、イン・ビボでの前以て決定された核内受容体の活性化につ
いての、試験化合物の、アゴニストまたはアンタゴニスト効力（ある場合）の同
定に役立てる。
【００３０】 １つの変形において、生物効果フィンガープリントにより、複数の化合物（被
検薬剤）の特徴づけが可能となり、該特徴づけは、化合物（被検薬剤）を複数の
レポーター細胞種および／または非細胞レポーターアッセイと、複数の個々の別
々の反応容器（各別々の反応容器には、典型的には前以て決定された濃度の、独
特の被検薬剤種を含む）において接触させ、被検薬剤として、前以て決定された
医薬活性を有する化合物を使用した平行なアッセイのセットと比較することによ
り決定することを含み、各被検薬剤の生物効果フィンガープリントは、作表デー
タ編集を含み、しばしば行列フォーマットで、電子計算機に電子的に貯蔵され、
該被検薬剤のアッセイ読み出しおよび前以て決定された医薬活性は、統計解析に
基づき、被検薬剤に最も類似しており、よって、被検薬剤を既知の医薬的に活性
な化合物への類似性に基づき分類する。
【００３１】 （オーファン受容体） 本発明の方法および組成物は、有利には、生理学的リガンドが分かっていない
オーファン受容体へのリガンドの同定に使用できる。ツーハイブリッド系を使用
して、オーファン受容体に関して、結合活性を有するポリペプチド配列を同定で
き、および／またはペプチド擬似体を使用して、生理学的コアクチベーターおよ
びコリプレッサーは依然として同定され得ないが、生理学的コアクチベーターお
よびコリプレッサーを擬似できる結合モチーフは同定できる。
【００３２】 かかる組成物、レポーター宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物、および
キットは、環境リガンドの感度の高い診断検出系の、市場で販売可能な薬物発展
試薬として（例えば、サンプル中の多環式芳香族炭化水素を、Ａｈ核内受容体に
対するそのアゴニスト作用を検出することによりアッセイするために）、および
医薬製剤の調製のために核内受容体リガンドの生物強度を滴定するための試薬と
して用途を見出す。
【００３３】 本発明の他の特徴および利点は、以下の図面の記載、本発明の好ましい実施形
態、実施例、および特許請求の範囲から明らかである。
【００３４】
【詳細な説明】
本明細書に引用された全ての出版物が、逐語的に再現されているかのごとく完
全に本明細書に組み込まれる。
【００３５】 （定義） 別途定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用
語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を
有する。本明細書に記載されたものと類似又は等価な任意の方法及び材料が、本
発明の実施又は試験において用いられうるが、好ましい方法及び材料が記載され
る。本発明の目的のため、以下の用語は、下記のように定義される。
【００３６】 本明細書で用いる「コアクチベーター」の用語は、リガンド依存的に核内受容
体により転写制御されうる少なくとも一つの遺伝子に関する基底の転写を実質的
に改変することなく、核内受容体の転写活性を増強する、直接的な（一つ又は複
数の）タンパク質−タンパク質接触を介して、また典型的にはリガンド依存的又
はＡｆ−２ドメイン依存的に、核内受容体に結合する、任意の制限因子である。
いくつかのコアクチベーターの例には、これらに限定されないが、ＳＲＣ−１、
ＥＲＡＰ１４０、ＲＩＰ１４０、ＲＩＰ１６０、Ｔｒｉｐ１、ＳＷＩ１／ＳＮＦ
、ＡＲＡ７０、ＲＡＰ４６、ＴＩＦ１、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＩＦ２、ＧＲＩＰ
１、ＴＲＡＰ複合体タンパク質、及びＧｌａｓｓら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２２２又はＨｏｒｗｉｔｚら（１９９６）Ｍｏ
ｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１０：１１６７に記載されているものを含む、当分野に
おいて既知のその他のタンパク質が含まれる。コアクチベーターは、典型的には
、少なくとも一つの−ＬＸＸＬＬ−モチーフ（ＬＣＤ）を含有し、典型的には、
少なくとも二つ又は三つのそのようなモチーフを含有する。コアクチベーターは
、典型的には、ＡＦ−２依存的にＬＢＤに結合する。コアクチベーターは、天然
には見出されないが、リガンド依存的な核内受容体のＬＢＤとの結合に関するペ
プチドスクリーニング法により同定される、アミノ酸配列を含みうる。
【００３７】 本明細書で用いる「コリプレッサー」の用語は、ＤＮＡ結合受容体によりプロ
モーターにつながれた後、転写を阻害するか、又はコアクチベーターの結合を遮
断する、任意のタンパク質性制限因子、受容体との結合がリガンド制御される因
子、及び転写に対する阻害効果がリガンド依存的に解除されうる因子である。い
くつかのコリプレッサーの例には、これらに限定されないが、Ｎ−Ｃｏｒ、ＳＭ
ＲＴ、カルレティキュリン、ＴＲＵＰ、及びＴｕｐ１、及びＧｌａｓｓら（１９
９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２２２又はＨｏｒｗｉｔ
ｚら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１０：１１６７に記載されている
ものを含む、当分野において既知のその他のタンパク質が含まれる。コリプレッ
サーは、典型的には、少なくとも一つ又は複数の相互作用ドメイン（ＩＤ）を含
有し、典型的には、少なくとも二つ又は三つのそのようなモチーフを含有する。
【００３８】 本明細書で用いる２０個の一般的なアミノ酸及びそれらの略号は、一般的な使
用法に従う（参照として本明細書に組み込まれるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ
．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄ
ｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（１９９１））。２０個の一般的な
アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、二置換アミノ酸、Ｎ−アルキ
ルアミノ酸、乳酸、及びその他の一般的でないアミノ酸のような非天然アミノ酸
も、本発明のポリペプチドにとって適当な成分でありうる。一般的でないアミノ
酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタメート、Ｎ，Ｎ，Ｎ−
トリメチルリジン、Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスフォセリン、Ｎ−アセチルセ
リン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン
、Ｎ−メチルアルギニン、並びにその他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば
、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書において用いられるポリペプ
チド表記において、標準的な使用法及び慣例に従い、左方がアミノ末端方向であ
り、右方がカルボキシ末端方向である。同様に、別途特記しない限り、一本鎖ポ
リヌクレオチド配列の左方は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左
方は５’末端と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は、
転写方向と呼ばれる。ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端の５
’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡと同一の配
列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端の３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「
下流配列」と呼ばれる。
【００３９】 ポリペプチドに適用されるように、「実質的同一性」という用語は、２つのペ
プチド配列が、デフォルト・ギャップ・ウェイト（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｗ
ｅｉｇｈｔｓ）を用いたプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適に
整列化させたとき、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なく
とも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの
配列同一性、又はそれ以上（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有する
ことを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的なアミノ酸置換に
より異なっている。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の相互交
換可能性をさす。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン
、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシ
ル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリン及びトレオニンであり、アミノ含
有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギン及びグルタミンであり、芳
香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、及びト
リプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アル
ギニン、及びヒスチジンであり、そして、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグル
ープは、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換グルー
プは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン
−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００４０】 本明細書で用いる「断片」の用語は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の
欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、例えばコアクチベーター、コリプレッ
サー、又は核内受容体の全長ｃＤＮＡ配列から推測される、天然に存在する（例
えば、成熟タンパク質）配列の対応する位置と同一であるポリペプチドをさす。
断片は、典型的には、少なくとも１４アミノ酸長であり、好ましくは少なくとも
２０アミノ酸長であり、通常少なくとも５０アミノ酸長又はそれ以上であり、か
つＬＣＤ、ＩＤ、又はＡＦ−２のような相互作用インターフェースを含有する。
【００４１】 本明細書で用いる「アナログ」の用語は、ＬＢＤ、ＣＡ、又はＣＲの一部と実
質的同一性を有し、核内受容体種、ＣＡ種、又はＣＲ種との特異的結合を有する
少なくとも２５アミノ酸のセグメントからなるポリペプチドをさす。典型的には
、アナログポリペプチドは、天然に存在する配列に対する保存的アミノ酸置換（
又は付加もしくは欠失）を含む。アナログは、典型的には、少なくとも２０アミ
ノ酸長であり、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長又はそれ以上であり、最も
通常には天然に存在するポリペプチドの全長と同等の長さを有する。
【００４２】 「ポリペプチド」の用語は、本明細書において、天然型タンパク質、断片、又
はポリペプチド配列のアナログをさすための総称的な用語として用いられる。従
って、天然型タンパク質、断片、及びアナログは、ポリペプチド属の種である。
【００４３】 本明細書において、対象に対して適用される「天然に存在する」という用語は
、対象が天然に見出されうるという事実をさす。例えば、天然起源から単離され
うる（ウイルスを含む）生物中に存在し、実験室において人工的に故意に修飾さ
れていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものであ
る。本明細書において用いられるように、古典的な遺伝学に従い選択的に交配さ
れているかもしれない齧歯類の実験用系統は、天然に存在する動物と見なされる
。
【００４４】 本明細書で用いる「ＬＢＤ」又は「リガンド結合ドメイン」の用語は、第二の
結合した機能ドメインに検出可能な活性を与えるよう、生理的リガンド（例えば
、ステロイドホルモン）に結合し、それによりコンフォメーション変化、及び／
又は会合タンパク質との分子間相互作用の改変を受ける、ステロイドスーパーフ
ァミリー受容体又は本明細書において論じたようなその他の適当な核内受容体の
ような核内受容体のタンパク質ドメインをさす。適当な有効なリガンドがＬＢＤ
と相互作用し、アゴニストとのリガンド複合体を形成するとき、ＬＢＤは活性化
され、一つ又は複数のコアクチベーター種が結合するようになる。適当な有効な
リガンドがＬＢＤと相互作用し、アンタゴニストとのリガンド複合体を形成する
とき、又はいくつかの場合には、結合リガンドの非存在下において、ＬＢＤは一
つ又は複数のコリプレッサー種に結合する。
【００４５】 アゴニストリガンドとは、本明細書において、コアクチベーターの結合及び／
又はコリプレッサーの解離を誘導するため、ＬＢＤが結合したとき、コンフォメ
ーション変化及び／又はＬＢＤの分子間又は分子間相互作用の改変を受けるリガ
ンドと定義される。アンタゴニストリガンドとは、本明細書において、一般的に
は用量依存的な競合的結合により、又はさもなければＬＢＤとコリプレッサーと
の結合の誘導もしくは安定化、又はＬＢＤと一つ又は複数のコアクチベーター種
との結合の阻害により、アゴニストリガンドの効果に対抗するリガンドと定義さ
れる。核内受容体ＬＢＤは、当業者に既知であり、及び／又は当業者により同定
されうるものであり、本明細書に記載されているようなものである。例示的なＬ
ＢＤは、ステロイドホルモン受容体（例えば、ＥＲ、ＧＲ、ＰＲ、ＡＲ、ＥｃＲ
）、レチノイン酸受容体（例えば、ＲＡＲ、ＲＸＲ、ＲＺＲ）、ペルオキシソー
ム増殖剤反応性受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａ
ｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）（例えば、ＰＰＡＲ）、チロキシン（
Ｔ３）受容体（ＴＲ）、ビタミンＤ受容体（例えば、ＶＤＲ）、及びファルセノ
イド（ｆａｒｓｅｎｏｉｄ）受容体（例えば、ＦＸＲ）、アリル炭水化物受容体
（Ａｈ）、オーファン核内受容体、その他から得られる。本発明は、既知の核内
受容体に限定されず、結合したリガンドの非存在下で、コリプレッサーに結合し
、及び／又はコアクチベーター種に結合できない、ＬＢＤを有する任意の適当な
核内受容体由来のＬＢＤを使用することができる。
【００４６】 本明細書で用いる「ＬＢＤ−ＴＲＸ」及び「ＬＢＤ−ＴＲＸ融合タンパク質」
の用語は、（１）少なくとも約１×１０−８Ｍの親和性で、予め決定されたリガ
ンド種、典型的には生理的リガンド（例えば、ステロイドホルモン）に結合する
ことができ、結合したリガンドの非存在下で、コリプレッサーに結合することが
でき、及び／又はリガンド依存的に結合可能となる一つ又は複数のコアクチベー
ター種に結合することができない核内受容体（例えば、ステロイド受容体スーパ
ーファミリーのメンバー）の一部、並びに（２）転写因子ＤＢＤ又はＡＤの触媒
活性を有する一部、を含むポリペプチドをさす。いくつかの実施形態において、
約１〜２５アミノ酸のポリペプチドスペーサーが、ＴＲＸ部分からＬＢＤ部分を
隔離していてもよい。スペーサーは、好ましくは、非干渉性の（即ち、細胞の核
においてＬＢＤ−ＴＲＸの所望の機能を許容する）配列であり、実務者により容
易に決定及び選択されうる。いくつかの実施形態において、非干渉性配列内に、
付加的なアミノ酸のアミノ酸末端及び／又はカルボキシ末端伸長が存在してもよ
い。典型的な本発明のＬＢＤ−ＴＲＸに関して、アミノ末端からカルボキシ末端
へのＬＢＤ及びＴＲＸの直線的な順序は、ＬＢＤ−ＴＲＸ融合タンパク質に、所
望の機能、コアクチベーターとの結合及び／又はコリプレッサーとの解離のリガ
ンド誘導可能活性化が保持されている限りにおいて、様々に変動しうる。
【００４７】 本明細書で用いる「細胞表面レポーター」の用語は、宿主細胞の細胞膜に局在
し、タンパク質の一部が細胞外領域に露出しているタンパク質をさす（例えば、
内在性膜タンパク質又は膜貫通糖タンパク質、検出タンパク質と膜つなぎ配列と
の人工的融合体）。ここで、該細胞外部分には、少なくとも約１×１０７Ｍ−１ の親和性で、特異的抗体もしくはその他のリガンドが結合することができ、及び
／又は外細胞外部分は、基質の生成物への検出可能な変換を触媒することができ
る。細胞表面レポーターという用語は、そのような細胞表面タンパク質をコード
するポリヌクレオチド配列もさす。天然に存在する細胞表面タンパク質には存在
しない少なくとも一つのセグメント（例えば、少なくとも約３個の連続アミノ酸
のエピトープ）を含む融合タンパク質を含む、様々な細胞表面タンパク質が、細
胞表面レポーターとして用いられうる。例えば、これらに限定されないが、以下
のものが細胞表面レポーターとして用いられうる。造血系の細胞上に存在するＣ
Ｄ（クラスター・オブ・ディファレンシエーション（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ））抗原（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｃ
Ｄ２１など）、グルタミルトランスペプチダーゼ、接着タンパク質（例えば、Ｉ
ＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１）、エンベロープを有
するウイルスのスパイク糖タンパク質（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈ
ＣＭＶ）の糖タンパク質Ｈ）、及び膜結合型の免疫グロブリンμ鎖。また、例え
ば、これらに限定されないが、膜貫通タンパク質とガラクトシダーゼタンパク質
との融合タンパク質は、細胞表面レポーターを構成しうる（即ち、グルタミルト
ランスペプチダーゼのヘビーサブユニットと結合したガラクトシダーゼ配列を有
する融合タンパク質）。そのような融合タンパク質を保有する細胞は、固定化抗
ガラクトシダーゼ抗体を用いてアフィニティ濃縮されうる。好ましい細胞表面レ
ポータータンパク質は、酵素、又はその触媒活性部分と、膜つなぎ配列との融合
体であり、特に、酵素が基質の生成物への検出可能な変換を生じ、宿主細胞膜が
該基質（例えば、ルシフェラーゼ）に対して実質的に非透過性である融合体であ
る。好ましくは、細胞表面レポータータンパク質は、通常は宿主細胞上に有意な
レベルで発現しないタンパク質である。ルシフェラーゼは脊椎動物のタンパク質
であるため、ルシフェラーゼを含む融合タンパク質は、哺乳動物宿主細胞と共に
用いるための好ましい細胞表面レポーターである。例えば、様々なクローニング
されているＣＤ（「クラスター・オブ・ディファレンシエーション」）抗原のよ
うな、適当な細胞表面レポーターの多数のその他の特別な例は、（例えば、文献
及びジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＴＭ、例えばＣＤ２ジェンバンク配列ファ
イル：Ｈｕｍｃｄ２１、Ｈｕｍｃｄ２２、Ｈｕｍｃｄ２３、Ｈｕｍｃｄ２４、及
びＨｕｍｃｄ２５、並びにＨｕｓｃｄ２１、Ｈｕｓｃｄ２２、Ｈｕｓｃｄ２３、
Ｈｕｓｃｄ２４、及びＨｕｓｃｄ２５から）当業者に既知であり、実務者の所望
の適用に基づき、本発明の方法及びポリヌクレオチド構築物における使用のため
選択されうる。
【００４８】 本明細書で用いる「発現カセット」の用語は、ｃＤＮＡ配列又はゲノミックＤ
ＮＡ配列のような構造配列と機能的に結合した、プロモーター配列と、場合によ
り（一つ又は複数の）エンハンサー因子及び／又はサイレンサー因子を含むポリ
ヌクレオチドをさす。いくつかの実施形態において、発現カセットは、転写物の
ポリアデニル化を確実にするためのポリアデニル化部位配列を含んでいてもよい
。コードされたタンパク質を分泌させるか又は細胞膜に保持させたい場合には、
一般的にコーディング配列のアミノ末端部分にシグナル配列がコードされる。発
現カセットが適当な宿主細胞に導入されるとき、構造配列が発現カセットプロモ
ーターから転写され、直接的に、又は適当なＲＮＡスプライシングの後に、翻訳
可能なメッセージが生成する。典型的には、発現カセットは、（１）ＳＶ４０初
期領域プロモーター、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、又はホスフォグリセレートキ
ナーゼ（ｐｇｋ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、Ｓｒプロモーター、又は
当分野において既知のその他の適当なプロモーターのようなプロモーターと、（
２）プロモーターからの転写により機能的タンパク質をコードするＲＮＡが生成
するようにセンス方向でプロモーターとライゲートした、ｃＤＮＡ又はゲノム断
片のようなクローニングされたポリヌクレオチド配列と、（３）ポリアデニル化
配列とを含む。例えば、これらに限定されないが、本発明の発現カセットには、
ｃＤＮＡ発現クローニングベクター、ｐｃＤ及びＮＭＴ（参照として本明細書に
組み込まれるＯｋａｙａｍａ Ｈ ａｎｄ Ｂｅｒｇ Ｐ（１９８３）Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０； Ｏｋａｙａｍａ Ｈ ａｎｄ Ｂｅｒｇ
Ｐ（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１３６）又は当分野におい
て既知であり利用可能なその他の好ましい発現ベクターが含まれうる。発現カセ
ット内の転写制御配列は、目的の適用に基づき、実務者により選択される。特別
な使用に応じて、転写制御は、誘導可能、抑制可能、構成性、細胞型特異的、発
生段階特異的、性別特異的、又はその他の所望の型の転写制御配列を使用するこ
とができる。
【００４９】 本明細書で用いる「レポーターポリヌクレオチド」の用語は、直線的に、機能
的に結合した転写制御配列及びレポーターカセットを含むポリヌクレオチド配列
をさす。一つの変形として、レポーターポリヌクレオチドは、レポーター宿主細
胞内のレポーターポリヌクレオチドの存在を確実にするため選択されうる選択可
能マーカーをコードする。好ましい選択可能マーカー遺伝子には、これらに限定
されないが、Ｇ−４１８Ｒ、ミコフェノール酸耐性、ＤＨＦＲ、ＨＳＶ−ｔｋな
どが含まれる。好ましいレポーターカセットには、細胞を死滅させることなく、
代謝活性細胞の細胞表面に発現し検出されうるタンパク質をコードする配列が含
まれる。好ましくは、そのようなタンパク質は、所望により、バックグラウンド
を減少させるため、細胞表面から容易に切り出されうる。レポーターポリヌクレ
オチドは、実務者の裁量により遺伝因子のタンデムアレイを含みうる。
【００５０】 本明細書で用いる「レポーター宿主細胞」の用語は、レポーターポリヌクレオ
チド、ＬＢＤ−ＴＲＸ発現カセット、及びＣＡ−ＴＲＸ発現カセット、及び／又
はＣＲ−ＴＲＸ発現カセットを保有する、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞を
さす。レポーターポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド結合により、一つ
又は複数の発現カセット配列として同一ポリヌクレオチド上に位置してもよいし
、又は別々のポリヌクレオチド上に位置してもよい。発現カセット及び／又はレ
ポーターポリヌクレオチドは、染色体外因子（例えば、レプリコン）として存在
してもよいし、宿主細胞の染色体に組み込まれていてもよいし、又は複製不可能
な非組み込み形態で一過性形質転換されていてもよい。好ましくは、発現カセッ
ト及びレポーターポリヌクレオチドは、いずれも、非相同的組み込み又は相同的
配列ターゲティングのいずれかにより、宿主細胞の染色体位置に安定的に組み込
まれている。
【００５１】 「転写モデュレーション」の用語は、本明細書において、シスに結合した構造
配列の転写を増強するか、又は転写を阻害する能力をさすために用いられる。そ
のような増強又は阻害は、誘導因子による刺激のような特別なイベントの発生に
よるかもしれないし、及び／又はある種の細胞型にのみ現れるかもしれない。例
えば、これらに限定されないが、活性化された（例えば、リガンドが結合した）
グルココルチコイド受容体の形成を妨害するタンパク質の発現は、グルココルチ
コイド応答性の細胞型がグルココルチコイドの存在下でグルココルチコイド応答
性遺伝子の転写をモデュレートする能力を改変する。この改変は、通常グルココ
ルチコイドによる刺激の後に起こるグルココルチコイド応答性遺伝子の転写増強
の阻害として現れるであろう。転写の増強又は阻害をモデュレートする能力の改
変は、直前に引用された例のような遺伝子の誘導可能な転写に影響を与えるかも
しれないし、又は遺伝子の基底レベルの転写に影響を与えるかもしれないし、又
はその両方であるかもしれない。例えば、レポーターポリヌクレオチドは、細胞
表面レポータータンパク質をコードする配列の、グルココルチコイド誘導可能エ
ンハンサー−プロモーターにより支配される転写を含みうる。そのようなレポー
ターポリヌクレオチドは、レポーター宿主細胞として用いるためのグルココルチ
コイド応答性細胞系へ導入されうる。グルココルチコイドの存在下で培養された
細胞における細胞表面レポーターの発現を抑止するクローニングされた配列も、
（例えば、基底の転写を減少させ、検出可能なグルココルチコイド誘導可能性を
確実にするため）導入されうる。特別なエンハンサー及びサイレンサーのような
、多数のその他の転写制御因子の特別な例は、当業者に既知であり、実務者の所
望の適用に基づき、本発明の方法及びポリヌクレオチド構築物における使用のた
め選択されうる。本発明における使用のための適当な転写制御因子及びその他の
構造配列及び機能的配列の選択において、当業者は、文献供給源及び公開された
特許書類、並びにジェンバンクＴＭ及びその他の配列情報データ供給源を参照す
ることができる。必要に応じて、転写制御因子は、利用可能な配列情報（例えば
、ＣＤ４エンハンサー、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、又はＳＶ４０初期プロモー
ターに関するジェンバンク配列）に基づき作成されたオリゴヌクレオチドの合成
（及び、必要であればライゲーション）により、構築されうる。
【００５２】 本明細書で用いる「結合した」とは、使用される情況に応じて、ポリヌクレオ
チド結合（即ち、ホスフォジエステル結合）又はポリペプチド結合を意味する。
「未結合」とは、別のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と結合していない
ことを意味する。従って、２つの配列がそれぞれ遊離の５’末端及び遊離の３’
末端を有する場合、それらは未結合である。
【００５３】 本明細書で用いる「機能的に結合した」とは、機能的な関係におけるポリヌク
レオチド因子の結合をさす。核酸が、別の核酸配列と機能的な関係におかれたと
き、それは「機能的に結合」している。例えば、プロモーター又はエンハンサー
が、コーディング配列の転写に影響を与える場合、それらはコーディング配列と
機能的に結合している。機能的に結合したとは、結合したＤＮＡ配列が典型的に
は連続しており、２つのタンパク質コーディング領域を接合する必要がある場合
には、連続しており、かつリーディングフレーム内にあることを意味する。しか
し、エンハンサーは一般的に数キロ塩基プロモーターから離れたとき機能し、イ
ントロン配列は様々な長さを有しうるため、いくつかのポリヌクレオチド因子は
機能的に結合しているが連続はしていない。内因性遺伝子の転写制御配列に相当
するポリヌクレオチド配列と機能的に結合した構造遺伝子（例えば、ＨＳＶ ｔ
ｋ遺伝子）は、一般的に、天然に存在する遺伝子と実質的に同一の時間的、細胞
型特異的パターンで発現する。
【００５４】 別途特記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左方は５’末端であり、
二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の
５’から３’への付加の方向は、転写方向と呼ばれる。ＲＮＡと同一の配列を有
し、ＲＮＡ転写物の５’末端の５’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配
列」と呼ばれ、ＲＮＡと同一の配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端の３’側に
あるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
【００５５】 本明細書で用いる「転写制御配列」の用語は、転写可能なポリヌクレオチド配
列と機能的結合状態に置かれたとき、機能的に結合した転写可能ポリヌクレオチ
ド配列の転写をモデュレートすることができる、ポリヌクレオチド配列又はポリ
ヌクレオチドセグメントをさす。正の転写制御因子とは、単独で、又は一つもし
くは複数の他のＤＮＡ配列と組み合わされて転写を活性化するＤＮＡ配列である
。典型的には、転写制御配列は、プロモーターを含み、しばしばエンハンサーを
含み、当分野において既知であるか、又は（例えば、「プロモータートラップ」
ベクター、転写速度アッセイなどを用いた）従来の転写活性分析により容易に同
定されうる、その他の正及び／又は負の転写制御因子を含みうる。しばしば、転
写制御配列は、プロモーター及び転写因子認識部位（下記参照）を含む。この用
語は、しばしば、転写制御領域に機能的に結合したポリヌクレオチド配列の転写
に必須の、機能的プロモーターを含むＤＮＡ配列及び任意の関連転写因子（例え
ば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰ１部位など）
をさす。
【００５６】 本明細書で用いる「転写の増強」の用語は、機能的プロモーターを含有する結
合した配列の転写速度を増加させる機能的特性をさす。
【００５７】 本明細書で用いる「転写ユニット」又は「転写複合体」の用語は、構造遺伝子
（エキソン）、ｃａｒｅｓ作用性結合プロモーター、及び構造配列の効率的な転
写に必要なその他のｃａｒｅｓ作用性配列、構造配列の適当な組織特異的、発生
的転写にとって必要な遠位制御因子、並びに効率的な転写及び翻訳にとって重要
な付加的なｃａｒｅｓ配列（例えば、ポリアデニル化部位、ｍＲＮＡ安定性調節
配列）を含むポリヌクレオチド配列をさす。
【００５８】 本明細書で用いる「転写因子認識部位」及び「転写因子結合部位」とは、しば
しば直接的なタンパク質−ＤＮＡ結合の形態をとり、一つ又は複数の転写因子の
配列特異的相互作用のための部位として同定される、（一つ又は複数の）ポリヌ
クレオチド配列又は（一つ又は複数の）配列モチーフをさす。典型的には、転写
因子結合部位は、ＤＮＡフットプリント法、ゲル移動度シフトアッセイなどによ
り同定され、及び／又は既知のコンセンサス配列モチーフに基づき、もしくは当
業者に既知のその他の方法により推定されうる。例えば、本発明を限定するもの
ではないが、真核生物転写因子には、これらに限定されないが、ＮＦＡＴ、ＡＰ
１、ＡＰ−２、Ｓｐ１、ＯＣＴ−１、ＯＣＴ−２、ＯＡＰ、ＮＦ Ｂ、ＣＲＥＢ
、ＣＴＦ、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、Ｐｉｔ−１、Ｃ／ＥＢＰ、Ｓ
ＲＦが含まれる（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＰＪ ａｎｄ Ｔｉｊａｎ Ｒ（１９８９
）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：３７１）。本発明の目的のため、ステロイド受容体
、ステロイドスーパーファミリー受容体、その他の核内受容体、ＲＮＡポリメラ
ーゼ、及び配列特異的にＤＮＡと相互作用し、転写制御効果を発揮するその他の
タンパク質が、転写因子と見なされる。
【００５９】 本明細書で用いる「機能的に発現した」の用語は、転写、翻訳、（関連があれ
ば）翻訳後修飾される、タンパク質が所望の機能を提供するよう細胞内に位置す
るコーディング配列をさす。レポーターカセットに関して、機能的発現とは、一
般的に、レポーターポリヌクレオチドのリガンド誘導転写効果をレポートするた
めに統計的に有意な検出可能シグナルを提供するために充分な量の、コードされ
た細胞表面レポータータンパク質の産生を意味する。
【００６０】 「薬剤」の用語は、本明細書において、化学的化合物、化学的化合物の混合物
、空間的に局在する化合物のアレイ（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチドアレイ、ポ
リヌクレオチドアレイ、及び／又はコンビナトリアル小分子アレイ）、生物学的
巨大分子、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリー、バクテリオ
ファージ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）ディスプレイライブラリー、ポリソームペプ
チドディスプレイライブラリー、又は細菌、植物、真菌、もしくは動物（特に、
哺乳動物）の細胞もしくは組織のような生物学的材料から作成された抽出物を表
記するために用いられる。薬剤は、本明細書に記載の方法のスクリーニングアッ
セイなどに含まれることにより、核内受容体ゴニスト剤としての潜在的な活性に
ついて評価される。薬剤は、下記のスクリーニングアッセイに含まれることによ
り、特異的な核内受容体ゴニストとしての潜在的な活性について評価される。薬
剤は、ＬＢＤ−ＴＲＸ融合タンパク質のＬＢＤに対するリガンドとして働くこと
により、直接的に作用するかもしれないし、及び／又はＬＢＤを活性化するセカ
ンドメッセンジャー（例えば、ＬＢＤをリン酸化するキナーゼ、ＬＢＤのリガン
ドであるセカンドホルモンなど）を生じることにより間接的に作用するかもしれ
ない。「被検薬剤」とは、核内受容体のＬＢＤに対して、アゴニスト活性、アン
タゴニスト活性を有しているか、又は活性を有しないかを決定するため、本発明
の方法により評価される薬剤である。
【００６１】 本明細書で用いる「被検薬剤」の用語は、少なくとも約１×１０６Ｍ−１の親
和性で、予め決定された核内受容体ＬＢＤのリガンドとしてはたらく薬剤と同一
の化学的特性を有する薬剤である。典型的には、これらの特性は、小さいサイズ
（例えば、３，０００ダルトン未満のＭＷ）、疎水性、受容体ＬＢＤの既知のリ
ガンドとの構造的類似性、及び／又はコンピューターモデリングに基づき推定さ
れたＬＢＤ結合ポケットとの相互作用が含まれる。
【００６２】 本明細書で用いる「アゴニスト」の用語は、核内受容体の活性化を生じ、及び
／又は本発明の核内受容体シグナル伝達系と接触したとき、一つもしくは複数の
コアクチベータータンパク質とＬＢＤ−ＴＲＸ融合タンパク質との結合を実質的
に増加させ、及び／又は一つもしくは複数のコリプレッサータンパク質とＬＢＤ
−ＴＲＸ融合タンパク質との結合を解除する薬剤をさす。
【００６３】 本明細書で用いる「アンタゴニスト」の用語は、核内受容体ＬＢＤの既知のア
ゴニストのアゴニスト活性に対抗するか、又はコリプレッサータンパク質とＬＢ
Ｄ−ＴＲＸタンパク質との結合を増強もしくは安定化し、及び／又は一つもしく
は複数のコアクチベータータンパク質とＬＢＤ−ＴＲＸ融合タンパク質との結合
を阻害する薬剤をさす。
【００６４】 本明細書で用いる「生理的条件」の用語は、生存生物と適合性であり、及び／
又は生存培養された哺乳動物細胞の細胞内に典型的に存在する温度、ｐＨ、イオ
ン強度、粘性などの生化学的パラメータ、特に該哺乳動物細胞の核内に存在する
条件をさす。例えば、典型的な実験的培養条件下で増殖した哺乳動物細胞の核内
又は細胞質内の条件は、生理的条件である。イン・ビトロ転写カクテルのための
適当なイン・ビトロ反応条件は、一般的に生理的条件であり、多様な当分野にお
いて既知の核抽出物により例示される。一般に、イン・ビトロ生理的条件は、５
０〜２００ｍＭのＮａＣｌ又はＫＣｌ、ｐＨ６．５〜８．５、２０〜４５Ｃ、及
び０．００１〜１０ｍＭの二価陽イオン（例えば、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋）であり
、好ましくは約１５０ｍＭのＮａＣｌ又はＫＣｌ、ｐＨ７．２〜７．６、５ｍＭ
の二価陽イオンであり、しばしば０．０１〜１．０パーセントの非特異的タンパ
ク質（例えば、ＢＳＡ）を含む。非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ−４
０、トリトンＸ−１００）が、しばしば、通常約０．００１から２％、典型的に
は０．０５〜０．２％（ｖ／ｖ）で存在しうる。特定の水性条件は、従来の方法
に従い実務者により選択されうる。一般的な指針のため、以下の緩衝水性条件が
適用可能である。（一つ又は複数の）二価陽イオン、金属キレート形成剤、非イ
オン性界面活性剤、膜画分、消泡剤、及びシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎ
ｔ）が最適に添加された、１０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、５〜５０ｍＭのトリス
塩酸、ｐＨ５〜８。
【００６５】 本明細書で用いる「標識」又は「標識された」の用語は、検出可能マーカー、
例えば放射標識アミノ酸又は回収可能標識（例えば、アビジン又はストレプトア
ビジンにより回収されうるビオチニル部分）又はエピトープタグ又は付加された
触媒活性の取り込みをさす。回収可能標識には、相補的配列ポリヌクレオチドと
のハイブリダイゼーションにより回収されうる、共有結合したポリヌクレオ塩基
配列が含まれうる。ポリペプチド及びポリヌクレオチドを標識する様々な方法が
当分野において既知であり、用いられうる。標識の例には、これらに限定されな
いが、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、
蛍光もしくはリン光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍りん光
体（ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ））、酵素標識（例えば、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファ
ターゼ）、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される予め決定されたポリ
ペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、抗体の結合部位、転写
活性化因子ポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれる。い
くつかの実施形態において、例えば可能性のある立体障害を減少させるため、標
識は、様々な長さのスペーサーアームにより接着されうる。「標識された抗体」
は、接着した検出可能標識を有する一次抗体であっても、接着した検出可能標識
を有する二次抗体により検出されうる一次抗体であってもよい。
【００６６】 本明細書で用いる「統計的に有意な」の用語は、一般的に、対照アッセイ読み
出し値の少なくとも３つの別々の決定の平均値よりも上もしくは下の少なくとも
２つの標準偏差であり、及び／又は統計的に有意であることがスチューデントｔ
検定もしくはその他の当分野において認めらている統計的有意性の尺度により決
定された、結果（即ち、アッセイ読み出し）を意味する。 好ましい実施形態の説明 一般に、以下で使用される名称および下記の細胞培養、分子遺伝学および核酸
化学やハイブリダイゼーションにおける実験手続きは周知であって、従来技術で
通常用いられてきた。標準の技術が組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞
培養、およびトランスジーン組み込みに使用されている（たとえば電気穿孔法、
ミクロ注入法、リポフェクション法）。一般に酵素反応、オリゴヌクレオチド合
成および精製の段階はメーカー仕様に基づいて行われる。技術および手順は一般
に従来技術における従来方法および、本明細書さらには本明細書に参照として組
み込まれているＭａｎｉａｔｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎ：Ａ Ｌａｂｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９），２ｎｄ Ｅｄ．，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ
Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ
１５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ（１９８７），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを通して提供されているさまざまな一般的基準に基づき行わ
れる。各手順は従来技術において周知なものとされており、読者のための便宜を
図って提供されている。それらに含まれる情報はすべて参照により本文に取り込
まれている。
【００６７】 オリゴヌクレオチドは、応用バイオシステムオリゴヌクレオチドシンセサイザ
ー上で、メーカーが提供する仕様に基づいて合成される場合がある。
【００６８】 ＧｅｎＢａｎｄｋデータベースによりここで参照されている配列はすべて名称
をファイルしており（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｈｕｍａｔｃｔ４ａ）または
一般に利用可能な配列データベースや科学出版物のルーチン検索によって入手が
でき、またここに参照により取り込まれており、かつ重なりヌクレオチドまたは
その他の手段による配列の再構成によるなどして一般に利用可能である。
【００６９】 参照すべき出版物ははあらゆる目的のために、あらゆる図解、図表をふくめて
すべての出版物がここで再現されているかのように本文に取り込んでいる。 概説 一般に、本発明は、ＬＢＤを有するあらかじめ決定された核内受容体のアゴニ
ストまたはアンタゴニストである因子を特定する目的のために因子を発生させス
クリーニングするために用いられる方法、ポリヌクレオチド構造および宿主細胞
を含むものであり、ＬＢＤは第一段階ではアゴニストリガンドにより未結合であ
り、コアクチベータータンパク質、典型的には少なくとも一つのＬＸＸＬＬモチ
ーフを含むタンパク質に対して実質的に未結合のままであり、第二段階において
アゴニストリガンドにより結合し、前記コアクチベータータンパク質に結合する
可能性がある。一般に、これら各方法はアゴニストリガンドを検出するためにＬ
ＢＤ−ＴＲＸ融合タンパク質を使用する。アゴニストリガンドはＬＢＤ−ＴＲＸ
内でコンフォメーション変化を生じさせ、これによりコアクチベータータンパク
質への結合（またはコリプレッサータンパク質の解離）を可能にする結合部分を
活性化させ、前記結合部分はそうでなければ非リガンドＬＢＤにより実質的に抑
制されている。リガンド誘導ＬＢＤ変化の結果ＣＡ−ＴＲＸの結合を生じさせ、
レポーターカセットの機能的発現を生じさせるためにレポーターポリヌクレオチ
ドの転写を操作することができる、転写上活性な複合体を形成する。
【００７０】 本発明はリガンド結合の機能を他の転写因子の機能から分離し、これらの内部
タンパク質相互作用を特に有利に測定する方法で評価できる共因子結合活性に結
合する。
【００７１】 Ｗａｇｎｅｒら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１３６９，
Ｈｏｒｗｉｔｓ（１９９６）ｃｐ．ｃｉｔ、Ｇｌａｓｓら（１９９７）ｃｐ，ｃ
ｉｔ、およびＫｒｅｙら（１９９７）Ｍｏｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．３５：７７９
はリガンド依存的にコアクチベーターおよびコリプレッサーとのＬＢＤ相互作用
を同定する方法を記載している。
【００７２】 本発明は、核内受容体のＬＢＥをコンフォメーション的に活性化することがで
きるアゴニスト剤およびアンタゴニスト群を同定する作用剤バンクを高感度で、
確実にかつ自動的にスクリーニングする手段となる方法および組成物を提供する
。
【００７３】 （核内受容体ＬＢＤ） 本方法のためのＬＢＤを提供するのに適した核内受容体は、核内に配置されて
いるおよび／またはリガンド結合上の核に転位することができる受容体である。
隣接したまたはぴったりと結合した機能ドメインを抑制する制御可能ドメインを
有するような核内受容体（ここでそのような抑制は実質的にアゴニストリガンド
の結合によるようなアゴニスト刺激により制御可能ドメインの活性を助ける）が
使用に適している。しばしば、制御可能ドメインは、ステロイドホルモン、レチ
ノイドまたはその他の一般に疎水性の小形分子リガンドのような既知のリガンド
を結合している。もっとも多くの場合、リガンド結合およびドメイン活性化は、
特別リガンド形状および構造特徴に対して選択的な立体特異性方法において起こ
る。Ｒｉｂｉｅｒｏ ＲＣら（１９９５）ｏｐ．ｃｉｔはそのような核内受容体
のいくつかの総体的概説を示している。Ｇｌａｓｓら（１９９７）ｏｐ．ｃｉｔ
もまた核内受容体の例を提供している。
【００７４】 既知の核内受容体のリストには、ステロイド受容体スーパーファミリー（たと
えばエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ），アンドロゲ
ン受容体（ＡＲ））に限定することなく、グルココルチコイド（ＧＲ）、レチノ
イン酸（「ＲＡＲ」）、レチノイド−Ｘ受容体（「ＲＸＲ」）、ビタミンＤ受容
体（「ＶＤＲ」）、ペルオキシソーム増殖剤反応性受容体（たとえばＰＰＡＲ、
ＰＰＡＲおよびＰＰＡＲのような「ＰＰＡＲ」）、チロイドホルモン受容体（「
ＴＲ」）、ファルネゾイド受容体（「ＦＸＲ」）、昆虫エクジソン受容体（「Ｅ
ｃＲ」）、レチノイド−Ｚ受容体（「ＲＺＲ」）および従来技術において既知の
および／または公的な核酸およびタンパク質配列データベースのコンピュータ化
された同族検索により当業者が決定することができるようなその他の同族体遺伝
子が含まれる。Ｇｒｅｅｎら（１９９５）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３３３：１０１
はペルオキシソーム増殖剤反応性受容体（ＰＰＡＲ）を開示している。Ｇｒｅｉ
ｎｅｒら（１９９６）ＰＮＡＳ ９３：１０１０５、Ｃａｒｌｂｅｒｇら（１９
９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：７５７、Ｍｅｄｖｅｄｅｖら（１９
９６）Ｇｅｎｅ １８１：１９９およびＳｃｈｒａｄｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９７３２はＲＺＲ受容体を開示している。Ｋｅｐ
ｈａｒｔら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０：４０８はビタミ
ンＤ受容体（ＶＤＲｓ）を開示している。Ｋｏｚａｋら（１９９６）Ｍａｍｍ．
Ｇｅｎｏｍｅ．７：１６４はファルネゾイド受容体（ＦＸＲ）を開示している。
ステロイド受容体スーパーファミリーの配列は公共の配列データベースおよび出
版されている科学および特許明細書からたやすく得ることができる。各メンバー
に対するリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の同定は、ステロイドスーパーファミ
リー受容体を知るために配列同一性および構造同族に基づき当業者によって公表
されるかまたは決定されることが可能である。必要ならば所定の核内受容体のＬ
ＢＤの正確な境界線を決定するための通常の分析アッセイを、結合されたＳＳＲ
のリガンド誘導抑制を付与するために、断片のリガンド結合および／または保持
の直接欠失分析および測定により行ってもよい。
【００７５】 （ＬＢＤ−ＴＲＸ融合タンパク質） 補足ハイブリッドＣＡ−ＴＲＸまたはＣＲ−ＴＲＸ融合タンパク質のリガンド
活性化可能転写パートナーであるＬＢＤ−ＴＲＸ融合タンパク質をコードポリペ
プチドするは、非干渉配列の１〜約２５アミノ酸のポリペプチドスペーサーによ
り任意に分離された、ＴＲＸへのポリペプチド結合における核内受容体のＬＢＤ
を含んだタンパク質をコードするポリヌクレオチドから発現することが可能であ
る。
【００７６】 本発明の各側面において、ＬＢＯ−ＴＲＸのＬＢＤ部分は、ＬＢＤが誘導され
た天然発生核内受容体のＬＢＤ配列に比較されるような少なくとも一つの突然変
異を含む突然変異タンパク質である。
【００７７】 Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
２４：１４０４、Ｚｈａｎｇら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．２４：５４３およびＭｅｔｚｇｅｒら（１９９５）ＰＮＡＳ ９２：６９９
１は、ホルモン誘導Ｃｒｅ組換え酵素を生成するためのＣｒｅ組換え酵素へのホ
ルモン結合ドメインの融合を報告している。Ｌｏｇｉｅ ＣおよびＳｔｅｗａｒ
ｔ ＡＦ（１９９５）ｏｐ．ｃｉｔ．はＦＬＰ組換え酵素へのホルモン反応ドメ
インの融合を報告している。Ｋｏｌｂ ＡＦおよびＳｉｄｄｅｌｌ ＳＧ（１９
９６）Ｇｅｎｅ １８３：１もまたＣｒｅ組換え酵素への酵素活性融合を報告し
ている。このように、当業者はＬＢＤ−ＴＲＸのＬＢＤ部分に対する必要なコー
ドセグメントを得るための適切な核内受容体のタンパク質を同定することができ
る。便宜上、実務者はＬＢＤ配列を選択する場合追加手引きとしてそのような出
版物を参照してもよい。
【００７８】 （レポーターポリヌクレオチド） レポーターポリヌクレオチドユニットは、レポーターをコードする構造配列に
操作しやすく結合している転写制御配列を含んでいる。レポーターヌクレオチド
は、ＬＢＤ−ＴＲＸがその中でリガンドにより活性化されている細胞の信号対雑
音比を増幅できるよう、この基本フォーマットの一つまたは複数の直列反復を有
していてもよい。変形において、レポーターヌクレオチドユニットの少なくとも
二つの反復が存在し、信号を減少させる可能性のあるインターユニット部位特定
組換えの頻度を減少させるのに十分なスペーサーにより結合している。十分なス
ペースは非干渉配列のおよそ少なくとも１００〜２５０ヌクレオチドであると考
えられており、スペーサーポリヌクレオチド配列の長さを変えかつ最大レポータ
ー遺伝子発現のために最適な長さを決定することで経験的にたやすく口径を測定
することができる。１００ヌクレオチド未満または２５０ヌクレオチドを超える
スペーサーは実務者の判断で使用する場合がある。レポーターポリヌクレオチド
はＬＢＤ−ＴＲＸ（ＣＡ−ＴＲＸおよび／またはＣＲ−ＴＲＸ）発現カセット結
合していてもよく、または非結合であってもよい。
【００７９】 （レポータータンパク質） 従来技術で使用されているレポーター遺伝子には、従来の転写レポーター（た
とえば−ｇａｌ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＣＡＴ）、選択可能薬剤マーカー（ネオ、アラニンアミノ基トランスフ
ェラーゼ（ｇｐｔ）、ｔｋ）、アルカリ性ホスファターゼおよび緑色蛍光タンパ
ク質）が含まれる。
【００８０】 レポーター酵素は天然の全長のタンパク質または酵素機能断片およびそのよう
なもののアミノ酸配列変異体であってもよい。たとえば、酵素には分離すると酵
素活性を付与することができる単一ドメインを有するものもある。本発明におけ
る使用に適したレポーター遺伝子としてはクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（ＣＡＴ）、（Ａｌｔｏｎ ＆ Ｖａｐｎｅｋ（１９７９），Ｎａ
ｔｕｒｅ ２８２：８６４−８６９）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、アルカリ性
ホスファターゼ（Ｔｏｈら（１９８９），Ｆｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９
：２３１−２３８）およびガラクトシダーゼがある。ホタルルシフェラーゼが特
に適切である（ｄｅＷｅｔ（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ １３３：３−１４；ｄｅＷｅｔ ら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７８７０−７８７３；ｄｅＷｅｔら（１９８７）Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｏｌ．７：７２５−７３７）。ルシフェラーゼをコードするＤ
ＮＡがそこから誘導しうるホタルの４種は日本ゲンジボタル・ヘイケボタルＬｕ
ｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｄｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ、東ヨ
ーロッパボタルＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａおよび北米ボタル（Ｐｈ
ｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社よりプラスミドｐＧＥＭと
して市販されている）である。ツチボタルＬａｍｐｖｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃ
ａはＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓの配列に対して８４％配列同一性を有す
るさらに遠いルシフェラーゼ遺伝子源である。配列獲得レポーター酵素はゲノム
、ｃＤＮＡ、二つのハイブリッド、または合成であってもよい。本発明の利点は
、真核細胞プラズマ薄膜が実質的に不浸透性である基質を有するレポーター酵素
に対してもっとも有効である。すなわちそのような基質はそのような細胞により
、別の細胞からレポーター酵素を発現させる細胞を見分ける、容易に検出しうる
代謝産物を発生させるのに十分な量で捕獲されない。ルシフェラーゼ、アルカリ
性ホスファターゼおよびベータ−ガラクトシダーゼの基質のための場合がそうで
ある。
【００８１】 あるタイプのオフレポータータンパク質には天然発生細胞表面タンパク質の配
列が含まれ（たとえば、ヒトＣＤ８、薄膜結合μ免疫グロブリン、グリコホリン
Ａ）または融合タンパク質（たとえばａ−ガラクトシダーゼ／−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼ融合タンパク質）であってもよい。好ましくは細胞表面レポー
タータンパク質は、宿主細胞上では通常発現されないタンパク質または異種構造
（すなわち異なる種に由来する）であり、そのため細胞表面レポーターは、たと
えば種特異性抗体と共に、宿主細胞表面上に天然発生する細胞表面タンパク質か
ら識別することが可能である。より好ましくは、細胞表面レポータータンパク質
は異種構造であると同時に宿主細胞上に通常発現されないタンパク質である。た
とえば、ネズミ肝腫瘍細胞は通常有意な量のＣＤ８タンパク質、細胞毒性Ｔリン
パ球の特性を示すタンパク質を発現させない。ネズミ肝腫瘍細胞に関して、ヒト
ＣＤ８タンパク質を含む細胞表面レポーターは、異種構造であると同時に細胞タ
イプ（すなわち肝細胞）上で通常発現されないタンパク質である。細胞表面レポ
ーターの構造的配列は、融合された真核生物（たとえ−ガラクトシダーゼのよう
な細菌性配列）内で、正確なリーディングフレーム内において、トランス薄膜タ
ンパク質（たとえばヒト−グルタミルトランスペプチダーゼ重サブユニット、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ：Ｈｕｍｇｇｔ，Ｈｕｍｇｇｔｘ，Ｇｏｏｄｓｐｅｅｄら（１９８
９）Ｇｅｎｅ ７６：１，参照としてここに組み込まれる）の細胞外タンパク質
内では天然発生しないセグメントを有する融合タンパク質をコードするポリヌク
レオチド配列を含んでいてもよい。
【００８２】 （宿主細胞） 宿主細胞には典型的には哺乳類細胞および酵母、昆虫細胞および菌類のような
その他のタイプの真核細胞がある。トランスフェクションに敏感に反応する不死
化宿主細胞培養およびイン・ビトロ細胞培養および遺伝子工学において一般的に
用いられる種類の細胞培養が好ましい（たとえばヒーラー細胞、ＫＢ細胞、ＪＷ
−２細胞、デトロイト６細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ−１細胞、ＶＥＲＯ細胞および
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）。トランスジェニック動物を発生するために用いられる胚
細胞もまた適切である（たとえば接合子、胚幹細胞）。細胞タイプは融合タンパ
ク質をコードするレポーター構成を発現できるものでなければならない。宿主細
胞は一般に哺乳類細胞、もっとも好ましくはＨｅｐＧ２、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、
ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＥＢＶ−不死化リンパ球のような哺乳類細
胞株またはその他の当技術で利用可能な細胞株である。適切な細胞株は、アメリ
カンタイプ培養コレクション（本文献に挿入された「細胞株およびハイブリドー
マのＡＴＣＣカタログ」、アメリカンタイプ培養コレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌ、ＭＤ）を含むさまざまな出典から得られてもよい。代替として、リンパ球、
造血幹細胞および一次肝細胞のような一次細胞外植体と共に本発明を実行するこ
とが可能である。
【００８３】 さまざまな宿主細胞は実務者の判断で選択されてもよい。宿主細胞の選択は一
般に、レポーターポリヌクレオチドの転写制御配列から転写を持続させる細胞の
能力に基づいて行う。
【００８４】 レポーターポリヌクレオチドおよび融合タンパク質発現カセットを収容してい
る宿主細胞はレポーター宿主細胞である。レポーター宿主細胞は、複製可能エピ
ゾーム、非相同的に統合されたトランスジーン、相同的に目標とされた配列、人
工クロモゾームまたは一過性非複製ポリヌクレオチドのようないくつかのフォー
マットのいずれかにレポーターポリヌクレオチドを収容していてもよい。レポー
ター宿主細胞は、レポーター配列に実行可能に結合されている転写制御配列を含
む、かつ構造的要素および制御的要素のどちらにも及ぶ単一ポリヌクレオチド配
列と見なされる場合、天然発生ポリヌクレオチド配列として宿主細胞ゲノム内に
存在しないレポーターポリヌクレオチドの検出可能な存在になどによって容易に
同定されうる。
【００８５】 特殊タンパク質―タンパク質相互作用は大概の細胞および有機的機能に基本的
なものである。ポリペプチド相互作用は、機能的転写複合体、シグナルトランス
ダクション経路、細胞骨格生物体（たとえば微小管重合）、ポリペプチドホルモ
ン受容体リガンド結合、マルチサブユニット酵素複合体等の形成に関わる。
【００８６】 （ツーハイブリッド相互作用システム） 生理学的条件下のタンパク質管相互作用の研究には問題あった。関心が向けら
れているタンパク質に結合しているタンパク質を特定するのに相当な努力が払わ
れた。一般に、これらの相互作用は共沈殿実験装置を用いて検出されてきた。実
験装置内では既知のタンパク質に抗体を細胞抽出物と共に混合させ、この既知の
タンパク質およびこのタンパク質と安定的に結合している何らかのタンパク質を
沈殿するのに用いる。この方法にはいくつかの問題点がある。たとえば（１）生
理学的細胞内条件下よりも細胞抽出物条件で結合しているタンパク質だけを検出
する、（２）効率のよい共免疫沈降反応に対して十分な長さおよび安定性で既知
のタンパク質に結合しているタンパク質だけを検出する、（３）抗体結合上の既
知のタンパク質から転置した連合したタンパク質を検出する。このようなまたそ
の他の理由から、既知のタンパク質と相互作用するタンパク質を特定する方法の
改良が進んだ。
【００８７】 （ツーハイブリッドシステム） 一つのアプローチは、融合タンパク質内に存在する事前決定されたポリペプチ
ド配列に結合したポリペプチド配列を特定するためのいわゆるツーハイブリッド
システムを使用することであった（Ｃｈｉｅｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：９５７８）。このアプローチは転写活
性化因子（Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ ａｎｄ Ｓｓｏｎｇ Ｏ（１９８９）Ｎａｔｕｅ
３４０：２４５）、酵母Ｇａ１４転写タンパク質の再構成を通してイン・ビボ
のタンパク質―タンパク質相互作用を同定するものである。本方法は、ＤＮＡ−
結合および転写活性に関係する分離可能ドメインで構成される酵母Ｇａ１４タン
パク質に基づくものである。一つは、既知のタンパク質のポリペプチド配列に融
合された酵母Ｇａ１４ＤＮＡ−結合ドメインで構成され、他方は第２タンパク質
のポリペプチド配列に融合されたＧａ１４活性化ドメインから構成されている２
つのハイブリッドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを構成し酵母宿主細
胞内に導入する。二つの融合タンパク質間の細胞間結合がＧａ１４ＤＮＡ−結合
ドメインをＧａ１４活性化ドメインと共に再構成し、これによりＧａ１４結合部
位に操作可能に連結しているレポーター遺伝子（たとえばｌａｃＺ、ＨＩＳ３）
の転写を活性させる。一般にツーハイブリッド方法は、既知タンパク質と相互作
用する新しいポリペプチド配列を特定するために使われる（Ｓｉｌｖｅｒ ＳＣ
ａｎｄ Ｈｕｎｔ ＳＷ（１９９３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１５
５；Ｄｕｒｆｅｅら（１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．７；５５５；Ｙａｎ
ｇら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：６８０；Ｌｕｂａｎら（１９９３）
Ｃｅｌｌ ７３：１０６７；Ｈａｒｄｙら（１９９２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ
．６；８０１；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４
：９２０；およびＶｏｊｔｅｋら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４；２０５）。しか
しながら、ツーハイブリッド方法の変形が、その結合を第２の既知タンパク質に
及ぼす既知のタンパク質の突然変異を同定するのに用いられてきた（Ｌｉ Ｂ
ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ（１９９３）ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：９５７；Ｌａｌｏ
ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０：５５
２４；Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３；２８
９９；およびＭａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１
２０４６）。ツーハイブリッドシステムはまた二つの既知のタンパク質の相互作
用する構造ドメイン（Ｂａｒｄｗｅｌｌら（１９９３）ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．８：１１７７；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６７：１７４９８；Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：４６０８；およびＭｉｌｎｅ ＧＴ ａｎｄ Ｗｅａｖ
ｅｒ ＤＴ（１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅ．７；１７５５）または単一タン
パク質の低重合体に関するドメイン（Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅ ８；１６９３；Ｂｏｇｅｒｄら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：
５０３０）を同定するために使われてきた。ツーハイブリッドシステムの変形は
タンパク質分解酵素のイン・ビボ活性を研究するために用いられてきた（Ｄａｓ
ｍａｈａｐａｔｒａら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｒｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（ＵＳＡ）８９：４１５９）。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ／ＢＣＣＰ相互作用スク
リーニングシステム（Ｇｅｒｍｉｎｏら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｒｔｌ，Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０：９３３；ｇｕａｒｅｎｔｅ Ｌ（１９９３）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｒｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０：１６３９）は相互
作用するタンパク質配列を特定するために用いることができる（すなわちヘテロ
二量化またはより順位の高いヘテロ多重体からのタンパク質配列）。
【００８８】 これらのツーハイブリッド方法のそれぞれは、二つのＧａ１４融合タンパク質
間の正結合に依るものであり、その結果Ｇａ１４結合部位に操作可能に連結して
いるレポーター遺伝子の転写を誘発する機能的Ｇａ１４転写活性化因子を再構成
する。レポーター遺伝子の転写は、一般に（１）比色分析酵素評価により特定す
ることが可能な酵素活性（たとえばガラクトシダーゼ）としてまたは（２）限定
された媒体（たとえばＨＩＳ３）上の強化細胞成長として出現する正読み出しを
生ずる。したがってこれらの方法はポリペプチド配列の正相互作用を特定するの
に好都合であるが、二つのポリペプチド配列間の細胞間連合を部分的に変える（
たとえば阻害する）因子または条件を特定するには向いていない。
【００８９】 （逆ツーハイブリッドシステム） 逆ツーハイブリッドシステムとしてここで参照している一般的方法が提供され
ており、ここでは、二つの相互作用ポリペプチド（ＬＢＤおよびＣＡまたはＣＲ
ドメインのどちらか）間の細胞間結合を分裂させる因子がこの方法によって分離
可能なおよび／または検出可能な読み出しを発生させる（たとえば、栄養要求性
表現型の相補、検出可能レポーター分子の発現、等）。一般的には逆ツーハイブ
リッド方法は、因子が相互作用ポリペプチドの分子間結合を遮断するまたは阻害
する条件下で正読み出しを生ずる。一般に正読み出し条件は以下の一つまたはそ
れ以上の検出可能条件として特定される；すなわち（１）あらかじめ決定された
レポーター遺伝子の増大した転写率、（２）一般的にはイン・ビボで容易にアッ
セイ価することができる酵素のような、あらかじめ決定されたレポーター遺伝子
によりコードされるポリペプチド産物の増大した濃縮度または発生量、および／
または（３）逆ツーハイブリッドシステムを収容する有機体（たとえば酵母）内
での選択可能または同定可能表現型の変化。一般に、正読み出し条件を特徴づけ
る選択可能または同定可能表現型変化は有機体上に、定義された媒体の選択的成
長優位、交配表現型、特徴的な形態または発展段階、耐薬性、または検出可能酵
素活性（たとえば−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファタ
ーゼ、等）のいずれかを付与する。この方法では、二つの予備決定相互作用ポリ
ペプチド間の分子間結合を阻害する因子（ポリペプチド、小分子およびオリゴヌ
クレオチドなどがあるがこれに限定されない）を効果的に特定することができる
。
【００９０】 本発明の一つの側面で、逆ツーハイブリッドシステムは、（１）第１ハイブリ
ッドタンパク質（たとえばＬＢＤ−ＴＲＸ）、（２）制御条件下に第１ハイブリ
ッドタンパク質に結合している第ツーハイブリッドタンパク質（たとえば、ＣＡ
−ＴＲＸまたはＣＲ−ＴＲＸ）、（３）互いに機能的に結合している第１ハイブ
リッドタンパク質および第２ハイブリッドタンパク質の結果として効果的に発現
するリレー（またはシグナル変換）遺伝子、および（４）リレー（またはシグナ
ル変換）遺伝子の産物が実質的に不存在である場合は効果的に発現し、リレー（
またはシグナル変換）遺伝子産物が効果的に発現している場合はほとんど発現し
ないかまたは全く発現しないレポーター遺伝子で構成される。第１ハイブリッド
タンパク質と第２ハイブリッドタンパク質とは互いに、相互作用ポリペプチドセ
グメントを通して結合されている（すなわち、好ましくは第１ハイブリッドタン
パク質の部分が、第１および第２ハイブリッドタンパク質を含むヘテロ二量体ま
たはより順位の高いヘテロ多重体を形成する第２ハイブリッドタンパク質の部分
に結合している；前記各ハイブリッドタンパク質の結合部分は「相互作用ポリペ
プチドセグメント」と呼ばれる）。
【００９１】 第１ハイブリッドタンパク質には、（１）ポリペプチド結合内の第１相互作用
ポリペプチド配列（ＬＢＤ）、（２）転写活性化因子タンパク質またはその他Ｄ
ＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ−結合ドメイン（たとえばリプレッサー）を含む。
第２ハイブリッドタンパク質は、（１）制御条件下に（たとえば、生理学的条件
および因子の不存在）第１相互作用ポリペプチド配列と分子間結合を形成するこ
とができる第２相互作用ポリペプチド配列（ＣＡまたはＣＲ）、（２）第１ハイ
ブリッドタンパク質および第２ハイブリッドタンパク質間の分子間結合（相互作
用ポリペプチド配列を経て）が行われ、それにより第１ハイブリッドタンパク質
のＤＮＡ−結合ドメインを転写活性化因子機能を発生させる第２の活性化ドメイ
ンを結合する転写活性化因子タンパク質の活性化ドメインを含む。一般に第１ハ
イブリッドタンパク質および第２ハイブリッドタンパク質は、宿主有機体内で構
造的に発現するポリヌクレオチドによりコードされる（たとえば真核細胞または
原核細胞、または多細胞有機体）。
【００９２】 リレー遺伝子（またはシグナル変換遺伝子と呼ばれる）は、第１ハイブリッド
タンパク質の第２ハイブリッドタンパク質への分子間結合により形成される転写
活性化因子により明確に制御される転写制御配列（「リレー転写制御配列」）に
操作可能に結合している。このため第１ハイブリッドタンパク質が（相互作用ポ
リペプチド配列を介して）第２ハイブリッドタンパク質に結合しているとき、形
成された転写活性化因子はそれによって、リレー遺伝子に操作可能に結合してい
る転写制御配列に結合し、かつリレー遺伝子の正味の転写を増大させる。リレー
遺伝子はレポーター遺伝子の転写を抑制するタンパク質をコードする。たとえば
第１および第２ハイブリッドタンパク質が互いに機能的に結合しているとき、リ
レー遺伝子が発現しそれによってレポーター遺伝子の転写を抑制する。実施形態
において、このようなリレー遺伝子は、従来技術において「転写の負の制御因子
」としてしばしば引用されるタイプのものである。本発明の実施形態において、
リレー遺伝子は酵母中の転写の負の因子であるが、たとえばＧＡＬ８０遺伝子を
酵母中でリレー遺伝子として利用することができるが、これに限定されない。宿
主有機体を逆ツーハイブリッドシステムを収容するために使用する実施形態では
、リレー遺伝子は多くの場合宿主有機体種の生殖細胞ＤＮＡ内で天然発生する遺
伝子であり、しばしば内因性生殖細胞遺伝子であってもよく、あるいは外因性Ｄ
ＮＡ（たとえば「ノックアウトバックグランド」）として宿主有機体内に導入さ
れてもよく、一般的には対応する機能的内生遺伝子が無い宿主ゲノム内に導入さ
れる。
【００９３】 レポーター遺伝子は、リレー遺伝子の遺伝子産物により負に調節され、リレー
遺伝子産物の不存在下では誘発される転写制御配列（「レポーター転写制御配列
」）に操作可能に結合している。したがって、レポーター遺伝子の転写は、二つ
のハイブリッドタンパク質が互いに結合し、リレー遺伝子の転写を増大させる転
写活性化因子を形成している条件下（たとえば因子不存在の生理学的条件）では
抑制される。一般に、リレー遺伝子産物は、レポーター遺伝子に操作可能に連結
している転写制御配列に結合しており、またはレポーター遺伝子に操作可能に連
結している転写制御配列に結合している転写タンパク質に結合している。レポー
ター遺伝子転写制御配列におよび／またはリレー遺伝子の構造的発現に必要な転
写タンパク質に結合しているリレー遺伝子の結果として、レポーター遺伝子の正
味転写率は減少する（または完全に遮断される）。正読み出しを生じるレポータ
ー遺伝子のどれを使用してもよい。たとえば制限することなく、適切なレポータ
ー遺伝子は、（１）レポーター遺伝子が効果的に発現している細胞に選択可能表
現型を付与する、および／または（２）原位置でアッセイ等により都合よく検出
される遺伝子産物をコードする遺伝子である。選択可能表現型を付与する適切な
遺伝子は、宿主有機体（たとえば酵母ＨＩＳ３）内で栄養要求性突然変異を補足
する遺伝子、耐薬性（たとえばネオＲ）をコードする遺伝子、細胞増殖を誘発す
る遺伝子、およびその発現で選択的成長優位を付与するその他の遺伝子等がよい
例であるが、これらに限定されるものではない。原位置で都合よく検出される遺
伝子産物をコードする適切な遺伝子は、−ガラクトシダーゼ（たとえばＥ．ｃｏ
ｌｉ ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ホースラディ
ッシュペロキシダーゼ、等がよい例であるが、これらに限定されるものではない
。
【００９４】 本発明は第１ハイブリッドタンパク質および第２ハイブリッドタンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドは転写活性
化因子のＤＮＡ−結合ドメインまたは活性化ドメインをコードし、一つまたはそ
れ以上の相互作用ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの、リーディ
ングフレーム内での、隣接挿入のためのクローニング部位を都合よく有すること
が可能である。典型的には第１ポリヌクレオチドは、第１予備決定相互作用ポリ
ペプチド配列および転写活性化因子のＤＮＡ−結合ドメインから構成される第１
ハイブリッドタンパク質をコードし、第２ポリヌクレオチドは、第２予備決定相
互作用ポリペプチド配列および転写活性化因子の活性化ドメインから構成される
第２ハイブリッドタンパク質をコードし、ここで、第１ハイブリッドタンパク質
のＤＮＡ−結合ドメインは、活性化ドメインとの再構成が可能で、機能的転写活
性化因子を形成することができる。往々にして、ハイブリッドタンパク質ペアの
ＤＮＡ−結合ドメインおよび活性化ドメインは同じ天然発生転写活性化因子（た
とえばＧａｌ4）から誘導される。しかしながら当業者は、天然発生しない機能 的転写活性化因子から再構成できる別の転写活性化因子からＤＮＡ−結合ドメイ
ンおよび活性化因子を選択してもよい（たとえば細菌性ｌｅｘＡタンパク質のＤ
ＮＡ−結合ドメインはウイルス性タンパク質からの転写活性化因子と共に使用し
てもよい、ＶＰ１６；Ｖｏｊｔｅｋら（１９９３）ｏｐ．ｃｉｔ．）。このよう
なポリヌクレオチドの転写および翻訳により、相互作用ポリペプチド部分および
転写活性化因子のＤＮＡ−結合ドメインまたは活性化ドメインから構成されるハ
イブリッド（または融合）タンパク質を生成する。
【００９５】 本発明はまたリレー（またはシグナル変換）遺伝子を含むポリヌクレオチドを
提供する。リレー（またはシグナル変換）遺伝子は予備決定レポーター遺伝子の
発現（一般的には転写）を阻害または抑制するタンパク質をコードする。もっと
も多くの場合リレー遺伝子は予備決定遺伝子または遺伝子類のための転写の負の
制御因子である。実施形態において、リレー遺伝子はポリヌクレオチド配列に結
合し、それによりシス−結合または操作可能に結合した配列の転写を阻害する転
写リプレッサータンパク質である。別の実施形態において、リレー遺伝子は予備
決定遺伝子または遺伝子類の転写の正制御因子であり、結合の結果正制御因子の
転写活性を阻害するタンパク質に結合する。そのようなリレー遺伝子のうちの一
つが転写制御因子の一つまたは複数の活性ドメインに結合しこれを遮断している
。多くの適切なリレータンパク質が当業者に知られているが、リレータンパク質
のカテゴリーでは腫瘍抑制タンパク質ｐ５３の転写ドメインを結合する哺乳類ｍ
ｄｍ２腫瘍タンパク質、およびＧａ１４の活性ドメインを結合しこれを不活性に
するＧａ１８０酵母がよい例である。実施形態において、リレータンパク質には
、天然発生同族リレータンパク質と比較して、イン・ビボでのリレータンパク質
の安定性を弱める突然変異、付加、欠失を含む。リレータンパク質は、正転写シ
グナル（二つのハイブリッドタンパク質による機能的な転写活性化因子の再構成
）と負の転写シグナルに転化することで、予備決定レポーター遺伝子の転写を弱
めることに役立つため、シグナル変換タンパク質として見なすこともできる。一
般に、リレータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、二つのハイブリッド
タンパク質のＤＮＡ−結合ドメインおよび活性ドメインの機能的再構成に依存す
るリレー遺伝子の転写を生じさせるリレー転写制御配列に操作可能に連結してい
る。たとえばこのようなリレー転写制御配列は、プロモーターおよび、二つハイ
ブリッドタンパク質の連合により形成された再構成された機能的転写活性化因子
に結合する一つまたはそれ以上の部位を含むポリヌクレオチド配列を含む場合が
あるが、それに限定されない。たとえば、転写活性化因子複合体がＤＮＡ−結合
ドメインを含むなら、リレー遺伝子に操作可能に連結したリレー転写制御配列は
、縦一列に整列した一つまたはそれ以上のｌｅｘＡ結合部位を有していてもよい
。
【００９６】 ツーハイブリッドシステムの別の側面は、あらゆる目的のために本文に参照し
て組み込まれている米国特許第５，５２５，４９０号に記載されている。
【００９７】 （その他の側面） 本発明は予備決定核内受容体のアゴニストリガンドを同定するための方法を提
供する。本方法は以下のことを含む。
【００９８】 （１）被検薬剤を（２）受容体細胞の個体群と接触させることで因子処理宿主
細胞を形成する ＬＢＤ−ＴＲＸ融合タンパク質およびＣＡ−ＴＲＸ（またはＣＲ−ＴＲＸ）を
含むリガンド複合体がある場合はその形成を考慮して、被検薬剤を核に配置する
のに十分な適切な培養期間のための培養条件下で因子処理宿主細胞を形成する；
および アゴニストリガンドとして、実質的に同一の条件下でかつ被検薬剤を欠いてい
る、培養した非処理宿主細胞の参照個体群と比較して、因子処理宿主細胞の個体
群中レポータータンパク質の検出可能な発現において統計的に有意な増加を生じ
させる被検薬剤を特定する。
【００９９】 本方法の一つの側面で、被検薬剤は少なくとも１種の小細胞（Ｍ．Ｗ．＜３，
０００ダルトン）から成る。本方法の一つの側面において、被検薬剤は脂肪親和
性化合物である。実施形態において、被検薬剤はステロイド、レチノイド、チロ
キシン類似物、ビタミンＤ誘導体、または多環式芳香性炭化水素である。実施形
態において、未処理宿主細胞は、被検薬剤の代わりにビヒクルまたは既知の不活
性物質と接触させる。多くの場合、非干渉アミノ酸配列（熟練者により選択され
てもよくかつ過度の実験を必要とせず経験的に決定されてもよい）の１からおよ
そ１００までのアミノ酸のスペーサーポリペプチド配列は、ＬＢＤセグメントと
ＴＲＸセグメントとのおよび／またはＣＡ（またはＣＲ）セグメントとその連結
したＴＲＸセグメントとの間のポリペプチド連鎖の中にあり、潜在的な立体妨害
を減少させている。
【０１００】 一つの側面において本方法は、予備決定核内受容体関連したアゴニストまたは
アンタゴニスト活性に対する被検薬剤コレクションの有効性および／または強度
（または他の薬理学的特性）をランク付けするために用いる。被検薬剤のコレク
ション（またはライブラリー）を、個々の被検薬剤種の平行スクリーニングによ
りまたはまたは関連する構造上の特徴を有する被検薬剤の複数のプールの中でス
クリーニングしてもよく、受容体宿主細胞の個体群の中においてＬＢＤ−ＴＲＸ
の用量依存および／または時間依存活性を引き出すために各被検薬剤種またはそ
のプールの能力を決定する。本方法は一般的にはレポーター宿主細胞の個体群を
用い、この個体群はマルチウェル培養皿（たとえば９６マイクロ滴定量皿）のウ
ェルの中にたとえば実質的に同一の条件下に培養される複数の下位個体群に細別
され、実質的に同一の条件に置かれるほぼ等価受容体宿主細胞の副次集団を個々
に有する一つの培養皿コレクション（たとえば各ウェル）を形成する。各培養皿
（たとえばウェル）に、被検薬剤または被検薬剤のプールの予備決定した量また
は濃度を加え、所定の被検薬剤種またはプールに対して、複数の用量レベルまた
は濃度が培養皿のコレクションの中で示される。たとえば、９６ウェルプレート
は明確な被検薬剤種を示した各横行および一連の予備決定用量または濃度（また
は未知の濃度のストック被検薬剤溶液の予備決定希釈比）を示した縦行を有して
いてもよい。被検薬剤またはプールの添加に続いて、被検薬剤またはプールにさ
らされたレポーター宿主細胞を入れた培養皿を適切なインキュベーション条件下
に（たとえば従来の細胞培養条件）、レポーター宿主細胞中のＬＢＤ−ＳＳＲの
ＬＢＤ部分が得られた方の核内受容体期間に続いてまたはその間に、細胞表面レ
ポータータンパク質の発現を各培養皿から検出し、実質的に同一の条件下で培養
されしかし被検薬剤を欠いた、しかしバックグラウンドレポーター発現を確立す
るために対照として、被検薬剤を加えるために用いられるビヒクルを与えた、レ
ポーター宿主細胞を入れた平行培養皿中の細胞表面レポーターの発現レベルと比
較する。所望であれば、各培養皿の細胞表面レポーター発現を検出し、複数の時
点で計量を行って、各被検薬剤またはプールについて活性の時間経過を決定する
ことも可能である。各培養皿中の細胞表面レポーター発現の量を比較することで
、用量反応曲線（たとえば細胞表面レポーター発現が反応であるような）および
／または活性化時間曲線を各被検薬剤およびプールについて計算し、各被検薬剤
およびプールの薬理学上のプロフィールを決定することが可能である。例示的な
薬理学的パラメーターには、たとえば特にＥＤ５０結合定数、活性潜在期などが
あってもよい。各被検薬剤およびプールは、実質的に同一の条件下でこのように
して得られた用量−反応データに基づいて評価した別の被検薬剤またはプールに
比例してランク付けしてもよく、望ましい薬理学的パラメーターを有する好まし
い被検薬剤をそれによって識別することができる。
【０１０１】 本発明はまた、ＬＢＤ−ＳＳＲ融合をコードする発現ポリヌクレオチド、本発
明のレポーターポリヌクレオチドおよび任意に適切な宿主細胞、および任意に使
用説明書を含むキットを提供する。別の方法として、キットはまた第２ポリヌク
レオチドを含んでおり、前記第２ポリヌクレオチドは第２ポリヌクレオチドの特
定部位再結合が行われた宿主細胞に対して選択可能表現型を付与する。実施形態
において、キットは、予備決定核内受容体のリガンドに対してアゴニストおよび
／またはアンタゴニストを同定するための、被検薬剤スクリーニングアッセイで
使用するのに適したレポーター細胞を含んでいる。
【０１０２】 本発明は理解が明快に成るために図示を用いてある程度詳細に説明を行ったが
、若干の変更および修正は本特許請求の範囲内で行われ得ることが明らかである
。下記の実験に基づく実施例は例証として提示されており、いずれの方法におい
ても本発明を限定するものではない。
【０１０３】
【実験例】 （概説） 核内受容体を高度処理量スクリーニングで使用するために特定し類別するため
の手段としての核内受容体：活性化因子相互作用の使用の評価を行った。酵素に
よる読み出し（エリザ）と共にイン・ビトロで使用するのに適した直接相互作用
アッセイが、ＴＲ（チロイドホルモン受容体）または（エストロゲン受容体）リ
ガンド−結合ドメイン（ＬＢＤｓ）およびコアクチベータータンパク質の断片、
ＳＲＣ−１を含む融合タンパク質を用いて構成された。特定リガンド依存相互作
用の証明を行った。
【０１０４】 レポーター遺伝子および二つのハイブリッド分子を含むツーハイブリッドシス
テムを有する哺乳類細胞株：一つはＶＰ１６酸活性ドメインに融合された核内受
容体ＬＢＤ（ＴＲまたはＥＲ）を有し、第２は、Ｇａ１４ＤＮＡ−結合ドメイン
に融合された少なくとも一つのロイシン荷電ドメイン（ＬＣＤ）を有するコアク
チベータータンパク質の断片を含み、ここでは二つのハイブリッドが、レポータ
ー遺伝子に関する転写活性の再構成に導くリガンド依存方法において相互作用が
可能である。ＳＲＣ−１の第３ＬＣＤが、ＴＲおよびＥＲ ＬＢＤｓとの相互作
用のためには不可欠であることが分かり、第２ＬＣＤは好ましくはＴＲよりはむ
しろＥＲと相互作用することがわかった。さらに、コリプレッサータンパク質の
断片ＳＭＲＴおよびＮｃｏＲからのＴｒ’ＬＢＤのリガンド依存解離はこのフォ
ーマットで立証された。これらコリプレッサー断片とＥＲ ＬＢＤとの間の検出
不可能相互作用はリガンドの不存在下で観察された。ＴＲおよび／またはＥＲ転
写活性化因子と相互作用する新たなペプチドモチーフは受容体およびリガンド−
特質方法において機能する。大幅に無作為でかつ集中させた（ロイシン荷電モチ
ーフ上に集めた）組換え型ペプチド多様性ライブラリーをスクリーニングし、特
にＥＲと相互作用する新たな配列を認識した。エストラジオールはこれらの新規
ペプチドの能力を高めＥＲと相互作用させる。
【０１０５】 例 １：直接相互作用アッセイ 図１は、核内受容体ＬＢＤと、ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲ
Ｃ−１）の結合断片との相互作用を測るための直接相互作用アッセイフォーマッ
ト（エリザ）の例示実施形態の略図である。核内受容体のＬＢＤ（ＥＲ＝エスト
ロゲン受容体、ＴＲ／＝チロイドホルモン受容体または型）はインフレームでグ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ配列（ＧＳＴ）に融合し、プラスチック９６
−ウェルプレートへの静電気結合によるような、ウェル表面として現れている基
質上に固定されている核内受容体ＬＢＤに対する結合部分を形成した。コアクチ
ベーター部分は、アミノ末端でＧＳＴ／ＭＢＰにインフレームで融合され、かつ
カルボキシ末端で抗体１７９エピトープタグにインフレームで融合されたＳＲＣ
−１の３ロイシン荷電ドメイン（ＬＣＤｓ）を含んでいる。ＬＣＤ配列が示され
ている。固定されたＬＢＤに結合しているＳＲＣ−１融合部分が、特に１７９エ
ピトープと相互作用するネズミ抗体および第２抗体（接合抗ネズミＡｂにコンジ
ュゲートされたアルカリ性ホスファターゼ）と共に検出された。図２は、ＳＲＣ
−１と相互作用するＥＲ ＬＢＤを用いた直接相互作用アッセイの結果を示して
いる。精製した０．５μｇのＧＳＴ−ＥＲを、ＧＳＴ−ＳＲＣ−１を含む、さま
ざまな量の未加工細菌性溶解物と共に使用した。相互作用は特異的であり（ＧＳ
Ｔ制御）かつエストラジオールにより増大した。図３は、ＳＲＣ−１と相互作用
するＥＲ ＬＢＤを用いた直接相互作用アッセイの結果を示している。精製した
０．５μｇのＧＳＴ−ＥＲを、ＧＳＴ−ＳＲＣ−１を含む未加工細菌性溶解物の
量をさまざまに変化させてこれと共に使用した。相互作用は特異的であり（ＧＳ
Ｔ制御）かつエストラジオールにより増大した。図４は、ＳＲＣ−１と相互作用
するＴＲおよびＴＲ ＬＢＤｓの直接相互作用アッセイの結果示している。ＧＳ
Ｔ融合タンパク質を提示されている量使用した。相互作用は特異的であり、Ｔ３
に依存している。図５は、ＴＲとＴＲ ＬＢＤｓとＳＲＣ−１との間の相互作用
を促進させてＴ３の用量−反応曲線のような直接相互作用アッセイの結果を示し
ている。Ｔ３は受容体上により強く出現した。直接タンパク質間相互作用は、当
業者に明らかな数あるフォーマットの中でも特にファージ−ｄｉｐｌａｙｅｄタ
ンパク質および精製タンパク質含むさまざまなフォーマットで、無細胞システム
中で検出が可能である。
【０１０６】 例 ２：正ハイブリッド系：コアクチベーター 図６は、使用されたＬＲＢ−ＴＲＸ、ＣＡ−ＴＲＸおよびＣＲ−ＴＲＴ構造お
よびツーハイブリッドシステムのレポーターポリヌクレオチドの略図である。「
受容体」は、結合リガンド（Ｌ）を有する一般的核内受容体（ＮＲ）ＬＢＤによ
り例証されるＬＢＤおよびＶＰ１６酸性活性ドメイン（ＶＰ１６）により代表さ
れるＴＲＸドメインと共に、ＬＢＤ−ＴＲＸを示している。「コアクチベーター
」は、ＳＲＣ−１タンパク質の部分、ＣＢＰタンパク質の部分、またはこれらの
タンパク質から分離したＬＣＤ配列である典型的ＣＡ種と共にＣＡーＴＲＸを示
しており、ＴＲＸドメインはＧａ１４ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）として例証
されている。「コリプレッサー」は、Ｇａ１４ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に
より例証されるようにＴＲＸドメインに融合されたＳＭＲＴまたはＮｃｏＲから
の相互作用ドメイン（ＩＤ１またはＩＤ２）である典型的ＣＲ種と共にＣＲ−Ｔ
ＲＸを示している。レポーターポリヌクレオチドはＧａ１４ＤＢＤのための結合
部位を含むＵＡＳ−ＴＫ−ルシフェラーゼレポーターとして例証される。ＣＨＯ
細胞をこれらの添加された構造物およびホルモンと共に３重にトランスフェクシ
ョンを行った。図７は用量−反応曲線として正ツーハイブリッドシステムからの
データーを示しており、前記用量−反応曲線は、３つすべての成分（ＶＲ１６Ｅ
Ｒ、Ｇａ１４−ＳＲＣ−１，およびＵＡＳ−ＴＫ−ルシフェラーゼ）が共にトラ
ンスフェクションされた場合にだけレポーター（ルシフェラーゼ）が発生するこ
と、およびエストラジオール濃度に関しては反応は用量依存であることを示して
いる。図８は用量−反応曲線として正ツーハイブリッドシステムからのデーター
を示しており、前記曲線は、３つすべての成分（ＶＲ１６ＥＲ、Ｇａ１４−ＳＲ
Ｃ−１，およびＵＡＳ−ＴＫ−ルシフェラーゼ）が共にトランスフェクションさ
れた場合にだけレポーター（ルシフェラーゼ）が発生することを、かつＴ３濃度
に関しては反応は用量依存であることを示している。
【０１０７】 例 ３：正ハイブリッド系：コリプレッサー 図９は正ハイブリッド系中のＴＲ ＬＢＤとのコアクチベーター／コリプレッ
サー相互作用を示している。ＮｃｏＲ ＩＤ１、およびより小さな限度でＳＭＲ
Ｔ ＩＤ１はＴＲＬＢＤと相互作用するが、ＩＤ２はいずれもＬＢＤとは強力に
相互作用しない。Ｔ３は、コアクチベーターを補充するために必要とされるより
かなり低い濃度でのコリプレッサー断片の解離を含んでいる。図１０は正ツーハ
イブリッドシステムにおけるＥＲ ＬＢＤとの相互作用を示している。ＮｃｏＲ
ＩＤ１、およびより小さな限度でＳＭＲＴ ＩＤ１はＴＲ ＬＢＤと相互作用
するが、ＩＤ２はいずれもＬＢＤとは強力に相互作用しない。４つのＩＤｓのい
ずれも、リガンドの不存在下ではＥＲ ＬＢＤと有意に相互作用しない。
【０１０８】 例 ４：新規ＬＣＤｓの同定 図１１は表示されたペプチドのライブラリーから新たなＬＣＤ配列を同定する
ための方法の略図を示している。ペプチドライブラリーはＬａｃ リプレッサー
（Ｌａｃｌ）への融合配列により作成された。コードするプラスミドは作動遺伝
子部位を有しており、その結果細菌性溶解物はコードするプラスミドに結合した
表示ペプチドを含んでいる。ライブラリーは４ラウンド（倍量）濃縮中エストラ
ジオールの存在下に固定されたＧＳＴ−ＥＲによりスクリーニングされる。
【０１０９】 図１２は、ＥＲおよびエストラジオールの存在下に、集中させた（−ＬＸＸＬ
Ｌ−）またはランダム（−ＸＸＸＸ−）１５ｍｅｒライブラリーのいずれかより
得たＬａｃｌ融合ペプチドのためのエリザシグナルを示している。
【０１１０】 図１３は、ＥＲパニングによりライブラリーをスクリーニング することで得
られたＬａｃｌ融合ペプチドの配列を示している。配列の頂部セットは集中させ
た（−ＬＸＸＬＬ−）ライブラリーから、底部セットはランダム配列（−ＸＸＸ
Ｘ−）ライブラリーから得られた。注目に値するアミノ酸をハイライトしている
。図１４は、個体群としてＭＢＰベクター（１価の反応物）中に下位クローンさ
せた、かつエストラジオールなしでランダムクローンテストを行ったＬａｃｌ−
融合（４価の反応物）４ラウンド選択物からのエリザデータを示している。対照
は３ＬＣＤｓを含むＳＲＣ−１断片（５９７−７８１）である。図１５は、個体
群としてＭＢＰベクター（１価の反応物）中に下位クローンさせた、かつエスト
ラジオールなしでランダムクローンテストを行ったＬａｃｌ−融合（４価の反応
物）４ラウンド選択物からのエリザデータを示している。対照は３ＬＣＤｓを含
むＳＲＣ−１断片（５９７−７８１）である。ＥＲとの相互作用のためのクロー
ンの多くのエストラジオール依存に注意すること（図１４のデータを図１５と比
較する）。図１６は選択したクローンの配列を示している。注目すべきアミノ酸
残渣をハイライトしている。図１７は、図の説明で下記したような薬剤概要略図
を示している。
【０１１１】 例 ５：「ヘッドピースーダイマー」ライブラリーからの受容体選択的ペプチ
ドの選択 ライブラリーから選択したペプチドの下位セットをより正確に特徴づけるため
に、さらなる分析用の８つのＥＲおよびＴＲ選択ペプチド融合を選択した。さら
に初期Ｍ２Ｈ研究において使用した数個のＳＣＲ−１断片へのＭＢＰ融合を構成
した。最後に天然ＮＲ−ｂｏｘｅｓとの比較のために、３つのＳＲＣ−１ファミ
リーメンバー、ＳＲＣ−１、ＴＩＦ−２およびＲＡＣ−３から誘導した１１個の
１９ｍｅｒペプチドへのＭＢＰ融合を作成した。これらのペプチドは集中させた
Ｘ、Ｌ７ＸＸＬＬＸ７「ヘッドピースーダイマー」誘導ペプチドのフォーマット
をまねるために構成された。我々は、エリザにおいて 等しい分量が確実に使用
できるようにするため親和性クロマトグラフィーにより３つのタンパク質を精製
した。精製したＳＲＣ−１ ＮＲＩＤ断片の固定受容体ＥＲ、ＥＲ ＴＲおよび
ＴＲへの結合を測定した。幾度も実験を繰り返したが、等量の固定目標受容体で
は、エリザにおけるＳＲＣ−１ＮＲＩＤ（ＳＲＣ１＋２＋３）とのシグナル強度
は受容体から受容体へほとんど変化せず、かつＭＢＰ単独は一貫して低シグナル
を示すことを確認した。ゆえに、我々はＳＲＣ１＋２＋３により得られた特定シ
グナルの状況で天然およびライブラリー選択ペプチド融合の両方を分析した。使
用したＭＢＰ融合の濃度で、固定受容体と相互作用するための比較的高い親和性
タンパク質（ＮＲＩＤ断片のような）の能力における差は簡単には明らかになら
ない。したがってＮＲＩＤ断片に対して、Ｍ２Ｈアッセイでみられた差異はそれ
ほど明らかではない。しかしながら、ＳＲＣ１＋２＋３に関連するもっとも低い
シグナルはＳＲＣ２およびＥＲで得られた。これは、ＳＲＣ１＋２＋３およびＲ
Ｃ２間のルシフェラーゼシグナルにおける差異がＥＲに対してもっとも大きいＭ
２Ｈアッセイでは一貫している。ＮＲＩＤ断片間親和性における事実上の差異は
、ＮＲ−ｂｏｘ１９ｍｅｒペプチドにみられた差異と比べると比較的小さい。こ
れらの結果は、共因子／ＮＲ相互作用に対する最小要求の解釈が高度に評価タイ
プ依存らしいことを示している。
【０１１２】 天然コアクチベーター誘導ペプチドを含むＭＢＰ融合をエリザによりテストす
ることで、異なるペプチド間および異なる受容体間のシグナル強度において著し
い差が明らかになった。予想したように、ＳＲＣ２は４つすべての受容体によく
結合するが、ＳＲＣ１は４つすべてにはそれほどよく結合せず、特にＴＲｓには
ほとんど結合しない。ＳＲＣ３もまたＳＲＣ２より結合せず、しかし予想したよ
うにＥＲよりもＴＲを好む。似たような結果が他の二つのＳＲＣ−１ファミリー
メンバーでも得られたが、しかしながら、ＲＡＣー３のＮＲ−ｂｏｘ＃３はＴｒ
ｓよりもＥＲｓにより強力に結合しているように見える。
【０１１３】 ペプチドライブラリーから選択により誘導された精製したＭＢＰ−ペプチドの
分析で、二つの受容体に対して別々に選択ペプチドの普遍的なＥＲおよびＴＲ選
択性があることが示された。しかしながら、このアッセイにより予想された選択
性の度合いは、未加工溶解物と共に行われたエリザから予想されたほどには高く
はなかった。たとえば、あるリガンド（Ｍ１５３）は未加工溶解物を使ったアッ
セイでは全くＥＲ選択性であるが、精製したＭＢＰ−ペプチド融合はＥＲおよび
ＴＲのどちらとも相互作用では等しく効果的であることが明らかである。これは
上記で示唆したように評価の種類によるものであると思われる。この場合、評価
におけるＭＢＰ融合の絶対量は、精製したタンパク質を使用する場合、遙かに多
いと考えられ、したがって幾分親和性相互作用を低くしているようだ。これらの
ペプチドはＥＲおよびＴＲの−形状で選択されたが、いくつかの差異（たとえば
リガンドＭ−６９３、ＴＲ対ＴＲ）が選択的ペプチドが同定され得ることを示唆
しているものの、大いに選択性はそれぞれの受容体の−形状に及んでいる。
【０１１４】 例 ６：ラジオ競合アッセイによる受容体／コアクチベーター−疑似ペプチド
相互作用親和性決定 天然および選択された配列の相互作用をより量的な系統的分類法によりアッセ
イするために、我々は、トレーサーとして固定受容体ＬＢＤｓおよびヨウ素で処
理したＳＲＣ−１ ＮＲＩＤ（ＳＲＣ１＋２＋３）を使ってラジオ競合アッセイ
を設定した。我々はシンチレーション近似（ＳＰＡ）に基づいた同質結合アッセ
イを設定した。対照は、競合剤として未分類トレーサーを使って実験した。エス
トラジオールの不存在下でもＥＲはＮＲＩＤとはっきりと飽和状態で相互作用す
る。ＳＲＣ１＋２＋３に対するＩＣ５０はリガンドなしで２１ｎＭであるが、エ
ストラジオールの添加に対して、５分の１の４．３ｎＭまで減少する。さらにエ
リザ実験から予想されたように、固定受容体に結合したトレーサーの量はリガン
ドを加えると劇的に増加した。ＴＲはリガンド不存在下ではＮＲＩＤと測定可能
なほど相互作用せず、リガンド不存在下でのＥＲと比較してエリザにおけるＴＲ
との一貫してかなりより低いシグナルについての我々の観察と一致している。Ｔ
Ｒ ＳＰＡにリガンドを添加した結果、未分類ＳＲＣ１＋２＋３に対して１２５ ＩＮＲＩＤと５．１ｎＭのＩＣ５０との予想された会合が起こった。
【０１１５】 我々は次に、それぞれエストリジオールおよびトリイオドチロニンの存在下に
、ＥＲ−ＮＲＩＤおよびＴＲ−ＮＲＩＤ ＳＰＡｓの両方で、競争者として先の
節で記載したＭＢＰ融合を用いた。我々が観察した親和性および選択性傾向がい
ずれのタンパク質調製の人為構造でないことを確実にするため、いくつかのＭＢ
Ｐ融合の第２バッチを再度分離し、すべての計測を繰り返した。二つのタンパク
質調製の間で若干の量的差異があったが、どの場合にも結果は同じ結論に至った
。予想したように、ＳＲＣ１＋２＋３およびＳＲＣ２＋３に対するＩＣ５０値は
、ＴＲアッセイに対してはほとんど同一（３−１１ｎＭ）であり、これらのタン
パク質断片は、この受容体上で評価したどの天然または人工のシグナルＮＲ−ｂ
ｏｘ含有ペプチドよりも有力である。ＳＲＣ１＋２およびＳＲＣ２は、ペプチド
（１９ｍｅｒ）または断片（〜５６ｍｅｒ）いずれとしても、より能力が低く、
上記のＭ２Ｈアッセイと一致している。３つのＳＲＣ−１ファミリーメンバーか
ら誘導された相同ペプチドはＴＲとの類似の融合中で機能する。各ケースの３つ
の ＮＲ−ｂｏｘの親和性の順番は＃２＞＃３＞＃１であり、ＮＲＩＤ−ＡＦ２
相互作用レベルでは好ましくなくＳＲＣ−１ファミリーメンバーのいずれか一つ
を表示する。我々のＭ２Ｈ実験と一致して、ＣＢＰのアミノ末端ＮＲ−ｂｏｘお
よびｐ３００はＴＲに対して比較的親和性が乏しい。ＴＲ選択ペプチドは最良天
然ペプチド、たとえばＳＲＣ２に類似したＩＣ５０値を有するが、ＥＲ選択ペプ
チドはＴＲに対して親和性が低い。ＴＲ選択ペプチドの折畳み（ｆｏｌｄ）選択
性は常に＞２であるが、我々がエリザによりＴＲおよびＥＲのいずれにも結合す
ることを示した一つのリガンド（Ｍ−６５５）は除かれる。対照的にわずかな例
外を別にして、大部分の天然コアクチベーター由来ペプチドはたった１〜２倍の
選択性を有するのみである。ＴＲおよびＴＩＦ１に対するＳＲＣ３またはまたは
ＥＲに対するＲＡＣ１のより大きな折畳み選択性がエリザおよびＭ２Ｈの結果を
与えていると思われる。
【０１１６】 天然コアクチベーター由来ペプチドまたはＳＲＣ−１断片のＥＲとの相互作
用は、予想されたように、ＴＲとの場合とは若干異なっている。ＳＲＣ１＋２＋
３はそれでももっともＩＣ５０が低いが、ＴＲで得られたものとは対照的に、Ｅ
Ｒに対してＳＲＣ１＋２およびＳＲＣ２＋３について得られた値同士ではほとん
ど差異がない。断片またはペプチド形態中のＳＲＣ２は、Ｍ２Ｈアッセイで予想
されたように、一つ以上のＮＲ−ｂｏｘを含む融合タンパク質よりも融和性が低
い。さらに、ＥＲに対する各ＳＲＣ−１ファミリーメンバー中の３つのＮＲ−ｂ
ｏｘの親和性順序は＃２＞＃３＝＃１である。データから、３つのタンパク質の
＃１および＃３ＮＲ−ｂｏｘの親和性がＳＲＣ−１の対応するＮＲ−ｂｏｘｅｓ
の親和性よりも有意に高いので、ＴＩＦ−２およびＲＡＣ−３はＳＲＣ−１より
もより効果的なＥＲ依存転写のコアクチベーターであったことが明らかである。
酵母ツーハイブリッドシステムを用いた先の研究が、ＥＲ ＬＢＤがＣＢＰのア
ミノ末端（Ｋａｍｅｉ １９９６）とまたはアミノ末端ＣＢＰ ＮＲ−ｂｏｘ（
ＳＲＣ ＮＲ−ｂｏｘと比較してわずかであるが、Ｈｅｅｒｙ １９９７）と相
互作用できることを示したが、我々のデータではこれらの相互作用はきわめて低
いものであるらしいことを示唆している。選り分け反応物としてＥＲを用いて我
々が選択したペプチドはＥＲに対してＴＲに対するよりも比較的高い選択性を示
している。ＴＲ−選択ペプチドおよびＴＲとのように、ＥＲに対するＥＲ−選択
ペプチドの親和性は、最良天然ＮＲ−ｂｏｘｅｓよりはそれほど高くないにして
も類似している。さらに、ＴＲ−選択ペプチドに類似して、これら個々のペプチ
ドは、一つ以上のＬＸＸＬＬモチーフを含むＳＲＣ−１断片のいずれとも同じく
らい高いＥＲに対して親和性を持たない。上記の実験は、個々の受容体によりペ
プチドライブラリーをスクリーニングすることは、相対的に非選択性天然ＮＲ−
ｂｏｘ由来配列に等しいまたはそれよりも大きい親和性を持つ受容体選択性ペプ
チドを得るためには良い方法であることを証明している。
【０１１７】 本発明の好ましい実施形態の前述の記載は例証および説明の目的で示した。そ
れらは網羅的であることまたは本発明を開示された正確形態に制限することを意
図するものでなく多くの変更および修正が上記説明に照らして可能である。
【０１１８】 すべての出版物および特許出願が、各個々の出版物および特許出願が明確にか
つ個別的にある程度参照により組み込まれることを指示されているかのように本
文に参照により組み込まれている。
【０１１９】 当業者に明白であるような修正および変更が本発明の範囲内で行われることを
意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、核内受容体ＬＢＤと、ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲ
Ｃ−１）の結合断片の相互作用の測定についての、直接的相互作用アッセイフォ
ーマット（エリザ）の例示的実施形態の概略図である。核内受容体（ＥＲ＝エス
トロゲン受容体、ＴＲ／＝甲状腺ホルモン受容体または形）のＬＢＤは、グルタ
チオンＳ−トランスフェラーゼ配列（ＧＳＴ）にインフレーム融合して、プラス
チックの９６ウェルプレートへの静電気的結合などの、ウェル表面として示され
る基質上に固定された核内受容体ＬＢＤの結合メンバーを形成する。コアクチベ
ーターのメンバーは、アミノ末端でＧＳＴ／ＭＢＰにインフレーム融合し、カル
ボキシ末端で抗体１７９エピトープタグにインフレーム融合したＳＲＣ−１の３
つのロイシン荷電ドメイン（ＬＣＤ）を含む。ＬＣＤ配列を示す。固定ＬＢＤに
結合したＳＲＣ−１融合メンバーは、１７９エピトープと特異的に反応するマウ
ス抗体および第二抗体（抗マウスＡｂにコンジュゲートしたアルカリホスファタ
ーゼ）を用いて検出される。
【図２】 図２は、ＳＲＣ−１と相互作用するＥＲ ＬＢＤを使用した直接的相互作用ア
ッセイの結果を示す。０．５μｇの精製ＧＳＴ−ＥＲを、ＧＳＴ−ＳＲＣ−１を
含む様々な量の粗細菌溶菌液と共に使用した。相互作用は特異的であり（ＧＳＴ
対照）、エストラジオールにより増強される。
【図３】 図３は、ＳＲＣ−１と相互作用するＥＲ ＬＢＤを使用した直接的相互作用ア
ッセイの結果を示す。０．５μｇの精製ＧＳＴ−ＥＲを、ＧＳＴ−ＳＲＣ−１を
含む様々な量の粗細菌溶菌液と共に使用した。相互作用は特異的であり（ＧＳＴ
対照）、エストラジオールにより増強される。
【図４】 図４は、ＳＲＣ−１と相互作用するＴＲおよびＴＲ ＬＢＤの直接的相互作用
アッセイの結果を示す。指示量のＧＳＴ融合タンパク質を使用した。相互作用は
特異的であり、Ｔ３依存性である。
【図５】 図５は、ＴＲおよびＴＲ ＬＢＤおよびＳＲＣ−１の間の相互作用の促進にお
ける、Ｔ３の用量反応曲線としての直接的相互作用アッセイの結果を示す。Ｔ３
は、受容体により強力であるようである。
【図６】 図６は、使用したＬＲＢ−ＴＲＸ、ＣＡ−ＴＲＸ、およびＣＲ−ＴＲＸ作成物
並びにツーハイブリッド系のレポーターポリヌクレオチドの図解を示す。「受容
体」は、ＬＢＤ−ＴＲＸを示し、ＬＢＤは結合リガンド（Ｌ）をもつ一般的核内
受容体（ＮＲ）ＬＢＤにより例示され、ＴＲＸドメインは、ＶＰ１６酸性活性化
ドメイン（ＶＰ１６）により示される。「コアクチベーター」は、ＣＡ−ＴＲＸ
を示し、例示的ＣＡ種は、ＳＲＣ−１タンパク質の一部、ＣＢＰタンパク質の一
部、またはこれらのタンパク質からの単離ＬＣＤ配列であり、ＴＲＸドメインは
、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）により例示される。「コリプレッサー
」は、ＣＲ−ＴＲＸを示し、例示的ＣＲ種は、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン（Ｄ
ＢＤ）により例示される、ＴＲＸドメインに融合したＳＭＲＴまたはＮｃｏＲか
らの相互作用ドメイン（ＩＤ１またはＩＤ２）である。レポーターポリヌクレオ
チドは、Ｇａｌ４ＤＢＤの結合部位を含むＵＡＳ−ＴＫ−ルシフェラーゼレポー
ターとして例示される。ＣＨＯ細胞は、これらの作成物を用いて三重にトランス
フェクトし、ホルモンを加えた。
【図７】 図７は、レポーター（ルシフェラーゼ）は、全３つの成分（ＶＰ１６ＥＲ、Ｇ
ａｌ４−ＳＲＣ−１、およびＵＡＳ−ＴＫ−ルシフェラーゼ）が共にトランスフ
ェクトされ、反応がエストラジオール濃度に関して用量依存性である場合にのみ
生じることを示す、用量反応曲線としての正ツーハイブリッド系のデータを示す
。
【図８】 図８は、レポーター（ルシフェラーゼ）は、全３つの成分（ＶＰ１６ＴＲ、Ｇ
ａｌ４−ＳＲＣ−１、およびＵＡＳ−ＴＫ−ルシフェラーゼ）が共にトランスフ
ェクトされ、反応がＴ３濃度に関して用量依存性である場合にのみ生じることを
示す、用量反応曲線としての正ツーハイブリッド系のデータを示す。
【図９】 図９は、正ツーハイブリッド系における、ＴＲ ＬＢＤとコアクチベーター／
コリプレッサーの相互作用を示す。ＮｃｏＲ ＩＤ１、およびより低い程度でＳ
ＭＲＴ ＩＤ１は、ＴＲ ＬＢＤと相互作用するが、どちらのＩＤ２もＬＢＤと
強力に相互作用する。Ｔ３は、コアクチベーターの補充に必要な濃度よりも有意
に低い濃度でコリプレッサー断片の解離を誘導した。
【図１０】 図１０は、正ツーハイブリッド系における、ＥＲ ＬＢＤとコアクチベーター
／コリプレッサーの相互作用を示す。ＮｃｏＲ ＩＤ１、およびより低い程度で
ＳＭＲＴ ＩＤ１は、ＥＲ ＬＢＤと相互作用するが、どちらのＩＤ２もＬＢＤ
と強力に相互作用しない。４つのＩｄのいずれも、リガンドの非存在下では、Ｅ
Ｒ ＬＢＤとは有意に相互作用しない。
【図１１】 図１１は、示したペプチドライブラリーからの新規ＬＣＤ配列を同定する方法
の図解を示す。ペプチドライブラリーを、配列をＬａｃリプレッサー（Ｌａｃｌ
）に融合させることにより作成した。コードしているプラスミドは、細菌溶菌液
が、コードしているプラスミドに結合した示したペプチドを含むように、オペレ
ーター部位を含む。ライブラリーを、エストラジオールの存在下で、４ラウンド
の濃縮で、固定ＧＳＴ−ＥＲを用いてスクリーニングした。
【図１２】 図１２は、ＥＲおよびエストラジオールの存在下で、集中（−ＬＸＸＬＬ−）
またはランダム（−ＸＸＸＸＸ−）１５ｍｅｒライブラリーから得られた、Ｌａ
ｃｌ融合ペプチドのエリザシグナルを示す。
【図１３】 図１３は、ＥＲパニングによりライブラリーをスクリーニングすることにより
得られたＬａｃｌ融合ペプチドの配列を示す。上のセットの配列は、集中（−Ｌ
ＸＸＬＬ−）ライブラリーから得られ、下のセットは、ランダム配列（−ＸＸＸ
ＸＸ−）ライブラリーから得られた。注目すべきアミノ酸配列を強調する。
【図１４】 図１４は、一個体群としてＭＢＰベクター（１価試薬）にサブクローニングし
たＬａｃｌ融合物（４価試薬）の第４ラウンドの選択物およびエストラジオール
の非存在下で試験したランダムクローンからのエリザデータを示す。対照は、３
ＬＣＤを含むＳＲＣ−１断片（５９７−７８１）である。
【図１５】 図１５は、一個体群としてＭＢＰベクター（１価試薬）にサブクローニングし
たＬａｃｌ融合物（４価試薬）の第４ラウンドの選択物およびエストラジオール
の存在下で試験したランダムクローンからのエリザデータを示す。対照は、３Ｌ
ＣＤを含むＳＲＣ−１断片（５９７−７８１）である。ＥＲとの相互作用につい
て、多くのクローンのエストラジオール依存性に注意（図１４のデータを図１５
と比較）。
【図１６】 図１６は、選択したクローンの配列を示す。注目すべきアミノ酸残基を強調す
る。
【図１７】 図１７は、２次元スコア行列を使用した生物効果フィンガープリントの仮説的
図解を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１０月２６日（１９９９．１０．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】 １つの側面において、本発明はまた、（１）核タンパク質には天然に存在せず
、（２）典型的には天然に存在するコアクチベーターおよび／またはコリプレッ
サーが結合する核内受容体の結合界面との相互作用により、核内受容体に結合す
ることが前以て決定されている、結合アミノ酸配列を含む新規なポリペプチドを
提供する。これらのポリペプチドおよびその組成物は、コアクチベーターまたは
コリプレッサー結合の候補アンタゴニスト（例えば競合的阻害剤）であり、ＣＡ
−ＴＲＸ融合物のＣＡ部分として、またはＣＲ−ＴＲＸ融合物のＣＲ部分として
、本発明のアッセイの使用に（かかる使用は、試薬などの商業的な販売を含み得
る）および当業者には明らかな他の使用に利用できる。かかる結合アミノ酸配列
は、一般に、ＬＸＸＬＬ（配列番号１）モチーフ（ここで、Ｌはロイシンであり
、Ｘは慣用的なアミノ酸のいずれかである）を含み、ヒトエストロゲン受容体の
ＬＢＤに関して、図１６で示す配列（配列番号２３〜４０）を含む。新規なポリ
ペプチドは、一般に、５−５０，０００アミノ酸長、最も通例には１０−５００
アミノ酸長であり、１つまたは複数の種のかかる結合アミノ酸配列（これは反復
していてもよい）を含み得、残りのポリペプチドは、他の天然に存在する配列（
例えば、既知のタンパク質への融合物）を含み得、および／またはランダム、偽
ランダム、または確定配列ケマル（ｋｅｍａｌ）アミノ酸配列（群）を含み得る
。新規結合配列への構造相同性を有するペプチド擬似体もまた、当分野で公知の
方法に従って提供され；かかるペプチド擬似体または束縛ペプチドは、一以上の
核内受容体リガンドのアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を提供する新規
な治療薬物を提供できる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１０】 図１３は、ＥＲパニングによりライブラリーをスクリーニング することで得
られたＬａｃｌ融合ペプチドの配列を示している。配列の頂部セットは集中させ
た（−ＬＸＸＬＬ−）（配列番号１）ライブラリーから、底部セットはランダム
配列（−ＸＸＸＸ−）（配列番号２）ライブラリーから得られた。注目に値する
アミノ酸をハイライトしている。図１４は、個体群としてＭＢＰベクター（１価
の反応物）中に下位クローンさせた、かつエストラジオールなしでランダムクロ
ーンテストを行ったＬａｃｌ−融合（４価の反応物）４ラウンド選択物からのエ
リザデータを示している。対照は３ＬＣＤｓを含むＳＲＣ−１断片（５９７−７
８１）である。図１５は、個体群としてＭＢＰベクター（１価の反応物）中に下
位クローンさせた、かつエストラジオールなしでランダムクローンテストを行っ
たＬａｃｌ−融合（４価の反応物）４ラウンド選択物からのエリザデータを示し
ている。対照は３ＬＣＤｓを含むＳＲＣ−１断片（５９７−７８１）である。Ｅ
Ｒとの相互作用のためのクローンの多くのエストラジオール依存に注意すること
（図１４のデータを図１５と比較する）。図１６は選択したクローンの配列（肺 列番号２３〜４０） を示している。注目すべきアミノ酸残渣をハイライトしてい
る。図１７は、図の説明で下記したような薬剤概要略図を示している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１１】 例 ５：「ヘッドピースーダイマー」ライブラリーからの受容体選択的ペプチ
ドの選択 ライブラリーから選択したペプチドの下位セットをより正確に特徴づけるため
に、さらなる分析用の８つのＥＲおよびＴＲ選択ペプチド融合を選択した。さら
に初期Ｍ２Ｈ研究において使用した数個のＳＣＲ−１断片へのＭＢＰ融合を構成
した。最後に天然ＮＲ−ｂｏｘｅｓとの比較のために、３つのＳＲＣ−１ファミ
リーメンバー、ＳＲＣ−１、ＴＩＦ−２およびＲＡＣ−３から誘導した１１個の
１９ｍｅｒペプチドへのＭＢＰ融合を作成した。これらのペプチドは集中させた
Ｘ、Ｌ７ＸＸＬＬＸ７ （配列番号３）「ヘッドピースーダイマー」誘導ペプチド
のフォーマットをまねるために構成された。我々は、エリザにおいて 等しい分
量が確実に使用できるようにするため親和性クロマトグラフィーにより３つのタ
ンパク質を精製した。精製したＳＲＣ−１ ＮＲＩＤ断片の固定受容体ＥＲ、Ｅ
Ｒ ＴＲおよびＴＲへの結合を測定した。幾度も実験を繰り返したが、等量の固
定目標受容体では、エリザにおけるＳＲＣ−１ＮＲＩＤ（ＳＲＣ１＋２＋３）と
のシグナル強度は受容体から受容体へほとんど変化せず、かつＭＢＰ単独は一貫
して低シグナルを示すことを確認した。ゆえに、我々はＳＲＣ１＋２＋３により
得られた特定シグナルの状況で天然およびライブラリー選択ペプチド融合の両方
を分析した。使用したＭＢＰ融合の濃度で、固定受容体と相互作用するための比
較的高い親和性タンパク質（ＮＲＩＤ断片のような）の能力における差は簡単に
は明らかにならない。したがってＮＲＩＤ断片に対して、Ｍ２Ｈアッセイでみら
れた差異はそれほど明らかではない。しかしながら、ＳＲＣ１＋２＋３に関連す
るもっとも低いシグナルはＳＲＣ２およびＥＲで得られた。これは、ＳＲＣ１＋
２＋３およびＲＣ２間のルシフェラーゼシグナルにおける差異がＥＲに対しても
っとも大きいＭ２Ｈアッセイでは一貫している。ＮＲＩＤ断片間親和性における
事実上の差異は、ＮＲ−ｂｏｘ１９ｍｅｒペプチドにみられた差異と比べると比
較的小さい。これらの結果は、共因子／ＮＲ相互作用に対する最小要求の解釈が
高度に評価タイプ依存らしいことを示している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、核内受容体ＬＢＤと、ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲ
Ｃ−１）の結合断片の相互作用の測定についての、直接的相互作用アッセイフォ
ーマット（エリザ）の例示的実施形態の概略図である。核内受容体（ＥＲ＝エス
トロゲン受容体、ＴＲ／＝甲状腺ホルモン受容体または形）のＬＢＤは、グルタ
チオンＳ−トランスフェラーゼ配列（ＧＳＴ）にインフレーム融合して、プラス
チックの９６ウェルプレートへの静電気的結合などの、ウェル表面として示され
る基質上に固定された核内受容体ＬＢＤの結合メンバーを形成する。コアクチベ
ーターのメンバーは、アミノ末端でＧＳＴ／ＭＢＰにインフレーム融合し、カル
ボキシ末端で抗体１７９エピトープタグにインフレーム融合したＳＲＣ−１の３
つのロイシン荷電ドメイン（ＬＣＤ）を含む。ＬＣＤ配列（配列番号４〜６）を
示す。固定ＬＢＤに結合したＳＲＣ−１融合メンバーは、１７９エピトープと特
異的に反応するマウス抗体および第二抗体（抗マウスＡｂにコンジュゲートした
アルカリホスファターゼ）を用いて検出される。
【図２】 図２は、ＳＲＣ−１と相互作用するＥＲ ＬＢＤを使用した直接的相互作用ア
ッセイの結果を示す。０．５μｇの精製ＧＳＴ−ＥＲを、ＧＳＴ−ＳＲＣ−１を
含む様々な量の粗細菌溶菌液と共に使用した。相互作用は特異的であり（ＧＳＴ
対照）、エストラジオールにより増強される。
【図３】 図３は、ＳＲＣ−１と相互作用するＥＲ ＬＢＤを使用した直接的相互作用ア
ッセイの結果を示す。０．５μｇの精製ＧＳＴ−ＥＲを、ＧＳＴ−ＳＲＣ−１を
含む様々な量の粗細菌溶菌液と共に使用した。相互作用は特異的であり（ＧＳＴ
対照）、エストラジオールにより増強される。
【図４】 図４は、ＳＲＣ−１と相互作用するＴＲおよびＴＲ ＬＢＤの直接的相互作用
アッセイの結果を示す。指示量のＧＳＴ融合タンパク質を使用した。相互作用は
特異的であり、Ｔ３依存性である。
【図５】 図５は、ＴＲおよびＴＲ ＬＢＤおよびＳＲＣ−１の間の相互作用の促進にお
ける、Ｔ３の用量反応曲線としての直接的相互作用アッセイの結果を示す。Ｔ３
は、受容体により強力であるようである。
【図６】 図６は、使用したＬＲＢ−ＴＲＸ、ＣＡ−ＴＲＸ、およびＣＲ−ＴＲＸ作成物
並びにツーハイブリッド系のレポーターポリヌクレオチドの図解を示す。「受容
体」は、ＬＢＤ−ＴＲＸを示し、ＬＢＤは結合リガンド（Ｌ）をもつ一般的核内
受容体（ＮＲ）ＬＢＤにより例示され、ＴＲＸドメインは、ＶＰ１６酸性活性化
ドメイン（ＶＰ１６）により示される。「コアクチベーター」は、ＣＡ−ＴＲＸ
を示し、例示的ＣＡ種は、ＳＲＣ−１タンパク質の一部、ＣＢＰタンパク質の一
部、またはこれらのタンパク質からの単離ＬＣＤ配列であり、ＴＲＸドメインは
、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）により例示される。「コリプレッサー
」は、ＣＲ−ＴＲＸを示し、例示的ＣＲ種は、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン（Ｄ
ＢＤ）により例示される、ＴＲＸドメインに融合したＳＭＲＴまたはＮｃｏＲか
らの相互作用ドメイン（ＩＤ１またはＩＤ２）である。レポーターポリヌクレオ
チドは、Ｇａｌ４ＤＢＤの結合部位を含むＵＡＳ−ＴＫ−ルシフェラーゼレポー
ターとして例示される。ＣＨＯ細胞は、これらの作成物を用いて三重にトランス
フェクトし、ホルモンを加えた。
【図７】 図７は、レポーター（ルシフェラーゼ）は、全３つの成分（ＶＰ１６ＥＲ、Ｇ
ａｌ４−ＳＲＣ−１、およびＵＡＳ−ＴＫ−ルシフェラーゼ）が共にトランスフ
ェクトされ、反応がエストラジオール濃度に関して用量依存性である場合にのみ
生じることを示す、用量反応曲線としての正ツーハイブリッド系のデータを示す
。
【図８】 図８は、レポーター（ルシフェラーゼ）は、全３つの成分（ＶＰ１６ＴＲ、Ｇ
ａｌ４−ＳＲＣ−１、およびＵＡＳ−ＴＫ−ルシフェラーゼ）が共にトランスフ
ェクトされ、反応がＴ３濃度に関して用量依存性である場合にのみ生じることを
示す、用量反応曲線としての正ツーハイブリッド系のデータを示す。
【図９】 図９は、正ツーハイブリッド系における、ＴＲ ＬＢＤとコアクチベーター／
コリプレッサーの相互作用を示す。ＮｃｏＲ ＩＤ１、およびより低い程度でＳ
ＭＲＴ ＩＤ１は、ＴＲ ＬＢＤと相互作用するが、どちらのＩＤ２もＬＢＤと
強力に相互作用する。Ｔ３は、コアクチベーターの補充に必要な濃度よりも有意
に低い濃度でコリプレッサー断片の解離を誘導した。
【図１０】 図１０は、正ツーハイブリッド系における、ＥＲ ＬＢＤとコアクチベーター
／コリプレッサーの相互作用を示す。ＮｃｏＲ ＩＤ１、およびより低い程度で
ＳＭＲＴ ＩＤ１は、ＥＲ ＬＢＤと相互作用するが、どちらのＩＤ２もＬＢＤ
と強力に相互作用しない。４つのＩｄのいずれも、リガンドの非存在下では、Ｅ
Ｒ ＬＢＤとは有意に相互作用しない。
【図１１】 図１１は、示したペプチドライブラリーからの新規ＬＣＤ配列を同定する方法
の図解を示す。ペプチドライブラリーを、配列をＬａｃリプレッサー（Ｌａｃｌ
）に融合させることにより作成した。コードしているプラスミドは、細菌溶菌液
が、コードしているプラスミドに結合した示したペプチドを含むように、オペレ
ーター部位を含む。ライブラリーを、エストラジオールの存在下で、４ラウンド
の濃縮で、固定ＧＳＴ−ＥＲを用いてスクリーニングした。
【図１２】 図１２は、ＥＲおよびエストラジオールの存在下で、集中（−ＬＸＸＬＬ−） （配列番号１） またはランダム（−ＸＸＸＸＸ−）（配列番号２）１５ｍｅｒラ
イブラリーから得られた、Ｌａｃｌ融合ペプチドのエリザシグナルを示す。
【図１３】 図１３は、ＥＲパニングによりライブラリーをスクリーニングすることにより
得られたＬａｃｌ融合ペプチドの配列を示す。上のセットの配列（配列番号３お よび配列番号７〜１７） は、フォーカスされた（−ＬＸＸＬＬ−）（配列番号１ ） ライブラリーから得られ、下のセット（配列番号１８〜２２）は、ランダム配
列（−ＸＸＸＸＸ−）（配列番号２）ライブラリーから得られた。注目すべきア
ミノ酸配列を強調する。
【図１４】 図１４は、一個体群としてＭＢＰベクター（１価試薬）にサブクローニングし
たＬａｃｌ融合物（４価試薬）の第４ラウンドの選択物およびエストラジオール
の非存在下で試験したランダムクローンからのエリザデータを示す。対照は、３
ＬＣＤを含むＳＲＣ−１断片（５９７−７８１）である。
【図１５】 図１５は、一個体群としてＭＢＰベクター（１価試薬）にサブクローニングし
たＬａｃｌ融合物（４価試薬）の第４ラウンドの選択物およびエストラジオール
の存在下で試験したランダムクローンからのエリザデータを示す。対照は、３Ｌ
ＣＤを含むＳＲＣ−１断片（５９７−７８１）である。ＥＲとの相互作用につい
て、多くのクローンのエストラジオール依存性に注意（図１４のデータを図１５
と比較）。
【図１６】 図１６は、選択したクローンの配列を示す。注目すべきアミノ酸残基を強調す
る（配列番号２３〜４０）。
【図１７】 図１７は、２次元スコア行列を使用した生物効果フィンガープリントの仮説的
図解を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 5/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 45/00 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 // Ａ６１Ｋ 45/00 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓ ｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇ ｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａ ｉｎ (72)発明者 ハート、チャールズ・プラレイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94010 バーリンゲーム、ローリンズ・ロ ード 1450、シグネイチャー・バイオサイ エンシイズ内 (72)発明者 シャーツ、ピーター・ジョセフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94304 パロ・アルト、ミランダ・アベニ ュー 4001、アフィマックス・リサーチ・ インスティテュート内

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 正ハイブリッド核内受容体シグナル伝達系であって、（１）
    前以て決定された転写因子の転写活性化ドメイン（「ＡＤ」）に共有結合した前
    以て決定された核内受容体のリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）を含む、リガ
    ンドで活性化可能な融合タンパク質をコードおよび発現するＬＢＤ−ＴＲＸポリ
    ヌクレオチド配列、（２）前以て決定された転写因子のＤＮＡ結合ドメインに連
    結した前以て決定された該核内受容体の該ＬＢＤに結合できる核内受容体コアク
    チベータータンパク質（「ＣＡ」）のドメインを含む、コアクチベーター融合タ
    ンパク質をコードおよび発現するＣＡ−ＴＲＸポリヌクレオチド配列、および（
    ３）直鎖状の順序で、前以て決定された該転写因子に応答性の転写調節配列、並
    びにシグナルまたは検出可能な表現型を付与する配列をコードするレポーターカ
    セットを含むレポーターポリヌクレオチド配列を含む、無傷真核宿主細胞を含む
    、上記正ハイブリッド核内受容体シグナル伝達系。
  2. 【請求項２】 正ハイブリッド核内受容体シグナル伝達系であって、（１）
    前以て決定された転写因子の転写活性化ドメイン（「ＡＤ」）に共有結合した前
    以て決定された核内受容体のリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）を含む、リガ
    ンドで活性化可能な融合タンパク質をコードおよび発現するＬＢＤ−ＴＲＸポリ
    ヌクレオチド配列、（２）前以て決定された転写因子の転写活性化ドメインに連
    結した前以て決定された該核内受容体の該ＬＢＤに結合できる核内受容体コリプ
    レッサータンパク質（「ＣＲ」）のドメインを含む、コリプレッサー融合タンパ
    ク質をコードおよび発現するＣＲ−ＴＲＸポリヌクレオチド配列、および（３）
    直鎖状の順序で、前以て決定された該転写因子に応答性の転写調節配列、並びに
    シグナルまたは検出可能な表現型を付与する配列をコードするレポーターカセッ
    トを含むレポーターポリヌクレオチド配列を含む、無傷真核宿主細胞を含む、上
    記正ハイブリッド核内受容体シグナル伝達系。
  3. 【請求項３】 核内受容体シグナル伝達系であって、（１）転写因子のＤＢ
    ＤまたはＡＤにポリペプチド連結した核内受容体のリガンド結合ドメインを含む
    融合タンパク質をコードするＬＢＤ−ＴＲＸポリヌクレオチド配列；（２）前以
    て決定された転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＲＸ）に連結した前以て決定さ
    れた該核内受容体の該ＬＢＤに結合できる核内受容体コリプレッサータンパク質
    （「ＣＲ」）のドメインを含む、コリプレッサー融合タンパク質（「ＣＲ−ＴＲ
    Ｘ」）をコードおよび発現するＣＡ−ＴＲＸポリヌクレオチド配列、および（３
    ）ＣＲ−ＴＲＸへのＬＤＢ−ＴＲＸの結合の結果として転写活性複合体として効
    率的に発現されるタンパク質をコードするリレー（またはシグナル変換）遺伝子
    、および（４）直鎖状の順序で、該転写活性複合体に応答性の転写調節配列、お
    よびリポーターをコードするリポーターカセットを含むリポーター遺伝子（ここ
    で、リポーター遺伝子が効率的に発現されると、リレー（またはシグナル変換）
    遺伝子の産物は実質的に存在せず、リレー（またはシグナル変換）遺伝子が効率
    的に発現されるとあまり発現されないか、または発現されない）を含む、逆ハイ
    ブリッドレポーター宿主細胞を含む、上記核内受容体シグナル伝達系。
  4. 【請求項４】 以下：（１）正ハイブリッド系：コアクチベーター、（２）
    正ハイブリッド系：コリプレッサー、（３）逆ハイブリッド系：コアクチベータ
    ー、（４）逆ハイブリッド系：コリプレッサー、（５）直接的相互作用アッセイ
    、または（６）核内受容体のアンタゴニストまたはアゴニストとしての、リガン
    ドの効力および／または強度の同定および／または定量のための他の当分野で公
    知のアッセイの、少なくとも２つを含む、核内受容体リガンドを同定するための
    多重フォーマットアッセイ。
  5. 【請求項５】 被検薬剤のライブラリーから候補医薬を同定する方法であっ
    て、候補医薬は所望の生物学的効果プロフィルを有し、（１）ライブラリーの各
    々別々の被検薬剤（これは混合物でもよい）を個々に使用して、ｎ個（ｎは、２
    以上、好ましくは３以上で、１００億以下の数である）の別個の本発明のアッセ
    イを実施し、各個々の被検薬剤測定について、別々のアッセイでリガンド誘導コ
    ンフォメーション変化または結合相互作用変化として検出される、少なくともｎ
    個の生物学的効果を得、（２）検出された各生物学的効果について、各アッセイ
    におけるリガンド誘導コンフォメーション変化または結合相互作用の検出（また
    はその欠失）に基づき、スコア値（二進数または定量的）を割り当て、別々に各
    物質のスコア行列（「生物効果フィンガープリント」）を作成し、および（３）
    各物質のスコア行列を、一以上の前以て決定されたアゴニスト（群）および／ま
    たはアンタゴニスト（群）における等価なスコア行列と比較し、よって、前以て
    決定された該アゴニスト（群）またはアンタゴニスト（群）のスコア行列とかな
    り類似したスコア行列を有する物質を同定することを含む、上記方法。
  6. 【請求項６】 （１）核タンパク質に天然には存在せず、および（２）典型
    的には天然に存在するコアクチベーターおよび／またはコリプレッサーが結合す
    る核内受容体の結合界面との相互作用により、核内受容体に結合することが前以
    て決定されている、結合アミノ酸配列を含むポリペプチド。
  7. 【請求項７】 上記ポリペプチドは、図１６で示される配列群から選択され
    た配列を含む、請求項６のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 正ハイブリッド核内受容体系、逆ハイブリッド核内受容体系
    、またはその組合せを用いて被検薬剤のライブラリーをスクリーニングし、アゴ
    ニストリガンドを選択するプロセスにより同定された核内受容体のアゴニストリ
    ガンド。
  9. 【請求項９】 上記プロセスは、上記ライブラリーを直接的な相互作用アッ
    セイを用いてスクリーニングし、各スクリーニング段階で陽性として検出される
    アゴニストリガンドを選択する段階をさらに含む、請求項８のアゴニストリガン
    ド。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006103813A1 (ja) * 2005-03-29 2006-10-05 Enbiotec Laboratories Co., Ltd. 核内受容体に対する結合物質の検出方法

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1229000A (en) * 1998-10-23 2000-05-15 Glaxo Group Limited Assays for ligands for nuclear receptors
DE69940958D1 (de) 1998-12-23 2009-07-16 Glaxo Group Ltd Bestimmungsmethode fur liganden der nuklearen rezeptoren
EP1194535A4 (en) * 1999-06-23 2004-03-10 Genesource Inc NON-DESTRUCTIVE, CELL-BASED TEST PROCEDURE
CA2398590C (en) * 2000-02-08 2012-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Cells for drug discovery
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
WO2001071361A2 (en) * 2000-03-23 2001-09-27 Glaxo Group Limited Constitutive androstane receptor
US6291194B1 (en) * 2000-07-28 2001-09-18 Taneli Raivio Assay for determination of androgenic or anti-androgenic activity of a serum sample or a test compound
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
ES2385598T3 (es) 2001-02-20 2012-07-27 Intrexon Corporation Sistema novedoso de expresión génica inducible basado en el receptor de ecdisona/receptor X retinoide de invertebrado
DK1534738T3 (da) 2001-02-20 2012-10-01 Intrexon Corp Nye substitutionsmutantreceptorer og anvendelse heraf i et inducérbart genekpressionssystem på basis af en nuklear receptor
EP1373470B1 (en) 2001-02-20 2013-04-24 Intrexon Corporation Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
WO2002066614A2 (en) * 2001-02-20 2002-08-29 Rheogene Holdings, Inc. Chimeric retinoid x receptors and their use in a novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system
AU2002249247A1 (en) * 2001-03-01 2002-09-19 Lion Bioscience Ag Cofactors of the estrogen receptor alpha and methods of use
JP2005532781A (ja) * 2001-09-26 2005-11-04 レオジーン・ホールディングス，インコーポレーテッド ヨコバイエクジソン受容体核酸、ポリペプチド、およびそれらの使用
US20040072831A1 (en) * 2001-10-12 2004-04-15 Choongwae Pharma Corporation Reverse-turn mimetics and method relating thereto
US20030148391A1 (en) * 2002-01-24 2003-08-07 Salafsky Joshua S. Method using a nonlinear optical technique for detection of interactions involving a conformational change
US20030228607A1 (en) * 2002-04-15 2003-12-11 Wagner Brandee Lynn Screening method and modulators having an improved therapeutic profile
AU2003269654A1 (en) * 2002-09-26 2004-04-19 Centre For Translational Research In Cancer Nuclear receptor transcriptional corepressor and uses thereof
CN1726394B (zh) * 2002-10-15 2010-10-13 阿伯麦特里科斯公司 针对短表位的数字化抗体组以及其使用方法
US7302347B2 (en) * 2002-12-10 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Method for creating specific, high affinity nuclear receptor pharmaceuticals
DE10309280A1 (de) * 2003-03-04 2004-10-14 Schering Ag Verfahren zur Bestimmung des hormonellen Effekts von Substanzen
PT1455190E (pt) 2003-03-04 2007-02-28 Schering Ag Processo para a determinação do efeito hormonal de substâncias por meio da interacção entre o receptor de androgénio e a proteína do sarcoma de ewing
WO2005012497A2 (en) * 2003-07-29 2005-02-10 Trellis Bioscience, Inc. Translocation tagging
AU2004267802B2 (en) * 2003-08-18 2011-03-17 Tethys Bioscience, Inc. Methods for reducing complexity of a sample using small epitope antibodies
CA2536946A1 (en) * 2003-08-26 2005-03-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Estrogen receptor modulators and uses thereof
US7935510B2 (en) * 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
US20060040338A1 (en) * 2004-08-18 2006-02-23 Odyssey Thera, Inc. Pharmacological profiling of drugs with cell-based assays
FR2893942A1 (fr) * 2005-11-25 2007-06-01 Genfit S A Methode de criblage de modulateurs de recepteurs nucleaires
US20110178112A1 (en) 2006-01-18 2011-07-21 Evolva Sa PPAR Modulators
CA2645159A1 (en) * 2006-03-10 2008-06-26 Michael S. Urdea Multiplex protein fractionation
ATE459001T1 (de) * 2006-09-08 2010-03-15 Pamgene Bv Testverfahren für nukleäre rezeptoren
US20100248975A1 (en) * 2006-12-29 2010-09-30 Gunjan Tiwari Fluorogenic peptide substrate arrays for highly multiplexed, real-time monitoring of kinase activities
JP2010516700A (ja) 2007-01-18 2010-05-20 エヴォルヴァ エスアー 置換１，３−ジオキサンおよびそれらの使用
AU2008206047B2 (en) 2007-01-18 2014-07-10 Evolva Sa Substituted 1,3-dioxanes useful as PPAR modulators
EP2303887B1 (en) 2008-06-06 2015-08-05 Prism Biolab Corporation Alpha helix mimetics and methods relating thereto
US9182406B2 (en) 2008-08-04 2015-11-10 Biodesy, Inc. Nonlinear optical detection of molecules comprising an unnatural amino acid possessing a hyperpolarizability
JP5545573B2 (ja) 2008-10-14 2014-07-09 株式会社 ＰＲＩＳＭ ＢｉｏＬａｂ アルファへリックスミメティック及び関連の方法
EP2461819A4 (en) 2009-07-28 2013-07-31 Sangamo Biosciences Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING TRI-NUCLEOTIDE REPEAT DISORDERS
EP2553097A1 (en) * 2010-03-26 2013-02-06 Integratech Proteomics, LLC Controlled release hybrid systems
EP2678341A1 (en) 2011-02-25 2014-01-01 PRISM Pharma Co., Ltd. Alpha helix mimetics and methods relating thereto
GB2503604B (en) 2011-03-21 2020-04-22 Biodesy Llc Classification of kinase inhibitors using second harmonic optical techniques
EP2578695A1 (en) * 2011-10-05 2013-04-10 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Assay for Clostridium botulinum Neurotoxin
WO2013115867A1 (en) 2012-02-05 2013-08-08 Biodesy, Llc Methods for identifying modulators of ras using nonlinear techniques
US20130288271A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 Biodesy, Llc Methods for detecting allosteric modulators of protein
US9395358B2 (en) 2012-02-05 2016-07-19 Biodesy, Inc. Methods for detecting allosteric modulators of protein
CN107075575B (zh) 2014-06-30 2021-12-03 蓝光治疗公司 用于生物实体中的构象的高通量分析的系统和方法
WO2016106286A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Biodesy, Inc. Attachment of proteins to interfaces for use in nonlinear optical detection
US10672502B2 (en) 2015-04-02 2020-06-02 Biodesy, Inc. Methods for determining protein structure using a surface-selective nonlinear optical technique
JP7027169B2 (ja) 2015-05-28 2022-03-01 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア バイオセーフティーのためのリガンド依存性必須遺伝子をもつ合成栄養要求体
US11210341B1 (en) * 2019-12-09 2021-12-28 A9.Com, Inc. Weighted behavioral signal association graphing for search engines

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5688938A (en) * 1991-08-23 1997-11-18 The Brigham & Women's Hospital, Inc. Calcium receptor-active molecules
AU680822B2 (en) * 1992-05-08 1997-08-14 Receptagen Corporation Anti-receptor agents to the vitamin B12/transcobalamin II receptor
US5679582A (en) * 1993-06-21 1997-10-21 Scriptgen Pharmaceuticals, Inc. Screening method for identifying ligands for target proteins
US5470952A (en) 1993-10-20 1995-11-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CNTF and IL-6 antagonists
US5525490A (en) * 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5906920A (en) * 1995-08-29 1999-05-25 The Salk Institute For Biological Studies Methods for the detection of ligands for retinoid X receptors

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006103813A1 (ja) * 2005-03-29 2006-10-05 Enbiotec Laboratories Co., Ltd. 核内受容体に対する結合物質の検出方法
JP4811400B2 (ja) * 2005-03-29 2011-11-09 藤倉化成株式会社 核内受容体に対する結合物質の検出方法

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Publication number Publication date
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