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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des hormonellen
Effektes von Substanzen sowie ein Verfahren zur Bestimmung von Störungen im
Co-Modulationsmechanismus
nukleärer
Rezeptoren (NR). Darüberhinaus
bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Ewing Sarcoma
Protein (EWS) oder von EWS Derivaten sowie von Nukleinsäuren, welche
dafür kodieren.
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Bei
der Beurteilung von Substanzen für
eine mögliche
pharmazeutische Anwendung ist es allgemein üblich, diese Substanzen auf
eine eventuelle hormonelle Wirkung, insbesondere auf eine möglicherweise
vorhandene androgene oder antiandrogene Aktivität, zu prüfen. Bei der Verabreichung
pharmakologisch wirksamer Substanzen sind Kenntnisse über deren
hormonelle Effekte, insbesondere androgene oder antiandrogene Effekte,
zur Beurteilung etwaiger Nebenwirkungen, wichtig. Zur Prüfung der
hormonellen Wirkung von Substanzen kommen beispielsweise Verfahren
zum Einsatz, bei denen die Fähigkeit
der Substanzen gemessen wird, an die Hormonrezeptoren zu binden
und deren Transkriptionsaktivität
zu aktivieren.
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Kenntnisse über hormonelle
Effekte von Substanzen sind aber nicht nur bei potentiellen Pharmaka
von Interesse, sondern auch bei nicht-pharmazeutischen Substanzen,
da von vielen, in der Umwelt vorhandenen Substanzen angenommen wird,
dass sie bei Teilen der Bevölkerung
eine androgene oder antiandrogene bzw. estrogene oder antiestrogene
Aktivität
aufweisen können.
Möglicherweise
wird dadurch eine unerwünschte, schädliche Wirkung
hervorgerufen.
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Eine
besondere Schwierigkeit liegt in der Identifizierung und Charakterisierung
von Effekten auf die von Steroidhormonen vermittelten Wirkungen,
da die Signalkaskaden und -Netzwerke, die letztlich die hormonvermittelte
Transkriptionsregulation steuern, hier besonders komplex ausgestaltet
sind. Der Grund dafür liegt
in der sehr ähnlichen
Ausgestaltung der DNA-Zielsequenzen, an welche die verschiedenen
Steroidhormonrezeptoren nach Ligandenaktivierung binden. Diese bedingt,
dass die nukleären
Rezeptoren zur Auslösung
einer gezielten Antwort auf die Interaktion mit speziellen Co-Faktoren
angewiesen sind, die unter anderem die Spezifität der rezeptorvermittelten
Transkriptionsaktivierung verstärken.
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Zur
Identifizierung von Substanzen, welche auf bestimmte hormoninduzierte
Signalwege einwirken, sind daher Testsysteme und -Verfahren notwendig,
die gezielt die Funktion einzelner Komponenten des zellulären Signalnetzwerkes
zur Vermittlung steroidaler Effekte erfassen können.
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Es
besteht somit ein Bedarf an einem Verfahren, mit dem in zuverlässiger,
empfindlicher, einfacher, kostengünstiger und schneller Weise
eine Aussage über
den hormonellen Effekt von Substanzen getroffen werden kann. Die
bisher bekannten Verfahren genügen
dem nicht.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, ein
Verfahren bereitzustellen, mit dem in zuverlässiger, empfindlicher, einfacher,
kostengünstiger
und schneller Weise eine Aussage über den hormonellen Effekt
der zu testenden Substanzen getroffen werden kann.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren zur Bestimmung des hormonellen Effektes von Substanzen
mit den Schritten Kontaktieren von Ewing Sarcoma Protein (EWS) oder
einem Derivat davon mit einem NR (nukleären Rezeptor) oder einem Derivat
davon und einer Testsubstanz, und
- a. Bestimmung
des Einflusses der Testsubstanz auf die Bindung von EWS oder dessen
Derivat und NR oder dessen Derivat, oder
- b. Bestimmung des Einflusses der Testsubstanz auf die Liganden-induzierte
Aktivität
von NR.
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Als
Derivat eines Proteins bzw. Polypeptids wird im Rahmen der vorliegenden
Erfindung jede, z.B. durch Aminosäure-Deletion, Substitution,
Insertion, Inversion, Addition oder Austausch erhaltene Variante
des Proteins bzw. Polypeptids verstanden. Hierbei sind solche Derivate
bevorzugt, die die Fähigkeit
des unveränderten
Proteins/Polypeptides, z.B. die Aktivität anderer Proteine zu beeiflussen
oder diese zumindest zu binden, behalten haben (funktionelle Derivate).
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Die
Erfindung beruht auf der überraschenden
Erkenntnis, dass das Ewing Sarkom Protein sowie davon abgeleitete
Derivate (im folgenden als EWS bezeichnet) die Fähigkeit haben, mit nukleären Rezeptoren (bzw.
Derivaten derselben) zu interagieren und deren Aktivität zu modulieren.
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Die
Superfamilie der nukleären
Rezeptoren (NRs), zu der mehr als 50 verschiedene Proteine gehören, ist
eine Gruppe verwandter Transkriptionsfaktoren, die die Transkription
des jeweiligen Zielgens als Reaktion auf spezifische Liganden, z.
B. Hormone, steuern. Die Familie kann nach bestimmten Charakteristika,
wie z.B. Dimerisationsstatus, Art des Liganden oder Struktur des
DNA-Reaktionselements, in mehrere Subfamilien unterteilt werden
(Beato et al., 2000, Human Reproduct. Update, 6, 225–236). Charakteristisches
Merkmal der NRs ist die übereinstimmende
Struktur der funktionellen Domäne
(mit den Bezeichnungen A bis F) mit einer stark variablen, nur schwach
konservierten N-terminalen
Region mit autonomer konstitutiver Aktivierungsfunktion (AF-1),
einer stark konservierten DNA-Bindungsdomäne (DBD), die für die Erkennung
von speziellen DNA-Reaktionselementen
verantwortlich ist und aus zwei Zinkfinger-Motiven besteht, einer
variablen Scharnierdomäne
und einer konservierten multifunktionalen C-terminalen Ligandenbindungsdomäne (LBD)
mit Dimerisations- und Liganden-abhängiger Transaktivierungsfunktion
(AF-2). Im Anschluss daran folgt die am weitesten C-terminal gelegene
Region, deren Funktion nicht bekannt ist und die bei Rezeptoren
wie z.B. PR (Progesteron-Rezeptor), PPAR (Peroxisomproliferator-aktivierter
Rezeptor) und RXR (Retinoid-X-Rezeptor)
fehlt (Mangelsdorf & Evans,
1995; Cell, 83, 841–850;
Robyr et al., 2000, Mol. Endocrinol., 14, 329–347). Für einige NRs (z.B. den Androgen-Rezeptor
(AR)) wurde nachgewiesen, dass die N-terminale Region in der Lage
ist, mit der C-terminalen Region zu interagieren (Brinkmann et al.,
1999, J. Steroid Biochem. and Mol. Biol., 69, 307–313). Steroidhormonrezeptoren
wie z.B. Estrogen- (ER), Progesteron- (PR), Glukokortikoid(GR),
Mineralokortikoid- (MR) und Androgenrezeptoren (AR) binden steroidale
Liganden, die sich von Pregnenolon ableiten, wie die Progestine,
die Estrogene, die Glukokortikoide und die Mineralokortikoide, sowie
Androgene. Die Ligandenbindung aktiviert den Rezeptor und steuert
die Expression entsprechender Zielgene.
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EWS
ist bekannt als Proto-Onkogen des Ewing-Sarkoms und anderer Neoplasien
wie z.B. der Klarzellsarkome von Sehnen und Aponeurosen, der klein-
und rundzelligen desmoplastischen Intraabdominaltumoren sowie der
extraskeletalen Chondrosarkome (Delattre, O., Zucman, J., Plougastel,
B., Desmaze, C., Melot, T., Peter, M., Kovar, H., Joubert, I., de
Jong, P., Rouleau, G., Aurias, A., and Thomas, G., 1992, Nature
359: 162-165, Zucman,
J., Delattre, O., Desmaze, C., Epstein, A. L., Stenman, G., Speleman,
F., Fletchers, C.D., Aurias, A., and Thomas, G; 1993, Nature Genet.
4: 341–345,
Gerald, W. L, Rosai, J. and Ladanyi, M., 1995, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92: 1028–1032,
Laballe, Y., Zucman, J., Stenman, G., Kindblom, L.G., Knight, J., Turc-Carel,
C., Dockhorn-Dworniszak,
B., Mandahl, N., Desmaze, C., Peter, M., Aurias, A., Delattre, O.,
and Thomas, G., 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2219–2226). Bei all diesen Tumoren
wird der EWS-Genlocus
umarrangiert, so dass das Aminosäuren-Ende
(N-Terminus) des Proteins mit einer DNA-Bindungsdomäne von FLI1,
ERG1, ATF1 oder WT1 verschmilzt. Dieses N-terminale Ende des fusionierenden Proteins
enthält
die EWS-Exone 1–7
oder 1–8
oder 1–9.
Liegt die Bruchstelle zwischen Exon 7 und Exon 8, weist der EWS-Anteil des
durch die Fusion entstandenen Proteins keine Übereinstimmungen mit der hier
definierten Androgenrezeptorbindungsdomäne auf. Liegt dagegen die Bruchstelle
zwischen den Exonen 8 und 9 oder 9 und 10, stimmen nur 5 bzw. 20
Aminosäuren
der beiden onkogenen EWS-Fusionsproteine mit dem EWS-Anteil überein, der
die Androgenrezeptorbindungsdomäne
enthält.
Daraus ist zu schließen,
dass die umarrangierten EWS-Fusionsproteine die Fähigkeit
zur Bindung an Androgenrezeptoren verloren haben.
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Bei
der Analyse von Thymus-RNA mittels RT-PCR wurde eine EWS-Variante
(EWS1-c), bei der 17 Aminosäuren
fehlten (3), gefunden.
Offensichtlich handelt es sich hierbei um eine Splice-Variante,
da alle notwendigen Konsensus-Sequenzen an den Nahtstellen zwischen
Intronen und Exonen vorhanden waren. Das Ergebnis war eine Verkürzung von
Exon 15 (Exon 15b). Im Stand der Technik sind darüber hinaus
weitere Splice-Varianten bekannt. Eine (Ohno, T., Ouchida, M., Lee,
L., Gatalica, Z., Rao, V.N., and Reddy, E.S., 1994, Oncogene 9:
3087–3097)
stellt ein um 200 by verkürztes
EWS-Transkript (EWS1-b)
dar und wurde in ruhenden oder durch Phytohämagglutinin (PHA) stimulierten
Lymphozyten gefunden. Dem EWS1-b fehlen die Exone 8 und 9. Eine
andere Variante (Melot, T., Dauphinot, L., Sevenet, N., Radvanyi,
F., Delattre, O. (2001), Eur. J. Biochem. 268, 3483–3489) enthält ein zusätzliches
Exon 4' zwsischen
den Exonen 4 und 5 und ist als gehirnspezifische Isoform bezeichnet.
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EWS
gehört
zu einer Gruppe RNA-bindender Proteine, denen im Stand der Technik
eine Implikation in Prozesse der RNA-Synthese bzw. -Prozessierung
zugeschrieben wird, daneben war über
die physiologische Funktion von somatischem wildtyp EWS bislang
jedoch nur wenig bekannt. Insbesondere war im Stand der Technik
nicht bekannt, dass EWS die Fähigkeit
besitzt, nukleäre
Rezeptoren zu binden und deren Aktivität zu modulieren, wodurch es
der Klasse der NR-Co-Modulatoren zuzuordnen ist.
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Ein
E. coli Stamm mit der Beezichnung Escherichia Coli EWS-10 CMX wurde
unter der Nr. DSM 15417 am 24. Janaruar 2003 bei der Deutschen Sammlung
von Mirkoorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) hinterlegt. Escherichia
Coli EWS-10 CMX enthält die
full length-EWS-cDNA, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden
kann.
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Die
sog. Co-Modulatoren sind eine Klasse von Proteinen, die bei der
Aktivierung (Co-Aktivatoren)
bzw. Repression (Co-Repressoren) der Gentranskription als Brückenmoleküle zwischen
dem Transkriptionsinitiationskomplex und den NRs dienen (McKenna
et al., 1999, Endocr. Rev., 20, 321–347). Ein Co-Aktivator muss fähig sein,
die Rezeptorfunktion zu verstärken
und in Anwesenheit eines Agonisten mit der Aktivierungsdomäne von NRs
direkt zu interagieren. Er muss auch mit dem basalen Transkriptionsapparat
interagieren, und schließlich
darf er nicht selbst die basale Transkriptionsaktivität verstärken. Die
meisten Co-Modulatoren interagieren mit Hilfe eines oder mehrerer
LXXLL-Motiv(en)
(NR-Boxes) mit der AF-2-Domäne
von NRs, jedoch wurden auch einige Co-Modulatoren beschrieben, die mit anderen
NR-Regionen interagieren (Ding et al., 1998, Mol. Endocrinol., 12,
302–313).
Ferner wurden viele Co-Modulatoren identifiziert, die in ähnlicher
Weise mit mehreren verschiedenen NRs interagieren.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann sowohl in vitro (also z.B. als rein biochemischer oder biophysikalischer
Assay, in Lösung
oder in geeigneten soliden Matrizes, etc.) als auch teilweise oder
gänzlich
im zellulären
System ablaufen. Dem Fachmann sind solche unterschiedlichen Testsysteme
hinlänglich
bekannt.
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Vorzugsweise
läuft mindestens
einer der Verfahrensschritte im zellulären System ab, da die Effekte der
steroidvermittelten Transkriptionsaktivierung im physiologischen
Kontext der Zelle besonders gut darstellbar sind. Demzufolge eignen
sich für
die Erfindung insbesondere eukaryontische Zellen, wobei sowohl primäre Zellen
als auch etablierte Zellinien zum Einsatz kommen können. Die
Verwendung etablierter Zelllinien erlaubt eine besonders gute Reproduzierbarkeit
und Kostengünstigkeit,
die Verwendung primärer
Zellen vermeidet dagegen weitgehend durch Mutation und klonale Selektion
bedingte Zellkultur-Artefakte. Besonders geeignet sind Prostatazellen,
Nervenzellen, Gliazellen, Fibroblasten, Blutzellen, Osteoblasten,
Osteoklasten, Hepatozyten, Epithelzellen oder Muskelzellen.
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Der
hier bestimmte (d.h. identifizierte, quantifizierte oder charakterisierte)
hormonelle Effekt kann sowohl aktivatorischer als auch inhibitorischer
Natur sein und neben der Einwirkung auf die Rezeptor-Co-Modulator-Bindung
auch jeden anderen Schritt der NR-Aktion beziehen, z.B. die Liganden-induzierte
Transaktivierung aber auch Kernlokalisierung des NR.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
umfasst das efindungsgemäße Verfahren
die folgenden Schritte:
- a. Zunächst werden
Zellen, die EWS oder ein Derivat davon und NR oder ein Derivat davon
exprimieren, der zu testenden Substanz ausgesetzt.
- b. Es folgt dann die Bestimmung des Einflusses der Substanz
auf die Interaktion zwischen dem Rezeptor oder dessen Derivat und
EWS oder dessen Derivats durch Messung der Protein-Protein-Interaktion
oder der Protein-Protein-DNA-Interaktion.
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Die
Expression einer oder beider der miteinander interagierenden Komponenten
(EWS/Derivat einerseits und NR/Derivat andererseits) kann in der
Zelle von Natur aus oder infolge transienter oder stabiler Transfektion
mit geeigneten Expressionsvektoren erfolgen. Die Auswahl geeigneter
Zelltypen und ggf. Vektorsysteme stellt eine dem zuständigen Fachmann
geläufige
Massnahme dar. Zur Expression im eukaryontischen System eignen sich
beispielsweise pCMX oder pSG5 als Vektoren.
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Die
Messung der Protein-Protein-Interaktion zwischen Rezeptor bzw. Derivat
und EWS bzw. Derivat oder der Protein-Protein-DNA-Interaktion der
vorgenannten Komponenten mit der DNA-Zielsequenz erfolgt durch dem
Fachmann bekannte Massnahmen. Hierzu eignen sich beispielsweise
Techniken wie das Two-Hybrid-System, Co-Immunpräzipitation, GST-Pull-down-Assays,
FRET-Analaysen und ABCD-Assays bzw. Gelretardationsassays zur Analyse
von Protein-Protein-DNA Interaktionen.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfasst die Schritte:
- a. Zellen, die EWS oder
Derivat davon und NR oder ein Derivat davon exprimieren und mit
einem Reportergenkonstrukt transfiziert sind, werden dem Liganden
des nukleären
Rezeptors und der zu testenden Substanz ausgesetzt,
- b. Bestimmung der Transkriptionsaktivität von NR durch Messung der
Reportergenaktivität
und
- c. Vergleich mit der Transkriptionsaktivität bei Durchführung der
Schritte a und b in Abwesenheit der zu testenden Substanz.
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Reportergene
sind Gene oder Genfragmente, die für möglichst einfach nachweisbare
Genprodukte kodieren, z. B. photometrisch durch Farbreaktionen.
Häufig
verwendete Reportergene sind das Gen für β-Galactosidase, das Gen für die alkalische
Phosphatase, das Gen für
Chloramphenicol-Acetyltransferase, das Gen für die Catechol-Dioxygenase, das
Gen für
das „green" oder „blue fluorescent
protein" sowie verschiede ne Luciferase-Gene,
die die Zellen zum Leuchten bringen können. Durch Vorschaltung eines
geeigneten Kontrollelementes, z.B. einer Promotor-Enhancer Sequenz,
die unter der Kontrolle eines bestimmten Transkriptionsfaktors oder
einer bestimmten Signaltransduktionskaskade steht, kann beispielsweise
die Aktivität
des Transkriptionsfaktors bzw. der Kaskade anhand der Menge des
exprimierten Genproduktes bestimmt werden.
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Herkömmlicherweise
werden derartige Reportergene in geeigneten Vektoren unter Vorschaltung
der interessierenden Promotor-Enhancer Sequenz in die Zellen eingebracht.
Zur Analyse der steroidalen Aktivität von Substanzen eignen sich – abhängig vom
zu analysierenden NR – alle
bekannten NR-Zielsequenzen. Beispiel einer solchen Vektors, ist
der Vektor MMTV-Luciferase, der zur Messung der androgenen Wirkung
von Substanzen eingesetzt wird.
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Substanzen
mit einem hormonellen Effekt, vorzugsweise einem androgenen/antiandrogenen
Effekt, sind dann an der im Vergleich zu Versuchsansätzen ohne
Beigabe der zu testenden Substanz erhöhten bzw. verminderten Expression
des Reportergens erkennbar.
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Zur
Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung eignen sich, neben
wildtyp EWS, EWS Derivate, und hier besonders funktionelle EWS-Derivate,
die die Fähigkeit
behalten haben, die Aktivität
mindestens eines nukleären
Rezeptors, insbesondere die von Androgenrezeptoren, zu modulieren
oder diesen zumindest zu binden (in durch geeignete Methoden nachweisbarer
und nicht zu vernachlässigender
Weise – z.B.
in Protein-Protein Interaktionsassays wie EMSA; der zuständige Fachmann
kann hier differenzieren). Analoges gilt für die NR-Derivate: Auch hier
sind solche Derivate bevorzugt, die die Fähigkeit behalten haben, durch
EWS oder seine funktionellen Derivate moduliert oder zumindest gebunden
zu werden.
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EWS
und EWS kodierende Nukleinsäuren
sind im Stand der Technik bereits bekannt (s.o.). Zur Verwendung
im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein durch
die Nukleinsäure
gemäß Seq. ID No.
1 kodiertes EWS, bzw. ein abgeleitetes Derivat geeignet (insbesondere
ein funktionelles Derivat). Besonders bevorzugt ist ein EWS Derivat,
welches die Aminosäuren
319 bis 656 der in Seq. ID No. 1 beschriebene Sequenz aufweist,
insbesondere ein Fragment, welches aus diesen Aminosäuren besteht.
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Die
Erfindung bezieht sich demgemäß auch auf
die Verwendung von EWS bzw. dessen Derivaten zur Identifizierung
und Charakterisierung von Substanzen, die die Aktivität von NR
beeinflussen.
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Die
Erfindung betrifft überdies
die Verwendung von Nukleinsäuren
mit mindestens 70 Homologie zu Seq. ID. No. 1 oder zum Sequenzbereich
8 bis 2032 oder dem Sequenzbereich 1000 bis 2011 der Seq. ID. No. 1
zur Identifizierung und Charakterisierung von Substanzen, die die
Aktivität
von Nukleäre
Rezeptoren beeinflussen. Bevorzugterweise sind derartige Nukleinsäuren in
Expressionskassetten geeigneter Expressionsvektoren, insbesondere
eukaryontischer Expressionsvektoren, kloniert.
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Der
Begriff „Nukleinsäuren mit
mindestens 70 % Homologie zu Seq. ID No. 1" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung
als den gesamten Bereich zwischen 70 % bis 100 Homologie (also völlige Übereinstimmung
mit Seq. ID No. 1) betreffend verstanden. Die Auswahl von für den jeweiligen
Zweck geeigneten Nukleinsäure
im genannten Homologiebereich liegt im Bereich der herkömmlichen
fachmännischen
Fähigkeiten.
Die Bestimmung der Nukleinsäurehomologie
erfolgt in dem zuständigen
Fachmann geläufiger
Weise. Hierzu können
verschiedene, dem Fachmann bekannte Computer Programme verwendet
werden (z.B BLAST; BLAST-2, ALIGN oder Megalign (DNASTAR).
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
bzw. die erfindungsgemäße Verwendung
der genannten Proteine bzw. Nukleinsäuren eignet sich insbesondere
zur Analyse des hormonellen Effektes von Substanzen auf Androgenrezeptoren,
Estrogenrezeptoren (α und β), Progesteronrezeptoren
(A und B), Glukokortikoidrezeptoren, Mineralokortikoidrezeptoren,
Schilddrüsenhormonrezeptoren,
Vitamin-D-Rezeptoren, Peroxisomproliferator-aktivierter Rezeptoren,
Retinsäurerezeptoren,
Retinoid-X-Rezeptoren oder Orphan-Rezeptoren. Aufgrund der besonders
gut charakterisierten Wirkung von EWS bzw. EWS-Derivaten auf den
Androgenrezeptor, kommt dieser in besonders bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung zum Einsatz.
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Überdies
findet EWS Verwendung als klinischer Indikator androgenbedingter
Erkrankungen. Relevante androgenbedingte Erkrankungen sind z.B.
Prostatakrebs, Glatzenbildung, Akne oder Hypogonadismus, sowie Androgenresistenzsyndrome,
wie z.B. die testikuläre
Feminisierung. Diese beruhen vermutlich auf Defekten im Co-Modulationsmechanismus
zwischen Androgenrezeptor (AR) und EWS. Eine plausible diagnostische Möglichkeit
bei Patienten mit derartigen Störungen
bestünde
somit in der Messung der relativen Raten von AR und EWS. Dies ist
möglich
durch Anwendung quantitativer Verfahren zur Messung der relativen
Menge beider Moleküle
in dem Zielgewebe bei dem jeweiligen Patienten.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich demgemäß auf die
Verwendung einer Nukleinsäure
mit mindestens 70% Nomologie zu Seq. ID No. 1, zum Sequenzbereich
8 bis 2032 oder 1000 bis 2011 der Seq. ID No. 1 oder eines Antikörpers, welcher
gegen ein durch eine dieser Nukleinsäuren kodiertes Protein gerichtet ist,
zur Diagnose von Er krankungen, welche mit einer Dysfunktion einer
NR-Aktivität,
vorzugsweise der Androgenrezeptor Aktivität einhergehen.
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Eine
solche Verwendung kommt vorzugsweise im Rahmen eines Verfahrens
zur Bestimmung von Störungen
im Co-Modulationsmechanismus zwischen einem Androgenrezeptor und
EWS zur Anwendung, bei dem die zellulären Konzentrationen oder Gewebskonzentrationen
von Androgenrezeptor und EWS gemessen werden. Unter den verschiedenen,
dem Fachmann hierzu geeigneten Techniken eignen sich insbesondere
Radioimmunoassays, ELISAs, Immunfärbungen, quantitative RT-PCRs
oder Western Blots.
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Derartigen
Messungen der relativen Raten von AR versus EWS liegt die Theorie
zugrunde, dass ein Androgenresistenzsyndrom auf einer Störung des
Gleichgewichts zwischen AR- und EWS-Prävalenz in den Zielzellen beruht.
Zuviel EWS könnte
zu einer Überempfindlichkeit
des AR-Systems führen,
so dass es auf Moleküle
reagiert, die normalerweise keinen androgenen Effekt haben. Unterempfindlichkeit
durch Fehlen oder Fehlfunktion von EWS kann auf allen Ebenen zur
Androgenresistenz führen.
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Darüber hinaus
ist es möglich,
mit Hilfe geeigneter EWS-cDNA Primer, einen PCR-Assay zu konstruieren, mit dem sich
bei bestimmten Patienten Mutationen der normalen DNA-Sequenz nachweisen
oder Transkripte für
den Northern Blot Assay bzw. eine DNA für In-situ-Hybridisierungsassays
generieren lassen.
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Der
Nachweis von zu viel EWS bei einem Patienten spräche für die Anwendung von Mitteln
oder Maßnahmen
zur Senkung des EWS Spiegels, beispielsweise mittels Antisense-Nukleinsäuren gegen
EWS oder EWS Derivate oder ähnlicher
Techniken, um unter klinischen Bedingungen den EWS-Titer bei dem
jeweiligen Patienten zu reduzieren. Dasselbe könnte durch Moleküle erreicht
werden, die in der Lage sind, die Interaktion zwischen AR und EWS
zu hemmen.
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Hat
ein Patient dagegen einen zu niedrigen EWS-Spiegel, könnte man
ihm EWS-cDNA, -Protein oder -DNA über verschiedene Mechanismen
zuführen,
um auf diese Weise den Titer des aktiven EWS zu erhöhen. Ein
weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich demgemäß auf die
Verwendung der vorgenannten EWS oder EWS-Derivate kodierenden Nukleinsäuren bzw.
EWS Proteine EWS-Derivate die durch eine solche Nukleinsäure kodiert
werden, zur Therapie von durch die Dysfunktion der NR-Aktivität bedingten
Erkrankungen.
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand eines Beispiels unter Bezugnahme
auf die Abbildungen näher erläutert.
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Es
stellen dar: 1 eine
schematische Darstellung des Gens für den Androgenrezeptor (AR)
und das AR2-Fragment,
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2 eine schematische Darstellung
des Gens für
das Ewing-Sarkom-Protein (EWS),
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3 die Sequenzen von EWS-Exonen
und -Proteinen
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4 die Co-Aktivierung des
AR-Signals in SH-SY5Y-Zellen,
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5 zeigt die Gewebsverteilung
des EWS-Transkripts (5a)
und des AR-Transkripts (5b).
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Beispiel 1:
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Verwendete Oligonukleotide:
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- Primer für
die PCR-Amplifikation der Bibliotheks-Inserts:
Act2c5050Eco:
gattacgctagcttgggtgg (SEQ ID Nr. 3)
Act2-4939Xho: gttgaagtgaacttggcgggg
(SEQ ID Nr. 4)
- Primer für
die Amplifikation von EWS-cDNA in voller Länge:
EWS-8-Sal: gggtcgacggacgttgagagaacgagg
(SEQ ID Nr. 5)
cESW-c2032-Eco: gggaattctgcggggtctctgcatctagtaggg
(SEQ ID Nr. 6)
- Sequenzierungs Primer:
XII-139a1: gcttgggtggtcatatgg (SEQ
ID Nr. 7)
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Verwendete Vektoren:
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- pACT2 (Genbank-Zugangsnummer 029899) für die Bibliothek;
- pGBT9-Derivate für
die Sonden: pGBT9rev und pGBT(+1)rev (Roder, K. H.; Wolf, S.S.;
Schweizer, M., 1996, Analytical Biochemistry 241, 260–62);
- pCR2.1Topo-Vektor (Firma Invitrogen) für die Klonierung von PCR-Fragmenten;
CMX-Vektor für
die Expression in Säugetierzellen;
- pAHIuc für
den Reportergen-Assay (enthält
den MMTV-Promoter und ein Luciferase-Reportergen; Firma A. Cato);
- pSG5AR (pSG5 mit dem humanen Gen für den Androgenrezeptor; Genbank-Zugangsnummer AAA51775).
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Verwendete Organismen:
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- Hefestämme:
Y187 und PJ69-2A
- E.-coli-Stamm: DH5α
- Säugetierzellen:
SH-SY5Y (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSMZ): DSM ACC209);
PC3 (American type Culture Collection
(ATCC): CRL-1435);
PC3AR: mit pSG5AR stabil transfizierte PC3
(Firma A. Cato, Karlsruhe, Deutschland).
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Zur
Identifizierung neuer Co-Modulatoren des Androgenrezeptors, wurde
mit Hilfe des Hefe-Zweihybrid-Systems eine cDNA-Bibliothek Humane
cDNA-Bibliothek („Matchmaker" der Firma Clontech;
Nr. HY4028AH) aus fetalem Gehirn mit drei verschiedenen Fragmenten
des Androgenrezeptors (AR) als Sonde gescreent.
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Hierzu
wurde der Vektor pSG5AR, der die cDNA für den humanen AR enthält (Genbank
AAA51775), mit Hilfe der. Endonuklease PstI so aufgespalten, dass
drei verschiedene AR-DNA-Fragmente entstanden. Das kürzeste dieser
Fragmente (AR4) kodiert für
den N-Terminus des Rezeptors (AS 1-56), das mittlere (AR3) für den Mittelteil
mit den Aktivierungsdomänen
(AS 57-324) und das längste
(AR2) für
den C-Terminus (AS 325-918)
mit der DNA- und der Ligandenbindungsdomäne (DBD und LBD; vergleiche Übersicht
in 1). AR2 wurde in
den pGBT9(+1)rev-Vektor kloniert, nachdem dieser vorher mit Hilfe
von PstI linearisiert worden war.
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Anschliessend
erfolgte die Transformation des pGBT-Vektors, der das AR-Fragment
enthielt, in den Hefestamm PJ69-2A. Die positiven Transformanten
(Trp+) wurden nach den Anweisungen des Herstellers (Clontech) mit
einer aus fetalem Gehirn gewonnenen cDNA-Bibliothek inkubiert (Humane
Multiple-Tissue-cDNA (MTC), Panel II der Firma Clontech; Kat.: Nr.
K1421-1). In Übereinstimmung
mit den Anweisungen des Herstellers (Clontech) wurden 3 × 106 Klone gescreent. Die positiven Klone wurden
selektiert und nach den Anweisungen des Herstellers (Clontech) auf
ihre R-Galaktosidase-Aktivität getestet.
Die der Bibliothek entstammenden Inserts blauer Kolonien wurden
mittels PCR und unter Verwendung der Primer Act2c5050Eco und Act 2-4939Xho
direkt aus den Hefezellen amplifiziert.
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Die
PCR-Produkte wurden gelelektrophoretisch ihrer Länge nach aufgetrennt und mittels
Spaltung durch MspI weiter analysiert. Mindestens ein Exemplar jedes
Restriktionsfragmentmusters wurde unter Verwendung von XII-139a1
als Sequenzprimer sequenziert. Die Sequenzen wurden mit der Genbak
oder der Datenbank Incyte abgeglichen.
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Eines
der mehrfach identifizierten Inserts hatte eine Länge von
1500 by und konnte durch Sequenzierung und Sequenzvergleich mit
der Datenbank NCBJ als für
den C-terminalen
Anteil des menschlichen EWS (AS 319-656) kodierend identifiziert
werden (Übersicht
in 2; Aminosäurensequenz
in 3).
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3 zeigt cDNA Sequenz von
humanem EWS mitsamt der abgeleiteten Aminosäuresequenz. Dargestellt sind
die Exone 1 bis 17. Die fettgedruckten Buchstaben bezeichnen das
Fragment, das in Hefe-Zweihybrid-Systemen zu finden ist und an den
AR-Abschnitt AS 325 bis AS 919 bindet. Unterstrichen sind die in den
Splice-Varianten
ESW1-b (durchgängig
unterstrichen) bzw. EWS1-c (gepunktete Unterstreichung) fehlenden
Sequenzbereiche.
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Mittels
PCR und unter Verwendung der Primer EWS-8-Sal und cEWS-c2032-Eco
sowie Thymus- oder Milz-cDNA der Firma Clontech wurde EWS in voller
Länge amplifiziert,
wobei aus der Milz die vollständige
codierende Region des Transkriptes und aus dem Thymus die Variante
mit Exon 15 B anstelle von Exon 15 isoliert wurde. Die amplifizierte
cDNA wurde dann mit EcoRI und SaI I in die Expressionscassette des
Säugetierexpressionsvektors
CMX kloniert.
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Wie
aus dem in 4 dargestellten
Säulendiagramm
hervorgeht, ist EWS nach transienter Transfektion in SH-SY5Y-Zellen
fähig,
eine starke Co-Aktivierung der AR-Signaltätigkeit herbeizuführen, insbesondere bei
niedrigen Androgenkonzentrationen von 10–12–10–10 mol.
Hierzu wurden auf Reaktionsplatten mit jeweils sechs Reaktionsmulden
SH-SY5Y-Zellen mit 0,75 μg
eines Vektors, der die cDNA für
den humanen Androgenrezeptor enthielt (pSG5AR), 1,5 μg des Reportergenkonstrukts
pAHIuc, das vor dem Luciferase-Gen den MMTV-Promotor enthält, und
1 μg des
EWS-CMX-Vektors co-transfiziert. Die Transfektion erfolgte unter
Verwendung von Lipofectin von der Firma Gibeo BRC nach Angaben des
Herstellers. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden
die Zellen über
Nacht mit unterschiedlichen Androgenmengen inkubiert. Die Zellen
wurden mit einem herkömmlichen
Lysispuffer lysiert, und die Luciferase-Aktivität im Lumistar-Luminometer von
BMG Lab Technologies gemessen. Die EWS-CMX-Luciferase-Aktivitäten wurden
mit den Kontrollaktivitäten
verglichen (leerer CMX-Vektor). Die Mischung in jeder Mulde wurde
in vier Mulden einer Mikrotiterplatte gemessen. Die Kontrollwerte
der Substanz ohne DHT wurden subtrahiert. Die Standardbweichung
ist in der 4 durch Balken
eingezeichnet.
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Die
Gewebeverteilung des humanen EWS in normalem humanen Gewebe ist
in 5a anhand der dargestellten
Autoradiographien ersichtlich. Hierzu wurde ein EWS-cDNA-Fragment,
das für
die Aminosäuren 244-656
von EWS kodiert, nach dem MegaprimeTM DNA-Markierungssystem
(Amersham Life Science) mit 32P-α-dATP und dem Klenow-Fragment
markiert. Das markierte Fragment wurde auf einer Nick-Säule (Pharmacia)
nach Angaben des Herstelllers gereinigt und mit Human-Blots; Human Northern
Blot (MTN) der Firma Clontech Nr. 7760-1 und 7759-1) der Firma Clontech
hybridisiert. Wie aus der 5a hervorgeht,
wird EWS-RNA vorwiegend in den Hoden exprimiert. Darüber hinaus
sind in den meisten untersuchten Organen unterschiedliche EWS-Mengen
nachweisbar.
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5b zeigt die Gewebeverteilung
des humanen AR in normalem humanen Gewebe.
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Aus
den 5a und 5b lassen sich die Normexpressionen
dieser beiden Proteine im Gewebe ermittlen.
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4 zeigt die Co-Aktivierung
des AR-Signals in SH-SY5Y-Zellen. In eine Reaktionsplatte mit sechs Reaktionsmulden
wurden pro Mulde 1 μg
Co-Aktivator, 1,5 μg
MMTV-Luciferase und 0,75 μg
pSG5AR-Plasmid gegeben. Die sechs Mischungen wurden in jeweils vier
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte überführt und dort gemessen. Die
Fehlerabweichung ist als SD angegeben. Bei allen Signalen wurden
die Werte der entsprechenden Kontrollen ohne DHT subtrahiert.
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5a zeigt die Gewebsverteilung
des EWS-Transkripts (Northern Blot MTN der Firma Clontech). Nach
den Anweisungen des Herstellers (Amersham) erfolgte ein Zufallspriming
des EWS-cDNA-Fragments, das für
die Aminosäuren
244 bis 656 kodiert, und eine Markierung mit 32P-αdATP und
dem Klenow-Fragment. Die Blots wurden mit der Sonde hybridisiert,
gewaschen, auf einen Film übertragen
und entwickelt.
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