DE10251244A1 - Verfahren zur Auffindung neuer antihyperlipidämischer Wirkstoffe (Lipidsenker) auf der Basis des Nikotinsäure-Rezeptors - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von antihyperlipidämisch wirkenden Verbindungen ("Lipidsenkern"), basierend auf einer Wechselwirkung der zu testenden Verbindungen mit einem Nikotinsäure-bindenden Protein ("Nikotinsäure-Rezeptor") oder einem biologisch aktiven Derivat davon, sowie einen auf diesem Verfahren basierenden Kit. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieses Nikotinsäure-Rezeptors oder eines biologisch aktiven Derivates davon als Bindungsprotein für antihyperlipidämisch wirkende Verbindungen.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von antihyperlipidämisch wirkenden Verbindungen ("Lipidsenkern"), basierend auf einer Wechselwirkung der zu testenden Verbindungen mit einem Nikotinsäurebindenden Protein ("Nikotinsäure-Rezeptor") oder einem biologisch aktiven Derivat davon, sowie einen auf diesem Verfahren basierenden Kit. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieses Nikotinsäure-Rezeptors oder eines biologisch aktiven Derivates davon als Bindungsprotein für antihyperlipidämisch wirkende Verbindungen.
  • Wesentliche Risikofaktoren für die Entstehung von kardiovaskulären Erkrankungen, die zu den häufigsten Erkrankungen in den Industrienationen zählen, stellen Fettstoffwechselstörungen dar, die erhöhte Lipidwerte in Patienten zur Folge haben. Eine der wichtigsten Behandlungsstrategien für kardiovaskuläre Erkrankungen ist daher die Behandlung dieser Patienten mit sogenannten Lipidsenkern.
  • Nikotinsäure ist der älteste bekannte Lipidsenker. Nikotinsäure verringert die Lipolyse im Fettgewebe (Carlson, Acta Med. Scand. 173: 719, 1963), was zu einer Abnahme der Triglycerid- und Cholesterinspiegel führt (Olsson, Handbook of Experimental Pharmacology Bd. 109 (Hrsg. Schettler & Habenicht) S. 349–400, 1994; Knopp, N. Engl. J. Med. 341: 498–511, 1999). Nachteilig bei der Behandlung mit Nikotinsäure ist, daß relativ hohe Dosen verabreicht werden müssen, die wahrscheinlich für die Entstehung von Nebenwirkungen mitverantwortlich sind. Insbesondere das "Flushing" – eine intensive Gesichtsröte, die subjektiv als unangenehme Hitze empfunden wird – und Hautirritationen sind vorübergehende, jedoch harmlose Nebenwirkungen, führen aber zu einer mangelnden Akzeptanz der Einnahme von Nikotinsäure bei Patienten.
  • Seit Ende der achtziger Jahre werden daher verstärkt HMG-CoA-Reduktasehemmer als Lipidsenker eingesetzt. In mehreren Arbeiten konnte auch ein positiver Effekt von Nikotinsäure als Zusatztherapie zu diesen HMG-CoA-Reduktasehemmern nachgewiesen werden (Braun et al., N. Engl. J. Med. 345: 1583–1592, 2001; Wink et al., Am. Heart. J. 143: 514–518, 2002). Der Vorteil von Nikotinsäure beruht darauf, daß Nikotinsäure die HDL-Cholesterin-Plasmakonzentration im Patienten um 15 bis 35% erhöht, während dieser Effekt bei den oben genannten HMG-CoA-Reduktasehemmern nur bei 5 bis 15% liegt (Olsson, supra; Knopp, supra).
  • Dementsprechend besteht ein Bedarf, neue Arzneimittel zu entwickeln, welche die antihyperlipidämische Wirkung von Nikotinsäure aufweisen, bei denen aber die oben genannten Nebenwirkungen fehlen. Dies erfordert ein detailliertes Verständnis des molekularen Mechanismus, auf welchem die Wirkung von Nikotinsäure beruht. Seit langem ist bekannt, daß die antihyperlipidämische Wirkung von Nikotinsäure primär auf der verringerten Lipolyse im Fettgewebe durch Hemmung der hormonsensitiven Triglycerid-Lipase basiert (Carlson, supra). Weitere Untersuchungen zeigten, daß diese antilipolytische Wirkung von Nikotinsäure auf der Hemmung der cAMP-Akkumulation im Fettgewebe durch Hemmung der Adenylatzyklase beruht, wobei die Wirkung durch Pertussistoxinsensitive G-Proteine des Gi-Typs vermittelt wird (Aktories et al., FEBS Lett. 115: 11–4, 1980; Lorenzen et al., Mol. Pharmacol. 59: 349–357, 2001). Der spezifische molekulare Rezeptor, an welchen die Nikotinsäure bindet, ist jedoch bisher nicht bekannt.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neues System zur Auffindung antihyperlipidämisch wirkender Verbindungen bereitzustellen, welches auf dem molekularen Wirkmechanismus von Nikotinsäure basiert.
  • Diese Aufgabe wird durch die in den beigefügten Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst. Insbesondere wird ein Verfahren zum Nachweis von antihyperlipidämisch wirkenden Verbindungen bereitgestellt, umfassend
    • (a) das Zugeben einer zu testenden bzw. zu untersuchenden Verbindung zu einem System, welches mindestens ein erstes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus SEQ-ID-Nr.1 und SEQ-ID-Nr.2, oder ein biologisch aktives Derivat davon enthält, und
    • (b) das Bestimmen der antihyperlipidämischen Wirkung der in Schritt (a) zugegebenen Verbindung.
  • Das im erfindungsgemäß verwendeten System enthaltene erste Polypeptid als Bindungsprotein für antihyperlipidämisch wirkenden Verbindungen weist eine hohe Bindungsspezifität und -affinität zu Nikotinsäure auf und wird im Fettgewebe von Säugern stark exprimiert. Somit kann dieses erste Polypeptid auch als ein Rezeptor für Nikotinsäure betrachtet werden.
  • In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt das System Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, welche das erste Polypeptid enthalten. Der Begriff "Zellen" umfaßt gezüchtete Zellen, beispielsweise CHO-Zellen, COS7-Zellen, HeLa-Zellen, NIH3T3-Zellen oder HEK293-Zellen ("Human embryonic kidney"-Zellen, Subklon 293), und in einem Säuger enthaltene Zellen, beispielsweise in der Maus, Kaninchen oder Hund.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten die Zellen ferner ein zweites Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus SEQ-ID-Nr. 3 oder SEQ-ID-Nr.4, oder ein biologisch aktives Derivat davon.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Zellen sind vorzugsweise Zellen, welche das erste und/oder zweite Polypeptid stabil oder transient exprimieren. Der Begriff "stabile Expression" bedeutet, daß die Zellen mit einem geeigneten Expressionsvektor, welcher die für das erste und/oder zweite Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthält, transfiziert werden und der Expressionsvektor oder Abschnitte des Expressionsvektors, welche die für das erste und/oder zweite Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenzen, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten, heterologen regulatorischen Sequenzen, enthalten, in das genetische Material der Zellen integriert werden. Der Begriff "transiente Expression" bedeutet, daß die Zellen mit einem Expressionsvektor, welcher die für das erste und/oder zweite Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenzen enthält, transfiziert werden, wobei der Expressionsvektor oder Abschnitte davon nicht in das genetische Material der Zellen integriert werden. Erfindungsgemäß zu verwendende Expressionsvektoren mit geeigneten regulatorischen Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt und/oder im Handel erhältlich, beispielsweise pcDNA3.1 (Invitrogen), pCMV (Stratagene) oder virale Expressionssysteme.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Zellen ein Genprodukt bzw. Reportergenprodukt enthalten, dessen Expression durch die Bindung einer antihyperlipidämisch wirkenden Verbindung an das erste Polypeptid direkt oder indirekt über eine Signalübertragungskaskade induziert wird. Beispielsweise kann durch die Bindung einer antihyperlipidämisch wirkenden Verbindung an das erste Polypetid die für die Expression eines derartigen Reportergenprodukts verantwortliche regulatorische Sequenz auf Transkriptionsebene aktiviert werden, wodurch die Expression des Reportergenprodukts induziert wird. Reportergenprodukte kodierende Nukleinsäuresequenzen können mit geeigneten, beispielsweise vorstehend beschriebenen Expressionsvektoren, in die Zellen eingeschleust werden. Selbstverständlich können auch Expressionsvektoren mit für das erste und/oder zweite Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenzen und dem Reportergen verwendet werden. Beispiele für Reportergenprodukte sind das "green fluorescent protein", das "green fluorescent protein" fusioniert mit Aequorin, β-Lactamase, Luziferase, Chloramphenicolacetyltransferase, β-Galactosidase und das menschliche Wachstumshormon. Beispiele für geeignete regulatorische Sequenzen in den Expressionsvektoren sind Promotoren, die durch Calcium oder Protein-Kinase C aktiviert werden können.
  • Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff "biologisch aktives Derivat" jegliche proteinartige, modifizierte Verbindung, die sich von jeder der Sequenzen der SEQ-ID-Nrn. 1 bis 4 ableitet, mit im wesentlichen gleicher biologischer Funktion wie die in SEQ-ID-Nr. 1 bis 4 aufgelisteten Polypeptide; beispielsweise haben von den Sequenzen mit den SEQ-ID-Nrn. 1 und 2 abgeleitete Derivate eine im wesentlichen gleiche oder höhere Bindungsaffinität für Nikotinsäure und beispielsweise haben von den Sequenzen mit den SEQ-ID-Nrn. 3 und 4 abgeleitete Derivate eine im wesentlichen gleiche oder höhere Bindungsaffinität für das erste Polypeptid, sowie die im wesentlichen gleiche oder verbesserte Fähigkeit des zweiten Polypeptids nach Bindung einer antihyperlipidämisch wirkenden Verbindung an das erste Polypeptid, von diesem zu dissoziieren und an ein Effektorenzym zu binden, das in seiner Aktivität gesteigert oder gehemmt wird. Die Modifikationen im biologisch aktiven Derivat können eine oder mehrere Deletionen, Substitutionen, Additionen von Aminosäuren auf genetischer und/oder posttranslationaler Ebene und/oder posttranslationale, chemische und/oder enzymatisch durchgeführte Modifikationen der Aminosäure-Seitenketten umfassen.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt das System einen Träger, auf welchem mindestens das erste Polypeptid oder die vorstehend definierten Zellen oder Teile dieser Zellen, wie beispielsweise das erste Polypeptid enthaltende Zellmembranen, aufgebracht sind. Das Trägermaterial unterliegt keiner besonderen Einschränkung und kann jedes Material, wie beispielsweise Kunststoffe mit Polymeren oder Copolymeren als Bindemittel, glasartige Materialien oder Halbleitermaterialien, in jeglicher Form, wie beispielsweise kugelförmig, flächig und/oder porös ausgebildete Formkörper, sein. In einer Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße verwendete System einen Biochip, auf welchem das erste Polypeptid oder die Zellen oder Teile dieser Zellen punktförmig, vorzugsweise in einer regelmäßigen Anordnung beispielsweise zur Computer-gesteuerten Auswertung, aufgebracht sind. Das erste Polypeptid kann nicht-kovalent oder kovalent an den Träger gebunden vorliegen.
  • Die zu testenden Verbindungen können in geeigneten Konzentrationen oder Konzentrationsreihen, abhängig von den Nachweisgrenzen des in Schritt (b) verwendeten Analyseverfahrens, zu dem entsprechenden System in Schritt (a) zugegeben werden. Die zu testenden Verbindungen können auch zur in Schritt (b) durchzuführenden Bestimmung eine Markierung, wie beispielsweise eine radioaktive, fluoreszierende oder immunologisch nachweisbare Markierung, aufweisen.
  • In Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die antihyperlipidämische Wirkung der zu testenden Verbindung, basierend auf deren Bindingsaffinität an das erste Polypetid bestimmt. Die Bestimmung der Bindungsaffinität sowie deren Auswertung hängt von dem in Schritt (a) erfindungsgemäß verwendeten System und der zu testenden Verbindung ab und kann beispielsweise spektroskopisch, z.B. fluorometrisch oder radiometrisch, immunologisch oder enzymatisch oder durch Hybridisierungsreaktionen, z.B. Northern Blot, oder mit einer geeigneten Kombination davon erfolgen.
  • Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind nachstehend aufgelistet: In Schritt (a) umfaßt das System
    • (i) Zellen, welche das erste Polypeptid enthalten oder
    • (ii) Zellen, welche das erste Polypeptid und das zweite Polypeptid enthalten, oder
    • (ii) Zellen, welche das erste Polypeptid, das zweite Polypeptid und eine Nukleinsäuresequenz, deren Expression durch Bindung von antihyperlipidämisch wirkenden Verbindungen an das erste Polypeptid unter Erhalt eines Reportergenproduktes induziert wird, enthalten; oder
    • (iv) das auf einen flächig ausgebildeten Träger punktförmig und in regelmäßiger Anordnung aufgebrachte erste Polypeptid ("Bio-Chip").
  • In Schritt (b) erfolgt die Bestimmung in den Zellen (i)–(iv) vorzugsweise
    • – durch das Messen der Bindungsaffinität und -spezifität der zu testenden Verbindung an das erste Polypeptid, oder
    • – durch die Messung der Aktivierung des G-Proteins bzw. der G-Protein-Signalkaskade über die Bindung einer zu testenden Verbindung an das erste Polypeptid als Nikotinsäure-Rezeptor.
  • Die Messung der Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Nikotinsäure-Rezeptoren umfaßt somit mindestens einen der folgenden Schritte:
    • (A) das Binden einer antihyperlipidämisch wirkenden Verbindung an den Nikotinsäure-Rezeptor, wobei der Rezeptor aktiviert wird und seinerseits an ein G-Protein bindet,
    • (B) den Austausch von GDP gegen GTP im G-Protein und die Dissoziation der α-Untereinheit von der β-, γ-Untereinheit im G-Protein oder (C) das Binden der aktivierten Gα-Untereinheit an ein Effektorenzym, das in seiner Aktivität gesteigert oder gehemmt wird.
  • Beispielsweise erfolgt die Bestimmung in den Zellen (i) durch das Messen der Aktivierung der extrazellulär signal-regulierten Kinase (ERK) (Phosphorylierung) oder durch das Messen des intrazellulären cAMP-Spiegels, wobei die Zellen zusätzlich den β2-Adreno-Rezeptor (SEQ-ID-Nr. 5) exprimieren und der cAMP-Spiegel durch den β-Adreno-Rezeptor-Agonist Isoproterenol oder durch den Adenylcyclase-Stimulator Forskolin erhöht wird. In den Zellen (ii) erfolgt die Bestimmung beispielsweise durch das Messen des intrazellulären Ca-Anstiegs oder durch das Messen der Hemmung der hormon-sensitiven Triglycerid-Lipase. In den Zellen (iii) erfolgt die Bestimmung beispielsweise durch das Messen der Expression des induzierbaren Reportergenproduktes.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit zum Nachweis von antihyperlipidämisch wirkenden Verbindungen, welcher mindestens das vorstehend definierte, erfindungsgemäß verwendete System enthält. Der Kit kann ferner Mittel zur Durchführung der in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens beschriebenen Bestimmung enthalten. Derartige Mittel können beispielsweise anti-phospho-ERK-1/2-Antikörper, 3H-markierte Nikotinsäure, cAMP-spezifische Antikörper, cAMP-spezifische Bindungsproteine (z.B. die regulatorische Untereinheit der Proteinkinase A), 3H-cAMP, α-32P-ATP (Messung der cAMP-Bildung durch Bestimmung des aus radioaktiv-markiertem ATP(α-32P]-ATP gebildeten 32P-cAMP in Membranfraktionen nach säulenchromtographischer Trennung), jeweils in Abhängigkeit des in Schritt (a) verwendeten Systems, sein.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des vorstehend definierten Systems, vorzugsweise des ersten Polypeptids, zur Bindung antihyperlipidämisch wirkender Verbindungen.
  • Mit dem erfindungsgemäß gekennzeichneten Verfahren ist es möglich, eine gezielte Suche nach neuen antihyperlipidämisch wirkenden Verbindungen durchzuführen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die antihyperlipidämisch wirkenden Verbindungen im High-Throughput-Screening (HTS), bei dem voll automatisch und Roboter-unterstützt große Substanzzahlen mit Hilfe geeigneter Verfahren getestet werden, nachgewiesen, wobei das erste Polypeptid oder biologisch aktive Derivate davon als "Drug-Target" dienen. Dieses überraschende Ergebnis beruht auf der Erkenntnis, daß die in SEQ-ID-Nr. 1 und 2 dargestellten Polypeptide als im Säuger vorkommende Nikotinsäure-Rezeptoren betrachtet werden können.
  • Die Figuren zeigen:
  • 1 zeigt die Expression des Nikotinsäure-Rezeptors in verschiedenen Geweben der Maus bzw. des Menschen (BAT = braunes Fettgewebe und WAT = weißes Fettgewebe, Submax. gl = submaxilliäre Drüse), wobei (a) einen Northern Blot der Nikotinsäure-Rezeptor-mRNA der Maus ("PUMA-G") in verschiedenen Geweben der Maus, (b) einen Northern Blot der Niktotinsäurerezeptor-mRNA des Menschen ("HM74") in verschiedenen menschlichen Geweben und (c) einen Southern Blot mit cDNAs, die durch RT-PCR aus unterschiedlichen Geweben der Maus unter Verwendung von PUMA-G-spezifischen Primern erhalten werden, darstellt.
  • 2 zeigt Liniendiagramme mit den konzentrationsabhängigen Beziehungen der intrazellulären Ca2+-Änderungen [Ca2+] in CHO-K1-Zellen ("Chinese hamster ovan cells", Subklon K1) nach Behandlung mit Nikotinsäure, Acipimox, Pyrazine-2-carbonsäure und Furan-3-carbonsäure, wobei in (a) die Zellen das erste Polypeptid mit der SEQ-ID-Nr. 1 ("PUMA-G") und das zweite Polypeptid mit der SEQ-ID-Nr. 3 (Gα15-Protein) exprimieren und in (b) die Zellen das erste Polypeptid mit der SEQ-ID-Nr. 2 ("HM-74") und das zweite Polypeptid mit der SEQ-ID-Nr. 3 (Gα15-Protein) exprimieren. RLU sind die Relativen Lichteinheiten.
  • 3 zeigt Balkendiagramme, die den Effekt von Nikotinsäure (200 μM) auf die intrazellulären cAMP-Spiegel in CHO-K1-Zellen, die den β2-Adreno-Rezeptor (SEQ-ID-Nr. 5) und den Nikotinsäure-Rezeptor exprimieren, graphisch darstellen, wobei in (a) der Nikotinsäure-Rezeptor der Maus ("PUMA-G") und in (b) der Nikotinsäure-Rezeptor des Menschen ("HM74") verwendet worden ist. Insbesondere wird der Effekt von Nikotinsäure auf den cAMP-Spiegel in Zellen untersucht, in welchen der cAMP-Spiegel durch Behandlung mit Isoprotenerol (1 μM) erhöht worden ist und die mit oder ohne Pertussistoxin (PTX) über Nacht vorbehandelt worden ist. Die Ergebnisse sind Mittelwerte +/– Standardabweichung aus einer Dreifachbestimmung.
  • 4 zeigt einen Western Blot, welcher den Effekt von Pertussitoxin (PTX) auf die Phosphorylierung von ERK in Zellen, welche den Nikotinsäure-Rezeptor der Maus ("PUMA-G") exprimieren und mit 200 μM Nikotinsäure oder Acipimox behandelt werden, beschreibt.
  • 5 zeigt Liniendiagramme einer Rezeptor-Bindungsstudie des Niktotinsäure-Rezeptors, wobei (a) eine Sättigungsbindungsisotherme von 3H-markierter Nikotinsäure in Zellmembranen von HEK293-Zellen, welche den Nikotinsäure-Rezeptor der Maus (PUMA-G) nach Transfektion expremieren, (b) eine Sättigungsbindungsisotherme von 3H-markierter Nikotinsäure in Zellmembranen von HEK293-Zellen, welche den humanen Nikotinsäure-Rezeptor ("HM74") nach Transfektion expremieren, und (c) die Kompetitions-Bindungsstudien des Nikotinsäure-Rezeptors der Maus ("PUMA-G") beschreibt. Die leeren Kreise entsprechen der Gesamtbindung, die leeren Quadrate entsprechen der unspezifischen Bindung und die ausgefüllten Kreise entsprechen der spezifischen Bindung. Die Nebenbilder in (a) und (b) zeigen die Scatchard-Analyse der Bindungssättigungsisotherme von 3H-Nikotinsäure. Ergebnisse sind Mittelwerte +/– Standardabweichung aus einer Dreifachbestimmung.
  • Durch die nachfolgenden Beispiele soll die vorliegende Erfindung näher erläutert werden, aber in keiner Weise beschränkt werden.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Expression des ersten Polypeptids mit der SEQ-ID-Nr. 1 bzw. 2 in Mausgewebe bzw. humanem Gewebe (im folgenden PUMA-G bzw. HM74 bezeichnet)
  • Gesamt-RNA (15 μg) wird aus Mausgewebe oder humanem Gewebe von unterschiedlichen Organen bzw. Geweben isoliert (BioCat, Heidelberg, Germany), in denaturierenden 1%-Agarosegelen aufgetrennt und auf Nylonmembranen (Amersham) transferiert. Nach der Prähybridisierung werden die Membranen mit einer radioaktiv markierten cDNA-Sonde (gesamte kodierende Region PUMA-G bzw. HM74; spezifische Aktivität > 1 × 109 cpm/μg) über Nacht inkubiert. Nach dem Waschen der Membranen wird die hybridisierte Sonde durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • Für die RT-PCR wird 1 μg Gesamt-RNA aus unterschiedlichen Geweben der Maus isoliert. Anschließend wird die PUMA-G-cDNA mit Primern, die die gesamte kodierende Sequenz flankieren, in einer RT-PCR amplifiziert. Ein 395 bp-Fragment des Genes, welches das ribosomale Protein L19 kodiert, wird als Kontrolle coamplifiziert.
  • Wie aus 1 ersichtlich ist, kann eine hohe Expression von PUMA-G im Fettgewebe der Maus (vgl. 1a und 1c) bzw. HM-74 im menschlichen Fettgewebe (vgl. 1b) nachgewiesen werden. Die Expression von PUMA-G und HM74 ist sowohl im weißen Fettgewebe (WAT) wie im braunen Fettgewebe (BAT) hoch.
  • Beispiel 2: Herstellung der Expressionsvektoren für den PUMA-G- und HM74-Rezeptor
  • Die kodierende Region des PUMA-G- bzw. HM74-Rezeptors werden durch PCR mit cDNA bzw. genomischer DNA aus weißen Fettzellen unter Verwendung von Primern, welche die gesamte kodierende Sequenz flankieren, amplifiziert und in den Säugerexpressionsvektor pcDNA 3.1 (Invitrogen) insertiert.
  • Beispiel 3: PUMA-G und HM74 sind Rezeptoren für Nikotinsäure
  • PUMA-G- bzw. HM74-cDNA-Expressionsvektoren werden zusammen mit einem Expressionsvektor, der die Nukleinsäuresequenz für die Gα15-Untereinheit des G-Proteins (SEQ-ID-Nr. 3) kodiert, in CHO-K1-Zellen cotransfiziert, welche stabil ein Reportergenprotein exprimieren, dessen Fluoreszenz- bzw. Lumineszenzeigenschaften durch erhöhte Ca2+-Spiegel messbar verändert werden. Das Reporterprotein ist das "green fluorescent protein" (GFP) fusioniert mit Äquorin (Baubet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97; 7260–7265, 2000). Das Gα15-Protein kann durch eine Reihe von G-Protein-gekoppleten Rezeptoren (z.B. PUMA-G oder HM74) aktiviert werden und aktiviert die Phospholipase C (PLC), die wiederum die intrazellulären Ca-Spiegel erhöht (Offermanns and Simon, J. Biol. Chem. 270: 15175–15180, 1995).
  • Für die Transfektion werden die Zellen in Platten mit 96 Vertiefungen überführt und mit den angegebenen cDNAs oder Kontroll-DNA (50 ng/Vertiefung) unter Verwendung des FuGENE6-Reagenz (Roche) transfiziert. 2 Tage nach der Transfektion werden die Zellen mit 5 μM Coelenterazin h (Biotium) in Calciumfreier Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), die 10 mM HEPES (pH 7,4) enthält, für 3,5 h bei 37°C inkubiert. 45 Minuten vor der Zugabe der Nikotinsäure bzw. der Nikotinsäurederivate wird der Puffer durch HBSS, welcher 1,8 mM CaCl2 enthält, ersetzt. Anschließend werden die Zellen mit Nikotinsäure und Derivaten davon behandelt. Nikotinsäure (Pyridin-3-carbonsäure), Pyrazin-2-carbonsäure, Furan-3-carbonsäure werden von Sigma erhalten, Acipimox (5-Methylpyrazin-2-carbonsäure-4-oxid) wird von Pharmacia-Upjohn erhalten. Die Calcium-Messungen werden unter Verwendung eines Luminometer-Plattenmessers (Luminoskan Ascent, Labsystems) durch Messung der RLU (relative light units = relative Lichteinheiten) durchgeführt.
  • Konzentrationsabhängig kann Nikotinsäure sowie deren Derivate die intrazellulären Ca-Spiegel erhöhen. Die Nikotinsäure-Konzentrationen, bei denen 50 % der maximalen Erhöhung der Ca-Spiegel auftritt (EC50-Konzentrationen) liegen bei etwa 3 μM für den Maus- und bei etwa 1 μM für den menschlichen Rezeptor (vgl. 2a und b). Die Nikotinsäure hat keinen Einfluß auf untransfizierte Zellen oder Zellen, welche nur mit Gα15 transfiziert werden. Die antihyperlipidämische Wirkung der verschiedenen Nikotinsäure-Strukturderivate (Acipimox, EC50 2–5 μM; Pyrazin-2-carbonsäure, EC50 10 μM; Furan-3-carbonsäure, EC50 > 100 μM; vgl. 2a und b), die auf Basis der PUMA-G/Gα15 oder HM74/Gα15 vermittelten Calciumantwort erhalten wird, stimmt mit der Wirkung in Fettzellen überein, die durch Hemmung der Adenylatzyklase oder Stimulation der GTPγ-S-Bindung ermittelt wird (Lorenzen et al., Mol. Pharmacol. 59: 349–357, 2000, Aktories et al., Arzneimittelforschung 33: 1525–1527, 1983).
  • Beispiel 4: Nikotinsäure aktiviert durch Bindung an den PUMA-G- bzw. HM74-Rezeptor einen Gi-Protein vermittelten Signalweg ("cAMP-Messung").
  • In diesem Beispiel wird die Aktivierung des PUMA-G- bzw. HM74-Rezeptors über Nikotinsäure durch Pertussistoxin-sensitive G-Proteine der Gi-Familie mittels Hemmung der Adenylatzyklase bestimmt. In CHO-K1-Zellen, welche transient mit einem PUMA-G- oder HM74-Expressionsvektor zusammen mit einem Expressionsvektor für den β2-Adrenorezeptor kotransfiziert werden, werden in Platten mit 6 Vertiefungen gezüchtet und die intrazellulären cAMP-Spiegel mit einem Radiorezeptorassay unter Verwendung von 3H-cAMP (Amersham) unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen gemessen.
  • Nach Behandlung der Zellen mit Nikotinsäure (200 μM) wird eine Abnahme der intrazellulären cAMP-Spiegel gemessen, welche durch den β-Adrenorezeptor-Agonisten Isoproterenol (1 μM) erhöht worden sind. Die Hemmung der Adenylatzyklase durch den aktivierten PUMA-G- und HM74-Rezeptor kann vollständig durch die Vorbehandlung der Zellen mit Pertussistoxin (PTX, 100 ng/ml übernacht) gehemmt werden (vgl. 3a und b). Die Nikotinsäure hat keinen Einfluß auf die cAMP-Spiegel in untransfizierten Zellen. PUMA-G/HM74 sind nicht fähig, eine Nikotinsäure-abhängige Herstellung von Inositolphosphaten zu bewirken. Somit ist der PUMA-G- bzw. HM74-Rezeptor mit G-Proteinen vom Gi-Typ gekoppelt.
  • Beispiel 5: Nikotinsäure aktiviert durch Bindung an den PUMA-G- bzw. HM74-Rezeptor einen Gi-Protein vermittelten Signalweg ("ERK-Phosphorylierung").
  • In diesem Beispiel wird die Aktivierung des PUMA-G- bzw. HM74-Rezeptors über Nikotinsäure durch Pertussistoxin-sensitive G-Proteine der Gi-Familie über die Aktivierung der extrazellulär Signal-regulierten Kinase (ERK) bestimmt.
  • Nach 12 h Hungern werden CHO-K1-Zellen, welche transient mit cDNA von PUMA-G- oder HM74-Rezeptoren transfiziert worden sind, für 5 Minuten bei 37 °C mit 200 μM Nikotinsäure oder Acipimox inkubiert. Die Zellen werden in Lysepuffer (50 mM Tris-HCL (pH 7,5), 150 mM Natriumchlorid, 5 mM EDTA, 1 % (v/v) NP-40, 0,5% (w/v) Natriumdesoxycholat, 0,1 % (w/v) SDS und Proteaseinhibitoren) lysiert, und die Proben werden durch Immunoblotting unter Verwendung von phosphonlierungsspezifischen ERK1/2-Antikörpern (Cell signalling) und einem Elektrochemilumineszenz (ECL)-Detektionssystem (Roche) analysiert.
  • Die Aktivierung von ERK durch PUMA-G (4) oder HM74 ist ebenfalls sensitiv gegenüber einer Vorbehandlung der Zellen mit Pertussistoxin (PTX, 100 ng/ml übernacht). Die Nikotinsäure hat keinen Einfluß auf die Phosphorylierung von ERK in untransfizierten Zellen. Dies ist ein weiterer Beweis, daß PUMA-G/HM74 mit G-Proteinen vom Gi-Typ gekoppelt sind.
  • Beispiel 6: Radioligand-Bindungsstudien mit 3H-markierter Nikotinsäure an PUMA-G- bzw. HM74-Rezeptoren
  • Die Gleichgewichtsbindung von 3H-markierter Nikotinsäure (American Radiolabeled Chemicals; 50 Ci/mmol) wird mit 30 μg Membranen aus HEK 293T-Zellen, welche PUMA-G oder HM74-Rezeptoren exprimieren, in einem Gesamtvolumen von 250 μl Bindungspuffer (50 mM Tris-HCL (pH 7,4), 2 mM MgCl2, 0,02% (v/v) CHAPS) durchgeführt. Nach 4 h Inkubation bei 25°C wird die ungebundene und membrangebundene Radioaktivität mittels Filtration der Proben durch Nitrocellulosefilter, gefolgt von zwei Waschschritte mit 4 ml eiskaltem Bindungspuffer abgetrennt. Die unspezifische Bindung wird in Anwesenheit von 200 μM unmarkierter Nikotinsäure bestimmt. Die Kompetitionsbindungsanalyse wird in Anwesenheit von 60 nM 3H-Nikotinsäure durchgeführt.
  • Die Sättigungsbindungsanalysen zeigen, daß die aus HEK-293T-Zellen, welche mit PUMA-G und HM74 transfiziert sind, hergestellten Membranen eine sättigungsfähige und spezifische Bindung aufweisen (PUMA-G: Disoziationskonstante Kd = 83,3 nM; HM74: Kd = 55,6 nM) (vgl. 5a und b). Die Kompetitions-Bindungsstudien (vgl. 5c) mit unterschiedlichen Nikotinsäureanalogen zeigen eine Affinitätsreihenfolge ähnlich zu der, die für die endogene Bindungsstelle beschrieben wird (Lorenzen et al., Mol. Pharmacol. 59: 349–357, 2001).
  • Die maximale antihyperlipidämische Wirkung von Nikotinsäure kann bei Plasmakonzentrationen von 4–16 μM beobachtet werden (Hotz, Adv.Lipid. Res. 20: 195–217; Svedmyr et. al., Clin. Pharmacol. Ther. 10: 559–570), und die maximale Plasma-Konzentration nach der Verabreichung einer pharmazeutischen Standarddosis liegt im Bereich von 500–300 μM (Carlson et al., Acta Med. Scand. 183: 457–465, 1968). Somit sind die EC50-Werte für eine Nikotinsäure-induzierte intrazelluläre Calcium-Erhöhung durch Aktivierung des G-Protein-Rezeptors PUMA-G bzw. HM74 über die Gα15-Untereinheit sowie die Bindungsaffinität und -spezifität für Nikotinsäure an den PUMA-G- bzw. HM74-Rezeptor in Übereinstimmung mit der Rolle von PUMA-G/HM74 bei der antihyperlipidämischen Wirkung der Nikotinsäure in vivo.
  • Die vorliegenden experimentellen Daten zeigen deutlich, daß PUMA-G/HM74 eine entscheidende Rolle für die antihyperlipidämische Wirkung von Nikotinsäure spielt. SEQUENCE LISTING
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Claims (12)

  1. Verfahren zum Nachweis von antihyperlipidämisch wirkenden Verbindungen, umfassend (a) das Zugeben einer zu testenden Verbindung zu einem System, welches mindestens ein erstes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus SEQ-ID-Nr.1 und SEQ-ID-Nr.2, oder ein biologisch aktives Derivat davon enthält, und (b) das Bestimmen der antihyperlipidämischen Wirkung der in Schritt (a) zugegebenen Verbindung.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das System Zellen umfaßt, welche das erste Polypeptid oder ein biologisch aktives Derivat davon enthalten.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zellen Säugerzellen sind.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das System einen Träger umfaßt, auf welchem das erste Polypeptid oder ein biologisch aktives Derivat davon oder die Zellen oder Teile der Zellen aufgebracht sind.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Zellen ein zweites Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus SEQ-ID-Nr.3 oder 4, oder ein biologisch aktives Derivat davon enthalten.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Zellen ferner ein Protein mit der SEQ-ID-Nr. 5 oder Derivat davon enthalten.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Zellen ein Genprodukt enthalten, welches durch die Bindung der zu testenden Verbindung an das erste Polypeptid oder ein biologisch aktives Derivat davon induzierbar ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das erste Polypeptid in den Zellen stabil oder transient exprimiert wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das zweite Polypeptid in den Zellen stabil oder transient exprimiert wird.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Bestimmung der antihyperlipidämischen Wirkung der zu testenden Verbindung in Schritt (b) durch direkte Messung der Bindungsaffinität der zu testenden Verbindung an das erste Polypeptid oder durch Messung der cAMP-Konzentration nach der Bindung der zu testenden Verbindung an das erste Polypeptid oder durch Messung der intrazellulären Ca-Konzentration nach der Bindung der zu testenden Verbindung an das erste Polypeptid oder durch Messung der Aktivierung der extrazellulär Signal-regulierten Kinase (erk) nach der Bindung der zu testenden Verbindung an das erste Polypeptid ausgeführt wird.
  11. Kit zum Nachweis von antihyperlipidämisch wirkenden Verbindungen, enthaltend das in einem der Ansprüche 1 bis 11 definierte System.
  12. Verwendung eines Polypeptides mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus SEQ-ID-Nr.1 und SEQ-ID-Nr.2, oder eines biologisch aktiven Derivates davon als Bindungsprotein für antihyperlipidämisch wirkende Verbindungen.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002084298A2 (en) * 2001-04-11 2002-10-24 Glaxo Group Limited Medicaments which are modulators of hm74 and/or hm74a activity

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Seite 1: Sequenzvergleich zwischen der vorliegen- den SEQ ID Nr. 1 (PUMA-G) und der murinen Sequenz nach Figur 8 von (1) *
Seite 1: Sequenzvergleich zwischen der vorliegen- den SEQ ID Nr. 1 (PUMA-G) und der murinen Sequenz nach Figur 8 von (1); Seite 2: tblastn-Eingabe von vorliegender SEQ ID Nr. 1 im Ein-Buchstaben-Code und DNA-Sequenz des murinen HM74A Nr. 7 aus Figur 7 von (1), Genbank-Eintragungsnummer AX704518 vom 03.04.2003 (gutacht.) [rech. am 27.06.2003]
Seite 2: tblastn-Eingabe vonvorliegender SEQ ID Nr. 1 im Ein-Buchstaben-Code und DNA-Sequenz des murinen HM74A Nr. 7 aus Figur 7 von (1), Genbank-Eintragungsnummer AX704518 vom 03.04.2003 (gutacht.) [rech. am 27.06.2003] *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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