DE60207254T2 - Natürlicher ligand von gpcr chemr23 und dessen verwendung - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft die Identifizierung natürlicher Liganden des verwaisten G-Protein gekoppelten Rezeptors (GPCR) ChemR23 und deren Verwendungen.
  • G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind Proteine, die für die Signaltransduktion innerhalb einer Zelle verantwortlich sind. GPCRs besitzen üblicherweise sieben Transmembran-Domänen. Nach der Bindung eines Liganden an einen extrazellulären Anteil oder ein Fragment eines GPCR, wird innerhalb der Zelle ein Signal transduziert, das in einer Veränderung einer biologischen oder physiologischen Eigenschaft oder des Verhaltens der Zelle resultiert. GPCRs, zusammen mit G-Proteinen und Effektoren (von G-Proteinen modulierte intrazelluläre Enzyme und Kanäle), sind Bestandteile eines modulären Signalgebungssystems, das den Status intrazellulärer sekundärer Botenstoffe mit extrazellulären Inputs verbindet.
  • GPCR-Gene und -Genprodukte können verschiedene physiologische Prozesse modulieren und sind potentielle Krankheitsursachen. Die GPCRs scheinen sowohl für das zentrale Nervensystem als auch periphere physiologische Prozesse von kritischer Wichtigkeit zu sein.
  • Die GPCR-Proteinsuperfamilie ist durch fünf Familien repräsentiert: Familie I, Rezeptoren, die durch Rhodopsin und den beta2-adrenergen Rezeptor charakterisiert werden, und zurzeit durch über 200 einzigartige Mitglieder repräsentiert wird; Familie II, die Parathyroidhormon/Calcitonin/Sekretin-Rezeptor-Familie; Familie III, die metabotrope Glutamat-Rezeptorfamilie, Familie IV, die CAMP-Rezeptor-Familie, die für die Chemotaxis und Entwicklung von D. discoideum wichtig ist; und Familie V, der Kreuzungspheromon-Rezeptor der Pilze wie STE2.
  • G-Proteine repräsentieren eine Familie von heterotrimären Proteinen, die aus α-, β- und γ- Untereinheiten bestehen, die Guaninnukleotide binden. Diese Proteine sind üblicherweise für die Signaltransduktion an Zelloberflächenrezeptoren (Rezeptoren, die sieben Transmembrandomänen enthalten) gebunden. In der Tat wird nach Bindung eines Liganden an den GPCR eine Konformationsänderung an das G-Protein übermittelt, die dazu führt, dass die α-Untereinheit ein gebundenes GDP-Molekül gegen ein GTP-Molekül austauscht und von den βγ-Untereinheiten abdissoziiert.
  • Die GTP-gebundene Form der α-, β- und γ-Untereinheiten wirkt üblicherweise als eine Effektormodellierende Einheit, die zur Produktion von sekundären Botenstoffen wie cAMP (z.B. durch die Aktivierung einer Adenyl-Cyclase), Diacylglycerin oder Inositolphosphaten führt.
  • Im Menschen sind mehr als 20 unterschiedliche Typen von α-Untereinheiten bekannt. Diese Untereinheiten assoziieren mit einem kleinen Pool von β- und γ Untereinheiten. Beispiele für G-Proteine der Säuger beinhalten Gi, Go, Gq, Gs und Gt. G-Proteine sind ausführlich in Lodish et al., Molecular Cell Biology (Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995; und auch von Downes and Gautam, 1999, The G-Protein Subunit Gene Families, Genomics 62:544-552) beschrieben, wobei deren Inhalt durch Bezugnahme hierin inkorporiert wird.
  • Bekannte und uncharakterisierte GPCRs stellen zurzeit wichtige Angriffsziele für Arzneimittelwirkung und -entwicklung dar. Es gibt beständige Anstrengungen, neue G-Proteingekoppelte Rezeptoren zu identifizieren, die verwendet werden können, um neue Agonisten und Antagonisten mit potenziellen prophylaktischen und therapeutischen Eigenschaften zu durchmustern.
  • Mehr als 300 GPCRs wurden bislang kloniert, wobei die Familie der olfaktorischen Rezeptoren ausgeschlossen ist. Mechanistisch gesprochen wirken etwa 50-60% aller klinisch relevanten Arzneimittel durch die Modulation von Funktionen verschiedener GPCRs (Cudermann et al., J. Mol. Med., 73:51-63, 1995).
  • ChemR23, auch Dez genannt [Sequenz ID NRn.: 1 (humane Polynukleotidsequenz, 1); 2 (humane Aminosäuresequenz, 2); 3 (Polynukleotidsequenz der Maus, 3); 4 (Aminosäuresequenz der Maus, 3); 5 (Polynukleotidsequenz der Ratte; 4); und 6 (Aminosäuresequenz der Ratte, 4)], wurde als ein verwaister G-Protein-gekoppelter Rezeptor beschrieben, der mit GPR-1 (insgesamt 38% Aminosäuresequenzidentität), dem C3a-Rezeptor (38%), C5a Anaphylatoxin-Rezeptor (36%) und den Formyl-Met-Leu-Phe-Rezeptoren (35%) verwandt ist. ChemR23 ist mit der Chemokin-Rezeptor-Subfamilie entfernter verwandt (Methner A, Hermey G, Schinke B, Hermans-Borgmeyer I. (1997) Biochem Biophys Res Commun 233:336-42; Samson M, Edinger AL, Stordeur P, Rucker J, Verhasselt V, Sharron M, Govaerts C, Mollereau C, Vassart G, Doms RW, Parmentier M. (1998) Eur J Immunol 28:1689-700). ChemR23-Transkripte wurden in dendritischen Zellen und Makrophagen, die von Monozyten abgeleitet sind, mit oder ohne Behandlung mit LPS in hoher Menge gefunden. Eine geringe Expression konnte auch durch reverse Transkriptions-PCR in CD4+ T-Lymphozyten nachgewiesen werden. In situ-Hybridisierungsexperimente zeigten auch, dass der Rezeptor während der Entwicklung differenziell reguliert ist, wobei eine deutliche Expression in sich entwickelnden Knochen- und Knorpelgeweben auftritt. Er ist auch in Nebenschilddrüsen des Erwachsenen nachweisbar, was eine mögliche Funktion im Kalziumphosphatmetabolismus anzeigt.
  • Das ChemR23-kodierende Gen wurde durch Strahlungs-Hybridisierungskartierung der g21.2-21.3-Region des humanen Chromosoms 12 zugewiesen, außerhalb der Gencluster, die bislang für Chemo-Lockstoffrezeptoren identifiziert wurden. ChemR23 wurde in Fusionsassays auf eine potentielle Co-Rezeptoraktivität in einer Reihe von viralen HIV-1-, HIV-2- und SIV-Stämmen getestet. Einige SIV-Stämme (SIVmac316, SIVmac239, SIVmac17E-Fr und SIVsm62A), sowie ein primärer HIV-1-Stamm (92UG024-2) verwendeten ChemR23 effizient als einen Co-Rezeptor. Dieser Rezeptor erscheint daher ein Co-Rezeptor für Immundefizienzviren zu sein, der nicht zur Chemokin-Rezeptor-Familie gehört. Er ist auch ein putativer Chemo-Lockstoffrezeptor und er könnte in der Rekrutierung oder im Transport von Leukozyten-Zellpopulationen eine wichtige Rolle spielen.
  • TIG2 (Tazaroten-induziertes Gen 2 [Sequenz ID NRn.: 7 (humane TIG2-Polynukleotidsequenz, 6); 8 (humane Aminosäuresequenz, 6); 9 (Polynukleotidsequenz der Maus, 7); und 10 (Aminosäuresequenz der Maus, 7)] wurde als eine cDNA identifiziert, deren Expression durch die Behandlung von Haut-Plattenkulturen mit dem Retinsäure-Rezeptor (RAR) beta/gamma-selektiven anti-psoriatischen synthetischen Retinoid, Tazaroten [AGN 190168/Ethyl 6-[2-(4,4-dimethylthiochroman-6-yl)-ethynyl]nicotinat] (Nagpal S, Patel S, Jacobe H, DiSepio D, Ghosn C, Malhotra M, Teng M, Duvic M, Chandraratna RA. (1997) J Invest Dermatol 109:91-5) hochreguliert ist. Die Retinoid-vermittelte Hochregulation der Expression von TIG2 wurde durch Northern Blot Analyse bestätigt. Die TIG2-cDNA ist 830 bp lang und kodiert ein putatives Proteinprodukt von 164 Aminosäuren. TIG2 wird in Kultur exprimiert und nur wenn Keratinozyten und Fibroblasten eine gewebeähnliche dreidimensionale Struktur ausbilden durch Tazaroten induziert. Von RAR-spezifischen Retinoiden wurde ebenfalls gezeigt, dass sie die TIG2-mRNA-Konzentrationen erhöhen. Im Gegensatz dazu steigerten weder RXR-spezifische Retinoide noch 1,25-Dihydroxyvitamin D3 die TIG2-Konzentrationen in diesen Zellen. TIG2 ist in hohen Konzentrationen ebenfalls in psoriasischer Haut ohne Läsionen exprimiert, jedoch in geringeren Konzentrationen in den psoriasischer Läsionen, und seine Expression ist in psoriasischen Läsionen nach topischer Anwendung von Tazaroten hochreguliert. Darüber hinaus wurde von TIG2 gezeigt, dass es durch 1,25-Dihydroxyvitamin D3 und Dexamethason in Osteoclasten unterstützenden Stromazellen dramatisch hochreguliert wird (Adams AE, Abu-Amer Y, Chappel J, Stueckle S, Ross FP, Teitelbaum SL, Suva LJ. (1999) J. Cell Biochem 74:587-95).
  • Die vorliegende Erfindung offenbart die Identifizierung von TIG2, des Polypeptidprodukts des Tazaroten-induzierten Gens 2, als ein natürlicher Ligand des ChemR23 GPCR (G-Protein gekoppelten Rezeptors). Die Anmeldung offenbart die Verwendung der Wechselwirkung von ChemR23-Polypeptiden und TIG2-Polypeptiden als die Basis für Durchmusterungsassays für Agenzien, welche die Aktivität des ChemR23-Rezeptors modulieren. Die Anmeldung offenbart ebenfalls diagnostische Assays, die auf der ChemR23/TIG2-Wechselwirkung beruhen, sowie Kits zur Ausführung der diagnostischen und Durchmusterungsassays.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung eines Agens, das ChemR23 bindet, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) ein ChemR23 Polypeptid mit einem gestutzten TIG2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NR:48, oder mit einem TIG2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist, aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, in Gegenwart oder Abwesenheit eines zu testenden Bindemittels unter Bedingungen in Berührung zu bringen, die das Binden des gestutzten TIG2-Polypeptids oder des TIG2-Polypeptids an das ChemR23-Polypeptid ermöglichen, und
    • (b) die Bindung des ChemR23-Polypeptids an das gestutzte TIG2-Polypeptid oder das TIG2-Polypeptid zu messen, wobei eine Abnahme in der Bindung in Gegenwart des zu testenden Bindemittels relativ zur Bindung in Abwesenheit des zu testenden Bindemittels das zu testende Bindemittel als ein Agens identifiziert, das ChemR23 bindet.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch das oben genannte Verfahren, wobei das Agens in einer Probe vorliegt. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Identifizierung eines Agens, das die Signalaktivität von ChemR23 herabsetzt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) ein ChemR23-Polypeptid mit einem gestutzten TIG2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NR:48, oder mit einem TIG2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist, aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, in Gegenwart oder Abwesenheit des Agens in Berührung zu bringen,
    • (b) eine Signalaktivität des ChemR23-Polypeptids zu messen, und
    • (c) die Menge an Aktivität, die in einer Reaktion gemessen wurde, die das ChemR23-Polypeptid und das gestutzte TIG2-Polypeptid oder das TIG2-Polypeptid ohne das Agens enthält, mit der Menge der Aktivität zu vergleichen, die in einer Reaktion gemessen wurde, die das ChemR23-Polypeptid, das gestutzte TIG2-Polypeptid oder das TIG2-Polypeptid und das Agens enthält, wobei eine Abnahme in der Aktivität in Gegenwart des Agens relativ zur Aktivität in Abwesenheit des Agens das Agens als ein Antagonist für das ChemR23-Polypeptid identifiziert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiter das oben erwähnte Verfahren, wobei das Agens in einer Probe vorliegt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung eines Agens, das die Signalgabe von ChemR23 erhöht, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) ein ChemR23-Polypeptid mit einem Agens in Berührung zu bringen,
    • (b) eine Signalaktivität des ChemR23-Polypeptids in Gegenwart des Agens zu messen, und
    • (c) die in Gegenwart des zu testenden Modulator-Agens gemessene Aktivität mit der Aktivität zu vergleichen, die in einer Reaktion gemessen wurde, in der das ChemR23-Polypeptid mit einem gestutzten TIG2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NR:48, oder mit einem TIG2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist, aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, wobei das Agens als Agonist, der die Signalgabe des ChemR23-Polypeptids verstärkt, identifiziert wird, wenn die Menge der Aktivität, die in Gegenwart des Agens gemessen wird, wenigstens 10% der Menge beträgt, die durch das gestutzte TIG2-Polypeptid oder das TIG2-Polypeptid induziert wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiter das oben genannte Verfahren, wobei das Agens in einer Probe vorliegt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform jeder der beiden vorhergehenden Verfahren wird die Messung mit einem Verfahren ausgeführt, das aus Markierungsaustausch, Oberflächenplasmonresonanz, Fluoreszenzresonanz-Energietransfer, Fluoreszenz-Quenchen und Fluoreszenz-Polarisation ausgewählt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform jedes der vorstehenden Verfahren wird das TIG2-Polypeptid nachweisbar markiert. Es wird vorgezogen, dass das TIG2-Polypeptid nachweisbar mit einer Einheit markiert wird, die ausgewählt wird aus einem Radioisotop, einem Fluorophor, einem Fluoreszenzquencher, einem Enzym, einem Affinitäts-Tag und einem Epitop-Tag.
  • In einer Ausführungsform jedes der vorstehenden Verfahren wird das In-Berührung-Bringen in oder auf einer Zelle, die das ChemR23-Polypeptid exprimiert, ausgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform jedes der vorstehenden Verfahren wird das In-Berührung-Bringen in oder auf synthetischen Liposomen ausgeführt (siehe Tajib et al., 2000, Nature Biotechnology 18:649-654, das durch Bezugnahme hierin inkorporiert wird) oder Virusinduzierte Knospenmembranen, die ein ChemR23-Polypeptid enthalten (siehe WO 01/02551, 2001, durch Bezugnahme hierin inkorporiert).
  • In einer weiteren Ausführungsform jedes der vorstehenden Verfahren wird das Verfahren mit einer Membranfraktion von Zellen, die das ChemR23-Polypeptid exprimieren, ausgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Agens ausgewählt aus einem Peptid, einem Polypeptid, einem Antikörper oder einem Antigen-bindendem Fragment davon, einem Lipid, einem Kohlenhydrat, einer Nukleinsäure und einem kleinen organischen Molekül.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Schritt der Messung einer Signalaktivität des ChemR23-Polypeptids den Nachweis einer Veränderung in der Konzentration eines sekundären Botenstoffs.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Schritt der Messung einer Signalaktivität die Messung einer Guaninnukleotid-Bindung oder eines -Austausches, Adenylatzyklase-Aktivität, cAMP, Proteinkinase C-Aktivität, Phosphatidylinositolabbau, Diacylglycerin, Inositoltriphosphat, intrazelluläres Kalzium, Arachinoidsäure, MAP-Kinase-Aktivität, Tyrosinkinase-Aktivität oder Reportergenexpression.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Messung einer Signalaktivität die Verwendung eines Aequorin-gestützten Assays.
  • Die Erfindung umfasst fernerhin eine Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes ChemR23-Polypeptid und ein isoliertes TIG2-Polypeptid wie es unten definiert ist.
  • Die Erfindung umfasst ferner einen Kit für die Durchmusterung auf Agenzien, welche die Signalaktivität von ChemR23 modulieren, oder für die Diagnose einer Krankheit oder Störung, die durch eine Deregulierung eines ChemR23-Polypeptids gekennzeichnet ist, wobei das Kit ein isoliertes ChemR23-Polypeptid, ein isoliertes TIG2-Polypeptid, wie es unten definiert ist, und Verpackungsmaterialien dafür umfasst. Diagnostische Kits gemäß der Erfindung erlauben die Bestimmung ob, zum Beispiel, eine Gewebeprobe oder ein aus einer Gewebeprobe zubereiteter Extrakt eine erhöhte Konzentration oder Aktivität von TIG2 oder ChemR23 aufweist. Die Kits erlauben auch die Identifizierung von Mutationen in Genen, die ChemR23 oder TIG2 kodieren, und den Nachweis anormaler Konzentrationen von Nukleinsäuren, die ChemR23 oder TIG2 kodieren.
  • Die Erfindung umfasst weiter einen Kit zur Durchmusterung von Agenzien, welche die Signalgebung von ChemR23 modulieren, oder für die Diagnose einer Krankheit oder Störung, die durch Deregulierung eines ChemR23-Polypeptids gekennzeichnet ist, wobei das Kit ein isoliertes Polynukleotid, das ein ChemR23-Polypeptid kodiert, ein isoliertes Polynukleotid, das ein TIG2-Polypeptid, wie es unten definiert ist, kodiert, und Verpackungsmaterialien dafür umfasst.
  • Die Erfindung umfasst weiter ein Kit für die Durchmusterung auf Agenzien, welche die ChemR23-Signalaktivität modulieren, oder für die Diagnose einer Krankheit oder Störung, welche durch die Deregulierung eines ChemR23-Polypeptids gekennzeichnet ist, wobei das Kit eine Zelle, die mit einem Polynukleotid, das ein ChemR23-Polypeptid kodiert, transformiert ist, ein isoliertes Polynukleotid, das ein TIG2-Polypeptid, wie es unten definiert ist, kodiert, oder eine Zelle, die ein Polynukleotid, das ein TIG2-Polypeptid, wie es unten definiert ist, kodiert, umfasst und Verpackungsmaterialien dafür.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein in vitro-Verfahren zur Modulierung der Aktivität eines ChemR23-Polypeptids in einer Zelle, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, der Zelle ein gestutztes TIG2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NR:48, ein TIG2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, TIG2-Antikörper oder TIG2 kodierende Nukleotide zuzuführen, so dass die Aktivität von ChemR23 moduliert wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch das oben genannte Verfahren, wobei das TIG2-kodierende Nukleotid ein Aptamer ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Verwendung eines gestutzten TIG2-Polypeptids, dargestellt durch SEQ ID NR:48, oder eines TIG2-Polypeptids, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, für die Herstellung eines Kits zum Durchmustern von Agenzien auf ihre Fähigkeit, die Signalgabe von ChemR23 zu modulieren, oder für die Herstellung eines Kits für die Diagnose von Krebs, Tumormetastasen, Entzündungserkrankungen, Autoimmunerkrankungen, geerbten oder erworbenen Immunschwächen, Osteoporose, Knochenheilung, Knochengewebstransplantaten, Transplantatabstoßung, Ekzemen, entzündlichen Infektionen und trophischen Erkrankungen der Haut, viralen, bakteriellen und parasitären Infektionen, weiblicher Unfruchtbarkeit und Tumoren von Eierstock und Uterus.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein gestutztes TIG2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NR:48, oder ein TIG2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist, aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, oder ein Fusionsprotein, das diese Polypeptide umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid, wie es oben definiert ist, kodiert.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „ChemR23-Polypeptid" ein Polypeptid mit zwei essenziellen Eigenschaften: 1) ein ChemR23-Polypeptid besitzt wenigstens 70% Aminosäureidentität und vorzugsweise 80%, 90%, 95% oder mehr, einschließlich 100% Aminosäureidentität zu SEQ ID NR:2; und 2) ein ChemR23-Polypeptid besitzt ChemR23-Aktivität, d.h. das Polypeptid bindet ein TIG2-Polypeptid oder ein funktionales Fragment davon. Idealerweise besitzt ein „ChemR23-Polypeptid" eine ChemR23-Signal-Aktivität wie sie hierin definier ist.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „ChemR23-Polynukleotid" ein Polynukleotid, welches das ChemR23-Polypeptid, wie es hierin definiert ist, kodiert.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „ChemR23-Aktivität" die spezifische Bindung eines TIG2-Polypeptids oder eines funktionalen Fragments davon durch ein ChemR23-Polypeptid.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „ChemR23-Signalaktivität" die Initiierung oder Propagierung von Signalweiterleitung durch ein ChemR23-Polypeptid. Die ChemR23-Signalaktivität wird durch Messung eines nachweisbaren Schritts in der Signalkaskade durch Messung eines oder mehrerer folgenden Parameter überwacht: Stimulierung des GDP zu GTP-Austausches in einem G-Protein; Änderung der Adenylatzyklase-Aktivität; Proteinkinase C-Modulation; Phosphatidylinositolabbau (Erzeugung der sekundären Botentstoffe Diacylglycerin und Inositoltriphosphat); intrazellulärer Kalziumfluss; Aktivierung von MAP-Kinasen; Modulation von Tyrosinkinasen; oder Modulation von Gen- oder Reportergen-Aktivität. Von einem nachweisbaren Schritt in einer Signalkaskade wird angenommen, dass er initiiert oder vermittelt wird, wenn die messbare Aktivität um 10% oder mehr über oder unterhalb einer Basislinie geändert wird, welche bei völligem Fehlen eines TIG2-Polypeptids in Abhängigkeit zu jedem der ChemR23-Aktivitätsassays, wie sie hierin beschrieben sind, etabliert wird. Die messbare Aktivität kann direkt gemessen werden, wie bei der Messung der, zum Beispiel, cAMP- oder Diacylglycerin-Konzentrationen. Alternativ kann die messbare Aktivität indirekt gemessen werden, wie in einem, zum Beispiel, Reportergenassay.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „nachweisbarer Schritt" einen Schritt, den man entweder direkt, z.B. durch Messung eines sekundären Botenstoffs oder Nachweis eines modifizierten (z.B. phosphorylierten) Proteins, oder indirekt, z.B. durch Überwachung einer stromabwärts dieses Schrittes liegenden Wirkung, messen kann. Beispielsweise resultiert die Aktivierung der Adenylatzyklase in der Erzeugung von cAMP. Die Aktivität der Adenylatzyklase kann direkt, z.B. mit einem Assay, der die Produktion von cAMP in dem Assay überwacht, oder indirekt durch Messung der tatsächlichen Konzentrationen von cAMP gemessen werden.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „isoliert" eine Population von Molekülen, z.B. Polypeptide oder Polynukleotide, deren Zusammensetzung weniger als 50% (nach Gewicht), vorzugsweise weniger als 40% und am meisten bevorzugt 2% oder weniger kontaminierende Moleküle von unverwandter Art aufweist. Wenn der Ausdruck „isoliert" für ein ChemR23-Polypeptid verwendet wird, wird insbesondere gemeint, dass er ein ChemR23-Polypeptid umfasst, das mit einer Lipidmembran assoziiert oder darin eingebettet ist.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „TIG2-Polypeptid" ein Polypeptid mit wenigstens 31% Identität (oder höherer Identität, wie 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% oder sogar 100%) zum Polypeptid, das durch SEQ ID NR:48 dargestellt wird, das spezifisch an ein ChemR23-Polypeptid mit der Sequenz gemäß SEQ ID NR:2 bindet und dessen Signal-Aktivierung aktiviert. Der Ausdruck „spezifisch binden" bedeutet, dass das TIG2-Polypeptid einen EC50-, IC50- oder einen Kd-Wert von 100 nM oder weniger besitzt. „TIG2-Polypeptid" betrifft auch ein Fragment eines Polypeptids, das die vorhergehende Definition erfüllt, wobei das Fragment wenigstens 50% der Bindungsaktivität und des Niveaus der Signal-Aktivierung des Volllängen-Polypeptids von SEQ ID NR:48 zurückbehält. Ein TIG2-Polypeptid kann Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen bezüglich der SEQ ID NR:48 umfassen, solange das resultierende Polypeptid wenigstens 50% der Bindungsaktivität und des Niveaus der Signal-Aktivierung des Volllängen-Polypeptids zurückbehält, das durch SEQ ID NR:48 dargestellt wird. In einer Ausführungsform umfasst ein „TIG2-Polypeptid" weiter die gestutzte TIG2-Sequenz von SEQ ID NR:48 wie sie in 17 gezeigt ist (die in 17 gezeigte Nukleotidsequenz, die das gestutzte TIG2-Polypeptid kodiert, ist SEQ ID NR:49).
  • Derivate können ähnliche Polypeptide, Fusionsproteine oder Deletionen davon sein. Die vorliegende Erfindung illustriert, dass das gestutzte Polypeptid, wie es in SEQ ID NR:48 dargestellt ist, spezifisch an ein ChemR23-Polypeptid bindet und seinen Signaltransduktionsweg aktiviert. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein gestutztes TIG2-Polypeptid, das in SEQ ID NR:48 dargestellt ist; eine Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NR:49 dargestellt ist und das gestutzte TIG2-Polypeptid oder Derivate davon kodiert.
  • Wenn man die Sequenz, wie sie in SEQ ID NR:48 angegeben ist, mit einer Sequenz, wie sie durch SEQ ID NR:8 dargestellt wird oder in 9 (tig2) angegeben ist, vergleicht, wird klar, dass die Verkürzung in der Deletion des „KALPRS"-Schwanzes liegt. Der Sequenz der Ratte fehlt der „PRS"-Schwanz; der Gallus-Sequenz fehlt der „RS"-Schwanz, oder ein Äquivalent davon, in Abhängigkeit davon, welche Sequenz als Referenzsequenz betrachtet wird. Aus diesem Vergleich wird es offensichtlich, dass der C-Terminus des TIG2-Peptids in seiner Länge variieren kann. Die vorliegende Erfindung legt weiterhin nahe, dass weitere Deletionen in diesem Schwanz vorliegen können, die in einem funktionalen Peptid hinsichtlich des ChemR23-Polypeptids resultieren.
  • Zu den Sequenzen, die für die Bindung an ChemR23 und die Aktivierung einer ChemR23-Signal-Aktivierung notwendig sind, kann ein TIG2-Polypeptid, einschließlich des gestutzten TIG2-Polypeptids, zusätzliche Sequenzen umfassen, beispielsweise ein TIG2-Fusionsprotein. Nicht begrenzende Beispiele für Fusionspartner beinhalten Glutathion-S-Transferase (GST), das Maltose bindende Protein, alkalische Phosphatase, Thioredoxin, das grün fluoreszierende Protein (GFP), Histidin-Tags (z.B. 6× oder mehr His) oder Epitop-Tags (z.B. Myc-tag, FLAG-tag).
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „TIG2-Polynukleotid" ein Palynukleotid, das ein TIG2-Polypeptid, wie es hierin definiert ist, kodiert, oder den Komplementärstrang davon. Ein „TIG2-Polynukleotid" kann eine Polynukleotidsequenz sein, die ein gestutztes TIG2-Polypeptid kodiert, z.B. das gestutzte TIG2-Polypeptid, wie es in 17 dargestellt ist, oder jedes der Polypeptide, wie sie in 18 gezeigt sind. Das Polynukleotid, das ein gestutztes Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR:48 dargestellt wird, kodiert, ist in 17 und durch SEQ ID NR:49 dargestellt. Die Polynukleotide, die die Polypeptide, wie sie in 18 gezeigt sind, kodieren und durch die SEQ ID NR:50 bis 60 dargestellt sind, können vom Fachmann von den korrespondierenden Aminosäuresequenzen abgeleitet werden, da jede Aminosäure durch ein spezifisches Triplett (oder ein spezifisches Set) von Nukleotiden kodiert werden kann und die der Fachmann kennt.
  • Die vorliegende Anmeldung betrifft auch ein Agens, das mit einem Verfahren, wie oben beschrieben, identifiziert oder nachgewiesen wurde. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die dieses Agens umfasst.
  • Die Anmeldung betrifft weiter die Verwendung eines Agens oder einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments; insbesondere für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer ChemR23-abhängigen Krankheit oder einer ChemR23-abhängigen Störung; wobei diese Krankheit oder Störung vorzugsweise ausgewählt wird aus Krebs, Tumormetastasen, Entzündungserkrankung, Autoimmunerkrankung, geerbten oder erworbenen Immunschwächen, Osteoporose, Knochenheilung, Knochengewebstransplantaten, Transplantatabstoßung, Psoriasis, Ekzemen, entzündlicher Infektion und trophischen Erkrankungen der Haut, viralen, bakteriellen und parasitären Infektionen, weiblicher Unfruchtbarkeit und Tumoren von Eierstock und Uterus; oder für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer TIG2-abhängigen Krankheit oder einer TIG2-abhängigen Störung, wobei diese Krankheit oder Störung vorzugsweise ausgewählt wird aus Osteoporose, Knochenheilung, Knochengewebstransplantaten, Transplantatabstoßung, Psoriasis, Ekzemen, entzündlicher Infektion und trophischen Erkrankungen der Haut, viraler, bakterieller und parasitärer Infektion, weiblicher Unfruchtbarkeit und Tumoren von Eierstock und Uterus.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein gestutztes TIG2=Peptid, das durch SEQ ID NR:48 dargestellt ist, und eine Nukleotidsequenz, die dieses Polypeptid oder Derivate davon kodiert. Sie betrifft weiter eine Nukleotidsequenz, die durch SEQ ID NR:49 dargestellt wird und die das gestutzte TIG2-Polypeptid wie es durch SEQ ID NR:48 dargestellt ist, kodiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines gestutzten TIG2-Polypeptids oder einer Polynukleotidsequenz, wie sie oben beschrieben wurde, vorzugsweise in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Gestutzte TIG2-Polypeptide oder ein TIG2-Polypeptid, wie es oben definiert ist, gemäß der vorliegenden Erfindung können auch für die Herstellung einer Zusammensetzung verwendet werden, die ein isoliertes ChemR23-Polypeptid und ein isoliertes TIG2-Polypeptid, wie es oben definiert ist, umfasst. Alternativ können die gestutzten TIG2-Polypeptide oder ein TIG2-Polypeptid gemäß der Erfindung für die Herstellung eines Antikörpers, für die Herstellung eines Kits zur Durchmusterung von Agenzien, welche die Signalgebung von ChemR23 modulieren, oder für die Herstellung eines Kits für die Diagnose einer Krankheit, welche durch die Deregulierung der ChemR23-Signalgebung gekennzeichnet ist, verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines gestutzten TIG2-Polypeptids, wie es oben beschrieben ist, oder eines TIG2-Polypeptids, wie es oben definiert ist, als ein Ligand für ChemR23.
  • Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Polynukleotidsequenz, die das gestutzte TIG2-Polypeptid, wie es oben beschrieben ist, kodiert, oder einer Polynukleotidsequenz, die ein TIG2-Polypeptid, wie es oben beschrieben ist, kodiert, zur Herstellung eines Liganden für ChemR23.
  • Die Anmeldung offenbart auch die Verwendung eines gestutzten TIG2-Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung oder eines Volllängen-TIG2-Polypeptids für die Herstellung eines Medikaments. Das Medikament kann für die Behandlung einer ChemR23-abhängigen Krankheit oder einer ChemR23-abhängigen Störung verwendet werden; wobei die Krankheit oder Störung vorzugsweise ausgewählt wird aus Krebs, Tumormetastasen, Entzündungserkrankungen, Autoimmunerkrankungen, geerbten oder erworbenen Immunschwächen, Osteoporose, Knochenheilung, Knochengewebstransplantaten, Transplantatabstoßung, Psoriasis, Ekzemen, entzündlichen Infektionen und trophischen Erkrankungen der Haut, viralen, -bakteriellen und parasitären Infektionen, weiblicher Unfruchtbarkeit und Tumoren von Eierstock und Uterus; oder das Medikament kann für die Behandlung einer TIG2-verwandten Krankheit oder einer TIG2-abhängigen Störung verwendet werden, wobei die Krankheit oder Störung vorzugsweise ausgewählt wird aus Osteoporose, Knochenheilung, Knochengewebstransplantaten, Transplantatabstoßung, Psoriasis, Ekzemen, entzündlichen Infektionen und trophischen Erkrankungen der Haut, viralen bakteriellen und parasitären Infektionen, weiblicher Unfruchtbarkeit und Tumoren von Eierstock und Uterus.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnen die Ausdrücke „Kandidatenverbindung" und „Kandidatenmodulator" eine Zusammensetzung, die auf ihre Fähigkeit hin bewertet wird, die Ligandenbindung an ein ChemR23-Polypeptid zu modulieren oder die Fähigkeit, eine Aktivität eines ChemR23-Polypeptids zu modulieren. Kandidatenmodulatoren können natürliche oder synthetische Verbindungen sein, einschließlich, beispielsweise, kleiner Moleküle, Verbindungen die in Extrakten von Tieren, Pflanzen, bakteriellen oder pilzlichen Zellen enthalten sind, sowie in konditionierten Medien solcher Zellen.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „kleines Molekül" eine Verbindung mit einer molekularen Masse von weniger als 3000 Dalton, vorzugsweise von weniger als 2000 oder 1500, noch bevorzugter von weniger als 1000 und am meisten bevorzugt von weniger als 600 Dalton. Ein „kleines organisches Molekül" ist ein kleines Molekül, das Kohlenstoff umfasst.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Bindungsänderung" oder „Aktivitätsänderung" und die äquivalenten Ausdrücke „Bindungsunterschied" oder „Aktivitätsunterschied" eine wenigstens um 10% verstärkte oder verringerte Bindung oder Signal-Aktivität in einem gegebenen Assay.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck „Bedingungen, welche die Bildung von TIG2 gemäß der Erfindung an ChemR23 erlauben" Bedingungen von, zum Beispiel, Temperatur, Salzkonzentration, pH und Proteinkonzentration, bei denen TIG2 ChemR23 bindet. Die exakten Bindungsbedingungen werden in Abhängigkeit von der Art des Assays variieren, zum Beispiel ob der Assay lebensfähige Zellen verwendet oder lediglich Membranfraktionen von Zellen. Allerdings werden bevorzugte Bedingungen im Allgemeinen physiologische Salzkonzentrationen (90 mM) und pH (etwa 7,0 bis 8,0) beinhalten, da ChemR23 ein Zelloberflächenprotein ist und da TIG2 ein sekretiertes Polypeptid ist, das mit ChemR23 auf der Zelloberfläche wechselwirkt. Temperaturen für die Bindung können von 15°C bis 37°C variieren, werden aber vorzugsweise zwischen Raumtemperatur und etwa 30°C sein. Die Konzentration von TIG2- und ChemR23-Polypeptid in einer Bindungsreaktion werden ebenfalls variieren, werden aber vorzugsweise etwa 0,1 pM (z.B. in einer Reaktion mit radioaktiv markierten Tracer-TIG2, wo die Konzentration im Allgemeinen unter dem Kd) ist bis 1 μM (z.B. TIG2 als Kompetitor). Als ein Beispiel für einen Bindungsassay mit ChemR23-exprimierenden Zellen und aufgereinigtem, rekombinantem, markiertem TIG2-Polypeptid, wird die Bindung unter Verwendung von 0,1 nM markiertem TIG2, 100 nM kaltem TIG2 und 25.000 Zellen bei 27°C in 250 μl Bindungspuffer, der aus 50 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM CaCl2 und 0,5% fettsäurefreies BSA besteht, ausgeführt.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Probe" die Quelle der Moleküle, die auf Anwesenheit eines Agens getestet werden, das die Bindung an oder die Signal-Aktivität eines ChemR23-Polypeptids moduliert. Eine Probe kann eine Umweltprobe, ein natürliches Extrakt aus Tier-, Pflanzen-, Hefe- oder bakteriellen Zellen oder -Geweben sein, eine klinische Probe, eine synthetische Probe, oder ein konditioniertes Medium von rekombinanten Zellen oder eines Fermentationsprozesses. Der Ausdruck „Gewebeprobe" betrifft ein Gewebe, das auf Vorliegen, Menge, Qualität oder eine Aktivität eines ChemR23-Polypeptids, eines TIG2-Polypeptids, einer Nukleinsäure, die ein ChemR23- oder TIG2-Polypeptid kodiert, oder eines Agens, das die Ligandenbindung oder Aktivität eines ChemR23-Polypeptids modifiziert, getestet wird.
  • Wie hierin verwendet, ist ein „Gewebe" eine Aggregation von Zellen, die eine besondere Funktion in einem Organismus ausführen. Der Ausdruck „Gewebe", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet zelluläres Material aus einem besonderen physiologischen Bereich. Die Zellen in einem besonderen Gewebe können mehrere unterschiedliche Zelltypen umfassen. Ein nicht begrenzendes Beispiel dessen würde Hirngewebe sein, das weiter Neurone und Gliazellen sowie Kapillar-endotheliale Zellen und Blutzellen umfasst, die alle in einem gegebenen Gewebeschnitt oder einer -Probe enthalten sind. Zusätzlich zu festen Geweben soll der Ausdruck „Gewebe" auch nicht feste Gewebe wie Blut umfassen.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Membranfraktion" eine Zubereitung zellulärer Lipidmembranen, die ein ChemR23-Polypeptid umfassen. So wie der Ausdruck hierin verwendet wird, ist eine „Membranfraktion" von einem zellulären Homogenat insofern verschieden, dass wenigstens ein Teil (d.h. wenigstens 10% und vorzugsweise mehr) der nichtmembranassoziierten zellulären Bestandteile entfernt wurde. Der Ausdruck „membranassoziiert" bezeichnet diejenigen zellulären Bestandteile, die entweder in die Lipidmembran integriert sind oder physikalisch mit einem Bestandteil assoziiert sind, der in eine Lipidmembran integriert ist.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Abnahme" in der Bindung eine Abnahme um wenigstens 10% in der Bindung eines TIG2-Polypeptids gemäß der Erfindung oder anderer Agonisten an ein ChemR23-Polypeptid wie es in einem Bindungsassay, wie er hierin beschrieben ist, gemessen wird.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „sekundärer Botenstoff ein Molekül, das erzeugt wird oder dessen Konzentration variiert, wenn ein G-Protein gekoppelter Rezeptor aktiviert wird, der an der Transduktion eines Signals von diesem GPCR beteiligt ist. Nicht begrenzende Beispiele für sekundäre Botenstoffe beinhalten cAMP, Diacylglycerin, Inositoltriphosphate und intrazelluläres Kalzium. Der Ausdruck „Veränderung in der Konzentration eines sekundären Botenstoffs" bezeichnet einen Anstieg oder eine Abnahme um wenigstens 10% der nachgewiesenen Konzentration eines gegebenen sekundären Botenstoffs im Vergleich mit der Menge, die in einem Assay nachgewiesen wird, wenn ein Kandidatenmodulator fehlt.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Aequorin-gestützter Assay" einen Assay für GPCR-Aktivität, der einen intrazellulären Kalziumfluss misst, der durch aktivierte GPCRs induziert wird, wobei der intrazelluläre Kalziumfluss durch die Lumineszenz von Aequorin gemessen wird, das in der Zelle exprimiert wird.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Bindung" die physikalische Assoziierung eines Liganden (z.B. einem TIG2-Polypeptid) mit einem Rezeptor (z.B. ChemR23). So wie der Ausdruck hierin verwendet wird, ist die Bindung „spezifisch", wenn sie mit einem EC50- oder einem Kd-Wert von 100 nM oder weniger auftritt, im Allgemeinen in einem Bereich von 100 nM bis 10pM. Beispielsweise ist die Bindung spezifisch, wenn der EC50- oder Kd-Wert 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 950 pM, 900 pM, 850 pM, 750 pM, 650 pM, 600 pM, 550 pM, 450 pM, 400 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 75 pM, 50 pM, 25 pM oder 10 pM oder weniger ist.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „EC50-Wert" die Konzentration eines Agens, bei der eine gegebene Aktivität, einschließlich der Bindung eines TIG2-Polypeptids gemäß der Erfindung oder eines anderen Liganden und eine funktionale Aktivität eines ChemR23-Polypeptids, 50% des Maximalwerts dieser ChemR23-Aktivität beträgt, der unter Verwendung desselben Assays messbar ist. Anders ausgedrückt ist „EC50-Wert" die Konzentration eines Agens, der 50% Aktivierung ergibt, wenn 100% Aktivierung auf die Menge von Aktivität gesetzt wird, die nicht mehr ansteigt, wenn noch mehr Agonist hinzugefügt wird. Es soll beachtet werden, dass der „EC50-Wert eines TIG2-Polypeptids" mit der Identität des TIG2-Polypeptids variieren wird; beispielsweise können variante TIG2-Polypeptide (d.h. diejenigen mit Insertionen, Deletionen, Substitutionen oder Fusionen mit anderen Polypeptiden, einschließlich von TIG2-Molekülen von Arten die nicht human sind und deren Varianten, die der Definition des TIG2-Polypeptids, wie sie oben dargelegt wurde, genügen) EC50-Werte besitzen, die höher, niedriger oder genauso hoch sind wie der des wildtypischen TIG2. Daher kann der Fachmann für den Fall, dass eine TIG2-variante Sequenz sich von TIG2 der SEQ ID NR:48 unterscheidet, den EC50-Wert für diese Variante gemäß herkömmlicher Verfahren bestimmen. Der EC50-Wert eines gegebenen TIG2-Polypeptids wird bestimmt, indem ein Assay ausgeführt wird, mit dem die Aktivität einer bestimmten von ChemR23-Polypeptid in Anwesenheit von Dosen des TIG2-Polypeptids ermittelt wird, welche wenigstens solange ansteigen, bis die ChemR23-Antwort gesättigt oder maximal ist, und die gemessene ChemR23-Aktivität gegen die Konzentration des TIG2-Polypeptids aufgetragen wird.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „IC50-Wert" die Konzentration eines Antagonisten oder inversen Agonisten, der die maximale Aktivierung eines ChemR23-Rezeptors um 50% verringert.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „nachweisbar markiert" die Eigenschaft eines Moleküls, z.B. eines TIG2-Polypeptids oder eines anderen ChemR23-Liganden, das/der eine strukturelle Modifikation besitzt, die eine funktionale Gruppe (Markierung) einfügt, die leicht nachgewiesen werden kann. Nachweisbare Markierungen beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Fluoreszenzverbindungen, isotopische Verbindungen, chemilumineszente Verbindungen, Quantenpunktmarkierungen, Biotin, Enzyme, elektronendichte Reagenzien und Haptene oder Proteine, für die Antiseren oder monoklonale Antikörper erhältlich sind. Die verschiedenen Mittel des Nachweises beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf spektroskopische, photochemische, radiochemische, biochemische, immunochemische oder chemische Mittel.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Affinitäts-Tag" eine Markierung, die an ein Molekül von Interesse (z.B. ein TIG2-Polypeptid oder ein anderer ChemR23-Ligand) angebracht ist, das dem markierten Molekül die Fähigkeit verleiht, spezifisch von einem Reagenz gebunden zu werden, das die Markierung bindet. Affinitäts-Tags beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf ein Epitop für einen Antikörper (bekannt als „Epitop-Tags"), Biotin, 6x His und GST. Affinitäts-Tags können für den Nachweis sowie für die Aufreinigung der markierten Moleküle verwendet werden.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Abnahme in der Bindung" eine Abnahme von wenigstens 10% in der Bindungsmenge, die in einem gegebenen Assay mit einem bekannten oder vermuteten Modulator von ChemR23 nachgewiesen wird, im Vergleich zur Bindung, die in einem Assay nachgewiesen wird, wo der bekannte oder vermutete Modulator fehlt.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „Zufuhr", wenn er in Bezug auf ein Medikament oder ein Agens verwendet wird, die Hinzugabe eines Medikaments oder Agens zu einem Assay-Gemisch, oder zu einer Zelle in Kultur. Der Ausdruck bezeichnet auch die Verabreichung des Medikaments oder Agens an ein Tier. Eine solche Verabreichung kann zum Beispiel durch Injektion (in einem geeigneten Träger, z.B. sterile Kochsalzlösung oder Wasser) oder durch Inhalation oder durch einen oralen, transdermalen, rektalen, vaginalen oder einen anderen für das Medikament üblichen Verabreichungsweg erfolgen.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „wirkungsvolle Menge" die Menge eines Medikaments oder eines ChemR23-modulierenden Agens, die in einer Veränderung der ChemR23-Aktivität, wie sie hierin definiert ist, resultiert (d.h. wenigstens 10% Anstieg oder Abnahme der ChemR23-Aktivität).
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Standard" eine Probe, die von einem Individuum entnommen wurde, das nicht von einer Krankheit oder Störung betroffen ist, die durch eine Deregulierung der ChemR23- oder TIG2-Aktivität gekennzeichnet ist. Der „Standard" wird als Referenz zum Vergleich eines ChemR23- oder TIG2-Polypeptids oder der mRNA-Konzentrationen und -Qualität (d.h. Mutant vs. Wildtyp) verwendet sowie für den Vergleich von ChemR23-Aktivitäten.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Amplifizierung", wenn er bezüglich einer Nukleinsäuresequenz verwendet wird, eine Vorgang, wodurch eine oder mehrere Kopien einer Nukleinsäuresequenz ausgehend von einer Matrizennukleinsäure erzeugt wird/werden. Ein bevorzugtes Verfahren von „Amplifizierung" ist PCR oder RT/PCR.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „im Wesentlichen fehlend" eine Konzentration eines aktivierenden oder inhibierenden Faktors, die unter der Konzentration liegt, die notwendig ist, um die GPCR-Funktion um wenigstens 10% zu aktivieren oder zu inhibieren, wie dies durch einen gegebenen Assay, wie er hierin offenbart oder dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, gemessen wird.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „G-Protein gekoppelter Rezeptor" oder „GPCR" ein Membran-assoziiertes Polypeptid mit 7 alpha-helikalen Transmembrandomänen. Funktionale GPCRs assoziieren mit einem Liganden oder Agonisten und assoziieren auch mit und aktivieren G-Proteine(n). ChemR23 ist ein GPCR.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Agens, das die Funktion eines ChemR23-Polypeptids moduliert" ein Molekül oder eine Verbindung, das/die eine ChemR23-Aktivität verstärkt oder abschwächt, einschließlich von Verbindungen, welche die Bindung von erfindungsgemäßen TIG2-Polypeptiden oder anderer Agonisten und Verbindungen, welche die stromabwärts liegenden Signal-Aktivitäten von ChemR23 verändern.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Antikörper" ein konventionelles Immunglobulinmolekül, sowie Fragmente davon, die auch mit einem der betroffenen Polypeptide reaktiv sind. Antikörper können unter Verwendung konventioneller Techniken fragmentiert werden, und die Fragmente können auf ihre Nützlichkeit auf dieselbe Art und Weise, wie sie hierin für ganze Antikörper beschrieben ist, durchmustert werden. Zum Beispiel können F(ab)2-Fragmente erzeugt werden, indem Antikörper mit Pepsin behandelt werden. Das resultierende F(ab)2-Fragment kann behandelt werden, um Disulfidbrücken zu reduzieren, so dass Fab-Fragmente entstehen. Der erfindungsgemäße Antikörper soll ferner bispezifische, einzelkettige und chimere und humanisierte Moleküle beinhalten, die eine Affinität für ein Polypeptid aufweisen, die durch wenigstens einen CDR-Bereich des Antikörpers vermittelt wird. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst(en) die/der Antikörper weiter ein an ihn/sie angebrachte Markierung, die nachgeweisbar ist (z.B. kann die Markierung ein Radioisotop, eine fluoreszente Verbindung, eine chemilumineszente Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Co-Faktor sein).
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Nullmutation" eine Insertion, Deletion oder Substitution, die die chromosomalen Sequenzen, die ein Polypeptid kodieren, so modifiziert, dass das Polypeptid nicht exprimiert wird.
  • 1 zeigt die Nukleotid- (SEQ ID NR:1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz von humanem ChemR23/Dezb/CMKRL1 (AC075748).
  • 2 zeigt die Aminosäuresequenz von humanem ChemR23/Dezb/CMKRL1 (371 Aminosäuren) (SEQ ID NR:2). Die sieben vorhergesagten Transmembrandomänen sind unterstrichen. Die Konsensussequenz für N-verknüpfte Glykosylierung (N-X-S/T) am N- Terminus ist fettgedruckt, und die potentielle PKC-Phosphorylierungsstelle (S/T-X-R/K) im C-Terminus ist kursiv dargestellt.
  • 3 zeigt die Nukleotid- (SEQ ID NR:3) und abgeleitete Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR:4) von Dez der Maus, dem Maus-Orthologen von ChemR23 (AC u79525).
  • 4 zeigt die Nukleotid- (SEQ ID NR:5) und abgeleitete Aminosäure- (SEQ ID NR:6) Sequenz des G-Protein-gekoppelten Chemoattraktants 1 der Ratte, das Ratten-Ortholog von ChemR23/Dezb/CMKRL1 (AC NM_022218).
  • 5 zeigt die strukturellen Ähnlichkeiten zwischen den Aminosäuresequenzen von ChemR23/Dezb/CMKRL1 und den Sequenzen der AT2-, C3a-, c5a- und fMLP-Rezeptoren und ausgewählter Chemokinrezeptorsequenzen, wie sie unter Verwendung des ClustalX-Algorithmus ermitelt wurden. Das gezeigte Dendrogram wurde unter Verwendung des TreeView-Algorithmus erzeugt.
  • 6 zeigt die Nukleotid- (SEQ ID NR:7) und abgeleitete Aminosäure- (SEQ ID NR:8) – Sequenzen von humanem TIG2 (AC Q99969).
  • 7 zeigt die Nukleotid- (SEQ ID NR:9) und abgeleitete Aminosäure- (SEQ ID NR:10) – Sequenzen von TIG2 der Maus.
  • 8 zeigt ein Alignment der humanen (SEQ ID NR:8) und murinen (SEQ ID NR:10) Aminosäufresequenzen von TIG2. Identische Aminosäuren und konservative Substitutionen sind umrandet.
  • 9 zeigt ein Alignment der TIG2-Sequenzen des Menschen („tig2", SEQ ID NR:8), der Ratte (SEQ ID ID NR:31), der Maus (SEQ ID NR:10), von Sus (Sus scrofa) (SEQ ID NR:32), von Bos (Bos taurus) (SEQ ID NR:33), und Gallus (Gallus gallus) (SEQ ID NR:34). Die Figur illustriert die Aminosäureidentität zwischen beliebigen zwei Arten, die aufgelistet sind, in Prozentwerten.
  • 10 zeigt ein partielles Chromatogramm des fünften Schritts der Aufreinigung von TIG2 aus ascitischer Flüssigkeit. Die aktiven Fraktionen (eluiert mit etwa 28% CH3CN) des vorhergehenden Schritts wurden sechsfach mit 0,1% TFA in H2O verdünnt und direkt auf eine C18-Reversphasensäule (1 mm × 50 mm, Vydac) geladen, die mit 5% CH3CN/0,1% TFA in H2O prä-equilibriert wurde, bei einer Flussrate von 0,1 ml/min bei Raumtemperatur. Ein 5-95%-Gradient von CH3CN in 0,1% TFA wurde mit einer Steigung von 0,3%/min zwischen 25 und 45% angewendet. Die Aktivität wurde bei 40% CH3CN eluiert (angezeigt durch die schwarze horizontale Linie).
  • 11 zeigt die Identifizierung einer spezifischen Antwort auf ChemR23 nach der Durchmusterung von HPLC-Fraktionen, die nach Fraktionierung von humaner Ascitesflüssigkeit der Eierstöcke erhalten wurden. Die verschiedenen Fraktionen, die nach der Fraktionierung menschlicher Aszitesflüssigkeit aus dem Eierstock gewonnen wurden, wurden fünffach mit Assay-Puffer verdünnt und in einem Aequorin-Assay unter Verwendung einer Zelllinie, die ChemR23 exprimiert (offene Kreise), oder unter Verwendung von Zelllinien, die unverwandte Rezeptoren exprimieren (geschlossene Dreiecke und Quadrate), getestet. Die in jeder Fraktion erhaltene Reaktion wurde unter Verwendung der ATP-Reaktion jeder Zelllinie normalisiert.
  • 12 zeigt die Aktivierung von ChemR23 durch konditioniertes Medium von 293 T-Zellen, die transient mit TIG2 transfiziert wurden. 293 T-Zellen wurden transient mit pcDNA3-TIG2 oder mit pcDNA3 alleine (Kontrolltransfektion) transient transfiziert. Ansteigende Volumina des Überstands wurden vier Tage nach der Transfektion gesammelt und unter Verwendung eines Mikrolumat mit einem Aequorin-gestützten Assay mit CHO-Zellen, die ChemR23 exprimieren, analysiert. Der Assay wurde in Triplikaten ausgeführt, und die SD ist angegeben. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt.
  • 13 zeigt die Charakterisierung von Antikörpern, die gegen ChemR23 gerichtet sind, mittels Durchflusszytometrie. Ein Gemisch rekombinanter Zellen, das zu 2/3 aus rekombinanten ChemR23-CHO-Zellen und zu 1/3 aus rekombinanten HCR CHO-Zellen (Negativkontrolle) besteht, wurde entweder mit einem Überstand des Anti-ChemR23 5C1H2-monoklonalen Antikörpers (dicke Linie) oder mit einem Überstand ohne bekannte Antikörperaktivität (dünne Linie, grau ausgefüllt) umgesetzt. Nach Färbung mit FITC-markiertem Anti-Maus-Ig, wurden diese Präparate mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Ergebnisse sind als ein Histogramm der Zellanzahl (Ereignisachse) angegeben, die eine gegebene Fluoreszenz exprimieren (FL1-H-Achse). Der monoklonale Antikörper 5C1H2 erlaubte es, die ChemR23-rekombinante Sub-Population von Zellen von den negativen Kontrollzellen zu unterscheiden, was durch die relativen Anteile beider Zelltypen dargelegt ist. Die Hintergrundfluoreszenz des Assays ist durch eine zweite Färbung angegeben (grau ausgefüllt).
  • 14 zeigt den EC50-Wert für die Aktivierung von ChemR23 durch das gestutzte hTIG2-Polypeptid, die wie in Beispiel 11 bestimmt wurde.
  • 15 zeigt die Gewebeverteilung von hTIG2-mRNA, die wie in Beispiel 10 angegeben bestimmt wurde.
  • 16 zeigt die Gewebeverteilung der ChemR23-mRNA, die wie in Beispiel 10 erklärt nachgewiesen wurde. DC steht für dendritische Zellen.
  • 17 zeigt das Polypeptid (SEQ ID NR:48) und das Polynukleotid (SEQ ID NR:49) des gestutzten humanen TIG2.
  • 18 zeigt die Polypeptidsequenzen anderer gestutzter humaner TIG2-Polypeptide (SEQ ID NR:50-60) im Vergleich mit TIG2 der SEQ ID NR:48 und dem Volllängen-TIG2 (SEQ ID NR:8).
  • Die Anmeldung offenbart, dass das TIG2-Polypeptid ein natürlicher Ligand für den verwaisten ChemR23-GPCR ist. Die Wechselwirkung ist für Durchmusterungsassays nach Agenzien nützlich, welche die Wechselwirkung und daher die Funktion von ChemR23 modulieren. Der bekannte Ligand und seine Wechselwirkung mit dem Rezeptor stellt auch Mittel für die Diagnose von Krankheitszuständen bereit, die eine Deregulierung der Rezeptoraktivität beinhalten.
  • I. Assays für die Identifizierung von Agenzien, welche die Aktivität von ChemR23 modulieren
  • Agenzien, welche die Aktivität von ChemR23 modulieren, können auf eine Anzahl von Weisen identifiziert werden, die ihren Nutzen aus der Wechselwirkung des Rezeptors mit TIG2 ziehen. Zum Beispiel stellt die Fähigkeit, eine ChemR23/TIG2-Bindung entweder in vitro, auf kultivierten Zellen, oder in vivo zu rekonstituieren, ein Ziel für die Identifizierung von Agenzien bereit, die diese Bindung auflösen. Assays, die auf der Auflösung von Bindung beruhen, können Agenzien identifizieren, beispielsweise kleine organische Moleküle, die aus Bibliotheken oder Sammlungen solcher Moleküle stammen. Alternativ können solche Assays Agenzien in Proben oder Extrakten von natürlichen Quellen identifizieren, z.B. pflanzliche, pilzliche oder bakterielle Extrakte oder sogar in humanen Gewebeproben (z.B. Tumorgewebe). In einem Aspekt können die Extrakte aus Zellen hergestellt werden, die eine Bibliothek verschiedener Nukleinsäuren, Peptide und Polypeptide, einschließlich von, zum Beispiel, Varianten des TIG2-Polypeptids selbst, exprimieren. Modulatoren der ChemR23-TIG2-Bindung können anschließend durchmustert werden, indem ein Bindungsassay oder ein Funktionalitäts-Assay verwendet wird, der die stromabwärts liegende Signalwirkung durch den Rezeptor misst. Sowohl Bindungsassays als auch Funktionalitäts-Assays werden unter Verwendung des TIG2-Polypeptids validiert.
  • Ein weiterer Ansatz, der die ChemR23/TIG2-Wechselwirkung direkter zur Identifizierung von Agenzien nutzt, welche die ChemR23-Funktion modulieren, misst Änderungen der stromabwärts von ChemR23 gelegenen Signalaktivität, die durch Kandidatenagenzien oder Kandidatenmodulatoren induziert werden. Diese Funktionalitäts-Assays können in isolierten Zellmembranfraktionen oder auf Zellen ausgeführt werden, die den Rezeptor auf ihren Oberflächen exprimieren.
  • Die folgende Beschreibung stellt Verfahren für sowohl Bindungs- als auch Funktionalitäts-Assays bereit, die auf der Wechselwirkung von ChemR23 und TIG2 basieren.
  • A. ChemR23-Polypeptide
  • Assays, welche die Wechselwirkung von ChemR23 und TIG2 verwenden, benötigen eine Quelle für das ChemR23-Polypeptid. Die Polynukleotid- und Polypeptid-Sequenz des humanen ChemR23 sind hierin als SEQ ID NR:1 und 2 dargestellt. Die humane ChemR23-Polynukleotidsequenz ist auch unter der GenBank Zugangsnummer Y14838 erhältlich und wurde in Samson et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 1689-1700 publiziert. Eine ChemR23-Polypeptidsequenz ist unter den Zugangsnummern 075748 und CAA75112 in der Swissprot-Datenbank gespeichert. Verwandte Sequenzen beinhalten die Sequenz für CMKRL1 (GenBank Zugangsnummern XM_006864 und NM004072 (Nukleotidsequenzen) und Swissprot-Zugangsnummer Q99788 (Polypeptidsequenz)), humanes DEZb (GenBank-Zugangsnummer U79527 (Nukleotidsequenz)), humanes DEZa (GenBank-Zugangsnummer U79526 (Nukleotidsequenz), das DEZ der Maus (GenBank-Zugangsnummer U79525 (Nukleotidsequenz) und Swissprot-Zugangsnummer P97468 (Polypeptidsequenz)) und das ChemR23 der Ratte (GenBank-Zugangsnummer AJ002745 (Nukleotidsequenz) und Swissprot-Zugangsnummer 035786 (Polypeptidsequenz).
  • Der Durchschnittsfachmann kann eine ChemR23-Sequenz leicht aus einer Probe amplifizieren, die mRNA enthält, die das Protein kodiert, indem er grundlegende PCR und molekulare Klonierungstechniken unter Verwendung von Primern oder Sonden ausführt, die ausgehend von den bekannten Sequenzen entworfen sind.
  • Die Expression von rekombinanten Polypeptiden ist in der Fachwelt wohl bekannt. Der Durchschnittsfachmann kann leicht Vektoren und Expressions-Kontrollsequenzen zur Expression von nützlichen erfindungsgemäßen ChemR23-Polypeptiden in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen auswählen. ChemR23 muss mit der Zellmembran assoziiert sein oder Detergentien wie synthetischen Liposomen, um eine Bindungs- oder Signalgebungs-Funktion zu haben. Verfahren für die Zubereitung zellulärer Membranfraktionen sind in der Fachwelt wohl bekannt, zum Beispiel das Verfahren, das von Hubbard & Cohn, 1975, J. Cell Biol. 64: 461-479 publiziert wurde. Um Membranen herzustellen, die ChemR23 umfassen, muss man solche Techniken lediglich für Zellen anwenden, die endogen oder rekombinant ChemR23 exprimieren. Alternativ kann membranfreies ChemR23 in Membranzubereitungen integriert werden, indem eine Detergenzlösung des Polypeptids verdünnt wird (siehe z.B. Salamon et al., 1996, Biophys. J. 71: 283-294).
  • B. TIG2-Polypeptide
  • Humane TIG2-Polynukleotid und -Polypeptidsequenzen sind hierin als SEQ ID NR:7 bzw. 8 dargestellt. TIG2-Sequenzen sind auch von GenBank erhältlich (z.B. Humane Polynukleotidsequenzen beinhalten Zugangsnummern XM 004765, U77594, NM 002889, humane Polypeptidsequenzen sind unter Zugangsnummern Q99969, BAA76499, AAB47975, NP002880 und XP004765 erhältlich; Gallus gallus Polynukleotidsequenzen beinhalten Zugangsnummern BG713704, GB713660 und BG713614; Polynukleotidsequenzen der Maus beinhalten BF020273, AW113641 und bf018000; Polynukleotidsequenzen der Ratte beinhalten AW915104; Polynukleotidsequenzen von Sus scrofa beinhalten BF078978 und BF713092 (überlappende ESTs, die letzten 7 Aminosäuren der TIG2-Sequenz in BF713092); und die Polynukleotidsequenzen von Bos taurus beinhalten BG691132). Ein Alignment der TIG2-Sequenzen ist in 9 dargestellt.
  • Wie bei ChemR23, können TIG2-Polynukleotide mittels Standard-PCR und molekularen Klonierungstechniken unter Verwendung der bekannten Sequenzen als Quelle der Amplifikationsprimer oder Sonden kloniert werden. In ähnlicher Weise können klonierte TIG2-Polypeptide in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen, wie es im Stand der Technik bekannt ist, exprimiert werden. Als ein nicht begrenzendes Beispiel kann ein TIG2-Expressionsvektorsystem eines Säugetiers einen bicistronischen Expressionsvektor umfassen, der den Promotor des humanen EF1α (beschrieben in Mishizuma & Nagata, 1990, Nucl. Acids Res. 18: 5322), einen Polylinker, die interne ribosomale Eintrittsstelle von ECMV (IRES, beschrieben von Ghattas et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11:5848-5859) und das Neomycin-Resistenzgen gefolgt von einem SV40 PolyA-Signal enthält. Ein TIG2-Expressionskonstrukt für die Expression in Hefe ist in Beispiel 4 beschrieben.
  • TIG2 kann auch in vitro durch eine in vitro-Transkription und -Translation exprimiert werden. Ferner, wenn dies für einen gegebenen Assay oder eine Technik gewünscht ist, können die nützlichen erfindungsgemäßen TIG2-Polypeptide als Fusionsproteine oder Betagte Proteine hergestellt werden. Das TIG2 voller Länge oder ein Teil von ihm (d.h. wenigstens 10 Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 20 Aminosäuren oder mehr, bis zu einer Aminosäure weniger als das TIG2 voller Länge besitzt) kann an Glutathion-S-Transferase (GST), sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP), ein FLAG-Tag, ein Myc-Tag oder ein 6x-His-Peptid fusioniert werden, um die Aufreinigung oder den Nachweis des TIG2-Polypeptids- zu erleichtern. Verfahren und Vektoren für die Herstellung von getagten oder Fusionsproteinen sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt, genauso wie Isolations- und Nachweisverfahren für solche fusionierten oder getagten Proteine.
  • TIG2-Polypeptide und insbesondere die gestutzten Formen können auch mittels chemischer Synthese, wie dies im Stand der Technik bekannt ist, zubereitet werden.
  • Rekombinante TIG2-Polypeptide können in aufgereinigter Form verwendet werden. Alternativ kann konditioniertes Medium von TIG2-transfizierten Zellen verwendet werden. Die Mengen von TIG2, die in einem gegebenen Bindungs- oder Funktionalitäts-Assay gemäß der Erfindung notwendig sind, werden je nach Assay variieren, man wird jedoch im Allgemeinen 1 pM bis 1 nM von markiertem und 10 pM bis 1 μM von unmarkiertem TIG2 pro Assay verwenden. Die Affinitäten und EC50-Werte von getagten TIG2-Polypeptiden für ChemR23 können im Vergleich zu jenen des wildtypischen TIG2-Polypeptids voller Länge variieren, und die Menge, die für einen gegebenen Assay notwendig ist, kann daher relativ zu den Wildtyp-Werten angepasst werden. Wenn dies für einen gegebenen Assay notwendig ist, kann TIG2 durch Inkorporierung von radiomarkierten Aminosäuren in das Medium während der Synthese markiert werden, z.B. 35S-Met, 14C-Leu oder andere geeignete Aminosäuren. Verfahren der chemischen Markierung mit 125I sind im Stand der Technik bekannt. Fluoreszente Markierungen können an die TIG2-Polypeptide oder andere ChemR23-Liganden angebracht werden, indem Standardmarkierungstechniken verwendet werden.
  • C. Assays, um Modulatoren der ChemR23-Aktivität zu identifizieren
  • Die Entdeckung, dass TIG2 ein Ligand des ChemR23-Rezeptors ist, erlaubt die Durchführung von Durchmusterungsassays, um Agonisten, Antagonisten und inverse Agonisten der Rezeptoraktivität zu identifizieren. Die Durchmusterungsassays werden im Allgemeinen zwei Ansätze aufweisen.
    • 1) Ligandenbindungsassays, in denen ChemR23 exprimierende Zellen, Membranextrakte von solchen Zellen oder immobilisierte Lipidmembranen, die ChemR23 umfassen, einem markierten TIG2-Polypeptid und einer Kandidatenverbindung ausgesetzt werden. Nach einer Inkubation wird das Reaktionsgemisch auf spezifische Bindung des markierten TIG2-Polypeptids an den ChemR23-Rezeptor gemessen. Verbindungen, die das markierte TIG2-Polypeptid stören oder austauschen, können Agonisten, Antagonisten oder inverse Agonisten der ChemR23-Aktivität sein. Eine Funktionalitätsanalyse kann mit positiven Verbindungen ausgeführt werden, um zu bestimmen in welche dieser Kategorien sie einzuordnen sind.
    • 2) Funktionalitäts-Assays, in denen eine Signal-Aktivität von ChemR23 gemessen wird. a) Für die Durchmusterung nach Agonisten werden ChemR23 exprimierende Zellen oder Membranen, die von solchen Zellen zubereitet wurden, mit einer Kandidatenverbindung inkubiert, und eine Signal-Aktivität von ChemR23 wird gemessen. Die Assays werden unter Verwendung eines TIG2-Polypeptids, wie es oben definiert ist, als Agonist validiert, und die Aktivität, die durch Verbindungen, welche die Rezeptoraktivität modulieren, wird verglichen mit derjenigen, die durch TIG2, wie es oben definiert ist, induziert wird. Ein Agonist oder partieller Agonist wird eine maximale biologische Aktivität aufweisen, die wenigstens 10% der Maximalaktivität von TIG2, wie es oben definiert ist, beträgt, wenn der Agonist oder partielle Agonist in einer Konzentration von 10 μM oder weniger vorliegt. b) Für eine Durchmusterung nach einem Antagonisten oder inversen Agonisten, werden ChemR23 exprimierende Zellen oder Membranen, die von solchen Zellen isoliert wurden, auf Signal-Aktivität in Gegenwart eines TIG2-Polypeptids mit einer oder ohne eine Kandidatenverbindung getestet. Antagonisten oder inverse Agonisten werden das Niveau der TIG2-stimulierten Rezeptoraktivität um wenigstens 10% senken, relativ zu Reaktionen ohne den Antagonisten oder inversen Agonisten. c) Für die Durchmusterung nach einem inversen Agonisten, werden Zellen, die eine ChemR23-Aktivität konstitutiv exprimieren, oder Membranen, die von solchen Zellen isoliert wurden, in einem Funktionalitäts-Assay verwendet, der eine Aktivität des Rezeptors in Gegenwart und bei Fehlen einer Kandidatenverbindung misst. Inverse Agonisten sind solche Verbindungen, welche die konstitutive Aktivität des Reporters um wenigstens 10% senken. Eine Überexpression von ChemR23 (d.h. eine Expression eines fünffachen oder höheren Überschusses an ChemR23-Polypeptid im Vergleich zu der Konzentration, die natürlicherweise in vivo in Makrophagen exprimiert wird) kann zu einer konstitutiven Aktivierung führen. ChemR23 kann überexprimiert werden, indem es unter Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors, z.B. des CMV frühen Promotors, gestellt wird. Alternativ können bestimmte Mutationen von konservierten GPCR-Aminosäuren oder Aminosäuredomänen dazu neigen, zu einer konstitutiven Aktivität zu führen. Siehe zum Beispiel: Kjelsberg et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:1430; McWhinney et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:2087; Ren et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:16483; Samama et al., 1993, J. Biol. Chem 268:4625; Parma et al., 1993, Nature 365:649; Parma et al., 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther. 286:85; and Parent et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:7949.
  • Ligandenbindung und Austausch-Assays
  • Man kann ChemR23-Polypeptide, die auf einer Zelle exprimiert werden, oder isolierte Membranen mit Rezeptorpolypeptiden, zusammen mit einem TIG2-Polypeptid verwenden, um nach Verbindungen zu durchmustern, die die Bindung von TIG2 an ChemR23 inhibieren. Wenn in einem Assay, der die Bindung oder den Austausch des TIG2-Polypeptids alleine misst, Verbindungen identifiziert werden, müssen diese Verbindungen einem Funktionalitätstest unterworfen werden, um zu bestimmen, ob sie als Agonist, Antagonist oder inverser Agonist wirken.
  • Für Austauschexperimente werden Zellen, die ein ChemR23-Polypeptid exprimieren (im Allgemeinen 25.000 Zellen pro Assay oder 1 bis 100 μg Membranextrakt) in einem Bindungspuffer (z.B. 50 mM Hepes pH 7,4; 1 mM CaCl2; 0,5% bovines Serumalbumin (BSA) fettsäurefrei; und 0,5 mM MgCl2) für 1,5 Stunden (bei, zum Beispiel, 27°C) mit markiertem TIG2-Polypeptid in Anwesenheit oder bei Fehlen von ansteigenden Konzentrationen eines Kandidatenmodulators inkubiert. Um den Assay zu validieren und zu kalibrieren, können Kontroll-Kompetitionsreaktionen unter Verwendung ansteigender Konzentrationen von unmarkiertem TIG2-Polypeptid ausgeführt werden. Nach Inkubation werden die Zellen intensiv gewaschen, und gebundenes, markiertes TIG2 wird so gemessen, wie es für die gegebene Markierung passend ist (z.B. Szintillationszählung, Enzymassay, Fluoreszenz, etc.). Eine Abnahme von wenigstens 10% in der Menge von markiertem TIG2-Polypeptid, das in Anwesenheit eines Kandidatenmodulators gebunden ist, zeigt einen Austausch der Bindung durch den Kandidatenmodulator an. Von Kandidatenmodulatoren nimmt man an, dass sie in diesen oder anderen hierin beschriebenen Assays spezifisch binden, wenn sie 50% des markierten TIG2 (eine TIG2-Dosis die unter der Sättigung liegt) bei einer Konzentration von 10 μM oder weniger (d.h. einem EC50-Wert, der 10 μM geringer ist) austauschen.
  • Alternativ kann die Bindung oder der Austausch der Bindung mittels Oberflächenplasmonresonanz (SPR) überwacht werden. Oberflächenplasmonresonanz-Assays können als ein quantitatives Verfahren verwendet werden, um die Bindung zwischen zwei Molekülen durch die Massenänderung in der Nähe eines immobilisierten Sensors zu messen, die durch die Bindung oder den Verlust der Bindung eines TIG2-Polypeptids aus der wässrigen Phase an ein ChemR23-Polypeptid, das in einer Membran auf dem Sensor immobilisiert ist, verursacht wird. Diese Massenveränderung wird als Resonanzeinheiten pro Zeit gemessen, nachdem das TIG2-Polvpeptid oder der Kandidatenmodulator injiziert oder entfernt wurde, und wird unter Verwendung eines Biacore Biosensors (Biacore AB) gemessen. ChemR23 kann auf einem Sensorchip (zum Beispiel einem hochreinen CMS-Chip; Biacore AB) in einer dünnen Lipid-Filmmembran gemäß den Verfahren, die von Salamon et al. (Salamon et al., 1996, Biophys. J. 71:283-294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24:213-219) beschrieben sind, immobilisiert werden. Sarrio et al. zeigten, dass SPR verwendet werden kann, um eine Ligandenbindung an den GPCR A(1) Adenosinrezeptor nachzuweisen, der in einer Lipidschicht auf dem Chip immobilisiert wurde (Sarrio et al., Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174). Die Bedingungen für eine TIG2-Bindung an ChemR23 in einem SPR-Assay können vom Fachmann unter Verwendung der von Sarrio et al. beschriebenen Bedingungen als ein Ausgangspunkt fein eingestellt werden.
  • SPR kann auf wenigstens zweierlei Weise auf Modulatoren der Bindung testen. Zunächst kann ein TIG2-Polypeptid an ein immobilisiertes ChemR23-Polypeptid gebunden werden, gefolgt von einer Injektion eines Kandidatenmodulators bei einer Flussrate von etwa 10 μl/min und einer Konzentration, die von 1 nM bis 100 μM reicht, vorzugsweise etwa 1 μM. Der Austausch des gebundenen TIG2 kann quantifiziert werden, was den Nachweis der Modulatorbindung erlaubt. Alternativ kann membrangebundenes ChemR23-Polypeptid mit einem Kandidatenmodulator vor-inkubiert werden und einem TIG2-Polypeptid ausgesetzt werden. Ein Unterschied in der TIG2-Bindung an das ChemR23, das dem Modulator ausgesetzt ist, im Vergleich zu demjenigen auf einem Chip, das einem Modulator nicht vor-ausgesetzt war, wird die Bindung zeigen. In beiden Assays zeigt ein Absinken der Menge eines gebundenen TIG2-Polypeptids in Anwesenheit eines Kandidatenmodulators um 10% oder mehr, im Vergleich zur Menge eines gebundenen TIG2-Polypeptids bei Fehlen eines Kandidatenmodulators, an, dass der Kandidatenmodulator die Wechselwirkung von ChemR23 und TIG2 inhibiert.
  • Ein anderes Verfahren zur Messung der Inhibition der Bindung eines TIG2-Polypeptids an ChemR23 verwendet den Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET). FRET ist ein quantenmechanisches Phänomen, das zwischen einem Fluoreszenz-Donor (D) und einem Fluoreszenz-Akzeptor (A) in großer Nähe zueinander (üblicherweise < 100 Å Abstand) auftritt, wenn das Emissionsspektrum von D mit dem Erregungsspektrum von A überlappt. Die zu testenden Moleküle, z.B. ein TIG2-Polypeptid und ein ChemR23-Polypeptid, werden mit einem komplementären Paar von Donor- und Akzeptor-Fluorophoren markiert. Während sie durch die ChemR23:TIG2-Wechselwirkung eng aneinander gebunden sind, wird die nach Anregung des Donor-Fluorophors emittierte Fluoreszenz eine andere Wellenlänge besitzen, als die, die als Reaktion auf die Anregungswellenlänge emittiert wird, wenn die Polypeptide nicht gebunden sind, was die Möglichkeit einer Quantifizierung von gebundenen gegenüber ungebundenen Polypeptiden durch Messung der Emissionsintensität bei jeder Wellenlänge ermöglicht. Donor-Akzeptor-Paare von Fluorophoren, mit denen die Polypeptide markiert werden, sind dem Fachmann wohl bekannt. Von besonderem Interesse sind Varianten des A. victoria GFP, das als Cyan FP (CFP, Donor(D)) und Gelb FP (YFP, Akzeptor(A)) bekannt sind. Die GFP-Varianten können als Fusionsproteine mit den entsprechenden Mitgliedern des Bindungspaars hergestellt werden, um als D-A-Paare in einer FRET-Analyse zu dienen, um Protein-Protein-Wechselwirkung zu messen. Vektoren für die Expression von GFP-Varianten als Fusionen sind in der Fachwelt wohl bekannt. Beispielsweise kann eine CFP-TIG2-Fusion und eine YFP-ChemR23-Fusion hergestellt werden. Die Hinzugabe eines Kandidatenmodulators zum Gemisch markierter TIG2- und ChemR23-Proteine wird in einer Inhibierung des Energietransfers resultieren, die zum Beispiel durch ein Absinken der YFP-Fluoreszenz im Vergleich zu einer Probe ohne den Kandidatenmodulator angezeigt wird. In einem Assay, der FRET für den Nachweis einer ChemR23:TIG2-Wechselwirkung verwendet wird, zeigt ein 10%-iges oder größeres Absinken der Intensität der Fluoreszenzemission bei der Akzeptorwellenlänge in Proben mit einem Kandidatenmodulator, im Vergleich zu Proben ohne den Kandidatenmodulator, an, dass der Kandidatenmodulator eine ChemR23:TIG2-Wechselwirkung inhibiert.
  • Eine Variation von FRET verwendet Fluoreszenz-Quenchen, um molekulare Wechselwirkungen zu überwachen. Ein Molekül im wechselwirkenden Paar kann mit einem Fluorophor markiert werden, und das andere mit einem Molekül, das die Fluoreszenz des Fluorophors quencht, wenn es in große Nähe gebracht wird. Eine Änderung der Fluoreszenz nach Anregung zeigt eine Änderung in der Assoziierung der mit dem Fluorophor:Quencher-Paar getagten Moleküle an. Im Allgemeinen zeigt ein Anstieg der Fluoreszenz des markierten ChemR23-Polypeptids an, dass das Quencher tragende TIG2-Polypeptid ausgetauscht wurde. In Quench-Assays zeigt ein 10%-iger oder höherer Anstieg der Intensität der Fluoreszenzemission in Proben mit einem Kandidatenmodulator, im Vergleich zu Proben ohne den Kandidatenmodulator, an, dass der Kandidatenmodulator eine ChemR23:TIG2-Wechselwirkung inhibiert.
  • Zusätzlich zu den Oberflächenplasmonresonanz- und FRET-Verfahren ist die Fluoreszenzpolarisationsmessung nützlich, um eine Protein-Protein-Bindung zu quantifizieren. Der Fluoreszenzpolarisations-Wert für ein Fluoreszenz-getagtes Molekül hängt von der Rotationskorrelationszeit oder Taumelrate ab. Proteinkomplexe, wie solche, die von ChemR23, das mit einem Fluoreszenz-markierten TIG2-Polypeptid assoziiert, ausgebildet werden, besitzen höhere Polarisationswerte als unkomplexiertes markiertes TIG2. Die Miteinbeziehung eines Kandidateninhibitors der ChemR23:TIG2-Wechselwirkung resultiert in einem Absinken der Fluoreszenzpolarisation, im Vergleich zu einem Gemisch ohne den Kandidateninhibitor, wenn der Kandidateninhibitor die Interaktion von ChemR23 mit TIG2 auseinanderreißt oder inhibiert.
  • Fluoreszenzpolarisation ist gut für die Identifizierung kleiner Moleküle geeignet, welche die Bildung von Polypeptid- oder Proteinkomplexen unterbinden. Ein Abfall von 10% oder mehr in der Fluoreszenzpolarisation in Proben mit einem Kandidatenmodulator, im Vergleich mit der Fluoreszenzpolarisation in einer Probe ohne den Kandidatenmodulator, zeigt an, dass der Kandidatenmodulator eine ChemR23:TIG2-Wechselwirkung inhibiert.
  • Eine weitere Alternative, um ChemR23:TIG2-Wechselwirkungen zu überwachen, verwendet einen Biosensor-Assay. ICS-Biosensoren wurden von AMBRI (Australian Membrane Biotechnology Research Institute; http://www.ambri.com.au/) beschrieben. In dieser Technologie ist die Assoziierung von Makromolekülen, wie ChemR23 und TIG2, an das Schließen Gramacidin-reaktiver Ionenkanäle in suspendierten Membrandoppelschichten gekoppelt, und daher an eine messbare Veränderung in der Zugänglichkeit (ähnlich des Widerstands) des Biosensors. Dieser Ausatz ist über sechs Größenordnungen der Zugänglichkeitsänderung linear und ideal geeignet, kombinatorische Bibliotheken kleiner Moleküle im großen Maßstab und im Hochdurchsatz zu durchmustern. Eine 10%-ige oder größere Änderung (Anstieg oder Abfall) in der Zugänglichkeit einer Probe mit einem Kandidatenmodulator, im Vergleich zur Zugänglichkeit einer Probe ohne den Kandidatenmodulator, zeigt an, dass der Kandidatenmodulator die Wechselwirkung von ChemR23 und TIG2 inhibiert.
  • Es ist wichtig zu beachten, dass es in Protein-Protein-Wechselwirkungsassays möglich ist, dass ein Modulator der Interaktion nicht notwendigerweise direkt mit der Domäne/den Domänen der miteinander physikalisch wechselwirkenden Proteine wechselwirkt. Es ist auch möglich, dass ein Modulator an einem Ort wechselwirkt, der von der Stelle, wo die Protein-Protein-Wechselwirkung stattfindet, entfernt liegt, und beispielsweise eine Konformationsänderung im ChemR23-Polypeptid verursacht. Modulatoren (Inhibitoren oder Agonisten), die auf diese Weise wirken, sind nichtsdestotrotz als Agenzien von Interesse, die die Aktivität von ChemR23 modulieren.
  • Man sollte verstehen, dass jeder der hierin beschriebenen Bindungsassays mit einem nicht-TIG2-Liganden (zum Beispiel einem Agonisten, Antagonisten, etc.) von ChemR23 ausgeführt werden kann, zum Beispiel einem kleinen Molekül, dass wie hierin beschrieben identifiziert worden ist. In praktischer Hinsicht weist die Verwendung eines Liganden, der ein kleines Molekül ist, oder eines anderen nicht-TIG2-Liganden den Vorteil auf, dass chemische Verbindungen, die keine Polypeptide sind, im Allgemeinen billiger und einfacher in aufgereinigter Form herzustellen sind als Polypeptide wie TIG2. Daher ist ein nicht-TIG2-Ligand für Hochdurchsatzassays zur Identifizierung von Agonisten, Antagonisten oder inversen Agonisten besser geeignet als das TIG2 voller Länge. Dieser Vorteil untergräbt allerdings in keinster Weise die Wichtigkeit von Assays unter Verwendung von TIG2, da solche Assays für die anfängliche Identifizierung von nicht-TIG2-Liganden gut geeignet sind.
  • Jeder der hierin beschriebenen Bindungsassays kann verwendet werden, um das Vorliegen eines Agens in einer Probe, z.B. in einer Gewebeprobe, zu bestimmen, die das ChemR23-Rezeptormolekül bindet, oder die die Bindung von TIG2 an den Rezeptor beeinflusst. Um dies zu tun, wird das ChemR23-Polypeptid mit dem TIG2-Polypeptid oder einem anderen Liganden in Anwesenheit oder bei Fehlen der Probe umgesetzt, und die Bindung von TIG2 oder des Liganden wird gemessen, so wie es für den verwendeten Bindungsassay geeignet ist. Ein Absinken um 10% oder mehr in der Bindung von TIG2 oder eines anderen Liganden zeigt an, dass die Probe ein Agens enthält, das die TIG2- oder Ligandenbindung an das Rezeptorpolypeptid moduliert.
  • Funktionalitäts-Assays der Rezeptoraktivität
  • i. GTPase/GTP-Bindungsassays:
  • Für GPCRs wie ChemR23 ist ein Größenwert der Rezeptoraktivität die Bindung von GTP durch Zellmembranen, die Rezeptoren enthalten. In dem Verfahren, das von Traynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47: 848-854 beschrieben wurde, misst man im Wesentlichen die G-Proteinkopplung an Membranen, indem man die Bindung von markiertem GTP misst. Für GTP-Bindungsassays werden Membranen, die von Zellen isoliert wurden, die den Rezeptor exprimieren, in einem Puffer mit 20 mM HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl und 10 mM MgCl2, 80 pM 35S-GTPγS und 3 μM GDP inkubiert. Das Assaygemisch wird für 60 Minuten bei 30°C inubiert, wonach ungebundenes markiertes GTP durch Filtration auf GF/B-Filter entfernt wird. Gebundenes markiertes GTP wird durch Flüssig-Szintillationszählung gemessen. Um auf Modulation der TIG2-induzierten ChemR23-Aktivität zu testen, werden Membranen, die von Zellen, die ein ChemR23-Polypeptid exprimieren, zubereitet wurden, mit einem TIG2-Polypeptid gemischt, und der GTP-Bindungsassay wird in Anwesenheit und bei Fehlen eines Kandidatenmodulators der ChemR23-Aktivität ausgeführt. Ein Abfall von 10% oder mehr in der Bindung von markiertem GTP, wie sie durch Szintillationszählung in einem Assay dieser Art mit einem Kandidatenmodulator gemessen wurde, im Vergleich zu einem Assay ohne den Modulator, zeigt an, dass der Kandidatenmodulator die ChemR23-Aktivität inhibiert.
  • Ein ähnlicher GTP-Bindungsassay kann ohne TIG2 ausgeführt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die als Agonisten wirken. In diesem Fall wird TIG2-stimulierte GTP-Bindung als Standard verwendet. Eine Verbindung wird als ein Agonist betrachtet, wenn sie wenigstens 50% des Niveaus der GTP-Bindung induziert, die durch das wildtypische TIG2 voller Länge induziert wird, wenn die Verbindung in einer Konzentration von 1 μM oder weniger vorliegt, und vorzugsweise ein Niveau induzieren wird, das dem durch TIG2 induzierten entspricht oder höher ist.
  • GTPase-Aktivität wird gemessen, indem die Membranen, die ein ChemR23-Polypeptid enthalten, mit γ32P-GTP inkubiert werden. Aktive GTPase wird die Markierung als anorganisches Phosphat freisetzen, das durch Abtrennung von freiem anorganischem Phosphat in einer 5%-igen Aktivkohlesuspension in 20 mM H3PO4 gefolgt von einer Szintillationszählung nachgewiesen wird. Kontrollen beinhalten Assays unter Verwendung von Membranen, die von Zellen isoliert wurden, die kein ChemR23 exprimieren (kontroll-transfiziert), um mögliche unspezifische Wirkungen der Kandidatenverbindung auszuschließen.
  • Um die Wirkungen eines Kandidatenmodulators auf ChemR23-regulierte GTPase-Aktivität zu testen, werden Membranproben mit einem TIG2-Polypeptid inkubiert, mit und ohne den Modulator, gefolgt von dem GTP-Assay. Eine Veränderung (Anstieg oder Absinken) von 10% oder mehr im Niveau der GTP-Bindung oder GTPase-Aktivität im Vergleich zu Proben ohne Modulator zeigt eine ChemR23-Modulation durch einen Kandidatenmodulator an.
  • ii. Aktivierungsassays für den stromabwärts gelegenen Reaktionsweg:
  • a. Kalziumfluss – Der Aequorin-gestützte Assay
  • Der Aequorin-Assay nutzt die Reaktivität von mitochondrialem Apoaequorin auf eine intrazelluläre Kalziumfreisetzung, die durch die Aktivierung von GPCRs induziert wird (Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252: 115-126; Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192: 1501-1508). Kurz gesagt werden ChemR23-exprimierende Klone transfiziert, so dass sie mitochondriales Apoaequorin und Gα16 co-exprimieren. Zellen werden mit 5 μM Coelenterazin H (Molecular Probes) 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, in DMEM-F12-Kulturmedium gewaschen und in einer Konzentration von 0,5 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Zellen werden anschließend mit zu testenden Agonist-Peptiden gemischt, und die Lichtemission durch das Aequorin wird mit einem Luminometer für 30 sec aufgezeichnet. Ergebnisse werden als relative Lichteinheiten (RLE) ausgedrückt. Kontrollen beinhalten Assays unter Verwendung von Membranen, die von Zellen isoliert wurden, die kein ChemR23 exprimieren (kontrolltransfiziert), um mögliche unspezifische Wirkungen der Kandidatenverbindung auszuschließen.
  • Die Aequorin-Aktivität oder intrazellulären Kalziumkonzentrationen sind „verändert", wenn die Lichtintensität in einer Probe von Zellen, die ein ChemR23-Polypeptid exprimieren und mit einem Kandidatenmodulator behandelt wurden, um 10% oder mehr ansteigt oder absinkt, im Vergleich zu einer Probe von Zellen, die das ChemR23-Polypeptid exprimieren, aber nicht mit dem Kandidatenmodulator behandelt wurden, oder im Vergleich zu einer Probe von Zellen, die das ChemR23-Polypeptid (kontroll-transfizierte Zellen) nicht exprimieren, aber mit dem Kandidatenmodulator behandelt wurden.
  • Wenn der Assay bei Fehlen eines TIG2-Polypeptids ausgeführt wurde, kann der Assay verwendet werden, um einen Agonisten der ChemR23-Aktivität zu identifizieren. Wenn der Assay in Gegenwart eines TIG2-Polypeptids ausgeführt wird, kann er verwendet werden, um auf einen Antagonisten hin zu testen.
  • b. Adenylatzyklase-Assay:
  • Assays für die Adenylatzyklase-Aktivität sind von Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585-591, beschrieben. Dieser Assay ist eine Modifikation des Assays, der von Solomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58: 541-548, gelehrt wird. Kurz gesagt enthalten 100 μl-Reaktionen 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 20 mM Kreatinphosphat (Dinatriumsalz), 10 Einheiten (71 μg Protein) Kreatinphosphokinase, 1 mM α-32P-ATP (Tetranatriumsalz, 2 μCi), 0,5 mM zyklisches AMP, G-3H-markiertes zyklisches AMP (etwa 10.000 cpm), 0,5 mM Ro20-1724, 0,25% Ethanol und 50-200 μg Proteinhomogenat, das getestet werden soll (d.h. ein Homogenat von Zellen, die ein ChemR23-Polypeptid entweder exprimieren oder nicht exprimieren, die mit einem TIG2-Polypeptid entweder behandelt oder nicht behandelt worden sind und die entweder mit oder ohne einen Kandidatenmodulator vorliegen. Die Reaktionsgemische werden im Allgemeinen bei 37°C 6 Minuten lang inkubiert. Nach der Inkubation werden die Reaktionsgemische durch die Zugabe von 0,9 ml kalter 6%-iger Trichloressigsäure deproteinisiert. Die Reaktionsgefäße werden bei 1800 × g 20 Minuten zentrifugiert, und jede Überstandlösung wird auf eine Dowex AG50W-X4-Säule aufgetragen. Die cAMP-Fraktion wird mit 4 ml 0,1 mM Imidazol-HCl (pH 7,5) von der Säule in ein Zählgefäß eluiert. Die Assays sollten als Triplikate ausgeführt werden. Kontrollreaktionen sollten ebenfalls ausgeführt werden, wobei ein Proteinhomogenat von Zellen verwendet wird, die kein ChemR23-Polypeptid exprimieren.
  • Gemäß der Erfindung „ändert" sich die Adenylatzyklase-Aktivität, wenn sie in einer Probe, die von Zellen genommen wurde, die mit einem Kandidatenmodulator der ChemR23-Aktivität behandelt würden, um 10% oder mehr ansteigt oder absinkt, im Vergleich zu einer ähnlichen Probe von Zellen, die nicht mit dem Kandidatenmodulator behandelt wurden, oder im Vergleich mit einer Probe von Zellen, die kein ChemR23-Polypeptid exprimieren (kontroll-transfizierte Zellen), aber mit dem Kandidatenmodulator behandelt wurden.
  • c. cAMP-Assay
  • Intrazelluläres oder extrazelluläres cAMP wird unter Verwendung eines cAMP-Radioimmunassays (RIA) oder unter Verwendung eines cAMP-Bindungsproteins gemäß Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, gemessen. Beispielsweise beschreiben Horton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91-105 einen RIA für cAMP.
  • Eine Anzahl von Kits zur Messung von cAMP sind kommerziell erhältlich, beispielsweise der High Efficiency Fluorescence Polarization-based Homogeneous Assay, der von LJL Biosystems und NEN Life Science Products vermarktet wird. Kontrollreaktionen sollten ausgeführt werden, indem Extrakte von kontroll-transfizierten Zellen verwendet werden, um mögliche unspezifische Wirkungen einiger Kandidatenmodulatoren auszuschließen.
  • Das Niveau von cAMP ist „verändert", wenn das Niveau von cAMP, das in Zellen nachgewiesen wird, die ein ChemR23-Polypeptid exprimieren, und mit einem Kandidatenmodulator der ChemR23-Aktivität behandelt wurden (oder in Extrakten solcher Zellen), unter Verwendung des RIA-gestützten Assays von Horton & Baxendale, 1995, oben, um wenigstens 10% ansteigt oder absinkt, im Vergleich zu dem cAMP-Niveau in ähnlichen Zellen, die nicht mit dem Kandidatenmodulator behandelt wurden.
  • d. Phospholipid-Abbau, DAG-Produktion und Inositoltriphosphat-Konzentrationen
  • Rezeptoren, die den Abbau von Phospholipiden aktivieren, können aufgrund der Aktivität bekannter und vermuteter Modulatoren von ChemR23 auf Veränderungen hin überwacht werden, indem der Phospholipidabbau und die resultierende Produktion der sekundären Botenstoffe DAG und/oder Inositoltriphosphat (IP3) überwacht werden. Verfahren, um diese zu messen, sind in Phospholipid Signaling Protocols beschrieben, herausgegeben von Ian M. Bird. Totowa, NJ, Humana Press, 1998. Siehe auch Rudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 11824-11831, die ebenfalls einen Assay zum Phosphatidylinositol-Abbau beschreiben. Assays sollten ausgeführt werden, indem Zellen oder Extrakte von Zellen verwendet werden, die ChemR23 exprimieren, die mit einem TIG2-Polypeptid entweder behandelt oder nicht behandelt wurden und mit oder ohne einen Kandidatenmodulator. Kontrollreaktionen sollten ausgeführt werden, indem kontroll-transfizierte Zellen verwendet werden, oder Extrakte aus diesen, um mögliche unspezifische Wirkungen einiger Kandidatenmodulatoren auszuschließen.
  • Gemäß der Erfindung sind der Phosphatidylinositol-Abbau und die Diacylglycerin- und/oder Inositoltriphosphat-Konzentrationen „verändert", wenn sie in einer Probe von Zellen, die ein ChemR23-Polypeptid exprimieren und mit einem Kandidatenmodulator behandelt wurden, um wenigstens 10% ansteigen oder absinken, im Vergleich zu der Konzentration, die in einer Probe von Zellen beobachtet wird, die ein ChemR23-Polypeptid exprimieren und die nicht mit dem Kandidatenmodulator behandelt wurden.
  • e. PKC-Aktivierungs-Assays
  • Wachstumsfaktor-Rezeptortyrosinkinasen neigen dazu, ein Signal über einen Signalweg weiterzuleiten, der die Aktivierung von Proteinkinase C (PKC) mit einbezieht, die eine Familie von Phospholipid- und Kalzium-aktivierten Proteinkinasen darstellt. Eine PKC-Aktivierung resultiert schließlich in der Transkription einer Reihe proto-onkogener Transkriptionsfaktorkodierender Gene, einschließlich c-fos, c-myc und c-jun, Proteasen, Protease-Inhibitoren, einschließlich Kollagenase Typ I und Plasminogenaktivator-Inhibitor und Adhäsionsmolekülen, einschließlich dem intrazellulären Adhäsionsmolekül I (ICAM I). Um eine PKC-Aktivierung und damit eine Rezeptor-Aktivität zu überwachen, können Assays verwendet werden, die entworfen sind, um Anstiege in Genprodukten nachzuweisen, die durch PKC induziert werden. Darüber hinaus kann die Aktivität von Rezeptoren, die über PKC Signale weiterleiten, durch die Verwendung von Reportergenkonstrukten überwacht werden, die durch Kontrollsequenzen von Genen angetrieben werden, die durch eine PKC-Aktivierung aktiviert werden. Diese Art eines Reportergen-gestützten Assays wird im Folgenden detailliert diskutiert.
  • Für eine direktere Messung der PKC-Aktivität kann das Verfahren von Kikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 13341, verwendet werden. Dieser Assay misst die Phosphorylierung eines Substratpeptids der PKC, das anschließend durch Bindung an Phosphozellulosepapier abgetrennt wird. Dieses PKC-Assaysystem kann verwendet werden, um die Aktivität aufgereinigter Kinase zu messen oder die Aktivität in rohen Zellexetrakten. Eine Proteinkinase C-Probe kann in 20 mM HEPES/2 mM DTT kurz vor Gebrauch verdünnt werden.
  • Das Substrat in dem Assay ist das Peptid Ac-FKKSFKL-NH2 (SEQ ID NR:35), das von dem myristylierten Alanin-reichen Proteinkinase C Substratprotein (MARCKS) abgeleitet ist. Der Km-Wert des Enzyms für dieses Peptid beträgt etwa 50 μM. Andere basische, Proteinkinase C-selektive Peptide, die in der Fachwelt bekannt sind, können auch in einer Konzentration von wenigstens 2-3 mal ihrem Km-Wert verwendet werden. Co-Faktoren, die für den Assay benötigt werden, beinhalten Kalzium, Magnesium, ATP, Phosphatidylserin und Diacylglycerin. In Abhängigkeit von der Absicht des Verwenders, kann der Assay ausgeführt werden, um die Menge an vorhandenem PKC (aktivierende Bedingungen) oder die Menge an vorhandenem aktivem PKC (nicht-aktivierende Bedingungen) zu bestimmen. Für die meisten erfindungsgemäßen Zwecke werden nicht-aktivierende Bedingungen verwendet werden, so dass die PKC in der Probe aktiv ist, wenn sie isoliert und gemessen wird, und nicht die PKC gemessen wird, die aktiviert werden kann. Bei nicht-aktivierenden Bedingungen wird das Kalzium im Asssay zugunsten von EGTA weggelassen.
  • Der Assay wird in einem Gemisch mit 20 mM HEPES, pH 7,4, 1-2 mM DTT, 5 nM MgCl2, 100 μM ATP, ~1 μCi γ32P-ATP, 100 μg/ml Peptidsubstrat ~100 μM), 140 μM / 3,8 μM Phosphatidylserin/Diacylglycerin-Membranen und 100 μM Kalzium (oder 500 μM EGTA) ausgeführt. 48 μl der Probe, verdünnt in 20 mM HEPES, pH 7,4, 2 mM DTT wird in einem Endreaktionsvolumen von 80 μl verwendet. Die Reaktionen werden bei 30°C 5-10 Minuten lang ausgeführt, gefolgt von einer Zugabe von 25 μl 100 mM ATP, 100 mM EDTA, pH 8,0, das die Reaktionen beendet.
  • Nachdem die Reaktion beendet wurde, wird ein Teil (85 μl) jeder Reaktion auf einen Whatman P81 Zellulosephosphatfilter getropft, gefolgt von folgenden Waschschritten: viermal 500 ml in 0,4% Phosphorsäure, (5-10 Minuten pro Waschgang); und ein letzter Waschschritt in 500 ml 95% EtOH 2-5 Minuten lang. Die gebundene Radioaktivität wird durch Scintillationszählung gemessen. Spezifische Aktivität (cpm/nmol) des markierten ATP wird bestimmt, indem eine Probe der Reaktion auf P81-Papier getropft wird und ohne Waschschritte gezählt wird. Die Einheiten der PKC-Aktivität, definiert als nmol Phosphat transferiert pro min, werden wie folgt berechnet:
    Die Aktivität in EINHEITEN (nmol/min) ist:
    = (cpm auf Papier) × (105 μl gesamt/85 μl getropft)
    (Assayzeit, min.) (spezfische Aktivität von ATP cpm/nmol).
  • Ein alternativer Assay kann unter Verwendung eines Proteinkinase C Assaykits, der von PanVera verkauft wird (Cat. # P2747) ausgeführt werden.
  • Die Assays werden mit Extrakten aus Zellen ausgeführt, die ein ChemR23-Polypeptid exprimieren, mit einem TIG2-Polypeptid mit oder ohne einen Kandidatenmodulator behandelt oder nicht behandelt wurden. Kontrollreaktionen sollten ausgeführt werden, indem kontrolltransfizierte Zellen verwendet werden, oder Extrakte von solchen Zellen, um mögliche unspezifische Wirkungen einiger Kandidatenmodulatoren auszuschließen.
  • Gemäß der Erfindung ist die PKC-Aktivität durch einen Kandidatenmodulator „verändert", wenn die PKC-Einheiten, die durch einen oben beschriebenen Assay gemessen werden, in Extrakten von Zellen, die ChemR23 exprimieren und mit einem Kandidatenmodulator behandelt wurden, um wenigstens 10% ansteigen oder absinken, im Vergleich zu einer Reaktion, die mit einer ähnlichen Probe von Zellen ausgeführt wurde, die nicht mit einem Kandidatenmodulator behandelt wurden.
  • f. Kinase-Assays:
  • Die MAP-Kinase-Aktivität kann unter Verwendung jedes beliebigen von mehreren kommerziell erhältlichen Kits getestet werden, zum Beispiel den p38-MAP-Kinase-Assay-Kit, der von New England Biolabs verkauft wird (Cat. # 9820), oder die FlashPlateTM MAP-Kinase-Assays, die von Perkin-Elmer Life Sciences verkauft werden.
  • Die MAP-Kinase-Aktivität ist „verändert", wenn das Niveau der Aktivität in einer Probe von Zellen, die ein ChemR23-Polypeptid exprimieren, bei Behandlung mit einem Kandidatenmodulator um 10% oder mehr ansteigt oder absinkt, im Vergleich zur MAP-Kinase-Aktivität in einer Probe ähnlicher Zellen, die nicht mit dem Kandidatenmodulator behandelt wurden.
  • Direkte Assays auf Tyrosinkinase-Aktivität unter Verwendung bekannter synthetischer oder natürlicher Tyrosinkinasesubstrate und markierter Phosphate sind dem Fachmann wohl bekannt genauso wie ähnliche Assays für andere Typen von Kinasen (z.B. Ser/Thr-Kinasen). Kinase-Assays können sowohl mit aufgereinigten Kinasen als auch Rohextrakten ausgeführt werden, die von Zellen zubereitet werden, die ein ChemR23-Polypeptid exprimieren, die mit oder ohne ein TIG2-Polypeptid und mit oder ohne einen Kandidatenmodulator behandelt wurden. Kontrollreaktionen sollten unter Verwendung von kontroll-transfizierten Zellen oder Extrakten aus solchen Zellen ausgeführt werden, um mögliche unspezifische Wirkungen einiger Kandidatenmodulatoren auszuschließen. Substrate können entweder Volllängenproteine oder synthetische Peptide sein, die das Substrat darstellen. Pinna & Ruzzene (1996, Biochem. Biophys. Acta 1314: 191-225) listen eine Anzahl von Phosphorylierungssubstratstellen auf, die für die Messung von Kinase-Aktivitäten nützlich sind. Eine Anzahl von Kinase-Substratpeptiden ist kommerziell erhältlich. Eines, das besonders nützlich ist, ist das „Src-verwandte Peptid", RRLIEDAEYAARG (SEQ ID NR:11; erhältlich von Sigma # A7433), das ein Substrat für viele Rezeptor- und nicht-Rezeptortyrosinkinasen ist. Da der unten beschriebenen Assay die Bindung von Peptidsubstraten an Filter voraussetzt, sollten die Peptidsubstrate eine positive Nettoladung aufweisen, um die Bindung zu erleichtern. Im Allgemeinen sollten Peptidsubstrate wenigstens 2 basische Reste und einen freien Aminoterminus haben. In den Reaktionen wird im Allgemeinen eine Peptidkonzentration von 0,7-1,5 mM verwendet.
  • Die Assays werden im Allgemeinen in einem 25 μl-Volumen ausgeführt, das 5 μl eines 5X-Kinasepuffers (5 mg/ml BSA, 150 mM Tris-Cl (pH 7,5), 100 mM MgCl2; in Abhängigkeit von der exakten Kinase, auf die getestet wird, kann MnCl2 anstelle von oder zusätzlich zum MgCl2 verwendet werden), 5 μl 1,0 mM ATP (0,2 mM Endkonzentration), γ-32P-ATP (100-500 cpm/pmol), 3 μl des 10 mM Peptidsubstrats (1,2 mM Endkonzentration), ein Zellextrakt mit einer Kinase, auf die getestet werden soll (Zellextrakte, die für die Kinase-Assays verwendet werden, sollten einen Phosphataseinhibitor enthalten (z.B. 0,1-1 mM Natriumorthovanadat)), und H2O auf 25 μl umfasst. Die Reaktionen werden bei 30°C durchgeführt und werden unter Zugabe des Zellextrakts initiiert.
  • Die Kinase-Reaktionen werden 30 Sekunden bis etwa 30 Minuten lang ausgeführt, gefolgt von der Zugabe von 45 μl eiskalter 10%-iger Trichloressigsäure (TCA). Die Proben werden 2 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, und 35 μl des Überstands wird auf Whatman P81 Zellulosephosphatrundstücke getropft. Die Filter werden drei Mal mit 500 ml kalter 0,5%-iger Phosphorsäure gewaschen, gefolgt von einem Waschschritt mit 200 ml Azeton bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Die Filter werden getrocknet und inkorporiertes 32P wird durch Szintillationszählung gemessen. Die spezifische Aktivität von ATP in der Kinase-Reaktion (z.B. in cpm/pmol) wird nachgewiesen, indem eine kleine Probe (2-5 μl) der Reaktion auf ein P81-Filterrundstück getropft wird und direkt, ohne es zu waschen, gezählt wird. Die in der Kinase-Reaktion erhaltenen Zähler pro Minute (minus Leerwert) werden dann durch die spezifische Aktivität geteilt, um die Mole an transferiertem Phosphat in der Reaktion zu bestimmen.
  • Tyrosinkinase-Aktivität ist „verändert", wenn das Niveau der Aktivität in einer Probe von Zellen, die ein ChemR23-Polypeptid exprimieren, bei Behandlung mit einem Kandidatenmodulator um 10% oder mehr ansteigt oder absinkt, im Vergleich zur Kinase-Aktivität in einer Probe ähnlicher Zellen, die nicht mit dem Kandidatenmodulator behandelt wurden.
  • g. Transkriptionsreporter für die stromabwärts liegende Reaktionswegaktivierung
  • Das intrazelluläre Signal wird durch die Bindung eines Agonisten an einen Rezeptor, z.B. ChemR23, initiiert, und setzt eine Kaskade intrazellulärer Ereignisse in Bewegung, deren letzte Konsequenz eine schnelle und nachweisbare Änderung in der Transkription oder Translation eines oder mehrer Gene ist. Die Aktivität des Rezeptors kann daher überwacht werden, indem die Expression eines Reportergens, das durch Kontrollsequenzen angetrieben wird, die auf eine ChemR23-Aktivierung reagieren, gemessen wird.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Promotor" transkriptionelle Kontrollelemente, die für eine Rezeptor-vermittelte Regulation der Genexpression notwendig sind, was nicht nur den Basalpromotor, sondern auch alle Enhancer oder Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen beinhaltet, die für eine Rezeptor-regulierte Expression notwendig sind. Der transkriptionsgestützte Reporterassay stellt eine schnelle Anzeige bereit, ob ein gegebener Rezeptor aktiviert ist, indem Promotoren ausgewählt werden, die auf die intrazellulären Signale reagieren, die aus einer Agonistenbindung resultieren, und indem die ausgewählten Promotoren operativ mit Reportergenen verknüpft werden, deren Transkription, Translation oder letztendliche Aktivität leicht nachweisbar und messbar sind.
  • Reportergene, wie Luciferase, CAT, GFP, β-Laktamase oder β-Galaktosidase sind dem Fachmann wohl bekannt, genauso wie die Assays für den Nachweis ihrer Produkte.
  • Gene, die besonders gut für die Überwachung der Rezeptoraktivität sind, sind die „immediate early"-Gene, die schnell, im Allgemeinen innerhalb von Minuten nach dem Kontakt des Rezeptors und des Effektor-Proteins oder -Ligands, induziert werden. Die Induktion der „immediate early"-Gentranskription bedarf keiner Synthese neuer regulatorischer Proteine. Zusätzlich zu einer schnellen Reaktivität auf eine Ligandenbindung, beinhalten Charakteristika bevorzugter Gene, die für die Herstellung von Reporterkonstrukten nützlich sind: niedrige oder nicht-nachweisbare Expression in ruhenden Zellen; eine Induktion, die transient und unabhängig ist von neuer Proteinsynthese; eine anschließende Abschaltung der Transkription benötigt eine neue Proteinsynthese; und mRNAs, die von diesen Genen transkribiert werden, besitzen eine kurze Halbwertszeit. Es ist bevorzugt, aber nicht notwendig, dass ein transkriptionelles Kontrollelement all diese Eigenschaften aufweisen muss, damit es nützlich ist.
  • Ein Beispiel eines Gens, das gegenüber einer Anzahl von unterschiedlichen Stimuli reaktiv ist, ist das c-fos-Proto-Onkogen. Das c-fos-Gen wird in einer von einer Proteinsynthese unabhängigen Art und Weise durch Wachstumsfaktoren, Hormone, differenzierungsspezifische Agenzien, Stress und andere bekannte Induktoren von Zelloberflächenproteinen aktiviert. Induktion der c-fos-Expression ist extrem schnell und tritt häufig innerhalb von Minuten nach Rezeptorstimulation ein. Dieses Charakteristikum macht die regulatorischen Regionen von c-fos besonders attraktiv für die Verwendung als ein Reporter der Rezeptoraktivierung.
  • Die c-fos regulatorischen Elemente beinhalten (siehe Verma et al., 1987, Cell 51: 513-514): eine TATA-Box, die für die Transkriptionsinitiierung benötigt wird; zwei stromaufwärts gelegene Elemente für die basale Transkription, und einen Enhancer, der ein Element mit Dyad-Symmetrie beinhaltet, und der für die Induktion durch TPA, Serum, EGF und PMA benötigt wird.
  • Das 20 bp-lange transkriptionelle Enhancer-Element von c-fos, das zwischen -317 und -298 bp stromaufwärts von der mRNA-Cap-Stelle von c-fos gelegen ist, ist für die Seruminduktion in Serum-ausgehungerten NIH 3T3-Zellen essenziell. Eines der zwei stromaufwärts gelegenen Elemente ist bei -63 bis -57 gelegen und ähnelt der Konsensussequenz für die cAMP-Regulation.
  • Der Transkriptionsfaktor CREB (zyklisches AMP reaktives Elementbindungsprotein) ist, wie der Name nahe legt, reaktiv auf die Konzentrationen intrazellulären cAMPs. Daher kann die Aktivierung eines Rezeptors, der sein Signal durch die Modulation von cAMP-Konzentrationen weitergibt, überwacht werden, indem entweder die Bindung des Transkriptionsfaktors oder die Expression eines Reportergens, das an ein CREB-Bindungselement (CRE oder cAMP-reaktives Element genannt) verknüpft ist, gemessen werden. Die DNA-Sequenz des CRE ist TGACGTCA (SEQ ID NR:12). Reporterkonstrukte, die gegenüber der CREB-Bindungsaktivität reaktiv sind, sind in US Patent Nr. 5,919,649 beschrieben.
  • Andere Promotoren und transkriptionelle Kontrollelemente, zusätzlich zu den c-fos-Elementen und CREB-reaktiven Konstrukten, beinhalten den Promotor des vasoaktiven Intestinalpeptidgens (VIP) (cAMP-reaktiv; Fink et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6662-6666); den Promotor des Somatostatingens (cAMP-reaktiv; Montminy et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 8.3: 6682-6686); den Promotor des Proenkephalin (reaktiv gegenüber cAMP; nikotinische Agonisten und Phorbolester; Comb et al., 1986, Nature 323: 353-356); den Promotor des Phosphoenolpyruvat-Carboxykinasegens (PEPCK) (cAMP-reaktiv; Short et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:9721-9726).
  • Zusätzliche Beispiele für transkriptionelle Kontrollelemente, die auf Änderungen der GPCR-Aktivität reaktiv sind, beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf solche Elemente, die gegenüber dem AP-1 Transkriptionsfaktor reaktiv sind und solche Elemente, die gegenüber einer NF-κB-Aktivität reaktiv sind. Die Konsensus AP-1-Bindungsstelle ist das Palindrom TGA(C/G)TCA (Lee et al., 1987, Nature 325:368-372; Lee et al., 1987 Cell49: 741-752). Die AP-1-Stelle ist auch dafür verantwortlich, die Induktion durch Tumorpromotoren, wie den Phorbolester 12-0-Tetradecanoylphorbol-β-Acetat (TPA) zu vermitteln, und wird daher manchmal auch als ein TRE für TPA-reaktives Element bezeichnet. AP-1 aktiviert zahlreiche Gene, die in der frühen Reaktion von Zellen auf Wachstumsstimulatoren beteiligt sind. Beispiele für AP-1-reaktive Gene beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf die Gene für Fos und Jun (welche selbst eine AP-1-Aktivität hervorrufen), die Fos-verwandten Antigene (Fra) 1 und 2, IκBα, Ornithindecarboxylase und die Annexine I und II.
  • Das NF-κB-Bindeelement besitzt die Konsensussequenz GGGGACTTTCC (SEQ ID NR:36). Eine große Anzahl von Genen wurde als NF-κB-reaktiv identifiziert, und ihre Kontrollelemente können mit einem Reportergen verknüpft werden, um GPCR-Aktivität zu überwachen. Ein kleines Beispiel für Gene, die gegenüber NF-κB-reaktiv sind, beinhalten diejenigen, die IL-1β (Hiscott et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13:6231-6240), TNF-α (Shakhov et al., 1990, J. Exp. Med. 171:35-47), CCRS (Liu et al., 1998 AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 1509-1519), P-Selektin (Pan & McEver, 1995, J. Biol. Chem. 270: 23077-23083), Fas-Ligand (Matsui et al., 1998, J. Immunol. 161: 3469-3473), GM-CSF (Schreck & Baeuerle, 1990, Mol. Cell. Biol. 10: 1281-1286) und IκBα (Haskill et al., 1991, Cell 65: 1281-1289) kodieren. Dem Fachmann sind auch Vektoren, die NF-κB-reaktive Reporter kodieren, bekannt, oder sie können vom Fachmann leicht hergestellt werden, indem man, z.B., synthetische NF-κB-Elemente und einen Minimalpromotor verwendet, oder indem man die NF-κB-reaktiven Sequenzen eines Gens verwendet, von dem man weiß dass es einer NF-κB-Regulation untersteht. Ferner sind NF-κB-reaktive Reporterkonstrukte kommerziell erhältlich von, z.B., CLONTECH.
  • Ein gegebenes Promotorkonstrukt sollte getestet werden, indem ChemR23-exprimierende Zellen, die mit dem Konstrukt transfiziert sind, einem TIG2-Polypeptid ausgesetzt werden. Ein wenigstens zweifacher Anstieg der Expression des Reporters in Reaktion auf das TIG2-Polypeptid zeigt an, dass der Reporter ein Indikator der ChemR23-Aktivität ist.
  • Um die ChemR23-Aktivität mit einem TIG2-reaktiven transkriptionellen Reporterkonstrukt zu testen, werden Zellen, die ein ChemR23-Polypeptid stabil exprimieren, stabil mit dem Reporterkonstrukt transfiziert. Um auf Agonisten zu durchmustern, werden die Zellen unbehandelt belassen, Kandidatenmodulatoren ausgesetzt oder einem TIG2-Polypeptid ausgesetzt, und die Expression des Reporters wird gemessen. Die TIG2-behandelten Kulturen dienen als ein Standard für das Niveau der Transkription, die durch einen bekannten Agonisten induziert wird. Ein Anstieg von wenigstens 50% in der Reporterexpression in Gegenwart eines Kandidatenmodulators zeigt an, dass der Kandidat ein Modulator der ChemR23-Aktivität ist. Ein Agonist wird mindestens eine gleich starke, und vorzugsweise dieselbe Menge oder mehr, Reporterexpression hervorrufen wie das TIG2-Polypeptid. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um auf inverse Agonisten zu durchmustern, wo Zellen ein ChemR23-Polypeptid in Konzentrationen exprimieren, so dass eine erhöhte basale Aktivität des Reporters bei Fehlen von TIG2 oder eines anderen Agonisten auftritt. Ein Abfall an Reporteraktität um 10% oder mehr in Gegenwart eines Kandidatenmodulators, im Vergleich zu seinem Fehlen, zeigt an, dass die Verbindung ein inverser Agonist ist.
  • Um nach Antagonisten zu durchmustern, werden Zellen, die ChemR23 exprmieren und das Reporterkonstrukt tragen, in Anwesenheit oder bei Fehlen eines Kandidatenmodulators einem TIG2-Polypeptid ausgesetzt (oder einem anderen Agonisten). Ein Abfall der Reporterexpression um 10% oder mehr in Gegenwart eines Kandidatenmodulators, im Vergleich zu dem Fall, dass der Kandidatenmodulator fehlt, zeigt an, dass der Kandidat ein Modulator der ChemR23-Aktivität ist.
  • Kontrollen für Transkriptionsassays beinhalten Zellen, die kein ChemR23 exprimieren, aber das Reporterkonstrukt tragen, sowie Zellen mit einem promotorlosen Reporterkonstrukt. Verbindungen, die als Modulatoren einer ChemR23-regulierten Transkription identifiziert wurden, sollten auch analysiert werden, um zu bestimmen, ob sie die von anderen regulatorischen Sequenzen oder anderen Rezeptoren angetriebene Transkription beeinflussen, um die Spezifität und das Spektrum ihrer Aktivität zu bestimmen.
  • Der transkriptionelle Reporterassay und die meisten zellbasierten Assays, sind gut geeignet, um Expressionsbibliotheken auf Proteine zu durchmustern, die ChemR23-Aktivität modulieren. Die Bibliotheken können z. B. cDNA-Bibliotheken natürlichen Ursprungs, z.B. von Pflanzen, Tieren, Bakterien, etc. sein, oder sie können Bibliotheken sein, die zufällig oder systematisch mutierte Varianten eines oder mehrerer Polypeptide exprimieren. Genomische Bibliotheken in viralen Vektoren können ebenfalls verwendet werden, um in den verschiedenen Bibliotheken, die für die Durchmusterung von ChemR23 verwendet werden, den mRNA-Gehalt einer Zelle oder eines Gewebes zu exprimieren.
  • Jeder der Assays auf Rezeptor-Aktivität, einschließlich des GTP-Bindungs-, GTPase-, Adenylatzyklase-, cAMP-, Phospholipid-Abbau-, Diacylglycerin-, Inositoltriphosphat-, PKC-, Kinase- und Transkriptionsreporter-Assays, können verwendet werden, um die Gegenwart eines Agens in einer Probe, z.B. einer Gewebeprobe, zu bestimmen, das die Aktivität des ChemR23-Rezeptormoleküls beeinflusst. Um dies zu tun, wird ein ChemR23-Polypeptid auf Aktivität in Gegenwart und bei Fehlen der Probe oder eines Extrakts der Probe getestet. Ein Anstieg der ChemR23-Aktivität in Gegenwart der Probe oder des Extrakts im Vergleich zum Fehlen der Probe zeigt an, dass die Probe einen Agonisten der Rezeptoraktivität beinhaltet. Ein Absinken der Rezeptoraktivität in Gegenwart von TIG2 oder eines anderen Agonisten und der Probe, im Vergleich zur Rezeptoraktivität in Gegenwart des TIG2-Polypeptids allein, zeigt an, dass die Probe einen Antagonisten der ChemR23-Aktivität enthält. Wenn erwünscht, können die Proben anschließend fraktioniert werden und weiter getestet werden, um den Agonisten oder Antagonisten zu isolieren oder aufzureinigen. Die Menge des Anstiegs oder des Absinkens der gemessenen Aktivität, die nötig ist, damit man sagen kann, dass eine Probe einen Modulator enthält, hängt von der Art des verwendeten Assays ab. Im Allgemeinen zeigt eine 10%-ige oder größere Änderung (Anstieg oder Absinken), im Vergleich zu einem Assay, der ohne Probe durchgeführt wird, die Gegenwart eines Modulators in der Probe an. Eine Ausnahme ist der Transkriptionsreporter-Assay, in dem wenigstens ein zweifaches Ansteigen oder eine 10%-ige Abnahme des Signals notwendig ist, damit man sagen kann, dass die Probe einen Modulator enthält. Es wird vorgezogen, dass ein Agonist wenigstens 50%, und vorzugsweise 75% oder 100% oder mehr, z.B. 2-fach, 5-fach, 10-fach oder eine größere Rezeptoraktivierung stimuliert als Wildtyp-TIG2.
  • Andere funktionale Assays beinhalten z.B. Mikrophysiometer- oder Biosensor-Assays (siehe Hafner, 2000, Biosens. Bioelectron. 15:149-158).
  • II. Diagnostische Assays die auf der Wechselwirkung zwischen ChemR23 und TIG2 beruhen:
  • Die Signalweiterleitung durch GPCRs ist in der Pathologie einer großen Anzahl von Krankheiten und Störungen beteiligt. ChemR23, das in Zellen mit Lymphozytenabstammung exprimiert wird und von dem gezeigt wurde, dass es als ein Co-Rezeptor für Immundefizienzviren wirkt, kann eine Rolle in Immunvorgängen, Störungen oder Krankheiten besitzen. Das ChemR23-Expressionsmuster beinhaltet auch Knochen und Knorpel, was anzeigt, dass dieser Rezeptor eine Rolle bei Krankheiten, Störungen oder Vorgängen (z.B. Bruchheilung) spielt, die diese Gewebe beeinflussen. Die Expression in der Nebenschilddrüse der Erwachsenen legt eine mögliche Bedeutung im Kalziumphosphat-Stoffwechsel nahe.
  • Wegen seiner Expression in Zellen lymphozytischer Abstammung kann ChemR23 in die Reaktion auf virale Infektionen des Körpers oder in Krankheiten, die durch verschiedene Viren induziert werden, einschließlich HIV-Typen I und II oder Bakterien, involviert sein. Das Expressionsmuster von ChemR23 und das Wissen in Bezug auf Krankheiten, die üblicherweise durch GPCRs vermittelt werden, legen nahe, dass ChemR23 an der Störung von Zellmigration, Krebs, Tumorentwicklung und Tumormetastasis, inflammatorischen und neoplastischen Prozessen, Wund- und Knochenheilung und Dysfunktion regulatorischer Wachstumsfunktionen, Diabetes, Fettsucht, Anorexie, Bulimie, akutes Herzversagen, niedrigem Blutdruck, Bluthochdruck, Harnverhaltung, Osteoporose, Angina pectoris, Myokardinfarkt, Restenose, Atherosklerose, Krankheiten, die durch eine exzessive Proliferation glatter Muskelzellen charakterisiert sind, Aneurismen, Krankheiten, die durch einen Verlust an glatten Muskelzellen oder reduzierter Proliferation glatter Muskelzellen charakterisiert sind, Schlaganfall, Ischämie, Geschwüren, Allergien, gutartiger Prostatahypertrophie, Migräne, Erbrechen, psychotischen und neurologischen Krankheiten, einschließlich Angstzuständen, Schizophrenie, manische Depression, Depression, Delirium, Demenz und ernster mentaler Retardation, degenerativen Krankheiten, neurodegenerativen Krankheiten, wie die Alzheimer-Krankheit oder Parkinson, und Dyskinese, wie Chorea Huntington oder das Gilles de 1a Tourette-Syndrom und anderen verwandten Krankheiten beteiligt ist.
  • Die Wechselwirkung von ChemR23 mit TIG2 kann als eine Grundlage für Assays zur Diagnose oder Überwachung von Krankheiten, Störungen oder Prozessen, die eine ChemR23-Signalweiterleitung umfassen, verwendet werden. Diagnostische Assays für ChemR23-verwandte Krankheiten oder Störungen können mehrere verschiedene Formen haben. Zunächst können diagnostische Assays die Menge von ChemR23 und/oder TIG2-Polypeptid, Genen oder mRNA in einer Gewebeprobe messen. Assays, die die Menge von mRNA messen, die eines oder beide dieser Polypeptide kodieren, gehören ebenso in diese Kategorie. Zweitens können Assays die Qualitäten des Rezeptors oder des Liganden evaluieren. Beispielsweise können Assays, die bestimmen, ob ein Individuum eine mutante oder variante Form von entweder ChemR23 oder TIG2 oder beide exprimiert, diagnostisch verwendet werden. Drittens können Assays, die eine oder mehrere Aktivitäten des ChemR23-Polypeptids messen, diagnostisch verwendet werden.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krankheit oder Störung eine ChemR23-verwandte Krankheit oder eine ChemR23-verwandte Störung ist, die ausgewählt ist aus Krebs, Tumormetastasen, Entzündungskrankheiten, Autoimmunkrankheiten, geerbten oder erworbenen Immunschwächen, Osteoporose, Knochenheilung, Knochengewebstransplantaten, Transplantatabstoßung, Psoriasis, Ekzemen, entzündlichen Infektionen und trophischen Erkrankungen der Haut, viralen, bakteriellen und parasitären Infektionen, weiblicher Unfruchtbarkeit und Tumoren von Eierstock und Uterus. Alternativ betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krankheit oder Störung eine TIG2-verwandte Krankheit oder eine TIG2-verwandte Störung ist, die ausgewählt ist aus Osteoporose, Knochenheilung, Knockengewebstransplantaten, Transplantatabstoßung, Psoriasis, Ekzemen, entzündlichen Infektionen und trophischen Erkrankungen der Haut, viralen, bakteriellen und parasitären Infektionen, weiblicher Unfruchtbarkeit und Tumoren von Eierstock und Uterus.
  • Gemäß dem vorliegenden Verfahren kann das TIG2-Polypeptid ein Polypeptid mit wenigstens 31% Identität oder höherer Identität, wie 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% oder sogar 100% zu dem Polypeptid sein, das durch SEQ ID NR:8 dargestellt wird, und wobei das Polypeptid spezifisch an ein ChemR23-Polypeptid mit der Sequenz von SEQ ID NR:2 bindet und dessen Signal-Aktivität aktiviert. Alternativ kann das TIG2-Polypeptid ein Fragment des Volllängenpolypeptids von SEQ ID NR:8 sein, wobei das Fragment wenigstens 50% der Bindungsaktivität und des Niveaus der Signalaktivierung des Volllängenpolypeptids von SEQ ID NR:8 aufweist. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das TIG2-Polypeptid eine oder mehrere Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen im Vergleich zur SEQ ID NR:8 umfassen. Das TIG2-Polypeptid kann ein gestutztes TIG2-Polypeptid sein, wie es von SEQ ID NR:48 dargestellt wird oder wie es durch eine der Sequenzen SEQ ID NR:50 bis 60 dargestellt wird; das TIG2-Polypeptid kann zusätzliche Sequenzen umfassen, die ein TIG2-Fusionsprotein ausbilden, wobei die zusätzlichen Sequenzen ausgewählt werden können aus Glutathion-S-Transferase (GST), dem Maltose-bindenden Protein, alkalischer Phosphatase, Thioredoxin, dem grün fluoreszierenden Protein (GFP), Histidin-Tags (z.B. 6X oder mehr His) oder Epitop-Tag-(z.B. Myc-Tag, FLAG-Tag)-Sequenzen.
  • A. Assays, die die Menge von ChemR23 oder TIG2 messen
  • Die ChemR23- und TIG2-Konzentrationen können gemessen und mit Standards verglichen werden, um zu bestimmen, ob in der Probe eine anormale Konzentration des Rezeptors oder seines Liganden vorliegt, was beides eines wahrscheinliche Dysregulation der ChemR23-Signalweiterleitung anzeigt. Polypeptid-Konzentrationen werden beispielsweise durch Immunohistochemie unter Verwendung von Antikörpern gemessen, die für das Polypeptid spezifisch sind. Eine Probe, die von einem Individuum isoliert wurde, von dem angenommen wird, dass es an einer Krankheit oder Störung leidet, die durch eine ChemR23-Aktivität gekennzeichnet ist, wird mit einem Antikörper für ChemR23 oder TIG2 kontaktiert, und die Bindung des Antikörpers wird, wie dies im Stand der Technik bekannt ist, gemessen (z.B. durch Messung der Aktivität eines Enzyms, das an einen sekundären Antikörper konjugiert ist).
  • Ein anderer Ansatz für die Messung der ChemR23- und/oder TIG2-Polypeptidkonzentrationen verwendet eine durchflusszytometrische Analyse von Zellen eines betroffenen Gewebes. Verfahren der Flusszytometrie, einschließlich der fluoreszenten Markierung von Antikörpern, die für ChemR23 oder TIG2 spezifisch sind, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Andere Ansätze beinhalten Radioimmunassays oder ELISA. Verfahren für jeden dieser Ansätze sind im Stand der Technik ebenfalls wohlbekannt.
  • Die nachgewiesene Menge an Bindung wird mit der Bindung in einer Probe mit ähnlichem Gewebe von einem gesunden Individuum oder einer Probe von einem betroffenen Individuum, die nicht so betroffen ist, verglichen. Ein Anstieg von 10% oder mehr im Vergleich zum Standard zeigt eine Krankheit oder Störung an, die durch eine ChemR23-Dysregulation gekennzeichnet ist.
  • Die ChemR23- und TIG-2-Expression kann auch durch die Bestimmung der Menge der mRNA gemessen werden, die eines oder beide Polypeptide in einer Gewebeprobe kodieren. mRNA kann mittels quantitativer oder semi-quantitativer PCR quantifiziert werden. Verfahren einer „quantitativen" Amplifikation sind dem Fachmann wohlbekannt, und Primersequenzen für die Amplifikation von sowohl ChemR23 als auch TIG2 sind hierin offenbart. Ein übliches Verfahren für quantitative PCR beinhaltet die gleichzeitige Co-Amplifizierung einer bekannten Menge einer Kontrollsequenz unter Verwendung derselben Primer. Dies stellt einen internen Standard bereit, der verwendet werden kann, um die PCR-Reaktion zu kalibrieren. Detaillierte Protokolle für eine quantitative PCR werden in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y., (1990), bereitgestellt. Ein Ansteig von 10% oder mehr in der Menge von mRNA, die ChemR23 oder TIG2 kodieren, in einer Probe, im Vergleich zu der Menge, die in einer Gewebeprobe exprimiert wird, die von einem ähnlichen Gewebe aus einem gesunden Individuum stammt oder in einer Gewebeprobe, die von einem unbetroffenen Bereich in einem betroffenen Individuum stammt, zeigt eine Krankheit oder Störung an; die durch die Dysregulation der ChemR23-Signalweiterleitung gekennzeichnet ist.
  • B. Qualitative Assays
  • Assays, die aufzeigen, ob das ChemR23-Polypeptid oder die es kodierende mRNA wildtypisch ist oder nicht, können für diagnostische Verfahren verwendet werden. Um eine Krankheit oder Störung, die durch eine ChemR23- oder TIG2-Dysregulation gekennzeichnet ist, auf diese Weise zu diagnostizieren, wird aus einer Probe isolierte RNA als eine Matrize für eine PCR-Amplifikation von TIG2 und/oder ChemR23 verwendet. Die amplifizierten Sequenzen werden anschließend unter Verwendung von Standardverfahren entweder direkt sequenziert oder zuerst in einen Vektor kloniert, gefolgt durch eine Sequenzierung. Ein Unterschied in der Sequenz, der eine oder mehrere kodierte Aminosäuren im Vergleich zu der Sequenz des wildtypischen ChemR23 oder TIG2 verändert, kann auf eine Krankheit oder Störung hinweisen, die durch die Dysregulation der ChemR23-Signalleitung gekennzeichnet ist. Es kann nützlich sein, im Fall, dass eine Veränderung in der kodierenden Sequenz in einer Probe identifiziert würde, den varianten Rezeptor oder Liganden zu exprimieren und seine Aktivität zu der vom wildtypischen ChemR23 oder TIG2 zu vergleichen. Neben anderen Vorteilen kann dieser Ansatz neue Mutanten bereitstellen, einschließlich konstitutiv aktive und Nullmutanten.
  • Zusätzlich zu den Standardsequenzierverfahren können amplifizierte Sequenzen auf das Vorliegen spezifischer Mutationen getestet werden, indem z.B. Hybridisierung von molekularen Sonden verwendet wird, die zwischen wildtypischen und varianten Sequenzen unterscheiden. Hybridisierungsassays, die auf der Basis von Änderungen, die so klein wie ein Nukleotidaustausch sind, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Alternativ kann eine beliebige Anzahl von „Minisequenzierungs"-Assays ausgeführt werden, einschließlich derer, die beispielsweise in den U.S. Patenten 5,888,819, 6,004,744 und 6,013,431 beschrieben sind. Diese Assays und andere, die im Stand der Technik bekannt sind, können in einer gegebenen Probe das Vorliegen einer Nukleinsäure mit einem bekannten Polymorphismus bestimmen.
  • Wenn erwünscht, können Array- oder Mikroarray-gestützte Verfahren verwendet werden, um die Expression oder das Vorliegen einer Mutation in ChemR23 oder TIG2-Sequenzen zu analysieren. Array-gestützte Verfahren zur Minisequenzierung und für die Quantifizierung einer Nukleinsäureexpression sind im Stand der Technik wohlbekannt.
  • C. Funktionalitäts-Assays
  • Die Diagnose einer Krankheit oder Störung, die durch Dysregulation der ChemR23-Signalweiterleitung gekennzeichnet ist, kann auch unter Verwendung von Funktionalitäts-Assays ausgeführt werden. Um dies zu tun, werden Zellmembranen oder Zellextrakte aus einer Gewebeprobe zubereitet und in einem Assay auf ChemR23-Aktivität, wie er hierin beschrieben ist, verwendet (z.B. Ligandenbindungsassays, der GTP-Bindungsassay, GTPase-Assay, Adenylatzyklase-Assay, cAMP-Assay, Phospholipid-Abbau, Diacylglycerin- oder Inositoltriphosphat-Assays, PKC-Aktivierungsassays oder Kinaseassays). Die nachgewiesene Aktivität wird mit der einer Standardprobe verglichen, die von einem gesunden Individuum entnommen wurde oder von einer nicht betroffenen Stelle des betroffenen Individuums. Als eine Alternative kann eine Probe oder ein Extrakt einer Probe mit Zellen in Kontakt gebracht werden, die ChemR23 exprimieren, gefolgt von einer Messung der ChemR23-Signalaktivität im Vergleich zu einer Standardprobe. Ein Unterschied von 10% oder mehr in der Aktivität, die in einem dieser Assays gemessen wird, im Vergleich zu der Aktivität des Standards, ist für eine Krankheit oder Störung kennzeichnend, die durch eine Dysregulation der ChemR23-Signalweiterleitung gekennzeichnet ist.
  • Modulation der ChemR23-Aktivität in einer Zelle gemäß der Erfindung
  • Die Entdeckung von TIG2 als ein Ligand von ChemR23 stellt Verfahren bereit, die Aktivität eines ChemR23-Polypeptids in einer Zelle zu modulieren. Die ChemR23-Aktivität in einer Zelle wird moduliert, indem der Zelle ein Agens zugeführt wird, das die Funktion eines ChemR23-Polypeptids moduliert. Diese Modulation kann in kultivierten Zellen als Teil eines Assays auf die Identifizierung zusätzlicher modulierender Agenzien ausgeführt werden, oder beispielsweise in einem Tier, einschließlich des Menschen. Agenzien beinhalten TIG2-Polypeptide, wie sie hierin definiert sind, sowie zusätzliche Modulatoren, die unter Verwendung der Durchmusterungsverfahren, wie sie hierin beschrieben werden, identifiziert werden.
  • Einer Zelle kann ein Agens zugeführt werden, indem es dem Kulturmedium zugefügt wird. Die Menge, die zugeführt werden muss, wird mit der Identität des Agens variieren und mit dem Zweck, zu dem es zugeführt wird. Beispielsweise wird man in einem Kulturassay, um Antagonisten der ChemR23-Aktivität zu identifizieren, vorzugsweise eine Menge von TIG2-Polypeptid hinzufügen, die die Rezeptoren halb-maximal aktiviert (z.B. etwa der EC50-Wert), vorzugsweise ohne die Dosis zu überschreiten, die für eine Rezeptorsättigung benötigt wird. Diese Dosis kann bestimmt werden, indem die Menge an TIG2-Polypeptid titriert wird, um den Punkt zu bestimmen, an dem eine weitere Hinzugabe von TIG2 keinen zusätzlichen Effekt auf die ChemR23-Aktivität besitzt.
  • Wenn ein Modulator der ChemR23-Aktivität einem Tier für die Behandlung einer Krankheit oder Störung verabreicht wird, kann die verabreichte Menge vom Durchschnittsfachmann auf Basis des erwünschten Resultats angepasst werden. Eine erfolgreiche Behandlung wird erreicht, wenn ein oder mehrere messbare Aspekte) der Pathologie (z.B. Tumorzellwachstum, Akkumulierung inflammatorischer Zellen) um wenigstens 10% im Vergleich zu dem Wert verändert wird werden, wie er/sie hinsichtlich dieses Aspekts vor der Behandlung war/waren.
  • Erfindungsgemäße nützliche Kandidatenmodulatoren
  • Kandidatenmodulatoren können aus großen Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen durchmustert werden. Zahlreiche Mittel werden zurzeit für die zufällige oder zielgerichtete Synthese von Saccharid-, Peptid-, Lipid-, Kohlenhydrat- und Nukleinsäure- basierten Verbindungen verwendet. Bibliotheken synthetischer Verbindungen sind von einer Anzahl von Unternehmen kommerziell erhältlich, einschließlich, beispielsweise Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) und Microsource (New Milford, CT). Eine seltene chemische Bibliothek ist von Aldrich (Milwaukee, WI) erhältlich. Kombinatorische Bibliotheken kleiner organischer Moleküle sind erhältlich und können zubereitet werden. Alternativ sind Bibliotheken natürlicher Verbindungen in Form bakterieller, pilzlicher, pflanzlicher und tierischer Extrakte von z.B. Pan Laboratories (Bothell, WA) oder MycoSearch (NC) erhältlich, oder sind leicht mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren herzustellen. Darüber hinaus werden natürliche und synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen leicht durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel modifiziert.
  • Wie hierin vorher bereits angegeben, können Kandidatenmodulatoren auch Varianten bekannter Polypeptide (z.B. TIG2, Antikörper) oder Nukleinsäuren (z.B. Aptamere), die in einer Nukleinsäurebank kodiert sind, sein. Zellen, z.B. Bakterien-, Hefe-, oder höhere eukaryotische Zellen), die mit der Bibliothek transformiert sind, können kultiviert und als Extrakte zubereitet werden, die anschließend für ChemR23-Bindungsassays oder Funktionalitäts-Assays der ChemR23-Aktivität herangezogen werden.
  • Antikörper, die gemäß der Erfindung nützlich sind
  • Die Erfindung stellt Antikörper gegen ChemR23 und TIG2 bereit. Die Antikörper können unter Verwendung von Standardprotokollen, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden (siehe beispielsweise Antibodies: A Laboratory Manual, herausg. von Harlow und Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Ein Säugetier, wie eine Maus, ein Hamster oder ein Kaninchen, kann mit einer immunogenen Form des Peptids (z.B. ein ChemR23- oder TIG2-Polypeptid oder ein antigenes Fragment, das in der Lage ist, eine Antikörperreaktion hervorzurufen, oder ein Fusionsprotein, wie es hierin oben beschrieben ist) immunisiert werden. Immunogene, um Antikörper hervorzurufen, werden hergestellt, indem die Polypeptide (z.B. isolierte rekombinante Polypeptide oder synthetische Polypeptide) mit Adjuvantien gemischt werden. Alternativ werden ChemR23- oder TIG2-Polypeptide oder -Peptide als Fusionsproteine mit größeren immunogenen Proteinen hergestellt. Polypeptide können auch mit anderen größeren immunogenen Proteinen, wie dem Napfschnecken-Hämocyanin kovalent verbunden werden. Alternativ können Plasmid- oder virale Vektoren, die ChemR23 oder TIG2, oder ein Fragment dieser Proteine, kodieren, verwendet werden, um die Polypeptide zu exprimieren und einer Immunreaktion in einem Tier, wie dies in Costagliola et al., 2000, J. Clin. Invest. 105:803-811, beschrieben ist, zu erzeugen. Um Antikörper zu erzeugen, werden Immunogene üblicherweise intradermal, subkutan oder intramuskulär an Versuchstiere, wie Kaninchen, Schafe und Mäuse, verabreicht. Zusätzlich zu den oben diskutierten Antikörpern können gentechnisch hergestellte Antikörperderivate hergestellt werden, beispielsweise Einzelkettenantikörper.
  • Das Fortschreiten der Immunisierung kann mittels Nachweis der Antikörpertiter in Plasma oder Serum überwacht werden. Es können auch Standard-ELISA-, Flusszytometrie- oder andere Immunoassays mit dem Immunogen als Antigen verwendet werden, um die Konzentrationen der Antikörper zu bestimmen. Antikörperzubereitungen können einfach Serum eines immunisierten Tieres sein oder, wenn dies erwünscht ist, es können polyklonale Antikörper aus dem Serum durch beispielsweise Affinitätschromatographie unter Verwendung des immobilisierten Immunogens isoliert werden.
  • Um monoklonale Antikörper herzustellen, können Antikörper-produzierende Milzzellen aus einem immunisierten Tier geerntet werden und mittels standardisierter somatischer Zellfusionsverfahren mit immortalisierenden Zellen, wie Myelomazellen, fusioniert werden, um Hybridomzellen zu gewinnen. Solche Techniken sind im Stand der Technik wohlbekannt und beinhalten beispielsweise die Hybridomtechnologie (ursprünglich von Köhler und Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497 entwickelt), die humane B-Zellhybridomtechnologie (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4:72) und die EBV-Hybridomtechnologie, um humane monoklonale Antikörper herzustellen (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96). Hybridomzellen können immunochemisch auf die Produktion von Antikörpern durchmustert werden, die spezifisch mit einem TIG2- oder ChemR23-Peptid oder -Polypeptid reagieren, und monoklonale Antikörper aus dem Medium einer Kultur isoliert werden, die solche Hybridomzellen umfasst.
  • Nützliche Kits gemäß der Erfindung
  • Die Erfindung stellt Kits bereit, die für die Durchmusterung nach Modulatoren der ChemR23-Aktivität nützlich sind. Nützliche erfindungsgemäße Kits können ein isoliertes ChemR23-Polypeptid (einschließlich eines Membran- oder Zell-assoziierten ChemR23-Polypeptids, z.B. auf isolierten Membranen, Zellen, die ChemR23 exprimieren, oder auf einem SPR-Chip) und ein isoliertes TIG2-Polypeptid beinhalten. Ein Kit kann auch einen Antikörper gegen TIG2 umfassen. Alternativ, oder zusätzlich, kann ein Kit Zellen enthalten, die transformiert sind, und dadurch ein erfindungsgemäßes ChemR23-Polypeptid exprimieren, und/oder Zellen, die transformiert sind und dadurch ein erfindungsgemäßes TIG2-Polypeptid exprimieren. In einer weiteren Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes Kit ein Polynukleotid enthalten, das ein ChemR23-Polypeptid kodiert, und/oder ein Polynukleotid, das ein erfindungsgemäßes TIG2-Polypeptid kodiert. Alle erfindungsgemäßen Kits werden die genannten Teile oder Kombinationen der Teile sowie Verpackungsmaterialien dafür umfassen. Kits werden auch Gebrauchsanweisungen beinhalten.
  • Gemäß dem vorliegenden Kit kann das TIG2-Polypeptid ein Polypeptid mit wenigstens 31% Identität oder höherer Identität, wie 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% oder sogar 100% zu dem durch SEQ ID NR:48 dargestellten Polypeptid sein; und wobei dieses Polypeptid spezifisch an ein ChemR23-Polypeptid mit der Sequenz von SEQ ID NR:2 bindet und dessen Signalaktivität aktiviert. Alternativ kann das TIG2-Polypeptid ein Fragment des Volllängenpolypeptids von SEQ ID NR:48 sein, wobei das Fragment wenigstens 50% der Bindungsaktivität und des Niveaus der Signalaktivierung des Volllängenpolypeptids nach SEQ ID NR:8 zurückbehält. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das TIG2-Polypeptid eine oder mehrere Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen im Vergleich zur SEQ ID NR:48 umfassen. Das TIG2-Polypeptid kann ein gestutztes TIG2-Polypeptid sein, wie es durch SEQ ID NR:48 oder durch eine der SEQ ID NR:50 bis 60 dargestellt ist; das TIG2-Polypeptid kann zusätzliche Sequenzen umfassen, die ein TIG2-Fusionsprotein bilden, wobei die zusätzlichen Sequenzen ausgewählt werden können aus Glutathion-S-Transferase (GST), dem Maltose-bindenden Protein, alkalischer Phosphatase, Thioredoxin, dem grün fluoreszierenden Protein (GFP), Histidin-Tags (z.B. 6X oder mehr His) oder Epitop-Tag- (z.B. Myc-Tag, FLAG-Tag)-Sequenzen.
  • BEISPIELE
  • In den folgenden Beispielen wurden alle Chemikalien von Sigma erworben, wenn dies nicht angegeben ist. Die Zellkulturmedien sind von Gibco BRL und die Peptide sind von Bachem.
  • Beispiel 1: Klonierung des humanen ChemR23-Rezeptors
  • Das humane ChemR23 wurde wie in Samson et al. (1998) beschrieben kloniert (SEQ ID NRn: 1 und 2). Als beispielhafte Verfahrensschritte, die man verwenden könnte, um andere ChemR23-Polypeptide, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, zu klonieren, ist das Verfahren im Folgenden beschrieben. Um die ChemR23-Sequenz zu klonieren, wurde ein klassisches Klonierungsverfahren mit humaner genomischer DNA ausgeführt. Ein Klon, HOP102 genannt, wurde aus humaner genomischer DNA unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden amplifiziert. HOP102 teilte 45-50% Identität mit fMLP- und C5a-Rezeptoren und etwas geringere Ähnlichkeiten mit der Familie der Chemokinrezeptoren. Dieser partielle Klon wurde als eine Sonde verwendet, um eine humane genomische Bank zu durchmustern, und drei überlappende lambda-Klone wurden isoliert. Es wurde eine Restriktionskarte der Klone aufgestellt und ein 1,7 kb XbaI-Fragment wurde in pBS-SK(+) (Stratagene) subkloniert und beide Stränge wurden sequenziert. Von der Sequenz wurde gefunden, dass sie die HOP 102-Sonde vollständig beinhaltet, mit 100% Identität. Dieses neue Gen wurde ChemR23 genannt (GenBank Zugangsnr.: Y14838).
  • Die Amplifikation der kodierenden Sequenz von ChemR23 ergab ein Fragment von 1,1 kb Länge. Dieses Fragment wurde in den pCDNA3 (Invitrogen)-Vektor subkloniert und beide Stränge wurden sequenziert.
  • Beispiel 2: Aufreinigung des natürlichen Liganden von ChemR23 und Identifizierung von TIG2
  • Es wurde etwa ein Liter humane aszitische Flüssigkeit einer Patientin mit Eierstockkrebs vorgefiltert und anschließend schrittweise durch 0,45 und 0,22 μm Millex-Filter (Millipore) gefiltert.
  • In Schritt 1 wurde die Aszites direkt auf eine C18-Reversphasen-Säule (10 mm × 100 mm POROS 20 R2-Kügelchen, Applied Biosystems), die mit 5% CH3CN/0,1% TFA prä-equilibriert wurde, bei einer Flussrate von 20 ml/min bei Raumtemperatur geladen. Ein 5-95% Gradient von CH3CN in 0,1% TFA wurde anschließend mit einer Neigung von 6%/min angewendet. Es wurden 5-Milliliter-Fraktionen gesammelt, und 20 μl jeder Fraktion wurden beiseite gestellt und auf [Ca2+]-Übergänge in ChemR23-exprimierenden CHO-Zellen getestet.
  • In Schritt 2 wurden die aktiven Fraktionen (etwa 10 Fraktionen, die zwischen 25 und 40% CH3CN eluierten) gepoolt, auf pH 5 eingestellt, durch einen 20 μm Millex-Filter (Millipore) filtriert, 3-fach in Acetatpuffer bei pH 4,8 verdünnt und anschließend auf eine Kationenaustauscher-HPLC-Säule (Polycat 9,6 mm × 250 mm, Vydac), die mit Acetatpuffer bei pH 4,8 und 4°C prä-equilibriert wurde, aufgetragen. Ein 0-1 M-Gradient von NaCl in Acetatpuffer bei pH 4,8 wurde mit 10%/min bei einer Flussrate von 4 ml/min angewendet. Es wurden 1-Milliliter-Fraktionen gesammelt, und ein 25 μl-Aliquot jeder Fraktion wurde für den [Ca2+]-Assay verwendet, nachdem es auf einer 10 kDa-Ausschlussmembran (Ultrafree, Millipore) entsalzt wurde.
  • In Schritt 3 wurden die aktiven Fraktionen (die mit etwa 700 mM NaCl eluiert wurden) gepoolt und auf einer 10 kDa-Ausschluss-Ultrafree-Membran auf etwa 10 mM NaCl entsalzt. Die Eluate verschiedener Kationenaustauscher-HPLC-Läufe wurden gepoolt und auf eine zweite Kationenaustauscher-HPLC-Säule (Polycat 2,1 mm × 250 mm, Vydac) geladen, die mit Acetatpuffer bei pH 4,8 und 4°C prä-equilibriert wurde. Es wurde ein 0-1 M-Gradient von NaCl in Acetatpuffer bei pH 4,8 bei einer Flussrate von 1 ml/min mit einer Neigung von 2%/min angewendet. Es wurden 0,5-Milliliter-Fraktionen gesammelt und ein 20 μl-Aliquot jeder Fraktion für einen intrazellulären Kalzium-Assay verwendet, nachdem es auf einer 10 kDa-Ausschluss-Ultrafree-Membran entsalzt wurde.
  • In Schritt 4 wurden die aktiven Fraktionen gepoolt, 8-fach mit H2O/0,1% H3PO4 verdünnt und auf eine analytische C18-Reversphasen-Säule (4,6 mm × 250 mm, Vydac), die mit 5% CH3CN/0,1% H3PO4 prä-equilibriert wurde, bei einer Flussrate von 1 ml/min bei Raumtemperatur geladen. Es wurde ein 5-95%-Gradient von CH3CN in 0,1% H3PO4 mit einem 0,3%/min-Gradienten zwischen 25 und 40% CH3CN angewendet. Individuelle UV-Absorptionspeaks (214 nm) wurden manuell gesammelt, und etwa 5% jedes Fraktionsvolumens wurde auf biologische Aktivität getestet.
  • In Schritt 5 wurden die aktiven Peaks (etwa 28% CH3CN) 6-fach mit H2O/0,1% TFA verdünnt und direkt auf eine zweite C18-Reversphasen-Säule (1 mm × 50 mm, Vydac), die mit 5% CH3CN/0,1% TFA prä-equilibriert wurde, bei einer Flussrate von 0,1 ml/min bei Raumtemperatur geladen. Es wurde ein 5-95%-Gradient von CH3CN in 0,1% TFA mit einem 0,3%/min-Gradienten zwischen 30 und 45% CH3CN angewendet. Der Endpeak wurde manuell bei 40% CH3CN gesammelt und mittels Massenspektrometrie analysiert. 800 ml Eierstockkrebs-Aszites-Flüssigkeit ergaben 50 fmole TIG2.
  • Die aktive Fraktion wurde vollständig in einer Speed-Vac getrocknet und in 10 μl 0,1M Tris bei pH 8,7 resuspendiert. Nachdem die Probe 15 min lang bei 95°C gekocht wurde, wurde die Probe bei 37°C über Nacht in Gegenwart von 250 ng modifiziertem Trypsin (Promega) inkubiert. Die verdaute Probe wurde anschließend mittels einer Festphasenextraktion auf C18-ZipTip (Millipore) aufgereinigt. Die eluierte Probe (1,5 μl in 70% CH3CN/0,1% TFA) wurde in Gegenwart von 120 mg/ml Dihydroxybenzoesäure-Matrix in ein MALDI-Gerät gegeben und anschließend auf einem MALDI-Q-TOF-Prototyp (Micromass) analysiert. Ein direkter monoisotoper Massen-Fingerprint erlaubte die Identifizierung von 7 tryptischen Peptiden, d.h. 63 Aminosäuren mit einer Sequenz-Wiederherstellung von 38,7%.
  • Tabelle 1: Sequenzen der Peptide, die durch monoisotope Massen-Fingerprints gefunden wurden
  • Die zwei mit einem Sternchen markierten Peptide wurden mittels MS/MS-Fragmentierung mikrosequenziert. Die Position der Peptide ist definiert im Vergleich mit der TIG2-Aminosäuresequenz (SEQ ID NR:5)
    Figure 00570001
  • Beispiel 3: Klonierung und rekombinante Expression von humanem TIG2
  • Um die TIG2-Sequenz (6, GenBank Zugangs-Nr. Q99969) zu klonieren, wurde eine Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit Nieren-cDNA (Clontech Laboratories) ausgeführt. Primer wurden, basierend auf der humanen TIG2-Sequenz, synthetisiert und waren die Folgenden:
    hTig2 fw: 5' CAGGAATTCAGCATGCGACGGCTGCTGA 3' SEQ ID NR:20
    hTig2 rv: 5' GCTCTAGATTAGCTGCGGGGCAGGGCCTT 3' SEQ ID NR:21
  • Die Amplifikation wurde mit Qiagen-Taq-Polymerase unter Bedingungen, wie sie vom Hersteller beschrieben sind, und mit den folgenden Zyklen ausgeführt: 3 min bei 94°C, 35 Zyklen von 1 min bei 94°C, 90 sec bei 58°C und 90 sec bei 72°C, gefolgt von einer Endinkubation von 10 min bei 72°C. Die Amplifikation ergab ein Fragment von 500 bp Länge, das die gesamte kodierende Sequenz des TIG2-Gens enthielt. Dieses Fragment wurde in den Vektor pCDNA3 (Invitrogen) für eine DNA-Sequenzierungsanalyse subkloniert.
  • Eine Maxiprep (Qiagen)-DNA wurde in transienten Transfektionen von HEK293-Zellen verwendet, die das T-Antigen (293T) exprimieren, und COS-7-Zellen, unter Verwendung von Fugene6 in 10 cm-Platten. Parallel wurden Transfektionen des Expressionsvektors alleine (kontroll-transfiziert) in diesebnen Zelllinien ausgeführt. 24 h nach der Transfektion wurde das Medium durch 9 ml DMEM-F12, 1% BSA ersetzt, und 3 ml des Überstands wurden drei Tage lang alle 24 h gesammelt (48, 72 und 96 h nach der Transfektion). CHO-Zellen wurden mit demselben Plasmid transfiziert, und die transfizierten Zellen wurden mit G418 selektiert. Die Aktivität des konditionierten Mediums wurde mit ChemR23-exprimierenden Zellen unter Verwendung des Aequorin-Assays verifiziert.
  • Beispiel 4: Rekombinante Expression von TIG2 in Hefen
  • Die kodierenden Sequenzen von TIG2 des Menschen und der Maus werden durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert (es werden zwei verschiedene Primer für die Amplifikation des 5'-Endes des humanen TIG2 verwendet, um den unterschiedlichen Voraussagen des Signalpeptids dieses Proteins gerecht zu werden):
    Figure 00580001
  • Die amplifizierten TIG2-Sequenzen werden kloniert, sequenziert und in pPIC9K eingefügt, ein Multicopy-Pichia-Expressionsplasmid (Invitrogen), das die Signale enthält, die die Sekretion der exprimierten Proteine gewährleisten. Nach der Transformation werden Pichia pastoris-Zellen unter Verwendung des G418-Antibiotikums selektioniert. Nach der Selektion werden 20 Klone auf ihre Expression hin analysiert, und der Klon mit der höchsten Expression wird für eine Expression im großen Maßstab in Schüttelkolben amplifiziert. Das Medium wird gesammelt, zentrifugiert und für eine partielle Aufreinigung nach einem Protokoll verwendet, das von demjenigen abgeleitet ist, das für die anfängliche TIG2-Aufreinigung verwendet wurde (siehe oben).
  • Beispiel 5: Rekombinante Expression von chimärem TIG2, das mit sekretierter alkalischer Phosphatase (SEAP) fusioniert ist
  • Die kodierenden Sequenzen des TIG2 der Maus und des Menschen werden mittels PCR amplifiziert, kloniert und sequenziert. Die PCR- und Sequenzierungsprimer sind wie folgt:
    Figure 00590001
  • Die klonierten TIG2-Sequenzen werden anschließend in den bicistronischen Expressionsvektor, pEFIN, für Säugetiere subkloniert, um ein Fusionsprotein zu erhalten, an dem TIG2 an seinem carboxyterminalen Ende an die sekretierte alkalische Phosphatase geknüpft ist, markiert mit sechs Histidinresten (His6). Säugetierzellen, einschließlich COS-7, HEK-293, die das große T-Antigen (293T) exprimieren, und CHO-K1-Zellen werden mit diesem Plasmid unter Verwendung von Fugene 6TM transfiziert und 3-4 Tage lang in komplettem Ham's-F12-Medium (Nutrient Mixture Ham's F12 (Life Technologies)) inkubiert, das 10% fötales Kälberserum, 100 IU/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Fungizon (Amphotericin B) enthält. Der TIG2-SEAP-His6-haltige Überstand wird nach Zentrifugation gesammelt, filtriert (0,45 μm) und bei 4°C gelagert, nachdem 20 mM Hepes (pH 7,4) und 0,02% Natriumazid hinzugefügt wurden.
  • Für eine Ein-Schritt-Affinitätsaufreinigung des TIG2-Fusionsproteins wird der Überstand auf 1 ml Hisbond-Harz (Qiagen) aufgetragen. Nach dem Waschen wird gebundenes TIG2-SEAP-His6 mit einem Imidazolgradienten eluiert. Die Konzentration des isolierten TIG2-SEAP-His6 wird mittels eines Sandwich-Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assays bestimmt. Kurz gesagt werden Mikrotiterplatten mit Anti-Plazenta-alkalische Phosphatase-Antikörpern beschichtet. Nach einer Blockierung mit 1 mg/ml bovinem Serumalbumin (BSA) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung werden die Proben titriert und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen werden die Platten mit biotinylierten Kaninchen-anti-plazentale alkalische Phosphatase-Antikörpern, die 1:500 verdünnt sind, für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, nochmals gewaschen und mit Peroxidase-konjugiertem Streptavidin für 30 min inkubiert. Nach dem Waschen wird gebundene Peroxidase mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin umgesetzt. Die Reaktion wird durch die Hinzugabe von 1 N H2SO4 beendet, und die Absorption bei 450 nm wird gemessen. Die alkalische Phosphatase-Aktivität wird durch einen Chemilumineszenz-Assay unter Verwendung des Great EscapeTM-Nachweiskits (Clontech) bestimmt. Aufgereinigte plazentale alkalische Phosphatase wird verwendet, um eine Standardkurve zu erzeugen. Die enzymatische Aktivität wird als relative Lichteinheiten/sec ausgedrückt.
  • Beispiel 6: Funktionalitäts-Assay für ChemR23
  • ChemR23-exprimierende Klone wurden durch Transformation von CHO-K1-Zellen, so dass sie mitochondriales Apoaequorin und Gα16 co-exprimieren, mittels limitierender Verdünnung und Auswahl durch Northern Blots erhalten. Positive Klone wurden zur Durchmusterung humaner Eierstockkrebs-Aszites-Extrakte, die wie oben dargestellt zubereitet wurden, verwendet. Ein Funktionalitäts-Assay, der auf der Lumineszenz mitochondrialen Aequorins nach intrazellulärer Ca2+-Freisetzung beruht (Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115-126) wurde wie beschrieben ausgeführt (Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192, 1501-1508). Kurz gesagt wurden Zellen von Platten in PBS mit 5 mM EDTA gesammelt, pelletiert und in einer Dichte von 5 × 106 Zellen/ml in DMEM-F12-Medium resuspendiert. Zellen wurden mit 5 μM Coelenterazin H (Molecular Probes) 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden anschließend in DMEM-F12-Medium gewaschen und in einer Dichte von 0,5 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend mit Test-Agonist-Peptiden oder Platten mit Gewebeextrakten gemischt, und die Lichtemission wurde 30 sec lang unter Verwendung eines Microlumat-Luminometers (Perkin Elmer) aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind als relative Lichteinheiten (RLE) dargestellt.
  • Beispiel 7: Aktivierung von Zellen, die ChemR23 exprimieren, durch rekombinantes TIG2
  • Das konditionierte Medium von COS-7-, CHO-K1- und 293T-Zellen, die mit einem TIG2-Expressionsvektorsystem für Säugetiere (pCDNA-TIG2) oder pcDNA3 alleine transfiziert wurden, wurde gesammelt und für Aequorin-Assays mit CHO-Zellen, die ChemR23 exprimieren, verwendet. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Steigende Mengen von konditioniertem Überstand resultierten in einem Anstieg an Lumineszenz in den Zellen mit Aequorin-System, die ChemR23 exprimieren.
  • Beispiel 8: Herstellung von Antikörpern, die für ChemR23 spezifisch sind
  • Antikörper, die gegen ChemR23 gerichtet sind, wurden durch wiederholte Injektionen von Plasmiden, die ChemR23 kodieren, in Mäuse hergestellt. Die Seren wurden, beginnend nach der zweiten Injektion, gesammelt und der Antikörperfiter und die Antikörperspezifität wurden mittels Durchflusszytofluorometrie mit CHO-K1-Zellen bestimmt, die mit der ChemR23-cDNA transfiziert wurden, und CHO-K1-Zellen, die mit der cDNA einer unverwandten GPCR-cDNA transfiziert wurden. Mehrere Seren waren positiv und wurden für immunohistochemische und andere verwandte Anwendungen verwendet, einschließlich der Durchflusszytometrie-Analyse humaner primärer Zellen.
  • Monoklonale Antikörper wurden von immunisierten Mäusen durch Standard-Hybridomtechnologie unter Verwendung der NSO-Myeloma-Zelllinie der Maus als immortaler Partner erhalten. Überstände wurden auf Anti-ChemR23-Antikörper-Aktivität getestet, indem der Test verwendet wurde, der für die Bewertung der Antiseren verwendet wurde. Zellen der positiven Löcher wurden expandiert und eingefroren, und die Überstände wurden gesammelt.
  • 13 zeigt die Ergebnisse von Exprimenten, um die Antikörper, die gegen ChemR23 herangezogen wurden, zu charakterisieren. Ein Gemisch rekombinanter Zellen aus 2/3 rekombinanten ChemR23-CHO-Zellen und 1/3 kontroll-transfizierten CHO-Zellen (Negativkontrolle) wurde mit entweder einem Überstand von Zellen, die den Anti-ChemR23-5C1H2-monoklonalen Antikörper (dicke Linie) exprimieren, oder einem Überstand von Zellen mit keiner bekannten Antikörperaktivität (dünne Linie, grau ausgefüllt) umgesetzt. Nach Färbung mit FITC-markiertem Anti-Maus-Ig wurden diese Zubereitungen mittels Durchflusszytofluorometrie analysiert. Die Ergebnisse sind als ein Histogramm der Anzahl der Zellen (Ereignisachse) dargestellt, die eine gegebene Fluoreszenz exprimieren (FL1-H-Achse). Monoklonaler 5C1H2 erlaubte die Unterscheidung der ChemR23-rekombinanten Zell-Subpopulation von den Zellen der Negativkontrolle, wie es sich durch die relativen Proportionen beider Zelltypen zeigt. Die Hintergrundfluoreszenz des Assays wird durch die zweite Färbung (graue Füllung) angegeben.
  • Beispiel 9: Bindungs-Austauch-Assay
  • Für Austauschexperimente werden ChemR23-CHO-K1-Zellen (25.000 Zellen/Reaktionsgefäß) 90 min bei 27°C mit 1 nM SEAP-HIS6 oder TIG2-SEAP-HIS6 in Gegenwart steigender Konzentrationen von unmarkiertem TIG2 in 250 μl Bindungspuffer (50 mM Hepes pH 7,4; 1 mM CaCl2; 0,5% bovines Serumalbumin (BSA) fettsäurefrei; 5 mM MgCl2) inkubiert. Für Sättigungsexperimente werden ChemR23-CHO-K1-Zellen (25.000 Zellen/Reaktionsgefäß) 90 min lang bei 27°C mit steigenden Konzentrationen von TIG2-SEAP-HIS6 in Gegenwart oder bei Fehlen von 1 μM unmarkiertem TIG2 inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen 5 Mal gewaschen und in 50 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1% Triton-X100 lysiert. Die Proben werden 10 min lang auf 65°C aufgeheizt, um zelluläre Phosphatasen zu inaktivieren. Die Lysate werden durch Zentrifugation gesammelt, und die Aktivität der alkalischen Phosphatase in 25 μl des Lysats wird mit dem oben beschriebenen Chemilumineszenz-Assay bestimmt.
  • Beispiel 10: Gewebeverteilung von TIG2 und ChemR23
  • Es wurde eine semi-quantitative RT-PCR unter Verwendung von genspezifischen Primern für hTIG2 und ChemR23 auf polyA+-RNA und Gesamt-RNA von verschiedenen humanen Geweben (CLONTECH und Ambion) ausgeführt. Kurz gesagt wurde Gesamt-RNA aus Blutzellen mittels des Rneasy-Minikits (Qiagen) zubereitet. Die hTIG2-Primer waren vorwärts (5'-GCAGACAAGCTGCCGGA-3'; SEQ ID NR:37), die TagMan-Sonde (5'-AACCCGAGTGCAAAGTCAGGCCC-3'; SEQ ID NR:38) und rückwärts (5'-AGTTTGATGCAGGCCAGGC-3'; SEQ ID NR:39). Die hChemR23-Primer waren vorwärts (5'-GTCCCAGAACCACCGCAG-3'; SEQ ID NR:40), TagMan-Sonde (5'-TTCGCCTGGCTTACATGGCCTGC-3'; SEQ ID NR:41) und rückwärts (5'-AAGAAAGCCAGGACCCAGATG-3'; SEQ ID NR:42). Primer, die für das Haushaltsgen GAPDH entworfen wurden, vorwärts (5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'; SEQ ID NR:43), TaqMan-Sonde (5'-AGCTCTCCCGCCGGCCTCTG-3'; SEQ ID NR:44) und rückwärts (5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3; SEQ ID NR:45), wurden verwendet, um Referenz-mRNA-Profile herzustellen. Die Verteilung von hTIG2 und ChemR23 in verschiedenen Geweben ist in den 15 bzw. 16 gezeigt. Das Expressionsniveau von hTIG2 oder ChemR23 ist als Verhältnis von hTIG2 oder ChemR23 zu der GAPDH-Referenz mRNA-Expression ausgedrückt.
  • Beispiel 11: Identifizierung eines gestutzten humanen TIG2-Polypeptids als Ligand für ChemR23
  • Das gestutzte humane TIG2-Polypeptid wurde aus humaner tumoraler Aszites-Flüssigkeit von einer Patientin mit Eierstockkrebs isoliert. Das für diese Isolierung verwendete Verfahren ist in Beispiel 2 der vorliegenden Patentanmeldung offenbart, außer der Tatsache, dass nach der Peptid-Sequenzierung ein Polypeptid, wie es in SEQ ID NR:48 dargestellt ist, aufgedeckt wurde.
  • Die dieses gestutzte Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz wurde gemäß einem Verfahren, wie es in Beispiel 3 offenbart ist, isoliert. Die rekombinante Expression des gestutzten TIG2 in Hefe- und Säugetierzellen wurde ausgeführt, wie es in den Beispielen 4 und 5 offenbart ist.
  • Ein Funktionalitäts-Assay zeigte, dass beide TIG2-Polypeptide, wie sie in SEQ ID NR:8 und SEQ ID NR:48 dargestellt sind, Liganden für ChemR23 sind. Das für diesen Assay ausgeführte Verfahren ist ein solches, wie es in Beispiel 6 offenbart ist.
  • 14 zeigt die Konzentrations-Reaktions-Kurve für das gestutzte hTIG2-Peptid (SEQ ID NR:48) auf ChemR23, das in CHO-Zellen exprimiert wurde. Der Assay wurde wie im vorhergehenden Absatz beschrieben ausgeführt. Wie es in der Abbildung gezeigt ist, aktiviert das gestutzte hTIG2-Molekül ChemR23 mit einem EC50-Wert von 4,27 nM. Die Ergebnisse sind als relative Lichteinheiten (RLE) ausgedrückt. Ähnliche Aktivierungsstudien, Bindungs-Austausch-Assays und Antikörper-Herstellung wurden für das gestutzte TIG2-Peptid ausgeführt, wie sie für das Vollängen-TIG2-Polypeptid ausgeführt wurden und in den Beispielen 7, 8 und 9 offenbart sind.
  • Die Gewebeverteilung des gestutzten TIG2-Polypeptids wurde untersucht, um zu bestimmen, ob sie von der Verteilung des Volllängen-TIG2-Polypeptids verschieden ist. Dies kann eine spezifische Funktion dieser gestutzten Form in Hinblick auf die Volllängenform aufdecken.

Claims (28)

  1. Verfahren zur Identifizierung eines Agens, das ChemR23 bindet, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) ein ChemR23 Polypeptid mit einem gestutzten TIG2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO:48, oder mit einem TIG-2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, in Gegenwart oder Abwesenheit eines zu testenden Bindemittels unter Bedingungen in Berührung zu bringen, die das Binden des gestutzten TIG2-Polypeptids oder des TIG2-Polypeptids an das ChemR23 Polypeptid ermöglichen, und (b) die Bindung des ChemR23 Polypeptids an das gestutzte TIG2-Polypeptid oder das TIG2-Polypeptid zu messen, wobei eine Abnahme in der Bindung in Gegenwart des zu testenden Bindemittels relativ zur Bindung in Abwesenheit des zu testenden Bindemittels das zu testende Bindemittel als ein Agens identifiziert, das ChemR23 bindet.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Agens in einer Probe vorliegt.
  3. Verfahren zur Identifizierung eines Agens, das die Signalaktivität von ChemR23 herabsetzt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) ein ChemR23 Polypeptid mit einem gestutzten TIG2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO:48, oder mit einem TIG-2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, in Gegenwart oder Abwesenheit des Agens in Berührung zu bringen, (b) eine Signalaktivität des ChemR23 Polypeptids zu messen, und (c) die Menge an Aktivität, die in einer Reaktion gemessen wurde, die das ChemR23 Polypeptid und das gestutzte TIG2-Polypeptid oder das TIG2-Polypeptid ohne das Agens enthält, mit der Menge der Aktivität zu vergleichen, die in einer Reaktion gemessen wurde, die das ChemR23 Polypeptid, das gestutzte TIG2-Polypeptid oder das TIG2-Polypeptid und das Agens enthält, wobei eine Abnahme in der Aktivität in Gegenwart des Agens relativ zur Aktivität in Abwesenheit des Agens das Agens als ein Antagonist für das ChemR23 Polypeptid identifiziert.
  4. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Agens in einer Probe vorliegt.
  5. Verfahren zur Identifizierung eines Agens, das die Signalgabe von ChemR23 erhöht, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) ein ChemR23 Polypeptid mit einem Agens in Berührung zu bringen, (b) eine Signalaktivität des ChemR23 Polypeptids in Gegenwart des Agens zu messen, und (c) die in Gegenwart des zu testenden Modulator-Agens gemessene Aktivität mit der Aktivität zu vergleichen, die in einer Reaktion gemessen wurde, in der das ChemR23 Polypeptid mit einem gestutzten TIG2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO:48, oder mit einem TIG2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, wobei das Agens als Agonist, der die Signalgabe des ChemR23 Polypeptids verstärkt, identifiziert wird, wenn die Menge der Aktivität, die in Gegenwart des Agens gemessen wird, wenigstens 10% der Menge beträgt, die durch das gestutzte TIG2-Polypeptid oder das TIG2-Polypeptid induziert wird.
  6. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Agens in einer Probe vorliegt.
  7. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das gestutzte TIG2-Polypeptid oder das TIG2-Polypeptid nachweisbar markiert ist.
  8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei das gestutzte TIG2-Polypeptid oder das TIG2-Polypeptid nachweisbar markiert ist mit einer Einheit, die ausgewählt ist aus einem Radioisotop, einem Fluorophor, einem Fluoreszenz-Quenscher, einem Enzym, einem Affinitätskennzeichen (Tag) und einem Epitop-Kennzeichen (Tag).
  9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Schritt des in Berührung Bringens in oder auf einer Zelle durchgeführt wird, die das ChemR23 Polypeptid exprimiert.
  10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Schritt des in Berührung Bringens in oder auf synthetischen Liposomen durchgeführt wird.
  11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Schritt des in Berührung Bringens in oder auf Virus induzierten knospenden (budding) Membranen, die ein ChemR23 Polypeptid enthalten, durchgeführt wird.
  12. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 11, wobei das Verfahren unter Verwendung einer Membranfraktion von Zellen durchgeführt wird, die das ChemR23 Polypeptid exprimieren.
  13. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Schritt des Messens unter Verwendung eines Verfahrens durchgeführt wird, das ausgewählt ist aus Markierungsverdrängung (label displacement) Oberflächenplasmon-Resonanz (surface plasmon resonance), Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (fluorescence resonance energy transfer), Fluoreszenz-Quenchen und Fluoreszenz-Polarisierung.
  14. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Agens ausgewählt ist aus Peptiden, Polypeptiden, Antikörpern oder Antigen bindenden Fragmenten von diesen, Lipiden, Kohlehydraten, Nukleinsäuren und kleinen organischen Molekülen.
  15. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6 und 9 bis 14, wobei der Schritt, die Signalaktivität des ChemR23 Polypeptids zu messen, den Schritt umfasst, eine Veränderung in der Konzentration eines sekundären Boten (second messenger) zu detektieren.
  16. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6 und 9 bis 14, wobei der Schritt, die Signalaktivität zu messen, eine der folgenden Messungen umfasst: Bindung oder Austausch von Guanin-Nukleotiden, Aktivität von Adenylat-Cyclase, cAMP, Aktivität von Protein-Kinase C, Abbau von Phosphatidylinositol, Diacylglycerin, Inositoltriphosphat, intrazellulärem Kalzium, Arachidonsäure, Aktivität von MAP-Kinase, Aktivität von Tyrosin-Kinase oder Expression eines Reportergens.
  17. Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Schritt, die Signalaktivität zu messen, die Verwendung eines Assays auf Aequorin-Basis umfasst.
  18. Kit für die Durchmusterung auf Agentien, die die Bindungs- oder Signal-Aktivität von ChemR23 modulieren, für die Diagnose einer Krankheit oder Störung, die durch eine Fehlregulierung der ChemR23-Signalgabe gekennzeichnet ist, wobei dieses Kit ein isoliertes ChemR23 Polypeptid, ein isoliertes gestutztes TIG2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO:48, oder ein TIG2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, und Verpackungsmaterialien dafür umfasst.
  19. Kit für die Durchmusterung auf Agentien, die die Bindungs- oder Signal-Aktivität von ChemR23 modulieren, für die Diagnose einer Krankheit oder Störung, die durch eine Fehlregulierung der ChemR23-Signalgabe gekennzeichnet ist, wobei dieses Kit ein isoliertes Polynukleotid, das das ChemR23 Polypeptid kodiert, ein isoliertes Polynukleotid, das ein gestutztes TIG2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO:48, oder ein TIG2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, kodiert, und Verpackungsmaterialien dafür, umfasst.
  20. In vitro-Verfahren zur Modulation der Aktivität eines ChemR23 Polypeptids in einer Zelle, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, der Zelle ein gestutztes TIG2-Polypeptid dargestellt durch SEQ ID NO:48, ein TIG2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, TIG2-Antikörper oder TIG2 kodierende Nukleotide zuzuführen, so dass die Aktivität von ChemR23 moduliert wird.
  21. Das Verfahren nach Anspruch 20, wobei das für TIG2 kodierende Nukleotid ein Aptamer ist.
  22. Verwendung eines gestutzten TIG2-Polypeptids, dargestellt durch SEQ ID NO:48, oder eines TIG2-Polypeptids, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, für die Herstellung eines Kits zum Durchmustern von Agentien auf ihre Fähigkeit, die Signalgabe von ChemR23 zu modulieren, oder für die Herstellung eines Kits für die Diagnose von Krebs, Tumormetastasen, Entzündungserkrankungen, geerbten oder erworbenen Immunschwächen, Osteoporose, Knochenheilung, Knochengewebstransplantaten, Transplantatabstoßung, Ekzemen, entzündlichen Infektionen und trophischen Erkrankungen der Haut, viralen, bakteriellen und parasitären Infektionen, weiblicher Unfruchtbarkeit und Tumoren von Eierstock und Uterus.
  23. Verwendung eines gestutzten TIG2-Polypeptids dargestellt durch SEQ ID NO:48, oder eines TIG2-Polypeptids, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, als Ligand für ChemR23.
  24. Zusammensetzung umfassend ein isoliertes ChemR23 Polypeptid und ein isoliertes gestutztes TIG2-Polypeptid dargestellt durch SEQ ID NO:48, oder ein TIG2-Polypeptids, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist.
  25. Das Verfahren, die Verwendung, die Zusammensetzung oder das Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei das gestutzte TIG2-Polypeptid zusätzliche Sequenzen umfasst, die ein gestutztes TIG2-Fusionsprotein bilden.
  26. Das Verfahren, die Verwendung, die Zusammensetzung oder das Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die zusätzlichen Sequenzen ausgewählt sind aus Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose-bindendem Protein, alkalischer Phosphatase, Thioredoxin, dem Grün fluoreszierenden Protein (GFP), Histidin-Kennzeichen (Tags) (z.B. 6 oder mehr His) oder Epitop-Kennzeichen- (Tag-) (zum Beispiel Myc-Tag-, FLAG-Tag-) Sequenzen.
  27. Gestutztes TIG2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO:48, oder ein TIG2-Polypeptid, das Additionen, Insertionen, Deletionen oder Substitutionen relativ zu dem gestutzten TIG2-Polypeptid aufweist aber mindestens 50% der Bindungsaktivität und der Signal-Aktivierung des gestutzten TIG2-Polypeptids aufweist, oder ein Fusionsprotein, das diese Polypeptide umfasst.
  28. Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid nach Anspruch 27 kodiert.
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