DE69434166T2

DE69434166T2 - Menschliche metabotropische glutamatrezeptor untertype hmglur7 und verwandte dns-verbindungen

Info

Publication number: DE69434166T2
Application number: DE69434166T
Authority: DE
Inventors: Peter Josef Flor; Rainer Kuhn; Kristin Lindauer; Irene Püttner; Thomas Knöpfel
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1993-09-20
Filing date: 1994-09-07
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2014-09-08
Also published as: CA2171206A1; NZ273015A; EP1199359A1; HU9600692D0; EP0720650A1; ATE283916T1; FI961251A; NO961115L; DE69434166D1; US6515107B2; US20030113868A1; AU7615994A; JPH09503913A; ATE522610T1; AU695641B2; FI961251A0; NO961115D0; US6228610B1; EP1199359B1; EP0720650B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die humanen, metabotropen Glutamatrezeptorproteine (hmGluR), isolierte Nukleinsäuren hierfür, Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Proteine bilden, Verfahren zur Herstellung solcher Proteine, Nukleinsäuren und Wirtszellen und Verwendungen hiervon. Ferner liefert die Erfindung Antikörper; die gegen die hmGluR Proteine der Erfindung gerichtet sind.
Metabotrope Glutamatrezeptoren (hmGluR) gehören zur Klasse der G-Protein (Guaninnukleotidbindeprotein) gekuppelten Rezeptoren, die nach dem Binden eines glutamatergen Liganden ein extrazelluläres Signal über ein intrazelluläres Botenstoffsystem, wie Calciumionen, ein cyclisches Nukleotid, Diacylglycerin und Inosit-1,4,5-triphosphat in eine physiologische Reaktion umwandeln. Da sie sieben putative Transmembransegmente aufweisen, die von einer großen extrazellulären aminoterminalen Domäne angeführt sind und von einer großen carboxyterminalen Domäne gefolgt werden, sind metabotrope Glutamatrezeptoren durch eine gemeinsame Struktur gekennzeichnet. Auf der Grundlage der Sequenzidentität auf Aminosäureebene kann die Klasse der mGluR in unterschiedliche Unterfamilien eingeteilt werden, die einzelne Rezeptorsubtypen umfassen (Nakanishi, Science 258, 597–603 (1992)). Jeder mGluR Subtyp wird durch ein einziges Gen kodiert. In Anbetracht der Homologie eines individuellen mGluR Subtyps zu einem anderen Subtyp einer unterschiedlichen Unterfamilie sind die Aminosäuresequenzen zu weniger als etwa 50% identisch. Innerhalb einer Subfamilie beträgt das Maß an Sequenzidentität im allgemeinen weniger als etwa 70%. So kann ein bestimmter Subtyp durch die Aminosäuresequenzhomologie zu einem anderen mGluR Subtyp charakterisiert werden, speziell einem Subtyp der gleichen Säugerspezies. Ferner kann ein bestimmter Subtyp durch seine Region- und Gewebeverteilung, sein zelluläres und subzelluläres Expressionsmuster oder sein bestimmtes physiologisches Profil charakterisiert werden, beispielsweise durch die elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften.
Die Aminosäure L-Glutamat ist der hauptsächliche erregende Neurotransmitter, wobei glutamaterge Systeme eine wichtige Rolle in mehreren neurologischen Prozessen spielen dürften, wie unter anderem schnelle erregende, synaptische Übertragung, Regulation der Neurotransmitterfreisetzungen, Langzeitpotenzierung, Lernen und Gedächtnis, synaptische Entwicklungsplastizität, hypoxisch-ischämische Schädigung und neuronaler Zelltod, epileptiforme Schädigungen, wie auch bei der Pathogenese von mehreren neurodegenerativen Störungen. Molekulare Klonierungsstudien haben 5 unterschiedliche Subtypen von mGluRs (mGluR1 bis mGluR5) identifiziert, die sieben putative membrandurchspannende Domänen aufweisen, denen eine große extrazelluläre Domäne vorausgeht (Masu et al., Nature, 349, (1991), 760–765, Houamed et al., Science 252 (1991) 1318–1321, Tanabe et al., Neuron 8 (1992) 169–179, Abe et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 13361 bis 13368). Nakajima et al., J. Biol. Chem. Band 268, Seiten 11868–11873 beschreiben den aus Ratten isolierten mGluR6 Rezeptor. Jedoch ist bis heute keine Information über die humanen, metabotropen Glutamatrezeptorsubtypen (hmGluR) verfügbar, beispielsweise über ihre Aminosäuresequenz oder ihre Gewebeverteilung. Dieses fehlende Wissen hemmt die Suche nach humanen, therapeutischen Mitteln, die zur spezifischen Beeinflussung jeder Störung fähig sind, die einem Defekt im glutamatergen System zuzuordnen ist. In Anbetracht der potentiellen physiologischen und pathologischen Bedeutung der metabotropen Glutamatrezeptoren besteht ein Bedarf für humane Rezeptorsubtypen und Zellen, die solche Subtypen in Mengen bilden, die zur Ermittlung der elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften dieser Proteine ausreichen. Beispielsweise erfordern Arzneimittelscreeningtests gereinigte humane Rezeptorproteine in einer aktiven Form, die bisher nicht zuzuordnen waren.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, diesen Bedarf zu befriedigen, nämlich bestimmte hmGluR Subtypen, Nukleinsäuren, die hierfür kodieren, und Wirtszellen, die solche Subtypen bilden, bereitzustellen. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung den hmGluR Subtyp, der als hmGluR7 bezeichnet wird. Die Verwendung eines Systems, das einen rekombinanten hmGluR Subtyp der Erfindung beim Screening auf hmGluR reaktive Arzneimittel umfasst, bietet (unter anderem) die Möglichkeiten, eine größere Anzahl an Rezeptoren pro Zelle zu erreichen, was zu einer größeren Ausbeute an Reagenz und einem höheren Signal zu Rausch Verhältnis in Tests führt, wie auch zu einer erhöhten Rezeptorsubtypspezifität (was möglicherweise zu einer größeren biologischen Spezifität und Krankheitsspezifität führt).
Gemäß der Erfindung bezieht sich der Ausdruck "hmGluR Subtyp" auf ein gereinigtes Protein, das zur Klasse der G-Protein gekuppelten Rezeptoren gehört und das beim Binden eines glutamatergen Liganden ein extrazelluläres Signal über ein intrazelluläres Botenstoffsystem hervorruft. In einem solchen Fall ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass sie die Menge eines cyclischen Nukleotids (cAMP, cGMP) modifiziert. Alternativ dazu kann die Signaltransduktion über eine direkte Wechselwirkung des an einen erfindungsgemäßen Rezeptorsubtyp gekuppelten G-Proteins mit einem anderen Membranprotein erfolgen, wie einem Ionenkanal oder einem weiteren Rezeptor. Ein erfindungsgemäßer Rezeptorsubtyp dürfte durch ein bestimmtes Gen kodiert sein, das keinen anderen metabotropen Glutamatrezeptorsubtyp kodiert. Ein bestimmter Subtyp der Erfindung kann durch das distinkte physiologische Profil gekennzeichnet sein, vorzugsweise durch die Signaltransduktion und die pharmakologischen Eigenschaften. Die pharmakologischen Eigenschaften sind beispielsweise die Selektivität für Reaktionen durch Agonisten und Antagonisten.
Wie hierin definiert ist ein glutamaterger Ligand beispielsweise L-Glutamat oder eine andere Verbindung, die mit einem hmGluR Subtyp in einer Glutamat-ähnlichen Weise wechselwirkt und insbesondere hieran bindet, wie ACPD (1S,3R-1-Aminocyclopentan-1,3-dicarbonsäure), ein ACPD-ähnlicher Ligand, beispielsweise QUIS (Quisqualat), AP4 und dergleichen. Andere Liganden, beispielsweise (R,S)-α-Methylcarboxyphenylglycin (MCPG) oder α-Methyl-L-AP4, können mit einem erfindungsgemäßen Rezeptor so wechselwirken, dass die Bindung des glutamatergen Liganden verhindert wird.
Wie hierin vorher oder später verwendet sollen sich die Ausdrücke "gereinigt" oder "isoliert" auf ein erfindungsgemäßes Molekül in einer angereicherten oder reinen Form beziehen, das aus einer natürlichen Quelle oder durch Gentechnik erhalten werden kann. Die gereinigten Proteine, DNAs und RNAs der Erfindung können auf eine Weise brauchbar sein, dass die Proteine, DNAs und RNAs, wie sie natürlich vorkommen oder auch nicht, zur Identifizierung von Verbindungen dienen, die die Expression der Aktivität eines hmGluR der Erfindung selektiv modulieren.
Gereinigter hmGluR der Erfindung meint hmGluR7, einen Vertreter der hmGluR4 Subfamilie, die indentifiziert wurde und keine Komponente aus ihrer natürlichen Umgebung aufweist. Gereinigter hmGluR umfasst gereinigten hmGluR der Erfindung in rekombinanter Zellkultur. Die angereicherte Form eines Subtyps der Erfindung bezieht sich auf eine Präparation, die den Subtyp in einer Konzentration enthält, die höher als die natürliche ist, beispielsweise eine Zellmembranfraktion, die diesen Subtyp enthält. Falls dieser Subtyp in einer reinen Form vorliegt, ist diese im wesentlichen frei von anderen Makromolekülen, insbesondere von natürlich vorkommenden proteinartigen Kontaminationen. Erforderlichenfalls kann der Subtyp der Erfindung solubilisiert werden. Ein bevorzugter hmGluR Subtyp der Erfindung ist ein rekombinantes Protein. Vorzugsweise ist der Subtyp der Erfindung in einem aktiven Zustand, was meint, dass er sowohl Ligandenbindungs- und Signaltransduktionsaktivität aufweist. Die Rezeptoraktivität wird gemäß in der Technik bekannter Verfahren gemessen, beispielsweise mittels eines Bindungstests oder eines funktionellen Tests, beispielsweise eines unten beschriebenen Tests.
Ein Protein vom hmGluR7-Typ kann ein Polypeptid enthalten, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus den Polypeptiden, welche die jeweils in den SEQ ID Nr. 4, 8 und 10 gezeigten Sequenzen aufweisen. Ein solcher hmGluR7 Subtyp ist bevorzugt. Besonders bevorzugt sind die hmGluR7 Subtypen mit den jeweils in den SEQ ID Nr. 12 und 14 gezeigten Aminosäuresequenzen.
Die Erfindung soll feiner Varianten der erfindungsgemäßen Rezeptorsubtypen umfassen. Beispielsweise ist eine Variante eines hmGluR Subtyps der Erfindung ein funktionales oder immunologisches Äquivalent dieses Subtyps. Ein funktionelles Äquivalent ist ein Protein, insbesondere ein humanes Protein, das ein physiologisches Profil aufweist, das im wesentlichen zu dem Profil des bestimmten Subtyps identisch ist. Das physiologische Profil in vitro und in vivo umfasst die Rezeptor-Effektorfunktion, die elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften, beispielsweise die selektive Wechselwirkung mit Agonisten oder Antagonisten. Beispielhafte funktionelle Äquivalente können Spleißvarianten sein, die durch mRNA kodiert werden, welche durch alternatives Spleißen eines Primärtranskripts erzeugt werden, Aminosäuremutanten und Glycosylierungsvarianten. Ein immunologisches Äquivalent eines bestimmten hmGluR Subtyps ist ein Protein oder Peptid, das zur Erzeugung von Antikörpern fähig ist, die für diesen Subtyp spezifisch sind. Portionen der extrazellulären Domäne des Rezeptors, beispielsweise Peptide, die zumindest aus 6 bis 8 Aminosäuren, insbesondere 20 Aminosäuren bestehen, werden als besonders brauchbare immunologische Äquivalenie betrachtet.
Weitere Varianten, die hierin enthalten sind, sind membrangebundene und lösliche Fragmente und kovalente oder aggregative Konjugate mit anderen chemischen Resten, wobei diese Varianten eine oder mehrere Rezeptorfunktionen zeigen, wie die Ligandenbindung oder die Signaltransduktion. Beispielsgemäße Fragmente von hmGluR Subtypen der Erfindung sind die Polypeptide mit den Aminosäuresequenzen, die jeweils in den SEQ ID Nr. 4, 8 und 10 gezeigt sind. Die erfindungsgemäßen Fragmente erhält man von einer natürlichen Quelle, durch chemische Synthese oder durch rekombinante Techniken. Aufgrund ihrer Fähigkeit zur Konkurrenz mit dem endogenen Gegenstück eines hmGluR Subtyps der Erfindung um dessen endogene Liganden, werden Fragmente oder Derivate hiervon, die die Ligandenbindungsdomäne enthalten, als therapeutische Mittel betrachtet.
Kovalente Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester oder Amide einer Rezeptorcarboxylgruppe, O-Acylderivate von Hydroxygruppen-enthaltenden Resten und N-Acylderivate von Aminogruppen-enthaltenden Resten. Solche Derivate können durch Bindung von Funktionalitäten an reaktive Gruppen hergestellt werden, die sich in den Seitenketten und am N- und C-Terminus des Rezeptorproteins finden. Das erfindungsgemäße Protein kann auch mit einer detektierbaren Gruppe markiert werden, beispielsweise radioaktiv markiert werden, kovalent an Chelate mit seltenen Erden gebunden werden oder an einen Fluoreszenzrest konjugiert werden.
Weitere Derivate sind kovalente Konjugate eines erfindungsgemäßen Proteins mit einem weiteren Protein oder Peptid (Fusionsproteine). Beispiele sind Fusionsproteine, die unterschiedliche Teile von verschiedenen Glutamatrezeptoren enthalten. Solche Fusionsproteine können zur Veränderung der Kupplung an G-Proteine und/oder Verbesserung der Empfindlichkeit eines funktionellen Tests verwendet werden. Beispielsweise können in solchen Fusionsproteine oder chimären Rezeptoren die intrazellulären Domänen eines Subtyps der Erfindung durch die entsprechenden Domänen eines anderen mGluR Subtyps, insbesondere eines hmGluR Subtyps ersetzt werden, beispielsweise einem hmGluR Subtyp, der zu einer anderen Unterfamilie gehört. Besonders geeignet zur Konstruktion eines solchen chimären Rezeptors sind die intrazellulären Domänen eines Rezeptors, der den Phospholipase C/Ca²⁺ Signalweg aktiviert, beispielsweise mGluR1 (Masu et al., Nature 349, 760–765) oder mGluR5. Eine intrazelluläre Domäne, die für einen solchen Austausch geeignet ist, ist beispielsweise die zweite intrazelluläre Schleife, die auch als i2 bezeichnet wird (Pin et al., EMBO J. 13, 342–348 (1994)). Daher ist es möglich, die Wechselwirkung einer Testverbindung mit einer Ligandenbindungsdomäne eines erfindungsgemäßen Rezeptors mittels eines Tests für Calciumionen zu analysieren. Der chimäre, erfindungsgemäße Rezeptor kann durch rekombinante Techniken oder Mittel synthetisiert werden, die in der Technik zur Quervernetzung von Proteinen geeignet sind.
Aggregative Derivate sind beispielsweise Adsorptionskomplexe mit Zellmembranen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die einen hmGluR Subtyp der Erfindung enthält.
Die erfindungsgemäßen Proteine sind beispielsweise als Immunogene in Arzneimittelscreeningtests als Reagenzien für Immuntests und in Reinigungsverfahren brauchbar, wie zur Affinitätsreinigung eines Bindungsliganden.
Ein erfindungsgemäßes Protein ist aus einer natürlichen Quelle, beispielsweise durch Isolierung aus Hirngewebe, durch chemische Synthese oder rekombinante Techniken erhältlich.
Die Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung eines hmGluR Subtyp der Erfindung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass geeignete Wirtszellen, die einen erfindungsgemäßen Rezeptorsubtyp bilden, in vitro oder in vivo vermehrt werden. Vorzugsweise werden die Wirtszellen mit einem Hybridvektor transformiert (transfiziert), der eine Expressionskassette enthält, welche einen Promotor und eine DNA Sequenz umfasst, die für diesen Subtyp kodiert, wobei die DNA durch diesen Promotor kontrolliert wird. Anschließend kann der erfindungsgemäße hmGluR Subtyp gewonnen werden. Die Gewinnung umfasst beispielsweise die Isolierung des Subtyps der Erfindung aus den Wirtszellen oder die Isolierung der Wirtszellen, die den Subtyp enthalten, beispielsweise aus der Kulturbrühe. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung eines funktionell aktiven Rezeptors.
HmGluR Muteine können aus einer DNA hergestellt werden, die für ein erfindungsgemäßes hmGluR Protein kodiert, wobei die DNA einer in vitro Mutagenese unterzogen wurde, was zu einer Anfügung, einem Austausch und/oder einer Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren geführt hat. Beispielsweise werden Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten eines hmGluR Subtyps der Erfindung durch rekombinante Verfahren hergestellt und auf eine Immunkreuzreaktivität mit den nativen Formen des hmGluR gescreent.
Ein erfindungsgemäßes Protein kann auch in vitro gemäß herkömmlicher Methoden derivatisiert werden, die in der Technik bekannt sind.
Geeignete Wirtszellen umfassen eukaryontische Zellen, beispielsweise Tierzellen, Pflanzenzellen und Pilze und prokaryontische Zellen, wie Gram-positive und Gram-negative Bakterien, beispielsweise E. coli. Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen sind aus Amphibien- oder Säugerursprung.
Wie hierin verwendet, meint in vitro ex vivo und umfasst so beispielsweise Zellkultur- und Gewebekulturbedingungen.
Die Erfindung deckt ferner eine Nukleinsäure (DNA, RNA) ab, die eine gereinigte, vorzugsweise rekombinante Nukleinsäure (DNA, RNA) umfasst, die für einen erfindungsgemäßen Subtyp kodiert oder ein Fragment einer solchen Nukleinsäure. Zusätzlich zur Brauchbarkeit bei der Herstellung der oben erwähnten rekombinanten hmGluR Proteine sind diese Nukleinsäuren als Sonden brauchbar, da sie es dem Fachmann ermöglichen, Nukleinsäuren zu identifizieren und/oder isolieren, die für ein hmGluR Protein der Erfindung kodieren. Die Nukleinsäure kann unmarkiert oder markiert sein mit einem detektierbaren Rest. Ferner ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure beispielsweise in einem Verfahren zur Bestimmung des Vorkommens von hmGluR brauchbar, wobei das Verfahren die Hybridisierung der DNA (oder RNA), die für hmGluR kodiert (oder hierzu komplementär ist), mit der Testprobennukleinsäure und die Bestimmung der Gegenwart von hmGluR umfasst.
Gereinigte für hmGluR kodierende Nukleinsäure der Erfindung umfasst Nukleinsäure, die zumindest nicht die kontaminierende Nukleinsäure aufweist, mit der sie normalerweise in der natürlichen Quelle der hmGluR Nukleinsäure assoziiert ist. Gereinigte Nukleinsäuren kommen daher in einer anderen Form oder Umgebung als der vor, die man in der Natur findet. Jedoch umfasst gereinigte hmGluR Nukleinsäure hmGluR Nukleinsäure in üblichen hmGluR exprimierenden Zellen, worin die Nukleinsäure an einer chromosomalen Stelle vorkommt, die sich von der der natürlichen Zellen unterscheidet oder ansonsten von einer unterschiedlichen DNA Sequenz flankiert ist, als der, die man in der Natur findet.
Insbesondere liefert die Erfindung ein gereinigtes oder isoliertes DNA Molekül, das für einen hmGluR Subtyp der Erfindung kodiert, oder ein Fragment einer solchen DNA. Per Definition umfasst eine solche DNA die einzelsträngige, kodierende DNA, eine doppelsträngige DNA, die aus dieser kodierenden DNA und der komplementären DNA hierzu besteht, oder deren komplementäre (einzelsträngige) DNA. Bevorzugt ist eine DNA, die für die oben isoliert bevorzugten hmGluR Subtypen oder ein Fragment hiervon kodiert. Darüberhinaus betrifft die Erfindung eine DNA, die eine solche DNA umfasst.
Bevorzugt ist eine für einen hmGluR7 Subtyp kodierende DNA, insbesondere eine DNA, die einen der hmGluR7 Subtypen kodiert, die die jeweils in den SEQ ID Nr. 12 und 14 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen, beispielsweise die DNAs mit den jeweils in den SEQ ID Nr. 11 und 13 gezeigten Sequenzen. Die Erfindung liefert ferner ein DNA Fragment, das für einen Teil eines hmGluR7 Subtyps kodiert, insbesondere den oben als bevorzugt identifizierten hmGluR7 Subtypen. Beispielhaft umfassen die hmGluR7 DNA Fragmente die für hmGluR7-kodierenden Teile der cDNAs cmR2, cmR3, cmR5 und cR7PCR1, wie dies in den Beispielen beschrieben ist oder ein DNA Fragment hiervon, das im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz kodiert, die von dem den hmGluR7-kodierenden Teil des Plasmids cmR2 kodiert wird, das am 13. September 1993 unter der Hinterlegungsnummer DSM 8550 bei der DSM hinterlegt wurde. Diese DNAs kodieren Teile von putativen Spleißvarianten des hierin beschriebenen hmGluR7 Subtyps.
Die hierin bereitgestellten Nukleinsäuresequenzen können zur Identifizierung von DNAs verwendet werden, die weitere hmGluR Subtypen kodieren. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zur Identifizierung von DNAs verwendet werden, die für weitere hmGluR Subtypen kodieren, welche zur Subfamilie gehören, die hmGluR4 umfasst. Ein Verfahren zur Identifizierung solcher DNA umfasst das Zusammenbringen von humaner DNA mit einer Nukleinsäuresonde, wie dies oben beschrieben ist, und die Identifizierung der DNA(s), die mit dieser Sonde hybridisieren.
Beispielhafte Nukleinsäuren der Erfindung können alternativ dazu als solche Nukleinsäuren charakterisiert werden, die einen hmGluR Subtyp der Erfindung kodieren und an eine DNA Sequenz hybridisieren, die in den SEQ ID Nr. 3, 7, 9, 11 oder 13 angegeben ist oder einen ausgewählten Teil (Fragment) dieser DNA Sequenz. Beispielsweise sind ausgewählte Fragmente, die zur Hybridisierung brauchbar sind, die Protein-kodierenden Teile dieser DNAs. Bevorzugt sind solche DNAs, die einen hmGluR der Erfindung kodieren und unter Bedingungen mit hoher Stringenz an die oben erwähnten DNAs hybridisieren.
Die Stringenz der Hybridisierung bezieht sich auf Bedingungen unter denen Polynukleinsäurehybride stabil sind. Solche Bedingungen sind dem Fachmann bekannt. Wie es dem Fachmann bekannt ist, spiegelt sich die Stabilität der Hybride in der Schmelztemperatur/T_m) des Hybrids wider, das mit jeder Abnahme der Sequenzhomologie um 1% um etwa 1 bis 1,5°C abnimmt. Im allgemeinen ist die Stabilität eines Hybrids eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der Temperatur. Typischerweise wird die Hybridisierungsreaktion unter Bedingungen höherer Stringenz ausgeführt, wonach Waschschritte mit variierender Stringenz folgen.
Wie hierin verwendet bezieht sich die hohe Stringenz auf Bedingungen, die die Hybridisierung von nur den Nukleinsäuresequenzen erlauben, die bei 1 M Na⁺ und 65–68°C stabile Hybride bilden. Bedingungen mit hoher Stringenz können beispielsweise durch die Hybridisierung in einer wässrigen Lösung bereitgestellt werden, die 6 × SSC, 5 × Denhardt's, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat), 0,1 Na⁺ Pyrophosphat und 0,1 mg/ml denaturierte Lachsspermien DNA als unspezifischen Kompetitor enthält. Nach der Hybridisierung kann ein Waschen mit hoher Stringenz in mehreren Schritten ausgeführt werden, wobei ein letzter Waschschritt (etwa 30 Minuten) bei der Hybridisierungstemperatur in 0,2–0,1 × SSC, 0,1 SDS ausgeführt wird.
Moderate Stringenz bezieht sich auf Bedingungen, die einer Hybridisierung in der oben beschriebenen Lösung, aber bei 60–62°C äquivalent sind. In diesem Fall wird der letzte Waschschritt bei der Hybridisierungstemperatur in 1 × SSC, 0,1% SDS ausgeführt.
Geringe Stringenz bezieht sich auf Bedingungen, die einer Hybridisierung in der oben beschriebenen Lösung bei 60–62°C äquivalent sind. In diesem Fall wird der letzte Waschschritt bei der Hybridisierungstemperatur in 2 × SSC, 0,1% SDS ausgeführt.
Es ist gut verstanden, dass diese Bedingungen mittels einer Vielzahl an Puffer, beispielsweise auf Formamid basierende Puffer und Temperaturen angepasst und vervielfältigt werden können. Denhardt's Lösung und SSC sind dem Fachmann gut bekannt, wie dies auch bei anderen geeigneten Hybridisierungspuffern der Fall ist (siehe beispielsweise J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA oder F. M. Ausubel et al., (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene und Wiley, USA). Optimale Hybridisierungsbedingungen müssen empirisch bestimmt werden, da die Länge und der GC-Gehalt der Sonde auch eine Rolle spielen.
Gemäß der Beschreibung der vorliegenden Erfindung erhält man die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gemäß in der Technik bekannter Verfahren. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von solchen Aminosäuren.
Beispielsweise erhält man eine erfindungsgemäße DNA durch chemische Synthese, durch rekombinante DNA Technologie oder durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Herstellung durch rekombinante DNA Technologie kann das Screening einer geeigneten cDNA oder genomischen Genbank umfassen. Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung einer DNA der Erfindung umfasst die Synthese von mehreren Oligonukleotiden, ihre Amplifizierung durch PCR Methoden und ihr Spleißen unter Bildung der gewünschten DNA Sequenz. Geeignete Genbanken sind im Handel erhältlich, beispielsweise die Genbanken, die in den Beispielen verwendet werden, oder können aus neutralem oder neuronalen Gewebeproben hergestellt werden, beispielsweise Gewebe oder Zelllinien und dergleichen aus Hippocampus und Cerebellum.
Für einzelne hmGluR Subtypen (und Spleißvarianten) der Erfindung kann das Expressionsmuster in neuralen oder neuronalen Geweben variieren. Daher ist es zur Isolierung der cDNA, die einen bestimmten Subtyp (oder eine Spleißvariante) kodiert, vorteilhaft, Genbanken zu screenen, die aus unterschiedlichem Gewebe oder Zellen präpariert wurden. Als Screeningsonde kann eine DNA oder RNA verwendet werden, die im wesentlichen die gesamte kodierende Region eines hmGluR Subtyps der Erfindung umfasst oder eine geeignete Oligonukleotidsonde, die auf dieser DNA basiert. Eine geeignete Oligonukleotidsonde (für die beim Screenen beteiligte Hybridisierung) ist eine einzelsträngige DNA oder RNA, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die zumindest 14 aufeinanderfolgende Basen umfasst, die identisch (oder komplementär) zu 14 oder mehr aufeinanderfolgenden Basen sind, die in einer der SEQ ID Nr. 3, 7, 9, 11 und 13 gezeigt sind. Die Sonde kann mit einem geeigneten chemischen Rest für eine leichte Detektion markiert werden. Die Nukleinsäuresequenzen, die als Sonden ausgewählt werden, sollten eine ausreichende Länge aufweisen und sollten ausreichend eindeutig sein, so dass falsch positive Ergebnisse minimiert werden.
Bevorzugte Regionen, aus denen die Sonden konstruiert werden, umfassen 5' und/oder 3' kodierende Sequenzen, Sequenzen, die Ligandenbindungsstellen kodieren sollen und dergleichen. Beispielsweise können entweder die hierin beschriebenen Vollängen-cDNA-Klone oder Fragmente hiervon als Sonden verwendet werden. Vorzugsweise werden die Nukleinsäuresonden der Erfindung mit geeigneten Markierungen zur leichten Detektion bei einer Hybridisierung markiert. Beispielsweise ist eine geeignete Markierung eine radioaktive Markierung. Das bevorzugte Verfahren zur Markierung eines DNA Fragments ist der Einbau von ³²P markiertem α-dATP mit dem Klenowfragment der DNA Polymerase in einer zufälligen Primerreaktion, wie dies in der Technik bekannt ist. Oligonukleotide werden gewöhnlich mit ³²P markiertem γ-ATP und Polynukleotidkinase endmarkiert. Jedoch können andere Verfahren (beispielsweise nicht radioaktiv) auch zur Markierung des Fragments oder Oligonukleotids verwendet werden, einschließlich beispielsweise Enzymmarkierung und Biotinylierung.
Nach dem Screenen der Genbank, beispielsweise mit einem Teil der DNA, die im wesentlichen die gesamte für hmGluR kodierende Sequenz enthält oder einem geeigneten Oligonukleotid, das auf einem Teil dieser DNA basiert, werden positive Klone durch die Detektion eines Hybridisierungssignals identifiziert, die identifizierten Klone werden durch Restriktionsenzymkartierung und/oder DNA Sequenzanalyse charakteisiert und dann untersucht, beispielsweise durch den Vergleich mit den hierin beschriebenen Sequenzen, um sicherzustellen, ob sie DNA enthalten, die für ein vollständiges hmGluR kodiert (das heißt, ob sie Translationsinitiations- und Translationsterminationscodons enthält). Falls die ausgewählten Klone unvollständig sind, können sie verwendet werden, um dieselbe oder eine unterschiedliche Genbank zu screenen, um überlappende Klone zu erhalten. Falls die Genbank genomisch ist, können die überlappenden Klone Exons und Introns enthalten. Falls die Genbank eine cDNA Genbank ist, dann enthalten die überlappenden Klone einen offenen Leserahmen. In beiden Fällen können vollständige Klone durch den Vergleich mit den hierin bereitgestellten DNA und abgeleiteten Aminosäuresequenzen identifiziert werden.
Darüberhinaus kann zur Detektion jeder Abnormalität eines endogenen hmGluR Subtyps der Erfindung ein genetisches Screening mittels der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen als Hybridisierungssonden ausgeführt werden. Ebenfalls können auf der Grundlage der hierin bereitgestellten Nukleinsäuresequenzen therapeutische Mittel vom Antisensetyp entwickelt werden.
Es wird erkannt, dass die erfindungsgemäße Nukleinsäure leicht durch Nukleotidsubstitution, Nukleotiddeletion, Nukleotidinsertion oder Nukleotidinversion eines Nukleotidabschnitts und jeder Kombination hiervon modifiziert werden kann. Solche modifizierten Sequenzen können zur Bildung eines mutierten hmGluR Subtyps verwendet werden, der sich von den in der Natur gefundenen Rezeptorsubtypen unterscheidet. Die Mutagenese kann vorbestimmt (ortsspezifisch) oder zufällig sein. Eine Mutation, die keine stille Mutation ist, darf die Sequenzen nicht aus dem Leserahmen bringen und erzeugt vorzugsweise keine komplementären Regionen, die unter Bildung von sekundären mRNA Strukturen hybridisieren können, wie Schleifen oder Haarnadeln.
Die cDNA oder genomische DNA, die den nativen oder mutierten hmGluR der Erfindung kodiert, kann in Vektoren zur weiteren Vermehrung eingebracht werden. Ferner betrifft die Erfindung eine rekombinante DNA, die ein Hybridvektor ist, der zumindest eine der oben erwähnten DNAs umfasst.
Die erfindungsgemäßen Hybridvektoren umfassen einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz, einen oder mehrere dominante Markersequenzen und wahlweise Expressionskontrollsequenzen, Signalsequenzen und zusätzliche Restriktionsstellen.
Vorzugsweise umfasst der erfindungsgemäße Hybridvektor eine oben beschriebene Nukleinsäureinsertion, die wahlweise an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, insbesondere eine der hierin später beschriebenen.
Vektoren üben typischerweise zwei Funktionen zusammen mit kompatiblen Wirtszellen aus. Eine Funktion ist es, die Klonierung der Nukeinsäure zu erleichtern, die den hmGluR Subtyp der Erfindung kodiert, das heißt brauchbare Mengen der Nukleinsäure (Klonierungsvektoren) herzustellen. Die andere Funktion ist es, für die Replikation und Expression der Genkonstrukte in einem geeigneten Wirt zu sorgen, entweder durch Aufrechterhaltung als extrachromosomales Element oder durch Integration in das Wirtschromosom (Expressionsvektoren). Ein Klonierungsvektor umfasst die wie oben beschriebenen DNAs, einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz, selektierbare Markersequenzen und wahlweise Signalsequenzen und zusätzliche Restriktionsstellen. Ein Expressionsvektor umfasst zusätzlich Expressionskontrollsequenzen, die zur Transkription und Translation der erfindungsgemäßen DNA essentiell sind. Daher bezieht sich ein Expressionsvektor auf ein rekombinantes DNA Konstrukt, wie ein Plasmid, einen Phagen, ein rekombinantes Virus oder einen anderen Vektor, der bei der Einführung in eine geeignete Wirtszelle zu einer Expression der klonierten DNA führt. Geeignete Expressionsvektoren sind in der Technik gut bekannt und umfassen die, die in eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen replizierbar sind.
Die meisten Expressionsvektoren sind zur Replikation in zumindest einer Klasse an Organismen fähig, aber können zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert und dann wird derselbe Vektor in Hefe oder Säugerzellen transfiziert, auch wenn er nicht zur Replikation unabhängig vom Wirtszellchromosom fähig ist. Die DNA kann auch durch Insertion in das Wirtsgenom amplifiziert werden. Jedoch ist die Gewinnung von genomischer DNA, die für hmGluR kodiert, komplexer als die des exogen replizierten Vektors, da ein Restriktionsenzymverdau erforderlich ist, um die hmGluR DNA auszuschneiden. Die DNA kann durch PCR amplifiziert und direkt in die Wirtszellen ohne Replikationskomponente transfiziert werden.
Vorteilhafterweise enthält der Expressions- und Klonierungsvektor ein Selektionsgen, das auch als Selektionsmarker bezeichnet wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder das Wachstum der transformierten Wirtszellen erforderlich ist, die in einem selektiven Kulturmedium angezogen werden. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor transformiert sind, der das Selektionsgen enthält, überleben im Kulturmedium nicht. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die eine Resistenz gegenüber Antibiotika und anderen Toxinen verleihen, beispielsweise Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, auxotrophe Defizienzen komplementieren oder kritische Nährstoffe liefern, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind.
Da die Amplifizierung der Vektoren bequem in E. coli ausgeführt wird, werden vorteilhafterweise ein genetischer E. coli Marker und ein E. coli Replikationsursprung einbezogen. Diese können von E. coli Plasmiden erhalten werden, wie pBR322, Blueskript Vektor oder einem pUC Plasmid.
Geeignete Selektionsmarker für Säugerzellen sind die, die die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die zur Aufnahme von hmGluR Nukleinsäure kompetent sind, wie die Dihydrofolatreduktase (DHFR, Methotrexatresistenz), Thymidinkinase oder Gene, die eine Resistenz gegenüber G418 oder Hygromycin verleihen. Die Säugerzelltransfektanden werden unter Selektionsdruck gestellt, wobei nur die Transfektanden überleben, die einzigartig an ein Überleben angepasst sind, die den Marker aufgenommen haben und exprimieren.
Die Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten gewöhnlich einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und der operativ an die hmGluR Nukleinsäure gebunden ist. Ein solcher Promotor kann induzierbar oder konstitutiv sein. Die Promotoren sind operativ an DNA gebunden, die für hmGluR kodiert, indem man den Promotor aus der Quellen-DNA durch Restriktionsverdau entfernt und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor einbaut. Sowohl die native hmGluR Promotorsequenz als auch viele heterologe Promotoren können zur direkten Amplifizierung und/oder Expression der hmGluR DNA verwendet werden. Jedoch sind heterologe Promotoren bevorzugt, da sie im allgemeinen eine stärkere Transkription und höhere Ausbeuten des exprimierten hmGluR im Vergleich zum nativen hmGluR Promotor erlauben.
Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryontischen Wirten geeignet sind, umfassen beispielsweise die β-Lactamase- und Lactosepromotorsysteme, alkalische Phosphatase, ein Tryptophanpromotorsystem (trp) und Hybridpromotoren, wie den tac-Promotor. Die Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht und ermöglichen es daher dem Fachmann, sie operativ an DNA zu binden, die für hmGluR kodiert, indem sie Linker oder Adaptoren verwenden, um die erforderlichen Restriktionsschnittstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten im allgemeinen auch eine Shine-Dalgarno-Sequenz, die operativ an die für hmGluR kodierende DNA gebunden ist.
Die hmGluR Gentranskription von Vektoren in Säugerwirtszellen kann durch Promotoren kontrolliert werden, die mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind, beispielsweise Promotoren, die von den Genomen von Viren stammen. Geeignete Plasmide zur Expression eines hmGluR Subtyps der Erfindung in eukaryontischen Wirtszellen, insbesondere Säugerzellen, sind beispielsweise Cytomegalievirus(CMV)-Promotoren enthaltende Vektoren, RSV Promotor enthaltende Vektoren, SV40 Promotor enthaltende Vektoren und MMTV LTR Promotor enthaltende Vektoren. In Abhängigkeit der Art der Regulation können die Promotoren konstitutiv sein oder durch experimentelle Bedingungen regulierbar sein.
Die Transkription einer für einen erfindungsgemäßen hmGluR Subtyp kodierenden DNA durch höhere Eukaryonten kann durch die Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht werden.
Die verschiedenen DNA Segmente der Vektor DNA sind operativ verbunden, das heißt sie folgen aufeinander und sind in eine funktionelle Beziehung zueinander gesetzt.
Die Konstruktion der erfindungsgemäßen Vektoren verwendet herkömmliche Ligationstechniken. Isolierte Plasmide oder DNA Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der Form religiert, die erwünscht ist, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen. Erforderlichenfalls wird eine Analyse auf eine in der Technik bekannte Weise ausgeführt, um die korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden zu bestätigen. Geeignete Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren, Herstellung von in vitro Transkripten, Einführung von DNA in Wirtszellen und die Ausführung von Analysen zur Untersuchung der hmGluR Expression und Funktion sind dem Fachmann bekannt. Das Vorkommen des Gens, die Amplifizierung und/oder Expression kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch einen herkömmlichen Southern Blot, Northern Blot zur Quantifizierung der Transkription der mRNA, Dot Blot (DNA oder RNA Analyse), in situ Hybrisierung, wobei eine geeignet markierte Sonde verwendet wird, die auf einer hierin bereitgestellten Sequenz basiert, durch Bindungstests, Immundetektion und Funktionstests. Geeignete Verfahren umfassen die, welche im Detail in den Beispielen beschrieben sind. Der Fachmann erkennt, wie diese Verfahren modifiziert werden, falls dies gewünscht wird.
Die Erfindung liefert ferner Wirtszellen, die zur Bildung eines hmGluR Subtyps der Erfindung fähig sind und auch heterologe (fremde) DNA, die für diesen Subtyp kodiert.
Die Nukleinsäuren der Erfindung können in einer großen Vielzahl an Wirtszellen exprimiert werden, beispielsweise den oben erwähnten, die mit einem geeigneten Expressionsvektor transformiert oder transfiziert sind. Der Rezeptor der Erfindung (oder ein Teil hiervon) kann auch als Fusionsprotein exprimiert werden. Rekombinante Zellen können dann unter Bedingungen kultiviert werden, wobei die durch die erfindungsgemäße DNA kodierten Proteine exprimiert werden.
Geeignete Prokaryonten umfassen Eubakterien, wie Gram-negative oder Gram-positive Organismen, wie E. coli, beispielsweise E. coli K 12 Stämme, DH5α und HB 101 oder Bazillen. Ferner umfassen Wirtszellen, die für hmGluR kodierende Vektoren geeignet sind, eukaryontische Mikroben, wie filamentöse Pilze oder Hefe, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae. Höhere eukaryontische Zellen umfassen Insekten-, Amphibien- und Vertebratenzellen, insbesondere Säugerzellen, beispielsweise Neuroblastomzelllinien oder von Fibroblasten abgeleitete Zelllinien. Beispiele für bevorzugte Zelllinien sind beispielsweise HEK 293 Zellen, CHO Zellen, CV1 Zellen, BHK Zellen, L Zellen, LLCPK-1 Zellen, GH3 Zellen, L Zellen und COS Zellen. In den letzten Jahren wurde die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ein Routineverfahren. Die in dieser Anmeldung angeführten Wirtszellen umfassen Zellen in in vitro Kultur wie auch Zellen, die innerhalb eines Wirtstieres vorkommen.
Geeignete Wirtszellen zur Expression eines aktiven, rekombinanten hmGluR der Erfindung exprimieren vorteilhafterweise endogene oder rekombinante G-Proteine. Bevorzugt sind Zellen, die wenig oder gar keinen endogenen metabotropen Glutamatrezeptor bilden. Die DNA kann stabil in die Zellen eingebaut werden oder kann transient gemäß herkömmlicher Verfahren exprimiert werden.
Stabil transfizierte Säugerzellen können durch die Transfektion von Zellen mit einem Expressionsvektor, der ein Selektionsmarkergen aufweist, und der Anzucht der transfizierten Zellen unter Bedingungen hergestellt werden, die für Zellen selektiv sind, die das Markergen exprimieren. Um transiente Transfektanden herzustellen, werden Säugerzellen mit einem Reportergen transfiziert, um die Transfektionseffizienz zu verfolgen.
Um solche stabilen oder transient transfizierten Zellen herzustellen, sollten die Zellen mit einer ausreichenden Menge an hm-GluR-kodierender Nukleinsäure unter Bildung von hmGluR der Erfindung transfiziert werden. Die genauen Mengen der für erfindungsgemäßen hmGluR kodierenden DNA können empirisch bestimmt und für eine bestimmte Zelle und einen bestimmten Test optimiert werden.
Eine erfindungsgemäße DNA kann auch in nicht humanen, transgenen Tieren exprimiert werden, insbesondere in transgenen Warmblütern. Verfahren zur Herstellung dieser transgenen Tiere, einschließlich Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe und Schweine sind in der Technik bekannt und sind beispielsweise von Hammer et al., (Nature 315, 680–683, 1985) beschrieben. Eine Expressionseinheit, die eine für einen hmGluR kodierende DNA der Erfindung zusammen mit geeignet positionierten Expressionskontrollsequenzen umfasst, wird in die Pronuklei von befruchteten Eiern eingeführt. Die Einführung kann beispielsweise durch Mikroinjektion erreicht werden. Die Integration der injizierten DNA wird beispielsweise durch Blotanalyse der DNA aus geeigneten Gewebeproben detektiert. Es ist bevorzugt, dass die eingeführte DNA in die Keimlinie des Tieres eingebaut wird, so dass sie an die Nachkommen des Tieres weitergegeben wird. Vorzugsweise wird ein transgenes Tier durch gezielte Mutation zur Zerstörung einer hmGluR Sequenz entwickelt. Ein solches Tier ist beispielsweise für die Untersuchung der Rolle eines metabotropen Rezeptors im Metabolismus brauchbar.
Ferner kann ein Knock-out Tier durch die Einführung einer Mutation in die hmGluR Sequenz entwickelt werden, wobei ein Tier erzeugt wird, das kein funktionelles hmGluR Gen mehr exprimiert. Ein solches Knock-out Tier ist beispielsweise zur Untersuchung der Rolle des metabotropen Rezeptors im Metabolismus brauchbar. Verfahren zur Herstellung von Knock-out Mäusen sind in der Technik bekannt.
Es werden Wirtszellen mit den oben gewonnenen Expressions- oder Klonierungsvektoren der Erfindung transfiziert oder transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die geeigneterweise zur Einführung von Promotoren, Auswahl von Transformanden oder Amplifizierung der Gene modifiziert wurden, die die gewünschten Sequenzen kodieren. Es kann heterologe DNA in die Wirtszellen durch jedes in der Technik bekannte Verfahren eingeführt werden, wie Transfektion mit einem Vektor, der eine heterologe DNA enthält, durch die Calciumphosphatcopräzipitationstechnik, durch Elektroporation oder durch Lipofektinvermittlung. Es sind mehrere Verfahren zur Transfektion dem Fachmann bekannt. Eine erfolgreiche Transfektion wird im allgemeinen erkannt, wenn Anzeichen zur Funktionsfähigkeit des Vektors in der Zelle auftreten. Die Transformation wird mittels Standardtechniken erreicht, die für die im einzelnen verwendeten Wirtszellen geeignet ist.
Der Einbau der klonierten DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, die Transfektion von eukaryontischen Zellen mit einem Plasmidvektor oder eine Kombination von Plasmidvektoren, wobei jeder ein oder mehrere distinkte Gene enthält, oder mit linearer DNA und die Selektion der transfizierten Zellen sind in der Technik gut bekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Transfizierte oder transformierte Zellen werden mittels Medien und Kulturbedingungen kultiviert, die in der Technik bekannt sind, vorzugsweise unter Bedingungen, bei den der durch die DNA kodierte hmGluR exprimiert wird. Die Zusammensetzung von geeigneten Medien ist dem Fachmann bekannt, so dass sie leicht hergestellt werden können. Geeignete Kulturmedien sind auch im Handel erhältlich.
Während die hierin bereitgestellte DNA in jeder geeigneten Wirtszelle exprimiert werden kann, beispielsweise in den oben erwähnten, sind eukaryontische Expressionssysteme zur Expression der funktionellen hmGluR kodierenden DNA bevorzugt, insbesondere Säugerexpressionssysteme, einschließlich im Handel erhältlicher Systeme oder Systeme, die dem Fachmann bekannt sind.
Humane mGluR DNA der Erfindung wird in einen Vektor ligiert und in geeignete Wirtszellen unter Bildung von transformierten Zelllinien eingeführt, die einen bestimmten hmGluR Subtyp der Erfindung oder spezifische Subtypkombinationen exprimieren. Die entstehende Zelllinie kann dann in Mengen gebildet werden, die für eine reproduzierbare qualitative und quantitiative Analyse der Effekte eines Rezeptoragonisten, Rezeptorantagonisten oder allosterischen Modulators ausreichen. Zusätzlich kann mRNA durch eine in vitro Transkription von DNA gebildet werden, die einen Subtyp der Erfindung kodiert. Diese mRNA kann in Xenopus Oocyten injiziert werden, worin die mRNA die Synthese des aktiven Rezeptorsubtyps steuert. Alternativ dazu kann die für den Subtyp kodierende DNA direkt in Oocyten injiziert werden. Die transfizierten Säugerzellen oder die injizierten Oocyten können dann in einem Arzneimittelscreeningtest verwendet werden, der hierin später bereitgestellt wird. Solche Arzneimittel sind bei Erkrankungen brauchbar, die mit der Pathogenese eines hmGluR Subtyps der Erfindung assoziiert sind. Solche Erkrankungen umfassen Erkrankungen, die aus einer übermäßigen Wirkung von Glutamat resultieren, die durch vorwiegend von hmGluRs vermittelt wird, wie Schlaganfall, Epilepsie und chronische, neurodegenerative Erkrankungen. Besonders brauchbar zur Untersuchung der spezifischen Wechselwirkung der Verbindungen mit spezifischen hmGluR Subtypen sind stabil transfizierte Zelllinien, die einen hmGluR der Erfindung exprimieren.
Daher sind Wirtszellen, die einen hmGluR der Erfindung exprimieren, zum Arzneimittelscreening brauchbar und es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung oder eines Signals bereitzustellen, das die Aktivität von hmGluR moduliert, wobei das Verfahren die Exposition von Zellen umfasst, die heterologe DNA enthalten, welche den erfindungsgemäßen hmGluR kodiert, wobei die Zellen funktionelles hmGluR bilden, gegenüber zumindest einer Verbindung oder eines Signals, deren Fähigkeit zur Modulierung der Aktivität des hmGluR bestimmt werden soll, und anschließend Verfolgen dieser Zellen bezüglich Veränderungen, die durch diese Modulation verursacht werden. Ein solcher Test ermöglicht die Identifizierung von Agonisten, Antagonisten und allosterischen Modulatoren eines hmGluR der Erfindung.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Test zur Identifizierung von Verbindungen, die die Aktivität eines hmGluR Subtyps der Erfindung modulieren, wobei der Test umfasst

– Zusammenbringen der Zellen, die einen aktiven hm GluR Subtyp der Erfindung exprimieren und heterologe DNA enthalten, die diesen hmGluR Subtyp kodiert, mit zumindest einer Verbindung, deren Fähigkeit zur Modulation der Aktivität dieses Rezeptorsubtyps bestimmt werden soll und
– Analyse der Zellen auf einen Unterschied in der Menge an Botenstoff oder Rezeptoraktivität.

Insbesondere umfasst die Erfindung einen Test zur Identifizierung von Verbindungen, die die Aktivität eines hmGluR Subtyps der Erfindung modulieren, wobei der Test umfasst:

– Zusammenbringen der Zellen, die einen aktiven hmGluR der Erfindung kodieren und heterologe DNA enthalten, die diesen hmGluR Subtyp kodiert, mit mindestens einer Verbindung, deren Fähigkeit zur Modulation der Aktivität dieses Rezeptors bestimmt werden soll, und
– Beobachtung dieser Zellen bezüglich einer resultierenden Veränderung der Botenstoffaktivität.

Das erhaltene Ergebnis im Test wird mit einem Test verglichen, der als Negativkontrolle geeignet ist.
Testverfahren erfordern allgemein einen Vergleich mit verschiedenen Kontrollen. Eine Veränderung in der Rezeptoraktivität oder in der Menge des Botenstoffs sollte durch eine Testverbindung induziert werden, falls ein solcher Effekt nicht in Abwesenheit der Testverbindung auftritt. Ein Effekt einer Testverbindung auf einen Rezeptorsubtyp der Erfindung dürfte durch den Rezeptor vermittelt werden, falls der Effekt nicht in Zellen beobachtet wird, die den Rezeptor nicht exprimieren.
Wie hierin verwendet bezieht sich eine Verbindung oder ein Signal, das die Aktivität eines hmGluR der Erfindung moduliert, auf eine Verbindung oder ein Signal, das den durch hmGluR vermittelten Reaktionsweg in einer Zelle verändert (im Vergleich zur Abwesenheit dieses hmGluR). Ein Reaktionsweg wird durch einen extrazellulären Stimulus aktiviert, was zu einer Veränderung der Botenstoffkonzentration oder der Enzymaktivität führt, oder zu einen Veränderung der Aktivität eines membrangebundenen Proteins führt, wie einem Rezeptor oder einem Ionenkanal. Es kann eine Vielzahl an Reaktionswegen verwendet werden, einschließlich beispielsweise der Adenylatcyclasereaktionsweg, der Phospholipase C/intrazellulärer Calciumionenreaktionsweg oder die Kupplung an einen Ionenkanal. Tests zur Bestimmung der Adenylatcyclaseaktivität sind in der Technik gut bekannt und umfassen beispielsweise den von Nakajima et al., J. Biol. Chem. 267, 2437–2442 (1992)) beschriebenen Test.
Daher können die Zellen, die den erfindungsgemäßen hmGluR exprimieren, zur Identifizierung der Verbindungen verwendet werden, insbesondere niedermolekulare Moleküle, die zur Wirkung als Glutamatagonisten oder Glutamatantagonisten fähig sind. Bevorzugt sind niedermolekulare Moleküle mit weniger als 1000 Dalton. Innerhalb des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung soll ein Agonist ein Molekül sein, das zur Wechselwirkung mit einem Rezeptor fähig ist, wobei die Wirkung von L-Glutamat nachgeahmt wird. Insbesondere wird ein Glutamatagonist durch die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit einem hmGluR der Erfindung und einer Erhöhung oder Verringerung der Stimulierung eines Reaktionswegs in einer Zelle charakterisiert. Beispielsweise erhöht oder verringert ein Agonist einen messbaren Parameter innerhalb der Wirtszelle, wie die Konzentration eines Botenstoffs, wie der natürliche Ligand diesen Parameter erhöht oder verringert. Beispielsweise ist ein solcher Agonist in einem geeigneten Testsystem, worin hmGluR der Erfindung negativ an die Adenylatcyclase gekuppelt ist, beispielsweise CHO oder BHK Zellen, die einen erfindungsgemäßen hmGluR exprimieren, zur Modulierung der Funktion dieses hmGluR auf eine Weise fähig, dass die intrazelluläre Konzentration an cAMP verringert wird.
Im Gegensatz dazu sind in Situationen, in denen es gewünscht ist, die Aktivität des hmGluR abzuschwächen, antagonisierende Moleküle brauchbar. Innerhalb des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung bezieht sich ein Antagonist auf ein Molekül, das zur Wechselwirkung mit einem Rezeptor oder mit L-Glutamat fähig ist, das aber keine Reaktion in einer Zelle stimuliert. Insbesondere werden Gluta matantagonisten im allgemeinen durch ihre Fähigkeit zur Wechselwirkung mit einem hmGluR der Erfindung und einer Verringerung der Fähigkeit der natürlichen Liganden zur Stimulierung einer Reaktion in einer Zelle identifiziert, beispielsweise durch Wechselwirkung mit der Bindung von L-Glutamat an einen hmGluR der Erfindung oder durch die Hemmung von anderen zellulären Funktionen, die zur Aktivität eines hmGluR erforderlich sind. Beispielsweise ist in einem geeigneten Test, beispielsweise einem Test der CHO oder BHK Zellen umfasst, die einen erfindungsgemäßen hmGluR exprimieren, ein Glutamatantagonist zur Modulierung der Aktivität eines erfindungsgemäßen hmGluR auf die Weise fähig, dass die Fähigkeit des natürlichen Liganden zur Verringerung der intrazellulären cAMP Konzentration geschwächt wird. Eine weitere Alternative zur Erzielung eines Antagonisteneffekts ist es, eine Überexpression einer hmGluR Antisense-RNA zu erzielen. Bevorzugt ist ein Agonist oder Antagonist, der selektiv am Rezeptor der hmGluR4 Unterfamilie hmGluR7 wirkt. Besonders brauchbar ist ein Agonist oder Antagonist, der spezifisch die Aktivität eines bestimmten hmGluR Subtyps ohne Beeinflussung der Aktivität eines anderen Subtyps moduliert.
Ein weiterer allosterischer Modulator eines erfindungsgemäßen hmGluR wechselwirkt mit dem Rezeptorprotein an einer anderen Stelle als L-Glutamat und wirkt so als Agonist oder Antagonist. Daher sind die hierin beschriebenen Screeningtests auch zur Detektion eines allosterischen Modulators eines erfindungsgemäßen Rezeptors brauchbar. Beispielsweise kann ein als allosterischer Modulator wirkender Agonist die spezifische Wechselwirkung zwischen einem hmGluR der Erfindung und L-Glutamat fördern. Falls ein allosterischer Modulator als Antagonist wirkt kann dieser beispielsweise mit einem Rezeptorprotein auf eine Weise Wechselwirken, dass die Bindung des Agonisten funktionell weniger wirksam ist.
Ein in vitro Test für einen Glutamatagonisten oder Glutamatantagonisten kann erfordern, dass ein erfindungsgemäßer hmGluR in ausreichenden Mengen in einer funktionellen Form mittels rekombinanter DNA Verfahren hergestellt wird. Es wird dann ein Test zur Messung einer funktionellen Eigenschaft des hmGluR Proteins entworfen, beispielsweise der Wechselwirkung mit einem glutamatergen Liganden. Die Bildung eines erfindungsgemäßen hmGluR wird als ausreichende Menge betrachtet, falls die Aktivität dieses Rezeptors zu einer messbaren Reaktion führt.
Beispielsweise werden Säugerzellen, wie HEK293 Zellen, L Zellen, CHO-K1 Zellen, LLCPK-1 Zellen oder GH3 Zellen (erhältlich von der American Tissue Type Culture Collection) angepasst, um in einem Glutamat-reduzierten, vorzugsweise Glutamat-freien Medium zu wachsen. Ein hmGluR Expressionsplasmid, beispielsweise ein in den Beispielen beschriebenes Plasmid, wird transient in die Zellen transfiziert, beispielsweise durch Calciumphosphatfällung (F. M. Ausubel et al., (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, USA). Die Zelllinien, die stabil einen erfindungsgemäßen hmGluR exprimieren, können beispielsweise durch Lipofectin-vermittelte Transfektion mit hmGluR Expressionsplasmiden und einem Plasmid, das ein Selektionsmarkergen enthält, erzeugt werden, beispielsweise pSV2-Neo (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327–341 (1982)), ein Plasmidvektor, der das G 418 Resistenzgen kodiert. Die die Selektion überlebenden Zellen werden isoliert und im Selektionsmedium angezogen. Resistente klonale Zelllinien werden beispielsweise auf Immunreaktivität mit Subtyp-spezifischen hmGluR Antikörpern oder durch Tests auf funktionelle hmGluR Reaktionen nach einer Agonistzugabe analysiert. Zellen, die den gewünschten hmGluR Subtyp bilden, werden in einem Verfahren zur Detektion von Verbindungen verwendet, die an den hmGluR der Erfindung binden oder in einem Verfahren zur Identifizierung eines Glutamatagonisten oder Glutamatantagonisten.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an einen hmGluR Subtyp binden, wobei das Verfahren die Verwendung eines erfindungsgemäßen hmGluR Subtyps in einem kompetitiven Bindungstest umfasst. Das einem kompetitiven Bindungstest zugrundeliegende Prinzip ist in der Technik allgemein bekannt. Kurz gesagt werden erfindungsgemäße Bindungstests ausgeführt, indem die auf die hmGluR Bindungsfähigkeit zu testende Verbindung in Kompetition mit einem bekannten, geeignet markierten, glutamatergen Liganden um die Bindungsstelle am hmGluR Zielmolekül getestet wird. Ein geeignet markierter Ligand ist beispielsweise ein radioaktiv markierter Ligand, wie [³H]-Glutamat oder ein Ligand, der durch die optischen Eigenschaften detektiert werden kann, wie Absorption oder Fluoreszenz. Nach der Entfernung des ungebundenen Liganden und der Testverbindung wird die Menge an markiertem Liganden gemessen, die an hmGluR gebunden ist. Falls die Menge des markierten Liganden in Gegenwart der Testverbindung verringert wird, dürfte die Verbindung an das Zielmolekül binden. Ein kompetitiver Bindungstest kann beispielsweise mit transformierten oder transfizierten Wirtszellen ausgeführt werden, die einen erfindungsgemäßen hmGluR exprimieren oder mit einer Membranzellfraktion ausgeführt werden, die einen hmGluR der Erfindung umfasst.
Die an den Ziel-hmGluR gebundene Verbindung kann die funktionellen Eigenschaften von hmGluR modulieren und hierbei als Glutamatagonist oder Glutamatantagonist eines funktionellen Tests identifiziert werden.
Funktionelle Tests werden zur Detektion einer Veränderung in der funktionellen Aktivität eines erfindungsgemäßen hmGluR verwendet, das heißt zur Detektion einer funktionellen Reaktion, beispielsweise als Ergebnis der Wechselwirkung der zu testenden Verbindung mit dem hmGluR. Eine funktionelle Reaktion ist beispielsweise eine Veränderung (ein Unterschied) in der Konzentration eines relevanten Botenstoffs oder eine Veränderung in der Aktivität eines anderen membrangebundenen Proteins, das durch den erfindungsgemäßen Rezeptor beeinflusst wird, in Zellen, die einen funktionellen hmGluR der Erfindung exprimieren (im Vergleich zu einer Negativkontrolle). Der Fachmann kann leicht einen Test identifizieren, der zur Detektion einer Veränderung in der Menge eines intrazellulären Botenstoffs geeignet ist, der die Expression eines aktiven hmGluR anzeigt (funktioneller Test). Beispiele umfassen cAMP Tests (siehe beispielsweise Nakajima et al., J. Biol. Chem. 267, 2437–2442 (1992), cGMP Tests (siehe beispielsweise Steiner et al., J. Biol. Chem. 247, 1106–1113 (19972)), Phosphatidylinositol (PI) Umsatztests (Nakajima et al., J. Biol. Chem. 267, 2437–2442 (1992)), Calciumionenflusstests (Ito et al., J. Neurochem. 56, 531–540 (1991)), Arachidonsäurefreisetzungstests (siehe beispielsweise Felder et al., J. Biol. Chem. 264, 20356–20362 (1989)) und dergleichen.
Genauer gesagt umfasst ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Detektion eines Glutamatagonisten die Schritte aus (a) Exposition einer Verbindung gegenüber einem erfindungsgemäßen hmGluR Subtyp, der an einen Reaktionsweg gekuppelt ist unter Bedingungen und für eine Zeit, die eine Wechselwirkung der Verbindung mit dem Rezeptor und eine assoziierte Reaktion über den Signalweg erlaubt und (b) Detektion einer Erhöhung oder Verringerung der Stimulierung des Reaktionswegs, der aus der Wechselwirkung der Verbindung mit dem hmGluR Subtyp resultiert relativ zur Abwesenheit der getesteten Verbindung und hieraus Bestimmung der Anwesenheit eines Glutamatagonisten.
Ein Verfahren zur Identifizierung eines Glutamatantagonisten umfasst die Schritte aus (a) Exposition einer Verbindung in Gegenwart eines bekannten Glutamatagonisten gegenüber einem hmGluR Subtyp der Erfindung, der an einen Reaktionsweg gekuppelt ist, unter Bedingungen und für eine Zeit, die eine Wechselwirkung des Agonisten mit dem Rezeptor und eine assoziierte Reaktion über den Reaktionsweg erlaubt und (b) Detektion einer Hemmung der Stimulierung des Reaktionswegs durch den Agonisten, die aus einer Wechselwirkung der Testverbindung mit dem hmGluR Subtyp resultiert, relativ zur Stimulierung des Reaktionswegs, die durch den Glutamatagonisten alleine ausgelöst wird und hieraus Bestimmung der Anwesenheit eines Glutamatantagonisten. Die Hemmung kann beispielsweise detektiert werden, falls die Verbindung mit dem Glutamatagonisten für den erfindungsgemäßen hmGluR konkurriert. Die Verbindungen, die mittels solcher Verfahren gescreent werden können, sind blockierende Antikörper, die spezifisch an den hmGluR Subtyp binden. Ferner ist ein solcher Test zum Screening von Verbindungen brauchbar, die mit L-Glutamat wechselwirken, beispielsweise lösliche hmGluR Fragmente, die die gesamte Ligandenbindungsdomäne oder einen Teil hiervon umfassen.
Vorzugsweise zeigt die Wechselwirkung eines Agonisten oder eines Antagonisten mit einem hmGluR der Erfindung die Bindung des Agonisten oder Antagonisten an diesen hmGluR an.
Wie hierin verwendet variieren die Bedingungen und Zeiten, die zur Wechselwirkung eines Kandidaten für einen Glutamatagonisten oder Glutamatantagonisten mit dem Rezeptor ausreichend sind, mit der Quelle des Rezeptors, jedoch liegen die Bedingungen, die im allgemeinen zur Ausbildung der Bindung geeignet sind, zwischen etwa 4°C und etwa 40°C, vorzugsweise zwischen etwa 4°C und etwa 37°C in einer Pufferlösung zwischen 0 und 2 M NaCl, vorzugsweise zwischen 0 und 0,9 M NaCl, wobei 0,1 M NaCl besonders bevorzugt ist und innerhalb eines pH Bereichs von 5 bis 9, vorzugsweise zwischen 6,5 und 8. Ausreichend Zeit zur Bindung und Reaktion liegt im allgemeinen zwischen 1 ms und etwa 24 Stunden nach der Exposition.
Innerhalb einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Reaktionsweg ein membrangebundener Adenylatcyclaseweg und für einen Agonisten umfasst der Detektionsschritt die Messung der Reduktion oder Erhöhung, vorzugsweise der Reduktion der cAMP Bildung durch den membrangebundenen Adenylatcyclasereaktionsweg relativ zur cAMP Bildung in der relevanten Kontrollumgebung. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die Verringerung oder Erhöhung der cAMP Bildung gleich groß oder größer als die Verringerung oder Erhöhung ist, die durch L-Glutamat induziert wird, das mit einer seiner HK₅₀ entsprechenden Konzentration angewendet wird. Für einen Antagonisten umfasst der Detektionsschritt die Messung in Gegenwart des Antagonisten einer geringeren durch L-Glutamat induzierten Verringerung oder Erhöhung der cAMP Bildung durch den membrangebundenen Adenylatcyclasereaktionsweg im Vergleich zur cAMP Bildung in Abwesenheit des Antagonisten. Die Messung von cAMP kann nach der Zellzerstörung oder durch eine für cAMP empfindliche in die Zelle gebrachte Molekularsonde ausgeführt werden, wie ein Fluoreszenzfarbstoff, der bei der Bindung von cAMP seine Eigenschaften ändert, beispielsweise seine Fluoreszenzeigenschaften.
Die Bildung von cyclischem AMP kann mittels in der Technik gut bekannter Verfahren gemessen werden, einschließlich beispielsweise Verfahren, die von Nakajima et al., siehe obige Literaturstelle beschrieben sind oder mittels im Handel erhältlicher Kits, beispielsweise Kits, die radioaktiv markiertes cAMP enthalten, beispielsweise [¹²⁵I]cAMP oder [³H]cAMP. Beispielsgemäße Kits sind der Scintillation Proximity Assay Kit von Amersham, der die Bildung von cAMP durch die Kompetition von iodiertem cAMP mit cAMP Antikörpern misst oder der Cyclic AMP [³H] Assay Kit von Amersham.
In Testsystemen mittels Zellen, die Rezeptorsubtypen exprimieren, die negativ an den Adenylatcyclaseweg gekuppelt sind, das heißt eine Verringerung des cAMP nach einer Stimulierung und eine Erhöhung des cAMP nach einer Verringerung der Stimulierung verursachen, ist es bevorzugt, die Zellen vor der Zugabe des (potentiellen) Rezeptoragonisten oder Rezeptorantagonisten gegenüber einer Verbindung zu exponieren, die reversibel oder irreversibel die Adenylatcyclase hemmt, beispielsweise Forskolin oder ein Phosphodiesteraseinhibitor ist, wie Isobutylmethylxanthin (IBMX).
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der Reaktionsweg der PI Hydrolyse/Ca²⁺ Mobilisierungsweg. Ein solcher Test zur Bestimmung der spezifischen Wechselwirkung einer Testverbindung mit einem hmGluR Subtyp der Erfindung kann funktionell an Veränderungen in der intrazellulären Calciumionenkonzentration (Ca²⁺) gebunden sein. Es sind mehrere Verfahren zur Bestimmung der Veränderung in der intrazellulären Konzentration von Ca²⁺ in der Technik bekannt, beispielsweise ein Verfahren, das einen auf Calciumionen empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff umfasst, wie Fura-2 (siehe Grynkiewisz et al., J. Biol. Chem. 260, 3440–3450, 1985), Fluo-3 oder Indo-1, wie das Calcium-Fluor-QuinZ Verfahren, das von Charest et al. (J. Biol. Chem. 259, 8679–8773 (1993)) beschrieben ist oder das Aequorinphotoproteinverfahren, das von Nakajima-Shimada (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6878–6882 (1991)) beschrieben ist. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die intrazelluläre Calciumionenkonzentration durch Mikrofluorometrie in rekombinanten Zellen gemessen, die mit Calcium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen Fluo-3 oder Fura-2 beladen sind. Diese Messungen können mittels Zellen ausgeführt werden, die auf einem Deckglas angezogen wurden, was die Verwendung eines invertierten Mikroskops und Videobildaufzeichnungstechnologien oder eines Fluoreszenzphotometers erlaubt, um die Calciumkonzentrationen auf Einzelzellebene zu messen. Für beide Ansätze müssen die Zellen, die mit einem hmGluR exprimierenden Plasmid transformiert sind, mit dem Calciumindikator beladen werden. Am Ende wird das Wachstumsmedium von den Zellen entfernt und mit einer Lösung ersetzt, die Fura-2 oder Fluo-3 enthält. Die Zellen werden für Calciummessungen vorzugsweise während der folgenden 8 Stunden verwendet. Die Mikrofluometrie erfolgt nach Standardverfahren.
Die Ca²⁺ Signale, die aus der funktionellen Wechselwirkung der Verbindungen mit dem Zielmolekül resultieren, können transient sein, falls die Verbindung für eine begrenzte Zeitspanne angewendet wird, beispielsweise über ein Perfusionssystem. Mittels einer transienten Anwendung können mehrere Messungen mit denselben Zellen gemacht werden, was interne Kontrollen und eine große Anzahl an getesteten Verbindungen erlaubt.
Die funktionelle Kupplung eines erfindungsgemäßen hmGluR an die Ca²⁺ Signalkette kann beispielsweise in CHO Zellen durch verschiedene Verfahren erreicht werden

(i) Coexpression eines rekombinanten hmGluR der Erfindung und eines rekombinanten, spannungsgesteuerten Kationenkanals, dessen Aktivität funktionell an die Aktivität des hmGluR gekuppelt ist,
(ii) Expression eines chimären hmGluR Rezeptors, der direkt den PI/Ca²⁺ Signalweg stimuliert,
(iii) Coexpression eines rekombinanten hmGluR der Erfindung mit einem rekombinanten, Ca²⁺-permeablen cAMP abhängigen Kationenkanal.

In anderen Expressionssystemen kann die funktionelle Kupplung eines hmGluR an die Ca²⁺ Signalkette durch die Transfektion eines hmGluR der Erfindung erreicht werden, falls diese Zellen natürlicherweise exprimieren (i) spannungsgesteuerte Ca-Kanäle, deren Aktivität funktionell an die Aktivität von mGluRs gekuppelt ist oder (ii) Ca²⁺-permeable cAMP abhängige Ionenkanäle. Beispielsweise erlauben GH3 Zellen, die natürlicherweise spannungsgesteuerte Ca-Kanäle exprimieren, direkt die Anwendung von Ca²⁺ Tests, um auf die funktionelle Aktivität von hmGluR durch die Cotransfektion von hmGluRs zu testen.
Ferner können Zell-basierte Screeningtests beispielsweise durch die Konstruktion von Zelllinien entworfen werden, worin die Expression eines Reporterproteins, das heißt eines leicht zu testenden Proteins, wie β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) oder Luciferase, von der Funktion eines erfindungsgemäßen hmGluR abhängt. Beispielsweise ist ein DNA Konstrukt, das ein cAMP Reaktionselement enthält, operativ an eine DNA gekuppelt, die für Luciferase kodiert. Das entstehende DNA Konstrukt, das die Enzym-DNA enthält, wird stabil in eine Wirtszelle transfiziert. Die Wirtszelle wird dann mit einem zweiten DNA Konstrukt transfiziert, das ein erstes DNA Segment enthält, welches für einen erfindungsgemäßen hmGluR kodiert, das operativ an zusätzliche DNA Segmente gebunden ist, die zur Expression des Rezeptors erforderlich sind. Falls beispielsweise die Bindung einer Testverbindung an den erfindungsgemäßen hmGluR zu erhöhten cAMP Spiegeln führt, wird die Expression der Luciferase in Abhängigkeit des gewählten Promotors induziert oder verringert. Die Luciferase wird gegenüber Luciferin exponiert und die während der Oxidation des Luciferins emittierten Photonen werden gemessen.
Die hierin bereitgestellten Arzneimittelscreeningtests ermöglichen die Identifizierung und die Konstruktion von Rezeptorsubtyp-spezifischen Verbindungen, insbesondere von Liganden, die das Rezeptorprotein binden, was eventuell zur Entwicklung eines für eine Erkrankung spezifischen Arzneimittels führt. Falls es für eine sehr spezifische Wechselwirkung mit nur einem bestimmten hmGluR Subtyp (oder einer vorbestimmten Selektion von hmGluR Subtypen) entworfen wurde, dürfte ein solches Arzneimittel weniger unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen, als ein Arzneimittel, das durch das Screening mit Zellen identifiziert wurde, die eine (unbekannte) Anzahl an Rezeptorsubtypen exprimieren. Ebenfalls liefert das Testen eines einzelnen Rezeptorsubtyps der Erfindung oder spezifischer Kombinationen an unterschiedlichen Rezeptorsubtypen mit einer Vielzahl an potentiellen Agonisten oder Antagonisten zusätzliche Information in Bezug auf die Funktion und die Aktivität der einzelnen Subtypen und sollte zur Identifizierung und der Konstruktion von Verbindungen führen, die zur sehr spezifischen Wechselwirkung mit einem oder mehreren Rezeptorsubtypen fähig sind.
In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung polyklonale und monoklonale Antikörper, die gegen einen erfindungsgemäßen hmGluR Subtyp erzeugt wurden. Solche Antikörper können beispielsweise für Immuntests brauchbar sein, die Immunhistochemie wie auch diagnostische und therapeutische Anwendungen umfassen. Beispielsweise können Antikörper, die für die extrazelluläre Domäne eines bestimmten hmGluR Subtyps oder Teile hiervon spezifisch sind, zur Blockierung des endogenen hmGluR Subtyps angewendet werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Verfahren hergestellt werden, die in der Technik gut bekannt sind, wobei ein Antigen eines erfindungsgemäßen hmGluR Subtyps oder ein Fragment hiervon oder eine Zelle, die diesen Subtyp oder das Fragment exprimiert, verwendet werden. Das Antigen kann die aktive oder inaktive Form des erfindungsgemäßen Rezeptors darstellen. Die Antikörper können zur Unterscheidung zwischen der aktiven und der inaktiven Form fähig sein. Faktoren, die bei der Auswahl der Subtypfragmente als Antigene (entweder als synthetisches Peptid oder als Fusionsprotein) zu berücksichtigen sind, umfassen Antigenität, Zugänglichkeit (das heißt extrazelluläre und cytoplasmatische Domänen) und Einzigartigkeit für den bestimmten Subtyp.
Besonders brauchbar sind Antikörper, die selektiv die Rezeptorsubtypen der oben beschriebenen Unterfamilie erkennen und binden, ohne an einen Subtyp einer anderen Unterfamilie zu binden und Antikörper, die selektiv einen bestimmten Subtyp ohne der Bindung an einen anderen Subtyp erkennen und binden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können einem behandlungsbedürftigen Patienten unter Verwendung von in der Technik bekannten Standardverfahren verabreicht werden. Der Fachmann kann leicht Dosierungsformen, Behandlungspläne usw. in Abhängigkeit der Art der verwendeten Verabreichung bestimmen.
Die Erfindung betrifft insbesondere die spezifischen Ausführungsformen, wie sie in den Beispielen beschrieben sind, die zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung dienen, sollten aber nicht als Beschränkungen hiervon aufgefasst werden.
Abkürzungen: hmGluR = humaner metabotroper Glutamatrezeptor, nt = Nukleotid.
Referenzbeispiel 1: cDNA, die für hmGluR4 kodiert
Humane mGluR4 cDNA Klone werden aus humanem, fetalem Gehirn und humanen Cerebellum cDNA Genbanken durch Hybridisierung mit geringer Stringenz mittels einer radioaktiv markierten mGluR4 Rattensonde isoliert, die durch PCR aus Rattenhirn cDNA isoliert wurde.
1.1. Herstellung von Poly(A)⁺ RNA aus dem Rattengroßhirn
Erwachsene, männliche Sprague-Dawley Ratten werden durch Erstickung getötet, ihr Großhirn wird entfernt und unmittelbar in flüssigem N₂ eingefroren. Die Gesamt-RNA wird mittels des Guanidiniumthiocyanatverfahrens (Chromczynski und Sacchi (1987), Anal. Biochem. 162, 156–159) isoliert. Eine Anreicherung von Poly(A)⁺ RNA wird durch eine Affinitätschromatographie auf Oligo(dt)-Cellulose gemäß den Standardverfahren erreicht (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA).
1.2. cDNA Erststrangsynthese für PCR
Poly(A)⁺ RNA (mRNA) wird revers in DNA durch die Moloney Murine Leukämie Virus Reverse Transkriptase (M-MLV RT, BRL) transkribiert. 50 μl Reaktionen werden wie folgt angesetzt: 10 μg der Rattengroßhirn Poly(A)⁺ RNA in 10 μl sterilem H₂O werden für 10 Minuten auf 70°C erhitzt und dann schnell auf Eis gekühlt. Dann werden 10 μl 5 × Reaktionspuffer (250 mM Tris-HCl pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2t), 5 μl 0,1 M Dithiothreit, 5 μl gemischte dNTP (10 mM jeweils von dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Pharmacia), 1,25 μl Oligo-dT_12–18 (2 mg/ml, Pharmacia), 2,5 μl RNAsin (40 E/μl, Promega), 12,25 μl steriles H₂O und 4 μl (200 E/μl) M-MLV RT zugegeben. Die Reaktion wird bei 37°C für 60 Minuten ausgeführt.
1.3 PCR Bedingungen zur Erzeugung des mGluR4 Rattenfragments
Die für die PCR verwendeten Oligodesoxynukleotidprimer werden durch das Phosphoramiditverfahren synthetisiert. Die Sequenzen sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle I

P1: 5'-GTCAAGGCCTCGGGCCGGGA-3' entsprechen den Basenpaaren 1921–1940 der mGluR4 cDNA der Ratte (Tanabe et al., (1992), Neuron 8, 169–179)
P2: 5'-CTAGATGGCATGGTTGGTGTA-3' entsprechen den Basenpaaren 2788–2808 der mGluR4 cDNA der Ratte (Tanabe et al., (1992), Neuron 8, 169–179)

Die PCR Standardbedingungen für ein 100 μl Reaktionsgemisch sind: 30 ng Rattengroßhirn cDNA, 50 pmol von jedem der Primer P1 und P2, jeweils 200 μmol der vier Desoxynukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 10% DMSO in PCR-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,05% Tween (G/V), 0,05% NP-40 (G(V)) und 0,5 E AmpliTaq Polymerase (Perkin Elmer Cetus). Die Amplifikation wird mittels der folgenden Bedingungen ausgeführt: 30 Sekunden Denaturierung bei 93°C, 1 Minute 30 Sekunden Anellierung bei 56°C und 3 Minuten Verlängerung bei 72°C für insgesamt 40 Zyklen. Die anfängliche Denaturierung wird für 4 Minuten bei 94°C ausgeführt.
1.4 Subklonierung des mGluR4 PCR Fragments aus der Ratte
Restriktionsendonukleaseverdaus, die Verwendung von modifizierenden Enzymen, Vektorpräparation (Dephosphorylierung, Gelreinigung), Ligationen, Transformation von E. coli und Plasmid-DNA-Präparationen werden gemäß Standardverfahren ausgeführt (Sambrook et al., (1989), siehe obige Literaturstelle).
Das gemäß dem in 1.3 beschriebenen Verfahren erhaltene PCR Fragment (888 bp) wird in die SmaI Schnittstelle des Blueskript SK⁺ Plasmids (Stratagene, La Jolla, USA) ligiert. Das in den Blueskriptvektor inserierte Fragment wird von beiden Enden mittels T7 und T3 Primern (Strategene, La Jolla, USA) sequenziert.
1.5. Herstellung einer radioaktiv markierten Sonde
20–50 ng des durch PCR erzeugten mGluR4 Fragments der Ratte werden im Gel gereinigt und durch zufälliges Primen mittels eines DNA Labeling Kits (Boehringer Mannheim) ³²P-markiert.
1.6 cDNA Genbankscreening
Etwa 1 × 10⁶ Phagen von einer humanen fetalen Gehirngenbank (λZAP II, Stratagene, La Jolla, USA), einer cDNA Bank aus dem humanen Hippocampus (λZAP, Stratagene, La Jolla, USA) und aus dem humanen Cerebellum (λZAP, Stratagene) werden auf eine Hybridisierung mit dem mGluR4 Fragment der Ratte gescreent. Die Hybridisierung wird in 5 × SSC, 0,02% (G/V) Ficoll (Typ 400), 0,02% (G/V) Polyvinylpyrrolidon, 0,1% (G/V) SDS, 50 μg/ml Herring Testis DNA ausgeführt. Die Prähybridisierung wird zwischen 30 Minuten bis 3 Stunden bei 58°C ausgeführt. Die Hybridisierung wird bei einer geringen Stringenz bei 58°C über Nacht in derselben Lösung ausgeführt, die das ³²P-markierte Fragment in einer Konzentration von 1–3 × 10⁵ cpm/ml enthält. Die Waschschritte werden dreimal für 20 Minuten bei jeweils 58°C in 2 × SSC/0,1% SDS ausgeführt.
Phagen, die mit der mGluR4 Rattensonde hybridisieren, werden durch eine zweite und dritte Screeningrunde unter den oben beschriebenen Bedingungen gereinigt. Die cDNA Inserts, die die gereinigten Phagen enthalten, werden durch in vivo Exzision mittels des ExAssist/SOLR Systems (Strategene, La Jolla, USA) gewonnen.
1.7 Charakterisierung der isolierten cDNA Klone
Es werden mehrere cDNA Inserts durch Restriktionsenzymkartierung und DNA Sequenzanalyse charakterisiert. Einer dieser Klone, nämlich cDNA cmR20 (aus der humanen Cerebellumgenbank isoliert) enthält ein Insert mit etwa 3,3 kb. Die Sequenzanalyse von cmR20 zeigt an, dass er fast die gesamte kodierende Region des humanen mGluR4 einschließlich eines Translationsterminationscodons (Nukleotide 158 bis 2739, siehe SEQ ID Nr. 1) wie auch etwa 750 nt der 3'-untranslatierten Region enthält. Das 5'-Ende einschließlich des Translationsstartcodons fehlt.
1.8 Isolierung des 5'-Endes des humanen mGluR4
Um die kodierende Region des humanen mGluR4 zu vervollständigen, werden PCR Reaktionen mittels humaner, genomischer DNA oder Erststrang-cDNA der humanen Gehirn-RNA als Matrize ausgeführt. Der Sinnprimer P3 entspricht dem 5'-Ende der mGluR4 cDNA der Ratte, der Antisinnprimer P4 entspricht den Nukleotiden 440–459 der mGluR4 cDNA der Ratte.
Tabelle 2

P3: 5'-GCGCTGCAGGCGGCCGCAGGGCCTGCTAGGGCTAGGAGCGGGGC-3' entspricht den Nuleotiden 11–37 der mGluR4 cDNA der Ratte (Tanabe, et al., (1992), Neuron 8, 169–179)
P4: 5'-GCGGAATTCCCTCCGTGCCGTCCTTCTCG-3' entspricht den Nuleotiden 440–459 der mGluR4 cDNA der Ratte (Tanabe, et al., (1992), Neuron 8, 169–179)

Zusätzliche Sequenzen sind unterstrichen, Restriktionsenyzme sind in Fettdruck angegeben.
Die PCR Reaktionen für ein 100 μl Reaktionsgemisch sind: 400 ng der humanen, genomischen DNA, 1 μM jedes Primers, 2 mM jedes Desoxynukleosidtriphosphats (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) in PCR Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl und 2 E AmpliTaq Polymerase. Die Amplifizierung wird unter Verwendung der folgenden Bedingungen ausgeführt; 1 Minute Denaturierung bei 95°C, 1 Minute Anellierung bei 56°C und 1 Minute Verlängerung bei 72°C für insgesamt 32 Zyklen. Die anfängliche Denaturierung wird für 3 Minuten bei 94°C ausgeführt.
Die Produkte von mehreren unabhängigen PCRs werden mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI verdaut, im Gel gereinigt und in die PstI/EcoRI Schnittstellen von Bluescript SK (Stratagene) ligiert. Subklonierte Fragmente von verschiedenen unabhängigen PCRs werden durch DNA Sequenzanalyse (cP4PGR1-4) analysiert. Eine Sequenzanalyse zeigt, dass der Klon cR4PCR2 380 Nukleotide der für hmGluR4 kodierenden Region einschließlich des Translationsinitiationscodons enthält (Nukleotide 1–380, siehe SEQ ID Nr. 1). cR4PCR2 überlappt am 3' Ende um 223 nt mit cmR20.
Die vollständige abgeleitete Aminosäuresequenz des hmGluR4 Proteins ist in SEQ ID Nr. 2 gezeigt.
Beispiel 2: cDNA Klone, die für hmGluR7 kodieren
Das Screening der humanen fetalen Gehirn- und humanen Cerebellum cDNA Genbanken durch eine Hybridisierung mit geringer Stringenz unter Verwendung des radioaktiv markierten mGluR Fragments der Ratte (wie dies in 1.5 und 1.6 beschrieben ist) erlaubt die Isolierung von cDNA Klonen, die den humanen metabotropen Glutamatrezeptorsubtyp mGluR7 identifizieren. Die Charakterisierung der cDNA Klone durch DNA Sequenzanalyse zeigt, dass die isolierten cDNAs zumindest zwei scheinbare Spleißvarianten der humanen mGluR7 mRNA darstellen.
Die cDNA cmR2 (isoliert aus der humanen, fetalen Gehirn-cDNA-Genbank) hat eine Größe von 3804 nt. Der Klon cmR2 enthält 2604 nt aus der für hmGluR7 kodierenden Sequenz, einschließlich eines Translationsterminationscodons, gefolgt von 1200 nt an 3'-untranslatierter Sequenz (siehe SEQ ID Nr. 3).
Die cDNA cmR3 (isoliert aus der humanen Hippocampus cDNA Genbank) hat eine Größe von 1399 nt (SEQ ID Nr. 5). Die cDNA cmR3 enthält 270 nt der für hmGluR7 am 3'-Ende kodierenden Region, einschließlich eines Translationsstopcodons (die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 6 gezeigt), wonach 1129 nt der 3'-untranslatierten Sequenz folgen. Die Sequenz von cmR3 ist vollständig in cmR2 enthalten, unterscheidet sich aber von cmR2 durch die Deletion von 92 Nukleotiden, die sich vom nt an der Position 2534 bis zum nt an der Position 2625 in SEQ ID Nr. 3 erstrecken. Diese scheinbare Spleißvariante von hmGluR7 erzeugt ein unterschiedliches 3'-Ende der abgeleiteten hmGluR7 Aminosäuresequenz.
Die cDNA cmR5 (isoliert aus der humanen, fetalen Gehirn cDNA Genbank) hat eine Größe von 1588 nt (SEQ ID Nr. 7). Die cDNA cmR5 überlappt um 1424 nt mit der cDNA cmR2. Sie unterscheidet sich am 3'-Ende exakt an der Position der 92 nt Insertion/Deletion von cmR2/cmR3. Zusätzliche 164 nt von cmR5 kodieren entweder für Intronsequenzen, wie dies durch das Vorkommen einer konservierten Spleißdonorsequenz unmittelbar nach der Stelle des cmR5 und cmR2/cmR3 Sequenzunterschieds gezeigt ist oder repräsentieren eine dritte Spleißvariante.
Das 5'-Ende der kodierenden Region der hmGluR7 DNA, das in den cDNA Klonen cmR2, cmR3 und cmR5 fehlt, wird durch eine Kombination aus genomischem Genbankscreening und PCR Techniken isoliert. Eine genomische Lambda-Fix Genbank (Stratagene) wird mit einem EcoRI/SmaI Restriktionsfragment, das die Nukleotide 1–1304 der cDNA cmR2 enthält, unter Hybridisierungsbedingungen mit hoher Stringenz gescreent, wie dies in Sambrook et al., (1989), obige Literaturstelle beschrieben ist. Lambdaklone, die an das 5'-Ende des cDNA Klons cmR2 hybridisieren, werden gereinigt und durch Restriktionsanalysen und DNA Sequenzierung analysiert. Das vollständige 5'-Ende der kodierenden Region des humanen mGluR7, einschließlich des ATG Translationsinitiationscodons, wird durch PCR aus humaner Gehirn-DNA mittels Primersequenzen amplifiziert, die aus klonierten genomischen Fragmenten stammen. Das PCR Fragment hat eine Größe von 557 nt. Es wird als cR7PCR1 bezeichnet und ist als SEQ ID Nr. 9 dargestellt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 10 beschrieben. cR7PCR1 überlappt am 3'-Ende mit cmR2 um 392 nt.
Die DNA Sequenzen, die für die vollständigen hmGluR7a und b Proteine kodieren, sind jeweils in SEQ ID Nr. 11 und 13 dargestellt. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind jeweils in SEQ ID Nr. 12 und 14 dargestellt. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminsäuresequenzen zeigt etwa 70% Sequenzidentität zu dem hmGluR4 Subtyp von Beispiel 1.
Referenzbeispiel 3: cDNA, die partiell hmGluR6 kodiert
Ein einzelner cDNA Klon, nämlich cmR1, mit einem Insert von 1,0 kb wird aus einer humanen Hippocampusgenbank durch Hybridisierung mit niedriger Stringenz unter Verwendung des hmGluR Fragments isoliert, wie dies oben in Beispiel 1.5 und 1.6 beschrieben ist. Etwa 630 Nukleotide sind zum humanen mGluR4 homolog. Zusätzliche Sequenzen am 5'- und 3'-Ende von cmR1 kodieren scheinbar Intronsequenzen, wie dies durch das Vorkommen von putativen Spleißdonor- und Spleißakzeptorsequenzen angedeutet wird. Die cDNA cmR1 identifiziert einen Teil des humanen metabotropen Glutamatrezeptorsubtyps hmGluR6 (SEQ ID Nr. 15). Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 16 gezeigt.
Die vollständige kodierende Region von hmGluR6 wird durch Screenen der cDNA und genomischen Genbanken unter Bedingungen mit hoher Stringenz unter Verwendung von cDNA cmR1 als Sonde isoliert. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigt etwa 70% Sequenzidentität zu hmGluR4 von Beispiel 1.
Beispiel 4: Expression von hmGluR cDNAs in Säugerzellen
4.1 Rezeptorexpressionsplasmide
cDNAs, die für die obigen hmGluR4, hmGluR6 und hmGluR7 Volllängenproteine kodieren, werden aus cDNA Fragmenten erzeugt und in Säugerexpressionsvektoren ligiert, die auf konstitutiven Promotoren (CMV, SV40, RSV) oder induzierbaren Promotoren basieren. Beispiele sind pBK-CMV (Stratagene), pBK-RSV (Stratagene), pCMV-T7 (Sibia, Inc.) und pICP4 (Novagen, USA).
Die Volllängen cDNA, die für den hmGluR4 Subtyp kodiert, wird in den Säugerexpressionsvektor pBK-CMV durch die Ligation des hmGluR4 Fragments vom 5'-Ende (Klon cR4PCR2) mit der cDNA cmR20 an der XhoI Einzelschnittstelle eingebaut, die bei Nukleotid 346–351 der hmGluR4 cDNA liegt. Genauer gesagt wird das Plasmid pBK-CMV-hmGluR4 durch eine Dreierligation des NotI/XhoI Fragments von cR4PCR2, des XhoI/NotI Fragments der cDNA cmR20 und des mit NotI verdauten Vektors pBK-CMV erzeugt. Das Plasmid pCMV-T7-hmGluR4 wird durch die Dreierligation des PstI/XhoI Fragments von cR4PCR4, des XhoI/EcoRI Fragments von cmR20 und des mit PstI/EcoRI verdauten Vektors pCMV-T7-2 erzeugt. Beide Expressionskonstrukte enthalten die vollständige kodierende Region von hmGluR4, wie auch etwa 750 nt der 3'-untranslatierten Sequenzen.
Die Volllängen cDNAs, die die zwei hmGluR7 Spleißvarianten darstellen, die als hmGluR7a (SEQ ID Nr. 12) und hmGluR7b (SEQ ID Nr. 14) bezeichnet werden, werden in pCMV-T7-2 (SIBIA Inc.) unter Verwendung der überlappenden cDNA Klone cmR2, cmR3 und hcR7PCR1 eingebaut. Ein hmGluR7b Volllängenexpressionskonstrukt, das als pCMV-T7-hmGluR7b bezeichnet wird, wird durch eine Dreierligation des PstI/BsaI Fragments von hcR7PCR1, des BSAI/EagI Fragments von cmR2 und des PstI/NotI Fragments von pCMV-T7-2 hergestellt. Das Plasmid pCMV-T7-hmGluR7b enthält die vollständige kodierende Region von hmGluR7b und 191 nt der 3'-untranslatierten Sequenzen. Zur Konstruktion eines Vollängen-hmGluR7a Expressionskonstrukts, das als pCMV-T7-hmGluR7a bezeichnet wird, wird ein 370 bp HindIII/EagI Fragment von cmR2 gegen das entsprechende Fragment von cmR3 ausgetauscht. Das BsaI/EagI Fragment des entstehenden Klons wird für eine Dreierligation verwendet, wie dies oben beschrieben ist.
Das Plasmid pBK-CMV-hmGluR6 wird analog mittels herkömmlicher Techniken erzeugt (Sambrook et al., siehe obige Literaturstelle).
4.2 Transfektion von Säugerzellen
Säugerzellen (beispielsweise CHO-K1, GH3, American Tissue Type Culture Collection) werden zum Wachstum in Glutamat-freiem Medium angepasst (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, dem L-Glutamat fehlt und das eine verringerte Konzentration an 2 mM L-Glutamin enthält und mit 0,046 mg/ml Prolin und 10% dialysiertem, fetalem Rinderserum versetzt ist, Gibco-BRL). HmGluR Expressionsplasmide werden transient in die Zellen durch Calciumphosphatfällung transfiziert (F. M. Ausubel et al., (1993), Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, USA).
Die stabil hmGluRs exprimierenden Zelllinien werden durch eine Lipofectin-vermittelte Transfektion (Gibco-BRL) von CHO-K1 Zellen mit hmGluR Expressionsplasmiden und pSV2-Neo erzeugt (Southern und Berg, 1982), einem Plasmidvektor, der das G 418 Resistenzgen kodiert. Die Zellen werden für 48 Stunden angezogen, bevor 1 mg/ml G 418 Sulfat (Geneticin, Gibco) zugegeben wird. Das Medium wird alle zwei bis drei Tage ersetzt. Die die G 418 Selektion überlebenden Zellen werden isoliert und im Selektionsmedium angezogen. 32 G-418 resistente klonale Zelllinien werden 6 bis 8 Wochen nach der anfänglichen Transfektion auf hmGluR Proteinexpression durch eine Immunreaktivität mit dem anti-hmGluR7 Antikörper (Immundetektion siehe später 4.3) und funktionellen Reaktionen nach einer Agonistzugabe über einen cAMP Radioimmuntest (siehe später 5.1) getestet.
Ähnlich werden die hmGluR Expressionskonstrukte pBK-CMV-hm-GluR4, pCMV-T7-hmGluR4, pCMV-T7-hmGluR7b und pCMV-T7-hmGluR7a transient und stabil in Säugerzellen (CV1, CHO, HEK293, COS) gemäß Standardverfahren exprimiert (F. M. Ausubel et al., (1993), Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, USA). Die transfizierten Zellen werden durch verschiedene Tests auf die hmGluR Expression analysiert: [³H]-Glutamatbindungsstudien, Immuncytochemie mittels hmGluR Subtyp-spezifischer Antikörper und Tests, die eine Veränderung in der intrazellulären Konzentration von cAMP ([cAMP]) detektieren.
4.3 Immundetektion von hmGluR Proteinexpression mit Subtyp-spezifischen hmGluR Antikörpern
Die hmGluR Proteinexpression wird durch Immuncytochemie mit Subtyp-spezifischen hmGluR Antikörpern analysiert (siehe Beispiel 7). Ein bis drei Tage nach der Transfektion werden die Zellen zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, mit PBS/4% Paraformaldehyd für 10 Minuten fixiert und mit PBS gewaschen. Die Zellen werden mit PBS/0,4% Triton X-100 permeabili siert, wonach ein Waschschritt mit PBS/10 mM Glycin und PBS erfolgt. Die Zellen werden mit PBSTB (1 × PBS/0,1% Triton X-100/1% BSA) für 1 Stunde blockiert und dann anschließend mit immungereinigtem hmGluR Antiserum (0,5–2,0 μg/ml in PBSTB) für 1 Stunde inkubiert. Nach drei Waschschritten mit PBS werden die Zellen für 1 Stunde mit alkalischer Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG (1 : 200 in PBSTB, Jackson Immuno Research) inkubiert. Die Zellen werden dreimal mit PBS gewaschen und die Immunreaktivität wird mit 0,4 mg/ml Naphtholphosphat (Biorad)/1 mg/ml Fast red (Biorad)/10 mM Levamisol (Sigma)/100 mM Tris/HCl pH 8,8/100 mM NaCl/50 mM MgCl₂ detektiert. Die Färbereaktion wird nach 15 Minuten durch anschließendes Waschen mit PBS gestoppt. 2 bis 4 Zelllinien, die jeweils homolog hmGluR4, hmGluR6 oder hmGluR7 exprimieren, werden durch Immunfärbung identifiziert.
Beispiel 5: Verwendung von stabilen Zelllinien die hmGluRs für das Screening von Modulatoren der Rezeptoraktivität exprimieren
Es werden stabile Zelllinien, die hmGluR4, hmGluR6 und hmGluR7 exprimieren, zum Screening auf Agonisten, Antagonisten und allosterische Modulatoren verwendet. Solche Verbindungen werden durch die Bindungsstudien identifiziert, die [³H]-Glutamat verwenden und/oder Messungen der Veränderungen der intrazellulären Botenstoffmengen ([cAMP, [Ca²⁺]).
5.1 cAMP Radioimmuntest
Die Ligandenbindung und die durch Agonisten induzierte Depression der durch Forskolin stimulierten cAMP Akkumulation (Veränderungen in der intrazellulären cAMP Konzentration) werden durch cAMP Radioimmuntest (Amersham) analysiert. Die Zellen werden in Platten mit 12 Vertiefungen mit einer Dichte von 0,5–2,0 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung angeimpft und für 2 bis 4 Tage angezogen, bis man eine konfluente Lage an Zellen erhält. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen und für 20 Minuten in PBS inkubiert, worin 1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) enthalten ist. Die Zellen werden für 20 Minuten mit frischem PBS inkubiert, worin 10 μM Forskolin, 1 mM IBMX und ein bekannter hmGluR Agonist enthalten sind. Der agonistische Effekt wird gestoppt und das durch die Zellen gebildete cAMP wird durch die Zugabe von 1 ml an Ethanol-Wasser-HCl Gemisch (100 ml Ethanol, 50 ml Wasser, 1 ml 1 M HCl) freigesetzt, nachdem das Arzneimittel-enthaltende Medium abgesaugt wurde. Die cAMP Mengen werden durch einen cAMP Radioimmuntest bestimmt, worin [³H] cAMP (Amersham) enthalten ist.
Die hmGluR Subtypen 4, 6 und 7 werden negativ an die Adenylatcyclase gekuppelt, wenn sie in CHO Zellen exprimiert werden. Eine Agonistenbindung führt zu einer Hemmung der durch Forskolin induzierten cAMP Akkumulation. Alle Subtypen sind AP-4 sensitiv, was bedeutet, dass AP4 einen Agonisteneffekt in einer Konzentration von weniger als 1 mM hat.
5.2 Messung des intrazellulären [Ca²⁺]
Zellen, die mit einem der obigen Expressionsplasmide transformiert sind, werden mit einem Calcium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff beladen, wie Fura-2 oder Fluoro-3. Um dies zu erreichen, werden die Zellen in einzelne Vertiefungen, wobei die einzelnen Vertiefungen ein Deckgläschen aufweisen, oder in Platten mit 96 Vertiefungen plattiert und für 1 bis 5 Tage angezogen, bis eine 50–100% konfluente Zelllage erhalten wird. Die Zellen werden dreimal mit einer Balancesalzlösung (BBS) gewaschen und für 1 Stunde in BBS inkubiert, wonach 3 zusätzliche Waschschritte mit BBS erfolgen. Dann werden die Zellen für 20 bis 60 Minuten in einer Lösung inkubiert, die 50 μg Fura-2-AM (oder Fluoro-3-AM) (Molecular Probes, Inc.), 4,99 ml BBS, 75 μl DMSO und 6,25 μg Pluronic (Molecular Probes, Inc.) enthält. Die Zellen werden dreimal mit BBS gewaschen, worin 2 mg/ml Rinderalbumin enthalten sind, wonach drei Waschschritte in BBS erfolgen. Nach der Erholung der Zellen für mindestens 10 Minuten werden sie für mikrofluorometrische Messungen von [Ca²⁺] verwendet.
Die Zellen werden in ein Gerät für eine Fluorometrie überführt, wie ein invertiertes Mikroskop und ein Spektrofluorometer eines Fluoreszenzmessgeräts. Die Fluoreszenz des Calciumindikators (beispielsweise Fura-2 oder Fluo-3) wird durch Beleuchtung mit Licht einer Wellenlänge induziert, die das Anregungsspektrum des Farbstoffs abdeckt (Fura 2: 340/380 nm, Fluo-3: 480 nm). Eine Zunahme der intrazellulären Konzentration an freien Calciumionen wird jeweils als Zunahme der Fluoreszenz von Fura-2 oder Fluo-3 gemessen, die jeweils bei 340 nm und 480 nm angeregt wird oder durch eine Abnahme der Fura-2 Fluoreszenz, die bei 380 nm angeregt wird.
Als Positivkontrolle wird L-Glutamat in einer Konzentration angewendet, die dem EK₅₀ Wert auf die Zellen entspricht, wobei eine messbare Zunahme der intrazellulären Calciumionenkonzentration induziert wird. Eine Testverbindung ist ein Agonist, falls sie ein Ca²⁺ Signal induziert, das mit dem vergleichbar ist, das durch Glutamat induziert wird. Eine Testverbindung ist ein Antagonist, falls das durch Glutamat induzierte Calciumsignal in Gegenwart der Testverbindung kleiner ist, als in Abwesenheit der Testverbindung.
Beispiel 6: Chimäre hmGluR4, 6 und 7 Rezeptoren
Intrazelluläre Domänen von mGluR1, insbesondere die zweite intrazelluläre Schlaufe (i2) und die C-terminale Region, sind für die Bindung von G-Proteinen entscheidend, die den Phospholipase C/Ca²⁺ Signalweg aktivieren, ohne das pharmakologische Profil des Rezeptors zu verändern (Pin et al., EMBO J. 13, 342–348 (1994)). Herkömmliche PCR Mutagenesetechniken werden zum Austausch der intrazellulären Domänen der hmGluR 4, 6 und 7 gegen die entsprechenden Domänen von hmGluR1 verwendet. Es werden stabile CHO Zelllinien mit chimären hmGluR4/1, 6/1 und 7/1 Expressionskonstrukten erzeugt, wobei die Analyse des Einflusses von Modulatoren der Rezeptoraktivität (hmGluR 4, 6 und 7) mittels Ca²⁺-abhängiger Tests ermöglicht wird. Im folgenden wird die Erzeugung eines chimären hmGluR7/1 Rezeptors beschrieben. Die Expressionskonstrukte mit chimären hmGluR4/1 und hmGluR6/1 werden mittels analoger Klonierungs- und PCR-Techniken erzeugt.

(i) Das Expressionskonstrukt pCMV-hmGluR7b wird mit EagI verdaut, wobei das vollständige cDNA Insert freigesetzt wird. Die cDNA wird in die NotI Schnittstelle von Bluescript-NotI kloniert, einem Derivat von pBluescript II (Stratagene), worin die Polylinkersequenzen zwischen den KpnI und NotI Einzelschnittstellen deletiert sind. Der entstehende Klon wird als pBluescript-Not-hmGluR7 bezeichnet.
(ii) Die Transmembranregion von hmGluR1 wird durch PCR unter Verwendung von Primern kloniert, die von Masu et al., 1991, siehe obige Literaturstelle stammen. Das Oligonukleotid mit der Sequenz 5'-TATCTTGAGTGGAGTGACATAG-3' (entspricht den nt 1753 bis 1774 der Masu-Sequenz) wird als Sinnprimer verwendet. Der Antisinnprimer hat die Sequenz 5'-ACTGCGGACGTTCCTCTCAGG-3' und entspricht den Nukleotiden 2524 bis 2544 der Masu-Sequenz. Das C-terminate Ende der Spleißvarianten 1a, 1b und 1c wird durch PCR mittels Primern abgespalten, die jeweils von Masu et al., 1991, Tanabe et al., 1992, siehe obige Literaturstellen und Pin et al., 1992 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10331–10335 (1992)) stammen. Das Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz 5'-AAACCTGAGAGGAACGTCCGCAG-3' (das den Nukleotiden 2521 bis 2543 der Masu-Sequenz entspricht) wird als Sinnprimer verwendet. Die Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen 5'-CTACAGGGTGGAAGAGCTTTGCTT-3', die den Nukleotiden 3577 bis 3600 der Masu-Sequenz entspricht, 5'-TCAAAGCTGCGCATGTGCCGACGG-3', die den Nukleotiden 2698 bis 2721 der Tanabe-Sequenz entspricht, und 5'-TCAATAGACAGTGTTTTGGCGGTC-3', die den Nukleotiden 2671 bis 2694 der Pin-Sequenz entspricht, werden als Antisinnprimer jeweils für hmGluR1a, 1b und 1c verwendet. Das PCR Fragment wird in pBluescript II kloniert und vollständig sequenziert.
(iii) Ein chimäres cDNA Fragment, worin die i2 Schlaufe von hmGluR7a oder hmGluR7b (jeweils Nukleotide 2035 bis 2106 der SEQ ID Nr. 11 und 13) durch die entsprechenden Sequenzen von hmGluR1 ersetzt ist, wird durch PCR erzeugt (wie dies in Pin et al., 1994, siehe obige Literaturstelle beschrieben ist). Das Fragment wird mit SmaI und BglII verdaut, die an Einzelschnittstellen schneiden, welche die i2-Schlaufe flankieren. Das chimäre SmaI/BglII Fragment wird gegen die SmaI/BglII Fragmente von pBluescript-NotI-mGluR7 ausgetauscht.
(iv) Ein zusätzlicher Austausch der C-terminalen Domäne von hmGluR7b oder hmGluR7a durch die entsprechenden Sequenzen der oben erwähnten hmGluR1 Spleißvarianten wird durch die Verwendung der Restriktionsschnittstellen BglII und SacII erreicht, die das C-terminate Ende von hmGluR7 flankieren.
(v) Die entstehenden chimären hmGluR7/hmGluR1 cDNAs werden sequenziert und mit EagI verdaut, wobei die vollständigen cDNAs aus pBluescript-Not freigesetzt werden. Für eine stabile Expression in CHO Zellen werden die chimären cDNAs in die NotI Einzelschnittstelle des Säugerexpressionsvektors pCMV-T7-2 kloniert.

Beispiel 7: Erzeugung und Anwendung von anti-hmGluR Antikörpern
Peptide, die der abgeleiteten C-terminalen Aminosäuresequenz von hmGluR7 entsprechen, werden synthetisiert und an Ovalbumin oder Tentagel gekuppelt. Es werden polyklonale Antiseren in Kaninchen erzeugt. Für humanen mGluR spezifische Antikörper werden aus den Antiseren durch die Immunaffinitätschromatographie auf Peptidsäulen gereinigt. Die für hmGluR spezifischen Antikörperwerden durch ELISA und Immunblots mit Glutathion-S-Transferase/hmGluR Fusionsproteinen (hergestellt in E. coli) oder humanen Gehirnextrakten charakterisiert. Antikörper, die für hmGluR7spezifisch sind, werden zur Detektion von hmGluR Rezeptoren in transfizierten Zellen und zur Analyse des zellulären und subzellulären Expressionsmusters der hmGluR Rezeptorproteine in Gewebeschnitten von humanem Gehirnmaterial verwendet. Es werden Antikörper gegen unterschiedliche für hmGluR-spezifische Peptide, die aus 20 Aminosäuren bestehen, und Fusionsproteine erzeugt, die in E. coli exprimiert werden. Die Peptide werden durch Festphasensynthese synthetisiert und an Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) oder Ovalbumin mit Glutaraldehyd gekuppelt. PCR Fragmente, die das gesamte putative intrazelluläre C-terminate Fragment der hmGluRs enthaften, werden als BamHI/EcoRI Fragmente in das E. coli Expressionsplasmid pGEX-2T (Guan und Dixon, Analytical Biochemistry 192, 262–267 (1991)) unter Bildung von Glutathion-S-transferase (GST)/hmGluR Fusionsgenen kloniert. E. coli DH5α Zellen (Gibco BRL), die die Expressionsplasmide mit den GST/hmGluR Fusionsgenen enthaften, werden über Nacht bei 37°C in LB Medium/100 mg/ml Ampicillin angezogen. Die Kulturen werden 1 : 30 in LB verdünnt und für 2 Stunden bei 30°C angezogen. Die Expression der Fusionsproteine wird durch die Behandlung mit 0,1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid für 3 Stunden bei 30°C induziert. Die Zellen werden durch die Zentrifugation bei 5000 × g geerntet. Das Fusionsprotein wird mittels Glutathionaffinitätschromatographie isoliert.
Hinterlegungsdaten
Die folgenden Plasmide wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig am 13. September 1993 hinterlegt:
Plasmid cmR1: Hinterlegungsnummer DSM 8549.
Plasmid cmR2: Hinterlegungsnummer DSM 8550
Sequenzliste

Claims

Gereinigter humaner metabotroper Glutamatrezeptor (hmGluR), der die in SEQ ID Nr. 12 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Gereinigter humaner metabotroper Glutamatrezeptor (hmGluR), der die in SEQ ID Nr. 14 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Gereinigter humaner metabotroper Glutamatrezeptor (hmGluR), der die in SEQ ID Nr. 4, 8 oder 10 gezeigten Aminosäuresequenzen umfasst.
Gereinigter metabotroper Glutamatrezeptor, der durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die zur Hybridisierung unter hohen Stringenzbedingungen an die SEQ ID Nr. 3, 7, 9, 11 oder 13 fähig ist, wobei das Polypeptidprodukt unter Standardbedingungen im cAMP Radioimmuntest zeigt, dass AP-4 eine agonistische Wirkung bei einer Konzentration von weniger als 1 mM aufweist.
Fusionsprotein, das einen Rezeptor nach den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4 umfasst.
Nukleinsäure, die eine Nukleinsäure umfasst, welche für einen Rezeptor nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 kodiert.
Nukeinsäure nach Anspruch 6, worin die Nukleinsäure DNA ist.
DNA nach Anspruch 7, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus den DNAs mit den in SEQ ID Nr. 3, 7, 9, 11 oder 13 gezeigten Nukleotidsequenzen.
Nukleinsäuresonde, die zumindest 14 aufeinanderfolgende Basen der Nukleinsäure gemäß Anspruch 6 oder 7 oder dem Komplementär hiervon umfasst und die spezifisch an eine Nukleinsäure nach Anspruch 6 oder 7 oder dem Komplementär hiervon unter Bedingungen mit hoher Stringenz bindet.
DNA nach Anspruch 7, worin die DNA ein Hybridvektor ist.
Wirtszelle, die durch den Hybridvektor von Anspruch 10 transformiert ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 11, worin die Wirtszelle eine eukaryontische Wirtszelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 11, worin die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.
Gereinigte mRNA, die komplementär zur DNA nach Anspruch 8 ist.
Antikörper, der gegen ein Protein nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 gerichtet ist.
Antikörper nach Anspruch 15, der ein polyklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 15, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren zur Herstellung eines Rezeptors nach Anspruch 1 bis 4, das die Vermehrung einer geeigneten Wirtszelle umfasst, die mit einem Hybridvektor transformiert ist, der eine Expressionskassette enthält, die einen Promotor und eine DNA enthält, die für einen solchen Rezeptor kodiert, wobei die DNA durch den Promotor kontrolliert wird.
Verwendung eines Rezeptors nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 zum Screenen einer Verbindung, die die Aktivität des Rezeptors moduliert.
Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach Anspruch 7, das die chemische Synthese, die rekombinante DNA Technologie oder die Polymerasekettenreaktion (PCR) umfasst.
Verwendung einer Wirtszelle nach Anspruch 11 zum Screening einer Verbindung, die die Aktivität eines Rezeptors nach Anspruch 1 bis 4 moduliert.
Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle nach Anspruch 11, das die Transfektion oder Transformation der Wirtszelle mit dem Hybridvektor nach Anspruch 10 umfasst.
Verfahren zur Identifizierung der DNA, die für einen hmGluR Subtyp nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 kodiert, das das Zusammenbringen von humaner DNA mit einer Sonde nach Anspruch 9 und die Identifizierung der DNA(s) umfasst, die mit dieser Sonde hybridisieren.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die einen hmGluR Subtyp binden, das die Verwendung eines Rezeptorproteins nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 in einem kompetitiven Bindungstest umfasst.
Test zur Identifizierung von Verbindungen, die die Aktivität eines hmGluR Subtyps nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 modulieren, der umfasst – Zusammenbringen der Zellen nach Anspruch 12 mit zumindest einer Verbindung oder einem Signal, deren Fähigkeit zur Modulation der Aktivität dieses Rezeptorsubtyps bestimmt werden soll und anschließend – Analyse der Zellen auf einen Unterschied in der funktionellen Reaktion, die diesem Rezeptor zuzuordnen ist.
Test nach Anspruch 25, der umfasst – Zusammenbringen der Zellen nach Anspruch 12 mit mindestens einer Verbindung oder einem Signal, deren Fähigkeit zur Modulation der Botenstoffaktivität eines erfindungsgemäßen Rezeptorsubtyps bestimmt werden soll, und anschließend – Beobachtung dieser Zellen bezüglich einer Veränderung der Menge eines bestimmten Botenstoffs.
Verfahren zur Detektion eines Glutamatagonisten oder eines allosterischen Modulators eines hmGluR Subtyps nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 mit einer agonistischen Aktivität, das folgende Schritte umfasst (a) Exposition einer Verbindung gegenüber einem hmGluR Subtyp nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, der an einen Reaktionsweg gekuppelt ist unter Bedingungen und für eine Zeit, die eine Wechselwirkung der Verbindung mit dem Rezeptor und eine assoziierte Reaktion über den Signalweg erlaubt und (b) Detektion einer Erhöhung oder Verringerung der Stimulierung des Reaktionswegs, der aus der Wechselwirkung der Verbindung mit dem hmGluR Subtyp resultiert relativ zur Abwesenheit der getesteten Verbindung und Bestimmung der Anwesenheit eines Agonisten oder eines allosterischen Modulators, der eine Agonisten-ähnliche Aktivität aufweist.
Verfahren zur Identifizierung eines Glutamatantagonisten oder eines allosterischen Modulators eines hmGluR Subtyps nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 mit einer antagonistischen Aktivität, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst (a) Exposition einer Verbindung in Gegenwart eines bekannten Glutamatagonisten für einen hmGluR Subtyp nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 gegenüber einem Reaktionsweg unter Bedingungen und für eine Zeit, die eine Wechselwirkung des Agonisten mit dem Rezeptor und eine assoziierte Reaktion über den Reaktionsweg erlaubt und (b) Detektion einer Hemmung der Stimulierung des Reaktionswegs durch den Agonisten, die aus einer Wechselwirkung der Testverbindung mit dem hmGluR Subtyp resultiert, relativ zur Stimulierung des Reaktionswegs, die durch den Glutamatagonisten alleine ausgelöst wird und hieraus Bestimmung der Anwesenheit eines Glutamatantagonisten oder eines allosterischen Modulators mit einer Antagonisten-ähnlichen Aktivität.
Verfahren zur Modulation der Signaltransduktionsaktivität eines hmGluR Subtyps nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, das das Zusammenbringen des Rezeptors mit einem Antikörper nach Anspruch 15 umfasst.