DE69933776T2

DE69933776T2 - GABA B-REZEPTOR-SUBTYPEN GABA B-R1c UND GABA B-R2 UND DEREN HETERODIMERE

Info

Publication number: DE69933776T2
Application number: DE69933776T
Authority: DE
Inventors: Antony Ashley Stevenage BARNES; Alan Stevenage WISE; Hamilton Fiona Stevenage MARSHALL; James Neil Stevenage FRASER; Helen Julia Stevenage WHITE; Michael Steven Stevenage FOORD
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1998-09-07
Filing date: 1999-09-03
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2019-09-04
Also published as: EP1109901B1; DE69933776D1; WO2000014222A3; ES2275351T3; AU5639799A; JP2002524074A; WO2000014222A2; ATE343634T1; EP1109901A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die neuen GABA_B-Rezeptor-Subtypen GABA_B-R1c und GABA_B-R2 sowie einen neuen funktionellen GABA_B-Rezeptor, welcher ein Heterodimer aus GABA_B-R1 und GABA_B-R2-Rezeptoruntereinheiten umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Varianten der Rezeptoren, den Rezeptor codierende Nucleotidsequenzen und Varianten davon und neue Vektoren, stabile Zelllinien, Antikörper, Durchmusterungsverfahren, Behandlungsverfahren und Verfahren zur Rezeptorherstellung.
Hintergrund der Erfindung
GABA (γ Aminobuttersäure) ist der hauptsächliche, hemmende Neurotransmitter des Zentralnervensystems (ZNS), welcher zwei verschiedene Rezeptorfamilien aktiviert: die ionotropen GABA_A- und GABA_C-Rezeptoren für die schnellen synaptischen Übertragungen und die metabotropen GABA_B-Rezeptoren, welche eine langsamere synaptische Übertragung steuern. GABA_B-Rezeptoren sind Mitglieder der Superfamilie von G-Protein-gekoppelten 7-Transmembran-Rezeptoren. Die Aktivierung führt zur Signaltransduktion durch eine Vielzahl von Signalwegen, die hauptsächlich durch Mitglieder der G_i/G_o-Familie der Pertussistoxin-sensitiven G-Proteine vermittelt werden. Für GABA_B-Rezeptoren wurde gezeigt, dass sie Ca²⁺-Kanäle vom Typ N, P/Q und T in einer Pertussistoxin-sensitiven Weise hemmen (Kobrinsky et al. 1993; Menon-Johansson et al. 1993; Harayama et al., 1998) und in der Tat gibt es auch einige Hinweise auf direkte Wechselwirkungen zwischen GABA_B-Rezeptoren und Ca²⁺-Kanälen, da die Liganden der Ca²⁺-Kanäle die Bindung der GABA_B-Agonisten modifizieren können (Ohmori et al. 1990). Die GABA_B-Rezeptor-vermittelte Ca²⁺-Kanal-Hemmung ist der wesentliche Mechanismus der präsynaptischen Hemmung der Freisetzung von Neurotransmittern. Postsynaptisch ist die hauptsächliche Wirkung der GABA_B-Rezeptor-Aktivierung, die Kaliumkanäle zu öffnen, um postsynaptische Hemmpotentiale zu schaffen.
Autoradiographieuntersuchungen zeigen, dass GABA_B-Rezeptoren im Überfluss vorkommen und innerhalb des ZNS heterogen verteilt sind, mit besonders hohen Spiegeln in der molekularen Schicht des Kleinhirns, des Nucleus interpeduncularis, des frontalen Kortex, der olfaktorischen und thalamischen Nuclei. GABA_B-Rezeptoren sind ebenfalls im Globus pallidus, temporalen Kortex, in der Raphe magnus und im Rückenmark weit verbreitet (Bowery et al., 1987). GABA_B-Rezeptoren sind ein wichtiges therapeutisches Ziel im ZNS für Zustände wie Spastik, Epilepsie, Alzheimer-Krankheit, Schmerz, Gemütskrankheiten und Essstörungen. GABA_B-Rezeptoren sind auch im peripheren Nervensystem sowohl auf sensorischen Nerven als auch auf parasympathischen Nerven vorhanden. Ihre Fähigkeit, diese Nerven zu modulieren, gibt ihnen das Potential, als Ziele bei Erkrankungen der Lunge, des GI-Trakts und der Blase zu dienen (Kerr und Ong, 1995, 1996, Malcangio und Bowery, 1995).
Trotz der weitverbreiteten Fülle von GABA_B-Rezeptoren legen deutliche Hinweise aus neurochemischen, elektrophysiologischen und Verhaltensstudien nahe, dass verschiedene Subtypen von GABA_B-Rezeptoren existieren. Diese Heterogenität der GABA_B-Rezeptoren kann die Entwicklung von selektiven Liganden erlauben, die in der Lage sind, spezifische Aspekte der GABA_B-Rezeptorfunktion anzusteuern. Dies würde zur Entwicklung von Wirkstoffen mit verbesserten Selektivitätsprofilen im Vergleich zu derzeitigen Verbindungen (wie Baclofen) führen, welche relativ unselektiv sind und eine Vielzahl von unerwünschten Verhaltenswirkungen wie Sedierung und Atemnot zeigen. Vielfache Rezeptor-Subtypen werden am besten durch die unterschiedlichen Profile von agonistischen und antagonistischen Liganden klassifiziert.
Bis dato beruhte die Durchmusterung nach GABA_B-Liganden und anschließende Bestimmungen der Struktur/Aktivität auf Radioliganden-Bindungstests an Rattenhirnmembranen. Eine weitere Analyse solcher Liganden in Tiermodellen hat Unterschiede in ihrem Verhaltensprofil gezeigt. Durch das Fehlen von clonierten GABA_B-Rezeptoren wurde die molekulare Basis für solche Unterschiede jedoch nicht definiert und daher war es nicht möglich, die GABA_B-Liganden für die therapeutische Verwendung zu optimieren.
GABA_B-Rezeptoren wurden das erste Mal vor beinahe 20 Jahren beschrieben (Hill und Bowery, 1981), aber trotz intensiver Bemühungen unter Verwendung konventioneller Expressionsclonierungsstrategien, zum Beispiel in Xenopus-Oocyten, oder von Clonierung auf Basis von Sequenzhomologie, blieb die molekulare Natur des GABA_B-Rezeptors schwer fassbar. Die Entwicklung eines Antagonisten mit hoher Affinität für den Rezeptor erlaubte schließlich Kaupmann et al. (1997) eine Expressionsclonierung des Rezeptors von einer cDNA aus der Hirnrinde der Ratte unter Verwendung eines Radioliganden-Bindungstests. Zwei Spleißvarianten des Rezeptors wurden identifiziert, GABA_B-R1a, codierend ein Protein von 960 Aminosäuren, und GABA_B-R1b, codierend ein Protein von 844 Aminosäuren, die sich nur in den Längen ihrer N-Termini unterschieden. Diese beiden Spleißvarianten weisen unterschiedliche räumliche Verteilungen innerhalb des Hirns auf, kommen aber beide eher in neuronalen als in Gliazellen vor. Die beiden Spleißvarianten sind pharmakologisch ähnlich, denn sie zeigen Bindungsaffinitäten für eine Reihe von Antagonisten, jedoch 10-fach niedriger als diejenigen von nativen Rezeptoren, sowie Agonisten-Verdrängungskonstanten, die etwa 100-150-fach niedriger als diejenigen von nativen Rezeptoren sind. Diese Beobachtungen haben zu der Vermutung geführt, dass der clonierte Rezeptor ein Rezeptor mit niedriger Affinität war und ein zusätzlicher, pharmakologisch verschiedener GABA_B-Rezeptor-Subtyp mit hoher Affinität im Hirn vorkommen könnte. Alternativ wurde diskutiert, dass die G-Protein-Kopplung uneffizient war oder dass der Rezeptor im verwendeten rekombinanten Systemen unempfindlich wurde.
Ein Anzahl von im Fachgebiet arbeitenden Gruppen haben jedoch herausgefunden, dass sich der clonierte Rezeptor weder in Säugerzellen noch in Xenopus-Oocyten wie ein funktioneller GABA_B-Rezeptor verhält. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Clonierung eines neuen menschlichen GABA_B-Rezeptor-Subtyps, GABA_B-R2, die Identifizierung einer neuen Spleißvariante GABA_B-R1c und die überraschende Beobachtung, dass der GABA_B-R1 und GABA_B-R2 stark über ihre C-Termini in Wechselwirkung treten und somit Heterodimere bilden. Die gemeinsame Expression von GABA_B-R1 und GABA_B-R2 erlaubt die Wanderung von GABA_B-R1 an die Zeltoberfläche und führt zu einem funktionellen GABA_B-Rezeptor mit hoher Affinität sowohl in Säugerzellen als auch in Xenopus-Oocyten.
Diese überraschenden Befunde stellen eine einzigartige Gelegenheit bereit, die GABA_B-Subtypen auf molekularer Ebene zu definieren, welche wiederum zur Identifizierung von neuen Subtyp-spezifischen Wirkstoffen führt.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein GABA_B-Rezeptor bereitgestellt, umfassend ein Heterodimer zwischen einem GABA_B-R1-Rezeptorprotein und einem GABA_B-R2-Rezeptorprotein, worin das GABA_B-R2-Rezeptorprotein die Aminosäuresequenz, welche in 1B bereitgestellt wird, oder eine Aminosäuresequenz aufweist, welche mindestens 90% Homologie zur in 1B bereitgestellten Aminosäuresequenz hat.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, umfassend eine Nucleotidsequenz, codierend ein GABA_B-R1-Rezeptorprotein, und eine Nucleotidsequenz, codierend ein GABA_B-R2-Rezeptorprotein, wobei der Vektor in der Lage ist, die GABA_B-R1- und GABA_B-R2-Rezeptorproteine zu exprimieren, wobei das GABA_B-R2-Rezeptorprotein die Aminosäuresequenz, welche in 1B bereitgestellt wird, oder eine Aminosäuresequenz aufweist, welche mindestens 90% Homologie zur in 1B bereitgestellten Aminosäuresequenz hat.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein isoliertes GABA_B-R2-Rezeptorprotein mit der in 1B bereitgestellten Aminosäuresequenz bereitgestellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Nucleotidsequenz, codierend ein erfindungsgemäßes GABA_B-R2-Rezeptorprotein, oder eine Nucleotidsequenz, welche dazu komplementär ist, bereitgestellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Nucleotidsequenz, codierend einen GABA_B-R2-Rezeptor, wie in 1A gezeigt, oder eine Nucleotidsequenz, welche dazu komplementär ist, bereitgestellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, umfassend eine erfindungsgemäße Nucleotidsequenz, welche in der Lage ist, ein GABA_B-R2-Rezeptorprotein zu exprimieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine stabile Zelllinie, umfassend einen erfindungsgemäßen Vektor, bereitgestellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine stabile Zelllinie bereitgestellt, welche so modifiziert wurde, dass sie die GABA_B-R1- und GABA_B-R2-Rezeptorproteine exprimiert, wobei das GABA_B-R2-Rezeptorprotein die Aminosäuresequenz, welche in 1B bereitgestellt wird, oder eine Aminosäuresequenz aufweist, welche mindestens 90% Homologie zur in 1B bereitgestellten Aminosäuresequenz hat.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein GABA_B-Rezeptor bereitgestellt, umfassend ein Heterodimer zwischen einem GABA_B-R1-Rezeptorprotein und einem GABA_B-R2-Rezeptorprotein, welche durch eine erfindungsgemäße stabile Zelllinie hergestellt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein GABA_B-R2-Rezeptorprotein bereitgestellt, welches durch eine erfindungsgemäße stabile Zelllinie hergestellt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Antikörper, der spezifisch für einen GABA_B-Rezeptor oder ein erfindungsgemäßes GABA_B-Rezeptorprotein ist, bereitgestellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereitgestellt, welche eine den GABA_B-Rezeptor modulierende Aktivität aufweist, umfassend das Inkontaktbringen eines erfindungsgemäßen GABA_B-Rezeptors mit einer Testverbindung und Nachweis der Modulationsaktivität oder des Fehlens einer solchen Aktivität.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. Nucleotid- und Proteinsequenzen des menschlichen GABA_B-R2
Die Nucleotidsequenz (a) und die translatierte Proteinsequenz (b) für den menschlichen GABA_B-R2 werden gezeigt.
2. Protein-Gegenüberstellung zwischen GABA_B-R1a-, GABA_B-R1b-, GABA_B-R1c-Spleißvarianten und GABA_B-R2.
Die Aminosäuresequenzen der menschlichen GABA_B-R1a-, GABA_B-R1b- und GABA_B-R2-Rezeptoren wurden zum Vergleich gegenübergestellt. Signalsequenzen und die vorhergesagte Spaltstelle (✂), zusammen mit den N-terminalen Spaltstellen für GABA_B-R1a und GABA_B-R1b werden gezeigt. Die GABA_B-R1c-Sequenz ist exakt diejenige von GABA_B-R1a, mit Ausnahme der Deletion von 63 Aminosäuren (offenes Kästchen). Zwischen GABA_B-R1a und GABA_B-R1b konservierte Aminosäuren sind fett gedruckt und potentielle N-Glycosylierungsstellen (*) werden gezeigt. Die Linien unter dem Text zeigen die Positionen der sieben vorhergesagten TM-Domänen und gewundene Knäuel-Strukturen codierende Regionen werden durch Schattierung angegeben. Die C-terminale Region von GABA_B-R1, welche als Köder in der Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse diente, ist als 'BAIT→' markiert und GABA_B-R2 C-terminale Domänen, welche aus der Durchmusterung der Genbank gegen den GABA_B-R1-C-Terminus erhalten wurden, werden als 'YTH HITS→' gezeigt.
3. Hydrophobieprofil von GABA_B-R2.
Hydrophobieprofile der GABA_B-R2-Sequenz wurden unter Verwendung des Kyte-Doolittle-Algorithmus bestimmt, wobei die positiven Werte hydrophobe Regionen anzeigen. Die vorhergesagte Signalsequenz und die Sieben-Transmembrandomänen werden gezeigt.
4. Gewebeverteilungsuntersuchungen für menschliches GABA_B-R1 und GABA_B-R2.
Ein RNA-Masterblot vom Menschen (Clontech), enthaltend normalisierte polyA⁺-mRNA aus verschiedenen Geweben adulten und fötalen Ursprungs wurden nacheinander mit einer pan-spezifischen Sonde auf GABA_B-R1 (alle Spleiß-Varianten) untersucht, gefolgt von einer GABA_B-R2-spezifischen Sonde. Die entstandene autoradiographische Analyse der Blots wird zusammen mit einem Gitter, das den Gewebetyp identifiziert, gezeigt. Die Spezifitätskontrollen umfassen Hefe-RNA und E. coli-DNA.
5. Heterodimerisierung und Homodimerisierung zwischen den C-terminalen Domänen der GABA_B-R1- und GABA_B-R2-Rezeptoren im Hefe-Zwei-Hybrid-System.
Die β-Galaktosidase-Aktivität wurde in Y190-Hefezellen, welche die GABA_B-R1- oder GABA_B-R2-C-Termini exprimieren, entweder gegen den leeren Vektor oder gegeneinander in allen Kombinationen unter Verwendung von ONPG gemessen. Von jedem Proteinpaar, das im Zwei-Hybrid-System exprimiert wird, bezieht sich das erste immer auf das GAL4_BD-Fusionskonstrukt, während sich das zweite auf das GAL4_AD-Fusionskonstrukt bezieht. Die β-Galaktosisdase-Aktivität wird in Bezug auf die Zellzahlen bestimmt und wird in willkürlichen Einheiten angegeben.
6. Untersuchungen zur gemeinsamen Immunpräzipitation des GABA_B-Heterodimers in HEK239-Zellen.
HEK293T-Zellen wurden mit 1 μg von entweder Myc-GABA_B-R1b oder HA-GABA_B-R2 alleine oder in Kombination transfiziert. Die Zellen wurden 48 Std. nach der Transfektion geerntet, lysiert und die am Epitop markierten Rezeptoren wurden unter Verwendung von 12CA5(HA)- oder 9E10 (Myc)-Antiseren, wie im Teil Verfahren beschrieben wird, immunpräzipitiert. Die Immunkomplexe wurden dann einer SDS-PAGE unterzogen, auf Nitrocellulose übertragen und das eingefangene Myc-GABA_B-R1b und HA-GABA_B-R2 wurde durch Immunblotting mit Myc beziehungsweise HA identifiziert. Spuren 1 und 4, Immunpräzipitate von nur mit Myc-GABA_B-R1b transfizierten Zellen; Spuren 2 und 5, nur HA-GABA_B-R2; Spuren 3 und 6, Immunpräzipitate von mit Myc-GABA_B-R1b zusammen mit HA-GABA_B-R2 transfizierten Zellen. Spuren 1–3, Lysate, mit 9E10 (Myc) immunpräzipitiert und gegen 12CA5(HA) geblottet; Spuren 4–6, Lysate, mit 12CA5(HA) immunpräzipitiert und gegen 9E10 (Myc) geblottet.
7. Lokalisierung des GABA_B-R1-Rezeptors an der Zeltoberfläche ist abhängig von der gemeinsamen Expression mit GABA_B-R2.
Durchflusscytometrie wurde mit HEK293T-Zellen durchgeführt, welche mit 1 μg von entweder Myc-GABA_B-R1b oder HA-GABA_B-R2 oder beiden Rezeptoren in Kombination transfiziert waren. (A) Analyse unter Verwendung von 9E10 (c-Myc) als primären Antikörper zum Nachweis von Myc-GABA_B-R1b; intakte Zellen. (B) Analyse unter Verwendung von 9E10 (c-Myc) als primären Antikörper zum Nachweis von Myc-GABA_B-R1b; permeabilisierte Zellen. (C) Analyse unter Verwendung von 12CA5 (HA) als primärer Antikörper zum Nachweis von HA-GABA_B-R2; intakte Zellen. Scheintransfizierte Zellen, welche die Hintergrundfluoreszenz reflektieren, sind schattiert und der Marker zeigt die Fluoreszenz an, die über dem Hintergrundspiegel gemessen wurde. Daten zu Myc-GABA_B-R1b werden als graue Linie gezeigt, während die gemeinsame Expression von Myc-GABA_B-R1b und HA-GABA_B-R2 in Schwarz gezeigt wird. 30.000 Zellen wurden in jeder Probe analysiert. Die gezeigten Histogramme stammen aus einem einzelnen Experiment. Die angebebenen Statistiken stammen aus dem Mittel von drei getrennten Transfektionen und deren Analyse.
8. Gemeinsame Expression von GABA_B-R1a- und -1b-Spleißvarianten mit GABA_B-R2-Rezeptoren in HEK293T-Zellen führt zur terminalen Glycosylierung von sowohl GABA_B-R1a als auch GABA_B-R1b.
P2-Membranfraktionen stammten aus HEK293T-Zellen, welche mit 1 μg von entweder GABA_B-R1a (Spuren 1–3), GABA_B-R1b (Spuren 4–6) oder HA-GABA_B-R2 (Spuren 13–15) oder mit jeweils 1 μg HA-GABA_B-R2 in Kombination mit 1 μg von entweder GABA_B-R1a (Spuren 7–9, 16–18) oder GABA_B-R1b (Spuren 10–12, 19–21) transfiziert waren. Der Glycosylierungsstatus der transfizierten Rezeptoren wurde nach Behandlung der P2-Fraktionen (50 μg Membranprotein) mit entweder Vehikel (Spuren 1, 4, 7, 10, 13, 16 und 19), Endoglycosidase F (Spuren 2, 5, 8, 11, 14, 17 und 20) oder Endoglycosidase H (Spuren 3, 6, 9, 12, 15, 18 und 21) bewertet. Die Proben wurden durch SDS-PAGE (10% (Gew./Vol.) Acrylamid) aufgetrennt, auf Nitrocellulose übertragen und einem Immunblott-Verfahren unterworfen. Obere Tafel: das Antiserum 501 wurde als primäres Reagenz verwendet, um die Identifizierung von GABA_B-R1a und -1b zu erlauben. Untere Tafel: das anti-HA-Antiserum 12CA5 wurde für die Identifizierung von HA-GABA_B-R2 verwendet. Ein „*" markiert terminale glycosylierte Formen von GABA_B-R1a und -1b.
9. Gemeinsame Expression von GABA_B-R1- und GABA_B-R2-Rezeptoren in HEK293T Zellen führt zur GABA-vermittelten Stimulierung von [³⁵S]GTPγS-Bindungsaktivität.
Die [³⁵S]GTPγS-Bindungsaktivität wurde an partikulären P2-Fraktionen gemessen, die aus HEK293T-Zellen stammten, welche mit 1 μg von entweder G_O1α zusammen mit 1 μg von entweder GABA_B-R1a, GABA_B-R1b oder HA-GABA_B-R2 oder mit je 1 μg von G_O1α und HA-GABA_B-R2 in Kombination mit 1 μg von entweder GABA_B-R1a oder GABA_B-R1b transfiziert waren. (A) Die [³⁵S]GTPγS-Bindung wurde in Abwesenheit (offene Balken) oder in Gegenwart (schraffierte Balken) von GABA (10 mM), wie es im Abschnitt Verfahren beschrieben wird, gemessen. (B) Die Fähigkeit variierender Konzentrationen von GABA, die Bindung von [³⁵S]GTPγS zu stimulieren, wurde in den P2-Membranfraktionen aus HEK293T-Zellen, die entweder G₀₁α und HA-GABA_B-R2 alleine (offene Kreise) oder in Kombination mit entweder GABA_B-R1a (gefüllte Quadrate) oder GABA_B-R1b (gefüllte Dreiecke) exprimieren, gemessen. Die gezeigten Daten sind die Mittelwerte ± SA von dreifachen Messungen und sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.
10. Durch GABA vermittelte Stimulierung der [³⁵S]GTPγS-Bindungsaktivität in HEK293T Zellen, welche GABA_B-R1- und GABA_B-R2-Rezeptoren gemeinsam exprimieren, benötigt eine Kotransfektion mit zusätzlichem G_iG-Protein, G_o1α.
Die [³⁵S]GTPγS-Bindungsaktivität wurde an partikulären P2-Fraktionen gemessen, die aus HEK293T-Zellen stammten, welche mit HA-GABA_B-R1b (1 μg) zusammen mit HA-GABA_B-R2 (1 μg) und G_o1α (1 μg) (geschlossene Dreiecke) oder in Kombination mit entweder HA-GABA_B-R2 (1 μg) (offene Kreise) oder G_o1α (1 μg) (geschlossene Kreise) transfiziert waren. Die Fähigkeit der variierenden Konzentrationen an GABA, die Bindung von [³⁵S]GTPγS zu stimulieren, wurde bestimmt. Die gezeigten Daten sind die Mittelwerte ± SA von dreifachen Messungen.
11. Gemeinsame Expression von GABA_B-R1- und GABA_B-R2-Rezeptoren in HEK293T Zellen erlaubt die durch GABA vermittelte Hemmung der durch Forskolin stimulierten Adenylatcyclase-Aktivität.
Die cAMP-Spiegel wurden in HEK293T-Zellen, welche mit 1 μg G_i1α zusammen mit 1 μg von entweder GABA_B-R1a, GABA_B-R1b oder HA-GABA_B-R2 oder mit je 1 μg von G_i1α und HA-GABA_B-R2 in Kombination mit 1 μg von entweder GABA_B-R1a oder GABA_B-R1b transfiziert waren, wie es im Abschnitt Verfahren beschrieben wird. (A) Die CAMP-Spiegel wurden in Zellen, die in Abwesenheit (offene Balken) oder in Gegenwart (schraffierte Balken) von GABA (1 mM) mit Forskolin behandelt wurden. (B) Die Fähigkeit variierender Konzentrationen von GABA, die durch Forskolin erhöhte Adenylatcyclase-Aktivität in HEK293T-Zellen, welche G_i1α und HA-GABA_B-R2 in Kombination mit GABA_B-R1b exprimieren, zu hemmen. Die gezeigten Daten sind die Mittelwerte ± SA von dreifachen Messungen.
12. Gemeinsame Expression von GABA_B-R1- und GABA_B-R2-Rezeptoren in Xenopus-Oocyten erlaubt die Agonisten-abhängige Aktivierung des Ionenflusses durch CFTR und GIRK1/4.
Xenopus-Oocyten wurde cRNA, codierend GABA_B-R1-, GABA_B-R2-Rezeptoren (in gleichen Mengen für CFTR, 1:2 Verhältnis für GIRK), plus entweder CFTR (A) oder das GIRK1/GIRK4-Heteromer (B) injiziert. A: eine Auftragung des zeitlichen Verlaufs für eine Oocyte, die GABA_B-R1, GABA_B-R2 und CFTR exprimiert. Die Anwendung von 100 mM GABA, 100 mM SKF97541 oder 1 mM Baclofen (Pfeile) aktivierte einen starken einwärts gerichteten CFTR-Strom. Man beachte die Erhöhung der CFTR-Antwort, die durch wiederholte GABA-Applikation gesehen wird. B: Auftragung des zeitlichen Verlaufs für eine Oocyte, die GABA_B-R1, GABA_B-R2, GIRK1 und GIRK4 exprimiert. Der Wechsel von einer ND96- (wenig Kalium) zu einer 90K-Lösung (viel Kalium) führte zu einer einwärts gerichteten Verschiebung des Haltestroms, was zeigt, dass der GIRK1/GIRK4-Kanal in dieser Oocyte exprimiert wird. Die nachfolgende Applikation von 100 mM GABA aktivierte einen starken einwärts gerichteten Strom (mittlere Tafel). Negativ- und Positivkontrollexperimente von Oocyten, welche den GABA_B-R2-Rezeptor alleine exprimieren (linke Tafel), und von solchen, die den Adenosin-Al-Rezeptor (rechte Tafel) exprimieren, werden gezeigt.
13. Strom-Spannungskurven in einer Oocyte, exprimierend GABA_B-R1-und GABA_B-R2 und die Kaliumkanäle GIRK1 und GIRK4.
Strom-Spannungskurven werden für eine einzelne Oocyte nach Anwendung von 200 ms Spannungsklemmen-Pulsen von einem Haltepotential von –60 mV auf Testpotentiale zwischen –100 mV und +50 mV gezeigt. Der Gleichgewichtsstrom wird gegen das Testpotential in ND96-Lösung (wenig Kalium), 90K-Lösung (90 mM Kalium) und 90 K plus 100 mM GABA aufgetragen. Man beachte den GIRK1/4 Basisstrom, der in der 90K-Lösung aufgezeichnet wurde, und die starke durch einen Agonist hervorgerufene Aktivierung des GIRK-Kaliumkanals.
14. Durch GABA vermittelte Stimulierung der [³⁵S]GTPγS-Bindungsaktivität ist abhängig von den relativen Spiegeln der GABA_B-R1- und GABA_B-R2-Rezeptoren.
HEK293T-Zellen wurden mit HA-GABA_B-R2 (1 μg) und G_o1α (1 μg) zusammen mit verschiedenen Mengen (0-1 μg) HA-GABA_B-R1b transfiziert. Die Zellen wurden 48 Std. nach der Transfektion geerntet und die P2-Membranfraktionen wurden präpariert. (A) Die Agonistenstimulierung der [³⁵S]GTPγS-Bindungsaktivität wurde in transfizierten Zellmembranen in Gegenwart von GABA (10 mM) gemessen. Die Daten werden als Stimulierung oberhalb des Basalwertes (ZpM) gezeigt und sind die Mittelwerte ± SA von dreifachen Messungen. (B) Die Zellmembranen wurden einem Immunblot-Verfahren mit anti-HA-Antiserum unterzogen, um die Bewertung der relativen Spiegel von HA-GABA_B-R2- und HA-GABA_B-R1b-Rezeptoren zu erlauben.
15. Gemeinsame Expression von GABA_B-R1- und GABA_B-R2-Rezeptoren in HEK293T-Zellen erzeugt eine GABA_B-Bindungsstelle mit hoher Affinität, ähnlich der von GABA_B-Rezeptoren des Hirns.
P2-Membranfraktionen wurden aus HEK293T Zellen präpariert, welche unter Anwendung derselben Bedingungen, wie sie für die GTPγS-Bindungsstudien beschrieben wurden, transfiziert wurden. % spezifische Bindung wurde für die Verdrängung von [³H]-CGP54626 durch GABA bestimmt. Die gezeigten Daten sind die Mittelwerte von mindestens dreifachen Messungen ± SEM ("standard error of means", Standardfehler vom Mittelwert).
Genaue Beschreibung der Erfindung
Innerhalb der vorliegenden Beschreibung und der begleitenden Ansprüche sollen die Wörter „umfassen" und „einschließen" und Variationen davon, wie „umfasst" und „umfassend", „schließt ein" und „einschließlich", durchgängig einschließend interpretiert werden. Das heißt, dass diese Wörter beabsichtigen, den möglichen Einschluss von anderen Elementen oder ganzen Zahlen, die nicht spezifisch genannt werden, zu vermitteln, soweit der Kontext es erlaubt.
Wie zuvor erklärt, umfasst die vorliegende Erfindung eine Anzahl wichtiger Aspekte. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung isolierte GABA_B-R2-Rezeptorproteine und GABA_B-Rezeptoren, umfassend ein Heterodimer zwischen einem GABA_B-R1-Rezeptorprotein und einem GABA_B-R2-Rezeptorprotein, sowie andere verwandte Aspekte. Im Kontext der vorliegenden Erfindung beabsichtigt der Begriff „isoliert" zu vermitteln, dass das Rezeptorprotein insofern nicht in seinem nativen Zustand ist, als es zumindest zu einem gewissen Maß gereinigt oder synthetisch hergestellt wurde, zum Beispiel durch rekombinante Verfahren. Der Begriff „isoliert" umfasst daher die Möglichkeit, dass das Rezeptorprotein in Kombination mit anderem biologischen oder nicht-biologischen Material wie Zellen, Suspensionen von Zellen oder Zellfragmenten, Proteine, Peptide, organische oder anorganische Lösungsmittel oder andere Materialien, soweit geeignet, vorliegen kann, schließt jedoch die Situation aus, in der das Rezeptorprotein in einem Zustand ist, wie er in der Natur gefunden wird.
Routineverfahren, wie sie im nachfolgenden experimentellen Abschnitt weiter erklärt werden, können angewendet werden, um die erfindungsgemäßen Rezeptorproteine zu reinigen und/oder zu synthetisieren. Solche Verfahren sind den Fachleuten leicht verständlich und umfassen Verfahren wie diejenigen, welche bei Sambrook, J. et al., 1989 offenbart werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst nicht nur das GABA_B-R2-Rezeptorprotein mit der in 1B gezeigten Aminosäuresequenz, sondern auch GABA_B-R2-Rezeptorproteine mit einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 90% Homologie zur in 1B gezeigten Aminosäuresequenz hat. Solche Proteine behalten den gleichen wesentlichen Charakter des GABA_B-R2-Rezeptorproteins, für welches die Sequenzinformation bereitgestellt wird. Zum Beispiel werden Proteine mit mindestens 95% Homologie zu den in 1B bereitgestellten Aminosäuresequenzen als GABA_B-R2-Rezeptorproteine angesehen. Solche Proteine können die Deletion, Modifizierung oder Addition von einzelnen Aminosäuren oder Gruppen von Aminosäuren innerhalb der Aminosäuresequenz umfassen, solange die biologische Funktionalität des Proteins nicht beeinträchtigt wird.
Die Erfindung schließt auch Nucleotidsequenzen ein, die GABA_B-R2-Rezeptorproteine codieren, sowie Nucleotidsequenzen, welche dazu komplementär sind. Vorzugsweise ist die Nucleotidsequenz eine DNA-Sequenz und am stärksten bevorzugt eine cDNA-Sequenz.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Expressionsvektoren ein, welche Nucleotidsequenzen umfassen, die GABA_B-R2-Rezeptorproteine codieren. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Expressionsvektor, umfassend Nucleotidsequenzen, codierend ein GABA_B-R1-Rezeptorprotein und ein GABA_B-R2-Rezeptorprotein. Solche Expressionsvektoren werden routinemäßig im Fachgebiet der Molekularbiologie konstruiert und dies kann die Verwendung von Plasmid-DNA und geeigneten Initiatoren, Promotoren, Enhancern und anderen Elementen einbeziehen, welche notwendig sein können und welche in der richtigen Orientierung positioniert sind, um die Proteinexpression zu ermöglichen.
Die Erfindung schließt auch Zelllinien ein welche so modifiziert wurden, dass sie den neuen Rezeptor exprimieren. Solche Zelllinien schließen transiente oder vorzugsweise stabile höhere eukaryontische Zelllinien ein, wie Säugerzellen oder Insektenzellen, niedrigere eukaryontische Zellen wie Hefe oder prokaryontische Zellen wie Bakterienzellen. Spezielle Beispiele von Zellen, welche durch Insertion von Vektoren, codierend erfindungsgemäße Rezeptorproteine, modifiziert wurden, schließen HEK293T-Zellen und Oocyten ein. Vorzugsweise ist die ausgewählte Zelllinie eine, die nicht nur stabil ist, sondern auch eine reife Gycosylierung und die Expression der erfindungsgemäßen Rezeptoren an der Zelloberfläche erlaubt. Im Fall des funktionalen GABA_B-Rezeptors, welcher ein Heterodimer von GABA_B-R1-und GABA_B-R2-Untereinheiten umfasst, kann die Zelllinie einen einzelnen Vektor, der die Expression beider Rezeptor-Subtypen erlaubt, oder alternativ getrennte Vektoren für jede Untereinheit beinhalten. Es wird jedoch bevorzugt, dass die Rezeptorsubtypen gemeinsam exprimiert werden, um den Dimerisierungsprozess zu optimieren, welcher zur vollständigen Glycosylierung und zum Transport des glycosylierten Dimers zur Zelloberfläche führt.
Es ist für die erfindungsgemäßen Rezeptoren auch möglich, dass sie in einer Zelllinie oder auf einer Membran transient exprimiert werden, wie zum Beispiel in einem Baculovirus-Expressionssystem. Solche Systeme, welche daran angepasst sind, die erfindungsgemäßen Rezeptoren zu exprimieren, sind ebenfalls in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
In einem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung wird das Heterodimer zwischen den GABA_B-R1- und GABA_B-R2-Rezeptorproteinen gebildet, was zur Bildung eines funktionalen GABA_B-Rezeptors führt. Ohne an diese Theorie gebunden sein zu wollen, scheint es, dass die Bildung eines Heterodimers über die gewundene Knäuel-Domänen innerhalb der C-terminalen Schwänze des Rezeptors stattfindet und dass dies wiederum eine Vorraussetzung für den Transport und die vollständige Gylcosylierung von GABA_B-R1 und auch für die Erzeugung eines GABA_B-Rezeptors mit hoher Affinität an der Zelloberfläche ist.
Das Heterodimer, welches einen funktionellen GABA_B-Rezeptor bildet, kann einen beliebigen GABA_B-R1-Rezeptor-Subtyp oder eine Spleißvariante umfassen. Obwohl wir derzeit nur einen GABA_B-R2-Subtyp kennen, wird es vorausgesehen, dass die erfindungsgemäßen Heterodimere andere GABA_B-R2-Subtypen oder Spleißvarianten umfassen können, so wie die GABA_B-R2-Rezeptorproteine, welche mindestens 90% Homologie mit der in 1B gezeigten GABA_B-R2-Rezeptorproteinsequenz haben.
Insbesondere kann der funktionelle GABA_B-Rezeptor GABA_B-R1-Rezeptorproteine, ausgewählt aus den Spleißvarianten GABA_B-R1a, GABA_B-R1b, GABA_B-R1c, Varianten davon oder sogar anderen GABA_B-R1-Rezeptor-Subtypen oder Spleißvarianten, welche noch nicht identifiziert wurden, umfassen.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, welche durch Standardverfahren erzeugt wurden und für die erfindungsgemäßen Rezeptorproteine spezifisch sind. Solche Antikörper könnten zum Beispiel für die Reinigung, Isolierung oder Durchmusterung unter Einschluss von Immunpräzipitationsverfahren nützlich sein und könnten als Werkzeuge zur weiteren Aufklärung der GABA_B-Rezeptorfunktion oder in der Tat als therapeutische Mittel selbst verwendet werden. Antikörper können im Gegensatz zu den Monomer-Untereinheiten auch gegen spezifische Epitope der erfindungsgemäßen Rezeptoren erzeugt werden.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von erfindungsgemäßen Rezeptorproteinen, insbesondere des heterodimeren GABA_B-Rezeptors in Durchmusterungsverfahren, die so gestaltet sind, dass sie Verbindungen identifizieren, welche als Rezeptorliganden fungieren und welche nützlich sein können, um die Rezeptoraktivität zu modulieren. Allgemein beinhalten solche Durchmusterungsverfahren das Inkontaktbringen des betreffenden Rezeptorproteins, vorzugsweise des heterodimeren GABA_B-Rezeptors, mit einer Testverbindung und den anschließenden Nachweis der Modulation der Rezeptoraktivität oder in der Tat der Nachweis der fehlenden Rezeptoraktivität, die daraus entsteht. Die vorliegende Erfindung schließt in ihrem Geltungsbereich auch solche Verbindungen mit ein, die mittels der vorstehend dargelegten Durchmusterungsverfahren dadurch identifiziert werden, dass sie eine nützliche, den GABA_B-Rezeptor modulierende Aktivität besitzen. Die in der Erfindung enthaltenen Durchmusterungsverfahren sind im Allgemeinen den Fachleuten wohlbekannt und werden im nachfolgenden experimentellen Abschnitt weiter diskutiert.
Ein anderer Aspekt der vorliegende Erfindung ist die Verwendung von Verbindungen, welche durch die vorstehend erwähnte Durchmusterungsverfahren identifiziert wurden, bei der Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen, welche auf die Modulierung einer GABA_B-Rezeptoraktivität in einem Säuger ansprechen. Was durch den Begriff „Modulierung" gemeint ist, ist, dass es entweder einen Agonismus oder einen Antagonismus an der Rezeptorstelle gibt, der aus der Ligandenbindung der Verbindung an den Rezeptor resultiert. GABA_B-Rezeptoren wurden mit Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS), des Gastrointestinal(GI)-Traktes, der Lunge und der Blase in Verbindung gebracht und daher führt die Modulierung der GABA_B-Rezeptoraktivität in diesen Geweben zu einem positiven therapeutischen Ergebnis in Bezug auf solche Erkrankungen. Insbesondere haben diese Verbindungen, welche unter Verwendung der erfindungsgemäßen Durchmusterungsverfahren identifiziert werden, den Nutzen für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen wie Spastik, Epilepsie, Alzheimer-Krankheit, Schmerz sowie Gemütskrankheiten und Essstörungen. Es soll jedoch deutlich gemacht werden, dass die Erwähnung solcher Erkrankungen nur beispielhaft sein soll und nicht beabsichtigt, den Geltungsbereich der Erfindung einzuschränken.
Die Verbindungen, welche aufgrund der vorstehend kurz dargestellten Durchmusterungs-Verfahren identifiziert werden, können mit pharmazeutisch verträglichen Standard-Trägern und/oder -Excipienten formuliert werden, wie es in der Pharmazeutik Routine ist und wie es vollständig bei Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Esstern Pennsylvania, 17te Ausgabe, 1985, beschrieben wird, dessen Offenbarung in seiner Gänze durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist.
Die Verbindungen können auf enteralen oder parenteralen Wegen wie auf oralen, buccalen, analen, pulmonalen, intravenösen, intraarteriellen, intramuskulären, intraperitonealen, topischen oder anderen geeigneten Verabreichungswegen verabreicht werden.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden mittels Beispielen im angefügten experimentellen Teil weiter erklärt.
Experimenteller Teil
Erqebnisse
1. Clonierung von menschlichem GABA_B-R1 und eines neuen Rezeptor-Subtyps, GABA_B-R2
Menschliche Homologe zu den Ratten-GABA_B-R1a- und -1b-Spleißvarianten wurden aus den ESTs identifiziert und aus der menschlichen Kleinhirn-cDNA unter Verwendung einer Kombination von PCR und schneller Amplifizierung von cDNA-Enden (RACE)-PCR subcloniert. Menschliche GABA_B-R1a- und -1b-Sequenzen zeigen eine Identität von über 99% zu GABA_B-R1a und -GABA_B-R1b der Ratte (Daten nicht gezeigt). Diese Rezeptoren haben beide wie ihre Gegenstücke in der Ratte Signalsequenzen, gefolgt von erweiterten N-Termini, eine typische Sieben-Transmembran-Topologie und einen kurzen intrazellulären C-terminalen Schwanz. Der N-Terminus codiert die GABA-Bindungsdomäne, für die durch eingeschränkte Homologie zu bakteriellen periplasmatischen Proteinen vorhergesagt wird, dass sie als zwei globuläre Domänen existiert, welche GABA einfangen (Bettler et al., 1998), sowie drei potentielle N-Glycosylierungsstellen. Interessanterweise codiert der N-Terminus der GABA_B-R1a-Spleißvariante 129 Aminosäuren über die von GABA_B-R1b hinaus, welche zwei Tandem-Kopien der 'kurzen Consensuswiederholung', oder der Sushi-Domäne codiert. Sushi-Domänen sind etwa 60 Aminosäuren fang und existieren in einer breiten Vielfalt von Proteinen, die am Komplement und an der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt sind (Chou und Heinrikson, 1997). Daher können die Sushi-Domänen innerhalb von GABA_B-R1a die Protein-Protein-Wechselwirkungen möglicherweise durch Zell-Zell-Kontakt dirigieren und eine weitere Rolle für GABA_B-R1a über die von GABA_B-R1b hinaus und dieser übergeordnet widerspiegeln. Interessanterweise wurde während der Isolierung dieser Clone eine neue N-terminale Spleißvariante, GABA_B-R1c, identifiziert. GABA_B-R1c unterscheidet sich von GABA_B-R1a durch eine 185 bp-Deletion von den Basen 290 bis 475 (vgl. 2). Diese Region codiert eine der beiden Sushi-Domänen, die für GABA_B-R1a einzigartig sind und daher können die GABA_B-R1a- und GABA_B-R1c-Spleißvarianten zusammen mit ihrer zellulären Lokalisation in der Biologie der GABA_B-Rezeptoren bedeutsam sein. In der Tat legen in situ-Hybridisierungen nahe, dass GABA_B-R1a- und GABA_B-R1b unterschiedliche subzelluläre Lokalisationen aufweisen, wobei GABA_B-R1a eher an präsynaptischen als an postsynaptischen Stellen exprimiert wird (Bettler et al., 1998).
Datenbanksuchen identifizierten eine Anzahl von ESTs, welche eine schwächere Homologie zu GABA_B-R1 zeigen, was die Existenz eines neuen GABA_B-Rezeptor-Subtyps nahe legt. Unter Verwendung von PCR mit menschlicher Kleinhirn-cDNA bestätigten wir die Existenz eines solchen neuen GABA_B-Rezeptors, welchen wir cloniert und sequenziert haben (1). Dieser neue Rezeptor, den wir GABA_B-R2 genannt haben, zeigt insgesamt eine Ähnlichkeit von 54% und eine Identität von 35% zu GABA_B-R1 über die volle Länge des Proteins (2). Wie erwartet, wiesen die Hydrophobieprofile für GABA_B-R2 (3) darauf hin, dass das Protein ein Signalpeptid von 42 Aminosäuren aufweist, gefolgt von einer extrazellulären N-terminalen Domäne, die in der Größe mit der von GABA_B-R1b vergleichbar ist und sieben Transmembran umspannenden Regionen. Insgesamt fünf N-Glycosylierungsstellen wurden über die N-terminale Domäne vorhergesagt, von denen drei innerhalb von GABA_B-R1 konserviert sind. Schließlich codiert der Rezeptor eine intrazelluläre C-terminale Domäne, welche deutlich größer als diejenige von GABA_B-R1 ist. Innerhalb der GABA_B-R2-Sequenz wurden keine Sushi-Domänen identifiziert und wir haben bis heute keine Hinweise auf irgendwelche Spleißvarianten.
2. Gewebeverteilung
Die Expressionsspiegel von GABA_B-R1 und GABA_B-R2 wurden beide in verschiedenen Geweben und in verschiedenen Entwicklungsstadien durch Absuchen von menschlichen RNA-Masterblots (Clontech) bestimmt und verglichen. Diese Blots enthalten polyA⁺-RNA-Proben aus 50 menschlichen Geweben, welche auf die mRNA-Expressionsspiegel von acht verschiedenen „Haushalts"-Genen normalisiert wurden. GABA_B-R1-Spiegel wurden unter Verwendung einer pan-spezifischen Sonde, die alle Spleißvarianten abdeckt (4a), untersucht, und die Blots zeigen an, dass in Übereinstimmung mit den Beobachtungen von Kaupmann et al. (1997), GABA_B-R1 im ZNS, in allen Bereichen des Hirns und des Rückenmarks hochexprimiert ist. Im Gegensatz zu Kaupmann et al., (1997) finden wir jedoch, dass GABA_B-R1 auch in vergleichbaren Spiegeln in peripheren Geweben exprimiert wird, mit besonders hohen Expressionsspiegeln in der Hypophyse, Lunge, Eierstöcken, Niere, Dünndarm und Milz. In deutlichem Gegensatz dazu wird GABA_B-R2 spezifisch nur im ZNS in hohen Spiegeln exprimiert, mit der möglichen Ausnahme des Rückenmarks, wo die Expression etwas niedriger erscheint. In den peripheren Geweben wird kein Signal gesehen, weder in Gewebe von Erwachsenen noch in fötalem Gewebe (4b). Diese deutlich unterschiedliche Verteilung der mRNA-Spiegel zwischen GABA_B-R1 und GABA_B-R2 legt nahe, dass die beiden Subtypen unterschiedliche Rollen im ZNS und in der Peripherie spielen könnten.
3. Ursprüngliche Expressionsstudien
Wir schlussfolgerten, dass GABA_B-R2 ein GABA_B-Rezeptor mit hoher Affinität sein könnte und exprimierten daher den Rezeptor in sowohl Xenopus-Oocyten als auch in HEK293T-Zellen und suchten nach funktionellen Antworten. Trotz wiederholter Versuche, waren wir jedoch nicht in der Lage, eine funktionelle Aktivierung von GABA_B-R2 oder in der Tat GABA_B-R1a-, GABA_B-R1b- oder GABA_B-R1c-Rezeptoren entweder durch GABA selbst oder für GABA_B selektive Agonisten nachzuweisen (vgl. 9, 11 und 12). Einige Hinweise deuteten klar darauf hin, dass GABA_B-R1 in vivo nicht, wie vorhergesagt, exprimiert wurde. Erstens zeigte Durchflusscytometrie von HEK293T Zellen, die GABA_B-R1b exprimieren, dass die Rezeptoren auf internen Membranen zurückgehalten wurden, anstatt an der Zelloberfläche exprimiert zu werden (7). Zweitens wurden GABA_B-R1a und GABA_B-R1b durch ihre Sensitivität gegenüber den Endoglycosidasen F und H als unreife Glycoproteine exprimiert (8, Spuren 1–6) und schließlich gab die gemeinsame Expression von GABA_B-R1 mit entweder GIRK oder CFTR in Oocyten keinen Hinweis auf eine funktionelle Antwort (Daten nicht gezeigt). Wir folgerten, dass ein zusätzlicher Kofaktor notwendig sein muss, um eine funktionelle Antwort zu fördern.
4. Hefe-Zwei-Hybrid Genbank-Durchmusterung
Der Calcitonin-Rezeptor-ähnliche Rezeptor wird als unreifes Glycoprotein innerhalb des endoplasmatischen Retikulums zurückgehalten und benötigt ein zusätzliches Protein aus der unlängst identifizierten RAMP-Proteinfamilie, um den Rezeptor zur Oberfläche zu transportieren, um ein funktionelles CGPR(Calcitonin-Gen verwandtes Peptid) oder einen funktionellen Adrenomedullinrezeptor zu erzeugen (McLatchie et al., 1998). Wir vermuteten, dass die GABA_B-R1-Rezeptoren einen analogen Trafficking-Factor oder einen anderen Protein-Kofaktor für ihren Transport zur Zelloberfläche benötigen, um einen Rezeptor mit hoher Affinität zu schaffen. Um solche potentiellen in Wechselwirkung tretenden Proteine zu identifizieren, wurde eine Hefe-Zwei-Hybrid-Genbank-Durchmusterung unter Verwendung der C-terminalen 108 Aminosäuren von GABA_B-R1 einer cDNA-Genbank aus menschlichem Hirn durchgeführt. Interessanterweise zeigten Motivsuchen eine starke gewundenes Knäuel-Domäne innerhalb dieser 108 Reste, eine Struktur, von der bekannt ist, dass sie Protein-Protein-Wechselwirkungen vermittelt (Lupas, 1996). Aus insgesamt 4,3 × 10⁶ cDNAs wurden 122 positive Treffer gewonnen, von denen 33 die gesamte C-terminale Domäne von GABA_B-R2 codierten. Für diese Domäne von GABA_B-R2 wird in ähnlicher Weise vorhergesagt, dass sie ein gewundenes Knäuel-Motiv enthält, welches genau mit dem von GABA_B-R1 übereinstimmt (vgl. 2). Diese Beobachtung weist stark darauf hin, dass die beiden Rezeptoren mit ihren C-Termini in Wechselwirkung treten, um ein Heterodimer zu bilden. Bezeichnenderweise konnte durch die Durchmusterung die C-terminale Domäne von GABA_B-R1 selbst nicht wiedergefunden werden, was darauf hinweist, dass GABA_B-R1 nicht in der Lage ist, ein Homodimer zu bilden. Diese Wechselwirkung wurde direkt im Hefe-Zwei-Hybrid-System unter Verwendung der C-Termini der beiden Rezeptoren geprüft (5). GABA_B-R1 und GABA_B-R2 waren in der Lage, stark über ihre C-Termini in Wechselwirkung zu treten, während keiner der Rezeptoren in der Lage war, ein Homodimer zu bilden. Diese Beobachtung legte nahe, dass GABA_B-R1 und GABA_B-R2 über ihre C-terminalen gewundenes Knäuel-Domänen Heterodimere bilden, und führten zu der Spekulation, dass die Homodimerisierung eine funktionelle Bindestelle in vivo erzeugen kann. Daher bestätigten wir als nächstes die Wechselwirkung zwischen den beiden Rezeptor-Subtypen durch Immunpräzipitationsuntersuchungen am ganzen, Epitop-markierten Rezeptor in transfizierten HEK293T-Zellen.
5. Ko-Immunpräzipitationsuntersuchungen
Die Epitop-markierten Rezeptoren, Myc-GABA_B-R1b und HA-GABA_B-R, wurden transient in HEK293T Zellen entweder allein oder in Kombination exprimiert. Die Immunpräzipitation von Myc-GABA_B-R1b aus mit Detergenz solubilisierten Zellfraktionen mit Myc-Antiseren führte zum Immunnachweis von HA-GABA_B-R2 innerhalb von Immunkomplexen unter Verwendung von HA als primären Antikörper, aber nur nach gemeinsamer Expression mit dem Rezeptor (6, Spuren 1–3). GABA_B-R1- und GABA_B-R2-Assoziierung wurde durch gemeinsamen Immunnachweis von Myc-GABA_B-R1b aus Immunkomplexen, die unter Verwendung des anti-HA-Antikörpers eingefangen wurden, bestätigt. Wieder konnte die Ko-Immunpräzipitation nur gesehen werden, wenn die beiden Rezeptorformen gemeinsam exprimiert wurden (6, Spuren 4-6). Daher stellen diese Daten in Übereinstimmung mit den Beobachtungen aus dem Hefe-Zwei-Hybrid-System einen zwingenden Beweis für die Heterodimerisierung zwischen in voller Länge exprimiertem GABA_B-R1 und GABA_B-R2 in Säugerzellen bereit. Daher untersuchten wir als nächstes die Antworten der GABA_B-Rezeptoren nach gemeinsamer Expression von beiden Rezeptor-Subtypen in HEK293T-Zellen oder in Xenopus-Oocyten.
6. Oberflächen-Expression des Heterodimers
HEK293T-Zellen wurden transient mit Myc-GABA_B-R1b alleine oder in Kombination mit HA-GABA_B-R2 transfiziert und die Transfektanten wurden mittels Durchflusscytometrie analysiert (7). Myc-Immunreaktivität konnte nicht an der Oberfläche von Zellen nachgewiesen werden, die mit Myc-GABA_B-R1b allein transfiziert waren (7a), obwohl die Zellpermeabilisierung eine Immunreaktivität bei 35% (n = 3) der Zellpopulation offenbarte (7b). Diese letztere Beobachtung zeigte, dass Zellen effizient transfiziert waren, und wies darauf hin, dass die exprimierten Myc-GABA_B-R1-Rezeptoren ausschließlich auf internen Membranen lokalisiert waren. Im Gegensatz dazu zeigten 14% (n = 3) der HEK293T-Zellen, die mit HA-GABA_B-R2 transfiziert waren, eine Immunreaktivität an der Oberfläche (7c). Die gemeinsame Expression von Myc-GABA_B-R1b und HA-GABA_B-R2 führte jedoch zum Erscheinen von Myc-GABA_B-R1b an der Oberfläche von 20% (n = 3) der analysierten Zellen (7a), was stark darauf hinweist, dass eine gemeinsame Expression von GABA_B-R1b mit GABA_B-R2 für die Oberflächenexpression von GABA_B-R1b notwendig ist.
7. Rezeptorglycosylierungsuntersuchungen
Die Endoglycosidasen F und H können verwendet werden, um zwischen im Kern und an den Enden glycosylierten N-verknüpften Glycoproteinen zu unterscheiden. Daher wurden diese Enzyme verwendet, um den Glycosylierungsstatus von GABA_B-R1 und GABA_B-R2 nach Expression in HEK293T-Zellen zu untersuchen. Die Membranen von transfizierten Zellen wurden entweder mit Endoglycosidase F oder Endoglycosidase H behandelt und die exprimierten GABA_B-Rezeptoren wurden durch Immunblot-Verfahren charakterisiert, um die relativen elektrophoretischen Beweglichkeiten der Rezeptoren zu vergleichen (8). Die Zellmembranen, die entweder GABA_B-R1a oder -1b exprimierten, produzierten deutliche Banden von M_r130 beziehungsweise 100 K (8, Spuren 1 und 4), welche sich nach Endoglycosidase F-Behandlung in der Größe auf einzelne immunreaktive Spezies von M_r 110 und 80 K verringerten, welche GABA_B-R1a beziehungsweise GABA_B-R1b repräsentieren (8, Spuren 2 und 5). Dies zeigt, dass rekombinantes GABA_B-R1a beziehungsweise -1b Glycoproteine sind, was in Übereinstimmung mit Beobachtungen von Kaupmann et al. (1997) ist. Beide GABA_B-R1a und -1b-Spleißvariantenformen waren auch sensitiv gegenüber Behandlung mit Endogylcosidase H, was zeigt, dass die exprimierten Proteine nur im Kern glycosyliert sind (Spuren 3 und 6) und ihnen die endständige Glycosylierung fehlt. Diese Beobachtung, zusammen mit der FACS-Analyse, weist darauf hin, dass die Proteine unreif glycosyliert werden und in den internen Membranen zurückgehalten werden. Bezeichnenderweise war eine Komponente von GABA_B-R1a oder -1b resistent gegenüber Endoglycosidase H-Spaltung, wenn entweder GABA_B-R1a (Spuren 7–9) oder GABA_B-R1b (Spuren 10–12) mit HA-GABA_B-R2 gemeinsam exprimiert wurde, was darauf hinweist, dass eine deutlicher Anteil von GABA_B-R1 bei gemeinsamer Expression mit GABA_B-R2 nun ein reifes Glycoprotein ist (Spuren 9 und 12).
Ähnliche Untersuchungen mit HA-GABA_B-R2 ergaben eine immunreaktive Spezies mit einem Mr von 120 K (8, Spuren 13, 16, 19), welche gegenüber Behandlung mit Endoglycosidase F sensitiv war (Spuren 14, 17 und 20), jedoch resistent gegenüber Behandlung mit Endoglycosidase H (Spuren 15, 18 und 21), unabhängig davon, ob sie allein oder in Kombination mit GABA_B-R1 exprimiert wurde. Daher zeigen diese Daten, dass das exprimierte GABA_B-R2 ein reifes Glycoprotein ist, dessen Glycosylierungsstatus nicht durch die gemeinsame Expression mit GABA_B-R1 beeinträchtigt wird. Daher könnte die Heterodimerisierung zwischen GABA_B-R1 und GABA_B-R2, möglicherweise im Golgi-Komplex, eine Voraussetzung für die Reifung und den Transport von GABA_B-R1 zur Plasmamembran sein.
B. Funktionelle Untersuchungen
Um zu bestimmen, ob die gemeinsame Expression von GABA_B-R1 und GABA_B-R2 und ihre anschließende Glycosylierung im reifen Zustand und Expression an der Zelloberfläche einen Rezeptorkomplex erzeugte, der in der Lage war, funktionell auf GABA zu antworten, haben wir drei Typen von Signalisierungen gemessen. Wir verwendeten transient transfizierte HEK239T-Zellen, um erstens die Aktivierung von [³⁵S]GTPγS-Bindung in Membranen und zweitens die Hemmung von mit Forskolin stimulierter cAMP-Aktivierung in ganzen Zellen zu untersuchen. Drittens exprimierten wir GABA_B-R1 und GABA_B-R2 in Xenopus-Oocyten, die entweder den cystic-fibrosis transmembrane-regulator (CFTR) oder einwärts gleichrichtende K⁺-Kanäle (GIRK und KATP) exprimierten und untersuchten die Aktivierung des Ionenflusses als Antwort auf Agonisten.
i. [³⁵S]GTPγS-Bindung
Es wurde keine durch GABA stimulierte [³⁵S]GTPγS-Bindung in Membranen beobachtet, die aus Zellen präpariert wurden, die entweder mit GABA_B-R1 oder HA-GABA_B-R2 in Kombination mit G_o ₁α transfiziert waren. Die gemeinsame Expression von GABA_B-R1 und HA-GABA_B-R2 zusammen mit G_o1α führte jedoch zu einer kräftigen Stimulierung der [³⁵S]GTPγS-Bindungsaktivität (9a). Es wurde herausgefunden, dass dies Konzentrationsabhängig mit ähnlichen EC₅₀-Werten (Mittelwert ± SEM, n = 3) war, die für Membranen aus Zellen, die mit HA-GABA_B-R2 und G_o1α zusammen mit entweder GABA_B-R1a (9,5 ± 1,1 × 10^-5M) oder GABA_B-R1b (7,8 ± 0,4 × 10^-5M) transfiziert waren, bestimmt wurden (9b). Diese Werte sind äquivalent zu denen der durch GABA vermittelten Stimulierung der [³⁵S]GTPγS-Bindung an Membranen des Hirns der Ratte (5,9 ± 0,4 × 10^-5M) (Daten nicht gezeigt). Wir hatten die Befürchtung, dass eine N-terminale HA-Epitopmarkierung auf GABA_B- R2 die Rezeptorfunktion ändern könnte und daher führten wir parallele Untersuchungen in HEK293T Zellen durch, die unmarkierte Versionen von GABA_B-R2 und GABA_B-R1 zusammen mit G_o1α exprimierten. Ähnliche Wirksamkeiten und Stärken der GABA-Wirkung wurden in Membranen dieser Zellen beobachtet, wie es für die mit Epitop markierten Rezeptoren berichtet wurde (Daten nicht gezeigt), was eindeutig darauf hinweist, dass das Anfügen dieser Peptidsequenzen an die N-Termini von GABA_B-R2 und GABA_B-R1 die Rezeptorfunktion nicht signifikant änderte. Es ist bemerkenswert, dass eine messbare GABA-vermittelte Erhöhung der [³⁵S]GTPγS-Bindungsaktivität nur nach gemeinsamer Expression von GABA_B-R1 und HA-GABA_B-R2 zusammen mit zusätzlichem G_o1α beobachtet wurde (10). Die Notwendigkeit für zusätzliches G-Protein ist höchstwahrscheinlich durch die relativ niedrigen Spiegel endogen exprimierter G-Proteine der G_i/o-Familie bedingt, wodurch eine unterscheidbare GABA-vermittelte Antwort auf die gemeinsame Expression von GABA_B-R1 und GABA_B-R2 ausgeschlossen wird.
ii cAMP-Hemmung
Ähnliche Ergebnisse wurden unter Anwendung der Hemmung des durch Forskolin hervorgerufenen cAMP als Ablesung mit HEK293T Zellen erhalten, die transient mit GABA_B-R1 und GABA_B-R2 transfiziert waren. Wiederum wurden funktionelle Antworten nur dann beobachtet, wenn GABA_B-R1 und GABA_B-R2 gemeinsam exprimiert wurden (11).
iii Xenopus-Oocyten
Mit Xenopus-Oocyten kann auf drei Klassen von G-Proteinen getestet werden:

1) Durch die endogene Ca²⁺-aktivierte-Chlorid-Leitfähigkeit der Oocyten kann auf Aktivierung von G_q und eine anschließende Erhöhung des interzellulären Calciums getestet werden (Uezono et al., 1993).
2) Mit dem cystic-fibrosis-transmembrane-regulator (CFTR), welcher einen cAMP-aktivierten Chloridkanal enthält, kann die Rezeptoraktivierung über G_s oder G_i/o getestet werden (Uezono et al., 1993, Wotta et al., 1997).
3) Mittels G-Protein-regulierter Kalium-Kanäle GIRK1 (Kir 3.1, Kubo et al., 1993) und GIRK4 (oder CIR, Kir 3.4, Kaprivinsky et al., 1995), die in gleichen Mengen injiziert wurden, um einen heteromeren Kanal zu schaffen, kann auf die Aktivierung von für Pertussis-Toxin sensitive G-Proteine getestet werden (Kovoor et al., 1997).

Es wurden keine funktionellen Antworten auf GABA oder Baclofen gesehen, wenn clonierte GABA_B-R1a-, GABA_B-R1b- oder GABA_B-R2-Rezeptoren in Oocyten in Kombination mit CFTR oder GIRK1/4 exprimiert wurden (Daten nicht gezeigt, vgl. 12b). Wenn GABA_B-R1 und GABA_B-R2 mit CFTR gemeinsam exprimiert wurden, wurden einige signifikante kräftige Antworten nach Applikation von 100 μM GABA aufgezeichnet (12a). Außerdem führte die wiederholte Applikation von GABA zu einem progressiven Anstieg der Höhe der CFTR-Antwort, was darauf hinweist, dass die funktionelle Antwort des Heterodimers nun auf eine weitere Herausforderung durch den Agonisten sensitiviert ist. Dieses Phänomen wurde nicht für andere clonierte Rezeptoren beobachtet, die in Oocyten exprimiert wurden, und kann mit der Heterodimerisierung oder sogar der Oligomerisierung des GABA_B-Rezeptors in Zusammenhang stehen. Schließlich riefen zwei andere GABA_B-selektive Agonisten, Baclofen und SKF97541, funktionelle Antworten durch CFTR, ähnlich der durch GABA hervorgerufenen Antwort, hervor (12a). Im Gegensatz dazu ergaben die Antagonisten keine Antwort (Daten nicht gezeigt).
Als nächstes untersuchten wir das GABA_B-R1/GABA_B-R2-Heterodimer mit den durch G-Protein regulierten Kaliumkanälen GIRK1 und GIRK4 und fanden wieder Agonisten-abhängige Antworten. Die Auftragung des zeitlichen Verlaufs wurde für drei individuelle Oocyten untersucht, welche GABA_B-R2 alleine (linke Tafel), GABA_B-R1 plus GABA_B-R2 (mittlere Tafel) und den Adenosin-Al-Rezeptor (als Positivkontrolle, rechte Tafel) exprimieren (12b). In jedem Fall führte das Umschalten von einer physiologischen Lösung mit niedrigem Kaliumgehalt (ND96) auf eine extrazelluläre Lösung mit hohem Kaliumgehalt (90 mM K⁺) zu einer einwärts gerichteten Verschiebung des Haltestroms, was aus dem Agonisten-unabhängigen Einstrom von Kaliumionen durch den GIRK1/4-Kanal resultiert. Es wurde keine GABA-Antwort in Oocyten gesehen, die GABA_B-R2 in Isolierung exprimieren (12b, linke Tafel) und in ähnlicher Weise ergaben allein exprimiertes GABA_B-R1a und GABA_B-R1b auch keine Antwort auf GABA (Daten nicht gezeigt). Bezeichnenderweise wurde eine starke GABA-Antwort in Oocyten aufgezeichnet, die GABA_B-R1 und GABA_B-R2 gemeinsam exprimierten (12b, mittlere Tafel), wobei die Antwort in ähnlicher Höhe war wie die des Adenosin-Al-Rezeptors als Antwort auf den Agonisten NECA (12b, rechte Tafel). Daher ruft wiederum die gemeinsame Expression von zwei Rezeptor-Subtypen eine funktionelle Agonistenabhängige Antwort hervor, während die Expression von jedem Subtyp-Rezeptor alleine dies nicht tut. Wir untersuchten auch, ob die gemeinsame Expression der beiden Rezeptoren in Oocyten eine endogene Ca²⁺-aktivierte Chlorid-Leitfähigkeit aktivieren konnte. Es wurden keine Hinweise auf eine Aktivierung gesehen (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass zumindest in Oocyten der GABA_B-R1/GABA_B-R2-Komplex nicht durch G_q signalisiert. Schließlich wurde eine Stromstärke/Spannungskurve für eine Oocyte konstruiert, welche GABA_B-R1 und GABA_B-R2 gemeinsam exprimiert (13). Dies zeigt deutlich, dass GABA, das an den GABA_B-Rezeptor gebunden ist, einen starken einwärts gleichrichtenden Strom aktiviert, was mit der Aktivierung des GIRK-Kaliumkanals in einer vollständig Dosisabhängigen Art und Weise konsistent ist.
9. Stöchiometrische Untersuchungen am Heterodimer
Da die gemeinsame Expression von GABA_B-R1 und GABA_B-R2 für einen funktionellen GABA_B-Rezeptor notwendig ist, beschlossen wir, das stöchiometrische Verhältnis zwischen den beiden Rezeptor-Subtypen in vivo zu untersuchen. Die relativen Expressions-Spiegel für sowohl GABA_B-R1 als auch GABA_B-R2 wurden nach Transfektion in HEK293T-Zellen gemessen und mit der Rezeptorfunktion verglichen, wie durch GTPγS-Bindung bestimmt wurde (14). Steigende Mengen von HA-GABA_B-R1-Plasmid (bis zu 1 μg) wurden in HEK293T-Zellen zusammen mit einer konstanten Menge an HA-GABA_B-R2 (1 μg) transfiziert. GABA verursachte eine Stimulierung von [³⁵S]GTPγS-Bindung oberhalb der Basisspiegel in Membranen, die aus diesen Zellen extrahiert wurden, welche mit steigender Menge an transfiziertem HA-GABA_B-R1 stieg, bis die Bindung eine Sättigung erreichte, wenn die Spiegel an HA-GABA_B-R1 größer als 0,25 μg waren (14a). Immunblot-Verfahren mit den selben Membranproben zeigte äquivalente Expressionsspiegel von HA-GABA_B-R1 und HA-GABA_B-R2 in Membranen, die mit 0,25–0,5 μg HA-GABA_B-R1 transfiziert waren (14b). Dies entsprach bei der GABA-vermittelten Erhöhung der [³⁵S]GTPγS-Bindungsaktivität einem Plateau und weist daher stark darauf hin, dass GABA_B-R1 und GABA_B-R2 in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 funktionell in Wechselwirkung treten.
10. Kompetitionsbindungsuntersuchungen
Schließlich bestimmten wir, ob die beobachteten funktionellen Antworten durch den GABA_B-Rezeptor mit hoher Affinität bedingt waren, der sich aus einem Heterodimer der beiden Rezeptoren zusammensetzt. HEK293T Zellen wurden entweder mit 1 μg HA-GABA_B-R1b und HA-GABA_B-R2 einzeln oder mit steigenden Mengen (bis zu 1 μg) HA-GABA_B-R1 und einer festen Menge (1 μg) HA-GABA_B-R2 zusammen mit G_o ₁α transfiziert. Die Kompetitionsbindungstests wurden dann mit gereinigten Membranen durchgeführt. Die Expression von HA-GABA_B-R1b alleine produzierte ein hohes Maß an spezifischer Bindung von [³H]-CGP54626 (Bittiger et al., 1992), ein strukturelles Analog von [¹²⁵J]-CGP64213, und des Antagonisten, der ursprünglich verwendet wurde, um eine Expressionsclonierung von GABA_B-R1 durchzuführen (Kaupmann et al., 1997). Wie jedoch zuvor für [¹²⁵J]-CGP64213 berichtet wurde, waren die GABA-Hemmkurven im Vergleich zur Bindung an Membranen aus Rattenhirn deutlich nach rechts verschoben (15), was zu einem etwa 22-fach niedrigerem IC₅₀ als bei der Rattenhirnbindung führte. Bemerkenswerterweise zeigte die gemeinsame Expression von äquivalenten Mengen von HA-GABA_B-R1b- und HA-GABA_B-R2-Protein ein hohes Maß an spezifischer Bindung. In einem Kontrollexperiment unter Verwendung von unmarkierten Rezeptoren wurden ähnliche Werte erhalten (Daten nicht gezeigt). Das Erreichen eines stöchiometrischen Verhältnisses der Expression von HA-GABA_B-R1b und HA-GABA_B-R2 von 1:1 führte zu Agonisten-Hemmkurven, ähnlich denen, die in Rattenhirnmembranen erhalten wurden (IC₅₀ ± 95% Konfidenzintervalle für 1 μg HA-GABA_B-R2/0,25 μg HA-GABA_B-R1b = 2,29 μM (1,48–3,55 μM) und für Rattenhirn = 1,04 μM (0,69–1,58 μM). Für solche vergleichbaren Höhen der Rezeptorexpression wurde auch gezeigt, dass sie die optimale Agonisten-Aktivierung im GTPγS-Test erlauben (vgl. 14). Die Änderung des Rezeptorverhältnisses von 1:1 dahingehend, dass GABA_B-R1b der am stärksten vorherrschende Rezeptor war, führte zu verminderter Agonistenaffinität, wahrscheinlich durch Bindung an nicht dimerisierte und unreif glycosylierte GABA_B- R1b-Rezeptoren (15). Zusätzlich waren wir trotz seiner offensichtlichen Zelloberflächenexpression nicht in der Lage, irgendeine [³H]-CGP54626-spezifische Bindung an HEK293T-Zellen, die transient mit HA-GABA_B-R2 allein transfiziert waren, nachzuweisen (Daten nicht gezeigt). Wir schlussfolgern, dass die Heterodimerisierung der GABA_B-R1 und GABA_B-R2-Subtypen notwendig ist, um einen GABA_B-Rezeptor mit hoher Affinität zu erzeugen. Es gibt eine Anzahl von möglichen Erklärungen für die Änderung der GABA-Affinität nach gemeinsamer Expression der beiden Rezeptor-Subtypen. Das Erscheinen des GABA_B-Rezeptorkomplexes an der Zelloberfläche würde erwarten lassen, die G-Protein-Kopplung des Rezeptors zu erlauben, was die Agonistenaffinität erhöhen würde. In vorangehenden Untersuchungen wurde jedoch gezeigt, dass das Fehlen der G-Protein-Kopplung alleine nicht für den Unterschied der Agonistenaffinität zwischen Rattenhirn-Rezeptoren und GABA_B-R1 verantwortlich sein kann (Kaupmann et al., 1997). Weiterhin haben wir festgestellt, dass [³H]-CGP54626 primär den Rezeptor im Zustand niedriger Affinität zu binden scheint, sogar in Rattenhirnmembranen, wie durch die Tatsache demonstriert wird, dass GTPγS nicht in der Lage ist, die Agonisten-Hemmkurven zu verschieben, und tatsächlich die Höhe der [³H]-CGP54626-spezifischen Bindung erhöht (Daten nicht gezeigt). Daher ist eine wahrscheinlichere Erklärung für die Änderung der GABA-Affinität nach gemeinsamer Expression der beiden GABA_B-Rezeptoren diejenige, dass die Heterodimerisierung zusammen mit dem reifen Glycosylierungszustand des Proteins eine Bindungsstellen-Konformation mit einer inhärent höheren Affinität produziert.
Diskussion
Funktionelle GABA_B-Rezeptoren innerhalb des ZNS umfassen ein Zelloberflächen-Heterodimer mit zwei verschiedenen 7-Transmembran-Rezeptoruntereinheiten, GABA_B-R1 und GABA_B-R2, in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1. In vivo können GABA_B-Rezeptoren einfach als, Heterodimere existieren oder sie bilden sogar größere multimere Komplexe von vielen Heterodimeren. Die Bildung eines Heterodimers über die gewundenes Knäuel-Domänen innerhalb der C-terminalen Schwänze des Rezeptors scheint eine Voraussetzung für den Transport und die vollständige Glycosylierung von GABA_B-R1 sowie für die Erzeugung eines GABA_B-Rezeptors mit hoher Affinität an der Zelloberfläche zu sein. Unter Verwendung dieser Information waren wir in der Lage, die GABA_B-Stellen sowohl in Säuger-HEK293T Zellen als auch in Oocyten unter Verwendung von mehreren funktionellen Ablesungen wie der Aktivierung des Ionenflusses durch CFTR oder GIRK in Oocyten oder der Hemmung der Adenylylcyclase in HEK293T Zellen zu reproduzieren. In der Tat erklärt das Fehlen von funktionellen Antworten in Zellen, die GABA_B-R1 alleine exprimieren und die Notwendigkeit für die Expression eines zweiten 7TM-Rezeptors, warum viele Gruppen extreme Schwierigkeiten bei der Expressionsklonierung eines GABA_B-Rezeptors mit herkömmlichen Verfahren hatten. Wir glauben, dass dies der erste Bericht einer Rezeptor-Heterodimerisierung als eine obligatorische Voraussetzung ist, um einen voll funktionellen Rezeptor mit hoher Affinität in rekombinanten Systemen zu erzeugen, der zu dem von endogenen Geweben voll gleichwertig ist.
Die Dimerisierung wurde für andere Rezeptorfamilien berichtet, wie für die Opioid-Familie als Teil ihres Desensibilisierungsprozesses, den ß2-adrenergen Rezeptor, bei dem die Homodimere bei der Signalisierung eine Rolle spielen können, und den metabotropen Glutamat-Rezeptoren (mGluRs, Hebert et al., 1996; Romano et al., 1996, Cvejic et al., 1997, Hebert und Bouvier, 1998). Bemerkenswerterweise scheint die Dimerisierung in diesen Rezeptorfamilien nicht eine absolute Bedingung für die funktionelle Kopplung in rekombinanten Systemen zu sein. Im Fall der mGluRs, welche eine zu GABA_B eng verwandte Rezeptorfamilie sind (Kaupmann et al., 1997) wird die Homodimerisierung durch Disulfidbrücken zwischen den N-terminalen extrazellulären Domänen eher als durch ein C-terminales gewundenes Knäuel vermittelt. In der Tat ist die Heterodimerisierung zwischen zwei 7-Transmembran-Rezeptoren, die sowohl zum Transport als auch zur Glycosylierung der Proteine im reifen Zustand führt, um einen funktionellen Rezeptor zu erhalten, beispiellos und einzigartig im Gebiet der GPCR. Mit Sicherheit wurde für mGluRs nicht gefunden, dass sie Heterodimere bilden (Romano et al., 1996), und die Tatsache, dass zwei so eng verwandte Rezeptorfamilien solche unterschiedliche Mechanismen der Dimerbildung entwickelt haben, weist drauf hin, dass dies ein fundamental wichtiger Prozess für die Rezeptorfunktion ist.
In vivo weisen pharmakologische Hinweise darauf hin, dass es viele verschiedene GABA_B-Rezeptor-Subtypen sowohl innerhalb des ZNS, als auch in peripheren Geweben gibt. Wie bilden sich solche pharmakologischen Subtypen der GABA_B-Rezeptoren? Nur für GABA_B-R1 und GABA_B-R2 wurden bis heute getrennte Gene identifiziert und das Fischen in Datenbanken hat keine weiteren Rezeptorhomologe zu bekannten GABA_B-Rezeptoren identifiziert. Dies schließt nicht die Möglichkeit aus, dass noch mehr, bisher unerkannte GABA_B-Rezeptoren existieren. Die Unterschiede in der Verteilung existieren für die beiden GABA_B-Rezeptoren, zum Beispiel wird GABA_B-R2 spezifisch im ZNS exprimiert, während GABA_B-R1 sowohl an zentralen als auch an peripheren Stellen exprimiert wird. Diese Unterschiede in der Verteilung machen das Ganze eindeutig noch komplizierter, was zu pharmakologisch unterschiedlichen Rezeptor-Subtypen führt. Außerdem können die Gene, die GABA_B-Rezeptoren codieren, einem unterschiedlichen Spleißen unterliegen. GABA_B-R1 codiert drei N-terminale Spleißvarianten und noch mehr können entdeckt werden. Interessanterweise haben diese Spleißvarianten Änderungen in ihrer extrazellulären N-terminalen Domäne, der Region, die an der GABA-Bindung beteiligt ist (Takahashi et al., 1993, O'Hara et al., 1993), und codieren entweder zwei (GABA_B-R1a), eine (GABA_B-R1c) oder keine (GABA_B-R1b) Sushi-Domänen. In Anbetracht dessen, dass die Sushi-Domänen den Zell-Zell-Protein-Protein-Kontakt vermitteln, können die Unterschiede in den drei Spleißvarianten zu noch mehr pharmakologisch definierten GABA_B-Rezeptor-Subtypen führen. Bis heute haben wir keine Spleißvarianten von GABA_B-R2 entdeckt. Weiterhin gibt es signifikante Unterschiede in der Verteilung der individuellen Spleißvarianten, was darauf hinweist, dass sie verschiedenen Funktionen innerhalb des ZNS übernehmen. Zum Beispiel wird über die GABA_B-R1a-Spleißvariante berichtet, dass sie innerhalb des Hirns präsynaptisch ist (Bettler et al., 1998), und sie kann daher präsynaptische GABA_B-Autorezeptoren definieren. Es erscheint wahrscheinlich, dass diese Spleißvarianten von GABA_B-R1 zumindest zu einigen der pharmakologisch definierten Subtypen führen. Schließlich wurde mit dieser neuen Beobachtung einer obligaten Rezeptor-Heterodimerisierung eine weitere Stufe der Komplexizität hinzugefügt wurde, da die funktionellen GABA_B-Bindungsstellen einen Heterodimerisierungspartner benötigen.
Nun da die molekulare Natur des GABA_B-Rezeptors besser verstanden ist, können rekombinante Systeme für Hochdurchsatz-Durchmusterungen nach Verbindungen gegen individuelle pharmakologisch definierte GABA_B-Stellen etabliert werden. Mit diesen Mitteln können Verbindungen mit höherer Spezifität und mit weniger unerwünschten Nebenwirkungen entdeckt werden. Dazu sollten GABA_B-R1 und GABA_B-R2 (einschließlich aller Spleißvarianten und jeglicher Fragmente des Rezeptors) entweder stabil oder transient in geeigneten Wirtszellen gemeinsam exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen umfassen höhere eukaryontische Zelllinien wie Säugerzellen, Insektenzellen, niedrigere eukaryontische Zellen wie Hefezellen oder prokaryotische Zellen, wie Bakterienzellen. Durchmusterungstests mit diesen rekombinanten Zelllinien könnten die Verwendung von Radioligandenbindung an das Dimer oder individuelle Untereinheiten innerhalb des Dimers umfassen. Das Aktivitätsprofil in einem Bindungstest an das Dimer ist wahrscheinlich zur Aktivität der getesteten Verbindungen unter Verwendung der Bindungstests an GABA_B-R1 alleine aufgrund von Änderungen im Glycosylierungsstatus und der Konformation des Rezeptors als Ergebnis der gemeinsamen Expression von GABA_B-R1 und GABA_B-R2 unterschiedlich. Funktionelle Tests, welche die Ereignisse stromabwärts der Rezeptoraktivierung messen, können auch zur Durchmusterung von Verbindungen verwendet werden. Solche Tests umfassen die [³⁵S]GTPγS-Bindung an Membranen, die aus Zellen isoliert wurden, welche das Dimer exprimieren, die Aktivierung oder Hemmung von Ionenkanälen unter Verwendung von elektrophysiologischer Aufzeichnung oder Ionenfluss-Tests, die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium, die Modulierung von cAMP-Spiegeln, die Aktivierung oder Hemmung der MAP-Kinase-Wege oder die Änderungen der Aktivität von Transkriptionsfaktoren unter Verwendung von Reportergenen. Dazu können sekundäre Durchmusterungen in einer ähnlichen Art und Weise unter Verwendung von verschiedenen Heterodimer-Kombinationen etabliert werden, um unerwünschte Aktivität auszuschließen und dadurch Subtypen-selektive GABA_B-Verbindungen zu ermitteln.
Zusätzlich könnte ein beliebiger Ansatz, der auf die Zerstörung oder die Verstärkung der Dimerbildung des GABA_B-Heterodimers abzielt, einen neuen therapeutischen Ansatz darstellen, mit dem auf GABA_B-Rezeptoren gezielt wird. Solche Strategien könnten Peptide oder Proteine, die physikalisch mit gewundenes Knäuel-Domänen assoziiert sind, oder tatsächlich beliebige andere in Wechselwirkung tretende Bereiche des Dimers umfassen. Kleine Moleküle könnten ebenfalls identifiziert werden, welche an den Kontaktpunkten, die durch die Wechselwirkung der Bestandteile des Dimers entstehen, wirken. Diese können die Rezeptorfunktion entweder fördern oder verstärken. Schließlich könnten Antikörper hergestellt werden, welche, im Gegensatz zu den Monomer-Untereinheiten, Epitope auf dem Dimer spezifisch erkennen. Diese könnten als Werkzeuge verwendet werden, um die Funktion von GABA_B-Rezeptoren bei Krankheiten oder als therapeutische Mittel selbst aufzuklären.
Verfahren
DNA-Manipulation
sStandardprotokolle der Molekularbiologie wurden durchgängig verwendet (Sambrook et al., 1989) und alle bakterielle Manipulationen wurden unter Verwendung von Escherichia coli XL-1 Blue (Stratagene) gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Standardbedingungen für PCR wurden durchgängig verwendet, wenn nicht anders angegeben. Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt 10–50 ng Ziel-DNA, 1 pMol von jedem Primer, 200 μM dNTPs und 2,5 E von entweder Taq-Polymerase (Perkin-Elmer) oder Pful-Polymerase (Stratagene) mit dem geeigneten Puffer, der vom Hersteller bereitgestellt wird. Die Zyklisierungsparameter waren 1 Zyklus 95°C für 2 Minuten, 25 Zyklen 95°C für 45 Sekunden, 55°C für 45 Sekunden, 72°C für 1 Minute und 1 Zyklus 72°C für 10 Minuten. Alle PCRs wurden unter Verwendung von entweder einer Perkin Elmer-9600-PCR-Maschine oder einer Robocycler Gradient 96 PCR-Maschine (Stratagene) ausgeführt.
GABA_B-R1 - Clonierung von menschlichen Homologen und Spleißvarianten
Einige menschliche ESTs (X90542, X90543, D80024, AA348199, T06711, T07518 und AA38224) wurden als Homologe zu GABA_B-R1a der Ratte und GABA_B-R1b-Sequenzen (Y10369, Y10370) identifiziert. Die ESTs wurden ausgerichtet und der vorhergesagte offene Leserahmen wurde mittels RT-PCR ausgehend von polyA⁺-RNA aus menschlichem Kleinhirn (Clontech) unter Verwendung des Superscript-Preamplification-System (Life Technologies) amplifiziert. Das 3'-Ende des Rezeptors (1545–2538 Bp, GABA_B-R1b) wurde unter Verwendung der Primer 5'- GCGACTGCTGTGGGCTGCTTACTGGC-3' und 5'-GCGAATTCCCTGTCCTCCCTCACCCTACCC-3' amplifiziert. Der zentrale Bereich (277–1737 Bp von GABA_B-R1b) wurde unter Verwendung von 5'- CCGAGCTCAAGCTCATCCACCACG und 5'-TCTTCCTCCACTCCTTCTTTTCTT-3' amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in pCR-Script SK(+) (PCR-Script Amp-Clonierungskit, Stratagene) untercloniert. Ein fehlerfreies PCR-Produkt wurde in einer Drei-Wege-Ligierung über BstEII, SacI und EcoRI zusammengesetzt und in pBluescript SK(–) (Stratagene) untercloniert.
Die N-Termini der Spleißvarianten wurden unter Verwendung von RACE (schnelle Amplifizierung von cDNA-Enden) mit dem Marathon-cDNA-Amplifikations-Kit gegen menschliche Marathon-Ready-Kleinhirn-cDNA (Clontech) erzeugt. RACE-PCR wurde ausgehend von einer konservierten Sequenz innerhalb von GABA_B-R1 unter Verwendung des Primers 5'-TGAGCTGGAGCCATAGGAAAGCACAAT-3' gestartet, um ein Produkt von 700 Bp zu erzeugen. Durch diese weitere PCR erfolgte unter Verwendung des AP2-Primers (Marathon) und einem zweiten internen GABA_B-R1-Primer 5'-GATCTTGATAGGGTCGTTGTAGAGCA-3' eine Amplifikation.
Das entstehende Produkt von 600 Bp wurde unter Verwendung des Zero-Blunt-PCR-Clonierungskits (Invitrogen) untercloniert. Die Sequenzinformation, die aus dieser RACE-PCR erhalten wurde, wurde verwendet, um den N-Terminus der GABA_B-R1-Spleißvariante unter Verwendung der Primer 5'-GCTCCTAACGCTCCCCAACA-3' und 5'-GGCCTGGATCACACTTGCTG-3' in pCR-Script SK(+) (Stratagene) zu clonieren. Menschliche GABA_B-R1a-5'-Sequenzen wurden von ESTs (1005101, 3289832) der Incyte-Datenbank heruntergeholt und verwendet 5'-CCCAACGCCACCTCAGAAG-3' und 5'-CCGCTCATGGGAAACAGTGC-3' zu entwerfen. Eine PCR mit cDNA aus Kleinhirn und cDNA aus der KELLY-Neuroblastom-Zelllinie lieferte zwei deutliche Banden bei 300 Bp und 400 Bp, welche in pCR-Script SK(+) (Stratagene) cloniert wurden. Die Sequenzierung ergab, dass das 400 B_P-Produkt einige der menschlichen GABA_B-R1a-5'-Sequenzen codierten und das 300 B_P-Produkt die neue Splice-Variante GABA_B-R1c codierte. Als nächstes wurde der Primer 5'-CCCCGGCACACATACTCAATCTCATAG-3' entworfen, um eine RACE-PCR auf die fehlenden ~225 Bp von GABA_B-R1a durchzuführen. Ein Produkt von 250 Bp wurde erhalten und erneut unter Verwendung des Primers 5'-CCGGTACCTGATGCCCCCTTCC-3' mit dem Primer AP2 (Marathon) amplifiziert. Eine Bande von ~250 Bp wurde erneut erzeugt, in pCR-Script SK(+) untercloniert, und diese codierte, nachdem sie sequenziert wurde, das 5'-Ende von GABA_B-R1a. Als nächstes wurden Clone erzeugt, die sowohl die konservierte Rezeptorsequenz als auch die % Enden der Spleißvarianten GABA_B-R1a und GABA_B-R1c umfassten. Der Primer 5'-CGAGATGTTGCTGCGCTGCTA-3', der vom Startcodon ausging und der reverse RACE-Primer erzeugten eine vorhergesagte Bande von ~800 Bp und diese wurde in pCR-Script SK(+) untercloniert. Nun können Clone in voller Länge von GABA_B-R1a, GABA_B-R1b und GABA_B-R1c in pcDNA3.1(–) (Invitrogen) zusammengesetzt werden. Die GABA_B-R1b 5'-Sequenzen, die mit NotI/SacI gespalten wurden, und die konservierte Region des Rezeptors, die mit EcoRI/SacI gespalten wurde, wurden beide zusammen in pcDNA3.1(–), gespalten mit NotI/EcoRI, gemeinsam ligiert. In ähnlicher Weise wurden die GABA_B-R1a- und GABA_B-R1c-5'-Fragmente über XhoI/SacI mit dem konservierten EcoRI/SacI-Fragment untercloniert und in pcDNA3.1(–), der mit XhoI/EcoRI geschnitten wurde, gemeinsam ligiert, um Clone in voller Länge wiederherzustellen.
Markierung von GABA_B-R1b
GABA_B-R1b wurde entweder mit myc- oder HA-Epitopen markiert. Die PCR-Primer 5'-TAGGATCCCACTCCCCCCATCCC-3' und 5'-CCAGCGTGGAGACAGAGCTG-3' wurden verwendet, um die Region, die der vorgeschlagenen Signalsequenz (Position 88) unmittelbar folgt, bis etwa 20 Bp stromabwärts einer einzigartigen PstI-Stelle an Position 389 der codierenden Sequenz zu amplifizieren, wodurch eine einzigartige 5'-BamHI-Stelle im Leseraster geschaffen wurde. Dieses Fragment wurde über BamHI/PstI in einen Vektor, enthaltend die CD97-Signalsequenz, das myc-Epitop und eine BamHI-Stelle im Leseraster, cloniert. Dieses Konstrukt enthält auch eine NotI-Stelle 5' der CD97-Signalsequenz und eine EcoRI-Stelle stromabwärts der PstI-Stelle. GABA_B-R1b-Sequenzen stromabwärts der PstI-Stelle und bis zu einer externen EcoRI-Stelle wurden aus dem Rezeptor in voller Länge in den vorstehend beschriebenen Vektor, der genauso mit PstI/EcoRI geschnitten wurde, untercloniert, um markiertes GABA_B-R1b in voller Länge zusammenzusetzen. Die CD97-Signalsequenz, das myc-Epitop und die GABA_B-R1b codierende Sequenz wurden über NotI/EcoRI in pCDNA3.1(–) (Invitrogen) untercloniert.
Das HA-Epitop wurde durch gemeinsame Ligierung der 5'-BamHI/PstI- und 3'-PstI/EcoRI-Fragmente in pCIN6, gespalten mit BamHI/EcoRI, an GABA_B-R1b angefügt. Dieser Vektor enthält eine T8-Signalsequenz und ein 12CA5-HA-Epitop, das einer BamHI-Stelle im Leseraster unmittelbar vorangeht.
Clonierung von GABA_B-R2, dem neuen GABA_B-Rezeptor-Subtyp
Die EST-Clone (H14151, R76089, R80651, AA324303, T07621, Z43654) wurden mit einer Nucleotid-Identität zu GABA_B-R1 von etwa 50% identifiziert. Die PCR zeigte, dass H14151 eine Insertion von 1,5 Kb enthielt und ausreichend Sequenz für einen wesentlichen Teil des neuen GABA_B-Rezeptors codierte. Eine PCR zwischen dem 3'-Ende von H14151 und dem 5'-Ende von AA324303 unter Verwendung einer cDNA-Genbank aus Kleinhirn als Matrize erzeugte ein Produkt von ~700 Bp, welches zeigte, wenn es in den T-Vektor (TA-Clonierungskit, Invitrogen) cloniert und sequenziert wurde, dass T07621 innerhalb von AA324303 überlappt. Außerdem wurde gefunden, dass Z43654 sowie die genomischen DNA-Fragmente R76089 und R80651 mit AA324303 überlappten und zusammen Sequenzdaten für das 3'-Ende des GABA_B-Subtyp-Rezeptors bereitstellten. Eine weitere Sequenzierung von H14151 stellte die vollständige Sequenz für den neuen Rezeptor-Subtyp bereit. Die Incyte-Clone 662098 und 090041, welche mit dieser Region überlappten, wurden jedoch wegen Uneindeutigkeiten an der Position des Stoppcodons in Z43654/R80448/R80651 sequenziert. Das Stoppcodon wurde identifiziert und für die Sequenz für GABA_B-R2 wurde bestätigt, dass sie innerhalb von H14151 (5'-Ende) und 662098 (3'-Ende) liegt. Die 5'-Sequenzen von GABA_B-R2 wurden unter 5'-ATGGCTTCCCCGCGGAG-3', um das Startcodon des Rezeptors bereitzustellen, und des Primers 5'-GAACAGGCGTGGTTGCAG-3', der sich jenseits einer einzigartigen EagI-Stelle anlagert, durch PCR erzeugt. Das erwartete Produkt von ~250 Bp wurde in pCRSCRIPT cloniert und sequenziert. Der Rezeptor in voller Länge wurde dann mittels einer 3-Wege-Ligierung zwischen H14151, geschnitten mit ApaLI/EagII, 662098, geschnitten mit ApaLI/NotI, und dem pCRSCRIPT-GABA_B-R2-5'-PCR-Produkt, gespalten mit EagI, zusammengesetzt.
GABA_B-R2 in voller Länge wurde aus dem pCRSCRIPT Vektor unter Verwendung von EcoRI/NotI entfernt und für Expressionsuntersuchungen in pcDNA3 (Invitrogen) ligiert.
Das mit HA-Epitop markierte GABA_B-R2 wurde in pCIN6 konstruiert. Ein Linker, der die Aminosäuren zwischen der GABA_B-R2-Signalsequenz und der einzigartigen EagI-Stelle codierte, wurde konstruiert.
HindIII XhoI EagI EcoRI AGCT TCTC GAG GCT TGG GGA TGG GCA CGA GGA GCT CCT GCT CGG CCG G A GAG CTC CGA ACC CCT ACC CGT GCT CCT CGT GGT CGA GCC GGC CTT AA Ala Trp Gly Trp Ala Arg Gly Ala Pro Arg
Der Linker wurde in pUC18 cloniert (EcoRI/HindIII), gefolgt von GABA_B-R2 in voller Länge aus dem pCRSCRIPT als ein EagI/NotI-Fragment. Schließlich wurde das modifizierte GABA_B-R2 in pCIN6 als ein XhoI-Fragment cloniert.
Verteilungsuntersuchungen
Die Blots wurden über Nacht bei 65°C gemäß der Anleitung des Herstellers mit radioaktiv markierten, sich zufällig angelagerten cDNA-Sonden unter Verwendung der ExpressHyb-Hybridisierungslösung hybridisiert. Die Sonde für GABA_B-R1, entsprechend den Resten 1129-1618 der codierenden GABA_B-R1b-Sequenz, wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-CGCCTGGAGGACTTCAACTACAA-3' und 5'-TCCTCCCAATGTGGTAACCATCG-3' gegen GABA_B-R1b-DNA als Matrize amplifiziert. Die cDNA-Sonde für GABA_B-R2, entsprechend den Resten 1397-1800, wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-ACAAGACCATCATCCTGGA-3' und 5'-GATCACAAGCAGTTTCTGGTC-3' mit GABA_B-R2-DNA als Matrize amplifiziert. Die DNA-Fragmente wurden mit ³²P-α-dCTP unter Verwendung des Rediprime-DNA-Markierungs-Systems (Amersham) markiert. Die Sonden wurden zu einer spezifischen Aktivität von >10⁹ ZpM/μg markiert und in einer Konzentration von etwa 5 ng/ml Hybridisierungslösung verwendet. Nach der Hybridisierung wurden die Blots mit 2 × SSC/1% SDS bei 65°C und 0,1 × SSC/0,5% SDS bei 55°C (20 × SSC ist 3M NaCl/0,3M Na₃Citrat·2H₂O, pH 7,0) gewaschen und gegen einen Röntgenfilm exponiert.
Hefe-Zwei-Hybrid-Untersuchungen
Saccharomyces cerevisiae Y190 [MATa, gal4, Igal80, ade2-101, his3, trp1-901, ura3-52, leu2-3, 112, URA3::GAL1-lacZ, LYS2::GAL1-HIS3, cyh^R] wurde für alle beschriebenen Hefe-Zwei-Hybrid-Arbeiten verwendet (Harper et al., 1993, Clontech Laborstories, 1996). Die GAL4-Bindungsdomänen (GAL4BD)-Fusionsvektoren wurden entweder in pYTH9 (Fuller et al., 1998) oder pYTH 16, einer episomalen Version von pYTH9, konstruiert. Alle GAL4-Aktivierungsdomänen-Fusionen wurden in pACT2 (Clontech Laborstories, 1998) durchgeführt. Alle Hefe-Manipulationen wurden unter Verwendung von Standard-Hefemedien ausgeführt (Sherman, 1991). Eine MATCHMAKER-Genbank aus menschlichem Hirn (HL4004AH) in pACT2 wurde bei Clontech Laborstories erworben und gemäß den Anleitungen des Herstellers amplifiziert. Die C-terminale Domäne von GABA_B-R1 wurde aus einem Clon in voller Länge unter Verwendung der Primer 5'-GTTGTCCCCATGGTGCCCAAGATGCGCA GGCTGATCACC-3' und 5'-
GTCCTGCGGCCGCGGATCCTCACTTATAAAGCAAATGCACT CG-3' amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde nach Größe auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt, gereinigt und unter Zwang über NcoI/NotI in pYTH9 und anschließend in pACT2 cloniert. Die C-terminale Domäne von GABA_B-R2 wurde in ähnlicher Weise mit den Primem 5'-CTCTGCCCCATGGCCGTGCCGAAGCTCATCACCCTGA GAACAAACCC-3' und 5'-GGCCCAGGGCGGCCGCACTTACAGGCCCGAGACCATGACTC GGAAGGAGGG-3' erzeugt und in pYTH9, pYTH 16 und pACT2 untercloniert. Alle clonierten PCR-Produkte wurden sequenziert und als fehlerfrei bestätigt. Die Fusion von GAL4B_D-GABA_B-R1-C-Terminus in pYTH9 wurde stabil im trp1-Locus von Y190 durch zielgerichtete homologe Rekombination integriert. Hefen, die den GAL4B_D-GABA_B-R1-C-Terminus von exprimierten, wurden selektioniert und unter Leucin-Selektion mit einer cDNA-Genbank aus menschlichem Hirn unter Verwendung eines hocheffizienten Lithiumacetat-Transformationsprotokolls (Clochtech Laborstories, 1998) transformiert. Ausreichend unabhängige cDNAs wurden transformiert, um eine dreifache Repräsention der Genbank zu ergeben. Clone, die in Wechselwirkung traten, wurden durch Selektion unter 20 mM 3-Amino-1,2,4-triazol (Sigma) auf Wachstum selektioniert, gefolgt von Produktion von β-Galactosidase, wie durch einen Gefrierbruch-Test (Clontech Laborstories, 1998) bestimmt wurde. Die Plasmid-DNA wurde nach Spaltung der Zellwand durch 400 μg/ml Zymolase 100T (ICN Biochemicals) in 250 μl 1,2 M Sorbit, 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) bei 37°C für 2 Stunden aus den Hefezellen gewonnen. Die Plasmid-DNA wurde durch eine alkalische Standard-Lyse-Miniprep von Qiagen nach der Anleitung des Herstellers extrahiert und in ultrakompetente XL-2Blue-Zellen (Stratagene) transformiert. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Primers 5'-CAGGGATGTTTAATACCACTACAATGG-3' unter Verwendung von automatisierter ABI-Sequenzierung sequenziert und die entstehenden Sequenzen wurden gegen Datenbanken mittels BLAST analysiert.
Hefe Y190 wurde mit pYTH16 und pACT2, welche die C-terminale Domäne von GABA_B-R1 und die C-terminale Domäne von GABA_B-R2 exprimiert, in allen Kombinationen sowie mit leeren Vektoren transformiert. Die Transformanten wurden in Flüssigmedium bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet und etwa 1,5 ml wurden geerntet. Die β-Galactosidase-Aktivität wurde unter Verwendung des Substrats o-Nitrophenyl-β-D-galactopryranosid (ONPG, Sigma) unter Verwendung eines Gefrierbruchsystems mit flüssigem Stickstoff, im Wesentlichen wie durch Harshman et al., (1988) beschrieben, quantifiziert.
Zwei-Mikroelektroden-Spannungsklemme in Xenopus-Oocyten
Erwachsene weibliche Xenopus laevis-Tiere (Blades Biologicals) wurden unter Verwendung von 0,2% Tricaine (3-Aminobenzoesäure-ethylester) anästhesiert, getötet und die Eierstöcke wurden zügig entfernt. Die Oocyten wurden durch Kollagenaseverdau (Sigma Typ I, 1,5 mg ml^-1) in divalenter, Kationen-freier OR2-Lösung (82,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH₂PO₄, 5 mM HEPES, pH 7,5 bei 25°C) von den Follikeln befreit. Einzelne Oocyten im Stadium V und VI wurden in ND96-Lösung (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH 7,5 bei 25°C), welches 50 μg ml^-1 Gentamycin enthielt, übertragen und bei 18°C gelagert.
GABA_B-R1a und GABA_B-R1b (beide in pcDNA3.1rev, Invitrogen), GABA_B-R2, GIRK1, GIRK4 (in pcDNA3) und cytic-fibrosis-transmembrane-regulator (CFTR, in pBluescript, Stratagene) wurden linearisiert und unter Verwendung von T7- oder T3-Polymerase in RNA umgeschrieben (Promega-Wizard-Kit). Mit m'G(5')pp(5')GTP-Kappenstruktur am Ende versehene cRNA wurde in Oocyten (20–50 nl von 1 μg μl^-1 RNA pro Oocyte) injiziert und die Ströme in ganzen Zellen wurden unter Verwendung von Zwei-Mikroelektroden-Spannungsklemmen (Geneclamp-Verstärker, Axon Instruments Inc.) 3 bis 7 Tage nach der RNA-Injektion aufgezeichnet. Die Mikroelektroden hatten einen Widerstand von 0,5 bis 2 MΩ, wenn sie mit 3 M KCl gefüllt waren. In allen Experimenten wurde bei den Oocyten eine Spannungsklemme bei einem Haltepotential von –60 mV in ND96-Lösung (umströmt mit 2 ml pro Min.) angewandt und Agonisten wurden durch Zugabe zu dieser extrazellulären Lösung angewendet. In GIRK-Experimenten wurde die extrazelluläre Lösung vor der Anwendung des Agonisten in eine Lösung mit hohem Kaliumgehalt geändert, um die Aufzeichnung von einwärts gerichteten Kaliumströmen zu ermöglichen. Die Strom/Spannungskurven wurden durch Anwendung von Spannungsklemmen-Pulsen von 200 ms vom Haltepotential von –60 mV zu Testpotentialen von zwischen –100 mV und +50 mV erstellt.
Säugerzellkultur und Transfektionen
HEK293T-Zellen (HEK293-Zellen, die das große SV40-T-Antigen stabil exprimieren) wurden in DMEM, enthaltend 10% (Vol./Vol.) fötales Kälberserum und 2 mM Glutamin gehalten. Die Zellen wurden vor der Transfektion mittels Lipofectamin-Reagenz mit pCDNA3, enthaltend die relevante DNA-Spezies, in 60-mm-Kulturschalen ausgesät und bis zu einer Konfluenz von 60–80% gezüchtet (18–24 Std.). Für die Transfektion wurden 3 μg DNA mit 10 μl Lipofectamin in 0,2 ml Opti-MEM (Life Technologies Inc.) vermischt und bei Raumtemperatur für 30 Min. vor der Zugabe von 1,6 ml Opti-MEM inkubiert. Die Zellen wurden für 5 Std. dem Lipofectamin/DNA-Gemisch ausgesetzt und 2 ml 20% (Vol./Vol.) Serum von neugeborenen Kälbern in DMEM wurden dann zugegeben. Die Zellen wurden 48–72 Std. nach der Transfektion geerntet.
Präparation von Membranen
Plasmamembran enthaltende partikuläre P2-Fraktionen wurden aus Zellpasten, die nach der Ernte bei –80°C eingefroren wurden, präpariert. Alle Verfahren wurden bei 4°C durchgeführt. Die Zellsedimente wurden in 1 ml 10 mM Tris-HCl und 0,1 mM EDTA, pH 7,5 (Puffer A) resuspendiert und durch Homogenisierung für 20 s mit einem Polytron-Homogenisator, gefolgt von dem Passieren (fünfmal) durch eine 25 Gauge-Nadel aufgebrochen. Die Zelllysate wurden bei 1000 g für 10 Min. in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um die Kerne und die nicht aufgebrochenen Zellen zu sedimentieren, und die partikulären P2-Fraktionen wurden durch Mikrozentrifugation bei 16.000 g für 30 Min. gewonnen. Die partikulären P2-Fraktionen wurden in Puffer A resuspendiert und bei –80°C so lange gelagert, bis sie benötigt wurden. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bicinchoninsäure(BCA)-Verfahrens (Smith et al., 1985) unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt.
[³⁵S]GTPγS-Bindung mit hoher Affinität
Die Tests wurden unter Verwendung eines Verfahrens in Abwandlung dessen von Wieland und Jakobs, 1994, in einem Format mit 96-Vertiefungen durchgeführt. Die Membranen (10 mg pro Punkt) wurden auf 0,083 mg/ml in Testpuffer (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, pH 7,4), ergänzt mit Saponin (10 mg/l), verdünnt und mit 40 mM GDP vorinkubiert. Verschiedene Konzentrationen an GABA wurden zugegeben, gefolgt von [³⁵S]GTPγS (1170 Ci/mMol, Amersham) mit 0,3 nM, (Gesamtvolumen von 100 ml) und die Bindung wurde bei Raumtemperatur für 30 Min. ablaufen gelassen. Nicht-spezifische Bindung wurde durch Hinzufügen von 0,6 mM GTP bestimmt. Weizenkeim-Agglutinin-SPA-Kügelchen (Amersham) (0,5 mg) in 25 ml Testpuffer wurden zugegeben und das Ganze wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Bewegung inkubiert. Die Platten wurden bei 1500 g für 5 Min. zentrifugiert und das gebundene [³⁵S]GTPγS wurde durch Szintillationszählung auf einem 1450-Microbeta-Trilux Szintillationszähler, Wallac, bestimmt.
Messung der cAMP-Spiegel
24 Stunden nach der Transfektion wurde jede 60-mm-Schale mit HEK293T-Zellen in 36 Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen aufgeteilt und man ließ die Zellen konnten sich über Nacht wieder anheften. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit DMEM-Medium, enthaltend 300 μM IBMX, für 30 Minuten bei 37°C vorinkubiert. Forskolin (50 μM) und verschiedene Konzentrationen von GABA wurden zugegeben und die Zellen wurden für weitere 30 Min. vor der cAMP-Extraktion mit 0,1 M HCl für 1 Std. bei 4°C inkubiert. Die Tests wurden mit 0,1 M KHCO₃ neutralisiert und die cAMP-Spiegel wurden unter Verwendung von Szintillations-Näherungstests (Biotrak-Kit, Amersham) bestimmt.
Durchflusscytometrische Analyse
HEK293T-Zellen wurden, wie beschrieben, transient mit cDNA transfiziert. 48–72 Std. nach der Transfektion wurden die Zellen zurückgewonnen und zweimal in PBS, ergänzt mit 0,1% (Gew./Vol.) NaN₃ und 2,5% (Vol./Vol.) fötalem Kälberserum, gewaschen. Die Zellen wurden in Puffer resuspendiert und mit den primären Antikörpern 9E10 (c-Myc) oder 12CA5 (HA) für 15 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten mit PBS wurden die Zellen mit dem Sekundärantikörper (Schaf-anti-Maus-Fab₂, gekoppelt mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)) 1:30 verdünnt für 15 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Für permeabilisierte Zellen wurde ein Fix and Perm-Kit (Caltag) verwendet. Die Zellanalyse wurde auf einem Elite-Durchflusscytometer von Coulter, der auf den Nachweis der FITC-Fluoreszenz eingestellt war, durchgeführt. 30.000 Zellen pro Probe wurden analysiert.
Immunologische Untersuchungen
Das Antiserum 501 wurde gegen ein synthetisches Peptid, entsprechend den 15 C-terminalen Aminosäuren des GABA_B-R1-Rezeptors, erzeugt und unter Verwendung eines Konjugats dieses Peptids und KLH ("keyhole limpet hemocyanin") (Calbiochem) als Antigen in einem Schaf produziert. Membranproben (30–60 μg) wurden durch SDS-PAGE unter Verwendung von 10% (Gew./Vol.) Acrylamid getrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine anschließend auf Nitrocellulose (Hybond ECL, Amersham) übertragen, mit dem Antiserum 501 in einer Verdünnung von 1:1000 in Kontakt gebracht und durch verstärkte Chemilumineszenz (ECL, Amersham) sichtbar gemacht. Epitopmarkierungen wurden durch ein Immunblot-Verfahren mit den monoclonalen Antikörpern anti-Myc (9E10, Verdünnung 1:100) oder anti-HA (12CA5, 1:500) sichtbar gemacht.
Deglycosylierung
Die enzymatische Entfernung von über Asparagin verknüpften (N-verknüpfte) Kohlenhydratresten mit den Endoglycosidasen F und H wurde im Wesentlichen gemäß den Anleitungen des Herstellers (Boehringer Mannheim) unter Verwendung von 50 μg Membranprotein pro Enzymreaktion durchgeführt. Der Glycosylierungs-Zustand des GABA_B-Rezeptors wurde nach SDS-PAGE/Immunblot-Verfahren von Proben untersucht.
Immunpräzipitationsverfahren
Transient transfizierte HEK293T-Zellen wurden, wie vorstehend beschrieben, aus 60-mm-Kulturschalen geerntet. Zellen aus jeder Schale wurden in 1 ml 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% (Vol./Vol.) Nonidet^® P40, 0,5% (Gew./Vol.) Natriumdesoxycholat, pH 7,5 (Lysepuffer), ergänzt mit Complete^TM-Protease-Inhibitorcocktail-Tabletten (1 Tablette/25 ml) (Boehringer Mannheim), resuspendiert. Die Zelllyse und die Solubilisierung von Membranprotein wurden durch Homogenisierung für 20 Sekunden mit einem Polytron-Homogenisator, gefolgt von vorsichtigem Mischen für 30 Min. bei 4°C, erreicht. Unlösliche Zelltrümmer wurden durch Mikrozentrifugation bei 16.000 g für 15 Min. bei 4°C entfernt und der Überstand wurde durch Inkubieren mit 50 μl Protein-A-Agarose (Boehringer Mannheim) für 3 Std. bei 4°C auf einem Helixrad vorgeklärt, um den unspezifischen Hintergrund zu verringern. Der solubilisierte Überstand wurde in 2 × 500 μl-Aliquote aufgeteilt und 20 μl von entweder HA- oder Myc-Antiseren wurden zu jedem gegeben. Man ließ die Immunpräzipitation vor der Zugabe von 50 μl Protein-A-Agarose-Suspension für 1 Std. bei 4°C auf einem Helixrad ablaufen. Das Einfangen der Immunkomplexe wurde über Nacht bei 4°C auf einem Helixrad vorangetrieben. Die Komplexe wurden durch Mikrozentrifugation bei 12.000 g für 1 Min. bei 4°C gesammelt und der Überstand wurde verworfen. Die Kügelchen wurden durch vorsichtiges Resuspendieren und Bewegen nacheinander in 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,1% (Vol./Vol.) Nonidet-P40 und 0,05% (Gew./Vol.) Natriumdesoxycholat, gefolgt von 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% (Vol./Vol.) Nonidet^® P40 und 0,05% (Gew./Vol.) Natriumdesoxycholat gewaschen. Die immunpräzipitierten Proteine wurden aus der Protein-A-Agarose durch Inkubieren in 30 μl SDS-PAGE-Probenpuffer bei 70°C für 10 Min. freigesetzt und durch SDS-PAGE, gefolgt von Immunblotting, analysiert.
Bindungsuntersuchungen
Kompetitionsbindungstests wurden in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 40 μM Isoguvacin (Tocris Cookson) durchgeführt, um die Bindungsstellen von GABA_A aus Rattenhirn zu blockieren. P2-Membran-Präparationen wurden aus HEK293T-Zellen, die unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen transfiziert wurden, hergestellt. Steigende Konzentrationen an GABA wurden zugegeben, um den Antagonisten [³H]-CGP54626 (Tocris Cookson, 40 Ci/mMol) zu verdrängen. Die Testbedingungen waren 0,4–0,6 nM [³H]-CGP54626, inkubiert mit 50 μg/Röhrchen ungereinigter „mitochondrialer" Fraktionen aus Rattenhirn oder 25 μg/Röhrchen HEK293T-P2-Membranen bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Das Gesamtvolumen pro Röhrchen war 0,5 ml und unspezifische Bindung wurde unter Verwendung von 1 mM GABA bestimmt. Gebundener Ligand wurde unter Verwendung eines Erntegeräts für 48 Vertiefungen von Brandel auf GF/B-Filter (Whatman) wiedergewonnen und durch Flüssigszintillation unter Verwendung eines LS6500-Zählgeräts von Reckmann gemessen.
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Sequenzprotokoll

Claims

GABAB-Rezeptor, umfassend ein Heterodimer zwischen einem GABAB-R1-Rezeptorprotein und einem GABAB-R2-Rezeptorprotein, wobei das GABAB-R2-Rezeptorprotein die in 1B dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Homologie zu der in 1B dargestellten Aminosäuresequenz besitzt.
GABAB-Rezeptor gemäß Anspruch 1, wobei der GABAB-R1-Rezeptor ein GABAB-R1-Rezeptorprotein, ein GABAB-R1b-Rezeptorprotein oder ein GABAB-R1c-Rezeptorprotein ist.
Isoliertes GABAB-R2-Rezeptorprotein, das die in 1B dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
Nucleotidsequenz, die ein GABAB-R2-Rezeptorprotein gemäß Anspruch 3 codiert, oder eine Nucleotidsequenz, die hierzu über die volle Länge komplementär ist.
Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 4, die die in 1A dargestellte Nucleotidsequenz aufweist, oder eine Nucleotidsequenz, die hierzu über die volle Länge komplementär ist.
Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 4 oder 5, die eine cDNA-Sequenz ist.
Expressionsvektor, umfassend eine Nucleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, der zur Expression eines GABAB-R2-Rezeptorproteins fähig ist.
Expressionsvektor, umfassend eine einen GABAB-R1-Rezeptor codierende Nucleotidsequenz und eine einen GABAB-R2-Rezeptor codierende Nucleotidsequenz, wobei der Vektor fähig ist, sowohl ein GABAB-R1- Rezeptorprotein als auch ein GABAB-R2-Rezeptorprotein zu exprimieren, wobei das GABAB-R2-Rezeptorprotein die in 16 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Homologie zu der in 1B dargestellten Aminosäuresequenz hat.
Vektor gemäß Anspruch 8, wobei das GABAB-R1-Rezeptorprotein ein GABAB-R1a-Rezeptorprotein, ein GABAB-R1b-Rezeptorprotein oder ein GABAB-R1c-Rezeptorprotein ist.
Stabile Zelllinie, umfassend einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9.
Stabile Zelllinie, die so modifiziert ist, dass sie sowohl GABAB-R1- als auch GABAB-R2-Rezeptorproteine exprimiert, wobei das GABAB-R2-Rezeptorprotein die in 1B dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Homologie zu der in 1B dargestellten Aminosäuresequenz hat.
Stabile Zelllinie gemäß Anspruch 10 oder 11, die eine modifizierte HEK293T-Zelllinie ist.
GABAB-Rezeptor, umfassend ein Heterodimer zwischen einem GABAB-R1-Rezeptorprotein und einem GABAB-R2-Rezeptorprotein, produziert von einer stabilen Zelllinie gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12.
GABAB-R2-Rezeptorprotein, das von einer stabilen Zelllinie gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 produziert wird.
Antikörper, der für einen GABAB-Rezeptor gemäß Anspruch 1 oder 2 spezifisch ist.
Antikörper, der für ein GABAB-R2-Rezeptorprotein gemäß Anspruch 3 spezifisch ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die GABAB-Rezeptormodulationsaktivität zeigt, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines GABAB-Rezeptors gemäß Anspruch 1 oder 2 mit einer Testverbindung sowie den Nachweis der Modulationsaktivität oder des Fehlens einer solchen Aktivität umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines GABAB-Rezeptors, umfassend das Einbringen eines geeigneten Vektors oder von geeigneten Vektoren, die GABAB-R1- und GABAB-R2-Rezeptorproteine codierende Nucleotidsequenzen umfassen, in eine geeignete Zelllinie unter Bedingungen, die geeignet sind, die Expression des Rezeptorproteins oder von Varianten herbeizuführen, wobei das GABAB-R2-Rezeptorprotein die in 1B dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Homologie zu der in 1B dargestellten Aminosäuresequenz hat.