ES2275351T3 - Subtipos gaba b-r1c y gaba b-r2 del receptor gaba b y sus heterodimeros. - Google Patents
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Abstract
Un receptor GABAB que comprende un heterodímero entre una proteína receptora GABAB-R1 y una proteína receptora GABAB-R2, donde la proteína receptora GABAB-R2 tiene la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Fig. 1B o una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Fig. 1B.
Description
Subtipos GABA_{B}-R1c y
GABA_{B}-R2 del receptor GABA_{B} y sus
heterodímeros.
La presente invención se refiere a los nuevos
subtipos del receptor GABA_{B} GABA_{B}-R1c y
GABA_{B}-R2, así como a un receptor GABA_{B}
nuevo y funcional que comprende un heterodímero de subunidades de
receptor GABA_{B}-R1 y
GABA_{B}-R2. La presente invención también se
refiere a variantes de los receptores, a secuencias de nucleótidos
que codifican los receptores y variantes de los mismos y a nuevos
vectores, líneas celulares estables, anticuerpos, métodos de
selección, métodos de tratamiento y métodos de producción de
receptores.
El GABA (ácido
\gamma-amino-butírico) es el
neurotransmisor inhibidor principal en el sistema nervioso central
(SNC) que activa dos familias distintas de receptores; los
receptores ionotrópicos GABA_{A} y GABA_{C} para las
transmisiones sinápticas rápidas, y los receptores metabotrópicos
GABA_{B} que gobiernan una transmisión sináptica más lenta. Los
receptores GABA_{B} son miembros de la superfamilia de receptores
con 7 dominios transmembrana acoplados a proteínas G. La activación
produce una transducción de señales a través de una diversidad de
rutas mediadas principalmente por miembros de la familia
G_{i}/G_{o} de proteínas G sensibles a la toxina pertussis. Se
ha demostrado que los receptores GABA_{B} inhiben los canales de
Ca^{2+} de tipo N, P/Q y T de una manera sensible a la toxina
pertussis (Kobrinsky et al., 1993;
Menon-Johansson et al., 1993; Harayama et
al., 1998) y de hecho también hay algunas pruebas de
interacciones directas entre los receptores GABA_{B} y los
canales de Ca^{2+}, ya que los ligandos de los canales de
Ca^{2+} pueden modificar la unión de agonistas de GABA_{B}
(Ohmori et al., 1990). La inhibición de los canales de
Ca^{2+} mediada por el receptor GABA_{B} es el mecanismo
principal para la inhibición presináptica de la liberación de
neurotransmisores. Postsinápticamente, el efecto principal de la
activación del receptor GABA_{B} es la apertura de los canales de
potasio, para generar potenciales inhibidores postsinápticos.
Ciertos estudios autorradiográficos demuestran
que los receptores GABA_{B} son abundantes y están distribuidos
heterogéneamente a lo largo de todo el SNC, con niveles
particularmente elevados en la capa molecular del cerebelo, núcleo
interpeduncular, corteza frontal, núcleos olfativos y núcleos
talámicos. Los receptores GABA_{B} también están muy extendidos
en el globus pallidus, corteza temporal, rafe magnus y médula
espinal (Bowery et al., 1987). Los receptores GABA_{B} son
una diana terapéutica importante en el SNC para afecciones tales
como espasticidad, epilepsia, enfermedad de Alzheimer, dolor,
trastornos afectivos y trastornos alimentarios. También están
presentes receptores GABA_{B} en el sistema nervioso periférico,
tanto en nervios sensoriales como en nervios parasimpáticos. Su
capacidad de modular estos nervios hace que sean posibles dianas en
trastornos del pulmón, tracto Gl y vejiga (Kerr y Ong, 1995; 1996;
Malcangio y Bowery, 1995).
A pesar de la abundancia generalizada de los
receptores GABA_{B}, las considerables pruebas de los estudios
neuroquímicos, electrofisiológicos y conductuales sugiere que
existen múltiples subtipos de receptores GABA_{B}. Esta
heterogeneidad de receptores GABA_{B} puede permitir el desarrollo
de ligandos selectivos, capaces de dirigirse a aspectos específicos
de la función del receptor GABA_{B}. Esto conduciría al desarrollo
de fármacos con mejores perfiles de selectividad con respecto a los
compuestos actuales (tales como baclofen) que son relativamente no
selectivos y muestran una diversidad de acciones conductuales
indeseables tales como sedación y depresión respiratoria. La mejor
manera de clasificar los múltiples subtipos de receptores es por
los diferentes perfiles de ligandos agonistas y antagonistas.
Hasta ahora, la selección de los ligandos de
GABA_{B} y las determinaciones posteriores de la
estructura/actividad se ha basado en ensayos de unión de
radioligandos a membranas cerebrales de rata. Otros análisis de
estos ligandos en modelos animales ha indicado diferencias en su
perfil de comportamiento. Sin embargo, debido a la ausencia de
receptores GABA_{B} clonados, no se ha definido la base molecular
para estas diferencias y, por lo tanto, no ha sido posible
optimizar los ligandos de GABA_{B} para uso terapéutico.
Los receptores GABA_{B} se describieron por
primera vez hace casi 20 años (Hill y Bowery, 1981), pero a pesar
de las considerables tentativas usando estrategias de clonación de
expresión convencional, por ejemplo, en oocitos de Xenopus,
o clonación basada en la homología de secuencia, la naturaleza
molecular del receptor GABA_{B} continuó siendo una incógnita. El
desarrollo de un antagonista de alta afinidad para el receptor
finalmente permitió a Kaupmann et al., (1997) clonar la
expresión del receptor a partir de un ADNc de corteza cerebral de
rata usando un ensayo de unión de radioligando. Se identificaron dos
variables de corte y empalme del receptor,
GABA_{B}-R1a que codificaba una proteína de 960
aminoácidos y GABA_{B}-R1b que codificaba una
proteína de 844 aminoácidos, que diferían sólo en las longitudes de
sus extremos N. Estas dos variantes de corte y empalme tienen
distintas distribuciones espaciales dentro del cerebro, pero las dos
residen dentro de células neuronales en lugar de en células
gliales. Farmacológicamente, las dos variantes de corte y empalme
son similares, mostrando afinidades de unión para una serie de
antagonistas, pero aproximadamente 10 veces menores que las de los
receptores nativos, así como constantes de desplazamiento de
agonistas que son aproximadamente 100-150 veces
menores que las de los receptores nativos. Estas observaciones han
llevado a la especulación de que el receptor clonado era un
receptor de baja afinidad y podía existir en el cerebro un receptor
GABA_{B} adicional de alta afinidad farmacológicamente distinto.
Como alternativa, se sugirió que el acoplamiento a proteínas G era
ineficaz o que el receptor se estaba desensibilizando en los
sistemas recombinantes usados.
Sin embargo, varios grupos que trabajaban en
este área descubrieron que el receptor clonado no se comporta como
un receptor GABA_{B} funcional ni en células de mamífero ni en
oocitos de Xenopus. La presente invención describe la
clonación de un nuevo subtipo de receptor GABA_{B} humano,
GABA_{B}-R2, la identificación de una nueva
variante de corte y empalme GABA_{B}-R1c, y la
sorprendente observación de que GABA_{B}-R1 y
GABA_{B}-R2 interaccionan fuertemente a través de
su extremo C para formar heterodímeros. La coexpresión de
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2
permite el desplazamiento de GABA_{B}-R1 a la
superficie celular y da como resultado un receptor GABA_{B}
funcional de alta afinidad tanto en células de mamífero como en
oocitos de Xenopus.
Estos sorprendentes descubrimientos proporcionan
una oportunidad única para definir subtipos de GABA_{B} a nivel
molecular, lo cual a su vez llevará a la identificación de nuevos
fármacos con especificidad de subtipo.
De acuerdo con una realización de la invención,
se proporciona un receptor GABA_{B} que comprende un heterodímero
entre una proteína receptora GABA_{B}-R1 y una
proteína receptora GABA_{B} R2, donde la proteína receptora
GABA_{B}-R2 tiene la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la Fig. 1B o una secuencia de aminoácidos que tiene
una homología de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la Fig. 1B.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica una proteína receptora
GABA_{B}-R1 y una secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína receptora GABA_{B}-R2,
siendo capaz dicho vector de expresar proteínas receptoras tanto
GABA_{B}-R1 como GABA_{B}-R2,
donde la proteína receptora GABA_{B}-R2 tiene la
secuencia de aminoácidos proporcionada en la Fig. 1B o una
secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos 90% con
la secuencia de aminoácidos proporcionada en la Fig. 1B.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona una proteína receptora GABA_{B}-R2
aislada que tiene la secuencia de aminoácidos proporcionada en la
Fig. 1B.
De acuerdo con una realización adicional de la
invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica
una proteína receptora GABA_{B}-R2 de la
invención, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la
misma.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica un
receptor GABA_{B}-R2 como el mostrado en la Fig.
1A, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la
misma.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia
de nucleótidos de la invención que puede expresar una proteína
receptora GABA_{B}-R2.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona una línea celular estable que comprende un vector de
la invención.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona una línea celular estable modificada para expresar
proteínas receptoras tanto GABA_{B}-R1 como
GABA_{B}-R2, donde la proteína receptora
GABA_{B}-R2 tiene la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la Fig. 1B o una secuencia de aminoácidos que tiene
una homología de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la Fig. 1B.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona un receptor GABA_{B} que comprende un heterodímero
entre una proteína receptora GABA_{B}-R1 y una
proteína receptora GABA_{B}-R2 producidas por una
línea celular estable de la invención.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona una proteína receptora GABA_{B}-R2
producida por una línea celular estable de la invención.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona un anticuerpo específico para un receptor o proteína
receptora GABA_{B} de la invención.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona un método para la identificación de un compuesto que
presenta actividad moduladora del receptor GABA_{B}, que comprende
poner en contacto un receptor GABA_{B} de la invención con un
compuesto de ensayo y detectar la actividad o inactividad
moduladora.
Figura
1
Se muestran la secuencia de nucleótidos (a) y la
secuencia proteica traducida (b) para GABA_{B}-R2
Humano.
Figura
2
Secuencias de aminoácidos de los receptores
GABA_{B}-R1a, GABA_{B}-R1b y
GABA_{B}-R2 humanos alineados para
comparación.
Se muestran las secuencias señal y el puntos de
escisión (\ding{34}) previsto, junto con los puntos de corte y
empalme N-terminales para
GABA_{B}-R1a y GABA_{B}-R1b. La
secuencia de GABA_{B}-R1c es exactamente la de
GABA_{B}-R1a, con la excepción de la deleción de
63 aminoácidos (recuadro blanco). Los aminoácidos conservados entre
GABA_{B}-R1a y GABA_{B}-R1b
están en negrita y se muestran los posibles sitios de
N-glicosilación (*). Las líneas por debajo del
texto muestran posiciones de los siete dominios TM previstos y las
regiones que codifican la estructura de superenrollamiento se
indican por un sombreado. La región C-terminal de
GABA_{B}-R1 usada como cebo en el análisis de
doble híbrido de levadura se comercializa como “BAIT\rightarrow”,
y los dominios C-terminales de
GABA_{B}-R2 recuperados a partir de la selección
de la biblioteca frente al extremo C de
GABA_{B}-R1 se muestran como “YTH
HITS\rightarrow”.
Figura
3
Los perfiles de hidrofobia de la secuencia de
GABA_{B}-R2 se determinaron usando el algoritmo de
Kyte-Doolittle, con lo que los valores positivos
indican regiones hidrófobas. Se muestran la secuencia señal prevista
y siete dominios transmembrana.
Figura
4
Se sondeó secuencialmente un RNA Master Blot
humano (Clontech), que contenía ARNm poliA' normalizado procedente
de múltiples tejidos de origen fetal y adulto, con una sonda con
especificidad total por GABA_{B}-R1 (todas las
variantes de corte y empalme) seguido de una sonda con especificidad
por GABA_{B}-R2. Se muestra el análisis
autorradiográfico resultante de las manchas de transferencia, junto
con una cuadrícula que identifica el tipo de tejido. Los controles
de especificidad incluyen ARN de levadura y ADN de E.
coli.
Figura
5
Se midió la actividad
\beta-galactosidasa en células Y190 de levadura
que expresaban el extremo C de GABA_{B}-R1 o de
GABA_{B}-R2, frente al vector vacío o entre sí en
todas las combinaciones, usando ONPG. De cada par de proteínas
expresadas en el sistema doble híbrido, la primera siempre se
refiere a la construcción de fusión GAL4_{BD} mientras que la
segunda se refiere a la construcción de fusión GAL4_{AD}. La
actividad \beta-galactosidasa se determina con
respecto a la cantidad de células y se presenta en unidades
arbitrarias.
Figura
6
Se transfectaron células HEK293T con 1 \mug de
Myc-GABA_{B}-R1b o con 1 \mug de
HA-GABA_{B}-R2 solos o en
combinación. Las células se recogieron 48 h después de la
transfección, se lisaron y se inmunoprecipitaron los receptores con
el epítopo señalizado usando antisuero 12CA5 (HA) o 9E10 (Myc) como
se describe en la sección de Métodos. Los complejos inmunes después
se sometieron a SDS-PAGE, se transfirieron a
nitrocelulosa y los complejos
Myc-GABA_{B}-R1b y
HA-GABA_{B}-R2 se identificaron
por inmunotransferencia con Myc y HA, respectivamente. Calles 1 y
4, inmunoprecipitados de células transfectadas con
Myc-GABA_{B}-R1b sólo; calles 2 y
5, HA-GABA_{B}-R2 sólo; calles 3
y 6, inmunoprecipitados de células transfectadas con
Myc-GABA_{B}-R1b junto con
HA-GABA_{B}-R2. Calles
1-3, lisados inmunoprecipitados con 9E10 (Myc) y
transferidos hasta 12CA5(HA); calles 4-6,
lisados inmunoprecipitados con 12CA5(HA) y transferidos con
9E10 (Myc).
Figura
7
Se realizó citometría de flujo en células
HEK293T transfectadas con 1 \mug de
Myc-GABA_{B}-R1b o
HA-GABA_{B}-R2 o ambos receptores
en combinación. (A) Análisis usando 9E10 (c-Myc)
como anticuerpo primario para detectar
Myc-GABA_{B}-R1b; células
intactas. (B) Análisis usando 9E10 (c-Myc) como
anticuerpo primario para detectar
Myc-GABA_{B}-R1b; células
permeabilizadas. (C) Análisis usando 12CA5 (HA) como anticuerpo
primario para detectar
HA-GABA_{B}-R2; células intactas.
Las células transfectadas de forma simulada, que reflejan la
fluorescencia de fondo, están sombreadas y el marcador indica la
fluorescencia medida sobre los niveles de fondo. Los datos de
Myc-GABA_{B}-R1b se muestran como
una línea gris, mientras que la coexpresión de
Myc-GABA_{B}-R1b con
HA-GABA_{B}-R2 se muestra en
negro. En cada muestra se analizaron 30.000 células. Los histogramas
mostrados proceden de un solo experimento. Los parámetros
estadísticos citados proceden de la media de tres transfecciones y
análisis diferentes.
Figura
8
Se obtuvieron fracciones de membrana P2 a partir
de células HEK293T que se transfectaron con 1 \mug de
GABA_{B}-R1a (calles 1-3),
GABA_{B}-R1b (calles 4-6) o
HA-GABA_{B}-R2 (calles
13-15), o con 1 \mug de
HA-GABA_{B}-R2 en combinación con
1 \mug de GABA_{B}-R1a (calles
7-9, 16-18) o
GABA_{B}-R1b (calles 10-12,
19-21). Se evaluó el estado de glicosilación de los
receptores transfectados después del tratamiento de fracciones P2
(50 \mug de proteína de membrana) con vehículo (calles 1, 4, 7,
10, 13, 16 y 19), endoglicosidasa F (calles 2, 5, 8, 11, 14, 17 y
20) o endoglicosidasa H (calles 3, 6, 9, 12, 15, 18 y 21). Las
muestras se resolvieron por SDS-PAGE (acrilamida al
10% (p/v)), se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a
inmunotransferencia. Panel superior, se usó antisuero 501 como
reactivo primario para permitir la identificación de
GABA_{B}-R1a y 1b. Panel inferior, se empleó
antisuero 12CA5 anti-HA para identificar
HA-GABA_{B}-R2. ^{*}, indica
formas glicosiladas terminalmente de GABA_{B}-R1a
y 1b.
Figura
9
Se midió la actividad de unión de
[^{35}S]GTP\gammaS en fracciones de partículas de P2
procedentes de células HEK293T transfectadas con 1 \mug de
G_{o1}\alpha junto con 1 \mug de
GABA_{B}-R1a, GABA_{B}-R1b o
HA-GABA_{B}-R2; o con 1 \mug de
G_{o1}\alpha y de
HA-GABA_{B}-R2 en combinación con
1 \mug de GABA_{B}-R1a o de
GABA_{B}-R1b. (A) La unión de
[^{35}S]GTP\gammaS se midió en ausencia (barras blancas)
o en presencia (barras sombreadas) de GABA (10 mM) como se describe
en la sección de Métodos. (B) Se midió la capacidad de
concentraciones variables de GABA de estimular la unión de
[^{35}S]GTP\gammaS en fracciones de membrana P2 de
células HEK293T que expresaban G_{o1}\alpha y
HA-GABA_{B}-R2 solos (círculos
blancos) o en combinación con GABA_{B}-R1a
(cuadrados negros) o GABA_{B}-R1b (triángulos
negros). Los datos mostrados son las medias \pm S.D. de
mediciones por triplicado y son representativos de tres experimentos
independientes.
Figura
10
Se midió la actividad de unión de
[^{35}S]GTP\gammaS en fracciones en forma de partículas
P2 procedentes de células HEK293T transfectadas con
HA-GABA_{B}-R1b (1 \mug) junto
con HA-GABA_{B}-R2 (1 \mug) y
G_{o1}\alpha (1 \mug) (triángulos negros), o en combinación
con HA-GABA_{B}-R2 (1 \mug)
(círculos blancos) o G_{o1}\alpha (1 \mug) (círculos negros).
Se determinó la capacidad de que concentraciones variables de GABA
estimularan la unión de [^{35}S]GTP\gammaS. Los datos
mostrados son la media \pm S.D. de mediciones por triplicado.
Figura
11
Se midieron los niveles de AMPc en células
HEK293T transfectadas con 1 \mug de G_{i1}\alpha junto con 1
\mug de GABA_{B}-R1a,
GABA_{B}-R1b o
HA-GABA_{B}-R2; o con 1 \mug de
G_{i1}\alpha y 1 \mug de
HA-GABA_{B}-R2 en combinación con
1 \mug de GABA_{B}-R1a o
GABA_{B}-R1b, como se describe en la sección de
Métodos. (A) Se determinaron los niveles de AMPc en células
tratadas con forskolina (50 \muM) en ausencia (barras blancas) o
en presencia (barras sombreadas) de GABA (1 mM). (B) capacidad de
concentraciones variables de GABA de inhibir la actividad adenilato
ciclasa elevada por forskolina en células HEK293T que expresan
G_{i1}\alpha y HA-GABA_{B}-R2
en combinación con GABA_{B} R1b. Los datos mostrados son las
medias \pm S.D. de mediciones por triplicado.
Figura
12
Se inyectaron oocitos de Xenopus con ARNc
que codificaba receptores GABA_{B}-R1 y
GABA_{B}-R2 (en cantidades iguales para CFTR,
relación 1:2 para GIRK) más CFTR (A) o el heterómero GIRK1/GIRK4
(B). A, Gráfico de transcurso de tiempo para un oocito que expresa
GABA_{B}-R1, GABA_{B}-R2 y CFTR.
La aplicación de GABA 100 mM, SKF97541 100 mM o Baclofen 1 mM
(flechas) activó una gran corriente de entrada de CFTR. Obsérvese el
aumento en la respuesta de CFTR observada con la aplicación
repetida de GABA. B, Gráfico de transcurso de tiempo para un oocito
que expresa GABA_{B}-R1,
GABA_{B}-R2, GIRK1 y GIRK4. El cambio de solución
de ND96 (bajo contenido de potasio) a 90K (alto contenido de
potasio) condujo a un cambio hacia el interior en la corriente de
mantenimiento, lo cual demuestra que en este oocito se expresa el
canal GIRK1/GIRK4. La posterior aplicación de GABA 100 mM activó
una gran corriente de entrada (panel central). Se muestran
experimentos de control negativos y positivos en oocitos que
expresan el receptor GABA_{B}-R2 solo (panel de la
izquierda) y los que expresan el receptor de adenosina A1 (panel de
la derecha).
Figura
13
Se muestran curvas de
corriente-voltaje para un solo oocito después de la
aplicación de pulsos de pinzamiento de voltaje de 200 ms desde un
potencial de mantenimiento de -60 mV a potenciales de ensayo
comprendidos entre -100 mV y + 50mV. Se representa la corriente en
estado estacionario frente al potencial de ensayo en solución ND96
(bajo contenido de potasio), solución 90K (potasio 90 mM) y 90K más
GABA 100 mM. Obsérvese la corriente de GIRK1/4 basal registrada en
solución 90K y la gran activación provocada por agonista del canal
de potasio GIRK.
Figura
14
Se transfectaron células HEK293T con
HA-GABA_{B}-R2 (1 \mug) y
G_{o1}\alpha (1 \mug) junto con diversas cantidades
(0-1 \mug) de
HA-GABA_{B}-R1 b. Las células se
recogieron 48 h después de la transfección y se prepararon
fracciones de membrana P2. (A) Estimulación por agonista de la
actividad de unión de [^{35}S]GTP\gammaS medida en
membranas de células transfectadas en presencia de GABA (10 mM). Los
datos se muestran como estimulación por encima del valor basal
(cpm) y son la media \pm S.D. de mediciones por triplicado. (B) Se
sometieron a inmunotransferencia membranas celulares con antisuero
anti-HA para permitir evaluar los niveles relativos
de receptores HA-GABA_{B}-R2 y
HA-GABA_{B}-R1b.
Figura
15
Se prepararon fracciones de membrana P2 a partir
de células HEK 293T transfectadas usando las mismas condiciones
descritas para los estudios de unión de GTP\gammaS. Se determinó
el porcentaje de unión específica para el desplazamiento de
[3H]-CGP54626 por GABA. Los datos mostrados son la
media del mínimo de estudios por triplicado \pm sem.
A lo largo de la presente memoria descriptiva y
las reivindicaciones adjuntas, las expresiones "comprender" e
"incluir" y variaciones tales como "comprende", "que
comprende", "incluye" y "que incluye" deben
interpretarse de manera inclusiva. Es decir, se pretende que estas
palabras expresen la posible inclusión de otros elementos o números
enteros no mencionados específicamente, cuando el contexto lo
permita.
Como se ha explicado previamente, la presente
invención incluye varios aspectos importantes. En particular, la
presente invención se refiere a proteínas receptoras
GABA_{B}-R2 aisladas y a receptores GABA_{B} que
comprenden un heterodímero entre una proteína receptora
GABA_{B}-R1 y una proteína receptora
GABA_{B}-R2, así como a otros aspectos
relacionados. En el contexto de la presente invención, se pretende
que la palabra "aislado" signifique que la proteína receptora
no está en su estado nativo, en la medida en que se ha purificado
al menos en algún grado o se ha producido sintéticamente, por
ejemplo por métodos recombinantes. Por lo tanto, el término
"aislado" incluye la posibilidad de que la proteína receptora
esté en combinación con otro material biológico o no biológico, tal
como células, suspensiones de células o fragmentos celulares,
proteínas, péptidos, disolventes orgánicos o inorgánicos, u otros
materiales cuando sea apropiado, pero excluye la situación en la
que la proteína receptora está en un estado como se encuentra en la
naturaleza.
Pueden emplearse métodos rutinarios, como se
explica con más detalle en la siguiente sección experimental, para
purificar y/o sintetizar las proteínas receptoras de acuerdo con la
invención. Los especialistas en la técnica entienden bien estos
métodos e incluyen técnicas tales como las descritas en Sambrook, J.
et al, 1989. La presente invención no sólo incluye la
proteína receptora GABA_{B}-R2 que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1B, sino también
proteínas receptoras GABA_{B}-R2 que tienen una
secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos 90%
con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1B. Estas
proteínas retienen el mismo carácter esencial de la proteína
receptora GABA_{B}-R2 para la que se proporciona
información de la secuencia. Por ejemplo, las proteínas con una
homología de al menos 95% con las secuencias de aminoácidos
proporcionadas en la Fig. 1B se consideran proteínas receptoras
GABA_{B}-R2. Estas proteínas pueden incluir la
deleción, modificación o adición de aminoácidos individuales o
grupos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos,
siempre que no se vea afectada de manera adversa la funcionalidad
biológica de la proteína.
La invención también incluye secuencias de
nucleótidos que codifican proteínas receptoras
GABA_{B}-R2, así como secuencias de nucleótidos
que son complementarias a las mismas. Preferiblemente, la secuencia
de nucleótidos es una secuencia de ADN y, aún más preferiblemente,
una secuencia de ADNc.
La presente invención también incluye vectores
de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican
las proteínas receptoras GABA_{B}-R2. Otro aspecto
de la invención se refiere a un vector de expresión que comprende
secuencias de nucleótidos que codifican una proteína receptora
GABA_{B}-R1 y una proteína receptora
GABA_{B}-R2. Estos vectores de expresión se
construyen de manera rutinaria en la técnica de la biología
molecular y pueden implicar el uso de ADN plasmídico e iniciadores,
promotores, potenciadores y otros elementos apropiados, que pueden
ser necesarios, y que se colocan en la orientación correcta, para
permitir la expresión de proteínas.
La invención también incluye líneas celulares
que se han modificado para expresar el nuevo receptor. Estas líneas
celulares incluyen líneas celulares eucariotas superiores
transitorias, o preferiblemente estables, tales como células de
mamífero o células de insecto, células eucariotas inferiores tales
como levaduras o células procariotas tales como células
bacterianas. Los ejemplos particulares de células que se han
modificado por inserción de vectores que codifican las proteínas
receptoras de acuerdo con la invención incluyen células HEK293T y
oocitos. Preferiblemente, la línea celular seleccionada será una que
no sólo sea estable, sino que también permita la glicosilación
madura y la expresión en la superficie celular de los receptores de
la invención. En el caso del receptor GABA_{B} funcional que
comprende un heterodímero de subunidades
GABA_{B}-R1 y GABA_{-B}-R2, la
línea celular puede incluir un solo vector que permite la expresión
de los dos subtipos de receptores, o como alternativa vectores
separados para cada subunidad. Sin embargo, se prefiere que los
subtipos de receptores se coexpresen para optimizar el proceso de
dimerización, que dará como resultado la glicosilación completa y
el transporte del dímero glicosilado a la superficie celular.
También es posible que los receptores de la
invención se expresen de manera transitoria en una línea celular o
en una membrana, tal como, por ejemplo, en un sistema de expresión
de baculovirus. Estos sistemas, que están adaptados para expresar
los receptores de acuerdo con la invención, también se incluyen
dentro del alcance de la presente invención.
Un aspecto particularmente preferido de la
invención es el heterodímero formado entre las proteínas receptoras
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2 que
tiene como resultado la formación de un receptor GABA_{B}
funcional. Sin intención de limitarse por ninguna teoría, parece
ser que la formación del heterodímero tiene lugar a través de los
dominios de superenrollamiento dentro de las colas
C-terminales del receptor, y que esto a su vez es
un pre-requisito para el transporte y la
glicosilación completa de GABA_{B}-R1 y también
para la generación de un receptor GABA_{B} de alta afinidad en la
superficie celular.
El heterodímero que forma un receptor GABA_{B}
funcional puede comprender cualquier subtipo de receptor
GABA_{B}-R1 o variante de corte y empalme. Aunque
actualmente sólo se reconoce un subtipo de
GABA_{B}-R2, es previsible que los heterodímeros
de acuerdo con la presente invención puedan incluir otros subtipos
de GABA_{B}-R2 o variantes de corte y empalme
tales como proteínas receptoras GABA_{B}-R2 que
tienen una homología de al menos 90% con la proteína receptora
GABA_{B}-R2 mostrada en la Figura 1B.
En particular, el receptor GABA_{B} funcional
puede incluir proteínas receptoras GABA_{B}-R1
seleccionadas entre variantes de corte y empalme
GABA_{B}-R1a, GABA_{B}-R1b,
GABA_{B}-R1c, variantes de las mismas o incluso
otros subtipos de receptores GABA_{B}-R1 o
variantes de corte y empalme que aún no se han identificado.
De acuerdo con otro aspecto, la presente
invención también se refiere a anticuerpos que se han inducido por
técnicas convencionales y son específicos para las proteínas
receptoras de acuerdo con la invención. Estos anticuerpos podrían
ser útiles, por ejemplo, en la purificación, aislamiento o selección
que implican técnicas de inmunoprecipitación y podrían usarse como
herramientas para esclarecer adicionalmente la función del receptor
GABA_{B}, o como agentes terapéuticos por sí mismos. También
pueden inducirse anticuerpos contra epítopos específicos de los
receptores de acuerdo con la invención, en lugar de las subunidades
monoméricas.
Un aspecto importante de la presente invención
es el uso de proteínas receptoras de acuerdo con la invención,
particularmente el receptor GABA_{B} heterodimérico, en métodos de
selección diseñados para identificar compuestos que actúan como
ligandos de receptores y que pueden ser útiles para modular la
actividad del receptor. En términos generales, estos métodos de
selección implicarán poner en contacto la proteína receptora a la
que se hace referencia, preferiblemente el receptor GABA_{B}
heterodimérico, con un compuesto de ensayo y después detectar la
modulación en la actividad del receptor o, de hecho,detectar la
inactividad del receptor que se produce. La presente invención
también incluye dentro de su alcance los compuestos que se
identifican como compuestos que poseen una actividad de modulación
del receptor GABA_{B} útil, por los métodos de selección
mencionados anteriormente. Los métodos de selección comprendidos por
la invención generalmente son bien conocidos por los especialistas
en la técnica y se describen adicionalmente en la sección
experimental que se presenta a continuación.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de compuestos que se han identificado por técnicas de selección
mencionadas anteriormente en el tratamiento o profilaxis de
trastornos que responden a la modulación de la actividad del
receptor GABA_{B}, en un mamífero. Por el término
"modulación" lo que se entiende es que habrá agonismo o
antagonismo en el sitio receptor que resulta de la unión al ligando
del compuesto en el receptor. Los receptores GABA_{B} se han
implicado en trastornos del sistema nervioso central (SNC), tracto
gastrointestinal (Gl), pulmones y vejiga y, por lo tanto, la
modulación de la actividad del receptor GABA_{B} en estos tejidos
producirá un resultado terapéutico positivo en relación con estos
trastornos. En particular, los compuestos que se identificarán
usando las técnicas de selección de acuerdo con la invención tendrán
utilidad para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos tales
como espasticidad, epilepsia, enfermedad de Alzheimer, dolor así
como trastornos afectivos y trastornos alimentarios. Sin embargo,
debe entenderse que la mención de estos trastornos sólo se realiza
a modo de ejemplo, y no pretende ser limitante del alcance de la
invención.
Los compuestos que se identifican de acuerdo con
los métodos de selección indicados anteriormente pueden formularse
con vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables
convencionales como es rutinario en la técnica farmacéutica, y como
se describe con detalle en Remmington's Pharmaceutical Sciences,
Mack Publishing Company, Eastern Pennsylvania, 17th Ed, 1985, cuya
descripción se incluye en este documento en su totalidad como
referencia.
Los compuestos pueden administrarse por vías
entéricas o parenterales, tales como la vía oral, bucal, anal,
pulmonar, intravenosa, intraarterial, intramuscular,
intraperitoneal, tópica u otras vías de administración
apropiadas.
En la sección experimental adjunta se explicarán
adicionalmente otros aspectos de la presente invención, a modo de
ejemplo.
Se identificaron homólogos humanos de las
variantes de corte y empalme GABA_{B}-R1a y 1 b de
rata a partir de EST y se subclonaron a partir de ADNc de cerebelo
humano, usando una combinación de PCR y amplificación rápida de PCR
de extremos de ADNc (RACE). Las secuencias de
GABA_{B}-R1 a y 1b humanas revelan una identidad
de más de 99% con GABA_{B}-R1a y
GABA_{B}-R1b de rata (datos no mostrados). Estos
receptores, al igual que sus homólogos de rata, tienen secuencias
señal, seguidas de extremos N prolongados, una topología típica de
siete dominios transmembrana y una cola C-terminal
intracelular corta. El extremo N codifica el dominio de unión a
GABA, que según se predice por homología limitada con proteínas
periplásmicas bacterianas, existe como dos dominios globulares que
capturan GABA (Bettler et al., 1998), así como tres sitios de
N-glicosilación potenciales. De manera interesante, el
extremo N de la variante de corte y empalme
GABA_{B}-R1a codifica 129 aminoácidos más que el
de GABA_{B}-R1b, que codifica dos copias en tándem
de la "repetición consenso corta" o dominio sushi. Los
dominios de Sushi tienen una longitud aproximada de 60 aminoácidos y
existen en una amplia serie de proteínas implicadas en el
complemento y la adhesión célula-célula (Chou y
Heinrikson, 1997). Por lo tanto, los dominios de Sushi dentro de
GABA_{B}-R1a pueden dirigir interacciones
proteína-proteína, posiblemente a través del
contacto célula-célula y pueden reflejar un papel
adicional para GABA_{B}-R1a, aparte del de
GABA_{B}-R1 b. De manera interesante, durante el
aislamiento de estos clones, se identificó una nueva variante de
corte y empalme N-terminal,
GABA_{B}-R1c. GABA_{B}-R1c
difiere de GABA_{B}-R1a por una deleción de 185
pb de las bases 290 a 475 (véase la Figura 2). Esta región codifica
uno de los dos dominios de Sushi únicos para
GABA_{B}-R1 a y, por lo tanto, las variantes de
corte y empalme GABA_{B}-R1a y
GABA_{B}-R1c, junto con su localización celular,
pueden ser significativas en la biología de los receptores
GABA_{B}. De hecho, las hibridaciones in situ sugieren que
GABA_{B}-R1a y GABA_{B}-R1b
tienen diferentes localizaciones subcelulares, expresándose
GABA_{B}-R1a en sitios presinápticos en lugar de
postsinápticos (Bettler et al., 1998).
Las búsquedas en bases de datos también
identificaron varios EST que muestran una homología débil con
GABA_{B}-R1, lo que sugiere la existencia de un
nuevo subtipo de receptor GABA_{B}. Usando PCR en ADNc de cerebelo
de cerebro humano, se confirmó la existencia de dicho nuevo
receptor GABA_{B} que se clonó y secuenció (Figura 1). Este nuevo
receptor, que se ha denominado GABA_{B}-R2,
muestra una similitud global de 54% y una identidad de 35% con
GABA_{B}-R1 en toda la longitud de la proteína
(Figura 2). Como era de esperar, los perfiles de hidrofobia para
GABA_{B}-R2 (Figura 3) sugirieron que la proteína
tiene un péptido señal de 42 aminoácidos seguido de un dominio
N-terminal extracelular comparable en tamaño al de
GABA_{B}-R1b y siete regiones transmembrana. En
total, se predijeron cinco sitios de N-glicosilación
en el dominio N-terminal, tres de los cuales se
conservan dentro de GABA_{B}-R1. Finalmente, el
receptor codifica un dominio C-terminal
intracelular, que tiene un tamaño considerablemente mayor que
GABA_{B}-R1. Dentro de la secuencia de
GABA_{B}-R2 no se identificó ningún dominio sushi
y no se han tenido pruebas de que haya ninguna variante de corte y
empalme hasta la fecha.
Se determinaron y compararon los niveles de
expresión de GABA_{B}-R1 y
GABA_{B}-R2 en diferentes tejidos y fases del
desarrollo sondeando RNA Master Blots humanos (Clontech). Estas
manchas contienen muestras de ARN poliA^{+} de 50 tejidos humanos
que se han normalizado con respecto a los niveles de expresión de
ARNm de ocho genes "internos" diferentes. Los niveles de
GABA_{B}-R1 se examinaron usando una sonda con
especificidad total que cubría todas las variantes de corte y
empalme (Figura 4a) y las manchas indican que de acuerdo con las
observaciones de Kaupmann et al., (1997),
GABA_{B}-R1 se expresa en altos niveles en el SNC,
en todas las áreas del cerebro y en la médula espinal. Sin embargo,
en contraste con Kaupmann et al., (1997), se descubrió que
GABA_{B}-R1 también se expresa a niveles
comparables en tejidos periféricos, con niveles de expresión
particularmente elevados en la pituitaria, pulmón, ovario, riñón,
intestino delgado y bazo. En un contraste notable,
GABA_{B}-R2 se expresa específicamente a altos
niveles únicamente en el SNC, con la posible excepción de la médula
espinal, donde la expresión parece algo menor. No se observa ninguna
señal para los tejidos periféricos, ni en tejidos fetales ni en
tejidos adultos (Figura 4b). Esta distribución notablemente
diferente de los niveles de ARNm entre
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2
sugiere que los dos subtipos pueden tener distintos papeles en el
SNC y en la periferia.
Se dedujo que GABA_{B}-R2
podría ser un receptor GABA_{B} de alta afinidad y, por lo tanto,
el receptor se expresó tanto en oocitos de Xenopus como en
células HEK293T y se buscaron las respuestas funcionales. Sin
embargo, a pesar de los intentos repetidos, no se pudo detectar
ninguna activación funcional del receptor
GABA_{B}-R2 o, de hecho, de los receptores
GABA_{B}-R1a, GABA_{B}-R1b o
GABA_{B}-R1c por GABA o por agonistas selectivos
de GABA_{B} (véanse las Figuras 9, 11 y 12). Varias líneas de
evidencia indicaron claramente que GABA_{B}-R1 no
se expresaba como se prevé in vivo. En primer lugar, la
citometría de flujo de células HEK293T que expresan
GABA_{B}-R1b, reveló que los receptores quedaban
retenidos en las membranas internas en lugar de expresarse en la
superficie celular (Figura 7). En segundo lugar,
GABA_{B}-R1a y GABA_{B}-R1b se
expresaban como glicoproteínas inmaduras, gracias a su sensibilidad
a las endoglicosidasas F y H (Figura 8, calles 1-6)
y finalmente, la coexpresión de GABA_{B}-R1 en
oocitos con GIRK o CFTR no dio ninguna indicación de una respuesta
funcional (datos no mostrados). Se concluyó que debe requerirse
algún cofactor adicional para promover la respuesta funcional.
El receptor de tipo receptor de calcitonina
queda retenido como una glicoproteína inmadura dentro del retículo
endoplásmico y requiere una proteína auxiliar de la familia de
proteínas RAMP identificada recientemente para transportar el
receptor a la superficie y generar un receptor funcional de CGRP
(péptido relacionado con el gen de calcitonina) o adrenomedulina
(McLatchie et al., 1998). Era previsible que los receptores
GABA_{B}-R1 requirieran un factor de circulación
análogo o algún otro cofactor proteico para su transporte a la
superficie celular para generar un receptor de alta afinidad. Para
identificar estas proteínas de posible interacción, se procesó un
sistema de biblioteca de doble híbrido de levadura usando los 108
aminoácidos C-terminales de
GABA_{B}-R1 contra una biblioteca de ADNc de
cerebro humano. De manera interesante, las búsquedas de motivos
revelaron un fuerte dominio de superenrollamiento dentro de estos
108 restos, una estructura que se sabe que media interacciones
proteína-proteína (Lupas, 1996). A partir de un
total de 4,3 x 10^{6} ADNc, se recuperaron 122 aciertos
positivos, 33 de los cuales codificaban el dominio
C-terminal entero de GABA_{B}-R2.
De manera similar, se prevé que este dominio de
GABA_{B}-R2 contenga un motivo de
superenrollamiento, que se alinea exactamente con el de
GABA_{B}-R1 (véase la Figura 2). Esta observación
sugiere fuertemente que los dos receptores interaccionan a través
de su extremo C para formar un heterodímero. Significativamente, la
selección no recuperó el dominio C-terminal del
propio GABA_{B}-R1, lo que implica que
GABA_{B}-R1 no puede homodimerizarse. Esta
interacción se ensayó directamente en el sistema doble híbrido de
levadura usando el extremo C de los dos receptores (Figura 5).
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2
pudieron interaccionar fuertemente a través de su extremo C,
mientras que ninguno de los receptores pudo homodimerizarse. Esta
observación sugirió que GABA_{B}-R1 y
GABA_{B}-R2 forman heterodímeros a través de sus
dominios superenrollados C-terminales y condujo a la
especulación de que la homodimerización puede producir un sitio de
unión funcional in vivo. Por lo tanto, a continuación se
confirmó la interacción entre los dos subtipos de receptores por
estudios de inmunoprecipitación sobre el receptor entero con el
epítopo señalizado en células HEK293T transfectadas.
Se expresaron de manera transitoria receptores
con el epítopo señalizado,
Myc-GABA_{B}-R1 b y
HA-GABA_{B}-R2 en células HEK293T
solos o en combinación. La inmunoprecipitación de
Myc-GABA_{B}-R1b en fracciones
celulares solubilizadas con detergente con antisuero Myc condujo a
la inmunodetección de
HA-GABA_{B}-R2 dentro de
complejos inmunes usando HA como anticuerpo primario, pero sólo
sobre la coexpresión del receptor (Figura 6, calles
1-3). La asociación de GABA_{B}-R1
y GABA_{B}-R2 se confirmó por
co-inmunodetección de
Myc-GABA_{B}-R1b a partir de
complejos inmunes capturados usando el anticuerpo
anti-HA. De nuevo, sólo pudo verse
co-inmunoprecipitación cuando se coexpresaron las
dos formas del receptor (Figura 6, calles 4-6). Por
lo tanto, de acuerdo con las observaciones en el sistema doble
híbrido de levadura, estos datos proporcionan una prueba convincente
de la heterodimerización entre GABA_{B}-R1 y
GABA_{B}-R2 de longitud completa expresados en
células de mamífero. Por lo tanto, se examinaron las respuestas del
receptor GABA_{B} después de la coexpresión de los dos subtipos
de receptores en células HEK293T o en oocitos de Xenopus.
Se transfectaron de manera transitoria células
HEK293T con Myc-GABA_{B}-R1b solo
o en combinación con
HA-GABA_{B}-R2 y los
transfectantes se analizaron por citometría de flujo (Figura 7). No
pudo detectarse inmunorreactividad de Myc en la superficie de las
células transfectadas con
Myc-GABA_{B}-R1b solo (Figura 7a),
aunque la permeabilización celular reveló inmunorreactividad en 35%
(n=3) de la población celular (Figura 7b). Esta última observación
indicó que las células se transfectaban de manera eficaz y sugirió
que los receptores Myc-GABA_{B}-R1
expresados se localizaban exclusivamente en membranas internas. Por
el contrario, 14% (n=3) de las células HEK293T transfectadas con
HA-GABA_{B}-R2 mostraron
inmunorreactividad en la superficie (Figura 7c). Sin embargo, la
cotransfección tanto de
Myc-GABA_{B}-R1b como de
HA-GABA_{B}-R2 condujo a la
aparición de Myc-GABA_{B}-R1b en
la superficie de 20% (n=3) de las células analizadas (Figura 7a),
lo que sugiere fuertemente que la coexpresión de
GABA_{B}-R1b con GABA_{B}-R2 es
necesaria para la expresión en la superficie de
GABA_{B}-R1b.
Las endoglicosidasas F y H pueden usarse para
diferenciar entre las glicoproteínas glicosiladas centralmente y
las glicoproteínas unidas a N glicosiladas terminalmente. Por
lo tanto, estas enzimas se usaron para examinar el estado de
glicosilación de GABA_{B}-R1 y
GABA_{B}-R2 después de la expresión en células
HEK293T. Se trataron membranas de células transfectadas con
endoglicosidasa F o endoglicosidasa H y los receptores GABA_{B}
expresados se caracterizaron por inmunotransferencia para comparar
las movilidades electroforéticas relativas de los receptores
(Figura 8). Las membranas celulares que expresaban
GABA_{B}-R1a o 1b produjeron bandas distintas de
M_{r} 130 y 100K respectivamente (Figura 8, calles 1 y 4)
que después del tratamiento con endoglicosidasa F, redujeron su
tamaño hasta especies inmunorreactivas individuales de
M_{r} 110 y 80K; que representan
GABA_{B}-R1a y GABA_{B}-R1b
respectivamente (Figura 8, calles 2 y 5). Esto demuestra que
GABA_{B}-R1a y 1b recombinantes son
glicoproteínas, lo cual está de acuerdo con las observaciones de
Kaupmann et al., (1997). Sin embargo, las dos formas
variantes de corte y empalme GABA_{B}-R1a y 1 b
también fueron sensibles al tratamiento con endoglicosidasa H, lo
que indica que las proteínas expresadas sólo están glicosiladas
centralmente (calles 3 y 6) y carecen de glicosilación terminal.
Esta observación, junto con el análisis FACS, sugiere que las
proteínas se glicosilan de manera inmadura y quedan retenidas en las
membranas internas. De manera significativa, cuando se coexpresaba
GABA_{B}-R1a (calles 7-9) o
GABA_{B}-R1b (calles 10-12) con
HA-GABA_{B}-R2, un componente de
GABA_{B}-R1a o 1 b era resistente a la digestión
con endoglicosidasa H, lo cual sugiere que cuando se coexpresa con
GABA_{B}-R2, una fracción significativa de
GABA_{B}-R1 es la glicoproteína madura (calles 9
y 12).
Los estudios similares con
HA-GABA_{B}-R2 dieron una especie
inmunorreactiva con un valor de M_{r} de 120 K (Figura 8,
calles 13, 16, 19) que era sensible al tratamiento con
endoglicosidasa F (calles 14, 17 y 20) pero resistente al
tratamiento con endoglicosidasa H (calles 15, 18 y 21), tanto si se
expresaba solo como si se expresaba en combinación con
GABA_{B}-R1. De esta manera, estos datos indican
que HA-GABA_{B}-R2 expresado es
una glicoproteína madura cuyo estado de glicosilación no se ve
afectado por la coexpresión con GABA_{B}-R1. De
esta manera, la heterodimerización entre
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2,
posiblemente en el complejo de Golgi, podría ser un
pre-requisito para la maduración y el transporte de
GABA_{B}-R1 a la membrana plasmática.
Para determinar si la coexpresión de
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2 y su
posterior glicosilación madura y expresión en la superficie celular
generaban un complejo receptor capaz de responder funcionalmente a
GABA, se midieron tres tipos de señalización. Se usaron células
HEK239T transfectadas de manera transitoria para examinar, en
primer lugar, la activación de la unión de
[^{35}S]GTP\gammaS en las membranas y en segundo lugar la
inhibición de la activación de AMPc estimulada por forskolina en
células enteras. En tercer lugar, se expresaron
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2 en
oocitos de Xenopus, que expresaban el regulador transmembrana
de la fibrosis quística (CFTR) o los canales de K^{+} de
rectificación hacia el interior (GIRK y KATP) y se examinó la
activación del flujo de iones en respuesta al agonista.
No se observó unión de
[^{35}S]GTP\gammaS estimulada por GABA en las membranas
preparadas a partir de células transfectadas con
GABA_{B}-R1 o
HA-GABA_{B}-R2 en combinación con
G_{o1}\alpha. Sin embargo, la coexpresión de
GABA_{B}-R1 y
HA-GABA_{B}-R2 junto con
G_{o1}\alpha produjo una fuerte estimulación de la actividad de
unión de [^{35}S]GTP\gammaS (Figura 9a). Se descubrió que
este efecto dependía de la concentración, determinándose valores de
CE_{50} (media, \pm S.E.M., n = 3) similares para membranas
procedentes de células transfectadas con
HA-GABA_{B}-R2 y G_{o1}\alpha
junto con GABA_{B}-R1a (9,5 \pm 1,1 x
10^{-5}M) o GABA_{B}-R1b (7,8 \pm 0,4 x
10^{-5}M) (Figura 9b). Estos valores son equivalentes a los de la
estimulación mediada por GABA de la unión de
[^{35}S]GTP\gammaS a membranas de cerebro de rata (5,9
\pm 0,4 x 10^{-5}M) (datos no mostrados). Preocupaba el hecho
de que una señal de epítopo de HA N-terminal en
GABA_{B}-R2 pudiera alterar la función del
receptor y por lo tanto se realizaron estudios paralelos en células
HEK293T, que expresaban versiones sin señal de
GABA_{B}-R2 y GABA_{B}-R1 junto
con G_{o1}\alpha. Se observaron eficacias y potencias similares
de la acción de GABA en membranas de estas células, como se indica
en el caso de los receptores con el epítopo señalizado (datos no
mostrados), lo cual sugiere claramente que la adición de estas
secuencias peptídicas al extremo N de GABA_{B}-R2
y GABA_{B}-R1 no alteraba significativamente la
función del receptor. Debe mencionarse que sólo se observó una
elevación medible mediada por GABA de la actividad de unión de
[^{35}S]GTP\gammaS tras la coexpresión de
GABA_{B}-R1 y
HA-GABA_{B}-R2 junto con
G_{o1}\alpha adicional (Figura 10). Lo más probable es que la
necesidad de proteína G adicional se deba a los niveles
relativamente bajos de proteínas G de la familia G_{i/o}
expresadas endógenamente, impidiendo de esta manera una respuesta
perceptible mediada por GABA tras la coexpresión de
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2.
Se obtuvieron resultados similares en células
HEK293T transfectadas de manera transitoria con
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2,
usando la inhibición de AMPc inducida por forskolina como lectura de
salida. De nuevo, sólo se observaron respuestas funcionales cuando
se coexpresaron GABA_{B}-R1 y
GABA_{B}-R2 (Figura 11).
Los oocitos de Xenopus pueden ensayarse
con respecto a tres clases de proteína G:
- 1)
- Puede ensayarse la conductancia de cloruro activada por Ca^{2+} endógena en oocitos para determinar la activación de G_{q} y la posterior elevación en el calcio intracelular (Uezono et al.,1993).
- 2)
- Puede ensayarse el regulador transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), que contiene un canal de cloruro activado por AMPc, con respecto a la activación del receptor a través de G_{s} o G_{i/o} (Uezono et al., 1993; Wotta et al., 1997).
- 3)
- Pueden ensayarse canales de potasio regulados por proteínas G GIRK1 (Kir 3.1; Kubo et al., 1993) y GIRK4 (o CIR, Kir 3.4, Kaprivinsky et al.,1995), inyectados en cantidades iguales para generar un canal heteromérico, con respecto a la activación de proteínas G sensibles a toxina pertussis (Kovoor et al., 1997).
No se observó ninguna respuesta funcional a GABA
o baclofen cuando se expresaron receptores
GABA_{B}-R1a, GABA_{B}-R1b o
GABA_{B}-R2 clonados en oocitos en combinación con
CFTR o GIRK1/4 (datos no mostrados; véase la Figura 12b). Cuando
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2 se
coexpresaron con CFTR, se registraron varias respuestas sólidas
significativas después de la aplicación de GABA 100 \muM (Figura
12a). Además, la aplicación repetida de GABA condujo a un aumento
progresivo en el tamaño de la respuesta de CFTR, lo que sugiere que
la respuesta funcional del heterodímero ahora está sensibilizada
ante una exposición adicional al agonista. Este fenómeno no se ha
observado para otros receptores clonados expresados en oocitos y
puede estar relacionado con la heterodimerización o incluso la
oligomerización de los receptores GABA_{B}. Finalmente, otros dos
agonistas selectivos de GABA_{B}, Baclofen y SKF97541 indujeron
respuestas funcionales similares a través de CFTR a la de GABA
(Figura 12a). Por el contrario, los antagonistas no dieron ninguna
respuesta (datos no mostrados).
A continuación, se examinó el heterodímero
GABA_{B}-R1/GABA_{B}-R2 con los
canales de potasio regulados por proteínas G GIRK1 y GIRK4 y de
nuevo se encontraron respuestas dependientes de agonista. Se
examinaron los gráficos de transcurso de tiempo para tres oocitos
individuales que expresaban GABA_{B}-R2 solo
(panel de la izquierda), GABA_{B}-R1 más
GABA_{B}-R2 (panel central) y el receptor de
adenosina A1 (como control positivo, panel de la derecha) (Figura
12b). En cada caso, el cambio de una solución fisiológica de bajo
contenido de potasio (ND96) a una solución extracelular de alto
contenido de potasio (K^{+} 90 mM) condujo a un desplazamiento
hacia el interior en la corriente de mantenimiento, resultante de la
entrada independiente de agonista de iones de potasio a través del
canal GIRK1/4. No se vio ninguna respuesta GABA en oocitos que
expresaban GABA_{B}-R2 en aislamiento (Figura
12b, panel de la izquierda) y, de manera similar,
GABA_{B}-R1a y GABA_{B}-R1b
expresados solos tampoco produjeron respuesta a GABA (datos no
mostrados). Significativamente, se registró una gran respuesta a
GABA en oocitos que coexpresaban GABA_{B}-R1 y
GABA_{B}-R2 (Figura 12b, panel central) de una
magnitud similar a la del receptor de adenosina A1 en respuesta al
agonista NECA (Figura 12b, panel de la derecha). De esta manera, de
nuevo la coexpresión de los dos subtipos de receptor induce una
respuesta funcional dependiente de agonista, mientras que la
expresión de cualquier subtipo de receptor solo no lo hace. También
se examinó si la coexpresión de los dos receptores en oocitos podía
activar la conductancia de cloruro activada por Ca^{2+} endógena.
No se observó ninguna prueba de activación (datos no mostrados), lo
cual sugiere que al menos en oocitos, el complejo receptor
GABA_{B}-R^{1}/GABA_{B}-R2 no
señaliza a través de Gq. Finalmente, se construyó una curva de
corriente-voltaje para un oocito que coexpresaba
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2
(Figura 13). Esto demuestra claramente que GABA, unido al receptor
GABA_{B}, activa una gran corriente de rectificado hacia el
interior coherente con la activación del canal de potasio GIRK de
una manera totalmente dependiente de la dosis.
Como la coexpresión de
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2 es
necesaria para un receptor GABA_{B} funcional, se decidió
investigar la relación estequiométrica entre los dos subtipos de
receptores in vivo. Se midieron los niveles relativos de
expresión tanto para GABA_{B}-R1 como para
GABA_{B}-R2 después de la transfección en células
HEK293T y se compararon con la función del receptor, como se
determina por la unión de GTP\gammaS (Figura 14). Se
transfectaron cantidades crecientes de plásmido
HA-GABA_{B}-R1 (hasta 1 \mug) en
células HEK293T junto con una cantidad constante (1 \mug) de
HA-GABA_{B}-R2. GABA produjo la
estimulación de la unión de [^{35}S]GTP\gammaS por
encima de los niveles basales en membranas extraídas a partir de
estas células, que aumentó al aumentar la cantidad de
HA-GABA_{B}-R1 transfectado hasta
que la unión alcanzó un estado estacionario cuando los niveles de
HA-GABA_{B}-R1 eran mayores que
0,25 \mug (Figura 14a). La inmunotransferencia de las mismas
muestras de membrana reveló niveles equivalentes de expresión de
HA-GABA_{B}-R1 y
HA-GABA_{B}-R2 en membranas
transfectadas con 0,25-0,5 \mug de
HA-GABA_{B}-R1 (Figura 14b). Esto
correspondía al estado estacionario de la elevación mediada por
GABA de la actividad de unión de [^{35}S]GTP\gammaS y,
por lo tanto, sugiere firmemente que GABA_{B}-R1
y GABA_{B}-R2 interaccionan funcionalmente en una
relación estequiométrica 1:1.
Finalmente, se determinó si las respuestas
funcionales observadas se debían a un receptor GABA_{B} de alta
afinidad, compuesto de un heterodímero de los dos receptores. Se
transfectaron células HEK293T con 1 \mug de
HA-GABA_{B}-R1b y
HA-GABA_{B}-R2 individualmente o
con cantidades crecientes (hasta 1 \mug) de
HA-GABA_{B}-R1 b y una cantidad
fija (1 \mug) de HA-GABA_{B}-R2
junto con G_{o1}\alpha. Después se realizaron ensayos de unión
competitiva sobre las membranas purificadas. La expresión de
HA-GABA_{B}-R1b solo produjo altos
niveles de unión específica de [^{3}H]-CGP54626
(Bittiger et al., 1992), un análogo estructural de
[^{125}I]-CGP64213 y el antagonista usado
originalmente para la expresión del clon
GABA_{B}-R1 (Kaupmann et al., 1997). Sin
embargo, como se ha indicado previamente para
[^{125}I]-CGP64213, las curvas de inhibición de
GABA se desplazaron significativamente a la derecha en comparación
con la unión a membranas de cerebro de rata (Figura 15), dando
valores de CI_{50} aproximadamente 22 veces menores que la unión
en cerebro de rata. Significativamente, la coexpresión de
cantidades equivalentes de proteína
HA-GABA_{B}-R1b y
HA-GABA_{B}-R2 reveló altos
niveles de unión específica. En un experimento de control que usa
receptores no señalizados se obtuvieron valores similares (datos no
mostrados). La obtención de una relación estequiométrica 1:1 de
expresión de HA-GABA_{B}-R1 b y
HA-GABA_{B}-R2 condujo a curvas de
inhibición de agonista similares a las obtenidas en membranas de
cerebro de rata (CI_{50} \pm intervalos de confianza de 95% para
1 \mug de HA-GABA_{B}-R2 / 0,25
\mug de HA-GABA_{B}-R1b = 2,29
\muM (1,48-3,55 \muM) y para cerebro de rata =
1,04 \muM (0,69-1,58 \muM). También se demostró
que estos niveles comparables de expresión de receptores permitían
una activación óptima de agonista en el ensayo de GTP\gammaS
(véase la Figura 14). La alteración de la relación de receptores
desde 1:1, de tal manera que GABA_{B}-R1b fuera
el receptor más prevalente, redujo la afinidad del agonista,
supuestamente debido a la unión a receptores
GABA_{B}-R1b no dimerizados y glicosilados de
manera inmadura (Figura 15). Además, a pesar de su expresión
aparente en la superficie celular, no se pudo detectar ninguna unión
específica de [^{3}H]-CGP54626 a células HEK293T
transfectadas de manera transitoria con
HA-GABA_{B}-R2 solo (datos no
mostrados). Se concluye que la heterodimerización de los subtipos
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2 es
necesaria para generar un receptor GABA_{B} de alta afinidad. Hay
varias explicaciones posibles para el cambio en la afinidad por GABA
después de la coexpresión de los dos subtipos de receptores. Sería
de esperar que la aparición del complejo receptor GABA_{B} en la
superficie celular permitiera el acoplamiento a proteínas G del
receptor, lo cual aumentaría la afinidad por el agonista. Sin
embargo, en estudios previos se ha demostrado que sólo la ausencia
de acoplamiento a proteínas G no puede explicar la diferencia en
afinidad por el agonista entre los receptores de cerebro de rata y
GABA_{B}-R1 (Kaupmann et al., 1997).
Además, se ha observado que [^{3}H]-CGP54626
parece unirse principalmente al estado de baja afinidad del
receptor, incluso en membranas de cerebro de rata, como se demuestra
por el hecho de que GTP\gammaS no puede desplazar las curvas de
inhibición de agonista y realmente aumenta el nivel de unión
específica a ^{3}H-CGP54626 (datos no mostrados).
Por lo tanto, una explicación más probable para el cambio en la
afinidad por GABA después de la coexpresión de los dos receptores
GABA_{B} es que la heterodimerización junto con el estado de
glicosilación madura de la proteína produce una conformación en el
sitio de unión con una mayor afinidad intrínseca.
Los receptores GABA_{B} funcionales dentro del
SNC comprenden un heterodímero en la superficie celular de dos
subunidades distintas de receptor con 7 dominios transmembrana,
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2 en una
relación estequiométrica 1:1. In vivo, los receptores
GABA_{B} pueden existir simplemente como heterodímeros o formar
complejos multiméricos incluso mayores de muchos heterodímeros. La
formación del heterodímero a través de los dominios superenrollados
con las colas C-terminales del receptor parece ser
un pre-requisito para el transporte y la
glicosilación completa de GABA_{B}-R1, así como
para la generación de un receptor GABA_{B} de alta afinidad en la
superficie celular. Usando esta información, ha sido posible
reproducir sitios GABA_{B} tanto en células HEK293T de mamífero
como en oocitos, usando varias lecturas funcionales tales como
activación del flujo de iones a través de CFTR o GIRK en oocitos, o
la inhibición de la adenilil ciclasa en células HEK293T. De hecho,
la falta de respuestas funcionales en células que expresan
GABA_{B}-R1 solo y la necesidad de expresión de
un segundo receptor 7TM explica por qué muchos grupos han encontrado
una dificultad extrema en la clonación de expresión de un receptor
GABA_{B} por medios convencionales. Se cree que éste es el primer
informe de heterodimerización de receptores como requisito obligado
para generar un receptor completamente funcional, de alta afinidad,
en sistemas recombinantes, que es totalmente equivalente al de
tejidos endógenos.
Se ha informado sobre la dimerización para otras
familias de receptores, tales como la familia de opiáceos como
parte de su proceso de desensibilización, el receptor
\beta2-adrenérgico, donde los homodímeros juegan
un papel importante en la señalización, y los receptores
metabotrópicos de glutamato (mGluRs, Hebert et al., 1996;
Romano et al., 1996; Cvejic et al., 1997, Hebert and
Bouvier, 1998). Significativamente, la dimerización en estas
familias de receptores no parece ser un requisito absoluto para el
acoplamiento funcional en sistemas recombinantes. En el caso de los
mGluRs, que son una familia de receptores muy relacionados a
GABA_{B} (Kaupmann et al., 1997), la homodimerización está
mediada por enlaces disulfuro entre los dominios extracelulares
N-terminales en lugar de un superenrollamiento
C-terminal. De hecho, la heterodimerización entre
dos receptores con 7 dominios transmembrana, que conduce tanto a la
circulación como a la glicosilación madura de las proteínas para
producir un receptor funcional, no tiene precedentes y es única en
el campo de GPCR. Desde luego no se ha observado que los mGluRs
formen heterodímeros (Romano et al., 1996) y el hecho de que
estas dos familias de receptores tan relacionadas hayan implicado
mecanismos tan diferentes de formación de dímeros sugiere que éste
es un proceso fundamentalmente importante para la función del
receptor.
In vivo, las pruebas farmacológicas
sugieren que hay muchos subtipos de receptores GABA_{B}
diferentes; tanto dentro del SNC como en tejidos periféricos. ¿Cómo
se forman estos subtipos farmacológicos de receptores GABA_{B}?
Hasta la fecha sólo se han identificado
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2 como
genes separados y la investigación de bases de datos no ha
identificado ningún otro receptor homólogo a los receptores
GABA_{B} conocidos. Esto no excluye la posibilidad de que existan
más receptores GABA_{B} aunque no estén reconocidos. Existen
diferencias de distribución para los dos receptores GABA_{B}, por
ejemplo GABA_{B}-R2 se expresa específicamente en
el SNC mientras que GABA_{B}-R1 se expresa en
sitios tanto centrales como periféricos. Estas diferencias en la
distribución claramente añaden complejidad conduciendo a subtipos de
receptores farmacológicamente distintos. Además, los genes que
codifican los receptores GABA_{B} pueden someterse a corte y
empalme de manera diferencial. GABA_{B}-R1
codifica tres variantes de corte y empalme
N-terminal y es posible que aún no se hayan
detectado todas. De manera interesante, estas variantes de corte y
empalme tienen alteraciones en su dominio extracelular,
N-terminal, la región implicada en la unión a GABA
(Takahashi et al., 1993, O'Hara et al., 1993) y
codifican dos (GABA_{B}-R1a), uno
(GABA_{B}-R1c) o ningún
(GABA_{B}-R1b) dominio sushi. Dado que los
dominios de Sushi median el contacto célula-célula
proteína-proteína, las diferencias en estas tres
variantes de corte y empalme pueden responder de los subtipos de
receptor GABA_{B} adicionales definidos farmacológicamente. Hasta
la fecha no se ha detectado ninguna variante de corte y empalme de
GABA_{B}-R2. Además, hay diferencias
significativas en la distribución de las variantes de corte y
empalme individuales, lo que sugiere que pueden tener diferentes
funciones dentro del SNC. Por ejemplo, se ha notificado que la
variante de corte y empalme GABA_{B}-R1a es
presináptica dentro del cerebro (Bettler et al., 1998) y, por
lo tanto, puede definir autorreceptores GABA_{B} presinápticos.
Parece probable que estas variantes de corte y empalme de
GABA_{B}-R1 puedan responder de al menos algunos
de los subtipos definidos farmacológicamente. Finalmente, con esta
nueva observación de heterodimerización de receptores obligada, se
ha añadido un nivel adicional de complejidad ya que los sitios de
unión a GABA_{B} funcionales requieren un compañero de
heterodimerización.
Ahora que se entiende mejor la naturaleza
molecular del receptor GABA_{B}, pueden establecerse sistemas
recombinantes para la selección de alto rendimiento de compuestos
contra sitios GABA_{B} individuales definidos farmacológicamente.
De esta manera pueden descubrirse compuestos con mayor especificidad
y con menos efectos secundarios indeseados. Para esto, deben
coexpresarse GABA_{B}-R1 y
GABA_{B}-R2 (incluyendo todas las variantes de
corte y empalme, y cualquier fragmento del receptor) de manera
estable o transitoria en células hospedadoras adecuadas. Las
células hospedadoras adecuadas incluyen líneas de células eucariotas
superiores tales como células de mamífero, células de insecto,
células eucariotas inferiores tales como levadura o células
procariotas tales como células bacterianas. Los ensayos de selección
con estas líneas celulares recombinantes podrían implicar el uso de
unión de radioligandos al dímero o a subunidades individuales dentro
del dímero. Es probable que el perfil de actividad en un ensayo de
unión al dímero sea diferente de la actividad de compuestos
ensayados usando ensayos de unión a GABA_{B}-R1
solo debido a alteraciones en el estado de glicosilación y la
conformación del receptor como resultado de la coexpresión de
GABA_{B}-R1 o GABA_{B}-R2.
También pueden usarse ensayos funcionales que miden sucesos
posteriores a la activación del receptor, para seleccionar
compuestos. Estos ensayos incluyen la unión de
[^{35}S]-GTP\gammaS a membranas aisladas a
partir de células que expresan el dímero; activación o inhibición
de canales iónicos usando registro electrofisiológico o ensayos de
flujo de iones; la movilización del calcio intracelular; la
modulación de los niveles de AMPc; la activación o inhibición de
las rutas de la MAP quinasa o alteraciones en la actividad de
factores de transcripción con el uso de genes indicadores. Además
de esto, pueden establecerse selecciones secundarias de una manera
similar, usando diferentes combinaciones de heterodímeros para
excluir una actividad indeseada y de esta manera establecer
compuestos GABA_{B} con selectividad de subtipo.
Además, cualquier estrategia que se dirija a la
ruptura o potenciación de la formación del dímero del heterodímero
GABA_{B} podría representar una nueva estrategia terapéutica con
la cual dirigirse a receptores GABA_{B}. Estas estrategias
podrían incluir péptidos o proteínas asociadas físicamente con el
dominio superenrollado o, de hecho, cualquier otra región de
interacción del dímero. También podrían identificarse pequeñas
moléculas que actúan en los puntos de contacto formados por
interacción de los componentes del dímero. Éstas pueden promover o
mejorar la función del receptor. Finalmente, podrían obtenerse
anticuerpos que reconocen específicamente epítopos en el dímero, en
lugar de las subunidades monoméricas. Estas moléculas podrían usarse
como herramientas para esclarecer adicionalmente la función de los
receptores GABA_{B} en enfermedades o como agentes terapéuticos
por sí mismos.
A lo largo de todo el proceso se usaron
protocolos de biología molecular convencionales (Sambrook et
al., 1989) y todas las manipulaciones bacterianas usaron
Escherichia coli XL-1Blue (Stratagene) de
acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. A lo largo del
todo el experimento se usaron condiciones de PCR convencionales, a
menos que se indique otra cosa. La mezcla de reacción de PCR
contenía 10-50 ng de ADN diana, 1 pmol de cada
cebador; dNTP 200 \muM y 2,5 U de Taq polimerasa
(Perkin-Elmer) o Pful polimerasa (Stratagene) con el
tampón apropiado suministrado por el fabricante. Los parámetros de
los ciclos fueron 1 ciclo a 95ºC durante 2 minutos; 25 ciclos a
95ºC durante 45 segundos, a 55ºC durante 45 segundos y a 72ºC
durante 1 min; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos. Todas las PCR se
reali-
zaron usando una máquina de PCR Perkin Elmer 9600 o una máquina de PCR Robocycler Gradient 96 (Stratagene).
zaron usando una máquina de PCR Perkin Elmer 9600 o una máquina de PCR Robocycler Gradient 96 (Stratagene).
Se identificaron varios EST humanos (X90542;
X90543; D80024; AA348199; T06711; T07518 y AA38224) como homólogos
a las secuencias GABA_{B}-R1a y
GABA_{B}-R1b de rata (Y10369; Y10370). Los EST se
alinearon y la fase de lectura abierta prevista se amplificó por
RT-PCR a partir de ARN poliA^{+} de cerebelo de
cerebro humano (Clontech) usando el Sistema de Preamplificación
Superscript (Life Technologies). El extremo 3' del receptor
(1545-2538 pb; GABA_{B}-R1 b) se
amplificó usando los cebadores
5'-GCGACTGCTGTGGGCTGCTTACT GGC-3 y
5'-GCGAATTCCCTGTCCTCCCTCACCCTACCC-3'.
La sección central (277-1737 pb de
GABA_{B}-R1b) se amplificó usando
5'-CCGAGCTCAAGCTCATCCACCACG-3' y
5'-TCTTCCTCCACTCCTTCTTTTCTT-3'. Los
productos de PCR se subclonaron en pCR-Script SK(+)
(kit de clonación PCR-script Amp; Stratagene). Los
productos de PCR sin error se ensamblaron en una unión
BstEII, SacI y EcoRI de tres vías y se subclonaron en
pBluescript SK (-) (Stratagene).
Los extremos N de las variantes de corte y
empalme se generaron usando PCR RACE (amplificación rápida de
extremos de ADNc) con el kit de amplificación de ADNc Marathon
frente a ADNc de cerebelo humano Marathon-Ready
(Clontech). La PCR RACE se cebó a partir de una secuencia
conservada dentro de GABA_{B}-R1 usando el cebador
5'-TGAGCTGGAGCCATAGGAAAGCACAAT-3'
para generar un producto de 700 pb. Esta PCR se amplificó
adicionalmente usando el cebador AP2 (Marathon) y un segundo
cebador GABA_{B}-R1 interno
5'-GATCTTGA
TAGGGTCGTTGTAGAGCA-3'. El producto de 600 pb resultante se subclonó usando el kit de clonación de PCR romo Zero (Invitrogen). La información de secuencia conseguida a partir de esta PCR RACE se usó para clonar el extremo N de la variante de corte y empalme GABA_{B}-R1b, usando los cebadores 5'-GCTCCTAACGCTCCCCAACA-3'
y 5'-GGCCTGGATCACACTTGCTG-3' en pCR-Script SK (+) (Stratagene). Las secuencias GABA_{B}-R1a 5' humanas se recuperaron a partir de la base de datos de EST de Incyte (1005101;3289832) y se usó para diseñar cebadores 5'-CCCAACGCCACCTCAGAAG-3' y 5'-CCGCTCATGGGAAACAGTG C-3'. La PCR en ADNc de cerebelo y en ADNc de línea celular de neuroblastoma KELLY produjo dos bandas discretas a 300 pb y 400 pb, que se clonaron en pCR-Script SK (+) (Stratagene). La secuenciación reveló que el producto de 400 pb codificaba algunas de las secuencias de GABA_{B}R1a 5' humanas y el producto de 300 pb codificaba la nueva variante de corte y empalme, GABA_{B}-R1c.
A continuación, se diseñó el cebador 5'-CCCCGGCACACATACTCAATCTCATAG-3' para someter a PCR RACE los \sim225 pb que faltaban de GABA_{B}-R1a. Se obtuvo un producto de 250 pb y se reamplificó usando el cebador
5'-CCGGTACCTGATGCCCCCTTCC-3' con el cebador AP2 (Marathon). De nuevo se generó una banda de \sim250 pb, se subclonó en pCR-Script SK (+) y cuando se secuenció, codificaba el extremo 5' de GABA_{B}-R1a. A continuación se generaron clones que incluían tanto la secuencia conservada del receptor como los extremos %' de las variantes de corte y empalme GABA_{B}-R1a y GABA_{B}-R1c. El cebador 5'-CGAGATGTTGCTGCTGCTGCTA-3', que ceba a partir del codón de iniciación y el cebador RACE inverso generaron una banda de \sim800 pb y ésta se subclonó en pCR-Script SK(+). Ahora, los clones GABA_{B}-R1a, GABA_{B}-R1b y GABA_{B}-R1c de longitud completa pueden ensamblarse en pcDNA3.1 (-) (Invitrogen). Para GABA_{B}-R1 b, se co-ligaron secuencias 5', sometidas a restricción con NotI/SacI, y la región conservada del receptor, cortado con EcoRI/SacI, en pcDNA3.1 (-), sometido a restricción con NotI/EcoRI. De manera similar, se subclonaron fragmentos 5' XhoI/SacI GABA_{B}-R1a y GABA_{B}-R1c con el fragmento conservado EcoRI/SacI y se unieron conjuntamente a pcDNA3.1(-), cortado con XhoI/EcoRI para reconstituir clones de longitud completa.
TAGGGTCGTTGTAGAGCA-3'. El producto de 600 pb resultante se subclonó usando el kit de clonación de PCR romo Zero (Invitrogen). La información de secuencia conseguida a partir de esta PCR RACE se usó para clonar el extremo N de la variante de corte y empalme GABA_{B}-R1b, usando los cebadores 5'-GCTCCTAACGCTCCCCAACA-3'
y 5'-GGCCTGGATCACACTTGCTG-3' en pCR-Script SK (+) (Stratagene). Las secuencias GABA_{B}-R1a 5' humanas se recuperaron a partir de la base de datos de EST de Incyte (1005101;3289832) y se usó para diseñar cebadores 5'-CCCAACGCCACCTCAGAAG-3' y 5'-CCGCTCATGGGAAACAGTG C-3'. La PCR en ADNc de cerebelo y en ADNc de línea celular de neuroblastoma KELLY produjo dos bandas discretas a 300 pb y 400 pb, que se clonaron en pCR-Script SK (+) (Stratagene). La secuenciación reveló que el producto de 400 pb codificaba algunas de las secuencias de GABA_{B}R1a 5' humanas y el producto de 300 pb codificaba la nueva variante de corte y empalme, GABA_{B}-R1c.
A continuación, se diseñó el cebador 5'-CCCCGGCACACATACTCAATCTCATAG-3' para someter a PCR RACE los \sim225 pb que faltaban de GABA_{B}-R1a. Se obtuvo un producto de 250 pb y se reamplificó usando el cebador
5'-CCGGTACCTGATGCCCCCTTCC-3' con el cebador AP2 (Marathon). De nuevo se generó una banda de \sim250 pb, se subclonó en pCR-Script SK (+) y cuando se secuenció, codificaba el extremo 5' de GABA_{B}-R1a. A continuación se generaron clones que incluían tanto la secuencia conservada del receptor como los extremos %' de las variantes de corte y empalme GABA_{B}-R1a y GABA_{B}-R1c. El cebador 5'-CGAGATGTTGCTGCTGCTGCTA-3', que ceba a partir del codón de iniciación y el cebador RACE inverso generaron una banda de \sim800 pb y ésta se subclonó en pCR-Script SK(+). Ahora, los clones GABA_{B}-R1a, GABA_{B}-R1b y GABA_{B}-R1c de longitud completa pueden ensamblarse en pcDNA3.1 (-) (Invitrogen). Para GABA_{B}-R1 b, se co-ligaron secuencias 5', sometidas a restricción con NotI/SacI, y la región conservada del receptor, cortado con EcoRI/SacI, en pcDNA3.1 (-), sometido a restricción con NotI/EcoRI. De manera similar, se subclonaron fragmentos 5' XhoI/SacI GABA_{B}-R1a y GABA_{B}-R1c con el fragmento conservado EcoRI/SacI y se unieron conjuntamente a pcDNA3.1(-), cortado con XhoI/EcoRI para reconstituir clones de longitud completa.
Se señalizó GABA_{B}-R1b con
epítopos myc o HA. Se usaron cebadores de PCR
5'-TAGGATCCCACTCCCCC
CATCCC-3' y 5'-CCAGCGTGGAGACAGAGCTG-3' para amplificar una región inmediatamente después de la secuencia señal propuesta (posición 88) hasta aproximadamente 20 pb cadena abajo de un sitio PstI único en la posición 389 de la secuencia codificante, creando un solo sitio BamHI 5' en fase. Este fragmento se clonó, BamHl/PstI, en un vector que contenía la secuencia señal de CD97, el epítopo de myc y un sitio BamHl en fase. Esta construcción también contiene un sitio NotI en posición 5' con respecto a la secuencia señal de CD97 y un sitio EcoRI cadena abajo del sitio PstI. Se subclonaron secuencias GABA_{B}-R1b cadena abajo del sitio PstI y cadena arriba de un sitio EcoRI externo a partir del receptor de longitud completa en el vector descrito anteriormente cortado de manera similar con PstI/EcoRI, para ensamblar GABA_{B}-R1b señalizado de longitud completa. La secuencia señal de CD97, el epítopo de myc y la secuencia codificante de GABA_{B}-R1b se subclonaron, NotI/EcoRI, en pCDNA3.1 (-) (Invitrogen). El epítopo de HA se añadió a GABA_{B} R1b por unión conjunta de los fragmentos 5' BamHI/PstI y 3' PstI/EcoRI a pCIN6 cortado con BamHI/EcoRI. Este vector contiene una secuencia señal T8 y un epítopo de HA 12CA5 inmediatamente antes de un sitio BamHI en fase.
CATCCC-3' y 5'-CCAGCGTGGAGACAGAGCTG-3' para amplificar una región inmediatamente después de la secuencia señal propuesta (posición 88) hasta aproximadamente 20 pb cadena abajo de un sitio PstI único en la posición 389 de la secuencia codificante, creando un solo sitio BamHI 5' en fase. Este fragmento se clonó, BamHl/PstI, en un vector que contenía la secuencia señal de CD97, el epítopo de myc y un sitio BamHl en fase. Esta construcción también contiene un sitio NotI en posición 5' con respecto a la secuencia señal de CD97 y un sitio EcoRI cadena abajo del sitio PstI. Se subclonaron secuencias GABA_{B}-R1b cadena abajo del sitio PstI y cadena arriba de un sitio EcoRI externo a partir del receptor de longitud completa en el vector descrito anteriormente cortado de manera similar con PstI/EcoRI, para ensamblar GABA_{B}-R1b señalizado de longitud completa. La secuencia señal de CD97, el epítopo de myc y la secuencia codificante de GABA_{B}-R1b se subclonaron, NotI/EcoRI, en pCDNA3.1 (-) (Invitrogen). El epítopo de HA se añadió a GABA_{B} R1b por unión conjunta de los fragmentos 5' BamHI/PstI y 3' PstI/EcoRI a pCIN6 cortado con BamHI/EcoRI. Este vector contiene una secuencia señal T8 y un epítopo de HA 12CA5 inmediatamente antes de un sitio BamHI en fase.
Se identificaron clones EST (H14151, R76089,
R80651, AA324303, T07621, Z43654) con una identidad de nucleótidos
de aproximadamente 50% con GABA_{B}-R1. La PCR
reveló que H14151 contenía un inserto de 1,5 Kb y codificaba una
secuencia suficiente para una parte sustancial del nuevo receptor
GABA_{B}. La PCR entre el extremo 3' de H14151 y el extremo 5' de
AA324303, usando una biblioteca de ADNc de cerebelo como plantilla,
produjo un producto de -700 pb, que cuando se clonó en el vector T
(kit de clonación TA, Invitrogen) y se secuenció, reveló que T07621
solapa dentro de AA324303. Además, se descubrió que Z43654, así como
los fragmentos de ADN genómico R76089 y R80651, solapan con
AA324303 y conjuntamente proporcionaron datos de secuencia para el
extremo 3' del receptor de subtipo GABA_{B}. La secuenciación
adicional de H14151 proporcionó la secuencia completa del nuevo
subtipo de receptor. Sin embargo, debido a las ambigüedades en la
posición del codón de parada en Z43654/R80448/R80651, se
secuenciaron los clones 662098 y 090041 de Incyte, que solapan en
esta región. Se identificó el codón de parada y se confirmó la
secuencia para GABA_{B}-R2 como dentro de H14151
(extremo 5') y 662098 (extremo 3'). Se generaron secuencias 5' de
GABA_{B}-R2 por PCR usando cebadores
5'-ATGGCTTCCCCGCGGAG-3' para
proporcionar el codón de parada del receptor y el cebador
5'-GAACAGGCGTGGTTGCAG-3', que ceba
más allá de un sitio EagI único. El producto de \sim250 pb
esperado se clonó en pCRSCRIPT y se secuenció. El receptor de
longitud completa después se ensambló con un ligamiento de tres vías
entre H14151, cortado con ApaLl/Eagl; 662098, cortado con
ApabI/NotI y el producto de PCR pCRSCRIPT-
GABA_{B}-R2-5', cortado con la
enzima de restricción EagI. Se retiró GABA_{B}-R2
de longitud completa del vector pCRSCRIPT usando EcoRI/NotI y se
unió a pcDNA3 (Invitrogen) para los estudios de expresión.
Se construyó GABA_{B}-R2
señalizado con el epítopo de HA en pCIN6. Se construyó un enlazador
que codificaba los aminoácidos entre la secuencia señal de
GABA_{B}-R2 y el sitio único EagI.
El enlazador se clonó en pUC18 (EcoRI/HindIII)
seguido de GABAB-R2 de longitud completa, a partir
de pCRSCRIPT como un fragmento EagI/NotI. Finalmente, el
GABA_{B}-R2 modificado se clonó en pCIN6 como un
fragmento XhoI.
Se hibridaron manchas de transferencia durante
una noche a 65ºC de acuerdo con las instrucciones del fabricante
con sondas de ADNc cebadas aleatoriamente de forma radiactiva usando
solución de hibridación ExpressHyb. La sonda para
GABA_{B}-R1, correspondiente a los restos
1129-1618 de la secuencia codificante de
GABA_{B}-R1b se amplificó por PCR usando los
cebadores
5'-CGCCTGGAGGACTTCAACTACAA-3' y
5'-TCCTCCCAATGTGGTAACCATCG-3' frente
al ADN de GABA_{B}-R1b como plantilla.
La sonda de ADNc de
GABA_{B}-R2, correspondiente a los restos
1397-1800, se amplificó por PCR usando los
cebadores 5'-ACAAGACCATCATCCTGGA-3'
y 5'-GATCACAAGCAGTTTCTGGTC-3' con
ADN de GABA_{B}-R2 como plantilla. Los fragmentos
de ADN se marcaron con
^{32}P-\alpha-dCTP usando un
sistema de marcaje de ADN Rediprime (Amersham). Las sondas se
marcaron con una actividad específica de >10^{9} cpm/\mug y
se usaron a una concentración solución de hibridación de
aproximadamente 5 ng/ml. Después de la hibridación, las manchas de
transferencia se lavaron con 2xSSC/SDS al 1% a 65ºC, y 0,1xSSC/SDS
al 0,5% a 55ºC (20xSSC es NaCl 3 M/Citrato Na_{3} 0,3 M.2H_{2}O
pH 7,0) y se expusieron a una película de rayos X.
Para todos los trabajos de doble híbrido de
levadura descritos se usaron Saccharomyces cerevisiae Y190 [MATa,
gal4 gal80, ade2-101, his3,
trp1-901, ura3-52,
leu2-3, 112, URA3::GAL1-lacZ, LYS2::
GAL1-HIS3, cyh^{R}] (Harper et al.,
1993, Clontech Laboratories, 1996). Se construyeron vectores de
fusión con el dominio de unión a GAL4 (GAL4_{BD}) en pYTH9
(Fuller et al., 1998) o pYTH16, una versión episomal de
pYTH9. Todas las fusiones con el dominio de activación de GAL4 se
realizaron en pACT2 (Clontech Laboratories, 1998). Todas las
manipulaciones de levadura se realizaron usando medio de lavadura
convencional (Sherman, 1991). Se adquirió una biblioteca de cerebro
humana MATCHMAKER (HL4004AH) en pACT2 a partir de Clontech
Laboratories y se amplificó de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes. El dominio C terminal de GABA_{B}-R1
se amplificó a partir de un clon de longitud completa, usando los
cebadores 5'-GTTGTCCCCATGGTGCCCAAGATGCGCA
GGCTGATCACC-3' y
5'-GTCCTGCGGCCGCGGATCCTCACTTATAAAGCAAATGCACT
CG-3'. El producto de PCR se fraccionó por tamaños
en un gel de agarosa al 0,8%, se purificó y se sometió a clonación
forzada Ncol/NotI en pYTH9 y posteriormente en pACT2. El dominio C
terminal de GABA_{B}-R2 se generó de manera
similar con los cebadores
5'-CTCTGCCC
CATGGCCGTGCCGAAGCTCATCACCCTGA GAACAAACCC-3' y 5'-GGCCCAGGGCGGCCGCACTTACAGG
CCCGAGACCATGACTC GGAAGGAGGG-3' y se subclonó en pYTH9, pYTH16 y pACT2. Todos los productos de PCR clonados se secuenciaron y se confirmó la ausencia de errores.
CATGGCCGTGCCGAAGCTCATCACCCTGA GAACAAACCC-3' y 5'-GGCCCAGGGCGGCCGCACTTACAGG
CCCGAGACCATGACTC GGAAGGAGGG-3' y se subclonó en pYTH9, pYTH16 y pACT2. Todos los productos de PCR clonados se secuenciaron y se confirmó la ausencia de errores.
La fusión del extremo C de
GAL4_{BD}-GABA_{B}-R1 en pYTH9
se integró de forma estable en el locus trp1 de Y190 por medio de
recombinación homóloga dirigida. Se seleccionaron las levaduras que
expresaban el extremo C de
GAL4_{BD}-GABA_{B}-R1 y se
transformaron con biblioteca de ADNc de cerebro humano bajo
selección con leucina usando un protocolo de transformación con
acetato de litio de alta eficacia (Clontech Laboratories, 1998). Se
transformaron suficientes ADNc independientes para dar una
representación triple de la biblioteca. Se seleccionaron clones de
interacción por crecimiento bajo selección con
3-amino-1,2,4-triazol
20 mM (Sigma), seguido de la producción de
\beta-galactosidasa, como se determina por un
ensayo de criofractura (Clontech Laboratories, 1998). Se recuperó
el ADN plasmídico a partir de las células de levadura después de la
digestión de la pared celular por Zymolase 100T a 400 \mug/ml
(ICN Biochemicals) en 250 \mul de Sorbitol 1,2 M; tampón fosfato
potásico 0,1 M (pH 7,4) a 37º durante 2 h. El ADN plasmídico se
extrajo por medio de un Miniprep de lisis alcalina Qiagen
convencional según las instrucciones del fabricante y se utilizó
para transformar células XL-2Blue ultracompetentes
(Stratagene). El ADN plasmídico se secuenció usando el cebador
5'-CAGGGATGTTTAATACCACTACAATGG-3'
usando secuenciación ABI automática y las secuencias resultantes se
enfrentaron a las bases de datos.
La levadura Y190 se transformó con pYTH16 y
pACT2 que expresaban el dominio C-terminal de
GABA_{B}-R1 y el dominio
C-terminal de GABA_{B}-R2 en todas
las combinaciones, así como contra vectores vacíos. Los
transformantes se dejaron crecer en medio líquido hasta la fase
semilogarítmica y se recogieron aproximadamente 1,5 ml. La
actividad \beta-galactosidasa se cuantificó usando
el sustrato o-nitrofenil
\beta-D-galactopiranósido (ONPG;
Sigma) usando un régimen de criofractura con nitrógeno líquido
esencialmente como se describe por Harshman et al.,
(1988).
Se anestesiaron hembras adultas de Xenopus
laevis (Blades Biologicals) usando tricaína al 0,2% (éster
etílico del ácido 3-aminobenzoico), se sacrificaron
y se extrajeron rápidamente los ovarios. Los oocitos se
desfolicularon por digestión con colagenasa (Sigma tipo I, 1,5 mg
ml^{-1}) en solución OR2 sin cationes divalentes (NaCl 82,5 mM,
KCl 2,5 mM, NaH_{2}PO_{4} 1,2 mM, HEPES 5 mM; pH 7,5 a 25ºC).
Los oocitos individuales en fase V y VI se transfirieron a solución
ND96 (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, MgCl_{2} 1,2 mM, CaCl_{2}, 1,8 mM,
HEPES 5 mM; pH 7,5 a 25ºC) que contenía 50 \mug ml^{-1} de
gentamicina y se almacenaron a 18ºC.
Se linealizaron GABA_{B}-R1a,
GABA_{B}-R1b (ambos en pcDNA3.1rev, Invitrogen),
GABA_{B}-R2, GIRK1, GIRK4 (en pcDNA3) y el
regulador transmembrana de la fibrosis quística (CFTR; en
pBluescript, Stratagene) y se transcribieron a ARN usando
polimerasa de T7 o T3 (kit Promega Wizard). Se inyectó ARNc
protegido terminalmente con m'G(5')pp(5')GTP en
oocitos (20-50 nl de 1 \mug\mul^{-1} de ARN
por oocito) y se registraron las corrientes de células enteras
usando pinzamiento de voltaje de dos microelectrodos (Geneclamp
amplifier, Axon instruments Inc.) de 3 a 7 después de la inyección
de ARN. Los microelectrodos tenían una resistencia de 0,5 a 2
M\Omega cuando se rellenaron con KCl 3 M. En todos los
experimentos, los oocitos se sometieron a pinzamiento de voltaje a
un potencial de mantenimiento de -60 mV en solución de ND96
(superfundido a 2 ml por minuto) y los agonistas se aplicaron por
la adición de esta solución intracelular. En experimentos GIRK, la
solución extracelular se cambió por solución de alto contenido de
potasio antes de la aplicación del agonista para facilitar el
registro de las corrientes de potasio hacia el interior. Se
construyeron curvas de corriente-voltaje aplicando
pulsos de pinzamiento de voltaje de 200 ms desde el potencial de
mantenimiento de -60 mV hasta potenciales de ensayo comprendidos
entre -100 mV y +50 mV.
Se mantuvieron células HEK293T (células HEK293
que expresan de forma estable el antígeno T grande de SV40) en DMEM
que contenía 10%(v/v) de suero de ternero fetal y glutamina 2 mM.
Las células se sembraron en placas de cultivo de 60 mm y se dejaron
crecer hasta una confluencia de 60-80%
(18-24 horas) antes de la transfección con pCDNA3
que contenía la especie de ADN relevante usando reactivo
Lipofectamine. Para la transfección, se mezclaron 3 \mug de ADN
con 10 \mul de Lipofectamine en 0,2 ml de Opti-MEM
(Life Technologies Inc.) y la mezcla se incubó a temperatura
ambiente durante 30 minutos antes de la adición de 1,6 ml de
Opti-MEM. Las células se expusieron a la mezcla de
Lipofectamine/ADN durante 5 horas y después se añadieron 2 ml de
suero de ternero recién nacido al 20% (v/v) en DMEM. Las células se
recogieron 48-72 h después de la transfección.
Se prepararon fracciones en forma de partículas
P2 que contenían membrana plasmática a partir de pastas de células
congeladas a -80ºC después de la recolección. Todos los
procedimientos se realizaron a 4ºC. Los sedimentos celulares se
resuspendieron en 1 ml de Tris-HCl 10 mM y EDTA 0,1
mM, pH 7,5 (tampón A) y por homogeneización durante 20 s con un
homogeneizador polytron seguido de pases (5 veces) a través de una
aguja de calibre 25. Los lisados celulares se centrifugaron a 1.000
g durante 10 min en una microcentrífuga para sedimentar los núcleos
y las células no fragmentadas y las fracciones de partículas P2 se
recuperaron por microcentrifugación a 16.000 g durante 30 min. Las
fracciones de partículas P2 se resuspendieron a tampón A y se
almacenaron a -80ºC hasta que fueron necesarias. Las
concentraciones de proteína se determinaron usando el procedimiento
de ácido bicincronínico (BCA) (Smith et al., 1985) usando BSA
como patrón.
Se realizaron ensayos en formato de 96 pocillos
usando un método modificado a partir de Wieland y Jakobs, 1994. Se
diluyeron membranas (10 mg por punto) a 0,083 mg/ml en tampón de
ensayo (HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, pH 7,4)
suplementado con saponina (10 mg/l) y se preincubaron con GDP 40 mM.
Se añadieron varias concentraciones de GABA, seguido de
[^{35}S]GTP\gammaS (1170 Ci/mmol, Amersham) a 0,3 nM
(volumen total de 100 ml) y se dejó que la unión continuara a
temperatura ambiente durante 30 minutos: La unión no específica se
determinó por la inclusión de GTP 0,6 mM. Se añadieron perlas SPA de
aglutinina de germen de trigo (Amersham) (0,5 mg) en 25 ml de
tampón de ensayo y el conjunto se incubó a temperatura ambiente
durante 30 minutos con agitación. Las placas se centrifugaron a
1500 g durante 5 minutos y se determinó el
[^{35}S]GTP\gammaS unido por recuento de centelleo en un
contador de centelleo Wallac 1450 microbeta Trilux.
24 horas después de la transfección, cada placa
de 60 mm de células HEK293T se dividió en 36 pocillos de una placa
de 96 pocillos y se dejó que las células se volvieran a unir durante
una noche. Las células se lavaron con PBS y se preincubaron en
medio DMEM que contenía IBMX 300 \muM durante 30 minutos a 37ºC.
Se añadieron forskolina (50 \muM) y concentraciones variables de
GABA y las células se incubaron durante 30 minutos más antes de la
extracción de AMPc con HCl 0,1 M durante 1 h a 4ºC. Los ensayos se
neutralizaron con KHCO_{3} 0,1 M y los niveles de AMPc se
determinaron usando ensayos de centelleo por proximidad (Biotrak
Kit, Amersham).
Se transfectaron de forma transitoria células
HEK293T con ADNc como se describe. 48-72 h después
de la transfección, las células se recuperaron y se lavaron dos
veces en PBS suplementado con NaN_{3} al 0,1 % (p/v) y suero de
ternero fetal al 2,5% (v/v). Las células se resuspendieron en tampón
y se incubaron con anticuerpos primarios 9E10
(c-Myc) o 12CA5 (HA) durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales con PBS,
las células se incubaron con anticuerpo secundario (Fab_{2} de
oveja anti-ratón acoplado con isotiocianato de
fluoresceína (FITC)) diluido 1:30 durante 15 min a temperatura
ambiente. Para las células permeabilizadas, se usó un kit Fix and
Perm (Caltag). El análisis de las células se realizó en un citómetro
de flujo Coulter Elite preparado para detectar la fluorescencia de
FITC. Para cada muestra se analizaron 30.000 células.
Se indujo antisuero 501 contra un péptido
sintético correspondiente a los 15 aminoácidos
C-terminales del receptor
GABA_{B}-R1 y se produjo en una oveja, usando un
conjugado de este péptido y hemocianina de lapa californiana
(Calbiochem) como antígeno. Se resolvieron muestras de membrana
(30-60 \mug) por SDS-PAGE usando
acrilamida al 10% (p/v). Después de la electroforesis, las proteínas
posteriormente se transfirieron a nitrocelulosa (Hybond ECL,
Amersham), se sondearon con antisuero 501 a una dilución de 1:1000 y
se visualizaron aumentando la quimioluminiscencia (ECL, Amersham).
Las señales de epítopo se visualizaron por inmunotransferencia con
anti-Myc (9E10; dilución 1:100) o anticuerpos
monoclonales anti-HA (12CA5; 1:500).
La eliminación enzimática de restos de
carbohidrato unidos a asparagina (unidos a N) con endoglicosidasas
F y H se realizó esencialmente de acuerdo con las instrucciones de
los fabricantes (Boehringer Mannheim) usando 50 \mug de proteína
de membrana por reacción enzimática. El estado de glicosilación del
receptor GABA_{B} se estudió después de
SDS-PAGE/inmunotransferencia de las muestras.
Se recogieron células HEK293T transfectadas de
manera transitoria como se ha descrito anteriormente en placas de
cultivo de 60 mm. Las células de cada placa se resuspendieron en 1
ml de Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Nonidet® P40 al
1% (v/v), desoxicolato sódico al 0,5% (p/v), pH 7,5 (tampón de
lisis) suplementado con comprimidos de cóctel inhibidor de proteasa
Complete™ (1 comprimido/25 ml) (Boehringer Mannheim). La lisis
celular y la solubilización de las proteínas de membrana se
consiguió por homogeneización durante 20 segundos con un
homogeneizador polytron, seguido de mezcla suave durante 30 minutos
a 4ºC. Los desechos insolubles se retiraron por microcentrifugación
a 16.000 g durante 15 min a 4ºC y el sobrenadante se preaclaró por
incubación con 50 \mul de Proteína A-agarosa
(Boehringer Mannheim) durante 3 h a 4ºC en una rueda helicoidal para
reducir el efecto de fondo no específico. El sobrenadante
solubilizado se dividió en 2 alícuotas de 500 \mul y a cada una se
le añadieron 20 \mul de antisuero HA o Myc. Se dejó que la
inmunoprecipitación continuara durante 1 h a 4ºC en una rueda
helicoidal antes de la adición de 50 \mul de suspensión de
Proteína A-agarosa. La captura de complejos inmunes
se continuó durante una noche a 4ºC en una rueda helicoidal. Los
complejos se recogieron por microcentrifugación a 12.000 g durante
1 minuto a 4ºC y se desechó el sobrenadante. Las perlas se lavaron
por resuspensión suave y agitación secuencial en 1 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, Nonidet® P40 al
0,1% (v/v) y desoxicolato sódico al 0,05% (p/v) seguido de 1 ml de
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, Nonidet® P40 al 0,1% (v/v) y
desoxicolato sódico al 0,05% (p/v). Las proteínas
inmunoprecipitadas se liberaron a partir de Proteína
A-agarosa por incubación en 30 \mul de tampón de
muestra de SDS-PAGE a 70ºC durante 10 minutos y se
analizaron por SDS-PAGE seguido de
inmunotransferencia.
Los ensayos de unión competitiva se realizaron
en tampón Tris HCl 50 mM (pH 7,4) que contenía isoguvacina 40
\muM (Tocris Cookson) para bloquear sitios de unión de GABA_{A}
de cerebro de rata. Se realizaron preparaciones de membrana P2 a
partir de células HEK293T transfectadas usando las condiciones
descritas anteriormente. Se añadieron concentraciones crecientes de
GABA para desplazar el antagonista [3H]-CGP 54626
(Tocris Cookson, 40 Ci/mmol). Las condiciones de ensayo fueron
[^{3}H]-CGP54626 0,4-0,6 nM,
incubado con 50 \mug/tubo de fracciones "mitocondriales" de
cerebro de rata en bruto o 25 \mug/tubo de membranas P2 de HEK293T
a temperatura ambiente durante 20 minutos. El volumen total por
tubo fue de 0,5 ml y la unión no específica se determinó usando GABA
1 mM. El ligando unido se recuperó usando un recolector Brandel 48
en filtros GF/B (Whatman) y se midió por centelleo de líquidos
usando un contador Beckman LS6500.
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<400> 27
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\hskip-.1em\dddseqskiptcctcccaat gtggtaacca tcg
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
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<400> 28
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\hskip-.1em\dddseqskipacaagaccat catcctgga
\hfill19
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<210> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
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<400> 29
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\hskip-.1em\dddseqskipgatcacaagc agtttctggt c
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<211> 39
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<212> ADN
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<220>
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Cebador
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<400> 30
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\hskip-.1em\dddseqskipgttgtcccca tggtgcccaa gatgcgcagg ctgatcacc
\hfill39
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<210> 31
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<211> 43
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<212> ADN
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<400> 31
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcctgcggc cgcggatcct cacttataaa gcaaatgcac tcg
\hfill43
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<212> ADN
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<400> 32
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\hskip-.1em\dddseqskipctctgcccca tggccgtgcc gaagctcatc accctgagaa caaaccc
\hfill47
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<211> 51
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<400> 33
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\hskip-.1em\dddseqskipggcccagggc ggccgcactt acaggcccga gaccatgact cggaaggagg g
\hfill51
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<400> 34
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagggatgtt taataccact acaatgg
\hfill27
Claims (18)
1. Un receptor GABA_{B} que comprende un
heterodímero entre una proteína receptora
GABA_{B}-R1 y una proteína receptora
GABA_{B}-R2, donde la proteína receptora
GABA_{B}-R2 tiene la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la Fig. 1B o una secuencia de aminoácidos que tiene
una homología de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la Fig. 1B.
2. El receptor GABA_{B} de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el receptor GABA_{B}-R1 es
una proteína receptora GABA_{B}-R1, una proteína
receptora GABA_{B}-R1b o una proteína receptora
GABA_{B}-R1c.
3. Una proteína receptora
GABA_{B}-R2 aislada que tiene la secuencia de
aminoácidos proporcionada en la Fig. 1B.
4. Una secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína receptora GABA_{B}-R2 de acuerdo con la
reivindicación 3, o una secuencia de nucleótidos que es
complementaria a la misma en toda su longitud.
5. Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con
la reivindicación 4 que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada
en la Fig. 1A o una secuencia de nucleótidos que es complementaria a
la misma en toda su longitud.
6. Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con
la reivindicación 4 ó 5, que es una secuencia de ADNc.
7. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, que puede expresar una proteína receptora
GABA_{B}-R2.
8. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica un receptor
GABA_{B}-R1 y una secuencia de nucleótidos que
codifica un receptor GABA_{B}-R2, siendo capaz
dicho vector de expresar tanto una proteína receptora
GABA_{B}-R1 como una proteína receptora
GABA_{B}-R2, donde la proteína receptora
GABA_{B}-R2 tiene la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la Fig. 1B o una secuencia de aminoácidos que tiene
una homología de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la Fig. 1B.
9. Un vector de acuerdo con la reivindicación 8,
donde la proteína receptora GABA_{B}-R1 es una
proteína receptora GABA_{B}-R1a, una proteína
receptora GABA_{B}-R1b o una proteína receptora
GABA_{B}-R1c.
10. Una línea celular estable que comprende un
vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a
9.
11. Una línea celular estable modificada para
expresar proteínas receptoras tanto GABA_{B}-R1
como GABA_{B}-R2, donde la proteína receptora
GABA_{B}-R2 tiene la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la Fig. 1B o una secuencia de aminoácidos que tiene
una homología de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la
Fig. 1B.
Fig. 1B.
12. Una línea celular estable de acuerdo con la
reivindicación 10 u 11, que es una línea celular HEK293T
modificada.
13. Un receptor GABA_{B} que comprende un
heterodímero entre una proteína receptora
GABA_{B}-R1 y una proteína receptora
GABA_{B}-R2 producida por una línea celular
estable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a
12.
14. Una proteína receptora
GABA_{B}-R2 producida por una línea celular
estable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a
12.
15. Un anticuerpo específico para un receptor
GABA_{B} de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.
16. Un anticuerpo específico para una proteína
receptora GABA_{B}-R2 de acuerdo con la
reivindicación 3.
17. Un método para identificar un compuesto que
presenta actividad moduladora del receptor GABA_{B}, comprendiendo
el método poner en contacto un receptor GABA_{B} de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 con un compuesto de ensayo y detectar la
actividad o inactividad moduladora.
18. Un método para producir un receptor
GABA_{B} que comprende introducir en una línea celular apropiada
un vector o vectores adecuados que comprenden secuencias de
nucleótidos que codifican proteínas receptoras
GABA_{B}-R1 y GABA_{B}-R2, en
condiciones adecuadas para obtener la expresión de las proteínas
receptoras o variantes, donde la proteína receptora
GABA_{B}-R2 tiene la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la Fig. 1B o una secuencia de aminoácidos que tiene
una homología de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos
proporcionada en la Fig. 1B.
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