JP2000512280A - ヒト甲状腺刺激ホルモンレセプター組成物およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 診断及び治療の目的に有用な、ＴＳＨＲ組成物及びその使用方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト甲状腺刺激ホルモンレセプター組成物およびその使用 技術分野 本研究は、全体的には細胞生理学、内分泌学、および免疫学の分野に関する。 特に本研究は、ヒト甲状腺刺激ホルモン(thyrotropin)レセプター組成物と、そ れらを用いた診断および治療法とに関する。 背景技術 従って、自己免疫疾患の患者における治療処置のための方法および組成物が必 要であり、それらは、利用できるアプローチの限界を打ち破るか、または除去す るものであろう。 図面の簡単な説明 第１図：パネルＡ： 細胞表面上にＴＳＨＲを発現しているＣＨＯ単層細胞ヘ の¹²⁵Ｉ−ＴＳＨの特異的結合。ウェル当たりのＴＳＨＲを同数にするために、 ４kb ＴＳＨＲ細胞およびＴＳＨＲ−０細胞を、それぞれ２４穴および９６穴の 培養皿内で培養した。細胞は、表示した濃度の¹²⁵Ｉ−ｂＴＳＨ（２４および９ ６穴プレートに、ウェル当たりそれぞれ２５０ｍｌおよび５０ｍｌ）と共にイン キュベートした。特異的な結合は、平行ウェルにおけるトランスフェクトされて いないＣＨＯ細胞に結合したトレーサーを引き算することにより測定した。パネ ルＢ： それぞれ２４および９６穴プレートで培養した４kb ＴＳＨＲ細胞およ びＴＳＨＲ−０細胞を用いたＴＢＩ分析。分析は、方法に記したように、同一の グレーヴズ病患者の血清を、¹²⁵Ｉ−ｂＴＳＨ（１０⁶cpm／ｍｌ）の飽和濃度に おいて使用して行なった。両パネルに示したデータは、二重の細胞皿からのほぼ 一致した値の平均値である。 第２図： ＴＢＩ分析における、放射性同位元素標識したヒトとウシのＴＳ Ｈの比較。データは、９６穴マイクロタイターウェル中で培養したＴＳＨＲ−０ 細 胞（細胞当たり〜150,000ＴＳＨＲ）を用いて調べた、１２の血清について示さ れている。ＴＢＩ分析は方法に記した通りである。¹²⁵Ｉ−ｂＴＳＨまたは¹²⁵Ｉ −ｈＴＳＨ（５ｘ１０⁴ｃｐｍ／ｍｌ；１０⁶ｃｐｍ／ｍｌ）５０ｍｌを、各々の ウェルに加えた。示した数値は各々のトレーサーについての三重のウェルの、ほ ぼ一致した値の平均値である。正常な血清の存在下におけるトレーサーＴＳＨの 結合は：¹²⁵Ｉ−ｂＴＳＨ、12,396ｃｐｍ（12,044、12,323、12,821cpmの平均） ；¹²⁵Ｉ−ｈＴＳＨ、2442ｃｐｍ（2509、2362、2454cpmの平均）であった。 第３図： かき集め、ホモジナイズしたＴＳＨＲ−10,000細胞は、洗浄剤で抽 出したＴＳＨＲの収量を減らす。１０ｃｍの集密的な(confluent)皿（５ｘ１０⁸ 細胞）５０個から細胞をかき集め、ペレット化した。１％のTriton X-100を含ん でいる緩衝液で抽出した（方法）後、表示した細胞数より成るアリコート（５０ ｍｌ）を、キットに通常使われている同量のブタＴＳＨＲに代用させた。別のプ ロトコールでは、細胞を培養皿から移さずに、１％のTriton X-100を含んでいる 緩衝液で「直接」細胞を抽出した（方法）。洗浄剤を含んでいる緩衝液３ｍｌを 、直径10ｃｍの培養皿（１０⁷細胞）に加えた。細胞抽出物の希釈の間、この洗 浄剤の濃度を一定に保持した。この分析においては、Triton X-100の最終濃度0. 25％は、¹²⁵Ｉ−ＴＳＨの結合に影響しないことが認められた。垂直の断続線は 、100％として定義した、ブタの可溶化されたＴＳＨＲ５０ｍｌと同等のＴＳＨ 結合（水平の断続線）を達成するために必要なＣＨＯ細胞数を示す。 第４図： ＴＳＨ結合阻害分析における、ブタおよびヒトの可溶化されたＴＳ ＨＲの比較。既知のあるいは擬似の、グレーヴズ病用に臨床研究所に送付された ３０の血清のＴＢＩ活性を測定した。血清は、ブタＴＳＨＲを用いた市販のキッ トで測定した。さらに、全く同じ血清を、可溶化したヒトＴＳＨＲをブタＴＳＨ Ｒに代用したこと以外は全く同じ試薬を用いて分析した（方法）。キットに定め られている、ポジティブであるとするためのカットオフポイント（ＴＢＩ＞１５ ％）を示す。矢印は、ヒトＴＳＨＲでは検出可能なＴＢＩ活性を有するが、ブ^{12 5} ＩタＴＳＨＲには活性を有しない二つの血清を示す。 第５図：甲状腺刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）活性と、可溶化したヒト（パネ ルＡ）またはブタ（パネルＢ）のＴＳＨＲで測定した、ＴＳＨ結合阻害（ＴＢ Ｉ）活性との相関関係。ＴＳＩ活性は、第４図に描いた２８の血清について、ヒ トＴＳＨＲで安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ Ｏ）細胞に関しての生物検定法を用いて測定した（方法）。細かい平行線を引い た区域は、正常な個体（ｎ＝２０）からの血清について測定したｃＡＭＰレベル （基準の130％）の平均値±２S.D.を示す。 第６図： パネルＡ： ＴＳＨＲ−10,000細胞における、先駆体で標識したＴ ＳＨレセプターの免疫沈降反応。細胞タンパク質を³⁵Ｓ−メチオニンおよび³⁵Ｓ −システイン（１時間のパルス；３および１６時間のチェイス）で標識し、次い で、そのエピトープがＴＳＨＲのアミノ酸残基22−３５（17）である、マウスｍ Ａｂ Ａ₁₀を用いた免疫沈降を行なった（方法）。免疫沈降した物質の部分を未 処理のままにする（Ｃｏｎ）か、またはエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ） またはＮ−グリコシダーゼＦ（Ｅｎｄｏ Ｆ）で処理した。産生物を、還元条件 下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％）にかけた。オートラジオグラフ ィーは16時間行なった。この実験ならびに以下の実験に用いた予め染色した分子 量マーカーの大きさは、未染色マーカーに対する、先行のキャリブレーションに より測定した（方法）。パネルＢ： ＴＳＨＲに対するｍＡｂの特異性。ＴＳＨ Ｒ−10,000細胞およびトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の両者を用いて 、一晩チェイスを行なった後、免疫沈降を行なった。さらに、先駆物質で標識し たＴＳＨＲ−10,000細胞を、ＴＰＯに対するｍＡｂと共にインキュベートした。 免疫沈降したタンパク質（酵素的に脱グリコシル化されていない）を7.5％のポ リアクリルアミドゲルにかけた。48ｋＤａバンドの非特異性に注目されたい。ま たこの図面には、ＴＳＨＲ−10,000細胞におけるＴＳＲの、Ｂサブユニットに対 するｍＡｂＴ３−365との免疫沈降が、ｍＡｂ Ａ10とよりもずっと効率が悪いこ とも示されているが、これは前者が主として変性したＴＳＨＲを認識することに よるのかもしれない(21)。ｍＡｂＴ３−365についての48ｋＤａの明らかな二本 のバンドは、再現不能のアーチファクトである。 第７図： ＴＳＨＲ−10,000細胞において過剰発現されたＴＳＨＲのイムノ ブロット。表示した場合には、これらの細胞またはトランスフェクトされていな いＣＨＯ細胞（「ＣＨＯ」）の粗膜標本は、未処理のままにする（Ｃｏｎ）か、 またはＮ−グリコシダーゼＦ（Ｅｎｄｏ Ｆ）またはエンドグリコシダーゼＨ（ Ｅｎｄｏ Ｈ）で処理した（方法）。次いで、材料を、還元条件下でポリアタリ ルアミドゲル電気泳動（10％）にかけ、ＰＶＤＦ膜に移し、表示したｍＡｂでプ ローブした。パネルＡ： いずれもＴＳＨＲのＢサブユニット（残基604ないし7 64の範囲内のエピトープ）に対するものである、ｍＡｂ Ｔ３−495およびＴ３− 365を用いたイムノブロット（方法）。パネルＢ： トランスフェクトされてい ない細胞との相互作用の欠如により決定される、Ｔ３−495およびＴ３−365ｍＡ ｂの特異性。パネルＣ： ｍＡｂ Ａ 10（ＴＳＨＲのアミノ酸22残基ないし35を 含んでいるエピトープ）とのイムノブロッティングでの、脱グリコシル化された Ａサブユニットの大きさの確認。同様のデータが、ＴＳＨＲのＡサブユニットに 対する別のｍＡｂである、ｍＡｂＡ１１を用いて得られた（データは示さず）。 パネルＤ： トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の認識の欠如、並びに無 関係な抗原（ＴＰＯ）に対するｍＡｂによるＴＳＨＲの検出の欠如により決定さ れる、ＴＳＨＲに対するｍＡｂ Ａ 10の特異性。 第８図： ＴＳＨレセプターサブユニットの概略説明図。この線図は、一定の 比率に縮小しておらず、本研究の新たな情報をもとに、発明者等の先の説明 （ 12）を修正したものである。ＴＳＨＲのエクトドメインのアミノ末端の三分の二 は、各々α−ヘリックスとβ−シートとを持つ９個のロイシンに富む繰り返しを 含み、リボヌクレアーゼＡインヒビターの三次元構造を基盤としている（28）。 この領域のさらに詳しいモデルは、Kajava等（29）により完成されている。Ａサ ブユニットのポリペプチッド骨格の大きさは35kDaであり、従って推定される開 裂部位＃１は、およそアミノ酸残基330となる（３）。グリコシル化されていな い主要なＢサブユニットは〜42kDaであり、従って第二の開裂部位はおよそ残基3 80に位置する。これら二つの部位での開裂は、〜50アミノ酸残基の推定上のＣペ プチドを放出する。残基317ないし366の濃い線は、他の糖タンパク質ホルモンレ セプターに比べてＴＳＨＲに対する独特の、50アミノ酸の「挿入」を表す。Ａサ ブユニットの８個のシステインのうち、６個のみを示す。ジスルフィド結合に関 わることが示されているシステインは仮説的なものであるが、それらがＴＳＨＲ の開裂後のＡおよびＢサブユニットの結合を維持することを表 している。ＴＳＨＲｍｙｃは、残基338ないし349と置換されるｃ−ｍｙｃエピト ープを含む。このエピトープに対するｍＡｂによる検出が、単一サブユニット型 のＴＳＨＲのみであるということは、二つのサブユニットへの開裂の結果、この エピトープが消失することを意味するであろう。この場合、開裂はｃ−ｍｙｃエ ピトープの上流か、またはその中にあってもよい。 第９図： ＨＥＫ細胞において安定発現されたｃ−ｍｙｃエピトープのタグを つけたＴＳＨＲ（ＴＳＨＲｍｙｃ）の免疫沈降。パネルＡ： 細胞タンパク質を³⁵ Ｓ−メチオニンおよび³⁵Ｓ−システイン（１時間パルス；一晩チェイス）で標 識した後、ｍＡｂ Ａ10（Ａサブユニット）、またはｍＡｂ ９Ｅ 10（ｃ−ｍｙ ｃピトープ）のいずれかを用いて免疫沈降した。沈降させた検体を未処理のまま にする（Ｃｏｎ）か、またはエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）またはＮ −グリコシダーゼＦ（Ｅｎｄｏ Ｆ）で処理した（方法）。産生物を、還元条件 下において、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（10％）にかけた。グリコシル化 されたＡサブユニットの位置を強調するための対照として、ＴＳＨＲ−10,000細 胞のｍＡｂ Ａ10（ＴＳＨＲｍｙｃ材料の約１／２０の量）による免疫沈降を、 一番右のレーンに示す。グリコシル化されたＡサブユニットが、〜62kDaのより 鮮明なグリコシル化されていないバンドに重なっている広がったバンドであるこ とに注意されたい。乾燥させたゲルのオートラジオグラフィーは17日間であった 。パネルＢ： いくつかの付加的または微細な特徴を説明している、バネルＡの 実験と同様の実験。第一に、そして最も重要であるのは、 ＴＳＨＲ−10,000細 胞の脱グリコシル化したＡサブユニットが、ＴＳＨＲｍｙｃ細胞の脱グリコシル 化したＡサブユニットと同一の大きさであることを示すために、同じゲルに含ま れていることである。第二には、異なるレセプター型の比例関係が、実験ごとに 変わることである。また、 ＴＳＨＲ−10,000細胞においては、開裂対未開裂レ セプターの、並びに単鎖レセプターの異なる型の相対的な割合が、示した二つの 実験で異なっており、このことは発明者等により、先のＴＳＨ架橋実験において 認められている（７）ことに注目されたい。オートラジオグラフィーは17日間で あった。パネルＣ： トランスフェクトされていないＨＥＫ細胞、並びにＴＰＯ に対する無関係なｍＡｂを用いたＴＳＨＲｍｙｃ細胞の、免疫沈降によって 測定された、ｍＡｂ Ａ10により認識される脱グリコシル化された35kDaのＡサブ ユニットバンドの特異性。48kDaバンドの非特異性に注目されたい。広がったグ リコシル化されたＡサブユニットが、より鮮明なグリコシル化されていないＴＳ ＨＲ成分（パネルＡ参照）の上に重ねられており、細胞内のＴＳＨＲの先駆物質 または分解産物を表しているといってよい。ＴＳＨＲｍｙｃ細胞におけるｃ−ｍ ｙｃエピトープのｍＡｂ ９Ｅ 10の特異性についてのデータは、参考文献15を参 照のこと。 第10図： インタクト（intact）なＴＳＨＲｍｙｃおよびＴＳＨＲ−０細胞 の表面上のＴＳＨＲに対する¹²⁵Ｉ−ＴＳＨの架橋の比較。両細胞型とも、同様 の数のＴＳＨＲ（細胞当たり各々、〜１０⁵および〜１.５ｘ１０⁵）を発現する 。放射性同位元素標識したＴＳＨの架橋、還元条件下でのＰＡＧＥ（1０％）、 およびオートラジオグラフィー（１８時間）は、方法に記した通りであった。リ ガンド¹²⁵Ｉ−ＴＳＨそれ自体がジスルフィド結合により結合した二つのサブユ ニットを含むことに注意されたい。還元条件下では、これらのサブユニットの一 つだけ（〜１４ｋＤａ）が、ＴＳＨＲに共有結合して残る。従って、ＴＳＨＲの 大きさは、この複合体からこの大きさを減じることにより推定される。 第１１図： ＴＳＨＲの二つの開裂部位の存在のための付加的な証拠。ＴＳＨ Ｒのエクトドメインは、５個の任意のドメイン（ＡからＥまで）に分けて示して あり、それらをキメラのＴＳＨ−ＬＨ／ＧＣレセプター分子の創造に用いた（２ ４）。本研究に関連のある３個のキメラのレセプター並びに、アミノ酸残基３１ ７ないし３６６が欠損しているＴＳＨＲ突然変異体を示す。これらの５０のアミ ノ酸は、ＬＨ／ＣＧレセプターには存在しない。従って、ＴＳＨＲのドメインＤ がＬＨ／ＣＧレセプターの対応するセグメントで置換する場合、残基３１７ない し３６０が欠けている。ＴＳＨＲｍｙｃにおけるｃ−ｍｙｃエピトープの部位を 、他のセグメントと関連して示した。 第１２図： ＣＨＯ全細胞におけるＴＳＨＲの免疫沈降。細胞タンパク質を³⁵ Ｓ−メチオニンおよび³⁵Ｓ−システイン（表示した実験では、１時間のパルスお よび８時間のチェイス）で先駆体標識した後、ＴＳＨＲに対するマウスモノクロ ーナル抗体（Ａ９＋Ａ１０；Paul Banga博士、ロンドン、英国）を用いて天然の 条件下で免疫沈降させた。以下のクローンＣＨＯ細胞系を用いた：トランスフェ クトされていないＣＨＯ細胞；５-および３-の非翻訳領域を含んでいる４ｋｂ ＴＳＨＲのｃＤＮＡでトランスフェクトしたＴＳＨＲ-ＷＴ-細胞（２６）；欠損 した非翻訳領域のある２．３ｋｂ ＴＳＨＲのｃＤＮＡでトランスフェクトした ＴＳＨＲ-Ｏ-細胞（２５）；２．３ｋｂ ＴＳＨＲのｃＤＮＡでトランスフェク トし、続いてそれぞれ800ｎＭまたは10,000ｎＭのメトトレキサート中での増殖 に適合させたＴＳＨＲ−800およびＴＳＨＲ−10,000細胞。免疫沈降したタンパ ク質を、還元条件下において、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％）に かけた。オートラジオグラフィーは１０日間であった。本質的に同等なデータが 、二回目の実験において得られた。矢印は、先にMisrahi等（１２）により観察 され、デンシトメトリーにより定量された、100ｋＤａのＴＳＨＲホロレセプタ ー型を示す。 第１３図： インタクトな細胞の表面上のＴＳＨＲに対する¹²⁵Ｉ−ＴＳＨの 架橋。用いた細胞は、第１２図の説明文中に述べられている。放射性同位元素標 識したＴＳＨの架橋、還元条件下でのＰＡＧＥ（７．５％）、およびオートラジ オグラフィー（２０時間）は方法に記した。等量の細胞膜タンパク質を各レーン につけた。４ｋｂＴＳＨＲのｃＤＮＡで安定にトランスフェクトしたＴＳＨＲ− ＷＴ細胞（２６）におけるＴＳＨＲの視覚化には、ずっと長いオートラジオグラ フィーの時間（少なくとも１０日間）が必要であった。同様なデータが、二回目 の実験において得られた。 第１４図： 異なる数のＴＳＨＲを発現している安定にトランスフェクトした ＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰレベル。方法に記したように、細胞を低 張培地（第１４Ａ図）または等張培地（第１４Ｂ図）においてインキュベートし た。これらの培地は、１ｍＵ／ｍｌのＴＳＨ（１０^-9Ｍ）を欠くか、または迫加 されていた。この濃度は、低張培地にさらされた細胞（３４、３５）においては 超最大であり、等張培地でインキュベートした細胞においてはＥＣ５０より少し 低い（４９、５０）。示したデータは、３ないし４回の実験で得られた値の平均 ±Ｓ．Ｅ．である。 第１５図： 標識されていないＴＳＨの濃度増加における、ＴＳＨＲを発現し ているＣＨＯ細胞への¹²⁵Ｉ−ＴＳＨの結合。安定にトランスフェクトした細胞 系は、第１２図の説明文中に述べた。単層のintactな細胞を、ＴＳＨを含んでい る培地中で、方法に記したようにインキュベートした。括弧は、三重の細胞皿に おいて得られた値の平均±Ｓ．Ｅ．を示す。リガンドによる部分的なレセプター の飽和を達成するために、ＴＳＨＲ−800およびＴＳＨＲ−10,000細胞を、トラ ンスフェクトされていないＣＨＯ細胞と共に１：50に希釈した。数値は、各々の 細胞系について最大結合が異なるため、標識されていないＴＳＨの不在時におけ る、ＴＳＨの最大結合の％として表す。同様な結果は、ＴＳＨＲ−800およびＴ ＳＨＲ−10,000を、ＣＨＯ細胞において、１：２０に希釈した場合に見られたが 、最大結合がより小さい場合は例外とする。 第１６図： 標識されていないＴＳＨがない場合の、¹²⁵Ｉ−ＴＳＨによる、 ＴＳＨＲを発現している細胞に対するＴＳＨの結合。９６穴プレート中の細胞を 、方法に記したように１．２５ｘ１０⁶ｃｐｍ／ウェル（２．５ｘ１０⁷ｃｐｍ／ ｗｅｌｌ）までの濃度の¹²⁵Ｉ−ＴＳＨ中でインキュベートした。示したデータ は、三重の細胞皿で得られた値の平均±Ｓ．Ｅ．である。データは、三つの別々 の実験の代表的なものである。 第１７図： カルボキシル末端で開裂した三つのＴＳＨＲエクトドメイン変異 体の概略説明図。ホロレセプターの曲がりくねった膜通過および細胞質部位（シ グナルペプチドを含む７６アミノ酸残基）は示していない。停止コドンがそれに 続く６個のヒスチジン残基（６Ｈ）は、表示したＴＳＨＲ残基の後に挿入されて いる。残基４１８への停止コドンの挿入は、主として高マンノースレベルの炭水 化物を含んでいるエクトドメインを生じることが以前から示されており、それは ほとんどが細胞内に保持され、グレーヴズ病患者の血清中のＴＳＨＲ自己抗体で は認識されない（３４）。本研究において示されたように、ＴＳＨＲエクトドメ インのカルボキシル末端の漸進的な開裂は、ＴＳＨＲの自己抗体活性を完全に中 和することができる、成熟した複合炭水化物を伴う物質の、高レベルの分泌に導 く。 第１８図： 培地へのＴＳＨＲエクトドメイン変異体の相対的な分泌。アミノ 酸残基２６１、２８９、および３０９で開裂したＴＳＨＲエクトドメイン変異体 を安定発現しているＣＨＯ細胞を、１時間先駆体標識し、１６時間チェイスした （方法）。次いで、培地中の（Ｍ）および細胞の（Ｃ）ＴＳＨＲを、アミノ酸残 基２２ないし３５に対するマウスｍＡｂ（Ａ１０）を用いて免疫沈降した（３７ ）。培地中のＴＳＨＲはまた、エクトドメイン変異体のＣ末端に挿入された６個 のヒスチジン残基に結合するＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて回収した。Ｎｉ−ＮＴＡ は、多数のＣＨＯ細胞タンパク質と相互作用するため、先駆体標識した細胞のＴ ＳＨＲの同定には効果的な方法ではない。示した実験でのオートラジオグラフィ ーは１２時間であった。 第１９図： グレーヴズ病患者の血清におけるＴＳＨＲ自己抗体による、ＴＳ ＨＲエクトドメイン変異体の認識。分析は、可溶化されたブタ甲状腺膜における 、自己抗体の、ＴＳＨＲに対する¹²⁵Ｉ−ＴＳＨの結合と競合する能力に関係す る（２５）（方法）。左のパネル：ＣＨＯ細胞からのコンディションドメディウ ム（ならし培地）がない条件下では、グレーヴズ病患者からの血清は、正常な個 体からの血清と異なり、¹²⁵Ｉ−ＴＳＨの結合を〜６０％まで減少させる。右の パネル：甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）を分泌している無関係な細胞培養物 からのコンディションドメディウムは、ＴＳＨ結合阻害（ＴＢＩ）活性に何ら影 響しない。対照的に、ＴＳＨＲ−２６１およびＴＳＨＲ−２８９細胞培養物から のコンディションドメディウムは、（ＴＳＨＲ−３０９と違い）ほぼ完全にＴＢ Ｉ活性をくつがえした。バーは、二重の測定値の平均±有効範囲を示す。コンデ ィションドメディウムから部分的に精製した後のＴＳＨＲ−２６１を用いての、 １８人のグレーヴズ病患者の血清についてのデータは、第２５図を参照のこと。 第２０図： ＴＳＨＲ−２６１エクトドメイン変異体のレクチン特異性。Ｔ ＳＨＲ−２６１を発現しているＣＨＯ細胞からのコンディションドメディウムを 、表示したレクチンに結合したセファロースに吸着させた（方法）。非吸着性（ 「フロウスルー」）およびビーズから回収した物質（「溶出物」）を、ニトロセ ルロースフィルター上に（原液のままか、または希釈した後に）スポットし、Ｔ ＳＨＲのアミノ末端に対するｍＡｂ Ａ１０でプローブした。 第２１図： コンディションドメディウムからレクチンを用いて濃厚にしたＴ ＳＨＲ−２６１のイムノブロット。等しい容量の同一の培地から、バンデイレア ・シンプリキフォリア（Bandeiraea simplicifolia）、コンカナバリンＡ、また は小麦胚芽凝集素を用いて得られた物質を、そのままにする（ー）か、エントグ リコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）またはエンドグリコシダーゼＦ（Ｅｎｄｏ F)で 消化した（方法）。標本を１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。タ ンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、マウスｍＡｂ Ａ１０でプローブした。 第２２図： ＴＳＨＲエクトドメイン変異体のイムノブロット。ＴＳＨＲ−２ ６１、ＴＳＨＲ−２８９、およびＴＳＨＲ−３０９を、コンカナバリンＡを用い てコンディションドメディウムからアフィニティ濃縮した（方法）。材料をその ままにする（ー）か、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）またはエンドグ リコシダーゼＦ（Ｅｎｄｏ Ｆ）で消化した（方法）。標本を10％ポリアクリル アミドゲル上で電気泳動した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ＥＣＬシステム を用いて、アミノ酸残基２２ないし３５（３７）に対するマウスｍＡｂ Ａ１０ でプローブした（方法）。 第２３図： ＴＳＨＲ−２６１の直接的な視覚化および定量。左パネル：コ ンディションドメディウムからコンカナバリンＡを用いて捕獲した後（最初のレ ーン）、およびそれに続くＮｉ−キレートクロマトグラフィーの工程の後（二番 目のレーン）に回収した材料のポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシ ーブルー染色。右パネル： 酵素的に脱グリコシル化し、クーマシーブルー染色 した材料の、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるＴＳＨＲ−２６１濃度の概 算。脱グリコシル化は、グリコシル化されたタンパク質よりも、より鮮明かつ強 いバンドを生じる。反応物中に存在する組み換えエンドグリコシダーゼＦは、０ ．７ｍｇタンパク質の内標準を与える。ＴＳＨＲ−２６１ポリペプチドは、グリ コシル化されたタンパク質の量の約６０％に相当する（第５および６図参照）。 第２４図： ＴＳＨＲ−２６１によるＴＳＨＲ抗体の中和の滴定。中間のＴ ＳＨ結合阻害（ＴＢＩ）活性のあるグレーヴズ病患者からの血清を、市販の自己 抗体キットを用いて（方法）、濃度を増した、部分精製されたＴＳＨＲ−２６１ の存在下に分析した。正常な個体からの血清は、可溶化されたブタ甲状腺ＴＳＨ Ｒへの¹²⁵Ｉ−ＴＳＨの結合を阻害しない（細かい平行せんを引いたバー）。Ｔ ＳＨＲ−２６１がないと、ＴＳＨの結合は最大値の〜４０％まで減少する。この 分 析におけるインキュベーションの体積は０．２ｍｌである。バーは、二重の測定 値の平均±有効範囲を表す。 第２５図： コンディションドメディウムから部分精製したＴＳＨＲ−２６１ によるＴＳＨＲ自己抗体の中和。１８人のグレーヴズ病患者の血清中の自己抗体 のＴＳＨ結合阻害（ＴＢＩ）活性を、市販のキットを用いて測定した（方法）。 これらの血清は、正常な個体からの二つの血清と異なり、ブタ甲状腺からの可溶 化された膜への¹²⁵Ｉ−ＴＳＨの結合と競合する（細かい平行線を引いたバー） 。ＴＳＨＲ−２６１（試験管あたり５０ｎｇ）が包含されると、１８の血清にお ける自己抗体の全てあるいはほとんどが中和された。バーは、二重の測定値の平 均±有効範囲を表す。 第２６図： 表面上に異なる数のＴＳＨＲを発現しているＣＨＯ細胞に対する 、ＩｇＧ−クラスＴＳＨＲ自己抗体の結合のフローサイトメトリーによる分析。 ＴＳＨＲ−ＷＴ細胞を、４ｋｂのＴＳＨｃＤＮＡで安定にトランスフェクトした （２４）。ＴＳＨＲ−０細胞は、ＴＳＨｃＤＮＡの２．３ｋｂの転写領域を含む （２５）。ＴＳＨＲ−800およびＴＳＨＲ−10,000細胞においては、トランスゲ ノム(transgenome)は増幅されており、ＴＳＨＲの発現は、細胞当たり各々〜１ ０⁶および〜１．９ｘ１０⁶に増加していた（１８）。細胞を、正常な個体（白ぬ きのヒストグラム）からの、およびＴＳＨ結合阻害分析により測定される高レベ ルのＴＳＨＲ自己抗体を含んでいる、グレーヴズ病患者（ＢＢ１、陰影を付した ヒストグラム）からの、血清（１：１０）と共にインキュベートした。蛍光は、 方法に記したように発生させた。 第２７図： ＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体およびウサギポリク ローナル抗体を用いた、ＴＳＨＲ−10,000細胞のフローサイトメトリーによる分 析。ＴＳＨＲ−10,000細胞を、マウスモノクローナル抗体Ａ９（１：１００） （パネルＡ）およびＡ１０（１：１００）（パネルＢ）、並びにウサギ血清Ｒ８ （１：６０）（パネルｃ）と共にインキュベートした（陰影を付したヒストグラ ム）。対照の血清（白ぬきのヒストグラム）は、特異的な血清に使用したものと すべて同一の希釈の、甲状腺ペルオキシダーゼに対するマウスモノクローナル抗 体、および正常なウサギ血清である。蛍光は、方法に記したように発生させた。 第２８図： ＴＳＨＲを発現している細胞を用いたフローサイトメトリーでの 、自己抗体蛍光シグナルの特異性に対する、トランスフェクトしていないＣＨＯ 細胞での吸着の影響。代表的な例を、それぞれ非常にＴＢＩ値の高い（各々81.7 ％および100％の阻害）、７ＨおよびＢＢ１の二個体からの血清（陰影を付した ヒストグラム）について示す。血清（１：１０希釈）を、ＴＳＨＲ−10,000細胞 とのインキュベーションに先立ち、トランスフェクトしていないＣＨＯ細胞上に あらかじめ吸着させない（上のパネル）か、またはあらかじめ吸着させた（下の パネル）（方法）。ネガティブコントロールとして含まれているのは、ＴＢＩ分 析により検出可能なＴＳＨＲ自己抗体のない、正常な個体からの血清である（白 ぬきのヒストグラム）。 第２９図： 表面上に組み換えＴＳＨＲを発現している細胞を用いての、ＴＳ ＨＲ自己抗体の吸着。ＴＳＨＲ−10,000細胞とのＦＡＣＳ分析で蛍光シグナルを 生じる血清ＢＢ１、１０Ｈ、３Ｈ、および１０Ｍ（表１）を、同じ細胞を用いた 分析に先立って、ＴＳＨＲ−10,000細胞上にあらかじめ吸着した（室温で０．５ 時間、３回）、（白ぬきのヒストグラム）。トランスフェクトしていないＣＨＯ 細胞上にあらかじめ吸着させた後、同じ血清により生じる蛍光を、陰影を付した ヒストグラムで示す。ＴＳＨＲ自己抗体の吸着を最適化するため、ＴＳＨ結合阻 害（ＴＢＩ）分析において血清は、各々の力価に応じて希釈した（表２）。 第３０図： 表面上にＴＳＨＲまたはＴＰＯのいすれかを発現しているＣＨＯ 細胞についてのフローサイトメトリーによって測定した、ＢＢ１血清におけるＴ ＰＯおよびＴＳＨＲ自己抗体の相対的な力価。ＴＳＨＲ−10,000細胞（１８）お よび、先にＣ４Ｃ細胞として記載した（２０）ＣＨＯ−ＴＰＯ細胞は、いずれも 、10,000ｎＭのメトトレキセートに抵抗性の細胞と共にジヒドロ葉酸レダクター ゼ遺伝子を用いて増幅させた遺伝子を含む。これらの二つの細胞系は、それらの 表面上に、同様の数（〜２ｘ１０⁶）のＴＳＨＲまたはＴＰＯを発現する。血清 ＢＢ１（陰影を付したヒストグラム）および、臨床検査により検出可能なＴＳＨ ＲまたはＴＰＯ自己抗体のない正常な個体からの血清（白ぬきのヒストグラム） を、１：１０と１：1000の間の希釈において検査した。 第３１図： ＴＳＨＲのエクトドメインは、５個の任意のドメイン（ＡからＥ まで）に分割して示されており、これをキメラのＴＳＨ−ＬＨ／ＣＧレセプター 分子の作成に用いた（１９）。本研究に関連した三つのキメラレセプターを示す 。ＬＨ／ＣＧレセプターにはアミノ酸残基３１７ないし３６６が存在しないこと に注目されたい。従って、ＴＳＨＲのドメインＤをＬＨ／ＣＧレセプターの対応 するセグメントで置き換えると、残基３１７ないし３６０は失われる。 第３２図：Ａ． ＴＳＨＲにおける推定上の開裂部位１の領域に導入されたア ミノ酸の置換。キメラレセプターＴＳＨ−ＬＨＲ−５のＤドメイン内に、突然変 異を生じた（第３１図）。ＬＨ／ＣＧレセプター用の断続線は、この領域がＴＳ ＨＲに独特であって、ＬＨ／ＣＧレセプターには存在しないことを表す。 Ｂ． Ａ．に記したレセプターを安定発現しているＣＨＯ細胞に対する、放射性 同位元素標識したＴＳＨの架橋。架橋産物を、還元条件下でＰＡＧＥ（７．５％ ）にかけ、ついでオートラジオグラフィーを行なった。リガンド、¹²⁵Ｉ−ＴＳ Ｈが、開裂していないＴＳＨホロレセプターかまたは開裂したＴＳＨＲのリガン ド結合性サブユニットＡに結合することが、この細胞表面上に開裂および未開裂 ＴＳＨＲの両者の存在を示していることに注目されたい。ホルモンリガンド複合 体のかたまりは、それ自体がジスルフィト結合で結合している二つのサブユニッ トを含むリガンドの、一つのサブユニットを含む。還元条件下では、一つのリガ ンドサブユニット（〜１４ｋＤａ）だけが、ＴＳＨＲに共有結合して残る。 第３３図：Ａ． ＴＳＨＲにおける推定上の開裂部位２の領域に導入されたア ミノ酸置換。キメラレセプターＴＳＨ−ＬＨＲ−４のＥドメインに突然変異を起 こさせた（第３１図）。太字で示した突然変異は、ＴＳＨ架橋によって測定され るように、開裂を阻害する。Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３突然変異において、「−」 は置換がないことを表すが、それはこれらのアミノ酸残基が両レセプターで同一 であるからである。Ｅ３においては、「・」はＬＨ／ＣＧレセプターに存在しな いアミノ酸の不在を表す。 Ｂ． Ａに記したレセプターを安定発現している、インタクトなＣＨＯ細胞に対 する、放射性同位元素標識したＴＳＨの架橋。開裂したレセプターにおけるサブ ユニットを解離するために、架橋したものを還元した。上の二つのパネルは７． ５％ゲルのオートラジオグラムを描いたものであり、下の二つのパネルは１０％ ゲ ルで電気泳動した材料を示す。 第３４図： ＧＱＥ₂₆₇−₂₆₉ＮＥＴ突然変異の存在は、野性型ＴＳＨＲの開裂 を妨げない。架橋した¹²⁵Ｉ−ＴＳＨ−ＴＳＨＲ産物を還元し、ＰＡＧＥ（１０ ％）およびオートラジオグラフィーを行なった。 発明を実施するための最良の形態 概括的な局面においては、本発明は、自己免疫疾患、特にグレーヴズ病の診断 および治療のための、診断および治療法に有用な、新規のヒト甲状腺刺激ホルモ ン組成物に向けて行なわれたものである。 本文に使われている技術的ならびに科学的用語は、他に定義しない限り、当業 者に一般的に理解される意味を有する。本文において参考文献は、当業者等には 周知の種々の方法論について作成されている。引用される、かかる周知の方法論 を発表している出版物その他の資料は、全て記載されているかのように、参考文 献として本文にことごとく組み入れられている。組み換えＤＮＡ技術の一般原則 を発表している標準的な参考用の研究には、Sambrook,J.等、Molecular Cloning :A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory出版、ニュー ヨーク州、プレインビュー（Plainview）(1989);Kaufman,P.B.等編、Handbook o f Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine、CRC出版、ボカ レイトン(Boca Raton)(1995);McPherson,M.J.編、Directed Mutagenesis：A Pra ctical Approach、IRL出版、オックスフォード(1991);Jones,J.,Amino Acid and Peptide Synthesis,Oxford Science Publications、オックスフォード(1992);A usten,B.M.およびWestwood,O.M.R.Protein Targeting and Secretion、IRL出版 、オックスフォード(1991)が含まれる。本発明を実行するに当たっては、当業者 等に周知のいかなる適切な材料および／または方法も利用することができる；し かしながら、好ましい材料および／または方法について記述する。以下の記述お よび実施例において引用している、材料および試薬等は、特にことわらない限り 市販のものから入手できる。 本発明の一つの局面によれば、現在発見されたことは、インタクトな細胞にお けるＴＢＩアッセイでは、（i）より多くのＴＳＨＲをもつ細胞の使用は、アッ セイの感度を改良するよりも減少させることと、（ii）放射性同位元素標識した ＴＳＨの種（ウシ対ヒト）が、得られるＴＢＩ値に影響し得ることである。一方 、非常に多くのレセプターを発現している細胞は、洗浄剤で可溶化したＴＳＨＲ の卓越した源ではあるが、それはその抽出法が本発明によって修正されている場 合にのみである。本発明の結果の一つは、実用的かつ費用効率のよいＴＢＩアッ セイにおいての、ブタのＴＳＨＲよりもヒトの組み換えられたＴＳＨＲを使用す ることの、以前には知られていなかった能力である。 本発明は、概して自己免疫疾患および、特にグレーヴズ病の治療処置のための 、本文に記した治療用組成物および当業者に高く評価されるであろうそれらの変 異物の、投与に関係する方法に広く向けて行なわれたものである。従って、一つ の局面において、本発明は、グレーヴズ病の治療法に向けて行なわれたものであ り、実質的に単離された本発明のヒト甲状腺刺激ホルモン組成物か、またはそれ らの変異体を、単独または一つ以上の他の活性成分と共に含んでなる効果的な量 の組成物を、グレーヴズ病を患っている患者に投与することを含んでいる。本発 明の方法による、かかる有用な組成物は、好ましくは、本発明による使用のため に、本文に開示されたか、または当業者等に周知の一つ以上のアッセイ法により 、選択される。 本発明の方法において有用な組成物は、好ましくは、実質的に単離されたヒト 甲状腺刺激ホルモンレセプターであり、それは本発明により組み換えによって産 生されるか、または患者においてグレーヴズ病を和らげることが可能なそれらの 変異体もしくは突然変異体であって、本文に記したように適切な分析法により選 択されてよい。このようにして選択されたＴＳＨ組成物は、望ましい治療結果を 達成するために、当業者等に周知の方法により投与されてよい。 本発明の組成物においては、例えば結果として生じたペプチドの血流中または 組織中での半減期を増加または減少させるための、他の変形が望ましいかもしれ ない。従って、分解に対してペプチドを保護するためのブロック基として作用す るかもしれない合成または非伝統的なアミノ酸残基、側鎖、ペプトイドにあるよ うな非アミド結合等の使用を含んでもよい本分野で周知の変更を導入することに より、有用な組成物の変形物を本発明の方法により製造することは、本発明の予 測される範囲内にある。これらのおよび他の、組成物の修正方法は、この分野で は周知である。 本発明による有用な組成物は、天然の源から単離および精製されてよい。しか しながらこの組成物は、この分野で周知の方法により合成されることが好ましい 。固相合成法が好ましいが、いかなる適切な合成法も用いてよい。 当業者等には、甲状腺組織の細胞のような細胞の集団の処置に際しては、治療 効果は、どんな数の既知の臨床上の終了点によってでも認められてよいことがわ かるであろう。本発明の化合物はまた、今日の治療の問題点ともいえる、薬剤耐 性との戦いにも役立つものである。本態様においては、本発明の化合物は、他の 作用物質と共に用いてもよい。薬剤耐性の機構は、例えばRemingtonのPharmaceu tical Science、第18版、上記、に記載されている。 効果的な治療に必要な活性成分の量は、投与法、標的部位、患者の生理学的状 態、および投与された他の薬剤を含んでいる、多くの異なる因子に依存するであ ろう。従って処置するための薬用量は、安全性と効率とを最適化するよう滴定さ れるべきである。典型的には、生体外（in vitro）で使用される薬用量は、その 活性成分のイン・シチュー（in situ）での投与に有用な量の、有用な手引きを 提供するといってよい。特定の病気の治療に効果的な投与量についての動物実験 は、ヒトの投与量の、さらに進んだ予測的指標を提供するであろう。種々の考慮 すべき問題は、例えば、GoodmanおよびGilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeuics、第７版、MacMillan出版社、ニューヨーク(1985)、およびRemingto nのPharmaceutical Science、第18版、Mack出版社、イーストン、ペンシルベニ ア州(1990)に記載されている。そこでは、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮 的、鼻の、イオン導入法による投与その他を含む、投与法について議論されてい る。 本発明に従って患者の治療に用いるための投与量の選択においては、標的細胞 に所望の治療効果を得るために十分な濃度の組成物を達成するであろう治療法が 選択されるだろう。当業者等は、効果的な濃度を達成するため投与の方法および 様式に依存して変わるであろう効果的な濃度を決定することができるだろう。 本発明の組成物の投与法の一つは、この組成物を含んでいる乾燥粉末配合物の 吸入である。肺胞を通して血流中へ活性成分を吸収させるためには、粉末は非常 に微細でなければならない；１ないし５ミクロン粒子程度の大きさ。高度に分配 する粉末は、薬物のボーラスを含んでいるエアロゾルクラウトを、吸入チャンバ ーの最上部において発生させる、吸入器により送達される。 本発明の組成物は、それ自体を患者の血流中に注入しやすいものにするであろ う。このようにして投与される活性成分の半減期は、周知の薬剤技術を用いるこ とにより、最大の治療効果に向けて操作されてよい。かかる技術の一例は、DEPO FOAMリン脂質球（Depo Tech Corp.、サンディエゴ、カリフォルニア州）として 知られており、これは数日ないし数週間の期間をかけて活性成分を徐々に放出す る。これは薬物のより低い初濃度と注入頻度とを用いて、一定したレベルの全身 濃度を与えるものである。 本発明の組成物を取り込みかつ安定化させる周知の方法は、薬物送達の異なる 経路を調節するために用いられてもよい。かかる技術の一例は、TECHNOSPHERE粉 末（Pharmaceutical Discovery Corp.、エルムスフォード、ニューヨーク州）で あり、これは活性ペプチド成分の構造的および機能的な完全性を保つ条件下にお いて、直径２ミクロンの球を確実に形成する。pH感受性の球は、血液中に注入さ れると活性成分を溶解および放出し、それはすばやく吸収される。このような微 粉末は、肺、口、静脈内、および腹腔内への投与に適している。 投与の部位および細胞は、治療される個々の疾患につての理解に基づき、当業 者により選択されるであろう。さらに、投与量、投与頻度、および治療経過期間 の長さは、治療される個々の疾患に基づき、当業者により決定および最適化され 得る。個々の投与の様式は、当業者により容易に選択されることが可能であり、 例えば経口、静脈内、皮下、筋肉内、その他を含むことが可能である。薬学的投 与量および薬物送達の原理は周知であり、例えば、Ansel,H.C.およびPopovich,N .G.、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems、第５版、Lea & Febiger出版、フィラデルフィア、ペンシルベニア州(1990)に記載されている 。例えば、本発明の薬剤を特異的に送達するためにリポソームを用いることがで きる。かかるリポソームは、薬物、放射性同位元素、レクチン、および毒素のよ うな、標的部位において作用する、付加的な生物活性化合物を含有するように製 造することができる。 本発明の組成物およびそれらの有用な変異体をコードしている核酸組成物は、 一般的には、ＲＮＡまたはＤＮＡ型か、混合ポリマー型か、または核酸の相補鎖 と塩基に特異的な方式で結合することが可能な、何らかの合成ヌクレオチド構造 をとっているであろう。かかる核酸の態様は典型的にはゲノムＤＮＡか，または 合成により調製したｃＤＮＡであるか、またはそれらの組み合わせから派生した ものである。ＤＮＡ組成物は、一般的には当該組成物またはそれらのフラグメン トをコードしている完全なコード領域を含む。 「機能的等価物」の意味するるものは、本発明の組成物と実質的に同様の生物 学的活性または免疫学的特徴を有しているペプチドであり、かかる活性または特 徴を有している「フラグメント」、「変異体」、「類似体」、「同族体」、また は「化学的誘導体」を含むことを意図するものである。本発明のペプチドの機能 的等価物は、従って、同等なアミノ酸配列を共有していなくてもよく、アミノ酸 の保存的(conservative)または非保存的な、通常のまたは通常でないアミノ酸の 置換が可能である。 本文中で「保存的」なアミノ酸置換と言っているのは、同様の側鎖を有するア ミノ酸残基の互換性を意味することを意図したものである。例えば、グリシン、 アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、脂肪族の側鎖を有するア ミノ酸群を形成し；セリンおよびトレオニンは、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有 するアミノ酸であり；アスパラギンおよびグルタミンは、アミドを含んでいる側 鎖を有するアミノ酸であり；フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファ ンは、芳香族側鎖を有するアミノ酸であり；リジン、アルギニン、およびヒスチ ジンは、塩基性側鎖を有するアミノ酸であり；システインおよびメチオニンは、 硫黄を含んでいる側鎖を有するアミノ酸である。所与の群からの一つのアミノ酸 を、同一の群からの別のアミノ酸と交換することは、保存的置換とみなされるで あろう。好ましい保存的置換群は、アスパラギン−グルタミン、アラニン−バリ ン、リジン−アルギニン、フェニルアラニン−チロシン、およびバリン−ロイシ ン イソロイシンを含む。 「突然変異体(mutant)」は、本文中に用いたように周知のペプチドまたはタン パク質と、少なくとも一つのアミノ酸が異なっているアミノ酸配列を有するペプ チドさす。突然変異体は、周知のタンパク質と、等しい生物学的および免疫学的 活性を有してもよい。しかしながら、突然変異体の生物学的または免疫学的活性 は、異なるかまたは欠損してもよい。例えば、ある突然変異体は、本発明のＴＳ ＨＲを特徴づける生物学的活性を欠損してもよいが、しかしそれに対する抗体の 産生、または抗体の検出または精製のためのエピトープとしての抗原決定基とし て、あるいはアゴニスト（競合的または非競合的）、アンタゴニスト、またはそ れらの機能の部分的なアゴニストとして、有用であってもよい。 本発明の分析に使用する適切な標識物は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、 化学発光化合物、または生物発光化合物のような、検出可能な標識物を含む。当 業者等は、他の適切な標識物を周知であろうし、あるいは、かかる慣例的な使用 実験法を確認することができるであろう。さらに、これらの標識物のペプチドに 対する結合は、この分野で周知の標準的な技術を用いて成し遂げられる。 本発明のＴＳＨＲの、さらに進んだ単離、精製、および配列決定は、例えば、 Cantor,C.編、Protein purification:Principles and Practice,Springer Verla g、ハイデルベルク，Publisher(1982);Hancock,W.編、New Methods in Peptide Mapping for the Caracterization of Proteins,CRC出版、ボカレイトン、フロ リダ州(1996)に記載されているような、標準的な生化学的方法により、本発明の 教示に従って成し遂げられてもよい。 ペプチド模倣薬が、病気の治療処置に使用される。かかるペプチド模倣物もま た本発明により提供されており、グレーヴズ病のような自己免疫疾患の調整のた めの薬剤として作用することができる。ペプチド模倣物は、製薬産業においては 一般的に、模倣されたペプチドの特性と類似した特性を有する非ペプチド薬物を 含むと理解されている。ペプチド模倣の設計の原理および実践は、この分野では 周知であり、例えば、Fauchere J.,Adv.Drug Res.15:29(1986);およびEvans等、 J.Med.Chem.30:1229(1987)に記載されている。治療上有用なペプチドに対して構 造的な類時性のあるペプチド模倣物は、同等の治療または予防効果を引き起こす ために使用されてもよい。典型的には、かかるペプチド模倣物は、生体内(in vi vo)における化学的分解に対する抵抗性のような、所望の特性を変えてもよい結 合によって任意に交換された、一つ以上のペプチド結合を含む。かかる結合は、 −CH₂NH−、−CH₂S−、−CH₂−CH₂−、−CH＝CH−、−COCH₂−、−CH(OH)CH₂− 、および−CH₂SO−を含んでよい。ペプチド模倣物は、増強さ れた薬理学的特性（生物学的半減期、吸収速度等）、異なる特異性、増加した安 定性、生産経済性、減少した抗原性等を示すといってよく、このことは、治療法 としてのそれらの使用を特に望ましいものにする。 本発明の組成物の正確な化学構造が、いくつかの因子に依存して変わってもよ いことは、当業者等には受け入れられるであろう。例えば、所与のタンパク質は 、その分子内にイオン化可能なカルボキシル、およびアミノ基が見つかっている ため、酸性または塩基性塩、あるいは中性の形で得られてよい。従って、本発明 の目的のためには、本発明の組成物の治療用または診断用活性を保持するヒトＴ ＳＨＲを含んでいる、いかなる形のペプチドも、本発明の範囲内にあることが意 図されるものである。 本発明の組成物は、本技術分野で周知の組み換えＤＮＡ技術により製造されて よい。例えば、本発明のヒトＴＳＨＲをコードしているヌクレオチド配列は、プ ラスミドのような適切なＤＮＡベクターに挿入されてよく、そのベクターを用い て適切な宿主を形質転換する。ヒト組み換えＴＳＨＲは、宿主中で発現により産 生される。形質転換した宿主は、原核または真核細胞でよい。この目的のための 、ヒトＴＳＨＲをコードしている好ましいヌクレオチド配列を本文中に開示する 。 合成ポリヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドの合成のための、周知の化 学的合成法により作成されてよい。かかる合成法は、例えば、Blackburn,G.M.お よびGait,M.J.編、Nucleic Acids in Chemistry and Biology,IRL出版、オック スフォード、英国(1990)に記載されており、また市販のオリゴヌクレオチドシン セサイザーも、製造業者らの指示に従って使用してもよいことが明らかであろう 。かかる製造業者の一つは、Applied Bio Systemsである。 本文中に開示したヌクレオチド配列に基づくプライマーを用いたポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）を、ｍＲＮＡプール、ｃＤＮＡクローンライブラリ、または ゲノムＤＮＡから、ＤＮＡフラグメントを増幅するために用いてよい。ＰＣＲヌ クレオチド増幅法は、本技術分野では周知であり、例えば、Erlich,H.A.編、PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,Stockton出 版、ニューヨーク、ニューヨーク州(1989);米国特許第4,683,202号；米国特許第 4,800,159号；および米国特許第4,683,195号に記載されている。当業者等に認め られるように、 本発明のポリヌクレオチドには、種々のヌクレオチドの欠損、付加、および置換 が取り込まれてもよく、また当業者等は、ヒトＴＳＨＲをコードしているヌクエ オチド配列における変化が、例えば対立遺伝子による多型、配列決定における小 さなエラー、およびその他の結果として生じてもよいことを認めるであろう。本 発明のペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼ イションプローブおよびＰＣＲプライマーとして有用な、短いオリゴヌクレオチ ドを含んでよい。本発明のポリヌクレオチド配列はまた、より大きなポリヌクレ オチドの一部を含んでもよく、それらはポリヌクレオチド結合を通して、フレー ム内で、異なるタンパク質をコードしている一つ以上のポリヌクレオチド配列と 融合してもよい。この事象においては、発現されたタンパク質は融合タンパク質 を含んでよい。もちろん、本発明のポリヌクレオチド配列は、病気の診断または 法医学的分析においての、自己抗体をコードしているｍＲＮＡの存在を検出する ためのＰＣＲ法に用いられてもよい。 タンパク質またはペプチド中のアミノ酸残基の配列は、本文中では、一般に採 用されている三文字の名称によるか、または一文字の名称によって命名した。こ れらの三文字および一文字の命名法の一覧表は、Lehninger,A.,Biochemistry第 ２版、Worth Publishers、ニューヨーク、ニューヨーク州(1975)のような教科書 に見い出されるであろう。アミノ酸配列を水平に列挙する場合には、アミノ末端 を左端に向け、カルボキシル末端を右端に向けるようにする。ペプチド中のアミ ノ酸残基はハイフンで隔ててもよい。かかるハイフンは、配列の呈示を容易にす るためだけのものである。 本発明の使用に適した作用物質には、ヒトＴＳＨＲおよびその模倣物、フラグ メント、それらの機能上の等価物および／または、ハイブリッドまたは突然変異 体、並びに上記のいずれかをコードしているｃＤＮＡを含んでいるベクターが含 まれる。作用物質は、単独かまたは他の適切な薬剤および／または治療過程との 組み合わせにおいて、および／または、同時に、投与することができる。 本発明の作用物質は、不適切な細胞の死によって特徴づけられる、自己免疫疾 患の治療に適している。自己免疫疾患は、自己の抗原に向けられた免疫応答によ って引き起こされる病気である。かかる疾患は、自己抗原を含んでいる組織にお いて、免疫適格細胞または免疫複合体によって引き起こされる、炎症性の障害と 共に、循環している自己抗体か、または自己抗原に対する細胞性免疫の存在によ って特徴づけられる。かかる疾患は、全身性エリテマトーデス、リウマチ様動脈 炎、およびグレーヴズ病を含む。 免疫学の一般原則を述べている標準的な関連研究には、Sell,S.Immunology,Im munopathology & Immunity、第５版、Appleton & Lange,Publ.スタンフォード、 コネクチカット州(1996);Male,D.等、Advanced Immunology、第３版、Times Mir ror Intl Publishers Ltd.,Publ.、ロンドン(1996);Stites,D.P.およびTerr,A.I .,Basic and ClinicalImmunology、第７版、Appleton & Lange,Publ.、ノーウォ ーク、コネクチカット州(1991);およびAbbas,A.K.等、Cellular and Molecular Immunology,W.B.Saunders Co,.Publ.、フィラデルフィア、ペンシルベニア州(19 91)が含まれる。 本文中に開示した、ヒトＴＳＨＲペプチド、模倣物、作用物質、およびその他 並びに、それらを、またはそれらに対応するアンチセンス配列をコードしている ヌクレオチド配列を含んでいるベクターと、かかるベクターを含んでいる宿主細 胞とは、自己免疫疾患を含む疾患の治療のための薬剤の製造に使用されてよい。 本発明は、ある種の局面において、限定のためではなく例として提供した以下 の実施例を参考に評価されてよい。 実施例 実施例１ 甲状腺刺激ホルモンレセプター自己抗体用ＴＳＨ結合阻害（ＴＢＩ）アッセイ におけるヒト甲状腺刺激ホルモンレセプター ＴＳＨレセプター（ＴＳＨＲ）に対する自己抗体はグレーヴズ病における甲状 腺免疫応答の証明である（１に概説）。殆どの場合、これらＴＳＨＲ自己抗体は 該レセプターを活性化し、甲状腺機能亢進症を発症させる。極く稀には、非刺激 性ＴＳＨＲ自己抗体がレセプターを占拠してＴＳＨ作用を妨げ、甲状腺機能低下 症を惹起こす（２〜４）。他の甲状腺自己抗原（甲状腺ペルオキシダーゼおよび サイログロブリン）に対する自己抗体とは対照的に、ＴＳＨＲ自己抗体に対する 直接的な臨床的アッセイ法は現時点で存在しない。代りに、これらの自己抗体は 放射性標識したＴＳＨ結合を阻害する能力（ＴＳＨ結合阻害：ＴＢＩ）またはＴ ＳＨＲ活性化のバイオアッセイ（ＴＳＨＲ刺激イムノグロブリンアッセイ：ＴＳ Ｉ）のいずれかにより検出する（５に概説）。最も広く用いられているアッセイ 法は甲状腺から洗浄剤により可溶化したブタＴＳＨＲを使用するＴＢＩである（ ６）。 ＴＳＨＲｃＤＮＡの分子クローニングは、組換えヒトＴＳＨＲを使用するＴＢ Ｉアッセイが間もなく始まるだろうとの期待を抱かせた。しかし、ヒトＴＳＨＲ ｃＤＮＡを安定にトランスフェクトした哺乳動物の細胞系が報告されている（７ 〜１２）にもかかわらず、また、大量のレセプタータンパクがバクテリア（１３ 〜１８）および昆虫細胞（１９〜２１）において、あるいは無細胞系翻訳物（２ ２）として産生されているにもかかわらず、ＴＢＩアッセイにおいては組換えヒ トＴＳＨＲがブタのＴＳＨＲの使用に取って代わってはいない。 哺乳動物細胞中で発現したＴＳＨＲは、未処理細胞（９，２３）、細胞粒子フ ラクション（１０、２４、２５）を用いるＴＢＩアッセイでの、および洗浄剤可 溶化膜（２５）におけるＴＢＩアッセイでの自己抗体によりよく認識される。し かし、培養細胞を用いるアッセイは一般使用法として実用的でない。更に、哺乳 動物細胞粒子フラクション（１０、２５）から回収した少量の組換えＴＳＨＲは 、この材料の使用を法外に高価なものとする。 それ故、組換えヒトＴＳＨＲ組成物を使用する改良実用型ＴＳＨ結合阻害アッ セイ法が必要である。方 法 細胞培養 ：３つの異なる安定にトランスフェクトにしたチャイニーズハムスター 卵巣（ＣＨＯ）細胞系を使用した。各細胞系はその細胞表面に異なる数のヒトＴ ＳＨＲを発現する（表１）。「４ｋｂ」ＴＳＨＲ細胞中のトランスゲノムは５’ および３'非翻訳末端の両方を有する完全長ｃＤＮＡを有している（７）。ＴＳ ＨＲｃＤＮＡのコード領域のみを発現するＴＳＨＲ−０細胞は、以前にはやっか いだったｐＴＳＨＲ−５'３'ＴＲ−ＮＥＯ−ＥＣＥ（２６）から再命名した。ゼ ロはこれら細胞中のＴＳＨＲｃＤＮＡトランスゲノムが増幅されていないことを 暗に示している。ＴＳＨＲ−１０，０００細胞中のトランスゲノムはこれらの細 胞を１０，０００ｎＭメトトレキセートに適合させることにより増幅した(２７) 。この研究のために、すべての細胞系（選択培地中限界希釈によりクローン化） は１０％ウシ胎児血清および標準抗生物質を添加したハム（Ｈａｍ）Ｆ−１２培 地中で生育した。細胞は本文記載のように、直径１０ｃｍの２４穴クラスターも しくは９６穴マイクロタイター培養ディッシュ中に集密培養した。 表１：ヒトＴＳＨレセプター発現細胞系の特性 血清：血清４２検体を使用した。すべての血清はリファレンス・ラボラトリーで あるコーニング・ニコルス研究所のジュアン・ターセロ（Juan Tercero）氏が好 意的に提供して下さったものであるが、該研究所はグレーヴズ病と判明したもの あるいはその疑いのあるものにつき血清が送られてくる研究所である。血清はコ ーニング・ニコルスが決めたとおりに平均化したスペクトルのＴＢＩ値（高値、 中間値、低値あるいは陰性）となるように選択した。血清は下記のように我々の 研究所で再アッセイした。未処理細胞を用いるＴＳＨ結合阻害（ＴＢＩ）アッセイ ：高度精製ウシＴＳＨ（ N.I.H.）または組換えヒトＴＳＨ（シグマ、セントルイス、ミズーリ）（５μｇ ）を、ボルトン−ハンター試薬（４４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；デュポン−ニューイ ングランド・ニュクレアー、ボストン、マサチューセッツ）により製造業者のプ ロトコールに従って比活性が〜８０μＣｉ／μｇタンパクとなるように¹²⁵Ｉで 放射性標識し、次いで、セファデックスＧ−１００クロマトグラフィーに付した （２８）。「４ｋｂ」ＴＳＨＲおよびＴＳＨＲ−０細胞をそれぞれ２４穴および ９６培養ディッシュに集密生育した。ＴＢＩ活性は、ボリエチレングリコール（ ＰＥＧ）沈殿ＩｇＧ（２３）を用いる既述（２３）の「２工程」アッセイ法によ り、以下のように改変して定量した。細胞をリン酸バッファー塩液（ＰＢＳ）中 、０．２５ｍｌ（２４穴プレート）もしくは０．１ｍｌ（９６穴プレート）のＩ ｇＧ調製物で、３７℃、１．５時間予め培養した。９６穴プレートを用いるアッ セイでは、必要により、洗浄および¹²⁵Ｉ−ＴＳＨ添加に先立って全血清 （５ ０ｍｌ）中で予め培養した。２工程アッセイで我々は全血清とＰＥＧ沈殿ＩｇＧ との間に差を見出さなかった。「結合バッファー」（ＮａＣｌの代りに２８０ｍ Ｍスクロースを含有し０．２５％ウシ血清アルブミンを添加したハンク（Ｈａｎ ｋ）バッファー）（２９）で２度洗浄した後、結合バッファー中の¹²⁵Ｉ−ＴＳ Ｈを本文記載の量（２４穴および９６穴プレート中それぞれ、ウエル当たり２５ ０ｍｌおよび５０ｍｌ）、細胞に添加した（３７℃２時間）。結合した¹²⁵Ｉ− ＴＳＨを以前に記載のように（２３）測定した。非トランスフェクトＣＨＯ細胞 に対する非特異結合を、特異結合値を得るために差し引いた。可溶化ＴＳＨレセプター調製物 ：レセプターを下記２つの手法によりＴＳＨＲ− １０，０００細胞から調製した。 （ｉ）培養ディッシュから取り除いた細胞：５０個の集密型１０ｃｍ直径ディ ッシュの細胞（１ディッシュ当たり１０⁷細胞）をＰＢＳで一度洗浄し、細胞を バッファーＡ（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５），フッ化フェニルメチルスルホニ ル０．１ｍｇ／ｍｌ、ロイペプチン１μｇ／ｍｌ、アプロチニン１μｇ／ｍｌ、 およびペプスタチン２μｇ／ｍｌ；シグマ）（３ｍｌ／ディッシュ）中に削ぎ落 とすことにより再懸濁した。ポリトロンで簡単に均一化した後（４℃、１０秒ｘ ３）、５００〜２０，０００ｘｇ粒子フラクションをリーズ・スミス（Rees Smi th）ら（６、３０）のプロトコールに従って処理した。最終抽出を５ｍｌの１０ ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％トリトンＸ−１００ で実施した。この材料を直接あるいは同一のバッファーに希釈した後に、本文記 載のごとくＴＳＨ結合に用いた。 （ii）単層中細胞の直接抽出：１個の集密型１０ｃｍ直径細胞ディッシュの培 地を移し、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ，５ｍＭ Ｎ−エチルマレインイ ミド、 １０％グリセリン、０．５％ＢＳＡおよび０．５％ゼラチンを添加した上記１％ トリトンＸ−１００バッファー３ｍｌで置換えた。４℃で２時間揺り動かした後 、該バッファーを回収し、遠沈し（１時間、１００，０００ｘｇ）、その上清を 上述のようにＴＢＩアッセイに用いた。バッファーへの添加物はアッセイでのＴ ＳＨを変化させないことが判明した。可溶化ＴＳＨＲによるＴＳＨ結合阻害（ＴＢＩ）アッセイ ：血清はＴＳＨＲ抗体 （ＴＲＡｂ）キット（クロナス、サンクレメンテ、カリフォルニアより購入）を 用い、アッセイした。このキットからの試薬（ＲＳＲ Ｌｔｄ．，カルディフ、 英国から）もまた、上記のようにして得た可溶化ヒトＴＳＨＲと組み合せて用い た。ＴＢＩ値は下式により計算した。 １−（ｃｐｍ血清サンプル−ＴＳＨＲ不存在下のｃｐｍ）ｘ１００ （ｃｐｍ陰性参照血清−ＴＳＨＲ不存在下のｃｐｍ）甲状腺刺激イムノグロブリン（ＴＳＩ）アッセイ ：９６穴培養プレートに集密的 に生育したＴＳＨＲ−０細胞をヒト甲状腺細胞に対し、以前に記載のとおりにア ッセイした（３１，３２）。この手法では低張培地改変品を採用している（３３ ）。この研究のために、下記の追加の改変を行った：−ＩｇＧをＰＥＧで沈殿さ せ（上記参照）、１０ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ３− イソブチル １−メチルキサンチンおよび０．３％ＢＳＡを添加した該低張培地 に再懸濁した。この培地（０．１ｍｌ）中で細胞を３７℃、２時間培養した。培 地中のサイクリックＡＭＰを５０ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ６．２）に希釈し、アセチ ル化し（３２）、ｃＡＭＰ，２’−Ｏ−サクシニル¹²⁵Ｉ−ヨードチロシン・メ チルエステル（デュポン、ボストン、マサチューセッツ）およびウサギ抗−ｃＡ ＭＰ抗体（カルビオケム、サンディエゴ、カリフォルニア）を用いるラジオイム ノアッセイにより測定した。ＴＳＩ活性は、正常人からの血清と同時インキュベ ーションした後に測定したｃＡＭＰに対するテスト血清のサイクリックＡＭＰ値 の百分比で表した。結 果 実施したＴＢＩアッセイは未処理ＣＨＯ細胞または可溶化ＴＳＨＲを包含する ２つの主要タイプのものであった（表２）。 表２：実施したＴＳＨ結合阻害（ＴＢＩ）アッセイのタイプ 単層中細胞によるＴＳＨ結合阻害（ＴＢＩ）アッセイ：以前、我々は完全長４ｋ ｂヒトＴＳＨＲｃＤＮＡを安定にトランスフェクトした未処理ＣＨＯ細胞を用い てのＴＢＩアッセイに関するデータを報告した（２３）。このアッセイ（７）に 用いた細胞は単位細胞当たり約１６，０００個のレセプターを発現したが（２６ ）、この細胞は例えよくはないとしても、市販の可溶化ブタＴＳＨＲアッセイ（ ６）に対する感受性が等しかった。しかし、大量のＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細 胞が利用可能であることは（２６，２７）、これらの細胞が更により効果的なＴ ＢＩアッセイを提供するか否かを試す我々の動機付けとなった。これに対して、 予備的な実験で我々は、ブタＴＳＨＲ ＴＢＩアッセイがヒトＴＳＨＲを過剰発 現する未処理ＣＨＯ細胞を用いるアッセイよりも遥かに勝っていることを予期せ ず見出した。例えば、３種の有力な血清のＴＢＩ値（¹²⁵Ｉ−ＴＳＨ結合の％阻 害） は、市販品での７９％、９１％および８３％であるのに対し、ＣＨＯ細胞ではそ れぞれ１０％、１３％および５７％であった。 細胞当たりの大量のＴＳＨＲのＴＢＩ感受性に対する有害な影響は、より小さ いウエル中で、より多くのレセプターをもつよりすくない細胞を培養することに より一部克服することができた。このように、マイクロタイター（０．３６ｃｍ² ）ウエル中で培養したＴＳＨＲ−０細胞（細胞当たり１５０，０００ＴＳＨＲ ）（２６）は、２４穴クラスタープレート（１．７７ｃｍ²ウエル）中で培養し た「４ｋｂ」ＴＳＨＲ細胞系（細胞当たり１６，０００ＴＳＨＲ）（７，２７） よりも、ウエル当たりわずか〜２倍多いレセプターを提供する。マイクロタイタ ープレートの２つの主な利点はより少ない血清とバックグランド結合の小さいよ り少量の¹²⁵Ｉ−ＴＳＨとを使用することであった。この手段により、ＴＳＨＲ 飽和を漸進的に増加させると共にトレーサー濃度を１００倍に増加させ得た(図 １Ａ)。それにもかかわらず、ＴＳＨＲ−０細胞でのＴＢＩ値は、前者細胞での ウエル当たりの大量のＴＳＨＲを反映して、４ｋｂＴＳＨＲ細胞系での値より低 かった(図１Ｂ)。 結局、未処理ヒトＴＳＨＲ発現ＣＨＯ細胞に関する研究において、我々はマイ クロタイターウエルにＴＳＨＲ−０細胞を張り付けて用いるＴＢＩアッセイによ り、¹²⁵Ｉ−ウシＴＳＨ（ｂ）の使用を¹²⁵Ｉ−ヒトＴＳＨ（ｈ）と比較した。広 範なＴＢＩ値を示す患者１２名の血清について得られたデータは、用いた放射性 標識ＴＳＨの種類に関係なく一般に類似していた(図２)。それにもかかわらず、 興味があり、潜在的に重要なことは、二三の血清（例えば、＃１，３および６） がウシＴＳＨとよりも、ヒトＴＳＨと結合する放射リガンドをより強く阻害する ことであった。しかし、強調せねばならないことは、ＴＢＩアッセイにおけるｈ ＴＳＨの使用は、この種のＴＳＨがｂＴＳＨよりも効果の低いリガンドである故 に現在制限がある（３４）。事実、示された実験において、最大の¹²⁵Ｉ−ＴＳ Ｈ結合はｂＴＳＨでよりもｈＴＳＨで５倍低かった（４．９％対２４．８％）。洗浄剤抽出組換えヒトＴＳＨＲによるＴＳＨ結合阻害アッセイ ：上述のごとく、 その表面に大量のレセプターを発現する未処理ＣＨＯ細胞はＴＢＩアッセイに使 用することはできない。しかし、我々はそのような細胞が可溶レセプターアッセ イにおける組換えＴＳＨＲの良好な源泉たり得るか否かを決めたいと思った。こ の目的のために、我々はその表面に大量のＴＳＨＲ（〜１．９ｘ１０⁶）を発現 する細胞（ＴＳＨＲ−１０，０００)を使用した（２７）。細胞を削ぎ落としに より懸濁し、１％トリトンＸ−１００を含むバッファーに均一化し、標準として 一・般に使用されている市販キット中の可溶化ブタＴＳＨＲと比較した。７ｘ１ ０⁶細胞から抽出した組換えレセプターは、ブタＴＳＨＲ標準品のものに比較し 得る¹²⁵Ｉ−ｂＴＳＨ結合を得るために必要であった（図３）。驚くべきことに 、また予期せずに、この低い収率とは逆に、同一細胞の単層を、培養ディッシュ から細胞を引き剥がさずに洗浄剤含有バッファーで培養した場合、ＴＳＨ結合可 能な遙に大量のＴＳＨＲが回収された。この場合、７０倍少ない（〜１０⁵）細 胞からのＴＳＨＲはブタＴＳＨＲ標準品に類似の結合を生じた。事実、単一の１ ０ｃｍ直径ディッシュの細胞は、キット中のブタＴＳＨＲと置換えたとき、１０ ０〜２００回の繰返し定量に充分なＴＳＨＲを提供した。 可溶化したヒトおよびブタＴＳＨＲの効率を、グレーヴズ病と判明した、ある いは疑いのある３０名からの血清を用いＴＢＩアッセイにより比較した。これら 血清の内の１０検体は、該キットのブタＴＳＨＲを用いた場合、ＴＳＨＲ自己抗 体は検出されなかった（ＴＢＩ＜１５％）。残り２０検体の血清は広範なＴＳＨ Ｒ自己抗体活性を含んでいた（図４）。ヒトＴＳＨＲを該キット中で置換えたと きに得られるＴＢＩ値は、ブタＴＳＨＲで定量した値と非常によく相関した（ｒ =０．９５４；ｐ＜０．００１）。しかし、ブタＴＳＨＲ抗原で陰性であった血 清２検体は、今やヒトＴＳＨＲで陽性であった（図４）。放射性標識ヒトＴＳＨ は¹²⁵Ｉ−ｂＴＳＨとは違って、トレーサーのポリエチレングリコール沈殿が個 々人の血清により強く、また多様に影響を受けるので、可溶ＴＳＨＲアッセイで は使用することができなかった。 可溶化ブタＴＳＨＲで得たＴＢＩ値はヒトＴＳＨＲの活性化に関するバイオア ッセイ（ＴＳＩ）において定量された甲状腺刺激活性と僅かながら相関すること が知られている（１１、２３、３５）。それ故、我々は可溶化ヒトＴＳＨＲで得 たＴＢＩ値が同一の血清でＩｇＧの生物活性とよく相関するか否かを決めようと した。充分量の血清が図４に示した３０サンプルの内の２８検体から得られ、ヒ トＴＳＨＲを安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用い、ＴＳＩ活性の定量 を可能とした。ＴＢＩ活性およびＴＳＩ活性間の相関は、ウシよりもむしろヒト のＴＳＨＲをＴＢＩアッセイに用いたときに良好でなかった（それぞれ、ｒ＝０ ．７３２および０．７０９）（図５ＡおよびＢ）。検 討 本発明の一つの側面はＴＳＨＲ自己抗体検出のための改良アッセイ法を目指す ことである。驚くべきことに、また予期せずに、その表面により多くのＴＳＨＲ を発現する哺乳動物細胞は、ＴＢＩアッセイを単層培地にて未処理細胞で実施し たとき、このアッセイはあまり感度がよくないことが判明した。意図して特別の 理論に結びつけた訳ではないが、この現象に対する有望な理論の一つは、血清中 のＴＳＨＲ自己抗体絶対濃度が非常に低いということである。以前から疑問であ ったが、つい最近では、ＴＳＨＲ自己抗体は一般に同一血清において甲状腺パー オキシダーゼ（ＴＰＯ）自己抗体よりもより低い濃度で存在することが、フロー サイトメトリー分析により示された（３６）。ＴＢＩアッセイのような占拠アッ セイの効率は抗原に対して過剰の抗体に依存する。このように、大量の抗原（Ｔ ＳＨＲ）と低濃度抗体の組合わせが、抗原の低占拠に繋がる。言い換えると、抗 体により占拠されていない多くのＴＳＨＲが¹²⁵Ｉ−ＴＳＨ結合のために利用可 能となるために、この現象がＴＢＩアッセイの感度を低くする。それ故、本発明 による最適ＴＢＩアッセイでは、リース−スミスが開発した手法（６、３０）に おいてアフィニティ精製したウシ¹²⁵Ｉ−ＴＳＨでの場合のように、少量のレセ プターと非常に効果のあるリガンドを利用すべきである。 細胞単層を用いるＴＢＩアッセイには、可溶化ＴＳＨＲを利用するアッセイに 関連して重大な実用上の不利益がある。しかし、可溶化ブタＴＳＨＲ調製物は明 らかに効果的であるが、ヒトＴＳＨＲはＴＳＨＲ自己抗体の研究にとって最も適 していることを示唆していた（３０）。しかし、その分子クローニングから７年 後の今日まで（７、３７、３８）、実用上のＴＢＩアッセイにおいて、組換えヒ トＴＳＨＲがブタの材料使用と取り代わっていないということは驚くべきことで ある。本発明の最も重要な寄与は、可溶性組換えヒトＴＳＨＲが哺乳動物細胞か ら大量に、且つ、有効なＴＢＩアッセイにとって適切な形熊で容易に得ることが できるということを初めて証明したことである。安定にトランスフェクトしたＣ ＨＯ細胞系を生成せしめて間もなく（７）、我々は培養ディッシュから削ぎ落し た細胞に結合するＴＳＨが、単層培養で細胞に結合するのと比較して大幅に減少 することを見出した。それ以来、我々はＴＢＩアッセイで未処理細胞を使用し始 めた（２３）。同様に、コスタグリオラ（Costagliola）らのデータを調べると 、削ぎ落としたＪＰＯ９細胞からの可溶化ＴＳＨＲの収量が期待したよりも相当 に低いことが明らかになる（２５）。安定にトランスフェクトしたマウス・ミエ ローマ細胞を醗酵槽中で高濃度に生育させ（１０）、そこから可溶化ＴＳＨＲを 産出したことについては報告がない。本発明は再懸濁した細胞からの有効なＴＳ ＨＲの回収率が低いことを証明し、細胞単層からＴＳＨＲを直接抽出することで 、この非常に難しいレセプターの明らかな壊れ易さを克服することができること を示す。しかし、本発明によると、非常に高いレベルでＴＳＨＲを発現するＴＳ ＨＲ−１０，０００などの細胞系のみが、更なる精製または濃縮なしにＴＢＩア ッセイに直接使用するのに適したＴＳＨＲを提供することができるし、その原則 に基づくのがむしろ好ましい。 ＴＳＨＲの種が刺激的自己抗体に対するバイオアッセイにおいて重要であると いう証拠がある（１１、３５、３９）。ブタよりもむしろヒトのＴＳＨＲを使用 するのがＴＢＩアッセイにおいて有利であるのか否かはこれまでに確立されてい ない。このファクターは可溶化ブタＴＳＨＲを使用してＴＢＩアッセイ法を最初 に開発した際に考慮したことである（３０）。しかし、両種のＴＳＨＲを使用し たときの血清１８検体のＴＢＩ値が大きく違わなかったために、また、ヒト甲状 腺組織よりもブタの組織がより入手し易かったために、ブタのＴＳＨＲがＴＢＩ アッセイにおける標準となった。注目する価値のあるのは、この研究での殆どの 血清が比較的高いＴＢＩ値をもち、該アッセイの非常に重要な低値終末点で差異 をはっきりさせるのが難しいことである。 本発明による可溶化組換えヒトＴＳＨＲの利用可能性がこの問題の再評価を可 能にした。非組換え材料による以前のデータ（３０）と矛盾なく、血清３０検体 のＴＢＩ値は一般に可溶化ブタおよびヒトＴＳＨＲと同等であった。しかし、我 々のデータではブタＴＳＨＲアッセイで陰性であった血清２〜３検体で、ヒトＴ ＳＨＲを使用すると陽性となる。 結局、問題は、ＴＳＨＲの種に加えて、ＴＢＩアッセイに用いたリガンド（Ｔ ＳＨ）の種が重要なのか否かということになる。ヒトＴＳＨＲはウシＴＳＨに比 べてその比活性が低い故に、ヒトＴＳＨＲと互いに影響し合うとしても、それを ＴＢＩアッセイに使用するのが非常に難しい。それにもかかわらず、未処理細胞 を用いるＴＢＩアッセイにおいて、ヒトＴＳＨおよびウシＴＳＨリガンドはすべ ての血清で同一の結果を生じなかった。絶対結合が低いことと相俟って、可溶化 ＴＳＨＲ ＴＢＩアッセイにヒトＴＳＨを使用しなかった多様な背景となる理由 は明確でない。実施例１で引用された参考文献 実施例２ 甲状腺刺激ホルモン・ドメインは２つの開裂部位を有する 本実施例では、これまでＴＳＨＲには１個所の開裂部位があるという概念に反 して、実際には２つのそのような部位があるというＧタンパク結合レ七プターに ついての驚くべき新しい発見を提供する。インシュリンのようなＴＳＨＲは分子 内で２つのサブユニットに開裂され、Ｃペプチドを遊離する。前置き 甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）については２つのサブユニットが 長年認知されている。かくして、放射性標識ＴＳＨを甲状腺細胞膜に共有結合で 架橋結合させると、リガンド結合糖蛋白Ａサブユニットがジスルフィド結合を介 して膜にかかるＢサブユニットに結合していることが判明する（１）。ＴＳＨＲ は単一のｍＲＮＡ種（２〜５）によりコード化されているので、ＡおよびＢサブ ユニットは分子内開裂により形成されなければならない。該レセプターの２つの サブユニット型に加えて、未開裂の単一鎖ＴＳＨＲもまた培養した甲状腺細胞表 面に存在し（６）、哺乳動物細胞にトランスフェクトされる（７）。 ＴＳＨＲ開裂の機能的重要性は現在謎である。ＴＳＨＲを発現する細胞を軽ト リプシン処理すると、レセプター活性化に付随してアミノ酸残基３５４〜３５９ でのエピトープを失うことになる（８）。一方、ＴＳＨは２つのサブユニットに 開裂しないキメラＴＳＨ−ＬＨ／ＣＧレセプターを活性化することができる（９ ）。ＴＳＨＲのエクトドメインにおける開裂部位を同定することはＴＳＨＲサブ ユニットの構造−機能相関を解明するのに重要である。ＴＳＨがＴＳＨＲ変異体 およびキメラＴＳＨ−ＬＨ／ＣＧレセプターに架橋結合することの研究から推論 する（１０）と、開裂部位はアミノ酸４１８残基エクトドメインの残基３１７（ 番号は推定上の２１残基シグナルペプチドを含む）の上流近傍であることを示唆 していた。ＴＳＨＲに対するウサギ抗血清を用いて得た他のデータは、開裂部位 が更に下流の残基３６６近傍にあるのが好ましいとする（１１）。アミノ酸残基 ３１７の上流近傍３つの顕著なアルギニン−およびリジン−富裕クラスターを変 異誘発してもＴＳＨＲが２つのサブユニットに開裂するのを防止せず、古典的な ズブチリシン関連プロタンパク変換酵素の役割が存在しないことを示唆している （１２）。極く最近、マトリックスメタロプロテイナーゼがＴＳＨＲの開裂に関 係づけられた（１３）。 本研究において、我々は組換えＴＳＨＲを発現する２つの新しい哺乳動物細胞 系を用い、エクトドメインの開裂部位を更に解明した。第一の系（ＴＳＨＲ−１ ０，０００）（１４）はＴＳＨＲを過剰発現し、それによって常用のＴＳＨＲ発 現哺乳動物細胞系を用いる直接免疫検出法（事前のアフィニティ精製せず）で経 験した低いシグナル・ノイズ比の不利益を克服する。第二の系、ＴＳＨＲｍｙｃ （１５）は開裂部位領域にｃ−ｍｙｃエピトープ標識を有する。これらの細胞系 で得たデータはＧタンパク結合レセプターについて驚異的な新しい知見を提供す る。すなわち、ヒトＴＳＨＲエクトドメインには１つではなく２つの開裂部位が 存在すると思われる。この知見の必然的結果は、インシュリンのようなＴＳＨＲ は分子内開裂に際してＣペプチドを放出するということである。方 法 ＴＳＨＲ発現細胞 ：（ｉ）ＴＳＨＲ−１０，０００（１４）はヒトＴＳＨＲを過 剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である（細胞当たり〜 ２ｘ１０⁶レセプター）。過剰発現は安定的にトランスフェクトしたＴＳＨＲｃ ＤＮＡトランスゲノムを増幅するためにジヒドロ葉酸レダクターゼ・ミニ遺伝子 を 用い達成した。（ii）ＴＳＨＲ−０は同じＴＳＨＲ ｃＤＮＡを発現するＣＨＯ 細胞であるが、トランスゲノムの増幅はない（細胞あたり〜１．５ｘ１０⁶レセ プター）（１４，１６）。（iii）ＴＳＨＲｍｙｃはエピトープ標識ヒトＴＳＨ Ｒに対する非増幅遺伝子を安定的に発現する２９３ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）細 胞である（１５）。エピトープ標識はＴＳＨＲのアミノ酸３３８〜３４９をヒト ｃ−ｍｙｃペプチドEEQKLISEEDLLと置換えることにより達成した。細胞はハムの Ｆ−１２培地（ＣＨＯ細胞）またはダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ） （２９３ＨＥＫ細胞）中で増殖させたが、培地には１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）および アンフォテリシン（２．５μｇ／ｍｌ）を添加した。前駆体標識ＴＳＨＲの免疫沈降 ：１００ｍｍ直径の培養ディッシュに略集密した 細胞をリン酸バッファー塩溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、５％熱不活化ＦＣＳ含有の ＤＭＥ−Ｈ２１メチオニン−およびシステイン−不含培地中で前培養した（０． ５時間、２度）。次いで、細胞を〜０．５ｍＣｉの³⁵Ｓ−メチオニン／システイ ン（＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ，デュポンＮＥＮ，ウイルミントンＤＥ）添加 ５ｍｌ新鮮培地中でパルス標識した（３７℃、１時間）。培地を吸引除去し、細 胞をＰＢＳで一度洗浄した後、１０％ＦＣＳ含有標準非選択的培地中所定時間チ ェイス（放射活性追跡）を実施した。細胞をＰＢＳで二度洗浄し、１ｍｌの氷冷 ２０ｍＭヘペス[ｐＨ７．２；プロテアーゼ阻害剤フッ化フェニルメチルスルホ ニル（ＰＭＳＦ）（１００μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）、アプ ロチニン（１μｇ／ｍｌ）およびペプスタチンＡ（２μｇ／ｍｌ）（すべてシグ マ、セントルイス、ミズーリより入手］含有１５０ｍＭ ＮａＣｌ(バッファーA) ）中に削ぎ落とした。細胞をペレット化し（５分、１００ｘｇ）、ＰＢＳで二度 洗浄し、１％トリトンＸ−１００含有バッファーＡに再懸濁した。時折振盪しな がら４℃で９０分放置した後、混合物を１００，０００ｘｇで４５分間遠沈し、 その上清を免疫沈降バッファー（２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．２，３００ｍＭＮａ Ｃｌ，０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．５％ノニデット−Ｐ４０，２ｍＭ ＥＤＴＡ）で１：４に希釈した。可溶化細胞タンパクを、２５μｌの充填・洗浄 したプロテインＡ−アガロース（シグマ）に予め結合した〜１５０μｇの正 常マウス血清ＩｇＧで、４℃、１時間、予備浄化した。プロテインＡをマイクロ 遠心機中で遠心（１０，０００ｘｇで３分）により取り除いた。本文記載のとお り、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を次いで加えた。Ａ１０およびＡ１１ （ポール・バンガ（Paul Banga）博士からの恵与、ロンドン、英国）は双方とも ＴＳＨＲアミノ酸残基２２〜３５を認識し（１７）、最終希釈１：１０００にし て用いた。抗−ｍｙｃｍＡｂ９Ｅ１０（ＡＴＣＣから入手）を最終希釈１：５０ ０で用いた。ＴＳＨＲ Ｂサブユニット（Ｅ．ミルグローム（Milgrom）およびＨ ．ルースフェルト（Loosfelt）両博士からの恵与、ル・クレムリン−バイセトル 、フランス）に対するｍＡｂであり、ヒト甲状腺ペルオキシダーセ（スコット・ ハッチソン（Scott Hutchison）からの恵与、ニコルス研究所、サンジュアンカ ピストラノ、カリフォルニア、米国）に対するｍＡｂであるＴ３−３６５を１： １０００の希釈度で用いた。４℃、３時間後、２５μｌの充填・洗浄したプロテ インＡ−アガロースを加え、そのチューブを４℃で１時間転倒振盪した。プロテ インＡを１０，０００ｘｇ(４℃)で遠心回収し、１ｍｌの免疫沈降バッファーで ５回洗浄し、次いで、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４），２ｍＭ ＥＤＴＡおよび ０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で１回洗浄した。最後に、ペレット を０．７Ｍβ−メルカプトエタノール含有レムリ（Laemmli）サンプルバッファ ー（１８）に再懸濁し（５０℃、３０分）、７．５％または１０％ＳＤＳ−ポリ アクリルアミドゲル（バイオラッド、ハーキュルス、カリフォルニア）上電気泳 動した。予め着色した分子量マーカー（バイオラッド）を並行レーンに包含させ た。本文に掲げた分子量を得るために、これらのマーカーはより正確な未着色マ ーカーに対して予め校正した。放射性標識タンパクはコダックＸＡＲ−５Ｘ線フ ィルム（イーストマンコダック、ロチェスター、ニューヨーク）上オートラジオ グラフィーにより可視化した。ＴＳＨＲタンパクのイムノブロット ：安定的にトランスフェクトしたＴＳＨＲ− １０，０００細胞（２個の１００ｍｍ直径ディッシュ中）を０．５ｍＭ ＥＤＴ Ａと共にＣａ⁺⁺−およびＭｇ⁺⁺−不含ＰＢＳ中インキュベーションすることによ り再懸濁した。細胞をペレット化し（５分間、１００ｘｇ、４℃）、上記のプロ テアーゼ阻害剤含有１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）１．５ｍｌ中に再懸濁 し、 ポリトロンホモジナイザー（ブリンタマン研究所、ウエストバリー、コネチカッ ト）で均一化した。５００ｘｇ(４℃)で１０分間遠心した後、上清を１０，００ ０ｘｇ（４℃）で２０分間再遠心した。ペレットを同一バッファー０．１ｍｌに 再懸濁し、その後、０．７Ｍβ−メルカプトエタノール含有レムリバッファーを 添加し（５０℃、３０分間）、サンプルを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル上電気泳動した。予め着色した分子量マーカーについては上記のとおりである 。タンパクをプロブロット（Pro Blott）膜（アプライドバイオシステムズ、フ ォスターシティ、カリフォルニア）に移し、すでに記載のとおりに処理した（１ ９）。膜をＡサブユニットに対するｍＡｂ Ａ１０またはＡ１１と共に、または Ｂサブユニットに対するｍＡｂＴ３−４９５（ＴＳＨ−Ｒ１；トランスバイオ、 ブーローニュ、フランス）またはＴ３−３６５（最終希釈、１：１０００）と共 に一夜（４℃）培養した。洗浄後、膜をアルカリホスファターゼ結合ヒツジ抗− マウスイムノグロブリンＧ（１：４００希釈）（カッペル、ダーラム、ノースカ ロライナ）と共に室温で１時間培養した。シグナルを、１００ｍＭ ＮａＣｌお よび５ｍＭ ＭｇＣｌ₂含有１００ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．５） 中、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ、４−クロロ、３−インドリ ルリン酸で発色した。ＴＳＨＲタンパクの酵素による脱グリコシル化 ：蛋白Ａ／ＩｇＧ／ＴＳＨＲ複合 体または１０，０００ｘｇ粗製膜フラクション（上記）を０．５％ＳＤＳ，１％ β−メルカプトエタノール含有変性バッファー中培養した(１００℃、１０分間) 。酵素による脱グリコシル化を製造業者（Ｎ．Ｅ．バイオラボ、ビバリー、マサ チュウセッツ）のプロトコールに従って実施した。Ｎ−グリコシダーゼＦ消化（ １００Ｕ，３７℃、２時間）を５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）１％Ｎ Ｐ−４０中で実施した。エンドグリコシダーゼＨ消化（５０Ｕ，３７℃、２時間 ）を５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中で実施した。サンプルを次い で上記どおりにＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。放射性標識ＴＳＨの共有結合架橋形成 ：高度精製ウシＴＳＨ（５μｇ、３０Ｕ／ ｍｇタンパク）を製造業者のプロトコールに従ってボルトン−ハンター試薬（４ ４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；デュポン−ＮＥＮ）により¹²⁵Ｉで比活性〜８０μＣｉ ／ μｇタンパクとなるよう放射性標識し、次いで、セファデックスＧ−１００クロ マトグラフィーに付した（２０）。集密１００ｍｍ直径ディッシュのＴＳＨＲ発 現細胞を、２８０ｍＭスクロースおよび０．２５％ＢＳＡ添加改変ハンクバッフ ァー（ＮａＣｌ不含）（結合バッファー）５ｍｌ中５μＣｉ¹²⁵Ｉ−ＴＳＨで３ ７℃、２時間培養した。氷冷した結合バッファーで３回細胞を洗浄し、結合しな かった¹²⁵Ｉ−ＴＳＨを除去した。次いで、上記プロテアーゼ阻害剤を含む１０ ｍＭリン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．４）に溶かしたジスクシンイミジル・スベ リン酸（ＤＳＳ；１ｍＭ；シグマ）を室温２０分間で加えた。架橋形成反応を２ ０ｍＭ酢酸アンモニウム（最終濃度）の添加により停止させた。 架橋形成後、細胞をＰＢＳで２度洗浄し、同じプロテアーゼ阻害剤を含む１０ ｍＭトリス（ｐＨ７．５）中に削ぎ落とした。細胞をポリトロンホモジナイザー により均一化し、４℃で５分間遠心した（５００ｘｇ）。上清を遠心し（１０， ０００ｘｇ、４℃、１５分間）、ペレットを１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）５０ μｌに再懸濁した。０．７Ｍβ−メルカプトエタノール含有レムリバッファーを 添加した後（４２℃、３０分間）、サンプルを上記同様１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ およびオートラジオグラフィーに付した。結 果 ＴＳＨＲ−１０，０００細胞中ＴＳＨＲの免疫検出 ：前駆体標識ＴＳＨＲ−１０ ，０００細胞の免疫沈降研究を、Ａサブユニットのアミノ末端にあるＴＳＨＲア ミノ酸残基２２〜３５に対するｍＡｂ Ａ１０（１７）で実施した。ＴＳＨＲの 多様な形態を、３時間および１６時間のチェイス（追跡）期間の後、還元条件下 で観察した（図６１Ａ）。単一サブユニット（未開裂）ＴＳＨＲの２つの形熊は ：（ｉ）〜１１５ｋＤａの大きさのもの（エンドグリコシダーゼＨ抵抗性複合体 炭水化物）および（ii）〜１００ｋＤａの大きさのもの（エンドグリコシダーゼ Ｈ感受性未成熟高マンノース炭水化物）であった（図６）。Ｎ−グリコシダーゼ Ｆによる消化が両形態の炭水化物を除去し、〜８４ｋＤａのポリペプチド・バッ クボーンを露出した。開裂したＴＳＨＲ（２サブユニット）も存在した。細胞外 Ａサブユニットが複合体炭水化物を有する幅の広い〜６２ｋＤａのバンドとして 見 ることができた。このバンドは脱グリコシル化によりより集約した３５ｋＤａの バンドになった。大部分膜透過したＢサブユニットは、恐らくそれが抗体結合Ａ サブユニットから脱離し、引き続く非常に厳しい洗浄処理の間に喪失するために 、これらの免疫沈降実験では可視化できなかった（図６Ａ）。ＴＳＨＲに対する ｍＡｂの特異性は未トランスフェクトＣＨＯ細胞を用い、甲状腺ペルオキシダー ゼ（ＴＰＯ）に対するｍＡｂによるコントロール実験において明らかであった（ 図６Ｂ）。 免疫沈降実験と対照的に、ＢサブユニットはＢサブユニット特異ｍＡｂＴ３− ４９５およびＴ３−３６５を用いるＴＳＨＲ−１０，０００細胞の免疫ブロット において明瞭に目視化された（２１）（図７Ａ，７Ｂ）。このように、ＴＳＨＲ の単一サブユニット型に加えて、〜４２ｋＤａの一次Ｂサブユニットバンドがい くつかのやや大き目のマイナーバンドと同じように明らかであった。エンドグリ コシダーゼＦおよびＨとインキュベーションしてもＢサブユニットバンドの移動 には影響がなく、これはそれらがＮ−結合グリコシル化部位を欠如していること と矛盾がなかった（図７Ａ）。ｍＡｂ Ｔ３−４９５およびＴ３−３６５の特異 性は未トランスフェクトＣＨＯ細胞での免疫ブロッティングにより確認した（図 ７Ｂ）。免疫沈降実験でのように、ＡサブユニットのサイズはＴＳＨＲアミノ末 端に対するｍＡｂ Ａ１０での免疫ブロッティングにより明確に決定することが できた。〜６２ｋＤａの成熟Ａサブユニットは複合体炭水化物（エンドグリコシ ダーゼＨ抵抗）を含んでいた（図７Ｃ）。最も重要なＮ−グリコシダーゼＦでの 脱グリコシル化では〜３５ｋＤａのサブユニットバックボーンを確認した。〜３ ９ｋＤａおよび〜４２ｋＤａのより少ないフラグメントもまた明瞭であった。再 び、Ａサブユニットに対するｍＡｂ Ａ１０の特異性は未トランスフェクトＣＨ Ｏ細胞での免疫ブロットおよびＴＰＯに対するｍＡｂでのＴＳＨＲ−１０，００ ０細胞の免疫ブロッティングにより確認した（図７Ｄ）。ＴＳＨＲの欠失断片の謎 ：２１アミノ酸残基のシグナルペプチドをもたないヒト ＴＳＨＲは予測した８４．５ｋＤａのポリペプチドバックボーン（７４３アミノ 酸残基）を有する。しかし、上に示した免疫沈降および免疫ブロットの研究から の、酵素的に脱グリコシル化したＡサブユニット（３５ｋＤａ）および一次Ｂ サブユニットフラグメント（〜４２ｋＤａ）の総計は高々〜７７ｋＤａであった 。ＴＳＨＲ Ａサブユニットでの３５ｋＤａポリペプチドバックポーンは、シグ ナルペプチドを欠如していることを考慮すると、その開裂部位をアミノ酸残基３ ３０の領域に置いている。更に、非グリコシル化Ｂサブユニットの〜４２ｋＤａ のサイズは残基３８０近辺にホロレセプター開裂部位を有することと矛盾がない 。従って、残基３３０〜３８０近傍の「Ｃペプチド」フラグメントは開裂したＴ ＳＨＲエクトドメインからなくなったものと思われた（図８）。この推定はＴＳ ＨＲエクトドメインの単一開裂部位について広く流布した概念と矛盾するもので ある。ＴＳＨＲｍｙｃ細胞のＴＳＨＲサブユニット ：ＴＳＨＲの２つの開裂部位の可能 性を探究するために、我々は残基３３８〜３４９の位置に１２アミノ酸のヒトｃ −ｍｙｃエピトープをもつレセプターを発現するＴＳＨＲｍｙｃ細胞を用いた。 このエピトープはもし開裂部位が２つあるとする仮説が正しければ失われてしま うと予測されるＴＳＨＲのセグメント、すなわち、残基〜３３０〜３８０内に存 在する（図８）。開裂したＡサブユニットではなく、ＴＳＨＲの単なる単一サブ ユニット型についての、ｃ−ｍｙｃに対するｍＡｂによる検出は、エクトドメイ ンの一部が分子内開裂に際して失われてしまうという概念を支持する。ｃ−ｍｙ ｃをエピトープ内で開裂すると、このエピトープが失われてしまう。開裂部位が ２つあるとする仮説はまた、Ａサブユニットのアミノ末端に対するｍＡｂ Ａ１ ０により、あるいは放射性標識ＴＳＨによる架橋形成によりより限定的に、ＴＳ ＨＲｍｙｃ細胞中にＡサブユニットが検出されることを予言するだろう。 ＴＳＨＲｍｙｃ細胞は増幅したトランスゲノムを含まず、ＴＳＨＲ−１０，０ ００細胞よりもレセプターの発現が少ない（細胞当たり〜１００，０００）（１ ５）。それにもかかわらず、抗−ｍｙｃ ｍＡｂ ９Ｅ１０およびｍＡｂ Ａ１０ 両方がこれら細胞におけるＴＳＨＲの単一鎖型を検出する際に同等の効果を示し た（図９Ａ）。これと対照に、ＴＳＨＲｍｙｃ細胞の拡散したグリコシル化ＴＳ ＨＲＡサブユニットはＴＡＨＲ−１０，０００細胞のものよりも検出するのがよ り困難であった。しかし、Ｎ−グリコシダーゼＦで脱グリコシル化した後のＴＳ ＨＲｍｙｃ細胞３５ｋＤａＡサブユニットはより集中して、ＴＳＨＲアミノ末端 に対するｍＡｂ Ａ１００での免疫沈降により明瞭に目視し得た。これと対照に 、 Ａサブユニットは同一材料中に抗−ｍｙｃｍＡｂ ９Ｅ１０により検出されなか った。この知見は重要なので、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞中の脱グリコシル化 Ａサブユニットが関連する同様の実験を示す（図９Ｂ）。 ＴＳＨＲｍｙｃ細胞およびＴＳＨＲ−１０，０００細胞中にｍＡｂＡ１０によ り検出される３５ｋＤａの脱グリコシル化Ａサブユニットのバンドは人為産物で はなかったが、その理由はそのようなバンドが前駆体標識未トランスフェクトＨ ＥＫ細胞のｍＡｂＡ１０による免疫沈降により検出されなかったこと、あるいは （ＴＰＯに対する）非関連ｍＡｂがこのバンドをＴＳＨＲｍｙｃ細胞中に検出し なかったからである（図９Ｃ）。 最後に、我々はＴＳＨＲｍｙｃ細胞中にＴＳＨＲＡサブユニットが存在するこ とを確認するために、（我々の手中にある）最も感度の高い方法、すなわち、単 層培養中の未処理細胞の表面に放射性標識ＴＳＨの共有架橋を形成する方法を適 用した。この手段により、ＡサブユニットがＴＳＨＲｍｙｃ細胞中に明らかに現 われていた（図１０）。更に、ＴＳＨ架橋形成により検出されたＡサブユニット と未開裂単一サブユニットレセプターとの間の割合が、ＴＳＨＲｍｙｃ細胞にお いて、同様数の野生型ＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−０）を発現する細胞系におけると同 じであった（１６）。検 討 ＴＳＨＲエクトドメイン中の２つの開裂部位についての本証拠は、この概念を （振返って）支持するこれまでのデータとの関連で検討しなければならない。こ のように、我々は何年もの間、あるキメラＴＳＨ−ＬＨ／ＣＧレセプターでのＴ ＳＨ架橋研究において我々が観察した現象に悩まされて来た。ＴＳＨＲ残基２６ １〜３６０（「Ｄドメイン」；キメラレセプターＴＳＨ−ＬＨＲ−４）あるいは 残基３６３〜４１８（「Ｅドメイン」；キメラレセプターＴＳＨ−ＬＨＲ−５） を関連するＬＨ／ＣＧレセプターのものと置換えても、ＴＳＨＲをＡおよびＢサ ブユニットへ開裂するのを妨げなかった（１０）（図１１）。ドメインＤおよび Ｅの同時置換のみが開裂を押し止めた。これらの知見はＤおよびＥドメインがそ れぞれ開裂部位をもつことと矛盾しない。 脱グリコシル化ＴＳＨＲ Ａサブユニットと非グリコシル化Ｂサブユニットの サイズの合計が期待値よりも小さいことは、ＴＳＨＲが２つの開裂部位をもち、 ボリペプチド鎖の介在部分を失うという概念を支持する。サイズの予測値が絶対 的に正確であり得ないということを我々も認めるが、その値にはＴＳＨＲに対し 異なる方法論を用いた異なる研究室間で再現性があり、分子内開裂の間にＴＳＨ Ｒの断片が失われたことを示唆している。我々は脱グリコシル化Ａサブユニット とＢサブユニットがそれぞれ〜３５ｋＤａおよび〜４２ｋＤａであることを観察 した。他でも同様サイズのＡおよびＢを報告している（２１〜２３）。すべての 研究で、２つのサブユニットの合計は８４ｋＤａのホロレセプターよりも小さい 約５ｋＤａである。我々のデータもまた両方の部位での開裂がすべてのあるいは 皆無の(all or none)現象ではないという可能性を提起している。このように、 優位なサブユニット型よりも僅かに大きなサイズの少量のＡおよびＢサブユニッ トを検出することで、両方の部位での僅かな程度の不完全な開裂を説明すること ができた。あるいは、これら少量のＡサブユニットの組成は不完全な脱グリコシ ル化を説明することができた。 ＴＳＨＲエクトドメインの２つの開裂部位を示唆する第三の証拠は、ＴＳＨＲ の単鎖ではない２つのサブユニット型における戦略的に位置づけられたｃ−ｍｙ ｃエピトープの選択的消失についての現在の観察である。この現象に対する３つ の可能な説明がある：（ｉ）２つの異なる部位での分子内開裂におけるｃ−ｍｙ ｃエピトープを含むペプチドフラグメントの消失；（ii）ｃ−ｍｙｃエピトープ 内での単一開裂部位が開裂して抗体認識を喪失する；（iii）これら２つの事象 の組合わせ（２つの開裂部位の１つがｃ−ｍｙｃエピトープ内にある）。これら の可能性の内、ｃ−ｍｙｃエピトープ内の単一部位での開裂は多くの理由からあ りそうにもない。すなわち、（i）アミノ酸残基３３８〜３４９（ｃ−ｍｙｃエ ピトープ）内の単一開裂では実験的に観察された実サイズ（４２ｋＤａ）よりも 明らかに大きな４６〜４７ｋＤａのＢサブユニットを生成する（図７Ａおよび７ Ｂ参照）；（ii）キメラレセプターＴＳＨ−ＬＨＲ−４（２４）および野生型Ｔ ＳＨＲ（２５）の欠失変異体（残基３１７〜３６６）はｃ−ｍｙｃエピトープが 挿入された領域を欠いている（図１１）が、両レセプターはなお２つのサブユニ ット に開裂する（７、１０）；（iii）ｃ−ｍｙｃエピトープの配列は本質的に野生 型レセプターの配列と異なっている。従って、このように高度に変異した領域で の継続的な開裂は、ＴＳＨＲ開裂部位に対するアミノ酸配列の特異性を欠いてい ることを示している。このような理由のすべてによって、ＴＳＨＲエクトドメイ ンには２つの開裂部位が存在する可能性があり、更にその上流にｃ−ｍｙｃエピ トープをもつ可能性がある。 ＴＳＨＲに思いもよらない２つの開裂部位が存在する可能性は、何故我々が以 前にＴＳＨＲの開裂がアミノ酸残基３１７の下流近傍ではなく、むしろ上流近傍 で起こったと推断するような誤りを冒したのかを説明する（７，１０，１２）。 我々が誤った推断をしたのは、ＴＳＨＲのＡおよびＢサブユニットへの開裂が、 ＴＳＨの突然変異誘発によって欠失した３１７〜３６６残基をもつレセプターに 対する架橋形成により明白であったからである（７，２５）。この知見がこの領 域に２つではない単一の開裂部位を排除させることになった（図１１）。更に、 このＴＳＨＲ変異体のＡサブユニットは野生型ＴＳＨＲのものにサイズが似てい た。振返って、重要な残基３１７の二三残基上流または下流での開裂は比較的大 型の（〜７４ｋＤａ）架橋産物から識別することは困難であった。 ｃ−ｍｙｃエピトープが他の糖タンパクホルモンレセプターと比較して、ＴＳ ＨＲに特有であると我々が観察した５０個のアミノ酸セグメント（残基３１７〜 ３６６）内に位置しているというのは興味深いことである（３）。この５０個の アミノ酸「挿入物」の正確な境界は（レセプター間での近接領域の相同性が低い ために）定かでないが、このＴＳＨＲセグメントは集中して研究すべき対象であ った。残基３１７〜３６６が非常に親水性であったことは、それがＴＳＨＲ分子 の外面に突出していて、多分リガンドの特異性に重要であると我々に憶測させる ものであった（２５）。しかし、驚くべきことに、その欠失はＴＳＨ結合あるい はＴＳＨ介在のシグナル変換に何ら影響しなかった（２５）。ＴＳＨＲ残基３１ ７〜３６６の推測される表面構造はまた、この領域をｃ−ｍｙｃエピトープ標識 のために選択した理由でもあった。他の研究者はＴＳＨＲに対する抗血清を生成 せしめるために、この領域部分に対応する合成ペプチドを用いた。特に、１つの ペプチド（３５２〜３６７残基）は高い免疫原性を有し、大多数のグレーヴズ病 血清におけるＴＳＨＲ自己抗体により認識されると報告されている（２６．２７ ）。更に、密接に関連する合成ペプチド（３５２〜３６６残基）に対する抗血清 はＦＲＴＬ−５ラット甲状腺細胞のＡサブユニットを認識するが、トランスフェ クトしたＣＯＳ細胞では非常に弱い（１１）。これらの知見を、開裂したＴＳＨ Ｒのこの領域の一部が欠如している可能性と関連付けることは興味深い。 要約すると、多様な証拠を一緒にすると、ＴＳＨＲのエクトドメインには２つ の開裂部位があることを示唆している。我々の知識では、ＴＳＨＲは、そのエク トドメインが複数の開裂部位を含むと思われる、Ｇタンパク結合レセプターファ ミリーの最初のメンバーである。推定上のＴＳＨＲ Ｃペプチドの精製および特 性づけは２つの開裂部位仮説に対する証拠を提供する。しかし、ＴＳＨＲを過剰 発現していないＴＳＨＲｍｙｃ細胞系から培地中に小さなＴＳＨＲポリペプチド フラグメントが遊離しているのを検出することは現在不可能である。それにもか かわらず、ＴＳＨＲエクトドメインの２つの開裂部位についての証拠は、ＴＳＨ Ｒサブユニットの構造−機能に関するこれからの研究に対して刺激を与える。 実施例３ 哺乳動物細胞中過剰発現するヒト甲状腺刺激ホルモンレセプター間の否定的協 力関係についての証拠 この実施例では、ＣＨＯ細胞でのＴＳＨＲの高レベル発現、並びにリガンド不 存在下での高い構成的ＴＳＨＲ活性、および単一サブユニットである未開裂ＴＳ ＨＲに対するＴＳＨの結合について記載する。更に、高レベルの発現は、ＴＳＨ Ｒ間のリガンドに対する親和性による明らかな否定的協力関係と関連している。前置き 甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）は甲状腺の生理的機能を制御する 際の中枢的重要性を有するものであり、グレーヴズ病で自己抗体が標的としたと きの甲状腺機能亢進症の直接の原因でもある（１−３に概観）。精製ＴＳＨＲが 入手可能となったことは、ＴＳＨＲの構造−機能相関を理解する上での、また同 様にヒトを冒す最も普通の臓器特異自己免疫疾患の一つであるグレーヴズ病の病 因を解明する上での重要な進歩である。甲状腺組織のＴＳＨＲは極く微量である ために（１）、組換えＴＳＨＲを高レベルで発現させることは、過去６年にわた り多くの研究者が精力的に追究してきたゴールである。殆どの努力は多くのタン パクで高レベルの発現を達成し得る原核細胞システム（４〜９）および昆虫細胞 システム（８，１０〜１４）に向けられている。ＴＳＨまたはＴＳＨＲ自己抗体 がそのような物質に結合するという報告（９、１０，１４，１５）、同様に合成 ＴＳＨＲペプチド（１５〜２０）および無細胞翻訳生成物（２１）に結合すると いう報告があるが、他の研究者らはタンパク産生またはリガンド認識のいずれか において厳しい困難に遭遇している（５，８，１３，２２）。 ５年前、我々がジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）ミニ遺伝子の増幅を用 いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で甲状腺ペルオキシダーゼを 過剰発現することに成功したので（２３）、我々はＴＳＨホロレセプターについ ても同じ方法を試みた。しかし、我々は高レベルの発現を達成しなかった（カウ フマン（Kaufman）ら、未刊行データ）。我々が次に行ったバクテリアおよびバ キ ュロウイルス法に手間取って幻滅したことが、ｄｈｆｒ−ミニ遺伝子増幅により 、ＣＨＯ細胞でのＴＳＨＲエクトドメインの過剰発現を我々に再試行させること となった。しかし、このタンパクの殆どはＴＳＨあるいは機能的ＴＳＨＲ自己抗 体のいずれをも認識しない未成熟の炭水化物のままで細胞内に保持されていた（ ２４）。 極く最近、我々はヒトＴＳＨＲの５'−および３'−未翻訳領域がＣＨＯ細胞で のＴＳＨＲ発現に重要な抑制効果を示すことに気づいた（２５）。ｄｈｆｒ−ミ ニ遺伝子法によるＴＳＨホロレセプター増幅での当初の試みで我々は両方の未翻 訳領域を有する完全長（４ｋｂ）ＴＳＨＲｃＤＮＡ（２６）を利用したので、２ ．３ｋｂ翻訳領域のみを用いてＴＳＨＲｃＤＮＡ増幅を再度繰り返した。今や我 々はＣＨＯ細胞での高レベルＴＳＨＲ発現を報告し、リガンド不存在下でのＴＳ ＨＲの高構成的活性を確認する（２７，２８）。更に、我々はより高いレベルの 発現がＴＳＨＲ間のリガンドに対する親和性による明らかな否定的協力関係と関 連していることを見出す。方 法 ヒトＴＳＨＲ−ＥＣＤ高レベル発現のためのプラスミドの構築 ：コード領域と０ ．４ｋｂの３'未翻訳領域とを含む２．７ｋｂのＴＳＨＲｃＤＮＡをｐＴＳＨＲ −５'ＴＲ−ＮＥＯ−ＥＣＥからＳａｌＩおよびＸｂａＩにより切除した（２５ ）。このフラグメントをＨｉｎｃＩＩで制限処理して２．３ｋｂのＴＳＨＲコー ド領域を遊離させ、次いで、ＳａｌＩ−ＸｂａＩ挿入断片を除去したｐＳＶ２− ＤＨＦＲ−ＥＣＥ−ＴＰＯ（２３）のＸｂａＩ（平滑化）およびＳａｌＩ部位に これを挿入した。ｐＳＶ２−ＤＨＦＲ−ＥＣＥ−ＴＳＨＲと命名したこの新しい プラスミドをリン酸カルシウム沈降法（２９）によりジヒドロ葉酸レダクターゼ （ｄｈｆｒ）−欠損ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＤＧ４４；ロバート・シムケ（Robert Schimke）博士の恵与、スタンフォード大学、パロアルト、カリフォルニア）に トランスフェクトした。安定にトランスフェクトした細胞を、１０％透析ウシ胎 児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ），ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）お よびアンホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍｌ）を添加したチミジン−、グアニン− およびヒ ポキサンチン−不含ハムＦ−１２培地中で選択した。限界希釈の後、１４種の異 なるクローンをＴＳＨで刺激して細胞内ｃＡＭＰを測定することによりＴＳＨＲ の発現につき試験した（下記参照）。最大応答を示したクローンをトランスゲノ ム増幅用に選択した。メトトレキセート（ＭＴＸ）を当初２０ｎＭの濃度で選択 細胞培地に加え、生存細胞を発展させた。メトトレキセートの濃度を連続的に増 大させ、最終濃度を１０，０００ｎＭ（１０μＭ）とした。細胞を８００ｎＭお よび１０，０００ｎＭメトトレキセート濃度で限界希釈し再クローン化した。前駆体標識ＴＳＨＲの免疫沈降 ：ＴＳＨＲを安定的に発現するＣＨＯクローン細 胞系を１００ｍｍ直径培養ディッシュ中集密的に生育した。リン酸バッファー塩 溶液（ＰＢＳ）で洗浄した後、細胞を５％熱不活性化ウシ胎児血清含有ＤＭＥ− Ｈ２１メチオニン−およびシステイン−不含培地中で予め培養した（０．５時間 、２度）。この細胞を〜０．５ｍＣｉの³⁵Ｓ−メチオニン／システイン（＞１０ ００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ，デュポンＮＥＮ，ウイルミントンＤＥ）添加新鮮培地５ ｍｌ中でパルス標識した（３７℃、１時間）。培地を吸引除去し、細胞をＰＢＳ で一度洗浄した後、１０％ウシ胎児血清を含む標準非選択Ｆ１２培地中でチェイ スを８時間実施した。細胞をＰＢＳで２度洗浄し、１ｍｌの氷冷２０ｍＭヘペス （ｐＨ７．２；プロテアーゼ阻害剤、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳ Ｆ）（１００μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（１ μｇ／ｍｌ）およびペプスタチンＡ（２μｇ／ｍｌ）（すべてシグマ、セントル イス、ミズーリより入手）含有１５０ｍＭＮａＣｌ）（バッファーＡ）中に削ぎ 落とした。該細胞をペレット化し（１００ｘｇ、５分間）、ＰＢＳで２回洗浄し 、１％トリトンＸ−１００を含むバッファーＡ中に再懸濁した。４℃で９０分間 時折振盪した後、混合物を１００，０００ｘｇで４５分間遠心し、その上清を免 疫沈降バッファー（２０ｍＭヘペスｐＨ７．２，３００ｍＭＮａＣｌ，０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム、０．５％ノニデット−Ｐ４０および２ｍＭ ＥＤＴＡ ）中に１：４に希釈した。可溶化した細胞タンパクを、２５μｌの充填・洗浄し たプロテインＡ−アガロース（シグマ）に予め結合した１５０μｇ正常マウス血 清ＩｇＧと４℃で１時間インキュベーションすることにより予め精製した。プロ テインＡをミクロ遠心機により遠沈（１０，０００ｘｇで３分間）して除去した 後、 ＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体（Ａ９とＡ１０の混合物、ポール・ バンガ（Paul Banga）博士から恵与、ロンドン、英国；最終希釈１：１０００） を添加した。Ａ９およびＡ１０はそれぞれアミノ酸１４７〜２２９および２２〜 ３５の間のＴＳＨＲ領域を認識する（３０）。４℃、３時間後、２５μｌの充填 ・洗浄したプロテインＡ−アガロースを加え、チューブを４℃、１時間転倒振盪 した。プロテインＡを１０，０００ｘｇ（４℃）で３分間遠心により回収し、免 疫沈降バッファー１ｍｌで５回洗浄し、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４），２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で１回洗浄した。最 後に、ペレットを０．７Ｍβ−メルカプトエタノール含有レムリ・サンプルバッ ファー（３１）に再懸濁し（４２℃、３０分間）、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル（バイオラッド、ハーキュレス、カリフォルニア）上電気泳動した 。予め着色した分子量マーカー（バイオラッド）を並行レーンに包含させた。放 射性標識タンパクはコダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルム（イーストマンコダック、 ロチェスター、ニューヨーク）上オートラジオグラフィーにより可視化した。デ ンシトメトリー分析をバイオラッド走査デンシトメーターにより実施した。放射性標識ＴＳＨの共有結合架橋形成 ：高度精製ウシＴＳＨ（５μｇ／ｍｌタン パク）をボルトン−ハンター試薬（４４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；デュポン−ＮＥＮ ）により製造業者のプロトコールに従って比活性が〜８０μＣｉ／μｇタンパク となるように¹²⁵Ｉで放射性標識し、次いで、セファデックスＧ−１００クロマ トグラフィーに付した（３２）。ＴＳＨをメトトレキセートにより異なるレベル の増幅率で安定的に発現するＣＨＯクローン細胞系を１００ｍｍ直径培養ディッ シュ中で集密的に生育した。細胞を０．２５％ＢＳＡ添加改変ハンクバッファー （等張性を維持するためにＮａＣｌを２８０ｍＭスクロースに置換）（結合バッ ファー）５ｍｌ中５μＣｉ ¹²⁵Ｉ−ＴＳＨで３７℃、２時間培養した。氷冷した 結合バッファーで３回細胞を洗浄し、結合しなかった¹²⁵Ｉ−ＴＳＨを除去した 。次いで、上記プロテアーゼ阻害剤を含む１０ｍＭリン酸Ｎａバッファー（ｐＨ ７．４）に溶かしたジスクシンイミジル・スベリン酸（ＤＳＳ；１ｍＭ；シグマ ）を室温２０分間で加えた。架橋形成反応を２０ｍＭ酢酸アンモニウム（最終濃 度）の添加により停止させた。 架橋形成後、細胞をＰＢＳで２度洗浄し、同一のプロテアーゼ阻害剤を含む１ ０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）中に削ぎ落とした。細胞をポリトロンホモジナイザ ー（ブリンクマン・インストルーメント、ウエストバリー、コネチカット）を用 いて均一化し、４℃で５分間遠心した（５００ｘｇ）。上清を遠心し（１５分間 、１０，０００ｘｇ、４℃）、ペレットを１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）５０μ ｌに再懸濁した。タンパク濃度をブラッドフォード法（３３）により定量した。 レムリバッファー（３１）を添加した後、０．７Ｍβ−メルカプトエタノールの 存在下（４２℃、３０分間）、サンプルを７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付し 、上記のように分析した。ＴＳＨ結合 ：ＴＳＨＲｃＤＮＡを安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を９６ 穴培養プレート中で集密的に生育せしめた。次いで、細胞を約５０，０００ｃｐ ｍの¹²⁵Ｉ−ＴＳＨ含有結合バッファー（上記参照）中で、高濃度非標識ウシＴ ＳＨ（シグマ）の存在下もしくは不存在下に３７℃、２時間培養した。培養期間 の終末点で、細胞を結合バッファー（４℃）で３度迅速に洗浄し、０．１ｍｌ ＮａＯＨで可溶化し、放射活性をガンマカウンターにて測定した。高濃度¹²⁵Ｉ −ＴＳＨを用いる実験は、非標識ＴＳＨを添加しなかったこと以外は同一条件下 で培養した細胞中で実施した。未トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する非特異^{12 5} Ｉ−結合は、特異結合のカウントを与えるために総結合カウントから差し引い た。これらの値は使用した最高トレーサー濃度（２．５ｘ１０⁷ｃｐｍ／ｍｌ） の総結合カウントの＜１０％であった。分子内ｃＡＭＰのＴＳＨ刺激 ：２４穴または９６穴培養プレートで集密的に生育 させたトランスフェクトＣＨＯ細胞を、低張培地（３４，３５）中または１％ウ シ血清アルブミン、１ｍＭイソブチルメチルキサンチン含有ハムのＦ−１２培地 中、ウシＴＳＨ（シグマ）の添加または無添加の条件で３７℃、２時間培養した 。サイクリックＡＭＰを低張培地中で直接測定した。等張ハムのＦ１２培地中Ｔ ＳＨに露呈した細胞については、培地を吸収除去し、細胞内ｃＡＭＰを９５％エ タノールで抽出し、蒸発乾燥し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．２）に再懸 濁した。サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ，２'−Ｏ−スクシニル¹²⁵Ｉ−ヨード チロシン・メチルエステル（デュポンＮＥＮ）およびウサギ抗ｃＡＭＰ抗体（カ ル ビオヘミ、サンジエゴ、カリフォルニア）を使用するラジオイムノアッセイによ り測定した。結 果 全ＣＨＯ細胞中ＴＳＨＲタンパク発現の免疫沈降による定量 ：ＣＨＯ細胞のゲノ ム中ＴＳＨＲホロレセプター／ｄｈｆｒ−ミニ遺伝子複合体の安定な移入の工程 および増幅の向上には略１年を要した。この間、選択したクローン中でのＴＳＨ Ｒ発現は¹²⁵Ｉ−ＴＳＨ結合により断続的に確認した。増幅工程を完成させた後 、我々は全細胞内のＴＳＨＲ発現レベルを前駆体³⁵Ｓ−メチオニンおよび³⁵Ｓ− システイン標識とＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体（Ａ９＋Ａ１０） を用いる在来条件下での免疫沈降により評価した（３０）。この比較において（ 図１２）、我々は以下のものを安定にトランスフェクトしたクローン細胞系を用 いた：（i）５'−および３'−非翻訳領域の両方をもつ４ｋｂ ＴＳＨＲｃＤＮＡ （野生型ＴＳＨＲ）（２６）；（ii）欠失非翻訳領域（５'３'ＴＲ−ＥＣＥ）（ ２５）をもつ２．３ｋｂ ＴＳＨＲｃＤＮＡ（この報告のためにＴＳＨＲ−０と 再命名）；（iii）８００ｎＭメトトレキセートで生育安定後の２．３ｋｂＴＳ ＨＲｃＤＮＡ（ＴＳＨＲ−８００）；および（iv）１０，０００ｎＭメトトレキ セートで生育安定後の２．３ｋｂＴＳＨＲｃＤＮＡ（ＴＳＨＲ−１０，０００） 。未トランスフェクトＣＨＯ細胞は陰性コントロールとして組み入れた。 還元性条件下で免疫沈降生成物を分析すると、全細胞ホモジネートにおいてミ スラーイ（Misrahi）ら（１２）が以前に報告したＴＳＨＲホロレセプター、サ ブユニットおよび前駆体のパターンと矛盾のない多数のバンドを現出させた。本 研究の展望から重要なのは、ｄｈｆｒ増幅工程と関連してすべてのＴＳＨＲ−特 異バンドが発現において明らかに増大していたことであった。本研究では、１０ ０ｋＤａのホロレセプターバンド（図１２において矢印で示す）のデンシトメト リーによる定量結果は、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞でのＴＳＨＲ発現がＴＳＨ Ｔ−０細胞でよりも大きい１０．３±２．０（２つの別個の実験での範囲）であ るということを示していた。細胞表面でのＴＳＨのＴＳＨＲへの架橋形成 ：安定的にトランスフェクトしたマ ウスＬ−細胞においては、甲状腺細胞とは違って、殆どのＴＳＨＲが通常の成熟 化を受けないと報告されている（１２）。代りに、未成熟な形態のレセプターは 細胞内に蓄積し、分解する。従って、細胞溶解物の免疫沈降により観察されるＴ ＳＨＲの増幅が細胞表面に発現した成熟ＴＳＨＲの増加とも関係あるか否かを決 めることが重要である。単層培養において未処理ＣＨＯ細胞に架橋形成している 放射性標識ＴＳＨは、ｄｈｆｒ−ミニ遺伝子増幅と共にＴＳＨ結合部位が増大し つつあることを物語っていた（図１３）。デンシトメーター分析によると、ＴＳ ＨＲ−１０，０００細胞に結合するＴＳＨＲはＴＳＨＲ−０細胞のものよりも１ ２．８±２．８倍（平均±Ｓ．Ｅ．：ｎ＝３実験）増加していた。以前に定量し たＴＳＨＲ−０（以前は５'３'ＴＲ−ＥＣＥ）細胞表面上のＴＳＨＲ分子が〜１ ５０，０００であったことに基づくと（２５）、今回のデータはＴＳＨＲ−１０ ，０００細胞がその表面に〜１．９ｘ１０⁶個のＴＳＨＲを発現していることを 示唆する。 架橋形成データに関しては更に２つの特徴を指摘すべきである。その第一は、 オートラジオグラムの照射が比較的短く（１６時間）、その時間ではＣＨＯ細胞 に発現した野生型ＴＳＨＲｃＤＮＡでのシグナルを見ることができない。第二に 、２つのリガンド−ＴＳＨＲ複合体（〜１３０ｋＤａおよび〜７５ｋＤａ）が還 元条件下ではっきり現われる。ＴＳＨサブユニットの分子質量を差し引いた後の 上部バンドは〜１１５ｋＤａの見かけの質量を有する単一鎖ホロレセプターを表 し（３６，３７）、下部バンドは〜６０ｋＤａの解離したＡサブユニット（３８ ）を表す。リガンド不存在下過剰発現したＴＳＨＲの機能 ：基礎ｃＡＭＰレベルは異なる数 のＴＳＨＲを発現する安定的にトランスフェクトした細胞系において評価した。 ＴＳＨを含まない低張培地（３４，３５）中で培養した細胞では、ｃＡＭＰレベ ルがＴＳＨＲ−０細胞（１．１０±０．２１ｐｍｏｌｅ／ウエル）に比較して、 ＴＳＨＲ−１０，０００細胞（２０．３±１．５Ｓ．Ｅ．ｐｍｏｌｅ／ウエル； ｎ＝３）では１８．５倍高かった（図１４Ａ）。等張培地では（図１４Ｂ），基 礎ｃＡＭＰレベルがＴＳＨＲ−０細胞（０．５２±０．０５ｐｍｏｌｅ／ウエル ）に比較して、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞（３．０４±０．３６Ｓ．Ｅ．ｐ ｍｏｌｅ／ウエル；ｎ＝３）ではより低い程度（６．０倍）で増加していた。こ れらのデータは非リガンドＴＳＨＲが有意な構成的活性を有することを示す。つ いでながら、低張条件下およびより多くのＴＳＨＲをもつ細胞系でのより高い基 礎ｃＡＭＰレベルと関連して、ＴＳＨ刺激に応答したｃＡＭＰレベルの増大がＴ ＳＨＲ−０細胞の１７倍からＴＳＨＲ−８００細胞での２．９倍およびＴＳＨＲ −１０，０００細胞での１．４倍に減少していた（図１４Ａ）。細胞を等張培地 で培養したときには、同じＴＳＨ濃度に応答して、同様の、しかしそれ程ドラマ ティックではないｃＡＭＰの減少が観察された。ＴＳＨＲを過剰発現する細胞表面結合性ＴＳＨの反応速度論 ：当初の実験で我々 はＴＳＨＲを過剰発現するＣＨＯ細胞結合性ＴＳＨの反応速度を、非標識ＴＳＨ 濃度増大下に¹²⁵Ｉ−ＴＳＨを用い定量した。驚くべきことに、ＴＳＨＲ−Ｏ細 胞（Ｋｄ〜５ｘ１０^-10Ｍ）（２５）と対照的に、我々はＴＳＨＲ−８００細胞 （〜１０^-9Ｍ）およびＴＳＨＲ−１０，０００細胞（〜２ｘ１０^-9Ｍ）により漸 進的に低下したＴＳＨ結合に対する半最大阻害値を観察した（図１５４）。これ らの値のすべてが野生型完全長のＴＳＨＲｃＤＮＡ（ＴＳＨＲ−ＷＴ）（２ｘ１ ０^-10Ｍ）トランスフェクト細胞について観察された値よりも低い。ＴＳＨ親和 性のスカッチャード分析および特にＴＳＨＲ数分析は、ＴＳＨＲ−８００および ＴＳＨＲ−１０，０００細胞についてはそれらの特異ＴＳＨ結合の親和性が低く 、非トランスフェクトＣＨＯ細胞（３９）への非特異ＴＳＨ結合の値に近づき、 なお且つプラスティックでの値（４０）（Ｋｄ〜６ｘ１０^-8Ｍ）にも近かった故 に、正確に実施できなかった。事実、強調しなければならないのは、図１５に示 した研究のためのリガンドでの部分的レセプター飽和を得るためには、各培養ウ エルでのＴＳＨＲ数を減らす必要があったことである。それ故に、ＴＳＨＲ−８ ００およびＴＳＨＲ−１０，０００細胞は未トランスフェクト細胞で１：５０に 希釈した。 非特異結合成分はその親和性が特異結合よりも大きさにおいて略一桁小さいが 、それを差し引くことにより生じる誤差を減ずるために、我々は非標識ＴＳＨの 不存在下、¹²⁵Ｉ−ＴＳＨ量を増加させる飽和分析法により、ＴＳＨＲを過剰発 現するＴＳＨＲ−８００およびＴＳＨＲ−１０，０００細胞に対するＴＳＨ結合 の反 応速度を決めようと試みた。トレーサーを１．２５ｘ１０⁶ｃｐｍ／ウエル（５ ０μｌ培地）にまで増やしても得られたＴＳＨＲの飽和が不十分であったために 、これらのデータをスカッチャド分析しても何も分からなかった（図１６）。そ れにもかかわらず、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞の表面に対する特異ＴＳＨ結合 はＴＳＨＲ−０細胞に対するよりも約１０倍高いことが明らかであり、¹²⁵Ｉ− ＴＳＨ架橋形成データと矛盾しない（図１３）。検 討 何年もの努力の結果、我々は最終的に哺乳動物細胞中でヒトＴＳＨＲを高いレ ベルで発現することに成功した。ＴＳＨＲ−１０，０００細胞表面にＴＳＨＲが 過剰発現したその限度（細胞当たり〜１．９ｘ１０⁶レセプター）は、甲状腺細 胞では推定値が高々〜５ｘ１０³ＴＳＨＲ（１）であることを考慮すれば極めて 注目すべきことである。このレベルの発現は以前に安定的にトランスフェクトし た哺乳動物細胞で得たものよりも１０〜１２倍高値であり（２２，４１，４２） 、在来のＴＳＨＲに関する研究を容易にする故に価値がある。バクテリア（９， １４）、昆虫細胞（１０，１４，１５）および無細胞翻訳（２１）発現システム で生成させた組換えＴＳＨＲあるいはペプチド（１５〜２０）として産生したＴ ＳＨＲとＴＳＨおよびＴＳＨＲ自己抗体との相互作用についての報告はあるが、 我々が言及するのは哺乳動物細胞で産生された本来のタンパクに絞っている。バ クテリアまたは昆虫細胞で生成したＴＳＨＲは一般に不溶性であり、カオトロピ ック剤での可溶化と引き続いての再生処理が必要である（９〜１１，１４）。 哺乳動物細胞による高レベルＴＳＨＲ発現での我々の最終目標はＴＳＨＲの三 次元構造を決めることである。しかし、過剰発現をもってしてさえ、ホロレセプ ターが巨大炭水化物組成を有する膜関連タンパクであるという観点からして、精 製したＴＳＨＲの結晶がいつかは得られるのか得られないのかさえ不確かなまま である。精製エクトドメインの結晶化はより可能性がある。しかし、我々の経験 では、エクトドメインそれ自身では哺乳動物細胞中で正しく成熟せず、過剰発現 し得ない（２４）。しかし一方で、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞により発現した ホロレセプターはサブユニットの構造、炭水化物組成物、生理的リガンドＴＳＨ との相互作用、並びに細胞内輸送の研究を容易にする。現在まで、また、マウス ｍＡｂが利用可能になってさえ（５，３０，４３）、哺乳動物細胞中で発現した 組換えＴＳＨＲは効率的な免疫学的検出のために予めアフィニティ精製する必要 がある（１２）。 ＴＳＨＲ−１０，０００細胞はまたＴＳＨＲ自己抗体研究のための抗原提供に 潜在的な価値がある。これらの用途の中には、ＴＳＨＲ自己抗体のための新しい アッセイ法の開発、患者血清のＴＳＨＲ自己抗体のフローサイトメトリー分析、 および患者のＢ細胞から誘導されるイムノグロブリン遺伝子コンビナトリアルラ イブラリーからのヒトモノクローナル自己抗体の単離などがある。しかし、これ ら細胞の高基礎ｃＡＭＰレベルはその感度を減じ、ＴＳＨＲ機能活性のバイオア ッセイにとってこれらの細胞は二次選択的なものとなる。 哺乳動物細胞での高レベルＴＳＨＲ発現の実用化には長い開発期間を要すると 思われるが、その実用的観点とは別に、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞の現在の研 究は、少なくともＣＨＯ細胞で発現したとして、ＴＳＨＲの機能を洞察する。第 一に、安定的にトランスフェクトした細胞系でのデータはＴＳＨＲがリガンドの 不存在下、適度のレベルの活性を保持しているという過渡的トランスフェクショ ンデータ（２８）を強く支持する。そのような自発性活性は最初にα１Ｂ−アド レナリンレセプターで観察された（４４）。甲状腺の場合でのこの活性の潜在的 重要性は、以前に我々が示唆した（２５）ように、甲状腺の過剰活性が、ｍＲＮ Ａコード領域での変異が不変数レセプターの増大した本質的活性を増大させ得る のと同じように、ｍＲＮＡ非翻訳領域における変異の結果として、特定個体の甲 状腺細胞上に増大発現したＴＳＨＲ数から由来したということである（４５，４ ６）。 ＴＳＨＲ−１０，０００細胞中に過剰発現するＴＳＨＲの第二の興味ある特徴 は、細胞表面に発現した単鎖ＴＳＨＲにＴＳＨが結合し得ることである。ＣＨＯ 細胞表面上の単鎖ＴＳＨＲおよび２つのサブユニットＴＳＨＲの比率は、発現さ れたレセプター数に依存しない。しかし、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞でのより 強いシグナルはこの現象を更に明瞭なものとし、ＡおよびＢサブユニットへの開 裂がＴＳＨの結合にとっての必要条件ではないとする、キメラＴＳＨ−ＬＨ／Ｃ Ｇレセプターを用いる我々の以前の証拠を支持する（３７）。この証拠は単鎖Ｔ ＳＨＲが少なくとも部分的に生理的レセプターであるという可能性を提起するが 、この概念は他の研究者の論争となった（５）。 ＴＳＨＲを過剰発現するＣＨＯ細胞の最も驚異的な特徴は、ＴＳＨＲ数が増大 するにつれて観察されるＴＳＨに対する親和性の漸進的減少であった。振返って 見て、我々が観察はしたが評価しなかったのは、ＴＳＨＲの５'−３'−非翻訳領 域の役割を試験する研究において、ＴＳＨの親和性が似てはいるがそれ程ドラマ ティックな減少ではなかったということである（２５）。野生型ＴＳＨＲｃＤＮ Ａの親和性が、ＴＳＨＲの発現が非翻訳領域の欠失後に増大したときに、２ｘ１ ０^-10Ｍから５ｘ１０^-10Ｍ Ｋｄに低下したように見えたのは人為的なものであ ると考えた。しかし、ＴＳＨＲ−８００とＴＳＨＲ−１０，０００細胞とのＴＳ Ｈ親和性の更なる減少は我々の結論を不可避なものとする。これらの細胞系にお けるＴＳＨ親和性は正確に評価することができないが、その理由は該親和性が非 特異ＴＳＨ結合の親和性よりもその大きさが高々１桁高いだけだからである。Ｔ ＳＨＲの分子クローニングに先立って、この顕著に高い非特異的な結合親和性は 、プラスティックでも観察されたものであるが（４０）、二次的低親和性型のＴ ＳＨＲであると考えた（１７，４７）。それにもかかわらず、半最大置換を惹起 こすＴＳＨ濃度に基づくと、ＴＳＨに対するＴＳＨＲ−１０，０００およびＴＳ ＨＲ−８００細胞の親和性はＴＳＨＲ−０細胞のものよりも明らかに低い。 我々の意見では、レセプター数と共に親和性が減少する現象に対するもっとも らしい説明はＴＳＨＲ間の否定的協力関係である。ＴＳＨＲは液体形質膜中、特 に高密度で凝集するかまたは「パッチ」形成することが可能である。ＴＳＨＲそ れ自身のコンホメーション変化またはＴＳＨ結合に対する立体障害もまた明らか に親和性の減少につながり、ホロレセプターとＴＳＨＲ Ｂサブユニットとの間 の結合物となり得る。過剰のＢサブユニットはＴＳＨＲを発現する細胞中に以前 観察したことがある（５，４８）。低親和性ＴＳＨＲの親和性は、多分、もし大 部分のＴＳＨＲがＧタンパクに結合すれば生じるものである。もしあるとすれば 、これらの代りとなるもののどれが基本となるメカニズムであるのかを解明する 更なる研究が必要である。我々は、高密度で発現したＴＳＨＲで観察される機能 的 変化が、構造上の情報を甲状腺細胞に存在するＴＳＨＲのこれらレセプターに外 挿推定する際に警戒を求めることを認める。それにもかかわらず、ＴＳＨＲの否 定的協力関係は安定な甲状腺機能を維持することと関連して、甲状腺の特徴であ る他のタイプの自己規制を表現しているとするのがもっともらしい。 実施例４：ヒト甲状腺刺激ホルモンレセプターのエクトドメインを、分泌されな い形態から、分泌されグレーヴズ病患者の血清中の自己抗体を中和する、免疫活 性の高い糖蛋白に処理する この例では、ヒトＴＳＨＲエクトドメインにおけるＣ末端の切除によって、グ レーヴズ病患者の血清中の自己抗体を中和する、複合炭水化物を伴う分泌された 蛋白を生じることが示される。抗原的に活性なＴＳＨＲは、グレーヴズ病の治療 、病原論や免疫療法に有用である。前置き グレーヴズ病は、非常にありふれた（有病率１％〜）（１）、器官特異的な自 己免疫疾患であり、ヒトのみに作用する。これよりは低い割合の器官特異的な病 気である、タイプＩ糖尿病とは異なり、グレーヴズ病には、自然発生の動物モデ ルは存在しない。また、タイプＩ糖尿病とは対照的に、グレーヴズ病の病原には 、一つの特定の抗原、すなわち甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）が関 与している。したがって、ＴＳＨＲに対する自己抗体はレセプターを活性化し、 これは甲状腺の過剰活性や甲状腺中毒症を引き起こす（２で再検討された）。こ の ため自己抗体とＴＳＨＲとの間の反応は、理論的、診断的及び（潜在的に）治療 的な観点から興味が持たれている。 自己抗体としてのＴＳＨＲの重要性から、バクテリア(6-11)、昆虫細胞(12-16 )、安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞(3,17-21)や無細胞(cell-free) 翻訳(22)などの多様な発現システム内で、及びペプチド合成(23,24)によってこ の蛋白を産生するためのｃＤＮＡ(3-5)の分子クローニングが行われて以来７年 間、多大な努力が払われてきた。しかし、効果的なＴＳＨＲ抗原の産生は極めて 困難であった。このように、多大な努力が行われ、これらのアプローチのうちの いくつかは有望であるように思えるが、組換えＴＳＨＲ抗原を用いたＴＳＨＲ自 己抗体の直接的アッセイが、２０年近くにわたって使用されているブタ甲状腺抽 出物(25)を用いた間接的ＴＳＨ結合阻害アッセイにとってかわることが出来てい ないのは注目に値する。その上、効果的な抗原が無いことは、自己抗体−ＴＳＨ Ｒ自己抗原反応の機構的、構造的研究を妨げている。 この困難さの重要な要因は、ＴＳＨと同様にＴＳＨＲ自己抗体が、不連続であ って高度に立体配座的な(conformational)エピトープ(26-28)を優れて認識する ことにある。哺乳動物細胞の表面に発現されたＴＳＨＲは立体配座的に完全(int act)であって、患者の血清(29-31)中の自己抗体によって問題なく認識される。 その上、多数のＴＳＨＲ発現哺乳動物細胞が発酵槽(20)で生産でき、チャイニー ズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）におけるＴＳＨＲの過剰発現が、トランスゲノ ム増幅(transgenome amplification)(32)によって達成された。しかしながら、 ＴＳＨＲの７つの膜にかかるセグメントのため、精製は容易ではない。予想に反 して、４１８アミノ酸残基、すなわち自己抗体結合ＴＳＨＲエクトドメインが、 ＣＨＯ細胞でその曲がった領域なしで発現された場合は、それは分泌されないが 、大部分が高度のマンノース炭水化物(34)を含む形で細胞(33,34)中に保持され る。その上、この未成熟炭水化物を含むＴＳＨＲエクトドメインは、患者の血清 (34)中の自己抗体によっては認識されない。 ここで我々は、つぎのことを報告する。すなわち、完全な(entire)ＴＳＨＲエ クトドメインとは対照的に、段階的なＣ末端切除は、ＣＨＯ細胞による成熟した 複合炭水化物を有する改変されたＴＳＨＲエクトドメインの分泌を引き起こす。 さらに我々は、この自己抗原のエピトープタグ付与(epitope-tagging)、及びＣ ＨＯ細胞中でトランスンスゲノムを増幅することにより、哺乳動物細胞起源のＴ ＳＨＲの直接的な視覚化及び定量化を初めて報告する。最も重要なことは、この 物質は患者の血清中のＴＳＨＲ結合活性をすべて若しくはほとんど中和すること ができることである。抗原的に活性なＴＳＨＲは、グレーヴズ病の病原に関する 将来の研究において大きな推進力を与えることとなるであろう。方法 プラスミド構成 ：我々は、哺乳類細胞において、限定されたＴＳＨＲエクトドメ イン切除を発現させるために３つのプラスミドを産生した。(Fig.17)：−(i)Ｔ ＳＨＲ−２６１ ：プラスミドＴＳＨＲ−５’ＴＲ−ＮＥＯ−ＥＣＥ（３５）は、 コドン２６０にＡｆｌIIサイトを、挿入部の３末端におけるベクターにＸｂａＩ サイトを含む。ＡｆｌII−ＸｂａＩフラグメントは切り取られ、２つの終止コド ンを伴う６つのヒスチジン残基（６Ｈ）をコードするカセットに置き換えられた 。カセットは２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって作製し た。２つのオリゴヌクレオチドとは、：−センス(Sense)：５’−ＴＴＡＡＣＣ ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＡＴ；アンチセンス(Antisense )：５’−ＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧ ＡｆIIサイトにおける結紮(Ligation)は６Ｈの上方にＡｓｎ残基を生じ、そのた め“２６１”と命名される。(ii)ＴＳＨＲ−２８９：コドン２６０にＡｆｌIIサ イトを含み、ＳｐｅＩサイトを伴いコドン２８９に続くｃＤＮＡフラグメントを 、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによって生産した(Stratagene,San Diego,CA)。このフラグメントは、ＴＳＨＲ−５’ＴＲ−ＮＥＯ−ＥＣＥ（Ｓｐ ｅＩサイトはコドン４１８にある）中のＡｆｌII−ＳｐｅIIセグメントに置き換 えられた(26)。つづいて、２つの終止コドンを伴う６Ｈをコードし、ＳｐｅＩ及 びＸｂａＩの接着末端(Adhesive ends)を有するオリゴヌクレオチドカセットを 、中間構成の同じサイトに挿入した。センス：５’−ＣＴＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣ ＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＡＴ；アンチセンス：上記ＴＳＨＲ−２６１ で示したのと同様。(iii)ＴＳＨＲ−３０９：ＰＣＲによって生産したＡｆｌII −Ｓ ｐｅ ｃＤＮＡフラグメントをコドン３０９まで延長したことを除いては、ＴＳ ＨＲ−２８９の場合と同様にして構成した。 関連した領域のヌクレオチド配列を確認した後、ＴＳＨＲ−２６１、ＴＳＨＲ −２８９及びＴＳＨＲ−３０９のｃＤＮＡはＳａｌＩ及びＸｂａＩとともに切除 され、ベクターｐＳＶ−ＥＣＥ−ｄｈｆｒ(36)に移された。ＴＳＨＲエクトドメイン変異体(Variant)の発現 ：上記ＴＳＨＲエクトドメイン ｃＤＮＡ変異体により安定してトランスフェクトされた細胞系を、先に述べた手 法(34)を用いて、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞（ＣＨＯ−ＤＧ４４：スタンドフォー ド大学、Palo Alro、CAのDr．Robert schimke提供）内で確立した。トランスゲ ノム増幅は、メトトレキサート(methotrexate)（最終濃度１０μＭ）中の成長に 対する段階的馴化(progressive adaptation)によって達成された(34)。培地及び細胞中のＴＳＨＲエクトドメイン変異体の検知 ：先に記載したのと正確 に同じ方法を用いて（１時間パルス、一晩追跡）(32)、ＴＳＨＲエクトドメイン 変異体発現のために試験するＣＨＯ細胞を、³⁵Ｓ−メチオニン／システインで代 謝的に標識した。先に記載した方法(32)に以下の修正を加えて、分泌されたＴＳ ＨＲ蛋白の免疫沈降のために培地を収穫し、細胞内ＴＳＨＲ蛋白の分析のために 細胞をさらに加工した。１％Triton X-100を含む緩衝液中に溶解した細胞を、マ ウスＩｇＧ及びプロテインＡとともに前もって除去(pre-clearing)するに先だっ て、100,000xｇで４５分間遠心分離し、つづいてマウスモノクローナル抗体（ｍ Ａｂ）Ａ１０（37）（Dr．Paul Banga，London，U.K.提供；アミノ酸残基２２− ３５におけるエピトープ；最終的に1:1000に希釈）を用いて免疫沈降した。培地 は、後の実験でマウスＩｇＧがプロテインＡに前もって結合されていない(not p rebound)こと以外は同様にして前もって除去した。サンプルを、還元条件下に１ ０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。前もって染色した分子量マーカ ー（BioRad,Hercules,CA）を、テキストで示された分子量を得るために、より正 確で未染色のマーカーに対して、前もって検定した。放射性同位元素標識された 蛋白は、Kodak XAR-5 X-rayフィルム（Eastman Kodak，Rochester,NY）上でオー トラジオグラフィーによって視覚化された。また、培地に分泌されたＴＳＨＲは 、先に報告された手法(34)により、Ni-NTA樹脂（QIAGEN,Inc,Chatsworth,CA）を 用 いた６Ｈタグ(tag)の手段により検知された。グレーヴズ病患者の血清中のＴＳＨＲ自己抗体中和のアッセイ ：ＴＳＨＲ自己抗 体キットは、Kronus（San Clemente,CA）から購入した。このアッセイの中心は 、自己抗体が、ブタ甲状腺由来の可溶化されたＴＳＨＲに¹²⁵Ｉ−ＴＳＨが結合 するのに競合する能力である（“ＴＳＨ結合阻害”又はＴＢＩアッセイ）(25)。 要するに、可溶化されたＴＳＨＲ(50ml)を、患者の血清(50ml)とともに前もって 培養する(15分)。つぎに¹²⁵Ｉ−ＴＳＨを含む緩衝液を加える（室温、２時間） 。ＴＳＨと複合した可溶化ＴＳＨＲをポリエチレングリコールで沈殿させる。抗 体活性は、自己抗体を有しない正常人由来の通常の血清と比較した場合の¹²⁵Ｉ −ＴＳＨ結合阻害を百分率（％）として測定する。我々は、このアッセイをつぎ のように修正した。すなわち、グレーヴズ病患者由来の血清(25ml)を、ＴＳＨＲ エクトドメイン変異体を発現する細胞由来の調整された培地(25ml)と前もって培 養した（室温、３０分）。つぎに、可溶化されたＴＳＨＲ(50ml)を血清／培地混 合液(50ml)に加えた。コントロールとして、我々は、正常人由来の血清及び切除 型の甲状腺パーオキシダーゼ(thyroid peroxidase)を分泌するＣＨＯ細胞由来の 調整された培地を使用した(36)。レクチン吸着 ：異なるレクチンに対する調整された培地中のＴＳＨＲの結合が、 ３つのセファロース結合レクチン(Sepharose-linked lectin)、すなわち小麦胚 凝集素(Wheat germ agglutinin)（ＷＧＡ）、バンデイラエア シンプリフィシ フォリア（Bandeiraea simplificifolia）及びコンカナバリンＡ(Concanavalin A)（Ｃｏｎ Ａ）に対して測定された(Pharmacia，Piscataway,NJ)。培地(40ml) を、0.4mlのセファロース−レクチン(Sepharose-lectin)とともに室温で２時間 ゆっくりとかき混ぜた。つぎに、ビーズを、１０ｍＭトリス，ｐＨ７．５、１５ ０ｍＭＮａＣｌ及び３ｍｌの同じ緩衝液とともに放出された吸着物質（室温、４ ５分間かき混ぜ）でバッチで荒く洗浄した。吸着物質の緩衝液にはそれぞれ、０ ．２５Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミン(N acetyl-glucosamine)（ＷＧＡ）、２０ ｍＭａ−メチルガラクトピラノシド(a-metyl-galactopyranoside)(Ｂ．Ｓｉｍｐ ｌｉｆｉｃｉｆｏｌｉａ）、０．５Ｍ ａ−メチルマンノシド(a-methy-mannosi de)（Ｃｏｎ Ａ）を補った。物質(3ml)は、テキストに示すように希釈してニト ロセ ルロース膜(Schleicher and Schuell，Keene，NH)に滴下した。膜は、エアード ライの後、５０ｍＭトリス緩衝液，ｐＨ７．５及び５．０％スキムミルクパウダ ーを含む１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）中で培養し（４５分）、すすぎ、ｍＡ ｂ Ａ１０（１：１０００）及び０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む ＴＢＳ中で培養した（３７℃、２時間）。膜をすすぎ、アルカリホスファターゼ 結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ及び先に述べたようにして(34)発生させたシ グナルとともに培養した（室温、１時間）。ＴＳＨＲエクトドメイン変異体のイムノブロット： レクチン結合ＴＳＨＲ−２６ １、ＴＳＨＲ−２８９及びＴＳＨＲ−３０９を溶出し（上記）、０．７Ｍ（最終 濃度）のβ−メルカプトエタノール(β-mercaptoethanol)を含むLaemmliサンプ ル緩衝液(38)を加えた（４５℃、３０分）。Ｎ−グリコシダーゼＦ(N-glycosida se F)及びエンドグリコシダーゼＨ(endoglycosidase H)を用いた酵素的脱グリコ シル化は先に述べたとおりである(34)。ＳＤＳ、１０％ポリアクリルアミドゲル 上での電気泳動の後、蛋白は電気泳動的にＰＶＤＦ膜に移された。つぎにこの蛋 白を、ｍＡｂ Ａ１０中での培養が一晩かけたものである点と２番目の抗体を１ 〜２時間かけて加える点を除いては、先に述べたのと同様にして加工した。いく つかの実験では（例えばFig.22）、イムノブロットは、BioMax-CDS-PROキット(E astman Kodak，Rochester，NY)を用いて製造者のプロトコルに従い行った。オー トラジオグラフィーにはHyperfilm ECL(Amersham,Arlington Heights,IL)を用い た。ＴＳＨＲ−２６１の部分的精製： １０％ウシ胎児血清、抗生物質及び５ｍＭ酪酸 ナトリウムを含む非選択的Ｆ１２培地中で培養したＴＳＨＲ−２６１を発現する ＣＨＯ細胞から、調整された培地を得た(39)。培地（２リットル）を、70mlコン カナバリンＡセファロースカラムに適用した。１０ｍＭトリス，ｐＨ７．５，１ ５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄の後、結合した物質を、同じ緩衝液で、〜８０ｍｌの ０．１５Ｍ ａ−メチルマンノシド(a-methyl-mannoside)とともに溶出させた。 溶出させた物質を５０ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．２に混ぜ、２つの５ｍｌ Hi s-Trapカラムに連続して適用した(Pharmacia)。溶出には、１０ｍＭトリス，ｐ Ｈ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１００ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液を用いた 。Centriprep30(Amicon,Beverly,MA)を使用して、サンプルを濃縮し、緩衝液を １０ ｍＭトリス，ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌに交換した。すべての段階で、Ｔ ＳＨＲ−２６１の回収は、バイオアッセイ（ＴＢＩ中和；上記参照）によりモニ ターした。ＰＶＤＦ膜から取り出した、脱グリコシル化したＴＳＨＲ−２６１の Ｎ末端アミノ酸配列は、デーヴィス(Davis)にあるカルフォルニア大学の蛋白構 造研究所(Protein Structure Laboratory)によって決定された。結果 開裂ＴＳＨＲエクトドメイン変異体の分泌： ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、アミノ酸 残基２６１、２８９又は３０９で開裂されたＴＳＨＲエクトドメイン変異体をコ ードするプラスミドで安定にトランスフエクトした(Fig.17)。個々のクローンは 、希釈溶液を限定することにより得られ、また、トランスゲノム増幅は、メトト レキサート（最終濃度１０ｍＭ）中の成長に対する段階的馴化(progressive ada ptation)によって実現された。高度のＴＳＨＲ発現のために選択された、それぞ れ１つのＴＳＨＲエクトドメイン変異体のクローンを発展させ、さらなる研究に 利用した。 一晩追跡した後の免疫沈降によって検知されたように、かなりの程度Ｃ末端を 切除されたエクトドメイン変異体（ＴＳＨＲ−２６１）は、完全に培地中に分泌 され、細胞中にはレセプターは残っていなかった(Fig.18)。切除の程度の低いＴ ＳＨＲ−２８９は、中間程度分泌された。細胞中に残ったレセプターは、多様な 形態で存在し、その主要なバンドは分泌された形態よりも低い分子量を有してい た。最後に、切除の最も少ないエクトドメインのＴＳＨＲ−３０９については、 培地中への分泌は比較的不十分なものであった。すなわち、分泌されたレセプタ ーは、細胞中に残存したレセプターよりも比例的に少なく、後者は主に低い分子 量の形態であった。エクトドメイン変異体のＣ末端における６つのヒスチジン残 基の発現は、培養培地中に分泌された前駆体標識物質のニッケル−ＮＴＡ樹脂精 製によって確認された(Fig.18)。これに対して、ＴＳＨＲ変異体は、細胞中で明 白には同定され得なかったが、これはニッケル−ＮＴＡ樹脂が標識された細胞内 蛋白の大部分と結合したからであった（データは示されていない）。ＴＳＨＲとグレーヴズ病患者の血清中の自己抗体との相互作用 ：我々がＴＳＨＲ エクトドメインの分泌された形態を生産する主要な目的は、グレーヴズ病患者の 血清中のＴＳＨＲ自己抗体を用いた研究に適した物質を得ることであったため、 分泌されたＴＳＨＲエクトドメイン変異体を、この特性のために試験することが 重要であった。我々は、ＴＳＨ結合阻害（ＴＢＩ）アッセイを用いて、ＴＳＨＲ −２６１、ＴＳＨＲ−２８９及びＴＳＨＲ−３０９を発現する培養された細胞由 来の調整された培地が、グレーヴズ病患者の血清中の自己抗体活性を中和するこ とができるかどうかを試験した。これらのうち、ＴＳＨＲ自己抗体による¹²⁵Ｉ −ＴＳＨ結合の阻害を転換するという点からは、ＴＳＨＲ−２６１及びＴＳＨＲ −２８９は明らかに活性であった(Fig.19)。ＴＳＨＲエクトドメイン変異体のレクチンへの吸着 ：Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂は、ＣＨ Ｏ細胞によって組織培養培地中に分泌された、放射性標識されたＴＳＨＲの精製 には効果的であったが、この方法では、培地由来の未標識のＴＳＨＲ蛋白の精製 を行うことはできなかった。Ｎｉ−ＮＴＡは、イミダゾールとの非特異的な相互 作用やより低いｐＨでの吸着を最小化しようという試みにもかかわらず、多くの 未標識蛋白に結合した（データは示さず）。このため我々は、レクチンを用いて 、調整された培地由来のＴＳＨＲエクトドメイン変異体の部分的な精製を試みた 。調整された培地中のＴＳＨＲ−２６１は、小麦胚凝集素(wheat germ agglutin in)及びBandeiraea simplicifoliaにはわずかしか結合しなかった(Fig.20)。こ の物質のほとんどすべては、“フロー−スルー”(flow−through)にとどまり、 最小量のみが、特定の糖を用いた溶出によって回収された。対照的に、コンカナ バリンＡ(Con A)は、ＴＳＨＲ−２６１の培地からの抽出に効果的であった。 ＴＳＨＲ自己抗体とは相互作用しない、分泌されない全長ＴＳＨＲエクトドメ インは、未成熟の多価マンノース炭水化物を含み、Con Aに強く結合したため(34 )、我々は、Con AがＴＳＨＲ−２６１の不活性な高マンノース成分（おそらくは 、崩壊した細胞から放出されたものであろう）を抽出していたことを心配した。 幸いなことに、そうではなかった。すなわち、Con Aによって富裕化された(enri ched)ＴＳＨＲ−２６１は、調整された培地からｍＡｂ Ａ１０を用いて免疫沈 降された物質のように(Fig.18)、分泌されたレセプターがエンドグリコシダーゼ Ｈ抵抗性であり、エンドグリコシダーゼＦ感受性である（複合炭水化物）である こと を示した(Fig.21)。確かに、このパターンは、調整された培地から小麦胚凝集素 を用いて回収できた少量のＴＳＨＲ−２６１と同じであった(Fig.21)。最も重要 なことに、Con-Aによって富裕化された物質は、患者の血清中での自己抗体ＴＢ Ｉ活性を中和することに関し、高度に活性であった（これらの実験についてのデ ータは示さず；多様なグレーヴズ血清を用いたより広範な研究におけるＴＢＩ活 性に関する以下のデータ参照；Fig.24）。 ＴＳＨＲ−２６１に加えて、ＴＳＨＲ−２８９及びＴＳＨＲ−３０９も、Con Aを用いて培地から抽出された。イムノブロット(immunoblotting)から、ＴＳＨ Ｒ−２６１と同様に、ＴＳＨＲ−２８９及びＴＳＨＲ−３０９が成熟した複合炭 水化物だけを含むことが示された(Fig.22)。注目すべきことに、ＴＳＨＲ−２６ １は、全体の４０％が〜２０kDaのN−結合によりグリコシル化したものであった 。脱グリコシル化した蛋白（ＴＳＨＲ−２６１、ＴＳＨＲ−２８９、ＴＳＨＲ− ３０９のそれぞれについて、〜３０、３２、３４kDa）の見掛けの分子量は、そ れらの公知のアミノ酸配列（６Ｈタグを含む）から予想されるよりも、わずかに (^-2kDa)大きかった。同様の現象が、先に、脱グリコシル化したＴＳＨＲエクト ドメイン（1-418残基）を用いて観察された(34)。部分的に精製されたＴＳＨＲ−２６１による自己抗体の中和 ：先行する研究から 、免疫沈降、イムノブロットにより、又は自己抗体中和により、分泌されたＴＳ ＨＲ変異体が、定性的に検知されていた。しかし、患者の血清中でＴＳＨＲ自己 抗体と相互作用するレセプターの量を、定量的に決定することが重要であった。 この目的のために使用できるＴＳＨＲ標準品は無かった。確かに、哺乳動物細胞 由来のＴＳＨＲは、ポリアクリルアミドゲル上での直接的な視覚化のために十分 には生成されていなかった。我々は、さらなる研究のためにＴＳＨＲ−２６１を 選んだ。これは、３つのエクトドメイン変異体の中で、ＴＳＨＲ−２６１の分泌 が最大であり(Fig.18)、また、自己抗体認識という点からのＴＳＨＲ−２６１の “生物活性”(bioactivity)はＴＳＨＲ−２８９のそれと等しいように見えたか らである(Fig.19)。 自己抗体の中和によりモニターされたように、Con Aクロマトグラフィーは、 〜１００倍の第一の精製を与えた。つぎに、またその第一の捕集ステム(capture s tem)としての使用の場合とは異なり、Ｎｉ−キレートクロマトグラフィーは、ク マシーブルー染色による直接的な視覚化及び定量化のために充分なＴＳＨＲ−２ ６１を産生するのにかなり効果的であった（Fig.23,左欄）。酵素的な脱グリコ シル化は、^-20kDaの複合炭水化物を伴う-30kDaのポリペプチド主鎖という、イム ノブロットの証拠を確認し（Fig.23,右欄）、また、回収されたレセプターの量 を定量化するための最もよい手段を提供する。調整された培地２リットルからの 、３つの別々の調製では、ＴＳＨＲ−２６１の回収（４０％グルカンに対する修 正）は、0.3^-0.4mg/リットル(liter)であった。30kDaの脱グリコシル化バンドのアミ ノ酸シーケンシングによって、ＴＳＨＲのアミノ末端（Met,Gly,X,Ser,Ser,Pro, Pro;XはCys残基を表す）が確認された。ＴＳＨＲ−２６１のさらなる精製（Ｓｅ ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００）は、活性の多大な喪失を伴う（データは示さず） 。しかしながら、半精製ＴＳＨＲ−２６１（推定20^-40％の純度）は、-80℃にお いてかなり安定であった。 一部精製されたＴＳＨＲ−２６１は、患者の血清中におけるＴＳＨＲ自己抗体 ＴＢＩ活性を中和する高い能力を有する。中程度のＴＳＨ結合阻害（ＴＢＩ）活 性を有するグレーヴズ病患者由来の血清についての予備的な研究では、チューブ (0.15mg/ml)当たり30ngのTＳＨＲ−２６１が自己抗体活性を完全に中和した(Fig .24)。したがって、我々は、さらなる血清の研究ではチューブ(0.25mg/ml)当た り50ngのＴＳＨＲ−２６１を使用した。この濃度のＴＳＨＲ−２６１は、試験し た１８のグレーヴズ血清中で、ＴＳＨ結合阻害活性のすべて若しくはほとんどを 中和した(Fig.25)。IgG(150kDa)が二価であり、アッセイに加えたＴＳＨＲ−２ ６１分子の100％が自己抗体中和の能力があるという仮定に基づく、我々の有す る最も有力なグレーヴズ血清に関する研究で、我々は、この特定の血清中のＴＳ ＨＲ自己抗体の最大濃度を^-7mg IgG/mlと見積もる。ＴＢＩ及びフローサイトメ トリーのデータからは(40)、大部分のグレーヴズ血清は、この有力な血清よりも 10^-50倍低い自己抗体レベルを有している。そこで我々は、ＴＳＨＲ自己抗体濃 度は典型的には0.1^-1mg IgG/mlであると見積もる。この値は、過大評価となりが ちである。これは、アッセイにおいて100％の抗原結合は達成しにくいものだか らであり、また、ＴＢＩアッセイの温度である室温における適当なＴＳＨＲ−２ ６１の不安定 性によるものである。最後に、ＴＳＨＲ−２６１は、ＴＳＨＲ自己抗原により明 らかに認識されたが、それをＴＢＩキットのブタホロレセプター(porcine holor eceptor)の代わりとした場合には、¹²⁵Ｉ−ＴＳＨには結合しなかった（データ は示さず）。検 討 治療法の発達及びグレーヴズ病の潜在的な(potential)免疫療法は、比較的大 量の免疫活性な組換え抗原の利用性にかかっている。グレーヴズ血清と、バクテ リア、昆虫細胞又は無細胞翻訳による産生又は合成ペプチドとしてのＴＳＨＲ物 質との相互作用について多くの研究がなされてきた（イントロダクション参照） 。これらの研究のほとんどは、イムノブロット、免疫沈降又はＥＬＩＳＡによる 組換え物質の探知を含んでいたが、これらの手段は、この物質が機能的な自己抗 体と相互作用する能力を評価することはできないものである。少量の“機能的な ”ＴＳＨＲエクトドメイン物質が、ＴＳＨＲ ｃＤＮＡを含む組換えバキュロウ イルスに感染した昆虫細胞中(15)及び安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞 中(33,34)に存在する。ごく最近になって、バキュロウイルス系で産生されたＴ ＳＨＲエクトドメインが、グレーヴズ病患者の血清中でＴＳＨ結合阻害（ＴＢＩ ）活性を中和することができることが確認された(16)。しかしながら、この物質 は大部分が不溶性であり、活性成分は同定されず、またその炭水化物（複合対多 価マンノース）は決定されなかった。 我々の経験では、哺乳動物細胞由来の組換えＴＳＨＲが、自己抗体との相互作 用において最も効果的である。この結論に対する最も強力な証明は、いまだに天 然のブタ甲状腺抽出物が標準的な臨床のＴＢＩアッセイにおいて使用されている ということである。ＣＨＯ細胞におけるＴＳＨホロレセプター(holoreceptor)の 過剰発現(32)は天然の洗浄剤抽出物を産生し、これはブタ甲状腺抽出物(41)の効 能と匹敵するか又はこれを超えるものである。しかしながら、この膜を伴う物質 は、構造研究における大規模な精製には使用できず、また、将来のＴＳＨＲ自己 抗体の直接的（間接的なＴＢＩに対して）なアッセイに使用するのは困難であろ う。 現在我々は、哺乳動物細胞中で、分泌された可溶性の複合炭水化物を含む形態 のＴＳＨＲエクトドメインを産生することがこれまでできなかったという問題(3 3,34)を克服した。分泌されない、高マンノースを含んだエクトドメイン(34)と は異なり、Ｃ末端が切除されたＴＳＨＲエクトドメイン変異体は、自己抗体によ って認識される。複合炭水化物がＴＳＨＲ自己抗体のエピトープの一部から構成 されているのかどうか、“高マンノース”(high mannose)エクトドメインの自己 抗体認識の欠如が不正確なポリペプチドの折りたたみ(polypeptide folding)（ 及び、これによるエンドプラズム・レチキュラム(endoplasmic reticulum)）(42 ,43)にとって二次的なものであるかどうかについては現在のところまだ分かって いない。ＴＳＨＲ変異体と類似した位置（アミノ酸残基２９４）における、ＬＨ ／ＣＧレセプターエクトドメインのＣ末端切除が、分泌されない蛋白を産生する ことは興味深いことである（又、矛盾したものである）(44)。一方、残基３２９ 又はそれよりも下流で切除されたＬＨ／ＣＧレセプターは、限られた程度分泌さ れた(45,46)。交互にスプライスされた切除型のＴＳＨＲ ｍＲＮＡが甲状腺組 織で検知されているが(47,48)、これらの転写が実際に発現されるかどうか、ま た、もしそうであるとすれば甲状腺細胞(thyrocytes)によって分泌されるかどう かについては分かっていない。 ＴＳＨＲ−２６１のレクチン特異性は、洗浄剤で可溶化された甲状腺膜からの ＴＳＨホロレセプター活性の抽出についての先のデータと部分的に合致する。こ の先行する研究において、B.SimplificifoliaはウシＴＳＨＲには効果的であっ たが、ヒトＴＳＨＲにはそうではなかった(49)。ヒトＴＳＨＲエクトドメイン変 異体とは異なり、ウシＴＳＨホロレセプターは、小麦胚凝集素(Wheat germ aggl utinin)によってもよく結合され、また、コンカナバリンＡによって不可逆的に 結合された(49)。ＴＳＨＲ−２６１の精製にとって、それ自身によるレクチン・ クロマトグラフィーは充分なものではなかった。将来は、ｍＡｂを用いた一段階 アフィニティー・クロマトグラフィーが好ましい方法となるであろう。今のとこ ろは、ネズミＩｇＧクラスｍＡｂが、原核生物若しくは昆虫細胞由来のＴＳＨＲ による免疫処置によって産生された(7,37,50,51)。残念なことに、たいていのｍ Ａｂ（我々が２つの異なる研究室で試みた６つを含む）(7,37)は、グレーヴズ病 の免 疫学的研究にとって必要な自然発生の(native)、成熟した哺乳動物ＴＳＨＲを認 識しない。将来の、複合炭水化物を含むＴＳＨＲ−２６１による、又はＭＨＣク ラスII分子(52)を伴うＴＳＨＲを発現する哺乳動物細胞による免疫処置は、この 問題を克服するかもしれない。 ＴＳＨＲ−２８９がＴＨＳＲ−２６１の利点の多くを共有すること、及び、室 温の下数時間で活性を喪失するＴＳＨＲ−２６１にくらべてより安定であり得る ことが、いま現在測定されている。このように、本発明においてはＴＳＨＲ−２ ８９は好ましいものであり得る。但しＴＳＨＲ−２６１は、いくらかはより効果 的に分泌される。２６１〜３０９における他の切除もまた、本発明の範囲に含ま れ、それらは、本発明の教示するところを読み、理解した当業者により不当な実 験を強いることなく利用され得る。 ＴＳＨＲ−２６１の自己抗体反応性により、３０年近く前の観察が思い出され る。すなわち、凍結し、解凍した甲状腺組織が、ＴＳＨＲ自己抗体を中和する、 水に可溶な因子（ＬＡＴＳ吸収活性；ＬＡＡ）を放出するというものである(53, 54)。ＬＡＡは（ＴＳＨＲ−２６１と同様）、^-50kDaと見積もられた(54)。より 最近になって、トリプシンにより放出されたＴＳＨＲのフラグメントが、ＴＳＨ Ｒ自己抗体を中和するのが観察された(55)。しかしながら、凍結−解凍(freeze- thawing)又はトリプシンのいずれによっても、生産されたＬＡＡ活性を伴うＴＳ ＨＲのセグメントは分かっていない。 特定量の哺乳類抗原を使用する、グレーヴズ病患者の血清中のＴＳＨＲ自己抗 体の定量的中和についての先行する研究は存在しない。自己抗体中和に必要とさ れる非常に少量(ng)のＴＳＨＲ−２６１は、合成ペプチドでの研究で使用される よりも数桁低いものである。この定量上の情報は、バクテリア及び昆虫起原の精 製されたＴＳＨＲの能力を判定するための将来の尺度として有用となるであろう 。ＴＳＨＲ自己抗体中和に必要な抗原の量が微量であることの結果として、従前 のフロー・サイトメトリーデータに一致して(40)、患者の血清中の自己抗体濃度 は、きわめて低い。ＴＳＨＲと甲状腺パーオキシダーゼ自己抗体の濃度における 大きな差異は、グレーヴズ病の病因を理解する上で有意なものである(56)。 ＴＳＨＲエクトドメイン変異体ＴＳＨＲ−２６１は、その自己抗体中和活性能 力にもかかわらず、ＴＳＨに結合しない。ＴＳＨＲ上のＴＳＨ結合部位は不連続 であり、残基２６１の下流のセグメントを含めて(26,57)、全エクトドメインに 及ぶ複数のセグメントを含む。したがって、ＴＳＨＲ抗体エピトープは、ＴＳＨ 結合部位よりもさらに限定されている。この見解に対する支持は、全ＴＳＨＲエ クトドメインに対するＴＳＨの結合は無視できるかまたは存在しないという、全 部ではないが(58,59)、殆どの(9,15,33,34)実験室からのデータによって与えら れている。驚くべきことに、ＴＳＨとは対照的に、ｈＣＧは、同族受容体のエク トドメインが炭水化物を欠く場合においても、その単離された同族受容体のエク トドメインに高い親和性で結合する（60で再検討された）。このように密接に関 連した受容体間の大きな差異に対する理由は不明である。ＴＳＨＲ−２６１によ る今回のデータはまた、キメラＴＳＨ−ＬＨ／ＣＧ受容体を使用して得られた、 自己抗体に対するエピトープもまた不連続であり、残基２６１の下流に延びる(2 6)という従来の証拠と調和させねばならない。このパラドックスに対する１つの 可能な説明は、ＴＳＨＲ−２６１は、グレーヴズ病患者の血清中の殆どのＴＳＨ Ｒ反応性を中和するのに充分な、不連続なエピトープの支配的部位を含むという ものである。 要約すると、カルボキシ末端の段階的切断は、ＣＨＯ細胞による成熟、複合炭 水化物により修飾されたＴＳＨＲエクトドメインの分泌を導く。最も重要なこと は、ＴＳＨＲ−２６１はＴＳＨＲ自己抗体と高度に相互作用する潜在能力がある ことである。抗原的に活性なＴＳＨＲは、グレーヴズ病の診断、病因及び免疫治 療についての将来の研究に大きな刺激を与えるであろう。 実施例５：血清中の甲状腺刺激ホルモンレセプター自己抗体は甲状腺ペルオキシ ダーゼ自己抗体よりもずっと低いレベルで存在する：フローサイトメトリーによ る分析 本実施例は、自己免疫性甲状腺疾患患者の血清中のＴＳＨＲ自己抗体はＴＰＯ 自己抗体よりもずっと低いレベルで存在するという見解に対する最強の支持とな るデータを提供する。この発見は、ＴＳＨＲ自己抗体の診断検定とグレーヴズ病 の病因を理解する上で、重要な意味を持つ。前置き 現在では、グレーヴズ病患者の血清中の甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳ ＨＲ）に対する自己抗体は、間接的な手法、即ちそれらが放射性標識したＴＳＨ 結合を阻害する能力により、最も有効に検定される（１）。長年にわたって、Ｔ ＳＨＲ自己抗体のその抗原に対する結合を直接検定する研究は困難を伴うもので あった。例えば、患者の血清を伴う甲状腺組織や細胞抽出物のイムノブロット法 や免疫沈殿法は（２、３）、現在知られているＴＳＨＲの構造と一致する抗原を 明らかにはしていない。単層培養における甲状腺細胞を用いた間接免疫蛍光検査 がわずか２種の高度に選択された血清について観察された（４）。組換えＴＳＨ Ｒ調製物を使用しても、血清自己免疫抗体とＴＳＨＲ間の直接の相互作用を立証 することは困難であった。したがって、抗原（５〜７）は抗体（８）のいずれか を事前精製するか、又は細胞を含まない翻訳物の使用（９）が必要であった。こ の自己抗体での困難性は、免疫化した動物由来の抗体、特にモノクローナル抗体 （１０〜１３）による優れたＴＳＨＲの認識と対照をなす。 ｉ）低いＴＳＨＲ濃度、ii）抗原の立体配座上の完全性に対する要求、iii） ヒト血清中のポリクローナル抗体で観察される高いバックグランド、及びiv）低 い自己抗体力価を含む、数多くの因子が直接的手段によってＴＳＨＲ自己抗体結 合を検定する際の困難性に寄与しているのであろう。甲状腺ペルオキシダーゼに 対する自己免疫は非常に高い濃度で存在し得る（１４）。初期の研究は、ＴＳＨ Ｒ自己抗体が血清中で非常に高い濃度（全ＩｇＧの２〜３％）で存在することを 示唆した。最近では、グレーヴズ病患者におけるＴＳＨＲ自己抗体特異性Ｂ細胞 の少なさに一致して（１６）、免疫蛍光データはＴＳＨＲ自己抗体濃度が低いも のであろうことを示唆する（４、１７）。ＴＰＯとＴＳＨＲ自己抗体を検出する 異なるアッセイ法の使用は、同じ血清におけるそれらの濃度の直接の比較を妨げ てきた。 本研究において、我々はこれらの障害のうちの２つ、即ちＴＳＨＲ濃度と構造 上の完全性を克服する、新規なＴＳＨＲ発現哺乳類セルラインを使用した。即ち 、ＴＳＨＲ−１０，０００チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、生体 内でその表面で多数の成熟ＴＳＨＲを発現する（１８）。これらの細胞を使用し て、我々は今回、フローサイトメトリー法により、少数の患者の血清中の自己抗 体の天然型ＴＳＨＲへの結合を直接検出する能力について報告する。しかしなが ら、同じ血清中の甲状腺ペルオキシダーセ（ＴＰＯ）自己抗体のフローサイトメ トリー分析は、ＴＳＨＲ自己抗体がＴＰＯ自己抗体よりもずっと低い濃度で存在 することを示す。この発見は、ＴＳＨＲ自己抗体の診断検定とグレーヴズ病の病 因を理解する上で、重要な意味を持つ。方 法 フローサイトメトリーに使用された血清：ボストンのニューイングランド メ ディカル センター ホスピタルのステファニー、リー博士により提供されたＢ Ｂ１血清は、遮断抗体の発達に伴って甲状腺機能が低下したグレーヴズ病患者由 来のものであった。カリフォルニア州サン ジュアン カピストラノのコーニン グ・ニコルス インスティテュートのジュアン、テルセロ氏から我々に３０個の 血清が提供された。これらの血清は、グレーヴズ病の疑いのもとに、臨床上の情 報なしにＴＳＨＲに対する自己抗体のアッセイに供された。３０個の血清中１０ 個がＴＳＨＲ自己抗体不存在として選択され、１０個が中程度のＴＳＨＲ結合阻 害（ＴＢＩ）活性存在として、そしてさらに１０個が高い（＞５０％）ＴＢＩ活 性として選択された。４人の実験室の人間が明らかに自己免疫性の甲状腺疾患を 持たない人間由来の血清供給源となり、そして４個の血清は抗ＤＮＡ及び／又は 抗カルジオリピン抗体を有する全身性エリテマトーデス患者由来のものであった 。 全ての血清は、我々の実験室で商業的に入手可能な試薬キット（Ｋｒｏｎｕｓ 、サンクレメンテ、カリフォルニア）を使用してＴＢＩ活性を試験された。コー ニ ング・ニコルスから得られた３０個の血清は同じアッセイ法によりあらかじめ試 験され、非常に近い結果が得られた。選択された血清のＴＳＨＲ自己抗体力価は 、自己免疫性甲状腺疾患歴を持たず検出不能なＴＳＨＲ自己抗体活性を有する正 常人由来の血清で、これらの血清を希釈することによって測定された。血清は^{12 5} Ｉ−ＴＰＯ（組換え）を使用して、以前に述べたようにして（１９）、ＴＰＯ 自己抗体についても試験された。 ＴＰＯ及びＴＳＨＲ細胞発現：ヒトＴＳＨＲ及びＴＰＯの過剰発現のためのプ ラスミドの構築とチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）の安定なトランフェク ションは他所で記述されている（１８、２０）。これらの細胞は、トランスフェ クトされていないＣＨＯ細胞（ＤＧ４４：カリフォルニア州パロ アルトのスタ ンフォード大学ロバート、シムケ博士から提供された）とともに、１０％牛胎児 血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及び アムホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍｌ）を補充したハム（Ｈａｍ）のＦ−１２培 地中で増殖された。 フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）：患者の血清を分析するために、細胞 は、改変を加えて、患者の血清とヒトモノクローナル抗体を使用しＣＨＯ細胞に おけるＴＰＯ発現で以前に記述したように（２１、２２）、処理された。簡単に 述べると、温和なトリプシン化による分離後に、細胞はペレット化され、上記の ように牛胎児血清と抗生物質で透析されたハムのＦ−１２培地中に浸された（５ 分間、１００×ｇ）。予備吸着のために、トランスファクトされていないＣＨＯ 細胞は０．１８ｍｌの緩衝液Ａ（リン酸塩緩衝液、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４、０．０５％ナトリウムアジド及び５６℃で３０分間熱不活性化した２％ 牛胎児血清）に再懸濁された。血清（２０μｌ）を添加し（最終濃度１：１０、 又はテキスト中に規定したように）、緩やかに４℃で６０分間混合した。遠心分 離により細胞を除去した後に、血清は２個の０．１ｍｌの画分に分けられた。１ つの画分は、ＴＳＨＲ又はＴＰＯのいずれかを発現するＣＨＯ細胞に添加され、 他の画分はトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞に添加された。４℃で６０ 分間培養した後に、細胞は緩衝液Ａ中に３回浸され、同じ緩衝液０．１ｍｌ中に 再懸濁された。アフィニティ精製したヤギ抗ヒトＩｇＧ（１．５μｌ）（Ｆｃ特 異性、フルオレスセイン イソチオシアネート結合体；Ｃａｌｔａｇ、南サンフ ランシスコ、カリフォルニア）が４℃で４５分間で細胞に添加された。緩衝液Ａ で３回洗浄後、細胞はベクトン ディッキンソン製ＦＡＣＳｃａｎ−ＣＥＬＬＱ ｕｅｓｔシステムを使用して分析された。３種のパラメーター（前方スキャッタ ー（ｓｃａｔｔｅｒ）、ＦＳＣ、９０°サイドスキャッター、ＳＳＣ、及びＦＬ １ディテクター）が分析に使用された。全アッセイは第２の抗体のみと正常人由 来の血清で処理された細胞を含んでいた。全ての血清はフローサイトメトリーに より少なくとも２回分析された。 ＴＳＨＲに対するマウスモノクローナル抗体（Ａ９及びＡ１０）（１：１００ 最終濃度）（１３）及びウサギ抗血清（１：６０最終濃度）（Ｒ８）（２３）（ 全て英国ロンドンのポール、バンガ博士の提供による）を使用したＴＳＨＲ−１ ０，０００細胞上でのＴＳＨＲの検出は、ヒト血清に対して記載されたプロトコ ールに従ったが、例外として次の第２の抗体を使用した：ｉ）アフィニティ精製 ヤギ抗マウスＩｇＧ（０．８μｌ）（フルオレスセイン イソチオシアネート結 合体）及びｉｉ）アフィニティ精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ（０．５μｌ）（フルオ レスセイン イソチオシアネート結合体）、両者ともカリフォルニア、南サンフ ランシスコのＣａｌｔａｇ製。結 果 ＴＳＨＲ発現ＣＨＯ細胞のフローサイトメトリー分析：我々は以前には、グレ ーヴズ血清を使用してＣＨＯ細胞の表面上で安定に発現されたＴＳＨＲを検出す ることはできなかった。しかしながら、最近次の２つの試薬が入手可能となった 。即ち、非常に多数のＴＳＨＲ（２×１０⁶に近い）をその表面で発現するＣＨ Ｏ細胞と、間接ＴＳＨ結合阻害（ＴＢＩ）アッセイに特に効力のあるグレーヴズ 血清（ＢＢＩ）である。この血清を使用して、ごく少量の特異的シグナル（トラ ンスフェクトされていない細胞のコントロールに関連）が、我々の細胞あたり〜 １６，０００ＴＳＨＲを発現するオリジナルライン（２４）によって検出された （図２６Ａ）。同じ血清を使用して、より強いシグナルが細胞あたり〜１５０， ０００ＴＳＨＲを発現するラインによって観察された（ＴＳＨＲ−０：以前５’ ３’ＴＲ−ＥＣＥと命名）（２５）（図２６Ｂ）。段階的に増大する特異的な蛍 光は、それぞれ細胞あたり〜１０⁶及び１．９×１０⁶のレセプターを発現するＴ ＳＨＲ−８００及びＴＳＨＲ−１０，０００細胞で明らかであった（１８）（図 ２６Ｃ及び２６Ｄ）。以前は放射性標識されたＴＳＨ結合及びＴＳＨ−伝達シグ ナル導入によって決定された（１８、２４、２５）、トランスフェクトされたＣ ＨＯ細胞の表面でのＴＳＨＲ抗原の発現は、ＴＳＨＲに対するウサギポリクロー ナル抗血清（Ｒ８）を使用することによって確認された（図２７Ｃ）。ネズミの モノクローナル抗体（Ａ９及びＡ１０）（１３）は、細胞表面上の天然型ＴＳＨ Ｒの認識にはより効果が小さいものであった（図２７Ａ、２７Ｂ）。したがって 、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞が、以後の天然型抗原への直接結合により他の患 者の血清中のＴＳＨＲ自己抗体の検出のための試験に使用された。 異なる血清中でのＴＳＨＲ自己抗体を検出するためのＴＳＨＲ−１０，０００ 細胞の使用 ：予備実験において、我々はいくつかの血清がＴＳＨＲ自己抗体を含 むか否かにかかわらず、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞によるフローサイトメトリ ーで高い蛍光を発するのを観察した。我々は、これらの血清をＴＳＨＲを発現し ないトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞で培養した時に、同様の高い蛍光 を観察した（データは開示せず）。したがって、いくつかの血清はＣＨＯ細胞の 表面における未知の抗原に対する抗体を含んでいた。このために、我々は、予備 吸着工程を設定し、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞に添加する前に、血清をトラン スフェクトされていないＣＨＯ細胞で予備培養した。予備吸着は、この非特異性 バックグラウンドを除去するかまたは大幅に減少させるのに有効であった。例え ば、予備吸着なしでは、高ＴＢＩ値（８１．７％）を有する血清（７Ｈ）は、Ｔ ＳＨＲ自己抗体を有さない血清のシグナルに関連するＴＳＨＲ−１０，０００細 胞における強いシグナルを誘発した。しかしながら、予備吸着後には、この表面 的には陽性の血清における活性は、明らかに非特異性のものであった（図２８Ｂ ）。対照的に、ＢＢ１のような血清では（上記参照）、予備吸着は現実にシグナ ルの特異性を高めた（図２８Ｃ及び２８Ｄ）。 我々は、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞上で予備吸着した後に、Ｔ ＳＨ−１０，０００細胞と３９個の血清のトランスフェクトされていないＣＨＯ 細胞の相互作用を検討した（表１）。血清ＢＢ１に加えて、このパネルは、ＴＢ Ｉ活性を有さない（１〜４．２％阻害）１０個の血清（１Ｌ〜１０Ｌ）；中程度 のＴＢＩ値を有する（１７．３〜３９．４％阻害）１０個の血清（１Ｍ〜１０Ｍ ）；高いＴＢＩレベルを有する（５２〜９５．１％阻害）１０個の血清（１Ｈ〜 １０Ｈ）；自己免疫性甲状腺疾患を有さない４人の正常人及び抗ＤＮＡ及び／又 は抗カルジオリピン抗体を有する４人の全身性エリテマトーデス患者を含んでい た。正常人、陰性ＴＢＩ値を有する人又は全身性自己免疫性患者由来の血清はい ずれもフローサイトメトリーで陽性のシグナルを生じなかった。驚いたことに、 ＢＢ１（非常に高いＴＢＩ活性として選択された）を含めてＴＢＩ陽性の２１個 の血清のうち４個のみが（１０Ｍ、３Ｈ及び１０Ｈ）、多数のレセプターを発現 する細胞を使用したフローサイトメトリーで、明白にＴＳＨＲを認識した（表１ ）。 血清ＢＢ１、１０Ｍ、３Ｈ及び１０Ｈで観察されたＴＳＨＲ−１０，０００細 胞上でのＦＡＣＳシグナルの特異性は、トランスフェクトされていない細胞にお けるよりも、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞における予備吸着に続く信号のバック グラウンドへの返信により明らかであった（図２９）。 フローサイトメトリーにおいてＴＳＨＲに対して陽性の４個の血清中のＴＳＨ Ｒ自己抗体力価は、ＴＢＩアッセイにより測定された（表２）。これらの細胞の 希釈は、ＢＢ１及び１０Ｈは、フローサイトメトリーにおいてそれらの強い蛍光 シグナルと一致する、同様の高いＴＳＨＲ自己抗体力価を有することを示した。 血清３Ｈの低いＴＢＩ力価は、又その相対的に低い蛍光シグナルと一致した。驚 くべきことに、最も低いＴＳＨＲ自己抗体力価を有する血清１０Ｍは、この血清 中にＴＳＨ結合を阻害しないＴＳＨＲに対する「中性の」自己抗体の存在の可能 性を示す、フローサイトメトリーにおける強いシグナルを発生した。 フローサイトメトリーにより検出されたＴＰＯ自己抗体：フローサイトメトリ ーによりＴＳＨＲを明白に認識することのできる血清の数が少ないことに鑑み、 我々はその表面でＴＰＯを過剰発現するＣＨＯ細胞を使用する同じ手法によって 、同じ血清中のＴＰＯ自己抗体について検討した（２０）。ＴＰＯ自己抗体は、 一般にＴＳＨＲ自己抗体と共存する。実際、２０個のＴＢＩ陽性血清（１−１０ Ｍ及び１−１０Ｈ）のうち、１９個が、正常人の血清中で検出された上限（２． ６％結合）をはるかに上回り、１３％を超えて¹²⁵Ｉ−ＴＰＯに結合した（表１ ）。さらに、この方法によれば、ＴＢＩ陰性血清（７Ｌ及び１０Ｌ）のうち２個 も、またＴＰＯ自己抗体陽性であった。驚くべきことに、検出可能なＴＰＯ自己 抗体を有する２０個の血清全てが、ＣＨＯ−ＴＰＯ細胞によるフローサイトメト リーで明らかに陽性であった。フローサイトメトリーにより、より多くの血清が ＴＳＨＲに対するよりもＴＰＯに対して陽性であっただけではなく、正味の蛍光 （トランスフェクトされていない細胞による蛍光を減じた後）は、ＴＳＨＲ発現 細胞よりもＴＰＯ発現細胞ではるかに高かった（表１）。ＴＳＨＲ−１０，００ ０細胞のように、ＴＰＯを過剰発現する細胞（ＴＰＯ−１０，０００）は、その 表面で〜２×１０⁶ＴＰＯ分子を有する（未発表データ）。 我々は、フローサイトメトリーによって最高のＴＳＨＲ自己抗体レベルを有す る血清（ＢＢ１）が、蛍光シグナルを失う前にどの程度まで希釈できるかを測定 するための検討を行った（図２９）。正常人由来の血清も同様に希釈された（白 抜きのヒストグラム）。両方の血清が、試験された全ての希釈度において、ＴＳ ＨＲ−１０，０００細胞で培養する前に、トランスフェクトされていないＣＨＯ 細胞上で予備吸着された。ＢＢ１の蛍光シグナル（図３０：左側のパネル、陰影 を付したヒストグラム）は、希釈するにつれて段階的に消失した。１：１０では 、正味のシグナル（ＢＢ１−正常血清）は２７６．３蛍光ユニットであった。１ ：１０００では、ＢＢ１はごく微小なシグナル（正味の蛍光７．３ユニット）を 発した。同じ吸着された血清をＴＰＯ−１０，０００細胞で培養すると、正味の 蛍光は１２４０．９から２４３．６蛍光ユニットに減少した（図３０：右側パネ ル、陰影を付したヒストグラム）。それぞれ、１：１０００及び１：１０に希釈 したときの、ＴＰＯ自己抗体及びＴＳＨＲ自己抗体に対する同様の蛍光（２４３ ．６及び２７６．３ユニット）が明らかでった。したがって、フローサイトメト リーによれば、ＢＢ１血清中のＴＰＯ自己抗体の力価は、同じ血清中のＴＳＨＲ 自己抗体力価よりも〜１００倍高いものである。 多数の血清で、ＴＳＨＲ−１０，０００又は（共通性は少ない）ＴＰＯ−１０ ，０００細胞による蛍光は、トランスフェクトされていない対照細胞によるもの よ りも低いものであり、負の「正味の」蛍光値（表１）となったことに留意すべき である。このいくつかの対照細胞での血清によって発せられる、より大きい蛍光 は、より厳しい吸着によっても除去できなかった（データは開示せず）。 検 討 最近ヒトＴＳＨＲを過剰発現するＣＨＯ細胞が入手可能となったこと（１８） によって促進された、本研究は、ＴＳＨＲに対するＩｇＧクラスの自己抗体がフ ローサイトメトリーによって直接検出できることを証明する。しかしながら、フ ローサイトメトリーによる明白なシグナルは、その高いＴＳＨＲ自己抗体活性に 基づいて選択された数個を含めて、２１個のＴＢＩ陽性血清中の４個についての み得られた。実際、これらの血清中１１個は高いＴＢＩレベル（＞５０％阻害） を有していた。ＴＳＨＲ自己抗体とは対照的に、¹²⁵Ｉ−ＴＰＯ結合によって検 出されたＴＰＯ自己抗体を有する２０個の血清全てが、ＴＰＯ発現ＣＨＯ細胞を 使用したフローサイトメトリーで強い陽性シグナルを与えた。 数系統の証拠は、ＴＰＯ自己抗体と対比して、フローサイトメトリーによるＴ ＳＨＲ自己抗体検出の低い頻度と幅の原因となる因子は、血清中でのＴＳＨＲ自 己抗体のきわめて低い濃度であることを示唆する。第１に、天然型コンフォーメ ーションで非常に多数のＴＳＨＲを発現する細胞が入手可能となったことが、適 切な検出のためには抗原が不充分という制約を排除する。その結果、ＴＳＨＲ− １０，０００細胞とＴＰＯ過剰発現ＣＨＯセルラインの両者が、それらの表面で 同様の数(〜２×１０⁶）の特異的抗原分子を有する。第２に、ＴＳＨＲ自己抗体 で観察される弱いシグナルは、抗原に対する弱い親和性によるものであるとする ことはできない。したがって、それらの親和性は直接測定されてはいないとして も、それらはＴＳＨＲに対するＴＨＳ結合の高い親和性（〜１０^-10Ｍ）と競合 し得るものである。ＴＰＯ自己抗体は、それらの抗原に対するのと同様の親和性 を有することが知られている（２６で概説）。最後に、ＴＳＨＲ自己抗体に対し て能力のある血清を１，０００倍に希釈すると、フローサイトメトリーにおける そのシグナルは殆ど除去されるが、一方同じ希釈度で、この血清中のＴＰＯ自己 抗体は非常に強いシグナルを発し続けた。 いくつかの血清で観察された、ＴＳＨＲ−１０，０００細胞に対する「正味で 負の」蛍光についての理由は不明である。この現象についての１つの可能な説明 は、ＴＳＨＲまたはＴＰＯ発現の高いレベルが、これらの血清により認識される ＣＨＯ細胞中のもう１つの未知の抗原の発現を消失させるというものである（２ １）。この抗原の発現は、例えば、増幅過程で生産された多数のトランスゲノム コピーの１つによるその遺伝子の開裂によって、消失させられ得る。多分、ＴＰ Ｏ自己抗体陽性血清で観察される非常に高い蛍光が、負の正味の蛍光現象を隠す のであろう。 今回の発見は、ＴＳＨＲｃＤＮＡを安定に発現するＣＨＯ細胞での間接的な免 疫蛍光によって、ＴＳＨＲ自己抗体を検出できないことに基づいた、我々の以前 の血清中の低いＴＳＨＲ自己抗体レベルの仮説（１７）を確認する。我々のデー タは、２つの例外的に能力のあるグレーヴズ血清のみによって培養された甲状腺 細胞での免疫蛍光シグナルの検出（４）と一致する。面白いことに、穏やかなＴ ＢＩ活性のみを有する血清（１０Ｍ）中でのフローサイトメトリーによるＴＳＨ Ｒ自己抗体の検出は、ＴＳＨ結合サイトへの自己抗体に加えて、いくつかのＴＳ ＨＲ自己抗体がこの領域外のエピトープを認識するという見解に対する支持を与 える。 血清中のＴＳＨＲ自己抗体の非常に低い濃度は、様々な意味を持つ。第１に、 我々の発見は、イムノ・ブロット法又は免疫沈殿法によって、グレーヴズ血清を 使用してＴＳＨＲを検出する際のこれまでの困難性を説明する。第２に、データ は、ＴＰＯ及びサイログロブリン自己抗体に比較して、生体外で患者のリンパ球 によるＴＳＨＲ自己抗体合成や分泌を検出する、より小さい能力（２７、２８） をも説明する。このＴＳＨＲ特異性Ｂリンパ球及びプラズマ細胞の低い頻度は、 またＩｇＧクラスのＴＳＨＲに対するヒト モノクローナル自己抗体を得る際の 大きな困難性にも寄与しているようである１（２９で概説）。第３に、フローサ イトメトリーは、ＴＳＨＲ自己抗体を検出するために現在使用されている臨床ア ッセイの代替物として使用することはできない。第４に、より重要なことは、精 製された抗原を使用したとしても、臨床に関連するＴＳＨＲ自己抗体の直接的な 結合アッセイを確立することは、困難なようである。 結論として、今回のデータは、自己免疫性甲状腺疾患患者の血清中のＴＳＨＲ 自己抗体は、ＴＰＯ自己抗体よりもずっと低いレベルで存在するという見解に対 する最強の支持を与える。この発見は、グレーヴズ病の病因を理解するための将 来の研究に重要な意味を持つ。したがって、以前に仮説したように（１７）、血 清中のＴＳＨＲ自己抗体の低い濃度は、長年にわたってしばしば存在したもので はあるが、それらが自己免疫性過程の初期段階で発生することを示唆する。この 見解に対する支持は、制限されたカッパー又はラムダ軽鎖の使用（３０〜３２） 、及び数人の患者におけるＴＳＨＲ自己抗体のＩｇＧ１サブクラスに対する相対 的な制限（３３）によって与えられる。 実施例６：レセプターサブユニット構造の進化上に分岐におけるＮ−結合グリコ シル化の意味 甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）及びルトロピン／絨毛膜（ｃｈｏ ｒｉｏｎｉｃ）ゴナドトロピンレセプター（ＬＨ／ＣＧＲ）は、糖蛋白ホルモン リガンドを有するＧ蛋白結合レセプターファミリーの密接に関連したメンバーで ある。ＴＳＨＲとＬＨ／ＣＧＲの両者は、ロイシンに富む繰返し単位を有する、 巨大で高度にグリコシル化されたエクトドメイン１（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）を 有し、多数のエクソンによってコードされる（１−３）。それらの共通の進化背 景にもかかわらず、それらのリガンドの特異性を別にしても、これらのレセプタ ーはいくつかの明白な差異を有する。例えば、ＴＳＨＲに対する病因となる自己 抗体は一般的であるが、一方ＬＨ／ＣＧＲに対する自己抗体は極端に少ない。し たがって、自己抗体によるＴＳＨＲの嵌入は、ヒトにのみ影響を与える器官特異 性自己免疫性疾患である、グレーヴズ病における甲状腺中毒の直接の原因である 。他の驚くでき差異が構造レベルで存在する。完全な細胞表面へのＴＳＨの架橋 によって検出されるように、機能性ＴＳＨＲは２つの形態、１本鎖レセプター及 び２つのサブユニットを有するレセプターとして存在する（４、５）。対照的に 、ＬＨ／ＣＧＲは１本鎖形態でのみ存在する（６で概説）。ＴＳＨＲの１本鎖と ２つのサブユニット形態の種々の割合が、哺乳類の細胞抽出物の免疫沈殿又はイ ムノ・ブロット法で観察された（７〜１１）。２つのサブユニットＴＳＨＲは、 リ ガンド結合性のグリコシル化されたＡサブユニットとジスルフィド結合により結 合した膜関連Ｂサブユニットを含む（１２）。ＴＳＨＲは単一のｍＲＮＡ種によ ってコードされているので（１３〜１６）、Ａ及びＢサブユニットは基質メラト プロテアーセ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｌｌａｔｏｐｒｏｔｅａｓｅ）を含むと信じ られるプロセスである、分子内開裂によって形成されるにちがいない。 最近の証拠は、ＴＳＨＲのＡ及びＢサブユニットへの開裂は、以前に考えられ ていたように単一の部位で生じるのではなく、現在知られている７個の膜にまた がるセグメントを有するＧ蛋白結合レセプターのファミリーメンバーに特有の性 状である、２つの部位で生じるという（１８）、驚くべき可能性を提起した。 今回の研究で、我々は選択されたキメラＴＳＨ−ＬＨ／ＣＧレセプターの変異 誘発を含むストラテジーを使用して、各推定上の開裂部位に関連したアミノ酸残 基を同定しようとした。この手法の基本は、Ａ及びＢサブユニットへの開裂は、 ＴＳＨＲエクトドメイン（アミノ酸残基２６１−４１８；任意に名づけたドメイ ン「Ｄ及びＥ」）のカルボキシ末端部分がＬＨ／ＣＧレセプターの対応する領域 で置換されたキメラレセプター（ＴＳＨ−ＬＨＲ−６）では起こらない（１９、 ２０）（図３１）ということであった。一方、ドメインＤ又はドメインＥ（残基 ２６１−３６０及び３６３−４１８；それぞれキメラレセプターＴＳＨ−ＬＨＲ −４及びＴＳＨ−ＬＨＲ−５）のいずれかが個別に置換されるときには、開裂は なお生じる。これらのデータは、他の情報（１８）とともに、開裂部位１及び２ は、それぞれＴＳＨＲのドメインＤ及びＥにあることを示唆した。 単一の開裂部位の突然変異による除去は、レセプター開裂を阻害するのに不充 分であるので、我々はＴＳＨ−ＬＨＲ−５のバックグラウンドの推定上の部位１ の近辺の領域を変化させた（２１）。逆に、我々はＴＳＨ−ＬＨＲ−４のバック グラウンドの推定上の部位２の近辺の領域を変化させた（２２）。この方法によ って、我々は、完全な安定にトランスフェクトされた細胞の単層への¹²⁵Ｉ−Ｔ ＳＨ架橋によって決定されたように（２３）、レセプターのサブユニットへの開 裂における各変異の構造上の有意性を決定することができた。変異誘発の一般原 理として、我々はＴＳＨＲ残基を、非開裂性ＬＨ／ＣＧレセプターの相同性の残 基で置換した。両レセプターに共通の残基は変えなかった。ＴＳＨＲに特有でＬ Ｈ／ＣＧレセプターでは欠けている５０アミノ酸領域（１４）（図３１）の場合 には、相同性置換を行うことができなかったので、我々は殆どのケースでアラ二 ン残基を導入した。この５０アミノ酸セグメント（残基３１７−３６６間にある と考えられる）は非常に親水性であり、野生型ＴＳＨＲからリガンド結合性と機 能を失わずに（２４）、そしてＡ及びＢユニットへの開裂を妨げることなく （ ５）除去することができることは、注目すべきである。 脱グリコシル化ＴＳＨＲ Ａサブユニットは〜３５ｋＤａの大きさであり（１ ８、２５）、開裂部位１をほぼアミノ酸残基３３５（２１残基のシグナルペプチ ドを含めて番号付け）の位置に配置するであろう。これに基づいて、我々は当初 残基３３０〜３３８をアラニンスキャニング変異誘発のターゲットとした。これ らの個々の置換はいずれも、ジスルフィド結合還元におけるＴＳＨ−結合Ａサブ ユニットの放出によって測定されるように（図３２Ｂ）、キメラレセプターＴＳ Ｈ−ＬＨＲ−５の開裂を妨げなかった。以前の完全な細胞へのＴＳＨ架橋の研究 と一致して、細胞表面のＴＳＨＲのごく一部が、ＴＳＨとともに１本のポリペプ チド鎖ＴＳＨＲにも結合する、２つのユニットに開裂することに留意せよ。１個 のアミノ酸残基では開裂部位をつぶすのに不充分であるという可能性があるので 、我々は次に残基３２４と３５２間の広い範囲にわたって複数置換を行ったが、 開裂を妨げることはなかった。最後に、我々はさらに離れた領域においても（残 基３１７−３２３）、計算上の開裂部位のかなり上流及びＤドメインのカルボキ シ末端迄（残基３５３−３６２）、ＴＳＨ−ＬＨＲ−５を変異させたが、効果は なかった（図３２Ｂ）。 推定上の開裂部位２を提供すると予測される近辺でのＴＳＨ−ＬＨＲ−４変異 誘発は（図３３Ａ）、残基３６７−３７５（Ｅ１サブドメイン）がＴＳＨＲサブ ユニット形成に関連することを確認した（図３３Ｂ）。Ｅ１領域を２つのセグメ ントに再分割することによって、次に残基３６７−３７１（Ｅｌａセグメント） がエクトドメイン開裂に関連することを確認した。引続いて行った残基３６７、 ３６８、３６９及び３７１（残基３７０は保護されていた）位における個々のア ラニンの置換は、開裂を妨げず、この件には複数のアミノ酸が寄与するとを示唆 した。したがって、さらに開裂関連残基を明らかにするために、我々はＥｌａセ グメント内でオーバーラップする２個の変異体、Ｅ１ａ１（ＧＱＥ_367-369ＮＥ Ｔ）及びＥ１ａ２（ＥＬＫ_369-371ＴＹ）（図３３Ａ）を作成した。前者におけ る開裂の阻害は、残基３６７−３６９が推定上の部位２における開裂に含まれる ことを確認した（図３３Ｂ）。 単一のアミノ酸置換が推定上の部位２での開裂を妨げることができないこと、 及びこの開裂部位では複数のアミノ酸が含まれることは、予測される領域で２１ 個の変異させた新規レセプターを作成したにもかかわらず、我々が推定上の開裂 部位１の位置を決められなかったことに鑑み、有用なものである。部位１を特性 づけるのに必要となるであろう、さらなる順列組合わせの数の大きさを考慮する と、これ以上の変異誘発は躊躇される。さらに、次のような多くの可能性が存在 する：（ｉ）開裂部位１はアミノ酸残基３１７の上流に位置しうる。しかしなが ら、この場合には、脱グリコシル化Ａサブユニットは、複数の研究者によって観 察されたものよりも小さい（１１、１８、２５）、３３ｋＤａまたはそれ以下の ものとなるであろう；（ii）部位１における開裂の特異性は「緩められた（ｒｅ ｌａｘｅｄ）」ものである、及び（iii）我々が以前に得た強い支持根拠（１８ ）にもかかわらず、２つの開裂部位についての我々の仮説が誤りであった。 開裂部位が唯一であるという可能性を排除するために、我々は、ＴＳＨ−ＬＨ Ｒ−４の開裂を妨げることが知られた、Ｅｌａｌ変異（ＧＱＥ_367-369ＮＥＴ） を野生型ＴＳＨＲに導入した。したがって、もしこのセグメントがＴＳＨＲ開裂 に関連する唯一の部位であれば、それを野生型ＴＳＨＲの導入することによって 開裂が妨げられるはずである。逆に、ＧＱＥ_367-369ＮＥＴ変異を含む野生型Ｔ ＳＨＲでなお開裂が生じるならば、ＴＳＨＲエクトドメインには２つの開裂部位 があるにちがいない。この新しい構築物への¹²⁵Ｉ−ＴＳＨの架橋は、明白に開 裂を示し（図３４）、部位１の存在を証明した。総合すると、データは上流開裂 部位（部位１）に対するアミノ酸モチーフにおける緩められた特異性を示唆する 。 驚くべきことに、部位２で開裂を妨げる変異（ＧＱＥ_367-369ＮＥＴ）は、Ｎ −結合グリコシル化部位に対するコンセンサス配列を導入する。したがって、こ の近辺での炭水化物側鎖は、例えば蛋白質分解酵素の立体障害によっって、エク トドメイン開裂を阻害し得る。上記したように、ＴＳＨＲにおける開裂部位２を 調査するために使用された変異誘発ストラテジーは、ＴＳＨＲ中に非開裂性ＬＨ ／ＣＧレセプターの対応セグメントを置換することを含んでいた。ＴＳＨＲ中で のＧＱＥ_367-369ＮＥＴ置換は、ＬＨ／ＣＧレセプター中でグリコシル化されて いるモチーフである（２７）、ＬＨ／ＣＧレセプターからのＮＥＴ_291-293を転 位するものである。ＴＳＨ−ＬＨＲ−４中でのＧＱＥ_367-369ＮＥＴ置換の機能 上の有意性を測定するために、我々はこのキメラレセプター中にグリコシル化部 位にはなり得ないモチーフ（ＡＡＡ）を導入した（図３３Ａ）。非開裂性レセプ ターとは対照的に、ＴＳＨ−ＬＨＲ−４−ＧＱＥ_367-369ＡＡＡは開裂した（図 ３３Ｂ）。 ２つのサブユニットに開裂するレセプターへのＴＳＨＲの進化上の分岐は、ユ ニークで不思議なものである。トロンビンとは異なり（２８）、ＴＳＨはそのレ セプターを開裂させない；ＴＳＨの不存在下に培養されたトランスフェクトされ た細胞中には２つのサブユニットＴＳＨＲが存在する。ＴＳＨはＴＳＨＲの開裂 及び非開裂体の両者に結合する。さらに、ＴＳＨの行動は、開裂したレセプター を必要としない（２０、２９）。１つの可能性は、ＴＳＨＲレセプターの開裂は 、開裂部位１及び２間の小さなペプチドの放出を含み、病因となる自己抗体のき わめて一般的な発生に関連しているかもしれないＧ蛋白結合レセプターファミリ ーの他のメンバーでは、仮に存在するとしても、まれにみられる現象であるとい うものである。 要約すると、ＣＨＯ細胞中で安定に発現された３３の新規なＴＳＨＲ変異体か ら得られたデータは、（ｉ）ＴＳＨＲ中に２つの開裂部位が存在することを証明 する、（ii）ＴＳＨＲ中の３個のアミノ酸残基は、ＬＨ／ＣＧレセプターの相同 性残基で置換されると、第２の下流開裂部位（部位２）における開裂を阻害する ことを確認する、そして（iii）この第２の部位における開裂又は非開裂Ｎ−結 合グリコシル化に関連することを明らかにする。我々の知識では、グリコシル化 の存在又は不存在が、２つの密接に関連したレセプターがサブユニット構造にお ける差異を有するものへと進化するための新しいメカニズムを提供する。その構 造特性についてのより大きな理解が、なぜＴＳＨＲがヒトの自己免疫性疾患にお ける重要な自己抗体であるかということをさらに理解するのにも寄与するであろ う。 21.レセプターの発現レベルを増加させるため、我々は、キメラレセプターＴＳ Ｈ−ＬＨＲ−５(19)の５’及び３’非翻訳領域を、そのAflII-SpeIフラグメント （ドメインＤ及びＥ）(Fig.31)をTSHR-5'3'TR-NEO-ECE(30)の対応するフラグメ ントに置換えることにより、切除した。キメラレセプタ−TSH-LHR-5のドメイン Ｄにおける変異は、重複プライマーとPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene，San Di ego,CA)を用いたＰＣＲによって発生された。ＰＣＲフラグメントのヌクレオチ ド配列は、ジデオキシヌクレオチド終止法(31)により確認された。プラスミドは 、リポフェクチン(Gibco-BRL，Galthersburg，MD)を用いて、10%ウシ胎児血清(F CS)と標準抗生物質を補ったハム(Ham)のF-12培地で培養されたチャイニーズハム スター卵巣(CHO)に、安定にトランスフェクトされた。選択には、400μｇ/ml G4 18(GIBCO)を用いた。生存クローン（100mm直径培養皿に対して>100）をプールし 、さらなる研究のために繁殖させた。 22.キメラレセプタ−TSH-LHR-4のドメインＥにおける我々が行った最初の変異の ために、我々は、野生型TSHR(32)において以前に構成されたＥ１、Ｅ２及びＥ３ 変異(Fig.33A)を使用した。これらの変異は、TSH-LHR-4(Eco RV-Xba I フラグメント) のcDNA中に置き換えられた。これにつづくTSH-LHR-4のＥドメインにおける僅か な変異が、重複プライマーを用いたＰＣＲによって行われ、これはAflII-SpeIの 置換を伴った。ドメインＤ変異の場合と同様の方法で、すべてのＰＣＲ産物のヌ クレオチド配列を決定し、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を生産し た。 23．先に述べたのと同様にして(10)、スベリン酸ジスクシンアミド(DSS;1mM;Sig ma)を用いて、ウシ¹²⁵I-TSHの、単層の手を加えていない(intact)細胞に対する 共有クロスリンクが達成された。細胞からの膜調製は、SDS-PAGE及びオートラジ オグラフィーに従う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マクラクラン，サンドラ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94939, ラークスパー，クリーク ビュー サーク ル 33

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＴＳＨＲ組成物。 ２．ＴＳＨＲ−２６１である請求項１の組成物。