CN1849336A - 嵌合gabab受体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了分离的GABAB受体蛋白，包括至少一个GABABR1a亚基以及至少一个GABABR2a亚基，其特征在于所述GABAB受体具有一个高亲合性激动剂结合位点以及一个低亲合性激动剂结合位点。尤其是，由保藏在比利时微生物保藏中心(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2CHO细胞系表达的分离的重组GABAB受体蛋白，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO－K1h－GABA－b R1a/R2克隆，登录号为LMBP 6046CB。因此，本发明的一个目的是提供保藏在比利时微生物保藏中心(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2 CHO细胞系，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO－K1 h－GABA－bR1a/R2克隆，登录号为LMBP 6046CB。本发明还提供了上述细胞系在利用功能性或者结合分析识别GABAB受体激动剂的方法中的应用。

Description

嵌合GABAB受体
本发明提供了利用3H-GABA结合分析在表达重组GABABR1a/R2受体的细胞中识别GABAB受体激动剂物质的新方法。
发明背景
GABA(γ-氨基丁酸)是中枢神经系统(CNS)中最广泛分布的氨基酸抑制性神经递质，激活两个不同的受体家族；用于快速突触传递的促离子型GABAA以及GABAC受体，以及控制较慢突触传递的促代谢型GABAB受体。
GABAB受体是7次跨膜G蛋白偶联受体超家族的成员，所述偶联受体与神经元的K+或者Ca2+通道偶联。据报道突触前GABAB受体激活通常导致Ca2+电导的抑制，引起诱发的神经递质释放的减少。在突触后，GABAB受体激活的主要作用是打开钾通道产生突触后的抑制电势。
GABAB受体的表达广泛分布在哺乳动物神经元轴中，在小脑，脚间核，前脑皮层(frontal cortex)，嗅神经核(olfactory nuclei)，视丘核(thalamic nuclei)，颞叶皮层(temporal cortex)，缝核(raphe magnus)以及脊髓的分子层中的水平尤为高。GABAB受体也存在于周围神经系统中，既在感觉神经上也在副交感神经上。它们对这些神经的调节能力使它们能够作为肺，胃肠道以及膀胱紊乱的靶(Belley等人，1999，Biorg.Med.Chem.7：2697-2704)。
许多药理学活性归因于GABAB受体激活，例如痛觉丧失，低温症，紧张症，低血压，记忆巩固以及保留的降低，刺激胰岛素、生长激素以及胰高血糖素释放(参见Bowery，1989，Trends Pharmacol.Sci.10：401-407的综述)。人们普遍接受的事实是，GABAB受体激动剂以及拮抗剂在药理学上可用于诸如僵人综合症、胃食管反流、神经性疼痛、失禁的适应症以及治疗咳嗽和可卡因成瘾。例如，已经显示GABAB受体激动剂巴氯芬可以用于减少短暂性食管下端括约肌松驰(TLESR)并且因此可用于在TLESR期间大多数反流发作发生时反流的治疗。然而，目前的GABAB受体激动剂，诸如巴氯芬相对无选择性并且显示了诸如镇静以及呼吸抑制的多种不合需要的行为作用。人们希望可以开发出改进了选择性并且具有较少上述不合需要的效果的更多的GABAB受体激动剂。
当前开发新药的通常方法包括评价几万或者几十万化合物的生物活性以便识别少数具有抗特定靶的目标活性的化合物，即高通量筛选(HTS)。在一般的HTS相关筛选方式中，在多孔微板，诸如96、384或者1536孔板中进行分析，给待进行的分析设置施加某些限制，包括原材料(即表达重组GABAB受体的细胞的膜制备物)的可利用性。HTS相关筛选优选在室温下进行，在分析中每一试验化合物进行单个测量，需要较短的周期时间，具有可重复且可靠的结果。
目前识别作为GABAB受体激动剂的化合物的体外筛选或是依赖于天然较不充足的原料，诸如大鼠大脑膜中结合分析或是由功能筛选分析组成，例如Ca2+应答，c-AMP应答和在表达重组GABAB受体的细胞中所实现的Ca2+以及K+通道效应。在部分这些功能性分析中，GABAB受体可能与G-蛋白，例如Gα16或者Gqi5或者嵌合G-蛋白Gαq-z5共表达，其增强G蛋白偶联(Bruner-Osborne & Krogsgaard-Larsen，1999，Br.J.Pharmacol.128：1370-1374)。然而，将更进一步减少HTS周期时间以及生化制品诸如重组蛋白的原料的GABAB激动剂结合分析目前是无法获得的。
本发明描述了培育中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其共表达人GABAB受体亚基GABABR1a以及GABABR2，所述亚基令人惊讶地证实了放射性配体结合实验中的激动剂结合。此外，本发明人证实hGABABR1a/GABABR2 CHO细胞系在重组表达的GABAB受体中具有一个高亲合性和一个低亲合性激动剂结合位点。因此，由本发明提供的hGABABR1a/GABABR2 CHO细胞系不仅可用于化合物筛选，而且还提供了表征化合物-受体相互作用的特性的有利工具。
发明概述
本发明提供了分离的GABAB受体蛋白，包括至少一个GABABR1a亚基以及至少一个GABABR2亚基，其特征在于所述GABAB受体具有一个高亲合性激动剂结合位点以及一个低亲合性激动剂结合位点。尤其是，由保藏在比利时微生物保藏中心(Belgian CoordinatedCollections of Microorganisms)(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2CHO细胞系表达的分离的重组GABAB受体蛋白，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO-K1h-GABA-b R1a/R2克隆，登录号为LMBP6046CB。因此，本发明的一个目的是提供保藏在比利时微生物保藏中心(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2 CHO细胞系，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2克隆，登录号为LMBP6046CB。
本发明还提供了上述细胞系在利用功能性或者结合分析识别GABAB受体激动剂的方法中的应用。尤其是在包括利用放射性标记的激动剂例如3H-GABA或者3H-巴氯芬的放射性配体-结合分析中。
本发明更进一步提供了识别GABAB受体激动剂的方法，包括将上述细胞系与试验化合物接触以及测定所述试验化合物与GABAB受体的结合。尤其是，该方法由放射性配体结合分析组成，包括在试验化合物存在以及缺乏的条件下将上述细胞暴露于GABAB的标记的激动剂并且根据本发明测定标记配体与细胞的结合，如果在试验化合物的存在下标记配体的结合量较少，那么该化合物就是GABAB受体的潜在激动剂。
本发明的另一个目的是提供识别高亲合性GABAB受体激动剂的方法，所述方法包括在试验化合物存在以及缺乏的条件下将上述的细胞与选自GABA、巴氯芬以及3-氨基丙基次膦酸(3-APPA a.k.a APMPA)的放射性标记的激动剂接触并且根据本发明测定标记配体与细胞的结合，其中如果在试验化合物的存在下标记配体与高亲合性结合位点的结合量较少，那么该化合物就是GABAB受体的潜在高亲合性激动剂。
或者，上述的结合分析在在保藏在比利时微生物保藏中心(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2 CHO细胞系的细胞提取物上进行，尤其是细胞膜制备物上进行，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO-K1h-GABA-b R1a/R2克隆，登录号为LMBP 6046CB。
在另一实施方案中，本发明提供了识别GABAB受体激动剂的方法，所述方法包括将上述细胞系与待试验化合物接触并且确定化合物是否激活所述细胞中GABAB受体功能应答。该功能性应答特别由离子通道或者胞内信使活性调节组成，如下文所述。
在下文将更详细论述本发明的这些以及更进一步的方面。
附图说明
图1存在以及缺乏阳性别构调节物CGP7930＞的条件下，由GABA刺激膜时的GTPγ35S-结合，表示为GABA的最大刺激百分比。
图2由激动剂(巴氯芬，GABA & APMPA)和拮抗剂(SCH50911 &CGP54626)代替3H-GABA。
图3独立于膜制备物的可重现的激动剂的IC50值(n＝5)。
图4在存在或者缺乏10μM CGP54626(a)或者JNJ 4309747-AAD(b)的条件下双侧的3H-GABA激动剂结合曲线。
详细说明
为了描述本发明的目的，在这里使用的GABABR1a或者hGABABR1a是指在Kaupmann等人的1998，Proc.Natl. Acad.Sci.USA95：14991-14996中被称为GABABR1a的人GABAB受体亚基(其的氨基酸序列(SEQ ID No.：2)可见于GenBank登录号AJ225028)及其哺乳动物直向同源物。GABABR1a还指其它的GABAB受体亚基，与上述的那些相比在氨基酸序列上具有微小变化，条件是这些其它的GABAB受体亚基与以上描述的亚基具有基本上相同的生物学活性。如果GABABR1a亚基的氨基酸序列与SEQ ID No.：2具有至少80％的同一性，优选至少95％的同一性，更优选至少97％的同一性，以及最优选至少99％的同一性并且对GABA，GABAB受体激动剂，例如巴氯芬和加巴喷丁或者GABAB受体拮抗剂例如CGP54626A，SCH 50911，saclofen和phaclofen的Kd或者EC50至多5倍于GABA的天然GABAB受体或者相同的GABAB受体激动剂或者GABAB受体拮抗剂的Kd或者EC50，那么GABABR1a亚基就具有基本上相同的生物学活性。
在这里使用的GABABR2是指在White等人的1998，Nature396：679-682中被称为GABABR2的人GABAB受体亚基(其的氨基酸序列(SEQ ID NO.：4)可见于GenBank登录号AF058795)及其哺乳动物直向同源物。GABABR2也指其它GABAB受体亚基，与上述的那些相比在氨基酸序列上具有微小变化，条件是那些其它GABAB受体亚基与以上描述的亚基具有基本上相同的生物学活性。如果GABABR2亚基的氨基酸序列与SEQ ID No.：4具有至少80％的同一性，优选至少95％的同一性，更优选至少97％的同一性，以及最优选至少99％的同一性并且与GABABR1亚基结合对GABA，GABAB受体激动剂，例如巴氯芬和加巴喷丁或者GABAB受体拮抗剂例如CGP54626A，SCH 50911，saclofen和phaclofen的Kd或者EC50至多5倍于GABA的天然GABAB受体或者相同的GABAB受体激动剂或者GABAB受体拮抗剂的Kd或者EC50，那么GABABR2亚基就具有基本上相同的生物学活性。
利用本领域技术人员公知的方法，尤其是利用对组织制备物的竞争结合研究确定天然GABAB受体的Kd和EC50值，所述竞争结合研究例如描述在Cross & Horton，1987Eur.J.Pharmacol.141(1)：159-162中。简而言之，通过整个大脑的匀质化，离心(30000×g，20分钟)以及彻底漂洗来制备粗突触膜。通过将膜与3H-GABA或者3H-巴氯芬一起培养测定总结合，而在存在100μM巴氯芬的条件下测定非特异性结合。在过滤除去未结合的配体时在β-计数器或者Topcount Harvester(Packhard)中对过滤物进行计数。对于竞争实验而言，在浓度渐增的未标记化合物存在的条件下发生结合。
因此本发明的目的是提供由至少一个GABABR1a和至少一个GABABR2亚基形成的分离的GABAB受体蛋白，其更进一步的特征在于所述分离的GABAB兼具高亲合性以及低亲合性激动剂结合位点。在更进一步的实施方案中，这种分离的GABAB受体是由细胞表达的功能性GABAB受体，其中所述细胞通常不表达GABAB受体。可以市售获得的合适的细胞包括但不局限于L-细胞，HEK-293细胞，COS细胞，CHO细胞，HeLa细胞以及MRC细胞，尤其是CHO细胞，其中GABAB受体蛋白包括至少一个由SEQ ID No.1组成的寡核苷酸序列编码的GABABR1a亚基以及至少一个由SEQ ID No.3组成的寡核苷酸序列编码的GABABR2亚基。在更特定的实施方案中，本发明的分离的GABAB受体由保藏在比利时微生物保藏中心(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2 CHO细胞系表达的受体蛋白组成，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2克隆20，登录号为LMBP 6046CB。
“功能性GABAB受体”是指由细胞中的GABABR2和GABABR1a的共表达形成的GABAB受体，其中所述细胞通常不表达GABAB受体，最优选产生GABABR2和GABABR1a的异二聚体，其中功能性GABAB受体当暴露于GABAB受体激动剂GABA时介导至少一个功能性应答。功能性应答的实例是：非洲蟾蜍黑色素细胞中的色素聚集，cAMP水平的负调节，与校正钾通道的内在偶联，调节神经元中迟发的抑制性突触后电势，提高钾导电率，降低钙导电率，MAP激酶的激活，细胞外pH酸化，及其他G蛋白偶联受体典型的功能应答。本领域技术人员可能熟悉测定G蛋白偶联受体功能应答的多种方法，诸如GABAB受体(参见，例如Lerner，1994，Trends Neurosci.17：142-146[黑色素细胞中色素分布变化(changes in pigment distribution in melanophorecells)]；Yokomizo等人，1997，Nature 387：620-624[cAMP或者钙浓度变化；趋化性(changes in cAMP or calcium concentration；chemotaxis)]；Howard等人，1996，Science 273：974-977[非洲蟾蜍卵母细胞中膜电流的变化(changes in membrane currents in Xenopusoocytes)]；McKee等人，1997，Mol.Endocrinol.11：415-423[利用水母蛋白分析测定的钙浓度的变化(changes in calcium concentrationmeasured using the aequorin assay)]；Offermanns & Simon，1995，J.Biol.Chem.270：15175-15180[肌醇磷酸酯水平的变化(changes ininositol phosphate levels)])。根据其中表达GABABR1a和GABABR2的异聚体的细胞，以及与由此形成的功能性GABAB受体偶联的G-蛋白，某些方法可能适合于测定这种功能性GABAB受体的功能性应答。本领域技术人员完全能够选择测定给定实验系统的功能性应答的合适方法。
在这里使用的术语“化合物”，“试验化合物”，“药物(agent)”或者“候选药物”可以是任一类型的分子，包括例如肽，多核苷酸，或者人们希望检验其作为GABAB受体激动剂的活性小分子，并且其中所述药物可以给接受所述药物的受试者提供治疗益处。候选药物可以通过多种途径对个体给予，包括，例如口服或者肠胃外，诸如静脉内，肌内，皮下，眼眶内，囊内，腹膜内，直肠内，脑池内或者分别利用例如透皮贴片或者透皮离子电渗由皮肤被动或者易化吸收。此外，化合物可以通过注射，插管或者局部给予，后者可以是被动的例如通过直接涂敷油膏或者可以是主动的例如利用鼻喷雾器或者吸入器，在该情况下组合物的一个组分是合适的推进剂。化合物的给予途径将部分取决于化合物的化学结构。例如当口服给予时肽和多核苷酸就不是特别有用，因为它们可以在消化道中降解。然而，化学修饰肽的方法，例如使它们对降解敏感性降低的方法是众所周知的并且包括例如，利用D-氨基酸，利用基于肽模拟物(peptidomimetics)的结构域，或者使用诸如乙烯基类肽的类肽。
用于该筛选方法的药物可用于可药用载体中。参见，例如E.W.Martin Mack Pub.Co.Easton PA的最新版本的Remington’sPharmaceutical Sciences，其公开了制备药用组合物的典型载体和常规方法，所述药物组合物可以与药物的制剂一起使用，其在此处引入作为参考。
细胞
如上所述，本发明提供了由表达载体稳定转染的细胞系，所述表达载体指导以上限定的GABAB受体亚基GABABR1a以及GABABR2的表达。尤其是，用所述表达载体转染的CHO细胞。这种表达载体通常根据分子生物学的技术进行构建，可以包括使用质粒DNA以及合适的起始物，启动子，增强子及其他元件(其可能必需并且位于正确方向)，以便进行蛋白表达。通常，可以使用任何适于维持，增殖或者表达多核苷酸的系统或者载体从而在宿主中产生多肽。合适的核苷酸序列，即编码以上限定的人GABABR1a或者GABABR2亚基的多核苷酸序列可以通过任何众所周知并且常规的技术插入表达系统中，所述众所周知并且常规的技术列举在例如Ausbel等人编辑的John Wiley &Sons，1997的Current Protocols in Molecular Biology中。
在特定的实施方案中，本发明的CHO细胞是用包括分别编码人GABABR1a(SEQ ID No.：1)以及人GABABR2(SEQ ID No.：3)的市售表达载体pcDNA3.1共转染的细胞。更优选地，本发明提供了保藏在比利时微生物保藏中心(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2CHO细胞系，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO-K1 h-GABA-b R1a/R2克隆20，登录号为LMBP 6046CB。这种细胞系的特征在于这种CHO细胞系中的功能性GABAB受体兼具GABAB受体激动剂的低和高亲合性结合位点。利用本发明的细胞系，不仅可以筛选化合物，而且提供了表征化合物与受体相互作用的特性的有用工具，即化合物是否与GABAB受体的低或者高亲合性激动剂结合位点相互作用。
为进一步了解与核酸结构的制备、诱变、测序、DNA引入细胞及基因表达、蛋白质分析有关的详情，参见例如Sambrook等人的分子克隆：实验室手册(第二版)(Molecular Cloning：a Laboratory Manual)，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
分析
本发明也提供了对能够与本发明的功能性GABAB受体相互作用的化合物的分析，所述分析包括：提供由本发明的hGABABR1a/GABABR2 CHO细胞系表达的GABAB受体，将所述受体与假定的结合化合物接触；以及确定所述化合物是否与受体相互作用。
在分析的一个实施方案中，在结合分析中可以使用受体或者受体的亚基。结合分析可以是竞争性的或者非竞争性的。这种分析可以适于大量化合物的快速筛选，从而确定哪些化合物能够与多肽相结合。
在此范围内，本发明提供了一种识别试验化合物是否与本发明的分离的GABAB受体蛋白结合从而确定该化合物是GABAB受体的潜在激动剂或者拮抗剂的方法，所述方法包括：
a)在已知结合GABAB受体的化合物存在或者缺乏的条件下将表达功能性GABAB受体的细胞与该试验化合物接触，其中这种细胞通常不表达GABAB受体，以及
b)利用已知结合GABAB受体的化合物作为参照，确定试验化合物与GABAB受体的结合。
利用本领域用于研究蛋白质-配体相互作用的已知方法评价试验化合物或者在这里称作参照化合物、已知结合GABAB受体的化合物的结合。例如，这种结合可以采用标记物质或者参照化合物进行测定。可以本领域已知的任何适当方式标记试验化合物或者参照化合物，例如以放射性，荧光或者酶促的方式进行。在上述方法的特定实施方案中，已知结合GABAB受体，也称作参照化合物的化合物被可检测地标记，并且所述标记被用于确定该试验化合物与GABAB受体的结合。利用放射性标记，荧光标记或者酶标记，优选放射性标记进行标记所述参照化合物。在更特定的实施方案中，本发明提供了识别试验化合物是否与分离的GABAB受体蛋白结合的方法，所述方法包括利用已知结合GABAB受体的化合物，其中所述参照化合物选自3H-GABA，3H-巴氯芬，3H-3-APPA，3H-CGP542626以及3H-SCH50911。
其后，可以利用那些发现进行结合的化合物进行更详尽的分析从而进一步确定这种化合物是否起到本发明的多肽的激动剂或者拮抗剂的作用。
由此，在更进一步的实施方案中，本发明提供了识别GABAB受体激动剂的方法，所述方法包括：
a)在试验化合物存在以及缺乏的条件下将表达功能性GABAB受体的细胞暴露于GABAB的标记的激动剂，其中所述细胞通常不表达GABAB受体，以及
b)确定标记的激动剂与所述细胞的结合，其中如果在试验化合物存在的条件下标记的激动剂的结合量较少，那么该化合物就是GABAB受体的潜在激动剂。如上文中一般结合分析的说明，利用本领域用于研究蛋白质-配体相互作用的已知方法评价GABAB受体激动剂的结合。标记通常选自放射性标记、荧光标记或者酶标记，尤其是放射性标记，其中激动剂选自3H-GABA，3H-巴氯芬以及3H-3-APPA。
类似地，本发明提供了识别GABAB受体拮抗剂的方法，所述方法包括：
a)在试验化合物存在以及缺乏的条件下将表达功能性GABAB受体的细胞暴露于GABAB的标记的拮抗剂，其中所述细胞通常不表达GABAB受体，以及
b)确定标记的拮抗剂与所述细胞的结合，其中如果在试验化合物存在的条件下标记的拮抗剂的结合量较少，那么该化合物就是GABAB受体的潜在拮抗剂。如上文中一般结合分析的说明，利用本领域用于研究蛋白质-配体相互作用的已知方法评价GABAB受体拮抗剂的结合。标记通常选自放射性标记、荧光标记或者酶标记，尤其是放射性标记，其中拮抗剂选自3H-CGP542626和3H-SCH50911。
在本发明另一实施方案中，在细胞组合物上进行上述的结合分析，即包含以上限定的GABAB受体的细胞提取物、细胞组分或者细胞器。尤其是，在包含以上限定的GABAB受体的细胞组合物(cellularcomposition)即细胞提取物、细胞组分或者细胞器上进行上述的结合分析，，其中所述细胞组合物，即细胞提取物、细胞组分或者细胞器获自表达功能性GABAB受体的细胞，其中所述细胞通常不表达GABAB受体。更优选地，细胞组合物，即细胞提取物、细胞组分或者细胞器获自保藏在比利时微生物保藏中心(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2CHO细胞系，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO-K1h-GABA-b R1a/R2克隆20，登录号为LMBP 6046CB。
因此，本发明的一个目的是提供识别作为GABAB受体激动剂或者拮抗剂的化合物的方法，所述方法包括：
a)在GABAB受体的可检测标记的激动剂或者拮抗剂的存在下给表达功能性GABAB受体的细胞的细胞组合物给予该化合物，其中所述细胞通常不表达GABAB受体；以及
b)确定标记的激动剂或者拮抗剂与所述细胞组合物的结合，其中如果在试验化合物的存在下标记的激动剂或者拮抗剂的结合量较少，那么该化合物就是GABAB受体的潜在激动剂或拮抗剂。
如上文中一般结合分析的说明，利用本领域用于研究蛋白质-配体相互作用的已知方法评价GABAB受体激动剂或者拮抗剂的结合。标记通常选自放射性标记，荧光标记或者酶标记，尤其是放射性标记，其中激动剂选自3H-GABA，3H-巴氯芬以及3H-3-APPA，拮抗剂选自3H-CGP542626以及3H-SCH50911。在更具体的实施方案中，利用一种或者多种上述的放射性标记的激动剂和/或拮抗剂，在由细胞的膜组分组成的细胞组合物上进行上述的结合分析，尤其是保藏在比利时微生物保藏中心(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2 CHO细胞系的膜组分上进行，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO-K1 h-GABA-bR1a/R2克隆20，登录号为LMBP 6046CB。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了识别调节本发明的细胞中GABAB-受体活性的化合物的功能性分析。利用本发明的细胞进行这种分析，即与人GABABR1a以及人GABABR2亚基共转染。该细胞与至少一种参照化合物接触，其中所述化合物调节GABAB-受体活性的能力是已知的。其后，细胞与试验化合物接触，并与参照化合物相比确定所述试验化合物是否调节GABAB受体的活性。在这里使用的“参照化合物”是指已知结合和/或调节GABAB受体活性的化合物。
“调节本发明的多肽的活性”的化合物或者信号是指改变多肽的活性使所述多肽在化合物或者信号的存在下与该化合物或者信号缺乏的条件下表现不同的化合物或者信号。影响调节的化合物包括激动剂和拮抗剂。GABAB受体的激动剂包含诸如GABA，巴氯芬和激活GABAB受体功能的3-APPA的化合物。或者，拮抗剂包括干扰GABAB受体功能的化合物。通常，观察到的拮抗剂的作用是阻断激动剂诱导的受体激活。拮抗剂包括竞争性的以及非竞争性的拮抗剂。竞争性拮抗剂(或者竞争性的阻断剂)与特异于激动剂结合的位点或在该位点附近相互作用。非竞争性的拮抗剂或者阻断剂通过与除了激动剂相互作用位点的位点相互作用灭活受体的功能。
在一个实施方案中，本发明提供了识别能够调节GABAB受体活性的化合物的方法，所述方法包括：
a)在允许GABAB受体激活的条件下，将表达功能性GABAB受体的细胞与至少一种参照化合物接触，其中所述细胞通常不表达功能性GABAB受体；
b)在允许GABAB受体激活的条件下，将步骤a)的细胞与试验化合物接触，以及c)确定所述试验化合物与参照化合物相比是否调节GABAB受体的活性。
确定化合物调节GABAB受体活性能力的方法是基于可用于确定G蛋白偶联受体功能性应答的多种分析(如上所述)并且尤其是基于确定钾电流的改变，钙浓度的改变，cAMP的改变以及GTPγS结合的改变的分析。允许GABAB受体激活的条件通常是本领域已知的，例如在拮抗剂筛选的情况下，这些条件包括在分析系统中GABAB受体激动剂的存在。用于这些活性分析的典型的GABAB受体激动剂是GABA、巴氯芬或者3-APPA。尤其是，在以下描述的GTPγS分析中，GABA被用来激活GABAB受体以便评价试验化合物灭活GABAB受体蛋白的能力。
在上述的分析中，在试验化合物的存在下GTPγS结合的增加指示该化合物激活了GABAB受体的活性，并且因此该试验化合物是GABAB受体蛋白的潜在激动剂。试验化合物的存在下GTPγS结合的减少指示该化合物灭活了GABAB受体蛋白并且因此该试验化合物是GABAB受体蛋白的潜在拮抗剂。
尤其优选的分析类型包括结合分析以及功能性分析，如下文所述进行：
结合分析
由本发明的hGABABR1a/GABABR2 CHO细胞系表达的过表达GABAB受体可用来产生用于配体结合研究的具有所述受体的膜制备物(为方便起见本节中指GABAB结合受体)。这些膜制备物可用于传统的滤膜结合分析(例如利用Brandel滤膜分析设备)或者用于高通量亲近闪烁型结合分析(Scintillation Proximity type binding assays)(SPA以及Cytostar-T闪烁平板技术；Amersham Pharmacia Biotech)以检测放射标记的GABAB配体(包括3H-GABA，3H-巴氯芬，3H-3-APPA，3H-CGP542626，3H-SCH50911)的结合以及这种放射配体被结合位点的竟争物取代。放射性活度可以利用Packard Topcount或者类似的能够从96-，384-，1536-微滴定量孔结构快速测量的仪器进行测量。SPA/Cytostar-T技术尤其适用于高通量筛选因此这种技术适于筛选能够取代常规配体的化合物。
另一研究在接近天然的条件下配体与GABAB结合受体蛋白结合的方法使用由Biacore仪器(Biacore)开发的表面等离子体共振效应。膜制备物或者全细胞中的GABAB结合受体可以附着于Biacore的生物传感器芯片并且在化合物存在以及缺乏的条件下检验配体的结合从而识别结合位点的竟争物。
功能性分析
因为GABAB受体属于G蛋白偶联受体也就是说与GIRK偶联(内在校正钾通道)，钾离子流应该在这些受体激活时产生。这种离子流可以利用多种技术实时测定从而确定特定化合物的激动或者拮抗效应。因此，在本发明的细胞系中表达的重组BABAB结合受体蛋白可以利用全细胞以及单通道电生理学进行表征从而确定目的化合物的作用机理。可以利用传统的电生理学技术进行GABAB结合受体蛋白的活性化合物的电生理学筛选，并且当可以获得这些技术时，新的高通量方法目前正在开发中。
假设GABAB受体对Ca2+通道的激活具有突触前效应，在另一个功能性筛选中，通过胞内钙的变化评价化合物化合物的调节效应。钙流可以利用几种离子敏感的荧光染料，包括fluo-3，fluo-4，fluo-5N，fura红及其他来自包括Molecular Probes的供应商的类似探针进行测量。因此可以利用荧光测定以及荧光成像技术实时表征GABAB受体激活引起的钙流的抑制，上述技术包括荧光显微术，包括或者不包括与图像分析算法相结合的激光共焦方法。
另一方法是高通量筛选分析活性的作为瞬时影响钙的激动剂或者调节剂的化合物。这种分析基于称作荧光成像板读入器((FLIPR)，Molecular Devices Corporation)的仪器。在其最共通的构造中，其激发并且测定由基于荧光素的染料发射的荧光。它利用在488nm的荧光团处产生高功率激发的氩离子激光器，迅速扫描96-/384-孔板的底部的光学系统以及捕获发射荧光的敏感的冷却CCD摄像机。其也含有可以使仪器将试验药物的溶液递送到96-/384-孔板的孔的96-/384-孔移液管头。该FLIPR分析被设计用于在添加化合物之前，期间以及之后同时从所有的96-/384-孔由细胞群实时测定荧光信号。FLIPR分析可用于筛选以及表征hGABABR1a/GABABR2CHO细胞系功能上活性的化合物。
具体用于识别GABAB激动剂的高通量筛选分析可以由一组方案组成，其中用合适的荧光染料装载hGABABR1a/GABABR2 CHO细胞，与试验化合物一起培养并且在进行相互作用足够的时间以后(8-24小时，通常12-24小时，尤其是24小时)，利用自动化荧光板读入器诸如FLIPR或者Ascent Fluoroskan(Thermo Labsystems市售，布鲁塞尔，比利时)测定相对荧光单位的变化。
在进一步的实施方案中，功能性分析是基于GTPγS与GABAB结合受体结合的改变。尤其是，利用竞争结合分析确定放射性标记的GTPγS的取代。通常，这种识别GABAB-受体激动剂的方法包括从表达本发明的hGABABR1a/GABABR2异二聚体的细胞制备膜组分，在放射性标记的GTPγS的存在下，在允许GABAB受体激活的条件下将所述膜制备物与待试验的化合物接触以及检测GTPγS与膜组分的结合。在所述的化合物的存在下，GTPγS结合的增加指示该化合物激活了hGABABR1a/GABABR2受体。在所述化合物的存在下，GTPγS结合的减少指示该化合物灭活了hGABABR1a/GABABR2受体。优选地，这种GTPγS结合分析是在获自保藏在比利时微生物保藏中心(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2CHO细胞系的膜组分上进行的，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO-K1h-GABA-b R1a/R2克隆20，登录号为LMBP 6046CB。此外，允许GABAB受体激活的条件包括在分析系统中存在GABAB受体激动剂，例如GABA、巴氯芬以及3-APPA。尤其是GABA。
在下文的实施例中将提供这种及其他功能性筛选分析。
GABAB受体激动剂
在其它方面，本发明提供了利用上述筛选分析中的一种识别的GABAB受体激动剂，其中所述GABAB受体激动剂由式(I)的化合物、其N-氧化物形式、可药用加成盐及立体化学异构体的形式表示，
Figure A20048002604000191
其中
＝Z1-Z2＝Z3-Z4＝代表选自＝N-CH＝CH-N＝(a)、＝N-CH＝N-CH＝(b)、＝CH-N＝CH-N＝(c)、＝CH-CH＝CH-CH＝(d)、＝N-CH＝CH-CH＝(e)、＝CH-N＝CH-CH＝(f)、＝CH-CH＝N-CH＝(g)和＝CH-CH＝CH-N＝(h)的二价基；
R1代表氢、卤素、羟基、氰基、C1-6烷基、CF3、氨基或者单或者二(C1-4烷基)氨基；
R2代表氢、C1-6烷基或者羟基羰基-C1-6烷基-。
尤其是那些式(I)的化合物，其中适用一种或者多种的下列限制：
(i)＝Z1-Z2＝Z3-Z4＝代表选自如下的二价基：
＝N-CH＝CH-N＝(a)、＝N-CH＝N-CH＝(b)、＝CH-N＝CH-N＝(c)以及＝CH-CH＝CH-CH＝(d)；
(ii)R1代表卤素、氨基或者单-或者二(C1-4烷基)氨基；
(iii)R2代表丁酸。
也包括那些满足如下条件的式(I)的化合物：
(i)R1连接在Z1的位置；和/或
(ii)＝Z1-Z2＝Z3-Z4＝代表(a)、(b)或者(d)，更优选地＝Z1-Z2＝Z3-Z4＝代表(d)。
上文以及下文所使用的卤素一般为氟，氯，溴以及碘；C1-4烷基限定了具有1到4个碳原子的直链以及支链饱和烃的基团，例如甲基，乙基，丙基，丁基，1-甲基乙基，2-甲基丙基，2，2-二甲基乙基等等；C1-6烷基限定了具有1到6个碳原子的直链以及支链饱和烃基团例如戊基，己基，3-甲基丁基(methylnutyl)，2-甲基戊基等。
上文提到的可药用加成盐是指包括式(I)化合物能够形成的有治疗活性的无毒酸加成盐形式。后者可以通过用这种合适的酸处理碱形式很方便地获得。合适的酸包括，例如，无机酸诸如氢卤酸，例如盐酸或者氢溴酸；硫酸；硝酸；磷酸等；或者有机酸，例如乙酸，丙酸，羟基乙酸，乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸(即，丁二酸)，马来酸，反式丁烯二酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，对甲苯磺酸，环己烷氨基磺酸，水杨酸，对氨基水杨酸，pamoic等。
上文提到的可药用加成盐是指包括式(I)化合物能够形成的有治疗活性的无毒碱加成盐的形式。这种碱加成盐形式的实例为例如，钠，钾，钙盐，以及与可药用胺例如，氨，烷基胺，苄星(benzathine)，N-甲基-D-葡萄糖胺，海巴胺(hydrabamine)，氨基酸例如精氨酸，赖氨酸的盐。
相反，所述盐形式可以通过用合适的碱或者酸进行处理转化成游离酸或者碱的形式。
上文使用的术语加成盐也包括(I)的化合物及其盐能够形成的溶剂化物。这种溶剂化物例如是水合物，乙醇化物等等。
上文使用的术语立体化学异构体形式限定了(I)的化合物可能具有的可能的不同异构体以及构象形式。除非另有提及或者标明，化合物的化学命名表示所有可能的立体化学以及构象的异构形式的混合物，所述混合物包含碱性分子结构所有的非对应异构体，对映异构体和/或构象体。纯形式或者彼此掺合的式(I)化合物的所有立体化学异构形式也包括在本发明的范围内。
式(I)化合物的N-氧化物形式是指包括其中一个或者几个氮原子被氧化成所谓的N-氧化物的式(I)的化合物。
本发明的7，8-二氢-吩噻嗪衍生物通常根据Nemeryuk M.P.等人在Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal(1985)，19(8)，964-968中所述方法进行制备。简言之，通过对适合的溶剂，诸如乙醇或者N-甲基吡咯烷酮中的两个反应物进行加热将已知的邻氨基取代的(杂)芳烃-硫醇(II)与合适的2-溴代-5，5-二甲基-3-氧代-环己-1-烯基氨基衍生物(III)缩合。常规的逐步反应(work-up)以及纯化产生式I的目标产物(流程1)
流程1
其中＝Z1-Z2＝Z3-Z4＝，R1和R2的限定见上文式(I)化合物中的限定。
合适的2-溴代-5，5-二甲基-3-氧代-环己-1-烯基氨基衍生物(III)通常可以通过用通式(IV)的合适胺在已知的胺化条件下对5，5-二甲基-1，3-环己二酮的胺化，然后用N-溴代琥珀酰亚胺进行溴化(流程图2)获得。
流程2
Figure A20048002604000212
其中R2的限定见上文式(I)化合物中的限定。
对于那些R2代表丁酸的式(I)的化合物，以下简称式(I’)的化合物，通过邻-氨基取代的(杂)芳烃-硫醇(II)与4-(2-溴代-5，5-二甲基-3-氧代-环己-1-烯基氨基)-丁酸或者酯衍生物诸如叔-丁基酯(V)利用本领域已知的条件，例如通过加热适合的溶剂，诸如乙醇或者N-甲基吡咯烷酮中的两个反应物进行缩合而获得。常规的逐步反应以及纯化产生目标产物或者酯衍生物，它们可以在酸性或者碱性条件下水解产生所需的丁酸(I’)(流程3)。
流程3
利用上述的合成法合成式(I)化合物的其它实例提供在下文的实验部分中。
当必需或者需求时，可以任何顺序进行下列任何的一个或者多个步骤：
(i)除去任何保留的保护基；
(ii)将式(I)的化合物或者其保护形式转化成式(I)的其它化合物或者其保护形式；
(iii)将式(I)的化合物或者其保护形式转化成式(I)化合物的N-氧化物、盐、季胺或者溶剂化物或者其保护形式；
(iv)将式(I)的化合物的N-氧化物、盐、季胺或者溶剂化物或者其保护形式转化成式(I)的化合物或者其保护形式；
(v)将式(I)的化合物的N-氧化物、盐、季胺或者溶剂化物或者其保护形式转化成式(I)化合物的另一N-氧化物、可药用加成盐、季胺或者溶剂化物或者其保护形式。
本领域技术人员应该认识到在如上所述的方法中中间体化合物的官能团可能需要被保护基封闭。
所希望保护的官能团包括羟基、氨基以及羧酸。羟基的适合的保护基包括三烷基甲硅烷基(例如叔-丁基二甲基甲硅烷基，叔-丁基二苯基甲硅烷基或者三甲基甲硅烷基)，苯甲基以及四氢-吡喃基。氨基的合适保护基包括叔丁氧羰基或者苄氧基羰基。羧酸的合适的保护基包括C(1-6)烷基或者苄基酯。
可以在反应步骤之前或者之后进行官能团的保护以及去保护。
保护基的应用详尽描述在TW Greene & P G M Wutz，John Wiley&Sons公司(1999年6月)第三版‘Protective Groups in OrganicSynthesis’中。
另外，式(I)化合物中的N-原子可以通过本领域已知的方法利用适合溶剂例如2-丙酮、四氢呋喃或者二甲基甲酰胺中的CH3-I甲基化。
在上文提到的反应步骤中使用的一些中间体以及起始材料是已知的化合物并且可以市售获得或者可以根据本领域已知的方法进行制备。
治疗方法
本发明还提供了使用上述分析中的一种识别为GABAB受体活性调节剂的化合物，尤其是上文所述的式(I)的化合物在制备用于治疗诸如僵人综合症、胃食管反流、神经性疼痛、失禁的适应症以及治疗咳嗽以及可卡因成瘾的药物中的应用。尤其是制备用于减少短暂性食管下端括约肌松驰(TLESR)的药物中的应用。因此本发明的目的是提供治疗温血动物，例如包括人的哺乳动物诸如僵人综合症、胃食管反流、神经性疼痛、失禁的适应症以及治疗咳嗽以及可卡因成瘾尤其是TLESR的方法。
所述方法包括给需要治疗的温血动物给予有效量的利用本发明方法识别为GABAB受体调节剂的化合物。尤其是系统或者局部给予包括人的温血动物有效量的本发明的化合物。
这种药物可以配制成包括连同可药用载体或者稀释剂的药物的组合物。该药物可以是生理功能衍生物的形式，诸如酯或者盐，诸如酸加成盐或者碱金属盐，或者N或者S氧化物。组合物可以配制用于任何合适的给予途径合方式。可药用载体或者稀释剂包括适用于口服，直肠，鼻，可吸入，局部(包括口腔或者舌下)，阴道或者肠胃外的(包括皮下，肌内，静脉内，皮内，鞘内以及硬膜外)给予的制剂中的那些。载体或者稀释剂的选择当然将取决于推荐的给予途径，其可以取决于药物及其治疗目的。制剂可以方便地以单位剂型存在并且可以由药学领域任何已知的方法进行制备。这种方法包括将活性成分与构成一或者多种助剂的载体结合的步骤。通常，通过均匀并紧密地将活性成分与液体载体或者细分散的固体载体或者二者结合然后如有必要将产物成形而制备制剂。
对于固体组合物而言，传统的无毒固体载体包括例如药品级甘露糖醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等可被使用。如上所限定的活性化合物可以利用例如聚二醇，乙酰化甘油三酯等作为载体配制成栓剂。液体药用可给予的组合物可以例如通过将上述的活性化合物以及任选的药用佐剂溶解，分散等在例如水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等载体中由此形成溶液或者悬浮液而进行制备。如果需要，待给予的药用组合物还可以包含微量的无毒助剂物质诸如润湿或者乳化剂，pH缓冲剂等等，例如，乙酸钠、单月桂酸山梨醇酐酯、三乙醇胺乙酸钠、单月桂酸山梨醇酐酯、油酸三乙醇胺酯等等。制备这种剂型的现行方法是已知的或者对本领域技术人员是显而易见的；例如参见Gennaro等人的Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack出版公司，Easton，宾尼法尼亚州，第18版，1990。
总之待给予的组合物或者制剂将包含大量的缓解待治疗受试者症状的有效量的活性化合物。
可以制备包含0.25到95％范围内的活性成分以及由无毒载体组成的余量的剂型或者组合物。
对于口服而言，可药用无毒组合物由掺入任何通常采用的赋形剂，例如药品级甘露糖醇、乳糖、纤维素、纤维素衍生物、交联羧甲纤维素(crosscarmellose)钠、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁(magnesium，carbonate)等进行制备。这种组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等的形式。这种组合物可以包含1％-95％的活性成分，更优选2-50％，最优选5-8％。
肠胃外给予的通常特征在于皮下、肌内或者静脉内注射。注射剂可以常规的形式制备，作为液体溶液或者悬浮液，适于注射之前溶解或者悬浮在液体中的固态或者作为乳剂。合适的赋形剂为例如水、盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等。此外，如果需要，待给予的药用组合物还可以包含微量的无毒助剂物质诸如润湿或者乳化剂，pH缓冲剂等等，例如，乙酸钠、单月桂酸山梨醇酐酯，油酸三乙醇胺酯，三乙醇胺乙酸钠等。
这种原组合物中所含的活性化合物的百分比高度依赖于其特异性，化合物的活性以及受试者的需要。然而，溶液中可使用0.1％到10％的活性成分的百分比，如果组合物为其后将稀释到上述百分比的固体，该百分比可能更高。优选地，组合物将包括溶液中0.2-2％的活性药物。
在整个说明书中，分子生物学技术范畴中使用的术语“常规方法”，“常规方案”以及“常规过程”应该被理解为普通实验室手册中的方案以及过程如：Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel等编，John Wiley and Sons，Inc.1994，或者Sambrook，J.，Fritsch，E.F.以及Maniatis，T.的分子克隆：实验室手册，第2版，ColdSpring Harbour Laboratony Press，Cold Spring Harbor，NY 1989。
本发明最好参考下述的实验细节进行理解，而且本领域技术人员应该认识到这些仅仅是用来示例在下述权利要求中更全面描述的本发明。另外，贯穿本申请引用了多个公开物。这些公开物的公开内容在本申请中引入作为参考从而更全面描述本发明所从属的技术领域的状况。
实验部分
I合成GABAB激动剂
在下文描述的过程中，使用下列缩写：“DIPE”代表“二异丙醚”；“EtOAc”代表乙酸乙酯。
对于一些化学试剂，使用化学式，例如，CH3CN指乙腈，NH3指氨，CH2Cl2指二氯甲烷，MgSO4指硫酸镁，HCl指盐酸。
A.制备中间体
实施例A.1
制备
Figure A20048002604000251
中间体1
以及 中间体2
将1，1-二甲基乙基4-氨基丁酸酯[50479-22-6](14g，0.087mol)和5，5-二甲基-1，3-环己二酮[126-81-8](12.26g，0.087mol)溶于三氯甲烷(250ml)中，并添加N，N-二乙基乙胺(0,5ml)。搅拌反应混合物3天并随后用3份250ml的水漂洗。在MgSO4上干燥有机层并减压浓缩。残余物在DIPE/CH3CN中重结晶产生18.6g(76％)的中间体1。
将该产物吸入甲醇(250ml)和水(100ml)中。在30分钟的时间内逐份添加1-溴代-2，5-吡咯烷二酮(11.8g，0.066mol)。另外搅拌1小时后，添加500ml的水。用3份二氯甲烷萃取混合物。在MgSO4上干燥合并的有机层并减压浓缩产生22g(92％)的中间体2。
还以类似的方式制备： 中间体3
实施例A.2
制备
Figure A20048002604000262
中间体4
在85℃搅拌乙醇(q.s.)中的5，6-二氨基-4(1H)-嘧啶硫酮[2846-89-1](0.0027mol)和中间体2(0.0027mol)的混合物2小时。过滤反应混合物并蒸发溶剂。经高效液相色谱纯化残余物。收集产物级分并蒸发溶剂(CH3CN)。用EtOAc萃取水层。分离，干燥(MgSO4)，过滤有机层并蒸发溶剂产生0.400g(30％)的中间体4。
实施例A.3
制备
Figure A20048002604000263
中间体5
在140℃搅拌1-甲基-2-吡咯烷酮[872-50-4](15ml)中的2-氨基苯硫醇[137-07-5](0.004摩尔)和中间体2(0.004mol)的混合物1小时。冷却反应混合物并用EtOAc/H2O(NH3)分离所述层。干燥(Mg2SO4)有机层、过滤并蒸发溶剂。经高效液相色谱纯化残余物。收集产物级分并蒸发溶剂(CH3CN)。用EtOAc萃取水层然后干燥(MgSO4)有机层，滤出并蒸发溶剂，产生0.6g(40％)的中间体5。
B.制备化会物
实施例B.1
制备
Figure A20048002604000271
化合物2
室温下搅拌三氟乙酸(5ml)中的中间体4(0.001mol)和二氯甲烷(5ml)的混合物1小时。氮气流下干燥反应混合物。将产生的残余物悬浮在二乙醚中。在30℃滤出目标产物并干燥(真空)，产生0.120g(23％)的化合物2的三氟乙酸盐。
同样还制备了：
化合物1
Figure A20048002604000272
氢溴酸盐
以及化合物4
Figure A20048002604000273
三氟乙酸盐
实施例B.2
制备
Figure A20048002604000274
化合物3
室温下搅拌三氟乙酸(5ml)中的中间体5(0.00155mol)和二氯甲烷(5ml)的混合物20小时。氮气流下干燥反应混合物。将产生的残余物在二乙醚中固化。在30℃滤出目标产物并干燥(真空)，产生0.320g(67％)的化合物3的三氟乙酸盐。
II培育GABAB-CHO-K1细胞
材料和方法
利用Lipofectamine PLUS对CHO-K1细胞永久性转染GABABR1a和GABABR2：
用hGABABR1a/pcDNA3.1转染CHO-细胞。用hGABABR2/pcDNA3.1Hygro+转染表达稳定单克隆R1a的细胞。用800μg遗传霉素+800μg hygromycine/ml选择克隆。
膜制备物：
4℃用pH7.4的50mM TrisHCl中的PBS短时间漂洗并在23500g离心10分钟后刮取丁酸酯-刺激(5mM终浓度)的细胞。经Ultra-Turrax(24000rpm)在5mM pH 7.4的TrisHCl中对沉淀(pellet)匀质化然后4℃在30000g离心20分钟。将产生的沉淀再悬浮在50mM的pH 7.4的TrisHCl中并再次匀质化。利用Bradford法测定蛋白浓度。
GTPγ35S活性分析：
在有或者没有1mM GABA(不存在巴氯芬时的基本活性)的条件下于37℃，将10μg的膜制备物培养在250μl的含20mM的pH 7.4的Hepes，100mM NaCl，3mM MgCl2，0.25nM GTPγ35S，3μMGDP，10μg皂苷/ml溶液中达20分钟。在Harvester(Packard)的96-孔GF/B滤板上进行过滤。用冷的pH 7.4的10mM磷酸盐缓冲液清洗滤器6次，并在添加30μl Microscint O之前过夜干燥并在Topcount(Packard，1min/孔)测量。
3H-激动剂结合：
在20℃将30-60μg膜制备物培养在pH 7.4的50mM TrisHCl，2.5mM CaCl2，10nM 3H-GABA或者20nM 3H-巴氯芬的500μl的溶液中。在存在100μM巴氯芬的条件下测定非特异性结合。90分钟后将混合物经Harvester(Packard)转移到96-孔GF/B滤板上。用冷的50mM的pH 7.4的TrisHCl，2.5mM CaCl2清洗滤器6次，并在添加30μl的Microscint O之前过夜干燥，并在Topcount(Packard，1min./孔)中进行测量。
结果
GTPγ35S活性分析
在稳定转染了hGABABR1a的CHO-细胞膜中，测定拮抗剂3H-CGP54626的结合。在那些具有最高拮抗剂结合的R1a-克隆中共转染hGABABR2。亚克隆后，获得了在经GABA刺激膜时的GTPγ35S-分析中显示功能活性的稳定克隆，其中所述活性在正效调节剂CGP7930的存在下得以加强(Urwyler S.等人，2001，Molecular Pharmacology60：963-971)(图1)。
激动剂过滤结合分析
在96-孔GF/B滤板中开发了激动剂过滤结合分析。测定已知激动剂和拮抗剂的IC50(图2)。虽然表达稳定hGABABR1a或者瞬时hGABABR2的单体GABAB受体的细胞没有显示与激动剂3H-GABA或者3H-巴氯芬的任何结合(数据未显示)，然而出乎意料的是用两个配体在我们的hGABABR1a/R2异二聚体克隆中检测到了激动剂的结合。在饱和度实验中测定3H-巴氯芬、3H-GABA以及3H-CGP54626的Kd并与组织制备物获得的公布结果进行充分比较(表1)。
表1
3H-巴氯芬
大鼠                            132nM  (Hill & Bowery，1981)
狗脑皮层                        28nM   (J&JPRD，2000)
hGABABR1aR2/CHO                30nM   (我们的数据，n＝2))
3H-GABA
大鼠                            77nM     (Hill & Bowery，1983)
大鼠                            15-30nM  (Cross & Horton，1988)
猪                              26nM     (Facklam & Bowery，1993)
人                              20-30nM  (Cross & Horton，1988)
hGABABR1aR2/CHO                10-30nM  (我们的数据，n＝6)
3H-CGP54626
大鼠                            1.5nM   (Bittiger等人，1993)
猪                              1.35nM  (Facklam & Bowery，1993)
hGABABR1aR2/CHO                1.5nM   (Green等人，1993)
hGABABR1aR2/CHO                2.78nM  (我们的数据，n＝1)
对激动剂的效力的顺序为AMPA＞GABA＞巴氯芬，并且对拮抗剂的效力的顺序为CGP54626＞SCH50911(图2)。在不同的膜制备物之间获得的IC50具有可重现性(图3)。
当全库筛选时，我们识别到一些与参照化合物GABA和巴氯芬具有可比效力的结合以及信号转导特性的化合物(表2)。
Figure A20048002604000301
表2：GABA配体结合，以及GTPγS信号转导分析中对于参照化合物以及HTS击中的pIC50以及％效果。
激动剂离心结合分析在另一结合分析中，用离心代替过滤从膜分离未结合的配体。根据先前描述的过滤结合分析进行该分析，差别在于在微量离心机中以12500rpm离心10分钟从膜分离未结合的配体。抛弃上清液，用漂洗缓冲液清洗沉淀并溶于200μl水中。添加闪烁(Scintillation)流体并在Topcount(Packhard，1min./孔)中测定结合的3H-GABA。
在饱和度分析中利用浓度逐渐增加的3H-GABA(终浓度1-400nM)I发现了由hGABABR1a/GABABR2CHO细胞系表达的GABAB受体具有低以及高亲合性激动剂的结合位点。饱和度以及scatchard分析的结果概括在表3中。在10μM GABAB拮抗剂CGP54626或者本发明的一种GABAB激动剂(化合物1)存在下进行饱和度分析时，阻断了3H-GABA与高以及低亲合性位点的结合(图4a，b)。
表3
平均值(n＝5)nM   SDnM
  Bmax 1Kd 1Bmax 2Kd 2 0.199.40.76401   0.053.10.24224
讨论
据我们所知，在有关重组hGABAB受体的文献中并没有报道显示在过滤结合分析中激动剂与高以及低亲合性结合位点的结合。已经利用3H-GABA开发了HTS激动剂过滤结合筛选。我们发现了已知激动剂以及拮抗剂的可重现性的Ki值，而与膜制备物无关。
此外还证实了重组GABAB受体具有两个激动剂结合位点。一个高亲合性以及一个低亲合性结合位点。可以预料GABAB受体的高亲合性激动剂与低亲合性激动剂相比将引发不同的应答。因此，本发明的细胞系不仅可以识别GABAB受体激动剂，而且还提供了表征化合物-受体相互作用的特性的有用工具。
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  0-2   国际申请号
  0-3   申请人或代理人档案号   PRD2108-PCTf
  11-1   以下说明涉及在说明书中所引用的保藏的微生物或着其它生物材料：页码 第3页第4行(中文)
  1-31-3-11-3-21-3-31-3-4   保藏特征保藏机构名称保藏机构地址保藏日期登录号 LMBP Vakgroep voor Moleculairebiologie-Plasmidencollectie(BCCM/LMBP)Universiteit Gent，K.L.Ledeganckstraat 35，B-9000Gent，Belgium2003年8月22日(22.08.2003)LMBP 6046CB
  1-4   补充说明   CHO-K1h-GABA-b R1a/R2克隆20
  1-5   指定国说明   所有指定国
仅用于受理局
 0-4   此表同国际申请一起收到(是或否)   2004年9月3日(03.09.2004)是
 0-4-1   授权的官员
仅用于国际局
  0-5   国际局收到此表，于
  0-5-1   授权的官员
比利时微生物保藏中心-BCCMTMLMBP保藏中心
第1页BCCMTM/LMBP/BP/4/03-14表原始保藏时的收据
       国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
按照7.1条，由下页底部所指明的国际保藏单位BCCMTM/LMBP所给出
                    的原始保藏时的收据
              国际BCCMTM/LMBP/BP/4/03-14表
至：保藏人名称：詹森药业有限公司(Janssen Pharmaceutica
                N.V.)
地址：          Turnhoutseweg 30
                B-2340 Beerse
I  微生物鉴定
1.1保藏人给出的鉴定参考号
  CHO-K1h-GABA-b R1a/R2克隆20
1.2国际保藏单位给出的登录号
  LMBP 6046CB
比利时微生物保藏中心-BCCMTMLMBP保藏中心
第2页BCCMTM/LMBP/BP/4/03-14表原始保藏时的收据
II  科学性描述和/或建议分类命名
    对上述I鉴定的微生物附带
                               (以十字作标记，适用框)
    -科学性描述                是□         否
Figure A20048002604000341
    -建议分类命名              是□         否
Figure A20048002604000342
III  收据和确认
     本国际保藏单位接收上述I鉴定的微生物，
     其收到日为(原始保藏日期)    2003年8月22日
IV   国际保藏单位
     比利时微生物保藏中心(BCCMTM)
     Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidencollectle
     (LMBP)
     Universiteit Gent
     Technologiepark 927
     B-9052Gent-Zwijnaarde，Belgium
     署名(具有代表国际保藏单位权利的人或授权的官员的署名)
     日期：2003年9月8日        Martine Vanhoucke
                               BCCM/LMBP馆长
序列表
<110>詹森药业有限公司(Janssen PharmaceuticaN.V.)
<120>嵌合GABAB受体(CHIMERIC GABAB RECEPTOR)
<130>PRD 2108
<150>PCT/EP03/10263
<151>2003-09-12
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2886
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2886)
<223>
<400>1
atgttgctgc tgctgctact ggcgccactc ttcctccgcc ccccgggcgc gggcggggcg    60
cagaccccca acgccacctc agaaggttgc cagatcatac acccgccctg ggaagggggc    120
atcaggtacc ggggcctgac tcgggaccag gtgaaggcta tcaacttcct gccagtggac    180
tatgagattg agtatgtgtg ccggggggag cgcgaggtgg tggggcccaa ggtccgcaag    240
tgcctggcca acggctcctg gacagatatg gacacaccca gccgctgtgt ccgaatctgc    300
tccaagtctt atttgaccct ggaaaatggg aaggttttcc tgacgggtgg ggacctccca    360
gctctggacg gagcccgggt ggatttccgg tgtgaccccg acttccatct ggtgggcagc    420
tcccggagca tctgtagtca gggccagtgg agcaccccca agccccactg ccaggtgaat    480
cgaacgccac actcagaacg gcgcgcagtg tacatcgggg cactgtttcc catgagcggg    540
ggctggccag ggggccaggc ctgccagccc gcggtggaga tggcgctgga ggacgtgaat    600
agccgcaggg acatcctgcc ggactatgag ctcaagctca tccaccacga cagcaagtgt    660
gatccaggcc aagccaccaa gtacctatat gagctgctct acaacgaccc tatcaagatc    720
atccttatgc ctggctgcag ctctgtctcc acgctggtgg ctgaggctgc taggatgtgg    780
aacctcattg tgctttccta tggatccagc tcaccagccc tgtcaaaccg gcagcgtttc    840
cccactttct tccgaacgca cccatcagcc acactccaca accctacccg cgtgaaactc    900
tttgaaaagt ggggctggaa gaagattgct accatccagc agaccactga ggtcttcact    960
tcgactctgg acgacctgga ggaacgagtg aaggaggctg gaattgagat tactttccgc    1020
cagagtttct tctcagatcc agctgtgccc gtcaaaaacc tgaagcgcca ggatgcccga    1080
atcatcgtgg gacttttcta tgagactgaa gcccggaaag ttttttgtga ggtgtacaag    1140
gagcgtctct ttgggaagaa gtacgtctgg ttcctcattg ggtggtatgc tgacaattgg    1200
ttcaagatct acgacccttc tatcaactgc acagtggatg agatgactga ggcggtggag    1260
ggccacatca caactgagat tgtcatgctg aatcctgcca atacccgcag catttccaac    1320
atgacatccc aggaatttgt ggagaaacta accaagcgac tgaaaagaca ccctgaggag    1380
acaggaggct tccaggaggc accgctggcc tatgatgcca tctgggcctt ggcactggcc    1440
ctgaacaaga catctggagg aggcggccgt tctggtgtgc gcctggagga cttcaactac    1500
aacaaccaga ccattaccga ccaaatctac cgggcaatga actcttcgtc ctttgagggt    1560
gtctctggcc atgtggtgtt tgatgccagc ggctctcgga tggcatggac gcttatcgag    1620
cagcttcagg gtggcagcta caagaagatt ggctactatg acagcaccaa ggatgatctt    1680
tcctggtcca aaacagataa atggattgga gggtcccccc cagctgacca gaccctggtc    1740
atcaagacat tccgcttcct gtcacagaaa ctctttatct ccgtctcagt tctctccagc    1800
ctgggcattg tcctagctgt tgtctgtctg tcctttaaca tctacaactc acatgtccgt    1860
tatatccaga actcacagcc caacctgaac aacctgactg ctgtgggctg ctcactggct    1920
ttagctgctg tcttccccct ggggctcgat ggttaccaca ttgggaggaa ccagtttcct    1980
ttcgtctgcc aggcccgcct ctggctcctg ggcctgggct ttagtctggg ctacggttcc    2040
atgttcacca agatttggtg ggtccacacg gtcttcacaa agaaggaaga aaagaaggag    2100
tggaggaaga ctctggaacc ctggaagctg tatgccacag tgggcctgct ggtgggcatg    2160
gatgtcctca ctctcgccat ctggcagatc gtggaccctc tgcaccggac cattgagaca    2220
tttgccaagg aggaacctaa ggaagatatt gacgtctcta ttctgcccca gctggagcat    2280
tgcagctcca ggaagatgaa tacatggctt ggcattttct atggttacaa ggggctgctg    2340
ctgctgctgg gaatcttcct tgcttatgag accaagagtg tgtccactga gaagatcaat    2400
gatcaccggg ctgtgggcat ggctatctac aatgtggcag tcctgtgcct catcactgct    2460
cctgtcacca tgattctgtc cagccagcag gatgcagcct ttgcctttgc ctctcttgcc    2520
atagttttct cctcctatat cactcttgtt gtgctctttg tgcccaagat gcgcaggctg    2580
atcacccgag gggaatggca gtcggaggcg caggacacca tgaagacagg gtcatcgacc    2640
aacaacaacg aggaggagaa gtcccggctg ttggagaagg agaaccgtga actggaaaag    2700
atcattgctg agaaagagga gcgtgtctct gaactgcgcc atcaactcca gtctcggcag    2760
cagctccgct cccggcgcca cccaccgaca ccccccagaac cctctggggg cctgcccagg   2820
ggaccccctg agccccccga ccggcttagc tgtgatggga gtcgagtgca tttgctttat    2880
aagtga                                                               2886
<210>2
<211>961
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
MLLLLLLAPL FLRPPGAGGA QTPNATSEGC QIIHPPWEGG IRYRGLTRDQ VKAINFLPVD    60
YEIEYVCRGE REVVGPKVRK CLANGSWTDM DTPSRCVRIC SKSYLTLENG KVFLTGGDLP    120
ALDGARVDFR CDPDFHLVGS SRSICSQGQW STPKPHCQVN RTPHSERRAV YIGALFPMSG    180
GWPGGQACQP AVEMALEDVN SRRDILPDYE LKLIHHDSKC DPGQATKYLY ELLYNDPIKI    240
ILMPGCSSVS TLVAEAARMW NLIVLSYGSS SPALSNRQRF PTFFRTHPSA TLHNPTRVKL    300
FEKWGWKKIA TIQQTTEVFT STLDDLEERV KEAGIEITFR QSFFSDPAVP VKNLKRQDAR    360
IIVGLFYETE ARKVFCEVYK ERLFGKKYVW FLIGWYADNW FKIYDPSINC TVDEMTEAVE    420
GHITTEIVML NPANTRSISN MTSQEFVEKL TKRLKRHPEE TGGFQEAPLA YDAIWALALA    480
LNKTSGGGGR SGVRLEDFNY NNQTITDQIY RAMNSSSFEG VSGHVVFDAS GSRMAWTLIE    540
QLQGGSYKKI GYYDSTKDDL SWSKTDKWIG GSPPADQTLV IKTFRFLSQK LFISVSVLSS    600
LGIVLAVVCL SFNIYNSHVR YIQNSQPNLN NLTAVGCSLA LAAVFPLGLD GYHIGRNQFP    660
FVCQARLWLL GLGFSLGYGS MFTKIWWVHT VFTKKEEKKE WRKTLEPWKL YATVGLLVGM    720
DVLTLAIWQI VDPLHRTIET FAKEEPKEDI DVSILPQLEH CSSRKMNTWL GIFYGYKGLL    780
LLLGIFLAYE TKSVSTEKIN DHRAVGMAIY NVAVLCLITA PVTMILSSQQ DAAFAFASLA    840
IVFSSYITLV VLFVPKMRRL ITRGEWQSEA QDTMKTGSST NNNEEEKSRL LEKENRELEK    900
IIAEKEERVS ELRHQLQSRQ QLRSRRHPPT PPEPSGGLPR GPPEPPDRLS CDGSRVHLLY    960
K                                                                    961
<210>3
<211>2823
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2823)
<223>
<400>3
atggcttccc cgcggagctc cgggcagccc gggccgccgc cgccgccgcc accgccgccc    60
gcgcgcctgc tactgctact gctgctgccg ctgctgctgc ctctggcgcc cggggcctgg    120
ggctgggcgc ggggcgcccc ccggccgccg cccagcagcc cgccgctctc catcatgggc    180
ctcatgccgc tcaccaagga ggtggccaag ggcagcatcg ggcgcggtgt gctccccgcc    240
gtggaactgg ccatcgagca gatccgcaac gagtcactcc tgcgccccta cttcctcgac    300
ctgcggctct atgacacgga gtgcgacaac gcaaaaagggt tgaaagcctt ctacgatgca   360
ataaaatacg ggccgaacca cttgatggtg tttggaggcg tctgtccatc cgtcacatcc    420
atcattgcag agtccctcca aggctggaat ctggtgcagc tttcttttgc tgcaaccacg    480
cctgttctag ccgataagaa aaaataccct tatttctttc ggaccgtccc atcagacaat    540
gcggtgaatc cagccattct gaagttgctc aagcactacc agtggaagcg cgtgggcacg    600
ctgacgcaag acgttcagag gttctctgag gtgcggaatg acctgactgg agttctgtat    660
ggcgaggaca ttgagatttc agacaccgag agcttctcca acgatccctg taccagtgtc    720
aaaaagctga aggggaatga tgtgcggatc atccttggcc agtttgacca gaatatggca    780
gcaaaagtgt tctgttgtgc atacgaggag aacatgtatg gtagtaaata tcagtggatc    840
attccgggct ggtacgagcc ttcttggtgg gagcaggtgc acacggaagc caactcatcc    900
cgctgcctcc ggaagaatct gcttgctgcc atggagggct acattggcgt ggatttcgag    960
cccctgagct ccaagcagat caagaccatc tcaggaaaga ctccacagca gtatgagaga    1020
gagtacaaca acaagcggtc aggcgtgggg cccagcaagt tccacgggta cgcctacgat    1080
ggcatctggg tcatcgccaa gacactgcag agggccatgg agacactgca tgccagcagc    1140
cggcaccagc ggatccagga cttcaactac acggaccaca cgctgggcag gatcatcctc    1200
aatgccatga acgagaccaa cttcttcggg gtcacgggtc aagttgtatt ccggaatggg    1260
gagagaatgg ggaccattaa atttactcaa tttcaagaca gcagggaggt gaaggtggga    1320
gagtacaacg ctgtggccga cacactggag atcatcaatg acaccatcag gttccaagga    1380
tccgaaccac caaaagacaa gaccatcatc ctggagcagc tgcggaagat ctccctacct    1440
ctctacagca tcctctctgc cctcaccatc ctcgggatga tcatggccag tgcttttctc    1500
ttcttcaaca tcaagaaccg gaatcagaag ctcataaaga tgtcgagtcc atacatgaac    1560
aaccttatca tccttggagg gatgctctcc tatgcttcca tatttctctt tggccttgat    1620
ggatcctttg tctctgaaaa gacctttgaa acactttgca ccgtcaggac ctggattctc    1680
accgtgggct acacgaccgc ttttggggcc atgtttgcaa agacctggag agtccacgcc    1740
atcttcaaaa atgtgaaaat gaagaagaag atcatcaagg accagaaact gcttgtgatc    1800
gtggggggca tgctgctgat cgacctgtgt atcctgatct gctggcaggc tgtggacccc    1860
ctgcgaagga cagtggagaa gtacagcatg gagccggacc cagcaggacg ggatatctcc    1920
atccgccctc tcctggagca ctgtgagaac acccatatga ccatctggct tggcatcgtc    1980
tatgcctaca agggacttct catgttgttc ggttgtttct tagcttggga gacccgcaac    2040
gtcagcatcc ccgcactcaa cgacagcaag tacatcggga tgagtgtcta caacgtgggg    2100
atcatgtgca tcatcggggc cgctgtctcc ttcctgaccc gggaccagcc caatgtgcag    2160
ttctgcatcg tggctctggt catcatcttc tgcagcacca tcaccctctg cctggtattc    2220
gtgccgaagc tcatcaccct gagaacaaac ccagatgcag caacgcagaa caggcgattc    2280
cagttcactc agaatcagaa gaaagaagat tctaaaacgt ccacctcggt caccagtgtg    2340
aaccaagcca gcacatcccg cctggagggc ctacagtcag aaaaccatcg cctgcgaatg    2400
aagatcacag agctggataa agacttggaa gaggtcacca tgcagctgca ggacacacca    2460
gaaaagacca cctacattaa acagaaccac taccaagagc tcaatgacat cctcaacctg    2520
ggaaacttca ctgagagcac agatggagga aaggccattt taaaaaatca cctcgatcaa    2580
aatccccagc tacagtggaa cacaacagag ccctctcgaa catgcaaaga tcctatagaa    2640
gatataaact ctccagaaca catccagcgt cggctgtccc tccagctccc catcctccac    2700
cacgcctacc tcccatccat cggaggcgtg gacgccagct gtgtcagccc ctgcgtcagc    2760
cccaccgcca gcccccgcca cagacatgtg ccaccctcct tccgagtcat ggtctcgggc    2820
ctg                                                                  2823
<210>4
<211>941
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
MASPRSSGQP GPPPPPPPPP ARLLLLLLLP LLLPLAPGAW GWARGAPRPP PSSPPLSIMG    60
LMPLTKEVAK GSIGRGVLPA VELAIEQIRN ESLLRPYFLD LRLYDTECDN AKGLKAFYDA    120
IKYGPNHLMV FGGVCPSVTS IIAESLQGWN LVQLSFAATT PVLADKKKYP YFFRTVPSDN    180
AVNPAILKLL KHYQWKRVGT LTQDVQRFSE VRNDLTGVLY GEDIEISDTE SFSNDPCTSV    240
KKLKGNDVRI ILGQFDQNMA AKVFCCAYEE NMYGSKYQWI IPGWYEPSWW EQVHTEANSS    300
RCLRKNLLAA MEGYIGVDFE PLSSKQIKTI SGKTPQQYER EYNNKRSGVG PSKFHGYAYD    360
GIWVIAKTLQ RAMETLHASS RHQRIQDFNY TDHTLGRIIL NAMNETNFFG VTGQVVFRNG    420
ERMGTIKFTQ FQDSREVKVG EYNAVADTLE IINDTIRFQG SEPPKDKTII LEQLRKISLP    480
LYSILSALTI LGMIMASAFL FFNIKNRNQK LIKMSSPYMN NLIILGGMLS YASIFLFGLD    540
GSFVSEKTFE TLCTVRTWIL TVGYTTAFGA MFAKTWRVHA IFKNVKMKKK IIKDQKLLVI    600
VGGMLLIDLC ILICWQAVDP LRRTVEKYSM EPDPAGRDIS IRPLLEHCEN THMTIWLGIV    660
YAYKGLLMLF GCFLAWETRN VSIPALNDSK YIGMSVYNVG IMCIIGAAVS FLTRDQPNVQ    720
FCIVALVIIF CSTITLCLVF VPKLITLRTN PDAATQNRRF QFTQNQKKED SKTSTSVTSV    780
NQASTSRLEG LQSENHRLRM KITELDKDLE EVTMQLQDTP EKTTYIKQNH YQELNDILNL    840
GNFTESTDGG KAILKNHLDQ NPQLQWNTTE PSRTCKDPIE DINSPEHIQR RLSLQLPILH    900
HAYLPSIGGV DASCVSPCVS PTASPRHRHV PPSFRVMVSG L                        941

Claims (29)

1.一种分离的GABAB受体蛋白，包括至少一个GABABR1a亚基以及至少一个GABABR2亚基，其特征在于所述GABAB受体具有一个高亲合性激动剂结合位点以及一个低亲合性激动剂结合位点。
2.根据权利要求1的GABAB受体蛋白，其中GABABR1a亚基由SEQ ID No.1组成的寡核苷酸序列编码并且GABABR2亚基由SEQ IDN0.3组成的寡核苷酸序列编码。
3.根据权利要求1或者2的GABAB受体蛋白，其中所述受体蛋白由保藏在比利时微生物保藏中心(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2CHO细胞系表达，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO-K1h-GABA-b R1a/R2克隆20，登录号为LMBP 6046CB。
4.权利要求1到3任一项的GABAB受体蛋白在识别GABAB受体激动剂或者拮抗剂的方法中的应用。
5.保藏在比利时微生物保藏中心(BCCM)的hGABABR1a/GABABR2CHO细胞系，所述细胞系在2003年8月22日保藏为CHO-K1h-GABA-b R1a/R2克隆，登录号为LMBP 6046CB。
6.识别一种试验化合物是否与权利要求1到3任一项的GABAB受体蛋白结合从而确定该化合物是GABAB受体的潜在激动剂或者拮抗剂的方法，所述方法包括：
a)在已知结合GABAB受体的化合物存在或者缺乏的条件下将表达功能性GABAB受体的细胞与所述试验化合物接触，其中所述细胞通常不表达GABAB受体，以及
b)利用已知结合GABAB受体的化合物作为参照确定试验化合物与GABAB受体的结合。
7.根据权利要求6的方法，其中已知结合GABAB受体的化合物被可检测地标记，并且其中所述标记被用于确定试验化合物与该GABAB受体的结合。
8.根据权利要求7的方法，其中已知结合GABAB受体的化合物选自3H-GABA、3H-巴氯芬、3H-3-APPA、3H-CGP542626和3H-SCH50911。
9.一种识别GABAB受体激动剂的方法，所述方法包括：
a)在试验化合物存在以及缺乏的条件下将表达功能性GABAB受体的细胞暴露于GABAB的标记的激动剂，其中所述细胞通常不表达GABAB受体，以及
b)确定标记的激动剂与所述细胞的结合，其中如果在试验化合物存在的条件下标记的激动剂的结合量较少，那么该化合物就是GABAB受体的潜在激动剂。
10.根据权利要求10的方法，其中标记的激动剂选自3H-GABA，3H-巴氯芬和3H-3-APPA。
11.一种识别GABAB受体拮抗剂的方法，所述方法包括：
a)在试验化合物存在以及缺乏的条件下将表达功能性GABAB受体的细胞暴露于GABAB的标记的拮抗剂，其中所述细胞通常不表达GABAB受体，以及
b)确定标记的拮抗剂与所述细胞的结合，
其中如果在试验化合物存在的条件下标记的拮抗剂的结合量较少，那么该化合物就是GABAB受体的潜在拮抗剂。
12.根据权利要求10的方法，其中标记的拮抗剂选自3H-CGP542626和3H-SCH50911。
13.一种识别作为GABAB受体激动剂的化合物的方法，所述方法包括：
a)在可检测标记的GABAB受体的激动剂的存在下给权利要求5的细胞的细胞组合物给予该化合物，以及
b)确定标记的激动剂与所述细胞组合物的结合，
其中如果在试验化合物的存在下标记的激动剂的结合量较少，那么该化合物就是GABAB受体的潜在激动剂。
14.根据权利要求13的方法，其中细胞组合物由权利要求5的细胞的膜组分组成。
15.根据权利要求13或者14的方法，其中标记的激动剂选自3H-GABA、3H-巴氯芬和3H-3-APPA。
16.一种识别作为GABAB受体拮抗剂的化合物的方法，所述方法包括：
a)在可检测标记的GABAB受体的拮抗剂的存在下给权利要求5的细胞的细胞组合物给予该化合物，以及
b)确定标记的拮抗剂与所述细胞组合物的结合，其中如果在试验化合物的存在下标记的拮抗剂的结合量较少，那么该化合物就是GABAB受体的潜在拮抗剂。
17.根据权利要求16的方法，其中细胞组合物由权利要求5的细胞的膜组分组成。
18.根据权利要求16或者17的方法，其中标记的拮抗剂选自3H-CGP542626和3H-SCH50911。
19.一种识别具有调节GABAB受体活性能力的化合物的方法，所述方法包括：
a)在允许GABAB受体激活的条件下，将表达功能性GABAB受体的细胞与至少一种参照化合物接触，其中所述细胞通常不表达功能性GABAB受体；
b)在允许GABAB受体激活的条件下，将步骤a)的细胞与试验化合物接触，以及
c)确定所述试验化合物与参照化合物相比是否调节GABAB受体的活性。
20.根据权利要求19的方法，其中利用选自如下的一种或者多种功能性应答测定试验化合物调节GABAB受体活性的能力：钾电流的改变，钙浓度的改变，cAMP的改变以及GTPγS结合的改变。
21.一种识别具有调节GABAB受体活性能力的化合物的方法，所述方法包括：
a)在允许GABAB受体激活的条件下，在放射性标记的GTPγS存在下将权利要求5的细胞的膜组分与待试验化合物接触；以及
b)确定GTPγS与膜组分的结合，其中在该化合物存在下GTPγS结合的增加指示该化合物激活了GABAB受体的活性。
22.一种识别具有调节GABAB受体活性能力的化合物的方法，所述方法包括：
a)在允许GABAB受体激活的条件下，在放射性标记的GTPγS存在下将权利要求5的细胞的膜组分与待试验化合物接触；以及
b)确定GTPγS与膜组分的结合，
其中在该化合物存在下GTPγS结合的降低指示该化合物灭活了GABAB受体的活性。
23.根据权利要求21或者22的方法，其中允许GABAB受体激活的条件包括GABAB受体激动剂的存在。
24.根据权利要求23的方法，其中GABAB受体激动剂选自GABA、巴氯芬以及3-APPA。
25.式(I)的化合物
Figure A2004800260400005C1
其N-氧化物形式、可药用加成盐及立体化学异构体的形式在制备用于治疗诸如僵人综合症、胃食管反流、神经性疼痛、失禁的适应症以及治疗咳嗽和可卡因成瘾的药物中的应用，在式(I)中
＝Z1-Z2＝Z3-Z4＝代表选自＝N-CH＝CH-N＝(a)、＝N-CH＝N-CH＝(b)、＝CH-N＝CH-N＝(c)、＝CH-CH＝CH-CH＝(d)、＝N-CH＝CH-CH＝(e)、＝CH-N＝C H-CH＝(f)、＝CH-CH＝N-CH＝(g)和＝CH-CH＝CH-N＝(h)的二价基；
R1代表氢、卤素、羟基、氰基、C1-6烷基、CF3、氨基或者单或者二(C1-4烷基)氨基；
R2代表氢、C1-6烷基或者羟基羰基-C1-6烷基-。
26.式(I)的化合物在制备用于减少短暂性食管下端括约肌松驰(TLESR)的药物中的应用。
27.式(I)的化合物，其中＝Z1-Z2＝Z3-Z4＝代表(a)、(b)或(d)，更优选其中＝Z1-Z2＝Z3-Z4＝代表(d)的那些式(I)的化合物。
28.权利要求27的化合物作为药物的应用。
29.权利要求27的化合物在制备用于减少短暂性食管下端括约肌松驰(TLESR)的药物中的应用。
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