CN1284966A

CN1284966A - 新型g蛋白偶联受体

Info

Publication number: CN1284966A
Application number: CN98813763A
Authority: CN
Inventors: S·阿马德; D·邦维尔; Y·福廷; P·莱姆波; D·奥多尼尔; S－H·沈
Original assignee: Astra Pharma Inc
Current assignee: AstraZeneca Canada Inc
Priority date: 1997-12-22
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2001-02-21
Also published as: SE9704836D0; NO20003221D0; TR200001861T2; WO1999032519A1; AU1990499A; AU756861B2; SK8752000A3; BR9814335A; US6696257B1; WO1999032519A9; IS5543A; EP1051434A1; NO20003221L; CA2316280C; US20090226932A1; IL136728A0; ES2262252T3; DE69834432D1; US20060068466A1; JP2001526064A

Abstract

本发明涉及主要发现于背根神经节中的新型G蛋白偶联受体。本发明包括受体蛋白以及编码该蛋白的核酸。血管紧张素Ⅰ和Ⅲ影响了用编码该受体的DNA转化的细胞中的钙信号。此外,本发明涉及使用所述受体的方法和组合物。

Description

新型G蛋白偶联受体

发明领域

本发明属于生物受体以及可以由这类受体制得的多种用途的普通领域。更具体而言，本发明涉及编码新型G蛋白偶联受体的核酸以及受体本身。

背景和现有技术

G蛋白偶联受体(GPCRs)构成了一个具有共同的结构排列的蛋白家族，其特征为细胞外N末端、可能构成跨膜结构域的七个疏水α螺旋以及细胞内C末端结构域。GPCRs和许多种配体结合，其通过激活转导G蛋白而引发细胞内信号(Caron，等人，Rec.Prog.Horm.Res.48∶277-290(1993)；Freedman等人，Rec.Prog.Horm.Res.51∶319-353(1996))。

目前为止已经克隆了超过300种GPCRs，一般认为存在大约超过1000种这样的受体。从机制上说，所有临床相关的药物中大约有50-60％都通过调节各种GPCRs的功能而发挥作用(Cudermann，等人，J.Mol.Med.73∶51-63(1995))。特别受关注的是位于背根神经节中的受体。这个区域的中枢神经系统受到参与疼痛的传导、调节以及感觉的主要或传入感觉神经元的密集支配。因此，来自这个区域的受体可被用于鉴定麻醉和镇痛的新药剂的测定中。

发明概述

本发明是基于发现了一种新型G蛋白偶联受体，该受体在结构上与先前报道的受体截然不同并且优先在背根神经节中表达。从大鼠中已经分离和测序了1种背根受体(DRR)，从人中分离和测序了6种。大鼠的受体命名为rDRR-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。人的受体命名为：

hDRR-1(SEQ ID NO：3)；

hDRR-2(SEQ ID NO：5)；

hDRR-3(SEQ ID NO：7)；

hDRR-4(SEQ ID NO：9)；

hDRR-5(SEQ ID NO：11)；和

hDRR-6(SEQ ID NO：13)。

除非特别说明，如本文所用的术语“DRR”是指来自人和大鼠两者的所有受体。

本发明的第一方面涉及除了以天然状态存在的以外的蛋白，上述蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11或13中所示的大鼠或人DRR组成的氨基酸序列。术语“在功能上由…组成”是指包括其序列已经进行了添加、缺失或取代而基本上没有改变受体的功能特征的任何受体蛋白。因此，本发明包含具有与序列表中所显示完全相同的氨基酸序列的蛋白，以及基本上没有差别的蛋白，这正如它们保留了DRR受体的基本的、定性的结合特征所证实的。本发明进而包含基本上由DRR氨基酸序列组成的基本上纯的蛋白，和DRR特异性结合的抗体(即对DRR的亲和性比对其它任何以天然状态存在的非DRR蛋白的亲和性大至少100倍)，以及通过一种方法制备的抗体，该方法包括将这种蛋白的药物上可接受的制剂注射到能产生所述抗体的动物中。在一个优选的实施方案中，通过将受体的药物可接受的制剂注射到小鼠中、然后将小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，从而生产出人或大鼠DRR的单克隆抗体。

本发明还涉及一种基本上纯的多核苷酸，该多核苷酸编码包括在功能上由大鼠DRR序列(如SEQ ID NO：1所示)或人DRR序列(如SEQ IDNO：3，5，7，9，11或13所示)组成的氨基酸序列的蛋白质。

本发明的这一方面包含编码基本上由序列表中所示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸、包括所述多核苷酸的表达载体和用所述载体转化的宿主细胞。还包括通过这种方式制备的宿主细胞产生的重组的大鼠和人DRR蛋白。

优选地，编码大鼠DRR的多核苷酸具有SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列，而编码人DRR的多核苷酸具有SEQ ID NO：3，5，7，9，11或13中所示的核苷酸序列。含有这些特定多核苷酸的用于表达DRR的载体和宿主细胞也是优选的。

另一方面，本发明涉及一种方法，该方法用于测定待测化合物和大鼠或人DRR结合的能力。该方法通过将DRR来源和已知结合受体的配体以及和待测化合物培养而进行。上述DRR来源应该基本上不含其它类型的G蛋白偶联受体，即存在的85％以上的所述受体都应该是相应于DRR的。完成培养后，通过结合配体已被置换的程度来确定测试化合物和DRR结合的能力。大鼠DRR应优选地相应于SEQ ID NO：1中所示的rDRR-1。人的受体应优选地为hDRR-1(SEQ ID NO：3)、hDRR-2(SEQID NO：5)、hDRR-3(SEQ ID NO：7)、hDRR-4(SEQ ID NO：9)、hDRR-5(SEQID NO：11)或hDRR-6(SEQ ID NO：13)。可以将表达重组DRR的转化细胞用于所述的测定中，或从所述的细胞制备出膜并加以使用。尽管不是必需的，该测定可伴随检测对第二信使途径(如腺苷酸环化酶途径)的激活作用。这将有助于确定一种和DRR结合的化合物是否起到了激动剂或拮抗剂的作用。

本文公开的一种用于确定待测化合物是否是任何一种DRR的激动剂的替代方法为采用细胞信号测定，例如测量细胞内腺苷酸环化酶活性或细胞内钙浓度的测定。将待测化合物和表达DRR，但基本上不含其它G蛋白偶联受体的细胞培养，所述细胞通常为用编码DRR的表达载体转染的细胞。当与未接触待测化合物的对照转染子相比时，作为激动通过在从细胞信号测定获得的结果中导致了统计学上的显著变化来鉴定作为激动剂的待测化合物。例如，接触待测化合物的细胞可能表现为腺苷酸环化酶活性或细胞内钙浓度的显著增高。

本发明还包含一种方法，该方法用于检测一种待测化合物是否是DRR的拮抗剂，这依赖于当G蛋白偶联受体大量表达时出现的所述受体已知的激活作用。该方法要求编码该受体的DNA被掺入到表达载体中，从而使得它和启动子可操作地连接，然后将该载体用于转染适当的宿主。为了产生足够的受体以产生组成型的受体激活(即在没有天然配体存在的情况下激活)，能大量产生蛋白的表达系统是优选的，例如，DRR DNA可被可操作地连接到一个CMV启动子上并在COS或HEK293细胞中表达。转染后选出具有激活受体的细胞，上述细胞的选择根据的是其在细胞信号测定中表现出的活性比对照细胞有所增强，对照细胞或者未被转染或者已转染了不能表达功能性DRR的载体。通常，细胞被选出是因为它们的细胞内腺苷酸环化酶活性或细胞内钙浓度表现出统计学上显著的增高。将选出的细胞和待测化合物接触并重复进行细胞信号测定以确定这是否造成了与未接触该待测化合物的对照细胞相比活性降低。例如，和对照细胞相比，腺苷酸环化酶活性或钙浓度的统计学上显著的降低将意味着该测试化合物是DRR的拮抗剂。本文公开的任何DRR都可用于这些测定。

通过将含DRR组基本上不含其它G蛋白偶联受体的来源(例如一种稳定转化的细胞)和血管紧张素Ⅱ或Ⅲ在存在或不存在待测化合物的情况下培养，并测量对细胞内钙浓度的调节来进行和DRR相互作用的化合物的测定。由于待测化合物导致的血管紧张素刺激的钙置换的明显增强或降低意味着和DRR发生的相互作用。可用于这些测定的受体包括大鼠DRR-1和人DRR-1，DRR-2，DRR-3，DRR-4，DRR-5和DRR-6。

另一方面，本发明涉及一种方法，该方法用于测定待测化合物改变大鼠或人DRR表达的能力。该方法是通过在待测化合物存在的情况下培养表达DRR、但基本上不含其它G蛋白偶联受体的细胞而进行的。然后收集细胞，并和对照细胞的表达比较DRR的表达，上述对照细胞的生长条件除了不含待测化合物外基本上是相同的。大鼠受体优选为rDRR-1，人受体可以是DRR-1，DRR-2，DRR-3，DRR-4，DRR-5或DRR-6。

一种优选的待测化合物为长度至少为15个核苷酸的寡核苷酸，该寡核苷酸包含和用于检测的DRR的序列互补的序列。

附图简述

图1．rDRR-1的核苷酸序列：编码rDRR-1的克隆3B-32是采用启动子发现者步行试剂盒从大鼠基因组文库中分离出来的(参见克隆技术方法.Clontech)。

将克隆的基因保藏在国际保藏机构Deutsche Sammlung VonMikroorganismen Und Zellkulturen GmbH中，地址Mascheroder Weg1 B.D-3300 Braunschweig，德国。保藏时间为1997年11月27日，提供的入册登记号为DSM 11877。

图2．推定的DRR-1的氨基酸序列：克隆3B-32编码337个氨基酸的蛋白。该氨基酸序列从核苷酸序列中的第一个ATG开始。

图3．克隆3B-32(rDRR-1)的推定的氨基酸序列和它的5个同源性最接近的序列的序列对比。加有方框和阴影的残基为和rDRR-1序列相同的残基。

图4．人DRR同系物的氨基酸的序列对比：对比了rDRR-1的所有6种人的同系物(hDRR-1；hDRR-2；hDRR-3；hDRR-4；hDRR-5和hDRR-6)的氨基酸序列。和克隆36(HUMAN36.PR)不同的氨基酸残基用方框表示。这些序列间的同一性程度在77％到接近100％之间。

定义

以下的说明中使用了许多关于重组DNA技术的术语。为了提供清楚和一致地理解说明书和权利要求书，包括赋予这些术语的范围，我们提供了以下的定义。

克隆载体：能够在宿主细胞中自主复制的质粒或噬茵体DNA或其它DNA的序列，其特征在于具有一个或少量的限制性内切酶识别位点。外源DNA片段可以在这些位点处被剪接到载体上，从而使该片段复制和克隆。上述载体可含有一个适用于鉴定转化细胞的标记。例如，标记可提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性。

表达载体：一种类似于克隆载体的载体，但转化到宿主后它能诱导已克隆到其中的DNA的表达。克隆的DNA通常被置于某些调节序列(如启动子或增强子)的控制之下(即可操作地连接到调节序列上)。

基本上纯的：正如本文所使用的那样，“基本上纯的”意指合乎需要的产品基本上不含有污染的细胞成分。一种“基本上纯的”蛋白或核酸通常包括样品的至少85％，更大的百分比是优选的。污染物可能包括蛋白、糖或脂类。一种测定蛋白或核酸纯度的方法是通过在一种基质上(如聚丙烯酰胺或琼脂糖上)电泳制剂。通过染色后出现的单一条带来验证纯度。其它评价纯度的方法包括层析和分析离心。

宿主：任何作为可复制的表达载体或克隆载体的受体的原核细胞或真核细胞都是该载体的“宿主”。这一术语包括已被改造在其染色体上或其基因组中掺入了合乎需要的基因的原核或真核细胞。可作为宿主的细胞的例子以及细胞转化的技术在本领域中是广为人知的(参见，例如Sambrook等人。《分子克隆：实验指南》第2版，冷泉港(1989))。

启动子：通常发现位于基因5’区并靠近起始密码子的DNA序列。在启动子处开始转录。如果启动子是诱导型的，那么转录的速度可由于诱导剂而增加。

互补的核苷酸序列：本文所用的互补的核苷酸序列是指可通过正常的碱基配对产生的序列。例如核苷酸序列5-AGAC-3的互补序列为5-GTCT-3。

表达：表达是从DNA产生多肽的过程。该过程涉及将基因转录成mRNA并将该mRNA翻译成多肽。

发明详述

本发明涉及DRR受体蛋白，编码该受体的遗传序列，用于检测化合物和DRR受体结合的方法以及用于检测化合物改变DRR表达的能力的方法。上述受体及其核酸是由它们的结构定义的(如图1，2和4；以及SEQ ID No：1-14所示)。

可以理解本发明不仅包括和图中以及序列表中所示的那些相同的序列，还包括基本上相同的序列以及其它方面基本相同并导致受体保留了DRR的基本结合特性的序列。例如，众所周知的是如定点诱变这样的技术可以用于在蛋白的结构中引入变化。通过这种或一些类似的方法引入的DRR蛋白的变化包括在本发明之内，如果得到的受体保留了未改变的DRR基本的定性的结合特性的话。因此，本发明涉及一些蛋白，上述蛋白包含在功能上由SEQ ID NO：1(大鼠)和SEQ ID NO：3，5，7，9，11和14(人)的序列组成的氨基酸序列。

I．编码DRR的核酸序列

编码DRR的DNA序列绝对地或至少高度优先地在背根神经节中表达，这些神经节可用作分离编码该受体的核酸的来源。此外，表达大鼠或人DRR的细胞和细胞系也可用作核酸的来源。这些或者可以是未转化的培养的细胞，或者可以是具体地改造以表达重组DRR的细胞系。

在所有的情况下都是从背根神经节中分离poly A+mRNA的、并将其反转录和克隆。然后可以采用源自所附序列表中SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12或14中所示序列的探针来筛选这样形成的cDNA文库，探针的来源根据所要分离的具体DRR而定。探针在长度上通常应当至少具有14个碱基，并且应源自DRR序列上保守性很差的一部分(参见图3和图4)。也可利用含有一个DRR基因的基因组文库或所述基因的一部分进行筛选，所述的基因或部分在其它DRR基因的分离中用作探针。例如，可以标记全长的rDRR-1并用于筛选人的基因组文库以分离hDRR-1，hDRR-2等等(参见实施例部分)。

另一方面，通过利用位于基因任何一端的引物进行PCR扩增，可以将基因组DNA文库用来分离DRR基因(对步骤的描述参见实施例部分)。例如，可用以下引物扩增人的基因组DNA：5’-GCAAGCTTTCTGAGCATGGATCCAACCGTC，和5’-CCCTCAGATCTCCAATTTGCTTCCCGACAG。

这可用于扩增所有的六种在本文中鉴定为hDRR-1，hDRR-2，hDRR-3，hDRR-4，hDRR-5和hDRR-6的人DRR基因。然后这些基因可被克隆到适当的载体(如pGEM-T(Promega))中，以进行DNA序列的分析。

Ⅱ抗大鼠和人DRR的抗体

本发明还涉及特异性地结合大鼠或人的DRR的抗体以及用于生产所述抗体的方法。把“特异性地结合DRR的”抗体定义为那些对DRR的亲和性比对任何其它蛋白的亲和性大至少一百倍的抗体。用于生产所述抗体的方法可能包括将DRR蛋白自身注射到一种适当的动物中，或优选地注射相应于DRR的不同区域制得的短肽。上述肽的长度应当至少为5个氨基酸，并且应该选自被认为是对靶向的特定DRR蛋白特有的区域。因此，在选择产生抗体的肽时，通常应避开高度保守的跨膜区域。制备和检测抗体的方法对于本领域中的普通技术人员是众所周知的，这可以由如下的标准参考著作来证实：(Harlow等人.《抗体：实验指南》.冷泉港实验室，N.Y.(1988)；Klein.《免疫学：自身与非自身辨别的科学》(1982)；Kennett，等人，《单克隆抗体与杂交痛：生物学分析的新方面》(1980)；以及Campbel.“单克隆抗体技术”在《生物化学与分子生物学中的实验室技术》中，(1984))。

本文所用的“抗体”意指包括完整的分子以及保留了结合抗原的能力的片段(如Fab和F(ab)2片段)。这些片段通常是通过用如木瓜蛋白酶(生产Fab片段)或胃蛋白酶(生产F(ab)2片段)这样的酶蛋白水解切割完整的抗体来生产的。术语“抗体”还指单克隆抗体和多克隆抗体两种。多克隆抗体源自用抗原免疫接种的动物的血清。单克隆抗体可采用杂交瘤技术制备(Kohler，等人，《自然》256：495(1975)；Hammerling，等人，在《单克隆抗体与T-细胞杂交痛》中Elsevier M.Y.第563-681页(1981))。总的来说，这种技术涉及或者用完整的DRR或者用源自DRR的片段免疫接种动物、通常为小鼠。提取出免疫接种的动物的脾细胞并和适当的骨髓瘤细胞(如SP20细胞)融合。融合后，将得到的杂交瘤细胞选择性地维持在HAT培养基中，然后通过有限稀释进行克隆(Wands等人.《胃肠学》80∶225-232(1981))。然后测定通过这样的选择得到的细胞以鉴定分泌能结合DRR的抗体的克隆。

采用多种免疫测定的任意一种，可以将本发明的抗体或抗体片段用于检测DRR蛋白的存在。例如，上述抗体可被用于放射免疫测定或免疫定量测定(immunometric assay)，也称为“双位点”或“夹心法”检测(参见Chard，T.，“放射免疫测定与有关技术的介绍，”在《生物化学与分子生物学中的实验室技术》中，North HollandPublishing Co.，N.Y.(1978))。在典型的免疫定量检测中，将一定量的未标记的抗体和固体载体结合，该载体在待测的流体(例如血液、淋巴液、细胞提取物等等)中是不溶的。在抗原和固定化的抗体首先结合后，加入一定量可检测的标记的二抗(可以和第一种抗体一样，也可以不一样)以检测和/或定量结合的抗原(参见例如《放射免疫测定法》，Kirkham等人编辑，第199-206页，E&S.Livingstone，Edinburgh(1970)。这些类型测定的多种变化在本领域中是已知的，并可用于检测DRR。

大鼠或人DRR的抗体也可用于纯化完整的受体或受体片段(通常参见Dean等人，《亲和层析实践途径》，IRL出版社(1986))。通常抗体被固定化在层析基质如Sepharose 4B上。然后将基质装到层析柱中，使含所需DRR的制剂在促进结合的条件下(如在低盐的条件下)通过层析柱。然后洗涤层析柱，并用促进与抗体解离的缓冲液(例如改变了pH值或盐浓度的缓冲液)洗脱结合的DRR。可以将洗脱的DRR转移到选中的缓冲液中(例如通过透析)，并直接储存或使用。

Ⅲ．受体结合的放射性配体测定

DRR核酸和重组蛋白的一个主要用途就是设计用来鉴定能结合DRR受体的物质的测定。这类物质可以是模拟受体结合的正常作用的激动剂，也可以是抑制受体结合的正常作用的拮抗剂。尤其受关注的是鉴定和DRR结合并且调节细胞中腺苷酸环化酶活性的物质。这些物质具有作为镇痛剂或麻醉剂的潜在的治疗用途。在放射性配体结合测定中，将DRR来源和已知结合受体的配体以及待测的化合物一起培养以测定结合活性。优选的DRR来源是经过了转化以重组表达受体的细胞，优选地为哺乳动物细胞。选中的细胞应不表达大量的任何其它可能结合配体并影响结果的G蛋白偶联受体。这可很容易地通过在来源于与那些重组表达DRR相同的组织或细胞系，但未进行转化的细胞中进行结合的测定来确定。

测定可用完整的细胞或从所述细胞制得的膜进行(参见例如Wang，等人，《美国国家科学院学报》90∶10230-10234(1993))。将该膜和对DRR受体特异的配体以及待测化合物的制剂一起培养。结合完成后，例如通过过滤将受体和含配体以及待测化合物的溶液分开，并且测定已经发生的结合的量。优选地，使用的配体用放射性同位素、如125Ⅰ进行可检测的标记。然而，如果需要的话也可使用荧光或化学发光的标记物替代。最为常用的荧光标记化合物为异硫氰酸荧光素，罗丹明，藻红蛋白，藻青蛋白，异藻青蛋白，邻苯二醛和荧光胺。有用的化学发光化合物包括鲁米诺，异鲁米诺，theromatic acridiniumester，咪唑，吖啶铵盐和草酸酯。任何这些试剂都可用于生产适用于上述测定的配体。

非特异性结合可通过在大量过剩的未标记配体存在的情况下进行结合反应来确定。例如，标记的配体可以和受体以及待测化合物在过量一千倍的未标记配体存在的情况下一起培养。非特异性结合应被从总结合中减去(即没有未标记配体时的结合)，以得到每个测试样品的特异性结合。必要时，在测定中可包括其它步骤如洗涤，搅拌，振荡，过滤等等。通常，在分离膜结合的配体和溶液中保留的配体之后以及在定量测量结合的配体(例如通过计数放射性同位素)之前包括了洗涤的步骤。比较存在待测化合物时获得的特异性结合和仅存在标记的配体时获得的特异性结合，以确定待测化合物已经置换了与受体的结合的程度。

在进行结合测定时，必须注意避免假象，假象可能使得看上去似乎待测化合物和DRR受体相互作用，而事实上结合是被某些其它机制抑制了。例如，待测化合物应当处于这样一种缓冲液中，其自身基本上不抑制配体和DRR的结合，并且应当优选地在几个不同的浓度下检测。还应测量待测化合物制剂的蛋白水解活性，并且在测定时包含抗蛋白酶是合乎需要的。最后，在足以对结果进行斯卡查德分析的浓度范围内重新测量被鉴定为置换配体和DRR受体结合的化合物是非常合乎需要的。这种分析是本领域中众所周知的并且可以用来测定待测化合物对受体的亲和性(参见例如Ausubel.等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，11.2.1-11.2.19(1993)；《生物化学与分子生物学中的实验室技术》Work等人编辑，N.Y.(1978)等)。可用计算机程序辅助分析结果(参见例如Munson，P.，MethodsEnzymol.92∶543-577(1983)；McPherson，G.A.，Kinetic，EBDALigand.Lowry-A Collection of Radioligand Binding AnalysisPrograms.Elsevier-Biosoft.英国(1985))。

可用多种不同的测定方法监测通过配体的结合对受体的激活。例如，腺苷酸环化酶的测定可这样进行：在微量滴定板的小孔中培养细胞，然后不同的孔在存在或不存在待测化合物的情况下培养。然后可以在乙醇中提取cAMP，将其冻干并用测定缓冲液重新悬浮。如此回收的cAMP的测定可以采用任何测定cAMP浓度的方法进行，例如BiotrackcAMP酶免疫测定系统(Amersham)或环AMP(3H)测定系统(Amersham)。通常，腺苷酸环化酶测定和结合测定是分开进行的，但也可能在单一细胞制品中进行结合测定和腺苷酸环化酶测定。其它可用于监测受体活性的“细胞信号测定”在下文进行了描述。

Ⅳ．用细胞信号测定鉴定DRR激动剂和拮抗剂

也可利用DRR通过细胞信号测定筛选候选药物。为了鉴定DRR激动剂，将编码受体的DNA掺入到表达载体中，然后转染到合适的宿主中。然后使转化的细胞和一系列待测化合物接触并监测每个的效果。可使用的测定包括测量cAMP产生的测定(参见以上讨论)，测量对报道基因活性激活的测定，或测量对GTP-r-S结合的调节的测定。

也可用细胞信号测定鉴定DRR的拮抗剂。通过在异源系统中以非常高的浓度表达G蛋白偶联受体，G蛋白偶联受体即使在没有其相关配体的情况下也能处于其激活状态。例如，可用杆状病毒感染昆虫Sf9细胞来超量表达受体，或将DRR基因与CMV启动子可操作地连接并在COS或HEK293细胞中表达。在这种组成型激活状态中，在没有配体的情况下通过测量待测化合物对组成型细胞信号活性抑制的能力可以鉴定受体的拮抗剂。针对这一内容的适当的测定依然是cAMP测定，报道基因激活测定或测量GTP-r-S的结合的测定。

一种优选的细胞信号测定是基于这种观察：稳定地转染了DRR的细胞在血管紧张素Ⅱ或Ⅲ存在的情况下培养后显示出细胞内钙水平的改变(参见实施例5)。因此可以用类似于以上讨论的放射性受体测定的步骤，但用血管紧张素Ⅱ或Ⅲ替代标记的配体并用测量钙浓度来替代测量结合的放射性，来鉴定DRR的激动剂或拮抗剂。比较在存在待测化合物以及血管紧张素Ⅱ或Ⅲ的情况下的钙浓度以及单独存在血管紧张素Ⅱ或Ⅲ的情况下的钙浓度，以确定该待测化合物是否和DRR受体相互反应。相应于待测化合物的细胞内钙浓度的统计学上显著的增加意味着待测化合物起到了激动剂的作用，而细胞内钙浓度统计学上显著的下降则意味着它起到了拮抗剂的作用。

Ⅴ．测定对DRR表达的调节能力

一种增强或减弱DRR的生物学作用的方法是改变受体在细胞中的表达水平。因此，对鉴定抑制或增强表达的化合物的测定是相当受关注的。这些测定是这样进行的：在待测化合物存在的情况下培养表达DRR的细胞，然后比较这些细胞中受体的表达以及在基本相同的条件下，但没有待测化合物的情况下培养的细胞中的表达。如在以上所讨论的结合测定中一样，所用的细胞基本上没有竞争的G蛋白偶联受体是合乎需要的。一种定量受体表达的方法是将DRR序列和编码肽或蛋白的很容易被定量的序列融合。例如，如实施例5所述，可以将DRR序列连接到编码血凝素的序列上，并用于稳定地转染细胞。在和待测化合物一同培养后，血凝素/受体复合物可用抗血凝素抗体进行免疫沉淀并进行蛋白质印迹分析。替代地，可用标记的配体进行结合测定的斯卡查德分析以确定受体的数目。结合测定可按照上文所讨论的进行，并且优选使用已被改造用于重组表达DRR的细胞。

包含在DRR表达测定中的待测化合物的优选基团由互补于DRR核酸序列不同区段的寡核苷酸组成。这些寡核苷酸在长度上应当至少有15个碱基并且应当源自受体核酸序列的非保守区。这些序列可以基于那些如SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12或14所示的序列。

被发现降低受体表达的寡核苷酸可被衍生或缀合以增强它们的效力。例如，可用核苷硫代磷酸替代它们天然的对等物(参见Cohen，J.，寡脱氧核苷酸，基因表达的反义抑制剂，CRC出版社(1989))。可将寡核苷酸运送到病人的体内以抑制DRR的表达。当进行该过程时，以促进其被细胞吸收的方式将寡核苷酸给药是优选的。例如可通过脂质体或缀合到一种可被细胞摄取的肽上来运送寡核苷酸。(参见例如美国专利号4，897，355和4，394，448；也参见非美国专利文献WO8903849和EP 0263740)。其它增强寡核苷酸运送效力的方法在本领域中是广为人知的，也与本发明是相容的。

现在已经描述了本发明，本发明通过参照以下的实施例将更容易理解，实施例是通过图例说明的方式提供的，实施例并非用来限制本

发明的范围。

实施例

实施例1：大鼠DRR-1的克隆

cDNA片段的分离

将简并的寡核苷酸合成出具有下列核苷酸序列的G蛋白偶联受体的高度保守区域(跨膜结构域2和7)：

5’GG CCG TCG ACT TCA TCG TC(A/T) (A/C)(T/C)C TI(G/T)CI(T/C) TIG C(A/C/G/T)G 3’(TM：有义)SEQ ID NO：15；和5’(A/G)(C/A/T)(A/T)(A/G)CA (A/G)TA IAT IAT IGG (A/G)TT3’(TM7：反义)SEQ ID NO：16

从培养的大鼠胚胎背根神经节(Sprague-Dawley)分离了PolyA+mRNA。用第一条链cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech)逆转录了上述mRNA，然后利用Ampli-Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增反应，扩增条件如下：94℃3分钟，94℃、45℃和72℃各1分钟循环40次。分离相应于约650bps的cDNAPCR片段并亚克隆到pGEM-T-载体(Promega公司)中。重组克隆的核苷酸序列用T7-双脱氧链终止测序试剂盒(Pharmacia Biotech)测定，基于Genbank/EMBL数据库的检索发现其是独特的。

全长的大鼠DRR-1序列是利用650个碱基对的片段和“启动子发现者DNA步行试剂盒”(Clontech，cat#K1806-1)从大鼠基因组DNA得到的。该试剂盒含有5个未克隆的，与连接物连接的基因组DNA片段文库。其方法包括两个连续的PCR反应。两个反应都是用同样从Clontech获得的“高级Tth聚合酶混合物”，按照销售商建议的条件完成的。第一次PCR反应用在试剂盒中提供的外部连接引物(AP1)以及源自DRR-1PCR片段之序列的外部基因特异性引物(GSP1)来实现。将第一次PCR混合物稀释并用作第二次(嵌套)PCR反应的模板，第二次PCR采用了嵌套连接引物(AP2)和嵌套基因特异引物(GSP2)。为了得到最初PCR片段序列上游的大鼠DRR-1基因序列，使用了下列寡核苷酸：

GSP1：寡聚YF3B59-B’5’-CGCAGATGAGGTAGTACAGCATCAC SEQID NO：17

GSP：寡聚 MML-R1，5’-CTGTGAGAGAGATGGTAACATACAG SEQ IDNO：18

从第一个文库得到了1.9Kb的一个AP2-MMLR1片段，从第三个文库得到了一个大约1.0Kb的片段。为了鉴定已知序列的下游序列使用了以下引物：

GSP1：寡聚YF3B59-F2’5’-GCATCCTTGACTGGTTCTTCTCAG SEQ IDNO：19

GSP2：寡聚MML-F1，5’-GGGTGAGACTCATCATCATTTGTGG.SEQ IDNO：20

从第一个文库得到了大约1Kb的一个MMLF1-AP2片段，从第三个文库得到了一个大约600bp的片段。图1显显了含有DRR-1完整预测的开放读框的1154个核苷酸的组合序列。该开放读框编码具有预测分子量为38.7KD的含337个氨基酸的蛋白质(图2)。该蛋白序列具有G蛋白偶联受体的所有特征：七个可能代表跨膜结构域的疏水螺旋、N末端胞外域上可能的糖基化位点(第30位)和第285-289位上的保守的NPXXY序列。

实施例2：人DRR受体基因的克隆

用两种方法鉴定和克隆了与大鼠DRR-1基因同源和/或有关的新型人DNA序列。首先筛选了入载体FixⅡ(Stratagene Cat.#946203)上的人基因组文库。将大约106个人基因组克隆涂布并转移到硝酸纤维素膜上以用32P标记的全长大鼠DRR-1序列作为探针进行杂交。杂交在42℃过夜进行。滤膜在室温、低严格条件下(1xSSC/0.1％SDS)洗涤以检测相关的但不必相同的序列。

用购自Boehringer-Mannheim的“扩展PCR试剂盒”在允许精确扩增非常大的DNA片段的条件下通过PCR扩增了阳性噬菌体中存在的人DNA插入片段。用各种限制酶消化这些长的DNA片段并亚克隆到质粒载体中。将和大鼠DRR-1基因探针杂交的这些克隆的部分并用ABI循环测序试剂盒进行测序。

第二种鉴定和DRR-1相关的新型人的序列的途径涉及在总的人基因组DNA上进行聚合酶链式反应(PCR)。根据以上描述的人基因组克隆合成了如下引物：

HML.H，5’-GCAAGCTTTCTGAGCATGGATCCAACCGTC，SEQ ID 21和

HML.Bg，5’-CCCTCAGATCTCCAATTTGCTTCCCGACAG，SEQ ID NO：22

扩增得到含有人类基因整个编码序列的大约1Kb的片段。将这些得到的片段亚克隆到pGEM-T(Promega)载体中以进行DNA测序分析。

利用以上的策略分离出6个人类克隆：

克隆7， SEQ ID NO：3和4；

克隆18，SEQ ID NO：5和6；

克隆23，SEQ ID NO：7和8；

克隆24，SEQ ID NO：9和10；

克隆36，SEQ ID NO：11和12；和

克隆40，SEQ ID NO：13和14；

这些克隆中没有一个含有内含子，它们的序列对比可以参见图3。

在氨基酸序列的水平上，大鼠DRR-1克隆和人类克隆的同一性为47％-49％。

在核酸水平上，大鼠DRR-1克隆和人类克隆的同一性为56％-58％。人类克隆(7，18，23，24，36，40)内部的序列同一性水平非常高，在氨基酸序列的水平上为77％-98％。所有的人类序列都被用作在公共数据库中(Genbank，Swissprot，EST)检索同源性的查询。没有检测到相同的序列。最接近的匹配是蛋白的mas癌基因家族的成员。大鼠DRR-1和任何分离的人类基因之间整个氨基酸序列的同源性在47％-50％之间。但某些片段表现出高得多的序列同源性，尤其是编码推测的跨膜结构域Ⅲ和Ⅶ(TM3和TM7)的区域和胞内环(loop)2和3，其中大鼠序列及其人的同系物之间的同源性大约为80％。

实施例3：原位杂交实验

组织的制备：通过断头法处死成年雄性Sprague-Dawley大鼠(～300gm：Charles River.St-Constant，Quebec)。取出带有背根神经节的大脑和脊髓，在异戊烷中-40℃下速冻20s并在-80℃下保藏。冷冻的人的大脑、脊髓和背根神经节是根据最严格的道德标准从位于Baltimore马里兰州大学的发育疾病的大脑与组织库中得到的。将冷冻的组织在Microm HM500 M恒冷切片机(德国)上制成14m的切片，并且融化固定到ProbeOn Plus载玻片(Fisher Scientific，Montreal，Quebec)上。原位杂交之前在-80℃下储存切片。

合成核糖探针：用SacⅡ或Not1限制酶将质粒pGemT-3b32 GPCR进行线性化处理。用T7或SP6 RNA聚合酶(Pharmacia Biotech)在〔35S〕UTP(～800Ci/mmol；Amersham，Qakville，Ontario)存在的条件下分别在体外转录了有义和反义的DRR核糖探针。用SacⅡ和Pst1限制酶将质粒pGemT-克隆36GPCR进行线性化处理。用T7或SP6RNA聚合酶(Pharmacia Biotech)在〔35S〕UTP存在的条件下分别在体外转录了有义和反义的克隆36的核糖探针。转录后用DNAse Ⅰ(Pharmacia)消化DNA模板。通过苯酚/氯仿/异戊醇提取来纯化核糖探针，并在含醋酸铵和tRNA的70％乙醇中沉淀。标记的核糖探针的质量用聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳确认。

原位杂交：在溶于0.1M磷酸缓冲液(PH7.4)的4％的低聚甲醛(BDH，Poole，英国)中将切片在室温(RT)下预先固定10分钟并用2x标准柠檬酸钠缓冲液(SSC；0.15M NaCl.0.015M柠檬酸钠，pH7.0)漂洗3次。然后将切片用0.1M三乙醇胺平衡，用溶于三乙醇胺的0.25％乙酐处理，用2xSSC漂洗并用系列浓度的乙醇(50％-100％)脱水。杂交在含75％甲酰胺(Sigma，St-Louis，Mo)，600mM NaCl，10mMTris(pH7.5)，1mMEDTA，1xDenhardt's溶液(Sigma)，50g/ml变性鲑精DNA(Sigma)，50g/ml酵母tRNA(Sigma)，10％硫酸葡聚糖(Sigma)，20mM二硫苏糖醇和〔35S〕UTP-标记的cRNA探针(10x106cpm/ml)的缓冲液中在潮湿的小室中于55℃下进行18小时。杂交后切片用2XSSC在室温下漂洗，用溶于RNase缓冲液(10mM Tris，500mM NaCl，1mM EDTA，pH7.5)的20g/ml RNase IA(Pharmacia)室温处理45分钟并洗涤，洗涤的最终严格性为0.1xSSC，65℃。然后使切片脱水并在显影前用柯达Biomax MR胶片曝光21天和/或浸泡在用蒸馏水以1∶1稀释的柯达NTB2乳胶中并在4℃下曝光4-6周，然后用醋酸甲酚紫(Sigma)进行对比染色。

结果：在所有检验的区域中，大鼠DRR-1mRNA的轴索仅在背根神经节中表达。高分辨率的乳胶放射自显影表明银颗粒仅在一些小的和中等大小的神经元中聚集。DRR-1的这种独特的和高度受限制的分布方式在大鼠胚胎中得以确认。E17大鼠胚胎的箭头型切片表明DRR-1mRNA局限于DRG。大鼠胚胎的所有其它结构都没有任何特异的杂交信号，进一步证实了DRR-1表达的高度选择性。

人克隆36受体的表达出现在人胚胎背根神经节中但不出现在脊髓中。目前为止还未在测量的任何成年人的CNS组织中检测到克隆36的特异性杂交信号。这些包括脊髓、皮层、海马、丘脑、黑质和导水管周围灰质(数据未示出)。克隆36的mRNA在成体DRG中的存在还有待检测。在其中将具有DRG切片的其它脊髓和35S-标记的大鼠DRR-1反义探针或克隆36的有义探针杂交的标准对照物中并未显示出特异性的杂交信号。

实施例4：Northern印迹

将含有2g源自各种组织的polyA RNA的市售的大鼠和人的多种Northern印迹(Clontech)用于测定大鼠DRR-1信号及其人类同系物的表达和分布。放射性标记的探针制备如下：利用Ready-to-Go DNA标记试剂盒(Pharmacia Biotech)和〔32P〕CTP(3000Ci/mmol，Amersham)通过随机引发标记了源自大鼠DRR-1(参见实施例1)或人克隆36的25ng 650bp的3b-32PCR片段。印迹用Expresshyb(Clontech)在68℃预杂交1小时，然后在同样的条件下杂交(2x 106cpm/ml的探针)1小时。在2xSSC，0.05％SDS中室温下洗涤印迹30min，然后在0.2xSSC，1％SDS中于50℃下洗涤3次60min，然后在-80℃用柯达Biomax胶片曝光6天。

大鼠DRR-1的表达和分布：2星期曝光后所有研究的大鼠组织(心、大脑、脾脏、肺、骨骼肌、肾脏和睾丸)中DRR-1的表达都是阴性的，而大鼠的基因组Southern分析表明用同样的cDNA片段探测到了1.1kb的条带。

人克隆36的表达和分布：用放射性标记的克隆36的DNA片段探测了含有来自各种人组织的RNA的Northern印迹。两星期曝光后所有研究的人组织(人胎儿的大脑、肺脏、肝脏和肾脏以及成人小脑、大脑皮层、骨髓、枕骨孔、额叶、颞叶、壳(putamen)、脊髓、扁桃体、尾状核、胼胝体、海马、全脑、底丘脑核和丘脑)中这种受体的表达都是阴性的。

实施例5：应答于血管紧张素Ⅰ-Ⅲ的钙信号

将人克隆24的编码序列转移到pcDNA3载体中并且进行修饰以在该受体序列的C末端添加血凝素标记。将命名为pcDNA3-HML-HA24的这一克隆；通过改进的CaCl₂方法(Maniatis，《分子克隆：实验指南》冷泉港实验室出版社(1989))转染到HEK293细胞中。将细胞在37℃，5％CO₂下维持在培养基中并且每3天稀释10倍。

将细胞接种到90mm组织培养皿(5×105个细胞/烧瓶)的补充了10％胎牛血清(FBS)，100U/ml青霉素、100微克/ml链霉素和0.25微克/ml两性霉素B(fungizone)的Dulbecco氏改进必需培养基(DMEM，Gibco BRL)中。接种后一天，用每个培养皿30微克的质粒DNA瞬时转染细胞。转染后48小时收获细胞进行分析。首先用免疫沉淀和借助抗一血凝素抗体的Western印迹法检测了该基因的表达。在瞬时以及稳定转染的HEK293细胞中检测到了大一种约43KD的蛋白，但在对照细胞中没有检测到。

在含800微克/mlG418的培养基中选择大约21天后得到了稳定转染的HEK293细胞。钙信号的测量是通过这些稳定转染的细胞系之一，即293/pcDNA3-HML-HA24进行的。将细胞在24mm圆形玻璃盖玻片上培养至铺满盖玻片的50％-70％。在用1.8NBS缓冲液(135mM NaCl，5mMKCl，1.2mM MgCl₂，1.8mMCaCl₂，5mM葡萄糖和10mM HEPES，pH7.3)漂洗细胞后，在用1.8 NBS稀释的0.5ml 3.5μM FURA-2AM(分子探针，F-1221)存在的情况下于室温培养细胞一小时。然后细胞用1.8NBS漂洗3次并进而在室温下培养30分钟。采用PTI(国际光子技术公司)D104光度计测量钙的置换，该光度计装备了PTI高速多波长发光器，PTI SC 500光闸控制器，PTI LPS220 ARC光源和PTI FELIX软件1.2版。利用光阑选择和分离了含有2至8个细胞的小组。细胞用340nm和380nm的光照射并记录由细胞发出的510nm的光。相继加入血管紧张素Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ-实验之间的顺序不同-，然后加入缓激肽作为阳性对照。在用血管紧张素Ⅱ和血管紧张素Ⅲ刺激时得到了显著的应答。加入血管紧张素Ⅰ没有产生应答。

本文引用的参考文献全部插入作为参考。现在已经完全地描述了本发明，本领域的普通技术人员应当理解在不影响本发明或其任何实施方案的精神或范围的情况下，本发明可以在很宽的和同等的条件、参数等的范围内进行。

序列表信息(1)总信息

(ⅰ)申请人：Astra Pharma Inc.加拿大

(ⅲ)发明标题：新受体

(ⅳ)序列数：22

(ⅴ)通讯地址：

A)通讯人：A stra AB.Patent Department

C)街道：S-151 85 Sodertalje

D)城市：Sodertalje

E)州：

F)国家：瑞典

G)邮政编码：无

(ⅵ)计算机可读形式：

A)介质类型：软盘

B)计算机：IBM PC或兼容机

E)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

F)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30

(ⅶ)目前申请信息

A)申请号：

B)归档日期：

C)归类：

(ⅸ)远程通讯信息：

(A)电话：46-8 553 26000

(B)传真：46-8 553 28820SEQ ID NO：1的信息

序列特征：

A)长度：337氨基酸

B)类型：氨基酸

C)链特性：不相关

D)拓扑特性：不相关

分子类型：蛋白

是否假设：否

是否反义：否

序列描述：SEQ ID NO：1：Met Val Cys Val Leu Arg Asp Thr Thr Gly Arg Phe Val Ser Met Asp1 5 10 15Pro Thr Ile Ser Ser Leu Ser Thr Glu Ser Thr Thr Leu Asn Lys Thr

20 25 30Gly His Pro Ser Cys Arg Pro Ile Leu Thr Leu Ser Phe Leu Val Pro

35 40 45Ile Ile Thr Leu Leu Gly Leu Ala Gly Asn Thr Ile Val Leu Trp Leu

50 55 60Leu Gly Phe Arg Met Arg Arg Lys Ala Ile Ser Val Tyr Val Leu Asn65 70 75 80Leu Ser Leu Ala Asp Ser Phe Phe Leu Cys Cys His Phe Ile Asp Ser

85 90 95Leu Met Arg Ile Met Asn Phe Tyr Gly Ile Tyr Ala His Lys Leu Ser

100 105 110Lys Glu Ile Leu Gly Asn Val Ala Phe Ile Pro Tyr Ile Ser Gly Leu

115 120 125Ser Ile Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp

130 135 140Pro Ile Trp Tyr His Cys His Arg Pro Arg Asn Met Ser Ala Ile Ile145 150 155 160Cys Val Leu Ile Trp Val Leu Ser Phe Leu Met Gly Ile Leu Asp Trp

165 170 175Phe Phe Ser Gly Phe Leu Gly Glu Thr His His His Leu Trp Lys Asn

180 185 190Val Asp Phe Ile Val Thr Ala Phe Leu Ile Phe Leu Phe Met Leu Leu

195 200 205Phe Gly Ser Ser Leu Ala Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg

210 215 220Arg Lys Pro Leu Ser Arg Leu Tyr Val Thr Ile Ser Leu Thr Val Met225 230 235 240Val Tyr Leu Ile Cys Gly Leu Pro Leu Gly Leu Tyr Leu Phe Leu Leu

245 250 255Tyr TrP Phe Gly Ile His Leu His Tyr Pro Phe Cys His Ile Tyr Gln

260 265 270Val Thr Val Leu Leu Ser Cys Val Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile

275 280 285Tyr Phe Leu Val Gly Ser Phe Arg His Arg Lys Lys His Arg Ser Leu

290 295 300Lys Met Val Leu Lys Arg Ala Leu Glu Glu Thr Pro Glu Glu Asp Glu305 310 315 320Tyr Thr Asp Ser His Val Gln Lys Pro Thr Glu Ile Ser Glu Arg Arg

325 330 335CysSEQ ID NO：2的信息

序列特征：

长度：1011碱基对

类型：核酸

链特性：双链

拓扑特性：线性

分子类型：DNA(基因组)

是否假设：否

是否反义：否序列描述：SEQ ID NO：2：ATGGTTTGTG TTCTCAGGGA CACTACTGGA AGATTTGTGA GCATGGATCC AACCATCTCA 60TCCCTCAGTA CAGAATCTAC AACACTGAAT AAAACTGGTC ATCCCAGTTG CAGGCCAATC 120CTCACCCTGT CCTTCCTGGT CCCCATCATC ACCCTGCTTG GATTGGCAGG AAACACCATT 180GTACTCTGGC TCTTGGGATT CCGCATGCGC AGGAAAGCCA TCTCAGTCTA CGTCCTCAAC 240CTGTCTCTGG CAGACTCCTT CTTCCTCTGC TGCCATTTTA TTGACTCTCT GATGCGGATC 300ATGAACTTCT ATGGCATCTA TGCCCATAAA TTAAGCAAAG AAATCTTAGG CAATGTAGCA 360TTCATTCCCT ATATCTCAGG CCTGAGCATC CTCAGTGCTA TCAGCACGGA GCGCTGCCTG 420TCTGTATTGT GGCCAATCTG GTACCACTGC CACCGCCCAA GAAACATGTC AGCTATTATA 480TGTGTTCTAA TCTGGGTTCT GTCCTTTCTC ATGGGCATCC TTGACTGGTT TTTCTCAGGA 540TTCCTGGGTG AGACTCACCA TCATTTGTGG AAAAATGTTG ACTTTATTGT AACTGCATTT 600CTGATTTTTT TATTTATGCT TCTCTTTGGG TCCAGTCTGG CGCTACTGGT GAGGATCCTC 660TGTGGTTCCA GACGGAAACC ACTGTCCAGG CTGTACGTTA CAATCTCTCT CACAGTGATG 720GTCTACCTCA TCTGCGGCCT GCCTCTCGGG CTTTACTTGT TCCTGCTATA TTGGTTTGGG 780ATCCATTTAC ATTATCCCTT TTGTCACATT TACCAAGTTA CTGTGCTCCT GTCCTGTGTG 840AACAGCTCTG CCAACCCCAT CATTTACTTC CTTGTAGGGT CCTTTAGGCA CCGTAAAAAG 900CATCGGTCCC TCAAAATGGT TCTTAAAAGG GCTCTGGAGG AGACTCCTGA GGAGGATGAA 960TATACAGACA GCCATGTTCA GAAACCCACT GAGATCTCAG AAAGGAGATG T 1011SEQ ID NO：3的信息

序列特征：

长度：322氨基酸

类型：氨基酸

链特性：不相关

拓扑特性：不相关

分子类型：蛋白

是否假设：否

是否反义：否序列描述：SEQ ID NO：3：Met Asp Pro Thr Ile Pro Val Leu Gly Thr Lys Leu Thr Pro Ile Asn1 5 10 15Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Asn Gln Thr Leu Ser Phe Thr Gly

20 25 30Leu Thr Cys Ile Ile Ser Leu Val Ala Leu Thr Gly Asn Ala Val Val

35 40 45Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr

50 55 60Ile Leu Asn Leu Val Ala Ala Asn Phe Leu Phe Leu Ser Gly His Ile65 70 75 80Ile Phe Ser Pro Leu Pro Leu Ile Asn Ile Arg His Pro Ile Ser Lys

85 90 95Ile Leu Ser Pro Val Met Thr Phe Pro Tyr Phe Ile Gly Leu Ser Met

100 105 110Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Ile Leu Trp Pro Ile

115 120 125Trp Tyr His Cys Arg Arg Pro Arg Tyr Leu Ser Ser Val Met Cys Val

130 135 140Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Phe145 150 155 160Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asn Ser Val Trp Cys Glu Thr Ser

165 170 175Asp Phe Ile Thr Ile Ala Trp Leu Val Phe Leu Cys Val Val Leu Cys

180 185 190Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys

195 200 205Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val

210 215 220Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gln Trp Ala Leu Phe Ser225 230 235 240Arg Ile His Leu Asp Trp Lys Val Leu Phe Cys His Val His Leu Val

245 250 255Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser ger Ala Asn Pro Ile Ile Tyr

260 265 270Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys

275 280 285Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Thr Pro Glu Val Asp Glu Gly

290 295 300Gly Gly Trp Leu Pro Gln Glu Thr Leu Glu Leu Ser Gly Ser Lys Leu305 310 315 320Glu GlnSEQ ID NO：4的信息

序列特征：

长度：969碱基对

类型：核酸

链特性：双链

拓扑特性：线性

分子类型：DNA(基因组)

是否假设：否

是否反义：否序列描述：SEQ ID NO：4：ATGGATCCAA CCATCCCAGT CTTGGGTACA AAACTGACAC CAATCAACGG ACGTGAGGAG 60ACTCCTTGCT ACAACCAAAC CCTGAGCTTC ACGGGGCTGA CGTGCATCAT TTCCCTTGTC 120GCGCTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT GCCGCATGCG CAGGAACGCT 180GTCTCCATCT ACATCCTCAA CCTGGTCGCG GCCAACTTCC TCTTCCTTAG CGGCCACATT 240ATATTTTCGC CGTTACCCCT CATCAATATC CGCCATCCCA TCTCCAAAAT CCTCAGTCCT 300GTGATGACCT TTCCCTACTT TATAGGCCTA AGCATGCTGA GCGCCATCAG CACCGAGCGC 360TGCCTGTCCA TCCTGTGGCC CATCTGGTAC CACTGCCGCC GCCCCAGATA CCTGTCATCG 420GTCATGTGTG TCCTGCTCTG GGCCCTGTCC CTGCTGCGGA GTATCCTGGA GTGGATGTTC 480TGTGACTTCC TGTTTAGTGG TGCTAATTCT GTTTGGTGTG AAACGTCAGA TTTCATTACA 540ATCGCGTGGC TGGTTTTTTT ATGTGTGGTT CTCTGTGGGT CCAGCCTGGT CCTGCTGGTC 600AGGATTCTCT GTGGATCCCG GAAGATGCCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTCCTC 660ACAGTGCTGG TCTTCCTCCT CTGTGGCCTG CCCTTTGGCA TTCAGTGGGC CCTGTTTTCC 720AGGATCCACC TGGATTGGAA AGTCTTATTT TGTCATGTGC ATCTAGTTTC CATTTTCCTG 780TCCGCTCTTA ACAGCAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCGTGGGCTC CTTTAGGCAG 840CGTCAAAATA GGCAAAACCT GAAGCTGGTT CTCCAAAGGG CTCTGCAGGA CACGCCTGAG 900GTGGATGAAG GTGGAGGGTG GCTTCCTCAG GAAACCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAAATTG 960GAGCAGTGA 969SEQ ID NO：5的信息

序列特征：

长度：322氨基酸

类型：氨基酸

链特性：不相关

拓扑特性：不相关

分子类型：蛋白

是否假设：否

是否反义：否序列描述：SEQ ID NO：5：Met Asp Pro Thr Val Pro Val Leu Gly Thr Glu Leu Thr Pro Ile Asn1 5 10 15Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Lys Gln Thr Leu Ser Phe Thr Gly

20 25 30Leu Thr Cys Ile Val Ser Leu Val Ala Leu Thr Gly Asn Ala Val Val

35 40 45Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr

50 55 60Ile Leu Asn Leu Val Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Gly His Ile65 70 75 80Ile Cys Ser Pro Leu Arg Leu Ile Asn Ile Ser His Pro Ile Ser Lys

85 90 95Ile Leu Ser Pro Val Met Thr Phe Pro Tyr Phe Ile Gly Leu Ser Met

100 105 110Leu Asn Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Ile Leu Trp Pro Ile

115 120 125Trp Tyr His Cys Arg Arg Pro Arg Tyr Leu Ser Ser Val Met Cys Val

130 135 140Leu Leu Trp Ala Pro Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Phe145 150 155 160Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Val Arg Cys Glu Thr Ser

165 170 175Asp Phe Ile Thr Ile Ala Trp Leu Val Phe Leu Arg Val Val Leu Cys

180 185 190Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys

195 200 205Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val

245 250 255Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr

260 265 270Phe Phe Met Gly Ser Phe Arg Gln Leu Gln Asn Arg Lys Thr Leu Lys

275 280 285Leu Val Leu Gln Arg Asp Leu Gln Asp Thr Pro Glu Val Asp Glu Gly

290 295 300Gly Trp Trp Leu Pro Gln Glu Thr Leu Glu Leu Ser Gly Ser Lys Leu305 310 315 320Glu IleSEQ ID NO：6的信息

序列特征：

长度：969碱基对

类型：核酸

链特性：双链

拓扑特性：线性

分子类型：DNA(基因组)

是否假设：否

是否反义：否序列描述：SEQ ID NO：6：ATGGATCCAA CCGTCCCAGT CTTGGGTACA GAACTGACAC CAATCAACGG ACGTGAGGAG 60ACTCCTTGCT ACAAGCAGAC CCTGAGCTTC ACGGGGCTGA CGTGCATCGT TTCCCTTGTC 120GCGCTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT GCCGCATGCG CAGGAACGCT 180GTCTCCATCT ACATCCTCAA CCTGGTCGCG GCCGACTTCC TCTTCCTTAG CGGCCACATT 240ATATGTTCGC CGTTACGCCT CATCAATATC AGCCATCCCA TCTCCAAAAT CCTCAGTCCT 300GTGATGACTT TTCCCTACTT TATAGGCCTA AGCATGCTGA ACGCCATCAG CACCGAGCGC 360TGCCTGTCCA TCCTGTGGCC CATCTGGTAC CACTGCCGCC GCCCCAGATA CCTGTCATCG 420GTCATGTGTG TCCTGCTCTG GGCCCCGTCC CTGCTGCGGA GTATCCTGGA GTGGATGTTC 480TGTGACTTCC TGTTTAGTGG TGCTGATTCT GTTCGGTGTG AAACGTCAGA TTTCATTACA 540ATCGCGTGGC TGGTTTTTTT ACGTGTGGTT CTCTGTGGGT CCAGCCTGGT CCTGCTGGTC 600AGGATTCTCT GTGGATCCCG GAAGATGCCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTCCTC 660ACAGTGCTGG TCTTCCTCCT CTGTGGCCTG CCCTTTGGCA TTCAGTGGGC CCTGTTTTCC 720AGGATCCACC TGGATTGGAA AGTCTTATTT TGTCATGTGC ATCTAGTTTC CATTTTCCTG 780TCCGCTCTTA ACAGCAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCATGGGCTC CTTTAGGCAG 840CTTCAAAACA GGAAGACCCT CAAGCTGGTT CTCCAGAGGG ATCTGCAGGA CACGCCTGAG 900GTGGATGAAG GTGGATGGTG GCTTCCTCAG GAAACCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAAATTG 960GAGATCTGA 969SEQ ID NO：7的信息

序列特征：

长度：322氨基酸

类型：氨基酸

链特性：不相关

拓扑特性：不相关

分子类型：蛋白

是否假设：否

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Claims

1．一种包括在功能上由如SEQ ID NO：1所示的大鼠背根受体1(DRR-1)组成的氨基酸序列的蛋白，以天然状态存在的除外。

2．根据权利要求1的基本上纯的蛋白，其中所说的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成．

3．一种基本上纯的多核苷酸，该多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO：1中所示的大鼠DRR-1组成的氨基酸序列。

4．权利要求3的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白基本上由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成．

5．权利要求4的多核苷酸，其中所说的多核苷酸具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

6．一种包括在功能上由如SEQ ID NO：3所示的人背根受体1(DRR-1)组成的氨基酸序列的蛋白，以天然状态存在的除外。

7．根据权利要求6的基本上纯的蛋白，其中所说的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。

8．一种基本上纯的多核苷酸，该多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO：3中所示的人DRR-1组成的氨基酸序列。

9．权利要求8的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白基本上由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。

10．权利要求9的多核苷酸，其中所说的多核苷酸具有SEQ IDNO：4的核苷酸序列。

11．一种包括在功能上由如SEQ ID NO：5所示的人背根受体2(DRR-2)组成的氨基酸序列的蛋白，以天然状态存在的除外。

12．根据权利要求11的基本上纯的蛋白，其中所说的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。

13．一种基本上纯的多核苷酸，该多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO：5中所示的人DRR-2组成的氨基酸序列。

14．权利要求13的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白基本上由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。

15．权利要求14的多核苷酸，其中所说的多核苷酸具有SEQ IDNO：6的核苷酸序列。

16．一种包括在功能上由如SEQ ID NO：7所示的人背根受体3(DRR-3)组成的氨基酸序列的蛋白，以天然状态存在的除外。

17．根据权利要求16的基本上纯的蛋白，其中所说的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。

18．一种基本上纯的多核苷酸，该多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO：7中所示的人DRR-3组成的氨基酸序列。

19．权利要求18的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白基本上由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。

20．权利要求19的多核苷酸，其中所说的多核苷酸具有SEQ IDNO：8的核苷酸序列。

21．一种包括在功能上由如SEQ ID NO：9所示的人背根受体4(DRR-4)组成的氨基酸序列的蛋白，以天然状态存在的除外。

22．根据权利要求21的基本上纯的蛋白，其中所说的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成。

23．一种基本上纯的多核苷酸，该多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO：9中所示的人DRR-4组成的氨基酸序列。

24．权利要求23的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白基本上由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成。

25．权利要求24的多核苷酸，其中所说的多核苷酸具有SEQ IDNO：10的核苷酸序列。

26．一种包括在功能上由如SEQ ID NO：11所示的人背根受体5(DRR-5)组成的氨基酸序列的蛋白，以天然状态存在的除外。

27．根据权利要求26的基本上纯的蛋白，其中所说的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成。

28．一种基本上纯的多核苷酸，该多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO：11中所示的人DRR-5组成的氨基酸序列。

29．权利要求28的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白基本上由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成。

30．权利要求29的多核苷酸，其中所说的多核苷酸具有SEQ IDNO：12的核苷酸序列。

31．一种包括在功能上由如SEQ ID NO：13所示的人背根受体6(DRR-6)组成的氨基酸序列的蛋白，以天然状态存在的除外。

32．根据权利要求31的基本上纯的蛋白，其中所说的氨基酸序列基本上由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成。

33．一种基本上纯的多核苷酸，该多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白包括在功能上由如SEQ ID NO：13中所示的人DRR-6组成的氨基酸序列。

34．权利要求33的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码一种蛋白，该蛋白基本上由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成。

35．权利要求34的多核苷酸，其中所说的多核苷酸具有SEQ IDNO：14的核苷酸序列。

36．一种通过以下方法制备的抗体，该方法包括将药物可接受的制剂注射到能产生所说抗体的动物中的步骤，其中所述药物可接受的制剂包括权利要求1，2，6，7，11，12，16，17，21，22，26，27，31或32之任一的蛋白。

37．一种特异性地结合权利要求1，2，6，7，11，12，16，17，21，22，26，27，31或32的蛋白之任一的抗体。

38．一种包括权利要求3或4之一的多核苷酸的用于表达大鼠DRR-1的载体。

39．用于表达的下之任一的载体：

(ⅰ)人DRR-1，该载体包括权利要求8或9的多核苷酸；

(ⅱ)人DRR-2，该载体包括权利要求13或14的多核苷酸；

(ⅲ)人DRR-3，该载体包括权利要求18或19的多核苷酸；

(ⅳ)人DRR-4，该载体包括权利要求23或24的多核苷酸；

(ⅴ)人DRR-5，该载体包括权利要求28或29的多核苷酸；

(ⅵ)人DRR-6，该载体包括权利要求33或34的多核苷酸。

40．用权利要求38或39的载体转化的宿主细胞。

41．由权利要求40的宿主细胞生产的重组的大鼠DRR-1、人DRR-1，人DRR-2，人DRR-3，人DRR-4，人DRR-5，人DRR-6。

42．一种用于测定待测化合物结合或激活G蛋白偶联背根神经节特异性受体(DRR)的能力的方法，该方法包括：

a)将含有DRR但基本上没有其它G蛋白偶联受体的来源和以下物质一同培养：

(ⅰ)已知和DRR结合的配体；

(ⅱ)所说的待测化合物；

以及

b)确定所说配体的结合被所说待测化合物置换的程度。