CN1171816A - 编码骨形态形成蛋白ii型受体的互补脱氧核糖核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离的BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段、表达该BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段的DNA序列、含有该DNA序列的重组表面载体、含有该重组表达载体的宿主细胞以及表达该BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段的方法。

Description

编码骨形态形成蛋白II型受体的互补脱氧核糖核酸
技术领域
本发明涉及骨形成和发育领域，更具体地，本发明涉及骨形态形成蛋白(BMP)受体、编码该受体的DNA序列和用编码该受体的DNA序列所转染的细胞。
背景技术
人和其他温血动物会受到许多骨相关疾病的困扰。这些疾病包括从骨折到衰弱性疾病如骨质疏松症等许多种类。尽管在健康的个体中，骨生长一般是正常地进行而且骨折的愈合也不需要药物介入，但是在某些情况下骨会衰弱或者不能正常愈合。例如，在老年人和用皮质类固醇治疗的病人(如移植病人)中，骨愈合进行得很缓慢。骨质疏松症是一种与新骨硬组织的发育相比，病人骨硬组织不成比例地丧失所导致的病症。骨质疏松症可定义为骨数量的减少，或骨骼组织的萎缩；骨髓和骨间隙变大；纤维性结合减少和密质骨变脆。另一种骨相关疾病是骨关节炎，这是活动关节的一种病症，其特征是关节软骨的退化和磨损以及在关节表面形成新骨。
尽管对于这些骨相关疾病有各种治疗方法，但是没有一种治疗能提供最佳的效果。治疗骨相关疾病的人们所遇到的困难之一是没有完全了解骨代谢和没有完全了解骨相关疾病。这种了解的一个关键问题是确定并定性骨生长所涉及的各种因子。已表明，骨形态形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)在骨形成和发育中起重要作用(J.M.Wozney，分子再生和发育(Molec Reproduct.and Develop.)32：160-167(1992))。
此外，BMP的作用可能并不局限于在骨中。已发现BMP在其他组织如脑、肾、层化鳞状部上皮和毛囊中的浓度较高(N.A.Wall，M.Blessing.，C.V.E.Wright，和B.L.M.Hogan.，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)，120 493-502(1993)；E.Ozkaynak，P.N.J.Schnegelsberg，D.F.Jin，G.M.Clifford，F.D.Warren，E.A.Drier，和H.Oppermann，生物化学杂志(J.Biol Chem.)，267：25220-25227(1992)；K.M.Lyons，C.M.Jones，和B.L.M.Hogan，遗传学趋势(Trends in Genetics)，7：408-412(1991)；V.Drozdoff，N.A.Wall，和W.J.Pledger，美国科学院院报(Proceedingsofthe National Academy of Sciences，USA)，91：5528-5532(1994))，该发现暗示它们可能在发育和分化中也起作用。支持该观点的证据有，最近发现BMP能促进神经细胞的分化以及影响毛囊的形成(K.Basler，T.Edlund，T.M.Jessell，和T.Yamada.，细胞73：687-702(1993)；V.M.Paralkar，B.S.Weeks，Y.M.Yu，H.K.Kleinman，和A.H.Reddi，细胞生物学杂志，119：1721-1728(1992)；M.Blessing，L.B.Nanney，L.E.King，C.M.Jones，和B.L.Hogan，基因发育(Genes Dev.)，7：204-215(1993))。
BMP是通过结合于BMP应答细胞的细胞膜上表达的特异BMP受体而发挥其生物效应。受体是一种蛋白质，通常横跨细胞膜，它与细胞外的配体结合，结合后将一个信号传入细胞内部，从而改变细胞功能。在这种情况下，配体是蛋白质BMP，而信号则诱导细胞分化。
因为BMP受体能特异地结合BMP，所以纯化的BMP受体组合物可用于BMP的诊断分析，以及产生可用于诊断和治疗的、针对BMP受体的抗体。此外，纯化的BMP受体组合物可直接用于治疗以结合或清除BMP，从而提供一种调节BMP在骨和其他组织中的活性的手段。为了研究BMP受体的结构和生物特性以及在组织生长/形成刺激过程中的各种细胞群对BMP的应答中BMP所起的作用，或者为了在治疗、诊断或分析中有效地使用BMP受体，都需要纯化的BMP受体组合物。然而，在实践中这种组合物只有用重组DNA技术，通过克隆和表达编码该受体的基因才能获得。为了用于生物化学分析或为了克隆和表达编码BMP受体的哺乳动物基因而进行的纯化BMP受体的努力，都因为缺乏合适的受体蛋白质或mRNA而受阻碍。在本发明之前，已知只有少数细胞系可以高水平地表达高亲和力的BMP受体，从而妨碍了纯化BMP受体用于蛋白质测序或构建基因文库用于直接表达克隆。得到BMP受体的序列，便能够产生高表达水平重组BMP受体的细胞系，从而可以用于生物化学分析和筛选试验。
BMP是TGF-β超家族的成员。TGF-β超家族的其他成员包括：TGF-β、活化素(activin)、抑制素、穆勒氏抑制物和生长分化因子(Growth and differentiationFactors，GDF)。如预期的那样，TGF-β超家族不同成员的受体共有类似的结构特征。TGF-β配体超家族的受体一般被分成称为I型和II型的2类亚组中的一类。I型和II型受体是根据氨基酸序列特征进行划分的。I型和II型受体两者都具有较小的胞外配体结合域、跨膜区域和预计具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞内蛋白激酶域(Lin和Moustaksa，细胞和分子生物学，40：337-349(1994)；L.S.Mathews，内分泌回顾(Endocrine Reviews)，15：310-325(1994)；L.Attisano，J.L.Wrana，F.Lopez-Casillas，和J.Massague，生物化学和生物物理学报(Biochimica et BiophysicaActa)，1222：71-80(1994))。
目前为止所克隆的I型受体属于一个与众不同的家族，其激酶结构域是高度相关的而且具有＞85％序列相同性(B.B.Koenig等人，分子和细胞生物学，14：5961-5974(1994))。I型受体的胞内并膜(juxtamembrane)区域的特征是从跨膜区域开始存在有SGSGSG基序的35-40氨基酸，而且这些受体的羧基端极短(B.B.Koenig等人，分子和细胞生物学，14：5961-5974(1994)；L.Attisano，J.L.Wrana，F.Lopez-Casillas，和J.Massague，生物化学和生物物理学报(Biochimica etBiophysica Acta)，1222：71-80(1994))。I型受体的胞外结构域含有特征性的位于跨膜区域的25-30个氨基酸中的半胱氨酸残基簇(被称为“半胱氨酸盒”)，以及位于推定的信号序列之后的另一个半胱氨酸残基簇(被称为“上游半胱氨酸盒”)(B.B.Koenig等人，分子和细胞生物学，14：5961-5974(1994)；L.Attisano，等人，生物化学和生物物理学报(Biochimica et Biophysica Acta)，1222：71-80(1994))。
与I型受体相反，II型受体的激酶结构域仅相互间有较远的相关性。在I型受体中发现的SGSGSG基序在II型受体中没有发现。同样，I型受体的“上游半胱氨酸盒”也不存在于II型受体中。此外，尽管所有的活化素的II型受体都在胞内并膜区域中有富含脯氨酸的基序，但是对于所有的II型受体而言没有共同的特征基序(L.S.Mathews，内分泌回顾(Endocrine Reviews)，15：310-325(1994))。II型受体羧基端的长度非常不同，其中已知的最长羧基端是在BMP II型受体DAF-4中发现的(M.Estevez，L.Attisano，J.L.Wrana，P.S.Albert，J.Massague和D.IL.Riddle，自然，365：644-49(1993))，而DAF-4是从线虫秀丽新杆线虫(C.elegans)中克隆出的。II型受体的胞外域有一个位于靠近跨膜域处的半胱氨酸盒。除了存在半胱氨酸盒之外，在TGF-β、活化素和BMP的II型受体的胞外域中有稍许的序列相似性。
由TGF-β配体超家族的成员产生信号，需要在同一细胞的表面上同时存在I型和II型受体(L.S.Mathews，内分泌回顾(Endocrine Reviews)，15：310-325(1994)；L.Attisano，J.L.Wrana，F.Lopez-Casillas，和J.Massague，生物化学和生物物理学报(Biochimica et Biophysica Acta)，1222：71-80(1994))。BMP是TGF-β配体超家族的成员；考虑到这些家族成员之间的高度的结构相似性，可以预期它们的受体与TGF-β和活化素的受体在结构上和功能上是相关的。可以预计，与TGF-β和活化素受体系统相似(J.Massague，L.Attisano，和J.L.Wrana，细胞生物学趋势，4：172-178(1994))，为了在细胞或组织中传导BMP信号，需要BMP I型受体和BMPII型受体两者。因此，在早已克隆的I型受体之外，还需要哺乳动物的II型BMP受体激酶蛋白。
已报道了3种不同的哺乳动物BMP I型受体：BRK-1(参见USSN08/158,735，1993年11月24日由J.S.Cook等人申请；和B.B.Koenig等人，分子和细胞生物学，14：5961-5974(1994))、ALK-2和ALK-6。BRK-1是ALK-3的鼠同源物(homologue)，它也和ALK-6一样与BMP-4结合；ALK-2结合BMP-7(参见P.ten Dijke，H.Yamashita，T.K.Sampath，A.H.Reddi，M.Estevez，D.L.Riddle，H.Ichijo，C.H.Heldin，和K.Miyazono，生物化学杂志(J.BiologicalChemistry)，269：16985-16988(1994))。还假定ALK-6是鸡受体BRK-2(也称为RPK-1)的鼠同源物(S.Sumitomo，T.Saito，和T.Nohno，DNA序列，3：297-302(1993))。
对BMP-2和BMP-4而言的唯一II型受体即DAF-4，已经从线虫秀丽新杆线虫(C.elegans)中克隆出(M.Estevez，L.Attisano，J.L.Wrana，P.S.Albert，J.Massague和D.L.Riddle，自然，365：644-49(1993))。因为线虫和哺乳动物之间的进化距离远，所以已不可能将DAF-4 cDNA用作探针来克隆哺乳动物的DAF-4同源物。这暗示，哺乳动物BMP II型受体的DNA序列与DAF-4的序列显著不同，因而需要克隆哺乳动物的BMP II型受体。因此，本发明的BMP受体激酶蛋白提供了一种哺乳动物II型受体，它能够形成一种高亲和性的复合物，而该复合物与哺乳动物BMP I型受体一起能够引发针对BMP的应答。因此，与由线虫II型受体和哺乳动物I型受体构成的受体复合物相比，这种哺乳动物BMP受体复合物可更相关地用于鉴别新的、可与BMP受体作用、并且可用作人和其他哺乳动物的治疗剂的化合物。
发明目的
本发明的一个目的是提供分离的BMP II型受体激酶蛋白。
本发明的另一个目的是提供编码BMP II型受体激酶蛋白的DNA序列。
本发明的另一个目的是提供编码BMP II型受体激酶蛋白的重组表达载体。
本发明的另一个目的是提供含有编码BMP受体激酶蛋白的重组表达载体的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供产生BMP II型受体激酶蛋白或其可溶性片段的方法。
本发明的另一个目的是提供对本发明的BMP II型受体激酶蛋白特异的抗体。
本发明的另一个目的是提供一种报道系统，它可用于评估测试化合物是否能够作为本发明的BMP II型受体激酶蛋白的间接促效剂或拮抗剂。
本发明的另一个目的是提供一种确定化合物能否结合本发明的BMP受体激酶蛋白的方法。
发明概述
本发明涉及分离的BMP II型受体激酶蛋白或其可溶性片段、编码该BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段的DNA序列、含有该DNA序列的重组表达载体、含有该重组表达载体的宿主细胞、表达该BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段的方法、针对本发明的BMP II型受体激酶蛋白的抗体、评估测试化合物是否能够作为本发明的BMP II型受体激酶蛋白的间接促效剂或拮抗剂的方法、以及测定化合物能否与本发明的BMP受体激酶蛋白结合的方法。
附图简述
图1是在t-BRK-3的PCR扩增中所用的简并寡核苷酸引物的DNA序列。核苷酸碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤分别用A、T、C和G表示。字母N表示在该位点存在A、T、C和G的等量混合物。引物衍生自TGF-βII型受体的序列(H.Y.Lin，X.F.Wang，E.Ng-Eaton，R.A.Weinberg和H.F.Lodish，细胞，68：775-785(1992))。
图2显示了用于在哺乳动物中瞬时表达t-BRK-3的构建物pJT4-hBRK3T。CMV，巨细胞病毒早期启动子/增强子；R，来自人T-细胞白血病病毒-1长末端重复序列的“R”元件；SP，SV40病毒的内含子拼接位点；T3，来自T3噬菌体的启动子区域；T7，来自T7噬菌体的启动子区域；poly A，来自SV40病毒指导信使RNA聚腺苷酸化的区域；SV40 ORI，SV40病毒的复制起点；Amp，用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性基因。
图3显示了用于在哺乳动物中瞬时表达BRK-1的构建物pJT4-J159F。缩写字母同图2。
图4显示了用于在哺乳动物中瞬时表达BRK2的构建物pJT3-BRK2。缩写字母同图2。
图5显示了用于在哺乳动物中瞬时表达秀丽新杆线虫(C.elegans)报道基因DAF-4的构建物pJT4-Daf4。缩写字母同图2。
图6显示了在存在或不存在I型受体BRK-1和BRK-2的情况下，[125I]-BMP-4与在COS-7细胞中表达的t-BRK-3的全细胞结合情况。柱代表了化为细胞数目的[125I]-BMP-4的特异性结合。从左至右，NIH3T3胚成纤维细胞；COS-7细胞；仅用载体pJT-4转染的COS-7细胞(称为“模拟物”)；仅用BRK-1、用BRK-1加10或20微克t-BRK-3、仅用BRK-2、BRK-2加10或20微克t-BRK-3、以及仅用t-BRK-3(20微克)转染的COS-7细胞。
图7显示了在存在或不存在I型受体BRK-1和BRK-2的情况下，[125I]-BMP-4与用t-BRK-3转染的COS-1细胞的交联情况。分子量标准示于左侧。在右侧的标记表示按预计的与[125I]-BMP-4交联的t-BRK-3、BRK-1和BRK-2分子量进行迁移的条带。从左至右，各泳道表示：仅用BRK-1；用BRK-1加2微克/毫升t-BRK-3；用BRK-1加4微克/毫升t-BRK-3；仅用BRK-2；用BRK-2加2微克/毫升t-BRK-3；用BRK-2加4微克/毫升t-BRK-3；仅用t-BRK-3(2微克/毫升)；和仅用4微克/毫升t-BRK转染的COS-1细胞。DNA混合物的体积是4毫升。在该图中，“BRK-3”是t-BRK-3。
图8显示了在存在或不存在I型受体BRK-1和BRK-2的情况下，t-BRK-3与在COS-1细胞中表达的并与[125I]-BMP-4的交联的秀丽新杆线虫(C.elegans)II型受体DAF-4免疫沉淀情况。分子量标准示于左侧；右侧所示区域表示按预计的与[125I]-BMP-4交联的DAF-4、t-BRK-3、BRK-1或BRK-2分子量进行迁移的蛋白质标记条带。在存在或不存在II型受体的情况下，抗血清1379用于用BRK-1转染的COS-1细胞；而在存在或不存在II型受体的情况下，抗血清1380用于用BRK-2转染的COS-1细胞。对于所有的其他泳道，抗血清列在括号中。从左至右，NIH3T3胚成纤维细胞(1379)；随后是仅用BRK-1；用BRK-1加DAF-4；BRK-1加t-BRK-3；仅用BRK-2；BRK-2加DAF-4；BRK-2加t-BRK-3转染的COS-1细胞。随后是NIH3T3胚成纤维细胞(1380)；仅用DAF-4(1379)；和仅用t-BRK-3(1380)转染的COS-1细胞。在该图中，“BRK-3”是t-BRK-3。
图9显示了在所示的存在或不存在过量未标记竞争物的情况下，用BRK-2和t-BRK-3转染的且与210pM[125I]-BMP-4交联的COS-1细胞的免疫沉淀情况。使用抗血清1380。在左边的重复泳道显示没有加入未标记竞争物，随后(从左至右)是加入10nM BMP-4；10nM BMP-2；10nM DR-BRMP-2；和50nM TGF-β1。在该图中，“BRK-3”是t-BRK-3。
图10显示了用于在哺乳动物中瞬时表达鼠BRK3的构建物pJT6-mBRK-3L。所用的缩写字母同图2。
图11显示了用于在哺乳动物中瞬时表达鼠BRK3的构建物pJT6-mBRK-3S。在该构建物中，去除了大部分不翻译的3＇区域。所用的缩写字母同图2。
图12显示了在存在或不存在I型受体BRK-2的情况下，[125I]-BMP-4与在COS-1细胞中表达的鼠BRK-3的全细胞结合情况。柱代表了化为细胞数目的[125I]-BMP-4的特异性结合。用于鼠BRK-3的构建物是pJT6-mBRK-3L和pJT6-mBRK-3S；对于BRK-2，所用的构建物是pJT3-BRK-2。两种构建物都含有鼠BRK-3的全编码区域。在pJT6-mBRK-3S中，删去了位于3＇不翻译区域中的富含A-T的区域。从左至右分别为：仅用载体pJT-6转染的COS-1细胞(称为“模拟物”)；仅用pJT3-BRK-2；仅用pJT6-mBRK-3S；仅用pJT6-BRK-3L；用pJT3-BRK-2加pJT6-BRK-3S；用pJT3-BRK-2加pJT6-BRK-3L转染的COS-1细胞。
图13显示了在存在或不存在I型BMP受体的情况下，[125I]-BMP-4与m-BRK-3的交联情况。COS-1细胞用BRK-3的cDNA转染(用pJT6-mBRK-3S构建物)，和/或用BRK-1的cDNA(用pJT4-J159F)或BRK-2(用pJT3-BRK-2)转染。然后让这些细胞结合[125I]-BMP-4，与辛二酸二琥珀酰亚胺酯(disuccinimidyl suberate)交联，然后进行SDS凝胶电泳。分子量标准示于左侧。从左至右分别为：仅用BRK-1；用BRK-1加m-BRK-3；仅用m-BRK-3；用BRK-2加m-BRK-3；仅用BRK-2；和仅用载体转染的COS-1细胞。在右侧标出了鉴别为BRK-1、BRK-2和BRK-3的条带。
图14显示了在存在或不存在I型BMP受体的情况下，m-BRK-3的免疫沉淀情况。COS-1细胞用mBRK-3的cDNA转染(用pJT6-mBRK-3S构建物)，和/或用BRK-1的cDNA(用pJT4-J159F)或BRK-2(用pJT3-BRK-2)转染。然后让这些细胞结合[125I]-BMP-4，与辛二酸二琥珀酰亚胺酯交联，与针对BRK-1或BRK-2的抗体进行免疫沉淀，然后进行SDS凝胶电泳。所用的抗血清在泳道下方标出：PI，免疫前；1379，用于所有用BRK-1cDNA转染的细胞；1380，用于所有用BRK-2cDNA转染的细胞。分子量标准的位置示于左侧。从左至右分别为：仅用BRK-1加m-BRK-3(免疫前血清)；仅用BRK-1；用BRK-1加m-BRK-3；用BRK-2加m-BRK-3；仅用BRK-2；和用BRK-2加m-BRK-3(免疫前血清)转染的COS-1细胞。
图15显示了pHSK1040的插入片段图。该构建物在BLUESCRIPT II SK(-)中含有人BRK-3的全编码区域。
发明详述
本发明通过提供分离的BMP受体激酶蛋白、编码该蛋白质的DNA序列、含有该DNA序列的重组表达载体、含有该重组表达载体的宿主细胞以及表达该BMP受体激酶蛋白的方法，满足了对哺乳动物BMP II型受体蛋白的需求。同时，本发明的BMP II型受体将重建成一种高亲和性的BMP受体复合体，这被认为在与BMP I型受体协同传导信号时是必需的。
如本文所用，“人BMP受体激酶蛋白-3”或“h-BRK-3”指具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质，以及具有基本类似SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质，它们的生物活性在于能与BMP分子(包括但并不限于：BMP-2、DR-BMP-2、BMP-4和/或BMP-7)结合、或者将由BMP分子结合而引发的生物信号转导给细胞、或者与针对h-BRK-3或m-BRK-3的抗体或者针对衍生自h-BRK-3或m-BRK-3蛋白质序列的肽的抗体发生交叉反应(参见下文)、或者与BMP I型受体形成复合物、或者与BMP I型受体共免疫沉淀(当使用对h-BRK-3或BMP I型受体的特异性抗体时)。
如本文所用，“截短的BMP受体激酶蛋白”或“t-BRK-3”指具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的蛋白质、或者是具有上述BRK-3特性的序列。
如本文所用，“鼠BMP受体激酶蛋白”或“m-BRK-3”指具有SEQ ID NO：8氨基酸序列的蛋白质、或者是具有上述BRK-3特性的序列。
如本文所用，“BRK-3”一般指h-BRK-3、t-BRK-3和m-BRK-3、或基本类似的BMP受体激酶蛋白。
如本文所用，当用“基本类似”描述氨基酸或核酸序列时，是指一个特定序列(例如通过诱变而改变的序列)与对照序列相比相差一个或多个取代、缺失或插入单元，但净效应是保留BRK-3蛋白的生物活性。另外，如果因遗传密码的简并性而使DNA序列编码基本类似于对照氨基酸序列的氨基酸序列，那么核酸序列和类似物与此处公开的特定DNA序列是“基本类似”的。此外，“基本类似”指受体蛋白会与针对BRK-3蛋白或衍生自BRK-3蛋白质序列的肽而产生的抗体发生反应。
如本文所用，“生物活性”是指特定的分子与本发明例子具有足够氨基酸序列相似性，从而能够结合可检测数量的BMP-2或BMP-4，或者将BMP-2或BMP-4的刺激传给细胞(例如作为杂合受体构建物的组份)。较佳地，具有本发明范围内生物活性的BRK-3意味着，受体蛋白能够以纳摩尔或亚纳摩尔亲和力与[125I]-BMP-4结合(Kd约等于10-9M)。较佳地，亲和力为约1X10-10M至约1×10-9M，且一部分结合位点的Kd小于10-10。
如本文所用，“可溶性片段”指对应于BRK-3的胞外区域的、能够结合BMP的氨基酸序列。可溶性片段包括截短的蛋白质，其中对于BMP结合所不需要的受体分子区域被删去。本发明的这种可溶性片段的例子包括(但并不限于)：氨基酸序列基本类似于SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：2中氨基酸残基1-150、或SEQ ID NO：8中氨基酸残基1-150的多肽，或者由基本类似于SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：1中核苷酸409-858、或SEQ ID NO：7中核苷酸17-466的核酸残基所编码的多肽。
如本文所用，“部分去除的BMP-2”和“DR-BMP-2”指成熟BMP-2的氨基末端通过适度的胰蛋白酶消化而去除后得到的BMP-2片段(B.B.Koenig等人，分子和细胞生物学，14：5961-5974(1994))。
如本文所用，用“分离的”描述本发明的受体蛋白或编码该蛋白质的DNA序列时，指蛋白质或DNA序列从其天然存在的复杂细胞环境中取出，而且当其可操作地连于合适的调控序列时，该蛋白质可在本来天然不表达的细胞中由该DNA序列表达。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，信号肽(分泌前导序列)DNA是可操作地连于多肽DNA，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
如本文所用，“ATCC”指美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，Maryland)。
如本文所用，“骨形态形成蛋白2”或“BMP-2”指ATCC NO：40345中所含的DNA序列编码的肽(参见ATCC/NIH REPOSITORY CATALOGUE OFHUMAN AND MOUSE DNA PROBES AND LIBRARIES，sixth Edition，1992，p.57，以下简称“ATCC/NIH REPOSITORY CATALOGUE”)。BMP的分离过程公开于下列专利中，其中每一篇专利都在此引用作为参考：美国专利NO：5,013,649(Wang,Wozney和Rosen，1991年5月7日授权)；美国专利NO：5,166,058(Wang，Wozney和Rosen，1992年11月24日授权)；和美国专利NO：5,168,050(Hammonds和Mason，1992年12月1日授权)。
如本文所用，“骨形态形成蛋白4”或“BMP-4”指ATCC NO：40342中所含的DNA序列编码的肽(参见ATCC/NIH REPOSITORY CATALOGUE)。BMP-4的分离过程公开美国专利NO：5,013,649(Wang，Wozney和Rosen，1991年5月7日授权)中，该专利在此引用作为参考。
如本文所用，“骨形态形成蛋白7”或“BMP-7”指ATCC NO：68020和ATT68182中所含的DNA序列编码的肽(参见ATCC/NIH REPOSITORY目录)，其中，ATCC 68182中的cDNA被声称含有编码BMP-7蛋白所需的全部核苷酸序列。BMP-7的分离过程公开美国专利NO：5,141,905(Rosen等人，1992年8月25日授权)中，该专利在此引用作为参考。
如本文所用，“BMP I型受体激酶”是能够结合BMP-2、BMP-4和/或其他已知BMP并且具有I型受体的特征序列的蛋白质，其中特征序列包括但并不限于：含有半胱氨酸盒和上游半胱氨酸盒的胞外配体结合域、位于胞内并膜区域中的SGSGSG基序(即GS结构域)、与TGF-β超家族中针对其他配体的其他I型受体的相似性＞约85％的胞内激酶结构域、和/或较短的羧基端。如本文所用，“BMPI型受体激酶”还包括具有BMP I型受体特征的受体蛋白，如在文献中描述：B.B.Koenig等人，分子和细胞生物学，14：5961-5974(1994)；L.Attisano等人，生物化学和生物物理学报(Biochimica et Biophysica Acta)，1222：71-80(1994)；J.Massague，L.Attisano，和J.L.Wrana，细胞生物学趋势，4：172-178(1994)；以及tenDijke等人，生物化学杂志(J.Biological Chemistry)，269：16985-16988(1994)中所描述的受体蛋白。
BMP I型受体的例子包括但并不限于：BRK-1(B.B.Koenig等人，分子和细胞生物学，14：5961-5974(1994))；BRK-2，也称为RPK-1(S.Sumitomo，T.Saito，和T.Nohno，DNA序列，3：297-302(1993))；ALK-2，已表明它是BMP-7的受体(ten Dijke等人，生物化学杂志(J.Biological Chemistry)，269：16985-16988(1994))；与BMP-2和BB4结合并且涉及中胚层诱导的非洲爪蟾(Xenopus)BMP I型受体(J.M.Graff，R.S.Thies，J.J.Song，A.J.Celeste和D.A.Meton，细胞，79：169-179(1994))；和来自果蝇(Drosophila)的、能与decapentaplegic肽(它是BMP-2和BMP-4的果蝇同源物)结合的I型受体。这些果蝇受体被称为25D1、25D2和43E(T.Xie，A.L.Finelli，和R.W.Padgett，科学，263：1756-1759(1994)；A.Penton，Y.Chen，K.Staehling-Hampton，J.L.Wrana，L.Attisano，J.Szidonya，A.Cassill，J.Massague，和F.M.Hoffmann，细胞，78：239-250(1994)；和T.Brummel，V.Twombly，G.Marques，J.Wrana，S.Newfeld，L.Attisano，J.Massague，M.O＇Connor，和W.Gelbart，细胞，78：25 1-261(1994))。
如本文所用，“DNA序列”指DNA聚合物，它处于单独的片段形式或者是较大的DNA构建物的一部分，它衍生自分离过至少一次的DNA并处于基本纯净形式(即基本上不含污染性的外源物质)而且其数量或浓度足以通过标准生物化学方法(例如通过克隆载体)鉴别、操作和回收该序列及其组分核苷酸序列。这种序列较佳地是以开放阅读框架形式提供，不含有通常存在于真核生物基因中的内部不翻译序列(内含子)。也可以使用含有相关序列的基因组DNA。非翻译DNA序列可以位于开放阅读框的5′或3，不干扰编码区域的操作或表达。本发明提供的编码蛋白质的DNA序列可用cDNA片段和短寡核苷酸接头或用一系列寡核苷酸装配而成，以提供能在重组转译单元中表达的合成基因。
如本文所用，“重组”意味蛋白质衍生自一个在体外操作过并引入宿主生物体的DNA序列。
如本文所用，“微生物的”指重组蛋白是在细菌或真菌(如酵母)或昆虫表达系统中生产的。
如本文所用，“重组表达载体”指用于表达编码所需蛋白质(如BRK-3)的DNA构建物，它含有一个包括下列组成的转录亚单元：1)在基因表达中具有调控作用的遗传因子，如启动子和增强子；2)被转录成mRNA和翻译成蛋白质的结构或编码DNA；和3)合适的转录和翻译起始及终止序列。用本领域中公知的方法，可构建本发明的重组表达载体。可用于本发明的载体包括(但并不限于)：对于哺乳动物细胞，pJT4(下面进一步描述)，pcDNA-1(Invitrogen，San Diego，Ca)和pSV-SPORT 1(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)；对于昆虫细胞，pBlueBac III或pBlueBacHis杆状病毒载体(Invitrogen，San Diego，CA)；以及对于细菌细胞，pET-3(Novagen，Madison，WI)。编码本发明BRK-3蛋白受体激酶的DNA序列可位于载体中并可操作地连于调控元件。
在本发明的一个例子中，哺乳动物宿主细胞较佳地是用质粒构建物pJT6-mBRK-3L转染的，从而导致表达m-BRK-3。在本发明的另一个例子中，哺乳动物宿主细胞较佳地是用质粒构建物pJT6-hBRK3T转染的，从而导致表达t-BRK-3。可用本领域中公知的方法实现重组分子的转染。
如本文所用，“宿主细胞”指含有本发明的重组表达载体的细胞。宿主细胞可用重组表达质粒稳定地转染或瞬时转染，或者用重组病毒载体感染。宿主细胞包括原核细胞如大肠杆菌，真菌系统如酿酒酵母、无限增殖的昆虫细胞系如Sf-9和Sf-21，以及无限增殖的哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和SV40转化的非洲绿猴肾细胞(COS)。
在一个例子中，本发明涉及BMP II型受体激酶蛋白或其可溶性片段。较佳地，BMP受体激酶蛋白具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的h-BRK-3或其具有SEQ IDNO：6氨基酸序列的可溶性片段。同样优选的是具有SEQ ID NO：8氨基酸序列的BMP受体激酶蛋白m-BRK-3或其具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的可溶性片段。同样优选的是具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的BMP受体激酶蛋白t-BRK-3
在另一例子中，本发明涉及编码h-BRK-3受体蛋白或其可溶性片段的DNA序列。(该DNA序列可以是基因组DNA或cDNA)。较佳地，h-BRK-3蛋白是由SEQID NO：1核酸序列所编码的；而其可溶性片段是由SEQ ID NO：5核酸序列所编码的。
在另一例子中，本发明涉及编码t-BRK-3蛋白的DNA序列。(该DNA序列可以是基因组DNA或cDNA)。较佳地，该DNA序列是SEQ ID NO：3。
在另一例子中，本发明涉及编码m-BRK-3蛋白或其可溶性片段的DNA序列。(该DNA序列可以是基因组DNA或cDNA)。较佳地，m-BRK-3蛋白是由SEQ IDNO：7 DNA序列所编码的；而其可溶性片段是由SEQ ID NO：9 DNA序列所编码的。
在另一例子中，本发明涉及含有编码m-BRK-3蛋白的DNA序列的重组表达载体。较佳地，该重组表达载体是质粒，它分别具有ATCC NO：69694和ATCCNO：69695所含的pJT6-mBRK-3S或pJT6-MBRK-3L质粒构建物所有确定的特性。在另一例子中，本发明涉及含有上述重组表达载体的宿主细胞。较佳地，该宿主细胞是哺乳动物细胞，更佳地是CHO细胞或COS细胞，或貂肺上皮细胞。
在另一例子中，本发明涉及含有编码t-BRK-3的DNA序列的重组表达载体。较佳地，该重组表达载体是质粒，它具有ATCC NO：69676所含的pJT4-hBRK-3T质粒构建物所有确定的特性。在另一例子中，本发明涉及含有编码t-BRK-3的DNA序列的重组表达载体的宿主细胞。较佳地，该宿主细胞是哺乳动物细胞，更佳地是CHO细胞或COS细胞。
在另一例子中，本发明涉及含有编码h-BRK-3的DNA序列的重组表达载体。在另一例子中，本发明涉及含有编码h-BRK-3的DNA序列的重组表达载体的宿主细胞。较佳地，该宿主细胞是哺乳动物细胞，更佳地是CHO细胞或COS细胞。
在另一例子中，本发明涉及产生BRK-3、t-BRK-3或m-BRK-3的方法，它包括从上述的宿主细胞中分离BRK-3、t-BRK-3或m-BRK-3。
本发明的BMP II型受体可用于鉴别能结合BMP受体激酶蛋白的化合物(例如BMP(较佳地为BMP-2、BMP-4或BMP-7)以及其他未发现的化合物)，该方法包括：将含有该化合物的样品与在细胞中表达的BMP II型受体激酶蛋白接触，让化合物与受体激酶蛋白结合。较佳地，II型受体激酶蛋白具有SEQ ID NO：2(h-BRK-3)或其可溶性片段的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO：8(m-BRK-3)或SEQID NO：4(t-BRK-3)或其可溶性片段的氨基酸序列。这种方法也可用于测定样品中存在的BMP或其他受体结合化合物的数量。
例如，样品中BMP的浓度可通过放射受体测定(radioreceptor assay)而确定，其中样品中的未标记BMP与标记的示踪物BMP竞争与BRK-3受体的结合。如在未审定的申请USSN.____(Rosenbaum在1994年11月4日申请)中所述，本发明的BRK-3受体可以与BMP I型受体复合。当样品中的BMP数量上升时，能够与BRK-3结合的标记BMP或者含有BRK-3的受体蛋白复合物的数量就下降。用已知浓度的未标记BMP制作标准曲线，通过与标准曲线的比较可以准确地确定样品中BMP的浓度。示踪物BMP的标记较佳地是用[125I]NaI的碘化反应完成。BRK-3可以在稳定的细胞系的外膜表达，或者以可溶性片段形式提供，或者作为共价连于固相载体的可溶性片段。为了进行测试，样品中未标记BMP和标记的示踪物BMP应一直与受体竞争结合，直至得到平衡。然后从游离配体中分离出受体-BMP复合物，例如通过洗涤(在附着细胞系情况下)、快速过滤或离心(在非附着细胞系或受体结合于固相载体的情况下)、或用抗体、聚乙二醇或其他沉淀剂在过滤或离心后沉淀受体-配体复合物(在可溶性受体的情况下)。然后通常通过伽马计数法并与已知对照标准进行比较而确定复合物中标记BMP的数量。使用其他受体的方法已经在文献中有描述(M.Williams，方法研究回顾(Med.Res.Rev.)，11：147-184(1991)；M.Higuchi和B.B.Aggarwal，分析生物化学(Anal.Biochem.)，204：53-58(1992)；M.J.Cain，R.K，Garlick和P.M.Sweetman，心血管药物杂志(J.Cardiovasc.Pharm.)，17：S150-S151(1991)；每一篇文献都在此引用作为参考)，而且可以方便地用于BRK-3受体/BMP系统。这种放射受体测定可出于诊断目的对临床样品中的BMP进行定量，在这些场合中定量是需要的。
本发明的BMP II型受体蛋白也可用于高流通量(high-throughput)筛选，以确定能与BRK-3或同源受体蛋白结合的化合物。在这种方法中，化合物与BRK-3的亲和性越高，它就能越有效地与示踪物竞争与受体的结合，因而受体-配体复合物的计数就越低。在这种情况下，人们可以比较相同浓度范围内的一系列化合物，以确定哪个化合物与受体结合的亲和性最高。
本发明可用于确定配体例如已知的或假定的药物是否能够结合和/或激活本发明的DNA分子所编码的受体。此处描述的通过该DNA序列转染入细胞系统，可提供一种用于确定配体是否能够结合和/或激活分离的DNA分子所编码的受体的测试系统。重组细胞系(例如此处所述的细胞系)可用作竞争性结合测试的活细胞培养物，该竞争性测试是在已知或候选药物与结合受体并用放射性、光谱的或其他试剂标记的配体之间进行的。含有受体的、从转染细胞中分离出的膜制剂也可用于竞争性结合测试。衍生自受体的含有配体结合结构域的可溶性受体也可以用于候选药物的高流通量筛选。细胞内信号传递的功能测试可作为结合亲和性及受体功能性激活功效的测试手段。此外，可以修饰重组细胞系使其含有可操作地连于效应元件的报道基因(reporter gene)，使受体发出的信号能够开启报道基因。这种系统特别适合针对确定受体拮抗剂的高流通量筛选。这些重组细胞系构成了可用于鉴别具有潜在药物开发价值的天然或合成化合物的“药物发现系统”。这种鉴别出的化合物可进一步修饰或者直接用作治疗化合物以激活或抑制分离的DNA分子编码的受体的天然功能。
本发明涉及一种受体-报道系统，该系统可用于鉴别能改变BMP II型受体BRK-3基因转录从而作为BRK-3的间接促效剂或拮抗剂的化合物。用于评估测试化合物是否可作为BMP II型受体蛋白激酶BRK-3或其功能修饰形式的促效剂的报道系统包括：
(a)培养细胞，该细胞含有：
  (i)编码BRK-3蛋白或其功能修饰形式的DNA，和
  (ii)可操作地连于报道基因的编码激素应答元件的DNA，
其中，在存在至少一种测试化合物下进行培养，其中该测试化合物诱导BRK-3蛋白转录活性的能力需被确定，然后
(b)监测细胞表达报道基因的情况。
用于评估测试化合物是否可作为BMP II型受体蛋白激酶BRK-3或其功能修饰形式的拮抗剂的报道系统包括：
(a)培养细胞，该细胞含有：
  (i)编码BRK-3蛋白或其功能修饰形式的DNA，和
  (ii)可操作地连于报道基因的编码激素应答元件的DNA，
其中，在存在固定浓度的至少一种BRK-3或其功能修饰形式的促效剂并增加至少一种测试化合物的浓度下进行培养，其中该测试化合物抑制BRK-3受体蛋白转录活性的能力需被确定，然后
(b)监测细胞中报道基因产物的表达水平，该水平是测试化合物浓度的函数，从而显示出测试化合物抑制转录活性的能力。
本发明的大量表达BMP II型受体蛋白或其可溶性片段的细胞系也可用作纯化受体的蛋白质来源。然后可将纯化的受体或其可溶性形式用于高流通量筛选测试以实现上述目的。纯化的受体或其可溶性形式也可通过X射线晶体衍射法或NMR(核磁共振)技术，用于确定BMP：BRK-3复合物的结构，从而设计合理的BMP促效剂或拮抗剂。此外，纯化的受体或其可溶性形式可以与I型受体或其可溶形式一起使用，以确定BMP：BRK-3：I型受体复合物的结构。可溶性受体蛋白还可在治疗上用作体内BMP功能的促效剂或拮抗剂。
本发明还涉及产生的、针对本发明的BMP II型受体激酶蛋白的抗体。这种抗体可以用本领域技术人员熟知的标准技术，将本发明的BMP II型受体激酶蛋白用作产生抗体的抗原而进行制备。这些抗体可用于诊断应用、治疗应用等。对于治疗应用，抗体较佳地是单克隆抗体。
本发明的可溶性受体蛋白和本发明的抗体可在临床环境中用诸如腹膜内、肌内、静脉或皮下注射、植入或透皮给药方式等方法进行施用。可以预计，这些施用可提供治疗上BMP活性的改变。
此处公开的核苷酸序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：1，表示从人皮肤成纤维细胞中分离出的分别编码t-BRK-3和h-BRK-3的DNA序列。SEQ ID NO：7表示从鼠NIH3T3细胞中分离出的编码m-BRK-3受体蛋白的DNA序列。用这些序列可方便地获得其他物种如大鼠、兔、果蝇和非洲爪蟾的编码BRK-3的cDNA。这些cDNA序列还可方便地用于分离BRK-3的基因组DNA。这样便可以分析控制受体基因表达的调控元件，从而提供新的治疗和疾病诊断机会。核苷酸序列还可用于确定BRK-3在正常组织及发病状态下的分布情况，从而确定其在体内的生理作用。
为了阐述本发明的优选例子，下面详细讨论实施例。这些实施例不起限制作用。
实施例1
PCR片段的产生
为了产生与TGF-βII型受体相关的II型受体的PCR片段，从TGF-βII型受体的激酶结构域中设计出图1所示的引物。对于第一轮PCR，引物是衍生自激酶结构域II的TSK-1和衍生自激酶结构域VIII的TSK-2。模板DNA由用从9个月大小男性的人皮肤成纤维细胞中分离出的mRNA而制备的cDNA构成。PCR反应在50微升的总体积中进行，它含有0.2微克这种DNA、浓度为15μM的TSK-1和TSK-2引物、浓度各为0.2mM的全部4种脱氧核苷酸原料、1.5单位的来自Thermus Therophilus的DNA聚合酶(以下简称Tth聚合酶)(Toyobo，Osaka，Japan)和用于Tth聚合酶的反应缓冲液(Toyobo，Osaka，Japan)。在最初的94℃1分钟的解链期之后，进行的温度循环如下：进行35个循环，每个循环包括解链(92℃，40秒)、退火(48℃，40秒)和延伸(75℃，90秒)。在第35个循环之后，反应在75℃再保持5分钟以完成延伸。
扩增出若干条带，包括某些在470碱基对(bp)位置的条带，这对应于与TGF-βII型受体类似的II型受体的预期序列长度。根据制造商的说明，用QIAEX(Qiagen，chatsworth，CA；一种凝胶纯化DNA片段的试剂盒，包括活化的氧化硅球和缓冲液)从琼脂糖凝胶中回收该大小范围内的片段，然后再悬浮于体积为20微升的10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA(TE)中。
为了减少从与TGF-βII型受体无关的cDNA中扩增出的片段的背景，进行第二轮PCR，其中使用基于TGF-βII型受体的位于第一轮扩增出的470bp区域中的保守区域的嵌套式引物。嵌套引物是衍生自TGF-βII型受体激酶结构域IV的AVR-5和衍生自激酶结构域VIB的TSK-4(图1)。模板由从第一轮PCR中分离出的一份(0.5微升)PCR片段构成。向其中加入引物AVR-5(5μM)和TSK-4(15μM)、全部4种脱氧核苷酸(各0.2mM)、1.5单位Tth DNA聚合酶和用于TthDNA聚合酶的反应缓冲液，总体积为50微升。温度循环程序完全按上述的第一轮PCR那样进行。如预期的那样，PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示出300bp区域的条带。用QIAEX分离该片段。
为了亚克隆第二轮PCR反应的PCR产物，用聚核苷酸激酶使纯化片段磷酸化，再连于已用Sma I切割并脱磷酸化的克隆载体pGEM7f(+)(Promega，Madison，WI)中。用连接混合物转化大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene，La Jolla，CA)。当转化混合物接种于含异丙基巯基-β-半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)的琼脂上，获得失去蓝色(意味着存在插入片段)的菌落。从选定的这些菌落中制备质粒DNA。发现有3种候选质粒即HSK7-1、HSK7-2和HSK7-4具有预期大小(300碱基对)的插入片段。根据对这些插入片段的测序，发现来自HSK7-2的300bp插入片段编码一种新激酶的一部分，该新激酶预计是TGF-β受体超家族的新成员。所以，将HSK7-2 PCR片段用作探针去分离全长受体克隆。
实施例2
分离人t-BRK-3 cDNA
为了定位对应于HSK7-2中300bp插入片段的cDNA，使用用于分离PCR片段的相同mRNA来构建cDNA文库。这是根据制造商的说明，用SUPERSCRIPTChoice System(Life Technologies，Gaithersburg，MD；一种用于cDNA合成的试剂盒，含有引物、衔接头、SUPERSCRIPT II RNAse H-反转录酶(Life Technologies，Gaithersburg，MD；一种修饰形式的Moloney鼠白血病病毒逆转录酶)、酶、核苷酸、缓冲液和凝胶过滤柱)而完成的，不同点在于在第一条链的合成中加入180单位RNase抑制剂(Takara，Kyoto，Japan)。模板是来自9个月大小男性的皮肤成纤维细胞的mRNA(4微克)。在第一条链和第二条链的合成之后，获得总计4微克的cDNA。随后加入内部含有Not I和Sal I位点的EcoR I衔接头(由试剂盒提供)。带EcoRI衔接头的cDNA再被磷酸化，并根据制造商的说明，用试剂盒提供的凝胶过滤柱进行大小分级。
将大小分级后的cDNA连于噬菌体λgt10的EcoRI位点中，并根据制造商的说明，在体外用GIGAPACK II Gold Packaging Extract(Stratagene，La Jolla，CA；一种用于在λ噬菌体中高效构建cDNA库的无限制体外包装抽提物)包装。获得总计8.1×105个噬菌体。
在10张HYBOND尼龙膜(Amersham，Arlington Heights，IL；优化用于固定核酸的尼龙膜)上筛选文库，密度为1×105噬菌斑/滤膜。根据制造商的说明，来自HSK7-2的插入片段用MULTIPRIME DNA标记系统(Amersham，Arlington Heights，IL；一种DNA随机引物标记的试剂盒，它含有Klenow DNA聚合酶、引物和缓冲液)进行标记。让标记的探针与文库滤膜在50％甲酰胺、6×SSPE(1×SSPE＝0.14M NaCl，8mM磷酸钠，0.08mM EDTA，pH 7.7)、5×Denhardt＇s溶液(1×Denhardt＝0.02％Ficoll 400，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％BSA)，0.5％十二烷基磺酸钠(SDS)和100微克变性鲑精DNA中，于42℃杂交12小时。印迹再在室温下于2×SSPE，0.1％SDS中洗涤3次(各15分钟)，随后在42℃洗涤1小时。
在3轮筛选后，获得3个独立的克隆。发现一个克隆HSK723编码与HSK7-2插入片段相同的序列。获得该克隆的完整DNA序列。来自该克隆的cDNA被称为t-BRK-3。
实施例3
t-BRK-3序列分析
这个t-BRK-3克隆的DNA序列示于SEQ ID NO：3，而推导出的t-BRK-3蛋白质序列示于SEQ ID NO：4。衍生自克隆HSK723的t-BRK-3开放阅读框编码至少583个氨基酸的蛋白质。在HSK723 cDNA的3＇区域中没有发现框架中的终止密码子，这表明该克隆在3＇端是不完整的。因而将其称为t-BRK-3。
SEQ ID NO：4中所示的推导出的t-BRK-3蛋白质序列，在Genbank版本84.0(1994年8月15日)中，用标准Needleman-Wunsch算法(S.B.Needlman和C.D.Wunsch，分子生物学杂志，48：443-453(1970))相对所有翻译的蛋白质序列进行检索，结果发现它代表了一种新序列。
对预计的蛋白质序列的分析揭示了预计的TGF-βII型受体超家族成员跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶结构。预计的单个跨膜区域包括SEQ ID NO：4中的残基151-172。在预计的胞外结构域中，在氨基酸残基55、110和126处有3个潜在的N-相连的糖基化位点。在SEQ ID NO：4中的氨基酸116-123含有称为“半胱氨酸盒”的半胱氨酸残基簇，这是针对TGF-β超家族配体的受体的特征。t-BRK-3的半胱氨酸盒与对BMP-2和BMP-4的DAF-4 II型受体的半胱氨酸盒有6-8个氨基酸相同。然而，t-BRK-3与DAF-4在胞外结构域中的全序列仅7.1％相同。
在预计的t-BRK-3细胞质区域中的氨基酸200-504(SEQ ID NO：4中)，含有所有的共有序列，这些共有序列是对丝氨酸/苏氨酸残基有预计特异性的蛋白激酶结构域的特征(S.K.Hanks，A.M.Quinn，和T.Hunter，科学，241：42-52(1988))。
实施例4
构建用于t-BRK-3、BRK-1、BRK-2和DAF-4的表达载体
为了在哺乳动物中表达t-BRK-3，它被亚克隆入用于瞬时表达的载体pJT4中。为了在COS细胞中进行瞬时表达而优化的pJT4载体，它含有：巨细胞病毒早期启动子和增强子，它能非常有效地转录信使；来自人T-细胞白血病病毒-1长末端重复序列的“R”元件，已表明它能进一步提高表达水平；来自SV40病毒的内含子拼接位点，据信它能增加信使的稳定性；多克隆位点；衍生自SV40病毒的聚腺苷酸化信号，它指导在信使RNA尾部添加聚腺苷酸，这是大多数真核mRNA所必需的；SV40病毒的复制起点，它允许在含有SV40大T抗原的细胞如COS细胞中复制出极高拷贝数的质粒。此外，为了在细菌中进行操作和扩增载体，载体含有大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性基因。将截短的人BRK-3 cDNA插入pJT4如下完成。
因为在激酶结构域的3＇区域没有鉴别出终止密码子，所以进行PCR从而插入终止密码子以便翻译蛋白质。因此，设计PCR引物，在SEQ ID NO：3的核苷酸2028之后插入2个终止密码子，从而在SEQ ID NO：4中Ile 540之后终止了激酶。这样的选择对应了活化素II型受体的长度(L.S.Mathews和W.V.Vale，细胞，65：973-982(1991)，从而使其足以能够进行激酶结构域的合适折叠。终止密码子后为Kpn I位点。引物的完整序列(包括SEQ ID NO：3中核苷酸2013-2028的反向互补序列)是5＇ACG CGG TAC CTC ACT AA TTT TTG GCA CAC GC 3＇。第二个引物被设计成与Afl III位点区域的t-BRK-3序列(SEQ ID NO：3中核苷酸1618-1637)完全匹配，其序列是5＇GTA GAC ATG TAT GCT CTT GG 3＇。反应模板是实施例2中所述的克隆HSK723，它在BLUESCRIPT II SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA；一种衍生自pUC19的2.96kb的产生集落的噬菌粒)中含有t-BRK-3 cDNA。
根据制造商的说明书，用GENE AMP PCR系统9600热循环仪(Perkin Elmer，Norwalk，CT))，采用具有AMPLITAQ DNA聚合酶的GENE AMP PCR试剂盒(Perkin Elmer，Norwalk，CT；一种含有聚合酶链反应扩增DNA所需的组份的试剂盒，包括AMPLITAQ，一种来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶的重组修饰形式(Perkin Elmer，Norwalk，CT)，核苷酸和缓冲液)进行PCR。在最初的95℃5分钟的解链之后，进行的20个程序如下的循环：95℃解链1分钟、50℃退火1分钟和72℃延伸1分钟。在最后一个循环之后，在72℃再保温2分钟以完成延伸。
从琼脂糖凝胶中分离出形成的、大小预计为400碱基对的扩增条带，然后用Afl III和Kpn I消化。同时，t-BRK-3 cDNA用EcoRV和Afl III消化，而载体pJT4用EcoRV和Kpn I消化。在单一步骤中将这3种分离片段连接起来，形成构建物pJT4-hBRK3T，如图2所示。为了证实在PCR中没有引入差错，用TAQDYE DEOXY Terminator Cycle测序试剂盒(Applied Biosystems，Foster City CA；试剂盒含有用双脱氧终止法自动DNA测序的各种组份，包括：AMPLITAQ、核苷酸混合物、染料标记的双脱氧核苷酸终止物和缓冲液)和AppliedBiosystems373A型自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)对Afl II位点至3＇端Kpn I位点之间的区域进行测序。没有发现差错。
为了确定t-BRK-3与I型BMP受体共表达的效应，有必要将t-BRK-3的cDNA和BRK-1的cDNA或BRK-2的cDNA进行共表达。鼠BRK-1的DNA序列示于SEQ ID NO：11，而推导出的鼠BRK-1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：12。鸡BRK-2的DNA序列示于SEQ ID NO：13，而推导出的鸡BRK-2蛋白质序列示于SEQ IDNO：14。
对于BRK-1的哺乳动物表达，使用质粒pJT4-J159F。该质粒的构建描述于USSN 08/158,735(Cook等人，1993年11月24日申请)和B.B.Koenig等人，分子和细胞生物学，14：5961-5974(1994)；ATCC 69457中。简而言之，含有亚克隆在BLUESCRIPT SK(-)中的BRK-1 cDNA的该构建物，用限制性内切酶AlfIII线性化，粘末端用DNA聚合酶I的Klenow片段填平。再用Not I消化线性化的质粒，从而从质粒中释放出插入片段。然后将该插入片段亚克隆入pJT4表达载体的Not I和EcoRV位点。Klenow反应所产生的平末端与同样是平末端的EcoRV位点是相容的；连接反应消除了EcoRV位点。构建物pJT4-J159F示于图3。
对于BRK-2的哺乳动物表达，将其cDNA亚克隆入载体pJT3。该质粒与该实施例中所述的pJT4相同，除了多克隆位点的方向相反而且在多克隆位点的5＇端有额外的Not I位点。BRK-2的cDNA(参见S.Sumitomo等人，DNA序列，3：297-302(1993))最初是从载体pRc/CMV(Invitrogen，San Diego，CA；一种哺乳动物表达载体)中获得的，用Kpn I和Xho I消化而切取。将其亚克隆入pJT3的Kpn I和Sal I位点。这样在BRK-2的5＇端产生了Kpn I位点，而Xho I和Sal I位点则被破坏。形成的构建物被称为pJT3-BRK-2，示于图4。
对于DAF-4(来自秀丽新杆线虫(Caenorhabditis elegans)的II型BMP受体(M.Estevez，L.Attisano，J.L.Wrana，P.S.Albert，J.Massague和D.L.Riddle，自然，365：644-49(1993)))的哺乳动物表达，在BLUESCRIPT II中获得cDNA，然后将其如下亚克隆入载体pJT4。用DraI和Apa I消化而切取含有daf-4 cDNA的2.4kb片段。将该片段亚克隆入pJT4的Sma I和Apa I位点。这样产生了Apa I位点，而Dra I和Sma I位点则被破坏。该构建物被称为pJT4-Daf4，示于图5。
对于m-BRK-3的哺乳动物表达，参见下面的实施例10。
实施例5
t-BRK-3、BRK-1、BRK-2和DAF-4的哺乳动物表达
用pJT4-hBRK-3T在哺乳动物细胞中瞬时表达BRK-3，是用电穿孔在COS-7细胞(ATCC CRL 1651)或用DEAE Dextran(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)在COS-1细胞(ATCC CRL 1650)中进行。
COS-7细胞在添加有10％小牛血清(Hyclone，Logan，Utah)、非必需氨基酸(GIBCO，Gaithersburg，MD)和谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle(Dulbecco′sModified Eagle，DME)高葡萄糖培养基中生长至汇合，然后用胰蛋白酶处理将细胞从平板上释放出来。释放的细胞在桌面离心器中离心，然后在新培养基中以6.25×106细胞/ml的浓度重新悬浮。将细胞悬浮液(5×106细胞，0.8ml)转移至BioRad GENE PULSER电穿孔系统(BioRad，Hercules，CA)的样品池中。在样品池中加入纯化的、含有感兴趣的受体DNA的质粒(对于pJT4-J159F和pJT3-BRK-2为10μg和/或对于pJT4-hBRK-3T为20μg)，然后细胞在4.0 kV/cm、25μFd电容下进行电穿孔。接着将细胞置于板上(对于12孔板的每个孔为400,000细胞，对于100mm板为5×106细胞)，让其复苏。24小时后添加新鲜培养基。48小时后，便可测试细胞与BRM-4的结合。
对于在COS-1细胞中瞬时表达BMP受体，在100毫米板上让细胞在添加有10％小牛血清(Hyclone，Logan，Utah)、非必需氨基酸(GIBCO，Gaithersburg，MD)和谷氨酰胺的DME高葡萄糖培养基中生长至约50-80％汇合。用37℃无血清的DME培养基洗涤细胞2次，随后向每个100毫米板加入4毫升DNA混合物。DNA混合物含有DME、10％Nu-Serum(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)、400微克/ml DEAE-Dextran(Pharmacia，Piscataway，NJ)、0.1mM氯喹(Sigma，St.Louis，MO)和有关的cDNA：对于t-BRK-3，为16微克pJT4-hBRK-3T；对于BRK-1，为8微克pJT4-J159F；对于BRK-2，为8微克pJT3-BRK-2；对于DAF-4，为16微克pJT4-Daf4。细胞在37℃与DNA混合物一起温育3小时。吸去溶液，将细胞与4毫升在无钙或镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液(PBS；LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)中含有10％二甲基亚砜(DMSO)的溶液一起温育。在2分钟后，吸去DMSO溶液，用上述的生长培养基洗涤细胞，将新鲜的培养基返回板。在转染后24小时，将转染细胞分入12孔板中，以便进行全细胞结合或交联反应。在48-68小时后，细胞便可用于结合分析。
实施例6
放射标记的BMP-4配体的产生
用IODOBEADS(Pierce，Rockford，IL；在无孔聚苯乙烯珠上的固定化氯胺T)制备[125I]-BMP-4。将冻干的BMP-4(2微克)溶解于50微升10mM乙酸中，将其加至冰上的450微升磷酸盐缓冲液(PBS)(Sigma，St.Louis，MO)中。向管子中加入5微升500微居里的125I(Amersham，Arlington Heights，IL)(2200Ci/mmol)和一个IODOBEAD。反应在冰上保温10分钟并偶尔摇晃一下。通过去除IODOBEAD而终止反应。为了去除非反应的125I，将混合物上样于已在10mM乙酸、0.1M氯化钠、0.25％明胶中平衡的PD-10凝胶过滤柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)。形成的标记蛋白质中有＞95％可用三氯乙酸沉淀，这表明所有的125I是与蛋白质结合的，而且典型的比活度是4000-9000Ci/mmol。
或者，BMP-4是通过氯胺T法(C.A.Frolik，L.M.Wakefield，D.M.Smith，和M.B.Sporn，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，259：10995-11000(1984))，用125I标记的。将BMP-4(2μg)溶解在5μl 30％乙腈、0.1％三氟乙酸(TFA)并添加有5μl 1.5 M磷酸钠(pH 7.4)中。加入无载体的[125I](1mCi，9μl)以及2μl氯胺T溶液(100μg/ml)。在2分钟和3.5分钟时再加入2μl氯胺T溶液。4.5分钟后，加入10μl 50mM N-乙酰酪氨酸、100μl 60mM碘化钾和100μl 11M尿素在1M乙酸中的溶液，使反应终止。在保温3.5分钟之后，未反应的碘通过PD-10凝胶过滤柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)，在4 mM HCl、75mM NaCl，1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)中上柱而去除。得到的标记蛋白质中95％以上可用三氟乙酸沉淀，这表明所有的125I都结合着蛋白质，而且典型的比活度为3000-8000 Ci/mmol。
实施例7
BMP-4与t-BRK-3结合的定性研究
BMP-4与t-BRK-3的结合可用下列方法显示：整个细胞与放射性标记BMP-4的结合；以及放射性标记BMP-4与受体的共价交联。下面详细描述这2种方法。
a.全细胞结合：
如实施例5所述，用pJT4-hBRK3T转染COS-7或COS-1细胞。转染后，将细胞接种于12孔培养板上，然后在48-68小时时进行结合试验。此时，用结合缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，128mM NaCl，5mM KCl，5mM MgSO4，1.2mM CaCl2，2mg/ml BSA)洗涤细胞一次，然后用相同缓冲液于4℃在轻摇动中平衡30分钟。吸去缓冲液，向每个孔中加入500μl结合缓冲液(4℃)，它含有[125I]-BMP-4示踪物100-400pM以及不同浓度的未标记BMP-2、BMP-4或其他未标记配体，这取决于具体测试情况。对于确定非特异结合，将BMP-4加入结合缓冲液中至终浓度为10-50nM。为了防止配体在保温过程中降解，还加入蛋白酶抑制剂混合物至终浓度为10μg/ml的亮抑酶肽(leupeptin)、10μg/ml抗蛋白酶(antipain)、50μg/ml抑蛋白酶肽(aprotinin)、100μg/ml苯甲脒、100μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、10μg/ml苯丁抑制素(bestatin)、10μg/ml胃酶抑制剂和300μM苯基甲基磺酰氯(PMSF)。细胞在4℃轻摇动中保温4小时。保温期结束之后，吸去缓冲液，用1毫升洗涤缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，128mM NaCl，5mM KCl，5mM MgSO4，1.2mM CaCl2，0.5mg/ml BSA)漂洗细胞4次。在吸去最后一次的漂洗液后，向每个孔中加入200μl溶解缓冲液(10mM TrisCl，pH 7.4，1mM EDTA，1％(v/v)TritonX-100)并在室温下保温15-30分钟。溶解的细胞再转至新试管，用Packard 5005型“COBRA”伽马计数器进行计数，(Packard Instruments，Meriden，CT)。
该试验的结果示于图6，它显示了在存在和不存在BRK-1和BRK-2下，[125I]-BMP-4与NIH3T3细胞(ATCC CRL 1658)(该细胞显示出与BMP-4的显著内源结合)以及与用t-BRK-3 cDNA转染的COS-7细胞的特异结合情况。t-BRK-3能够在单独表达时结合[125I]-BMP-4(最右侧的柱)，其结合水平类似于单独表达BRK-1和BRK-2时的结合水平。通过共表达t-BRK-3和BRK-1可增加与[125I]-BMP-4的结合，而且幅度高于共表达t-BRK-3和BRK-2的增加程度。
b.共价交联：
用双官能交联剂戊二酸二琥珀酰亚胺(disuccinimidyl glutarate，DSG)(Pierce，Rockford，IL)，通过与两个蛋白质的赖氨酸自由氨基的反应，将放射性配体共价交联至其受体。在交联之后，通过凝胶电泳分离细胞蛋白质，观察到放射性条带。标记条带表示受体选择性地“附着于”放射性标记的配体。在该程序中，如实施例5用BRK-3和/或BRK-1或BRK-2的cDNA转染细胞，然后将细胞接种于12孔培养板上。在转染后48-68小时后，洗涤细胞，平衡，然后如该实施例中全细胞结合研究中所述，与[125I]-BMP-4和竞争性未标记配体一起进行保温。与配体保温4小时后，细胞在4℃用2毫升结合缓冲液(其组成同上，除了不加入BSA)洗涤3次。向每个孔中加入1毫升不含BSA的新鲜结合缓冲液，然后加入新制备的DSG至终浓度为135μM。在轻轻旋荡以混合DSG后，培养板在4℃，于轻摇动下精确地保温15分钟。此时吸去培养基，用3毫升解离缓冲液(10 mM Tris碱，0.25 M蔗糖，1mM EDTA，0.3mM PMSF)或PBS洗涤细胞。再向各孔中加入溶解缓冲液(50微升)，让细胞在4℃振荡溶解30-45分钟。将一份样品(20微升)转至新的微离心管，并加入5微升5X上样缓冲液中(0.25M TrisCl，pH 6.8，10％SDS，0.5M DTT，0.5％溴酚蓝，50％甘油；从Five Prime Three Prime，Boulder，CO购得)。样品煮沸5分钟然后离心(13,0000xg，5分钟)。将上清液上样于7.5％聚丙烯酰胺凝胶(Integrated Separation Systems，Natick，MA)上，进行电泳。凝胶在0.12％考马斯蓝、5％甲醇、7.5％乙酸中染色，在5％甲醇、7.5％乙酸中脱色，然后干燥。可在PHOSPHORIMAGER(Molecular Devices，Sunnyvale，CA；一种用稳定的磷屏定量分析放射性的设备)上观察和计量干凝胶的放射性，或者用“Kodak X-OMAT AR”放射自显影底片(Kodak，Rochester，NY)进行放射自显影。
结果示于图7。当t-BRK-3单独在COS-1细胞中表达时，没有观察到交联条带。BRK-1的单独表达形成了分子量78千道尔顿的交联条带，该分子量对应于预期的BRK-1分子量加上BMP-4单体的分子量。共表达t-BRK-3和BRK-1导致出现大小类似于BRK-1的条带以及新的94千道尔顿交联条带，后者对应于预期的t-BRK-3分子量加上交联的BMP-4单体的分子量。类似地，单独表达BRK-2产生了75千道尔顿的单一交联条带，它对应于预期的BRK-2加上交联的BMP-4单体的分子量。共表达t-BRK-3和BRK-2导致出现对应于单独BRK-2中所见的条带以及新的94千道尔顿交联条带，后者同样对应于预期的t-BRK-3分子量加上交联的BMP-4单体的分子量。因此，仅在有共表达的I型BMP受体的情况下，可观察到[125I]-BMP-4与t-BRK-3的交联。
实施例8
显示与I型BMP受体形成复合物
已表明，TGF-β受体超家族的受体可形成涉及I型和II型受体的复合物(L.Attisano，J.L.Wrana，F.Lopez-Casillas，和J.Massague，生物化学和生物物理学报(Biochimica et Biophysica Acta)，1222：71-80(1994))。为了显示II型BMP受体t-BRK-3可以与I型BMP受体BRK-1和BRK-2形成复合物，如实施例5那样用t-BRK-3和BRK-1，或t-BRK-3和BRK-2的cDNA共转染COS-1细胞。将受体交联于[125I]-BMP-4，然后与对I型受体BRK-1和BRK-2特异的抗体一起进行免疫沉淀。如果对I型受体特异的抗体不仅沉淀出交联于[125I]-BMP-4的I型受体，而且还沉淀出交联于[125I]-BMP-4的BRK-3，那么这表明两种受体形成了复合物，正如对于具有相同配体结合特异性的I型和II型受体所预期的那样。
对I型受体BRK-1和BRK-2特异性的抗体，是将肽LNTRVGTKRYMAPEVLDESLNKNC用作抗原而产生的(B.B.Koenig等人，分子和细胞生物学，14：5961-5974(1994))。该肽基于BRK-1的胞内激酶结构域的氨基酸序列即SEQ ID NO：12氨基酸398-420并在C末端添加了半胱氨酸以便与肽偶联。将BRK-1激酶结构域的氨基酸序列与Raf蛋白质激酶结构域的比较揭示，BRK-1的该区域对应于Raf激酶中用于产生高特异性抗体的区域(W.Kolch，E.Weissinger，H.Mischak，J.Troppmair，S.D.Showalter，P.Lloyd，G.Heidecker，和U.R.Rapp，癌基因(Oncogene)，5：713-720(1990))。用标准方法将该肽偶联于匙孔血蓝蛋白(KLH)，然后免疫新西兰白兔(Hazleton Washington，Vienna，VA)。用抗体捕获ELISA(酶联免疫吸附测定)评估得到的抗血清识别涂在塑料上的原初肽的能力。抗血清被命名为1378、1379和1380。已表明，用该实施例中详细所述的程序，这些抗体可从用BRK-1 cDNA转染的COS-7细胞中免疫沉淀出BRK-1(B.B.Koenig等人，分子和细胞生物学，14：5961-5974(1994))。因为该区域内的BRK-2序列基本上与BRK-1相同，所以这些抗体也可随后测试它们免疫沉淀出BRK-2的能力，而且发现对于该目的是有效的。抗体1379给出了免疫沉淀BRK-1的优异结果，而抗体1380优选用于免疫沉淀BRK-2。
在免疫沉淀程序中，如实施例5用t-BRK-3和/或BRK-1、BRK-2或DAF-4的cDNA转染COS-7或COS-1细胞。然后将细胞接种于100mm培养皿上。它们按实施例7所述的方法与[125I]-BMP-4交联，不同点在于与[125I]-BMP-4和未标记配体的保温是在总体积4毫升而不是500μl中进行，因此所有的其他体积都相应增加。在交联之后，细胞用冰冷的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3次，然后用1毫升RIP缓冲液(20mM TrisCl，pH 8.0，100mM NaCl，1mM Na2EDTA，0.5％Nonidet P-40，0.5％脱氧胆酸钠，10mM碘化钠和1％牛血清白蛋白)进行裂解。裂解物在4℃于13000rpm离心10分钟。将上清液转入新的试管中，用SDS定溶至浓度为0.1％。为了去除存在于裂解物中的抗体，加入50μl “PANSORBIN”(Calbiochem，La Jolla，CA；10％金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的溶液)。在4℃保温30分钟，如上进行离心，再将上清液转至新试管中。
接着将一级抗体1379(当细胞是用t-BRK-3和BRK-1转染时)或1380(当细胞是用t-BRK-3和BRK-2转染时)加入试管中至终稀释度为1∶100，然后在冰上保温2小时或在4℃保温过夜。为了沉淀出抗原：一级抗体复合物，再加入25-50μl“PANSORBIN”，在冰上保温30分钟。复合物在离心机上以13,000rpm离心10分钟，弃出上清液。用含0.1％SDS的RIP缓冲液洗涤沉淀物3次，再用TNEN缓冲液(20mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl，1mM EDTA，0.5％NP-40)洗涤一次。将沉淀物重新悬浮于25μl 1X样品上样缓冲液中。(或者，沉淀用TNEN缓冲液洗涤2次，结果类似。)。样品煮沸5分钟，离心5分钟，然后在上样于7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶后进行电泳。
该试验的结果示于图8，它显示了在存在和不存在BRK-1或BRK-2的情况下，用t-BRK-3感染的COS-1细胞的免疫沉淀结果。正如预期的那样，仅用t-BRK-3转染的、交联于[125I]-BMP-4的并且用抗体1380进行免疫沉淀的细胞没有在免疫沉淀中显示出放射性标记，因为t-BRK-3并不与该抗体交叉反应。用BRK-1转染、交联并且用抗体1379免疫沉淀的细胞显示出78千道尔顿的单一标记条带，这与BRK-1加上交联的BMP-4单体后的预计分子量是一致的。用BRK-1和t-BRK-3共转染的细胞的免疫沉淀产生了仅有BRK-1时所见的条带，以及额外的94千道尔顿的标记条带，它与t-BRK-3加上交联的BMP-4单体后的预计分子量是一致的。(还观察到120千道尔顿处的较淡的条带)。用针对BRK-1的抗体不仅沉淀出BRK-1而且沉淀出t-BRK-3这一事实表明，在BRK-1和t-BRK-3之间形成了复合物。类似地，用BRK-2转染、交且联于[125I]-BMP-4并用抗体1380免疫沉淀的细胞显示出75千道尔顿的单一标记条带，这与BRK-2加上交联的BMP-4单体后的预计分子量是一致的。用BRK-2和t-BRK-3共转染的细胞产生了仅有BRK-2时所见的条带，以及额外的94千道尔顿的强标记条带，它与t-BRK-3加上交联的BMP-4单体后的预计分子量是一致的。(还观察到120千道尔顿处的较淡的条带)。同样，用针对BRK-2的抗体不仅沉淀出BRK-2而且沉淀出t-BRK-3这一事实表明，BRK-1和t-BRK-3形成了复合物。因此，正如对于II型BMP受体所预期的那样，t-BRK-3与两种不同的I型BMP受体形成复合物。
进行第二种免疫沉淀试验，以测试t-BRK-3受体复合物对BMP-2、BMP-4和TGF-β1的配体特异性。还测试了称为“部分去除的”BMP-2(DR-BMP-2)的BMP-2衍生物；DR-BMP-2是通过适度的胰蛋白酶消化BMP-2以去除氨基端而制备的，它对完整的细胞显示出显著降低的非特异性结合(B.B.Koenig等人，分子和细胞生物学，14：5961-5974(1994))。
如实施例5用BRK-2和t-BRK-3的cDNA转染COS-1细胞，与[125I]-BMP-4交联，然后如该实施例中所述的那样与抗体1380进行免疫沉淀，不同点在于在保温过程中，与[125I]-BMP-4同时加入过量的非标记配体(10nM BMP-4，10nMBMP-2，10nM DR-BMP-2或50nM TGF-β1)。结果示于图9。当不存在竞争性的非标记配体时，观察到75千道尔顿和94千道尔顿的两条标记条带，这分别与交联的BRK-2和BRK-3相对应，如图8中所见。但是，当存在过量的非标记BMP-4、BMP-2或DR-BMP-2时，这些条带都完全消失，这表明这些配体有效地与[125I]-BMP-4竞争与复合物的结合，而且所有这些配体都显示出与BRK-2和BRK-3受体复合物的特异结合。然而，存在50nM TGF-β1对标记的条带无影响，这表明TGF-β1不结合与[125I]-BMP-4所结合的相同位点。这表明，BRK-2/t-BRK-3复合物特异性地结合BMP-2和BMP-4，但是不特异性地结合TGF-β。
实施例9
鼠BRK-3的分离
为了分离全长的鼠同源物BRK-3，用NIH3T3鼠胚成纤维细胞(ATCC CRL1658)构建cDNA库。用总RNA分离试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)从细胞中分离出总RNA(1.26毫克)。用mRNA分离试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)从该总RNA(1毫克)中分离出信使RNA(81微克)。按制造商的说明，使用用于cDNA合成和质粒克隆的SUPER SCRIPT质粒系统(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，用一份mRNA(4微克)制备cDNA文库。得到的文库含有约4.9×105原始菌落，它被分成98个库，每个库含有5000个菌落。
用Southern印迹法完成对文库的最初筛选。用QIAGEN柱(Qiagen，Chatsworth，CA)从98个库的每个库中纯化出质粒。用Mlu I消化来自每个库的DNA(约5微克)以释放出cDNA插入片段，然后在1％琼脂糖凝胶上电泳。凝胶在0.6M氯化钠，0.4N NaOH中变性30分钟，然后在1.5M氯化钠，0.5M Tris，pH 7.5中和30分钟。再使用10×SSC作为转移缓冲液(1×SSC＝0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)，将DNA过夜转至于HYBOND尼龙膜(Amersham，ArlingtonHeights，IL)。
用EcoRV和Afl III切割人t-BRK-3，得到1.5kb片段。使用PRIME-IT II随机引物标记试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA；一种随机引物标记DNA的试剂盒，它含有Klenow DNA聚合酶、引物和缓冲液)，将该片段用比活度为3000Ci/mmol的α[32P]-dCTP(NEN Research Products，Boston，MA)进行随机标记。让标记的探针与Southern印迹在5xSSPE(1xSSPE＝0.14M NaCl，8 mM磷酸钠，0.8mMEDTA，pH7.7)、1xDenhardt’s溶液和100μg/ml变性的鲑鱼睾丸DNA、50％去离子甲酰胺中，于42℃杂交18小时。然后，印迹用0.25xSSPE和0.5％十二烷基磺酸钠(SDS)洗涤，其中在42℃洗涤15分钟二次，然后在65℃洗涤20分钟二次。接着让印迹于-80℃在KODAK X-OMAT AR胶片上曝光18小时。通过存在约2.5kb的标记条带而加以判断，胶片显影后显示出5个阳性库。
对于第二次筛选，用来自5个阳性库的大肠杆菌原种在平板上进行划线培养(5000菌落/平板)。将HYBOND尼龙膜置于平板的上方，从而使随机菌落可以转至滤膜。然后让菌落在37℃恢复2-3小时。将滤膜在10％SDS中浸泡3分钟，然后转至1.5M氯化钠，0.5M氢氧化钠中5分钟，在1.5M氯化钠，1.5M Tris，pH 7.5中和5分钟，然后在2×SSC中洗涤。为了去除蛋白质，将印迹在0.1M Tris，pH7.6，10mM EDTA，0.15M NaCl，0.02％SDS中用50微克/毫升蛋白酶K(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)于55℃摇动处理1小时。完全按上述对第一次筛选所述的那样，对人BRK-3片段(EcoRV-Afl III)进行标记，然后印迹杂交，洗涤，再进行放射自显影。
对应于放射自显影上标记斑点的菌落，在平板上进行划线培养以便第三次筛选。第三次筛选完全按上述第二次筛选那样进行。分离出4个阳性克隆。一个克隆pSPORT1/N89-5被发现具有最长的插入片段，即2.9kb。
用TAQ DYE DEOXY Terminator Cycle测序试剂盒和Applied Biosystems373A型自动DNA测序仪对4个阳性克隆的插入片段进行测序。对4个序列的比较揭示，4个中的3个在3＇端是相同的，而且在5＇端所有4个序列都可与人BRK-3的编码区域进行排列。最长的克隆pSPORT1/N89-5可与人BRK-3序列从编码区域开始起排列约600对。
为了得到更多的序列信息，用EcoR I和Sca I消化来自pSPORT1/N89-5的插入片段，将得到的1.4kb片段亚克隆入BLUESCRIPT II SK(-)的EcoRI和Hinc II位点。还用EcoR I和EcoRV消化pSPORT1/N89-5，将得到的2.1kb插入片段亚克隆入相同载体的位点。最后，用Sca I和Not I消化质粒，然后亚克隆入相同的Hinc II和Not I位点。对这3个构建物的测序，得到来自pSPORT1/N89-5的插入片段的完整序列。
使用用于快速扩增cDNA末端的5＇RACE系统(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，克隆在编码区域5＇端缺失的600碱基对。设计一个对应于pSPORT1/N89-5已知序列的反义引物，其序列为5＇CTG TGT GAA GAT AAGCCA GTC3＇(SEQ ID NO：7中核苷酸968-948的反向互补序列)。在从1微克NIH3T3 mRNA中合成了第一条链之后，按制造商的说明，用末端脱氧核苷酸转移酶将polyC尾加于新合成的cDNA。用上述引物和试剂盒中提供的锚定引物(Anchor Primer，其序列为(CUA)4 GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IgGGII GGG G3＇，其中I＝肌苷而U＝尿嘧啶)一起扩增BRK-3 cDNA的5＇端。用GENE-AMP PCR试剂盒和AMPLITAQ DNA聚合酶进行PCR。最初的解链期是95℃5分钟，随后是35个下列程序的循环：95℃解链1分钟，55℃退火1分钟和72℃延伸2分钟。在最后一个循环之后，反应在72℃保温5分钟以完成延伸。为了降低非特异引物结合的背景，用嵌套引物5＇CAA GAG CTT ACC CAATCA CTT G3’(该引物也来自pSPORT1/N89-5插入片段的已知序列)(SEQ ID NO：7中核苷酸921-900的反向互补序列)和第一轮PCR中所用的相同5＇锚定引物一起进行第二轮PCR。
将大小范围为600-1000bp的第二轮PCR反应的扩增产物，用Ecl XI和Sal I消化，然后克隆入BLUESCRIPT II SK(-)的Ecl XI和Sal I位点。再测序，得到另外的600bp序列，它可与人t-BRK-3编码区域相排列。3个不同的克隆，即R6-8BRK-2、R6-11-1和R6-11-2的测序结果相同。
为了装配全长的鼠BRK-3克隆，先如下将SalI位点置于克隆R6-11-1的5＇端。合成一个引物，它含有SalI位点且随后为R-11-1序列的核苷酸1-20；该引物的序列是5＇CAC ACG CGT CGA CCA TGA CTT CCT CGC TGC ATC G3＇。它与M13反向引物5＇AAC AGC TAT GAC CAT G3＇一起使用，以便扩增出DNA片段，其中使用来自克隆R6-11-1的质粒DNA作为模板。用GENE-AMP PCR试剂盒和AMPLITAQ DNA聚合酶进行PCR。最初的解链期是95℃5分钟，随后是35个下列程序的循环：95℃解链1分钟，55℃退火1分钟和72℃延伸2分钟。在最后一个循环之后，反应在72℃保温5分钟以完成延伸。接着，从R6-11-1扩增出的片段和来自pSPORT1/N89-5(230ng)的插入片段一起，被如下亚克隆入BLUESCRIPT II SK(-)中。用Sal I和Ecl XI消化从R6-11-1扩增出的片段。用Ecl XI和Pst I消化来自pSPORT1/N89-5的插入片段。用Sal I和Pst I消化载体BLUESCRIPT II SK(-)。用T4 DNA连接酶将这3种片段3段式地连接起来(3小时，25℃)，然后按制造商的说明，用BIO-RAD Gene PULSER(BIO-RAD，Hercules，CA)转化电感受态(electrocompetent)大肠杆菌株DH5-a。选择出阳性菌落，称为pBLUESCRIPt-mBRK-3。对用PCR扩增出的插入片段5＇部分的测序表明，其序列与克隆R6-11-1的相同，这表明在扩增中没有引入突变。
对于在哺乳动物中表达，将m-BRK-3亚克隆入哺乳动物表达载体pJT6中。该载体是实施例4中所述的pJT3的衍生物，其中多克隆位点5＇端的Not I位点被去除并在多克隆位点的Pst I和Bam HI限制性位点之间插入间隔片段。为了完成亚克隆，用Not I和Sal I将m-BRK-3从pBLUESCRIPt-mBRK-3中切下，然后亚克隆入Not I和Sal I位点以产生pJT6-mBRK-3。
然而，对pJT6-mBRK-3的3＇端和pSPORT1/N89-5中最初的cDNA的重新测序揭示在3＇端有阅读框的改变，并且表明终止密码子确实在Pst I位点的3＇。这样，pJT6-mBRK-3不含有终止密码子。所以如下制备2个新的构建物。
首先，用Spe I(位点在SEQ ID NO：7中2306位)和Not I(在pJT6中的多克隆位点)消化pJT6-mBRK-3，去除插入片段的3＇端。同样用Spe I和Not I消化在筛选NIH-3T3文库中分离出的最长的克隆pSPORT1/N89-5。将从pSPORT1/N89-5中释放出的1.2kb片段亚克隆入用Spe I/Not I消化过的pJT6-mBRK-3，重新产生2个位点。该构建物被称为pJT6-mBRK-3L，它含有pSPORT1/N89-5克隆的完整的3＇端。该构建物的图示于图10。
克隆的3＇端在终止密码子3＇侧的不翻译区域中含有430个核苷酸。该区域的A-T非常丰富，这可能导致表达水平低。为了去除该区域，制备第二个构建物。用Hind III(位点在SEQ ID NO：7中核苷酸3 168，在终止密码子3＇侧的21个碱基处)消化pSPORT1/N89-5质粒。用DNA聚合酶的Klenow片段(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)处理线性化的质粒以填平突出端，然后用Spe I切割以释放出插入片段3＇端的863bp片段。同时，用Not I消化pJT6-mBRK-3。用Klenow片段处理线性化的质粒，然后用Spe I切割以释放出插入片段的3＇端。然后将用Not I/Spe I消化过的pJT6-mBRK-3连于由Hind III/Spe I从pSPORT1/N89-5中释放出的片段；产生了SpeI位点，破坏了Hind III和Not I位点。形成的构建物被称为pJT6-mBRK3S，示于图11。
构建物pJT6-mBRK-3S还直接从m-BRK-3的部分cDNA克隆pSPORT1/N89-5和含有cDNA 5＇端的构建物克隆R6-11-1进行构建。这是这样完成的：通过用Sal I和Ecl XI消化克隆R6-11-1，用Ecl XI和Hind III消化pSPORT1/N89-5，以及用Sal I和Hind III消化BLUESCRIPT II SK(-)。这些片段再进行3段式连接以便在BLUESCRIPT II载体中产生全长的m-BRK-3 cDNA。再用Sal I和Not I将全长的cDNA从该构建物中切下，亚克隆入pJT6载体的Sal I和Not I位点。形成的质粒与上面例子中所述的pJT6-mBRK3S具有明确相同的cDNA。然而，它携带额外的位于cDNA 3＇端的载体序列，即位于BLUESCRIPT II SK(-)多克隆位点中Hind III和Not I位点之间的区域。
实施例10
鼠BRK-3的序列分析
来自pJT6-mBRK-3L的全长鼠BRK-3插入片段的DNA序列示于SEQ IDNO：7，而推导出的蛋白质序列示于SEQ ID NO：8。推导出的鼠BRK-3氨基酸序列，在GenBank版本84.0(1994年8月15日)中，用标准Needleman-Wunsch算法(S.B.Needlman和C.D.Wunsch，分子生物学杂志，48：443-453(1970))相对所有翻译的蛋白质序列进行检索。发现它是一种独特的序列。它编码1038个氨基酸的蛋白质。将鼠BRK-3与截短的人受体在t-BRK-3编码的区域(SEQ ID NO：4中氨基酸1-582；SEQ ID NO：8中氨基酸1-582)上进行比较，发现2种受体的序列有98％相同。与t-BRK-3相同，m-BRK-3含有预期的跨膜区域，包括氨基酸151-172。如t-BRK-3，胞内结构域含有所有的共有序列，这些共有序列对丝氨酸/苏氨酸残基有预计特异性的蛋白激酶结构域的特征(S.K.Hanks，A.M.Quinn，和T.Hunter，科学，241：42-52(1988))。该激酶结构域后是极长的羧基端(534个氨基酸)。事实上，因为存在这个羧基端，所以BRK-3中的胞内结构域(866个氨基酸)比TGF-β受体家族中任何其他受体的胞内结构域都长得多。它几乎是在本发明之前已知在TGF-β家族中具有最长胞内结构域的DAF-4胞内结构域(490个氨基酸)的2倍长。
实施例11
[125I]-BMP-4与m-BRK-3结合的显示
为了显示[125I]BMP-4特异性地结合于m-BRK-3，如实施例5中所述，用构建物pJT6-mBRK-3S和pJT6-mBRK-3L转染COS-1细胞。此外，还通过构建物pJT3-BRK-2用BRK-2I型受体的cDNA共转染细胞，以确定I型BMP受体的存在是否影响与[125I]-BMP-4的结合。还如实施例7那样进行与[125I]-BMP-4的全细胞结合。
结果示于图12，它显示了化为细胞数目的[125I]-BMP-4特异性结合情况。当单独用鼠BRK-3转染细胞(使用两种测试构建物中的任一种)时，[125I]-BMP-4的特异性结合都增加至用模拟物转染细胞中所见水平的4-7倍。单独用BRK-2转染显示，结合水平增加至与单独用鼠BRK-3时所见的类似水平。当用BRK-2和鼠BRK-3共转染细胞时，结合进一步增加至用模拟物转染细胞的9-11倍，这与用BRK-2和t-BRK-3所获得的结果是一致的(上面实施例7中的图6)。
作为另外显示m-BRK-3与[125I]-BMP-4结合，进行交联试验。如实施例5那样，用m-BRK-3cDNA(用构建物pJT6-mBRK-3S)和/或用BRK-1(用pJT4-J159F)或BRK-2(用pJT3-BRK-2)的cDNA转染COS-1细胞。如实施例7那样，将转染细胞与[125I]-BMP-4一起保温并交联，不同之处是将辛二酸二琥珀酰亚胺(disuccinimidyl suberate，DSS)替换戊二酸二琥珀酰亚胺用作交联剂。该试验的结果示于图13。仅用m-BRK-3转染的细胞不显示交联条带，这与用t-BRK-3获得的结果相同(图7)。仅用BRK-1 cDNA转染的细胞显示出表观分子量81千道尔顿的唯一迁移条带，该分子量对应于预期的BRK-1分子量加上交联的BMP-4单体后的分子量。用BRK-1和m-BRK-3 cDNA转染的细胞显示出3条条带，其中一条与仅用BRK-1时所见的条带一致(81千道尔顿)。另外的条带以表观分子量159kD和128kD进行迁移。其中分子量较大的条带与预期的m-BRK-3表观分子量加上交联的BMP-4单体后的分子量一致。注意，与仅用BRK-1时所见的结果相比，用BRK-1鉴别出的交联条带的密度大大增加。
类似地，仅用BRK-2 cDNA转染细胞产生了以表观分子量78千道尔顿迁移的交联条带，它对应于预期的BRK-2加上交联的BMP-4单体后的分子量。在用BRK-2和m-BRK-3 cDNA转染的细胞中，观察到用BRK-2所鉴别出的78千道尔顿条带类型，以及159kD和128kD的交联条带，它们与用BRK-1和m-BRK-3的cDNA转染细胞中所见的高分子量条带共迁移。与BRK-1的情况相同，与仅用BRK-2时所见的结果相比，用BRK-2鉴别出的交联条带的密度大大增加。最后，在仅用载体转染的细胞中没有观察到标记条带。
进行免疫沉淀试验以显示m-BRK-3与I型BMP受体形成复合物的能力。如实施例5那样，用m-BRK-3的cDNA(通过构建物pJt-mBRK-3S)和/或用BRK-1的cDNA(通过pJT4-J159F)或BRK-2的cDNA(通过pJT3-BRK-2)转染COS-1细胞。如实施例8所述，将转染的细胞与[125I]-BMP-4一起温育，交联，然后与针对适当的I型受体的抗体或免疫前血清进行免疫沉淀，不同点在于作为交联剂使用的是DSS而不是戊二酸二琥珀酰亚胺。该试验的结果示于图14。在仅用BRK-1cDNA转染的细胞中，针对BRK-1的抗体沉淀出一条条带，其以表观分子量81kD迁移。在用BRK-1和m-BRK-3的cDNA转染的细胞中，针对BRK-1的抗体沉淀出81kD条带，其密度现在更大。此外，还观察到以表观分子量159kD迁移的条带，这与预计的m-BRK-3加上交联的BMP-4单体后的分子量相一致。类似地，在仅用BRK-2 cDNA转染的细胞中，针对BRK-2的抗体沉淀出一条以表观分子量78kD迁移的条带。在用BRK-2和m-BRK-3的cDNA转染并用针对BRK-2的抗体进行沉淀的细胞中，再次观察到用BRK-2所鉴别的条带，其密度更大。此外，还观察到159kD的标记条带，这与m-BRK-3相一致并且与用BRK-1和m-BRK-3的cDNA转染的细胞中所见的高分子量条带一起共迁移。在用BRK-2和m-BRK-3的cDNA转染的细胞中，还观察到额外的94kD的标记条带。作为对照，用BRK-1和m-BRK-3，或用BRK-2和m-BRK-3的cDNA转染细胞，然后用免疫前血清进行免疫沉淀(最左侧和最右侧的泳道)；没有观察到标记条带。
这些试验表明，当m-BRK-3与I型BMP受体BRK-1或BRK-2共表达时，可沉淀出I型受体的抗体也可沉淀出m-BRK-3。因此，正如对哺乳动物II型BMP受体所预期的那样，m-BRK-3可与这些哺乳动物的I型BMP受体中的任何一种形成复合物。这与在实施例8中所述的、用t-BRK-3所获得的结果是一致的。
实施例12
分离全长的人BRK-3 cDNA
因为实施例2中所述的克隆HSK723不含有框架内的终止密码子，所以需要获得位于该cDNA 3＇端的其他序列。因此，完全按实施例2中所述的标记和筛选条件，用HSK 7-2 PCR片段再次筛选实施例1中制备的人包皮成纤维细胞文库。这导致分离出更长的克隆，它被称为pHSK1030，含有亚克隆在BLUESCRIPT SK(-)中的额外人BRK-3序列(总计3355碱基对)。对pHSK1030的插入片段进行测序，揭示了982个氨基酸构成的编码区域，但是该插入片段仍然没有框架内的终止密码子。
编码区域的剩余部分用如下方法通过PCR而克隆。从克隆pHSK1030的正链衍生得到2个正向引物。这些引物的序列如下：引物RPK3-1，5＇CCT GTC ACATAA TAG GCG TGT GCC 3＇(与SEQ ID NO：1中核苷酸1998-2021相同)；引物RPK3-2，5＇CGC GGA TCC ATC ATA CTG ACA GCA TCG 3＇(它含有BamH I位点，随后是SEQ ID NO：1中核苷酸2078-2095)。另外两个引物来自λgt10。这些引物是：G10F1，5＇GCT GGG TAG TCC CCA CCT TT 3＇和G10F2，5＇GAGCAA GTT CAGT CCT GGT 3＇。
将实施例1中制备的人成纤维细胞cDNA文库用作PCR模板。将文库(0.3微克)与总计50微升的RPK3-1和G10F1引物(各1μM)、Tth聚合酶(1.2单位)、全部4种脱氧核苷酸(各200μM)、Tth聚合酶缓冲液和水进行温育。PCR循环条件是：94℃解链2分钟，随后是20个如下的循环：94℃解链1.5分钟；52℃退火2分钟和72℃延伸3分钟。在20个循环之后，反应在72℃再保温8分钟以确保完全延伸。
为了增加特异性和减少背景，进行第二轮嵌套式PCR。保温混合物与该实施例中用于第一轮所述的相同，不同点在于：(1)将从第一轮PCR反应产物(0.5微升)用作模板；和(2)使用RPK3-2和G10F2引物以替代RPK3-1和G10F1。PCR反应的条件与该实施例第一轮PCR中所述的条件相同。
第二轮PCR导致扩增出1.6kb片段，它通过QIAEX从琼脂糖凝胶中分离出。用EcoRI和BamHI消化该片段，然后亚克隆入BLUESCRIPT SK(-)的EcoRI和BamHI位点。对形成的构建物pHSK723-3U进行测序，发现它编码带有框架内终止密码子的、BRK-3剩余编码区域。
为了装配全长的人BRK-3，将来自pHSK1030和pHSK723-3U的插入片段在载体BLUESCRIPT II SK(-)中，于唯一的Stu I位点(SEQ ID NO：1中核苷酸3219处)处连接起来。这样产生了完整的构建物pHSK1040，它含有人BRK-3的完整编码序列。pHSK1040示于图15。人BRK-3的DNA序列示于SEQ ID NO：1，而推导出的人BRK-3氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。
将人BRK-3的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)与m-BRK-3的氨基酸序列(SEQ IDNO：8)进行比较，发现96.7％相同。
实施例13
在配体结合分析中使用BRK-3以鉴别BMP受体促效剂和拮抗剂
通过使用设计用于测量配体与BRK-3相互作用的测试可以鉴别出与BRK-3相互作用的配体。一种适合处理大量样品的受体结合测试的例子是如下进行的。
如上面实施例11所述，通过pJT6-mBRK-3L，用m-BRK-3的cDNA转染COS-1细胞，不同点是细胞在12孔的培养皿中生长。在转染后48-68小时后，用1.0毫升结合缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，128mM NaCl，5mM KCl，5mM MgSO4，1.2mM CaCl2，2mg/ml BSA)洗涤细胞一次，然后在相同缓冲液于4℃在轻摇动中平衡60分钟。平衡后，吸去缓冲液，然后在存在或不存在各种浓度的未标记测试化合物(即假定的配体)下，向每个孔中加入500μl结合缓冲液(4℃)，它含有[125I]-BMP-4示踪物(100-400pM)，并在4℃轻轻摇动4小时。为了确定非特异结合和从BMP受体复合物中完全置换，加入BMP-2至终浓度为10nM。为了防止配体降解，还加入蛋白酶抑制剂混合物至终浓度为10μg/ml的亮抑酶肽(1eupeptin)、10μg/ml抗蛋白酶(antipain)、50μg/ml抑蛋白酶肽(aprotinin)、100μg/ml苯甲脒、100μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、10μg/ml苯丁抑制素(bestatin)、10μg/ml胃酶抑制剂和300μM PMSF。保温期结束之后，吸去缓冲液，用1毫升洗涤缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，128mM NaCl，5mM KCl，5mMMgSO4，1.2mM CaCl2，0.5mg/ml BSA)漂洗细胞4次。在吸去最后一次的漂洗液后，向每个孔中加入200μl溶解缓冲液(10mM TrisCl，pH 7.4，1mM EDTA，1％(v/v)Triton X-100)并在室温下保温15-30分钟。溶解的细胞再转至新试管，用Packard Model 5005 COBRA伽马计数器(Packard Instruments，Meriden，CT)进行计数。
观察到，可与m-BRK-3受体相互作用的测试化合物会在表达m-BRK-3的细胞中和[125I]-BMP-4示踪物竞争与受体的结合，从而与不存在新化合物的情况下与示踪物进行温育时所获得的结合相比，在存在测试化合物时更少的[125I]-BMP-4示踪物发生结合。在最高浓度的所研究测试化合物下，[125I]-BMP-4示踪物的结合下降≥30％则表示该测试化合物与m-BRK-3结合。
根据该实施例的方法，使用本发明的其他有关BRK-3蛋白受体激酶时，获得了类似的结果。
实施例14
在配体结合分析中使用m-BRK-3和BRK-2以鉴别BMP受体促效剂和拮抗剂
鉴别出与I型BMP受体复合的BRK-3相互作用的配体，可通过使用设计用于测量配体与该BMP受体复合物相互作用的测试方法而实现。一种采用m-BRK-3/BRK-2复合物并适合处理大量样品的受体结合测试的例子是如下进行的。
如上面实施例11所述，通过pJT6-mBRK-3L用m-BRK-3的cDNA和通过构建物pJT3-BRK-2用BRK-2的cDNA转染COS-1细胞，不同点是细胞在12孔的培养皿中生长。用于转染细胞的DNA化合物含有2微克/毫升pJT3-BRK-2和4微克/毫升Pjt6-mBRK-3L。在转染后48-68小时后，用1毫升结合缓冲液(50mMHEPES，pH 7.4，128mM NaCl，5mM KCl，5mM MgSO4，1.2mM CaCl2，2mg/mlBSA)洗涤细胞一次，然后在相同缓冲液于4℃在轻摇动中而平衡60分钟。平衡后，吸去缓冲液，然后在存在或不存在各种浓度的未标记测试化合物(即假定的配体)下，向每个孔中加入500μl结合缓冲液(4℃)，它含有[125I]-BMP-4示踪物(100-400pM)，并在4℃轻轻摇动4小时。为了确定非特异结合和从BMP受体复合物中完全置换，加入BMP-2至终浓度为10nM。为了防止配体降解，还加入蛋白酶抑制剂混合物至终浓度为10μg/ml的亮抑酶肽、10μg/ml抗蛋白酶、50μg/ml抑蛋白酶肽、100μg/ml苯甲脒、100μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、10μg/ml苯丁抑制素、10μg/ml胃酶抑制剂和300μM PMSF。保温期结束之后，吸去缓冲液，用1毫升洗涤缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，128mM NaCl，5mM KCl，5mMMgSO4，1.2mM CaCl2，0.5mg/ml BSA)漂洗细胞4次。在吸去最后一次的漂洗液后，向每个孔中加入200μl溶解缓冲液(10mM TrisCl，pH 7.4，1mM EDTA，1％(v/v)Triton X-100)并在室温下保温15-30分钟。溶解的细胞再转至新试管，用Packard Model 5005 COBRA伽马计数器(Packard Instruments，Meriden，CT)进行计数。
观察到，可与m-BRK-3/BRK-2受体复合物相互作用的测试化合物会在和[125I]-BMP-4示踪物竞争与受体复合物的结合，从而与不存在新化合物的情况下与示踪物进行温育时所获得的结合相比，在存在测试化合物时更少的[125I]-BMP-4示踪物发生结合。在最高浓度的所研究测试化合物下，[125I]-BMP-4示踪物的结合下降≥30％则表示该测试化合物与m-BRK-3/BRK-2受体复合物结合。
当本发明的其他BRK-3蛋白受体激酶或其同源物与BRK-2或其他BMP I型受体一起使用时，获得了类似的结果。
BRK-3、t-BRK-3和m-BRK-3的保藏
用pJT4-J159F(亚克隆入表达载体pJT4的SEQ ID NO：11)转化的大肠杆菌于1993年10月7日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。ATCC保藏号为NO：69457。
用pJT4-hBRK3T(亚克隆入表达载体pJT4的SEQ ID NO：3)转化的大肠杆菌于1994年8月16日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。ATCC保藏号为NO：69676。
用pJT6-mBRK-3S(亚克隆入表达载体pJT6的SEQ ID NO：7)转化的大肠杆菌于1994年9月28日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。ATCC保藏号为NO：69694。
用pJT6-mBRK-3L(亚克隆入表达载体pJT6的SEQ ID NO：7)转化的大肠杆菌于1994年9月28日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。ATCC保藏号为NO：69695。
用pHSK1040(亚克隆入表达载体BLUESCRIPT II SK(-)的SEQ ID NO：1)转化的大肠杆菌于1994年10月12日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。ATCC保藏号为NO：69703。
正如本领域所知晓的那样，在DNA和氨基酸测序方法中偶尔会有差错。因此，保藏材料所编码的序列在此结合作为参考，用于在本发明的书面描述中的任何序列存在差错时核对之用。还应注意，本领域中重复本申请人书面公开的工作的一般熟练技术人员，使用常规技术时可能会发现测序差错。保藏ATCC NO：69457、ATCC NO：69676、ATCC NO：69694、ATCC NO：69695和ATCC NO：69703并不意味着承认所保藏的材料是实施本发明所必需的。
所有上述提及的出版物在此全部引用作为参考。
应理解，此处描述的例子和实施例仅用于阐述目的，因此本领域的熟练技术人员会想到各种改变和变动形式，这些形式也在本发明和所附权利要求书的精神和范围之内。
                          序列表(1)一般信息：(i)申请人：Rosenbaum，Jan S.
         Nohno，Tsutomu(ii)发明名称：编码BMP II型受体的cDNA(iii)序列数目：14(iv)通信地址：
(A)地址：The Procter & Gamble Company
(B)街道：11810 East Miami River Road
(C)城市：Ross
(D)州：Ohio
(E)国家：U.S.A.
(F)邮编：45061(v)计算机可读形式：
(A)记录介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容型
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)本申请数据：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类：(viii)律师/代理人信息：
(A)姓名：Roof，Carl J.
(B)登记号：37,708
(C)卷宗/档案号：5473(ix)通讯信息：
(A)电话：513-627-0081
(B)传真：513-627-0260(2)SEQ ID NO.：1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：3601碱基对
(B)类型：核酸
(C)股性：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/分类符号：CDS
(B)位置：409..3525(xi)序列描述：SEQ ID NO.：1：CGCCCCCCGA CCCCGGATCG AATCCCCGCC CTCCGCACCC TGGATATGTT TTCTCCCAGA    60CCTGGATATT TTTTTGATAT CGTGAAACTA CGAGGGAAAT AATTTGGGGG ATTTCTTCTT    120GGCTCCCTGC TTTCCCCACA GACATGCCTT CCGTTTGGAG GGCCGCGGCA CCCCGTCCGA    180GGCGAAGGAA CCCCCCCAGC CGCGAGGGAG AGAAATGAAG GGAATTTCTG CAGCGGCATG    240AAAGCTCTGC AGCTAGGTCC TCTCATCAGC CATTTGTCCT TTCAAACTGT ATTGTGATAC    300GGGCAGGATC AGTCCACGGG AGAGAAGACG AGCCTCCCGG CTGTTTCTCC GCCGGTCTAC    360TTCCCATATT TCTTTTCTTT GCCCTCCTGA TTCTTGGCTG GCCCAGGG ATG ACT TCC     417
                                                 Met Thr Ser
                                                 1TCG CTG CAG CGG CCC TGG CGG GTG CCC TGG CTA CCA TGG ACC ATC CTG      465Ser Leu Gln Arg Pro Trp Arg Val Pro Trp Leu Pro Trp Thr Ile Leu
  5                  10                  15CTG GTC AGC ACT GCG GCT GCT TCG CAG AAT CAA GAA CGG CTA TGT GCG      513Leu Val Ser Thr Ala Ala Ala Ser Gln Asn Gln Glu Arg Leu Cys Ala20                  25                  30                  35TTT AAA GAT CCG TAT CAG CAA GAC CTT GGG ATA GGT GAG AGT AGA ATC      561Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp Leu Gly Ile Gly Glu Ser Arg Ile
             40                  45                  50TCT CAT GAA AAT GGG ACA ATA TTA TGC TCG AAA GGT AGC ACC TGC TAT      609Ser His Glu Asn Gly Thr Ile Leu Cys Ser Lys Gly Ser Thr Cys Tyr
         55                  60                  65GGC CTT TGG GAG AAA TCA AAA GGG GAC ATA AAT CTT GTA AAA CAA GGA      657Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly Asp Ile Asn Leu Val Lys Gln Gly
     70                  75                  80TGT TGG TCT CAC ATT GGA GAT CCC CAA GAG TGT CAC TAT GAA GAA TGT      705Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro Gln Glu Cys His Tyr Glu Glu Cys
 85                  90                  95GTA GTA ACT ACC ACT CCT CCC TCA ATT CAG AAT GGA ACA TAC CGT TTC      753Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser Ile Gln Asn Gly Thr Tyr Arg Phe100                 105                 110                 115TGC TGT TGT AGC ACA GAT TTA TGT AAT GTC AAC TTT ACT GAG AAT TTT      801Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys Asn Val Asn Phe Thr Glu Asn Phe.
            120                 125                 130CCA CCT CCT GAC ACA ACA CCA CTC AGT CCA CCT CAT TCA TTT AAC CGA      849Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu Ser Pro Pro His Ser Phe Asn Arg
        135                 140                 145GAT GAG ACA ATA ATC ATT GCT TTG GCA TCA GTC TCT GTA TTA GCT GTT      897Asp Glu Thr Ile Ile Ile Ala Leu Ala Ser Val Ser Val Leu Ala Val
    150                 155                 160TTG ATA GTT GCC TTA TGC TTT GGA TAC AGA ATG TTG ACA GGA GAC CGT      945Leu Ile Val Ala Leu Cys Phe Gly Tyr Arg Met Leu Thr Gly Asp Arg
165                 170                 175AAA CAA GGT CTT CAC AGT ATG AAC ATG ATG GAG GCA GCA GCA TCC GAA      993Lys Gln Gly Leu His Ser Met Asn Met Met Glu Ala Ala Ala Ser Glu180                 185                 190                 195CCC TCT CTT GAT CTA GAT AAT CTG AAA CTG TTG GAG CTG ATT GGC CGA      1041Pro Ser Leu Asp Leu Asp Asn Leu Lys Leu Leu Glu Leu Ile Gly Arg
            200                 205                 210GGT CGA TAT GGA GCA GTA TAT AAA GGC TCC TTG GAT GAG CGT CCA GTT      1089Gly Arg Tyr Gly Ala Val Tyr Lys Gly Ser Leu Asp Glu Arg Pro Val
        215                 220                 225GCT GTA AAA GTG TTT TCC TTT GCA AAC CGT CAG AAT TTT ATC AAC GAA      1137Ala Val Lys Val Phe Ser Phe Ala Asn Arg Gln Asn Phe Ile Asn Glu
    230                 235                 240AAG AAC ATT TAC AGA GTG CCT TTG ATG GAA CAT GAC AAC ATT GCC CGC      1185Lys Asn Ile Tyr Arg Val Pro Leu Met Glu His Asp Asn Ile Ala Arg
245                 250                 255TTT ATA GTT GGA GAT GAG AGA GTC ACT GCA GAT GGA CGC ATG GAA TAT      1233Phe Ile Val Gly Asp Glu Arg Val Thr Ala Asp Gly Arg Met Glu Tyr260                 265                 270                 275TTG CTT GTG ATG GAG TAC TAT CCC AAT GGA TCT TTA TGC AAG TAT TTA      1281Leu Leu Val Met Glu Tyr Tyr Pro Asn Gly Ser Leu Cys Lys Tyr Leu
            280                 285                 290AGT CTC CAC ACA AGT GAC TGG GTA AGC TCT TGC CGT CTT GCT CAT TCT      1329Ser Leu His Thr Ser Asp Trp Val Ser Ser Cys Arg Leu Ala His Ser
        295                 300                 305GTT ACT AGA GGA CTG GCT TAT CTT CAC ACA GAA TTA CCA CGA GGA GAT      1377Val Thr Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Thr Glu Leu Pro Arg Gly Asp
    310                 315                 320CAT TAT AAA CCT GCA ATT TCC CAT CGA GAT TTA AAC AGC AGA AAT GTC      1425His Tyr Lys Pro Ala Ile Ser His Arg Asp Leu Ash Ser Arg Asn Val
325                 330                 335CTA GTG AAA AAT GAT GGA ACC TGT GTT ATT AGT GAC TTT GGA CTG TCC      1473Leu Val Lys Asn Asp Gly Thr Cys Val Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser340                 345                 350                 355ATG AGG CTG ACT GGA AAT AGA CTG GTG CGC CCA GGG GAG GAA GAT AAT      1521Met Arg Leu Thr Gly Asn Arg Leu Val Arg Pro Gly Glu Glu Asp Asn
            360                 365                 370GCA GCC ATA AGC GAG GTT GGC ACT ATC AGA TAT ATG GCA CCA GAA GTG      1569Ala Ala Ile Ser Glu Val Gly Thr Ile Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val
        375                 380                 385CTA GAA GGA GCT GTG AAC TTG AGG GAC TGT GAA TCA GCT TTG AAA CAA      1617Leu Glu Gly Ala Val Asn Leu Arg Asp Cys Glu Ser Ala Leu Lys Gln
    390                 395                 400GTA GAC ATG TAT GCT CTT GGA CTA ATC TAT TGG GAG ATA TTT ATG AGA      1665Val Asp Met Tyr Ala Leu Gly Leu Ile Tyr Trp Glu Ile Phe Met Arg
405                 410                 415TGT ACA GAC CTC TTC CCA GGG GAA TCC GTA CCA GAG TAC CAG ATG GCT      1713Cys Thr Asp Leu Phe Pro Gly Glu Ser Val Pro Glu Tyr Gln Met Ala420                 425                 430                 435TTT CAG ACA GAG GTT GGA AAC CAT CCC ACT TTT GAG GAT ATG CAG GTT      1761Phe Gln Thr Glu Val Gly Asn His Pro Thr Phe Glu Asp Met Gln Val
            440                 445                 450CTC GTG TCT AGG GAA AAA CAG AGA CCC AAG TTC CCA GAA GCC TGG AAA      1809Leu Val Ser Arg Glu Lys Gln Arg Pro Lys Phe Pro Glu Ala Trp Lys
        455                 460                 465GAA AAT AGC CTG GCA GTG AGG TCA CTC AAG GAG ACA ATC GAA GAC TGT      1857Glu Asn Ser Leu Ala Val Arg Ser Leu Lys Glu Thr Ile Glu Asp Cys
    470                 475                 480TGG GAC CAG GAT GCA GAG GCT CGG CTT ACT GCA CAG TGT GCT GAG GAA      1905Trp Asp Gln Asp Ala Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Ala Glu Glu
485                 490                 495AGG ATG GCT GAA CTT ATG ATG ATT TGG GAA AGA AAC AAA TCT GTG AGC      1953Arg Met Ala Glu Leu Met Met Ile Trp Glu Arg Asn Lys Ser Val Ser500                 505                 510                 515CCA ACA GTC AAT CCA ATG TCT ACT GCT ATG CAG AAT GAA CGC AAC CTG      2001Pro Thr Val Asn Pro Met Ser Thr Ala Met Gln Asn Glu Arg Asn Leu
            520                 525                 530TCA CAT AAT AGG CGT GTG CCA AAA ATT GGT CCT TAT CCA GAT TAT TCT      2049Ser His Asn Arg Arg Val Pro Lys Ile Gly Pro Tyr Pro Asp Tyr Ser
        535                 540                 545TCC TCC TCA TAC ATT GAA GAC TCT ATC CAT CAT ACT GAC AGC ATC GTG      2097Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Asp Ser Ile His His Thr Asp Ser Ile Val
    550                 555                 560AAG AAT ATT TCC TCT GAG CAT TCT ATG TCC AGC ACA CCT TTG ACT ATA      2145Lys Asn Ile Ser Ser Glu His Ser Met Ser Ser Thr Pro Leu Thr Ile
565                 570                 575GGG GAA AAA AAC CGA AAT TCA ATT AAC TAT GAA CGA CAG CAA GCA CAA      2193Gly Glu Lys Asn Arg Asn Ser Ile Asn Tyr Glu Arg Gln Gln Ala Gln580                 585                 590                 595GCT CGA ATC CCC AGC CCT GAA ACA AGT GTC ACC AGC CTC TCC ACC AAC      2241Ala Arg Ile Pro Ser Pro Glu Thr Ser Val Thr Ser Leu Ser Thr Asn
            600                 605                 610ACA ACA ACC ACA AAC ACC ACA GGA CTC ACG CCA AGT ACT GGC ATG ACT     2289Thr Thr Thr Thr Asn Thr Thr Gly Leu Thr Pro Ser ThrGly Met Thr
        615                 620                 625ACT ATA TCT GAG ATG CCA TAC CCA GAT GAA ACA AAT CTG CAT ACC ACA      2337Thr Ile Ser Glu Met Pro Tyr Pro Asp Glu Thr Asn Leu His Thr Thr
    630                 635                 640AAT GTT GCA CAG TCA ATT GGG CCA ACC CCT GTC TGC TTA CAG CTG ACA      2385Asn Val Ala Gln Ser Ile Gly Pro Thr Pro Val Cys Leu Gln Leu Thr
645                 650                 655GAA GAA GAC TTG GAA ACC AAC AAG CTA GAC CCA AAA GAA GTT GAT AAG      2433Glu Glu Asp Leu Glu Thr Asn Lys Leu Asp Pro Lys Glu Val Asp Lys660                 665                 670                 675AAC CTC AAG GAA AGC TCT GAT GAG AAT CTC ATG GAG CAC TCT CTT AAA      2481Asn Leu Lys Glu Ser Ser Asp Glu Asn Leu Met Glu His Ser Leu Lys
            680                 685                 690CAG TTC AGT GGC CCA GAC CCA CTG AGC AGT ACT AGT TCT AGC TTG CTT      2529Gln Phe Ser Gly Pro Asp Pro Leu Ser Ser Thr Ser Ser Ser Leu Leu
        695                 700                 705TAC CCA CTC ATA AAA CTT GCA GTA GAA GCA ACT GGA CAG CAG GAC TTC      2577Tyr Pro Leu Ile Lys Leu Ala Val Glu Ala Thr Gly Gln Gln Asp Phe
    710                 715                 720ACA CAG ACT GCA AAT GGC CAA GCA TGT TTG ATT CCT GAT GTT CTG CCT      2625Thr Gln Thr Ala Asn Gly Gln Ala Cys Leu Ile Pro Asp Val Leu Pro
725                 730                 735ACT CAG ATC TAT CCT CTC CCC AAG CAG CAG AAC CTT CCC AAG AGA CCT      2673Thr Gln Ile Tyr Pro Leu Pro Lys Gln Gln Asn Leu Pro Lys Arg Pro740                 745                 750                 755ACT AGT TTG CCT TTG AAC ACC AAA AAT TCA ACA AAA GAG CCC CGG CTA      2721Thr Ser Leu Pro Leu Asn Thr Lys Asn Ser Thr Lys Glu Pro Arg Leu
            760                 765                 770AAA TTT GGC AGC AAG CAC AAA TCA AAC TTG AAA CAA GTC GAA ACT GGA      2769Lys Phe Gly Ser Lys His Lys Ser Asn Leu Lys Gln Val Glu Thr Gly
        775                 780                 785GTT GCC AAG ATG AAT ACA ATC AAT GCA GCA GAA CCT CAT GTG GTG ACA      2817Val Ala Lys Met Asn Thr Ile Asn Ala Ala Glu Pro His Val Val Thr
    790                 795                 800GTC ACC ATG AAT GGT GTG GCA GGT AGA AAC CAC AGT GTT AAC TCC CAT     2865Val Thr Met Asn Gly Val Ala Gly Arg Asn His Ser Val Asn Ser His
805                 810                 815GCT GCC ACA ACC CAA TAT GCC AAT GGG ACA GTA CTA TCT GGC CAA ACA      2913Ala Ala Thr Thr Gln Tyr Ala Asn Gly Thr Val Leu Ser Gly Gln Thr820                 825                 830                  835ACC AAC ATA GTG ACA CAT AGG GCC CAA GAA ATG TTG CAG AAT CAG TTT      2961Thr Asn Ile Val Thr His Arg Ala Gln Glu Met Leu Gln Asn Gln Phe
            840                 845                 850ATT GGT GAG GAC ACC CGG CTG AAT ATT AAT TCC AGT CCT GAT GAG CAT      3009Ile Gly Glu Asp Thr Arg Leu Asn Ile Asn Ser Ser Pro Asp Glu His
        855                 860                 865GAG CCT TTA CTG AGA CGA GAG CAA CAA GCT GGC CAT GAT GAA GGT GTT      3057Glu Pro Leu Leu Arg Arg Glu Gln Gln Ala Gly His Asp Glu Gly Val
    870                 875                 880CTG GAT CGT CTT GTG GAC AGG AGG GAA CGG CCA CTA GAA GGT GGC CGA      3105Leu Asp Arg Leu Val Asp Arg Arg Glu Arg Pro Leu Glu Gly Gly Arg
885                 890                 895ACT AAT TCC AAT AAC AAC AAC AGC AAT CCA TGT TCA GAA CAA GAT GTT      3153Thr Asn Ser Asn Asn Asn Asn Ser Asn Pro Cys Ser Glu Gln Asp Val900                 905                 910                 915CTT GCA CAG GGT GTT CCA AGC ACA GCA GCA GAT CCT GGG CCA TCA AAG      3201Leu Ala Gln Gly Val Pro Ser Thr Ala Ala Asp Pro Gly Pro Ser Lys
            920                 925                 930CCC AGA AGA GCA CAG AGG CCT AAT TCT CTG GAT CTT TCA GCC ACA AAT      3249Pro Arg Arg Ala Gln Arg Pro Asn Ser Leu Asp Leu Ser Ala Thr Asn
        935                 940                 945GTC CTG GAT GGC AGC AGT ATA CAG ATA GGT GAG TCA ACA CAA GAT GGC      3297Val Leu Asp Gly Ser Ser Ile Gln Ile Gly Glu Ser Thr Gln Asp Gly
    950                 955                 960AAA TCA GGA TCA GGT GAA AAG ATC AAG AAA CGT GTG AAA ACT CCC TAT      3345Lys Ser Gly Ser Gly Glu Lys Ile Lys Lys Arg Val Lys Thr Pro Tyr
965                 970                 975TCT CTT AAG CGG TGG CGC CCC TCC ACC TGG GTC ATC TCC ACT GAA TCG      3393Ser Leu Lys Arg Trp Arg Pro Ser Thr Trp Val Ile Ser Thr Glu Ser980                 985                 990                 995CTG GAC TGT GAA GTC AAC AAT AAT GGC AGT AAC AGG GCA GTT CAT TCC      3441Leu Asp Cys Glu Val Asn Asn Asn Gly Ser Asn Arg Ala Val His Ser
            1000                1005                1010AAA TCC AGC ACT GCT GTT TAC CTT GCA GAA GGA GGC ACT GCT ACA ACC      3489Lys Ser Ser Thr Ala Val Tyr Leu Ala Glu Gly Gly Thr Ala Thr Thr
        1015                1020                1025ATG GTG TCT AAA GAT ATA GGA ATG AAC TGT CTG TGAAATGTTT TCAAGCCTAT    3542Met Val Ser Lys Asp Ile Gly Met Asn Cys Leu
    1030                1035GGAGTGAAAT TATTTTTTGC ATCATTTAAA CATGCAGAAG ATGTTTAAAA AAAAAAAAA     3601(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：
(A)长度：1038氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Thr Ser Ser Leu Gln Arg Pro Trp Arg Val Pro Trp Leu Pro Trp1               5                  10                  15Thr Ile Leu Leu Val Ser Thr Ala Ala Ala Ser Gln Asn Gln Glu Arg
         20                  25                  30Leu Cys Ala Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp Leu Gly Ile Gly Glu
     35                  40                  45Ser Arg Ile Ser His Glu Ash Gly Thr Ile Leu Cys Ser Lys Gly Ser
 50                  55                  60Thr Cys Tyr Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly Asp Ile Asn Leu Val65                  70                  75                  80Lys Gln Gly Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro Gln Glu Cys His Tyr
             85                  90                  95Glu Glu Cys Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser Ile Gln Asn Gly Thr
        100                 105                 110Tyr Arg Phe Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys Asn Val Asn Phe Thr
    115                 120                 125Glu Asn Phe Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu Ser Pro Pro His Ser
130                 135                 140Phe Asn Arg Asp Glu Thr Ile Ile Ile Ala Leu Ala Ser Val Ser Val145                 150                 155                 160Leu Ala Val Leu Ile Val Ala Leu Cys Phe Gly Tyr Arg Met Leu Thr
            165                 170                 175Gly Asp Arg Lys Gln Gly Leu His Ser Met Asn Met Met Glu Ala Ala
        180                 185                 190Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asp Leu Asp Asn Leu Lys Leu Leu Glu Leu
    195                 200                 205Ile Gly Arg Gly Arg Tyr Gly Ala Val Tyr Lys Gly Ser Leu Asp Glu
210                 215                 220Arg Pro Val Ala Val Lys Val Phe Ser Phe Ala Asn Arg Gln Asn Phe225                 230                 235                 240Ile Asn Glu Lys Asn Ile Tyr Arg Val Pro Leu Met Glu His Asp Asn
            245                 250                 255Ile Ala Arg Phe Ile Val Gly Asp Glu Arg Val Thr Ala Asp Gly Arg
        260                 265                 270Met Glu Tyr Leu Leu Val Met Glu Tyr Tyr Pro Asn Gly Ser Leu Cys
    275                 280                 285Lys Tyr Leu Ser Leu His Thr Ser Asp Trp Val Ser Ser Cys Arg Leu
290                 295                 300Ala His Ser Val Thr Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Thr Glu Leu Pro305                 310                 315                 320Arg Gly Asp His Tyr Lys Pro Ala Ile Ser His Arg Asp Leu Asn Ser
            325                 330                 335Arg Asn Val Leu Val Lys Asn Asp Gly Thr Cys Val Ile Ser Asp Phe
        340                 345                 350Gly Leu Ser Met Arg Leu Thr Gly Asn Arg Leu Val Arg Pro Gly Glu
    355                 360                 365Glu Asp Asn Ala Ala Ile Ser Glu Val Gly Thr Ile Arg Tyr Met Ala
370                 375                 380Pro Glu Val Leu Glu Gly Ala Val Asn Leu Arg Asp Cys Glu Ser Ala385                 390                 395                 400Leu Lys Gln Val Asp Met Tyr Ala Leu Gly Leu Ile Tyr Trp Glu Ile
            405                 410                 415Phe Met Arg Cys Thr Asp Leu Phe Pro Gly Glu Ser Val Pro Glu Tyr
        420                 425                 430Gln Met Ala Phe Gln Thr Glu Val Gly Asn His Pro Thr Phe Glu Asp
    435                 440                 445Met Gln Val Leu Val Ser Arg Glu Lys Gln Arg Pro Lys Phe Pro Glu
450                 455                 460Ala Trp Lys Glu Asn Ser Leu Ala Val Arg Ser Leu Lys Glu Thr Ile465                 470                 475                 480Glu Asp Cys Trp Asp Gln Asp Ala Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys
            485                 490                 495Ala Glu Glu Arg Met Ala Glu Leu Met Met Ile Trp Glu Arg Asn Lys
        500                 505                 510Ser Val Ser Pro Thr Val Asn Pro Met Ser Thr Ala Met Gln Asn Glu
    515                 520                 525Arg Asn Leu Ser His Asn Arg Arg Val Pro Lys Ile Gly Pro Tyr Pro
530                 535                 540Asp Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Asp Ser Ile His His Thr Asp545                 550                 555                 560Ser Ile Val Lys Asn Ile Ser Ser Glu His Ser Met Ser Ser Thr Pro
            565                 570                 575Leu Thr Ile Gly Glu Lys Asn Arg Asn Ser Ile Asn Tyr Glu Arg Gln
        580                 585                 590Gln Ala Gln Ala Arg Ile Pro Ser Pro Glu Thr Ser Val Thr Ser Leu
    595                 600                 605Ser Thr Asn Thr Thr Thr Thr Asn Thr Thr Gly Leu Thr Pro Ser Thr
610                 615                 620Gly Met Thr Thr Ile Ser Glu Met Pro Tyr Pro Asp Glu Thr Asn Leu625                 630                 635                 640His Thr Thr Asn Val Ala Gln Ser Ile Gly Pro Thr Pro Val Cys Leu
            645                 650                 655Gln Leu Thr Glu Glu Asp Leu Glu Thr Asn Lys Leu Asp Pro Lys Glu
        660                 665                 670Val Asp Lys Asn Leu Lys Glu Ser Ser Asp Glu Asn Leu Met Glu His
    675                 680                 685Ser Leu Lys Gln Phe Ser Gly Pro Asp Pro Leu Ser Ser Thr Ser Ser
690                 695                 700Ser Leu Leu Tyr Pro Leu Ile Lys Leu Ala Val Glu Ala Thr Gly Gln705                 710                 715                 720Gln Asp Phe Thr Gln Thr Ala Asn Gly Gln Ala Cys Leu Ile Pro Asp
            725                 730                 735Val Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Pro Leu Pro Lys Gln Gln Asn Leu Pro
        740                 745                 750Lys Arg Pro Thr Ser Leu Pro Leu Asn Thr Lys Asn Ser Thr Lys Glu
    755                 760                 765Pro Arg Leu Lys Phe Gly Ser Lys His Lys Ser Asn Leu Lys Gln Val
770                 775                 780Glu Thr Gly Val Ala Lys Met Asn Thr Ile Asn Ala Ala Glu Pro His785                 790                 795                 800Val Val Thr Val Thr Met Asn Gly Val Ala Gly Arg Asn His Ser Val
            805                 810                 815Asn Ser His Ala Ala Thr Thr Gln Tyr Ala Asn Gly Thr Val Leu Ser
        820                 825                 830Gly Gln Thr Thr Asn Ile Val Thr His Arg Ala Gln Glu Met Leu Gln
    835                 840                 845Asn Gln Phe Ile Gly Glu Asp Thr Arg Leu Asn Ile Asn Ser Ser Pro
850                 855                 860Asp Glu His Glu Pro Leu Leu Arg Arg Glu Gln Gln Ala Gly His Asp865                 870                 875                 880Glu Gly Val Leu Asp Arg Leu Val Asp Arg Arg Glu Arg Pro Leu Glu
            885                 890                 895Gly Gly Arg Thr Asn Ser Asn Asn Asn Asn Ser Asn Pro Cys Ser Glu
        900                 905                 910Gln Asp Val Leu Ala Gln Gly Val Pro Ser Thr Ala Ala Asp Pro Gly
    915                 920                 925Pro Ser Lys Pro Arg Arg Ala Gln Arg Pro Asn Ser Leu Asp Leu Ser
930                 935                 940Ala Thr Asn Val Leu Asp Gly Ser Ser Ile Gln Ile Gly Glu Ser Thr945                 950                 955                 960Gln Asp Gly Lys Ser Gly Ser Gly Glu Lys Ile Lys Lys Arg Val Lys
            965                 970                 975Thr Pro Tyr Ser Leu Lys Arg Trp Arg Pro Ser Thr Trp Val Ile Ser
        980                 985                 990Thr Glu Ser Leu Asp Cys Glu Val Asn Asn Asn Gly Ser Asn Arg Ala
    995                 1000                1005Val His Ser Lys Ser Ser Thr Ala Val Tyr Leu Ala Glu Gly Gly Thr
1010                1015                1020Ala Thr Thr Met Val Ser Lys Asp Ile Gly Met Asn Cys Leu1025                1030                1035(2)SEQ ID NO.：3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：2156碱基对
(B)类型：核酸
(C)股性：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/分类符号：CDS
(B)位置：409..2154(xi)序列描述：SEQ ID NO.：3：CGCCCCCCGA CCCCGGATCG AATCCCCGCC CTCCGCACCC TGGATATGTT TTCTCCCAGA     60CCTGGATATT TTTTTGATAT CGTGAAACTA CGAGGGAAAT AATTTGGGGG ATTTCTTCTT     120GGCTCCCTGC TTTCCCCACA GACATGCCTT CCGTTTGGAG GGCCGCGGCA CCCCGTCCGA     180GGCGAAGGAA CCCCCCCAGC CGCGAGGGAG AGAAATGAAG GGAATTTCTG CAGCGGCATG     240AAAGCTCTGC AGCTAGGTCC TCTCATCAGC CATTTGTCCT TTCAAACTGT ATTGTGATAC     300GGGCAGGATC AGTCCACGGG AGAGAAGACG AGCCTCCCGG CTGTTTCTCC GCCGGTCTAC     360TTCCCATATT TCTTTTCTTT GCCCTCCTGA TTCTTGGCTG GCCCAGGG ATG ACT TCC      417
                                                 Met Thr Ser
                                                   1TCG CTG CAG CGG CCC TGG CGG GTG CCC TGG CTA CCA TGG ACC ATC CTG       465Ser Leu Gln Arg Pro Trp Arg Val Pro Trp Leu Pro Trp Thr Ile Leu
  5                  10                  15CTG GTC AGC ACT GCG GCT GCT TCG CAG AAT CAA GAA CGG CTA TGT GCG       513Leu Val Ser Thr Ala Ala Ala Ser Gln Asn Gln Glu Arg Leu Cys Ala 20                  25                  30                  35TTT AAA GAT CCG TAT CAG CAA GAC CTT GGG ATA GGT GAG AGT AGA ATC      561Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp Leu Gly Ile Gly Glu Ser Arg Ile
             40                  45                  50TCT CAT GAA AAT GGG ACA ATA TTA TGC TCG AAA GGT AGC ACC TGC TAT      609Ser His Glu Asn Gly Thr Ile Leu Cys Ser Lys Gly Ser Thr Cys Tyr
         55                  60                  65GGC CTT TGG GAG AAA TCA AAA GGG GAC ATA AAT CTT GTA AAA CAA GGA      657Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly Asp Ile Asn Leu Val Lys Gln Gly
     70                  75                  80TGT TGG TCT CAC ATT GGA GAT CCC CAA GAG TGT CAC TAT GAA GAA TGT      705Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro Gln Glu Cys His Tyr Glu Glu Cys
 85                  90                  95GTA GTA ACT ACC ACT CCT CCC TCA ATT CAG AAT GGA ACA TAC CGT TTC      753Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser Ile Gln Asn Gly Thr Tyr Arg Phe100                 105                 110                 115TGC TGT TGT AGC ACA GAT TTA TGT AAT GTC AAC TTT ACT GAG AAT TTT       801Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys Asn Val Asn Phe Thr Glu Asn Phe
            120                 125                 130CCA CCT CCT GAC ACA ACA CCA CTC AGT CCA CCT CAT TCA TTT AAC CGA       849Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu Ser Pro Pro His Ser Phe Asn Arg
        135                 140                 145GAT GAG ACA ATA ATC ATT GCT TTG GCA TCA GTC TCT GTA TTA GCT GTT       897Asp Glu Thr Ile Ile Ile Ala Leu Ala Ser Val Ser Val Leu Ala Val
    150                 155                 160TTG ATA GTT GCC TTA TGC TTT GGA TAC AGA ATG TTG ACA GGA GAC CGT       945Leu Ile Val Ala Leu Cys Phe Gly Tyr Arg Met Leu Thr Gly Asp Arg
165                 170                 175AAA CAA GGT CTT CAC AGT ATG AAC ATG ATG GAG GCA GCA GCA TCC GAA       993Lys Gln Gly Leu His Ser Met Asn Met Met Glu Ala Ala Ala Ser Glu180                 185                 190                 195CCC TCT CTT GAT CTA GAT AAT CTG AAA CTG TTG GAG CTG ATT GGC CGA      1041Pro Ser Leu Asp Leu Asp Asn Leu Lys Leu Leu Glu Leu Ile Gly Arg
            200                 205                 210GGT CGA TAT GGA GCA GTA TAT AAA GGC TCC TTG GAT GAG CGT CCA GTT      1089Gly Arg Tyr Gly Ala Val Tyr Lys Gly Ser Leu Asp Glu Arg Pro Val
        215                 220                 225GCT GTA AAA GTG TTT TCC TTT GCA AAC CGT CAG AAT TTT ATC AAC GAA     1137Ala Val Lys Val Phe Ser Phe Ala Asn Arg Gln Asn Phe Ile Asn Glu
    230                 235                 240AAG AAC ATT TAC AGA GTG CCT TTG ATG GAA CAT GAC AAC ATT GCC CGC      1185Lys Asn Ile Tyr Arg Val Pro Leu Met Glu His Asp Asn Ile Ala Arg
245                 250                 255TTT ATA GTT GGA GAT GAG AGA GTC ACT GCA GAT GGA CGC ATG GAA TAT      1233Phe Ile Val Gly Asp Glu Arg Val Thr Ala Asp Gly Arg Met Glu Tyr260                 265                 270                 275TTG CTT GTG ATG GAG TAC TAT CCC AAT GGA TCT TTA TGC AAG TAT TTA      1281Leu Leu Val Met Glu Tyr Tyr Pro Asn Gly Ser Leu Cys Lys Tyr Leu
            280                 285                 290AGT CTC CAC ACA AGT GAC TGG GTA AGC TCT TGC CGT CTT GCT CAT TCT      1329Ser Leu His Thr Ser Asp Trp Val Ser Ser Cys Arg Leu Ala His Ser
        295                 300                 305GTT ACT AGA GGA CTG GCT TAT CTT CAC ACA GAA TTA CCA CGA GGA GAT      1377Val Thr Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Thr Glu Leu Pro Arg Gly Asp
    310                 315                 320CAT TAT AAA CCT GCA ATT TCC CAT CGA GAT TTA AAC AGC AGA AAT GTC      1425His Tyr Lys Pro Ala Ile Ser His Arg Asp Leu Asn Ser Arg Asn Val
325                 330                 335CTA GTG AAA AAT GAT GGA ACC TGT GTT ATT AGT GAC TTT GGA CTG TCC      1473Leu Val Lys Asn Asp Gly Thr Cys Val Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser340                 345                 350                 355ATG AGG CTG ACT GGA AAT AGA CTG GTG CGC CCA GGG GAG GAA GAT AAT      1521Met Arg Leu Thr Gly Asn Arg Leu Val Arg Pro Gly Glu Glu Asp Asn
            360                 365                 370GCA GCC ATA AGC GAG GTT GGC ACT ATC AGA TAT ATG GCA CCA GAA GTG      1569Ala Ala Ile Ser Glu Val Gly Thr Ile Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val
        375                 380                 385CTA GAA GGA GCT GTG AAC TTG AGG GAC TGT GAA TCA GCT TTG AAA CAA      1617Leu Glu Gly Ala Val Asn Leu Arg Asp Cys Glu Ser Ala Leu Lys Gln
    390                 395                 400GTA GAC ATG TAT GCT CTT GGA CTA ATC TAT TGG GAG ATA TTT ATG AGA      1665Val Asp Met Tyr Ala Leu Gly Leu Ile Tyr Trp Glu Ile Phe Met Arg
405                 410                 415TGT ACA GAC CTC TTC CCA GGG GAA TCC GTA CCA GAG TAC CAG ATG GCT      1713Cys Thr Asp Leu Phe Pro Gly Glu Ser Val Pro Glu Tyr Gln Met Ala420                 425                 430                 435TTT CAG ACA GAG GTT GGA AAC CAT CCC ACT TTT GAG GAT ATG CAG GTT      1761Phe Gln Thr Glu Val Gly Asn His Pro Thr Phe Glu Asp Met Gln Val
            440                 445                 450CTC GTG TCT AGG GAA AAA CAG AGA CCC AAG TTC CCA GAA GCC TGG AAA      1809Leu Val Ser Arg Glu Lys Gln Arg Pro Lys Phe Pro Glu Ala Trp Lys
        455                 460                 465GAA AAT AGC CTG GCA GTG AGG TCA CTC AAG GAG ACA ATC GAA GAC TGT      1857Glu Asn Ser Leu Ala Val Arg Ser Leu Lys Glu Thr Ile Glu Asp Cys
    470                 475                 480TGG GAC CAG GAT GCA GAG GCT CGG CTT ACT GCA CAG TGT GCT GAG GAA      1905Trp Asp Gln Asp Ala Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Ala Glu Glu
485                 490                 495AGG ATG GCT GAA CTT ATG ATG ATT TGG GAA AGA AAC AAA TCT GTG AGC      1953Arg Met Ala Glu Leu Met Met Ile Trp Glu Arg Asn Lys Ser Val Ser500                 505                 510                 515CCA ACA GTC AAT CCA ATG TCT ACT GCT ATG CAG AAT GAA CGC AAC CTG      2001Pro Thr Val Asn Pro Met Ser Thr Ala Met Gln Asn Glu Arg Asn Leu
            520                 525                 530TCA CAT AAT AGG CGT GTG CCA AAA ATT GGT CCT TAT CCA GAT TAT TCT      2049Ser His Asn Arg Arg Val Pro Lys Ile Gly Pro Tyr Pro Asp Tyr Ser
        535                 540                 545TCC TCC TCA TAC ATT GAA GAC TCT ATC CAT CAT ACT GAC AGC ATC GTG      2097Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Asp Ser Ile His His Thr Asp Ser Ile Val
    550                 555                 560AAG AAT ATT TCC TCT GAG CAT TCT ATG TCC AGC ACA CCT TTG ACT ATA      2145Lys Asn Ile Ser Ser Glu His Ser Met Ser Ser Thr Pro Leu Thr Ile
565                 570                 575GGG GAA AAA AA                                                       2156Gly Glu Lys580(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：582氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Thr Ser Ser Leu Gln Arg Pro Trp Arg Val Pro Trp Leu Pro Trp1               5                  10                  15Thr Ile Leu Leu Val Ser Thr Ala Ala Ala Ser Gln Asn Gln Glu Arg
         20                  25                  30Leu Cys Ala Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp Leu Gly Ile Gly Glu
     35                  40                  45Ser Arg Ile Ser His Glu Asn Gly Thr Ile Leu Cys Ser Lys Gly Ser
 50                  55                  60Thr Cys Tyr Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly Asp Ile Asn Leu Val65                  70                  75                  80Lys Gln Gly Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro Gln Glu Cys His Tyr
             85                  90                  95Glu Glu Cys Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser Ile Gln Asn Gly Thr
        100                 105                 110Tyr Arg Phe Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys Asn Val Asn Phe Thr
    115                 120                 125Glu Asn Phe Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu Ser Pro Pro His Ser
130                 135                 140Phe Asn Arg Asp Glu Thr Ile Ile Ile Ala Leu Ala Ser Val Ser Val145                 150                 155                 160Leu Ala Val Leu Ile Val Ala Leu Cys Phe Gly Tyr Arg Met Leu Thr
            165                 170                 175Gly Asp Arg Lys Gln Gly Leu His Ser Met Asn Met Met Glu Ala Ala
        180                 185                 190Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asp Leu Asp Asn Leu Lys Leu Leu Glu Leu
    195                 200                 205Ile Gly Arg Gly Arg Tyr Gly Ala Val Tyr Lys Gly Ser Leu Asp Glu
210                 215                 220Arg Pro Val Ala Val Lys Val Phe Ser Phe Ala Asn Arg Gln Asn Phe225                 230                 235                 240Ile Asn Glu Lys Asn Ile Tyr Arg Val Pro Leu Met Glu His Asp Asn
            245                 250                 255Ile Ala Arg Phe Ile Val Gly Asp Glu Arg Val Thr Ala Asp Gly Arg
        260                 265                 270Met Glu Tyr Leu Leu Val Met Glu Tyr Tyr Pro Asn Gly Ser Leu Cys
    275                 280                 285Lys Tyr Leu Ser Leu His Thr Ser Asp Trp Val Ser Ser Cys Arg Leu
290                 295                 300Ala His Ser Val Thr Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Thr Glu Leu Pro305                 310                 315                 320Arg Gly Asp His Tyr Lys Pro Ala Ile Ser His Arg Asp Leu Asn Ser
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    355                 360                 365Glu Asp Asn Ala Ala Ile Ser Glu Val Gly Thr Ile Arg Tyr Met Ala
370                 375                 380Pro Glu Val Leu Glu Gly Ala Val Asn Leu Arg Asp Cys Glu Ser Ala385                 390                 395                 400Leu Lys Gln Val Asp Met Tyr Ala Leu Gly Leu Ile Tyr Trp Glu Ile
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        420                 425                 430Gln Met Ala Phe Gln Thr Glu Val Gly Asn His Pro Thr Phe Glu Asp
    435                 440                 445Met Gln Val Leu Val Ser Arg Glu Lys Gln Arg Pro Lys Phe Pro Glu
450                 455                 460Ala Trp Lys Glu Asn Ser Leu Ala Val Arg Ser Leu Lys Glu Thr Ile465                 470                 475                 480Glu Asp Cys Trp Asp Gln Asp Ala Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys
            485                 490                 495Ala Glu Glu Arg Met Ala Glu Leu Met Met Ile Trp Glu Arg Asn Lys
        500                 505                 510Ser Val Ser Pro Thr Val Asn Pro Met Ser Thr Ala Met Gln Asn Glu
    515                 520                 525Arg Asn Leu Ser His Asn Arg Arg Val Pro Lys Ile Gly Pro Tyr Pro
530                 535                 540Asp Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Asp Ser Ile His His Thr Asp545                 550                 555                 560Ser Ile Val Lys Asn Ile Ser Ser Glu His Ser Met Ser Ser Thr Pro
            565                 570                 575Leu Thr Ile Gly Glu Lys
        580(2)SEQ ID NO.：5的信息：(i)序列特征：
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(A)名称/分类符号：CDS
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                Met Thr Ser Ser Leu Gln Arg Pro Trp Arg Val
                  1               5                  10CCC TGG CTA CCA TGG ACC ATC CTG CTG GTC AGC ACT GCG GCT GCT TCG        99Pro Trp Leu Pro Trp Thr Ile Leu Leu Val Ser Thr Ala Ala Ala Ser
         15                  20                  25CAG AAT CAA GAA CGG CTA TGT GCG TTT AAA GAT CCG TAT CAG CAA GAC        147Gln Asn Gln Glu Arg Leu Cys Ala Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp
     30                  35                  40CTT GGG ATA GGT GAG AGT AGA ATC TCT CAT GAA AAT GGG ACA ATA TTA       195Leu Gly Ile Gly Glu Ser Arg Ile Ser His Glu Asn Gly Thr Ile Leu
 45                  50                  55TGC TCG AAA GGT AGC ACC TGC TAT GGC CTT TGG GAG AAA TCA AAA GGG       243Cys Ser Lys Gly Ser Thr Cys Tyr Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly60                  65                  70                  75GAC ATA AAT CTT GTA AAA CAA GGA TGT TGG TCT CAC ATT GGA GAT CCC       291Asp Ile Asn Leu Val Lys Gln Gly Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro
             80                  85                  90CAA GAG TGT CAC TAT GAA GAA TGT GTA GTA ACT ACC ACT CCT CCC TCA       339Gln Glu Cys His Tyr Glu Glu Cys Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser
         95                 100                 105ATT CAG AAT GGA ACA TAC CGT TTC TGC TGT TGT AGC ACA GAT TTA TGT       387Ile Gln Asn Gly Thr Tyr Arg Phe Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys
    110                 115                 120AAT GTC AAC TTT ACT GAG AAT TTT CCA CCT CCT GAC ACA ACA CCA CTC       435Asn Val Asn Phe Thr Glu Asn Phe Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu
125                 130                 135AGT CCA CCT CAT TCA TTT AAC CGA GAT GAG ACA TG                        471Ser Pro Pro His Ser Phe Asn Arg Asp Glu Thr140                  145                150(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：
(A)长度：150氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Thr Ser Ser Leu Gln Arg Pro Trp Arg Val Pro Trp Leu Pro Trp1               5                  10                  15Thr Ile Leu Leu Val Ser Thr Ala Ala Ala Ser Gln Asn Gln Glu Arg
         20                  25                  30Leu Cys Ala Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp Leu Gly Ile Gly Glu
     35                  40                  45Ser Arg Ile Ser His Glu Asn Gly Thr Ile Leu Cys Ser Lys Gly Ser
 50                  55                  60Thr Cys Tyr Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly Asp Ile Asn Leu Val65                  70                  75                  80Lys Gln Gly Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro Gln Glu Cys His Tyr
             85                  90                  95Glu Glu Cys Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser Ile Gln Asn Gly Thr
        100                 105                 110Tyr Arg Phe Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys Asn Val Asn Phe Thr
    115                 120                 125Glu Asn Phe Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu Ser Pro Pro His Ser
130                 135                 140Phe Asn Arg Asp Glu Thr145                 150(2)SEQ ID NO.：7的信息：(i)序列特征：
(A)长度：3508碱基对
(B)类型：核酸
(C)股性：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/分类符号：CDS
(B)位置：17..3133(xi)序列描述：SEQ ID NO.：7：CTTTGCTGGC CCAGGG ATG ACT TCC TCG CTG CAT CGG CCC TTT CGG GTG    49
                Met Thr Ser Ser Leu His Arg Pro Phe Arg Val
                  1               5                  10CCC TGG CTG CTA TGG GCC GTC CTG CTG GTC AGC ACT ACG GCT GCT TCT        97Pro Trp Leu Leu Trp Ala Val Leu Leu Val Ser Thr Thr Ala Ala Ser
         15                  20                  25CAG AAT CAA GAA CGG CTG TGT GCA TTT AAA GAT CCA TAT CAA CAA GAT       145Gln Asn Gln Glu Arg Leu Cys Ala Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp
     30                  35                  40CTT GGG ATA GGT GAG AGT CGA ATC TCT CAT GAA AAT GGG ACA ATA TTA       193Leu Gly Ile Gly Glu Ser Arg Ile Ser His Glu Asn Gly Thr Ile Leu
 45                  50                  55TGT TCC AAA GGG AGC ACG TGT TAT GGT CTG TGG GAG AAA TCA AAA GGG       241Cys Ser Lys Gly Ser Thr Cys Tyr Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly60                  65                  70                  75GAC ATC AAT CTT GTG AAA CAA GGA TGT TGG TCT CAC ATC GGT GAT CCC       289Asp Ile Asn Leu Val Lys Gln Gly Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro
             80                  85                  90CAA GAG TGC CAC TAT GAA GAG TGT GTA GTA ACT ACC ACC CCA CCC TCA       337Gln Glu Cys His Tyr Glu Glu Cys Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser
         95                 100                 105ATT CAG AAT GGA ACG TAC CGC TTT TGC TGC TGT AGT ACA GAT TTA TGT       385Ile Gln Asn Gly Thr Tyr Arg Phe Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys
    110                 115                 120AAT GTC AAC TTT ACT GAG AAC TTT CCA CCC CCT GAC ACA ACA CCA CTC       433Asn Val Asn Phe Thr Glu Asn Phe Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu
125                 130                 135AGT CCA CCT CAT TCA TTT AAT CGA GAT GAA ACG ATA ATC ATT GCT TTG       481Ser Pro Pro His Ser Phe Asn Arg Asp Glu Thr Ile Ile Ile Ala Leu140                 145                 150                 155GCA TCA GTT TCT GTG TTA GCT GTT TTG ATA GTC GCC TTA TGT TTT GGA       529Ala Ser Val Ser Val Leu Ala Val Leu Ile Val Ala Leu Cys Phe Gly
            160                 165                 170TAC AGA ATG TTG ACA GGA GAC CGG AAA CAG GGT CTT CAC AGC ATG AAC       577Tyr Arg Met Leu Thr Gly Asp Arg Lys Gln Gly Leu His Ser Met Asn
        175                 180                 185ATG ATG GAG GCG GCA GCA GCA GAG CCC TCC CTT GAC CTG GAT AAC CTG       625Met Met Glu Ala Ala Ala Ala Glu Pro Ser Leu Asp Leu Asp Asn Leu
    190                 195                 200AAG CTG CTG GAG CTG ATT GGA CGG GGT CGA TAC GGA GCA GTA TAT AAA       673Lys Leu Leu Glu Leu Ile Gly Arg Gly Arg Tyr Gly Ala Val Tyr Lys
205                 210                 215GGT TCC TTG GAT GAG CGT CCA GTT GCT GTA AAA GTA TTT TCT TTT GCA       721Gly Ser Leu Asp Glu Arg Pro Val Ala Val Lys Val Phe Ser Phe Ala220                 225                 230                 235AAC CGT CAG AAT TTT ATA AAT GAA AAA AAC ATT TAC AGA GTG CCT TTG       769Asn Arg Gln Asn Phe Ile Asn Glu Lys Asn Ile Tyr Arg Val Pro Leu
            240                 245                 250ATG GAA CAT GAC AAC ATT GCT CGC TTC ATA GTT GGA GAC GAG AGG CTC       817Met Glu His Asp Asn Ile Ala Arg Phe Ile Val Gly Asp Glu Arg Leu
        255                 260                 265ACT GCA GAC GGC CGC ATG GAG TAT TTG CTT GTG ATG GAG TAT TAT CCC       865Thr Ala Asp Gly Arg Met Glu Tyr Leu Leu Val Met Glu Tyr Tyr Pro
    270                 275                 280AAT GGA TCT CTG TGC AAA TAT CTG AGT CTC CAC ACA AGT GAT TGG GTA       913Asn Gly Ser Leu Cys Lys Tyr Leu Ser Leu His Thr Ser Asp Trp Val
285                 290                 295AGC TCT TGC CGT CTG GCT CAT TCT GTG ACT AGA GGA CTG GCT TAT CTT       961Ser Ser Cys Arg Leu Ala His Ser Val Thr Arg Gly Leu Ala Tyr Leu300                 305                 310                 315CAC ACA GAA TTA CCA CGA GGA GAT CAT TAT AAA CCC GCA ATC TCC CAC      1009His Thr Glu Leu Pro Arg Gly Asp His Tyr Lys Pro Ala Ile Ser His
            320                 325                 330CGA GAT TTA AAC AGC AGG AAT GTC CTG GTA AAG AAT GAC GGC GCG TGT      1057Arg Asp Leu Asn Ser Arg Asn Val Leu Val Lys Asn Asp Gly Ala Cys
        335                 340                 345GTT ATC AGT GAC TTT GGT TTA TCC ATG AGG CTA ACT GGA AAT CGG CTG      1105Val Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Met Arg Leu Thr Gly Asn Arg Leu
    350                 355                 360GTG CGC CCA GGG GAA GAA GAT AAT GCG GCT ATA AGT GAG GTT GGC ACA      1153Val Arg Pro Gly Glu Glu Asp Asn Ala Ala Ile Ser Glu Val Gly Thr
365                 370                 375ATT CGC TAT ATG GCA CCA GAA GTG CTA GAA GGA GCT GTG AAC CTG AGG      1201Ile Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Gly Ala Val Asn Leu Arg380                 385                 390                 395GAC TGT GAG TCA GCT CTG AAG CAA GTG GAC ATG TAT GCG CTT GGA CTC      1249Asp Cys Glu Ser Ala Leu Lys Gln Val Asp Met Tyr Ala Leu Gly Leu
            400                 405                 410ATC TAC TGG GAG GTG TTT ATG AGG TGT ACA GAC CTC TTC CCA GGT GAA      1297Ile Tyr Trp Glu Val Phe Met Arg Cys Thr Asp Leu Phe Pro Gly Glu
        415                 420                 425TCT GTA CCA GAT TAC CAG ATG GCT TTT CAG ACA GAA GTT GGA AAC CAT      1345Ser Val Pro Asp Tyr Gln Met Ala Phe Gln Thr Glu Val Gly Asn His
    430                 435                 440CCC ACA TTT GAG GAT ATG CAG GTT CTT GTG TCC AGA GAG AAG CAG AGA      1393Pro Thr Phe Glu Asp Met Gln Val Leu Val Ser Arg Glu Lys Gln Arg
445                 450                 455CCC AAG TTC CCA GAA GCC TGG AAA GAA AAT AGC CTG GCA GTG AGG TCA      1441Pro Lys Phe Pro Glu Ala Trp Lys Glu Asn Ser Leu Ala Val Arg Ser460                 465                 470                 475CTC AAG GAA ACA ATT GAA GAC TGC TGG GAC CAG GAT GCA GAG GCT CGG      1489Leu Lys Glu Thr Ile Glu Asp Cys Trp Asp Gln Asp Ala Glu Ala Arg
            480                 485                 490CTC ACT GCA CAG TGT GCT GAG GAG AGG ATG GCT GAA CTC ATG ATG ATA      1537Leu Thr Ala Gln Cys Ala Glu Glu Arg Met Ala Glu Leu Met Met Ile
        495                 500                 505TGG GAG AGA AAC AAG TCT GTG AGC CCA ACG GTC AAC CCA ATG TCA ACT      1585Trp Glu Arg Asn Lys Ser Val Ser Pro Thr Val Asn Pro Met Ser Thr
    510                 515                 520GCT ATG CAG AAT GAA CGC AAC CTG TCA CAT AAT AGG CGT GTG CCA AAA      1633Ala Met Gln Asn Glu Arg Asn Leu Ser His Asn Arg Arg Val Pro Lys
525                 530                 535ATC GGG CCT TAC CCA GAT TAT TCC TCT TCC TCA TAT ATT GAA GAC TCT      1681Ile Gly Pro Tyr Pro Asp Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Asp Ser540                 545                 550                 555ATC CAT CAT ACT GAC AGC ATT GTG AAG AAT ATT TCC TCT GAG CAT TCG      1729Ile His His Thr Asp Ser Ile Val Lys Asn Ile Ser Ser Glu His Ser
            560                 565                 570ATG TCC AGC ACA CCA TTG ACA ATA GGA GAA AAG AAT CGA AAT TCA ATT      1777Met Ser Ser Thr Pro Leu Thr Ile Gly Glu Lys Asn Arg Asn Ser Ile
        575                 580                 585AAT TAT GAA CGA CAG CAA GCA CAA GCT CGA ATC CCT AGC CCA GAA ACA      1825Asn Tyr Glu Arg Gln Gln Ala Gln Ala Arg Ile Pro Ser Pro Glu Thr
    590                 595                 600AGC GTC ACA AGC CTG TCC ACA AAC ACA ACC ACC ACA AAC ACC ACC GGC      1873Ser Val Thr Ser Leu Ser Thr Asn Thr Thr Thr Thr Asn Thr Thr Gly
605                 610                 615CTC ACT CCA AGT ACT GGC ATG ACC ACT ATA TCT GAG ATG CCA TAC CCA      1921Leu Thr Pro Ser Thr Gly Met Thr Thr Ile Ser Glu Met Pro Tyr Pro620                 625                 630                 635GAT GAG ACA CAT TTG CAC GCC ACA AAT GTT GCA CAG TCA ATC GGG CCA      1969Asp Glu Thr His Leu His Ala Thr Asn Val Ala Gln Ser Ile Gly Pro
            640                 645                 650ACC CCT GTC TGC TTA CAG CTG ACA GAA GAA GAC TTG GAG ACT AAT AAG      2017Thr Pro Val Cys Leu Gln Leu Thr Glu Glu Asp Leu Glu Thr Asn Lys
        655                 660                 665CTA GAT CCA AAA GAA GTT GAT AAG AAC CTC AAG GAA AGC TCT GAT GAG      2065Leu Asp Pro Lys Glu Val Asp Lys Asn Leu Lys Glu Ser Ser Asp Glu
    670                 675                 680AAT CTC ATG GAG CAT TCT CTG AAG CAG TTC AGT GGG CCA GAC CCA TTG      2113Asn Leu Met Glu His Ser Leu Lys Gln Phe Ser Gly Pro Asp Pro Leu
685                 690                 695AGC AGT ACC AGT TCT AGC TTG CTT TAT CCA CTC ATA AAG CTC GCA GTG      2161Ser Ser Thr Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Pro Leu Ile Lys Leu Ala Val700                 705                 710                 715GAA GTG ACT GGA CAA CAG GAC TTC ACA CAG GCT GCA AAT GGG CAA GCA      2209Glu Val Thr Gly Gln Gln Asp Phe Thr Gln Ala Ala Asn Gly Gln Ala
            720                 725                 730TGT TTA ATT CCT GAT GTT CCA CCT GCT CAG ATC TAT CCT CTC CCT AAG      2257Cys Leu Ile Pro Asp Val Pro Pro Ala Gln Ile Tyr Pro Leu Pro Lys
        735                 740                 745CAA CAG AAC CTT CCT AAG AGA CCT ACT AGT TTG CCT TTG AAC ACC AAA      2305Gln Gln Asn Leu Pro Lys Arg Pro Thr Ser Leu Pro Leu Asn Thr Lys
    750                 755                 760AAT TCA ACA AAA GAA CCC CGG CTA AAA TTT GGC AAC AAG CAC AAA TCA      2353Asn Ser Thr Lys Glu Pro Arg Leu Lys Phe Gly Asn Lys His Lys Ser
765                 770                 775AAC TTG AAA CAA GTA GAA ACT GGA GTT GCC AAG ATG AAT ACA ATC AAT      2401Asn Leu Lys Gln Val Glu Thr Gly Val Ala Lys Met Asn Thr Ile Asn780                 785                 790                 795GCA GCA GAG CCT CAT GTG GTG ACA GTA ACT ATG AAT GGT GTG GCA GGT      2449Ala Ala Glu Pro His Val Val Thr Val Thr Met Asn Gly Val Ala Gly
            800                 805                 810AGA AGC CAC AAT GTT AAT TCT CAT GCT GCC ACA ACC CAG TAT GCC AAT      2497Arg Ser His Asn Val Asn Ser His Ala Ala Thr Thr Gln Tyr Ala Asn
        815                 820                 825GGC GCA GTG CCA GCT GGC CAG GCA GCC AAC ATA GTG GCA CAT AGG TCC      2545Gly Ala Val Pro Ala Gly Gln Ala Ala Asn Ile Val Ala His Arg Ser
    830                 835                 840CAA GAA ATG CTG CAG AAT CAA TTT ATT GGT GAG GAT ACC AGG CTG AAT      2593Gln Glu Met Leu Gln Asn Gln Phe Ile Gly Glu Asp Thr Arg Leu Asn
845                 850                 855ATC AAT TCC AGT CCT GAT GAG CAT GAA CCT TTA CTG AGA CGA GAG CAA      2641Ile Asn Ser Ser Pro Asp Glu His Glu Pro Leu Leu Arg Arg Glu Gln860                 865                 870                 875CAG GCT GGC CAT GAT GAA GGG GTT CTG GAT CGT TTG GTA GAT AGG AGG      2689Gln Ala Gly His Asp Glu Gly Val Leu Asp Arg Leu Val Asp Arg Arg
            880                 885                 890GAA CGG CCA TTA GAA GGT GGC CGA ACA AAT TCC AAT AAC AAC AAC AGC      2737Glu Arg Pro Leu Glu Gly Gly Arg Thr Asn Ser Asn Asn Asn Asn Ser
        895                 900                 905AAT CCA TGT TCA GAA CAA GAT ATC CTT ACA CAA GGT GTT ACA AGC ACA      2785Asn Pro Cys Ser Glu Gln Asp Ile Leu Thr Gln Gly Val Thr Ser Thr
    910                 915                 920GCT GCA GAT CCT GGG CCA TCA AAG CCC AGA AGA GCA CAG AGG CCC AAT      2833Ala Ala Asp Pro Gly Pro Ser Lys Pro Arg Arg Ala Gln Arg Pro Asn
925                 930                 935TCT CTG GAT CTT TCA GCC ACA AAT ATC CTG GAT GGC AGC AGT ATA CAG      2881Ser Leu Asp Leu Ser Ala Thr Asn Ile Leu Asp Gly Ser Ser Ile Gln940                 945                 950                 955ATA GGT GAG TCA ACA CAA GAT GGC AAA TCA GGA TCA GGT GAA AAG ATC       2929Ile Gly Glu Ser Thr Gln Asp Gly Lys Ser Gly Ser Gly Glu Lys Ile
            960                 965                 970AAG AGA CGT GTG AAA ACT CCA TAC TCT CTT AAG CGG TGG CGC CCG TCC      2977Lys Arg Arg Val Lys Thr Pro Tyr Ser Leu Lys Arg Trp Arg Pro Ser
        975                 980                 985ACC TGG GTC ATC TCC ACC GAG CCG CTG GAC TGT GAG GTC AAC AAC AAT      3025Thr Trp Val Ile Ser Thr Glu Pro Leu Asp Cys Glu Val Asn Asn Asn
    990                 995                 1000GGC AGT GAC AGG GCA GTC CAT TCT AAA TCT AGC ACT GCT GTG TAC CTT      3073Gly Ser Asp Arg Ala Val His Ser Lys Ser Ser Thr Ala Val Tyr Leu
1005                1010                1015GCA GAG GGA GGC ACT GCC ACG ACC ACA GTG TCT AAA GAT ATA GGA ATG      3121Ala Glu Gly Gly Thr Ala Thr Thr Thr Val Ser Lys Asp Ile Gly Met1020                1025                1030                1035AAT TGT CTG TGAGATGTTT TCAAGCTTAT GGAGTGAAAT TATTTTTTTG              3170Asn Cys LeuCATCATTTAA ACATGCAGAA GACATTTAAA AAAAAAACTG CTTTAACCTC CTGTCAGCAC    3230CCCTTCCCAC CCCTGCAGCA AGGACTTGCT TTAAATAGAT TTCAGCTATG CAGAAAATTT    3290TAGCTTATGC TTCCATAATT TTTAATTTTG TTTTTTAAGT TTTGCACTTT TGTTTAGTCT    3350TGCTAAAGTT ATATTTGTCT GTTATGACCA CATTATATGT GTGCTTATCC AAAGTGGTCT    3410CCAAATATTT TTTTAAGAAA AAAGCCCAAA CAATGGATTG CTGATAATCA GTTTGGACCA    3470TTTTCTAAAG GTCATTAAAA CAGAAGCAAA TTCAGACC                            3508(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：
(A)长度：1038氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Met Thr Ser Ser Leu His Arg Pro Phe Arg Val Pro Trp Leu Leu Trp1               5                  10                  15Ala Val Leu Leu Val Ser Thr Thr Ala Ala Ser Gln Asn Gln Glu Arg
         20                  25                  30Leu Cys Ala Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp Leu Gly Ile Gly Glu
     35                  40                  45Ser Arg Ile Ser His Glu Asn Gly Thr Ile Leu Cys Ser Lys Gly Ser
 50                  55                  60Thr Cys Tyr Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly Asp Ile Asn Leu Val65                  70                  75                  80Lys Gln Gly Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro Gln Glu Cys His Tyr
             85                  90                  95Glu Glu Cys Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser Ile Gln Asn Gly Thr
        100                 105                 110Tyr Arg Phe Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys Asn Val Ash Phe Thr
    115                 120                 125Glu Asn Phe Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu Ser Pro Pro His Ser
130                 135                 140Phe Asn Arg Asp Glu Thr Ile Ile Ile Ala Leu Ala Ser Val Ser Val145                 150                 155                 160Leu Ala Val Leu Ile Val Ala Leu Cys Phe Gly Tyr Arg Met Leu Thr
            165                 170                 175Gly Asp Arg Lys Gln Gly Leu His Ser Met Asn Met Met Glu Ala Ala
        180                 185                 190Ala Ala Glu Pro Ser Leu Asp Leu Asp Asn Leu Lys Leu Leu Glu Leu
    195                 200                 205Ile Gly Arg Gly Arg Tyr Gly Ala Val Tyr Lys Gly Ser Leu Asp Glu
210                 215                 220Arg Pro Val Ala Val Lys Val Phe Ser Phe Ala Asn Arg Gln Asn Phe225                 230                 235                 240Ile Asn Glu Lys Asn Ile Tyr Arg Val Pro Leu Met Glu His Asp Asn
            245                 250                 255Ile Ala Arg Phe Ile Val Gly Asp Glu Arg Leu Thr Ala Asp Gly Arg
        260                 265                 270Met Glu Tyr Leu Leu Val Met Glu Tyr Tyr Pro Asn Gly Ser Leu Cys
    275                 280                 285Lys Tyr Leu Ser Leu His Thr Ser Asp Trp Val Ser Ser Cys Arg Leu
290                 295                 300Ala His Ser Val Thr Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Thr Glu Leu Pro305                 310                 315                 320Arg Gly Asp His Tyr Lys Pro Ala Ile Ser His Arg Asp Leu Asn Ser
            325                 330                 335Arg Asn Val Leu Val Lys Asn Asp Gly Ala Cys Val Ile Ser Asp Phe
        340                 345                 350Gly Leu Ser Met Arg Leu Thr Gly Asn Arg Leu Val Arg Pro Gly Glu
    355                 360                 365Glu Asp Asn Ala Ala Ile Ser Glu Val Gly Thr Ile Arg Tyr Met Ala
370                 375                 380Pro Glu Val Leu Glu Gly Ala Val Asn Leu Arg Asp Cys Glu Ser Ala385                 390                 395                 400Leu Lys Gln Val Asp Met Tyr Ala Leu Gly Leu Ile Tyr Trp Glu Val
            405                 410                 415Phe Met Arg Cys Thr Asp Leu Phe Pro Gly Glu Ser Val Pro Asp Tyr
        420                 425                 430Gln Met Ala Phe Gln Thr Glu Val Gly Asn His Pro Thr Phe Glu Asp
    435                 440                 445Met Gln Val Leu Val Ser Arg Glu Lys Gln Arg Pro Lys Phe Pro Glu
450                 455                 460Ala Trp Lys Glu Asn Ser Leu Ala Val Arg Ser Leu Lys Glu Thr Ile465                 470                 475                 480Glu Asp Cys Trp Asp Gln Asp Ala Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys
            485                 490                 495Ala Glu Glu Arg Met Ala Glu Leu Met Met Ile Trp Glu Arg Asn Lys
        500                 505                 510Ser Val Ser Pro Thr Val Asn Pro Met Ser Thr Ala Met Gln Asn Glu
    515                 520                 525Arg Asn Leu Ser His Asn Arg Arg Val Pro Lys Ile Gly Pro Tyr Pro
530                 535                 540Asp Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Asp Ser Ile His His Thr Asp545                  550                 555                 560Ser Ile Val Lys Asn Ile Ser Ser Glu His Ser Met Ser Ser Thr Pro
             565                 570                 575Leu Thr Ile Gly Glu Lys Asn Arg Asn Ser Ile Asn Tyr Glu Arg Gln
        580                 585                 590Gln Ala Gln Ala Arg Ile Pro Ser Pro Glu Thr Ser Val Thr Ser Leu
    595                 600                 605Ser Thr Asn Thr Thr Thr Thr Asn Thr Thr Gly Leu Thr Pro Ser Thr
610                 615                 620Gly Met Thr Thr Ile Ser Glu Met Pro Tyr Pro Asp Glu Thr His Leu625                 630                 635                 640His Ala Thr Asn Val Ala Gln Ser Ile Gly Pro Thr Pro Val Cys Leu
            645                 650                 655Gln Leu Thr Glu Glu Asp Leu Glu Thr Asn Lys Leu Asp Pro Lys Glu
        660                 665                 670Val Asp Lys Asn Leu Lys Glu Ser Ser Asp Glu Asn Leu Met Glu His
    675                 680                 685Ser Leu Lys Gln Phe Ser Gly Pro Asp Pro Leu Ser Ser Thr Ser Ser
690                 695                 700Ser Leu Leu Tyr Pro Leu Ile Lys Leu Ala Val Glu Val Thr Gly Gln705                 710                 715                 720Gln Asp Phe Thr Gln Ala Ala Asn Gly Gln Ala Cys Leu Ile Pro Asp
            725                 730                 735Val Pro Pro Ala Gln Ile Tyr Pro Leu Pro Lys Gln Gln Asn Leu Pro
        740                 745                 750Lys Arg Pro Thr Ser Leu Pro Leu Asn Thr Lys Asn Ser Thr Lys Glu
    755                 760                 765Pro Arg Leu Lys Phe Gly Asn Lys His Lys Ser Asn Leu Lys Gln Val
770                 775                 780Glu Thr Gly Val Ala Lys Met Asn Thr Ile Ash Ala Ala Glu Pro His785                 790                 795                 800Val Val Thr Val Thr Met Asn Gly Val Ala Gly Arg Ser His Asn Val
            805                 810                 815Asn Ser His Ala Ala Thr Thr Gln Tyr Ala Asn Gly Ala Val Pro Ala
        820                 825                 830Gly Gln Ala Ala Asn Ile Val Ala His Arg Ser Gln Glu Met Leu Gln
    835                 840                 845Asn Gln Phe Ile Gly Glu Asp Thr Arg Leu Asn Ile Asn Ser Ser Pro
850                 855                 860Asp Glu His Glu Pro Leu Leu Arg Arg Glu Gln Gln Ala Gly His Asp865                 870                 875                 880Glu Gly Val Leu Asp Arg Leu Val Asp Arg Arg Glu Arg Pro Leu Glu
            885                 890                 895Gly Gly Arg Thr Asn Ser Asn Asn Asn Asn Ser Asn Pro Cys Ser Glu
        900                 905                 910Gln Asp Ile Leu Thr Gln Gly Val Thr Ser Thr Ala Ala Asp Pro Gly
    915                 920                 925Pro Ser Lys Pro Arg Arg Ala Gln Arg Pro Asn Ser Leu Asp Leu Ser
930                 935                 940Ala Thr Asn Ile Leu Asp Gly Ser Ser Ile Gln Ile Gly Glu Ser Thr945                 950                 955                 960Gln Asp Gly Lys Ser Gly Ser Gly Glu Lys Ile Lys Arg Arg Val Lys
            965                 970                 975Thr Pro Tyr Ser Leu Lys Arg Trp Arg Pro Ser Thr Trp Val Ile Ser
        980                 985                 990Thr Glu Pro Leu Asp Cys Glu Val Asn Asn Asn Gly Ser Asp Arg Ala
    995                 1000                1005Val His Ser Lys Ser Ser Thr Ala Val Tyr Leu Ala Glu Gly Gly Thr
1010                1015                1020Ala Thr Thr Thr Val Ser Lys Asp Ile Gly Met Asn Cys Leu1025                1030                1035(2)SEQ ID NO.：9的信息：(i)序列特征：
(A)长度：469碱基对
(B)类型：核酸
(C)股性：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/分类符号：CDS
(B)位置：17..469(xi)序列描述：SEQ ID NO.：9：CTTTGCTGGC CCAGGG ATG ACT TCC TCG CTG CAT CGG CCC TTT CGG GTG         49
              Met Thr Ser Ser Leu His Arg Pro Phe Arg Val
                1               5                  10CCC TGG CTG CTA TGG GCC GTC CTG CTG GTC AGC ACT ACG GCT GCT TCT        97Pro Trp Leu Leu Trp Ala Val Leu Leu Val Ser Thr Thr Ala Ala Ser
         15                  20                  25CAG AAT CAA GAA CGG CTG TGT GCA TTT AAA GAT CCA TAT CAA CAA GAT       145Gln Asn Gln Glu Arg Leu Cys Ala Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp
     30                  35                  40CTT GGG ATA GGT GAG AGT CGA ATC TCT CAT GAA AAT GGG ACA ATA TTA       193Leu Gly Ile Gly Glu Ser Arg Ile Ser His Glu Asn Gly Thr Ile Leu
 45                  50                  55TGT TCC AAA GGG AGC ACG TGT TAT GGT CTG TGG GAG AAA TCA AAA GGG       241Cys Ser Lys Gly Ser Thr Cys Tyr Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly60                  65                  70                  75GAC ATC AAT CTT GTG AAA CAA GGA TGT TGG TCT CAC ATC GGT GAT CCC       289Asp Ile Asn Leu Val Lys Gln Gly Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro
             80                  85                  90CAA GAG TGC CAC TAT GAA GAG TGT GTA GTA ACT ACC ACC CCA CCC TCA       337Gln Glu Cys His Tyr Glu Glu Cys Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser
         95                 100                 105ATT CAG AAT GGA ACG TAC CGC TTT TGC TGC TGT AGT ACA GAT TTA TGT       385Ile Gln Asn Gly Thr Tyr Arg Phe Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys
    110                 115                 120AAT GTC AAC TTT ACT GAG AAC TTT CCA CCC CCT GAC ACA ACA CCA CTC       433Asn Val Asn Phe Thr Glu Asn Phe Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu
125                 130                 135AGT CCA CCT CAT TCA TTT AAT CGA GAT GAA ACG TG                        469Ser Pro Pro His Ser Phe Asn Arg Asp Glu Thr140                 145                 150(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征：
(A)长度：150氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：1 0：Met Thr Ser Ser Leu His Arg Pro Phe Arg Val Pro Trp Leu Leu Trp1               5                  10                  15Ala Val Leu Leu Val Ser Thr Thr Ala Ala Ser Gln Asn Gln Glu Arg
         20                  25                  30Leu Cys Ala Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp Leu Gly Ile Gly Glu
     35                  40                  45Ser Arg Ile Ser His Glu Asn Gly Thr Ile Leu Cys Ser Lys Gly Ser
 50                  55                  60Thr Cys Tyr Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly Asp Ile Asn Leu Val65                  70                  75                  80Lys Gln Gly Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro Gln Glu Cys His Tyr
             85                  90                  95Glu Glu Cys Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser Ile Gln Asn Gly Thr
        100                 105                 110Tyr Arg Phe Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys Asn Val Asn Phe Thr
    115                 120                 125Glu Asn Phe Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu Ser Pro Pro His Ser
130                 135                 140Phe Asn Arg Asp Glu Thr145                 150(2)SEQ ID NO.：11的信息：(i)序列特征：
(A)长度：2402碱基对
(B)类型：核酸
(C)股性：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/分类符号：CDS
(B)位置：连接(11..1609)(xi)序列描述：SEQ ID NO.：11：GAATCAGACA ATG ACT CAG CTA TAC ACT TAC ATC AGA TTA CTG GGA GCC         49
       Met Thr Gln Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala
         1               5                  10TGT CTG TTC ATC ATT TCT CAT GTT CAA GGG CAG AAT CTA GAT AGT ATG        97Cys Leu Phe Ile Ile Ser His Val Gln Gly Gln Asn Leu Asp Ser Met
 15                  20                  25CTC CAT GGC ACT GGT ATG AAA TCA GAC TTG GAC CAG AAG AAG CCA GAA       145Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Leu Asp Gln Lys Lys Pro Glu30                  35                  40                  45AAT GGA GTG ACT TTA GCA CCA GAG GAT ACC TTG CCT TTC TTA AAG TGC       193Asn Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys
             50                  55                  60TAT TGC TCA GGA CAC TGC CCA GAT GAT GCT ATT AAT AAC ACA TGC ATA       241Tyr Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile
         65                  70                  75ACT AAT GGC CAT TGC TTT GCC ATT ATA GAA GAA GAT GAT CAG GGA GAA       289Thr Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu
     80                  85                  90ACC ACA TTA ACT TCT GGG TGT ATG AAG TAT GAA GGC TCT GAT TTT CAA       337Thr Thr Leu Thr Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln
 95                 100                 105TGC AAG GAT TCA CCG AAA GCC CAG CTA CGC AGG ACA ATA GAA TGT TGT       385Cys Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys110                 115                 120                 125CGG ACC AAT TTG TGC AAC CAG TAT TTG CAG CCT ACA CTG CCC CCT GTT       433Arg Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Val
            130                 135                 140GTT ATA GGT CCG TTC TTT GAT GGC AGC ATC CGA TGG CTG GTT GTG CTC       481Val Ile Gly Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg Trp Leu Val Val Leu
        145                 150                 155ATT TCC ATG GCT GTC TGT ATA GTT GCT ATG ATC ATC TTC TCC AGC TGC       529Ile Ser Met Ala Val Cys Ile Val Ala Met Ile Ile Phe Ser Ser Cys
    160                 165                 170TTT TGC TAT AAG CAT TAT TGT AAG AGT ATC TCA AGC AGG GGT CGT TAC       577Phe Cys Tyr Lys His Tyr Cys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Tyr
175                 180                 185AAC CGT GAT TTG GAA CAG GAT GAA GCA TTT ATT CCA GTA GGA GAA TCA       625Asn Arg Asp Leu Glu Gln Asp Glu Ala Phe Ile Pro Val Gly Glu Ser190                 195                 200                 205TTG AAA GAC CTG ATT GAC CAG TCC CAA AGC TCT GGG AGT GGA TCT GGA       673Leu Lys Asp Leu Ile Asp Gln Ser Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly
            210                 215                 220TTG CCT TTA TTG GTT CAG CGA ACT ATT GCC AAA CAG ATT CAG ATG GTT       721Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Lys Gln Ile Gln Met Val
        225                 230                 235CGG CAG GTT GGT AAA GGC CGC TAT GGA GAA GTA TGG ATG GGT AAA TGG       769Arg Gln Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp
    240                 245                 250CGT GGT GAA AAA GTG GCT GTC AAA GTG TTT TTT ACC ACT GAA GAA GCT       817Arg Gly Glu Lys Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala
255                 260                 265AGC TGG TTT AGA GAA ACA GAA ATC TAC CAG ACG GTG TTA ATG CGT CAT       865Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Thr Val Leu Met Arg His270                 275                 280                 285GAA AAT ATA CTT GGT TTT ATA GCT GCA GAC ATT AAA GGC ACT GGT TCC       913Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly Ser
            290                 295                 300TGG ACT CAG CTG TAT TTG ATT ACT GAT TAC CAT GAA AAT GGA TCT CTC       961Trp Thr Gln Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu
        305                 310                 315TAT GAC TTC CTG AAA TGT GCC ACA CTA GAC ACC AGA GCC CTA CTC AAG      1009Tyr Asp Phe Leu Lys Cys Ala Thr Leu Asp Thr Arg Ala Leu Leu Lys
    320                 325                 330TTA GCT TAT TCT GCT GCT TGT GGT CTG TGC CAC CTC CAC ACA GAA ATT      1057Leu Ala Tyr Ser Ala Ala Cys Gly Leu Cys His Leu His Thr Glu Ile
335                 340                 345TAT GGT ACC CAA GGG AAG CCT GCA ATT GCT CAT CGA GAC CTG AAG AGC      1105Tyr Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser350                 355                 360                 365AAA AAC ATC CTT ATT AAG AAA AAT GGA AGT TGC TGT ATT GCT GAC CTG      1153Lys Asn Ile Leu Ile Lys Lys Asn Gly Ser Cys Cys Ile Ala Asp Leu
            370                 375                 380GGC CTA GCT GTT AAA TTC AAC AGT GAT ACA AAT GAA GTT GAC ATA CCC      1201Gly Leu Ala Val Lys Phe Asn Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro
        385                 390                 395TTG AAT ACC AGG GTG GGC ACC AAG CGG TAC ATG GCT CCA GAA GTG CTG      1249Leu Asn Thr Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu
    400                 405                 410GAT GAA AGC CTG AAT AAA AAC CAT TTC CAG CCC TAC ATC ATG GCT GAC      1297Asp Glu Ser Leu Asn Lys Asn His Phe Gln Pro Tyr Ile Met Ala Asp
415                 420                 425ATC TAT AGC TTT GGT TTG ATC ATT TGG GAA ATG GCT CGT CGT TGT ATT       1345Ile Tyr Ser Phe Gly Leu Ile Ile Trp Glu Met Ala Arg Arg Cys Ile430                 435                 440                 445ACA GGA GGA ATC GTG GAG GAA TAT CAA TTA CCA TAT TAC AAC ATG GTG       1393Thr Gly Gly Ile Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Met Val
            450                 455                 460CCC AGT GAC CCA TCC TAT GAG GAC ATG CGT GAG GTT GTG TGT GTG AAA       1441Pro Ser Asp Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Val Val Cys Val Lys
        465                 470                 475CGC TTG CGG CCA ATC GTG TCT AAC CGC TGG AAC AGC GAT GAA TGT CTT       1489Arg Leu Arg Pro Ile Val Ser Asn Arg Trp Asn Ser Asp Glu Cys Leu
    480                 485                 490CGA GCA GTT TTG AAG CTA ATG TCA GAA TGT TGG GCC CAT AAT CCA GCC       1537Arg Ala Val Leu Lys Leu Met Ser Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala
495                 500                 505TCC AGA CTC ACA GCT TTG AGA ATC AAG AAG ACA CTT GCA AAA ATG GTT       1585Ser Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Val510                 515                 520                 525GAA TCC CAG GAT GTA AAG ATT TGACAATTAA ACAATTTTGA GGGAGAATTT          1636Glu Ser Gln Asp Val Lys Ile
            530AGACTGCAAG  AACTTCTTCA  CCCAAGGAAT  GGGTGGGATT  AGCATGGAAT  AGGATGTTGA         1696CTTGGTTTCC  AGACTCCTTC  CTCTACATCT  TCACAGGCTG  CTAACAGTAA  ACCTTACCGC         1756ACTCTACAGA  ATACAAGATT  GGAACTTGGA  ACTTGGAACT  TCAAACATGT  CATTCTTTAT         1816ATATGGACAG  CTGTGTTTTA  AATGTGGGGT  TTTTGTGTTT  TGCTTTCTTT  GTTTTGTTTT         1876GGTTTTGATG  CTTTTTTGGT  TTTTATGAAC  TGCATCAAGA  CTCCAATCCT  GATAAGAAGT         1936CTCTGGTCAA  CCTCTGGGTA  CTCACTATCC  TGTCCATAAA  GTGGTGCTTT  CTGTGAAAGC         1996CTTAAGAAAA  TTAATGAGCT  CAGCAGAGAT  GGAAAAAGGC  ATATTTGGCT  TCTACCAGAG         2056AAAACATCTG  TCTGTGTTCT  GTCTTTGTAA  ACAGCCTATA  GATTATGATC  TCTTTGGGAT         2116ACTGCCTGGC  TTATGATGGT  GCACCATACC  TTTGATATAC  ATACCAGAAT  TCTCTCCTGC         2176CCTAGGGCTA  AGAAGACAAG  AATGTAGAGG  TTGCACAGGA  GGTATTTTGT  GACCAGTGGT         2236TTAAATTGCA  ATATCTAGTT  GGCAATCGCC  AATTTCATAA  AAGCCATCCA  CCTTGTAGCT         2296GTAGTAACTT  CTCCACTGAC  TTTATTTTTA  GCATAATAGT  TGTGAAGGCC  AAACTCCATG         2356TAAAGTGTCC  ATAGACTTGG  ACTGTTTTCC  CCCAGCTCTG  ATTACC                                           2402(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：
(A)长度：532氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Met Thr Gln Leu Tyr Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Cys Leu Phe1               5                  10                  15Ile Ile Ser His Val Gln Gly Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly
         20                  25                  30Thr Gly Met Lys Ser Asp Leu Asp Gln Lys Lys Pro Glu Asn Gly Val
     35                  40                  45Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser
 50                  55                  60Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn Gly 65                  70                  75                  80His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr Thr Leu
             85                  90                  95Thr Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys Lys Asp
        100                 105                 110Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr Asn
    115                 120                 125Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Val Val Ile Gly
130                 135                 140Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg Trp Leu Val Val Leu Ile Ser Met145                 150                 155                 160Ala Val Cys Ile Val Ala Met Ile Ile Phe Ser Ser Cys Phe Cys Tyr
            165                 170                 175Lys His Tyr Cys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Tyr Asn Arg Asp
        180                 185                 190Leu Glu Gln Asp Glu Ala Phe Ile Pro Val Gly Glu Ser Leu Lys Asp
    195                 200                 205Leu Ile Asp Gln Ser Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu
210                 215                 220Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Lys Gln Ile Gln Met Val Arg Gln Val225                 230                 235                 240Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg Gly Glu
            245                 250                 255Lys Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser Trp Phe
        260                 265                 270Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Thr Val Leu Met Arg His Glu Asn Ile
    275                 280                 285Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly Ser Trp Thr Gln
290                 295                 300Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Asp Phe305                 310                 315                 320Leu Lys Cys Ala Thr Leu Asp Thr Arg Ala Leu Leu Lys Leu Ala Tyr
            325                 330                 335Ser Ala Ala Cys Gly Leu Cys His Leu His Thr Glu Ile Tyr Gly Thr
        340                 345                 350Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn Ile
    355                 360                 365Leu Ile Lys Lys Asn Gly Ser Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala
370                 375                 380Val Lys Phe Asn Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro Leu Asn Thr385                 390                 395                 400Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp Glu Ser
            405                 410                 415Leu Asn Lys Asn His Phe Gln Pro Tyr Ile Met Ala Asp Ile Tyr Ser
        420                 425                 430Phe Gly Leu Ile Ile Trp Glu Met Ala Arg Arg Cys Ile Thr Gly Gly
    435                 440                 445Ile Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Met Val Pro Ser Asp
450                 455                 460Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Val Val Cys Val Lys Arg Leu Arg465                 470                 475                 480Pro Ile Val Ser Asn Arg Trp Asn Ser Asp Glu Cys Leu Arg Ala Val
            485                 490                 495Leu Lys Leu Met Ser Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser Arg Leu
        500                 505                 510Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Val Glu Ser Gln
    515                 520                 525Asp Val Lys Ile
530(2)SEQ ID NO.：13的信息：(i)序列特征：
(A)长度：2252碱基对
(B)类型：核酸
(C)股性：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/分类符号：CDS
(B)位置：355..1863(xi)序列描述：SEQ ID NO.：13：GTTTTCCAGC  AGACTGATGC  TATAAATGCT  CCACAACATG  GAGAATGGTT  TGGGTTGGAA             60GTAGACTTAA  AGACCATCTA  TGTGTGGGGA  TACCTCCCAC  TAGATCAGGC  TGCTCAGGGC            120CCCATTCACC  ACCTCCAGGG  ACGGGGTAGC  CACTGCTTCT  CTGAGCAACC  TGAGCAACTT            180CCTCACAGTG  AAGAGTTCCT  CCTGTATCCG  AGGGTGGAGT  TCATTTCTTT  TGTCCTTGGA            240AGTTGAATAG  CAGAAAGGGA  CATTTCAGCT  TTTCTTGATA  AAGGTTACAT  CCATTTTACT            300TAGACTACAA  GACGAAGATT  TCTGAAAATT  GAGATCTTTA  GTTTTCTGGA  CAAG  ATG             357
                                                              Met
                                                                1CCC TTG CTT AGC TCC AGC AAG TTG AGC ATG GAG AGC AGA AAA GAA GAT       405Pro Leu Leu Ser Ser Ser Lys Leu Ser Met Glu Ser Arg Lys Glu Asp
          5                  10                  15AGT GAG GGC ACA GCA CCT GCC CCT CCA CAG AAG AAG CTG TCA TGT CAG       453Ser Glu Gly Thr Ala Pro Ala Pro Pro Gln Lys Lys Leu Ser Cys Gln
     20                  25                  30TGC CAC CAC CAT TGT CCT GAG GAC TCA GTC AAC AGC ACC TGC AGC ACT       501Cys His His His Cys Pro Glu Asp Ser Val Asn Ser Thr Cys Ser Thr
 35                  40                  45GAT GGC TAC TGC TTC ACC ATA ATA GAA GAA GAT GAT TCT GGT GGA CAT       549Asp Gly Tyr Cys Phe Thr Ile Ile Glu Glu Asp Asp Ser Gly Gly His50                  55                  60                  65TTG GTC ACC AAA GGA TGT CTA GGA TTA GAG GGC TCG GAC TTC CAG TGT       597Leu Val Thr Lys Gly Cys Leu Gly Leu Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys
             70                  75                  80CGG GAC ACT CCT ATT CCA CAC CAA AGA AGA TCT ATT GAA TGC TGC ACA       645Arg Asp Thr Pro Ile Pro His Gln Arg Arg Ser Ile Glu Cys Cys Thr
         85                  90                  95GGC CAA GAT TAC TGT AAC AAA CAT CTT CAC CCA ACG CTG CCA CCA CTG       693Gly Gln Asp Tyr Cys Asn Lys His Leu His Pro Thr Leu Pro Pro Leu
    100                 105                 110AAA AAT CGA GAC TTT GCT GAA GGA AAC ATT CAC CAT AAG GCC CTG CTG       741Lys Ash Arg Asp Phe Ala Glu Gly Asn Ile His His Lys Ala Leu Leu
115                 120                 125ATC TCG GTG ACT GTC TGT AGT ATA CTA CTG GTG CTT ATC ATC ATA TTC       789Ile Ser Val Thr Val Cys Ser Ile Leu Leu Val Leu Ile Ile Ile Phe130                 135                 140                 145TGC TAC TTC AGG TAC AAG CGG CAA GAA GCC AGG CCC CGC TAC AGC ATC       837Cys Tyr Phe Arg Tyr Lys Arg Gln Glu Ala Arg Pro Arg Tyr Ser Ile
            150                 155                 160GGG CTG GAG CAG GAC GAG ACC TAC ATT CCC CCT GGA GAA TCC CTG AAG       885Gly Leu Glu Gln Asp Glu Thr Tyr Ile Pro Pro Gly Glu Ser Leu Lys
        165                 170                 175GAT CTG ATC GAG CAG TCC CAG AGC TCA GGC AGC GGC TCC GGG CTC CCT       933Asp Leu Ile Glu Gln Ser Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro
    180                 185                 190CTC CTG GTT CAA AGG ACC ATA GCA AAA CAG ATT CAG ATG GTA AAA CAG       981Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Lys Gln Ile Gln Met Val Lys Gln
195                 200                 205ATT GGA AAA GGT CGC TAT GGG GAA GTC TGG ATG GGA AAG TGG CGT GGC      1029Ile Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg Gly210                 215                 220                 225GAA AAG GTA GCT GTC AAA GTG TTT TTT ACC ACG GAG GAG GCC AGC TGG      1077Glu Lys Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser Trp
            230                 235                 240TTC AGA GAA ACA GAA ATC TAC CAA ACT GTC CTG ATG AGG CAT GAA AAT      1125Phe Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Thr Val Leu Met Arg His Glu Ash
        245                 250                 255ATT CTC GGA TTC ATT GCG GCA GAC ATT AAA GGC ACA GGC TCT TGG ACC      1173Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly Ser Trp Thr
    260                 265                 270CAA CTG TAT CTC ATC ACT GAC TAT CAT GAG AAT GGC TCC CTT TAC GAT      1221Gln Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Asp
275                 280                 285TAC CTA AAA TCC ACC ACC CTG GAC ACA AAA GGC ATG CTA AAA TTG GCT      1269Tyr Leu Lys Ser Thr Thr Leu Asp Thr Lys Gly Met Leu Lys Leu Ala290                 295                 300                 305TAC TCC TCT GTT AGT GGC TTG TGC CAC CTA CAT ACA GGG ATC TTC AGT      1317Tyr Ser Ser Val Ser Gly Leu Cys His Leu His Thr Gly Ile Phe Ser
            310                 315                 320ACC CAA GGC AAA CCG GCT ATT GCC CAC CGT GAT CTA AAA AGT AAG AAC      1365Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn
        325                 330                 335ATC CTG GTG AAA AAG AAC GGA ACC TGC TGT ATA GCA GAT TTG GGC TTG      1413Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu
    340                 345                 350GCT GTT AAA TTT ATT AGT GAT ACA AAT GAG GTA GAC ATC CCT CCA AAC      1461Ala Val Lys Phe Ile Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro Pro Asn
355                 360                 365ACC CGC GTA GGA ACA AAA CGC TAT ATG CCT CCT GAG GTG CTG GAT GAA      1509Thr Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Pro Pro Glu Val Leu Asp Glu370                 375                 380                 385AGC TTG AAC AGA AAT CAC TTT CAG TCG TAC ATC ATG GCT GAT ATG TAC      1557Ser Leu Asn Arg Asn His Phe Gln Ser Tyr Ile Met Ala Asp Met Tyr
            390                 395                 400AGC TTT GGA CTC ATC CTT TGG GAG ATA GCC AGG AGA TGT GTG TCA GGA      1605Ser Phe Gly Leu Ile Leu Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Val Ser Gly
        405                 410                 415GGA ATA GTG GAA GAA TAC CAG CTC CCA TAT CAC GAC CTT GTC CCC AGT      1653Gly Ile Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr His Asp Leu Val Pro Ser
    420                 425                 430GAC CCC TCC TAC GAG GAC ATG AGG GAG ATT GTG TGC ATC AAA AGG CTA      1701Asp Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Ile Val Cys Ile Lys Arg Leu
435                 440                 445CGT CCT TCA TTC CCC AAC AGA TGG AGC AGC GAT GAG TGC CTG CGG CAG      1749Arg Pro Ser Phe Pro Asn Arg Trp Ser Ser Asp Glu Cys Leu Arg Gln450                 455                 460                 465ATG GGG AAG CTC ATG ATG GAG TGC TGG GCC CAT AAC CCT GCA TCC CGG      1797Met Gly Lys Leu Met Met Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser Arg
            470                 475                 480CTC ACA GCC CTA CGA GTC AAA AAA ACA CTT GCC AAA ATG TCA GAG TCG      1845Leu Thr Ala Leu Arg Val Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Ser Glu Ser
        485                 490                 495CAG GAC ATT AAG CTC TGATGGAGCA AAAACAGCTC CTTCTCGTGA AGACCCATGG      1900Gln Asp Ile Lys Leu
    500AAACAGACTT  TCTCTTGCAG  GCAGAAGTCA  TGGAGAGGTG  CTGATAAGTA  CCCTGAGTGC         1960AGTCATATTT  AAGAGCAACT  GTTTGTTTGA  CAGCTTTGAG  GAGACTGTTC  TTGGCAAAAT         2020CAGCTGAATT  TTGGCATGCA  AGGTTGGGAG  AGGCTTATCT  GCCCTTGTTT  ACACAGGGAT         2080ATACAGTTTT  AGTAACTGGT  TTAAGGTTAT  GCATGTTGCT  TTCCGTGAAA  GCCACTTATT         2140ATTTTATTAT  TATTGTTATT  ATTATTATTT  TGATTGTTTT  AAAAGATACT  GCTTTAAATT         2200TTATGAAAAT  AAAACCCTTT  GGTTAGAAGA  AAAAAAGATG  TATATTGTTA  CA                           2252(2)SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征：
(A)长度：502氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Met Pro Leu Leu Ser Ser Ser Lys Leu Ser Met Glu Ser Arg Lys Glu1               5                  10                  15Asp Ser Glu Gly Thr Ala Pro Ala Pro Pro Gln Lys Lys Leu Ser Cys
         20                  25                  30Gln Cys His His His Cys Pro Glu Asp Ser Val Ash Ser Thr Cys Ser
     35                  40                  45Thr Asp Gly Tyr Cys Phe Thr Ile Ile Glu Glu Asp Asp Ser Gly Gly
 50                  55                  60His Leu Val Thr Lys Gly Cys Leu Gly Leu Glu Gly Ser Asp Phe Gln65                  70                  75                  80Cys Arg Asp Thr Pro Ile Pro His Gln Arg Arg Ser Ile Glu Cys Cys
             85                  90                  95Thr Gly Gln Asp Tyr Cys Asn Lys His Leu His Pro Thr Leu Pro Pro
        100                 105                 110Leu Lys Asn Arg Asp Phe Ala Glu Gly Asn Ile His His Lys Ala Leu
    115                 120                 125Leu Ile Ser Val Thr Val Cys Ser Ile Leu Leu Val Leu Ile Ile Ile
130                 135                 140Phe Cys Tyr Phe Arg Tyr Lys Arg Gln Glu Ala Arg Pro Arg Tyr Ser145                 150                 155                 160Ile Gly Leu Glu Gln Asp Glu Thr Tyr Ile Pro Pro Gly Glu Ser Leu
            165                 170                 175LysAsp Leu Ile Glu Gln Ser Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu
       180                 185                 190Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Lys Gln Ile Gln Met Val Lys
    195                 200                 205Gln Ile Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg
210                 215                 220Gly Glu Lys Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser225                 230                 235                 240Trp Phe Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Thr Val Leu Met Arg His Glu
            245                 250                 255Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly Ser Trp
        260                 265                 270Thr Gln Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu Tyr
    275                 280                 285Asp Tyr Leu Lys Ser Thr Thr Leu Asp Thr Lys Gly Met Leu Lys Leu
290                 295                 300Ala Tyr Ser Ser Val Ser Gly Leu Cys His Leu His Thr Gly Ile Phe305                 310                 315                 320Ser Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys
            325                 330                 335Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly
        340                 345                 350Leu Ala Val Lys Phe Ile Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro Pro
    355                 360                 365Asn Thr Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Pro Pro Glu Val Leu Asp
370                 375                 380Glu Ser Leu Asn Arg Asn His Phe Gln Ser Tyr Ile Met Ala Asp Met385                 390                 395                 400Tyr Ser Phe Gly Leu Ile Leu Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Val Ser
            405                 410                 415Gly Gly Ile Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr His Asp Leu Val Pro
        420                 425                 430Ser Asp Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Ile Val Cys Ile Lys Arg
    435                 440                 445Leu Arg Pro Ser Phe Pro Asn Arg Trp Ser Ser Asp Glu Cys Leu Arg
450                 455                 460Gln Met Gly Lys Leu Met Met Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser465                 470                 475                 480Arg Leu Thr Ala Leu Arg Val Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Ser Glu
            485                 490                 495Ser Gln Asp Ile Lys Leu
        500

Claims (14)

1.一种分离的、具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段；具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段；具有SEQ ID NO：8氨基酸序列的BMP受体激酶蛋白或其可溶性片段。
2.分离的、编码如权利要求1所述的BMP受体激酶蛋白的DNA序列。
3.如权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，该DNA序列是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7。
4.如权利要求1所述的可溶性片段，其特征在于，该可溶性片段具有SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
5.编码如权利要求4所述的可溶性片段的DNA序列。
6.如权利要求5所述的DNA序列，其特征在于，该DNA序列是SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9。
7.含有权利要求2、3、5或6所述的DNA序列的重组表达载体。
8.如权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于，该载体是具有ATCC NO：69676中所含的pJT4-hBRK3T的所有鉴别特征的质粒，或是具有ATCC NO：69695中所含的pJT6-mBRK-3L的所有鉴别特征的质粒。
9.含有权利要求7或8所述的重组表达载体的宿主细胞，特征在于，该宿主细胞优选是哺乳动物细胞，更佳是中国仓鼠卵巢细胞或COS细胞。
10.一种产生截短的BMP受体激酶蛋白的方法，其特征在于，它包括：在允许表达截短的BMP受体激酶蛋白的方式下培养权利要求9所述的宿主细胞，和分离BMP受体激酶蛋白。
11.一种确定某化合物是否能与BMP受体激酶蛋白结合的方法，其特征在于，该方法包括：将含有该化合物的样品与BMP受体激酶蛋白接触，并让化合物与BMP受体激酶蛋白结合，其中BMP受体激酶蛋白具有氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：2或其可溶性片段；
(b)SEQ ID NO：4或其可溶性片段；或
(c)SEQ ID NO：8或其可溶性片段。
12.一种针对BMP II型受体激酶蛋白的抗体，其特征在于，BMP II型受体激酶蛋白选自：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10。
13.一种评估某测试化合物能否作为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的BMP II型受体激酶蛋白或其功能修饰形式的转录促效剂的方法，其特征在于，该方法包括：
(a)培养含有下列组份的细胞：
(i)编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8、或其功能修饰形式的DNA，和
(ii)编码可操作地连于报道基因的激素应答元件的DNA，
其中，培养是在存在至少一种测试化合物下进行，而该测试化合物对编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的DNA的转录活性的诱导能力是待确定的，以及随后
(b)监测细胞表达报道基因的情况。
14.一种评估某测试化合物能否作为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的BMP II型受体激酶蛋白或其功能修饰形式的转录拮抗剂的方法，其特征在于，该方法包括：
(a)培养含有下列组份的细胞：
(i)编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的BMP II型受体激酶蛋白、或其功能修饰形式的DNA，和
(ii)编码可操作地连于报道基因的激素应答元件的DNA，
其中，培养是在存在固定浓度的至少一种SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8的BMP II型受体激酶蛋白、或其功能修饰形式的转录促效剂和浓度逐渐增加的至少一种测试化合物下进行，而该测试化合物对编码SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：8的DNA的转录活性的抑制能力是待确定的，以及随后
(b)监测细胞中作为测试化合物浓度的函数的报道基因产物的表达水平，从而表明测试化合物抑制转录活性的能力。
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