CN1955715A

CN1955715A - 配体－受体示踪测定法

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Publication number: CN1955715A
Application number: CNA2005101169380A
Authority: CN
Inventors: C·阿普费尔; T·恩德勒; S·J·佐夫曼; M·莫塞尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2004-10-25
Filing date: 2005-10-25
Publication date: 2007-05-02
Also published as: SG122043A1; CA2521142A1; US20060105393A1; JP2006115843A

Abstract

本发明提供基于图像的筛选化合物的方法，该方法基于测量荧光标记的配体的内化。本发明进一步提供了用于高内涵筛选化合物的多位方法，其中测量至少一个细胞参数。

Description

配体-受体示踪测定法

高内涵筛选最近作为一种与高通量筛选兼容的新方法出现在药物研发中。高内涵筛选是一种设计用于阐释活细胞内基因、蛋白及其它细胞组分的时间和空间活性的技术平台。

用于高内涵筛选的读出装置中一个重要组件是显微镜，该显微镜适于获得微量滴定板中样品的图像。该读出装置装备有提供自动图像获取和分析的软件。分析可以基于发光和/或视明场图像。

一种令人感兴趣的用于药物筛选的活性是激动剂诱导的配体-受体复合物的内化。通过融合至绿色荧光蛋白(GFP)的PTH(甲状旁腺素)受体的成像，已经显示了PTH-受体的激动剂诱导的内化和循环(Conway等，2001年，J.Cell.Physiol.189期，341-355页)。Schlag等描述了5HT2c-GFP的内化，其中用ArrayScan读出装置在一种细胞系中检测了内化作用。使用一种不同的检测法即FLIPR(Schlag等，2004年，J.Pharmacol.Exp.Ther.310，865-870)单独检测了Ca²⁺流通量。Gao等描述了GFP标记的MC4受体内化的人工定量，但该方法不适于大规模筛选目的(Gao等，2003年，J.Pharmacol.Exp.Ther.307，870-877)。Giuliano等公开了在同一单细胞群内的多参数高内涵筛选。该参考文献没有公开配体示踪或配体与多于一种细胞类型复合时的情形(Giuliano等，2003年，Assay Drug Dev.Technol.1(4)，565-577)。

本发明提供了用于高内涵筛选化合物的多位方法(multiplex method)。多位方法描述的是需要多于一个独立的参数用于读出信息的方法。通过高内涵筛选，基于图像的分析直接将某个测定的光学信号赋予单独的被鉴定细胞。这使得多位方法可用于表达不同受体的单种细胞内的多个事件，以及可用于表达不同受体的多种细胞内的多个事件。在一个实施方案中，提供了用于异种细胞混合物中的多个事件的多位方法，其中亚群可以有不同反应并能够通过光学方法辨别。在另一实施方案中，提供了用于细胞亚群中多个事件的多位方法，这些细胞亚群可以有不同反应，由此能够将亚群相互区分开来。

本发明方法因而使得可通过测量化合物对多细胞群中的多细胞参数的影响来筛选化合物。

因此，在本发明的多位方法中，表达至少一种靶标受体的至少一种单细胞或至少一种细胞亚群或异种细胞群的至少一种细胞参数在化合物存在或不存在时得以通过光学测量。在此方法中，可以使用细胞系、稳定或瞬时转染的细胞或原代细胞培养物，它们表达一种或多种靶标受体。优选地，至少两种细胞参数得以测量。更优选的，至少三种细胞参数得以测量。在另一优选的实施方案中，至少四种不同的参数得以测量。

术语“光学测量的”和“测量的”可理解为光学信号的定量测定。

对于上面描述的方法，优选所述参数在至少两种表达不同靶标受体的单细胞中或在至少两种表达不同靶标受体的不同细胞亚群中测量。所述参数也可在至少三种表达不同靶标受体的单细胞中或在至少三种表达不同靶标受体的不同细胞亚群中测量。

这里描述的方法中的任意一种靶标受体可以是任意类型的通过激动剂刺激后发生内化的受体。优选地，所述靶标受体是G-蛋白偶联受体(GPCR)。更优选地，所述受体选自生长抑素受体5(SSTR-5)(Seq IDNo.1)、生长激素促分泌素受体1a(GHSR-1a)(Seq ID No.2)、加压素-1b受体(Seq ID No.3)或神经激肽3受体(NK3R)(Seq ID No.4)。这里公开的方法中所用的细胞可以是天然表达靶标受体的细胞或是用靶标受体稳定或瞬时转染的细胞。

在另一优选的实施方案中，使用表达至少两种靶标受体之一的细胞的混合物。在一个更优选的实施方案中，通过多位方法分析细胞亚群。细胞亚群可以由一种或多种细胞组成。在另一优选实施方案中，细胞亚群可以例如通过它们在单孔中的位置或通过表达不同染料或用不同染料染色来区分。在进一步更优选的实施方案中，使用瞬时转染的细胞或最优选地使用稳定转染的细胞。细胞亚群由单种细胞或多于一种细胞组成。

细胞参数可以是任意的能通过光学检测的细胞参数。作为非限定性实例，这些参数可以是：

细胞亚群或单种细胞的位置，为此细胞可以独立地用荧光或非荧光染料标记，包括用荧光蛋白(例如GFP或本领域已知的其它荧光蛋白)转染；细胞中Ca²⁺流通量；受标记蛋白从一个细胞区室转运到另一细胞区室，其中所述的标记可以通过光学检测；蛋白的降解；使用报告基因检测基因表达；细胞凋亡的检测；受体或配体的内化或诱导内化至细胞内的小分子激动剂。

本发明公开了经优化用于在细胞水平上进行药物筛选的高内涵配体-受体示踪方法。本方法基于受标记配体和/或受体的局部浓度及其亚细胞定位的基于图像的示踪。本发明使得受体-配体示踪与其它细胞参数相关成为可能，这可通过多位方法达到。优选地，配体-受体内化通过本方法得以示踪。

受体脱敏作用是一种使得细胞能调控对细胞外激动剂的刺激产生反应的机制。脱敏作用对于调控细胞对细胞外刺激的敏感性是重要的，因为脱敏作用使得诱导的受体活性能快速衰减，从而使细胞准备好接受随后的相似或不同激动剂的刺激，所述的这些刺激使用相同的细胞信号传导途径。脱敏的第二种重要功能是通过连续的暴露于激动剂下来调节敏感性。对于GPCRs，信号的衰减涉及细胞内结构域的磷酸化作用，然后是受体蛋白从细胞表面的物理性移除。受体的内化发生时自细胞外膜形成小泡，小泡含有嵌入膜内的磷酸化受体和位于小泡内腔的配体。随后，受体可以在溶酶体中降解或复敏并循环回细胞表面。

筛选影响受体内化的化合物的检测法可以鉴别具有不同药学性质的受体配体，该检测法成为经典的竞争性结合检测法的竞争者。此外，靶向内化机制其它步骤的化合物也能在配体-受体示踪检测法中得以检测。

配体或受体的内化通过内化的定量成像和累加由可在细胞内区室中通过光学测量的标记提供的信号而示踪，并且这种内化能与在相同细胞中平行测量的其它细胞参数相关联。该方法优于现有技术中的配体示踪方法如由Nouel等，1997年，Endocrinology 138期，296-306页；或Rocheville等，2000年，J.Bio.Chem.275期，7862-7869所描述的方法。特别地，使用基于图像的检测才能获得足够强以进行多位方法的药物筛选包括配体受体示踪的信号。即使，在受标记的激动剂的情况下，当诱导内化时内化的激动剂最终被降解或从受体上解离，该激动剂也将在细胞内区室中保持聚集足够长的时间而得以直接测量，所测得的激动剂的数量与细胞表面存在的受体数量成比例。

因而，在本发明的一个优选实施方案中，至少两个所测细胞参数中的至少一个是受体-配体内化，其中所述受体-配体内化可以通过光学检测受标记的配体或受标记的受体得以示踪。

在本发明的该实施方案中，提供了诱导靶标受体内化的靶标受体的激动剂。受体-配体内化可以通过示踪受标记配体(激动剂)或通过示踪受标记的靶标受体得以检测，其中所述的标记可以通过光学检测。标记可以共价地或非共价地连接至配体或靶标受体上，并且光学检测可以是直接的或间接的。在一个优选的实施方案中，标记物是发光团。所述受标记的受体不是荧光蛋白如GFP与之融合的受体也是优选的。

标记物可以包括发光团，优选融合至配体上的荧光蛋白如GFP的荧光团，所述标记物共价地结合至靶标受体或配体上。备选地，标记物也可以是结合至所述靶标受体上而不诱导活化的抗体。所述抗体因而可以通过与它们连接的标记物得以示踪。这类标记物可以是任何能在活的或经固定细胞中能直接或间接通过光学检测的标记物。Adie等公开了内化的GPCRs的示踪，其能与融合有标记物的特定抗体结合，在所述抗体上连接有pH敏感的能用光学检测的标记物(Adie等，2003年，Assay Drug Dev.Technol.第1期，251-259页)。其它的标记包括生物素-链霉抗生物素体系或任意其它体系，在所述其它体系中，发光团或更优选地荧光团结合在一种这样的试剂上，所述试剂能以非共价的方式结合至配体或激动剂或受体上或结合至融合或连接在它们上的标记物上。合适的检测体系也包括镧系螯合物检测体系。在优选的本发明实施方案中，示踪用荧光团标记的配体。然后将这种荧光团标记的配体在存在或不存在所述化合物时与表达靶标受体的细胞孵育。如上文描述，所述细胞可以是表达一种或多种靶标受体的细胞系或原代细胞培养物。在一个优选的实施方案中，使用表达至少两种靶标受体任意之一的细胞混合物。在更优选的实施方案中，通过多位方法分析表达至少一种靶标受体的细胞亚群。在另一优选的实施方案中，所述的细胞亚群可以例如通过它们在单个板孔中的位置区分。在最优选的实施方案中，通过本发明的多位方法分析单种细胞。

受体激动剂可以是先前被鉴定作为给定靶标受体的激动剂并诱导受体内化的小分子，或是天然配体，优选肽或蛋白，或是它们的能作为激动剂并介导受体内化的片段。术语“激动剂”和“配体”可相互交换使用并且两者都包括天然配体、这类配体的片段、抗体以及能刺激受体和配体/激动剂内化的小分子。本发明的激动剂也包括对抗靶标受体的经标记抗体，该抗体诱导受体-激动剂复合物的内化。优选的实施方案是生长抑素，更优选地是生长抑素-14(Seq ID No.5)；生长激素释放激素(ghrelin)(Seq IDNo.6)，更优选地是截短形式的生长激素释放激素(Seq ID No.10)；加压素(Seq ID No.7)；或神经激肽3(Seq ID No.8)；

将用荧光团标记的激动剂与表达靶标受体的细胞孵育，该激动剂诱导激动剂-受体复合物的内化。然后将细胞固定并通过使用合适的具有受体内化算法(Receptor Internalization algorithm)的荧光成像硬件和软件如ArrayScan 4.0(Cellomics公司)定量荧光强度来测量内化的激动剂。在下面描述的实施例中，所用的软件能确定较亮目标例如细胞核(如用特异性荧光染料如Hoechst 33258染色的细胞核)或斑点(如代表包含荧光激动剂的小泡的斑点的位置、大小、形状以及强度)。因而，可将荧光激动剂的强度与通过被染色的细胞核测定的细胞数目相互关联。这使得能测定抑制荧光标记的激动剂内化的化合物的剂量反应曲线并因而计算出IC50值。

在存在或不存在所述化合物时孵育的所述细胞中，所述激动剂或配体的内化以及第二个参数(作为非限制性实例，它可以是一种细胞或细胞亚群或多种细胞的位置、Ca²⁺流通量、报告基因的表达或第二种激动剂的内化等)得以测量。

这种方法也可用于进行反向筛选以确定化合物的选择性，优选地在单孔中进行，其中至少两种不同的细胞亚群独立地表达至少两种能结合相同配体的受体。这种检测法的一个可能的非限制性实施方案是表达一种针对特定配体的靶标受体的一种细胞和表达针对相同配体的第二种受体的第二种细胞的使用，其中至少一种所述细胞能通过光学识别如用荧光或非荧光染料(如共表达的GFP)标记，或其中这两种细胞能基于它们的位置得以检测。这使得能区分这两种细胞。用发光团优选地用荧光团标记的配体或受体的内化然后能在两种细胞中通过光学独立地得以检测。拮抗剂对于两种受体的选择性然后可以得以测量并定量，其中所述拮抗剂阻止至少一种受体的内化。其它细胞参数，像例如Ca²⁺流通量，可以通过在本发明的多位方法中平行测量而与内化相互关联。

也可用于进行反向筛选的可能的另一方法是测定化合物的选择性，优选在单孔中进行，其中至少两种不同的细胞亚群独立地表达至少两种能结合不同配体的受体。这种检测法的一个可能的非限制性实施方案是使用表达针对特异性配体的一种靶标受体的一种细胞和表达针对第二种配体的第二种受体的第二种细胞，其中所述细胞能通过光学区分，例如通过不同的细胞大小或细胞亚群之间的其它光学差异，或通过用发光或非发光染料(如共表达的GFP)标记，或其中两种细胞可以基于它们的位置得以鉴别。这使得能区分两种细胞。用发光团优选地用荧光团标记的配体或受体的内化然后能在两种细胞中通过光学独立地检测。

在另一本发明的实施方案中，用可独立地检测的两种不同标记物标记的至少两种不同配体的内化在至少两种不同细胞亚群中于存在或不存在化合物时得以测量，其中所述的这两种不同细胞亚群独立地表达至少两种不同的靶标受体。

上文描述的方法的优选的实施方案中，靶标受体是GPCR。

上文描述的多位方法的优选实施方案中，至少三个细胞参数得以测量。

本发明提供了发光团标记的诱导受体内化的激动剂、发光团标记的受体或发光团标记的针对GPCR的抗体的用途，用于在化合物的多位高内涵筛选中的受体-配体示踪。优选地，所述发光团是荧光团。在一个实施方案中，发光团标记的受体不是荧光蛋白如GFP融合的受体。

附图描述：

图1：

用Cellomics ArrayScan 4.0高内涵筛选读出装置获得的制备在96孔板中的固定的细胞样品图像。物镜10x。滤光片设置(filter setting)1：XF53-TxR，2秒曝光时间(图片A和C)。滤光片设置2：XF53-hoechst，0.1秒曝光时间(图片B和D)。

A：与100nM Atto590-SST14在37℃下孵育30分钟的SSTR-5表达细胞，图像通过滤光片设置1获得。图像B：与A中相同的样品，图像通过滤光片设置2获得。C：与1μM SST14和100nM Atto590-SST14孵育的SSTR-5表达细胞，图像通过滤光片设置1获得。D：与C相同的样品，图像通过滤光片设置2获得。

图2：

剂量反应曲线

每个细胞的ERC(内质网循环区室)强度，检测自与100nM Atto590-SST14及不同量的SST14孵育的SSTR-5细胞样品(对于样品制备，见方法)。分析的图像用如图1说明中描述的相同的光学设置获得。细胞核的数量和ERCs中的强度通过使用受体内化算法(Cellomics公司)，从每孔4张图像得以测定。

图3：

用Cellomics ArrayScan 4.0高内涵筛选读出装置获得的制备在96孔板中的固定的细胞样品图像。物镜20x。滤光片设置1：XF110-Cy5，10秒曝光时间(图片A和C)。滤光片设置2：XF53-hoechst，0.1秒曝光时间(图片B和D)。

图片A：与1nM Atto655-NKB在37℃下孵育30分钟的NK3R表达细胞，图像通过滤光片设置1获得。B：与A相同样品，图像通过滤光片设置2获得。C：与1μM SB222200及1nM Atto655-NKB孵育的NK3R表达细胞，图像通过滤光片设置1获得。D：与C相同的样品，图像通过滤光片设置2获得。

图4：

剂量反应曲线

每个细胞的ERC强度，作为不同量的SB222200的函数测定自与1nMAtto655-NKB孵育的NK3R细胞样品(对于样品制备，见方法)。分析的图像用如图3说明中描述的相同的光学设置获得，并通过使用受体内化算法(Cellomics公司)，从每孔4张图像分析。

图5：

混合的NK3R表达细胞群和SSTR5表达细胞群，它们与1nMAtto655-NKB和100nM Atto590-SST14以及非荧光配体的不同组合在37℃下孵育30分钟。A、B、C：无非荧光配体；D、E、F：1μM SST14；G、H、I：1μM SB222200；J、K、L：1μM SST14和1μM SB222200。

于96孔板制备固定细胞样品，将用不同滤光片设置在CellomicsArrayScan 4.0高内涵筛选读出装置中获得的三张图片重叠。物镜10x。滤光片设置：XF53-TxR，0.8秒曝光时间(A、D、G、J)、XF93-Cy5，10秒曝光时间(B、E、H、K)和XF53-hoechst，0.1秒曝光时间(C、F、I、L)。

图6：

剂量反应曲线

每个细胞的ERC强度，该强度测定自与1nM Atto655-NKB及100nMAtto590-SST14孵育的混合的NK3R细胞和SSTR5细胞样品的图像。左边的Y轴，实心圆：用XF53-hoechst/XF53-TxR滤光片设置获得的图片对的ERC强度/细胞。右边的Y轴，空心圆：用XF93-hoechst/XF93-Cy5滤光片设置获得的同一样品图片对的ERC强度/细胞。上面的图片：作为不同量SB222200的函数的ERC强度，下面的图片：作为不同量SST14函数的ERC强度。图像组通过用受体内化算法(Cellomics公司)，从每孔4张图像分析。

图6显示了该方法如何使得能在同一样品中同时定量用于GPCR内化的两个独立读出信息。

图7：

用Cellomics ArrayScan 4.0高内涵筛选读出装置获得的制备在96孔板中的固定细胞样品图像。物镜20x。滤光片设置1：XF53-TxR，2秒曝光时间(图片A和C)。滤光片设置2：XF53-hoechst，0.1秒曝光时间(图片B和D)。

图片A：与10nM生长激素释放激素(1-19)-德克萨斯红37℃下孵育30分钟的GHSR-1a表达细胞。图像通过滤光片设置1获得。B：与A相同的样品，图像通过滤光片设置2获得。C：与1μM MK0677和10nM生长激素释放激素(1-19)-德克萨斯红孵育的GHSR-1a表达细胞，图像通过滤光片设置1获得。D：与C相同的样品，图像通过滤光片设置2获得。

图8：

剂量反应曲线

测定自与10nM生长激素释放激素(1-19)-德克萨斯红孵育的GHSR-1a细胞样品的每个细胞的ERC强度，其作为不同量的MK0677的函数(对于样品制备，见方法)。用如图7说明中描述的相同的光学设置获得分析的图像，并通过使用受体内化算法(Cellomics公司)，从每孔4张图像分析。

图9：

用Cellomics ArrayScan 4.0高内涵筛选读出装置获得的制备在96孔板中的固定细胞样品图像。物镜20x。滤光片设置1：XF93-TRITC，2秒曝光时间(图片A和C)。滤光片设置2：XF93-hoechst，0.1秒曝光时间(图片B和D)。

图片A：与5nM BO-TMR-加压素37℃下孵育30分钟的V1bR表达细胞，图像通过滤光片设置1获得。B：与A相同的样品，图像通过滤光片设置2获得。C：与100nM Arg-8-加压素及BO-TMR-加压素孵育的V1bR表达细胞，图像通过滤光片设置1获得。D：与C相同的样品，图像通过滤光片设置2获得。

图10：

剂量反应曲线

测定自与5nM BO-TMR-加压素孵育的V1bR细胞样品的每个细胞的ERC强度，其作为不同量的Arg-8-加压素的函数(对于样品制备，见方法)。分析的图像用如图8说明中描述的相同的光学设置获得，并通过使用受体内化算法(Cellomics公司)，从每孔4张图像分析。

实施例：

实施例1：激动剂内化检测法的一般性例子

使用至少一种与荧光团偶联的激动剂。可以额外使用用于细胞核的染料如Hoechst 33258来方便单个细胞的鉴别。下面的方法包括使用Hoechst33258，但它可以用任何其它细胞染料、荧光或非荧光染料来代替。

用于检测法的细胞可以是天然表达靶标受体的细胞，或是用靶标受体瞬时或稳定转染的细胞。

塑料器皿及溶液

检测板 View plate^TM96孔，黑色；Packard目录编号1104-02C，

任选地经多聚-D赖氨酸处理

10xHBSS GIBCO目录号14065-049

Hepes 1M溶液，GIBCO目录号15630-056

BSA 牛血清白蛋白级分V，Sigma，目录号A-3059

Hoechst 33258 Sigma，目录号B-2261(bisbenzimide)，在DMSO中

溶解至10mM。

甲醛 4％，稀释自PBS中的36.5％的贮液。

样品制备

第一天：在实验前24小时接种细胞：用胰蛋白酶/EDTA分离细胞。加入生长培养基并通过用10ml吸管吸移10-20次使细胞悬浮。测量细胞浓度并将细胞悬液稀释至合适的浓度。对于在96孔板中进行的实验，在200μl培养基中以15.000个细胞/每孔接种细胞。将细胞在细胞培养箱中37℃下孵育以使细胞贴在孔上。

第二天：制备I-缓冲液(1xHBSS，20mM Hepes，0.1％BSA，用蒸馏三次的水制备，不调整PH)。制备Hoechst 33258溶液并在37℃下平衡。制备竞争剂溶液及荧光配体溶液并在37℃下平衡5分钟。在下面的刺激期间，孔内温度保持37℃。

将细胞培养基小心吸出。在每个孔中，加入70μl 1.8x Hoechst溶液、用于竞争的具有1％DMSO的10μl荧光团-激动剂/缓冲液及10μl渐增浓度的荧光团-激动剂/缓冲液，或在对照孔中仅加入缓冲液。将混合物在增湿的培养箱中37℃下孵育20-40分钟。

以100μl/每孔37℃下预平衡的I-缓冲液小心而快速地洗涤细胞一次。然后加入100μl/每孔4％甲醛(室温)，并在室温下将板孔孵育15分钟。用150μl PBS/孔替代溶液。

激动剂内化的定量

使用购自Cellomics公司的装备有购自美国佛蒙特州Omega Optical公司的滤光片的ArrayScan 4.0定量激动剂内化。该机器装备有倒置荧光显微镜并使得能自动聚焦到样品上并能从制备于透明底部的96孔板中的样品获得图像。在该读出装置中，整合了用于图像分析的软件，该软件鉴定预先确定的目标类型的定位。

此处用于实施例1到4的分析方法(算法)称为“受体内化(ReceptorInternalization)”。分析基于两个图像，所述图像获取自不同的滤光片设置并用DNA特异性荧光团和受体特异性荧光团染色的样品。从两个图像可确定目标。从第一图像即DNA特异性染色，细胞核的数量、位置、大小及形状得以测定。从第二个图像，由集中的受体特异性荧光团(即所谓的ERCs)组成的目标的位置、大小、形状和强度得以测定。为了分析两个图像，目标的强度、大小和形状的某些限度可以由使用者调整。这使得对于目的目标能选择性地鉴别并定量不同的参数。

关于用于当前实施例的滤光片设置的更多细节，见实验方法的末尾列表。

数据分析

通过使用购自GraphPad Software公司的GraphPad Prism 3.02软件，测定非荧光配体对受体介导的荧光配体的内化的抑制作用的IC50值。

实施例2：使用Atto590-SST14的hSSTR5内化

用于制备96孔板中固定的、双染色的SSTR-5细胞群，及随后用高内涵筛选定量内化的方法。细胞染料：Hoechst 33258(用于细胞核染色)和Atto590-SST14。

用于该检测法的细胞系包括CHO细胞，该细胞能稳定表达重组的人生长抑素5(根据Rocheville等，2000年，J.Biol.Chem.第275期，7862-7869页产生)。

作为荧光激动剂，使用荧光团Atto590连接至其N端的生长抑素：Atto590-AGC^*KNFF-D-Trp-KTFTSC^*-COOH(Seq ID No.9)*表示半胱氨酸桥的形成

具有连接在N端上的荧光团Atto590(Atto-tec)的生长抑素-14类似物(Atto590-SS14)通过柏林Biosynthan公司定制合成。

储备溶液

1.8x Hoechst溶液

9μM Hoechst33258

I-缓冲液

9x竞争剂溶液

9x SST14(Bachem目录号H-1490)稀释系列，制备于I-缓冲液中。

通过在I-缓冲液中稀释新鲜制备

9x荧光配体溶液

900nm Atto590-SST14

通过在I-缓冲液中稀释新鲜制备

PBS

如上面和实施例1中描述制备样品，Atto590-SST14用作荧光团激动剂。如实施例1中描述定量配体内化。

图1显示SSTR-5表达细胞的图像，该细胞已经与Atto590-SST14孵育并额外用结合DNA的荧光团Hoechst染料染色。图像用CellomicsArrayScan Reader 4.0获得。

图A表示与Atto590-SST14孵育的细胞，该图用Atto590荧光选择性滤光片设置获得。图B中是同一样品的图像，该图像通过Hoechst选择性滤光片获得，表明细胞核的位置。在两个图像的重叠图中，可看见荧光配体作为点很近地定位于细胞核周围。明显地集中在内质循环区室(ERCs)中。

因为与过量的SST14共孵育(图C和D)阻碍了荧光ERCs的形成，所以Atto590-SST14转位入细胞质区室很大程度上是受体特异性的。

使用高内涵筛选读出装置如ArrayScan 4.0，可以定量在点中集中的荧光强度差异。在本实施例中，应用了受体内化算法(Cellomics公司)。该软件能够确定图像中较亮目标如细胞核及点的位置、大小、形状和强度。基于分别是Hoechst选择性和荧光配体选择性的两个图像，该算法鉴定细胞核的数目并定量位于鉴定的ERCs中的荧光强度。图2介绍了这些如何能用于检测受体竞争性配体的存在。渐增的SST14浓度以剂量依赖的方式减少了由HCS读出装置检测到的内化的Atto590-SST14数量。

计算IC50值。在三个独立的检测中，平均的IC50值测定为70mM+/-20nM(n＝3)，表示受体药理学可以以可重复的方式研究。滤光片设置如表1表示。

实施例3：hNK3R与Atto655-NKR的内化

对于该实施例，使用稳定表达NK3受体的CHO细胞(用NK3受体稳定转染CHO细胞在Gether等，1992年，FEBS Lett，296，241-244中描述)。

使用的细胞染料：Hoechst 33258(用于细胞核染色)

样品的制备和测量如实施例1中进行，并作以下修改：

作为荧光配体，将神经激肽B(NKB)类似物用荧光团Atto655(sAtto-tec，目录号AD 655-4)标记。

荧光NKB类似物具有下式结构：

(Seq ID No.11)

在神经激肽B类似物中，NKB的第7位氨基酸用甲基苯丙氨酸替代并且第1位氨基酸用半胱氨酸替代。Atto655连接至半胱氨酸侧链上。

该肽由柏林Biosynthan公司定制合成。根据以下方法将荧光团Atto655(Atto-tec，目录号AD 655-4)共价连接到半胱氨酸侧链上：

将含巯基肽以终浓度1-10mM溶于9∶1的DMSO∶50mM磷酸盐缓冲液pH6中。滴加入荧光团试剂(10-50mM，在DMSO中新鲜制备)并让混合物室温下反应10分钟。反应进行后用RP-HPLC分析样品。最后通过RP-HPLC分离荧光标记的肽。

通过将少量的样品再注射至HPLC中，发现产物为＞90％的纯度。分子量由质谱测定为1908.8Da。

荧光剂分子量为650Da并且反应基团为马来酰亚胺。荧光团的准确结构未知。根据这些信息计算得到的Atto655-NKB分子量为1909Da。

溶液

9x荧光配体溶液

9nM Atto655-NKB

通过在I-缓冲液中新鲜制备

9x竞争剂溶液

9x稀释系列，在I-缓冲液中制备

通过在I-缓冲液中稀释新鲜制备

检测法如实施例1中描述进行。Atto655-NKB用作荧光团激动剂。如实施例1中描述定量激动剂内化。

为了定量配体内化，使用下列滤光片设置：Omega滤光片，XF93hoechst和XF110 Cy5。

图3显示了NK3R表达细胞的图像，该细胞已经与Atto655-NKB和Hoechst 33258染料孵育。用Cellomics ArrayScan Reader 4.0获得图像。

图A表示与Atto655-NKB孵育的细胞，该图片用Atto655荧光选择性滤光片设置获得。图B中是同一样品的荧光图像，该图像通过Hoechst选择性滤光片获得，表明细胞核的位置。当重叠两个图像时，可清楚地看见荧光配体作为点很近地位于细胞核周围。明显地集中在内质循环区室(ERCs)中。

因为用过量的NK3R非肽拮抗剂SB222200共同孵育(图C和D)阻碍了荧光ERCs的形成，所以Atto655-NKB转位入细胞质区室很大程度上是受体特异性的。在该实施例中受体表达细胞明显地仅构成全部细胞群的小部分(20-30％)。

如实施例1描述，可用高内涵筛选读出装置定量内化的配体量。该实施例阐明即使对于其中仅小量细胞群明显表达NK3受体的细胞样品，内化的配体的定量也可以完成。图4展现了SB222200渐增的浓度如何以剂量依赖的方式减少了由HCS读出装置检测到的内化的Atto655-NKB的量。

在两个独立的检测中，平均的IC50值测定为10nM+/-8nM(N＝2)，表示受体药理学可以以可重复的方式研究。

实施例4：GHSR-1a与生长激素释放激素(1-19)-德克萨斯红的内化

对于该实施例，使用稳定表达GHSR-1a受体的人胚肾(HEK293)细胞。根据本领域熟知的方法(见例如Lindemann等，2005年，Genomics第85期，372-385页；J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，MolecularCloning：a Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约，1989年；Casademunt等，EMBO J.18期(1999年)6050-6061页)产生稳定表达GHSR-1a的细胞。

使用的细胞染料：Hoechst 33258(用于细胞核的染色)

样品的制备及测量如实施例1进行，并做如下修改：

使用用荧光团德克萨斯红(Molecular Probes)标记的截短的生长激素释放激素类似物作为荧光配体。

该荧光生长激素释放激素类似物具有下式结构：

将生长激素释放激素类似物从第19位氨基酸后截除并用半胱氨酸替代第19位氨基酸(见Seq ID No.10)。根据前面描述的方法(见EP 1524274)合成该肽并将德克萨斯红结合至半胱氨酸侧链上。

使用非肽配体MK0677(WO94113696)作为竞争剂。

溶液：

9x荧光配体溶液

90nM生长激素释放激素(1-19)德克萨斯红

通过在I-缓冲液中新鲜制备

9x竞争剂溶液

9x稀释系列，在I-缓冲液中制备

通过在I-缓冲液中稀释新鲜制备

该检测法如实施例1中描述进行。生长激素释放激素(1-19)-德克萨斯红用作荧光团-激动剂。如实施例1中描述定量激动剂内化。

为了定量配体内化，使用以下滤光片设置：

Omega滤光片，XF53 hoechst及XF53 TxR。

图7显示了GHSR-1a表达细胞的图像，该细胞已经与生长激素释放激素(1-19)-德克萨斯红和Hoechst 33258染料孵育。用CellomicsArrayScan Reader 4.0获得图像。

图A表示与生长激素释放激素(1-19)-德克萨斯红孵育的细胞，该图片用德克萨斯红荧光选择性滤光片设置获得。图B中是同一样品的荧光图像，该图像通过Hoechst选择性滤光片获得，表明细胞核的位置。当重叠两个图像时，可清楚地看见荧光配体作为点很近地位于细胞核周围。明显地集中在内质循环区室(ERCs)中。

因为用过量的GHSR-1a非肽拮抗剂MK0677共同孵育(图C和D)阻碍了荧光ERCs的形成，所以生长激素释放激素(1-19)-德克萨斯红转位入细胞质区室很大程度上是受体特异性的。

如实施例1描述，可用高内涵筛选读出装置定量内化的配体量。该实施例阐明即使对于其中仅小量细胞群明显表达GHSR-1a受体的细胞样品，内化的配体的定量也可以完成。图8展现了MK0677渐增的浓度如何以剂量依赖的方式减少了由HCS读出装置检测到的内化的生长激素释放激素(1-19)-德克萨斯红的量。

在两个独立的检测中，平均的IC50值测定为11nM+/-4nM(N＝4)，表示受体药理学可以以可重复的方式研究。

实施例5：hV1bR与BO-TMR-加压素的内化

对于该实施例，使用稳定表达V1b受体的CHO细胞。根据本领域熟知的方法(见例如Lindemann等，2005年，Genomics 85期，372-385页；J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，Molecular Cloning：a LaboratoryMannual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约，1989年；Casademunt等，EMBO J.18期(1999年)6050-6061页)产生稳定表达V1b的细胞。

使用的细胞染料：Hoechst 33258(用于细胞核的染色)

样品的制备及测量如实施例1进行，并做如下修改：

使用用荧光团BODIPY-TMR标记的加压素类似物作为荧光配体(荧光配体购自Perkin Elmer公司，为荧光极化试剂盒FPA 120的一部分)。

没有提供该肽的序列或结构。

使用Arg-8加压素(加压素位置8是Arg)作为竞争剂。

加压素的序列如Seq ID No.7所示。

溶液：

9x荧光配体溶液

5nM BO-TMR-加压素

通过在I-缓冲液中新鲜制备

9x竞争剂溶液

9x稀释系列，在I-缓冲液中制备

通过在I-缓冲液中稀释新鲜制备

该检测法如实施例1中描述进行。BO-TMR-加压素用作荧光团-激动剂。如实施例1中描述定量激动剂内化。

为了定量配体内化，使用以下滤光片设置：

Omega滤光片，XF93 hoechst及TRITC。

图9显示了V1bR表达细胞的图像，该细胞已经与BO-TMR-加压素和Hoechst 33258染料孵育。用Cellomics ArrayScan Reader 4.0获得图像。

图A表示与BO-TMR-加压素孵育的细胞，该图片用BO-TMR荧光选择性滤光片设置获得。图B中是同一样品的荧光图像，该图像通过Hoechst选择性滤光片获得，表明细胞核的位置。当重叠两个图像时，可清楚地看见荧光配体作为点很近地位于细胞核周围。明显地集中在内质循环区室(ERCs)中。

因为用过量的V1bR肽激动剂Arg-8加压素共同孵育(图C和D)阻碍了荧光ERCs的形成，所以BO-TMR-加压素转位入细胞质部位很大程度上是受体特异性的。

如实施例1描述，可用高内涵筛选读出装置定量内化的配体量。该实施例阐明即使对于其中仅小量细胞群明显表达V1b受体的细胞样品，内化的配体的定量也可以完成。图10展现了Arg-8加压素渐增的浓度如何以剂量依赖的方式减少了由HCS读出装置检测到的内化的BO-TMR-加压素的量。

在两个独立的检测法中，两个独立的实验中平均的IC50值分别测定为5nM和15nM，表示受体药理学可以以可重复的方式研究。

实施例6：在NK3及SSTR5表达细胞系中内化的多位方法

多位方法描述的是需要多于一个独立的参数用于读出信息的检测法。通过高内涵筛选，基于图像的分析直接将某个测定的光学信号赋予单独的被鉴定细胞。这使得多位方法可用于单种细胞内的多个事件，或可用于异种细胞混合物中的多个事件，其中细胞亚群可产生不同反应。

在该实施例中阐述了高内涵筛选可进行多位方法，通过在同一板孔中混合两种用于不同GPCRs的内化检测法实施。这里应用的方法是使用具有荧光光谱的受体特异性荧光配体，这使得可获得对每个独立配体有选择性的图像。

除了在同一板孔中共同接种两种细胞系并与多于一种荧光配体同时孵育以外，根据实施例1到3进行用于NK3R和SSTR-5的多位检测法。为了分析，必须获得同一视场的三个图像而不是两个图像：一个是细胞核的Hoechst染色图像，第二个是Atto590荧光特异性图像以及第三个为Atto655荧光特异性图像。

对于多位方法，将在实施例2和3中描述的两个细胞系在96孔板中如上描述共同接种24小时。和用于单独受体内化一样，使用相同浓度的储备溶液并调整体积以满足另外的竞争剂和荧光配体溶液。

为了用购自美国佛蒙特州Omega Optical公司的ArrayScan 4.0来定量配体内化，使用了Omega滤光片。在同一样品上进行了两次扫描：第1次扫描：“XF93 hoechst”和“XF93 Cy5”(检测内化的Atto655-NKB)，第2次扫描：“XF53 hoechst”和“XF53 TxR”(检测内化的Atto590-SSTR14)。

图5显示了与SSTR-5细胞混合的NK3R表达细胞的图像，该混合细胞已经与Atto590-SSTR14、Atto655-NKB及Hoechst染料孵育。图像通过使用Cellomics ArrayScan Reader 4.0获得。

图5中每一行图像为在一个样品中同一视场内获得，获取图像时采用三个不同的滤光片设置，该设置使得可实质上选择性地检测单独的荧光团Hoechst(C、F、I和L)、Atto590(B、E、H和K)及Atto655(A、D、G和J)。在第一个样品中(图像A、B和C)，NK3R表达细胞和SSTR5表达细胞都用内化的配体染色，内化配体分别是Atto655-NKB(A)和Atto590-SST14(B)。正如期望的，因为单种细胞仅表达其中一种受体，两种染色之间没有观察到显著的交叠。在接下来的第二和第三行中的两个样品图像组中，阐述了受体介导的荧光配体的内化如何能通过受体特异性非荧光竞争剂以选择性的方式阻断。因而过量的NK3R拮抗剂SB222200对SSTR-5没有影响(E)却阻碍了NK3R介导的荧光配体的内化(D)。同样当加入过量的SST14时，能以选择性的方式抑制SSTR-5的内化(G、H)。在最后一行中(J、K和L)，显示了两种竞争剂的混合物同时阻碍了NK3R和SSTR-5的内化。

在图6中显示了图像的定量，该图片通过如上面介绍的滤光片并取自同一样品，该滤光片使得可实质上选择性地检测其中一种荧光配体。在图像A中，增加SB222200的量减少了定位于ERCs中的Atto655-NKB的荧光强度而内化的Atto590-SST14的量未受影响。抑制Atto655-NKB内化的IC50值测定为21nM，该值与实施例2中介绍的单独的NK3配体示踪系统得到的IC50值很好地符合。在B中，情况相反，这里SST14减少了Atto590-SST14的ERC强度，而ERCs中的Atto655-NKB强度未变。抑制Atto590-SST14内化的IC50值为36nM，该值与实施例2中介绍的SSTR-5系统中得到的值关联得很好。

滤光片	激发	发射	二重(dicroic)
滤光片	激发	发射	二重(dicroic)	XF53-hoechst	XF1005365WB50	XF3057528-633DBEM	XF2044490-575DBDR
XF53-TxR	XF1044575DF25	XF3057528-633DBEM	XF2044490-575DBDR	XF53-hoechst	XF1005365WB50	XF3057528-633DBEM	XF2044490-575DBDR
XF53-TxR	XF1044575DF25	XF3057528-633DBEM	XF2044490-575DBDR	XF93-hoechst	XF1005365WB50	XF3067515-600-730TBEM	XF2054485-555-650TBDR
XF93-TRITC	XF1043555DF10	XF3067515-600-730TBEM	XF2054485-555-650TBDR	XF93-hoechst	XF1005365WB50	XF3067515-600-730TBEM	XF2054485-555-650TBDR
XF93-TRITC	XF1043555DF10	XF3067515-600-730TBEM	XF2054485-555-650TBDR	XF93-Cy5	XF1046655DF30	XF3067515-600-730TBEM	XF2054485-555-650TBDR
XF110-Cy5选择的	XF1069630AF50	XF3076695AF55	XF2035650DRLP	XF93-Cy5	XF1046655DF30	XF3067515-600-730TBEM	XF2054485-555-650TBDR

序列表

<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司

<120>配体-受体示踪测定法

<130>22817

<160>11

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>364

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>生长抑素受体5

<222>(1)..(364)

<223>SSTR 5；基因座ID：6755

<400>1

Met Glu Pro Leu Phe Pro Ala Ser Thr Pro Ser Trp Ash Ala Ser Ser

1 5 10 15

Pro Gly Ala Ala Ser Gly Gly Gly Asp Asn Arg Thr Leu Val Gly Pro

20 25 30

Ala Pro Ser Ala Gly Ala Arg Ala Val Leu Val Pro Val Leu Tyr Leu

35 40 45

Leu Val Cys Ala Ala Gly Leu Gly Gly Asn Thr Leu Val Ile Tyr Val

50 55 60

Val Leu Arg Phe Ala Lys Met Lys Thr Val Thr Asn Ile Tyr Ile Leu

65 70 75 80

Asn Leu Ala Val Ala Asp Val Leu Tyr Met Leu Gly Leu Pro Phe Leu

85 90 95

Ala Thr Gln Asn Ala Ala Ser Phe Trp Pro Phe Gly Pro Val Leu Cys

100 105 110

Arg Leu Val Met Thr Leu Asp Gly Val Asn Gln Phe Thr Ser Val Phe

115 120 125

Cys Leu Thr Val Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Val His Pro

130 135 140

Leu Ser Ser Ala Arg Trp Arg Arg Pro Arg Val Ala Lys Leu Ala Ser

145 150 155 160

Ala Ala Ala Trp Val Leu Ser Leu Cys Met Ser Leu Pro Leu Leu Val

165 170 175

Phe Ala Asp Val Gln Glu Gly Gly Thr Cys Asn Ala Ser Trp Pro Glu

180 185 190

Pro Val Gly Leu Trp Gly Ala Val Phe Ile Ile Tyr Thr Ala Val Leu

195 200 205

Gly Phe Phe Ala Pro Leu Leu Val Ile Cys Leu Cys Tyr Leu Leu Ile

210 215 220

Val Val Lys Val Arg Ala Ala Gly Val Arg Val Gly Cys Val Arg Arg

225 230 235 240

Arg Ser Glu Arg Lys Val Thr Arg Met Val Leu Val Val Val Leu Val

245 250 255

Phe Ala Gly Cys Trp Leu Pro Phe Phe Thr Val Asn Ile Val Asn Leu

260 265 270

Ala Val Ala Leu Pro Gln Glu Pro Ala Ser Ala Gly Leu Tyr Phe Phe

275 280 285

Val Val Ile Leu Ser Tyr Ala Asn Ser Cys Ala Asn Pro Val Leu Tyr

290 295 300

Gly Phe Leu Ser Asp Asn Phe Arg Gln Ser Phe Gln Lys Val Leu Cys

305 310 315 320

Leu Arg Lys Gly Ser Gly Ala Lys Asp Ala Asp Ala Thr Glu Pro Arg

325 330 335

Pro Asp Arg Ile Arg Gln Gln Gln Glu Ala Thr Pro Pro Ala His Arg

340 345 350

Ala Ala Ala Asn Gly Leu Met Gln Thr Ser Lys Leu

355 360

<210>2

<211>366

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>生长激素促分泌素受体la

<222>(1)..(366)

<223>GHSR 1a；基因座ID：2693

<400>2

Met Trp Asn Ala Thr Pro Ser Glu Glu Pro Gly Phe Asn Leu Thr Leu

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Trp Asp Ala Ser Pro Gly Asn Asp Ser Leu Gly Asp

20 25 30

Glu Leu Leu Gln Leu Phe Pro Ala Pro Leu Leu Ala Gly Val Thr Ala

35 40 45

Thr Cys Val Ala Leu Phe Val Val Gly Ile Ala Gly Asn Leu Leu Thr

50 55 60

Met Leu Val Val Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Thr Thr Thr Asn Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Ser Ser Met Ala Phe Ser Asp Leu Leu Ile Phe Leu Cys Met

85 90 95

Pro Leu Asp Leu Val Arg Leu Trp Gln Tyr Arg Pro Trp Asn Phe Gly

100 105 110

Asp Leu Leu Cys Lys Leu Phe Gln Phe Val Ser Glu Ser Cys Thr Tyr

115 120 125

Ala Thr Val Leu Thr Ile Thr Ala Leu Ser Val Glu Arg Tyr Phe Ala

130 135 140

Ile Cys Phe Pro Leu Arg Ala Lys Val Val Val Thr Lys Gly Arg Val

145 150 155 160

Lys Leu Val Ile Phe Val Ile Trp Ala Val Ala Phe Cys Ser Ala Gly

165 170 175

Pro Ile Phe Val Leu Val Gly Val Glu His Glu Asn Gly Thr Asp Pro

180 185 190

Trp Asp Thr Asn Glu Cys Arg Pro Thr Glu Phe Ala Val Arg Ser Gly

195 200 205

Leu Leu Thr Val Met Val Trp Val Ser Ser Ile Phe Phe Phe Leu Pro

210 215 220

Val Phe Cys Leu Thr Val Leu Tyr Ser Leu Ile Gly Arg Lys Leu Trp

225 230 235 240

Arg Arg Arg Arg Gly Asp Ala Val Val Gly Ala Ser Leu Arg Asp Gln

245 250 255

Asn His Lys Gln Thr Val Lys Met Leu Ala Val Val Val Phe Ala Phe

260 265 270

Ile Leu Cys Trp Leu Pro Phe His Val Gly Arg Tyr Leu Phe Ser Lys

275 280 285

Ser Phe Glu Pro Gly Ser Leu Glu Ile Ala Gln Ile Ser Gln Tyr Cys

290 295 300

Asn Leu Val Ser Phe Val Leu Phe Tyr Leu Ser Ala Ala Ile Asn Pro

305 310 315 320

Ile Leu Tyr Asn Ile Met Ser Lys Lys Tyr Arg Val Ala Val Phe Arg

325 330 335

Leu Leu Gly Phe Glu Pro Phe Ser Gln Arg Lys Leu Ser Thr Leu Lys

340 345 350

Asp Glu Ser Ser Arg Ala Trp Thr Glu Ser Ser Ile Asn Thr

355 360 365

<210>3

<211>424

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>加压素受体lB

<222>(1)..(424)

<223>基因座ID：553

<400>3

Met Asp Ser Gly Pro Leu Trp Asp Ala Asn Pro Thr Pro Arg Gly Thr

1 5 10 15

Leu Ser Ala Pro Asn Ala Thr Thr Pro Trp Leu Gly Arg Asp Glu Glu

20 25 30

Leu Ala Lys Val Glu Ile Gly Val Leu Ala Thr Val Leu Val Leu Ala

35 40 45

Thr Gly Gly Asn Leu Ala Val Leu Leu Thr Leu Gly Gln Leu Gly Arg

50 55 60

Lys Arg Ser Arg Met His Leu Phe Val Leu His Leu Ala Leu Thr Asp

65 70 75 80

Leu Ala Val Ala Leu Phe Gln Val Leu Pro Gln Leu Leu Trp Asp Ile

85 90 95

Thr Tyr Arg Phe Gln Gly Pro Asp Leu Leu Cys Arg Ala Val Lys Tyr

100 105 110

Leu Gln Val Leu Ser Met Phe Ala Ser Thr Tyr Met Leu Leu Ala Met

115 120 125

Thr Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Val Cys His Pro Leu Arg Ser Leu Gln

130 135 140

Gln Pro Gly Gln Ser Thr Tyr Leu Leu Ile Ala Ala Pro Trp Leu Leu

145 150 155 160

Ala Ala Ile Phe Ser Leu Pro Gln Val Phe Ile Phe Ser Leu Arg Glu

165 170 175

Val Ile Gln Gly Ser Gly Val Leu Asp Cys Trp Ala Asp Phe Gly Phe

180 185 190

Pro Trp Gly Pro Arg Ala Tyr Leu Thr Trp Thr Thr Leu Ala Ile Phe

195 200 205

Val Leu Pro Val Thr Met Leu Thr Ala Cys Tyr Ser Leu Ile Cys His

210 215 220

Glu Ile Cys Lys Asn Leu Lys Val Lys Thr Gln Ala Trp Arg Val Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Trp Arg Thr Trp Asp Arg Pro Ser Pro Ser Thr Leu Ala

245 250 255

Ala Thr Thr Arg Gly Leu Pro Ser Arg Val Ser Ser Ile Asn Thr Ile

260 265 270

Ser Arg Ala Lys Ile Arg Thr Val Lys Met Thr Phe Val Ile Val Leu

275 280 285

Ala Tyr Ile Ala Cys Trp Ala Pro Phe Phe Ser Val Gln Met Trp Ser

290 295 300

Val Trp Asp Lys Asn Ala Pro Asp Glu Asp Ser Thr Asn Val Ala Phe

305 310 315 320

Thr IIe Ser Met Leu Leu Gly Asn Leu Asn Ser Cys Cys Asn Pro Trp

325 330 335

Ile Tyr Met Gly Phe Asn Ser His Leu Leu Pro Arg Pro Leu Arg His

340 345 350

Leu Ala Cys Cys Gly Gly Pro Gln Pro Arg Met Arg Arg Arg Leu Ser

355 360 365

Asp Gly Ser Leu Ser Ser Arg His Thr Thr Leu Leu Thr Arg Ser Ser

370 375 380

Cys Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Leu Ser Leu Thr Leu Ser Gly Arg

385 390 395 400

Pro Arg Pro Glu Glu Ser Pro Arg Asp Leu Glu Leu Ala Asp Gly Glu

405 410 415

Gly Thr Ala Glu Thr Ile Ile Phe

420

<210>4

<211>465

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>神经激肽3受体

<222>(1)..(465)

<223>NK3R；基因座ID：6870

<400>4

Met Ala Thr Leu Pro Ala Ala Glu Thr Trp Ile Asp Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Val Gly Ala Asp Ala Val Asn Leu Thr Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala

20 25 30

Ala Thr Gly Ala Val Glu Thr Gly Trp Leu Gln Leu Leu Asp Gln Ala

35 40 45

Gly Asn Leu Ser Ser Ser Pro Ser Ala Leu Gly Leu Pro Val Ala Ser

50 55 60

Pro Ala Pro Ser Gln Pro Trp Ala Asn Leu Thr Asn Gln Phe Val Gln

65 70 75 80

Pro Ser Trp Arg Ile Ala Leu Trp Ser Leu Ala Tyr Gly Val Val Val

85 90 95

Ala Val Ala Val Leu Gly Asn Leu Ile Val Ile Trp Ile Ile Leu Ala

100 105 110

His Lys Arg Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Phe Leu Val Asn Leu Ala

115 120 125

Phe Ser Asp Ala Ser Met Ala Ala Phe Asn Thr Leu Val Asn Phe Ile

130 135 140

Tyr Ala Leu His Ser Glu Trp Tyr Phe Gly Ala Asn Tyr Cys Arg Phe

145 150 155 160

Gln Asn Phe Phe Pro Ile Thr Ala Val Phe Ala Ser Ile Tyr Ser Met

165 170 175

Thr Ala Ile Ala Val Asp Arg Tyr Met Ala Ile Ile Asp Pro Leu Lys

180 185 190

Pro Arg Leu Ser Ala Thr Ala Thr Lys Ile Val Ile Gly Ser Ile Trp

195 200 205

Ile Leu Ala Phe Leu Leu Ala Phe Pro Gln Cys Leu Tyr Ser Lys Thr

210 215 220

Lys Val Met Pro Gly Arg Thr Leu Cys Phe Val Gln Trp Pro Glu Gly

225 230 235 240

Pro Lys Gln His Phe Thr Tyr His Ile Ile Val Ile Ile Leu Val Tyr

245 250 255

Cys Phe Pro Leu Leu Ile Met Gly Ile Thr Tyr Thr Ile Val Gly Ile

260 265 270

Thr Leu Trp Gly Gly Glu Ile Pro Gly Asp Thr Cys Asp Lys Tyr His

275 280 285

Glu Gln Leu Lys Ala Lys Arg Lys Val Val Lys Met Met Ile Ile Val

290 295 300

Val Met Thr Phe Ala Ile Cys Trp Leu Pro Tyr His Ile Tyr Phe Ile

305 310 315 320

Leu Thr Ala Ile Tyr Gln Gln Leu Asn Arg Trp Lys Tyr Ile Gln Gln

325 330 335

Val Tyr Leu Ala Ser Phe Trp Leu Ala Met Ser Ser Thr Met Tyr Asn

340 345 350

Pro Ile Ile Tyr Cys Cys Leu Asn Lys Arg Phe Arg Ala Gly Phe Lys

355 360 365

Arg Ala Phe Arg Trp Cys Pro Phe Ile Lys Val Ser Ser Tyr Asp Glu

370 375 380

Leu Glu Leu Lys Thr Thr Arg Phe His Pro Asn Arg Gln Ser Ser Met

385 390 395 400

Tyr Thr Val Thr Arg Met Glu Ser Met Thr Val Val Phe Asp Pro Asn

405 410 415

Asp Ala Asp Thr Thr Arg Ser Ser Arg Lys Lys Arg Ala Thr Pro Arg

420 425 430

Asp Pro Ser Phe Asn Gly Cys Ser Arg Arg Asn Ser Lys Ser Ala Ser

435 440 445

Ala Thr Ser Ser Phe Ile Ser Ser Pro Tyr Thr Ser Val Asp Glu Tyr

450 455 460

Ser

465

<210>5

<211>116

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>生长抑素14

<222>(1)..(116)

<223>基因座ID：6750

<400>5

Met Leu Ser Cys Arg Leu Gln Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Val

1 5 10 15

Leu Ala Leu Gly Cys Val Thr Gly Ala Pro Ser Asp Pro Arg Leu Arg

20 25 30

Gln Phe Leu Gln Lys Ser Leu Ala Ala Ala Ala Gly Lys Gln Glu Leu

35 40 45

Ala Lys Tyr Phe Leu Ala Glu Leu Leu Ser Glu Pro Asn Gln Thr Glu

50 55 60

Asn Asp Ala Leu Glu Pro Glu Asp Leu Ser Gln Ala Ala Glu Gln Asp

65 70 75 80

Glu Met Arg Leu Glu Leu Gln Arg Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met

85 90 95

Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr

100 105 110

Phe Thr Ser Cys

115

<210>6

<211>117

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>生长激素释放激素前体

<222>(1)..(117)

<223>基因座ID：51738

<400>6

Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu

1 5 10 15

Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His

20 25 30

Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu

35 40 45

Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln

50 55 60

Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe

65 70 75 80

Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln

85 90 95

Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu

100 105 110

Ala Pro Ala Asp Lys

115

<210>7

<211>164

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>加压素(avp)

<222>(1)..(164)

<223>基因座ID：551

<400>7

Met Pro Asp Thr Met Leu Pro Ala Cys Phe Leu Gly Leu Leu Ala Phe

1 5 10 15

Ser Ser Ala Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly Gly Lys Arg Ala

20 25 30

Met Ser Asp Leu Glu Leu Arg Gln Cys Leu Pro Cys Gly Pro Gly Gly

35 40 45

Lys Gly Arg Cys Phe Gly Pro Ser Ile Cys Cys Ala Asp Glu Leu Gly

50 55 60

Cys Phe Val Gly Thr Ala Glu Ala Leu Arg Cys Gln Glu Glu Asn Tyr

65 70 75 80

Leu Pro Ser Pro Cys Gln Ser Gly Gln Lys Ala Cys Gly Ser Gly Gly

85 90 95

Arg Cys Ala Ala Phe Gly Val Cys Cys Asn Asp Glu Ser Cys Val Thr

100 105 110

Glu Pro Glu Cys Arg Glu Gly Phe His Arg Arg Ala Arg Ala Ser Asp

115 120 125

Arg Ser Asn Ala Thr Gln Leu Asp Gly Pro Ala Gly Ala Leu Leu Leu

130 135 140

Arg Leu Val Gln Leu Ala Gly Ala Pro Glu Pro Phe Glu Pro Ala Gln

145 150 155 160

Pro Asp Ala Tyr

<210>8

<211>121

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>神经激肽B

<222>(1)..(121)

<223>基因座ID：6866

<400>8

Met Arg Ile Met Leu Leu Phe Thr Ala Ile Leu Ala Phe Ser Leu Ala

1 5 10 15

Gln Ser Phe Gly Ala Val Cys Lys Glu Pro Gln Glu Glu Val Val Pro

20 25 30

Gly Gly Gly Arg Ser Lys Arg Asp Pro Asp Leu Tyr Gln Leu Leu Gln

35 40 45

Arg Leu Phe Lys Ser His Ser Ser Leu Glu Gly Leu Leu Lys Ala Leu

50 55 60

Ser Gln Ala Ser Thr Asp Pro Lys Glu Ser Thr Ser Pro Glu Lys Arg

65 70 75 80

Asp Met His Asp Phe Phe Val Gly Leu Met Gly Lys Arg Ser Val Gln

85 90 95

Pro Asp Ser Pro Thr Asp Val Asn Gln Glu Asn Val Pro Ser Phe Gly

100 105 110

Ile Leu Lys Tyr Pro Pro Arg Ala Glu

115 120

<210>9

<211>14

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>生长抑素14

<222>(1)..(14)

<223>生长抑素C端肽(103-117)

二硫键在C(3)和C(14)之间

<220>

<221>生长抑素14

<222>(8)..(8)

<223>D-Trp

<400>9

Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys

1 5 10

<210>10

<211>19

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>生长激素释放激素(1-19)

<222>(1)..(19)

<220>

<221>生长激素释放激素(1-19)

<222>(3)..(3)

<223>辛酰基衍生物或Dapa-辛酰基衍生物

<400>10

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Asn Arg Val Asn Asn Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Cys

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>神经激肽B肽

<222>(1)..(10)

<220>

<221>神经激肽B肽

<222>(7)..(7)

<223>Phe(7)＝甲基-苯丙氨酸

<400>11

Cys Met His Asp Phe Phe Phe Gly Leu Met

1 5 10

Claims

1.用于高内涵筛选化合物的多位方法，其中对表达至少一种靶标受体的至少一种单细胞或至少一种细胞亚群或异种细胞群的至少一个细胞参数在存在或不存在化合物时进行光学测量。

2.权利要求1的方法，其中对至少两个细胞参数进行测量。

3.权利要求1的方法，其中对至少三个细胞参数进行测量。

4.权利要求2或3的方法，其中对表达不同靶标受体的至少两种单细胞或两种细胞亚群进行测量。

5.权利要求1到4中任意一项所述的多位方法，其中至少一个细胞参数是配体-受体复合物的示踪，并且其中所述的配体-受体复合物通过光学检测受标记的配体或受标记的受体得以示踪。

6.权利要求1到5中任意一项所述的多位方法，其中至少一个细胞参数是配体-受体内化的示踪，并且其中所述的配体-受体内化通过光学检测受标记的配体或受标记的受体得以示踪。

7.权利要求5或6所述的多位方法，其中所述的受标记受体不包括融合有荧光蛋白的受体。

8.权利要求5到7中任意一项所述的多位方法，其中所述的受标记配体是连接有发光团的配体。

9.权利要求5到8中任意一项所述的多位方法，其中所述的受标记受体是被特异性抗体结合的受体，并且其中所述抗体用可光学检测的标记物标记。

10.权利要求2到9中任意一项所述的多位方法，其中不同的细胞或细胞亚群独立地表达能结合相同配体的不同靶标受体。

11.权利要求6到9中任意一项所述的多位方法，其中用两种不同的能被独立检测的标记物标记的至少两种不同配体的内化在至少两种不同细胞亚群中于存在或不存在化合物时得以测量，其中所述至少两种不同细胞亚群独立地表达至少两种不同的靶标受体。

12.权利要求1到11中任意一项所述的多位筛选方法，其中至少一种靶标受体是GPCR。

13.权利要求1到12中任意一项所述的多位筛选方法，其中至少一种标记物是荧光团。

14.发光团标记的诱导受体内化的激动剂的用途，用于在多位高内涵筛选化合物中示踪受体-配体。

15.发光团标记的受体的用途，用于在多位高内涵筛选化合物中示踪受体-配体。

16.发光团标记的针对GPCR的抗体的用途，用于在多位高内涵筛选化合物中示踪受体-配体。