CN1829734A - 具有与钛、银、硅结合能力的肽 - Google Patents
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Abstract
提供了一种与需要通过软质材料进行钛、银、硅材料的高机能化的钛、银、硅具有结合能力的肽序列、噬菌体、人工蛋白质和嵌合分子,或者是具有前述肽序列和功能性肽序列的肽、噬菌体、人工蛋白质或嵌合分子与钛的复合体。将钛颗粒等与噬菌体颗粒上呈现不同的肽序列的噬菌体团块接触,通过离心操作回收与噬菌体颗粒结合的钛颗粒,在菌体中增殖所得噬菌体颗粒,其后,通过重复淘洗(panning)操作,浓缩与钛结合的噬菌体克隆。从该噬菌体克隆中,鉴定出RKLPDAPGMHTW等具有与钛结合的能力的肽。作为具有与钛、银、硅的结合能力的肽,可以列举有RKLPDA和RALPDA。
Description
技术领域
本发明涉及筛选与钛具有结合能力的肽的方法,与钛、银和/或硅具有结合能力的肽,与钛、银和/或硅具有结合能力的肽与钛、银或硅结合的钛、银或硅与肽的复合体,与钛、银和/或硅具有结合能力的肽与功能性肽或功能性蛋白质结合的人工蛋白质,这种人工蛋白质与钛、银或硅结合的钛、银或硅与人工蛋白质的复合体,与钛、银和/或硅具有结合能力的肽与标识化物质或肽标记的结合体或与非肽类化合物结合的嵌合蛋白质,这种嵌合蛋白质与钛、银或硅结合的钛、银或硅与嵌合蛋白质的复合体,噬菌体表面呈现与钛、银和/或硅具有结合能力的肽的噬菌体,这种噬菌体与钛、银或硅结合的钛、银或硅与噬菌体的复合体,采用与钛、银和/或硅具有结合能力的肽、与钛、银和/或硅具有结合能力的嵌合蛋白质、与钛、银和/或硅具有结合能力的噬菌体的钛、银或硅表面的改性或钛的整列化方法,银或硅颗粒的形成方法,以及有效成分为钛-人工蛋白质复合体的移植材料。
背景技术
以1952年由ブロ一ネマルク引起的钛与骨通过结缔组织而无意结合的骨整合现象的发现为契机,1965年首次临床应用了纯钛制的移植体。迄今为止,利用骨整合现象的移植治疗仍为盛行,直至钛与骨结合所需时间,需要3-6个月非常长的时间,其间,以为了缩短这段时间提高骨亲合性为目的,对在表面精加工上想办法的钙和羟基磷灰石的向钛表面的升华沉淀以及材料中的肽合金的研究等主要是机械的材料改变的硬质材料的再设计的研究正为盛行,但是从未获得显著的效果。例如,羟基磷灰石这样的陶瓷时,包膜的减少或物理的性质上负荷弱就成为问题。而且,迄今为止对于合金的情况已经做了很多研究,但是许多情况下引起有害的组织反应,现在仍在使用的是这种纯钛和其合金Ti6Al4V。
此外,一般认为移植物与周围粘膜的关系与牙与牙肉的关系不同是对感染抗性小的疤痕组织。因此,为了解决该问题,进行了在钛表面包裹抗菌剂等前述硬质材料的研究,然而这种硬质材料的研究中,没有考虑改善移植物与周围粘膜的解剖学/组织学关系。
钛非常容易氧化,在大气/水中立即形成二氧化物。由于利用具有二氧化钛结晶的一种锐钛矿形结晶的光催化活性,能够分解/无害化大概所有的有害化学物质,用于sick house gas或乙醛等恶臭的分解、抗霉剂等各种用途。但是,由于能够利用锐钛矿形结晶的波长限于紫外区域,因此希望开发出能够在可视光区利用的光催化剂。
此外,还提出了在形成与放出可能形的骨桥蛋白组合的含有骨桥蛋白的植入物的状态中含有被检体中生物体内利用的合适的材料,增加骨整合的速度和骨粘合的百分比的新型的含有骨桥蛋白的植入物(特表2002-500898号公报);由于提供了结合金属化合物且能够在分子水平上控制其定位和序列的新型的蛋白质,蛋白质片段,肽或其突变体的衍生物,因此通过在蛋白质,蛋白质片段,肽或其突变体的所具有特征立体结构上导入具有氮川三乙酸等结构的官能团,在分子水平上控制结合的金属化合物的构造的技术(特开平10-338700号公报);和通过采用具有能够特异结合于半导体物质的氨基酸低聚物这样的经修饰的自身组织化生物分子,制备具有相或构型等特异的结晶特性的半导体物质的纳米结晶的方法(美国特许出版公开第2003/0073104号说明书)。
上述内容中,在考虑移植物领域中通过不是由硬质材料产生的材料改变,能够在钛表面柔软地结合的软质材料的蛋白质等高分子聚合物进行钛材料的高机能化时,存在着特异识别/结合钛表面的氨基酸基序在自然界中不存在这样的问题。本发明的课题就是提供对于用于进行由软质材料引起的钛材料的高机能化所需要的与钛具有结合能力的肽序列、噬菌体、人工蛋白质和嵌合分子或者是具有前述肽序列和功能性肽序列的肽,噬菌体、人工蛋白质或嵌合分子与钛的复合体。具体的是,提供了表面上结合有前述肽和钙化促进或骨增殖/分化肽或人工蛋白质/嵌合蛋白质的功能性钛移植材料,其中骨整合在短期内结束,或者在表面上结合有前述钛和在牙肉中具有高亲合性的肽或人工蛋白质/嵌合蛋白质的功能钛移植材料,其中对细菌感染等有高抵抗性。或者,提供了在可视光区具有光催化能力的前述肽或人工蛋白质/嵌合蛋白质与二氧化钛的复合体,或者前述复合体与铬4(クロモフオア)这样的低分子化合物的复合体,和表面结合有前述肽、与皮肤中简单的胶原等的嵌合蛋白质或人工蛋白质的二氧化钛颜料。
本发明人为了解决上述问题进行了积极的研究,在水溶液中将噬菌体颗粒上呈现有各种肽序列的噬菌体团块与金属钛接触,通过离心回收通过肽序列结合噬菌体颗粒的钛,所得与钛结合噬菌体颗粒在大肠杆菌中增殖,接着,通过重复将增殖的噬菌体颗粒上呈现的各种肽序列的噬菌体团块再次与钛接触的淘洗(panning)操作浓缩与钛结合的噬菌体克隆,得到所认为特异识别钛且呈现与钛具有结合能力的肽的噬菌体文库。
将所得噬菌体文库克隆化,研究呈现的氨基酸序列。预计尤其是呈现能够与钛强力结合的序列的克隆在噬菌体文库克隆中占多数,通过重复前述淘洗(panning)操作,发现呈现RKLPDAPGMHTW(由序列号3表示的氨基酸序列构成的肽)的噬菌体克隆在44个克隆中有33个,呈现由序列号3表示的氨基酸序列构成的肽的噬菌体克隆与钛的结合能大大超过比呈现由序列号16-38表示的氨基酸序列构成的肽的噬菌体克隆的结合能。
对于钛,必须要检验所得呈现由序列号3表示的氨基酸序列构成的肽的克隆是否最终通过呈现的序列而结合。通过使用以晶体振子形相互作用定量装置能够同时测定分散的QCM-D300(q-sense AB公司イエデボリ),可以确认呈现由序列号3表示的氨基酸序列构成的肽的噬菌体克隆与钛的结合是否以呈现的序列为媒介而特异结合。像噬菌体这样非常长的延伸分子,在与晶体振子传感器垂直方向结合时,经分散测定的粘弹性对应于表示结合量的频率的减少而急剧上升。同时,相反地非常长的延伸分子在与晶体振子传感器面水平方向结合时,没有发现粘弹性对应于频率的减少而急剧上升。实际上,所得结果显示,呈现由序列号3表示的氨基酸序列构成的肽的噬菌体克隆在对于钛表面的垂直方向结合。通过晶体振子形相互作用分析装置研究噬菌体的结合形式的实例,或许是世界首次,其同时显示这种方法对于分析在固体表面结合的噬菌体非常有用。
钛在水中其表面立刻被氧化,羟基与钛原子结合。认为结合的羟基是架桥于两个钛原子间的羟基,它和与一个钛原子结合的末端的羟基是不同的。由于架桥的羟基与末端的羟基的各自极性不同,它们具有不同的pK。一般认为架桥的羟基作用为酸,末端的羟基作用为碱基。通过研究由序列号3表示的氨基酸序列构成的肽以随机方式特异结合于这种钛表面,可以控制钛与肽的结合。
对于一般的肽基序的特异性的研究,通过导入点突变鉴定在功能上完成重要任务的残基,通过缺失突变体的分析进行功能区域的确定(絞り込み)。在前者中,通常进行称之为丙氨酸扫描术的一系列丙氨酸置换点突变体的功能分析。认为不带电荷的甲基向只有一条小支链的丙氨酸的置换破坏该氨基酸残基的支链的功能。对呈现由序列号3表示的氨基酸序列构成的肽的噬菌体克隆进行丙氨酸扫描。制备呈现由序列号4-14表示的氨基酸序列构成的肽的一系列点突变的噬菌体,对各个克隆与钛的结合能力进行研究结果是,第4位向脯氨酸的点突变体的结合能力是本次研究中损失最大的。脯氨酸的作用在于使得与甘氨酸相同的肽或蛋白质主链大幅折叠。因此,强有力地提示由序列号3表示的氨基酸序列构成的肽与钛的结合中,在第4位脯氨酸方面的主链的折叠产生重要的功能。同时,由于支链中带电荷的氨基酸的我们的第1位变异为精氨酸和第5位变异为天冬氨酸的点突变体的结合能力显著受损,提示这些残基与前述钛表面的正负电荷相互作用。
丙氨酸扫描的结果是,所获得的结果支持序列号2的前半部分、序列号1的区域完成与钛结合的重要功能,制备呈现缺失由序列号3表示的氨基酸序列构成的肽的第7-12位的突变体即由序列号1表示的氨基酸序列构成的肽的噬菌体克隆,研究与钛的结合能力。已经清楚的是,由于与钛的结合能力不受缺失影响,只有由序列号1表示的氨基酸序列部分就具有足够的结合能力。
序列号3的肽序列在与钛结合时,第一位精氨酸的支链的正电荷的重要性如前述记载,其留下和与主链的氨基末端的氨基同时协调性运作的钛结合的可能性。因此,对于由序列号3表示的氨基酸序列在其氨基末端插入丙氨酸制作出插入突变体(序列号15),研究与钛的结合能力。其结果发现与钛的结合能力上升。可以认为结合能力的上升的理由在于序列号3的第2位的赖氨酸支链的正电荷与主链的氨基末端的氨基的正电荷间的排斥通过插入一个残基的氨基酸而减少,由序列表15表示的氨基酸序列构成的肽的结构更为稳定。此外,该结果意味着,为了由序列号3表示的氨基酸序列构成的肽与钛的结合,精氨酸未必要位于顶端(氨基端)。这就是表示在制备与钛结合的嵌合蛋白质、人工蛋白质或合成肽等等时,完全不受序列号1或3的排列的一级结构上的限制的重要见解。
已知通过过氧化氢处理,由钛表面结合了许多羟基。此外,认为由如前述序列号1,3表示的氨基酸构成的肽与钛表面的相互作用是由与钛结合的羟基的电荷和序列号1,3的第1位的精氨酸支链和第5位的天冬氨酸的侧链间的静电的相互作用而控制的。如果可以调节与钛结合的羟基的数量,就有可以调节钛与肽结合量的可能性。实际上,呈现由序列号3表示的氨基酸序列构成的肽的噬菌体克隆与经过氧化氢处理的钛的结合能力上升。其通过经过氧化氢在钛表面再添加羟基,可以增加呈现序列号3的噬菌体克隆,序列号3的肽,以及含有这些的人工蛋白质/嵌合蛋白质的结合量。此外,希望从钛表面相反地除去羟基时,能够减少呈现由序列号3表示的氨基酸序列构成的的噬菌体克隆,序列号3的肽,以及含有这些的人工蛋白质/嵌合蛋白质的结合量。从钛表面除去羟基的方法,有例如氟化钠处理。希望通过组合这些方法,可以调节呈现由序列号3表示的氨基酸序列构成的的噬菌体克隆,序列号3的肽,以及含有这些的人工蛋白质/嵌合蛋白质与钛的结合量。
此外,研究与具有钛结合能力的肽与金属材料的结合的特异性,发现与钛以外的银、硅选择性结合,与金,铂,铜,铁,锡,锌,铬等不结合。利用这种金属结合特异性,可以预计通过例如在金基底上以钛制作布线图案,加入功能性化合物,例如与半导体纳米颗粒组合在一起的钛结合的肽,以及含有该物质的人工蛋白质/嵌合蛋白质,可以使得功能化合物以结合钛的肽作为媒介在金基底上制成布线图案。
本发明人基于上述见识,完成了本发明。
发明内容
也就是说,本发明涉及(1)一种筛选与钛具有结合能力的肽方法,特征在于使噬菌体颗粒上呈现有不同的肽序列的噬菌体团块与钛接触,通过离心回收通过肽序列结合噬菌体颗粒的钛,在菌体中增殖所得与钛结合的噬菌体颗粒,接着,通过重复将增殖的噬菌体颗粒上呈现的各种肽序列的噬菌体团块与钛接触的淘洗(panning)操作浓缩与钛结合的噬菌体克隆;及(2)与钛具有结合能力的肽,特征在于其由上述(1)中记载的筛选方法获得。
此外,本发明还涉及(3)由序列号1所示的氨基酸序列构成的与钛具有结合能力的肽;和(4)由序列号1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛具有结合能力的肽;和(5)上述(4)中记载的与钛具有结合能力的肽,特征在于其保留序列号1所示氨基酸序列的第1,4,5位的氨基酸残基;和(6)上述(5)中记载的与钛具有结合能力的肽,特征在于其由序列号2中第2位精氨酸被取代为丙氨酸所示的氨基酸序列构成;和(7)由序列号3所示氨基酸序列构成的具有与钛具有结合能力的肽;和(8)由序列号3所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛具有结合能力的肽;和(9)上述(8)中记载的与钛具有结合能力的肽,特征在于其保留序列号3所示氨基酸序列的第1,4,5位的氨基酸残基;和(10)上述(8)中记载的与钛具有结合能力的肽,特征在于其由第1-5位以及第7-12位氨基酸残基分别被取代为丙氨酸的序列号4-14所示的氨基酸序列所构成;和(11)上述(8)或(9)中记载的与钛具有结合能力的肽,特征在于其由在序列号3所示氨基酸序列的N末端上添加/插入了丙氨酸的序列号15所示的氨基酸序列构成;和(12)由序列号16-24所示的氨基酸序列构成与钛具有结合能力的肽;和(13)由序列号16-24所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛具有结合能力的肽;和(14)由序列号25-38所示的氨基酸序列构成与钛具有结合能力的肽;和(15)由序列号25-38所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛具有结合能力的肽;和(16)上述(2)-(15)任一项中记载的与钛具有结合能力的肽,其特征在于其是经化学修饰的肽。
进而,本发明涉及(17)上述(2)-(16)任一项中记载的与钛具有结合能力的肽,其特征在于钛是金属钛,钛合金或二氧化钛;和(18)上述(2)-(16)任一项中记载的与钛具有结合能力的肽的与钛结合的钛-肽复合体;和(19)上述(2)-(16)任一项中记载的与钛具有结合能力的肽与功能性肽或功能性蛋白质的结合体并且与钛具有结合能力的人工蛋白质;和(20)上述(19)记载的人工蛋白质,其特征在于功能性肽或功能性蛋白质是和与钛具有结合能力的肽相互协作的,自我组装形成二维结晶的肽或蛋白质;和(21)上述(19)记载的人工蛋白质,其特征在于功能性肽或功能性蛋白质是有着具有细胞粘连活性等细胞识别活性的肽序列的肽或蛋白质;和(22)上述(19)-(21)任一项中记载的人工蛋白质的与钛结合的钛-人工蛋白质复合体;和(23)上述(2)-(17)任一项中记载的与钛具有结合能力的肽与标识化物质或肽标记的结合体或者与非肽类化合物的结合体并且与钛具有结合能力的嵌合蛋白质;和(24)上述(23)记载的嵌合蛋白质的与钛结合的钛-嵌合蛋白质复合体;和(25)噬菌体颗粒表面呈现上述(2)-(17)任一项中记载的与钛具有结合能力的肽且与钛具有结合能力的噬菌体;和(26)上述(25)记载的噬菌体的与钛结合的钛-噬菌体复合体;和(27)钛表面的改良或钛颗粒的形成方法,其特征在于采用上述(2)-(17)任一项中记载的与钛具有结合能力的肽;和(28)钛表面的改良、钛颗粒的形成或钛的整列化方法,其特征在于采用上述(19)-(21)任一项中记载的与钛具有结合能力的人工蛋白质;和(29)钛表面的改良或钛颗粒的形成方法,其特征在于采用上述(23)记载的与钛具有结合能力的嵌合蛋白质;和(30)钛表面的整列化或钛颗粒的形成方法,其特征在于采用上述(25)记载的与钛具有结合能力的噬菌体;和(31)以上述(22)记载的钛-人工蛋白质复合体作为有效成分的移植材料。
此外,本发明还涉及(32)由序列1所示氨基酸序列构成与银具有结合能力的肽;和(33)由序列号1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与银具有结合能力的肽;和(34)上述(33)中记载的与银具有结合能力的肽,特征在于其保留序列号1所示氨基酸序列的第1,4,5位的氨基酸残基;和(35)上述(34)中记载的与银具有结合能力的肽,特征在于其由序列号2中第2位精氨酸被取代为丙氨酸所示的氨基酸序列构成;和(36)由序列号3所示氨基酸序列构成的具有与银具有结合能力的肽;和(37)由序列号3所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与银具有结合能力的肽;和(38)上述(32)-(37)任一项中记载的与银具有结合能力的肽,特征在于其是经化学修饰的肽;和(39)上述(32)-(38)任一项中记载的与银具有结合能力的肽的与银结合的银-肽复合体;和(40)上述(32)-(38)任一项中记载的与银具有结合能力的肽与功能性肽或功能性蛋白质的结合体并且与银具有结合能力的人工蛋白质;和(41)上述(40)记载的人工蛋白质的与银结合的银-人工蛋白质复合体;和(42)上述(32)-(38)任一项中记载的与银具有结合能力的肽与标识化物质或肽标记的结合体或者与非肽类化合物的结合体并且与银具有结合能力的嵌合蛋白质;和(43)上述(42)记载的嵌合蛋白质的与银结合的银-嵌合蛋白质复合体;和(44)噬菌体颗粒表面呈现上述(32)-(38)任一项中记载的与银具有结合能力的肽且与银具有结合能力的噬菌体;和(45)上述(44)记载的噬菌体的与银结合的银-噬菌体复合体;和(46)银表面的改良或银颗粒的形成方法,其特征在于采用上述(32)-(38)任一项中记载的与银具有结合能力的肽;和(47)银表面的改良、银颗粒的形成或银的整列化方法,其特征在于采用上述(40)中记载的与银具有结合能力的人工蛋白质;和(48)银表面的改良或银颗粒的形成方法,其特征在于采用上述(42)记载的与银具有结合能力的嵌合蛋白质;和(49)银颗粒的形成或银表面的整列化方法,其特征在于采用上述(44)记载的与银具有结合能力的噬菌体;和(50)由序列1所示氨基酸序列构成与硅具有结合能力的肽;和(51)由序列号1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与硅具有结合能力的肽;和(52)上述(49)中记载的与硅具有结合能力的肽,特征在于其保留序列号1所示氨基酸序列的第1,4,5位的氨基酸残基;和(53)上述(50)中记载的与硅具有结合能力的肽,特征在于其由序列号2中第2位精氨酸被取代为丙氨酸所示的氨基酸序列构成;和(54)由序列号3所示氨基酸序列构成的具有与硅具有结合能力的肽;和(55)由序列号3所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与硅具有结合能力的肽;和(56)上述(50)-(55)任一项中记载的与硅具有结合能力的肽,特征在于其是经化学修饰的肽;和(57)上述(50)-(56)任一项中记载的与硅具有结合能力的肽的与硅结合的硅-肽复合体;和(58)上述(50)-(56)任一项中记载的与硅具有结合能力的肽与功能性肽或功能性蛋白质的结合体并且与硅具有结合能力的人工蛋白质;和(59)上述(58)记载的人工蛋白质的与硅结合的硅-人工蛋白质复合体;和(60)上述(50)-(56)任一项中记载的与硅具有结合能力的肽与标识化物质或肽标记的结合体或者与非肽类化合物的结合体并且与硅具有结合能力的嵌合蛋白质;和(61)上述(60)记载的嵌合蛋白质的与硅结合的硅-嵌合蛋白质复合体;和(62)噬菌体颗粒表面呈现上述(50)-(56)任一项中记载的与硅具有结合能力的肽且与硅具有结合能力的噬菌体;和(63)上述(62)记载的噬菌体的与硅结合的硅-噬菌体复合体;和(64)硅表面的改良或硅颗粒的形成方法,其特征在于采用上述(50)-(56)任一项中记载的与硅具有结合能力的肽;和(65)硅表面的改良、硅颗粒的形成或硅的整列化方法,其特征在于采用上述(58)中记载的与硅具有结合能力的人工蛋白质;和(66)硅表面的改良或硅颗粒的形成方法,其特征在于采用上述(60)记载的与硅具有结合能力的嵌合蛋白质;和(67)硅表面的整列化或硅颗粒的形成方法,其特征在于采用上述(62)记载的与硅具有结合能力的噬菌体;和(68)将上述(2)-(17)任一项记载的与钛具有结合能力的肽、上述(32)-(38)任一项记载的与银具有结合能力的肽或上述(50)-(56)任一项记载的与硅具有结合能力的肽,用作原子力显微镜(AFM)的探针(probe)的方法。
附图说明
图1是表示采用D-12噬菌体文库向钛颗粒的淘洗(panning)的结果的图。
纵轴表示的是以对数表示能够洗脱的噬菌体的效价与加入的噬菌体的效价的比值,横轴的数字表示的是淘洗(panning)的次数。
图2是表示C7C噬菌体文库向钛颗粒的淘洗(panning)的结果的图。
纵轴表示的是以对数表示能够洗脱的噬菌体的效价与加入的噬菌体的效价的比值,横轴的数字表示的是淘洗(panning)的次数。
图3是表示采用D-12噬菌体文库,对钛颗粒重复3次淘洗(panning)后获得的克隆所呈现的氨基酸序列的图。
最左边是克隆的名字,在其旁边将显示的序列表示为氨基酸-字符标记。
图4是表示采用C7C文库,对钛颗粒重复3次淘洗(panning)后获得的克隆所呈现的氨基酸序列的图。
最左边是克隆的名字,在其旁边有以氨基酸字符表示的显示的序列。并且,为了C7C文库的呈现序列成为环状,这样表示的氨基酸序列中,其两端上包括具有必要的巯基的半胱氨酸。
图5是表示对克隆化的噬菌体与钛的结合能力进行研究的结果的图。
纵轴表示的是以对数表示已经洗脱的噬菌体的效价与加入的噬菌体的效价的比值,横轴表示图3、图4中所示各噬菌体克隆。
图6是表示利用晶体振荡器形生物分子相互作用分析装置QCM-D300对呈现由序列号3表示的肽的噬菌体克隆与钛表面的结合状态的分析结果的图。
图7是噬菌体向钛制晶体振荡器传感器上的结合状态的模式图。
利用QCM-D300模式化表示噬菌体克隆向钛制晶体振荡器传感器上的结合状态。上图,表示的是以BSA封闭传感器时的结合状态,下图表示的是没有封闭时的结合状态。
图8是表示实施例中采用的文库的碱基序列的图。
该图最开始的段落的左侧记载的“字母-数字-字母”写的是使用其引物制备的突变体的名字。名字的由来是氨基酸字符表示e3-2-3的序列,以数字表示的自其氨基酸残基的氨基端起始的位置,最后的A意思是指取代为丙氨酸。以P4A为例,就是自序列号3的N末端起的第4位的脯氨酸取代为丙氨酸中使用的引物。
接着,Δ7-12F、Δ7-12R、K2AΔ7-12R是实施例5中说明的缺失突变体制备中使用的引物。PCR中分别采用Δ7-12F和Δ7-12R的组合,Δ7-12F和K2AΔ7-12R的组合。
Ala insert是实施例6中说明的插入突变体制备中使用的引物。
图9是表示对呈现带来点突变的序列号4-14所示肽的噬菌体克隆与钛的结合能力的影响的研究结果的图。
纵轴以对数表示以呈现序列号4-14所示肽的噬菌体与钛的结合能力作为1时的点突变体的结合能力的值,横轴表示各个突变体。
图10是用PCR法的缺失突变体制备法的模式图的图。
图11是表示对呈现带来缺失变异和插入变异的序列号2和15所示肽的噬菌体克隆与钛的结合能力的影响的研究结果的图。
纵轴以对数表示以呈现序列号1所示肽的噬菌体克隆与钛的结合能力作为1时的点突变体的结合能力的值,横轴表示缺失和插入突变体。
图12是表示钛颗粒经过氧化氢处理对其与噬菌体的结合能力的影响的结果的图。
图13是表示对呈现由序列号3所示氨基酸序列构成的肽的噬菌体与各种金属的结合能力的研究结果的图。
纵轴是呈现由序列号3所示氨基酸序列构成的肽的噬菌体的结合量与不具有呈现序列的噬菌体的结合量的比值,表示由序列号3所示氨基酸序列构成的肽对结合的贡献。铜和铁这二者与噬菌体的结合量均在检出下限之下。
图14是表示由序列号3所示氨基酸序列构成的肽中丙氨酸取代变异对与钛、银、硅的结合的影响的研究结果的图。
纵轴表示以呈现由序列号3所示氨基酸序列构成的肽的噬菌体的结合量为1标准化的值。
图15是表示由序列号3所示氨基酸序列构成的合成肽的生物矿化生成的银颗粒的电子显微镜像和电子衍射模式的图片。
图16是表示由序列号3所示氨基酸序列构成的合成肽的生物矿化生成的硅石量与肽浓度的关系的图。
白色记号与虚线部分的肽浓度条件下,形成凝胶状的硅石,黑色记号与实线部分的肽浓度条件下,形成颗粒状的硅石。
图17是表示由序列号3所示氨基酸序列构成的合成肽的生物矿化生成的硅石颗粒的透射电子显微镜像和扫描电子显微镜像的图片。
图18是融合了由序列号1所示氨基酸序列构成的肽的铁蛋白表达载体构建的模式图。
图19是表示融合了由序列号1所示氨基酸序列构成的肽的重组铁蛋白与钛表面的结合结果的图。
具体实施方式
筛选与本发明的钛具有结合能力的肽的方法,只要是采用使噬菌体颗粒上呈现(display)有不同的肽序列的噬菌体团块(噬菌体文库)与钛接触,优选在水溶液中接触,通过离心回收通过肽序列结合噬菌体颗粒的钛,将所得与钛结合的噬菌体颗粒在大肠杆菌等菌体中增殖,接着,通过重复将增殖的噬菌体颗粒上呈现有各种肽序列的噬菌体团块与钛接触的淘洗(panning)操作浓缩与钛结合的噬菌体克隆的筛选方法即可,没有特别的限制,上述钛可以采用金属钛,钛合金或二氧化钛等钛。此外,上述噬菌体文库可以制备成噬菌体DNA中插入化学合成的随机DNA,通过在宿主大肠杆菌中导入基因生物合成形成噬菌体病毒的分子,表达病毒颗粒的外壳蛋白质pIII的N末端的前述的随机肽,在表层呈现随机化部分的氨基酸残基(-Xn-,X=随机氨基酸)的噬菌体,也可以使用市售的噬菌体文库(random 7 mer,12 mer,cyclic 7mer等)。
本发明的与钛、银和/或硅具有结合能力的肽,可以列举有通过上述本发明的筛选与钛具有结合能力的肽的方法所获得的与钛、银和/或硅具有结合能力的肽及其突变体。具体的是,在与钛、银和/或硅具有非常好的结合能力方面最好可以例举为序列号1所示氨基酸序列RKLPDA构成的与钛、银和硅具有结合能力的肽(Δ7-12),和由序列号1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛、银和/或硅具有结合能力的肽(Δ7-12突变体)。上述Δ7-12突变体中,优选是保留了序列号1所示氨基酸序列的第1位(Arg),第4位(Pro),第5位(Asp)的氨基酸残基的肽,在与钛、银和/或硅具有非常好的结合能力方面尤为优选第2位(Lys)取代为Ala的序列号2中所示氨基酸序列构成的肽。
此外,作为本发明的与钛、银和/或硅具有结合能力的肽,在与钛、银和/或硅具有非常好的结合能力方面可以例举为最好是序列号3所示氨基酸序列RKLPDAPGMHTW构成的与钛具有结合能力的肽(e3-2-3),和由序列号3所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛、银和/或硅具有结合能力的肽(e3-2-3突变体)。作为上述e3-2-3突变体,可以例举有第1-5位以及第7-12位氨基酸残基分别被取代为丙氨酸的序列号4-14所示的氨基酸序列所构成的肽(R1A,K2A,L3A,P4A,D5A,P7A,G8A,M9A,H10A,T11A,W12A),和在e3-2-3的N末端添加/插入丙氨酸的由序列号15所示氨基酸序列构成的肽(Alainsert)。Ala insert在与钛、银和/或硅具有非常好的结合能力方面是尤为优选的。
此外,作为本发明的与钛具有结合能力的肽,与e3-2-3相同的,可以例举有,从呈现12个残基的直线状随机肽的D12文库(纽英伦生物技术有限公司,Beverly)获得的序列号16-24所示氨基酸构成的肽,和由序列号16-24所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛具有结合能力的肽。
进而,作为本发明的与钛具有结合能力的肽,可以例举有从呈现7个残基的环状的随机肽的C7C文库(纽英伦生物技术有限公司)获得的序列号25-38所示氨基酸序列构成肽,和由序列号25-38所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛具有结合能力的肽。
这里,氨基酸的“取代、缺失或添加”的程度及其位置等,只要改变的肽是与由序列号1或3所示氨基酸序列构成的肽相同的与钛、银和/或硅具有结合能力的等效物就全部包含在本发明中。
此外,作为钛,可以例举有金属钛,钛合金,不定形二氧化钛,二氧化钛锐钛矿结晶,二氧化钛金红石结晶,二氧化钛板钛矿结晶。
作为上述本发明的与钛具有结合能力的肽组(以下,将这些肽称为“本申请结合钛的肽”),与银具有结合能力的肽组(以下,将这些肽称为“本申请结合银的肽”),与硅具有结合能力的肽组(以下,将这些肽称为“本申请结合硅的肽”),可以根据其氨基酸序列,按照一般的化学合成法制造。而,化学合成法中包含经通常的液相法和固相法的肽合成法。这种肽合成法更为具体的包括基于氨基酸序列信息的一次一个逐次结合各个氨基酸延长链的逐一延长法,和预先合成有几个氮基酸构成的片段,接着连结各个片段的反应的片段缩合法。本发明的肽的合成可以通过以上任一种进行。
上述肽合成中采用的缩合法可以按照公知的各种方法进行。其具体的例子可以列举有,如叠氮法、混酸酐法、DCC法、活性酯法、氧化还原法、DPPA(二苯基磷酰基叠氮)法、DCC+添加物(1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰胺、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-辛基二环庚烯二甲酰亚胺等)、woodward法。可以在这些方法中利用的可以在各种肽缩合反应中使用的溶剂可以从熟知的一般的溶剂中进行适当选择。作为例子,可以列举为如二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、六磷酰胺(ヘキサホスホロアミド)、二噁烷、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯等及其混合溶剂等。
在上述肽合成反应时,与反应无关的氨基酸或肽中的羧基,一般可以通过酯化,保护为例如甲酯、乙酯、叔丁基氰酯等低级烷基酸酯,例如苄基醚、p-甲氧基苯酯、p-硝基苯酯等芳烷基酯等。此外,侧链中具有官能团的氨基酸例如Tyr的羟基可以以乙酰基、苯甲基、苄氧羰基、叔丁基等形式进行保护,但不一定要进行这样的保护。此外,例如Arg的胍基可以通过硝基、甲苯磺酰基、2-甲氧苯磺酸基、亚甲基--2-磺酰基、苄氧羰基、异冰片基氧代羰基、刚玉氧代羰基(adamanthyl oxycarbonyl)等的适当的保护基进行保护。此外具有上述保护基的氨基酸、肽和最终获得的本申请与钛结合的肽等中这种保护基的脱保护反应中也可以按照惯用方法、例如接触还原法或按采用液氨/钠、氟化氢、溴化氢、氯化氢、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸等的方法实施。
此外,本申请与钛结合的肽等,可以根据编码本申请与钛结合的肽等的DNA碱基序列信息按照采用基因工程技术的常规方法方法进行制备。这样获得的本申请与钛结合的肽等,可以按照通常的方法例如离子交换树脂、分配层析法、高效液相色谱(HPLC)、逆流分布法等广泛应用于肽化学领域的方法对其进行适当精制。
此外,作为本申请与钛结合的肽、本申请与钛结合的银、本申请与钛结合的硅,可以有利地采用进行了化学修饰的肽。作为这种化学修饰,可以例举有取代为具有官能团的氨基酸所构成的化学修饰或用于容易与连结子形成结合的化学修饰,优选与经化学修饰的钛、银、硅的结合能力不降低的修饰。例如,作为上述用于容易与连结子形成结合的化学修饰可以列举有,利用生物素的N-羟基丁二酰亚胺酯与肽的氨基的生物素的共价结合。通过这种肽的生物素化,可以容易地制备出下述嵌合分子。
作为本发明的与肽、银、硅具有结合能力的人工蛋白质,只要是本申请与钛结合的肽、本申请与钛结合的银、或本申请与钛结合的硅与功能性肽或功能性蛋白质的结合体构成即可没有特别的限定,作为上述功能性肽或功能性蛋白质的功能可以例举有容易形成α螺旋等二级结构的功能、石灰化促进功能、骨增殖分化诱导功能、クロモフオア结合功能、胶原结合功能、细胞粘连功能、将蛋白质向细胞外定位的功能、靶向特定细胞内细胞器(线粒体、叶绿体、ER等)的功能、嵌入细胞膜的功能、淀粉样蛋白纤维形成功能、纤维性蛋白质形成功能、蛋白质性凝胶形成功能、蛋白质性薄膜形成功能、单分子膜形成功能、自我组装形成二维结晶等自我组装功能、粒子形成功能、辅助形成其他的蛋白质高级结构的功能、诱导病毒等的中和抗体的抗原的功能、免疫刺激化功能(自然医学(nature medicine),3:1266-1270,1997)、促进或抑制细胞增殖的功能、特异识别癌细胞的功能、蛋白质转导功能、细胞凋亡诱导功能、抗原决定残基呈现功能、金属结合功能、辅酶结合功能、催化活性功能、荧光发色活性功能、与特定的受体结合活化该受体的功能、与信号传递相关的特定因子结合从而调节其作用的功能、特异识别蛋白质、DNA、RNA糖等生物高分子的功能。这种人工蛋白质可以通过在与钛具有结合能力的肽中氨基酸水平上或DNA水平上直接或间接连结功能性肽或功能性蛋白质制备。在DNA水平上制备时,可以有利利用由本发明人提出的“高分子微基因聚合物的制备方法”(特许第3415995号公报)或“多功能碱基序列及含有它的人工基因”(特开第2001-352990号公报)所公开的人工蛋白质的设计技术。
上述功能性肽或功能性蛋白质中,例如采用和与钛、银或硅具有结合能力的肽相互协作的,自我组装形成二维结晶的肽或蛋白质时,可以构建出能够使钛、银或硅以纳米级沿着其二维结晶整列化的人工蛋白质。作为这种和与钛、银或硅具有结合能力的肽相互协作的,自我组装形成二维结晶的肽或蛋白质,可以列举有病毒(例如腺病毒,轮状病毒,脊髓灰质炎病毒,HK97,CCMV等)、铁蛋白和脱铁铁蛋白这样的铁蛋白家族、D-psA蛋白质和MrgA蛋白质。此外,作为自我组装形成二维结晶的肽或蛋白质,可以列举有人工设计的富有可重复性的人工蛋白质等。此外,作为制备蛋白质的二维结晶的方法,可以例举有在水面上以单分子膜展开蛋白质溶液后,吸收在固体基板上的方法。
此外,上述功能性肽或功能性蛋白质中,例如采用具有有着细胞粘连活性等细胞识别活性的肽序列的肽或蛋白质时,能够获得具有同时识别出钛、银或硅和细胞的复合活性的人工蛋白质。作为这种具有有着细胞粘连活性等细胞识别活性的肽序列的肽或蛋白质,可以例举有各种配体、单克隆抗体或其可变区域、单链抗体等,除此之外也不限于上述天然蛋白质,可以列举为含有具有细胞粘连活性的肽的人工蛋白质。
作为本发明的与钛、银或硅具有结合能力的嵌合蛋白质,可以列举为本申请与钛结合的肽、本申请与银结合的肽或本申请与硅结合的肽,与通过单独或与其它物质反应能够带来检出可能的信号的标识化物质或肽标记的结合体构成的嵌合分子。作为上述标识化物质,可以列举有酶、荧光物质、化学发光物质、放射性同位素、抗体的Fc区域等,具体的可以列举有过氧物酶(例如辣根过氧物酶)、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、青霉素酶、过氧化氢酶、apo葡萄糖氧化酶、尿素酶、虫荧光素酶、或乙酰胆碱脂酶等酶、异硫氰酸荧光素、フイコビリ蛋白质、希土类金属螯合物、丹磺酰氯或异硫氰酸四甲基若丹明等荧光物质、3H、4C、125I等放射性同位素、化学发光物质。此外,作为肽标记,可以具体地例举有HA、FLAG、Myc等表位标记和GST、结合麦芽糖的蛋白质、生物素化肽、寡聚组氨酸(His)等亲合性标记等以前已知的肽标记。例如,利用His标记与Ni-NTA的亲和性时,能够容易地制备出钛·肽或蛋白质复合体。
此外,作为本发明的与钛、银或硅具有结合能力的嵌合蛋白质,可以列举为本申请与钛结合的肽、本申请与银结合的肽或本申请与硅结合的肽,与非肽类化合物的结合体构成的嵌合分子。上述非肽类化合物中,作为非肽类低分子化合物可以具体地例举有氢化荧光素、牛角花素等荧光色素、氯霉素、氨苄青霉素等抗生物质,作为非肽类高分子化合物可以具体地例举有聚苯乙稀、聚丙烯、聚乙烯、玻璃珠、硅胶、多糖类(包括衍生物)、聚乙二醇等聚亚烷基二醇。
作为本发明的与钛、银或硅具有结合能力的噬菌体,只要是在噬菌体颗粒表面上展现本申请与钛结合的肽、本申请与银结合的肽或本申请与硅结合的肽即可不管什么样都可以,这种与钛、银或硅具有结合能力的噬菌体,除了通过经前述筛选过程从其它的噬菌体团块中分离出呈现与钛、银或硅分子强力结合的肽的噬菌体,获得与钛、银或硅具有结合的噬菌体之外,还可以通过常规方法在噬菌体mid载体中插入编码本申请与钛结合的肽、本申请与银结合的肽或本申请与硅结合的肽的DNA,以其转化大肠杆菌等宿主细胞,使其受辅助噬菌体感染而获得。由于一般而言M13和fd等纤维状噬菌体在高浓度的状态成为液晶状态,保持规则的排列结构,通过识别钛的肽噬菌体成为液晶状态,识别钛的肽可以以规则的纳米级建立排列的状态。
作为本发明的钛、银或硅与肽的复合体、或钛、银或硅与人工蛋白质的复合体、或钛、银或硅与嵌合蛋白质的复合体、钛、银或硅与噬菌体的复合体,可以列举有上述本发明的与钛、银或硅具有结合能力的肽、或与钛、银或硅具有结合能力的人工蛋白质、或与钛、银或硅具有结合能力的嵌合蛋白质、或与钛、银或硅具有结合能力的噬菌体通过离子结合、双电子结合、范德华力结合、疏水结合等弱结合中的随机一种或它们的组合与钛、银或硅结合的复合体。尤其是,钛-人工蛋白质复合体可以有利用作于移植材料、光催化剂、颜料等。
融合了与钛结合的肽的促进骨分化的细胞素,例如通过采用在钛制移植材料中通过介入与钛结合的肽结合BMP的材料,在钛移植物附近引起积极的骨化,有望缩短骨性结合的时间。此外,通过采用在钛制移植材料中通过介入与钛结合的肽结合促进人工融合了与钛结合的肽的羟基磷灰石的生物矿化的肽或蛋白质的材料,促进钛移植物表面的石灰化,有望骨性结合的时间。或者,通过采用在钛制移植材料中以与钛结合的肽为媒介结合人工融合了与钛结合的肽的具有抗菌作用的肽或蛋白质或化合物的材料,能够减低骨性结合中的感染症。进而,通过采用在钛制移植材料中以与钛结合的肽为媒介结合融合了与钛结合的肽的胶原的材料,能够构建出从未发现的牙根,胶原纤维与人工牙根垂直方向结合的结构。这就是,达到强力时,模仿原有的牙分散支持力的机制,通过这样当达到对于人工牙根的强力时,可以保持比原来的人工牙根更高的稳定性。
由于这种与钛结合的肽能够同时与银结合,因此例如融合了与钛结合的肽的胶原和氧化钛颜料与银结合的化妆品能够给予高抗菌作用。
进而,如果通过采用本发明的本申请与钛结合的肽的钛表面的改良方法,或采用与本申请与钛结合的肽结合的本发明的人工蛋白质的钛表面的改良、钛颗粒的形成或钛的整列化方法、或采用与本申请与钛结合的肽结合的本发明的嵌合蛋白质的钛表面的改良或钛颗粒的形成方法、或采用在颗粒表面呈现与本申请与钛结合的肽的本发明的噬菌体的钛的整列化或钛颗粒的形成方法,就能够改善钛表面的性状和钛的物理性质,尤其是通过利用蛋白质自我组装能力的氧化钛的制作布线图案,使纳米级装置的开发成为可能。
此外,如果通过采用本申请与银结合的肽或与本申请与硅结合的肽的银表面或硅表面的改良或者银颗粒或硅颗粒的形成方法,或采用与本申请与银结合的肽或本申请与硅结合的肽结合的本发明的人工蛋白质的银表面或硅表面的改良或者银颗粒或硅颗粒的形成、银或硅的整列化方法、或采用与本申请与银结合的肽或本申请与硅结合的肽结合的本发明的嵌合蛋白质的银表面或硅表面的改良或银颗粒或硅颗粒的形成方法、或采用在颗粒表面呈现与本申请与银结合的肽或本申请与硅结合的肽的本发明的噬菌体的银颗粒或硅颗粒的形成或银或硅的整列化方法,就能够改善银表面或硅表面的性状和银或硅的物理性质。
尤其是通过钛表面或银表面或硅表面的改良,能够给予生物在自身的体内外制备矿物(无机化合物)生物体矿物形成能力(biomineralization)。
此外,通过本申请与钛结合的肽或本申请与银结合的肽或本申请与硅结合的肽用作原子力显微镜(AFM)的探针(probe),使得在水溶液中分析固体材料表面成为可能。例如通过金·巯基结合将本申请与钛结合的肽或融合了本申请与钛结合的肽的融合蛋白质/嵌合蛋白质固定化成原子力显微镜的探针。通过使探针靠近于钛/银/硅的基盘,与钛结合的肽与基盘间产生相互作用,下次通过分离探针切断相互作用。然后就能够测定发生的张力。此外,通过二维扫描探针,以基盘表面和与钛结合的肽之间的结合力为指标,能够制备出force map。以制备出的force map为基础,开阔了在制作布线图案中合适的材料和晶面的选择等的范围。
下面,根据实施例更为具体地对本发明进行说明,本发明的技术范围不受这些示例的限制。
实施例1:
在1.5ml eppendorph管中加入10mg粒径为150μM的钛颗粒(住友チタニウム,兵库),用500μl的50mM Tris(羟甲基)甲胺(以下,Tris(キシダ化学,大阪))pH7.5的盐酸缓冲液,150mM氯化钠(和光纯药,大阪)溶液(以下TBS)中添加了0.1%牛血清白蛋白(以下BSA)0.1%聚氧化乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(以下,Tween-20(SIGMA公司,St.louis))的溶液两次清洗。通过桌上离心机H1300(コクサン)13,000rpm 5秒的离心操作,沉淀钛颗粒,去除上清进行钛颗粒的清洗。清洗后,为了封闭噬菌体的非特异的吸附,进而采用旋转搅拌机rotator RT-50(タイテツク公可)在室温下1ml相同溶液中旋转搅拌30分钟。
通过桌上离心机H1300(コクサン)13,000rpm 5秒的离心操作,沉淀钛颗粒,去除上清后,加入含有呈现肽的噬菌体文库,即呈现12个残基的直线状随机肽的D12文库(纽英伦生物技术有限公司,Beverly)的1.7×1011噬菌斑形成单位(以下,pfu)或含有呈现7个残基的环状的随机肽的C7C文库(纽英伦生物技术有限公司)的2.0×1011pfu的1ml TBS,0.1%BSA,0.1%Tween-20溶液,室温下用旋转搅拌机rotatorRT-50旋转搅拌两小时。
通过桌上离心机H1300(コクサン)13,000rpm 5秒的离心操作,去除上清后,用1ml TBS,0.1%Tween-20溶液清洗10次。清洗后,通过8,000×g 5秒的离心操作,进行钛颗粒的沉淀。去除清洗溶液后,加入1ml的0.2M甘氨酸(和光纯药)·pH2.2的盐酸缓冲液,通过采用タイテツク公司制造的旋转搅拌机rotator RT-50(タイテツク公司)室温下旋转搅拌洗脱与钛结合的噬菌体。通过离心操作,沉淀钛,将上清转移到其它的1.5ml eppendorph管中,进而通过加入150μl的1M Tris·pH9.1的盐酸缓冲液中和后,按照常规方法(分子克隆,第三版,冷泉港实验室出版社)测定溶液中的噬菌体效价(每单位溶液的噬菌斑形成能力)。
20mlLB培养液中以通过上述操作获得的噬菌体洗脱液对感染数增殖中的大肠杆菌ER2738株[F’lacIqΔ(lacZ)M15 proA+B+zzf::Tn10(TetR)fhuA2 supE thiΔ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5(rk -mk -McrBC-)],用振动培养机(BR40-LF,タイテツク公司)37℃下一边激烈搅拌一边温育6小时。将噬菌体感染菌培养液转移到离心管(50ml Beckman,カルフオルニア)中,进行2次用Beckman离心机(Beckman,JA-12转子)在4℃下以10,000,rpm离心10分钟去除ER2738株的操作,将上清的噬菌体液转移到其它管中。在噬菌体液中加入3.5ml(1/6量)的20%聚乙二醇6000(以下PEG6000、Fluka公司、Buchs)、2.5M盐酸钠溶液,通过test tuber mixerTM252(Iwaki)充分搅拌4℃下温育12小时,沉淀噬菌体。
用Beckman离心机在4℃下以10,000rpm将沉淀的噬菌体离心10分钟回收。进而,以4,000rpm将沉淀的噬菌体离心1分钟完全去除少量残留上清。在所得的噬菌体沉淀中加入1ml的TBS,水上冷却后,稳静地悬浮噬菌体。将该噬菌体悬浮液转移到1.5ml eppendorph管中,将经微量高速离心机(AT2018M转子,Kubota公司)以15,000,rpm离心5分钟的上清转移到其它管中,去除没有悬浮的残渣。在噬菌体液中再次加入200μl的20%PEG6000、2.5M盐酸钠溶液用搅拌器充分搅拌,沉淀在水中温育1小时的噬菌体。接着,通过微量高速离心机以15,000,rpm离心10分钟回收噬菌体沉淀。在所得的噬菌体沉淀中加入200μl的0.2%叠氮钠(和光纯药、大阪)、TBS完全悬浮。通过微量高速离心机以15,000,rpm离心5分钟去除无法悬浮的残渣。求出所得浓缩的噬菌体液的效价。
向上述所示的靶分子(这种情况下为钛)的噬菌体的结合、清洗、回收、由大肠杆菌增殖这样一系列操作,称之为淘洗(panning)操作。通过重复淘洗(panning)操作,就可能浓缩与靶分子特异强力结合的噬菌体克隆。这种情况,第1次淘洗(panning)操作后,用经一次大肠杆菌增殖的噬菌体,再次重复与钛的结合、清洗、回收、增殖的第2次之后的淘洗(panning)操作。第2次之后的淘洗(panning)操作试验条件与第1次的操作不同,如下所示。也就是,在第2次之后的淘洗(panning)操作中将加入的噬菌体的效价调制成D12文库和C7C文库共2.0×1011,第3次D12文库和C7C文库共2.0×1010,第4次D12文库4.3×1019、C7C文库2.0×1010。悬浮浓缩噬菌体的溶液与钛的反应溶液和其清洗溶液中的Tween-20浓度在第2次淘洗(panning)操作时为0.1%,在第3次淘洗(panning)操作时为0.3%,在第4次淘洗(panning)操作时为0.5%。
采用D12文库的淘洗(panning)试验的input效价(靶分子中加入的噬菌体效价)和output效价(从清洗后的目的分子中洗脱的噬菌体效价)的比值的变化表示在图1中,同时采用C7C文库的淘洗(panning)试验的输入效价和输出效价的比值的变化表示在图2中。
按照其各自的常规方法(Phage Display A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001),克隆采用D12文库和C7C文库的第3轮中获得的噬菌体,测定其呈现的肽部分的碱基序列。碱基序列的测定中通过采用相当于自呈现肽区域起下游96个碱基位置的碱基序列的互补链的引物[-96g III测序引物(5’-H0CCCTCATAGCCAGCGTAACG-3’)(序列号39)NEB公司的双脱氧终止法,Beverly],进行测定(CEQ DTCS Quick start kit、Beckman公司、カルフオルニア)。反应产物的移动和数据分析中,采用自动毛细管测序仪(CEQ2000,Beckman)。
由测定的碱基序列预计的呈现肽序列就D12文库而言表示于图3(序列号3,16-24)中,就C7C文库而言表示于图4(序列号25-38)中。
在这一点上,由D12文库获得的e3-2-3噬菌体的呈现肽序列RKLPDAPGMHTW(序列号3),在所研究的43个克隆中具有相同序列者有33个。形成特定的噬菌体克隆占据团块中的大多数的一个理由,可举例为这种噬菌体克隆对靶分子具有强结合能力。
克隆呈现图3(序列号3,16-24)、图4(序列号25-38)中所示的肽的噬菌体,按下述方式评价克隆化状态的噬菌体与钛的结合能力。
实施例2:
用通过实施例1获得的噬菌体克隆,根据以下实验评价对钛的结合能力。按由实施例1所示的淘洗(panning)操作相同的方法进行。与实施例1不同,钛与噬菌体克隆的搅拌时间为1小时,用各溶液中的Tween20的浓度为0.5%、BSA的浓度为1%进行时,按加入的噬菌体效价从D12获得的克隆为109pfu、从C7C获得的克隆为1011pfu实施。各个噬菌体克隆的与钛的结合能力汇集在图5中。
实施例3:
通过实施例2,尤其是对于与钛强力结合的克隆(呈现序列号3的肽),通过由晶体振荡器形生物体分子相互作用分析装置QCM-D300(q-sense AB公司,イエテボリ)的测定研究钛表面与噬菌体结合模式。
晶体振荡器中,采用QCM-D300纯正品的钛传感器。温度设定为24.99℃,实测值是从24.68℃至24.70℃附近。在用BSA封闭传感器的条件和不封闭传感器的条件下测定。不进行用BSA封闭传感器时,用TBS测定基准值后,按顺序测定噬菌体的效价调整成1010pfu/ml的噬菌体溶液。用BSA进行封闭时,用TBS测定基准值后,用TBS、0.1%BSA温育约十分钟来进行封闭,再次用TBS清洗游离的BSA后,用噬菌体的效价调整成1011pfu/ml的噬菌体溶液按顺序测定。其结果表示在图6中。
根据图6所示结果,没有BSA存在的条件下,噬菌体克隆与传感器的结合根据频率的变化是明显的,但是由于粘弹性没有那么大幅的上升,认为图7(下)所示的噬菌体在与钛表面水平上牢固结合。一方面,用BSA封闭传感器时,根据频率的变化量小得知与传感器结合的噬菌体量少,另一方面粘弹性大幅上升。这些结果提示如图7(上)所示,噬菌体对应于钛表面,主要以呈现肽区域结合,其它的噬菌体颗粒部分是在容易与钛结合的溶液中存在的形式结合。另一方面,对照的噬菌体中,在没有BSA存在条件下发现同样与钛表面的非特异的吸附,在用BSA进行封闭时,没有发现粘弹性上升。
实施例4:
实施例2中,尤其是对于与钛强力结合的克隆(序列号3),制备取代为支链上不具有甲基的丙氨酸的点突变体,研究各突变体噬菌体对应于钛的结合能力的变化。点突变体由于呈现序列的第6位有丙氨酸,对于除去第6位残基的残留的全部的残基进行制备。点突变体的制备按照Kunkel法(分子克隆第三版,冷泉港实验室出版社)进行。点突变体的制备中所用的合成DNA表示在图8(序列号40-50)中。点变异的导入的确认是通过测定噬菌体DNA的碱基序列来确定。DNA测序是与实施例1相同方式进行。所得点突变体与钛的结合能力的测定,按照加入的噬菌体的量共计1010pfu,实施例2中所示方法进行。各个点突变体的对钛的结合能力汇集在图9中。
根据图9所示结果,认为第1位的精氨酸,第5位的天冬氨酸的支链的电荷在与钛的结合中产生重要的作用。同时,根据第4位的脯氨酸的突变体的结果,提示在第4位的脯氨酸方面的肽的主链的折叠非常的重要。
实施例5:
根据实施例4的结果,与钛的结合中重要的是主要集中在序列号3的氨基酸部分。因此,制备缺失自羧基端侧的第7位至第12位的突变体,研究与钛的结合能力的变化。此外,对于实施例4中结合能力上升的第2位的赖氨酸取代为丙氨酸的突变体也制备同样的缺失突变体,研究与钛的结合能力的变化。
缺失突变体按图10模式表示的方法制备。用QIAGEN试剂盒制备各个噬菌体克隆的两条DNA(以下称RF)。以所得RF为模板进行PCR。此时采用的引物(图8,序列号51-53)中,可以在5’侧用限制性酶BamHI切断位点和BamHI切断,进而在5’侧添加3个残基的polyG序列。试剂采用ExpandTM长模板PCR系统(Long TemplatePcr System)进行,反应用100μl含聚合酶1μl、添加的10×缓冲液210μl、2.5mM dNTPs 8μl、引物100pmole/μl各1μl,0.5μlRF的溶液进行。PCR反应进行94℃30秒、60℃0秒、72℃6分钟的30个循环。此外,循环前进行94℃5分钟的预热,循环后72℃温育7分钟。PCR反应后,通过1%琼脂糖凝胶电泳分离生成物,UV下切出目的尺寸为7kb附近的条带,用Geneclean II试剂盒,按照附加的规程提纯。提纯的DNA用限制性酶BamHI在30℃下温育2小时后,经乙醇沉淀使BamHI失活,干燥DNA。干燥的DNA溶解于4μl的灭菌水、5μl的2×连接缓冲液(プロメガ)后,加入1μl T4DNA连接酶(ロシユ),室温下进行30分钟的连接反应从而自己环化。对于反应溶液,加入100μl的实施例1中记载的大肠杆菌ER2738株的感受态细胞,在水上静置30分钟后,施加42℃40秒的热激后,立刻在水上放置3分钟。之后,加入800μl的SOC培养液,37℃下激烈振荡培养3小时后,1,10,100μl与200μl对数增殖期的ER2738株混合,静置5分钟。之后,按照常规方法(分子克隆第三版,冷泉港实验室出版社)克隆化。缺失的导入的确认通过对噬菌体DNA的序列测序确认。DNA测序按与实施例1相同方式进行。所得缺失突变体与钛的结合能力的测定,按照加入的噬菌体的量共计1010pfu,实施例2中所示方法进行。两个缺失突变体的对钛的结合能力汇集在图1中。从图11得知呈现与钛结合的序列号1所示的肽的噬菌体克隆,只有前半部的第1-6位也同样强力结合。
实施例6:
实施例4的结果,得知序列号1第一个精氨酸的支链的正电荷在与钛的结合中产生重要的作用。但是,由于该精氨酸位于氨基末端的位置,主链的末端具有带正电的氨基。为了研究该正电荷与支链的正电荷强调的可能性,制备在精氨酸前插入丙氨酸的突变体,研究与钛的结合能力。
插入突变体的制备,除去退火条件按与实施例4相同的方法进行。在85℃10分钟、48℃15分钟后,切断加热块(ALB121,IWAKI)的开关,照原样放置直至下降至室温为止进行退火。所用的引物的序列(序列号54)表示在图8中。插入(insert)变异的导入的确认通过对噬菌体DNA的序列的测序进行确认。DNA测序按照与实施例1同样方式进行。所得插入突变体与钛的结合能力的测定,按照加入的噬菌体的量共计1010pfu,实施例2中所示方法进行。插入突变体的对钛的结合能力汇集在图11中。
实施例6的结果显示,虽然序列号15与钛结合,但是开头不必总是有精氨酸。这就是意味着在制备与钛结合的嵌合蛋白质、人工蛋白质或合成肽等时不受序列号1或3的排列的限制的重要的见识。
实施例7:
根据实施例3-6的结果,认为呈现由序列号3所示的肽的噬菌体克隆与和钛原子结合的带电荷的羟基结合。因此,为了增加与钛结合的羟基,研究呈现由序列号3所示肽的噬菌体克隆对于进行过氧化氢处理的钛颗粒的结合能力。
将10mg钛颗粒(颗粒径统在150mm以下,住友チタニウム)移到eppendorph管中,加入1ml 3%的过氧化氢(和光纯药)后,分别在120℃、80℃、室温(rt)下温育1小时后,用TBS两次清洗后,呈现由序列号3所示肽的噬菌体克隆的结合能力的测定按照加入的噬菌体的量共计1010pfu,实施例2所示方法进行。由过氧化氢处理产生的对与噬菌体的结合能力的影响的结果示于图12中。
根据实施例7的结果得知,经过氧化氢处理,能够增加呈现由序列号3所示肽的噬菌体克隆的结合量,由此提示通过改变钛表面的状态能够控制噬菌体的结合量。
实施例8:
为了研究呈现由序列号3所示氨基酸序列构成的肽的噬菌体克隆与金属材料的结合的特异性,采用对应于金(纯度>99.9%粒径<150μm)、银(纯度>99.9%粒径<75μm)、铜(纯度>99%粒径75-150μm)、白金(纯度>99.9%粒径<75μm)、铁(纯度>99.9%粒径150m)、锡(纯度>99.9%粒径<150μm)、锌(纯度>99.9%粒径150μm)、铬(纯度>98%粒径10μm)、钴(纯度>99%粒径<75μm)、硅(纯度>99%粒径<150μm)各10mg(高纯度化学研究所,埼玉)的1010pfu/ml由序列号3所示氨基酸序列构成的肽的噬菌体克隆,按与实施例2相同的方法研究与各种金属的结合能力。其结果汇集于图13中。根据图13所示结果,得知呈现由序列号2所示氨基酸序列构成的肽的噬菌体克隆不仅与钛而且与银或硅结合。
实施例9:
为了弄清呈现由序列号3所示氨基酸序列构成的肽的噬菌体克隆与银或硅的结合模式、序列特异性是否与钛结合的情况相同,用实施例4中使用的序列号4、5、7、8的丙氨酸取代变异的噬菌体的与银/硅的结合能力的测定按照实施例2所示方法进行。其结果汇集于图14中。根据图14所示结果,由各个丙氨酸的取代产生的对与银/硅的结合能力的影响显示与钛时相同的倾向。由此,提示呈现序列号3的噬菌体克隆是与和钛结合时相同的分子结构/序列特异的与银/硅结合。
实施例10:
为了确认由序列号3所示氨基酸序列构成的合成肽与钛表面结合,研究由序列号3所示氨基酸序列构成的合成肽对应于钛颗粒的结合能力。将实施例1中用的钛颗粒10mg移入eppendorph管中,用50mM HEPES-NaOH、150mM NaCl两次清洗后,添加100μl 5-40μM序列号3的合成肽,室温下用旋转搅拌机rotator RT-50(タイテツク公司)旋转搅拌两小时。通过桌上离心机H1300(コクサン)13,000rpm 5秒的离心操作,回收上清,与氟代醛(ピアス社Rockford Illinois)混合,用分光荧光光度计(日本分光东京),由激发波长342nm、荧光波长437nm,根据上清中的肽浓度求出与钛的结合量。根据密度与平均颗粒直径求出钛的比表面积。此外,用相同的方法对实施例13中使用的序列号2所示氨基酸序列构成的合成肽对于硅/锡而言的结合能力进行研究。对于所得结果代入用Langmuir吸附等温式进行计算,求出最大吸附量和离常数其结果汇集于表1。
(表1)
Kd(μM) | qm(摩尔/m2) | |
Ti | 11.1±2.8 | 2.5±0.3×10-6 |
Si | 13.2±4.0 | 2.1±0.3×10-7 |
Sn | ND | ND |
实施例11:
无机材料结合肽在许多情况具有将这种目的材料生物矿化的能力。因此,用以下方法研究由序列号3所示氨基酸序列构成的合成肽的银的生物矿化能力。在0.1-0.4mM溶解于TBS的由序列号3所示氨基酸序列构成的合成肽中加入硝酸银水溶液直至其终浓度为0.1mM,25℃下温育48小时后,通过离心操作回收生成的银。用蒸馏水充分清洗回收的银后,用透射式电子显微镜进行观察的结果汇集于图15中。根据图15所示结果,得知通过由序列号3所示氨基酸序列构成的合成肽生成了尺寸为约500nm的结晶性颗粒。
实施例12:
用以下方法研究由序列号3所示氨基酸序列构成的合成肽的硅的生物矿化能力。在2-12mg/ml溶解于TBS或PBS的由序列号3所示氨基酸序列构成的合成肽中加入1/10容量的以1mM HCl稀释成0.1M终浓度的四甲基硅烷(信越化学东京),之后在室温下静置5分钟,通过离心操作回收生成的硅。用蒸馏水充分清洗回收的硅后,通过20μl的0.5N NaOH、98℃温育30分钟溶解,250μl用蒸馏水稀释100-500倍的溶液中加入10μl的10倍稀释/有害金属测定用硫酸、10μl的10%钼酸铵水溶液,25℃下温育10分钟后,由385nm的吸光度对生成的硅的量进行定量。其结果或用透射式电子显微镜/扫描电子显微镜观察生成硅的形态的结果分别汇集于图16中。根据这些结果,得知通过由序列号3所示氨基酸序列构成的合成肽具有对硅颗粒的生物矿化能力。
实施例13:
由于带有由序列号1所示氨基酸序列构成的肽的序列的融合蛋白质显示获得与钛的结合能力,制备出与序列号1的融合的融合铁蛋白质(以下TBF)。用于表达TBF的质粒构建是按照图18中模式表示的方法进行。也就是,用限制性酶BamHI和SacI切断由序列号1所示氨基酸序列构成的肽的融合重组铁蛋白表达载体即马重组铁蛋白表达载体pMK2/ferritin、插入退火的序列号55和56中所示的合成DNA,接着用BamHI切断。在那里,插入经限制性酶BamHI切断pMK2/ferritin时产生的短DNA片段进行制备。
按常规方法(《分子克隆》,第三版,冷泉港实验室出版社)构建的TBF表达质粒转化大肠杆菌XLI-blue株。在5ml含有100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中培养转化菌株16-20小时,37℃下前培养后,在500ml含有100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中继续培养,进而在37℃下培养16-18小时。通过离心操作收集大肠杆菌后,用50mM Tris Hcl pH8.0缓冲液清洗菌体后,每升培养菌体用50mM Tris Hcl pH8.0缓冲液充分分散后,用超音波破碎装置Sonifer250(Branson公司制ダンバリ一,コネテイカツト),微量tip,输出量7,50%的工作循环2分钟破碎后,水冷却,重复2分钟破碎、水冷却充分破碎菌体。破碎后,通过离心操作回收可溶性馏分,70℃下温育15分钟,室温下放置徐徐冷却后,通过离心操作回收上清。通过采用阴离子交换载体Q-SepharoseHP(Amersham ピスカタウエイ,Jersey)的柱层色谱分离进行回收的溶液的提纯。通过0-400mM的盐酸钠的梯度洗脱TBF。通过超滤浓缩洗脱的TBF后,通过将Sephacry1S-400(Amersham ピスカタウエイ,Jersey)用作载体的凝胶过滤色谱法回收TBF的24量体的洗脱峰。
该TBF与钛的结合能力通过采用实施例3中使用的QCM进行。研究作为对照序列号1之外的与钛的结合的贡献,也研究不含由序列号1所示氨基酸序列构成的肽的重组铁蛋白质(fer0)与钛的结合。其结果表示在图19中。根据图19所示结果,得知TBF或与钛的结合比fer0强,显示出含有由序列号1所示氨基酸序列构成的肽的融合蛋白质与钛的亲和性大幅上升。
工业上利用的可能性
通过本发明,就可以提供例如缩短骨结合时间的钛移植材料,通过模仿牙对细菌感染性具有高抵抗性的钛移植材料等的医疗领域、可视光区域中有利用可能的具有光催化能的氧化钛材料等、能够有利应用于在纳米生物技术、材料工程、半导体、医药品、化妆品等中的复合体。
序列表
<110>独立行政法人科学技术振兴机构
<120>具有与钛、银、硅结合能力的肽
<130>N051-01PCT
<150>JP2003-282509
<151>2003-07-30
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Claims (68)
1、一种筛选与钛具有结合能力的肽方法,特征在于使噬菌体颗粒上呈现有不同的肽序列的噬菌体团块与钛接触,通过离心回收通过肽序列结合噬菌体颗粒的钛,在菌体中增殖所得与钛结合的噬菌体颗粒,接着,通过重复将增殖的噬菌体颗粒上呈现的各种肽序列的噬菌体团块与钛接触的淘洗操作浓缩与钛结合的噬菌体克隆。
2、与钛具有结合能力的肽,特征在于其由权利要求1中记载的筛选方法获得。
3、由序列号1所示的氨基酸序列构成的与钛具有结合能力的肽。
4、由序列号1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛具有结合能力的肽。
5、根据权利要求4中记载的与钛具有结合能力的肽,特征在于其保留序列号1所示氨基酸序列的第1,4,5位的氨基酸残基。
6、根据权利要求5中记载的与钛具有结合能力的肽,特征在于其由序列号2中第2位精氨酸被取代为丙氨酸所示的氨基酸序列构成。
7、由序列号3所示氨基酸序列构成的具有与钛具有结合能力的肽。
8、由序列号3所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛具有结合能力的肽。
9、根据权利要求8中记载的与钛具有结合能力的肽,特征在于其保留序列号3所示氨基酸序列的第1,4,5位的氨基酸残基。
10、根据权利要求8中记载的与钛具有结合能力的肽,特征在于其由第1-5位以及第7-12位氨基酸残基分别被取代为丙氨酸的序列号4-14所示的氨基酸序列所构成。
11、根据权利要求8或9中记载的与钛具有结合能力的肽,特征在于其由在序列号3所示氨基酸序列的N末端上添加/插入了丙氨酸的序列号15所示的氨基酸序列构成。
12、由序列号16-24所示的氨基酸序列构成与钛具有结合能力的肽。
13、由序列号16-24所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛具有结合能力的肽。
14、由序列号25-38所示的氨基酸序列构成与钛具有结合能力的肽。
15、由序列号25-38所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与钛具有结合能力的肽。
16、根据权利要求2-15任一项中记载的与钛具有结合能力的肽,其特征在于其是经化学修饰的肽。
17、根据权利要求2-16任一项中记载的与钛具有结合能力的肽,其特征在于钛是金属钛,钛合金或二氧化钛。
18、根据权利要求2-16任一项中记载的与钛具有结合能力的肽的与钛结合的钛-肽复合体。
19、根据权利要求2-16任一项中记载的与钛具有结合能力的肽与功能性肽或功能性蛋白质的结合体并且与钛具有结合能力的人工蛋白质。
20、根据权利要求19记载的人工蛋白质,其特征在于功能性肽或功能性蛋白质是和与钛具有结合能力的肽相互协作的,自我组装形成二维结晶的肽或蛋白质。
21、根据权利要求19记载的人工蛋白质,其特征在于功能性肽或功能性蛋白质是有着具有细胞粘连活性等细胞识别活性的肽序列的肽或蛋白质。
22、根据权利要求19-21任一项中记载的人工蛋白质的与钛结合的钛-人工蛋白质复合体。
23、根据权利要求2-17任一项中记载的与钛具有结合能力的肽与标识化物质或肽标记的结合体或者与非肽类化合物的结合体并且与钛具有结合能力的嵌合蛋白质。
24、根据权利要求23记载的嵌合蛋白质的与钛结合的钛-嵌合蛋白质复合体
25、噬菌体颗粒表面呈现根据权利要求2-17任一项中记载的与钛具有结合能力的肽且与钛具有结合能力的噬菌体。
26、根据权利要求25记载的噬菌体的与钛结合的钛-噬菌体复合体。
27、钛表面的改良或钛颗粒的形成方法,其特征在于采用根据权利要求2-17任一项中记载的与钛具有结合能力的肽。
28、钛表面的改良、钛颗粒的形成或钛的整列化方法,其特征在于采用根据权利要求19-21任一项中记载的与钛具有结合能力的人工蛋白质。
29、钛表面的改良或钛颗粒的形成方法,其特征在于采用根据权利要求23记载的与钛具有结合能力的嵌合蛋白质。
30、钛表面的整列化或钛颗粒的形成方法,其特征在于采用权利要求25记载的与钛具有结合能力的噬菌体。
31、以权利要求22记载的钛-人工蛋白质复合体作为有效成分的移植材料。
32、由序列1所示氨基酸序列构成与银具有结合能力的肽。
33、由序列号1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与银具有结合能力的肽。
34、根据权利要求33中记载的与银具有结合能力的肽,特征在于其保留序列号1所示氨基酸序列的第1,4,5位的氨基酸残基。
35、根据权利要求34中记载的与银具有结合能力的肽,特征在于其由序列号2中第2位精氨酸被取代为丙氨酸所示的氨基酸序列构成。
36、由序列号3所示氨基酸序列构成的具有与银具有结合能力的肽。
37、由序列号3所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与银具有结合能力的肽。
38、根据权利要求32-37任一项中记载的与银具有结合能力的肽,特征在于其是经化学修饰的肽。
39、根据权利要求32-38任一项中记载的与银具有结合能力的肽的与银结合的银-肽复合体。
40、根据权利要求32-38任一项中记载的与银具有结合能力的肽与功能性肽或功能性蛋白质的结合体并且与银具有结合能力的人工蛋白质。
41、根据权利要求40记载的人工蛋白质的与银结合的银-人工蛋白质复合体。
42、根据权利要求32-38任一项中记载的与银具有结合能力的肽与标识化物质或肽标记的结合体或者与非肽类化合物的结合体并且与银具有结合能力的嵌合蛋白质。
43、根据权利要求42记载的嵌合蛋白质的与银结合的银-嵌合蛋白质复合体。
44、噬菌体颗粒表面呈现根据权利要求32-38任一项中记载的与银具有结合能力的肽且与银具有结合能力的噬菌体。
45、根据权利要求44记载的噬菌体的与银结合的银-噬菌体复合体。
46、银表面的改良或银颗粒的形成方法,其特征在于采用根据权利要求32-38任一项中记载的与银具有结合能力的肽。
47、银表面的改良、银颗粒的形成或银的整列化方法,其特征在于采用根据权利要求40中记载的与银具有结合能力的人工蛋白质。
48、银表面的改良或银颗粒的形成方法,其特征在于采用根据权利要求42记载的与银具有结合能力的嵌合蛋白质。
49、银颗粒的形成或银表面的整列化方法,其特征在于采用根据权利要求44记载的与银具有结合能力的噬菌体。
50、由序列1所示氨基酸序列构成与硅具有结合能力的肽。
51、由序列号1所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与硅具有结合能力的肽。
52、根据权利要求49中记载的与硅具有结合能力的肽,特征在于其保留序列号1所示氨基酸序列的第1,4,5位的氨基酸残基。
53、根据权利要求50中记载的与硅具有结合能力的肽,特征在于其由序列号2中第2位精氨酸被取代为丙氨酸所示的氨基酸序列构成。
54、由序列号3所示氨基酸序列构成的具有与硅具有结合能力的肽。
55、由序列号3所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的并且与硅具有结合能力的肽。
56、根据权利要求50-55任一项中记载的与硅具有结合能力的肽,特征在于其是经化学修饰的肽。
57、根据权利要求50-56任一项中记载的与硅具有结合能力的肽的与硅结合的硅-肽复合体。
58、根据权利要求50-56任一项中记载的与硅具有结合能力的肽与功能性肽或功能性蛋白质的结合体并且与硅具有结合能力的人工蛋白质。
59、根据权利要求58记载的人工蛋白质的与硅结合的硅-人工蛋白质复合体。
60、根据权利要求50-56任一项中记载的与硅具有结合能力的肽与标识化物质或肽标记的结合体或者与非肽类化合物的结合体并且与硅具有结合能力的嵌合蛋白质。
61、根据权利要求60记载的嵌合蛋白质的与硅结合的硅-嵌合蛋白质复合体。
62、噬菌体颗粒表面呈现根据权利要求50-56任一项中记载的与硅具有结合能力的肽且与硅具有结合能力的噬菌体。
63、根据权利要求62记载的噬菌体的与硅结合的硅-噬菌体复合体。
64、硅表面的改良或硅颗粒的形成方法,其特征在于采用根据权利要求50-56任一项中记载的与硅具有结合能力的肽。
65、硅表面的改良、硅颗粒的形成或硅的整列化方法,其特征在于采用根据权利要求58中记载的与硅具有结合能力的人工蛋白质。
66、硅表面的改良或硅颗粒的形成方法,其特征在于采用根据权利要求60记载的与硅具有结合能力的嵌合蛋白质。
67、硅表面的整列化或硅颗粒的形成方法,其特征在于采用根据权利要求62记载的与硅具有结合能力的噬菌体。
68、将根据权利要求2-17任一项记载的与钛具有结合能力的肽、根据权利要求32-38任一项记载的与银具有结合能力的肽或根据权利要求50-56任一项记载的与硅具有结合能力的肽,用作原子力显微镜(AFM)的探针的方法。
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