CN1561394A - 人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林及有关蛋白的突变蛋白 - Google Patents

人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林及有关蛋白的突变蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于制备蛋白的突变蛋白的方法，其中，所述蛋白选自：人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林(hNGAL)、大鼠α2－微球蛋白相关蛋白(A2m)及小鼠24p3/子宫卡林(24p3)，所述突变蛋白对给定的靶标有可检测的亲合力。此方法包括将蛋白在一个或多个与hNGAL的序列位置33－54、66－83、94－106和123－136相对应的序列位置进行诱变，产生蛋白的一个或多个突变蛋白。本发明也公开了可以通过此方法获得的突变蛋白。

Description

人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林及有关蛋白的突变蛋白
技术领域
本发明涉及制备人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林(lipocalin)(hNGAL)、大鼠α2-微球蛋白相关蛋白(A2m)或小鼠24p3/子宫卡林(uterocalin)(24p3)的突变蛋白的方法，其中此突变蛋白对给定靶标有可检测的亲合力，并涉及可通过本方法获得的这三个蛋白的突变蛋白。本发明也涉及编码这些突变蛋白的核酸、含有本发明突变蛋白的药物组合物及人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林、大鼠α2-微球蛋白相关蛋白(A2m)和小鼠24p3/子宫卡林(24p3)的突变蛋白的各种用途。
发明背景
脂卡林(Pervaiz和Brew，FASEB J.1(1987)，209-214)是一个由常常为单体的分泌型小蛋白组成的家族，这些蛋白已经从各种生物体中分离出来，其生理学作用在于存放或运输不同靶物质，例如类黄醇或信息素，及参与更复杂的生物学功能例如味觉和嗅觉或前列腺素合成(综述，例如，Flower，Biochem.J.318(1996)，1-14)。脂卡林成员之间有相对小的相互序列相似性，作为蛋白结构家族，它们的关系首先通过x射线结构分析阐明(Sawyer等，Nature 327(1987)，659)。
脂卡林的典型靶标是低分子量的亲脂物质例如retinoid、脂肪酸、胆固醇、前列腺素、胆绿素、信息素、tastant、及添味剂(Flower，Biochem.J.318(1996)，1-14；也参见Kjeldsen，Biochimica et BiophysicaActa，1482(2000)，272-283)。对于视黄醇结合蛋白(Rbp)及β-乳球蛋白，脂卡林的一个典型靶标是维生素A(Papiz等，Nature 324(1986)，383-385)。
抗体，例如免疫球蛋白，是蛋白通过非共价相互作用选择性结合靶标的经典例子。这些蛋白作为试剂在生物技术、药学、生物分析及普通生物和生命科学领域扮演关键角色。尽管很多倍地需要与配体/靶标识别、结合或分离相关联的结合蛋白，但目前几乎仅有免疫球蛋白被用于这些目的。有明确的配体结合特征的其他蛋白，例如凝集素的应用仍然限于特定情况。
近来，脂卡林家族成员已经在关于有确定配体结合特征的蛋白的研究中成为研究对象。德国Offenlegungsschrift DE 19742706和国际专利公开WO 99/16873记载了anticalin_类；对给定配体有特异结合特征的类似于抗体的多肽(也参见Beste等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(1999)1898-1903)。起始自脂卡林家族多肽通过在如下四个片段中进行突变可以获得Anticalin_，这四个片段与后胆色素结合蛋白(Bbp)中含有氨基酸位置28到45、58到69、86到99、114到129的线性多肽序列的序列位置相对应。
另外，德国专利DE 19926068，WO 00/75308及Schlehuber等J.Mol.Biol.(2000)，1105-1120描述了后胆色素结合蛋白的突变蛋白例如特异结合地高辛配基的突变蛋白DigA和DigA16。
尽管anticalin_技术大体上已经建立且可能在如上述的地高辛配基结合Bbp突变蛋白方面产生有前途的实践应用，但仍需要其它的改进和实践应用。考虑到在生命科学领域中配体或靶标结合蛋白的各种潜在用途，纯粹出于实践应用中有更多的选择的原因，亦需要基于可选择的脂卡林支架制备anticalin_。
因此，本发明的目的是提供对给定靶标有结合亲合力的可选择脂卡林的突变蛋白。
发明内容
上述目的通过具有本申请独立权利要求的技术特征的方法和突变蛋白而解决。
此方法是用于制备选自下组中的蛋白的突变蛋白的方法：人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林(hNGAL)，大鼠α2-微球蛋白相关蛋白(A2m)及小鼠24p3/子宫卡林(24p3)，所述突变蛋白对给定靶标有可检测的亲合力，所述方法包括步骤(a)：对蛋白在与hNGAL的序列位置33-54、66-83、94-106、123-136相对应的一个或多个序列位置进行诱变，产生蛋白的一个或多个突变蛋白。
此方法优选地还包括步骤(b)，即，通过筛选从所获一个或多个突变蛋白中富集对给定靶标有结合亲合力的至少一个突变蛋白，和/或分离所述至少一个突变蛋白。优选地，诱变导致产生蛋白的多个突变蛋白，即，两个或多个突变蛋白。
这意味着本发明基于以下发现：人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林(hNGAL)及其大鼠(A2m)和小鼠(24p3)来源的同源蛋白为制备对给定的目的靶标有结合活性的蛋白提供了合适支架。hNGAL已经鉴定为脂卡林家族的成员且其三维结构已经由NMR(Coles等，J.Mol.Biol.289(1999)，139-157)和x射线晶体学(Goetz等，Biochemistry，39(2000)，1935-1941)解析，但直到今天无论其生理功能或其自然靶标仍没有被清楚地鉴定(Kjeldsen等，上面提到的引文)。因此，本发明第一次为hNGAL以及其同源A2m和24p3提供了可能的实践用途。
蛋白A2m和24p3中根据本发明方法进行诱变的氨基酸位置由hNGAL、A2m和24p3的氨基酸序列比对来确定。在与hNGAL有相同的氨基酸残基数目(178)的蛋白A2m中，用于诱变的序列位置与hNGAL中选择的位置，即hNGAL的序列位置33-54、66-83、94-106、123-136相同。对于24p3，相应的序列位置是序列位置33-54、66-85、96-108、125-138。因此，进行诱变的氨基酸位置分散于如下四个序列片段之中，这四个片段对应于hNGAL、A2m和24p3三维结构中的四个环。
用于诱变的上述片段(环)的数目可以变化。为了产生对给定靶标有可检测亲合力的突变蛋白，并不一定需要同时，例如在协同诱变中突变所有这四个环，也可以只进行两个或三个环的突变。
在根据本发明方法的一个优选实施方案中，各个蛋白，即hNGAL、A2m或24p3分别在与hNGAL序列位置40-50、70-79、101-103、125-132相对应的一个或多个序列位置进行诱变。例如，如果选择hNGAL用于制备突变蛋白，则对hNGAL在选自序列位置40-50、70-79、101-103和125-132的一个或多个序列位置处进行诱变。
在此方法的一个更优选实施方案中，各个蛋白在与hNGAL序列位置40、42、44、46、47、49、50、70、72、73、77、79、101、102、103、125、127、128、130、132相对应的一个或多个序列位置进行诱变。
在特别优选的实施方案中，在hNGAL或A2m的序列位置40、42、44、46、47、49、50、70、72、73、77、79、101、102、103、125、127、128、130和132或24p3的相应序列位置中至少有10个，更优选有至少15个被诱变。在最优选实施方案中，所有这20个序列位置均被随机化，其中优选在这些位置允许所有20种天然氨基酸整合入多肽序列。
这意味着本发明基于以下发现：对给定靶标有可检测亲合力的hNGAL或其同源A2m和24p3的突变蛋白可以通过诱变，优选随机诱变总共20个氨基酸残基，即hNGAL的序列位置40、42、44、46、47、49、50、70、72、73、77、79、101、102、103、125、127、128、130和132而获得。由于几个原因本发现是特别令人惊喜的。
正如指出的，在根据本发明方法的此优选实施方案中，一组总共20个氨基酸被随机化，即被诱变；而在WO 98/16873中总共只有16个氨基酸被突变。当将随机NNS或NNK密码子诱变用于这20个氨基酸位置的完全随机化时(即，在这所选的20个位置的每个位置处都允许20种天然氨基酸的每一个出现)，存在3220种可能的密码子组合。如果16个氨基酸位置用于随机化，存在3216种可能的密码子组合。因此，将进行随机诱变的氨基酸的数目增加4个(从16到20)，可以导致组合复杂性增加324≈106。然而，由于实验限制，在基于DNA的相应文库中可以实际上实现的突变体的数目不能任意地增加，并且根据本领域现状该数目通常限定在约1×109-1×1010(Fitzgerald，Drug Discov.Today 5(2000)，253-258)。在本发明的一个实施例中，使用了含有仅仅约1×107个序列变体(突变蛋白)的组合DNA文库。
考虑到组合序列空间中小的可获取部分将进一步缩小约106倍，令人惊喜的是完全有可能从含有仅1×107个序列变体的组合文库中分离出(a)不但可折叠成可溶性蛋白而且(b)甚至有新的配体/靶标特异性的hNGAL(或A2m或24p3)突变蛋白。
在这个方面，应当注意的是此处采用的方法与WO 99/16873中的教导是不同的。根据此文献，在单个实验中突变的氨基酸位置总数保持尽可能的低应当是有用的，这样诱变获得的变体集合，即文库才可能就整体或至少其中有代表性的选择部分而言实现尽可能的完整。
最后应当注意的是，令人惊喜的是本发明方法还能成功地用于制备对蛋白表位有特异结合活性的突变蛋白(参见例如实施例5、15)。
本发明也涉及对给定靶标有可检测亲合力的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林、大鼠α2-微球蛋白相关蛋白(A2m)或小鼠24p3/子宫卡林(24p3)的突变蛋白；此突变蛋白可以通过相应蛋白在与hNGAL序列位置33-54、66-83、94-106、123-136相对应的序列位置上的诱变获得。优选可以通过对相应蛋白在与hNGAL序列位置40-50、70-79、101-103、125-132相对应的位置进行诱变而获得的突变蛋白。
优选地，此突变蛋白在所选20个序列位置的5-10个，更优选8-12个或者最优选10-18个或10-20个序列位置处带有氨基酸替换。
在一个优选实施方案中，突变蛋白具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列。此突变蛋白也称作TlpcA。
本发明突变蛋白能与所需的靶标结合且有可检测的亲合力，即，具有优选至少105M-1的亲合常数。比这个低的亲合力用常规方法例如ELISA通常不再是可测量的，因此对于实践应用而言重要性次之。特别优选的是能结合所需的靶标且有至少106M-1亲合力(相应于1μM复合物的解离常数)的突变蛋白。本领域技术人员可以用多种方法测量突变蛋白与所需的靶标的结合亲合力，例如通过荧光滴定、通过竞争性ELISA或通过表面等离子体共振技术测量。
突变蛋白结合的靶标(配体)可以是任何化学部分，例如，也可以被免疫球蛋白识别和结合的化学部分。因此，靶标可以是游离或缀合形式的化学化合物，它可以显示以下化合物的特征：半抗原、激素例如类固醇激素或任何生物聚合物或其片段，例如肽、蛋白或蛋白结构域、肽、寡脱氧核苷酸、核酸、寡糖和多糖或者另外的大分子或其缀合物。本发明优选实施方案中，靶标是蛋白。
本发明突变蛋白在突变片段，即对于hNGAL而言氨基酸位置33-54、66-83、94-106、123-136的区域之外可以具有hNGAL、A2m或24p3的天然氨基酸序列。另一方面，此处公开的突变蛋白也可以在进行诱变的位置外含有氨基酸突变(与野生型蛋白相比而言)，只要这些突变不影响突变蛋白的结合活性及折叠即可。这包括可以将例如，氨基酸残基的突变、替换、缺失、插入及N-和/或C-端的添加引入hNGAL、A2m或24p3的天然氨基酸序列中。
对所选蛋白的氨基酸序列(无论在所选的结合区域之内或之外)的此类修饰包括定点诱变各单个氨基酸位置，例如为了简化突变后的脂卡林基因或其部分的亚克隆，可以并入某些限制性酶的切割位点。例如，可以向hNGAL基因引入Glu28到His和/或Thr145到Ala的突变，以便通过两个新BstXI限制位点简化突变基因片段在这些位置的克隆。而且，可以在四个肽环之内或之外引入突变，以改善所选作为支架的蛋白的突变蛋白的某些特征，例如其折叠稳定性或折叠效率或其对蛋白酶的抗性。
例如，在一个优选实施方案中，hNGAL的Cys87替换成Ser或Ala，由此可以防止其与其他蛋白例如明胶酶B的共价交联(这可能在体内应用突变蛋白时发生)并且可以稳定其单体结构。相似地，作为诱变和筛选本发明突变蛋白的结果而可能出现的Cys残基对于结合给定的靶标并不总是至关重要的，故也可以由Ser或Ala替换以防止共价键形成或巯基氧化。
在hNGAL的一个优选突变蛋白中，Cys87被替换和/或突变蛋白与hNGAL相比带有氨基酸替换Glu(28)→His和Thr(145)→Ala中的一个或两个。在这方面，应当注意的是本发明也涉及有天然氨基酸序列的(重组)hNGAL，其中只有Cys87由任何其他合适的氨基酸替换。用此处描述的用于制备本发明其他突变蛋白的方法可以制备此hNGAL多肽(参见实施例4)，例如通过使用pHNGAL7载体来制备。
本发明的方法优选包括(在步骤(b)中)(i)提供作为给定靶标的化合物，它选自显示出免疫半抗原、肽、蛋白或其他大分子的特征的游离或缀合形式的化学化合物，(ii)使所述靶标与多个突变蛋白接触以允许所述靶标与对所述靶标有结合亲合力的突变蛋白之间形成复合物，(iii)去除没有或基本上没有结合亲合力的突变蛋白。
没有或基本没有结合亲合力是指在所用条件下，在靶标与跟靶标接触的多个突变蛋白之间没有形成复合物。本领域技术人员清楚，复合物形成依赖于许多因素例如结合伙伴的浓度、作为竞争者的化合物的浓度、缓冲液的离子强度等等。筛选和富集通常在允许分离和富集对靶标有至少105M-1亲合常数的突变蛋白的条件下进行。然而，洗涤和洗脱步骤可以在不同严紧性下进行。例如，如果要分离有至少106M-1亲合常数的突变蛋白，可以在增加的严紧性下，即更严紧的条件下进行洗涤和洗脱。也可以就动力学特征进行选择。例如，筛选可以在有利于靶标和突变蛋白形成复合物的条件下进行，其中所述突变蛋白显示出与靶标(受体)的解离缓慢，或者换句话说具有低Koff率。
此处所用术语“多个”指存有至少两个在其氨基酸序列上能彼此区别开的突变蛋白。由诱变产生的突变蛋白的上限通常由实验条件限制，通常在107到1012之间。
术语“诱变”如此处所用指选择实验条件以便在hNGAL、A2m或24p3的序列位置处自然存在的氨基酸可以被在相应这些天然多肽序列的此特定位置处不存在的至少一个氨基酸所替换。术语“诱变”也包括(附加地)，通过缺失或插入一个或多个氨基酸改变序列片段的长度。因此，本发明的范围包括例如，在所选序列位置处一个氨基酸由一连串三个随机突变所替代，从而导致与野生型蛋白(相应片段)的长度相比有两个氨基酸残基的插入。术语“随机诱变”是指在某个序列位置不出现既定的单个氨基酸(突变)而是在诱变中可以以某一概率使至少两个氨基酸整入所选序列位置。
此实验条件，例如可以通过在结构基因中，例如，对于hNGAL在那些待被突变的位置处掺入具有简并碱基组成的密码子得到。例如，使用密码子NNK或NNS允许在诱变中整入所有20种氨基酸加琥珀终止密码子，而密码子VVS将可能整入的氨基酸数目限定到14，因为它排除了氨基酸Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val在多肽序列的所选位置的整入；使用密码子NMS使得例如，在所选序列位置处可能的氨基酸数目被限定到11，因为它排除了氨基酸Arg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Val在所选序列位置处的整入。在本发明方法的一个优选实施方案中，进行随机诱变，其中至少4个，优选6个，更优选8到12个或者8到15个氨基酸被允许整入hNGAL、A2m或24p3的一个所选序列位置。在特别优选的实施方案中，对至少一个序列位置进行完全随机化，即在诱变中所有20种氨基酸都被允许整入此位置。通过上面可以清楚，在各个蛋白例如hNGAL的某个序列位置自然出现的氨基酸也可以在该位置被诱变后于突变蛋白中出现。
在本发明方法的一个优选实施方案中，靶标是蛋白。蛋白可以以游离形式或缀合形式或以融合蛋白形式提供用于选择突变蛋白。
在本发明方法的一个优选实施方案中，使用编码选自hNGAL、A2m和24p3的单个蛋白的多个突变蛋白的核酸。此核酸由诱变产生，并且在3’末端与编码M13丝状噬菌体家族的外壳蛋白pIII或其片段的基因可操作地融合，以便选出结合给定靶标的至少一个突变蛋白。
可以通过使用PCR获得由诱变产生的核酸。在本发明方法的一个优选实施方案中，制备编码相应蛋白的突变片段的核酸包括以下两个步骤。首先，用PCR产生两个核酸片段，每个各编码突变蛋白的一部分，并使这些片段部分地重叠。这些片段与两个侧翼引物在第二扩增步骤中一起使用以获得含有完整突变结构基因的核酸(见图2及实施例1，其中阐述了这两个步骤)。由于重叠，在此反应中可以扩增全长PCR产物，而不必添加任何额外的核酸。在两个独立的扩增反应中用一对或多对适宜引物可以得到上述的两个片段(也参见图2和实施例1，其中显示这两个片段在PCR反应A和B中产生)。
对于某些应用，使用标记形式的本发明的hNGAL、A2m或24p3的突变蛋白是有用的。因此，本发明也涉及此处用作支架的这三个蛋白的突变蛋白，它与选自下组的标记物缀合：酶标记物、放射性标记物、荧光标记物、显色标记物、发光标记物、半抗原、生物素、地高辛配基、金属配合物(metal complex)、金属及胶体金。突变蛋白也可以与有机分子缀合。在本申请中使用的术语“有机分子”优选指含有至少两个碳原子但不超过7个可旋转碳键且分子量在100-2000道尔顿之间，优选1000道尔顿的有机分子和包括一个或两个金属原子的分子。
通常，可以用任何合适的化学物质或酶标记突变蛋白，这些化学物质或酶可以在化学、酶学或物理反应中直接或间接产生能用于检测的可检测化合物或信号。物理反应的一个例子是通过辐射激发后发射荧光或者通过放射性标记物发射X射线；碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶是酶标记物的例子，它们能催化形成随后可以被检测的显色(有颜色)化合物。通常用于抗体的所有标记物，除了那些专有地与免疫球蛋白Fc段中的糖部分一起使用的标记物外，也可以用于与本发明突变蛋白缀合。可以用本领域技术人员已知的方法制备这些缀合物。
对此处公开的突变蛋白的实践应用而言特别有利的一项可选方案是以融合蛋白的形式使用突变蛋白。在此融合蛋白的优选实施方案中，酶、蛋白或蛋白结构域、肽，例如信号序列和/或亲合标签等肽可操作地与突变蛋白的氨基端或羧基端融合。
融合伙伴能适当地赋予突变蛋白新特征，例如酶活性或对其他分子例如蛋白、大分子或低分子量靶标的亲合力。例如，可以与催化显色或荧光反应的酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶)或具有释放细胞毒性剂的作用的酶融合。在实践中可能有利的融合伙伴的另外例子是结合结构域例如蛋白质G的白蛋白结合结构域、蛋白质A、抗体片段、寡聚化结构域、毒素或本发明突变蛋白或者anticalin_，它们可以具有不同或相同的靶标特异性。后者的具体例子是含有本发明hNGAL突变蛋白和在德国专利DE19926068中公开的地高辛配基结合突变蛋白DigA16的融合蛋白。可用于亲合层析纯化和/或用于检测(例如使用Strep-tag_对链霉抗生物素蛋白的特异亲合力)的亲合标签例如Strep-Tag_或Strep-tag_II(Schmidt等J.Mol.Biol.255(1996)，753-766)或寡聚组氨酸标签(例如His6-tag)或蛋白例如谷胱甘肽-S-转移酶是优选的融合伙伴的另外例子。有显色或荧光性质的蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)也是合适的融合伙伴。
如此处所用，术语“融合蛋白”也包括装有信号序列的本发明突变蛋白，例如hNGAL的突变蛋白。位于本发明多肽N-端的信号序列可以适宜地在生物合成过程中指导多肽到达特定的细胞区室，例如进入大肠杆菌的周质或真核细胞的腔或者进入细胞周围的介质中。在此过程中，信号序列由信号肽酶切割。也可以使用其他引导序列或信号序列，但它必须位于多肽的N端并且允许多肽定位于特定细胞区室。用于分泌入大肠杆菌周质的优选信号序列是OmpA信号序列。大量的另外的信号序列是本领域已知的。
本发明也涉及含有编码本发明突变蛋白或其融合蛋白的序列的核酸分子。在优选实施方案中，核酸分子含有编码突变蛋白SEQ ID NO.12的核苷酸序列。
由于遗传密码的简并性允许某些密码子可以被规定相同氨基酸并因此导致相同蛋白的其他密码子替换，故本发明不限于特定的核酸分子，而是包括含有编码具有本发明氨基酸序列的突变蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。
含有编码本文公开的hNGAL、A2m或24p3之任一个的突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子可以与调节序列可操作地连接以允许核酸分子在宿主细胞(体内)表达或在无细胞系统(体外)中转录和翻译。
如果一个核酸分子例如DNA包括含有转录和翻译信息的核苷酸序列，并且这些序列与编码多肽的核苷酸序列“可操作的连接”，则该核酸分子被认为“能表达核酸分子或表达核苷酸编码序列”或者能“允许核苷酸序列表达”。可操作连接是指调节DNA序列与待表达的DNA序列以允许基因表达的方式相连。基因表达所需的调节区和元件的精确性质可能因生物体而异，但通常应包括启动子区，例如在原核生物中，包括启动子调节序列——该序列可以包括在细胞内有功能的转录区和在细胞内有功能的转录终止区。用于转录或翻译的元件有启动子、增强子、前导序列、转录起始位置和转录终止位置、多腺苷酸化信号、核糖体结合位点例如Shine-Dalgarno序列等等。这些调节序列和/或本发明突变蛋白可以是载体的一部分。因此，本发明也涉及含有编码如本文公开的hNGAL、A2m或24p3的突变蛋白的核酸序列的载体。
在另一个实施方案中，本发明也涉及制备本发明突变蛋白或其融合蛋白的方法。在此方法中起始自编码突变蛋白的核酸通过基因工程方法在细菌或真核宿主生物体内制备突变蛋白或融合蛋白，并从此宿主生物体或其培养物中分离该蛋白。为此，通常首先用包含编码例如本发明NGAL突变蛋白的核酸分子的载体转化适宜的宿主细胞。然后在允许此多肽生物合成的条件下培养此宿主细胞——它可以是任何原核或真核宿主细胞。然后通常从细胞或从培养基中回收多肽。由于人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林、A2m和24p3均含有一个结构二硫键，故优选通过合适的信号序列指导多肽进入具有氧化巯基/二硫化物氧化还原环境的细胞区室。此氧化环境存在于细菌例如大肠杆菌的周质中或真核细胞内质网腔中，并通常有助于二硫键的正确形成。然而，也可以在宿主细胞，优选大肠杆菌的胞质中生产本发明多肽。在这种情况下，多肽可以，例如，以包函体的形式生产，之后体外复性。另一个选择是使用在胞质中有氧化环境并因此允许在胞质中产生天然蛋白的特异突变菌株。
从以上公开可见，可以在多种应用中使用本发明突变蛋白或其融合蛋白或其缀合物。通常，本文公开的突变蛋白可以用于所有使用抗体的用途中，除了特别依赖于Fc段糖基化的那些用途。
突变蛋白的优选用途是用本发明突变蛋白或其融合蛋白检测靶标，它包括的步骤是：在合适条件下使突变蛋白与怀疑含有给定靶标的样品接触，由此允许突变蛋白与给定靶标之间形成复合物，并通过合适的信号确定形成复合物的突变蛋白。此信号可以由标记物，例如上述荧光或显色标记物引起。此信号也可以由物理特性的改变引起，而此改变是结合引起的，即由复合物形成本身引起。此特性的一个例子是表面等离子体共振，在结合伙伴的结合过程中共振值改变，其中一个结合伙伴固定于表面例如金箔上。
如上面提到的，与抗体或其片段类似，本文公开的突变蛋白及其衍生物能用于许多领域。突变蛋白优选用于结合固相，以使突变蛋白的靶标或此靶标的缀合物或融合蛋白能被固定或分离。本发明突变蛋白更优选的用法是标记上酶、抗体或放射性物质或有生化活性或确定的结合特性的其他基团，以使突变蛋白的靶标或此靶标的缀合物或融合蛋白能被检测或接触。通过成熟的生物分析方法例如ELISA或Western印迹，应用显微镜或免疫传感术，本发明突变蛋白可以例如用于检测化学结构。此处，检测信号可以通过合适的突变蛋白缀合物或融合蛋白直接产生，或者通过用针对突变蛋白的抗体或者例如通过使用亲合标签检测结合的突变蛋白间接产生。
在医学中也存在hNGAL、A2m或24p3的突变蛋白的多种可能应用。除了用于诊断外，还可以制备结合例如组织或肿瘤特异性细胞表面分子的本发明突变多肽。此突变蛋白可以，例如以缀合物或融合蛋白形式用于“肿瘤成像”或直接用于癌症治疗。
本文所述突变蛋白的另一个相关的优选用途是靶标确认，也就是检查经推测参与疾病或紊乱发展的多肽是否真正地以某种方式引起疾病或紊乱。确认蛋白为药理学药物靶标的这个用法利用了本发明突变蛋白特异识别蛋白天然构象的表面区域的能力，也就是本文公开的突变蛋白结合天然表位的能力。在这方面，值得注意的是，不论是由K_hler和Milstein(Nature256(1975)，495-497)的经典免疫方法制备的抗体还是由组合技术例如噬菌体展示制备的抗体，这种结合天然表位的能力仅仅在有限数量的重组抗体中有过报道。使用突变蛋白确认药物靶标不仅包括检测蛋白靶标，也包括检测存在形式为蛋白结构域、肽、核酸分子、有机分子或金属配合物的靶标。
在另一方面，本发明涉及含有本发明的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林、大鼠α2-微球蛋白相关蛋白(A2m)或小鼠24p3/子宫卡林(24p3)的突变蛋白或其融合蛋白及药学可接受载体的药物组合物。
有药物价值的突变蛋白，例如hNGAL突变蛋白，可以是，例如结合肿瘤特异性细胞表面的突变蛋白。也可以是结合特定药物并起到使药物“持续释放”或者使药物在患者体内长时间存留的作用的突变蛋白。此突变蛋白可以以任何对于蛋白质药物有效的治疗路径给药，例如通过肠胃外的、鼻内的、直肠的、口腔的方式给药或通过喷雾或气雾剂吸入呼吸道。可以以剂量单位制剂形式给药，此制剂含有所需的传统无毒药学可接受载体、辅药和赋形剂。术语“肠胃外”包括诸如皮下的、静脉内的、肌内的、胸骨内的(instrasternal)、动脉内的注射和输注技术等递送方式。由于低分子量，吸入是本发明药学有用突变蛋白的一个优选给药方式。
因此，本发明突变蛋白可以使用已知药学可接受成分和制备方法制成组合物。参见例如Remington等，Pharmaceutical Sciences，第15版，Mack Pub，Easton(1975)。
用于吸入时，本发明突变蛋白可以首先制成微粒分散形式。这可以通过制备含有相应多肽的含水气雾剂或固体颗粒来完成。通常，通过将所需多肽的含水溶液或悬液与传统药学可接受载体和稳定剂配制在一起来制备含水气雾剂。载体和稳定剂将根据每种多肽的需求不同而不同，它们可以包括非离子表面活性剂(例如Tweens.Pluronics或聚乙二醇)、无毒蛋白像血清白蛋白、山梨聚糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、缓冲液、盐、糖或糖醇。制剂也可以包括气管扩张剂。制剂是无菌的。气雾剂通常制备自等渗溶液。颗粒任选地包括常规肺表面活性蛋白(surfactantprotein)。用于蛋白吸入的典型制剂在例如美国专利6,099,517中公开。也可以以干粉组合物形式给药以吸入本发明突变蛋白。合适的干粉制剂在例如美国专利6,123,936中公开。
制备适合于吸入的药物组合物的一个可选择方案包括，在水性或非水性悬液，例如碳氟化合物抛射剂中形成颗粒气雾剂。此颗粒包括，例如，多肽或脂质体或微囊包载多肽的分子内聚集物。气雾剂应当无肺刺激物，即引起急性支气管收缩、咳嗽、肺水肿或组织破坏的物质。然而，非刺激性吸收增强剂在此处使用是适宜的。
适合肠胃外给药的组合物包括药学可接受无菌水性或非水性溶液、分散体、悬液或乳剂及用于在临用之前重新形成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。适合的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的典型例子包括水、乙醇、多羟基化合物例如甘油、丙二醇、聚乙二醇和其适宜的混合物、植物油例如橄榄油、和可注射的有机酯例如油酸乙酯。通过各种方法可以保持流动性，包括使用包衣材料例如卵磷脂、保持所需的颗粒大小(在分散体情况下)和使用表面活性剂。
组合物也可以包含辅药例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸、等渗剂例如糖、氯化钠、或延缓吸收剂例如单硬脂酸铝和白明胶。突变蛋白可以掺入缓释或持续释放或定向递送系统例如聚合物基质、脂质体和微球体中。
可注射的制剂可以用多种方法灭菌，包括通过阻滞细菌的过滤器过滤或者以无菌固体组合物形式混合灭菌剂，所述组合物可以在临用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。
本文中用作支架的每种蛋白的编码序列都能作为诱变本发明所选肽片段的起始点。例如Bundgard等Biochem.Biophys.Res.Commun.202(1994)，1468-1475中已经描述了hNGAL的编码序列。A2m和24p3的编码序列分别已经公开在例如，Chan等Nucleic Acid Res.16(1988)11638和Stoesz等Oncogene 11(1995)，2233-2241中。对于四个肽环中的氨基酸的诱变，本领域技术人员可以任意使用用于定点诱变或用于通过聚合酶链式反应进行诱变的各种已知方法。例如，诱变方法可以以如下为特征：利用在所需位置具有简并碱基组成的合成寡脱氧核苷酸的混合物引入突变。使用有减弱的碱基配对特异性的核苷酸构件，例如次黄嘌呤核苷，也是将突变引入所选序列片段或氨基酸位置的一个可选择方案。与抗体相比，此处对靶标结合位点进行诱变的方法更为简单，因为hNGAL仅有4个而不是6个序列片段——对应于4个上述肽环——必须为此目的而被操作。另外的可能性是所谓的三联体诱变。此方法使用不同核苷酸三联体的混合物，其中每个三联体编码一个用于整入编码序列的氨基酸。
将突变引入本文所用支架蛋白的四个所选肽环区域(即，在hNGAL情况下，序列位置33-54、66-83、94-106、123-136)的多种可应用方法之一是基于使用四个寡脱氧核苷酸，这些寡脱氧核苷酸的每一个都部分地衍生自待突变的四个相应序列片段之一。在生产这些寡脱氧核苷酸时，本领域技术人员可以使用核酸构件的混合物来合成与待突变的氨基酸位置相对应的那些核苷酸三联体，以便可以随机出现针对所有氨基酸的密码子或反密码子，或者根据遗传密码和该混合物的组成在此位置出现针对选定的所需氨基酸的密码子或反密码子。
例如，第一个寡脱氧核苷酸的序列(除突变位置外)可以至少部分地对应于肽环的编码链，此肽环位于hNGAL多肽序列的最N端位置。因此，第二个寡脱氧核苷酸至少部分地对应于多肽序列中随后第二序列片段的非编码链。第三个寡脱氧核苷酸依次至少部分地对应于相应的第三序列片段的编码链。最后，第四个寡脱氧核苷酸至少部分地对应于第四序列片段的非编码链。可以用相应第一和相应第二寡脱氧核苷酸，以及如果需要的话，单独地用相应第三和相应第四寡脱氧核苷酸，以编码支架蛋白的核酸和/或其互补链作为模板进行聚合酶链式反应。
有多种已知方法可以把这两个反应的扩增产物结合成含有从第一到第四序列片段的序列并在所选氨基酸位置带有突变的核酸。为此，两个产物可以例如进行新的聚合酶链式反应，其中用侧翼寡脱氧核苷酸为引物并使用一个或多个中间核酸分子来提供第二和第三序列片段之间的序列。在图1中示意性地再现了这个过程。在选择用于诱变的寡脱氧核苷酸的数目及它们在所用蛋白的基因序列中的排列方式时，本领域技术人员也有多种可随意选择的方案。
编码含有所用蛋白的四个肽环的序列区段并且在上述所选定位置含有突变的核酸分子可以例如，通过连接反应与遗失的hNGAL编码核酸的5’和3’序列连接，和/或与载体连接，并可以克隆入已知宿主生物体。有多种方法可以任意选择用于连接和克隆。例如，在扩增过程中，将带有限制性内切酶识别序列的合成核酸分子(此识别序列也出现在hNGAL核酸序列的相应位置)连接到将被克隆的核酸的两端以便使用相应限制酶水解之后可以进行连接反应。遗失的本发明所用脂卡林的编码核酸的5’-和3’-序列也可以通过PCR连接到含有突变序列位置的核酸分子上。
在编码所选用于诱变的蛋白的基因中，更长的序列片段也可以通过已知方法进行随机突变，例如在增加错误率的条件下使用聚合酶链式反应、通过化学诱变或者使用细菌增变菌株(Low等，J.Mol.Biol.260(1996)，359-368)进行随机突变。这些方法也可以用于进一步优化已经制备的突变蛋白的靶标亲合力或靶标特异性。例如，发生在具有hNGAL序列位置33-54、66-83、94-106和123-136的片段之外的突变常常是可以被耐受的，并且甚至可能被证实是有利的，例如当突变有助于提高突变蛋白的折叠效率或折叠稳定性的时候。
在诱变后的编码核酸序列得以表达之后，可以从获得的文库中筛选出载有编码可结合给定靶标的突变蛋白的遗传信息的多个克隆。筛选这些克隆时可以使用已知的表达策略和筛选策略。这类方法在生产或构建重组抗体片段的情况中已经描述，例如“噬菌体展示”技术(Hoess，Curr.Opin.Struct.Biol.3(1993)，572-579；Wells和Lowman，Curr.Opin.Struct.Biol.2(1992)，597-604)或“菌落筛查”方法(Skerra等，Anal.Biochem.196(1991)，151-155)或“核糖体展示”(Roberts，Curr.Opin.Chem.Biol.3(1999)268-273)。
此处给出“噬菌体展示”技术(Hoess，上引文；Wells和Lowman，上引文；Kay等，Phage Display of Peptides and Proteins-A laboratoryManual(1996)，Academic Press)的一个实施方案作为本发明筛选方法的例子，此筛选方法用于筛选有所需结合特性的突变蛋白。在此将“噬菌体展示”技术的各种其他可能实施方案并入作为参考。对于示例的筛选方法，制备可使突变hNGAL结构基因以融合蛋白形式表达的噬粒，其中所述融合蛋白在N-端带有信号序列，优选OmpA信号序列，并在C-端带有M13噬菌体的外壳蛋白pIII(Model和Russel，″The Bacteriophages″，Vol.2(1988)，Plenum Press，New York，375-456)或可以整入噬菌体外壳中的此外壳蛋白的片段。此噬菌体外壳蛋白的C端片段ΔpIII只含有天然外壳蛋白pIII的氨基酸第217-406位，并优选用于制备融合蛋白。特别优选的是pIII的C端片段，其中在201位的半胱氨酸残基发生缺失或由另一氨基酸代替。
融合蛋白可以含有其他成分，例如亲合标签或用于抗体的表位序列，它们将允许融合蛋白或其部分固定化或随后纯化。而且，可以将终止密码子置于编码hNGAL或其突变蛋白的区域和编码外壳蛋白或其片段的基因片段之间，此终止密码子，优选琥珀终止密码子在合适的抑制型菌株中在翻译过程中将至少部分地翻译成氨基酸。
此处的质粒是带有丝状噬菌体，例如M13或f1(Beck和Zink，Gene 16(1981)，35-58)的基因间隔区或其功能部分的质粒，这样在用辅助噬菌体，例如M13K07、VCS-M13或R408超感染细菌细胞的过程中，环状质粒DNA的一条链与外壳蛋白一起包装并作为所谓的噬粒输出到培养基中。一方面，此噬粒带有由相应质粒编码的hNGAL突变蛋白，此突变蛋白与外壳蛋白pIII或其片段以融合蛋白形式嵌入噬粒表面，其中融合蛋白的信号序列通常被切除。另一方面，所述噬粒带有来自辅助噬菌体的一个或多个拷贝的天然外壳蛋白pIII，因此能感染受体——通常为载有F-或F’-质粒的细菌株。这样，保证了在载有相应hNGAL突变蛋白的遗传信息的包装核酸和至少部分地以功能形式呈现在噬粒表面的编码蛋白之间存在物理偶联。
例如，可以使用载体phNGAL5(图1)构建具有编码hNGAL突变蛋白的序列的质粒。编码肽环的核酸可以，例如，通过两个BstXI限制位点插入载体phNGAL5。通过转化将重组质粒整合入大肠杆菌菌株，例如XL1-blue(Bullock等，BioTechniques 5(1987)，376-379)或TG1中。这样，得到能以融合蛋白形式生产许多不同hNGAL突变蛋白的克隆。
此文库，即所获克隆的集合，随后根据已知方法用M13辅助噬菌体在液体培养基中超感染。感染之后，为了产生噬粒可以降低培养物的孵育温度。优选的孵育温度是预期hNGAL突变蛋白——作为带有噬菌体外壳蛋白或其片段的融合蛋白的一个组分——能实现最佳折叠的温度。可以在感染期间或之后，通过例如加入无水四环素，诱导带有hNGAL突变蛋白的融合蛋白的编码基因在细菌细胞中表达。选择诱导条件以使产生的相当大部分的噬粒都展示至少一个hNGAL突变蛋白。培养孵育期之后，例如6-8小时后分离噬粒。用于分离噬粒的各种方法是已知的，例如聚乙二醇沉淀。
通过与所需的靶标孵育，可以进行分离噬粒的筛选，其中靶标以允许至少暂时固定如下噬粒的形式存在，这些噬粒在其外壳中带有融合蛋白形式的具有所需结合活性的突变蛋白。在本领域技术人员已知的各种实施方案中，靶标可以例如与载体蛋白例如血清白蛋白缀合并通过载体蛋白与蛋白结合表面例如聚苯乙烯结合。适合于ELISA技术的微量滴定板或所谓的“免疫棒(immno-stick)”可以优选地用于靶标的这种固定化。可选择地，也可以利用具有其他结合基团例如生物素的靶标缀合物。然后靶标可以固定于能选择性结合该基团的表面，例如包被有链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的微量滴定板或者顺磁颗粒。
可以用已知用于ELISA方法的封闭溶液饱和加载了靶标的表面上残留的蛋白或噬粒结合位点。随后，噬粒可以例如，在生理缓冲液中与固定于表面的靶标接触。通过多次洗涤去除未结合噬粒。随后洗脱仍留在表面上的噬粒颗粒。为了洗脱，可以以溶液形式加入游离靶标。但也可以通过加入蛋白酶或，例如，在酸、碱、去污剂或离液盐存在下，或在温和的变性条件下，洗脱噬粒。优选的方法是用pH2.2的缓冲液洗脱，其中洗脱物随后被中和。
之后，通过通常已知的方法，用洗脱的噬粒感染大肠杆菌。也可以从洗脱的噬粒中抽提核酸并以另外的方式掺入细胞。起始自以此方式获得的大肠杆菌克隆，根据上述方法通过用M13辅助噬菌体超感染再次产生噬粒，以此方式增殖的噬粒在带有固定化靶标的表面上再一次进行筛选。为富集带有本发明突变蛋白的噬粒，多个筛选循环经常是必需的。优选选择筛选循环的数目以使在后续功能分析中所研究的克隆的至少0.1％产生对给定靶标有可检测的亲合力的突变蛋白。依据规模，即所用文库的复杂度，为此目的通常需要2-8个循环。
为了进行所选突变蛋白的功能分析，用获自筛选循环的噬粒感染大肠杆菌菌株，分离相应的双链质粒DNA。起始自此质粒DNA或起始自从噬粒中抽提出的单链DNA，通过常用于此目的的方法可以测定本发明所选突变蛋白的核酸序列，并从此衍生出氨基酸序列。可以将突变区域或完整的hNGAL突变蛋白序列亚克隆入另一表达载体中并在合适的宿主生物体中表达。例如，phNGAL7可以用作表达载体(参见图3)，可以在大肠杆菌株系，例如大肠杆菌-TG1中，进行phNGAL7衍生物的表达。可以用各种蛋白质化学方法纯化通过基因工程产生的hNGAL突变蛋白。例如由phNGAL7产生的hNGAL突变蛋白在其C端带有亲合肽Strep-Tag II(Schmidt等，同上引文)，因此优选地可以用链霉抗生物素蛋白亲合层析纯化。
也可以用其他方法进行筛选。许多相应的实施方案是本领域技术人员已知的或者在文献中有描述。也可以使用组合方法。例如由“噬菌体展示”筛选或至少富集的克隆可以再进行“菌落筛查”。这个方案的益处是可以根据对靶标有可检测结合亲合力的hNGAL突变蛋白的生产来直接分离单克隆。
在“噬菌体展示”技术或“菌落筛查”方法中，除了用大肠杆菌作为宿主生物体外，例如其他细菌株系、酵母或昆虫细胞或哺乳动物细胞也可以用于此目的。除了从产生自突变蛋白的编码核酸序列的初级文库中筛选hNGAL突变蛋白外，也可以使用类似的方法以便通过对编码核酸序列进行重复且任选地有限的诱变来优化突变蛋白对所需靶标的亲合力或特异性。
令人惊喜的是，通过使用本发明的方法，可以分离出对给定靶标显示出可检测亲合力的hNGAL突变蛋白(参见，实施例4、5)。
此外，还可以对所产生的突变蛋白进行进一步的、任选地部分的随机诱变，以便从由此获得的新文库中筛选出具有甚至更高亲合力的变体。针对后胆色素结合蛋白的地高辛配基结合突变蛋白，本领域中已经描述了用于“亲合力成熟”目的的相应方案(DE 199 26 068，WO00/75308；Schlehuber等，同上引文)，本领域技术人员也可以以相应方式将此相应方案用于此处公开的突变蛋白。
以下通过非限制性实施例及附图进一步阐述本发明，其中：
图1示意性地描述质粒载体phNGAL5；
图2示意性地阐示在核酸水平制备脂卡林突变蛋白文库；
图3示意性地描述表达载体phNGAL7；
图4示意性地描述表达载体pTLpc3；
图5描述使用ELISA时突变蛋白T1pcA与Tear脂卡林的结合及使用hNGAL的相应对照实验；
图6示意性地描述质粒载体phNGAL12；
图7示意性地描述表达载体phNGAL15；
图8描述ELISA中突变蛋白RFY-B、RFY-C和RFY-E以及作为对照的hNGAL与血小板反应蛋白肽(SEQ ID NO：18)的结合；
图9描述根据表面等离子体共振谱学(SPR)突变蛋白RFY-B、RFY-C和RFY-E以及作为对照的hNGAL与血小板反应蛋白肽(SEQ ID NO：18)的结合；
图10描述ELISA中hNGAL突变蛋白N4与白介素-8的结合；
图11示意性地描述表达载体pTNFα；
图12描述菌落斑点分析中TNFα与hNGAL突变蛋白TNF-V1和TNF-V2的结合，以及与作为对照的hNGAL的结合。
图1显示phNGAL5的示意图。此载体编码融合蛋白，该蛋白的组成为：OmpA信号序列、带有三个氨基酸替换Gln28→His、Leu137-Ile及Thr145→Ala的修饰hNGAL、Strep-Tag II亲合标签和含有氨基酸217-406(pIII)的M13外壳蛋白pIII的截短形式。整个的结构基因由四环素启动子/操纵基因(tetp/o)进行转录控制，并在脂蛋白转录终止子(tlpp)处终止。载体的其它元件有复制起点(ori)、丝状噬菌体f1的基因间隔区(f1-IG)、编码β-内酰胺酶的氨苄青霉素抗性基因(bla)和四环素阻遏基因(tetR)。在SupE琥珀抑制型宿主菌株中部分地翻译成Gln的琥珀终止密码子定位于带有OmpA信号序列和Strep-Tag II的hNGAL编码区与截短的噬菌体外壳蛋白pIII编码区之间。用于突变基因盒克隆的两个BstXI限制位点和此结构基因两侧的限制位点都已标出。在序列表SEQ ID NO：7中显示了来自phNGAL5的相关核酸序列片段及编码的氨基酸序列。片段起始于XbaI限制位点，终止于HindIII限制位点。此区域外的载体元件与载体pASK75上的是相同的，其完整的核苷酸序列在德国专利出版物DE4417598A1中给出。
图2示意性地显示通过重复使用聚合酶链式反应(PCR)对hNGAL中20个选定的氨基酸位置进行协同诱变的策略。针对其中氨基酸待突变的四个肽环的每一个，合成寡脱氧核苷酸(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)，其中在突变位置使用在序列表中给出的相应核苷酸混合物。由于所选组成的原因，所有三个可能的终止密码子中只有琥珀终止密码子TAG被允许存在于突变密码子位置，它在用于基因表达的大肠杆菌supE-菌株XL1-blue(Bullock等，BioTechniques 5(1987)，376-378)或TG1(Sambrook等，分子克隆，实验室手册(1989)，ColdSpring Harbor Press)中将翻译成谷氨酰胺。对于某些应用，例如在其他细菌菌株或生物体中表达基因，此无义密码子当它出现在所选hNGAL突变蛋白的结构基因中时可以由本领域技术人员将其替换为编码谷氨酰胺的密码子，例如通过定点诱变替换。用引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2扩增出有168个碱基对的核酸片段(1.PCR，PCR A)，其中使用含有克隆的hNGAL cDNA的phNGAL3质粒DNA(SEQ ID NO：8)作为模板。在另一个PCR中，用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4扩增出有179个碱基对的核酸片段(1.PCR，PCR B)，其中也用phNGAL3为模板。与phNGAL5唯一不同的是，phNGAL3在283和630位缺失两个BstXI限制位点而在675位存在一个另外的BstXI限制位点，由此显示hNGAL野生型序列。两个PCR产物部分重叠，它们的混合物在另一个扩增(2.PCR)中用作模板，其中使用两个侧翼PCR引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，获得有386个碱基对的基因片段。此片段含有所有20个突变密码子的混合并随后用两个BstX限制位点克隆到载体phNGAL5上。使用这两个限制位点，由于它们的特定排列在限制消化中导致两个不相匹配的DNA突出末端，故使得可以获得特别有效的连接。在构建phNGAL5时已经预先完成了相对于原始序列而言的氨基酸Gln28到His和Thr145到Ala的替换及Ser156密码子的沉默突变，以便将两个BstXI限制位点引入hNGAL结构基因中。
图3显示phNGAL7的示意图。PhNGAL7编码融合蛋白，此蛋白由以下组成：OmpA信号序列、根据图1的修饰hNGAL、Strep-Tag_II亲合标签、链球菌属(Streptococcus)蛋白G的白蛋白结合结构域(abd)(Kraulis等，FEBS Lett.378(1996)，190-194)。所有另外的遗传元件与phNGAL5一致。在序列表SEQ ID NO：9中显示了来自phNGAL7的核酸序列相关片段及编码的氨基酸序列。片段起始于XbaI限制位点并终止于HindIII限制位点。此区域外的载体元件与载体pASK75是一致的，其完整的核苷酸序列由德国专利出版物DE4417598A1给出。
图4显示pTLpc3的示意图。pTLpc3编码融合蛋白，此蛋白由以下组成：OmpA信号序列、带有Cys97到Ser氨基酸替换的修饰人Tear脂卡林、Strep-Tag_II亲合标签。所有另外的遗传元件与phNGAL5一致。在序列表SEQ ID NO：9中显示了来自pTLpc3的核酸序列相关片段及编码的氨基酸序列。片段起始于XbaI限制位点并终止于HindIII限制位点。此区域外的载体元件与载体pASK75是一致的，其完整的核酸序列在德国专利出版物DE4417 598A1中给出。
图5显示来自实施例5的数据的图解表示，其中用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量与hNGAL突变蛋白T1pcA的结合。T1pcA和Tear脂卡林的结合(方形)与hNGAL和Tear脂卡林的相互作用(空心圆)对比。T1pcA以浓度依赖方式与Tear脂卡林结合。hNGAL没有显示显著的结合信号。
图6显示phNGAL12的示意图。此载体编码融合蛋白，该蛋白的组成为：OmpA信号序列、带有Gln28到His、Cys87到Ser、Leu137到Ile及Thr145到Ala四个氨基酸替换的修饰hNGAL、Strep-Tag_II亲合标签和含有氨基酸217-406(pIII)的M13外壳蛋白pIII缩短形式。另外，phNGAL12在OmpA信号序列编码区内有两个沉默突变以去除EcoK12限制位点。整个结构基因通过四环素启动子/操纵基因(tetp/o)进行转录控制并终止于脂蛋白转录终止子(tlpp)。载体的其它元件包括复制起点(ori)、丝状噬菌体f1的基因间隔区(f1-IG)、编码β-内酰胺酶的氨苄青霉素抗性基因(bla)、四环素阻遏基因(tetR)。在supE琥珀抑制型宿主菌株中部分地翻译为Gln的琥珀终止密码子定位于与OmpA信号序列及Strap-Tag_II融合的hNGAL编码区与截短的pIII噬菌体外壳蛋白的编码区之间。图中标出了用于突变基因盒克隆的两个BstXI限制位点和位于结构基因两侧的限制位点。在序列表SEQ ID NO：19中显示了phNGAL12的相关核酸序列片段及编码的氨基酸序列。片段起始于XbaI限制位点并终止于HindIII限制位点。该区域之外的载体元件与载体pASK75是一致的，其完整的核苷酸序列由德国专利出版物DE4417 598A1给出。
图7显示phNGAL15的示意图。PhNGAL15编码融合蛋白，该蛋白具有OmpA信号序列、根据图6的修饰hNGAL及Strep-Tag_II亲合标签。phNGAL15在OmpA信号序列编码区内带有与phNGAL12相同的沉默突变。在序列表SEQ ID NO：21中显示了phNGAL15的核酸序列相关片段及编码的氨基酸序列。片段起始于XbaI限制位点并终止于HindIII限制位点。此区域外的载体元件与载体pASK75是一致的，其完整的核苷酸序列由德国专利出版物DE4417 598A1给出。
图8显示来自实施例10的数据的图解表示，其中用酶联免疫吸附测定(ELISA)进行hNGAL突变蛋白和血小板反应蛋白肽的结合测量。hNGAL突变蛋白RFY-B(圆形)、RFY-C(方形)和RFY-E(菱形)和血小板反应蛋白肽的结合与hNGAL(三角形)和血小板反应蛋白肽的相互作用进行对比。血小板反应蛋白肽通过与其C端连接的生物素基团固定于抗生物素蛋白包被的微量滴定板上。hNGAL突变蛋白以浓度依赖的方式与血小板反应蛋白肽结合，而hNGAL并没有产生显著结合信号。在缺乏此肽时(空心符号)，观察到hNGAL突变蛋白与抗生物素蛋白有低水平的交叉反应。
图9显示来自实施例11的数据的图解表示，其中用表面等离子体共振谱学(SPR)进行hNGAL突变蛋白与血小板反应蛋白肽的结合测量。将hNGAL突变蛋白RFY-B(圆形)、RFY-C(方形)和RFY-E(菱形)分别和血小板反应蛋白肽的分子相互作用与hNGAL(三角)和血小板反应蛋白肽的相互作用进行对比。hNGAL突变蛋白以浓度依赖方式结合血小板反应蛋白肽，而hNGAL没有出现显著的结合信号。没有检测到hNGAL突变蛋白与传感器芯片SA的交叉反应(未显示)。
图10显示来自实施例15的数据的图解表示，其中用酶联免疫吸附测定(ELISA)进行hNGAL突变蛋白N4的结合测量。白介素8通过与其赖氨酸残基结合的生物素基团固定于抗生物素蛋白包被的微量滴定板上。将hNGAL突变蛋白N4和白介素8(实心圆)的结合与hNGAL突变蛋白N4与单独抗生物素蛋白(空心圆)的结合进行对比。hNGAL突变蛋白N4以浓度依赖的方式与白介素8结合，其没有显示出与单独抗生物素蛋白的显著结合信号。
图11显示质粒pTNFα的示意图，pTNFα编码融合蛋白，该蛋白由以下组成：肿瘤坏死因子α(TNFα)成熟形式及在其N端的六个组氨酸标签。所有另外的元件与质粒pRSET(Schoepfer，Gene 124(1993)，82-85)是一致的。在序列表SEQ ID NO：31中显示了pTNFα的核酸序列相关片段及编码的氨基酸序列。片段起始于NdeI限制位点并终止于HindIII限制位点。此区域外的载体元件与载体pRSET5a是一致的，其完整核苷酸序列在EMB登录号X54202中给出。
图12(A)显示实施例18菌落斑点分析的结果，其中测试三聚体TNFα与固定的hNGAL突变蛋白的结合。根据图12(B)，将表达以下ABD-融合蛋白的大肠杆菌TG1-F-细胞点在亲水膜上四或五次：hNGAL、后胆色素结合蛋白(BBP)、来自实施例6的文库的两个无关突变蛋白、在实施例17描述的菌落筛查分析中分离的9个克隆和(作为对照)没有蛋白。如实施例18中所述将各个菌落分泌的突变蛋白固定于HSA包被的疏水膜上。使用抗地高辛配基Fab-碱性磷酸酶缀合物观察地高辛化TNFα的结合。(B)描述点在膜上的各个克隆的位置。
实施例
实施例1：制备hNGAL突变蛋白文库
除非另外指明，使用本领域技术人员已知的基因工程方法，例如Sambrook等(同上引文)描述的方法。
根据图2在多个步骤中使用PCR，以使在hNGAL四个肽环中的所有20个所选氨基酸位置进行协同诱变。在两个第一扩增步骤中都进行100μl体积的PCR反应，其中20ng phNGAL3质粒DNA用作模板，并使用相应引物每个50pmol(分别地SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)，这些引物用传统的亚磷酰胺法合成。另外，反应混合物含有10μl 10x Taq缓冲液(100mM Tris/HCl pH9.0，500mM KCl，15mM MgCl2，1％(v/v)Triton X-100)，10μl dNTP混合物(2mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。加水补足体积后，加入5U Taq DNA聚合酶(5U/μl，Promega)，在有加热盖的热循环仪(Eppendorf)中进行94℃1分钟，60℃1分钟，72℃1.5分钟的20个温度循环，之后在60℃温育5分钟。用Jetsorb DNA抽提试剂盒(Genomed)通过制备型琼脂糖凝胶电泳从低熔点琼脂糖(Roche Diagnostics)中分离出所需的扩增产物。
也在100μl混合物中进行随后的扩增步骤，其中两个相应片段大约6ng用作模板，在引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6每个50pmol存在下进行反应。PCR混合物的剩余成分以和前面扩增步骤中相同的量加入。用94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1.5分钟的20个温度循环进行PCR，之后在60℃温育5分钟。用E.Z.N.A..Cycle-Pure试剂盒(PeqLab)纯化PCR产物。
为了克隆该片段，即核酸形式的hNGAL突变蛋白文库，首先该片段根据生产商的说明书用限制酶BstXI(New England Biolabs)切割，并用E.Z.N.A.Cycle-Pure试剂盒纯化。第二次BstXI限制消化后，用制备型琼脂糖凝胶电泳纯化核酸片段，得到347个核苷酸大小的双链DNA。以相同方式用BstXI切割载体phNGAL5的DNA，分离两个所得片段的较大者(3971bp)。
为了连接，在有180 Weiss单位T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)存在下，在600μl总体积中(50mM Tris/HCl pH7.8，10mMMgCl2，10mM DTT，1mM ATP，50μg/ml BSA)，16℃温育2.75μg(12pmol)PCR片段和31.45μg(12pmol)载体片段四天。随后通过每120μl连接混合物中加入5μg来自酵母的tRNA(Boehringer Mannheim)、125μl 5M乙酸铵及500μl乙醇来沉淀DNA。-20℃温育3天之后离心(30分钟，16000g，4℃)。每个沉淀用750μl乙醇(70％v/v，-20℃)洗涤，离心(5分钟，16000g，4℃)，并真空干燥(2分钟)。DNA最后溶于200μl TE/10中(1mM Tris/HCl pH8.0，0.1m MEDTA pH8.0)并加水调整至终体积260μl。
根据Tung和Chow(Trends Genet.11(1995)，128-129)及Hengen(Trends Biochem.Sci.21(1996)，75-76)描述的方法进行大肠杆菌K12菌株XL1 Blue(Bullock等，同上引文)电感受态细胞的制备。通过加入稳定期的XL1-blue过夜培养物将1L LB培养基调整为600nm光密度为OD600＝0.08，26℃以200rpm在2L三角瓶中温育，达到OD600＝0.6后，在冰上冷却培养物30分钟，随后4℃4000g离心15分钟。用冰冷的10％w/v甘油(每次使用500ml)洗涤细胞沉淀两次，最后重悬于2ml冰冷GYT培养基中(10％w/v甘油，0.125％w/v酵母抽提物，0.25％w/v胰蛋白胨)。
使用Micro Pulser系统(BioRad)与来自同一供应商的电穿孔杯(电极间距2mm)用于电穿孔。在4℃冷室中进行所有步骤。每5μl上面提到的DNA溶液与40μl细胞悬液混合，冰上温育1分钟，最后转入电穿孔杯中。电穿孔后，悬液立即在2ml冰冷的SOC培养基(2％w/v胰蛋白胨，0.5％w/v酵母抽提物，10mM NaCl，10mM MgSO4，10mM MgCl2)中稀释，37℃200rpm摇60分钟。培养物稀释于有100μg/ml氨苄青霉素的2L 2xYT培养基(2YT/Amp)中，培养直到由细胞增复制引起的OD550升至0.64。以此方式，使用总计34.2μg连接DNA，通过49次电穿孔得到7×107个转化体。根据实施例2进一步使用转化体。
实施例2：噬粒呈递与针对人Tear脂卡林对hNGAL突变蛋白的筛选。
将200ml含有转化了质粒载体的细胞的培养物转入无菌三角瓶中，此质粒载体类似于phNGAL5但编码融合蛋白形式的脂卡林突变蛋白文库。用VCS-M13辅助噬菌体(Stratagene)感染，感染复数约为10，之后培养物37℃，160rpm再摇30分钟。随后加入卡那霉素(70μg/ml)，培养箱温度降至30℃，10分钟后加入无水四环素(200μl在二甲基甲酰胺(DMF)中的100μg/ml储液)至100μg/L以诱导基因表达。30℃，160rpm继续再温育5小时。
从此培养物中取50ml，通过离心沉淀细胞(15分钟，12000g，4℃)。含有噬粒颗粒的上清液进行无菌过滤(0.45μm)，与1/4体积(12.5ml)20％(w/v)PEG8000，15％w/v NaCl混合，4℃温育过夜。离心后(20分钟，18000g，4℃)，沉淀的噬粒颗粒溶解于2ml冷的PBS(4mM KH2PO4，16mM Na2HPO4，115mM NaCl，pH7.4)中。溶液在冰上温育30分钟，分装入两个1.5ml反应容器中。未溶解成分离心后(5分钟，18500g，4℃)，每个上清液转移到新反应容器中。
与1/4体积20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合并在冰上温育30-60分钟，用于重沉淀噬粒颗粒。离心后(20分钟，18500g，4℃)，去除上清并将沉淀的噬粒颗粒溶解并合并于总计400μl PBS中。冰上温育30分钟后溶液离心(5分钟，18500g，4℃)，以去除残留的聚集物，上清液直接用于亲合富集。
免疫棒(Immuno-sticks)(NUNC)用于载有hNGAL突变蛋白融合蛋白的重组噬粒的亲合富集。这些免疫棒用800μl于PBS中的人Tear脂卡林(Tlpc)(450μg/ml)过夜包被。
为了产生重组Tlpc，用带有Tlpc cDNA(对于Tlpc的cDNA，参看Holzfeind和Redl，Gene 139.(1994)，177-183)的表达质粒pTLpc3转化大肠杆菌JM83细胞(Yanisch-Perron等，Giene33(1985)，103-119)，并将这些细胞用于根据实施例3的蛋白生产和纯化。蛋白产量约为2.2mg每1L培养体积。
免疫棒表面上未被占据的结合位点通过室温下与1.2ml PBST(有0.1％v/v Tween20的PBS)中的2％w/v BSA温育2小时来饱和。之后免疫棒在室温下与250μl噬粒溶液和500μl封闭缓冲液(PBST中的3％w/vBSA)的混合物温育1小时。
为了去除未结合的噬粒，进行8次洗涤，每次用950μl PBST洗2分钟。用950μl 0.1M甘氨酸/HCl pH2.2处理免疫棒10分钟以最后洗脱吸附的噬粒，之后通过与150μl 0.5M Tris混合立即中和洗脱级分的pH。
为了扩增，将此噬粒溶液(1.1ml，含有106-108菌落形成单位，这依赖于筛选循环)很快地加温到37℃，与3ml大肠杆菌XL1-Blue指数生长期培养物(OD550＝0.5)混合，37℃200rpm温育30分钟。随后沉淀(2分钟，4420g，4℃)感染有噬粒的细胞，在600μl培养基中重悬，铺在三个含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板(LB/Amp；直径140mm)上。
32℃温育14小时后，从琼脂平板上刮取细胞，每个平板加上10ml2xYT/Amp培养基转移到无菌三角瓶中，37℃200rpm摇20分钟以完全悬浮。把适当体积的此悬液接种到200ml 37℃预热的2x YT/Amp培养基中至OD550＝0.08。
为了噬粒颗粒的重复生产和亲合富集，使用与本实施例开始时描述的方法相同的方法。这种情况下，将琼脂平板上生长的细胞的0.2-1ml悬液接种入50ml 2x YT/Amp培养基中，在30℃经7小时而不是5小时生产噬粒。这样用Tlpc进行四次另外的筛选循环。
实施例3：用“菌落筛查”法鉴定与人Tear脂卡林结合的hNGAL 突变蛋白
为了以融合蛋白形式生产带有Strep-Tag_II及白蛋白结合结构域的hNGAL突变蛋白用于分析且为了通过菌落筛查鉴定它们，将两个BstXI切割位点之间的基因盒从载体phNGAL5亚克隆到phNGAL7上。
为了此目的，使用Perfectprep Plasmid Midi Kit(Eppendorf)从大肠杆菌克隆混合物分离质粒DNA，此克隆混合物是通过用来自实施例2作为最后筛选循环的结果洗脱的噬粒感染而得到的。用限制酶BstXI切割DNA，用如实施例1所述方法通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化出两个片段的较小者(347bp)。用BstXI切割载体phNGAL7的DNA并以同样的方法分离两个片段的较大者(3971bp)。
为了连接，两个DNA片段每个100fmol与1.5 Weiss单位T4 DNA连接酶(Promega)混合，总计体积为20μl(30mM Tris/HCl pH7.8，10mMMgCl2，10mM DTT，1mM ATP)，之后16℃温育过夜。使用CaCl2法(Sambrook等，同上引文)用2μl此连接混合物转化大肠杆菌TG1-F-(大肠杆菌K12 TG1，通过在无选择条件下重复培养丢失了其附加体)。
亲水的PVDF膜(Millipore，GVWP型，孔径大小0.22μm)在一个位置处标记并剪成合适大小，铺在LB/Amp琼脂平板上。来自此批转化的150μl细胞悬液离心(5000g，2分钟，4℃)并在500μl培养基中重悬，然后均一地铺到此膜上。琼脂平板37℃温育7.5小时直至菌落达到约0.5mm大小。
同时，将也剪成合适大小的疏水膜(Millipore，Immobilon P，孔径大小0.45μm)根据生产商的说明书用PBS弄湿。随后在10mg/ml人血清白蛋白(HSA，Sigma)的PBS溶液中室温下搅动4小时。膜上剩余的结合位点通过室温下与PBS中的3％w/vBSA，0.5％v/v Tween20温育2小时而饱和。膜洗涤两次，每次用20ml PBS洗10分钟，之后在加有200μg/L无水四环素的10ml LB/Amp培养基中搅动10分钟。随后在膜的一个位置作上标记并置于额外含有200μg/L无水四环素的LB/Amp琼脂培养板上。将其上菌落已经长出来的亲水膜置于疏水膜上，使两个标记重叠。培养板与两张膜22℃温育15小时。在此期间，各个hNGAL突变蛋白自菌落分泌出来并通过白蛋白结合结构域固定于下层膜的HSA上。
此后，有菌落的上层膜转移到新鲜LB/Amp琼脂平板上，4℃存放。拿去疏水膜并洗涤三次，每次用20ml PBST洗5分钟，随后在10ml Tear脂卡林与生物素的缀合物的PBST溶液(10μg/ml)中温育1小时。为了制备缀合物，将0.285mg D-生物素酰基-ε-酰氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche)在9μl DMSD中的溶液缓慢加入在5％w/v NaHCO3(pH8.2)中的2.5ml 450μg/ml Tlpc中。室温下搅动1小时后，通过PD-10凝胶过滤柱(Pharmacia)去除过多的反应物，用PBS作为流动缓冲液。
与缀合物温育之后，用PBST洗三次膜，之后与10ml抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物(Sigma，PBST中1∶40000稀释)温育1小时。随后用PBST两次及PBS一次每次5分钟洗膜，并在AP缓冲液(0.1M Tris/HClpH8.8，0.1M NaCl，5mM MgCl2)中搅动10分钟。为了显色反应，膜与10ml AP缓冲液温育，向其中加入30μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸4-甲苯胺盐(Roth，在二甲基甲酰胺中50μg/ml)和5μl氮蓝四唑(Roth，在70％v/v二甲基甲酰胺中75μg/ml)，直到在某些菌落的位置出现清楚的颜色信号。这样，检测到由这些菌落产生的hNGAL突变蛋白对蛋白配体，即Tlpc的结合活性。
从第一张膜培养产生颜色斑点的十二个菌落。分离它们的质粒DNA，根据生产商的说明书使用Genetic Analyzer 310系统(AppliedBiosystems)对hNGAL基因盒进行序列分析，其中用寡脱氧核苷酸SEQ IDNO：11作为引物。十二个测序的克隆显示只有8个不同序列，命名为TlpcA、TlpcB、TlpcC、TlpcD、TlpcE、TlpcF、TlpcG、TlpcH。TlpcA克隆出现5次。克隆的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，偏离hNGAL的那些氨基酸在表1中给出。也在SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13中给出了突变蛋白TlpcA的氨基酸序列和核苷酸序列。测序发现琥珀终止密码子在所有选择的变体中处于不同位置，该终止密码子在使用的大肠杆菌株系中被抑制。
实施例4：制备hNGAL突变蛋白
为了制备性生产hNGAL及其突变蛋白，一个所选菌落及在phNGAL7上最初编码的hNGAL(作为对照)在大肠杆菌株TG1-F-中生产。
为此，100ml LB/Amp培养基接种载有相应质粒的TG1-F-转化体单菌落，30℃200rpm过夜温育。然后将每个40ml此预培养物接种入在5L三角瓶中的2L LB/Amp培养基中，22℃200rpm摇至OD550＝0.5。通过加入200μg/L无水四环素(200μl在DMF中的2mg/ml储液)进行诱导，之后22℃200rpm再摇3小时。
离心来自一个三角瓶中的细胞(15分钟，4420g，4℃)，弃去上清液后，在20ml周质释放缓冲液(100mM Tris/HCl pH8.0，500mM蔗糖，1mMEDTA)中重悬，在冰上冷却30分钟。随后在两个连续离心步骤中去除原生质球(15分钟，4420g，4℃；15分钟，30000g，4℃)。用CP缓冲液(100mM Tris/HCl pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA)透析含有周质蛋白抽提物的上清液，无菌过滤，用于层析纯化。
通过位于hNGAL变体与白蛋白结合结构域之间的Strep-Tag_II亲合标签(Schmidt等，同上引文)进行纯化。在本情况下使用链霉抗生物素蛋白突变蛋白“1”(德国专利19641876.3；Voss和Skerra，Protein Eng，10(1997)，975-982)，它与NHS活化的Sepharose(Pharmacia)偶联，相对于基质的床体积产生5mg/ml固定化的链霉抗生物素蛋白。
装有此材料的4ml柱床体积层析柱用20ml CP缓冲液4℃以流速40ml/h平衡。通过在流通式光度计中测量洗脱物在280nm的吸收来监测层析。周质蛋白抽提物上样后，用CP缓冲液洗涤柱子直至达到基线，随后用10ml在CP缓冲液中的2.5mM D-脱硫生物素(Sigma)溶液洗脱结合的hNGAL突变蛋白。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(Fling和Gregerson，Anal，Biochem，155(1986)，83-88)检查含有纯化的hNGAL突变蛋白的级分并合并。蛋白产量在30μg到70μg每1L培养物之间。
                    表1：所选hNGAL突变蛋白的序列特征
位置    hNGAL  TlpcA  TlpcB  TlpcC  TlpcD  TlpcE  TlpcF  TlpcG  TlpcH
40      Ala    Cys    Gly    Leu    Ser    Val    Gly    Arg    Ala
42      Leu    Val    Tyr    Pro    Val    Leu    Ser    Ser    Cys
44      Glu    Gln    Tyr    Ile    Phe    Gln*  Phe    lle    Pro
46      Lys    Leu    Gln*  Gln*  Gln*  Cys    Arg    Phe    Leu
47      Asp    Leu    Arg    Ala    Ser    Trp    Phe    Gln*  Phe
49      Gln    Ser    Trp    Ile    Ser    Cys    Val    Val    Phe
50      Lys    Met    Ser    Phe    Ala    Pro    Gln    Phe    Leu
70      Leu    Leu    Leu    Glu    Gly    Asp    Ser    Pro    Gln*
72      Arg    Met    Arg    Ala    Asn    Glu    Gln*  Ala    Arg
73      Lys    Asp    Asp    Tyr    Lys    Lys    Gln    Asn    Pro
77      Asp    Arg    Pro    Val    Asn    Asn    Trp    Ile    Ser
79      Trp    Tyr    Met    Lys    Thr    Val    Arg    Ala    Arg
101     Pro    Gly    Leu    Tyr    Tyr    Pro    Phe    Val    Leu
102     Gly    Ile    Ser    Leu    Trp    Val    Pro    Val    Thr
103     Leu    Val    Leu    Tyr    Gln*  Leu    Ser    Thr    Met
125     Lys    Ser    Trp    Leu    Gly    Glu    Arg    Ala    Lys
127     Ser    Met    Ala    Cys    Arg    Ala    Lys    Lys    Ser
128     Gln    Thr    Asp    Pro    Met    Ser    Ala    Thr    Asp
130     Arg    Gln*  Gln    Gly    Glu    Gln    His    Lys    Asp
132     Tyr    Ala    Trp    Lys    Thr    Leu    Ser    Leu    Ile
55      Ile                                              Val°
98      Lys                                              Asn°
*这些谷氨酰胺残基由琥珀终止密码子编码。
这些氨基酸替换由于随机突变引起。
实施例5：测量hNGAL突变蛋白对Tear脂卡林的亲合力
为了检测ELISA(酶联免疫吸附测定)中的结合，微量滴定板(MicroTest III Flexible Assay板；Falcon)的每个孔都用100μl PBST中的20mg/ml HSA溶液填充，室温(RT)温育1小时。用PBST洗三次后，向孔中加入50μl来自实施例3的hNGAL突变蛋白TlpcA和hNGAL的1μM纯化融合蛋白溶液，以使蛋白通过abd和HSA之间的复合物形成而固定化。1小时后去除溶液并用PBST洗三次。然后在PBST中制备Tear脂卡林和生物素的缀合物的稀释系列，起始自140μg/ml，(实施例3)，之后室温下14时温育。用PBST洗三次后，抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物(Sigma)用PBST以1∶10000稀释，加入小孔中。室温温育1小时，之后用PBST洗两次，用PBS洗两次。由此，通过碱性磷酸酶催化水解对硝基苯磷酸完成结合固定化hNGAL突变蛋白的Tear脂卡林的检测。为此，向孔中加入100μl在AP缓冲液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mMTris/HCl pH8.8)中的0.5mg/ml对硝基苯磷酸(Amresco)溶液，通过在Spectra Max 250光度计(Molecular Devices)中测量405nm的吸收来监测产物形成。
实施例6：制备具有超过100亿个独立的hNGAL突变蛋白的文库
根据实施例2在多个步骤中使用PCR，通过四个肽环中共计20个所选氨基酸位置的协同诱变，制备有增加的多样性的hNGAL随机文库。在两个第一扩增步骤中进行100μl体积的PCR反应，其中10ng phNGAL5(图1)质粒DNA用作模板，并使用50pmol每对引物(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，分别地)，这些引物根据传统的亚磷酰胺法合成。另外，反应混合物含有10μl 10x Taq缓冲液(100mM Tris/HCl pH9.0，500mM KCl，15mM MgCl2，1％v/vTritonX-100)和10μl dNTP混合物(2mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。加入水补足体积后，加入5U Taq DNA聚合酶(5u/μl，Promega)。在有加热盖的热循环仪(Eppendorf)中进行94℃1分钟、60℃1分钟、72℃1.5分钟的20个温度循环，之后60℃最后温育5分钟。在每种情况下，用Jetsorb DNA提取试剂盒(Genomed)通过制备型凝胶电泳从GTQ琼脂糖(Roth)中分离所需的扩增产物。
也用100μl混合物进行随后的扩增步骤，其中使用约6ng的两个DNA片段为模板，在引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6各50pmol存在下进行反应。与实施例1不同，这两个引物都在其5’端带有生物素基团。加入与先前扩增步骤相同量的PCR混合物的剩余成分。用94℃1分钟、60℃1分钟、72℃1.5分钟的20个温度循环进行PCR，之后在60℃温育5分钟。PCR产物用E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit(PegLab)纯化。
为了克隆此DNA片段，即核酸形式的hNGAL突变蛋白文库，根据生产商的说明书用限制酶BstXI(Promega)切割5’-生物素化的PCR产物，如上述通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化347个核苷酸大小的产生片段。没有或不完全消化的残余DNA片段通过此溶液与链霉抗生物素蛋白包被的顺磁珠(Dynal)温育，借助其5’-生物素标签去除，因此得到适合于随后连接反应的双酶切DNA片段。
为此，用100μl TE缓冲液洗涤100μl商业上可得的浓度10mg/ml的顺磁颗粒悬液3次。然后排干顺磁颗粒并在室温下与100μl TE缓冲液中的11-22pmol DNA片段混合15分钟。借助于磁铁在Eppendorf管壁收集顺磁颗粒，回收含有纯化DNA片段的上清液以在以下连接反应中进一步使用。
如上述用BstXI切割载体phNGAL12的DNA(图6)，用制备型琼脂糖凝胶电泳分离两个产生的片段的较大者(3971bp)。为了连接，在855Weiss单位T4 DNA连接酶(Promega)存在下将6.85μg(30pmol)PCR片段与78.65μg(30pmol)载体片段16℃温育4天，共计体积为8550μl(50mM Tris/HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，50μg/ml BSA)。然后通过每350μl连接混合物中加入110μg来自酵母的tRNA(Boehringer Mannheim)、350μl 5M乙酸铵和1300μl乙醇来沉淀DNA。20℃温育2天后离心(30分钟，16000g，4℃)，每个沉淀用750μl乙醇(70％v/v，-20℃)洗涤，离心(5分钟，16000g，4℃)，真空干燥(2分钟)。DNA最后溶于总体积427.5μl水中至终浓度为200μg/ml。
根据实施例1中所述方法进行大肠杆菌K12菌株XL1-blue(Bullock等，同上引文)的电感受态细胞制备。
Micro Pulser系统(BioRad)与来自同一供应商的电穿孔杯(电极间距2mm)一起用于电穿孔。所有步骤在4℃冷室中进行。每个来自以上的10μl DNA溶液(2μg)与100μl细胞悬液混合，冰上温育1分钟，转移到预冷的电穿孔杯中。然后进行电穿孔(5ms，12.5kV/cm)，之后悬液立即在2ml冰冷的SOC培养基中稀释，之后37℃以200rpm摇60分钟。培养物在含有100μg/ml氨苄青霉素的1.5L 2x YT培养基(2YT/Amp)中稀释至OD550为0.5，37℃培养直至OD550由于细胞复制而升为0.7。通过使用总计85.5μg连接DNA，以这种方式使用共计43次电穿孔得到1.8×1010个转化体。根据实施例7进一步使用转化体。
实施例7：噬粒呈递及针对来自人血小板反应蛋白1细胞结合结构域 的8氨基酸肽(“血小板反应蛋白肽”)筛选hNGAL突变蛋白
含有转化了质粒载体的细胞的1500ml培养物(此质粒与phNGAL12相对应但编码融合蛋白形式的脂卡林突变蛋白文库)用VCS-M13辅助噬菌体(stratagene)感染，感染复数约为10。培养物37℃下160rpm再摇另外的30分钟。然后培养箱温度降至26℃，并加入卡那霉素(70μg/ml)。10分钟后，加入无水四环素(1875μl在DMF中的20μg/ml储液)至25μg/l以诱导基因表达。26℃，160rpm再温育15小时。
离心沉淀细胞(60分钟，12500g，4℃)。含有噬粒颗粒的上清液过滤除菌(0.45μm)，与1/4体积(375ml)冰冷的20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合，4℃温育1小时。离心后(30分钟，18500g，4℃)，沉淀的噬粒颗粒溶于60ml冷PBS中。溶液在冰上温育60分钟，分装到两个SS34离心管中。未溶解成分离心后(5分钟，18500g，4℃)，每个上清液转移到新离心管中。
通过与1/4体积20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合来重沉淀噬粒颗粒，之后在冰上温育60分钟。等分噬粒(2ml)并加入1mM EDTA和50mM苄脒(Sigma)用于在-20℃长期存放。
衍生自人血小板反应蛋白1细胞结合结构域的生物素化的合成血小板反应蛋白肽(Tulasne等，Blood 98(2001)，3346-3352，H2N-Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys-Aca-Aca-Lys-生物素-COOH，SEQ ID NO：18，Aca：氨基己酸)与链霉抗生物素蛋白包被的顺磁颗粒(Dynal)一起作为靶标用于从呈递hNGAL突变蛋白的噬粒文库中亲合富集。
为此，离心来自以上的沉淀噬粒的2ml等分试样(20分钟，18500g，4℃)，去除上清液，沉淀的噬粒颗粒溶于1ml PBS中。冰上温育30分钟后，离心溶液(5分钟，18500g，4℃)以去除残留的聚集物，上清液直接用于亲合富集。
为了富集与肽结合的噬粒，PBS中的生物素化血小板反应蛋白肽的825nM溶液40μl(33pmol)(通过100μl 10μM于DMF中的合成肽溶液与1112μl PBS混合制备)与260μl新制备的噬粒(2×1012-5×1012个菌落形成单位，cfu)溶液混合，室温温育1小时以使肽与噬粒所呈递的突变蛋白之间可以形成复合物。然后，加入PBS中的8％w/v BSA、0.4％v/vTween 20溶液100μl。
与此平行，用100μl PBS洗100μl商业上可获得的链霉抗生物素蛋白顺磁颗粒(Dynal)悬液三次。此处，通过旋转1-5ml Eppendorf管保持颗粒悬浮1分钟，然后借助于磁铁收集于管壁，去除上清。为了饱和非特异结合位点，室温下顺磁颗粒与100μl PBST中的2％w/v BSA温育1小时。
去除上清液之后，向顺磁颗粒加入生物素化血小板反应蛋白肽和噬粒的混合物，重悬颗粒并在室温下温育10分钟。最后，通过向混合物中加入10μl PBS中的4mM D-脱硫生物素(Sigma)溶液并在室温下温育所述混合物5分钟来饱和链霉抗生物素蛋白的游离生物素结合位点。此步骤用于防止Strep-tag_II——作为突变蛋白和噬菌体外壳蛋白pIII片段的融合蛋白的一部分——与链霉抗生物素蛋白形成复合物。
用1ml含有1mM D-脱硫生物素的新鲜PBST洗涤顺磁颗粒八次以去除未结合的噬粒。每次借助于磁铁收集颗粒并移去上清液。最后通过在950μl 0.1M甘氨酸/HCl pH 2.2中重悬颗粒并温育15分钟，洗脱结合的噬粒。用磁铁收集颗粒后，回收上清液并立即加入150μl 0.5M Tris中和。
为了扩增，此噬粒溶液(1.1ml，含有107-1010cfu，这依赖于筛选循环)很快地升温至37℃，与3ml大肠杆菌XL1-blue对数生长期培养物(OD550＝0.5，37℃时)混合，37℃200rpm温育30分钟。随后沉淀感染有噬粒的细胞(2分钟，4420g，4℃)，在600μl培养基中重悬，铺于三个含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养平板(LB/Amp；直径140mm)上。
32℃温育14小时后，从琼脂平板上刮取细胞，每个平板加入10ml 2xYT/Amp培养基，转移到无菌三角瓶中，37℃200rpm摇20分钟以完全重悬。
对于噬粒颗粒的另一轮生产和亲合富集，将0.2-1ml所述悬液接种入37℃预热的50ml 2x YT/Amp培养基中，以至于细胞密度为OD550＝0.08。37℃160rpm温育此培养物至细胞密度为OD550＝0.5。然后用VCS-M13辅助噬菌体(Stratagene)感染培养物，感染复数约为10，之后37℃160rpm再摇培养物30分钟。随后加入卡那霉素(70μg/ml)，培养箱温度降低至26℃，10分钟后加入无水四环素至25μg/L以诱导基因表达。26℃160rpm再温育15小时。
离心沉淀细胞(15分钟，12000g，4℃)。含有噬粒颗粒的上清液过滤除菌(0.45μm)，与1/4体积(12.5ml)20％w/v PEG8000，15％w/vNaCl混合，冰上温育1小时。离心后(20分钟，18000g，4℃)，沉淀的噬粒颗粒溶于2ml冷PBS中。冰上温育溶液30分钟，并分入两个1.5ml反应管中。未溶解成分离心后(5分钟，18500g，4℃)，每个上清液转移到新反应管中。
通过与1/4体积20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合，重新沉淀噬粒颗粒，之后冰上温育60分钟。离心后(20分钟，18500g，4℃)，去除上清液，沉淀的噬粒颗粒溶于1ml PBS。冰上温育30分钟后离心溶液(5分钟，18500g，4℃)，上清液直接用于亲合富集。这样用血小板反应蛋白肽再进行五个筛选循环。
实施例8：使用“菌落筛查”法鉴定与血小板反应蛋白肽结合的hNGAL 突变蛋白
为了与Strep-Tag_II和白蛋白结合结构域形成融合蛋白的hNGAL突变蛋白的分析生产，将两个BstXI切割位置间的基因盒从载体phNGAL12亚克隆到phNGAL7上。
为此，使用Plasmid Midi kit(Qiagen)从大肠杆菌克隆混合物中分离质粒DNA，此克隆混合物是由来自实施例7作为第四和第五个筛选循环的结果洗脱的噬粒感染而得到的。用限制酶BstXI切割两个制品的DNA，每种情况下均用如实施例6所述的制备型琼脂糖凝胶电泳纯化两个片段的较小者(347bp)。用BstXI切割载体phNGAL7的DNA并以同样的方法分离两个片段的较大者(3971bp)。
为了连接，分离的小DNA片段每个100fmol各与100fmol大DNA片段混合，并与1.5 Weiss单位T4 DNA连接酶(Promega)混合，总计体积为20μl(30mM Tris/HCl pH 7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mMATP)，之后16℃温育过夜。使用CaCl2法(Sambrook等，同上引文)用此连接混合物各2μl分别转化大肠杆菌TG1-F-(大肠杆菌K12 TG1，通过在无选择条件下重复培养丢失了其附加体)，得到2.0ml细胞悬液。100μl此悬液铺于含有LB/Amp培养基的琼脂平板上，37℃温育14小时。
两个亲水的PVDF膜(Millipore，GVWP型，孔径大小0.22μm)在一个位置作上标记并剪成合适大小，铺在LB/Amp琼脂平板上。来自这两批转化的150μl细胞悬液离心(5000g，2分钟4℃)并在500μl培养基中重悬，均一地铺到这些膜上。琼脂平板37℃温育7.5小时直至菌落达到约0.5mm大小。
同时，将也剪成合适大小的两张疏水膜(Millipore，Immobilon P，孔径大小0.45μm)根据生产商的说明书用PBS浸湿。随后每个在10mg/ml人血清白蛋白(HSA，Sigma)的10ml PBS溶液中室温下搅动4小时。膜上剩余的结合位点通过室温下与20ml在PBS中的3％w/v BSA，0.5％v/vTween 20温育2小时以饱和。膜洗涤两次，每次用20ml PBS洗10分钟。之后在加有200μg/L无水四环素的10ml LB/Amp培养基中浸泡10分钟。
最后，给它们在一个位置处作上标记，并置于另外含有200μg/L无水四环素的LB/Amp琼脂培养平板上。将来自上面且其上有菌落长出的亲水膜置于疏水膜上，使两个标记重叠。每个培养板与两张膜一起22℃温育15小时。在此期间，上层膜上的菌落各分泌出相应的hNGAL突变蛋白并通过其白蛋白结合结构域固定于下层膜的HSA上。
此后，有菌落的上层膜转移到新鲜LB/Amp琼脂平板上，4℃存放。取出疏水膜并洗涤三次，每次用20ml PBST洗5分钟。
为了分析固定化的hNGAL突变蛋白的结合活性，然后膜在10ml生物素化血小板结合蛋白肽在PBS中的10μg/ml溶液中温育1小时(DMF中的1mM生物素化肽储液因此在PBST中1∶100稀释)。用PBST洗膜三次，之后与10ml抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物(Sigma，PBST中1∶40，000稀释)温育1小时，以通过生物素基团检测结合的肽。两次PBST和一次PBS洗膜，每次5分钟，并在AP缓冲液(0.1M Tris/HClpH8.8，0.1M NaCl，5mM MaCl2)中搅动10分钟。对于显色反应，膜与10ml AP缓冲液温育，向其中加入30μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸4-甲苯胺盐(Roth，溶于二甲基甲酰胺中50μg/ml)和5μl氮蓝四唑(Roth，在70％v/v二甲基甲酰胺中75μg/ml)，直到在某些菌落位置出现明显的颜色信号。
培养来自相应亲水膜的、在疏水膜上产生强烈颜色斑点的19个菌落(9个分离自第4个淘选循环，10个来自第5个淘选循环)。分离它们的质粒DNA，根据生产商的说明书用Big Dye Terminator循环测序试剂盒以及Genetic Analyzer 310系统(Applied Biosystems)对hNGAL基因盒进行序列分析，其中用寡脱氧核苷酸SEQ ID NO：11作为测序引物。
19个测序的克隆显示只有12个不同序列，命名为RFY-A、RFY-B、RFY-C、RFY-D、RFY-E、RFY-F、RFY-G、RFY-H、RFY-I、RFY-J、RFY-K和RFY-L。RFY-B克隆出现两次，RFY-C克隆出现6次。RFY-J克隆显示有3个核苷酸缺失，导致位于第4个肽环内第125位的一个氨基酸缺失。琥珀终止密码子在supE抑制菌株中翻译成氨基酸谷氨酰胺，并在RFY-L克隆中鉴定到。克隆的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，偏离最初的hNGAL的那些氨基酸在表2a，b中给出。在序列表SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：27中也给出了突变蛋白RFY-B、RFY-C和RFY-E的核苷酸序列。在序列表SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28中给出了这些突变蛋白的氨基酸序列。
选择分别出现两次和六次的突变蛋白RFY-B和RFY-C，用于详细鉴定它们的结合活性。另外，选择突变蛋白RFY-E，因为在随机化区域中其氨基酸组成显示很大程度上的独特性。
                表2a：所选hNGAL突变蛋白的序列特征
位置    hNGAL  RFY-A  RFY-B  RFY-C  RFY-D  RFY-E  RFY-F  RFY-G  RFY-H
40      Ala    Phe    Gly    Gly    Thr    Gly    Leu    Ser    Met
42      Leu    Glu    Thr    His    Pro    Thr    Phe    Gly    Val
44      Glu    Leu    Tyr    Leu    Leu    Val    Ala    Pro    Leu
46      Lys    Ser    Arg    Asn    Val    Thr    Leu    Ser    Ile
47      Asp    Arg    Leu    Val    Leu    Leu    Phe    Leu    Pro
49      Gln    Phe    Ser    Pro    Thr    Ser    His    Arg    Asn
50      Lys    Thr    Val    Asn    Glu    Arg    Arg    Leu    Val
70      Leu    Met    Asp    Asp    Ile    Pro    Thr    His    Pro
72      Arg    Phe    Trp    Leu    Met    Met    Ser    Lys    Pro
73      Lys    Ser    Ala    Met    Asp    Gly    Ser    Asn    Ser
77      Asp    Leu    Asn    Pro    Leu    Lys    Ser    Pro    Gly
79      Trp    Leu    Lys    Phe    Pro    Lys    Lys    Lys    Glu
101     Pro    Phe    Leu    Pro    Asp    Met    Pro    Cys    Arg
102     Gly    Leu    Gly    Phe    Ala    Ser    Phe    Val    Gly
103     Leu    Asp    Leu    Leu    Leu    Asn    Ser    Ala    Asp
125     Lys    Asn    Pro    Asn    Pro    Gln    Pro    Glu    Arg
127     Ser    Ser    Gly    Pro    Lys    His    Ile    Leu    Leu
128     Gln    Gln    Gly    Arg    Asn    Lys    Ser    Asn    Lys
130     Arg    Arg    Ile    Tyr    Trp    Pro    Pro    Pro    Gln
132     Tyr    Tyr    Trp    Glu    Lys    Ser    Pro    Leu    Ile
106                   Phe°
         表2b：所选hNGAL突变蛋白的序列特征
位置       hNGAL     RFY-I     RFY-J     RFY-K     RFY-L
40         Ala       Cys       Arg       Gln       Ser
42         Leu       Gly       Leu       Pro       Pro
44         Glu       Leu       Cys       Lys       Ser
46         Lys       Ser       Pro       His       Leu
47         Asp       Phe       Phe       Leu       Ala
49         Gln       Ash       Val       Ser       Gly
50         Lys       Gly       Arg       Leu       Gln*
70         Leu       Lys       Lys       Pro       Thr
72         Arg       His       Glu       Lys       Asn
73         Lys       Gly       Arg       Met       Ala
77         Asp       Arg       Ala       Pro       Ser
79         Trp       Thr       His       Ile       Arg
101        Pro       Gly       Lys       Ala       Asn
102        Gly       Ser       Phe       Trp       Phe
103        Leu       Cys       Ser       Glu       Ser
125        Lys       Met       ΔΔΔ            Thr       Lys
127        Ser       Leu       Pro       Gly       Lys
128        Gln       Asn       Ser       Thr       Lys
130        Arg       Asn       Ile       Pro       Asp
132        Tyr       Ser       Glu       Thr       Pro
106        Tyr                           Ser°
126        Val                 Pro°
*此谷氨酰胺残基由琥珀终止密码子编码。
°这些氨基酸替换由随机化位置外的偶然突变引起。
Δ此氨基酸缺失由随机化位置外的偶然突变引起。
实施例9：制备hNGAL突变蛋白
为了获自实施例8的hNGAL突变蛋白RFY-B、RFY-C和RFY-E的制备性生产，将两个BstXI切割位置之间的诱变编码区从phNGAL7载体亚克隆到表达质粒phNGAL15上(图7)。因此获得编码突变蛋白的融合蛋白的质粒，此融合蛋白中突变蛋白在氨基端有OmpA信号序列而在羧基端有Strep-Tag_II亲合标签。
为了亚克隆，编码相关突变蛋白的质粒DNA用限制酶BstXI切割，用如实施例6所述的制备型琼脂糖凝胶电泳纯化两个片段的较小者(347bp)。以同样方式，用BstXI切割phNGAL15载体DNA，分离两个片段的较大者(3398bp)。
将1.5 Weiss单位T4 DNA连接酶(Promega)加入两个DNA片段(每个50fmol)中，总计体积20μl(30mM Tris/HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP)，混合物16℃温育16小时以连接。然后根据CaCl2方法，5μl连接混合物用于转化大肠杆菌JM83(Yanisch-Perron等，Gene 33(1985)，103-119)，得到2.0ml细胞悬液。100μl此悬液铺于LB/Amp培养基的琼脂平板上，37℃温育14小时。
大肠杆菌JM83转化体单菌落用于接种100ml LB/Amp培养基，之后30℃200rpm温育过夜。然后用40ml此预培养物接种5L三角瓶中的2LLB/Amp培养基，22℃ 200rpm摇至OD550＝0.5。通过加入200μg/L无水四环素(200μl于DMF中的2mg/ml储液)之后22℃200rpm再摇3小时进行诱导。
离心来自一个三角瓶的细胞(15分钟，4420g，4℃)，去除上清液之后，在20ml预冷周质释放缓冲液(100mM Tris/HCl pH8.0，500mM蔗糖，1mM EDTA)中重悬，冰上温育30分钟。在两个连续的离心步骤中(15分钟，4420g，4℃和15分钟，30000g，4℃)去除原生质球。在CP缓冲液(100mM Tris/HCl pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA)中进行含有周质蛋白抽提物的上清液的透析，之后过滤除菌，用于hNGAL突变蛋白的层析纯化。
纯化方法基于C端Strep-Tag_II亲合标签(Schmidt等，同上引文)。在本情况下，使用链霉抗生物素蛋白突变蛋白“1”(德国专利19641876,3；Voss和Skerra，同上引文)，它与NHS活化的Sepharose(Pharmacia)偶连，每1ml基质柱床体积产生5mg/ml固定化的链霉抗生物素蛋白。
用此材料填装的4ml柱床体积层析柱用20ml CP缓冲液在4℃平衡，流速为40ml/h，通过在流通式光度计中测量洗脱物在280nm的吸收来监测层析。周质蛋白抽提物上样之后，用CP缓冲液洗柱子直到达到基线，随后用在CP缓冲液中的2.5mM D-脱硫生物素(Sigma)溶液10ml洗脱结合的hNGAL突变蛋白。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(Fling和Gregerson，同上引文)检查含有纯化的hNGAL突变蛋白的级分并合并。为得到对于进一步使用合适的蛋白浓度和缓冲液条件，使用Centricon管YM 10(MW-截留值1000，Millipore)超滤将突变蛋白合并物浓缩至终体积约500μl，随后对HBS缓冲液(150mM NaCl，10mM HEPES pH7.4，3mMEDTA)透析。RFY-B、RFY-C和RFY-E的蛋白产量分别是70μg，60μg和200μg每1L培养物。这样制备了原始hNGAL和其突变蛋白RFY-B、RFY-C和RFY-E。
实施例10：在ELISA中测量hNGAL突变蛋白对血小板反应蛋白肽的 亲合力
为了在ELISA(酶联免疫吸附测定)中检测结合，微量滴定板(Maxisorb，Nunc)的每个孔加入50μl抗生物素蛋白(Fluka)在PBS中的50μg/ml溶液，室温(RT)下过夜温育。用PBST洗三次后，向孔中加入50μl生物素化血小板反应蛋白肽SEQ ID NO：18在PBST中的1μM溶液，通过在生物素与预吸附的抗生物素蛋白之间形成复合物来固定该肽。温育1小时后，去除溶液，用PBST洗微量滴定板的孔三次。为了饱和非特异结合位点，孔中加入100μl在PBST中的4％w/v BSA，室温下温育1小时，之后用PBST洗三次。
然后制备来自实施例9的突变蛋白的稀释系列，浓度起始自100nM，之后室温下温育1小时。对于抗生素蛋白的非特异结合，作为对照，向孔中加入hNGAL及其突变蛋白的相似稀释系列，而省去血小板反应蛋白肽。用PBST洗三次之后，向孔中加入抗-Strep II-抗体-HRP-缀合物(IBA)(用PBST以1∶8000稀释)。室温下1小时温育，之后用PBST洗三次用PBS洗两次。
用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺和H2O2作为辣根过氧化物酶的底物完成对结合的hNGAL突变蛋白的检测。为此，向孔中加入100μl现成的HRP-底物溶液(Biochem，Immuosystems)，几分钟后加入100μl 0.3M硫酸来终止显色。通过在Spectra Max 250光度计(Molecular Devices)中450nM的终点吸收测量产物形成。
根据[p·L]＝([P]t[L]t)/(KD+[P]t)等式在计算机程序Kaleidagraph(Synergy软件)帮助下通过非线性最小二乘方回归来拟合曲线。在此，[P]t是固定化血小板反应蛋白肽的总浓度(以A450单位表示)，[L]t是上样的突变蛋白或hNGAL的浓度，[P·L]是形成的复合物的浓度(以A450单位表示)，KD是表观解离常数。
图8中描述了所得的结合曲线。获得的hNGAL突变蛋白与血小板反应蛋白肽之间复合物的表观解离常数的数值总结于下表：
hNGAL变体           KD[nM]
hNGAL：             -*
RFY-B：             4.3±0.2
RFY-C：             4.6±0.6
RFY-E：             8.2±0.8
*未能检测到结合活性
实施例11：用SPR测量hNGAL突变蛋白时血小板反应蛋白肽的亲合 力
使用BIAcore X系统(BIACDRE)通过表面等离子体共振(SPR)测定hNGAL突变蛋白对血小板反应蛋白肽SEQ ID NO：18的结合亲合力。首先，根据生产商的说明书，把35μl浓度为1μg/ml的生物素化血小板反应蛋白肽(通过将1μl于DMF中的200μg/ml肽溶液与199μl含有150mM NaCl，10mM HEPES pH 7.4，3mM EDTA的HBS缓冲液混合制备)固定于链霉抗生物素蛋白包被的传感器芯片SA(BIACORE)的一个流体通道的表面，得到约400反应单位(RU)的量。然后，35μl在HBS缓冲液中的来自实施例9的每个纯化突变蛋白以浓度为500nM-25nM上样，使用HBS-EP(含有0.005％表面活性剂P20的HBS)作为流动缓冲液并且连续流速为5μl/分钟，测量hNGAL突变蛋白的结合曲线。
针对每个所用蛋白浓度，对固定有血小板反应蛋白肽的通道在注射期末测量稳态共振值。在传感器芯片的第二通道——它用作对照——只检测到可忽略的缓冲液效应。这些值直接对hNGAL突变蛋白浓度作图。
根据[P·L]＝([P]t[L]t)/(KD+[P]t)等式在计算机程序Kaleidagraph(Synergy软件)下通过非线性最小二乘方回归来拟合曲线。在此，[P]t是固定化血小板反应蛋白肽的总浓度(以RU为单位)，[L]t是上样的突变蛋白或hNGAL的浓度，[P·L]是形成的复合物的浓度(以RU为单位)，KD是在平衡条件下的解离常数。
图9中描述了得到的结合曲线。通过SPR测量得到的hNGAL突变蛋白和血小板反应蛋白肽之间的复合物解离常数值总结于下表：
hNGAL变体         KD[nM]
hNGAL：           -*
RFY-B：           105.4±6.5
RFY-C：           106.1±15.7
RFY-E：           107.2±11.4
*未能检测到结合活性
实施例12：筛选针对人白介素-8(IL-8)的hNGAL突变蛋白
重组人细胞因子白介素-8(Baggiolini和Clark-Lewis，FEBS Lett.397，(1992)，97-101；H2N-AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS-COOH；SEQ ID NO：29)与生物素基团缀合并作为靶用于在链霉抗生物素蛋白包被的顺磁颗粒(Dynal)存在下从呈递hNGAL突变蛋白的噬粒文库中亲合富集。
缀合物通过混合溶于3.4μl H2O中的5.6nmol(12.5μg)2-(生物素酰氨基)乙基-1，3-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯(NHS-SS-生物素，Pierce)与溶于50μl H2O中的1.4nmol(12.5μg)人重组IL-8(Promocell)、36.6μl水及10μl 10x浓缩PBS/NaOH pH8.5而得到。室温下搅动1小时温育混合物。然后根据生产商的说明书用PBS/NaOH pH8.5为流动缓冲液通过PD-10凝胶过滤柱(Pharmacia)从IL-8缀合物中去除过量的试剂。从PD-10柱中洗脱的生物素化IL-8用同样的缓冲液调整到终浓度为1μM，产生总体积1.24ml。-80℃以等分试样存放标记的IL-8，用前直接解冻。
为了分离展示有对IL-8具有亲合力的突变蛋白的噬粒，在-20℃长期存放的如实施例7中获得的沉淀噬粒的一个等分试样解冻并沉淀噬粒(20分钟，18500g，4℃)。去除上清液之后，沉淀的噬粒颗粒溶于270μl PBS中，冰上温育30分钟，最后离心(5分钟，18500g，4℃)以去除残留的聚集物。
为了富集与IL-8结合的噬粒，30μl生物素化白介素-8的1μM溶液(30pmol)与270μl于PBS中的噬粒(约1013cfu)混合，室温温育1小时，以允许细胞因子和噬粒呈递的突变蛋白之间形成复合物。然后，加入100μl于PBS中的8％w/v BSA，0.4％v/v Tween 20溶液。
与此平行，用1ml PBS洗100ml商业上可获得的链霉抗生物素蛋白-顺磁颗粒(Dynal)悬液三次。此处，通过旋转1.5ml Eppendorf管保持颗粒悬浮1分钟，然后借助于磁铁收集于管壁，去除上清。为了饱和非特异结合位点，室温下顺磁颗粒与1ml于PBST中的2％(w/v)BSA温育1小时。
去除如上上清液之后，向顺磁颗粒中加入生物素化IL-8和噬粒的混合物，重悬颗粒并在室温下温育10分钟。最后，通过向混合物中加入10μl于PBS中的4mM D-脱硫生物素(Sigma)溶液并在室温下温育所述混合物5分钟，以饱和链霉抗生物素蛋白的游离生物素结合位点。此步骤用于防止Strep-tag_II——作为突变蛋白和噬菌体外壳蛋白pIII片段的融合蛋白的一部分——与链霉抗生物素蛋白形成复合物。
用1ml含有1mM D-脱硫生物素的新鲜PBST洗涤顺磁颗粒1分钟八次以去除未结合的噬粒。每次借助于磁铁收集颗粒并吸出上清液。最后，通过在1ml含有1mM脱硫生物素和100mM DTT的PBST中重悬颗粒，在还原条件下洗脱结合的噬粒。溶液在37℃温育1小时以还原在IL-8和生物素之间的接头分子中所含的二硫键，由此从小珠上释放特异结合IL-8的噬粒。
为了扩增，将洗脱的噬粒溶液(1.0ml，含有107-108cfu，依赖于筛选循环)很快地升温至37℃，与3ml大肠杆菌XL1-blue对数生长期培养物(OD550＝0.5，37℃时)混合，37℃，200rpm摇30分钟。沉淀被感染的细胞(2分钟，4420g，4℃)，在600μl培养基中重悬，铺于三个含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养平板上(LB/Amp；直径140mm)。
32℃温育14小时后，从琼脂平板上刮取菌苔，每个平板加入10ml 2xYT/Amp培养基，悬液转移到无菌三角瓶中，37℃以200rpm摇20分钟。
对于噬粒颗粒的另一轮生产和亲合富集，将0.2-1ml所述悬液接种入37℃预热的50ml 2 x YT/Amp培养基中，以至于细胞密度为OD550＝0.08。37℃160rpm温育此培养物至细胞密度为OD550＝0.5。然后，用VCS-M13辅助噬菌体(Stratagene)感染培养物，感染复数约为10，37℃160rpm再摇培养物30分钟。随后加入卡那霉素(70μg/ml)，培养箱温度降低至26℃，10分钟后加入无水四环素至25μg/L以诱导基因表达。26℃160rpm再温育15小时。
离心沉淀细胞(15分钟，12000g，4℃)。含有噬粒颗粒的上清液过滤除菌(0.45μm)，与1/4体积(12.5ml)20％w/v PEG8000，15％w/vNaCl混合，冰上温育1小时。离心后(20分钟，18000g，4℃)，沉淀的噬粒颗粒溶于2ml冷PBS中。冰上温育溶液30分钟，并分入两个1.5ml反应管中。未溶解成分离心后(5分钟，18500g，4℃)，每个上清液转移到新反应管中。
通过与1/4体积20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合，重新沉淀噬粒颗粒，之后冰上温育60分钟。离心后(20分钟，18500g，4℃)，去除上清液，沉淀的噬粒颗粒溶于270μl PBS中。冰上温育30分钟后离心溶液(5分钟，18500g，4℃)，上清液直接用于亲合富集。这样用IL-8再进行四个筛选循环。
实施例13：用“菌落筛查”法鉴定与白介素-8结合的hNGAL突变蛋 白
为了如实施例3所述方法分析型生产与Strep-Tag_II和白蛋白结合结构域形成融合蛋白的hNGAL突变蛋白，将两个BstXI切割位置间的基因盒从载体phNGAL12亚克隆到phNGAL7上。
为此，使用Plasmid Midi Kit(Qiagen)从大肠杆菌克隆混合物中分离质粒DNA，此克隆混合物是由来自实施例12在第五个筛选循环后洗脱的噬粒感染而得到的。用限制酶BstXI切割DNA，用如实施例6所述的制备型琼脂糖凝胶电泳纯化两个片段的较小者(347bp)。用BstXI切割载体phNGAL7的DNA并以同样的方法分离两个片段的较大者(3971bp)。
为了连接，100fmol分离的小DNA片段与100fmol大DNA片段混合，并与1.5 Weiss单位T4 DNA连接酶(Promega)温育，共计体积20μl(30mM Tris/HClpH 7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP)，之后16℃过夜温育。根据CaCl2法(Sambrook等，同上引文)用4μl此连接混合物转化大肠杆菌TG1-F-(大肠杆菌K12 TG1，它在非选择条件下重复培养丢失其附加体)，得到2.0ml细胞悬液。离心细胞悬液(5000g，2分钟，4℃)，在100μl培养基中重悬，铺于含有LB/Amp培养基的琼脂平板上，37℃温育14小时以测定转化效率。
将亲水PVDF膜(Millipore，GVWP型，孔径大小0.22μm)在一个位置处作上标记并剪成合适大小，置于LB/Amp琼脂平板上。已经用5-10μl上述连接混合物转化的一批新转化的细胞悬液离心(5000g，2分钟，4℃)，在100μl培养基中重悬，均一铺于此膜上，以获得400-500个菌落。琼脂平板37℃温育7.5小时至菌落达到约0.5mm大小。
同时，取一张疏水膜(Millipore，Immobilon P，孔径大小0.45μm)也剪成合适大小，根据生产商的说明书用PBS浸湿。通过在10mg/ml HSA(Sigma)的10ml PBS溶液中室温下搅动4小时，完成用HSA的包被。通过室温下与20ml于PBS中的3％(w/v)BSA，0.1％(v/v)Tween-20温育2小时来饱和膜上的剩余结合位点。用20ml PBS洗两次膜10分钟，之后在其中加有200μg/L无水四环素的10ml LB/Amp培养基中浸泡10分钟。
最后，膜在一个位置处作上标记并置于另外加有200μg/L无水四环素的LB/Amp琼脂培养平板上。将来自上面的其上菌落已长出的亲水膜置于疏水膜上以使两个标记重叠。培养板与两张膜22℃温育15小时。在此期间，上层膜上的菌落各分泌出相应hNGAL突变蛋白，通过蛋白的白蛋白结合结构域和下层膜上的HAS，突变蛋白被固定于下层膜上。
此后，有菌落的上层膜转到新LB/Amp琼脂平板上，4℃存放。取下疏水膜并洗涤三次，每次用20ml PBST洗5分钟。
为了分析固定化的hNGAL突变蛋白的结合活性，膜在3.5ml地高辛化IL-8于PBS中的100nM溶液中温育1小时。
通过溶于2.3μlDMSO中的14n mol(9.2μg)地高辛配基-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(DIG-NHS，Roche)与溶于50μl水中的1.4n mol(12.5μg)人重组IL-8(Promocell)、37.7μl水和10μl 10x浓缩PBS/NaOH pH8.5混合，制备缀合物。搅动下混合物室温温育1小时。根据生产商的说明书用PBS/NaOH pH8.5为流动缓冲液，通过PD-10凝胶过滤柱(Pharmacia)从IL-8缀合物中去除多余的试剂。用同样的缓冲液将从PD-10柱上洗脱的地高辛化IL-8调整至终浓度为1μM，得到总体积1.56ml。-80℃以等分试样存放标记的IL-8，用前直接解冻。
用PBST洗三次膜，之后与10ml在PBST中1∶1000稀释的抗-地高辛配基Fab-碱性磷酸酶缀合物温育1小时，以通过IL-8的地高辛基团检测结合的IL-8。膜用PBST洗两次，用PBS洗一次，每次5分钟，并在AP缓冲液中搅动10分钟。为了显色反应，膜在10ml AP缓冲液中温育，向其中加入30μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸4-甲苯胺盐(Roth，在二甲基甲酰胺中50μg/ml)和5μl氮蓝四唑(Roth，在70％v/v二甲基甲酰胺中75μg/ml)，直到在某些菌落的位置出现明显的颜色信号。
从在膜上出现的200个菌落中，9个在疏水膜上出现强烈颜色斑点，从相应的亲水膜上培养此9个克隆。分离其质粒DNA，根据生产商的说明书使用Big Dye Terminator循环测序试剂盒和Genetic Analyzer 310系统(Applied Biosystems)对hNGAL基因盒进行序列分析，测序使用寡脱氧核苷酸SEQ ID NO：5作为引物。
所有9个克隆显示同一序列，说明在筛选过程中仅一个突变蛋白被优先富集。此突变蛋白命名为变体N4。
N4克隆的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，偏离自初始hNGAL蛋白的那些氨基酸残基在表3中给出。SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：34中也给出了突变蛋白N4的核苷酸序列和全长氨基酸序列。
     表3：hNGAL突变蛋白N4的序列特征
    位置     hNGAL    N4
    40       Ala      Asp
    42       Leu      Tyr
    44       Glu      Ala
    46       Lys      Ser
    47       Asp      Leu
    49       Gln      Gly
    50       Lys      Leu
    70       Leu      Val
    72       Arg      Tyr
    73       Lys      Asp
    77       Asp      Val
    79       Trp      Ser
    101      Pro      Glu
    102      Gly      Ala
    103      Leu      Val
    125      Lys      Asp
    127      Ser      Arg
    128      Gln      Pro
    130      Arg      Ser
    132      Tyr      Glu
实施例14：制备hNGAL突变蛋白N4
对于获自实施例13的hNGAL突变蛋白N4的制备型生产，从在phNGAL7中的此变体分离出BstXI盒并亚克隆到表达质粒phNGAL15(图7)上。产生的质粒编码在其氨基端有OmpA信号序列并在其羧基端有Strep-Tag_II亲合标签的突变蛋白N4的融合蛋白。
为了亚克隆，编码相关突变蛋白的phNGAL7质粒DNA用限制酶BstXI切割，如实施例6所述用制备型琼脂糖凝胶电泳纯化两个片段的较小者(347bp)。以同样方法，用BstXI切割phNGAL15载体DNA，分离两个片段的较大者(3398bp)。
将1.5 Weiss单位T4 DNA连接酶(Promega)加入两个DNA片段(每个50fmol)中，共计体积20μl(30mM Tris/HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP)，混合物16℃温育16小时用于连接。然后根据CaCl2方法用5μl此连接混合物转化大肠杆菌JM83(Yanisch-Perron等，同上引文)，得到2.0ml细胞悬液。100μl此悬液铺于含有LB/Amp培养基的琼脂上，37℃温育14小时。
大肠杆菌JM83转化体单菌落用于接种100ml LB/Amp培养基，之后30℃200rpm过夜温育。然后用40ml此预培养物接种5L三角瓶中的2LLB/Amp培养基，22℃200rpm摇至OD550＝0.5。通过加入200μg/L无水四环素(200μl于DMF中的2mg/ml储液)诱导突变蛋白N4的表达，温育再进行3小时。
离心来自一个三角瓶中的细胞(15分钟，5571g，4℃)，去除上清液后，在20ml预冷的周质释放缓冲液(100mM Tris/HCl pH8.0，500mM蔗糖，1mM EDTA)中重悬，冰上温育30分钟。在两个连续离心步骤(15分钟，2988g，4℃和15分钟，25000g，4℃)中去除原生质球。在CP缓冲液(100mM Tris/HCl pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA)中透析含有周质蛋白抽提物的上清液，之后过滤除菌，用于hNGAL突变蛋白的层析纯化。
纯化方法基于C端Strep-Tag_II亲合标签(Schmidt等，同上引文)，使用Strep-Tactin_Superflow材料(IBA)。填充有此材料的4ml柱床体积的层析柱用20ml CP缓冲液在4℃平衡，流速为2ml/分钟。通过在流通式光度计中测量280nm吸收来监测层析。周质蛋白抽提物上样(流速0.8ml/分钟)后，用CP缓冲液洗涤柱子，流速为2ml/分钟，直至达到基线。用2.5mM D-脱硫生物素(Sigma)在CP缓冲液中的溶液洗脱结合的hNGAL突变蛋白，流速为1ml/分钟。合并含有纯化hNGAL突变蛋白的级分(每个2.5ml)，用YM10 centricon管(分子量截留值10KDa，Millipore)浓缩至终体积约为500μl，用15％SDS聚丙烯酰胺凝胶分析(Fling和Gregerson，同上引文)。最后，材料过滤除菌(0.22μm)，4℃存放。
实施例15：在ELISA中测量hNGAL突变蛋白N4对IL-8的亲合力
为了在ELISA实验中检测结合，96孔微量滴定板(Maxisorb，Nunc)的两行(每排12个孔)用50μl抗生物素蛋白(Flukn)在PBS中的50μg/ml溶液4℃包被过夜。用PBST洗三次后，一行用50μl/孔的1μM于PBST中的生物素化IL-8溶液处理，而第二行与PBST温育作为对照。室温1小时后，所有孔用PBST洗三次，室温下用100μl于PBST中的4％w/v脱脂奶粉饱和非特异结合位点1小时。
为了测定突变蛋白N4对IL-8的KD值，在PBST中制备来自实施例14的N4蛋白的稀释系列，浓度起始自1μM。对于抗生物素蛋白的非特异结合，作为对照，将突变蛋白N4的相似稀释系列加入孔中而省去IL-8。室温1小时允许复合物形成，之后用PBST洗三次，室温下与PBST中的抗-strep II-抗体-HRP-缀合物(IBA)的1∶8000稀释物温育1小时。
用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺和H2O2作为辣根过氧化物酶的底物，完成对结合的突变蛋白N4的检测。为此，向所有孔中都加入100μl现成的HRP底物溶液(Biochem Immuosystems)。几分钟后加入100μl 0.3M硫酸来终止显色。通过在Spectra Max 250光度计(Molecular Devices)中的450nM终点吸收来测量产物形成。
根据实施例10借助于计算机程序Kaleidagraph(Synergy软件)通过非线性最小二乘方回归来拟合曲线。图10描述了得到的曲线。对于hNGAL突变蛋白N4和IL-8之间的复合物的表观解离常数，所获数值是300±34nM。
实施例16：筛选针对生物素化TNFα的hNGAL突变蛋白
重组人肿瘤坏死因子α(TNFα，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：35)与生物素基团缀合，并作为靶在链霉抗生物素蛋白包被的顺磁颗粒(Dynal)存在下从如实施例7所得到的呈递hNGAL突变蛋白的噬粒文库中进行亲合富集。
为了制备重组TNFα，用编码在其N端带有Arg-Gly-Ser-His(6)-Gly(3)标签的细胞因子TNFα(Wang等，Science 228(1985)，149-154)的表达质粒pTNFα转化大肠杆菌BL21[DE3]的细胞。如Schmidt和Skerra(Schmidt和Skerra，J Chromatogr.676(1994)，103-119)所述的进行TNFα的表达，但对于重组细胞因子的产生，30℃诱导4小时。在此情况下，TNFα在胞质聚集并呈可溶性蛋白形式，通过随后在30ml裂解缓冲液(50mM NaH2PO4/NaOH pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)中冻融1L培养基的细胞沉淀可以将TNFα释放。通过随后使用固定化金属亲合层析(IMAC；Porath等，Nature 258，(1975)598-599)和大小排阻层析，从此溶液中以三聚体形式纯化得到TNFα(Lohrengel等，Cytokine 12(1999)573-577)。蛋白产量约为1.5mg每1L培养体积。
通过溶于25μl H2O中的40nmol(24.3μg)NHS-SS-生物素(Pierce)与溶于235μl PBS/NaOH pH8.5中的10nmol(187.7μg)人重组TNFα反应来制备缀合物，其中反应在总体积1ml的PBS/NaOH pH8.5中进行。室温搅动下温育混合物1小时。然后根据生产商的说明书用PD-10凝胶过滤柱(Pharmacia)并用PBS为流动缓冲液从TNFα缀合物中去除多余的试剂。
为了分离展示有对TNFα具有亲合力的突变蛋白的噬粒，将-20℃长期存放的如实施例7获得的沉淀噬粒的一个等分试样解冻并沉淀噬粒(20分钟，18500g，4℃)。去除上清液后，沉淀的噬粒颗粒溶于270μl PBS中，冰上温育30分钟，最后离心(5分钟，18500g，4℃)以去除残留的聚集物。
30μl生物素化TNFα的1μM溶液(30pm0l)(通过200μl此生物素化细胞因子在PBS中的2.5μM溶液与300μl PBS混合制备)与270μl PBS中的噬粒(约1013cfu)混合，室温下温育1小时以允许细胞因子与噬粒呈递的突变蛋白之间形成复合物。然后，加入100μl于PBS中的8％w/v BSA，0.4％v/v Tween 20溶液。
与此平行，用1ml PBS洗100μl商业上可获得的链霉抗生物素蛋白-顺磁颗粒(Dynal)悬液三次。此处，通过旋转1.5ml Eppendorf管悬浮颗粒1分钟，然后借助于磁铁在管壁收集，吸去上清液。为了饱和非特异结合位点，顺磁颗粒与1ml PBST中的2％(w/v)BSA室温下温育1小时。
去除如上上清液后，生物素化TNFα与噬粒的混合物加入到顺磁颗粒中，重悬颗粒并室温下温育10分钟。最后，通过向混合物中加入10μl于PBS中的4mM D-脱硫生物素(Sigma)溶液，室温下温育所述混合物5分钟来饱和链霉抗生物素蛋白的游离生物素结合位点。此步骤用于防止Streptag_II——作为突变蛋白和噬菌体外壳蛋白pIII片段的融合蛋白的一部分——与链霉抗生物素蛋白形成复合物。
用1ml含有1mM D-脱硫生物素的新鲜PBST洗涤顺磁颗粒八次1分钟，去除未结合的噬粒。每次借助于磁铁收集颗粒，吸去上清液。最后，通过在1ml含有1mM脱硫生物素和100mM DTT的PBST中重悬颗粒在还原条件下洗脱结合的噬粒。37℃温育溶液1小时以还原包含于TNFα和生物素之间的接头分子中的二硫键，由此从珠子上释放特异结合TNFα的噬粒。
为了扩增，洗脱的噬粒溶液(1.0ml，含有107-109cfu，依赖于筛选循环)迅速升温至37℃，与3ml大肠杆菌XL1-blue对数生长期培养物(OD550＝0.5，37℃时)混合，37℃200rpm摇30分钟。沉淀感染的细胞(2分钟，4420g，4℃)，在600μl培养基中重悬，铺于三个含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养平板(LB/Amp；直径140mm)上。
32℃温育14小时后，从琼脂平板上刮取菌苔，每个加入10ml 2xYT/Amp培养基，悬液转移到无菌三角瓶中，37℃以200rpm摇20分钟。
对于噬粒颗粒的另一轮生产和亲合富集，0.2-1ml所述悬液按种预热至37℃的50ml 2x YT/Amp培养基，以使细胞密度为OD550＝0.08。37℃，160rpm温育此培养物至达到细胞密度OD550＝0.5。然后用VCS-M13辅助噬菌体(Stratagene)感染培养物，感染复数约为10，之后37℃160rpm将此培养物再摇30分钟。随后加入卡那霉素(70μg/ml)，培养箱温度降低至26℃，10分钟后，加入无水四环素至25μg/L以诱导基因表达。26℃160rpm再温育15小时。
通过离心沉淀细胞(15分钟，12000g，4℃)。含有噬粒颗粒的上清液过滤除菌(0.45μm)，与1/4体积(12.5ml)20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合，冰上温育1小时。离心后(20分钟，18000g，4℃)，沉淀的噬粒颗粒溶于2ml冷PBS中。冰上温育此溶液30分钟，分入两个1.5ml反应管中。未溶解成分离心沉淀后(5分钟，18500g，4℃)，每个上清液转移到新反应管中。
通过与1/4体积20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合来重沉淀噬粒颗粒，之后冰上温育60分钟。离心后(20分钟，18500g，4℃)，去除上清液，沉淀的噬粒颗粒溶于270μl PBS中。冰上温育30分钟后，离心此溶液(5分钟，18500g，4℃)，上清液直接用于亲合富集。以此方式用TNFα肽再进行另外四个筛选循环。
实施例17：通过“菌落筛查”法鉴定结合TNFα的hNGAL突变蛋白
如实施例3所述对于与Strep-Tag_II和白蛋白结合结构域形成融合蛋白的hNGAL突变蛋白的分析型生产，将两个BstXI切割位置之间的基因盒从载体phNGAL12亚克隆到phNGAL7上。
为此，用Plasmid Midi Kit(Qiagen)从大肠杆菌克隆的混合物中分离质粒DNA，此克隆是通过用来自实施例16在第五个筛选循环后洗脱的噬粒感染而得到的。用限制酶BstXI切割DNA，通过如实施例6所述的制备型琼脂糖凝胶电泳纯化两个片段的较小者(347bp)。用BstXI切割载体phNGAL7的DNA，以同样方法分离两个片段的较大者(3971bp)。
为了连接，100fmol分离的小DNA片段与100fmol大DNA片段混合，与1.5 Weiss单位T4 DNA连接酶(Promega)温育，总计体积20μl(30mM Tris/HCl pH 7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP)，之后16℃过夜温育。根据CaCl2法(Sambrook等，同上引文)用4μl此连接混合物转化大肠杆菌TG1-F-(大肠杆菌K12 TG1，它通过在无选择条件下反复培养丢失了其附加体)，得到2.0ml细胞悬液。离心细胞悬液(5000g，2分钟，4℃)，在100μl培养基中重悬，铺于含有LB/Amp培养基的琼脂平板上，37℃温育14小时以测定转化效率。
亲水PVDF膜(Millipore，GVWP型，孔径大小0.22μm)在一个位置处作上标记并剪成合适大小，置于LB/Amp琼脂平板上。将来自用3-6μl上述连接混合物转化的一批新鲜转化的细胞悬液离心(5000g，2分钟，4℃)，在100μl培养基中重悬，均匀铺于此膜上以得到400-500个菌落。琼脂平板37℃温育7.5小时至菌落达到约0.5mm大小。
同时，取一张疏水膜(Millipore，Immobilon P，孔径大小0.45μm)也剪成合适大小，根据生产商的说明书用PBS浸湿。通过在10ml于PBS中的10mg/ml HSA(Sigma)溶液中室温下搅动4小时，完成用HSA的包被。通过室温下与20ml于PBS中的4％(w/v)脱脂奶粉和0.1％(v/v)Tween-20温育2小时来饱和膜上的剩余结合位点。用20ml PBS洗两次膜10分钟，之后用其中加有200μg/L无水四环素的10ml LB/Amp培养基浸泡10分钟。
最后，膜在一个位置处作上标记并置于加有200μg/L无水四环素的LB/Amp琼脂培养板上。将来自上面的其上菌落已长出的亲水膜置于疏水膜上，使两个标记重叠。培养板与两张膜在22℃温育15小时。在此期间，上层膜上的菌落各分泌出相应hNGAL突变蛋白，这些蛋白通过其白蛋白结合结构域及下层膜上的HAS固定于下层膜上。
此后，有菌落的上层膜转移到新鲜LB/Amp琼脂平板上，4℃存放。拿下疏水膜并洗三次，每次用20ml PBST洗5分钟。
为了分析固定化hNGAL突变蛋白的结合活性，然后膜在3.5ml于含有0.5％w/v脱脂奶粉的PBST中的100nM地高辛化TNFα溶液中温育1小时。
通过溶于27μl DMSO中的40nmol(27.5μg)DIG-NHS(Roche)与溶于235μl PBS/NaOH(pH8.5)中的10nmol(187.7μg)TNFα反应来制备缀合物，反应在总体积1ml的PBS/NaOH pH8.5中进行。室温下搅动1小时来温育混合物。根据生产商的说明书使用PD-10凝胶过滤柱(Pharmacia)并且用PBS作为流动缓冲液，从TNFα缀合物中去除多余试剂。
用PBST洗三次膜，之后与10ml在PBST中1∶1000稀释的抗地高辛配基Fab-碱性磷酸酶缀合物温育1小时，以便通过TNFα缀合物的地高辛基团检测结合的TNFα。膜用PBST洗两次，用PBS洗一次，每次5分钟，并在AP缓冲液中搅动10分钟。为了显色反应，膜在10ml AP缓冲液中温育，向其中加入30μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸4-甲苯胺盐(Roth，在二甲基甲酰胺中50μg/ml)和5μl氮蓝四唑(Roth，在70％v/v二甲基甲酰胺中75μg/ml)，直到在某些菌落的位置出现明显的颜色信号。
在多个菌落筛查实验的膜上出现的1800个菌落中，14个在疏水膜上出现强烈颜色斑点，从相应的亲水膜培养此14个菌落。分离其质粒DNA，根据生产商的说明书使用有Big Dye Terminator循环测序试剂盒和Genetic Analyzer 310系统(Applied Biosystems)对hNGAL基因盒进行序列分析，测序使用寡脱氧核苷酸SEQ ID NO：5作为引物。
这14个突变蛋白中，13个显示同一序列，命名为TNF-V1，而第14个序列与其不同并命名为TNF-V2。
克隆TNF-V1和TNF-V2的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，偏离初始hNGAL突变蛋白的那些氨基酸残基在表4中给出。SEQ ID NO：32和SEQID NO：33中分别给出了突变蛋白TNF-V1和TNF-V2的核苷酸序列。SEQID NO：36和SEQ ID NO：37中分别给出了这两个突变蛋白的全长氨基酸序列。
表4：hNGAL突变蛋白TNF-V1和TNF-V2的序列特征
位置    hNGAL    TNF-V1    TNF-V2
40      Ala      Phe       Gly
42      Leu      Phe       Phe
44      Glu      Leu       Val
46      Lys      Leu       Phe
47      Asp      Glu       Asn
49      Gln      Phe       Ile
50      Lys      Phe       Ser
70      Leu      Thr       Asp
72      Arg      Leu       Ala
73      Lys      Glu       Asn
77      Asp      Phe       Ala
79      Trp      Glu       Arg
80      Ile      ΔΔΔ*  Ile
101     Pro      Lys       Gly
102     Gly      His       Asn
103     Leu      Gly       Val
125     Lys      Asp       Gly
127     Ser      Ser       Asp
128     Gln      Gln       Ser
130     Arg      Arg       Asn
132     Tyr      Asn       Arg
*由于核苷酸238-240的缺失，突变蛋白TNF-V1在80位缺少异亮氨酸残基。
实施例18：通过“菌落斑点分析”确认所选hNGAL突变蛋的对TNF α的结合活性
用与实施例17中描述的菌落筛查分析相似的方式进行菌落斑点分析，除了将含有相应表达质粒的大肠杆菌单菌落从原平板点到用格子标记的亲水膜上而不是将转化细胞的悬液铺板。每个克隆分别用无菌牙签在亲水膜(Millipore，GVWP型，孔径大小0.22μm)上点4到5次，此膜铺于LB/Amp琼脂培养板上。细胞在37℃生长5小时。
同时，疏水膜(Millipore，Immobilon P，孔径大小0.45μm)根据生产商的说明书用PBS浸湿。通过在10ml于PBS中的10mg/ml HSA(Sigma)溶液中室温下搅动4小时，完成用HSA的包被。通过室温下与20ml于PBS中的3％(w/v)BSA和0.1％(v/v)Tween-20温育2小时来饱和膜上的剩余结合位点。用20ml PBS洗两次膜10分钟，之后用其中加有200μg/L无水四环素的10ml LB/Amp培养基浸泡10分钟。
最后，膜在一个位置处作上标记，并置于含有200μg/L无水四环素的LB/Amp琼脂培养板上。来自上面的其上菌落已长出的亲水膜置于疏水膜上，使两个标记重叠。培养板与两张膜在22℃温育15小时。在此期间，各个hNGAL突变蛋白自上层膜上的菌落分泌出来，并通过其白蛋白结合结构域结合下层膜上的HAS从而固定于下层膜上。
此后，有菌落的上层膜转移到新鲜LB/Amp琼脂平板上，4℃存放。拿下疏水膜并洗三次，每次用20ml PBST洗5分钟。
为了确证所点的突变蛋白对TNFα的结合活性，然后膜在3.5ml于含有0.5％w/v脱脂奶粉的PBST中的100nM地高辛化TNFα溶液中温育1小时(因此地高辛化TNFα在PBS中的1.5μM储液在含有脱脂奶粉的PBST中1∶15稀释)。
用PBST洗三次膜，之后与10ml在PBST中1∶1000稀释的抗地高辛配基Fab-碱性磷酸酶缀合物温育1小时，以便通过TNFα缀合物的地高辛基团检测结合的TNFα。膜用PBST洗两次，用PBS洗一次，每次5分钟，并在AP缓冲液中搅动10分钟。为了显色反应，膜在10ml AP缓冲液中温育，向其中加入30μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸4-甲苯胺盐(Roth，在二甲基甲酰胺中50μg/ml)和5μl氮蓝四唑(Roth，在70％v/v二甲基甲酰胺中75μg/ml)。在点有突变蛋白TNF-V1和TNF-V2的位置处有明显的颜色信号，而对于hNGAL野生型(phNGAL7编码)、后胆色素结合蛋白(由载体pBBP22编码；Schlehuber等J.Mol.Biol.297(2000)，1105-1120)、来自如实施例6所述的hNGAL突变蛋白文库的两个无关突变蛋白(两个都亚克隆到phNGAL7上)以及没有表达蛋白的克隆(含有pBluescript(Stratagene)作为质粒)未能观察到结合信号。这证实TNF-V1和TNF-V2对TNFα的结合活性(图12)。
                            序列表
<110>皮里斯蛋白实验公司(Pieris Proteolab AG)
<120>人嗜中性粒细胞明胶酶相关lipocalin和有关蛋白的突变蛋白
<150>PCT/EP01/11213
<151>2001-09-27
<150>PCT/EP02/04223
<151>2002-04-16
<160>37
<210>1
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)...(22)
<223>n：a，g，c或t；k：g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)...(28)
<223>n：a，g，c或t；k：g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)...(34)
<223>n：a，g，c或t；k：g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(38)...(43)
<223>n：a，g，c或t；k：g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)...(52)
<223>n：a，g，c或t；k：g或t
<220>
<223>引物
<400>1
ggtaggtctc gcagggaatn nkattnnkag annkgacnnk nnkccgnnkn    50
nkatgtatgc caccatctat g                                   71
<210>2
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)...(32)
<223>n：a，g，c或t；m：a或c
<220>
<221>misc_feature
<222>(36)...(38)
<223>n：a，g，c或t；m：a或c
<220>
<221>misc_feature
<222>(48)...(53)
<223>n：a，g，c或t；m：a或c
<220>
<221>misc_feature
<222>(56)...(59)
<223>n：a，g，c或t；m：a或c
<220>
<223>引物
<400>2
ggctgggaac ctggaacaaa agtcctgatm nngtamnnac acttcttmnn    50
mnnaaamnng acggaggtga cattgta                             77
<210>3
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(53)...(61)
<223>n：a，g，c或t；k：g或t
<220>
<223>引物
<400>3
tgttccaggt tcccagccag gcgagttcac gctgggcaac attaagagtt    50
acnnknnknn kacgagttac ctcgtccga                           79
<210>4
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)...(34)
<223>n：a，g，c或t；m：a或c
<220>
<221>misc_feature
<222>(37)...(40)
<223>n：a，g，c或t；m：a或c
<220>
<221>misc_feature
<222>(44)...(49)
<223>n：a，g，c或t；k：g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(52)...(54)
<223>n：a，g，c或t；k：g或t
<220>
<223>引物
<400>4
ccttggttct cccgtagatg gtaatcttga amnnctcmnn gttmnnmnna    50
acmnncttaa agaacaccat agcatgc                             77
<210>5
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
cttccaggac aaccaattcc atgggaagtg gtatgtggta ggtctcgcag    50
ggaa                                                      54
<210>6
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
cctttagttc cgaagccagc tccttggttc tcccgtaga                39
<210>7
<211>1231
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>sig_peptide
<222>(22)...(84)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(85)...(1221)
<223>修饰的hNGAL、Strep-tag II和噬菌体外壳蛋白pIII片断的融合蛋白
<220>
<221>CDS
<222>(85)...(618)
<223>成熟hNGAL
<220>
<221>CDS
<222>(619)...(648)
<223>STrep-tagII亲和标签
<220>
<221>CDS
<222>(649)...(651)
<223>琥珀终止密码子
<220>
<221>CDS
<222>(652)...(1221)
<223>外壳蛋白pIII的第217-406位氨基酸
<400>7
tctagataacg agggcaaaa a  atg aaa aag aca gct atc gcg att       45
                         Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
                         -21 -20                 -15
gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc cag gac    90
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp
            -10                 -5               -1   1
tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag gtc cct    135
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro
          5                  10                  15
ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cat ggg aag tgg tat    180
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
         20                  25                  30
ctg gta ggt ctc gca ggg aat gca att ctc aga gaa gac aaa gac    225
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp
         35                  40                  45
ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa gac aag    270
Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
         50                  55                  60
agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt gac    315
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp
         65                  70                  75
tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tgc cag ccc ggc gag ttc    360
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe
         80                  85                  90
acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc    405
Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu
         95                 100                 105
gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc    450
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe
        110                 115                 120
ttt aag aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag att acc atc    495
Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile
        125                 130                 135
tac ggg aga acc aag gag ctg gct tcg gaa cta aag gag aac ttc    540
Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
        140                 145                 150
atc cgc ttc tct aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc    585
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
        155                 160                 165
ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc gct tgg tcc  630
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser
        170                 175                 180
cac ccg cag ttc gaa aaa tag gct ggc ggc ggc tct ggt ggt ggt  675
His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        185                 190                 195
tct ggc ggc ggc tct gag ggt ggt ggc tct gag ggt ggc ggt tct  720
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
        200                 205                 210
gag ggt ggc ggc tct gag gga ggc ggt tcc ggt ggt ggc tct ggt  765
Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
        215                 220                 225
tcc ggt gat ttt gat tat gaa aag atg gca aac gct aat aag ggg  810
Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly
        230                 235                 240
gct atg acc gaa aat gcc gat gaa aac gcg cta cag tct gac gct  855
Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala
        245                 250                 255
aaa ggc aaa ctt gat tct gtc gct act gat tac ggt gct gct atc  900
Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile
        260                 265                 270
gat ggt ttc att ggt gac gtt tcc ggc ctt gct aat ggt aat ggt  945
Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly
        275                 280                 285
gct act ggt gat ttt gct ggc tct aat tcc caa atg gct caa gtc  990
Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val
        290                 295                 300
ggt gac ggt gat aat tca cct tta atg aat aat ttc cgt caa tat  1035
Gly Asp Gly Asp Ash Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr
        305                 310                 315
tta cct tcc ctc cct caa tcg gtt gaa tgt cgc cct ttt gtc ttt  1080
Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe
        320                 325                 330
ggc gct ggt aaa cca tat gaa ttt tct att gat tgt gac aaa ata  1125
Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile
        335                 340                 345
aac tta ttc cgt ggt gtc ttt gcg ttt ctt tta tat gtt gcc acc  1170
Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr
        350                 355                 360
ttt atg tat gta ttt tct acg ttt gct aac ata ctg cgt aat aag  1215
Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys
        365                 370                 375
gag tct taataagctt                                           1231
Glu Ser
    379
<210>8
<211>1231
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>sig_peptide
<222>(22)...(84)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(85)...(1221)
<223>hNGAL、Strep-tag II和噬菌体外壳蛋白pIII片断的融合蛋白
<220>
<221>CDS
<222>(85)...(618)
<223>成熟hNGAL
<220>
<221>CDS
<222>(619)...(648)
<223>Strep-tagII亲和标签
<220>
<221>CDS
<222>(649)...(651)
<223>琥珀终止密码子
<220>
<221>CDS
<222>(652)...(1221)
<223>外壳蛋白pIII的第217-406位氨基酸
<400>8
tctagataacg agggcaaaa a  atg aaa aag aca gct atc gcg att     45
                         Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
                         -21 -20                 -15
gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc cag gac  90
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp
            -10                 -5               -1   1
tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag gtc cct  135
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro
          5                  10                  15
ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag tgg tat  180
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
         20                  25                  30
ctg gta ggt ctc gca ggg aat gca att ctc aga gaa gac aaa gac  225
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp
         35                  40                  45
ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa gac aag  270
Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
         50                  55                  60
agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt gac  315
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp
         65                  70                  75
tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tgc cag ccc ggc gag ttc  360
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe
        80                  85                  90
acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc  405
Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu
        95                  100                 105
gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc  450
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe
        110                 115                 120
ttt aag aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag att acc atc  495
Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile
        125                 130                 135
tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag aac ttc  540
Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
        140                 145                 150
atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc  585
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
        155                 160                 165
ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc gct tgg tcc  630
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser
        170                 175                 180
cac ccg cag ttc gaa aaa tag gct ggc ggc ggc tct ggt ggt ggt  675
His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        185                 190                 195
tct ggc ggc ggc tct gag ggt ggt ggc tct gag ggt ggc ggt tct  720
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
        200                 205                 210
gag ggt ggc ggc tct gag gga ggc ggt tcc ggt ggt ggc tct ggt  765
Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
        215                 220                 225
tcc ggt gat ttt gat tat gaa aag atg gca aac gct aat aag ggg  810
Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly
        230                 235                 240
gct atg acc gaa aat gcc gat gaa aac gcg cta cag tct gac gct  855
Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala
        245                 250                 255
aaa ggc aaa ctt gat tct gtc gct act gat tac ggt gct gct atc  900
Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile
        260                 265                 270
gat ggt ttc att ggt gac gtt tcc ggc ctt gct aat ggt aat ggt  945
Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly
        275                 280                 285
gct act ggt gat ttt gct ggc tct aat tcc caa atg gct caa gtc  990
Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val
        290                 295                 300
ggt gac ggt gat aat tca cct tta atg aat aat ttc cgt caa tat  1035
Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr
        305                 310                 315
tta cct tcc ctc cct caa tcg gtt gaa tgt cgc cct ttt gtc ttt  1080
Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe
        320                 325                 330
ggc gct ggt aaa cca tat gaa ttt tct att gat tgt gac aaa ata  1125
Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile
        335                 340                 345
aac tta ttc cgt ggt gtc ttt gcg ttt ctt tta tat gtt gcc acc  1170
Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr
        350                 355                 360
ttt atg tat gta ttt tct acg ttt gct aac ata ctg cgt aat aag  1215
Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys
        365                 370                 375
gag tct taataagctt                                           1231
Glu Ser
    379
<210>9
<211>805
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>sig_peptide
<222>(22)...(84)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(85)...(795)
<223>修饰的hNGAL、Strep-tag II和白蛋白结合结构域的融合蛋白
<220>
<221>CDS
<222>(85)...(618)
<223>成熟hNGAL
<220>
<221>CDS
<222>(619)...(648)
<223>Strep-tag II亲和标签
<220>
<221>CDS
<222>(649)...(795)
<223>蛋白G的白蛋白结合结构域
<400>9
tctagataac gagggcaaaa a  atg aaa aag aca gct atc gcg att       45
                         Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
                         -21 -20                 -15
gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc cag gac    90
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp
            -10                 -5               -1   1
tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag gtc cct    135
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro
          5                  10                  15
ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag tgg tat    180
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
         20                  25                  30
ctg gta ggt ctc gca ggg aat gca att ctc aga gaa gac aaa gac  225
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp
         35                  40                  45
ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa gac aag  270
Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
         50                  55                  60
agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt gac  315
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp
         65                  70                  75
tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tgc cag ccc ggc gag ttc  360
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe
         80                  85                  90
acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc  405
Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu
         95                 100                 105
gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc  450
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe
        110                 115                 120
ttt aag aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag att acc atc  495
Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile
        125                 130                 135
tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag aac ttc  540
Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
        140                 145                 150
atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc  585
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
        155                 160                 165
ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc gct tgg tcc  630
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser
        170                 175                 180
cac ccg cag ttc gaa aaa cca gct agc ctg gct gaa gct aaa gtt  675
His Pro Gln Phe Glu Lys Pro Ala Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val
        185                 190                 195
ctg gct aac cgt gaa ctg gac aaa tac ggt gtt tcc gac tac tac  720
Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr
        200                 205                 210
aaa aac ctc atc aac aac gct aaa acc gtt gaa ggt gtt aaa gct  765
Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala
        215                 220                 225
ctg atc gac gaa att ctc gca gca ctg ccg taataagctt           805
Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
        230                 235
<210>10
<211>580
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>sig_peptide
<222>(22)...(84)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(85)...(570)
<223>修饰的人tear Lipocalin和Strep-tag II的融合蛋白
<220>
<221>CDS
<222>(85)...(543)
<223>成熟人tear Lipocalin
<220>
<221>CDS
<222>(544)...(570)
<223>Strep-tag II亲和标签
<400>10
tctagataacg agggcaaaa a  atg aaa aag aca gct atc gcg att      45
                         Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
                         -21 -20                 -15
gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc gcc tca  90
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Ser
            -10                 -5               -1   1
gac gag gag att cag gat gtg tca ggg acg tgg tat ctg aag gcc 135
Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala
          5                  10                  15
atg acg gtg gac agg gag ttc cct gag atg aat ctg gaa tcg gtg 180
Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Val
         20                  25                  30
aca ccc atg acc ctc acg acc ctg gaa ggg ggc aac ctg gaa gcc 225
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala
         35                  40                  45
aag gtc acc atg ctg ata agt ggc cgg tgc cag gag gtg aag gcc 270
Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val Lys Ala
         50                  55                  60
gtc ctg gag aaa act gac gag ccg gga aaa tac acg gcc gac ggg 315
Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly
         65                  70                  75
ggc aag cac gtg gca tac atc atc agg tcg cac gtg aag gac cac 360
Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His
         80                  85                  90
tac atc ttt tac tct gag ggc gag ctc cac ggg aag ccg gtc cga 405
Tyr Ile Phe Tyr Ser Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg
         95                 100                 105
cgg gtg aag Ctc gtg ggc aga gac ccc aag aac aac ctg gaa gcc 450
Gly Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala
        110                 115                 120
ttg gag gac ttt gag aaa gcc gca gga gcc cgc gga ctc agc acg 495
Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr
        125                 130                 135
gag agc atc ctc atc ccc agg cag agc gaa acc tgc tct cca ggg 540
Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly
        140                 145                 150
agc gct tgg tct cac ccg cag ttc gaa aaa taataagctt          580
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
        155                 160
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
ccactcccta tcagtgat                            18
<210>12
<211>537
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(537)
<223>突变蛋白Tlpca
<400>12
cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag 45
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cat ggg aag 90
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys
                 20                  25                  30
tgg tat gtg gta ggt ctc gca ggg aat tgt att gtg aga cag gac 135
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Cys Ile Val Arg Gln Asp
                 35                  40                  45
ctt ctg ccg tct atg atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa 180
Leu Leu Pro Ser Met Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc tta ttt atg gat aag aag 225
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Met Asp Lys Lys
                 65                  70                  75
tgt cgg tac tat atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag ccg ggc 270
Cys Arg Tyr Tyr Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                 80                  85                  90
gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac ggt att gtt acg agt 315
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Gly Ile Val Thr Ser
                 95                 100                 105
tac ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg 360
Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
gtg ttc ttt aag tcg gtt atg acg aac tag gag gcg ttc aag att 405
Val Phe Phe Lys Ser Val Met Thr Asn Gln Glu Ala Phe Lys Ile
                125                 130                 135
acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg gct tcg gaa cta aag gag 450
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
aac ttc atc cgc ttc tct aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac 495
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc     537
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser
                170                 175
<210>13
<211>400
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>信号序列
<222>(-21)...(-1)
<220>
<221>链
<222>(1)...(379)
<223>修饰的hNGAL、Strep-tag II和噬菌体外壳蛋白pIII片断的融合蛋白
<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>成熟hNGAL
<220>
<221>
<222>(179)...(188)
<223>Strep-tag II亲和标签
<220>
<221>
<222>(189)
<223>琥珀终止密码子
<220>
<221>
<222>(190)...(379)
<223>外壳蛋白pIII的第217-406位氨基酸
<400>13
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
-21 -20                 -15
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp
            -10                 -5               -1   1
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro
          5                  10                  15
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
         20                  25                  30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp
         35                  40                  45
Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
         50                  55                  60
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp
         65                  70                  75
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe
         80                  85                  90
Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu
         95                 100                 105
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe
        110                 15                  120
Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile
        125                 130                 135
Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
        140                 145                 150
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
        155                 160                 165
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser
        170                 175                 180
His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        185                 190                 195
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
        200                 205                 210
Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
        215                 220                 225
Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly
        230                 235                 240
Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala
        245                 250                 255
Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile
        260                 265                 270
Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly
        275                 280                 285
Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val
        290                 295                 300
Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr
        305                 310                 315
Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe
        320                 325                 330
Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile
        335                 340                 345
Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr
        350                 355                 360
Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys
        365                 370                 375
gag tct
Glu Ser
    379
<210>14
<211>400
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>信号序列
<222>(-21)...(-1)
<220>
<221>链
<222>(1)...(379)
<223>hNGAL、Strep-tag II和噬菌体外壳蛋白pIII片断的融合蛋白
<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>成熟hNGAL
<220>
<221>
<222>(179)...(188)
<223>Strep-tag II亲和标签
<220>
<221>
<222>(189)
<223>琥珀终止密码子
<220>
<221>
<222>(190)...(379)
<223>外壳蛋白pIII的第217-406位氨基酸
<400>14
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
-21 -20                 -15
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp
            -10                 -5               -l   1
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro
          5                  10                  15
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
         20                  25                  30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp
         35                  40                  45
Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
         50                  55                  60
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp
         65                  70                  75
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe
         80                  85                  90
Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu
         95                 100                 105
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe
        110                 115                 120
Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile
        125                 130                 135
Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
        140                 145                 150
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
        155                 160                 165
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser
        170                 175                 180
His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        185                 190                 195
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
        200                 205                 210
Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
        215                 220                 225
Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly
        230                 235                 240
Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala
        245                 250                 255
Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile
        260                 265                 270
Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly
        275                 280                 285
Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val
        290                 295                 300
Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr
        305                 310                 315
Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe
        320                 325                 330
Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile
        335                 340                 345
Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr
        350                 355                 360
Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys
        365                 370                 375
Glu Ser
    379
<210>15
<211>258
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>信号序列
<222>(-21)...(-1)
<220>
<221>链
<222>(1)...(237)
<223>修饰的hNGAL、Strep-tagII和白蛋白结合结构域的融合蛋白
<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>成熟hNGAL
<220>
<221>
<222>(179)...(188)
<223>Strep-tag II亲和标签
<220>
<221>
<222>(189)...(237)
<223>蛋白G的白蛋白结合结构域
<400>15
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
-21 -20                 -15
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp
            -10                  -5              -1   1
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro
          5                 10                   15
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
         20                 25                   30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp
         35                 40                   45
Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
         50                 55                   60
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp
         65                 70                   75
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe
         80                  85                  90
Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu
         95                 100                 105
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe
        110                 115                 120
Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile
        125                 130                 135
Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
        140                 145                 150
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
        155                 160                 165
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser
        170                 175                 180
His Pro Gln Phe Glu Lys Pro Ala Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val
        185                 190                 195
Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr
        200                 205                 210
Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala
        215                 220                 225
Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
        230                 235
<210>16
<211>183
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>信号序列
<222>(-21)...(-1)
<220>
<221>链
<222>(1)...(1)
<223>修饰的人tear Lipocalin和Strep-tag II的融合蛋白
<220>
<221>
<222>(1)...(152)
<223>成熟人tear Lipocalin
<220>
<221>
<222>(153)...(162)
<223>Strep-tagII亲和标签
<400>16
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
-21 -20                 -15
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Ser
            -10                 -5               -1   1
Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala
          5                  10                  15
Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Val
         20                  25                  30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala
         35                  40                  45
Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val Lys Ala
         50                  55                  60
Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly
         65                  70                  75
Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His
         80                  85                  90
Tyr Ile Phe Tyr Ser Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg
         95                 100                 105
Gly Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala
        110                 115                 120
Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr
        125                 130                 135
Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly
        140                 145                 150
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
        155                 160
<210>17
<211>178
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>突变蛋白Tlpca
<400>17
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys
                 20                  25                  30
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Cys Ile Val Arg Gln Asp
                 35                  40                  45
Leu Leu Pro Ser Met Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Met Asp Lys Lys
                 65                  70                  75
Cys Arg Tyr Tyr Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                80                   85                  95
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Gly Ile Val Thr Ser
                 95                 100                 105
Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
Val Phe Phe Lys Ser Val Met Thr Asn Gln Glu Ala Phe Lys Ile
                125                 130                 135
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<210>18
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>衍生自人血小板反应蛋白1的肽
<220>
<221>MOD_Res
<222>(11)
<223>生物素化
<400>18
Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Aca Aca Lys
  1              5                   10
<210>19
<211>1231
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>sig_peptide
<222>(22)...(84)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(85)...(1221)
<223>修饰的hNGAL、Strep-tag II和噬菌体外壳蛋白pIII片断的融合蛋白
<220>
<221>CDS
<222>(85)...(618)
<223>成熟hNGAL
<220>
<221>CDS
<222>(619)...(648)
<223>Strep-tag II亲和标签
<220>
<221>CDS
<222>(649)...(651)
<223>琥珀终止密码子
<220>
<221>CDS
<222>(652)...(1221)
<223>外壳蛋白pIII的第217-406位氨基酸
<400>19
tctagataacg agggcaaaa a  atg aaa aag aca gct atc gcg att     45
                         Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
                         -21 -20                  -15
gca gtg gct ctg gct ggc ttc gct acc gta gcg cag gcc cag gac  90
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp
            -10                 -5               -1   1
tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag gtc cct  135
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro
          5                  10                  15
ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cat ggg aag tgg tat  180
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
         20                  25                  30
ctg gta ggt ctc gca ggg aat gca att ctc aga gaa gac aaa gac  225
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp
         35                  40                  45
ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa gac aag  270
Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
         50                  55                  60
agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt gac  315
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp
         65                  70                  75
tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc gag ttc  360
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe
         80                  85                  90
acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc  405
Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu
         95                 100                 105
gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc  450
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe
        110                 115                 120
ttt aag aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag att acc atc  495
Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile
        125                 130                 135
tac ggg aga acc aag gag ctg gct tcg gaa cta aag gag aac ttc  540
Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
        140                 145                 150
atc cgc ttc tct aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc  585
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
        155                 160                 165
ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc gct tgg tcc  630
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser
        170                 175                 180
cac ccg cag ttc gaa aaa tag gct ggc ggc ggc tct ggt ggt ggt  675
His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        185                 190                 195
tct ggc ggc ggc tot gag ggt ggt ggc tct gag ggt ggc ggt tct  720
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
        200                 205                 210
gag ggt ggc ggc tct gag gga ggc ggt tcc ggt ggt ggc tct ggt  765
Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
        215                 220                 225
tcc ggt gat ttt gat tat gaa aag atg gca aac gct aat aag ggg  810
Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly
        230                 235                 240
gct atg acc gaa aat gcc gat gaa aac gcg cta cag tct gac gct  855
Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala
        245                 250                 255
aaa ggc aaa ctt gat tct gtc gct act gat tac ggt gct gct atc  900
Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile
        260                 265                 270
gat ggt ttc att ggt gac gtt tcc ggc ctt gct aat ggt aat ggt  945
Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly
        275                 280                 285
gct act ggt gat ttt gct ggc tct aat tcc caa atg gct caa gtc  990
Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val
        290                 295                 300
ggt gac ggt gat aat tca cct tta atg aat aat ttc cgt caa tat  1035
Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr
        305                 310                 315
tta cct tcc ctc cct caa tcg gtt gaa tgt cgc cct ttt gtc ttt  1080
Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe
        320                 325                 330
ggc gct ggt aaa cca tat gaa ttt tct att gat tgt gac aaa ata  1125
Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile
        335                 340                 345
aac tta ttc cgt ggt gtc ttt gcg ttt ctt tta tat gtt gcc acc  1170
Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr
        350                 355                 360
ttt atg tat gta ttt tct acg ttt gct aac ata ctg cgt aat aag  1215
Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys
        365                 370                 375
gag tct taataagctt                                           1231
Glu Ser
    379
<210>20
<211>400
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>信号序列
<222>(-21)...(-1)
<220>
<221>链
<222>(1)...(379)
<223>修饰的hNGAL、Strep-tag II和噬菌体外壳蛋白pIII片断的融合蛋白
<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>修饰的成熟hNGAL
<220>
<221>
<222>(179)...(188)
<223>Strep-tag II亲和标签
<220>
<221>
<222>(189)
<223>琥珀终止密码子
<220>
<221>
<222>(190)...(379)
<223>外壳蛋白pIII的第217-406位氨基酸
<400>20
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
-21 -20                 -15
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp
            -10                 -5               -1   1
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro
          5                  10                  15
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
         20                  25                  30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp
         35                  40                  45
Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
         50                  55                  60
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp
         65                  70                  75
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe
         80                  85                  90
Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu
         95                 100                 105
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe
        110                 115                 120
Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile
        125                 130                 135
Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
        140                 145                 150
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
        155                 160                 165
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser
        170                 175                 180
His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        185                 190                 195
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
        200                 205                 210
Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
        215                 220                 225
Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly
        230                 235                 240
Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala
        245                 250                 255
Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile
        260                 265                 270
Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly
        275                 280                 285
Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val
        290                 295                 300
Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr
        305                 310                 315
Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe
        320                 325                 330
Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile
        335                 340                 345
Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr
        350                 355                 360
Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys
        365                 370                 375
Glu Ser
    379
<210>21
<211>658
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>sig_peptide
<222>(22)...(84)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(85)...(648)
<223>修饰的hNGAL和Strep-tag II的融合蛋白
<220>
<221>CDS
<222>(85)...(618)
<223>成熟hNGAL
<220>
<221>CDS
<222>(619)...(648)
<223>Strep-tagII亲和标签
<400>21
tctagataac gagggcaaaa a  atg aaa aag aca gct atc gcg att     45
                         Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
                         -21 -20                 -15
gca gtg gct ctg gct ggc ttc gct acc gta gcg cag gcc cag gac  90
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp
            -10                 -5               -1   1
tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag gtc cct  135
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro
          5                  10                  15
ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag tgg tat  180
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
         20                  25                  30
ctg gta ggt ctc gca ggg aat gca att ctc aga gaa gac aaa gac  225
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp
         35                  40                  45
ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa gac aag  270
Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
         50                  55                  60
agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt gac  315
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp
         65                  70                  75
tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc gag ttc  360
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe
         80                  85                  90
acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc  405
Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu
         95                 100                 105
gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc  450
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe
        110                 115                 120
ttt aag aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag att acc atc  495
Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile
        125                 130                 135
tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag aac ttc  540
Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
        140                 145                 150
atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc  585
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
        155                 160                 165
ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc gct tgg tcc  630
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser
        170                 175                 180
cac ccg cag ttc gaa aaa taataagctt                           658
His Pro Gln Phe Glu Lys
        185
<210>22
<211>209
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>信号序列
<222>(-21)...(-1)
<220>
<221>链
<222>(1)...(188)
<223>修饰的hNGAL和Strep-tag II的融合蛋白
<220><221>
<222>(1)...(178)
<223>修饰的成熟hNGAL
<220>
<221>
<222>(179)...(188)
<223>Strep-tag II亲和标签
<400>22
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
-21 -20                 -15
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp
            -10                 -5               -1   1
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro
          5                  10                  15
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
         20                  25                  30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp
         35                  40                  45
Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys
         50                  55                  60
Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp
         65                  70                  75
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe
         80                  85                  90
Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu
         95                 100                 105
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe
        110                 115                 120
Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile
        125                 130                 135
Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe
        140                 145                 150
Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val
        155                 160                 165
Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser
        170                 175                 180
His Pro Gln Phe Glu Lys
        185
<210>23
<211>534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(534)
<223>突变蛋白RFY-B
<400>23
cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag  45
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag  90
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
tgg tat ctg gta ggt ctc gca ggg aat ggg att acg aga tat gac  135
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Thr Arg Tyr Asp
                 35                  40                  45
cgg ctg ccg tct gtg atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa  180
Arg Leu Pro Ser Val Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc gat ttt tgg gct aag aag  225
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Trp Ala Lys Lys
                 65                  70                  75
tgt aat tac aag atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc  270
Cys Asn Tyr Lys Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                 80                  85                  90
gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac gat ctg ctt acg agt  315
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Leu Gly Leu Thr Ser
                 95                 100                 105
ttc ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg  360
Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
gtg ttc ttt aag ccg gtt ggg ggg aac att gag tgg ttc aag att  405
Val Phe Phe Lys Pro Val Gly Gly Asn Ile Glu Trp Phe Lys Ile
                125                 130                 135
acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag  450
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
aac ttc atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac  495
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc          534
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<210>24
<211>178
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>突变蛋白RFY-B
<400>24
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Thr Arg Tyr Asp
                 35                  40                  45
Arg Leu Pro Ser Val Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Trp Ala Lys Lys
                 65                  70                  75
Cys Asn Tyr Lys Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                 80                  85                  90
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Leu Gly Leu Thr Ser
                 95                 100                 105
Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
Val Phe Phe Lys Pro Val Gly Gly Asn Ile Glu Trp Phe Lys Ile
                125                 130                 135
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<210>25
<211>534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(534)
<223>突变蛋白RFY-C
<400>25
cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag  45
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag  90
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
tgg tat ctg gta ggt ctc gca ggg aat ggg att cat aga ctg gac  135
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile His Arg Leu Asp
                 35                  40                  45
aat gtt ccg cct aat atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa  180
Asn Val Pro Pro Asn Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc gat ttt ctt atg aag aag  225
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Leu Met Lys Lys
                 65                  70                  75
tgt ccg tac ttt atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc  270
Cys Pro Tyr Phe Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                 80                  85                  90
gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac ccg ttt ctt acg agt  315
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Phe Leu Thr Ser
                 95                 100                 105
ttc ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg  360
Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
gtg ttc ttt aag aat gtt cct agg aac tat gag gag ttc aag att  405
Val Phe Phe Lys Asn Val Pro Arg Asn Tyr Glu Glu Phe Lys Ile
                125                 130                 135
acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag  450
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
aac ttc atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac  495
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc          534
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<210>26
<211>178
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>突变蛋白RFY-C
<400>26
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile His Arg Leu Asp
                 35                  40                  45
Asn Val Pro Pro Asn Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Leu Met Lys Lys
                 65                  70                  75
Cys Pro Tyr Phe Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                 80                  85                  90
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Phe Leu Thr Ser
                 95                 100                 105
Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
Val Phe Phe Lys Asn Val Pro Arg Asn Tyr Glu Glu Phe Lys Ile
                125                 130                 135
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<210>27
<211>534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(534)
<223>突变蛋白RFY-E
<400>27
cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag  45
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag  90
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
tgg tat ctg gta ggt ctc gca ggg aat ggg att acg aga gtt gac  135
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Thr Arg Val Asp
                 35                  40                  45
acg ctg ccg tct cgg atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa  180
Thr Leu Pro Ser Arg Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc cct ttt atg ggt aag aag  225
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Pro Phe Met Gly Lys Lys
                 65                  70                  75
tgt aag tac aag atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc  270
Cys Lys Tyr Lys Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                 80                  85                  90
gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac atg tcg aat acg agt  315
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Met Ser Asn Thr Ser
                 95                 100                 105
ttc ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg  360
Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
gtg ttc ttt aag cag gtt cat aag aac cct gag tct ttc aag att  405
Val Phe Phe Lys Gln Val His Lys Asn Pro Glu Ser Phe Lys Ile
                125                 130                 135
acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag  450
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
aac ttc atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac  495
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc          534
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<2l0>28
<211>178
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>突变蛋白RFY-E
<400>28
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Thr Arg Val Asp
                 35                  40                  45
Thr Leu Pro Ser Arg Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Pro Phe Met Gly Lys Lys
                 65                  70                  75
Cys Lys Tyr Lys Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                 80                  85                  90
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Met Ser Asn Thr Ser
                 95                 100                 105
Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
Val Phe Phe Lys Gln Val His Lys Asn Pro Glu Ser Phe Lys Ile
                125                 130                 135
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<210>29
<211>77
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>
<222>(1)...(77)
<223>重组人白介素-8
<400>29
Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile
  1               5                  10                  15
Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu
                 20                  25                  30
Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile
                 35                  40                  45
Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu
                 50                  55                  60
Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu
                 65                  70                  75
Asn Ser
    77
<210>30
<211>534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(534)
<223>突变蛋白N4
<400>30
cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag  45
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag  90
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
tgg tat ctg gta ggt ctc gca ggg aat gat att tat aga gcg gac  135
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Asp Ile Tyr Arg Ala Asp
                 35                  40                  45
tct ttg ccg ggt ttg atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa  180
Ser Leu Pro Gly Leu Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc gtt ttt tat gat aag aag  225
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Val Phe Tyr Asp Lys Lys
                 65                  70                  75
tgt gtt tac tcg atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc  270
Cys Val Tyr Ser Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                 80                  85                  90
gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac gag gct gtt acg agt  315
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Glu Ala Val Thr Ser
                 95                 100                 105
ttc ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg  360
Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
gtg ttc ttt aag gat gtt agg ccg aac agt gag gag ttc aag att  405
Val Phe Phe Lys Asp Val Arg Pro Asn Ser Glu Glu Phe Lys Ile
                125                 130                 135
acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag  450
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
aac ttc atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac  495
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc          534
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<210>31
<211>522
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mat_peptide
<222>(4)...(513)
<223>肿瘤坏死因子α和亲和标签的融合蛋白
<220>
<221>CDS
<222>(4)...(42)
<223>亲和标签Arg-Gly-Ser-His(6)-Gly(3)
<220>
<221>CDS
<222>(43)...(513)
<223>成熟肿瘤坏死因子α
<400>31
cat atg aga gga tcg cat cac cat cac cat cac ggt ggc ggg gtc  45
    Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Gly Gly Val
      1               5                  10
aga tca tct tct cga acc ccg agt gac aag cct gta gcc cat gtt  90
Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
 15                  20                  25
gta gca aac cct caa gct gag ggg cag ctc cag tgg ctg aac cgc 135
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
 30                  35                  40
cgg gcc aat gcc ctc ctg gcc aat ggc gtg gag ctg aga gat aac 180
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn
 45                  50                  55
cag ctg gtg gtg cca tca gag ggc ctg tac ctc atc tac tcc cag 225
Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
 60                  65                  70
gtc ctc ttc aag ggc caa ggc tgc ccc tcc acc cat gtg ctc ctc 270
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
 75                  80                  85
acc cac acc atc agc cgc atc gcc gtc tcc tac cag acc aag gtc 315
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val
 90                  95                 100
aac ctc ctc tct gcc atc aag agc ccc tgc cag agg gag acc cca 360
Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro
105                 110                 115
gag ggg gct gag gcc aag ccc tgg tat gag ccc atc tat ctg gga 405
Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly
120                 125                 130
ggg gtc ttc cag ctg gag aag ggt gac cga ctc agc gct gag atc 450
Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile
135                 140                 145
aat cgg ccc gac tat ctc gac ttt gcc gag tct ggg cag gtc tac 495
Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr
150                 155                 160
ttt ggg atc att gcc ctg tgaaagctt                           522
Phe Gly Ile Ile Ala Leu
165                 170
<210>32
<211>534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(534)
<223>突变蛋白TNF-V1
<400>32
CAG GAC TCC ACC TCA GAC CTG ATC CCA GCC CCA CCT CTG AGC AAG 45
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
GTC CCT CTG CAG CAG AAC TTC CAG GAC AAC CAA TTC CAG GGG AAG 90
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
TGG TAT CTG GTA GGT CTC GCA GGG AAT TTT ATT TTT AGA TTG GAC 135
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Phe Ile Phe Arg Leu Asp
                 35                  40                  45
TTG GAG CCG TTT TTT ATG TAT GCC ACC ATC TAT GAG CTG AAA GAA 180
Leu Glu Pro Phe Phe Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
GAC AAG AGC TAC AAT GTC ACC TCC GTC ACG TTT TTG GAG AAG AAG 225
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Thr Phe Leu Glu Lys Lys
                 65                  70                  75
TGT TTT TAC GAG AGG ACT TTT GTT CCA GGT TCC CAG CCA GGC GAG 270
Cys Phe Tyr Glu Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu
                 80                  85                  90
TTC ACG CTG GGC AAC ATT AAG AGT TAC AAG CAT GGT ACG AGT TTC 315
Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Lys His Gly Thr Ser Phe
                 95                 100                 105
CTC GTC CGA GTG GTG AGC ACC AAC TAC AAC CAG CAT GCT ATG GTG 360
Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val
                110                 115                 120
TTC TTT AAG GAT GTT AGT CAG AAC CGT GAG AAT TTC AAG ATT ACC 405
Phe Phe Lys Asp Val Ser Gln Asn Arg Glu Asn Phe Lys Ile Thr
                125                 130                 135
ATC TAC GGG AGA ACC AAG GAG CTG CCT TCG GAA CTA AAG GAG AAC 450
Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn
                140                 145                 150
TTC ATC CGC TTC TCC AAA TCT CTG GGC CTC CCT GAA AAC CAC ATC 495
Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile
                155                 160                 165
GTC TTC CCT GTC CCA ATC GAC CAG TGT ATC GAC GGC             531
Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<210>33
<211>534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(534)
<223>突变蛋白TNF-V2
<400>33
cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag  45
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag  90
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
tgg tat ctg gta ggt ctc gca ggg aat ggt att ttt aga gtt gac  135
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Phe Arg Val Asp
                 35                  40                  45
ttt aat ccg att tct atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa  180
Phe Asn Pro Ile Ser Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc gat ttt gct aat aag aag  225
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Ala Asn Lys Lys
                 65                  70                  75
tgt gcg tac cgg atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc  270
Cys Ala Tyr Arg Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                 80                  85                  90
gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac ggt aat gtg acg agt  315
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Gly Asn Val Thr Ser
                 95                 100                 105
ttc ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg  360
Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
gtg ttc ttt aag ggt gtt gat tcg aac aat gag cgg ttc aag att  405
Val Phe Phe Lys Gly Val Asp Ser Asn Asn Glu Arg Phe Lys Ile
                125                 130                 135
acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag  450
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
aac ttc atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac  495
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc          534
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<210>34
<211>178
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>突变蛋白N4
<400>34
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Asp Ile Tyr Arg Ala Asp
                 35                  40                  45
Ser Leu Pro Gly Leu Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Val Phe Tyr Asp Lys Lys
                 65                  70                  75
Cys Val Tyr Ser Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                 80                  85                  90
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Glu Ala Val Thr Ser
                 95                 100                 105
Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
Val Phe Phe Lys Asp Val Arg Pro Asn Ser Glu Glu Phe Lys Ile
                125                 130                 135
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<210>35
<211>170
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>链
<222>(1)...(170)
<223>肿瘤坏死因子α和亲和标签的融合蛋白
<220>
<221>
<222>(1)...(13)
<223>亲和标签Arg-Gly-Ser-His(6)-Gly(3)
<220>
<221>
<222>(14)...(170)
<223>成熟肿瘤坏死因子α
<400>35
    Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Gly Gly Val
      1               5                  10
Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
 15                  20                  25
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
 30                  35                  40
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn
 45                  50                  55
Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
 60                  65                  70
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu
 75                  80                  85
Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val
 90                  95                 100
Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro
105                 110                 115
Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly
120                 125                 130
Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile
135                 140                 145
Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr
150                 155                 160
Phe Gly Ile Ile Ala Leu
165                 170
<210>36
<211>178
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>突变蛋白TNF-V1
<400>36
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Phe Ile Phe Arg Leu Asp
                 35                  40                  45
Leu Glu Pro Phe Phe Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Thr Phe Leu Glu Lys Lys
                 65                  70                  75
Cys Phe Tyr Glu Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu
                 80                  85                  90
Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Lys His Gly Thr Ser Phe
                 95                 100                 105
Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val
                110                 115                 120
Phe Phe Lys Asp Val Ser Gln Asn Arg Glu Asn Phe Lys Ile Thr
                125                 130                 135
Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn
                140                 145                 150
Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile
                155                 160                 165
Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
                170                 175
<210>37
<211>178
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>突变蛋白TNF-V2
<400>37
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys
  1               5                  10                  15
Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys
                 20                  25                  30
Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Phe Arg Val Asp
                 35                  40                  45
Phe Asn Pro Ile Ser Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
                 50                  55                  60
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Ala Asn Lys Lys
                 65                  70                  75
Cys Ala Tyr Arg Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly
                 80                  85                  90
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Gly Asn Val Thr Ser
                 95                 100                 105
Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met
                110                 115                 120
Val Phe Phe Lys Gly Val Asp Ser Asn Asn Glu Arg Phe Lys Ile
                125                 130                 135
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu
                140                 145                 150
Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His
                155                 160                 165
Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp G1n Cys Ile Asp Gly
                170                 175

Claims (16)

1.用于制备蛋白的突变蛋白的方法，其中，所述蛋白选自：人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林(hNGAL)、大鼠α2-微球蛋白相关蛋白(A2m)及小鼠24p3/子宫卡林(24p3)，所述突变蛋白对给定的靶标有可检测的亲合力，所述方法包括步骤(a)：
将蛋白在一个或多个与hNGAL的序列位置33-54、66-83、94-106、和123-136相对应的序列位置进行诱变，产生蛋白的一个或多个突变蛋白。
2.权利要求1的方法，还包括步骤(b)：
通过筛选从产生的一个或多个突变蛋白中富集对给定靶标有结合亲合力的至少一个突变蛋白，和/或分离所述至少一个突变蛋白。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)的诱变导致蛋白的多个突变蛋白。
4.根据权利要求1到3任一项的方法，其中蛋白在与hNGAL序列位置40-50、70-79、101-103和125-132相应的一个或多个序列位置进行诱变。
5.根据权利要求4的方法，其中蛋白在与hNGAL序列位置40、42、44、46、47、49、50、70、72、73、77、79、101、102、103、125、127、128、130和132相应的一个或多个序列位置进行诱变。
6.根据权利要求1到5任一项的方法，其中由诱变产生的编码蛋白的一个或多个突变蛋白的核酸可操作地在其3’末端融合有编码M13丝状噬菌体家族外壳蛋白pIII或此外壳蛋白的片段的基因，从而允许根据与给定靶标的结合筛选出至少一个突变蛋白。
7.对给定的靶标有可检测的结合亲合力的人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林(hNGAL)、大鼠α2微球蛋白相关蛋白(A2m)或小鼠24p3/子宫卡林(24p3)的突变蛋白，其可以由权利要求1到6任一项的方法获得。
8.根据权利要求7的hNGAL突变蛋白，其中Cys87被替换和/或其中突变蛋白与hNGAL相比载有Glu28→His和Thr145→Ala中的一个或多个氨基酸替换。
9.根据权利要求7的hNGAL突变蛋白，其具有SEQ ID NO：17、SEQID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28的氨基酸序列。
10.根据权利要求7到9任一项的突变蛋白，其与选自下组中的标记物缀合：有机分子、酶标记物、放射性标记物、荧光标记物、显色标记物、发光标记物、半抗原、地高辛配基、生物素、金属配合物、金属和胶体金。
11.含有根据权利要求7到10任一项的hNGAL、A2m或24p3的突变蛋白的融合蛋白，其中酶、蛋白或蛋白结构域、肽、信号序列和/或亲和标签与突变蛋白的氨基端或羧基端可操作地融合。
12.含有编码根据权利要求7到11任一项的hNGAL、A2m或24p3的突变蛋白或其融合蛋白的序列的核酸分子。
13.药物组合物，其含有根据权利要求7到11任一项的hNGAL、A2m或24p3的突变蛋白或其融合蛋白以及药学可接受载体。
14.用于制备根据权利要求7到11任一项的hNGAL、A2m或24p3的突变蛋白或其融合蛋白的方法，其中，起始自编码突变蛋白的核酸，通过基因工程方法在细菌或真核宿主生物体内产生突变蛋白或其融合蛋白，并从此宿主生物体或其培养物中分离之。
15.根据权利要求7到11任一项的hNGAL、A2m或24p3的突变蛋白或其融合蛋白在检测给定靶标中的用途，其包括步骤：在适宜的条件下使突变蛋白与怀疑含有给定靶标的样品接触，由此允许突变蛋白和给定靶标之间形成复合物，并通过适宜的信号测定形成复合物的突变蛋白。
16.权利要求15的用途，其中给定靶标是蛋白或蛋白结构域、肽、核酸分子、有机分子或金属配合物，且所述检测用于确认作为药理学药物靶标的蛋白。
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