CN105555303A - 用于多发性硬化症的树突细胞asgpr靶向免疫治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用融合到髓鞘碱性蛋白或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的树突细胞抗-ASGPR抗体治疗多发性硬化症的方法和组合物。

Description

用于多发性硬化症的树突细胞ASGPR靶向免疫治疗剂

说明

本申请要求于2013年6月28日提交的申请号为61/841,094的美国临时专利申请的优先权权益，通过引用将其全部内容在此并入本文。

发明背景

1.发明领域

总的来说，本发明涉及医药领域。更具体地，其涉及使用融合到髓鞘碱性蛋白或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的树突细胞抗-ASGPR抗体治疗多发性硬化的方法和组合物。

2.相关领域的描述

认为身体针对通常存在于体内的物质和组织的不适当的免疫应答引起自身免疫疾病(自身免疫性)。自身免疫可以限于某些器官或涉及不同位置的特定组织。虽然自身免疫疾病的治疗通常使用免疫抑制剂-降低免疫应答的药物，但是所有这些药物可能是有限的并且在一些情况下不足以治疗根本的病症。随着许多自身免疫疾病被确认，对这些疾病的治疗体现出重大的人类健康问题。多发性硬化症(MS)，也被称为播散性硬化症或播散性脑脊髓炎(encephalomyelitisdisseminata)，是其中围绕脑和脊髓的轴突的髓鞘被损坏的炎性疾病，导致髓鞘的损失和瘢痕。在一些情况下，根本机理被认为是免疫系统造成的破坏。这些变化影响神经细胞通讯的能力，导致许多病征和症状。

发明概述

本发明提供了可以用于在自身免疫疾病或病症中诱导免疫耐受的方法和组合物。具体考虑的是免疫治疗组合物和将这些组合物给予患者的方法。实施方案关注通过用特异性抗体靶向特异性DC受体，经受体介导的胞吞将髓鞘蛋白或组分靶向至树突细胞(DC)的组合物。

在一些实施方案中，提供了在患者中诱导对至少一种髓鞘蛋白的免疫耐受的方法。在某些实施方案中，所述方法包括给予患者有效量的包含树突细胞靶向复合物的组合物，所述树突细胞靶向复合物包含连接到至少一种髓鞘蛋白或其抗原片段的树突细胞抗体或其靶向片段。在其他实施方案中，所述髓鞘蛋白为髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)或髓鞘相关糖蛋白(MAG)。在某些方面，认为所述包含树突细胞靶向复合物的组合物是免疫治疗剂，所述树突细胞靶向复合物包含连接到至少一种髓鞘蛋白或其抗原片段的树突细胞抗体或其靶向片段。

在一些实施方案中，所述免疫治疗剂包括多种髓鞘蛋白或髓鞘组分。在某些实施方案中，免疫治疗剂的至少一种髓鞘蛋白是MBP。在其他实施方案中，免疫治疗剂的至少一种髓鞘蛋白为MOG。

在某些实施方案中，树突细胞靶向复合物的树突细胞抗体或其片段特异性结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在进一步的其他实施方案中，树突细胞靶向复合物组合物包含多种树突细胞靶向复合物。在其他方面，所述多种树突细胞靶向复合物包含不同的髓鞘蛋白或一种或多种髓鞘蛋白的不同的抗原片段。在进一步的其他方面，髓鞘蛋白或抗原片段分别连接到树突细胞抗体或其靶向片段。在某些方面，树突细胞抗体使用连接肽连接到髓鞘蛋白。存在将抗体或抗原片段连接到髓鞘蛋白的不同方式。在一些实施方案中，它们被直接连接。在某些实施方案中，抗体或抗原片段通过一个或多个共价键连接到髓鞘蛋白。具体考虑的是，可以存在包括抗体或抗原片段和一种或多种髓鞘蛋白(或其片段)的单条多肽。如果两部分通过肽键共价连接(在具有或没有连接肽的情况下)，则这样的多肽可以被描述为融合蛋白。这样的具有ASGPR抗体(或抗体片段)和髓鞘蛋白(或其片段)的融合蛋白不是天然存在的。

某些实施方案包括免疫原性组合物，其包含分离的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:42-53的至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150个或更多个氨基酸，包括其间的所有值和范围。在另一个方面，所述分离的多肽为融合蛋白。所述组合物可以包含佐剂。在某些方面，所述分离的多肽为融合蛋白和/或脂肽。

实施方案包括这样的组合物，其包括是SEQIDNO:42-53中任一条的多肽、肽或蛋白或与SEQIDNO:42-53中任一条至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或相似的多肽、肽或蛋白。在一些实施方案中，相似的多肽、肽和蛋白限于仅使用保守氨基酸替换的那些蛋白质化合物。在其他实施方案中，仅考虑保守替换，而在其他实施方案中，考虑在不涉及化合物的功能的区域中非必需氨基酸的缺失或其他氨基酸的添加。在另外的实施方案中，组合物可以包括是ASGPR结合多肽的多肽、肽或蛋白或与ASGPR结合多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同或相似的多肽、肽或蛋白，所述ASGPR结合多肽如m抗-ASGPR_49C11_7H(重链)SEQIDNO:42、m抗-ASGPR_49C11_7K(轻链)SEQIDNO:43、m抗-hASGPR_6.3H9.1D11H(重链)SEQIDNO:44、m抗-hASGPR_6.3H9.1D11K(轻链)SEQIDNO:45、m抗-hASGPR_5H8.1D4H(重链)SEQIDNO:46、m抗-hASGPR_5H8.1D4K(轻链)SEQIDNO:47、m抗-ASGPR_4G2.2_(重链)SEQIDNO:48、m抗-ASGPR_4G2.2_(轻链)SEQIDNO:49、m抗-ASGPR-5F10H(重链)SEQIDNO:50、m抗-ASGPR-5F10H(轻链)SEQIDNO:51、m抗-ASGPR1H11(重链)SEQIDNO:52或m抗-ASGPR1H11(轻链)SEQIDNO:53。

本文描述的ASGPR结合多肽可以包括在SEQIDNO:42-53中任一条的至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000个或更多个连续氨基酸或其中可推导出的任何范围内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个变体氨基酸。

在具体的实施方案中，免疫治疗剂、DC靶向复合物或ASGPR结合多肽是纯化的，这可以在具有或没有最小变性的情况下实现。在一些方面，免疫治疗剂、DC靶向复合物或ASGPR结合多肽是有活性的，意味着免疫治疗剂、DC靶向复合物或ASGPR结合多肽保留一些可检测水平的功能或活性，如描述的那些，包括结合能力。考虑的是免疫治疗剂、DC靶向复合物或ASGPR结合多肽可以纯化至约、至少约或至多约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％的纯度或同质性(相对于其他蛋白质分子和/或细胞大分子)或其中可推导的任意范围。在另外的实施方案中，重组的免疫治疗剂、DC靶向复合物或ASGPR结合多肽可以是分离的。术语“分离的”可以指这样的核酸或多肽，其基本上不含其原始来源的细胞物质、细菌物质、病毒物质或培养基(当通过重组DNA技术制备时)，或化学前体或其他化学品(当化学合成时)。此外，分离的化合物是指可以作为分离的化合物给予个体的化合物；换言之，如果化合物附着在柱上或包埋在琼脂糖凝胶中时，化合物不能被简单地认为是“分离的”。此外，“分离的核酸片段”或“分离的肽”是不作为片段天然存在的和/或通常不在功能状态下的核酸或蛋白片段。

此外，在本方法的某些实施方案中，所述方法可以涉及这样的组合物，其含有约、至少约或至多约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000μg或mg的蛋白(或可从其中推导的任意范围)。蛋白可以是约、至少约或至多约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、10、11、12、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000μl或ml(或可从其中推导的任意范围)。在某些方面，免疫治疗剂、DC靶向复合物或ASGPR结合多肽中的一种或多种可以以以下剂量给予：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0.19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000mg每千克体重。

在具体的实施方案中，由免疫治疗剂或树突细胞靶向复合物引发的免疫耐受应答可以被补充、增补、升高或增强。在某些方面，由免疫治疗剂或树突细胞靶向复合物引发的免疫耐受应答可以通过佐剂补充、增补、升高或增强。在某些方面，所述佐剂为致耐受性佐剂。在某些实施方案中，所述免疫治疗剂或树突细胞靶向复合物组合物还包括至少一种致耐受性佐剂。在某些方面，所述致耐受性佐剂连接到树突细胞靶向复合物。在其他方面，所述致耐受性佐剂缀合到树突细胞靶向复合物。在进一步的其他方面中，所述致耐受性佐剂融合到树突细胞抗体或其靶向片段，和/或融合到至少一种髓鞘蛋白。在具体的实施方案中，所述致耐受性佐剂选自IL-10、地塞米松、FK506(他克莫司)、霍乱毒素B亚单位、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位、IFN-β、糖皮质激素、维生素D3和维生素D3类似物。

在具体的实施方案中，考虑使用结合多肽将免疫治疗剂或树突细胞靶向复合物的分开的多肽、部分或模块融合、缀合或组合在一起。在某些方面，所述树突细胞抗体或其片段通过结合多肽连接到至少一种髓鞘蛋白。在具体的实施方案中，所述结合多肽为锚定蛋白(dockerin)和粘连蛋白(cohesin)。

在某些方面，给予患者有效量的包含树突细胞靶向复合物的组合物包括多于一次给予组合物。在某些方面，所述组合物经口、静脉内、皮下、皮内、肌内、经鼻、通过注射、通过吸入和/或使用雾化器给予。

在具体的方面，描述的方法和组合物的目的在于治疗、预防、减轻、抑制、消除、改善或以另外的方式处理患有自身免疫紊乱、疾病或病症的受试者或患者的症状。在某些方面，所述受试者显示脱髓鞘疾病的一种或多种症状。在其他实施方案中，受试者已被诊断患有脱髓鞘疾病。在进一步的其他实施方案中，受试者具有患脱髓鞘疾病的风险。在具体的实施方案中，脱髓鞘疾病影响中枢神经系统。在其他具体的实施方案中，脱髓鞘疾病为特发性炎性脱髓鞘疾病。在某些方面，脱髓鞘疾病为多发性硬化症、神经病、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎或脑白质营养不良。在一些实施方案中，脱髓鞘疾病是多发性硬化症的边界形式之一。在一些方面，多发性硬化症的边界形式是标准多发性硬化症、间歇性-复发性(Remitent-Recidivant)多发性硬化症(RRMS)、继发进展型多发性硬化症(SPMS)、原发进展型多发性硬化症(PPMS)、KIR4.1多发性硬化症、视神经脊髓型(Optic-spinal)多发性硬化症、视神经脊髓型(Opticospinal)多发性硬化症、德维克病、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性出血性白质脑炎、巴洛同心性硬化(Baloconcentricsclerosis)、希尔德病(Schilderdisease)、弥漫性脱髓鞘硬化症、马尔堡(Marburg)多发性硬化症、恶性多发性硬化症、暴发性多发性硬化症、急性多发性硬化症、肿瘤性多发性硬化症或单发性硬化症。在进一步的其他实施方案中，脱髓鞘疾病为苏萨克氏综合症、肌痛性脑脊髓炎或脑白质疏松。

在其他具体的实施方案中，所述脱髓鞘疾病为多发性硬化症。在某些方面，脱髓鞘疾病影响外周神经系统。在另外的实施方案中，所述脱髓鞘疾病为格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、抗-MAG外周神经病、腓骨肌萎缩症、缺铜症或进行性炎性神经病。

在某些方面，描述的包括树突细胞靶向复合物和/或免疫治疗剂的方法还包括制备组合物。在其他实施方案中，所述方法还包括在给予组合物后测定受试者中抗至少一种髓鞘蛋白的抗体。

在一些方面，考虑用于治疗受试者的脱髓鞘疾病的方法，其包括给予受试者药学上可接受的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少第一ASGPR抗体或其结合片段，其连接到髓鞘碱性蛋白(MBP)和/或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)或其抗原片段。在一些实施方案中，ASGPR抗体或其结合片段融合到MBP或MOG或其抗原片段。在其他实施方案中，多次给予所述受试者疫苗组合物。在进一步的其他实施方案中，组合物经口、静脉内、皮下、皮内、肌内、经鼻、通过注射、通过吸入、经粘膜和/或使用雾化器给予。在某些方面，所述受试者显示脱髓鞘疾病的一种或多种症状。在另外的方面，所述受试者已被诊断患有脱髓鞘疾病。在一些实施方案中，所述受试者具有患脱髓鞘疾病的风险。在其他实施方案中，脱髓鞘疾病影响中枢神经系统。在另外的实施方案中，脱髓鞘疾病为特发性炎性脱髓鞘疾病。在某些方面，脱髓鞘疾病为多发性硬化症、神经病、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎或脑白质营养不良。在具体的实施方案中，脱髓鞘疾病为多发性硬化症。在一些实施方案中，脱髓鞘疾病为多发性硬化症的边界形式之一。在一些方面，多发性硬化症的边界形式为标准多发性硬化症、间歇性-复发性多发性硬化症(RRMS)、继发进展性多发性硬化症(SPMS)、原发进展型多发性硬化症(PPMS)、KIR4.1多发性硬化症、视神经脊髓型(Optic-spinal)多发性硬化症、视神经脊髓型(Opticospinal)多发性硬化症、德维克病、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性出血性白质脑炎、巴洛同心性硬化、希尔德病、弥漫性脱髓鞘硬化症、马尔堡多发性硬化症、恶性多发性硬化症、暴发性多发性硬化症、急性多发性硬化症、肿瘤性多发性硬化症或单发性硬化症。在进一步的其他实施方案中，脱髓鞘疾病为苏萨克氏综合症、肌痛性脑脊髓炎或脑白质疏松。在其他方面，所述脱髓鞘疾病影响外周神经系统。在具体的实施方案中，所述脱髓鞘疾病为格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、抗-MAG外周神经病、腓骨肌萎缩症、缺铜症或进行性炎性神经病。在某些实施方案中，所述方法还包括制备组合物。在进一步的另外实施方案中，所述方法还包括在给予组合物后测定受试者中抗至少一种髓鞘蛋白的抗体。

在一些实施方案中，组合物包含至少第一ASGPR抗体或其结合片段，其连接到髓鞘碱性蛋白(MBP)和/或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)或其抗原片段。在其他实施方案中，使用连接肽将树突细胞抗体连接到髓鞘蛋白或其抗原片段。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种致耐受性佐剂。在进一步的其他实施方案中，所述致耐受性佐剂连接到树突细胞靶向复合物。在另外的实施方案中，所述致耐受性佐剂缀合到树突细胞靶向复合物。在一些方面，所述致耐受性佐剂融合到树突细胞抗体或其靶向片段，和/或融合到至少一种髓鞘蛋白。在具体的方面，所述致耐受性佐剂选自IL-10、地塞米松、FK506(他克莫司)、霍乱毒素B亚单位、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位、IFN-β、糖皮质激素、维生素D3和维生素D3类似物。在进一步的其他方面，所述树突细胞抗体通过结合多肽连接到至少一种髓鞘蛋白或其抗原片段。在一些实施方案中，所述结合多肽为锚定蛋白和粘连蛋白。

如本文在说明书中所使用的，“一(a)”或“一(an)”可以指一个或多个。如本文在权利要求中所使用的，当与词语“包含(comprising)”一起使用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指一个或多于一个。

在权利要求中使用术语“或”是用来指代“和/或”，除非明确规定指代供选择的方案之一，或供选择的方案互相排斥，但是本发明内容支持指代供选择的方案之一和“和/或”的定义。如本文所使用的，“另一”可以指至少第二个或更多个。

贯穿本申请，术语“约”用于表示这样的值，其包括用于确定值的装置、方法固有的误差变化或在研究受试者中存在的变化。

实施方案的其他目的、特征和优点将由以下详述变得显而易见。然而，应理解的是，虽然详细的说明和具体的实施例显示优选的实施方案，但是仅以说明的方式给出，这是因为在实施方案的精神和范围内的各种变化和修改将基于该详细说明变成是本领域技术人员显而易见的。

附图简述

以下附图构成本说明书的一部分，并且被囊括以进一步展示实施方案的某些方面。结合本文提供的具体实施方案的详述，参照这些附图中的一个或多个，可以更好地理解某些实施方案。

图1A-B：(A)实验方法图解。(B)抗-DC-ASGPR-PSA疫苗可以在NHP中刺激产生PSA-特异性IL-10的CD4+T细胞。

图2A-B：(A)实验方法图解。(B)抗-DC-ASGPR-HA1在体内促进产生IL-10的HA1-特异性CD4⁺T细胞。

图3A-B：单克隆抗体筛选。(A)RT-PCR分析。(B)Luminex分析。3/7克隆诱导DC表达IL-10，其他克隆诱导小于10pg/ml的IL-10。IL-10的表达水平随供体变化，IL-6和TNFa在Luminex分析中为背景水平。

图4：单克隆抗体筛选。49C11结合到MS患者和健康供体的CD11c⁺血DC。

图5：抗-DC-ASGPR-MBP和抗-DC-ASGPR-MOG融合蛋白的生成。融合到MBP和MOG的抗-DC-ASGPR(49C11)mAb的表达产物。

图6A-B:(A)实验方法图解。(B)抗-DC-ASGPR(49C11)-MBP蛋白的体外验证。抗-DC-ASGPR(49C11)-MBP结合到PBMC中的CD11c⁺DC并促进MBP-特异性Treg应答。

图7A-B：抗-DC-ASGPR(49C11)-MOG蛋白的体外验证。(A)CD11c+DC染色。(B)MS患者PBMC负载分析。抗-DC-ASGPR-MOG结合到DC并促进MOG-特异性Treg应答。

图8：在食蟹猴(CynomolgusMacaque)的EAE模型中抗-ASGPR-hMOG的有效性–实验设计。

图9：抗-DC-ASGPR-MOG治疗抑制EAE发展进行。

图10：抗-DC-ASGPR-MOG治疗使得动物存活率提高。

图11：第22天的AM637动物脑的磁共振图像。

说明性实施方案的描述

I.多发性硬化症免疫治疗技术

本发明提供了方法和组合物以在受试者中生成针对一种或多种髓鞘抗原的免疫耐受，以免受自身免疫紊乱如多发性硬化症或治疗自身免疫紊乱如多发性硬化症。树突细胞(DC)是在调节抗原-特异性免疫中起到关键作用的抗原呈递细胞(Mellman和Steinman2001)、(Banchereau,Briere等人2000)、(Cella,Sallusto等人1997)。DC捕获抗原并将其加工成肽，并将其呈递到T细胞。因此直接将抗原递送到DC是用于开发免疫治疗剂的受关注的领域。

本文提供了包含髓鞘抗原的免疫治疗组合物，其用于递送到DC以产生对髓鞘蛋白或组分的免疫耐受应答，或抑制对髓鞘蛋白或组分的免疫应答。在一些实施方案中，髓鞘蛋白或组分为髓鞘碱性蛋白(MBP)。在其他实施方案中，髓鞘蛋白或组分为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。在进一步的其他实施方案中，髓鞘蛋白或组分为蛋白脂质蛋白(PLP)。在进一步的其他实施方案中，髓鞘蛋白或组分为髓鞘相关糖蛋白。在另外的实施方案中，髓鞘蛋白或组分为以下任一种：外周髓鞘质蛋白(PMP-22)、P₀蛋白、接合素32蛋白、许旺细胞髓鞘质蛋白或少突细胞-髓鞘质糖蛋白(OMgp)。在进一步的另外实施方案中，所述免疫治疗剂包括如上所述的多种不同的髓鞘组分。

在递送免疫治疗剂后产生的免疫应答的类型可以通过所述治疗剂靶向的受体类型进行调节。在本方法的一些实施方案中，ASGPR结合抗体靶向脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在一些方面，所述抗体为单克隆抗体。在进一步的其他方面，所述抗体为小鼠单克隆抗体。在进一步的其他方面，所述抗体为人/小鼠嵌合体。在另外的方面，所述抗体为人源化单克隆抗体。

在某些方面，免疫治疗剂靶向的受体类型为DEC-205。DEC-205是主要由树突细胞(DC)表达的I型细胞表面蛋白。在本方法的一些实施方案中，DEC-205结合抗体靶向DEC-205。在一些方面，所述抗体为DEC-205单克隆抗体。在进一步的其他方面，所述抗体为DEC-205小鼠单克隆抗体。在进一步的其他方面，所述抗体为DEC-205小鼠/人嵌合体。在另外的方面，所述抗体为人源化DEC-205小鼠单克隆抗体。

这样的技术和实施方案描述在以下美国专利公开申请中：20120282281(通过树突细胞脱唾液酸糖蛋白受体(DC-ASGPR)接合抗原呈递细胞的药剂(AgentsthatEngageAntigen-PresentingCellsThroughDendriticCellAsialoglycoproteinReceptor(DC-ASGPR)))；20120244155(靶向结核病(TB)疫苗的树突细胞(DC)(DendriticCells(DCs)TargetingforTuberculosis(TB)Vaccine))；20120237513(基于使抗原靶向抗原呈递细胞上表达的DCIR的疫苗(VaccinesBasedonTargetingAntigentoDCIRExpressedonAntigen-PresentingCells))；20120231023(基于使抗体的佐剂直接靶向抗原呈递细胞的新型疫苗佐剂(NovelVaccineAdjuvantsBasedonTargetingAdjuvantstoAntibodiesDirectlytoAntigen-PresentingCells))；20120213768(B细胞成熟抗原的诊断和治疗用途(DiagnosticandTherapeuticUsesforBCellMaturationAntigen))；20120128710(病原体特异性记忆Th17细胞应答的增强(EnhancementofPathogen-SpecificMemoryTh17CellResponses))；20120121592(通过DC-脱唾液酸糖蛋白受体使抗原靶向人树突细胞以产生IL-10调节T细胞(TargetingAntigenstoHumanDendriticCellsViaDC-AsialoglycoproteinReceptortoProduceIL-10RegulatoryT-Cells))；20120039916(基于使抗体的佐剂直接靶向抗原呈递细胞的新型疫苗佐剂(NOVELVACCINEADJUVANTSBASEDONTARGETINGADJUVANTSTOANTIBODIESDIRECTLYTOANTIGEN-PRESENTINGCELLS))；20120035240(用于基因沉默的保守HBV和HCV序列(CONSERVEDHBVANDHCVSEQUENCESUSEFULFORGENESILENCING))；20120020990(分离的哺乳动物单核细胞基因；相关试剂(ISOLATEDMAMMALIANMONOCYTECELLGENES；RELATEDREAGENTS))；20120004643(基于使抗原靶向抗原呈递细胞上表达的DCIR的疫苗(VaccinesBasedonTargetingAntigentoDCIRExpressedonAntigen-PresentingCells))；20110274653(树突细胞免疫受体(DCIR)介导的人CD8+T细胞的交叉致敏(DENDRITICCELLIMMUNORECEPTORS(DCIR)-MEDIATEDCROSSPRIMINGOFHUMANCD8+TCELLS))；20110081343(针对朗格汉斯细胞的疫苗(VACCINESDIRECTEDTOLANGERHANSCELLS))；20100330115(与靶向性人源化单克隆抗体复合的多元抗原)；20100322929(抗原呈递细胞靶向的癌症疫苗(ANTIGENPRESENTINGCELLTARGETEDCANCERVACCINES))；20100297114(抗原呈递细胞靶向的疫苗(ANTIGENPRESENTINGCELLTARGETEDVACCINES)；20100291082(抗原呈递细胞靶向的抗病毒疫苗(ANTIGENPRESENTINGCELLTARGETEDANTI-VIRALVACCINES))；20100239575(抗-CD40抗体及其用途(ANTI-CD40ANTIBODIESANDUSESTHEREOF))；20100209907(分离的哺乳动物单核细胞基因；相关试剂(ISOLATEDMAMMALIANMONOCYTECELLGENES；RELATEDREAGENTS))；20100135994(基于使最大化GAG和NEF靶向树突细胞的HIV疫苗(HIVVACCINEBASEDONTARGETINGMAXIMIZEDGAGANDNEFTODENDRITICCELLS))；20080267984(通过树突细胞凝集素样氧化LDL受体-1(LOX-1)活化人抗原呈递细胞(ActivationofHumanAntigen-PresentingCellsThroughDendriticCellLectin-LikeOxidizedLDLReceptor-1(LOX-1)))；20080254047(通过CLEC-6活化人抗原呈递细胞(ActivationofHumanAntigen-PresentingCellsThroughCLEC-6))；20080254044(与靶向性人源化单克隆抗体复合的多元抗原(MultivariableAntigensComplexedwithTargetingHumanizedMonoclonalAntibody))；20080241170(基于使抗原靶向抗原呈递细胞上表达的DCIR的疫苗(VaccinesBasedonTargetingAntigentoDCIRExpressedonAntigen-PresentingCells))；20080233140(人抗原呈递细胞通过Dectin-1的活化的治疗性应用(TherapeuticApplicationsofActivationofHumanAntigen-PresentingCellsThroughDectin-1))；20080206262(通过树突细胞脱唾液酸糖蛋白受体(DC-ASGPR)接合抗原呈递细胞的药剂(AgentsThatEngageAntigen-PresentingCellsThroughDendriticCellAsialoglycoproteinReceptor(DC-ASGPR)))；20080070854(用于基因沉默的保守Hbv和Hcv序列(ConservedHbvandHcvSequencesUsefulforGeneSilencing))；20050287582(特异性结合于FDF03的抗体(AntibodiesthatspecificallybindtoFDF03))；20050059808(分离的哺乳动物单核细胞基因；相关试剂(Isolatedmammalianmonocytecellgenes；relatedreagents))；20040143858(分离的哺乳动物单核细胞基因；相关试剂(Isolatedmammalianmonocytecellgenes；relatedreagents))；20030105303(分离的哺乳动物单核细胞基因；相关试剂(Isolatedmammalianmonocytecellgenes；relatedreagents))；和20020161218(丙型肝炎病毒疫苗(HepatitisCvirusvaccine))，指出将其全部通过引用并入。

II.核酸

在某些实施方案中，存在编码本文所述的蛋白、多肽或肽的重组核酸。考虑用于方法和组合物的多核苷酸包括编码抗DC受体的抗体(也称为抗-DC抗体和DC靶向抗体)或其结合部分的那些。

如本申请中所使用的，术语“多核苷酸”是指重组的或不含总基因组核酸的经分离的核酸分子。术语“多核苷酸”包括寡核苷酸(长度为100个残基或更短的核酸)，重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。在某些方面，多核苷酸包括基本上与其天然存在的基因或蛋白编码序列分离开的调节序列。多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的，并且可以是RNA、DNA(基因组、cDNA或合成的)、其类似物或其组合。另外的编码或非编码序列可以但不是必须存在于多核苷酸内。

在这方面，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用来指编码蛋白、多肽或肽的核酸(包括合适的转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)。如本领域技术人员所理解的，该术语包括表达或可以适于表达蛋白、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体的基因组序列、表达盒、cDNA序列和更小的工程化核酸片段。编码所有或部分多肽的核酸可以包含编码所有或部分这样的多肽的连续核酸序列。还考虑该特定多肽可以由包含具有略微不同的核酸序列，但编码相同或基本相似的蛋白的变体的核酸编码(参见上文)。

在具体的实施方案中，存在分离的核酸片段和重组载体，所述重组载体掺入编码结合DC受体的多肽(例如抗体或其片段)的核酸序列。术语“重组的”可以与多肽或特异性多肽的名称联合使用，并且这一般是指由在体外被操纵的核酸分子产生的多肽或这样的分子的复制产物产生的多肽。

核酸片段，无论其编码序列长度如何，可以与其他核酸序列组合，如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制性酶切位点、多克隆位点、其他编码片段等，使得其全长可以变化很大。因此考虑可采用几乎任意长度的核酸片段，其中总长度优选地受到在预期的重组核酸方案中制备的容易程度和用途的限制。在一些情况下，核酸序列可以编码具有另外的异源编码序列的多肽序列，例如以实现纯化多肽、转运、分泌、翻译后修饰或治疗益处如靶向性或功效。如以上所讨论的，标签或其他异源多肽可以添加到修饰的多肽编码序列中，其中“异源”是指与修饰的多肽不同的多肽。

在某些实施方案中，存在与本文公开的序列基本相同的多核苷酸变体；与使用本文所述的方法(例如，使用标准参数的BLAST分析)本文提供的多核苷酸序列相比，包括至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些，包括其间的所有值和范围。在某些方面，分离的多核苷酸将包括：编码这样的多肽的核苷酸序列，所述多肽与本文所述的氨基酸序列在序列的全长上具有至少90％，优选为95％及以上的同一性；或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。

载体

多肽可以由核酸分子编码。核酸分子可以是核酸载体的形式。术语“载体”用来指载体核酸分子，异源核酸序列可以插入到所述载体核酸分子中以引入可以在其中复制和表达的细胞。核酸序列可以是“异源的”，这意味着其处在与引入载体的细胞不同的或与掺入的核酸不同的环境下，所述核酸序列包括与细胞或核酸中的序列是同源的，但位于宿主细胞或核酸内其不通常出现位置处的序列。载体包括DNA、RNA、质粒、粘粒、病毒(细菌噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员将具有通过标准重组技术构建载体的熟练能力(例如Sambrook等人,2001；Ausubel等人,1996，将两者通过引用并入本文)。载体可以用于宿主细胞中以产生结合树突细胞受体的抗体。

术语“表达载体”是指包含编码至少一部分能够被转录的基因产物的核酸序列的载体。在一些情况下，RNA分子随后被翻译成蛋白、多肽或肽。表达载体可以包含各种“控制序列”，其是指在特定宿主有机体中的可操作地连接的编码序列的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了支配转录和翻译的控制序列以外，载体和表达载体还可以包含起到其他作用和在本文中描述的核酸序列。

宿主细胞

如本文所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语还包括其子代，其为任意和所有后代。应理解的是，所有子代可以由于有意或无意的突变而不相同。在表达异源核酸序列的环境中，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，并且其包括能够复制载体或表达载体编码的异源基因的任意可转化的有机体。宿主细胞可以，并且已经被用作载体或病毒的受体。宿主细胞可以被“转染”或“转化”，这是指通过该方法将外源性核酸，如重组的蛋白编码序列转移到或引入宿主细胞中的方法。转化的细胞包括原代目标细胞及其子代。

一些载体可以采用控制序列，所述控制序列使其在原核和真核细胞两者中复制和/或表达。本领域技术人员将进一步理解这样的条件，在所述条件下孵育所有上述宿主细胞以使其维持并允许载体复制。还理解和已知的是将能够大规模制备载体，以及制备载体编码的核酸及其关联多肽、蛋白或肽的技术和条件。

表达系统

存在许多包括至少部分或所有以上讨论的组合物的表达系统。基于原核生物和/或真核生物的系统可以与产生核酸序列或其关联多肽、蛋白和肽的实施方案一起使用。许多这样的系统是市售的并且是普遍可得的。

昆虫细胞/杆状病毒系统可以产生高水平的异源核酸片段的蛋白表达，如美国专利5,871,986、4,879,236中所述，两者通过引用并入本文，并且可以例如以名称2.0购自和以名称BACPACK^TM杆状病毒表达系统购自

除了公开的表达系统以外，表达系统的其他实例包括的完全控制可诱导哺乳动物表达系统，其涉及合成蜕皮激素可诱导的受体或其pET表达系统，大肠杆菌(E.coli)表达系统。可诱导的表达系统的另一个实例可以得自其携带T-REX^TM(四环素调节的表达)系统，使用全长CMV启动子的可诱导的哺乳动物表达系统。还提供了称为甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)的酵母表达系统，其设计成在甲醇营养型酵母甲醇毕赤酵母中高水平产生重组蛋白。本领域技术人员将懂得如何表达载体，如表达构建体，以产生核酸序列或其关联多肽、蛋白或肽。

III.蛋白质组合物

替换变体通常包含在蛋白内的一个或多个位点处将一个氨基酸换成另一个，并且可以设计为在损失或不损失其他功能或特性的情况下调节多肽的一种或多种特性。替换可以是保守的，即，一个氨基酸被具有相似形状和电荷的氨基酸替代。保守替换在本领域中是熟知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；蛋氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。供选择地，替换可以是非保守的，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守变化通常涉及使用化学上不同的残基替换残基，如用极性或带电氨基酸替换非极性或不带电的氨基酸，反之亦然。

蛋白可以是重组的或在体外合成的。供选择地，非重组或重组蛋白可以从细菌分离。还考虑可以在组合物和方法中应用包含这样的变体的细菌。因此，蛋白不需被分离。

在本文中使用的术语“功能上等价的密码子”指代编码相同氨基酸的密码子，如精氨酸或丝氨酸的六个密码子，并且还指代编码生物学上等价的氨基酸的密码子(参见下表)。

密码子表

还应理解氨基酸和核酸序列可以分别包括另外的残基，如另外的N-或C-末端氨基酸或5'或3'序列，并且只要所述序列满足以上阐述的要求，就还仍然基本上是如本文公开的序列之一中阐述的，包括在涉及蛋白表达时保持生物蛋白活性。末端序列的添加特别适用于这样的核酸序列，所述核酸序列可以例如包括在编码区域的5'或3'部分侧翼的各种非编码序列。

以下是基于改变蛋白的氨基酸以产生等价或甚至改进的第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可以替换蛋白结构中的其他氨基酸而不明显损失与结构例如抗体的抗原结合区域或底物分子上的结合位点的相互作用的结合能力。由于相互作用的能力和蛋白性质限定蛋白的生物功能活性，因此可以在蛋白序列中以及在其基础DNA编码序列中进行某些氨基酸替换，而产生具有类似特性的蛋白。因此，本发明人考虑可以在基因的DNA序列中进行各种改变而不明显损失其生物效用或活性。

在进行这样的改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。本领域中通常理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物功能中的重要性(Kyte和Doolittle,1982)。认可的是氨基酸的相对亲水特征对产生的蛋白的二级结构有贡献，其转而限定蛋白与其他分子的相互作用，所述其他分子例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等。

本领域中还理解类似氨基酸的替换可以基于亲水性有效地进行。通过引用并入本文的美国专利4,554,101叙述了受其邻近氨基酸的亲水性控制的蛋白的最大局部平均亲水性与蛋白的生物特性相关。认为氨基酸可以替代另一个具有相似亲水性值的氨基酸并仍然产生生物学上等价和免疫上等价的蛋白。

如上所述，氨基酸替换一般地基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。考虑各种上述特征的示例性的替换是熟知的并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

考虑在组合物中每ml有约0.001mg至约10mg总多肽、肽和/或蛋白。因此，组合物中的蛋白的浓度可以是约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更高(或其中可推出的任何范围)。其中，约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％可以是靶向DC的抗体，并且可以与本文所述的其他蛋白、抗体或蛋白结合抗体组合使用。

多肽和多肽制备

实施方案涉及用于本文所述的多个方面的多肽、肽和蛋白及其免疫原性片段。例如，分析具体抗体结合DC受体并呈递作为抗原的髓鞘蛋白或组分或具体抗体用于结合DC受体并呈递作为抗原的髓鞘蛋白或组分。在具体的实施方案中，本文所述的所有或部分蛋白还可以根据常规技术，在溶液中或在固体载体上合成。各种自动合成仪是市售的并且可以根据已知方案使用。参见例如，Stewart和Young,(1984)；Tam等人,(1983)；Merrifield,(1986)；和Barany和Merrifield(1979)，将其各自通过引用并入本文。供选择地，可以采用重组DNA技术，其中编码肽或多肽的核苷酸序列插入到表达载体中，转化或转染到适合的宿主细胞中并在适合表达的条件下培养。

一个实施方案包括使用基因转移到细胞，包括微生物，用于制备和/或呈递蛋白。感兴趣的蛋白的基因可以转移到适合的宿主细胞中，接着在适合的条件下培养细胞。可采用编码几乎任何多肽的核酸。本文讨论了重组表达载体和其中包括的元件的生成。供选择地，待产生的蛋白可以是通常由用于蛋白产生的细胞来合成的内源性蛋白。

在某些方面，DC受体片段包括蛋白的基本上所有细胞外结构域，其与在片段序列的长度上选择的序列具有至少85％的同一性，至少90％的同一性，至少95％的同一性或至少97-99％的同一性，包括其间的所有值和范围。

免疫原性组合物中还包括融合蛋白，所述融合蛋白由髓鞘蛋白或组分，或髓鞘蛋白或组分的免疫原性片段组成(例如，髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘质相关糖蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、外周髓鞘质蛋白(PMP-22)、P₀蛋白、接合素32蛋白、许旺细胞髓鞘质蛋白、少突细胞-髓鞘质糖蛋白(OMgp))。供选择地，实施方案还包括髓鞘蛋白或组分或免疫原性片段的单个融合蛋白，作为与异源序列的融合蛋白，所述异源序列是如T细胞表位或纯化标签的提供者，例如β-半乳糖苷酶，谷胱甘肽-S-转移酶，6xHis，绿色荧光蛋白(GFP)，表位标签，如FLAG、myc标签，多组氨酸，或病毒表面蛋白，如流感病毒血凝素，或细菌蛋白，如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197。

抗体和抗体样分子

在某些方面，可以获得或产生对DC受体具有特异性的一种或多种抗体或抗体样分子(例如，包含抗体CDR结构域的多肽)。这些抗体可以用于本文所述的各种诊断或治疗应用中。

如本文所使用的，术语“抗体”意在泛指任意免疫结合剂，如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE以及保留抗原结合活性的包含抗体CDR结构域的多肽。因此，术语“抗体”用来指具有抗原结合区域的任何抗体样分子，并且包括抗体片段如Fab'、Fab、F(ab')2、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)和具有抗体CDR、显示CDR的脚手架区(scaffoldingdomain)的多肽(例如，anticalin)或纳米抗体。例如，所述纳米抗体可以是来自骆驼科IgG2或IgG3的抗原特异性VHH(例如，重组VHH)，或来自该骆驼科Ig的CDR-显示框架。骆驼科抗体的制备和使用描述于EP1118669A9和EP1414858B1中，将其两者通过引用并入本文。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域中是熟知的。用于制备和表征抗体的手段也是本领域中熟知的(参见例如Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988；通过引用并入本文)。

“微型抗体(mini-antibodies)”或“微抗体(minibodies)”也被考虑与实施方案一起使用。微抗体为sFv多肽链，其包括通过铰链区与sFv分离的在其C末端的低聚结构域(Pack等人,1992)。低聚结构域包括自缔合α-螺旋，例如亮氨酸拉链，其可以通过另外的二硫键被进一步稳定。低聚结构域被设计成与跨膜的矢量折叠相容，跨膜的矢量折叠被认为是促进多肽在体内折叠成功能性结合蛋白的过程。一般地，微抗体使用本领域熟知的重组方法制备。参见例如Pack等人(1992)；Cumber等人(1992)。

实施方案中也考虑抗体样结合模拟肽。Liu等人(2003)描述了“抗体样结合模拟肽”(ABiPs)，其为充当简化抗体的肽并具有更长的血清半衰期以及更方便的合成方法的优点。

抗原结合肽，如CDR的供选择的骨架也是可得到的并可以用于根据实施方案生成DC受体结合分子。一般地，本领域技术人员已知如何确定在其上移植至少一种由原始抗体产生的CDR的蛋白骨架的类型。更具体地，已知选择这样的骨架必须满足最大数量的如下标准(Skerra,2000)：良好的系统发育保守性；已知的三维结构(例如，通过晶体学、NMR光谱学或本领域技术人员已知的任意其他技术)；尺寸小；几乎没有转录后修饰；和/或易于制备、表达和纯化。

这样的蛋白骨架的起源可以是但不限于选自以下的结构：纤连蛋白和优选的纤连蛋白III型结构域10、脂质运载蛋白、anticalin(Skerra,2001)、硫氧还蛋白A或具有重复基序的蛋白，所述重复基序如“锚蛋白重复序列”(Kohl等人,2003)、“犰狳重复序列”、“富亮氨酸重复序列”和“三十四肽重复序列”。例如，anticalin或脂质运载蛋白衍生物是对各种靶分子具有亲和力和特异性的一类结合蛋白；这样的蛋白描述于第20100285564号、第20060058510号、第20060088908号、第20050106660号美国专利公开申请和第WO2006/056464号PCT公开申请中，通过引用将其并入本文。

在某些方面，还可以使用源自毒素和神经元NO合酶(PIN)的蛋白抑制剂的骨架，所述毒素例如来自蝎子、昆虫、植物、软体动物等的毒素。

认识到单克隆抗体(MAb)具有某些优点，例如重现性和大规模生产。实施方案包括人、小鼠、猴、大鼠、仓鼠、兔和鸡来源的单克隆抗体。

也考虑“人源化”抗体，如携带人恒定和/或可变区结构域的来自小鼠、大鼠或其他物种的嵌合抗体、双特异性抗体、重组和工程化的抗体及其片段。如本文所使用的，术语“人源化”免疫球蛋白是指包含人框架区和一个或多个来自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。为了描述一些实施方案的抗体，可以测量抗体分子结合表位的强度，称为亲和力。抗体的亲和力可以通过测量缔合常数(Ka)或解离常数(Kd)来确定。认为在某些实施方案中有用的抗体可以具有约、至少约或至多约10e6、10e7、10e8、10e9或10e10M的缔合常数或其中可推出的任意范围。类似地，在一些实施方案中，抗体具有约、至少约或至多约10e-6、10e-7、10e-8、10e-9或10e-10M的解离常数或其中可推出的任意范围。针对本文讨论的抗体报告这些值，并且相同的分析可以用于评价这些抗体的结合特性。

在某些实施方案中，抗体为重组抗体。重组抗体与内源性产生的抗体不同。例如，重组抗体就其糖基化状态而不同(参见例如，Jefferis,R.“GlycosylationofRecombinantAntibodyTherapeutics”Biotechnol.Prog.2005,21:11-16，将其通过引用并入本文)。

在某些实施方案中，特异性结合DC受体的多肽能够结合细胞表面上的DC受体并呈递髓鞘蛋白或组分，其能够产生对该髓鞘蛋白或组分强力的免疫耐受。此外，在一些实施方案中，使用的多肽可以提供针对髓鞘蛋白或组分的免疫耐受并防止多发性硬化症。

1.产生抗体的方法

产生抗体(例如，单克隆抗体和/或单克隆抗体)的方法在本领域中是已知的。简言之，通过使用根据实施方案的DC受体多肽或其部分免疫动物并从免疫动物收集抗血清来制备多克隆抗体。

许多动物物种可以用于制备抗血清。通常，用于制备抗血清的动物为兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。动物的选择可以基于易于操作、成本或所需的血清量来决定，如本领域技术人员将已知的。应理解的是，还可以通过产生目标免疫球蛋白重链和轻链序列的转基因哺乳动物或植物并以可回收的形式由其产生抗体来转基因制备抗体。就在哺乳动物中的转基因生产而言，抗体可以在山羊、牛或其他哺乳动物的乳汁中产生或从其回收。参见例如第5,827,690号、第5,756,687号、第5,750,172号和第5,741,957号美国专利。

还如本领域中所熟知的，具体免疫原组合物的免疫原性可以通过使用免疫应答的非特异性刺激物来提高，所述刺激物被称为佐剂。适合的佐剂包括任意可接受的免疫刺激化合物，如细胞因子、趋化因子、辅因子、毒素、原质团、合成的组合物或编码该佐剂的载体。佐剂可以以化学方法缀合于抗体或抗原递送抗体融合蛋白。供选择地，佐剂可以重组融合于抗体或抗原递送抗体融合蛋白。在某些方面，佐剂可以以化学方法缀合或重组融合于粘连蛋白或锚定蛋白，以实现与含有相应锚定蛋白或粘连蛋白结合结构域的任何其他分子的结合。

根据实施方案使用的佐剂可包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、-干扰素、GMCSP、BCG、氢氧化铝、聚ICLC、MDP化合物，如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A(MPL)。还考虑在2％鲨烯/吐温80乳液中的包含从细菌中提取的三种组分MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的RIBI。甚至可以使用MHC抗原。示例性佐剂可以包括完全弗氏佐剂(包含杀死的结核分支杆菌的免疫应答的非特异性刺激物)、不完全弗氏佐剂和/或氢氧化铝佐剂。

除了佐剂以外，可以希望的是共同给予生物反应修饰剂(BRM)，其已显示上调T细胞免疫或下调抑制细胞活性。这样的BRM包括但不限于西咪替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline,PA)；低剂量环磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead、NJ)；细胞因子，如-干扰素、IL-2或IL-12或涉及免疫辅助功能的基因编码蛋白，如B-7。

用于产生抗体的免疫原组合物的量基于免疫原的性质以及用于免疫的动物变化。各种途径可以用于给予免疫原，包括但不限于皮下、肌内、皮内、表皮内、静脉内和腹膜内。可以通过在免疫后的不同点处对免疫的动物采血样来监测抗体的产生。

还可以给予第二加强剂量(例如，在注射中提供)。重复加强和效价测定的过程直到实现适合的效价。当获得希望水平的免疫原性时，可以对免疫动物取血并分离和储存血清，和/或可以使用动物产生MAb。

对于兔多克隆抗体的产生，动物可以通过耳缘静脉或供选择地通过心脏穿刺取血。使移出的血凝结然后离心以从全细胞和血凝块中分离血清组分。血清可以照原样用于各种应用中，或另外地，希望的抗体部分可以通过熟知的方法纯化，如使用结合到固体基质的另一种抗体、肽的亲和色谱，或通过使用例如蛋白A或蛋白G色谱等。

Mab可以通过使用熟知技术容易地制备，如在美国专利4,196,265中例举的那些，将其通过引用并入本文。通常地，该技术涉及使用选择的免疫原组合物免疫适合的动物，所述免疫原组合物例如纯化的或部分纯化的蛋白、多肽、肽或结构域，其为野生型或突变体组合物。以有效刺激产生抗体的细胞的方式给予免疫组合物。

生成单克隆抗体(MAb)的方法一般按照与制备多克隆抗体相同的路线开始。在一些实施方案中，啮齿动物如小鼠和大鼠用于生成单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或青蛙细胞用于生成单克隆抗体。大鼠的用途是熟知的并且可以提供某些优点(Goding,1986,pp.6061)。常规地使用小鼠(例如，BALB/c小鼠)并一般地得到高百分比的稳定融合。

一般地如上所述地给动物注射抗原。抗原可以与佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂混合。加强给予相同的抗原或编码抗原的DNA可以在约两周的间隔进行。如实施例中所讨论的，与天然发现的抗原序列相比，抗原可以改变。

免疫后，选择具有产生抗体的潜力的体细胞用于MAb生成方案，所述体细胞具体为B淋巴细胞(B细胞)。这些细胞可以获自活检的脾、扁桃体或淋巴结或来自外周血液样品。一般地，脾细胞是处于分裂浆母细胞阶段的产生抗体细胞的丰富来源。通常地，由于外周血容易取得，因此外周血细胞可以容易地获得。

在一些实施方案中，一组动物将被免疫并且具有最高抗体效价的动物的脾脏将被移出，并且通过使用注射器对脾脏进行匀浆获得脾淋巴细胞。通常地，来自免疫的小鼠的脾脏包含约5x10⁷至2x10⁸个淋巴细胞。

来自免疫的动物的产生抗体的B淋巴细胞随后与永生骨髓瘤细胞的细胞融合，所述永生骨髓瘤细胞一般为与被免疫的动物相同的物种。适用于产生杂交瘤的融合程序的骨髓瘤细胞系优选为不产生抗体的，具有高融合效率和酶缺陷，所述酶缺陷使其随后不能在仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的特定选择性培养基中生长。

可以使用许多骨髓瘤细胞中的任一种，如本领域技术人员已知的(Goding,pp.6566,1986；Campbell,pp.7583,1984)。引用)。例如，当免疫的动物为小鼠时，可以使用P3X63/Ag8、X63Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210Ag14、FO、NSO/U、MPC11、MPC11X45GTG1.7和S194/5XX0Bul；对于大鼠，可以使用R210.RCY3、Y3Ag1.2.3、IR983F和4B210；并且U266、GM1500GRG2、LICRLONHMy2和UC7296对人细胞融合均有用。参见Yoo等人(2002)对骨髓瘤表达系统的讨论。

通过检索细胞系库编号GM3573容易从NIGMS人基因突变体细胞库得到的一种鼠骨髓瘤细胞为NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1)。另一个可以使用的鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性小鼠鼠骨髓瘤SP2/0不产性细胞系。

生成产生抗体的脾或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂合体的方法包括分别在促进细胞膜的融合的试剂或多种试剂(化学的或电的)的存在下以2:1的比例混合体细胞与骨髓瘤细胞，但该比例可以从约20:1变化至约1:1。使用仙台病毒的融合方法已由Kohler和Milstein(1975；1976)描述，并且使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG的那些已经由Gefter等人(1977)描述。使用电诱导的融合方法也是适合的(Godingpp.7174,1986)。

融合方法通常以约1x10-6至1x10-8的低频率产生可存活的杂合体。然而，这并未造成问题，因为可存活的融合杂合体是通过在选择性培养基中培养，由亲代未融合的细胞(特别是通常将持续无限分裂的未融合的骨髓瘤细胞)分化的。选择性培养基一般为含有阻断组织培养基中的核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性和优选的试剂为氨喋呤、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。氨喋呤和氨甲蝶呤阻断嘌呤和嘧啶从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨喋呤或氨甲蝶呤时，培养基补充次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，培养基补充次黄嘌呤。

选择培养基为HAT。只有能够运行核苷酸补救途径的细胞能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞的补救途径中的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)是有缺陷的，其不能生存。B细胞可以运行该途径，但其在培养中具有有限的寿命并且一般在约两星期内死亡。因此，能在选择性培养基中存活的唯一细胞为由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂合体。

该培养提供了杂交瘤群，从所述群选择特异性杂交瘤。通常，杂交瘤的选择通过在微量滴定板中的单克隆稀释液培养细胞，接着针对希望的反应性测试单个克隆的上清液(约两至三周后)来进行。分析应是灵敏、简单和快速的，如放射免疫分析、酶免疫分析、细胞毒性分析、噬斑分析、斑点免疫结合分析等。

选择的杂交瘤随后将被连续稀释并克隆成单个产生抗体的细胞系，所述克隆可以随后无限繁殖以提供MAb。可以以两种基本方式利用所述细胞系产生MAb。首先，杂交瘤的样品可以注入(通常注入腹膜腔中)用于提供用于原始融合的体细胞和骨髓瘤细胞的类型的组织相容的动物中(例如，同系小鼠)。任选地，在注射前，使用烃，尤其是油，如鲛烷(四甲基十五烷)敏化动物。注射的动物形成了分泌由融合细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。动物的体液，如血清或腹水可以随后被取出以提供高浓度的MAb。其次，单个细胞系可以在体外培养，其中MAb自然地分泌到培养基中，其可以从所述培养基容易地以高浓度获得。

此外，来自生产细胞系的抗体(或抗体的其他部分)的表达可以使用许多已知技术强化。例如，谷氨酰胺合酶和DHFR基因表达系统是用于在特定条件下强化表达的常用手段。高表达细胞克隆可以使用常规技术鉴定，如有限稀释克隆和微滴技术(Microdroptechnology)。第0216846号、第0256055号和第0323997号欧洲专利和第89303964.4号欧洲专利申请整体或部分讨论了GS系统。

如果需要，可以使用过滤、离心和各种色谱方法如HPLC或亲和色谱进一步纯化通过任一手段产生的MAb。单克隆抗体的片段可以通过包括使用酶，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，和/或通过化学还原切割二硫键的方法获得自如此制备的单克隆抗体。供选择地，单克隆抗体片段可以使用自动肽合成仪合成。

还考虑分子克隆方法可以用于产生单克隆抗体。在一个实施方案中，组合免疫球蛋白噬菌体文库由从免疫动物的脾脏中分离的RNA制备，并且使用表达抗原的细胞和对照细胞，通过筛选来选择表达适合抗体的噬菌体。该方法相对于常规杂交瘤技术的优点在于可以在单轮次中产生和筛选约10e4倍那么多的抗体，并且新特异性由H和L链组合生成，这进一步提高了发现合适的抗体的机会。

另一个实施方案涉及制备抗体，例如，见于第6,091,001号美国专利，其描述了使用Cre-介导的位点特异性重组，由包括修饰的免疫球蛋白基因座的细胞的基因组序列产生表达抗体的细胞的方法。所述方法涉及首先使用包含lox位点和靶向序列的同源靶向载体转染产生抗体的细胞，所述靶向序列与待转化为修饰区域的邻近基因组序列的免疫球蛋白基因座的区域的第一DNA序列同源，因此第一lox位点通过位点特异性同源重组插入基因组序列中。然后使用包含第二lox位点的lox靶向载体转染细胞，所述第二lox位点适于Cre介导的与整合lox位点和修饰序列的重组，以将免疫球蛋白基因座的区域转化为修饰区域。该转化通过在体内使lox位点与Cre相互作用来进行，以使修饰序列通过Cre介导的lox位点的位点特异性重组插入基因组序列中。

供选择地，单克隆抗体片段可以使用自动肽合成仪合成或通过在大肠杆菌中表达全长基因或基因片段来合成。

还考虑的是可以针对与特异性、亲和力、半衰期、免疫原性、结合缔合、结合解离有关的特性或与作为用于感染和/或疾病状态的治疗有关的总体功能特性进一步筛选或优化单克隆抗体。因此，考虑单克隆抗体可以在单克隆抗体mAnti-ASGPR49C11、mAnti-ASGPR4G2.2、mAnti-ASGPR5F10、mAnti-ASGPR1H11、mAnti-ASGPR6.3H9.1D11、mAnti-ASGPR5H8.1D4的1、2、3、4、5或6个CDR的氨基酸序列中具有1、2、3、4、5、6个或更多个变化。考虑在单克隆抗体mAnti-ASGPR49C11、mAnti-ASGPR4G2.2、mAnti-ASGPR5F10、mAnti-ASGPR1H11、mAnti-ASGPR6.3H9.1D11、mAnti-ASGPR5H8.1D4的轻或重可变区的VJ或VDJ区域的CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位上的氨基酸可以具有插入、缺失或使用保守或非保守氨基酸的替换。以上公开了可以被取代或构成替换的这样的氨基酸。

确定来自可变区的序列的CDR的方法在本领域中是已知的(参见例如，Zhao和Lu,“Agermlineknowledgebasedcomputationalapproachfordeterminingantibodycomplementaritydeterminingregions.”Mol.Immunol.,(2010)47(4):694-700，将其通过引用并入本文)。

在一些实施方案中，全抗体的片段可以发挥结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由VL、VH、CL和CHl结构域构成的Fab片段；(ii)由VH和CHl结构域构成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域构成的Fv片段；(iv)由VH或VL结构域构成的dAb片段(Ward,1989；McCafferty等人,1990；Holt等人,2003)；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过连接肽连接，其能使两个结构域缔合以形成抗原结合位点(Bird等人,1988；Huston等人,1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双功能抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger等人,1993)。Fv、scFv或双功能抗体分子可以通过加入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定(Reiter等人,1996)。还可以制备包含结合到CH3结构域的scFv的微抗体(Hu等人1996)。该段中的引文均通过引用并入。

抗体还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体形成第二代单克隆抗体，其中两个不同的可变区组合在相同的分子中(Holliger,P.&Winter,G.1999Cancerandmetastasisrev.18:411-419,1999)。其用途已在诊断领域和治疗领域由其募集新效应子功能或靶向肿瘤细胞表面上的几种分子的能力得到证实。当要使用双特异性抗体时，这些可以是常规双特异性抗体，其可以以各种方式制造(Holliger等人,PNASUSA90:6444-6448,1993)，例如以化学方法制备或由杂交的杂交瘤制备，或可以是上述任意双特异性抗体片段。这些抗体可以由化学方法获得(Glennie等人,1987J.Immunol.139,2367-2375；Repp等人,J.Hemat.377-382,1995)或体细胞方法获得(StaerzU.D.和BevanM.J.PNAS83,1986；等人,MethodEnzymol.121:210-228,1986)但同样地通过基因工程技术，其使得异源二聚化发生，从而促进寻找的抗体的纯化过程(Merchand等人NatureBiotech,16:677-681,1998)。双特异性抗体的实例包括BiTE^TM技术的那些，其中可以使用具有不同特异性的两种抗体的结合结构域并直接通过柔性短肽连接。这样在短的单多肽链上组合两个抗体。可以仅使用可变结构域，在没有Fc区域的情况下构建双功能抗体和scFv，潜在地降低抗独特型反应的作用。在该段中的引文均通过引用并入。

双特异性抗体可以构建为全IgG、双特异性Fab′2、Fab′PEG、双功能抗体或另外为双特异性scFv。此外，两个双特异性抗体可以使用本领域已知的常规方法连接以形成四价抗体。

双特异性双功能抗体与双特异性全抗体不同，还可以是特别有用的，因为其可以容易地构建并且在大肠杆菌中表达。具有适合的结合特异性的双功能抗体(和许多其他多肽如抗体片段)可以使用噬菌体展示容易地从文库中选择(WO94/13804)。如果双功能抗体的一条臂保持恒定，例如，具有针对DC受体的特异性，那么可以形成文库，其中另一条臂变化并选择具有合适的特异性的抗体。双特异性全抗体可以通过供选择的工程方法制备，如Ridgeway等人(ProteinEng.,9:616-621,1996)中所述，在此将其通过引用并入。

抗体和多肽缀合物

实施方案提供了针对DC受体的抗体和抗体样分子、连接于至少一种药剂以形成抗体缀合物或负载或融合体的多肽和肽。实施方案还提供了抗体药物缀合物(ADC)。为了提高抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，通常连接或共价结合或复合至少一种希望的分子或部分。这样的分子或部分可以是但不限于，至少一种效应分子或报告基因分子。效应分子包括具有期望活性的分子，例如细胞毒活性。已连接到抗体的效应分子的非限定性实例包括毒素、治疗酶、抗生素、放射标记的核苷酸等。相比之下，报告分子被定义为可以使用分析方法检测的任何部分。已缀合于抗体的报告分子的非限定性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色粒子或配体，如生物素。

抗体缀合物的某些实例是其中抗体连接于可检测的标记的那些缀合物。“可检测的标记”是由于其特异性功能特性和/或化学特征而可以被检测的化合物和/或要素，其使用能使其所连接的抗体被检测和/或需要时被进一步定量。

抗体缀合物在某些实施方案中用作诊断剂。抗体诊断一般分为两类，用于体外诊断如各种免疫分析中的那些，和/或用于体内诊断方案的那些，一般称为“抗体引导的成像”。许多适合的成像剂在本领域中是已知的，如用于其连接于抗体的方法(参见例如，第5,021,236号、第4,938,948号和第4,472,509号美国专利，各自通过引用并入本文)。使用的成像部分可以是顺磁离子、放射性同位素、荧光染料、NMR-可检测的物质、X射线成像。

在顺磁离子的情况下，可以以举例的方式提及的离子如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，其中钆是特别优选的。在其他情况下，如在X射线成像下有用的离子，包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)，和尤其是铋(III)。

在用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可以使用砹²¹¹、碳¹⁴、铬⁵¹、氯³⁶、钴⁵⁷、钴⁵⁸、铜⁶⁷、Eu¹⁵²、镓⁶⁷、氢³、碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹³¹、铟¹¹¹、铁⁵⁹、磷³²、铼¹⁸⁶、铼¹⁸⁸、硒⁷⁵、硫³⁵、锝⁹⁹和/或钇⁹⁰。¹²⁵I通常用于某些实施方案中，并且锝⁹⁹和/或铟¹¹¹也通常由于其低能量和适合用于远程检测而使用。放射性标记的单克隆抗体可以根据本领域中的熟知方法制备。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾和化学氧化剂如次氯酸钠、或酶促氧化剂如乳过氧化物酶接触来碘化。单克隆抗体可以通过配体交换过程使用锝99m标记，例如，通过使用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合在Sephadex柱上并将抗体施加到该柱。供选择地，可以使用直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐，还原剂如SNCl₂，缓冲溶液如邻苯二甲酸钠-钾溶液和抗体。通常用于将作为金属离子存在的放射性同位素结合于抗体的中间官能团为二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

在荧光标记中，考虑用作缀合物的包括Alexa350、Alexa430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、瀑布蓝、Cy3、Cy5,6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红等。

抗体缀合物包括主要意图用于体外的那些，其中所述抗体连接于在与发色底物接触时将产生有色产物的第二结合配体和/或酶(酶标签)。适合的酶的实例包括但不限于，脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体为生物素和/或亲和素和链霉亲和素化合物。这些标记的使用对本领域技术人员是熟知的并描述于例如，美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241；各自通过引用并入本文。

又一种已知的将分子位点特异性地连接于抗体的方法包括抗体与基于半抗原的亲和标记的反应。实质上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸反应，从而破坏该位点并阻断特异性抗原反应。然而，这可能不是有利的，因为其导致抗体缀合物的抗原结合的损失。

含有叠氮基团的分子也可以用于通过由低密度紫外光产生的反应性氮烯中间体形成与蛋白的共价键(Potter&Haley,1983)。具体地，嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮类似物已被用作定点光探针，以确定粗细胞提取物中的核苷酸结合蛋白(Owens&Haley,1987；Atherton等人,1985)。2-和8-叠氮核苷酸已被用于定位纯化蛋白的核苷酸结合结构域(Khatoon等人,1989；King等人,1989；和Dholakia等人,1989)并且可以用作抗体结合剂。

本领域已知几种用于将抗体连接或缀合于其缀合部分的方法。一些连接方法涉及金属螯合复合物的使用，其采用例如连接于抗体的有机螯合剂，如二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3-6-二苯基甘脲-3(第4,472,509号和第4,938,948号美国专利，各自通过引用并入本文)。单克隆抗体还可以与酶在偶联剂如戊二醛或高碘酸盐的存在下反应。具有荧光素标记物的缀合物在这些偶联剂的存在下制备或通过与异硫氰酸酯的反应制备。在第4,938,948号美国专利中，乳腺肿瘤的成像使用单克隆抗体实现，并且可检测的成像部分使用连接体如对羟基苯甲亚胺酸甲酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯结合于抗体。

在一些实施方案中，考虑使用不改变抗体组合位点的反应条件，通过在免疫球蛋白的Fc区域中选择性引入巯基的免疫球蛋白衍生化。公开了根据该方法制备的抗体缀合物显示改进的寿命、特异性和灵敏度(第5,196,066号美国专利，通过引用并入本文)。也已在文献中公开了效应分子或报告分子的位点特异性连接，其中所述报告或效应分子缀合到Fc区域中的糖残基(O'Shannessy等人,1987)。已报导该方法产生在诊断和治疗上有希望的抗体，其目前在临床评价中。

IV.树突细胞免疫治疗剂

如本文所使用的，“树突细胞”(DC)是指淋巴样或非淋巴样组织中发现的形态相似的细胞类型的不同群体的任何成员。这些细胞的特征是其有独特的形态、高水平的表面MHC-II类表达(Steinman等人,Ann.Rev.Immunol.9:271(1991)；就其对该细胞的描述通过引用并入本文)。这些细胞可以从许多组织来源分离，并且便利地从外周血中分离，如本文所述。

作为抗原的髓鞘蛋白和组分

在某些实施方案中，任何髓鞘蛋白或组分(包括但不限于髓鞘蛋白、糖蛋白、脂质或糖脂)可以重组融合或以化学方法缀合于DC靶向抗体以向树突细胞递送髓鞘蛋白或组分。髓鞘蛋白或组分可以是当融合于DC靶向抗体时足以引发受试者中的免疫耐受应答的任何髓鞘蛋白或组分。在某些实施方案中，免疫应答足以保护受试者免受多发性硬化症。在其他实施方案中，由抗原/靶向抗体融合提供的保护足以抑制或防止与多发性硬化症相关的症状。

在一些实施方案中，髓鞘蛋白或组分为髓鞘碱性蛋白(MBP)。在其他实施方案中，髓鞘蛋白或组分为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。在进一步的其他实施方案中，髓鞘蛋白或组分为蛋白脂质蛋白(PLP)。在进一步的其他实施方案中，髓鞘蛋白或组分为髓鞘相关糖蛋白。在另外的实施方案中，髓鞘蛋白或组分是外周髓鞘质蛋白(PMP-22)、P₀蛋白、接合素32蛋白、许旺细胞髓鞘质蛋白或少突细胞-髓鞘质糖蛋白(OMgp)中的任一种。在进一步的另外实施方案中，免疫治疗剂包括多种如上所述的不同的髓鞘组分。

树突细胞特异性抗体

在某些方面，用于将髓鞘蛋白或组分靶向树突细胞的抗体为树突细胞特异性抗体。一些可以用于该目的的抗体在本领域中是已知的。

在一些实施方案中，抗ASGPR抗体用于将髓鞘蛋白或组分靶向树突细胞。一个实例包括抗树突细胞免疫受体单克隆抗体缀合物，其中所述缀合物包含负载或化学偶联到抗体的抗原肽。这样的抗体描述于第8,236,934号美国专利中，通过引用并入本文。

连接肽

在某些方面，连接肽用于连接树突细胞特异性抗体和待呈递的髓鞘蛋白或组分。连接肽可以加入糖基化位点或引入二级结构。另外，这些连接体提高了融合蛋白的表达效率或稳定性，并且因此提高了抗原呈递到树突细胞的效率。连接体可以包括：SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQIDNO:1)、PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQIDNO:2)、TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQIDNO:3)或TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQIDNO:4)。这些实例和其他讨论于WO2010/104747，将其内容通过引用并入本文。用于该目的的另外的连接体描述于US2010/291082，将其内容通过引用并入本文。

在某些方面，抗体结构域、佐剂、抗原或连接肽可以通过高亲和力相互作用蛋白结构域结合。在一些实施方案中，高亲和力相互作用蛋白结构域涉及粘连蛋白-锚定蛋白结合对。粘连蛋白-锚定蛋白结合对可以重组融合到抗体结构域、佐剂、抗原或连接肽。在一些方面，修饰锚定蛋白以使其当在多肽的内部(非羧基或非氨基末端)部分重组编码时，能够结合粘连蛋白结构域。在某些方面，连接区域不是连接肽。非连接肽区域的实例可以是作为化学缀合的产物的结构，其中分子间形成的共价键不是肽键。

佐剂

在其他实施方案中，免疫佐剂直接融合或以另外的方式连接到树突细胞特异性抗体以提高免疫治疗的功效。在某些方面，免疫佐剂可以是toll样受体(TLR)激动剂。TLR激动剂包括来自肠道沙门氏菌或霍乱弧菌的鞭毛蛋白。在某些方面，佐剂为鞭毛蛋白-1或鞭毛蛋白-2。TLR激动剂可以对某些TLR类型具有特异性(即，TLR5、TLR7或TLR9激动剂)，并且可以以任何组合或作为任何变型存在。这样的免疫佐剂的实例描述于WO2012/021834，将其内容通过引用并入本文。也考虑多ICLC，TLR3配体与髓鞘蛋白或组分DC靶向免疫治疗组合物一起使用。在一些实施方案中，DC靶向免疫治疗剂包括髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘相关糖蛋白、外周髓鞘质蛋白(PMP-22)、P₀蛋白、接合素32蛋白、许旺细胞髓鞘质蛋白或少突细胞髓鞘质糖蛋白(OMgp)，并且多ICLC与抗体抗原融合多肽分开递送。在进一步的另外实施方案中，免疫治疗剂包括上述的一种或多种不同的髓鞘组分。在一个实施方案中，多ICLC如第7,439,349号美国专利所述，将其内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，多ICLC为也考虑白介素作为佐剂，其可以融合到树突细胞特异性抗体或融合到能够以高亲和力结合到树突细胞特异性抗体上的相应或互补结构域的蛋白结构域。这样的白介素的非限定性实例为IL-21、IL-2、IL-9和IL-10。在一些实施方案中，白介素蛋白为人白介素。在某些方面，佐剂为HLA-DR抗原相关的恒定链，其强化抗原加工。在某些方面，佐剂为干扰素α。在进一步其他的实施方案中，佐剂为将向还接收髓鞘蛋白或组分的细胞传递死亡信号的毒素，从而增强免疫治疗效率。这样的毒素的一个实例为PE38。任何佐剂可以以与DC靶向免疫治疗剂融合或缀合的形式递送，或可以在不融合或直接缀合的情况下作为相同的组合物或制剂的部分伴随递送。

致耐受性佐剂

在某些实施方案中，免疫佐剂可以是致耐受性佐剂。在某些情况下，致耐受性佐剂可以指用于致耐受性免疫的佐剂，其中使用抗原免疫的目的是产生免疫应答，以使抗原被免疫的受试者耐受。在某些方面，致耐受性佐剂的目的是提高致耐受性免疫以使对抗原的耐受性进一步提高。在某些实施方案中，致耐受性佐剂用于耐受自身免疫。在进一步的其他方面，致耐受性佐剂用于耐受有害的自身免疫。在一些实施方案中，致耐受性佐剂是免疫抑制剂。在进一步的其他实施方案中，致耐受性佐剂为地塞米松、FK506(他克莫司)、霍乱毒素B亚单位、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位、IFN-β、糖皮质激素、维生素D3或维生素D3类似物。在某些方面，致耐受性佐剂与DC靶向免疫治疗剂同时给予。在其他方面，致耐受性佐剂在给予DC靶向免疫治疗剂之前或之后给予。在进一步的其他实施方案中，两种或多种致耐受性佐剂在给予DC靶向免疫治疗剂同时、之前或之后给予。在某些方面，致耐受性佐剂可以融合、缀合或以其他方式连接到DC靶向免疫治疗剂。在一个实施方案中，致耐受性佐剂为白介素-10(IL-10)。在另一个实施方案中，IL-10与DC靶向免疫治疗剂共同给予。在某些方面，IL-10通过重组方法融合。在其他方面，IL-10是缀合的。在其他实施方案中，IL-10通过偶联或其他模块结构域(modulardomain)连接。

构建体

以下给出的序列，当作为抗体H或L链或由哺乳动物细胞分泌的蛋白提供时，显示为没有信号肽的氨基酸(“成熟的”分泌蛋白)，而DNA序列是包括信号序列的整个编码区域，如果存在的话。

H链构建体的所有实例通常用于CHO细胞和匹配的L链载体的共转染。此外，在一些实施方案中，免疫治疗剂将具有已针对抗-ASGPR_49C11、抗-CD4012E12、抗-Langerin15B10、抗-DCIR9E8和抗-LOX-115C4进行描述的人源化的可变区域。

抗-ASGPR重链和轻链可以选自以下：

抗-DCASGPRmAb

[mAnti-ASGPR—49C11—7H-LV-hIgG4H-C]

DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYILFSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKN QFFLQLNSVTTEDTATYFCARSNYGSFASWGQGTLVTVSAAKTTGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS(SEQIDNO.:5)。

以上序列是mAb49C11的H链可变区(显示为有下划线的)和hIgG4的C区域之间的嵌合体。

[mAnti-ASGPR-49C11—7K-LV-hIgGK-C]是相应的L链嵌合体(以下序列，可变区有下划线)

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSHMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSRLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSM EAEDAATYYCQQWSSHPWSFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO.:6).

_____________________________________________________________

[mAnti-ASGPR—4G2.2_Hv-V-hIgG4H-C]

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQVPGKGLRWMGWMDTFTGEPTYADDFKGRFAFSLETSAS TAYLQINSLKNEDTATYFCARGGILRLNYFDYWGQGTTLTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS(SEQIDNO.:7).

以上序列是mAb4G2.2的H链可变区(显示为有下划线的)和hIgG4的C区域之间的嵌合体。

[mAnti-ASGPR—4G2.2_Kv-V-hIgGK-C]是相应的L链嵌合体(以下序列，可变区有下划线)

DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNRLGWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYALSITS LQTEDLATYYCQQCWTSPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO.:8).

_____________________________________________________________

[mAnti-ASGPR—5F10H-LV-hIgG4H-C]为

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDINPNYGDTFYNQKFEGKATLTVDKSSR TAYMQLNSLTSEDSAVYYCGRGDYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLLSLGKAS(SEQIDNO.:9).

以上序列是mAb5F10H的H链可变区(显示为有下划线的)和hIgG4的C区域之间的嵌合体。

[mAnti-ASGPR—5F10K-LV-hIgGK-C]是相应的L链嵌合体(以下序列，可变区有下划线)

DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTINN VQSEDLADYFCQQYSSNPYMFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO.:10).

_____________________________________________________________

[mAnti-ASGPR1H11H-V-hIgG4H-C]为

QLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVRQSHGKSLEWIGGINPINGGPTYNQKFKGKATLTVDKSSSTA YMELRSLTSEDSAVYYCARWDYGSRDVMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS(SEQIDNO.:11).

以上序列是mAb1H11的H链可变区(显示为有下划线的)和hIgG4的C区域之间的嵌合体。

[mAnti-ASGPR1H11K-LV-hIgGK-C]是相应的L链嵌合体(以下序列，可变区有下划线)

NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQRPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISS VQAEDLADYHCGQTYSYIFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO.:12).

_____________________________________________________________

全长DC靶向抗体/抗原构建体的实例如下：

mAnti-ASGPR_49C11_7H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMBP

(LV-hIgG4H-C序列有下划线，Flex-v1序列为粗体，hMBP序列

ATGAGAGCGCTGATTCTTTTGTGCCTGTTCACAGCCTTTCCTGGTATCCTGTCTGATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATAGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATACTCTTCAGTGGTAGCACTAACTACAACCCATCTCTGAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTTCTGTGCAAGATCTAACTATGGTTCCTTTGCTTCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTGCATCACAAAAGCGGCCTTCACAACGGCACGGATCTAAATATCTGGCGACAGCCTCTACCATGGATCACGCCAGGCATGGCTTTCTGCCCAGGCACAGAGATACTGGAATCTTGGACTCCATCGGCAGGTTCTTTGGCGGCGACCGAGGGGCTCCCAAGAGAGGGAGTGGCAAGGATAGCCATCATCCAGCCCGAACAGCCCACTACGGAAGCCTGCCGCAGAAAAGCCACGGTCGCACGCAGGATGAAAATCCCGTTGTGCACTTCTTCAAAAACATTGTGACCCCACGAACTCCTCCACCTTCCCAAGGCAAGGGCAGAGGTCTCAGTCTCAGCCGGTTCAGTTGGGGGGCCGAGGGCCAGAGACCCGGATTTGGTTATGGGGGAAGGGCTAGCGACTACAAGTCTGCACATAAGGGGTTCAAAGGGGTCGACGCACAGGGAACCCTGTCCAAAATATTTAAGCTTGGTGGCCGCGACTCCCGCTCAGGCTCTCCCATGGCTCGGCGCTGA(SEQIDNO:13)

DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYILFSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKN QFFLQLNSVTTEDTATYFCARSNYGSFASWGQGTLVTVSAAKTTGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEF EGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AS (SEQIDNO:14)

mAnti-ASGPR_49C11_7K-LV-hIgGK-C

(LV-hIgGK-C序列有下划线)

ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTCACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACTTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAGACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCACCCATGGTCGTTCGGTGGAGGCACCAAACTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQIDNO:15)

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSHMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSRLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSM EAEDAATYYCQQWSSHPWSFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:16)

mAnti-ASGPR_49C11_7H-LV-hIgG4H-C-hMOG

(LV-hIgG4H-C序列有下划线；hMOG序列为粗体)

ATGAGAGCGCTGATTCTTTTGTGCCTGTTCACAGCCTTTCCTGGTATCCTGTCTGATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATAGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATACTCTTCAGTGGTAGCACTAACTACAACCCATCTCTGAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTTCTGTGCAAGATCTAACTATGGTTCCTTTGCTTCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTGGTCAGTTTAGAGTCATTGGGCCCAGACACCCTATAAGGGCTCTTGTGGGAGACGAGGTCGAGCTGCCGTGTCGCATTAGTCCAGGCAAAAACGCCACAGGGATGGAAGTGGGGTGGTACAGGCCTCCCTTCTCTAGGGTTGTGCATCTCTACCGCAACGGCAAAGATCAGGATGGAGATCAAGCTCCTGAATATCGGGGCCGGACTGAGCTGCTCAAGGACGCGATCGGCGAGGGTAAGGTGACCTTGCGCATCCGAAATGTTAGATTCAGCGATGAAGGCGGATTTACGTGCTTCTTTCGGGACCACTCATACCAGGAGGAAGCCGCAATGGAACTGAAGGTGGAGGACCCCTTCTATTGGGTATCCCCAGCTAGCTGA(SEQIDNO:17)

DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYILFSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKN QFFLQLNSVTTEDTATYFCARSNYGSFASWGQGTLVTVSAAKTTGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEF EGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASG AS(SEQIDNO:18)

mAnti-ASGPR_49C11_7K-LV-hIgGK-C

(LV-hIgGK-C序列有下划线)

ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTCACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACTTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAGACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCACCCATGGTCGTTCGGTGGAGGCACCAAACTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQIDNO:19)

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSHMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSRLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSM EAEDAATYYCQQWSSHPWSFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:20)

6xHis-粘连蛋白-hMOG

(6xHis有下划线；粘连蛋白为粗体；hMOG)

ATGGATCCCAAAGGATCCCTTTCCTGGAGAATACTTCTGTTTCTCTCCCTGGCTTTTGAGTTGAGCTACGGACTCGACATCACATCCCACCATCACCATCACCATGACGATCTGGATGCAGTAAGGATTAAAGTGGACACAGTAAATGCAAAACCGGGAGACACAGTAAGAATACCTGTAAGATTCAGCGGTATACCATCCAAGGGAATAGCAAACTGTGACTTTGTATACAGCTATGACCCGAATGTACTTGAGATAATAGAGATAGAACCGGGAGACATAATAGTTGACCCGAATCCTGACAAGAGCTTTGATACTGCAGTATATCCTGACAGAAAGATAATAGTATTCCTGTTTGCAGAAGACAGCGGAACAGGAGCGTATGCAATAACTAAAGACGGAGTATTTGCTACGATAGTAGCGAAAGTAAAAGAAGGAGCACCTAACGGACTCAGTGTAATCAAATTTGTAGAAGTAGGCGGATTTGCGAACAATGACCTTGTAGAACAGAAGACACAGTTCTTTGACGGTGGAGTAAATGTTGGAGATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACAGATGATCTGGATGCAGCTAGTGGTCAGTTTAGAGTCATTGGGCCCAGACACCCTATAAGGGCTCTTGTGGGAGACGAGGTCGAGCTGCCGTGTCGCATTAGTCCAGGCAAAAACGCCACAGGGATGGAAGTGGGGTGGTACAGGCCTCCCTTCTCTAGGGTTGTGCATCTCTACCGCAACGGCAAAGATCAGGATGGAGATCAAGCTCCTGAATATCGGGGCCGGACTGAGCTGCTCAAGGACGCGATCGGCGAGGGTAAGGTGACCTTGCGCATCCGAAATGTTAGATTCAGCGATGAAGGCGGATTTACGTGCTTCTTTCGGGACCACTCATACCAGGAGGAAGCCGCAATGGAACTGAAGGTGGAGGACCCCTTCTATTGGGTATCCCCAGCTAGCTGA(SEQIDNO:21)

LDITSHHHHHHDDLD AS

(SEQIDNO:22)

6xHis-粘连蛋白-hMBP

(6xHis有下划线；粘连蛋白为粗体；hMBP)

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGTATGGATCTGGATGCAGTAAGGATTAAAGTGGACACAGTAAATGCAAAACCGGGAGACACAGTAAATATACCTGTAAGATTCAGTGGTATACCATCCAAGGGAATAGCAAACTGTGACTTTGTATACAGCTATGACCCGAATGTACTTGAGATAATAGAGATAAAACCGGGAGAATTGATAGTTGACCCGAATCCTACCAAGAGCTTTGATACTGCAGTATATCCTGACAGAAAGATGATAGTATTCCTGTTTGCGGAAGACAGCGGAACAGGAGCGTATGCAATAACTAAAGACGGAGTATTTGCTACGATAGTAGCGAAAGTAAAAGAAGGAGCACCTAACGGGCTCAGTGTAATCAAATTTGTAGAAGTAGGCGGATTTGCGAACAATGACCTTGTAGAACAGAAGACACAGTTCTTTGACGGTGGAGTAAATGTTGGAGATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACAGATGATCTAGATGCAGCTAGTGCATCACAAAAGCGGCCTTCACAACGGCACGGATCTAAATATCTGGCGACAGCCTCTACCATGGATCACGCCAGGCATGGCTTTCTGCCCAGGCACAGAGATACTGGAATCTTGGACTCCATCGGCAGGTTCTTTGGCGGCGACCGAGGGGCTCCCAAGAGAGGGAGTGGCAAGGATAGCCATCATCCAGCCCGAACAGCCCACTACGGAAGCCTGCCGCAGAAAAGCCACGGTCGCACGCAGGATGAAAATCCCGTTGTGCACTTCTTCAAAAACATTGTGACCCCACGAACTCCTCCACCTTCCCAAGGCAAGGGCAGAGGTCTCAGTCTCAGCCGGTTCAGTTGGGGGGCCGAGGGCCAGAGACCCGGATTTGGTTATGGGGGAAGGGCTAGCGACTACAAGTCTGCACATAAGGGGTTCAAAGGGGTCGACGCACAGGGAACCCTGTCCAAAATATTTAAGCTTGGTGGCCGCGACTCCCGCTCAGGCTCTCCCATGGCTCGGCGCTGA(SEQIDNO:23)

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMDLD ASAS (SEQIDNO:24)

mAnti-hASGPR_6.3H9.1D11H-LV-hIgG4H-C-hMOG

(LV-hIgG4H-C有下划线，可变区；hMOG为)

ATGGAATGGAGCGGGGTCTTTATCTTTCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGCCCACTCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGATGTCCTGCGAGGCTGCTAGATTCACCTTCAGTAACTACTGGATTGGTTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTTCCCTGGAGGTGATTATACTAACTACAATAAGAAATTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGATCGGACTACGGTGGTTACTACGTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACAAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTGGTCAGTTTAGAGTCATTGGGCCCAGACACCCTATAAGGGCTCTTGTGGGAGACGAGGTCGAGCTGCCGTGTCGCATTAGTCCAGGCAAAAACGCCACAGGGATGGAAGTGGGGTGGTACAGGCCTCCCTTCTCTAGGGTTGTGCATCTCTACCGCAACGGCAAAGATCAGGATGGAGATCAAGCTCCTGAATATCGGGGCCGGACTGAGCTGCTCAAGGACGCGATCGGCGAGGGTAAGGTGACCTTGCGCATCCGAAATGTTAGATTCAGCGATGAAGGCGGATTTACGTGCTTCTTTCGGGACCACTCATACCAGGAGGAAGCCGCAATGGAACTGAAGGTGGAGGACCCCTTCTATTGGGTATCCCCAGCTAGCTGA(SEQIDNO:25)

QVQ SAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AS(SEQIDNO:26)

manti-hASGPR_6.3H9.1D11H-LV-hIgGK-C

(LV-hIgGK-C有下划线，可变区有粗体下划线)

ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAACCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTCTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGCTAGCTGA(SEQIDNO:27)

DI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECAS(SEQIDNO:28)

manti-hASGPR_5H8.1D4H-LV-hIgG4H-C-hMOG

(LV-hIgG4H-C有下划线，可变区有粗体下划线；hMOG为粗体)

ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCCGCCCAAAGTATCCAAGCACAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTTCACAGACTATTCAGTGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAATACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAGATGACCTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCTAAACCTACCTATAGATTTTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGCCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTGGTCAGTTTAGAGTCATTGGGCCCAGACACCCTATAAGGGCTCTTGTGGGAGACGAGGTCGAGCTGCCGTGTCGCATTAGTCCAGGCAAAAACGCCACAGGGATGGAAGTGGGGTGGTACAGGCCTCCCTTCTCTAGGGTTGTGCATCTCTACCGCAACGGCAAAGATCAGGATGGAGATCAAGCTCCTGAATATCGGGGCCGGACTGAGCTGCTCAAGGACGCGATCGGCGAGGGTAAGGTGACCTTGCGCATCCGAAATGTTAGATTCAGCGATGAAGGCGGATTTACGTGCTTCTTTCGGGACCACTCATACCAGGAGGAAGCCGCAATGGAACTGAAGGTGGAGGACCCCTTCTATTGGGTATCCCCAGCTAGCTGA(SEQIDNO:29)

AQIQ SAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS AS(SEQIDNO:30)

manti-hASGPR_5H8.1D4K-LV-hIgGK-C

(LV-hIgGK-C有下划线，可变区为粗体有下划线)

ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATATTGCTGCTGCTATGGGTATCTGGTTCCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAGGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGCTAGCTGA(SEQIDNO:31)

DI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECAS(SEQIDNO:32)

DC靶向多发性硬化症免疫治疗剂的模块结构域描述

在某些方面，DC靶向多发性硬化症免疫治疗剂可以通过组合根据具体功能分类属于不同类别的蛋白质的多肽结构域来组装。在通常意义上，这些结构域可以属于这样的类别，其包括抗体、抗体CDR、抗体重链、抗体轻链、连接体、抗原、偶联结构域、佐剂、纯化标签、标记标签或报告标签。

结构域分类的非限定性实例和每个类别中的具体实例在表1中示出(Flgln是鞭毛蛋白的缩写)。

在一些实施方案中，DC靶向免疫治疗剂的组分可以如下所述构建(对于以下的图示，适用以下缩写：连接肽(PL)；抗原(Ag)；标签(Tg)；偶联结构域(CD)；佐剂(Adj)；抗体(Ab)。缩写之后的数字区分构建体内的不同类型的该结构域。使用的连字符(“-”)可以代表共价键，如在例如融合蛋白的翻译过程中形成的多肽的两个结构域之间的肽键。共价键还可以通过但不限于已知的化学偶联方法形成。连字符还可以代表高亲和力、中亲和力或低亲和力的非共价相互作用。这些类型的非共价相互作用的实例是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于，抗体/抗原相互作用、受体/配体相互作用、亲和素/生物素相互作用、粘连蛋白/锚定蛋白相互作用和芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂相互作用：

CD-Ag-Tg；

Ab-Ag-Tg；

Ab-CD-Ag-Tg；

Ab-PL-Ag；

Ab-PL-Ag-Tg；

Ab-PL-Ag(1)-Ag(2)-Tg；

Ab-CD-PL；

Ab-Ag；

Tg-CD-Ag；

Tg-CD-Ag-Tg；

Ab-Adj；

Ab-Adj-Adj；

Tg-CD-Adj；

Tg-CD-Adj(1)-Adj(2)；

CD-Adj；

Ab-PL-Ag-PL-Ag；

PL包括但不限于连接肽。也考虑具有非肽键的连接体。在一些实施方案中，构建体中没有标签或标签被移除。

在一个具体的实施方案中，抗体-抗原融合蛋白(Ab.Ag)包括下式：

Ab-(PL-Ag)x；

Ab-(Ag-PL)x；

Ab-(PL-Ag-PL)x；

Ab-(Ag-PL-Ag)x；

Ab-(PL-Ag)x-PL；或

Ab-(Ag-PL)x-Ag；

其中Ab为DC靶向抗体或其片段；其中PL为连接肽；其中Ag为髓鞘蛋白或组分；并且，其中x为1至20的整数或其中可推出的任意范围。PL包括但不限于连接肽。也考虑具有非肽键的连接体。

在一个实施方案中，-(PL-Ag)x、-(Ag-PL)x、-(PL-Ag-PL)x或-(Ag-PL-Ag)x位于Ab重链或其片段的羧基末端。

在另一个实施方案中，-(PL-Ag)x、-(Ag-PL)x、-(PL-Ag-PL)x或-(Ag-PL-Ag)x位于Ab轻链或其片段的羧基末端。

在一个实施方案中，抗体-抗原复合物(Ab:Ag)包括下式

Ab.Doc:Coh.Ag；

Ab.Coh:Doc.Ag；

Ab.(Coh)x:(Doc.Ag)x；

Ab.(Doc)x:(Coh.Ag)x；

Ab.(Coh.Doc)x:(Doc.Ag¹)(Coh.Ag²)；或

Ab.(Coh)x(Doc)x:(Doc.Ag¹)x(Coh.Ag²)x；

其中Ab为DC靶向抗体或其片段；其中Ag为髓鞘蛋白或组分(Ag¹和Ag²为两种不同的髓鞘蛋白或组分)；其中Doc为锚定蛋白；其中Coh为粘连蛋白并且其中x为1至10的整数或从其中可推出的任意范围，表示紧接着其的前面括号中的分子或结构域的数量。句点(“.”)用来表示两个分子或结构域之间的共价键(这些共价键的实例包括但不限于，在例如融合蛋白的翻译过程中形成的两个多肽的结构域之间的肽键。共价键还可以通过但不限于已知的化学偶联方法形成)。冒号(“:”)用来表示粘连蛋白和锚定蛋白结构域之间的非共价相互作用。

IV.治疗方法

如上所述，组合物和使用这些组合物的方法可以治疗患有、疑似患有或具有患自身免疫障碍或相关疾病，特别是与多发性硬化症相关的疾病的风险的受试者(例如，预防多发性硬化症或引发对多发性硬化症自身免疫发作的强力的免疫耐受)。

如本文所使用的，短语“免疫应答(immuneresponse)”或其等价的“免疫性应答(immunologicalresponse)”是指在受体患者中针对实施方案的蛋白、肽或多肽的体液应答(抗体介导的)、细胞应答(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)或体液和细胞应答两者。治疗(Treatment)或治疗(therapy)可以是通过给予免疫原诱导的主动免疫应答或通过给予抗体、包含抗体的材料或敏化的T细胞实现的被动治疗。

就本说明书和所附权利要求的目的而言，术语“表位”和“抗原决定子”可互换使用，指B细胞和/或T细胞应答或识别的抗原上的位点。B细胞表位可由连续氨基酸或通过蛋白的三级折叠而靠近的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常当暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠而形成的表位当用变性溶剂处理时通常丢失。在独特的空间构象中，表位通常包括至少3个和更多个，通常至少5个或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括在表位定位方案(1996)中描述的那些方法。对于CD8细胞，T细胞识别约9个氨基酸的连续表位，对于CD4细胞，识别13-15个氨基酸的连续表位。识别表位的T细胞可通过测量抗原依赖性增殖的体内分析鉴定，如通过在应答表位时通过敏化的T细胞掺入3H-胸腺嘧啶(Bruke等人，1994)、通过抗原依赖性杀伤(细胞毒T淋巴细胞分析，Tigges等人，1996)或通过细胞因子分泌确定的。

细胞介导的免疫应答的存在可以通过增殖分析(CD4(+)T细胞)或CTL(细胞毒T淋巴细胞)分析确定。体液应答和细胞应答对免疫原的保护或治疗作用的相对贡献可以通过从免疫的同系动物分别分离IgG和T细胞，并且测量在第二受试者中的保护或治疗作用来区分。如本文和权利要求书中所使用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用。

任选地，抗体或优选抗体的免疫部分，可以化学缀合于或表达为与其他蛋白的融合蛋白。出于该说明书和所附权利要求书的目的，所有这样的融合蛋白均包括在抗体或抗体的免疫部分的定义中。

在一个实施方案中，方法包括治疗由自身免疫障碍引起的疾病或病症。在某些方面，实施方案包括多发性硬化症的治疗方法。在一些实施方案中，治疗在髓鞘蛋白或组分的存在下给予。此外，在一些实例中，治疗包括给予常用于对抗自身免疫障碍的其他药剂，如一种或多种免疫抑制化合物。

治疗组合物以与剂型制剂相容的方式，并且以治疗有效的量给予。待给予的量取决于待治疗的受试者。需要给予的活性成分的精确的量取决于从业人员的判断。适合最初给予和加强的方案也是可变的，但以初始给予接着随后给予为典型代表。

该方法的组合物可以经用于将疫苗或抗体引入患者的任意途径给予患者。这样的途径包括但不限于，粘膜或肌内递送。在具体的实施方案中，组合物经鼻内或通过吸入给予患者。在其他实施方案中，组合物经静脉或通过静脉注射给予。在另外的实施方案中，组合物的给予包括但不限于口服、肠胃外、皮下、肌内、静脉内给予或其各种组合。

应用方式可以差别很大。给予多肽治疗剂的任何常规方法是适用的。认为这些包括在固体生理上可接受的基质上或在生理上可接受的分散体中的口服应用，通过注射经胃肠道外给予等。组合物的剂量将取决于给予途径并根据受试者的尺寸和健康状况变化。在一个治疗方案中，患者每周接收皮下剂量的免疫治疗剂，持续三周，然后在另外的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月的每第一周接收皮下剂量的免疫治疗剂。

在某些情况下，将希望多次给予组合物，例如，2、3、4、5、6或更多次给予。可以在1、2、3、4、5、6、7、8至5、6、7、8、9、10、11、12周的间隔给予，包括其间的所有范围。

组合治疗

组合物和相关方法，特别是结合DC受体并将髓鞘蛋白或组分或肽递送到患者/受试者的抗体的给予，还可以与多发性硬化症的有效策略或传统免疫调节治疗的给予组合使用。在众多目的中，这样的策略或治疗可以涉及改善病程、治疗急性加重、管理症状或改善受损的功能。疾病改善剂包括但不限于，Aubagio(特立氟胺)、Avonex(干扰素β-1a)、倍泰龙和Extavia(干扰素β-1b)、Copaxone(醋酸格拉替雷)、Extavia(干扰素β-1b)、Gilenya(芬戈莫德)、Novantrone(米托蒽醌)、Rebif(干扰素β-1a)、Tecfidera(富马酸二甲酯)和Tysabri(那他珠单抗)。在其他实施方案中，在组合治疗中使用的疾病改善治疗剂包括但不限于，芬戈莫德(Gilenya)、氨甲蝶呤、咪唑硫嘌呤(Imuran)、静脉免疫球蛋白(IVIg)和环磷酰胺(Cytoxan)。

在一些情况下，组合治疗剂可以用于控制症状。可以用于控制多发性硬化症症状的药品或药物的实例包括但不限于，达伐吡啶(Ampyra)、替扎尼定(Zanaflex)、地西泮(Valium)、氯硝西泮(Klonopin)、丹曲林(Dantrium)、巴氯芬(Lioresal)或任何苯二氮卓、类胆碱药物或金刚烷胺。

在一个方面，考虑治疗与免疫抑制剂联合使用。在其他方面，治疗与疾病改善剂、症状控制剂或改善受损功能的药剂联合使用。供选择地，治疗可以在其他药剂治疗之前或之后，间隔数分钟至数周。在其他药剂和/或蛋白或多核苷酸分别给予的实施方案中，一般将确保有效的时期不在每次递送的时间之间终止，以使治疗组合物仍然能够对受试者发挥有利的组合作用。在这样的情况下，考虑可以各自在约12-24h内给予两种形式，更优选地各自在约6-12h内给予两种形式。然而，在一些情况下，可以期望显著延长给予的时期，其中在相应的给予之间中断数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

可以采用各种治疗的组合，例如免疫抑制治疗、疾病改善剂、症状控制剂或改善受损功能的药剂为“A”，以及包括结合DC受体并递送髓鞘蛋白或组分或肽或其共有肽(consensuspeptide)的抗体的抗体免疫治疗剂为“B”：

将抗体组合物给予患者/受试者将遵照给予该化合物的一般方案，考虑组合物的毒性，如果有的话。预期的是治疗周期将根据需要重复。还考虑各种标准治疗，如水合，可以与描述的治疗组合应用。

通用药物组合物

在一些实施方案中，药物组合物给予受试者。不同的方面可以涉及给予受试者有效量的组合物。在一些实施方案中，结合DC受体并递送髓鞘蛋白或组分或肽或其共有肽的抗体可以给予患者以保护其免受多发性硬化症或治疗多发性硬化症。供选择地，编码一种或多种这样的抗体或多肽或肽的表达载体可以作为预防性治疗给予患者。另外地，这样的组合物可以与免疫抑制剂组合给予。这样的组合物将一般溶于或分散在药学上可接受的载体或含水介质中。

术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当给予动物或人时不产生不利的、过敏性或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的这样的介质和药剂的用途在本领域是熟知的。除了在任何常规介质或药剂与活性成分不相容的范围内，考虑其用于免疫原性和治疗组合物中。补充的活性成分，如其他抗感染剂、免疫抑制剂和免疫治疗剂，也可以加入组合物中。

活性化合物可以配制成用于肠胃外给予，例如，配制成用于经静脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常地，这样的组合物可以制备成液体溶液或悬浮液；还可以制备适用于在注射前加入液体以制备溶液或悬浮液的固体形式；并且制剂还可以是乳化的。

适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或含水丙二醇的制剂；和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是流动的，到其可以容易地注射的程度。其在制造和储存条件下还应当是稳定的，并且必须针对微生物如细菌和真菌的污染作用进行防腐。

蛋白质组合物可以配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐，包括酸加成盐(由蛋白的游离氨基形成的)和与以下形成的药学上可接受的盐：无机酸，例如盐酸或磷酸；或有机酸，如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。由游离羧基形成的盐也可以源自：无机碱，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

药物组合物可以包括溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和植物油。适当的流动性可以例如通过使用包衣，如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒径，和通过使用表面活性剂来维持。对微生物的作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如，尼泊金、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选包括等张剂，例如，糖或氯化钠。可注射的组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延长吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

无菌注射液制备如下：根据需要在具有以上列举的各种其他成分的适合的溶剂中以所需量加入活性化合物，接着是过滤灭菌或等同的程序。一般地，分散体制备如下：将各种灭菌的活性成分加入无菌溶媒中，所述无菌溶媒含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末，加上来自其之前的无菌过滤溶液的任何另外希望的成分。

组合物的给予将通常通过任何常规途径。这包括但不限于口服、经鼻或经颊给予。供选择地，给予可以通过原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、鼻内或静脉内注射。在某些实施方案中，免疫治疗组合物可以吸入(例如，美国专利6,651,655，其具体通过引用并入)。这样的组合物将通常作为药学上可接受的组合物给予，其包括生理上可接受的载体、缓冲液或其他赋形剂。

基于预期目标确定治疗或预防组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适合在受试者中使用的物理上离散的单位，每个单位包含预定量的组合物，所述预定量的组合物经计算以产生与其给予，即适合的途径和方案相关的以上讨论的期望的应答。根据治疗次数和单位剂量的给予的量取决于期望的保护。

组合物的精确的量还取决于从业人员的判断，并且对于每个个体是独特的。影响剂量的因素包括受试者的身体和临床状态、给予途径、预期的治疗目标(症状减轻vs治愈)以及具体组合物的效价、稳定性和毒性。

在配制时，溶液将以与剂型相容的方式且以治疗或预防有效的这样的量给予。制剂容易地以各种剂型给予，如上述的注射液的类型。

IV.实施例

包括以下实施例以展示优选的实施方案。本领域技术人员将理解遵照本发明人发现的代表性技术的在实施例中公开的技术在实施方案的实施中很好地发挥作用，因此可以视为构成用于其实施的优选模式。然而。本领域技术人员根据本发明应理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，在公开的具体实施方案中可以作出许多变化，并且仍然获得相同或相似的结果。

实施例1–对抗-DC-ASGPR抗体的表征和应答

所有动物(总共12只动物：每组6只动物)使用活流感病毒(H1N1,PR8)预免疫。来自所有动物的血清显示HA1-特异性IgG(数据未显示)。敏化四个月后，使用抗-LOX-1-HA1(右臂)和抗-LOX-1-PSA(左臂)或抗-DC-ASGPR-HA1(右臂)和抗-DC-ASGPR-PSA(左臂)皮内免疫动物。在使用相同的重组融合蛋白以40天间隔免疫三次后，按照指示收集血液。当与使用抗-LOX-1-HA1免疫的那些相比，来自使用抗-DC-ASGPR-HA1免疫的动物的PBMC分泌更高水平的IL-10以应答HA1肽库(图2B，上图)。相反地，来自使用抗-LOX-1-HA1免疫的动物的PBMC比使用抗-DC-ASGPR-HA1免疫的动物分泌显著更高水平的IFNγ(图2B，下图)。在使用PSA融合蛋白敏化和加强两次的动物中得到相同的发现。PSA-特异性产生IL-10的细胞应答优先在使用抗-DC-ASGPR-PSA免疫的动物中上升(图1B，上图)。使用抗-LOX-1-PSA免疫的动物比使用抗-DC-ASGPR-PSA免疫的动物发生更高的PSA-特异性产生IFNγ的细胞应答(图1B，下图)。对于HA1和PSA，产生IL-10的细胞应答的峰值在第一周获得，但产生IFNγ的细胞应答的峰值在第三周获得。总之，数据显示通过DC-ASGPR使抗原靶向体内DC可以在体内建立抗原特异性产生IL-10的T细胞。

源自单核细胞的IFNDC在包被指定的单克隆抗体的板中培养过夜。收获细胞，并使用市售PCR引物，通过实时PCR评估IL-10、IL-6和TNFα的RNA表达水平。与抗-DC-ASGPR抗体的其他克隆相比，5H8和49C11导致IL-10的表达升高。其还诱导IL-6和TNFa的水平升高(图3A)。

在培养物上清液中的IL-10的量通过Luminex分析来评估。与左图中的数据一致，5H8和49C11诱导IFNDC分泌的IL-10的量升高(图3B)。

来自健康供体(n＝6)和MS患者(n＝25)的CD11c+血DC使用5H8、4G2和49C11染色。来自健康供体和患者的CD11c+DC均显示两种不同类型的抗-DC-ASGPR抗体结合：所有抗-DC-ASGPR抗体良好地结合于来自约50％的供体的CD11c+DC，而来自另外50％的供体的CD11c+DC被抗-DC-ASGPR抗体的三种克隆微弱染色。然而，49C11能够比另外两种克隆更好地结合于CD11c+DC。除了其(49C11)诱导IL-10的能力以外，49C11可以良好地结合于DC。因此，49C11被选择为待融合到MS抗原的克隆(图4)。

来自健康供体的CD11c+DC使用不同浓度的(0、3、10和30ug/ml)的抗-DC-ASGPR-MBP或单独的MBP染色。数据表明抗-DC-ASGPR-MBP良好地结合于DC(图6B，上图)。

来自健康和MS患者供体的PBMC负载5ug/ml抗-DC-ASGPR-MBP融合蛋白或仅负载MBP。孵育细胞7天，然后在源自MBP的肽簇(cluster)的存在下再刺激T细胞48h。通过Luminex评估由T细胞分泌的IFNg和IL-10。与MBP相比，抗-DC-ASGPR-MBP导致在健康和患者供体中均升高的MBP-特异性产生IL-10的T细胞应答(图6B，下图)。

来自健康供体的CD11c+DC使用不同浓度(0、3、10和30ug/ml)的抗-DC-ASGPR-MOG或单独的MOG染色。数据表明抗-DC-ASGPR-MOG良好地结合于DC(图7A)。

(下图)来自MS患者供体的PBMC负载5ug/ml抗-DC-ASGPR-MOG融合蛋白或仅负载MBP。孵育细胞7天，然后在源自MBP的肽簇的存在下再刺激T细胞48h。通过Luminex评估由T细胞分泌的IFNg和IL-10。与MOG相比，抗-DC-ASGPR-MOG导致在健康和患者供体中均升高的MBP-特异性产生IL-10的T细胞应答(图7B)。

实施例2-抗-DC-ASGPR-MOG对NHP中的EAE诱导/进展的影响

以下实验结果由与本发明人一起工作的Dr.RogerLeGrand友情提供。

为了测试抗-DC-ASGPR-MOG对非人灵长类(NHP)中的EAE形成/进展的影响，使用在食蟹猴中的EAE模型。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，有时称为实验性变应性脑脊髓炎，是脑炎的动物模型。其为中枢神经系统(CNS)的炎性脱髓鞘疾病。其最初使用啮齿类，广泛地作为人CNS脱髓鞘疾病，包括多发性硬化症和急性播散性脑脊髓炎(ADEM)的动物模型进行研究。EAE通常也是T细胞介导的自身免疫疾病的原型。根据以下临床症状和症状的持续时间对动物评分：

实验设计。实验设计总结在图8中。组1(实验组：由3只食蟹猴组成)和组2(对照组：由3只食蟹猴组成)在第0、28和56天注射不完全弗氏佐剂中的hMOG。实验组1的动物在第7、14、21、35和63天接受抗-ASGPR-hMOG注射。对照组2动物在第7、14、21、35和63天接受抗-ASGPR-hPSA注射。

抗-DC-ASGPR-MOG抑制EAE在NHP中的形成/进展。在实验的整个期间，每日监测动物以测量EAE得分。使用抗-DC-ASGPR-MOG处理的动物(ID号AP607、CB385和CB457)均未显示任何疾病的临床症状。这些动物不显示上升的EAE疾病得分。然而对照组中的三只动物(AM637、CB207和21983)中的两只(AM637和CB207)在第20天和第37天之间显示上升的EAE得分(当两只动物均死亡时，图9和10)。总之，本发明人的结论是抗-DC-ASGPR-MOG能够抑制EAE在NHP中的形成/进展。

为了进一步证实在对照组(图8中的组2)中的动物中观察到的临床症状(图9和10)是否是由于脑内感染，在第22天对动物AM637的脑进行磁共振成像(MRI)。图11显示静脉内给予的钆被分散，表明从血管渗漏到脑中。T2图像还显示水在几个点积聚，表明该动物中的髓鞘质受损，因此不能排除水。考虑到液体衰减反转恢复(Flair)数据以及T2和钆数据，得出该动物脑中具有严重炎症以及脱髓鞘质的结论，这是EAE的典型症状。

总之，本发明人证明：1)食蟹猴通过使用MOG肽和佐剂免疫形成EAE，和2)抗-DC-ASGPR-MOG而不是抗-DC-ASGPR-hPSA抑制食蟹猴中的EAE的形成/进展。

本文公开并讨论的方法可以依照本发明而不要过度的实验来制备和实施。尽管本发明的组合物和方法已经就优选的实施方案进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本发明的构思、精神和范围的情况下，对本文描述的方法和所述方法的步骤或者步骤的顺序进行变化。更具体地，将显而易见的是，某些化学和生理上均相关的药剂可以代替本文所述的药剂，同时实现相同或相似的结果。所有这些对于本领域技术人员而言显而易见的类似替代和修改被视为在由所附权利要求所限定的本发明的精神、范围及构思之内。

Claims (53)

1.一种诱导患者对至少一种髓鞘蛋白免疫耐受的方法，其包括给予患者有效量的包含树突细胞靶向复合物的组合物，所述树突细胞靶向复合物包含连接到至少一种髓鞘蛋白或其抗原片段的树突细胞抗体或其靶向片段。

2.权利要求1所述的方法，其中至少一种髓鞘蛋白为髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)或髓鞘相关糖蛋白(MAG)。

3.权利要求2所述的方法，其中至少一种髓鞘蛋白为MBP。

4.权利要求2所述的方法，其中至少一种髓鞘蛋白为MOG。

5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述树突细胞抗体特异性结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。

6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述组合物包含多种树突细胞靶向复合物。

7.权利要求6所述的方法，其中所述多种树突细胞靶向复合物包括不同的髓鞘蛋白或一种或多种髓鞘蛋白的不同的抗原片段。

8.权利要求6或7所述的方法，其中每种髓鞘蛋白或抗原片段分开连接到树突细胞抗体或其靶向片段。

9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中使用连接肽将所述树突细胞抗体连接到髓鞘蛋白。

10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述组合物还包含至少一种致耐受性佐剂。

11.权利要求10所述的方法，其中所述致耐受性佐剂连接到所述树突细胞靶向复合物。

12.权利要求11所述的方法，其中所述致耐受性佐剂缀合到所述树突细胞靶向复合物。

13.权利要求11所述的方法，其中所述致耐受性佐剂融合到所述树突细胞抗体或其靶向片段，和/或融合到所述至少一种髓鞘蛋白。

14.权利要求10-13任一项所述的方法，其中所述致耐受性佐剂选自IL-10、地塞米松、FK506(他克莫司)、霍乱毒素B亚单位、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位、IFN-β、糖皮质激素、维生素D3和维生素D3类似物。

15.权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述树突细胞抗体通过结合多肽连接到至少一种髓鞘蛋白。

16.权利要求15所述的方法，其中所述结合多肽为锚定蛋白和粘连蛋白。

17.权利要求1-16任一项所述的方法，其包括多于一次给予所述组合物。

18.权利要求1-16任一项所述的方法，其中所述组合物经口、静脉内、皮下、皮内、肌内、经鼻、通过注射、通过吸入、经粘膜和/或使用雾化器给予。

19.权利要求1-18任一项所述的方法，其中所述受试者显示脱髓鞘疾病的一种或多种症状。

20.权利要求1-19任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有脱髓鞘疾病。

21.权利要求1-20任一项所述的方法，其中所述受试者具有患脱髓鞘疾病的风险。

22.权利要求19-21任一项所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病影响中枢神经系统。

23.权利要求22所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为特发性炎性脱髓鞘疾病。

24.权利要求22所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为多发性硬化症、神经病、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎或脑白质营养不良。

25.权利要求24所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为多发性硬化症。

26.权利要求19-21任一项所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病影响外周神经系统。

27.权利要求26所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、抗-MAG外周神经病、腓骨肌萎缩症、缺铜症或进行性炎性神经病。

28.权利要求1-24任一项所述的方法，其还包括制备所述组合物。

29.权利要求1-28任一项所述的方法，其还包括在给予所述组合物后测定受试者中抗至少一种髓鞘蛋白的抗体。

30.用于治疗受试者的脱髓鞘疾病的方法，其包括给予受试者药学上可接受的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少第一ASGPR抗体或其结合片段，其连接到髓鞘碱性蛋白(MBP)和/或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)或其抗原片段。

31.权利要求30所述的方法，其中所述ASGPR抗体或其结合片段融合到MBP或MOG或其抗原片段。

32.权利要求30或31所述的方法，其中多次给予所述受试者疫苗组合物。

33.权利要求32所述的方法，其中所述组合物经口、静脉内、皮下、皮内、肌内、经鼻、通过注射、通过吸入、经粘膜和/或使用雾化器给予。

34.权利要求30-33任一项所述的方法，其中所述受试者显示脱髓鞘疾病的一种或多种症状。

35.权利要求30-33任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有脱髓鞘疾病。

36.权利要求30-33任一项所述的方法，其中所述受试者具有患脱髓鞘疾病的风险。

37.权利要求34-36任一项所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病影响中枢神经系统。

38.权利要求37所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为特发性炎性脱髓鞘疾病。

39.权利要求38所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为多发性硬化症、神经病、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓痨、横贯性脊髓炎、德维克病、进行性多灶性白质脑病、视神经炎或脑白质营养不良。

40.权利要求39所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为多发性硬化症。

41.权利要求34-36任一项所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病影响外周神经系统。

42.权利要求41所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病为格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、抗-MAG外周神经病变、腓骨肌萎缩症、缺铜症或进行性炎性神经病。

43.权利要求30-42任一项所述的方法，其还包括制备所述组合物。

44.权利要求30-43任一项所述的方法，其还包括在给予所述组合物后测定受试者中抗至少一种髓鞘蛋白的抗体。

45.一种组合物，其包含至少第一ASGPR抗体或其结合片段，其连接到髓鞘碱性蛋白(MBP)和/或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)或其抗原片段。

46.权利要求45所述的组合物，其中所述树突细胞抗体使用连接肽连接到所述髓鞘蛋白或其抗原片段。

47.权利要求45-46任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种致耐受性佐剂。

48.权利要求47所述的组合物，其中所述致耐受性佐剂连接到所述树突细胞靶向复合物。

49.权利要求48所述的组合物，其中所述致耐受性佐剂缀合到所述树突细胞靶向复合物。

50.权利要求48所述的组合物，其中所述致耐受性佐剂融合到所述树突细胞抗体或其靶向片段，和/或融合到至少一种髓鞘蛋白。

51.权利要求47-50任一项所述的组合物，其中所述致耐受性佐剂选自IL-10、地塞米松、FK506(他克莫司)、霍乱毒素B亚单位、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位、IFN-β、糖皮质激素、维生素D3和维生素D3类似物。

52.权利要求45-51任一项所述的组合物，其中所述树突细胞抗体通过结合多肽连接到至少一种髓鞘蛋白或其抗原片段。

53.权利要求52所述的组合物，其中所述结合多肽为锚定蛋白和粘连蛋白。