JP6566941B2 - 多発性硬化症のための樹状細胞ａｓｇｐｒ標的化免疫治療薬 - Google Patents

Description

本出願は、2013年6月28日に提出された米国特許仮出願第61/841,094号の優先権の恩典を主張し、この仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

発明の背景
1. 発明の分野
本発明は、概して医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、ミエリン塩基性タンパク質またはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質と融合した樹状細胞抗ASGPR抗体を使用して多発性硬化症を治療するための方法および組成物に関する。

2. 関連技術の説明
体内に通常存在する物質および組織に対する身体の不適切な免疫応答は、自己免疫疾患（自己免疫）を引き起こすと考えられる。自己免疫は、ある特定の器官に限られるか、または異なる場所で特定の組織に関与する。自己免疫疾患の治療は、典型的には免疫応答を軽減する免疫抑制薬物療法が用いられるものの、これらの薬物のレパートリーは、限定される可能性があり、場合によっては、根底となる状態を治療するには不十分である。多数の自己免疫疾患が認知されているので、これらの治療は、実質的なヒトの保健上の問題点に相当する。散在性硬化症または播種性脳脊髄炎としても公知の多発性硬化症（MS）は、脳および脊髄の軸索周囲のミエリン鞘が損傷を受け、ミエリンの喪失および瘢痕化に至る炎症性疾患である。いくつかの場合では、根底となるメカニズムは、免疫系によるいずれかの破壊であると考えられる。これらの変化は、神経細胞が通信する能力に影響し、広範囲の徴候および症状を招く。

自己免疫疾患または自己免疫状態において免疫寛容を誘導するために使用することができる方法および組成物が提供される。免疫治療薬組成物およびこれらの組成物を患者に投与する方法が具体的に考えられる。態様は、特異的抗体を用いて特異的DC受容体を標的化することによって、受容体媒介型エンドサイトーシスを経由して樹状細胞（DC）にミエリン鞘タンパク質またはミエリン鞘成分を標的指向させる組成物に焦点を合わせている。

いくつかの態様では、患者において少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に対する免疫寛容を誘導する方法が提供される。ある特定の態様では、本方法は、少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質またはその抗原性フラグメントに結合した樹状細胞抗体またはその標的指向フラグメントを含む樹状細胞標的化複合体を含む組成物の有効量を患者に投与することを含む。他の態様では、ミエリン鞘タンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）、プロテオリピドタンパク質（PLP）、またはミエリン関連糖タンパク質（MAG）である。ある特定の局面では、少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質またはその抗原性フラグメントに結合した樹状細胞抗体またはその標的指向フラグメントを含む樹状細胞標的化複合体を含む組成物は、免疫治療薬であると見なされる。

いくつかの態様では、免疫治療薬は、複数のミエリン鞘タンパク質またはミエリン鞘成分を含む。ある特定の態様では、免疫治療薬の少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質はMBPである。他の態様では、免疫治療薬の少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質はMOGである。

ある特定の態様では、樹状細胞標的化複合体の樹状細胞抗体またはそのフラグメントは、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）と特異的に結合する。さらに他の態様では、樹状細胞標的化複合体組成物は、複数種の樹状細胞標的化複合体を含む。他の局面では、複数種の樹状細胞標的化複合体は、異なるミエリン鞘タンパク質または1つもしくは複数のミエリン鞘タンパク質の異なる抗原性フラグメントを含む。さらに他の局面では、ミエリン鞘タンパク質または抗原フラグメントは、樹状細胞抗体またはその標的指向フラグメントに別々に結合している。ある特定の局面では、樹状細胞抗体は、ペプチドリンカーを使用してミエリン鞘タンパク質に結合している。抗体または抗原性フラグメントがミエリン鞘タンパク質に結合される種々の方法がある。いくつかの態様では、それらは直接結合している。ある特定の態様では、抗体または抗原性フラグメントは、1つまたは複数の共有結合を経由してミエリン鞘タンパク質に結合している。抗体または抗原性フラグメントおよび1つまたは複数のミエリン鞘タンパク質（またはそのフラグメント）を含む単一のポリペプチドがあり得ることが、具体的に考えられる。2つの部分が（ペプチドリンカーを有してまたはペプチドリンカーなしの）ペプチド結合を経由して共有結合しているならば、そのようなポリペプチドは、融合タンパク質として記載され得る。ASGPR抗体（または抗体フラグメント）およびミエリン鞘タンパク質（またはそのフラグメント）を有するそのような融合タンパク質は天然に存在しない。

ある特定の態様には、SEQ ID NO:42〜53の少なくともまたは多くとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150個またはそれを超えるアミノ酸（その間のすべての値および範囲を含む）を含む単離されたポリペプチドを含む免疫原性組成物が含まれる。さらなる一局面では、単離されたポリペプチドは融合タンパク質である。組成物は、アジュバントを含むことができる。ある特定の局面では、単離されたポリペプチドは、融合タンパク質および／またはリポペプチドである。

態様は、SEQ ID NO:42〜53のいずれかである、またはそのいずれかと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチド、もしくはタンパク質を含む組成物を含む。類似のポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、いくつかの態様では、置換が保存的アミノ酸だけによるタンパク質性化合物に限定される。他の態様では、保存的置換だけが考えられているが、その一方では、化合物の機能に関与しない領域における可欠アミノ酸の欠失または他のアミノ酸の付加が考えられる。さらなる一態様では、組成物は、m抗ASGPR_49C11_7H（重鎖）SEQ ID NO:42、m抗ASGPR_49C11_7K（軽鎖）SEQ ID NO:43、m抗hASGPR_6.3H9.1D11H（重鎖）SEQ ID NO:44、m抗hASGPR_6.3H9.1D11K（軽鎖）SEQ ID NO:45、m抗hASGPR_5H8.1D4H（重鎖）SEQ ID NO:46、m抗hASGPR_5H8.1D4K （軽鎖）SEQ ID NO:47、m抗ASGPR_4G2.2_（重鎖）SEQ ID NO:48、m抗ASGPR_4G2.2_（軽鎖）SEQ ID NO:49、m抗ASGPR-5F10H（重鎖）SEQ ID NO:50、m抗ASGPR-5F10H（軽鎖）SEQ ID NO:51、m抗ASGPR1H11（重鎖）SEQ ID NO:52、またはm抗ASGPR1H11（軽鎖）SEQ ID NO:53などのASGPR結合ポリペプチドである、または少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一もしくは類似であるポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質を含み得る。

本明細書に記載のASGPR結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:42〜53のいずれかの少なくともまたは多くとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個もしくはそれを超える連続アミノ酸内、またはその中から導き出せる任意の範囲内に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個またはそれを超える変異型アミノ酸を含み得る。

特定の態様では、免疫治療薬、DC標的化複合体またはASGPR結合ポリペプチドが精製され、それは、最小限の変性を伴ってまたは伴わずに達成され得る。いくつかの局面では、免疫治療薬、DC標的化複合体またはASGPR結合ポリペプチドは活性であり、それは、免疫治療薬、DC標的化複合体またはASGPR結合ポリペプチドが、結合能を含む既述の機能または活性などの、いくつかの検出可能なレベルの機能または活性を保持することを意味する。免疫治療薬、DC標的化複合体またはASGPR結合ポリペプチドは、（他のタンパク質性分子および／または細胞性高分子に対して）約、少なくとも約、または多くとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％またはその中から導き出せる任意の範囲の純度もしくは均質性に精製され得ることが考えられる。さらなる態様において、組換え免疫治療薬、DC標的化複合体またはASGPR結合ポリペプチドが単離され得る。用語「単離された」は、それらの起源の細胞物質、細菌物質、ウイルス物質、もしくは培地（組換えDNA技法によって産生される場合）、または化学的前駆体もしくは他の化学物質（化学合成された場合）を実質的に有さない核酸またはポリペプチドを表すことができる。そのうえ、単離された化合物は、単離された化合物として対象に投与することができる化合物を表し；言い換えると、化合物が、カラムに接着またはアガロースゲル中に包埋しているならば、その化合物は単に「単離された」と見なされ得ない。さらに、「単離された核酸フラグメント」または「単離されたペプチド」は、フラグメントとして天然に存在せず、かつ／または典型的には機能的状態にない、核酸フラグメントまたはタンパク質フラグメントである。

さらに、本方法のある特定の態様では、方法は、約、少なくとも約、または多くとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0. 19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、または1000μgまたはmg（またはその中から導き出せる任意の範囲）のタンパク質を含有する組成物を伴い得る。タンパク質は、約、少なくとも約、または多くとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、10、11、12、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、または1000μlまたはml（またはその中から導き出せる任意の範囲）であり得る。ある特定の局面では、1つまたは複数の免疫治療薬、DC標的化複合体またはASGPR結合ポリペプチドは、用量として0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、または1000mg/kg体重で投与することができる。

特定の態様では、免疫治療薬または樹状細胞標的化複合体によって誘発される免疫寛容応答は、補完、補充、増加または増強され得る。ある特定の局面では、免疫治療薬または樹状細胞標的化複合体によって誘発される免疫寛容応答は、アジュバントによって補完、補充、増加または増強され得る。ある特定の局面では、アジュバントは、寛容原性アジュバントである。ある特定の態様では、免疫治療薬または樹状細胞標的化複合体組成物は、さらに、少なくとも1つの寛容原性アジュバントを含む。ある特定の局面では、寛容原性アジュバントは、樹状細胞標的化複合体に結合している。他の局面では、寛容原性アジュバントは、樹状細胞標的化複合体にコンジュゲートされている。さらに他の局面では、寛容原性アジュバントは、樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメント、および／または少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に融合されている。特定の態様では、寛容原性アジュバントは、IL-10、デキサメタゾン、FK506（タクロリムス）、コレラ毒素Bサブユニット、大腸菌（Escherichia coli）熱不安定性エンテロトキシンBサブユニット、IFN-β、グルココルチコイド、ビタミンD3、およびビタミンD3類似体より選択される。

特定の態様では、結合ポリペプチドの使用が、免疫治療薬または樹状細胞標的化複合体の別々のポリペプチド、部分またはモジュールを融合するか、コンジュゲートするか、または一緒にすると考えられる。ある特定の局面では、樹状細胞抗体またはそのフラグメントは、結合ポリペプチドを経由して少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に結合している。特定の態様では、結合ポリペプチドは、ドッケリン（dockerin）およびコヒーシンである。

ある特定の局面では、樹状細胞標的化複合体を含む組成物の有効量を患者に投与することは、1回を超える組成物の投与を含む。ある特定の局面では、組成物は、経口的、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、経鼻的に、注射により、吸入により、および／またはネブライザーを使用して投与される。

特定の局面では、記載された方法および組成物は、自己免疫障害、疾患または状態を有する対象または患者の症状を、治療、予防、回復、抑制、消散、改善またはその症状に他の方法で取り組むことを目指している。ある特定の局面では、対象は、脱髄疾患の1つまたは複数の症状を示す。他の態様では、対象は、脱髄疾患と診断されている。さらに他の態様では、対象は、脱髄疾患のリスクがある。特定の態様では、脱髄疾患は、中枢神経系を侵す。他の特定の態様では、脱髄疾患は、突発性炎症性脱髄疾患である。ある特定の局面では、脱髄疾患は、多発性硬化症、ニューロパシー、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、または白質ジストロフィーである。いくつかの態様では、脱髄疾患は、境界型多発性硬化症の1種である。いくつかの局面では、境界型（borderline form）多発性硬化症は、標準（standard）多発性硬化症、再発寛解型（Remitent-Recidivant）多発性硬化症（RRMS）、二次性進行型多発性硬化症（SPMS）、一次性進行型多発性硬化症（PPMS）、KIR4.1多発性硬化症、視神経脊髄型（Optic-spinal）多発性硬化症、視神経脊髄型（Opticospinal）多発性硬化症、デビック病、急性散在性脳脊髄炎（ADEM）、急性出血性白質脳炎、バロー同心性硬化症、シルダー病、びまん性ミエリン破壊性硬化症（diffuse myelinoclastic sclerosis）、マールブルク型多発性硬化症、悪性多発性硬化症、劇症型多発性硬化症、急性多発性硬化症、腫瘤様多発性硬化症、または単発性硬化症である。さらに他の態様では、脱髄疾患は、スザック症候群、筋痛性脳脊髄炎または白質希薄化である。

他の特定の態様では、脱髄疾患は多発性硬化症である。ある特定の局面では、脱髄性疾患は末梢神経系を侵す。さらなる態様では、脱髄疾患は、ギラン-バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、抗MAG末梢性ニューロパシー、シャルコー-マリー-トゥース病、銅欠乏症、または進行性炎症性ニューロパシーである。

ある特定の局面では、樹状細胞標的化複合体および／または免疫治療薬を含む記載された方法は、組成物を調製することをさらに含む。他の態様では、これらの方法は、組成物を投与後の対象において少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に対する抗体を測定することをさらに含む。

いくつかの局面では、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）および／もしくはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）またはその抗原性フラグメントに結合した、少なくとも第1のASGPR抗体またはその結合フラグメントを含む薬学的に許容されるワクチン組成物を対象に投与することを含む、対象における脱髄疾患を処置するための方法が考えられる。いくつかの態様では、ASGPR抗体またはその結合フラグメントは、MBPもしくはMOGまたはその抗原性フラグメントに融合されている。他の態様では、対象は、ワクチン組成物を複数回投与される。さらに他の態様では、組成物は、経口的、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、経鼻的、注射により、吸入により、および／またはネブライザーを使用して投与される。ある特定の局面では、対象は、脱髄疾患の1つまたは複数の症状を示す。追加的な局面では、対象は、脱髄疾患と診断されている。いくつかの態様では、対象に、脱髄疾患のリスクがある。他の態様では、脱髄疾患は、中枢神経系を侵す。さらなる態様では、脱髄疾患は突発性炎症性脱髄疾患である。ある特定の局面では、脱髄疾患は、多発性硬化症、ニューロパシー、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、または白質ジストロフィーである。特定の態様では、脱髄疾患は多発性硬化症である。いくつかの態様では、脱髄疾患は、境界型多発性硬化症の1種である。いくつかの局面では、境界型多発性硬化症は、標準多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症（RRMS）、二次性進行型多発性硬化症（SPMS）、一次性進行型多発性硬化症（PPMS）、KIR4.1多発性硬化症、視神経脊髄型多発性硬化症、視神経脊髄型多発性硬化症、デビック病、急性散在性脳脊髄炎（ADEM）、急性出血性白質脳炎、バロー同心性硬化症、シルダー病、びまん性ミエリン破壊性硬化症、マールブルク型多発性硬化症、悪性多発性硬化症、劇症型多発性硬化症、急性多発性硬化症、腫瘤様多発性硬化症、または単発性硬化症である。さらに他の態様では、脱髄疾患は、スザック症候群、筋痛性脳脊髄炎または白質希薄化である。他の局面では、脱髄疾患は、末梢神経系を侵す。特定の態様では、脱髄疾患は、ギラン-バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、抗MAG末梢性ニューロパシー、シャルコー-マリー-トゥース病、銅欠乏症、または進行性炎症性ニューロパシーである。ある特定の態様では、本方法は、さらに、組成物を調製することを含む。さらなる態様では、これらの方法は、さらに、組成物を投与後に対象における少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に対する抗体を測定することを含む。

いくつかの態様では、組成物は、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）および／もしくはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）またはその抗原性フラグメントに結合した少なくとも第1のASGPR抗体またはその結合フラグメントを含む。他の態様では、樹状細胞抗体は、ペプチドリンカーを使用してミエリン鞘タンパク質またはその抗原性フラグメントに結合している。いくつかの態様では、組成物は、さらに、少なくとも1つの寛容原性アジュバントを含む。さらに他の態様では、寛容原性アジュバントは、樹状細胞標的化複合体に結合している。さらなる態様では、寛容原性アジュバントは、樹状細胞標的化複合体にコンジュゲートしている。いくつかの局面では、寛容原性アジュバントは、樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメントおよび／または少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質と融合している。特定の局面では、寛容原性アジュバントは、IL-10、デキサメタゾン、FK506（タクロリムス）、コレラ毒素Bサブユニット、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンBサブユニット、IFN-β、グルココルチコイド、ビタミンD3、およびビタミンD3類似体より選択される。さらに他の局面では、樹状細胞抗体は、結合ポリペプチドを経由して少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質またはその抗原性フラグメントに結合している。いくつかの態様では、結合ポリペプチドは、ドッケリンおよびコヒーシンである。

本明細書において使用される「一つ（a）」または「一つ（an）」は、1つまたは複数を意味し得る。本特許請求の範囲において使用される、「含む」という語と一緒に使用される場合の語「一つ（a）」または「一つ（an）」は、1つまたは1つを超える、を意味し得る。

選択肢のみを表すことが明確に示されている、または選択肢が相互に排他的である場合を除き、特許請求の範囲における用語「または」の使用は、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみおよび「および／または」を表す定義を支持する。本明細書において使用されるように、「別の」は、少なくとも2番目以降を意味し得る。

本出願にわたり、用語「約」は、値が、装置の誤差の固有の変動を含むことを示すために使用され、方法は、値、または試験対象間に存在する変動を決定するために採用されている。

[本発明1001]
患者において少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に対する免疫寛容を誘導する方法であって、少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質またはその抗原性フラグメントに結合した樹状細胞抗体またはその標的指向フラグメントを含む樹状細胞標的化複合体を含む組成物の有効量を患者に投与する段階を含む、方法。
[本発明1002]
少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）、プロテオリピドタンパク質（PLP）、またはミエリン関連糖タンパク質（MAG）である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質がMBPである、本発明1002の方法。
[本発明1004]
少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質がMOGである、本発明1002の方法。
[本発明1005]
樹状細胞抗体が、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）と特異的に結合する、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
組成物が、複数の樹状細胞標的化複合体を含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
複数の樹状細胞標的化複合体が、異なるミエリン鞘タンパク質または1つもしくは複数のミエリン鞘タンパク質の異なる抗原性フラグメントを含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
各ミエリン鞘タンパク質または抗原フラグメントが、樹状細胞抗体またはその標的指向フラグメントに別々に結合している、本発明1006または1007の方法。
[本発明1009]
樹状細胞抗体が、ペプチドリンカーを使用してミエリン鞘タンパク質に結合している、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
組成物が、少なくとも1つの寛容原性アジュバントをさらに含む、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
寛容原性アジュバントが、樹状細胞標的化複合体に結合している、本発明1010の方法。
[本発明1012]
寛容原性アジュバントが、樹状細胞標的化複合体にコンジュゲートされている、本発明1011の方法。
[本発明1013]
寛容原性アジュバントが、樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメント、および／または少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に融合されている、本発明1011の方法。
[本発明1014]
寛容原性アジュバントが、IL-10、デキサメタゾン、FK506（タクロリムス）、コレラ毒素Bサブユニット、大腸菌（Escherichia coli）熱不安定性エンテロトキシンBサブユニット、IFN-β、グルココルチコイド、ビタミンD3、およびビタミンD3類似体より選択される、本発明1010〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
樹状細胞抗体が、結合ポリペプチドを経由して少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に結合している、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
結合ポリペプチドが、ドッケリン（dockerin）およびコヒーシンである、本発明1015の方法。
[本発明1017]
1回を超える組成物の投与を含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
組成物が、経口的、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、経鼻的に、注射により、吸入により、粘膜的に、および／またはネブライザーを使用して投与される、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1019]
対象が、脱髄疾患の1つまたは複数の症状を示す、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
対象が、脱髄疾患と診断されている、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
対象に、脱髄疾患のリスクがある、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
脱髄疾患が、中枢神経系を侵す、本発明1019〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
脱髄疾患が、突発性炎症性脱髄疾患である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
脱髄疾患が、多発性硬化症、ニューロパシー、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、または白質ジストロフィーである、本発明1022の方法。
[本発明1025]
脱髄疾患が、多発性硬化症である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
脱髄疾患が、末梢神経系を侵す、本発明1019〜1021のいずれかの方法。
[本発明1027]
脱髄疾患が、ギラン-バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、抗MAG末梢性ニューロパシー、シャルコー-マリー-トゥース病、銅欠乏症、または進行性炎症性ニューロパシーである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
組成物を調製する段階をさらに含む、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1029]
組成物を投与した後に、対象における少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に対する抗体を測定する段階をさらに含む、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
対象における脱髄疾患を治療するための方法であって、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）および／もしくはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）またはその抗原性フラグメントに結合した少なくとも第1のASGPR抗体またはその結合フラグメントを含む薬学的に許容されるワクチン組成物を対象に投与する段階を含む、方法。
[本発明1031]
ASGPR抗体またはその結合フラグメントが、MBPもしくはMOGまたはその抗原性フラグメントに融合されている、本発明1030の方法。
[本発明1032]
対象にワクチン組成物が複数回投与される、本発明1030または1031の方法。
[本発明1033]
組成物が、経口的、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、経鼻的、注射により、吸入により、粘膜的に、および／またはネブライザーを使用して投与される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
対象が、脱髄疾患の1つまたは複数の症状を示す、本発明1030〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
対象が、脱髄疾患と診断されている、本発明1030〜1033のいずれかの方法。
[本発明1036]
対象に、脱髄疾患のリスクがある、本発明1030〜1033のいずれかの方法。
[本発明1037]
脱髄疾患が、中枢神経系を侵す、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
脱髄疾患が、突発性炎症性脱髄疾患である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
脱髄疾患が、多発性硬化症、ニューロパシー、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、または白質ジストロフィーである、本発明1038の方法。
[本発明1040]
脱髄疾患が、多発性硬化症である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
脱髄疾患が、末梢神経系を侵す、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1042]
脱髄疾患が、ギラン-バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、抗MAG末梢性ニューロパシー、シャルコー-マリー-トゥース病、銅欠乏症、または進行性炎症性ニューロパシーである、本発明1041の方法。
[本発明1043]
組成物を調製する段階をさらに含む、本発明1030〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
組成物を投与した後に、対象における少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に対する抗体を測定する段階をさらに含む、本発明1030〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
ミエリン塩基性タンパク質（MBP）および／もしくはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）またはその抗原性フラグメントに結合した少なくとも第1のASGPR抗体またはその結合フラグメントを含む組成物。
[本発明1046]
樹状細胞抗体が、ペプチドリンカーを使用して、ミエリン鞘タンパク質またはその抗原性フラグメントに結合している、本発明1045の組成物。
[本発明1047]
少なくとも1つの寛容原性アジュバントをさらに含む、本発明1045〜1046のいずれかの組成物。
[本発明1048]
寛容原性アジュバントが、樹状細胞標的化複合体に結合している、本発明1047の組成物。
[本発明1049]
寛容原性アジュバントが、樹状細胞標的化複合体にコンジュゲートされている、本発明1048の組成物。
[本発明1050]
寛容原性アジュバントが、樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメントに、および／または少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に融合されている、本発明1048の組成物。
[本発明1051]
寛容原性アジュバントが、IL-10、デキサメタゾン、FK506（タクロリムス）、コレラ毒素Bサブユニット、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンBサブユニット、IFN-β、グルココルチコイド、ビタミンD3、およびビタミンD3類似体より選択される、本発明1047〜1050のいずれかの組成物。
[本発明1052]
樹状細胞抗体が、結合ポリペプチドを経由して少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質またはその抗原性フラグメントに結合している、本発明1045〜1051のいずれかの組成物。
[本発明1053]
結合ポリペプチドが、ドッケリンおよびコヒーシンである、本発明1052の組成物。
態様の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかし、態様の主旨および範囲内の様々な変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は、好ましい態様を示すものの、例証のためだけに示されていることを理解すべきである。

以下の図面は、本明細書の部分を形成し、態様のある特定の局面をさらに実証するために含まれる。ある特定の態様は、本明細書に提示された特定の態様の詳細な説明と共にこれらの図面の1つまたは複数を参照することによってよりよく理解され得る。

（A）実験方法の模式図。（B）抗DC-ASGPR-PSAワクチンは、NHPにおいてPSA特異的IL-10産生CD4+ T細胞を初回刺激することができる。 （A）実験方法の模式図。（B）抗DC-ASGPR-HA1はIL-10産生HA1特異的CD4⁺ T細胞をインビボで促進する。 モノクローナル抗体の選択。（A）RT-PCRアッセイ。（B）ルミネックスアッセイ。7個中3個のクローンはDCを誘導してIL-10を発現させ、他のクローンは10pg/ml未満のIL-10を誘導する。IL-10の発現レベルはドナー間で変動し、IL-6およびTNFaは、ルミネックスアッセイでバックグラウンドのレベルである。 モノクローナル抗体の選択。49C11は、MS患者においてCD11c⁺血液DCに結合する。 モノクローナル抗体の選択。49C11は、健康なドナーにおいてCD11c⁺血液DCに結合する。 抗DC-ASGPR-MBP融合タンパク質および抗DC-ASGPR-MOG融合タンパク質の作製。MBPおよびMOGと融合した抗DC-ASGPR（49C11）mAbの発現産物。 （A）実験方法の模式図。 （B）抗DC-ASGPR(49C11)-MBPタンパク質のインビトロ検証。抗DC-ASGPR(49C11)-MBPはPBMCにおいてCD11c⁺ DCに結合し、MBP特異的Treg応答を促進する。 図6B-1の続きである。 抗DC-ASGPR(49C11)-MOGタンパク質のインビトロ検証。（A）CD11c+ DCの染色。（B）MS患者のPBMCのローディングアッセイ。抗DC-ASGPR-MOGはDCに結合し、MOG特異的Treg応答を促進する。 カニクイザルでのEAEモデルにおける抗ASGPR-hMOGの有効性。実験計画。 抗DC-ASGPR-MOG処置は、EAEの発症進行を抑制する。 抗DC-ASGPR-MOG処置は動物の生存増加をもたらす。 22日目のAM637動物の脳の磁気共鳴画像。

例証的な態様の説明
I. 多発性硬化症の免疫治療技法
多発性硬化症などの自己免疫障害から防御するためまたは自己免疫障害を処置するために、1つまたは複数のミエリン鞘抗原に対する免疫寛容を対象において発生させるための方法および組成物が提供される。樹状細胞（DC）は、抗原特異的免疫を調節することに主要な役割を果たす抗原提示細胞である（Mellman および Steinman 2001）、（Banchereau, Briere et al. 2000）、（Cella, Sallusto et al. 1997）。DCは、抗原を捕捉し、それらをペプチドにプロセシングし、これらをT細胞に提示する。したがって、抗原をDCに直接送達することは、免疫治療薬を開発するための焦点領域である。

ミエリン鞘タンパク質もしくは成分に対する免疫寛容応答を発生させるためまたはミエリン鞘タンパク質もしくは成分に対する免疫応答を抑制するために、DCに送達するためのミエリン鞘抗原を含有する免疫治療薬組成物が本明細書において提供される。いくつかの態様では、ミエリン鞘タンパク質または成分は、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）である。他の態様では、ミエリン鞘タンパク質または成分は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）である。さらに他の態様では、ミエリン鞘タンパク質または成分は、プロテオリピドタンパク質（PLP）である。さらに他の態様では、ミエリン鞘タンパク質または成分は、ミエリン関連糖タンパク質である。さらなる態様では、ミエリン鞘タンパク質または成分は、末梢ミエリンタンパク質（PMP-22）、P₀タンパク質、コネキシン32タンパク質、シュワン細胞ミエリンタンパク質、またはオリゴデンドロサイト-ミエリン糖タンパク質（OMgp）のいずれか1つである。さらなる態様では、免疫治療薬は、上述のような複数の異なるミエリン鞘成分を含む。

免疫治療薬の送達後に発生する免疫応答の種類は、治療薬によって標的化される受容体の種類によってモジュレートされ得る。本方法のいくつかの態様では、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）は、ASGPR結合性抗体によって標的化される。いくつかの局面では、抗体はモノクローナル抗体である。さらに他の局面では、抗体は、マウスモノクローナル抗体である。さらなる局面では、抗体はヒト／マウスのキメラである。さらなる局面では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。

ある特定の局面では、免疫治療薬によって標的化される受容体の種類は、DEC-205である。DEC-205は、樹状細胞（DC）によって主に発現されるI型細胞表面タンパク質である。本方法のいくつかの態様では、DEC-205は、DEC-205結合性抗体によって標的化される。いくつかの局面では、抗体は、DEC-205モノクローナル抗体である。さらに他の局面では、抗体は、DEC-205マウスモノクローナル抗体である。さらに他の局面では、抗体は、DEC-205マウス／ヒトキメラである。さらなる局面では、抗体は、ヒト化DEC-205マウスモノクローナル抗体である。

そのような技法および態様は、以下の米国特許出願公開第20120282281号（Agents that Engage Antigen-Presenting Cells Through Dendritic Cell Asialoglycoprotein Receptor (DC-ASGPR)）；同第20120244155号（Dendritic Cells (DCs) Targeting for Tuberculosis (TB) Vaccine）；同第20120237513号（Vaccines Based on Targeting Antigen to DCIR Expressed on Antigen-Presenting Cells）；同第20120231023号（Novel Vaccine Adjuvants Based on Targeting Adjuvants to Antibodies Directly to Antigen-Presenting Cells）；同第20120213768号（Diagnostic and Therapeutic Uses for B Cell Maturation Antigen）；同第20120128710号（Enhancement of Pathogen-Specific Memory Th17 Cell Responses）；同第20120121592号（Targeting Antigens to Human Dendritic Cells Via DC-Asialoglycoprotein Receptor to Produce IL-10 Regulatory T-Cells；同第20120039916号（NOVEL VACCINE ADJUVANTS BASED ON TARGETING ADJUVANTS TO ANTIBODIES DIRECTLY TO ANTIGEN-PRESENTING CELLS）；同第20120035240号（CONSERVED HBV AND HCV SEQUENCES USEFUL FOR GENE SILENCING）；同第20120020990号（ISOLATED MAMMALIAN MONOCYTE CELL GENES; RELATED REAGENTS）；同第20120004643号（Vaccines Based on Targeting Antigen to DCIR Expressed on Antigen-Presenting Cells）；同第20110274653号（DENDRITIC CELL IMMUNORECEPTORS (DCIR)-MEDIATED CROSSPRIMING OF HUMAN CD8+ T CELLS）；同第20110081343号（VACCINES DIRECTED TO LANGERHANS CELLS）；同第20100330115号（Multivariable Antigens Complexed with Targeting Humanized Monoclonal Antibody）；同第20100322929号（ANTIGEN PRESENTING CELL TARGETED CANCER VACCINES）；同第20100297114号（ANTIGEN PRESENTING CELL TARGETED VACCINES）；同第20100291082号（ANTIGEN PRESENTING CELL TARGETED ANTI-VIRAL VACCINES）；同第20100239575号（ANTI-CD40 ANTIBODIES AND USES THEREOF）；同第20100209907号（ISOLATED MAMMALIAN MONOCYTE CELL GENES； RELATED REAGENTS）；同第20100135994号（HIV VACCINE BASED ON TARGETING MAXIMIZED GAG AND NEF TO DENDRITIC CELLS）；同第20080267984号（Activation of Human Antigen-Presenting Cells Through Dendritic Cell Lectin-Like Oxidized LDL Receptor-1 (LOX-1)）；同第20080254047号（Activation of Human Antigen-Presenting Cells Through CLEC-6）；同第20080254044号（Multivariable Antigens Complexed with Targeting Humanized Monoclonal Antibody）；同第20080241170号（Vaccines Based on Targeting Antigen to DCIR Expressed on Antigen-Presenting Cells）；同第20080233140号（Therapeutic Applications of Activation of Human Antigen-Presenting Cells Through Dectin-1）；同第20080206262号（Agents That Engage Antigen-Presenting Cells Through Dendritic Cell Asialoglycoprotein Receptor (DC-ASGPR)）；同第20080070854号（Conserved Hbv and Hcv Sequences Useful for Gene Silencing）；同第20050287582号（Antibodies that specifically bind to FDF03）；同第20050059808号（Isolated mammalian monocyte cell genes; related reagents）；同第20040143858号（Isolated mammalian monocyte cell genes; related reagents）；同第20030105303号（Isolated mammalian monocyte cell genes; related reagents）；および同第20020161218号（Hepatitis C virus vaccine）に記載されており、それらのすべては、参照により本明細書に組み入れられる。

II. 核酸
ある特定の態様では、本明細書に記載のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする組換え核酸がある。方法および組成物における使用のために考えられるポリヌクレオチドには、DC受容体に対する抗体（抗DC抗体およびDC標的化抗体とも呼ばれる）またはその結合部分をコードするものが含まれる。

本出願に使用される用語「ポリヌクレオチド」は、組換えであるか、または総ゲノム核酸なしに単離されたかのいずれかの核酸分子を表す。用語「ポリヌクレオチド」の中にオリゴヌクレオチド（残基長100以下の核酸）、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターが含まれる。ポリヌクレオチドには、ある特定の局面では、天然に存在する遺伝子またはタンパク質をコードする配列から実質的に単離された調節配列が含まれる。ポリヌクレオチドは、1本鎖（コードもしくはアンチセンス）または2本鎖であり得、RNA、DNA（ゲノム、cDNAもしくは合成）、その類似体、またはそれらの組合せであり得る。追加的なコード配列または非コード配列は、ポリヌクレオチド内に存在し得るが、存在しなくてもよい。

これに関して、用語「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする核酸（適正な転写、翻訳後修飾、または局在化のために必要な任意の配列を含む）を表すために使用される。当業者に理解されるように、本用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および突然変異体を発現するまたは発現するように適応され得る、ゲノム配列、発現カセット、cDNA配列、およびより小さな操作核酸セグメントを包含する。ポリペプチドのすべてまたは部分をコードする核酸は、そのようなポリペプチドのすべてまたは部分をコードする連続核酸配列を含有し得る。わずかに異なる核酸配列を有するが、それでもなお同一または実質的に類似のタンパク質をコードする変異を含有する核酸によって、特定のポリペプチドがコードされ得ることも考えられる（上記参照）。

特定の態様では、DC受容体に結合するポリペプチド（例えば抗体またはそのフラグメント）をコードする核酸配列を組み入れている単離された核酸セグメントおよび組換えベクターがある。用語「組換え」は、ポリペプチドまたは特定のポリペプチド名と共に使用され得、これは、一般的にインビトロで操作されたまたはそのような分子の複製産物である核酸分子から産生されたポリペプチドを表す。

コード配列自体の長さに関係なく、核酸セグメントを、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコードセグメントなどの他の核酸配列と組合せてもよく、その結果、それらの全体長は、かなり変動し得る。したがって、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントが採用され得ると考えられ、合計長は、好ましくは意図された組換え核酸プロトコールでの調製および使用の容易さによって限定される。いくつかの場合には、核酸配列は、例えばポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾、または標的化もしくは効力などの治療上の利益を可能にするために、追加的な異種コード配列を有するポリペプチド配列をコードし得る。上述のように、タグまたは他の異種ポリペプチドを改変ポリペプチドのコード配列に付加してもよく、この「異種」は、改変ポリペプチドと同じではないポリペプチドを表す。

ある特定の態様では、本明細書に開示の配列と実質的な同一性を有するポリヌクレオチド変異体があり；それらの変異体は、本明細書に記載の方法（例えば、標準的なパラメーターを使用するBLAST解析）を使用して本明細書に提示されるポリヌクレオチド配列に比べて少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％またはそれよりも高い（その間のすべての値および範囲を含む）配列同一性を含む。ある特定の局面では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載のアミノ酸配列と配列の全長にわたり少なくとも90％、好ましくは95％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または該単離されたポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含む。

ベクター
ポリペプチドは、核酸分子によってコードされ得る。核酸分子は、核酸ベクターの形態の可能性がある。用語「ベクター」は、異種核酸配列を複製および発現できる細胞内に導入するために、異種核酸配列を挿入できる担体核酸分子を表すために使用される。核酸配列は、「異種」の可能性があり、それは、ベクターが導入されつつある細胞または組み入れられる核酸にとって外来の状況にあることを意味し、それらには、細胞または核酸中の配列と相同であるが、宿主細胞または核酸内に通常見い出されない位置にある配列が含まれる。ベクターには、DNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、ならびに人工染色体（例えばYAC）が含まれる。当業者は、標準的な組換え技法（例えば、両方とも参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996）によりベクターを構築するための知識を身につけている。ベクターは、樹状細胞受容体と結合する抗体を産生するために宿主細胞において使用され得る。

用語「発現ベクター」は、転写される能力がある遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを表す。次に、ある場合には、RNA分子は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。発現ベクターは、特定の宿主生物において機能的に連結されるコード配列の転写および場合によっては翻訳に必要な核酸配列を表す、多様な「制御配列」を含有することができる。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能も同様に果たす核酸配列を含有する場合があり、それらは、本明細書に記載されている。

宿主細胞
本明細書に使用されるように、用語「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」は、互換的に使用され得る。これらの用語のすべてには、任意およびすべてのその後の世代である後代も含まれる。すべての後代は、計画的突然変異または偶発性突然変異により同一なわけではない場合があることが理解されている。異種核酸配列を発現することに関連して、「宿主細胞」は、原核細胞または真核細胞を表し、それには、ベクターを複製する、またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現する能力のある任意の形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞は、ベクターまたはウイルスのレシピエントとして使用することができ、使用されてきた。宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列などの外因性核酸が宿主細胞内に転移または導入される過程を表す「トランスフェクション」または「形質導入」がされ得る。形質転換細胞には、初代対象細胞およびその後代が含まれる。

いくつかのベクターは、それが原核細胞および真核細胞の両方において複製および／または発現できるようにする制御配列を用い得る。当業者は、さらに、上記宿主細胞のすべてを維持するためおよびベクターの複製を許すためにそれらのすべてをインキュベートすべき条件を理解している。ベクターの大規模産生ならびにベクターによってコードされる核酸およびそれらの同族のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの産生を可能にする技法および条件も理解されており、公知である。

発現系
上述の組成物の少なくとも一部またはすべてを含む多数の発現系が存在する。原核生物および／または真核生物に基づく系を、核酸配列またはそれらの同族ポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生するための態様を用いた使用のために採用することができる。多くのそのような系は、市販されており、広く入手可能である。

昆虫細胞／バキュロウイルス系は、両方とも参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,871,986号、同第4,879,236号に記載されているような異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を産生することができ、それらは、例えばINVITROGEN（登録商標）からMAXBAC（登録商標）2.0およびCLONTECH（登録商標）からBACPACK（商標）バキュロウイルス発現系の名称で購入することができる。

開示された発現系に加えて、他の発現系の例には、合成エクジソン誘導受容体を伴うSTRATAGENE（登録商標）製COMPLETE CONTROL誘導哺乳類発現系またはそのpET発現系である大腸菌発現系が含まれる。完全長CMVプロモーターを使用する誘導哺乳類発現系であるT-REX（商標）（テトラサイクリン調節発現）系を担持する誘導発現系の別の例は、INVITROGEN（登録商標）から入手可能である。INVITROGEN（登録商標）は、ピキア-メタノリカ（Pichia methanolica）発現系と呼ばれる酵母発現系も提供しており、その発現系は、メチロトローフ酵母ピキア-メタノリカでの組換えタンパク質の高レベル産生用に設計されている。当業者は、発現構築物などのベクターを発現させて核酸配列またはその同族ポリペプチド、タンパク質、もしくはペプチドを産生する方法を知っている。

III. タンパク質性組成物
置換変異体は、典型的にはタンパク質内の1つまたは複数の部位で1つのアミノ酸から別のアミノ酸への交換を含み、他の機能または性質を欠如してまたは欠如せずに、ポリペプチドの1つまたは複数の性質をモジュレートするように設計され得る。置換は、保存的、すなわち1つのアミノ酸が類似の形状および電荷の1つと交換されることであり得る。保存的置換は、当技術分野において周知であり、それには、例えば、アラニンからセリン；アルギニンからリシン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リシンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからトレオニン；トレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変更が含まれる。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が侵されるような非保存的であり得る。非保存的変更は、典型的には、残基を非極性または無荷電アミノ酸の代わりに極性または荷電アミノ酸などの化学的に異なる残基に置換すること、およびその逆を伴う。

タンパク質は、組換え型であるか、またはインビトロ合成され得る。あるいは、非組換えまたは組換えタンパク質を細菌から単離してもよい。そのような変異体を含有する細菌が組成物および方法に実施され得ることも考えられる。その結果、タンパク質を単離する必要はない。

用語「機能的に等価のコドン」は、本明細書において、アルギニンまたはセリンについての6つのコドンなどの、同じアミノ酸をコードするコドンを表すために使用され、生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンも表す（下表参照）。

コドンの表

アミノ酸配列および核酸配列は、それぞれ追加的なN-末端アミノ酸もしくはC-末端アミノ酸、または5'配列もしくは3'配列などの追加的な残基を含む場合があり、さらに、タンパク質の発現に関して、配列が生物学的タンパク質活性の維持を含めた上述の基準に合う限り、アミノ酸配列および核酸配列は、本質的に本明細書に開示の配列の1つに示される通りであると理解されるであろう。末端配列の付加は、例えばコード領域の5'または3'部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を含み得る核酸配列に特に適用される。

以下は、等価な、または改良型でさえある第2世代分子を創出するためにタンパク質のアミノ酸を変更することに基づく議論である。例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位などの構造との相互作用結合能の顕著な喪失なしに、ある特定のアミノ酸でタンパク質構造中の他のアミノ酸を置換してもよい。タンパク質の生物学的機能活性を定義するのはタンパク質の相互作用能および性質であるので、ある特定のアミノ酸置換をタンパク質配列および根底となるDNAコード配列中に行い、それでもなお類似の性質を有するタンパク質を産生することができる。したがって、遺伝子の生物学的有用性または活性に顕著な喪失なしに、それらの遺伝子のDNA配列に様々な変更が加えられ得ることが、本発明者らによって考えられている。

そのような変更を加える上で、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与する上でのアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性が、一般的に当技術分野において理解されている（Kyte および Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対疎水性親水性が、結果として生じたタンパク質の二次構造の一因となり、それが今度はタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を定義することが受け入れられている。

類似のアミノ酸の置換が親水性に基づき効果的に行えることも、当技術分野において理解されている。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,554,101号は、隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性が、タンパク質の生物学的性質と相関すると述べている。アミノ酸で、類似の親水性値を有する別のアミノ酸を置換してもなお、生物学的に等価で免疫学的に等価のタンパク質を産生できることが理解されている。

上に概略を述べたように、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸の側鎖置換基、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどの相対類似性に基づく。様々な前述の特徴を考慮する例示的な置換は周知であり、それらには、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。

組成物中に1mlあたり約0.001mg〜約10mgの合計ポリペプチド、ペプチド、および／またはタンパク質があると考えられる。したがって、組成物中のタンパク質濃度は、約、少なくとも約、または多くとも約0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/mlまたはそれを超える（またはその中から導き出せる任意の範囲）の可能性がある。このうち、約、少なくとも約、または多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％が、DCを標的指向する抗体であり得、本明細書に記載の他のタンパク質、抗体またはタンパク質結合性抗体と組合せて使用され得る。

ポリペプチドおよびポリペプチドの産生
態様は、本明細書に記載の様々な局面における使用のためのポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質ならびにそれらの免疫原性フラグメントを伴う。例えば、DC受容体と結合することおよびミエリン鞘タンパク質または成分を抗原として提示することについて特異的抗体がアッセイまたは使用される。特定の態様では、本明細書に記載のタンパク質のすべてまたは部分は、従来の技法により溶液中または固体支持体上で合成することもできる。様々な自動合成装置が市販されており、公知のプロトコールにより使用することができる。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられるStewartおよびYoung（1984）；Tamら（1983）；Merrifield（1986）；ならびにBaranyおよびMerrifield（1979）を参照されたい。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクター内に挿入され、適切な宿主細胞内に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適した条件で培養される組換えDNA技法が採用され得る。

一態様は、タンパク質の産生および／または提示のための、微生物を含めた細胞への遺伝子導入の使用を含む。対象となるタンパク質に関する遺伝子を適切な宿主細胞内に導入し、続いて適切な条件下で細胞を培養してもよい。事実上任意のポリペプチドをコードする核酸が採用され得る。組換え発現ベクターおよびその中に含まれるエレメントの作製は、本明細書において論じられている。あるいは、産生されるべきタンパク質は、タンパク質産生のために使用される細胞によって通常合成される内因性タンパク質であり得る。

ある特定の局面では、DC受容体フラグメントは、フラグメント配列の全長にわたって選択された配列と少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも95％の同一性、または少なくとも97〜99％の同一性（その間のすべての値および範囲を含む）を有するタンパク質の細胞外ドメインの実質的にすべてを含む。

ミエリン鞘タンパク質もしくは成分、またはミエリン鞘タンパク質もしくは成分の免疫原性フラグメント（例えば、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、末梢ミエリンタンパク質（PMP-22）、P₀タンパク質、コネキシン32タンパク質、シュワン細胞ミエリンタンパク質、オリゴデンドロサイト-ミエリン糖タンパク質（OMgp））から構成される融合タンパク質も免疫原性組成物中に含まれる。あるいは、態様には、T細胞エピトープまたは精製タグ、例えばβ-ガラクトシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、6×His、緑色蛍光タンパク質（GFP）、FLAG、mycタグ、ポリヒスチジンなどのエピトープタグ、またはインフルエンザウイルスヘマグルチニンなどのウイルス表面タンパク質、または破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197などの細菌タンパク質の提供体などの、異種配列との融合タンパク質としての、ミエリン鞘タンパク質もしくは成分またはそれらの免疫原性フラグメントの個別の融合タンパク質も含まれる。

抗体および抗体様分子
ある特定の局面では、DC受容体に対して特異性を有する1種または複数種の抗体または抗体様分子（例えば、抗体のCDRドメインを含むポリペプチド）が、入手または産生され得る。これらの抗体は、本明細書に記載の様々な診断または治療的応用に使用され得る。

本明細書に使用されるように、用語「抗体」は、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEなどの任意の免疫学的結合性作用物質ならびに抗原結合活性を保持する抗体CDRドメインを含むポリペプチドを広く表すことが意図される。したがって、用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を表すために使用され、この用語には、Fab'、Fab、F（ab'）2、単一ドメイン抗体（DAB）、Fv、scFv（単鎖Fv）などの抗体フラグメント、および抗体CDRを有するポリペプチド、CDRを表示する足場ドメイン（例えばアンチカリン）またはナノボディーが含まれる。例えば、ナノボディーは、ラクダIgG2もしくはIgG3由来の抗原特異的VHH（例えば組換えVHH）、またはそのようなラクダIg由来のCDRディスプレイフレームであることができる。ラクダ抗体の産生および使用は、両方とも参照により本明細書に組み入れられるEP1118669 A9およびEP1414858 B1に記載されている。様々な抗体ベースの構築物およびフラグメントを調製および使用するための技法は、当技術分野において周知である。抗体を調製および特徴付けするための方法も、当技術分野において周知である（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照、これは参照により本明細書に組み入れられる）。

「ミニ抗体」または「ミニボディー」も、態様を用いた使用のために考えられる。ミニボディーは、ヒンジ領域によってsFvから分離された、C末端にオリゴマー化ドメインを含むsFvポリペプチド鎖である（Pack et al., 1992）。オリゴマー化ドメインは、自己会合性α-ヘリックス、例えばロイシンジッパーを含み、それは、追加的なジスルフィド結合によってさらに安定化することができる。オリゴマー化ドメインは、機能的結合性タンパク質へのポリペプチドのインビボフォールディングを促進すると考えられる過程である、膜通過ベクトルフォールディングに適合するように設計されている。一般的に、ミニボディーは、当技術分野において周知の組換え法を使用して産生される。例えば、Packら（1992）；Cumberら（1992）を参照されたい。

抗体様結合性ペプチド模倣体も態様において考えられる。Liuら（2003）は、切り詰められた抗体として作用し、より長い血清半減期および煩雑さがより少ない合成方法というある特定の利点を有するペプチドである「抗体様結合性ペプチド模倣体」（ABiP）を記載している。

CDRなどの抗原結合性ペプチドに対する代替的な足場も利用可能であり、態様によりDC受容体結合性分子を作製するためにそれを使用することができる。一般的に、当業者は、元の抗体から生じたCDRの少なくとも1つを移植するタンパク質足場の種類を決定する方法を承知している。さらに詳細には、選択されるには、そのような足場は以下の基準（Skerra, 2000）:良好な系統発生的保存性；公知の三次元構造（例えば、結晶学、NMR分光法もしくは当業者に公知の任意の他の技法による）；小さなサイズ；転写後修飾が少ないか、もしくは無い；ならびに／または産生、発現および精製が容易であること、に最も多く適合しなければならないことが公知である。

そのようなタンパク質足場の起源は、フィブロネクチン、優先的にはフィブロネクチンIII型ドメイン10、リポカリン、アンチカリン（Skerra, 2001）、チオレドキシンA、または「アンキリンリピート」（Kohl et al., 2003）、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」および「テトラトリコペプチドリピート」などの繰り返しモチーフを有するタンパク質より選択される構造の可能性があるが、これらに限定されない。例えば、アンチカリンまたはリポカリン誘導体は、様々な標的分子に対して親和性および特異性を有する種類の結合タンパク質であり、そのようなタンパク質は、米国特許出願公開第20100285564号、同第20060058510号、同第20060088908号、同第20050106660号、およびPCT公報WO2006/056464に記載されていて、これらは参照により本明細書に組み入れられる。

例えばサソリ、昆虫、植物、軟体動物などから由来の毒素などの毒素、およびニューロンNOシンターゼタンパク質阻害剤（PIN）由来の足場も、ある特定の局面では使用され得る。

モノクローナル抗体（MAb）は、ある特定の利点、例えば再現性および大規模生産を有すると認知されている。態様には、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギおよびニワトリ起源のモノクローナル抗体が含まれる。

ヒト定常領域ドメインおよび／または可変領域ドメインを担持する、マウス、ラット、または他の種由来のキメラ抗体、二重特異性抗体、組換えおよび操作抗体ならびにそれらのフラグメントと同様に、「ヒト化」抗体も考えられる。本明細書に使用されるように、用語「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（通常はマウスまたはラット）免疫グロブリン由来の1つまたは複数のCDRを含む免疫グロブリンを表す。CDRを提供している非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供しているヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖免疫グロブリンおよびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。いくつかの態様の抗体を説明するために、親和性として公知である、抗体分子がエピトープと結合する強度を測定することができる。抗体の親和性は、結合定数（Ka）または解離定数（Kd）を測定することによって決定され得る。ある特定の態様において有用と見なされる抗体は、約、少なくとも約、もしくは多くとも約10e6、10e7、10e8、10e9もしくは10e10M、またはその中から導き出せる任意の範囲の結合定数を有し得る。同様に、いくつかの態様では、抗体は、約、少なくとも約もしくは多くとも約10e-6、10e-7、10e-8、10e-9もしくは10e-10M、またはその中から導き出せる任意の範囲の解離定数を有し得る。これらの値は、本明細書において論じられた抗体について報告されており、そのような抗体の結合特性を評価するために同じアッセイが使用され得る。

ある特定の態様では、抗体は、組換え抗体である。組換え抗体は、内因的に産生された抗体と異なる。例えば、組換え抗体は、それらのグリコシル化状態に関して異なる（例えば、Jefferis, R. "Glycosylation of Recombinant Antibody Therapeutics" Biotechnol. Prog. 2005, 21:11-16を参照、これは、参照により本明細書に組み入れられる）。

ある特定の態様では、DC受容体に特異的に結合するポリペプチドは、細胞表面上のDC受容体と結合でき、ミエリン鞘タンパク質または成分を提示し、そのことがミエリン鞘タンパク質または成分に対する強い免疫寛容の発生を可能にする。そのうえ、いくつかの態様では、使用されるポリペプチドは、ミエリン鞘タンパク質または成分に対する免疫寛容を提供し、多発性硬化症を防ぐことができる。

1. 抗体を作製するための方法
抗体（例えば、モノクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体）を作製するための方法は、当技術分野において公知である。簡潔には、ポリクローナル抗体は、態様にしたがってDC受容体ポリペプチドまたはその部分を動物に免疫処置すること、および免疫処置された動物から抗血清を収集することによって調製される。

広範な動物種を、抗血清の産生のために使用することができる。典型的には、抗血清の産生のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギである。動物の選択は、当業者に公知のように操作の容易さ、費用または血清の所望の量に応じて決定され得る。抗体は、対象となる免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列に関してトランスジェニックな哺乳動物または植物を作製し、それから回収可能な形態で抗体を産生することによりトランスジェニック産生することもできることが理解されるであろう。哺乳動物でのトランスジェニック産生に関連して、抗体をヤギ、ウシ、または他の哺乳動物の乳汁中に産生させ、そこから回収することができる。例えば、米国特許第5,827,690号、同第5,756,687号、同第5,750,172号、および同第5,741,957号を参照されたい。

同様に当技術分野において周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫応答の非特異的刺激剤の使用によって高めることができる。適切なアジュバントには、サイトカイン、ケモカイン、補因子、毒素、プラスモディウム属原虫（plasmodia）、合成組成物などの、任意の許容される免疫刺激化合物またはそのようなアジュバントをコードするベクターが含まれる。アジュバントは、抗体または抗原送達性の抗体融合タンパク質に化学的にコンジュゲートされ得る。あるいは、アジュバントは、抗体または抗原送達性の抗体融合タンパク質に組換え融合され得る。ある特定の局面では、アジュバントは、コヒーシンまたはドッケリンに化学的にコンジュゲートまたは組換え融合されて、対応するドッケリンまたはコヒーシン結合ドメインを含む任意の他の分子への結合を可能にし得る。

態様にしたがって使用され得るアジュバントには、IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、-インターフェロン、GMCSP、BCG、水酸化アルミニウム、ポリICLC、thur-MDPおよびnor-MDPなどのMDP化合物、CGP（MTP-PE）、リピドAおよびモノホスホリルリピドA（MPL）が含まれるが、これらに限定されない。細菌から抽出された3成分であるMPL、トレハロースジミコレート（TDM）および細胞壁骨格（CWS）を、2％スクアレン／Tween 80エマルション中に含有するRIBIも考えられる。MHC抗原でさえも使用され得る。例示的なアジュバントには、完全フロイントアジュバント（結核菌（Mycobacterium tuberculosis）死菌を含有する、免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロイントアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムアジュバントが含まれ得る。

アジュバントに加えて、T細胞免疫をアップレギュレートまたはサプレッサー細胞活性をダウンレギュレートすることが示されている生物学的応答調節物質（BRM）を同時投与することが望ましい場合がある。そのようなBRMには、シメチジン（CIM; 1200mg/d）（Smith/Kline, PA）；低用量シクロホスファミド（CYP; 300mg/m2）（Johnson/ Mead, NJ）、-インターフェロン、IL-2、もしくはIL-12などのサイトカイン、またはB-7などの免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。

抗体の産生に使用される免疫原組成物の量は、免疫原の性質および免疫処置のために使用される動物に応じて変動する。免疫原を投与するために、皮下、筋肉内、皮内、表皮内、静脈内および腹腔内を含む多様な経路を用いることができるが、これらに限定されない。抗体の産生は、免疫処置後の様々な時点で免疫処置後の動物の血液を採取することによって監視され得る。

第2の追加免疫投与（例えば注射剤の状態で提供される）も与えられ得る。適切な力価が達成されるまで追加免疫処置および力価検定の工程が繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られた場合、免疫処置後の動物を出血させ、血清を単離および保存することができ、かつ／またはMAbを作製するために該動物を使用することができる。

ウサギポリクローナル抗体の産生のために、動物は、耳静脈を経由してまたはその代わりに心穿刺により出血させることができる。取り出された血液を凝固させ、次に遠心分離して、血清成分と全細胞および血餅を分離する。血清を、様々な適用のために使用してもよく、さもなければ、所望の抗体画分を固体マトリックスに結合させた別の抗体もしくはペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーなどの周知の方法によって、または例えばとりわけプロテインAもしくはプロテインGクロマトグラフィーを使用することによって、精製してもよい。

MAbは、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,196,265号に例示される技法のような、周知の技法の使用によって容易に調製され得る。典型的には、この技法は、それが野生型組成物であろうと突然変異型組成物であろうと、選択された免疫原組成物、例えば精製または部分精製されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはドメインを適切な動物に免疫処置することを伴う。免疫組成物は、抗体産生細胞を刺激するために有効な方法で投与される。

モノクローナル抗体（MAb）を作製するための方法は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同じように始まる。いくつかの態様では、マウスおよびラットなどのげっ歯類が、モノクローナル抗体の作製に使用される。いくつかの態様では、ウサギ、ヒツジまたはカエル細胞がモノクローナル抗体の作製に使用される。ラットの使用は周知であり、ある特定の利点を提供し得る（Goding, 1986, pp. 60 61）。マウス（例えばBALB/cマウス）は日常的に使用され、一般的に高率の安定融合体を与える。

一般的に上記のように動物に抗原が注射される。抗原は、フロイント完全または不完全アジュバントなどのアジュバントと混合され得る。同じ抗原または抗原をコードするDNAを用いた追加投与が、約2週間間隔で起こり得る。実施例に論じられるように、抗原は、自然界に見られる抗原配列に比べて改変されている場合がある。

免疫処置後に、抗体を産生する可能性を有する体細胞、具体的にはBリンパ球（B細胞）が、MAb作製プロトコールでの使用のために選択される。これらの細胞は、生検された脾臓、扁桃腺もしくはリンパ節から、または末梢血試料から得ることができる。一般的に、脾臓細胞は、分裂途中の形質芽球段階にある抗体産生細胞の豊富な供給源である。典型的には、末梢血は容易にアクセス可能であるので、末梢血細胞は容易に入手し得る。

いくつかの態様では、動物の集団が免疫処置され、抗体力価が最高の動物の脾臓が取り出され、脾臓をシリンジでホモジェナイズすることによって脾臓リンパ球が得られる。典型的には、免疫処置されたマウスからの脾臓は、リンパ球を約5×10⁷〜2×10⁸個含有する。

免疫処置された動物からの抗体産生Bリンパ球は、次に、不死骨髄腫細胞の細胞、一般的に免疫処置された動物と同じ種の細胞と融合される。ハイブリドーマ産生融合手順における使用に適した骨髄腫細胞系は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、酵素を欠乏している。この欠乏は、そういうわけで、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）だけの成長を支援するある特定の選択培地中で成長不能にする。

当業者に公知の多数の骨髄腫細胞のいずれか1つが使用され得る（Goding, pp. 65 66, 1986; Campbell, pp. 75 83, 1984）。引用）。例えば、免疫処置された動物がマウスの場合、P3 X63/Ag8、X63 Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210 Ag14、FO、NSO/U、MPC11、MPC11 X45GTG1.7およびS194/5XX0 Bulを使用してもよく；ラットについては、R210.RCY3、Y3 Ag1.2.3、IR983Fおよび4B210を使用してもよく；ヒト細胞融合体に関してU266、GM1500 GRG2、LICR LON HMy2およびUC7296がすべて有用である。骨髄腫発現系の議論についてはYooら（2002）を参照されたい。

1つのネズミ骨髄腫細胞は、細胞系リポジトリー番号GM3573を請求することによってNIGMSヒト遺伝子突然変異細胞リポジトリーから容易に入手可能なNS-1骨髄腫細胞系（P3-NS-1-Ag4-1とも呼ばれる）である。使用され得る別のマウス骨髄腫細胞系は、8アザグアニン耐性マウスネズミ骨髄腫SP2/0非産生細胞系である。

抗体産生脾臓細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを作製するための方法は、通常、細胞膜の融合を促進する1つまたは複数の作用物質（化学的または電気的）の存在下で体細胞を骨髄腫細胞と2：1の比で混合することを含むが、その比は、それぞれ約20：1から約1：1まで変動し得る。センダイウイルスを用いる融合方法は、KohlerおよびMilstein （1975; 1976）によって、37％（v/v）ポリエチレングリコール（PEG）などのPEGを使用する方法は、Gefterら（1977）によって記載されている。電気誘導融合方法の使用も適している（Goding pp. 71 74, 1986）。

融合手順は、通常、生存可能なハイブリッドを約1×10-6〜1×10-8の低頻度で産生する。しかし、選択培地中で培養することによって、生存可能な、融合されたハイブリッドが親の未融合の細胞（特に普通は無制限に分裂し続ける未融合の骨髄腫細胞）から区別されるので、これは問題とならない。選択培地は、一般的に、組織培養培地中でのヌクレオチドのデノボ合成を遮断する薬剤を含有する培地である。例示的で好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成を遮断するが、アザセリンはプリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、ヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンが補充される（HAT培地）。アザセリンが使用される場合、培地にヒポキサンチンが補充される。

選択培地はHATである。ヌクレオチドサルベージ経路が機能する能力がある細胞だけがHAT培地中で生存することができる。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の主要酵素、例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）を欠損しており、それらは生存することができない。B細胞ではこの経路が機能し得るが、培養状態での寿命が限られており、一般的に約2週間以内に死滅する。したがって、選択培地中で生存することができる唯一の細胞は、骨髄腫およびB細胞から形成されたハイブリッドである。

この培養は、ハイブリドーマ集団を提供し、そこから特定のハイブリドーマが選択される。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中で細胞を単一クローン希釈して培養し、続いて（約2〜3週間後に）所望の反応性について個別のクローン上清を検査することによって行われる。アッセイは、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなどのように高感度、簡単および迅速であるべきである。

次に、選択されたハイブリドーマは、連続希釈され、個別の抗体産生細胞系にクローニングされ、クローンは、次に無制限に増殖されてMAbを提供することができる。細胞系は、2つの基本的な方法でMAb産生のために活用され得る。第1に、ハイブリドーマの試料は、本来の融合体について体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用された種類の組織適合性動物（例えば同系マウス）に注射することができる（多くの場合、腹腔内に）。任意で、動物は、注射前に炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの油類で初回刺激される。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生される特定のモノクローナル抗体を分泌している腫瘍を発生する。次に、血清または腹水などの動物の体液を利用して、高濃度のMAbを提供することができる。第2に、個別の細胞系は、インビトロ培養することもでき、そこでMAbは、培地中に自然に分泌され、そこからMabは容易に高濃度で得ることができる。

さらに、産生細胞系からの抗体（またはそれ由来の他の部分）の発現は、いくつかの公知の技法を使用して高めることができる。例えば、グルタミンシンセターゼおよびDHFR遺伝子発現系は、ある特定の条件下で発現を高めるための一般的なアプローチである。高発現性細胞クローンは、限界希釈クローニングおよびマイクロドロップ（Microdrop）技法などの従来技法を用いて同定することができる。GS系は、全体的または部分的に、欧州特許第0 216 846号、同第0 256 055号、および同第0 323 997号ならびに欧州特許出願第89303964.4号に関連して論じられている。

いずれかの手段によって産生されたMAbは、所望により濾過、遠心分離、およびHPLCまたはアフィニティークロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー方法を使用してさらに精製され得る。モノクローナル抗体のフラグメントは、そのように産生されたモノクローナル抗体から、ペプシンもしくはパパインなどの酵素を用いた消化を含む方法によって、かつ／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって得ることができる。あるいは、モノクローナル抗体のフラグメントは、自動ペプチド合成装置を使用して合成することができる。

モノクローナル抗体を作製するために分子クローニングアプローチが使用され得ることも考えられる。一態様では、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーが、免疫処置された動物の脾臓から単離されたRNAから調製され、適切な抗体を発現しているファージミドが、抗原を発現している細胞および対照細胞を使用するパニングによって選択される。従来のハイブリドーマ技法に比べたこのアプローチの利点は、1ラウンドで約10e4倍の抗体を産生およびスクリーニングできること、ならびにHおよびL鎖の組合せによって新たな特異性が発生することであり、それにより、適切な抗体を見出す機会がさらに増える。

例えば、Cre介在性部位特異的組換えを使用して、改変免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞のゲノム配列から抗体を発現している細胞を産生する方法を記載している米国特許第6,091,001号に見られるように、抗体を産生させることに関する別の態様が、開示されている。この方法は、最初に、lox部位と、改変された領域に変換される予定のゲノム配列の免疫グロブリン遺伝子座領域に隣接する第1のDNA配列に相同な標的配列とを含む相同性標的化ベクターを抗体産生細胞にトランスフェクトすることを含み、その結果第1のlox部位が部位特異的相同組換えを介してゲノム配列内に挿入される。次に、組み込まれたlox部位とのCre介在性組換えに適した第2のlox部位と、免疫グロブリン遺伝子座領域を改変領域に変換するための改変配列とを含むlox標的化ベクターが細胞にトランスフェクトされる。この変換は、改変配列がlox部位のCre介在性部位特異的組換えを介してゲノム配列内に挿入されるようにlox部位をCreとインビボで相互作用させることによって行われる。

あるいは、モノクローナル抗体フラグメントは、自動ペプチド合成装置を使用して、または完全長遺伝子もしくは遺伝子フラグメントを大腸菌において発現させることによって合成することができる。

モノクローナル抗体は、さらに、感染および／または病状のための処置であることに関連して、特異性、親和性、半減期、免疫原性、結合性会合、結合の解離に関する特性、または全体の機能的特性についてさらにスクリーニングまたは最適化され得ることが考えられる。したがって、モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体である、m抗ASGPR 49C11、m抗ASGPR 4G2.2、m抗ASGPR 5F10、m抗ASGPR 1H11、m抗ASGPR 6.3H9.1D11、m抗ASGPR 5H8.1D4の1、2、3、4、5、または6つのCDRのアミノ酸配列に1、2、3、4、5、6つまたはそれを超える変更を有し得ると考えられる。モノクローナル抗体m抗ASGPR 49C11、m抗ASGPR 4G2.2、m抗ASGPR 5F10、m抗ASGPR 1H11、m抗ASGPR 6.3H9.1D11、m抗ASGPR 5H8.1D4の軽鎖または重鎖可変領域のVJまたはVDJ領域のCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、またはCDR6の位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸は、挿入、欠失、または保存されたアミノ酸もしくは保存されていないアミノ酸との置換を有し得ると考えられる。置換されるまたは置換を構成することができるそのようなアミノ酸は、上記に開示されている。

可変領域の配列からCDRを決定する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Zhao and Lu, "A germline knowledge based computational approach for determining antibody complementarity determining regions." Mol. Immunol., (2010) 47(4):694-700を参照、これは参照により本明細書に組み入れられる）。

いくつかの態様では、全体抗体のフラグメントは、抗原に結合する機能を果たすことができる。結合フラグメントの例は、（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインで構成されるFabフラグメント；（ii）VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント；（iii）単一抗体のVLおよびVHドメインと共に構成されるFvフラグメント；（iv）VHまたはVLドメインで構成されるdAbフラグメント（Ward, 1989; McCafferty et al., 1990; Holt et al., 2003）；（v）単離されたCDR領域；（vi）2つの連結したFabフラグメントを含む2価フラグメントであるF(ab')2フラグメント、（vii）VHドメインおよびVLドメインがペプチドリンカーを介して連結され、それにより2つのドメインが会合して抗原結合部位を形成できる、単鎖Fv分子（scFv）（Bird et al., 1988; Huston et al., 1988）；（viii）二重特異性単鎖Fv二量体（PCT/US92/09965）ならびに（ix）遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性フラグメントである「ダイアボディー」（WO94/13804; Holliger et al., 1993）である。Fv、scFvまたはダイアボディー分子は、VHドメインとVLドメインを連結するジスルフィド架橋の組み入れによって安定化され得る（Reiter et al., 1996）。CH3ドメインと結合したscFvを含むミニボディーも製造され得る（Hu et al. 1996）。この段落における引用文献は、すべて参照により組み入れられる。

抗体には、また、二重特異性抗体が含まれる。二重特異性または二機能性抗体は、2つの異なる可変領域が同分子内で組み合わされる第2世代のモノクローナル抗体を形成している（Holliger, P. & Winter, G. 1999 Cancer and metastasis rev. 18:411-419, 1999）。それらの使用は、それらが新しいエフェクター機能を動員する能力または腫瘍細胞表面上のいくつかの分子を標的指向する能力から、診断分野および治療分野の両方で実証されている。二重特異性抗体が使用されることになっている場合、これらは、多様な方法で製造でき、例えば化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製される従来の二重特異性抗体であり得（Holliger et al, PNAS USA 90:6444-6448, 1993）、または上述の任意の二重特異性抗体フラグメントであり得る。これらの抗体は、化学的方法（Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp et al., J. Hemat. 377-382, 1995）または体細胞法（Staerz U. D. and Bevan M. J. PNAS 83, 1986; et al., Method Enzymol. 121:210-228, 1986）によって得ることができるが、同様にヘテロ二量体化を強制させることを可能にし抗体の精製過程を促進する遺伝子工学技法によっても得ることができる（Merchand et al. Nature Biotech, 16:677-681, 1998）。二重特異性抗体の例には、異なる特異性を有する2つの抗体の結合ドメインを使用でき、短い柔軟なペプチドを介して直接連結できるBiTE（商標）技法の二重特異性抗体が含まれる。これは、短い単一ポリペプチド鎖上に2つの抗体を組合せるものである。ダイアボディーおよびscFvは、Fc領域なしに可変ドメインだけを使用して構築することができ、潜在的に抗イディオタイプ反応の影響を軽減する。この段落の引用文献は、すべて参照により組み入れられる。

二重特異性抗体は、全体IgGとして、二重特異性Fab'2として、Fab'PEGとして、ダイアボディーとしてまたはさもなければ二重特異性scFvとして構築することができる。さらに、当技術分野において公知の日常的な方法を使用して、2つの二重特異性抗体を連結して四価抗体を形成させることができる。

二重特異性全体抗体とは対照的に、二重特異性ダイアボディーも特に有用であり得る。その理由は、それらが大腸菌において容易に構築および発現できるからである。適切な結合特異性のダイアボディー（および抗体フラグメントなどの多数の他のポリペプチド）は、ファージディスプレイ（WO94/13804）を使用してライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディーの1つの腕が、例えばDC受容体に対する特異性に関して一定に保たれるべきならば、もう一方の腕が可変であるライブラリーを作ることができ、適切な特異性の抗体が選択される。二重特異性全体抗体は、Ridgewayら（Protein Eng., 9:616-621, 1996）に記載されているような代替操作法によって作成されることができ、これは参照により本明細書に組み入れられる。

抗体およびポリペプチドコンジュゲート
態様は、少なくとも1つの作用物質と連結されて抗体コンジュゲートもしくはペイロードもしくは融合体を形成する、DC受容体に対する抗体および抗体様分子、ポリペプチドおよびペプチドを提供する。態様は、また、抗体薬物コンジュゲート（ADC）を提供する。診断薬または治療薬としての抗体分子の有効性を増大させるために、少なくとも1つの所望の分子または部分と連結または共有結合または複合体形成させることが慣例的である。そのような分子または部分は、少なくとも1つのエフェクターまたは受容体分子であり得るが、それらに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に結合したエフェクター分子の非限定的な例には、毒素、治療用酵素、抗生物質、放射標識ヌクレオチドなどが含まれる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを用いて検出され得る任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされたレポーター分子の非限定的な例には、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはビオチンなどのリガンドが含まれる。

抗体コンジュゲートのある特定の例は、検出可能な標識に抗体が連結されているコンジュゲートである。「検出可能な標識」は、それらの特定の機能的性質および／または化学的特徴により検出できる化合物および／または元素であって、その使用は、それらが結合した抗体を検出し、かつ／または所望によりさらに定量できるようにする。

抗体コンジュゲートは、ある特定の態様では診断薬として使用される。抗体診断薬は、一般的に多様なイムノアッセイなどのインビトロ診断に使用するための抗体診断薬および／または一般的に「抗体介在性イメージング」として公知のインビボ診断プロトコールに使用するための抗体診断薬の2つのクラスに分類される。多くの適切なイメージング剤が、抗体へのイメージング剤の結合方法と同様に当技術分野において公知である（例えば、米国特許第5,021,236号；同第4,938,948号；および同第4,472,509号を参照、これらは参照により本明細書に組み入れられる）。使用されるイメージング部分は、常磁性イオン；放射性同位体；蛍光色素；NMRで検出可能な物質；X線イメージングの可能性がある。

常磁性イオンの場合、例として、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）および／またはエルビウム（III）などのイオンが言及され得、ガドリニウムが特に好ましい。X線イメージングなどの他の関連で有用なイオンには、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、特にビスマス（III）が含まれるが、これらに限定されない。

治療および／または診断用途のための放射性同位体の場合、アスタチン²¹¹、炭素¹⁴、クロム⁵¹、塩素³⁶、コバルト⁵⁷、コバルト⁵⁸、銅⁶⁷、Eu¹⁵²、ガリウム⁶⁷、水素³、ヨウ素¹²³、ヨウ素¹²⁵、ヨウ素¹³¹、インジウム¹¹¹、鉄⁵⁹、リン³²、レニウム¹⁸⁶、レニウム¹⁸⁸、セレニウム⁷⁵、イオウ³⁵、テクネチウム⁹⁹および／またはイットリウム⁹⁰も使用され得る。¹²⁵Iは、多くの場合に、ある特定の態様で使用され、テクニチウム⁹⁹および／またはインジウム¹¹¹も、多くの場合にそれらの低エネルギーおよび長距離検出への適合性により、使用され得る。放射性標識されたモノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法により産生され得る。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムおよび／またはヨウ化カリウムならびに次亜塩素酸ナトリウムなどの化学的酸化剤またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素的酸化剤との接触によってヨウ素化することができる。モノクローナル抗体は、リガンド交換工程によって、例えばスズ溶液で過テクネチウム酸塩を還元し、還元されたテクネチウムをSephadexカラム上にキレート化し、このカラムに抗体を適用することによってテクネチウム99mで標識され得る。あるいは、例えば、過テクネチウム酸塩、SNCl₂などの還元剤、フタル酸ナトリウム-カリウム溶液などの緩衝溶液、および抗体をインキュベートすることによって、直接標識技法が使用され得る。金属イオンとして存在する放射性同位体を抗体に結合させるために多くの場合に使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）である。

コンジュゲートとしての使用のために考えられる蛍光標識の中に、とりわけAlexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5,6-FAM、フルオレセインイソチオシアネート、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ROX、TAMRA、TET、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドが含まれる。

抗体コンジュゲートには、抗体が、発色基質と接触すると着色産物を発生する二次結合リガンドおよび／または酵素（酵素タグ）に連結されている、主にインビトロ使用を意図したものが含まれる。適切な酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホースラディッシュ）水素ペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。好ましい二次結合リガンドは、ビオチンならびに／またはアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。そのような標識の使用は、当業者に周知であり、例えば、米国特許第3,817,837号；同第3,850,752号；同第3,939,350号；同第3,996,345号；同第4,277,437号；同第4,275,149号および同第4,366,241号に記載されており、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる。

抗体への分子の部位特異的結合のなお別の公知の方法は、ハプテンに基づくアフィニティー標識と抗体の反応を含む。本質的に、ハプテンに基づくアフィニティー標識は、抗原結合部位でアミノ酸と反応することによって、この部位を破壊し、特異的抗原反応を遮断する。しかし、これは抗体コンジュゲートによる抗原結合の喪失を招くので、有利ではない場合がある。

アジド基を含有する分子は、また、低強度紫外線によって発生する反応性ニトレン中間体を経由してタンパク質に共有結合を形成するために使用され得る（Potter & Haley、1983）。特に、プリンヌクレオチドの2-アジド類似体および8-アジド類似体は、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位特異的光プローブとして使用されている（Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985）。2-および8-アジドヌクレオチドも、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインを位置づけるために使用されており（Khatoon et al., 1989; King et al., 1989;およびDholakia et al., 1989）、抗体結合剤として使用され得る。

抗体をそのコンジュゲート部分に結合するまたはコンジュゲートするためのいくつかの方法が、当技術分野において公知である。いくつかの結合方法は、例えば無水ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）；エチレントリアミン四酢酸；N-クロロ-p-トルエンスルホンアミドなどの有機キレート剤；および／または抗体に結合したテトラクロロ-3-6-ジフェニルグリコルリル-3（米国特許第4,472,509号および同4,938,948号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）を採用している金属キレート複合体の使用を伴う。モノクローナル抗体は、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製される。米国特許第4,938,948号において、乳房腫瘍の画像化は、モノクローナル抗体を使用して達成され、検出可能なイメージング部分は、メチル-p-ヒドロキシベンズイミデートまたはN-スクシンイミジル-3-（4-ヒドロキシフェニル）プロピオネートなどのリンカーを使用して抗体に結合している。

いくつかの態様では、抗体結合部位を変更しない反応条件を用いて免疫グロブリンのFc領域にスルフヒドリル基を選択的に導入することによる免疫グロブリンの誘導体化が考えられる。本方法により産生された抗体コンジュゲートは、改善された寿命、特異性および感受性を示すと開示されている（米国特許第5,196,066号、参照により本明細書に組み入れられる）。レポーター分子またはエフェクター分子がFc領域の炭水化物残基にコンジュゲートされる場合のエフェクター分子またはレポーター分子の部位特異的結合も、文献に開示されている（O'Shannessy et al., 1987）。このアプローチは、現在、臨床評価中の診断的および治療的に有望な抗体を産生することが報告されている。

IV. 樹状細胞免疫治療薬
本明細書に使用されるように、「樹状細胞」（DC）は、リンパ組織または非リンパ組織中に見られる、形態が類似の細胞型の多様な集団の任意のメンバーを表す。これらの細胞は、それらの別個の形態、高レベルの表面MHC-クラスII発現によって特徴付けられる（Steinman, et al., Ann. Rev. Immunol. 9:271 (1991)；そのような細胞の説明について参照により本明細書に組み入れられる）。これらの細胞は、いくつかの組織起源から、好都合には本明細書に記載の末梢血から単離することができる。

抗原としてのミエリン鞘タンパク質および成分
ある特定の態様では、任意のミエリン鞘タンパク質または成分（ミエリン鞘タンパク質、糖タンパク質、脂質または糖脂質を含むが、これらに限定されない）は、樹状細胞にミエリン鞘タンパク質または成分を送達するためにDC標的化抗体に組換え融合または化学的にコンジュゲートされ得る。ミエリン鞘タンパク質または成分は、DC標的化抗体と融合した場合に対象において免疫寛容応答を誘発するために十分な、任意のミエリン鞘タンパク質または成分であり得る。ある特定の態様では、免疫応答は、対象を多発性硬化症から保護するために十分である。他の態様では、抗原/標的化抗体融合体によって与えられる保護は、多発性硬化症に関連する症状を抑制または予防するために十分である。

いくつかの態様では、ミエリン鞘タンパク質または成分は、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）である。他の態様では、ミエリン鞘タンパク質または成分は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）である。なお他の態様では、ミエリン鞘タンパク質または成分は、プロテオリピドタンパク質（PLP）である。さらに他の態様では、ミエリン鞘タンパク質または成分は、ミエリン関連糖タンパク質である。さらなる態様では、ミエリン鞘タンパク質または成分は、末梢ミエリンタンパク質（PMP-22）、P₀タンパク質、コネキシン32タンパク質、シュワン細胞ミエリンタンパク質、またはオリゴデンドロサイト-ミエリン糖タンパク質（OMgp）のいずれか1つである。さらなる追加的な態様では、免疫治療薬は、上述の複数の異なるミエリン鞘成分を含む。

樹状細胞特異的抗体
ある特定の局面では、樹状細胞にミエリン鞘タンパク質または成分を標的指向させるために使用される抗体は、樹状細胞特異的抗体である。この目的のために使用され得る抗体の一部は、当技術分野において公知である。

いくつかの態様では、抗ASGPR抗体は、樹状細胞にミエリン鞘タンパク質または成分を標的指向させるために使用される。一例には、抗樹状細胞免疫受容体モノクローナル抗体コンジュゲートであって、抗体を負荷または抗体に化学的に結合した抗原性ペプチドを含むコンジュゲートが含まれる。そのような抗体は、米国特許第8,236,934号に記載されていて、これは参照により本明細書に組み入れられる。

ペプチドリンカー
ある特定の局面では、ペプチドリンカーは、樹状細胞特異的抗体および提示されるべきミエリン鞘タンパク質または成分を連結するために使用される。ペプチドリンカーは、グリコシル化部位を組み入れるか、または二次構造を導入する場合がある。さらに、これらのリンカーは、融合タンパク質の発現または安定性の効率を、結果として樹状細胞への抗原提示の効率を増加させる。リンカーには、

が含まれ得る。これらの例およびその他は、国際公開公報第2010/104747号に論じられており、その内容は、参照により本明細書に組み入れられる。この目的に有用なさらなるリンカーは、US2010/291082に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み入れられる。

ある特定の局面では、抗体ドメイン、アジュバント抗原またはペプチドリンカーは、高親和性相互作用性タンパク質ドメインによって結合され得る。いくつかの態様では、高親和性相互作用性タンパク質ドメインは、コヒーシン-ドッケリン結合対を伴う。コヒーシン-ドッケリン結合対は、抗体ドメイン、アジュバント、抗原またはペプチドリンカーと組換えで融合され得る。いくつかの局面では、ドッケリンは、ポリペプチドの内部（非カルボキシ末端または非アミノ末端）部分に組換えでコードされたときにコヒーシンドメインに結合できるように改変される。ある特定の局面では、リンカー領域はペプチドリンカーではない。非ペプチドリンカー領域の一例は、分子間に形成された共有結合がペプチド結合でない化学的コンジュゲーションの産物として生じ得る。

アジュバント
他の態様では、免疫アジュバントは、免疫治療薬の効力を高めるために、樹状細胞特異的抗体と直接融合またはその他の方法で連結される。ある特定の局面では、免疫アジュバントは、トール様受容体（TLR）アゴニストであり得る。TLRアゴニストは、サルモネラ-エンテリカ（Salmonella enterica）またはコレラ菌（Vibrio cholerae）由来のフラジェリンを含む。ある特定の局面では、アジュバントはフラジェリン-1またはフラジェリン-2である。TLRアゴニストは、ある特定のTLRクラスに特異的であり得（すなわちTLR5、TLR7またはTLR9アゴニスト）、任意の組合せまたは任意の改変として提示され得る。そのような免疫アジュバントの例は、国際公開公報第2012/021834号に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み入れられる。TLR3リガンドであるポリICLCも、ミエリン鞘タンパク質または成分DC標的化免疫治療薬組成物を用いた使用のために考えられる。いくつかの態様では、DC標的化免疫治療薬は、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）、プロテオリピドタンパク質（PLP）、ミエリン関連糖タンパク質、末梢ミエリンタンパク質（PMP-22）、P₀タンパク質、コネキシン32タンパク質、シュワン細胞ミエリンタンパク質、またはオリゴデンドロサイト-ミエリン糖タンパク質（OMgp）を含み、ポリICLCは、抗体抗原融合ポリペプチドと別に送達される。さらなる態様では、免疫治療薬は、上述の1つまたは複数の異なるミエリン鞘成分を含む。一態様では、ポリICLCは、その内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,439,349号に記載されている通りである。一態様では、ポリICLCはHiltonol（登録商標）である。インターロイキンも、樹状細胞特異的抗体または樹状細胞特異的抗体上の対応箇所もしくは相補的ドメインに高い親和性で結合する能力のあるタンパク質ドメインに融合され得るアジュバントとして考えられる。そのようなインターロイキンの非限定的な例は、IL-21、IL-2、IL-9およびIL-10である。いくつかの態様では、インターロイキンタンパク質は、ヒトインターロイキンである。ある特定の局面では、アジュバントは、抗原プロセシングを増強するHLA-DR抗原関連インバリアント鎖である。ある特定の局面では、アジュバントは、インターフェロンαである。なお他の態様では、アジュバントは、同様にミエリン鞘タンパク質または成分を受け取っている細胞にデスシグナルを送達することによって免疫治療薬の効率を増強する毒素である。そのような毒素の一例はPE38である。任意のアジュバントは、DC標的化免疫治療薬と融合もしくはコンジュゲートした形態で送達され得、または融合も直接コンジュゲーションも行わずに同じ組成物もしくは調製物の部分として同時に送達され得る。

寛容原性アジュバント
ある特定の態様では、免疫アジュバントは寛容原性アジュバントであり得る。ある特定の場合では、寛容原性アジュバントは、寛容原性免疫処置のために利用されるアジュバントを表し得、その際、抗原を用いた免疫処置の目的は、免疫処置された対象によって抗原が寛容化されるような免疫応答を発生させることである。ある特定の局面では、寛容原性アジュバントの目標は、抗原に対する寛容がさらに高まるように寛容原性免疫化を高めることである。ある特定の態様では、寛容原性アジュバントは、自己免疫を寛容化するために使用される。なお他の局面では、寛容原性アジュバントは、有害な自己免疫を寛容化するために使用される。いくつかの態様では、寛容原性アジュバントは免疫抑制薬である。なお他の態様では、寛容原性アジュバントは、デキサメタゾン、FK506（タクロリムス）、コレラ毒素Bサブユニット、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンBサブユニット、IFN-β、グルココルチコイド、ビタミンD3、またはビタミンD3類似体である。ある特定の局面では、寛容原性アジュバントは、DC標的化免疫治療薬と同時に投与される。他の局面では、寛容原性アジュバントは、DC標的化免疫治療薬の投与前または投与後に投与される。なお他の態様では、2種以上の寛容原性アジュバントが、DC標的化免疫治療薬の投与前または投与後に同時に投与される。ある特定の局面では、寛容原性アジュバントが、DC標的化免疫治療薬と融合、コンジュゲートまたはその他の方法で連結され得る。一態様では、寛容原性アジュバントは、インターロイキン-10（IL-10）である。別の態様では、IL-10は、DC標的化免疫治療薬と同時投与される。ある特定の局面では、IL-10は、組換え法によって融合される。他の局面では、IL-10はコンジュゲートされる。他の態様では、IL-10は、カップリングまたは他のモジュールドメインによって連結される。

構築物
哺乳動物細胞によって分泌される抗体のH鎖もしくはL鎖またはタンパク質として提示された場合の下記配列は、シグナルペプチドなしのアミノ酸として（すなわち「成熟」分泌タンパク質として）示され、一方でDNA配列は、存在する場合、シグナル配列を含むコード領域全体である。

H鎖構築物のすべての例は、典型的には、合致するL鎖ベクターをCHO細胞に同時トランスフェクションすることに使用される。また、いくつかの態様では、免疫治療薬は、抗ASGPR_49C11、抗CD40 12E12、抗ランゲリン15B10、抗DCIR 9E8、および抗LOX-1 15C4について記載されているヒト化可変領域を有する。

抗ASGPR重鎖および軽鎖は、以下より選択され得る：
抗DC ASGPR mAb
[m抗ASGPR-49C11-7H-LV-hIgG4H-C]

上記配列は、mAb 49C11のH鎖可変領域（下線を付けて示す）とhIgG4のC領域の間のキメラである。
[m抗ASGPR-49C11-7K-LV-hIgGK-C]は、対応するL鎖キメラである（下記配列、可変領域に下線を付ける）

[m抗ASGPR-4G2.2_Hv-V-hIgG4H-C]

上記配列は、mAb 4G2.2のH鎖可変部（下線を付けて示す）とhIgG4のC領域の間のキメラである。
[m抗ASGPR-4G2.2_Kv-V-hIgGK-C]は、対応するL鎖キメラである（下記配列、可変領域に下線を付ける）

[m抗ASGPR-5F10H-LV-hIgG4H-C]は、

である。
上記配列は、mAb 5F10HのH鎖可変部（下線を付けて示す）とhIgG4のC領域の間のキメラである。
[m抗ASGPR-5F10K-LV-hIgGK-C]は、対応するL鎖キメラである（下記配列、可変領域に下線を付ける）

[m抗ASGPR1H11H-V-hIgG4H-C]は、

上記配列は、mAb 1H11のH鎖可変部（下線を付けて示す）とhIgG4のC領域の間のキメラである。
[m抗ASGPR1H11K-LV-hIgGK-C]は、対応するL鎖キメラである（下記配列、可変領域に下線を付ける）。

完全長DC標的化抗体／抗原構築物の例は、以下の通りである：
m抗ASGPR_49C11_7H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMBP
（LV-hIgG4H-C配列に下線を付け、Flex-v1配列を太字で、hMBP配列に二重下線を付けて示す）。

m抗ASGPR_49C11_7K-LV-hIgGK-C
（LV-hIgGK-C配列に下線を付ける）

m抗ASGPR_49C11_7H-LV-hIgG4H-C-hMOG
（LV-hIgG4H-C配列に下線を付け；hMOG配列を太字で示す）

m抗ASGPR_49C11_7K-LV-hIgGK-C
（LV-hIgGK-C配列に下線を付ける）

6×His-コヒーシン-hMOG
（6×Hisに下線を付け；コヒーシンを太字で；hMOGに二重下線を付けて示す）

6×His-コヒーシン-hMBP
（6×Hisに下線を付け；コヒーシンを太字で；hMBPに二重下線を付けて示す）

m抗hASGPR_6.3H9.1D11H-LV-hIgG4H-C-hMOG
（LV-hIgG4H-Cに下線を付け、可変領域を下線付き太字で；hMOGを太字で示す）

m抗hASGPR_6.3H9.1D11K-LV-hIgGK-C
（LV-hIgGK-Cに下線を付け、可変領域を下線付き太字で示す）

m抗hASGPR_5H8.1D4H-LV-hIgG4H-C-hMOG
（LV-hIgG4H-Cに下線を付け、可変領域を下線付き太字で；hMOGを太字で示す）

m抗hASGPR_5H8.1D4K-LV-hIgGK-C
（LV-hIgGK-Cに下線を付け、可変領域を下線付き太字で示す）

DC標的化多発性硬化症免疫治療薬のモジュールドメインの説明
ある特定の局面では、DC標的化多発性硬化症免疫治療薬は、特定の機能に応じて分類された様々なクラスのタンパク質に属するポリペプチドドメインを組合せることによって組み立てられ得る。一般的な意味で、これらのドメインは、抗体、抗体CDR、抗体重鎖、抗体軽鎖、リンカー、抗原、カップリングドメイン、アジュバント、精製タグ、標識タグまたはレポータータグを含むクラスに属し得る。

ドメインの部類の非限定的な例および各部類内の具体例を、表1に示す。（Flglnはフラジェリンの略称である）

（表１）

いくつかの態様では、DC標的化免疫治療薬の成分は、下に示されるように構築され得る（以下の略図について、以下の略称があてはまる：ペプチドリンカー（PL）；抗原（Ag）；タグ（Tg）；カップリングドメイン（CD）；アジュバント（Adj）；抗体（Ab）。略称に続く数字は、構築物内のそのドメインの異なる種類を区別するものである。使用されたハイフン（「-」）は、例えば融合タンパク質の翻訳中に形成されたポリペプチドの2つのドメイン間のペプチド結合などの共有結合を表し得る。共有結合は、また、非限定的に公知の化学的カップリング手段によって形成され得る。ハイフンは、また、高親和性、中親和性、または低親和性の非共有結合性相互作用を表し得る。これらの種類の非共有結合性相互作用の例は、当業者に公知であり、それらには、抗体／抗原相互作用、受容体／リガンド相互作用、アビジン／ビオチン相互作用、コヒーシン／ドッケリン相互作用およびバルナーゼ／バルスター相互作用が含まれるが、これらに限定されない。）：
CD-Ag-Tg；
Ab-Ag-Tg；
Ab-CD-Ag-Tg；
Ab-PL-Ag；
Ab-PL-Ag-Tg；
Ab-PL-Ag(1)-Ag(2)-Tg；
Ab-CD-PL；
Ab-Ag；
Tg-CD-Ag；
Tg-CD-Ag-Tg；
Ab-Adj；
Ab-Adj-Adj；
Tg-CD-Adj；
Tg-CD-Adj(1)-Adj(2)；
CD-Adj；
Ab-PL-Ag-PL-Ag；
PLには、非限定的にペプチドリンカーが含まれる。非ペプチド結合を有するリンカーも考えられる。いくつかの態様では、タグは構築物に不在であるか、または除去されている。

特定の一態様では、抗体-抗原融合タンパク質(Ab.Ag)は、次式を含む:
Ab-(PL-Ag)x；
Ab-(Ag-PL)x；
Ab-(PL-Ag-PL)x；
Ab-(Ag-PL-Ag)x；
Ab-(PL-Ag)x-PL；または
Ab-(Ag-PL)x-Ag
［式中、Abは、DC標的化抗体またはそのフラグメントであり；PLはペプチドリンカーであり；Agはミエリン鞘タンパク質または成分であり；xは、1〜20の整数またはその中から導き出せる任意の範囲である］。PLには、非限定的にペプチドリンカーが含まれる。非ペプチド結合を有するリンカーも考えられる。

一態様では、-(PL-Ag)x、-(Ag-PL)x、-(PL-Ag-PL)x、または-(Ag-PL-Ag)xは、Ab重鎖またはそのフラグメントのカルボキシ末端に位置する。

別の態様では、-(PL-Ag)x、-(Ag-PL)x、-(PL-Ag-PL)x、または-(Ag-PL-Ag)xは、Ab軽鎖またはそのフラグメントのカルボキシ末端に位置する。

一態様では、抗体-抗原複合体(Ab:Ag)は、次式を含む
Ab.Doc:Coh.Ag；
Ab.Coh:Doc.Ag；
Ab.(Coh)x:(Doc.Ag)x；
Ab.(Doc)x:(Coh.Ag)x；
Ab.(Coh.Doc)x:(Doc.Ag¹)(Coh.Ag²)；または
Ab.(Coh)x(Doc)x:(Doc.Ag¹)x(Coh.Ag²)x
［式中、Abは、DC標的化抗体またはそのフラグメントであり；Agは、ミエリン鞘タンパク質または成分であり（Ag¹およびAg²は、2つの異なるミエリン鞘タンパク質または成分である）；Docはドッケリンであり；Cohはコヒーシンであり、xは、1〜10の整数またはその中から導き出せる任意の範囲であり、その直前のカッコ内の分子またはドメインの数を意味する］。ピリオド（「.」）は、2つの分子またはドメインの間の共有結合を意味するために使用される（これらの共有結合の例には、例えば融合タンパク質の翻訳中に形成された、ポリペプチドの2つのドメイン間のペプチド結合が含まれるが、これに限定されない。共有結合は、非限定的に、公知の化学的カップリング手段によっても形成され得る）。コロン（「:」）は、コヒーシンとドッケリンドメインの間の非共有結合性相互作用を意味するために使用される。

IV. 治療法
上述のように、組成物およびこれらの組成物を使用する方法は、自己免疫障害または関連する疾患、特に多発性硬化症に関連する疾患を有する、有する疑いのある、または発症するリスクのある対象を治療する（例えば多発性硬化症を予防するまたは多発性硬化症の自己免疫発作に対する強い免疫寛容を誘発する）ことができる。

本明細書において使用されるように、語句「免疫応答」またはその等価の語「免疫学的応答」は、レシピエント患者における態様のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドに対する体液性応答（抗体媒介性）、細胞性応答（抗原特異的T細胞もしくはそれらの分泌産物によって媒介される）または体液性応答および細胞性応答の両方を表す。処置または治療は、免疫原の投与によって誘導される能動免疫応答、または抗体、抗体含有材料、もしくは初回刺激されたT細胞の投与によって引き起こされた受動療法の可能性がある。

本明細書および添付の特許請求の範囲のために、用語「エピトープ」および「抗原決定基」は、B細胞および／またはT細胞が応答または認識する抗原上の部位を表すために互換的に使用される。B細胞エピトープは、連続アミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって併置される非連続アミノ酸の両方から形成される可能性がある。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒に暴露されても保持され、一方で三次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒で処理されると失われる。エピトープは、典型的には独特の空間コンフォメーションで少なくとも3個、より通常には少なくとも5または8〜10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間コンフォメーションを決定する方法には、Epitope Mapping Protocols（1996）に記載された方法が含まれる。T細胞はCD8細胞に関してアミノ酸約9個またはCD4細胞に関してアミノ酸約13〜15個の連続エピトープを認識する。エピトープを認識するT細胞は、初回刺激されたT細胞によるエピトープに応答した3H-チミジン取込みにより決定される抗原依存性増殖を測定するインビトロアッセイ（Burke et al., 1994）によって、抗原依存性死滅（細胞傷害性Tリンパ球アッセイ、Tigges et al., 1996）によって、またはサイトカイン分泌によって同定することができる。

細胞媒介性免疫学的応答の存在は、増殖アッセイ（CD4（+）T細胞）またはCTL（細胞傷害性Tリンパ球）アッセイによって決定することができる。免疫原の防御効果または治療効果に対する体液性応答および細胞性応答の相対的寄与は、免疫処置された同系動物からIgGおよびT細胞を別々に単離すること、ならびに第2の対象における防御効果または治療効果を測定することによって理解することができる。本明細書および特許請求の範囲に使用されるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、互換的に使用される。

任意で、抗体または好ましくは抗体の免疫学的部分は、他のタンパク質と化学的にコンジュゲートさせる、または他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。本明細書および添付の特許請求の範囲のために、すべてのそのような融合タンパク質は、抗体または抗体の免疫学的部分の定義に含まれる。

一態様では、方法は、自己免疫障害によって引き起こされた疾患または状態のための処置を含む。ある特定の局面では、態様は、多発性硬化症の治療方法を含む。いくつかの態様では、治療は、ミエリン鞘タンパク質または成分の存在下で行われる。さらに、いくつかの例では、治療は、1つまたは複数の免疫抑制化合物などの自己免疫障害に対して通例使用される他の薬剤の投与を含む。

治療用組成物は、投薬製剤と適合する方法で、治療的に有効な量で投与される。投与されるべき量は、処置されるべき対象に依存する。投与が必要な活性成分の正確な量は、診療医の判断に依存する。初回投与および追加免疫に適切な投与計画も変更可能であるが、初回投与およびそれに続くその後の投与によって代表される。

本方法の組成物は、ワクチンまたは抗体を患者に導入するために使用される任意の経路を経由して患者に投与され得る。そのような経路には、非限定的に粘膜または筋肉内送達が含まれる。特定の態様では、組成物は、経鼻的にまたは吸入によって患者に投与される。他の態様では、組成物は、静脈内にまたは静脈内注射によって投与される。さらなる態様では、組成物の投与には、経口、非経口、皮下、筋肉内、静脈内投与、またはそれらの様々な組合せが含まれるが、それらに限定されない。

適用方法は、広く変動し得る。ポリペプチド治療薬の投与のための任意の従来法が適用可能である。これらは、固体の生理学的に許容される基剤上または生理学的に許容される分散物の状態での経口適用、注射などによる非経口適用を含むと考えられる。組成物の投薬量は、投与経路に依存し、対象のサイズおよび健康に応じて変動する。一つの治療計画では、患者は、免疫治療薬の皮下投薬を3週間にわたり毎週、次に追加的な1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12ヶ月にわたり第1週の度に受ける。

ある特定の場合には、組成物の投与を複数回、例えば、2、3、4、5、6回またはそれを超える投与を受けることが望ましい。投与は、1、2、3、4、5、6、7、8週間目に、5、6、7、8、9、10、11、12週間間隔で、その間のすべての範囲を含めて行うことができる。

併用療法
組成物および関連方法、特にDC受容体と結合してミエリン鞘タンパク質または成分もしくはペプチドを患者／対象に送達する抗体の投与は、また、多発性硬化症の有効戦略の施行または伝統的な免疫調節療法と組合せて使用され得る。そのような戦略または治療法は、数ある目標の中で特に、疾患の経過を改変し、増悪を処置し、症状を管理し、または損なわれた機能を改善することに向けられ得る。疾患修飾薬の例には、Aubagio （テリフルノミド）、Avonex（インターフェロンβ-1a）、BetaseronおよびExtavia（インターフェロンβ-1b）、Copaxone（酢酸グラチラマー）、Extavia（インターフェロンβ-1b）、Gilenya（フィンゴリモド）、Novantrone（ミトキサントロン）、Rebif（インターフェロンβ-1a）、Tecfidera（フマル酸ジメチル）、およびTysabri（ナタリズマブ）が含まれるが、これらに限定されない。他の態様では、併用療法で使用されるべき疾患修飾療薬には、フィンゴリモド（Gilenya）、メトトレキサート、アザチオプリン（Imuran）、静脈内免疫グロブリン（IVIg）およびシクロホスファミド（Cytoxan）が含まれるが、これらに限定されない。

場合によっては、併用治療薬は、症状を制御するために使用され得る。多発性硬化症の症状を制御するために使用され得る医薬または治療薬の例には、ダルファムプリジン（Ampyra）、チザニジン（Zanaflex）、ジアゼパム（Valium）、クロナゼパム（Klonopin）、ダントロレン（Dantrium）、バクロフェン（Lioresal）、または任意のベンゾジアゼピン、コリン作動性医薬、またはアマンタジンが含まれるが、これらに限定されない。

一局面では、治療法は、免疫抑制薬と共に使用されることが考えられる。他の局面では、治療法は、疾患修飾薬、症状制御薬または損なわれた機能を改善する薬剤と共に使用される。あるいは、治療法は、他の薬剤の処置から数分〜数週間の範囲の間隔で先行または後続し得る。他の薬剤および／またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドが別々に投与される態様では、治療用組成物が依然として有利に組み合わされた効果を対象に発揮できるように、各送達の時間の間に重大な期間が終了しなかったことが一般的に保証される。そのような場合に、相互に約12〜24時間以内に、より好ましくは相互に約6〜12時間以内に両方の様式が施行され得ることが考えられる。しかし、いくつかの状況では、それぞれの投与の間に数日（2、3、4、5、6または7）から数週間（1、2、3、4、5、6、7または8）が経過する、投与のための期間を顕著に延長することが望ましい場合がある。

治療法の様々な組合せが使用され得、例えば免疫抑制剤療法、疾患修飾薬、症状制御薬、または損なわれた機能を改善するための薬剤は「A」であり、 DC受容体と結合し、ミエリン鞘タンパク質もしくは成分またはそのペプチドもしくはコンセンサスペプチドを送達する抗体を含む抗体免疫治療薬は「B」である。

患者／対象への抗体組成物の投与は、組成物の毒性がもしあれば、その毒性を考慮してそのような化合物を投与するための一般的なプロトコールに従う。処置サイクルは必要に応じて繰り返されると予想される。記載された治療法と組合せて、水分補給などの様々な標準的な治療法が適用され得ることも考えられる。

一般的な薬学的組成物
いくつかの態様では、薬学的組成物は、対象に投与される。異なる局面が、対象に組成物の有効量を投与することを伴い得る。いくつかの態様では、DC受容体と結合し、ミエリン鞘タンパク質もしくは成分またはそのペプチドもしくはコンセンサスペプチドを送達する抗体は、多発性硬化症から防御または多発性硬化症を処置するために患者に投与され得る。あるいは、1つまたは複数のそのような抗体またはポリペプチドまたはペプチドをコードする発現ベクターが、予防的処置として患者に与えられ得る。さらに、そのような組成物は、免疫抑制薬と組合せて投与することができる。そのような組成物は、一般的に薬学的に許容される担体または水性媒質中に溶解または分散される。

語句「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、動物またはヒトに投与された場合に有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を表す。本明細書に使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒質または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除き、免疫原性組成物および治療用組成物へのその使用が考えられる。他の抗感染剤、免疫抑制剤および免疫治療薬などの補助的な活性成分も、組成物中に混合することができる。

活性化合物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、静脈内、筋肉内、皮下を経由した注射用に、または腹腔内経路用にさえ製剤化することができる。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができ；注射前に液体を加えて溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固体形態も調製することができ、調製物を乳化することもできる。

注射用途に適した薬学的剤形には、無菌水溶液または分散物；ゴマ油、ラッカセイ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射液または分散物の即時調製用の無菌粉末が含まれる。すべての場合において、剤形は、無菌でなければならず、容易に注射され得る程度に流動性でなければならない。剤形は、また、製造および保存の状態で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。

タンパク質性組成物は、中性または塩形態に製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）であって、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基由来の可能性がある。

薬学的組成物は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒を含み得る。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散物の場合は必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合に、等張化剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。

無菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を適切な溶液中に、必要に応じて上に挙げられた多様な他の成分と共に混合し、続いて濾過滅菌または等価の手順を行うことによって調製される。一般的に、分散物は、基本分散媒および上に挙げられたものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に様々な無菌活性成分を混合することによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技法である。これにより、活性成分に加えて任意の追加的な所望の成分の粉末が、予め無菌濾過されたその溶液から生じる。

組成物の投与は、典型的には任意の通例の経路を経由する。これには、経口、経鼻、または口内投与が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、または静脈内注射による場合がある。ある特定の態様では、免疫治療薬組成物を吸入してもよい（例えば、米国特許第6,651,655号、これは参照により具体的に組み入れられる）。そのような組成物は、通常は、生理学的に許容される担体、緩衝剤または他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与される。

治療用または予防用組成物の有効量は、意図される目標に基づき決定される。用語「単位用量」または「投薬量」は、対象における使用に適した物理的に別個の単位を表し、各単位は、その投与、すなわち適切な経路および投与計画に関連して上述の所望の応答を産生すると計算された、予め決定された量の組成物を含有する。処置の回数および単位用量の両方に応じて投与されるべき量は、所望の防御に依存する。

組成物の正確な量も、診療医の判断に依存し、各個体に独特である。用量に影響する要因には、対象の身体的および臨床的状態、投与経路、意図される治療の目標（症状の軽減に対する治癒）、ならびに特別な組成物の効力、安定性、および毒性が含まれる。

製剤化の際に、溶液は、投薬製剤と適合するやり方で、治療的または予防的に有効な量で投与される。製剤は、上記の注射用溶液の種類などの多様な投薬剤形で容易に投与される。

IV. 実施例
好ましい態様を実証するために、以下の実施例が含まれる。以下の実施例に開示された技法は、本発明者らによって発見された技法が態様の実施にうまく機能することを表すものであり、したがってそれらの実施のための好ましい様式を構成すると見なすことができることが、当業者によって認識されるべきである。しかし、本開示に照らして、当業者は、開示された具体的な態様に多くの変更を加えることができ、それでも本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果が得られることを認識すべきである。

実施例1 - 抗DC-ASGPR抗体の特徴および応答
すべての動物（合計12匹:1群あたり6匹）に生きたインフルエンザウイルス（H1N1、PR8）を予備免疫処置した。すべての動物からの血清は、HA1特異的IgGを示した（データは示さず）。初回刺激の4ヶ月後に、動物に抗LOX-1-HA1（右腕）および抗LOX-1-PSA（左腕）または抗DC-ASGPR-HA1（右腕）および抗DC-ASGPR-PSA（左腕）のいずれかを皮内（i.d.）に免疫処置した。同じ組換え融合タンパク質を40日間隔で3回免疫処置後に、表示のように血液を採取した。抗DC-ASGPR-HA1を免疫処置された動物からのPBMCは、HA1ペプチドプールに応答して、抗LOX-1-HA1を免疫処置された動物よりも高いレベルのIL-10を分泌した（図2B、上欄）。逆に、抗LOX-1-HA1を免疫処置された動物からのPBMCは、抗DC-ASGPR-HA1を免疫処置された動物よりも有意に高いレベルのIFNγを分泌した（図2B、下欄）。PSA融合タンパク質で初回刺激され、2回追加免疫された動物で同じ発見がなされた。PSA特異的IL-10産生細胞応答が、抗DC-ASGPR-PSAを免疫処置された動物において優先的に開始された（図1B、上欄）。抗LOX-1-PSAを免疫処置された動物は、抗DC-ASGPR-PSAを免疫処置された動物よりも高いPSA特異的IFNγ産生細胞応答を開始した（図1B、下欄）。HA1およびPSAの両方について、IL-10産生細胞応答のピークは、1週間目に得られたが、IFNγ産生細胞応答のピークは3週間目に得られた。まとめると、データから、DC-ASGPRを介したインビボDCへの抗原の標的指向が、抗原特異的IL-10産生T細胞をインビボで確立することができると示されている。

示されたモノクローナル抗体でコーティングされたプレート中で単球由来IFNDCを一晩培養した。細胞を回収し、市販のPCRプライマーを使用するリアルタイムPCRによってIL-10、IL-6およびTNFαのRNA発現レベルを評価した。抗DC-ASGPR抗体の他のクローンに比べて、5H8および49C11は、IL-10の発現増加を招いた。それらは、IL-6およびTNFaのレベル増加も誘導した（図3A）。

ルミネックスアッセイによって培養上清中のIL-10の量を評価した。左欄のデータに一致して、5H8および49C11は、IFNDCを誘導して増加した量のIL-10を分泌した（図3B）。

健康なドナー（n=6）およびMS患者（n=25）からのCD11c+血液DCを、5H8、4G2および49C11で染色した。健康なドナーおよび患者ドナーからのCD11c+ DCは、2つの別個のパターンの抗DC-ASGPR抗体の結合を示し、すべての抗DC-ASGPR抗体は、ドナーの約50％からのCD11c+ DCによく結合し、一方でドナーの残りの50％からのCD11c+ DCは、抗DC-ASGPR抗体の3つのクローンで弱く染色された。しかし、49C11は、その他の2つのクローンよりも良好にCD11c+ DCに結合することができた。それ（49C11）がIL-10を誘導する能力に加えて、49C11は、DCによく結合することができる。したがって、MS抗原と融合されるべきクローンとして49C11を選択した（図4）。

健康なドナーからのCD11c+ DCは、異なる濃度（0、3、10、および30ug/ml）の抗DC-ASGPR-MBPまたはMBP単独で染色された。データから、抗DC-ASGPR-MBPがDCによく結合することが示されている（図6B、上欄）。

健康なドナーおよびMS患者ドナーからのPBMCに、5ug/ml抗DC-ASGPR-MBP融合タンパク質またはMBP単独を負荷した。細胞を7日間インキュベートし、次にMBP由来ペプチドクラスターの存在下でT細胞を48時間再刺激した。T細胞から分泌されたIFNgおよびIL-10をルミネックスによって評価した。MBPに比べて、抗DC-ASGPR-MBPは、健康なドナーおよび患者ドナーの両方にMBP特異的IL-10産生T細胞応答の増加を招いた（図6B、下欄）。

健康なドナーからのCD11c+ DCを異なる濃度（0、3、10、および30ug/ml）の抗DC-ASGPR-MOGまたはMOG単独で染色した。データから、抗DC-ASGPR-MOGがDCによく結合することが示されている（図7A）。

（下欄）MS患者ドナーからのPBMCに5ug/ml抗DC-ASGPR-MOG融合タンパク質またはMBP単独を負荷した。細胞を7日間インキュベートし、次にMBP由来ペプチドクラスターの存在下でT細胞を48時間再刺激した。T細胞から分泌されたIFNgおよびIL-10をルミネックスによって評価した。MOGに比べて、抗DC-ASGPR-MOGは、健康なドナーおよび患者ドナーの両方においてMBP特異的IL-10産生T細胞応答の増加を招いた（図7B）。

実施例2 - NHPにおけるEAE誘導／進行に及ぼす抗DC-ASGPR-MOGの効果
以下の実験結果は、本発明者らと共に研究したRoger Le Grand博士によって親切にも提供されたものである。

非ヒト霊長類（NHP）におけるEAEの発症／進行に及ぼす抗DC-ASGPR-MOGの効果を試験するために、カニクイザルにおけるEAEモデルを使用した。

時に実験的アレルギー性脳脊髄炎と呼ばれる実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、脳炎の動物モデルである。それは、中枢神経系（CNS）の炎症性脱髄疾患である。それは、本来げっ歯類で使用されたので、多発性硬化症および急性散在性脳脊髄炎（ADEM）を含めたヒトCNS脱髄疾患の動物モデルとして広く研究されている。EAEは、一般にT細胞媒介性自己免疫疾患の原型でもある。動物は、以下の臨床徴候および症状の持続期間に応じてスコア付けされる。

実験計画。実験計画を図8にまとめる。群1（実験群：カニクイザル3匹からなる）および群2（対照群：カニクイザル3匹からなる）に、0、28および56日目に不完全フロイントアジュバント中のhMOGを注射した。7、14、21、35、および63日目に実験群1の動物は抗ASGPR-hMOGの注入を受けた。7、14、21、35、および63日目に対照群2の動物は抗ASGPR-hPSAの注入を受た。

抗DC-ASGPR-MOGは、NHPにおけるEAEの発症／進行を抑制する。実験の全期間中に、動物を毎日監視してEAEスコアを測定した。抗DC-ASGPR-MOGで処置された動物（ID番号AP607、CB385、およびCB457）はどれも、疾患のいかなる臨床徴候も示さなかった。これらの動物は、増大したEAE疾患スコアを示さなかった。しかし、対照群の動物3匹（AM637、CB207、および21983）のうち2匹（AM637およびCB207）は、20日目〜37日目（両動物が死亡したとき；図9および10）に増大したEAEスコアを示した。まとめると、本発明者らは、抗DC-ASGPR-MOGがNHPにおけるEAEの発症／進行を抑制することができると結論づける。

対照群（図8の群2）の動物において観察された臨床徴候（図9および10）の原因が脳における炎症であったかどうかをさらに確認するために、22日目の動物AM637の脳の磁気共鳴画像法（MRI）を行った。図11に、静脈内（i.v.）投与されたガドリニウムが分散していることが示されるが、これは、血管において脳内への漏出があったことを示している。T2画像によっても、これは、この動物におけるミエリンが損傷され、したがって水を排除する能力が低下していることを示している。T2およびガドリニウムのデータに加えてフレアデータを考慮して、この動物が、EAEの典型的な徴候である脱髄に加えて、脳に重度の炎症を有したと結論づけた。

まとめると、本発明者らは、1）MOGペプチドおよびアジュバントを免疫処置することによって、カニクイザルがEAEを発症し、2）抗DC-ASGPR-hPSAではなく抗DC-ASGPR-MOGが、カニクイザルにおいてEAEの発症／進行を抑制したことを実証した。

本明細書において開示および請求された方法のすべては、本開示に照らして過度の実験なしに製作および実行できる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様により説明されているものの、本発明の概念、主旨および範囲から逸脱せずに、方法および本明細書に記載の方法の段階または段階の順序に変化が適用され得ることが、当業者に明白であろう。より具体的には、化学的および生理学的の両方で関係するある特定の薬剤が本明細書に記載の薬剤に代用される場合がある一方で、同じまたは類似の結果が達成されることが明白であろう。すべてのそのような類似の代用物および当業者に明白な改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の主旨、範囲および概念の範囲内であると見なされる。

Claims (12)

1. 対象において少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に対する免疫寛容を誘導するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質またはその抗原性フラグメントに結合した樹状細胞抗体またはその標的指向フラグメントを含む樹状細胞標的化複合体を１種または複数種含み、かつ該樹状細胞抗体がアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）と特異的に結合し、かつ該少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）、プロテオリピドタンパク質（PLP）、および／またはミエリン関連糖タンパク質（MAG）である、薬学的組成物。
2. （i）前記薬学的組成物が複数の樹状細胞標的化複合体を含む、
   （ii）前記樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメントが、ペプチドリンカーを使用して、前記少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質もしくはその抗原性フラグメントに結合している、
   （iii）前記薬学的組成物が、少なくとも1つの寛容原性アジュバントをさらに含む、
   （iv）前記樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメントが、結合ポリペプチドを経由して、前記少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質もしくはその抗原性フラグメントに結合している、
   （v）前記薬学的組成物が、2回以上投与される、
   （vi）前記薬学的組成物が、経口的に、静脈内に、皮下に、皮内に、筋肉内に、経鼻的に、注射により、吸入により、粘膜に、および／もしくはネブライザーを使用して、投与される、
   （vii）前記対象が、多発性硬化症の1つまたは複数の症状を示す、
   （viii）前記対象が、多発性硬化症と診断されている、
   （ix）前記対象に、多発性硬化症のリスクがある、ならびに／または
   （x）前記薬学的組成物の投与後に、前記対象におけるMBP、MOG、PLP、もしくはMAGに対する抗体が測定される、
   請求項1記載の薬学的組成物。
3. （a）前記少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質がMBPであるか、または
   （b）前記少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質がMOGである、
   請求項2記載の薬学的組成物。
4. 前記薬学的組成物が複数の樹状細胞標的化複合体を含み、かつ
   （a）該複数の樹状細胞標的化複合体が、異なるミエリン鞘タンパク質を含む、もしくは1つもしくは複数のミエリン鞘タンパク質の異なる抗原性フラグメントを含む、および／または
   （b）各ミエリン鞘タンパク質もしくは抗原性フラグメントが、樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメントに別々に結合している、
   請求項１〜３のいずれか一項記載の薬学的組成物。
5. 前記寛容原性アジュバントが、前記樹状細胞標的化複合体に結合している、請求項2記載の薬学的組成物。
6. （a）前記寛容原性アジュバントが、前記樹状細胞標的化複合体にコンジュゲートされている、または
   （b）前記寛容原性アジュバントが、前記樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメント、および／もしくは前記少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質もしくはその抗原性フラグメントに融合されている、
   請求項２または5記載の薬学的組成物。
7. 前記寛容原性アジュバントが、IL-10、デキサメタゾン、FK506（タクロリムス）、コレラ毒素Bサブユニット、大腸菌（Escherichia coli）熱不安定性エンテロトキシンBサブユニット、IFN-β、グルココルチコイド、ビタミンD3、およびビタミンD3類似体より選択される、請求項2、5、または6のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
8. 前記結合ポリペプチドが、ドッケリン（dockerin）およびコヒーシンである、請求項2記載の薬学的組成物。
9. 対象における多発性硬化症を治療するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物が、少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質またはその抗原性フラグメントに結合した樹状細胞抗体またはその標的指向フラグメントを含む樹状細胞標的化複合体を１種または複数種含み、かつ該樹状細胞抗体がアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）と特異的に結合し、該ミエリン鞘タンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）、プロテオリピドタンパク質（PLP）、および／またはミエリン関連糖タンパク質（MAG）である、薬学的組成物。
10. （i）前記樹状細胞抗体またはその標的指向フラグメントが、MBPもしくはMOGもしくはその抗原性フラグメントに融合されている、
    （ii）前記薬学的組成物が、前記対象に複数回投与される、
    （iii）前記薬学的組成物が、経口的に、静脈内に、皮下に、皮内に、筋肉内に、経鼻的に、注射により、吸入により、粘膜に、および／もしくはネブライザーを使用して、投与される、
    （iv）前記対象が、多発性硬化症の1つまたは複数の症状を示す、
    （v）前記対象が、多発性硬化症と診断されている、
    （vi）前記対象に、多発性硬化症のリスクがある、および／または
    （vii）前記薬学的組成物の投与後に、前記対象における前記少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質に対する抗体が測定される、
    請求項9記載の薬学的組成物。
11. （i）前記樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメントが、ペプチドリンカーを使用して、前記ミエリン鞘タンパク質またはその抗原性フラグメントに結合している、
    （ii）前記薬学的組成物が、少なくとも1つの寛容原性アジュバントをさらに含む、
    （iii）前記薬学的組成物が、少なくとも1つの寛容原性アジュバントをさらに含み、かつ該寛容原性アジュバントが前記樹状細胞標的化複合体に結合している、
    （iv）前記薬学的組成物が、少なくとも1つの寛容原性アジュバントをさらに含み、かつ該寛容原性アジュバントが、前記樹状細胞標的化複合体にコンジュゲートされている、
    （v）前記薬学的組成物が、少なくとも1つの寛容原性アジュバントをさらに含み、かつ該寛容原性アジュバントが、前記樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメントに、および／もしくは前記少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質もしくはその抗原性フラグメントに融合されている、
    （vi）前記薬学的組成物が、少なくとも1つの寛容原性アジュバントをさらに含み、かつ該寛容原性アジュバントが、IL-10、デキサメタゾン、FK506（タクロリムス）、コレラ毒素Bサブユニット、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンBサブユニット、IFN-β、グルココルチコイド、ビタミンD3、およびビタミンD3類似体より選択される、
    （vii）前記樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメントが、結合ポリペプチドを経由して前記少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質もしくはその抗原性フラグメントに結合している、ならびに／または
    （viii）前記樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメントが、結合ポリペプチドを経由して前記少なくとも1つのミエリン鞘タンパク質もしくはその抗原性フラグメントに結合しており、かつ結合ポリペプチドがドッケリンおよびコヒーシンである、
    請求項9記載の薬学的組成物。
12. （i）前記薬学的組成物が複数の樹状細胞標的化複合体を含む、または
    （ii）前記薬学的組成物が複数の樹状細胞標的化複合体を含み、かつ
    （a）該複数の樹状細胞標的化複合体が、異なるミエリン鞘タンパク質を含む、もしくは1つもしくは複数のミエリン鞘タンパク質の異なる抗原性フラグメントを含む、および／もしくは
    （b）各ミエリン鞘タンパク質もしくは抗原性フラグメントが、樹状細胞抗体もしくはその標的指向フラグメントに別々に結合している、
    請求項9記載の薬学的組成物。

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