JP7012004B2 - シヌクレイノパチーの治療のための薬剤、使用および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法施行規則(37 C.F.R.)第1.821条に従う1つまたは複数の配列表(以下参照)を含み、これは、コンピュータ可読媒体(ファイル名:0992_ST25.txt、2016年6月22日に作成され、44kBのサイズを有する)で開示され、このファイルは、全体が参照により本明細書に援用される。
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;および/または
(b)配列番号2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および/または
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;および/または
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;および/または
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および/または
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含むかまたはそれからなるシヌクレイン抗原結合フラグメントを有する。
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号33、34または35のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
を含むかまたはそれからなるシヌクレイン抗原結合フラグメントを有する。
(a)配列番号20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;および/または
(b)配列番号21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および/または
(c)配列番号22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;および/または
(d)配列番号23のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;および/または
(e)配列番号24のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および/または
(f)配列番号25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含むかまたはそれからなるシヌクレイン抗原結合フラグメントを有する。
(i)α-シヌクレインに対する結合親和性(KD)の相違;
(ii)α-シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する能力の相違;
(iii)F28-sncaトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する能力の相違;
(iv)インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα-シヌクレインのレベルを減少させる能力の相違;および/または
(v)慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回復させる能力の相違、
(vi)α-シヌクレインのシーディング(インビトロでのおよび/またはパーキンソン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化α-シヌクレインの蓄積など)を防ぐ能力の相違;および/または
(vii)ヒトの脳における切断α-シヌクレインに結合する能力の相違
を示すアミノ酸配列を(そのCDR、その可変領域、そのフレームワーク残基中またはその定常領域中に)含むシヌクレイン抗原結合フラグメントを有する。
本明細書において使用される際、「α-シヌクレイン」という用語は、「α-シヌクレインタンパク質」と同義であり、α-シヌクレインタンパク質アイソフォーム(例えば、P37840、1-3としてUniProtにおいて同定される)のいずれかを指す。α-シヌクレインのアミノ酸の番号付けは、以下に示されるように配列番号10に対して示され、メチオニン(M)は、アミノ酸残基1である:
i.1~5nMまたは1~2nMなどの、0.5~10nMのα-シヌクレインに対する結合親和性(KD);
ii.α-シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する能力;
iii.F28-sncaトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する能力;
iv.インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα-シヌクレインのレベルを減少させる能力;
v.慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回復させる能力
vi.α-シヌクレインのシーディング(インビトロでのおよび/またはパーキンソン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化α-シヌクレインの蓄積など)を防ぐ能力;および/または
vii.ヒトの脳における切断α-シヌクレインに結合する能力
の1つまたは複数を示す抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
(i)本明細書に記載される本発明の抗体の可変領域または前記領域の抗原結合部分、および
(ii)免疫グロブリンのCH領域またはCH2およびCH3領域を含むその領域
を含む一価抗体であり、ここで、CH領域またはその領域は、ヒンジ領域に対応する領域および、免疫グロブリンがIgG4サブタイプでない場合、CH3領域などのCH領域の他の領域が、ポリクローナルヒトIgGの存在下で、同一のCH領域とともにジスルフィド結合を形成するか、または同一のCH領域とともに他の共有結合または安定した非共有重鎖間結合を形成することが可能なアミノ酸残基を含まないように修飾されている。
(i)α-シヌクレインに対する抗α-シヌクレイン抗体の結合親和性(KD);
(ii)α-シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する、抗α-シヌクレイン抗体の能力;
(iii)F28-sncaトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する、抗α-シヌクレイン抗体の能力;
(iv)インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα-シヌクレインのレベルを減少させる、抗α-シヌクレイン抗体の能力;および
(v)慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回復させる、抗α-シヌクレイン抗体の能力、
(vi)α-シヌクレインのシーディング(インビトロでのおよび/またはパーキンソン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化α-シヌクレインの蓄積など)を防ぐ能力;および/または
(vii)ヒトの脳における切断α-シヌクレインに結合する能力
からなる群から選択される。
(i)α-シヌクレインに対する抗α-シヌクレインモノクローナル抗体の結合親和性(KD);
(ii)α-シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する、抗α-シヌクレインモノクローナル抗体の能力;
(iii)F28-sncaトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する、抗α-シヌクレインモノクローナル抗体の能力;
(iv)インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα-シヌクレインのレベルを減少させる、抗α-シヌクレインモノクローナル抗体の能力;および/または
(v)慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回復させる、抗α-シヌクレインモノクローナル抗体の能力;
(vi)α-シヌクレインのシーディング(インビトロでのおよび/またはパーキンソン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化α-シヌクレインの蓄積など)を防ぐ能力;および/または
(vii)ヒトの脳における切断α-シヌクレインに結合する能力
であり、特に、このような変化した機能性は、構造変化の結果であり、したがってそれと切り離すことができない。
(i)本明細書に定義される抗α-シヌクレイン抗体またはその抗原結合フラグメント、または調製物であって、このような用語が本明細書において定義される際、このような抗α-シヌクレイン抗体またはその抗原結合フラグメントを含む調製物、および
(ii)薬学的に許容できる担体
を含む医薬組成物に関する。
本文および実施例から明らかであろうように、本発明はさらに、以下の実施形態に関する。
(i)1~5nMまたは1~2nMなどの、0.5~10nMのα-シヌクレインに対する結合親和性(KD);
(ii)α-シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する能力;
(iii)F28-sncaトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する能力;
(iv)インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα-シヌクレインのレベルを減少させる能力;
(v)慢性的に投与されるとき、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回復させる能力;
(vi)α-シヌクレインのシーディング(インビトロでのおよび/またはパーキンソン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化αシヌクレインの蓄積など)を防ぐ能力;および/または
(vii)ヒトの脳における切断α-シヌクレインに結合する能力
の1つまたは複数を示す、先行する実施形態のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
a)GFTFSSYAMT(配列番号1)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
b)AIRS(N/S/Q/H)GDRTD YADSVKG(配列番号2、33、34、35)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;または
c)AKNWAPFDS(配列番号3)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または実施形態1~3および6~10に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
a)ASQSVSSSYLA(配列番号4)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
b)GASSRAT(配列番号5)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;または
c)QQYGSSPWT(配列番号6)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または実施形態1~3および6~13に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
a)AASGFTFSRFTMT(配列番号20)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
b)AISGSGGGTS YADSVKG(配列番号21)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;または
c)AKNWAPFDY(配列番号22)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または実施形態1~10に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
d)RASQSVSRSYLA(配列番号23)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;
e)GASSRAT(配列番号24)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列;または
f)QQYGSSPWT(配列番号25)または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または実施形態1~10および20~22のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
1.免疫原およびリガンド産生
以下のタンパク質を、図1に示される免疫原として使用するための取得または産生した。マウスを3つの免疫原で免疫した:完全長組み換えヒトα-シヌクレイン原線維;アミノ酸1~60を含有するヒトα-シヌクレイン組み換えタンパク質(Rpeptide,Bogart,Georgia)およびアミノ酸1~119を含有するヒトα-シヌクレイン組み換えタンパク質。完全長α-シヌクレインから原線維を作製するために、Rpeptide(Bogart,Georgia)製の凍結乾燥製品(カタログ番号S-1001-2)を使用した。これを、1mg/mlのタンパク質の濃度で、20mMのトリスおよび300mMのNaCl緩衝液に溶解させた。原線維を作製するために、7日間にわたって37℃で、Vortemp 56シェーカーインキュベータ(Labnet International,Edison,NJ,USA)において200rpmで各ウェル中に直径70μmのセラミックビーズを含む96ウェルプレート中で、タンパク質溶液を170μlのアリコートでインキュベートし、原線維の形成の後、チオフラビンTを加え、ウェルの1つにおける蛍光を測定した。アミノ酸1~60を含有する組み換えα-シヌクレインを、水に溶解させて、1mg/mlの濃度を得た。
抗体HuMab-シヌクレインは、完全にマウスである抗体の発現を防ぐよう、マウス免疫グロブリン(Ig)重鎖およびマウスκ軽鎖をダブルノックアウトされた、HuMAbマウス株HCo17-BALB/cおよびHCo12-BALB/cマウスの免疫化から得られた(ヒトモノクローナル抗体;Medarex Inc.,San Jose,CA,USA)。様々なマウス株を、ヒトIg重鎖およびヒトIg κ軽鎖遺伝子座の挿入によってトランスジェニックにし、これは、ヒトVH(重鎖の可変領域)およびVL(軽鎖の可変領域)遺伝子の数が異なる。
上に定義される十分な抗原特異的抗体価発現を有するHuMAbマウスを殺処分し、腹部大動脈および大静脈に隣接する脾臓およびリンパ節を採取した。マウス骨髄腫細胞株との脾細胞およびリンパ節細胞の融合は、基本的に製造業者の指示にしたがって、CEEF 50 Electrofusion System(Cyto Pulse Sciences,Glen Burnie,MD,USA)を用いた電気融合によって行った。融合細胞を、HyQ mADCF-Mab(Perbio)中の10%のFetal Clone I Bovine血清(Perbio)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Cambrex)、0.5U/mLのペニシリン、0.5U/mLのストレプトマイシン(Cambrex)、50μMの2-メルカプトエタノール(Invitrogen)、600ng/mLのインターロイキン6(IL-6)(Strathmann)、1×HAT(Sigma)および0.5mg/mLのカナマイシン(Invitrogen)を含有する融合培地に播種した。10日後、上清を収集し、細胞を、HyQ mADCF-Mab中の10%のFetal Clone I Bovine血清、0.5U/mLのペニシリン、0.5U/mLのストレプトマイシン、600ng/mLのIL-6および1×proHT(Cambrex)を含有する収集培地で洗浄した。ハイブリドーマ培養物の上清を、一次スクリーニングアッセイによってスクリーニングした。上清を、8つの異なるリガンドへの結合について特性評価した。これらは、4つのオルソログ:ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザル、ヒトα-シヌクレインβ-シヌクレインおよびヒトγ-シヌクレイン(配列番号37~41)を含み、最後に、それらを、α-シヌクレインの残基120~140が欠如したヒトα-シヌクレイン誘導体に結合するそれらの能力について試験した。
製造業者の指示にしたがって、SMART RACE cDNA Amplificationキット(Clontech)を用いて、全RNAを、0.2~5×106個のハイブリドーマ細胞から調製し、5’-RACE-相補的DNA(cDNA)を、100ngの全RNAから調製した。VHおよびVLコード領域を、PCRによって増幅させ、ライゲーション非依存クローニング(Aslanidis,C.and P.J.de Jong,Nucleic Acids Res 1990;18(20):6069-74)によって、p33G1fおよびp33κ発現ベクター(ヒトIgG1/κ定常領域コード配列を含む)中で、フレーム内で、直接クローニングした。各抗体について、16個のVLクローンおよび16個のVHクローンをシークエンシングした。適切なオープンリーディングフレーム(ORF)を有するクローンを、さらなる研究および発現のために選択した。重鎖および軽鎖の全ての組合せのベクターを、293fectinを用いて、FreestyleTM 293-F細胞中で一時的に共発現させた。
抗体を、一過性トランスフェクション剤としてpTT5ベクターおよびPEIpro(National Research Council of Canada)を用いた、HEK293 6E細胞中でのトランスフェクションによって産生した。簡潔に述べると、重鎖および軽鎖を、PEIpro(VWR)を用いてHEK293細胞へとトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後、細胞にTN1(Sigma)を補充した。生存率が50%に近づくまで細胞を増殖させ、抗体の収量をeasy IgG titre(Thermo)によって測定した。培養物の上清を、0.2μmのデッドエンドフィルタ上でろ過し、5mLのタンパク質Aカラム(rProtein A FF,Amersham Bioscience)に充填し、0.1Mのクエン酸-NaOH、pH3で溶離した。溶出液を、2Mのトリス-HCl、pH9で直ちに中和し、12.6mMのNaH2PO4、140mMのNaCl、pH7.4(B.Braun)に対して一晩(O/N)透析した。透析の後、試料を、0.2μmのデッドエンドフィルタ上で滅菌ろ過した。純度をSDS-PAGEによって決定し、濃度を比濁法および280nmでの吸光度によって測定した。精製された抗体を分割し、-80℃で貯蔵した。
α-シヌクレインへの抗体のリアルタイムの結合を、BIAcore(登録商標)3000を用いて測定した。捕捉表面を、CM5チップ(BIAcore(登録商標))の第1のフローセル(Fc1)および第2のフローセル(Fc2)中で、ポリクローナルウサギ抗マウス抗体(Mouse Antibody Capture Kit(GE Healthcare,Cat.no:BR-1008-38)の一部)をアミンカップリングすることによって調製した。マウス抗体を、約500RUのリガンドレベルを達成するのに必要な濃度で、Fc2中で捕捉した。検体(ASynBAP)を30μl/分でFc1~2中に注入する前に、ベースラインを10分間安定させた。ASynBAPを、それぞれ100~3200nMおよび25~3200RUで試験した。それぞれの一連の滴定における最高濃度は、二連で試験した。各サイクルの最後に、表面を10mMのグリシン-HCl、pH1.7(30秒の注入)で再生して、捕捉されたマウス抗体および検体を除去した。HBS-EP(GE Healthcare,Cat.No:BR-1001-88)を、全ての実験において試験緩衝液および試料希釈剤として使用し、アッセイを25℃で行った。全ての試料を、収集する前に4℃に保持した。
α-シヌクレインに対する抗体のエピトープマッピングを、Pepscan(Pepscan Zuidersluisweg 2 8243 RC Lelystad,the Netherlands)において一連の重複直鎖ペプチドを用いて行った。合成された20量体ペプチドのそれぞれに対する抗体の結合を、Pepscanに基づくELISAにおいて試験した。α-シヌクレインの全コード配列をカバーする直鎖ペプチドアレイ、ならびに酸化メチオニンまたはニトロシル化チロシンを含む全てのペプチドを、(4℃で一晩)一次抗体溶液とともにインキュベートした。洗浄後、ペプチドアレイを、25℃で1時間にわたって1/1000希釈率の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート(SBA,cat.nr.2010-05)とともにインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質2,2’-アジノ-ジ-3-エチルベンゾチアゾリンスルホネート(ABTS)および2μl/mlの3パーセントのH2O2を加えた。1時間後、発色を測定した。発色を、電荷結合素子(CCD)-カメラおよび画像処理システムを用いて定量化した。データ処理のために、標準的な96ウェルプレートELISAリーダーと同様に、0~3000mAUのCCDカメラ範囲からの値を得た。結果を定量化し、Peplabデータベースに保存した。時々、ウェルは、偽陽性値をもたらす気泡を含み、カードを手動で調べて、気泡によって生じる値を0として採点する。それぞれ配列ILEDMPまたはILEDを含有するペプチドへの抗体37および285の結合データが、図7に見られる。
ヒトDLBまたは健常対照(*で印を付けられる)に由来する帯状皮質の粗ホモジネートからのα-シヌクレインに結合し、破壊する抗体の能力を、免疫沈降によって分析した。ヒト帯状皮質に由来する凍結した試料(Tissue Solutions Ltd,Scotlandから入手した)を、低温保持装置中で切断し、100mgの試料を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤(Roche)を含有する1600μlのcellytic M細胞融解試薬(Sigma C2978)に加えた。5000rpmで4×30秒間、Precellysビーズホモジナイザー(Bertin technologies,France)を用いて試料が完全に溶解されるまで、脳組織を均質化した。溶液を3000×gで遠心分離し、上清を免疫沈降のための粗ホモジネートとして使用した。
組み換えα-シヌクレインモノマーおよび原線維は、培養物中で初代ニューロンによって取り込まれ得る。図10に概略的に示されるように、ニューロン中へのα-シヌクレインの取り込みの後、それは、アミノ酸119/122における主要なプロテアーゼ感受性部位で、カルパインIなどの細胞内プロテアーゼによってプロセシングされ得る。プロテアーゼによるα-シヌクレインの切断を調べるために、マウス初代皮質ニューロンを、Elvang et al.2009(Elvang et al..J Neurochem.2009;110(5):1377-87)に記載されるように調製し、星状膠細胞の増殖を阻害するために、DIV3(インビトロで3日間)で、シタラビンで処理した。DIV4(インビトロで4日間)で、ニューロンを、0.7μMの最終濃度の(カップホーン超音波処理器中で、50%の電力で5分間)超音波処理された予め形成されたα-シヌクレイン原線維(PFF)で、単独でまたは示される濃度の抗体と一緒に処理した。24時間のインキュベーションの後、培地を収集し、細胞を溶解させた。ウエスタンブロットを、4B12抗体(図11A)(Pierce MA1-90346)および二次抗マウス抗体を用いて、培地および細胞溶解物の両方において行った。4B12+抗マウスでプローブした後、ブロットを剥がし、抗ヒト-IgG抗体で再度プローブした。4B12でのブロット上では、PFFのみで処理された細胞からの培地において、14および12kDaにおいて強いバンドがあることが分かり、ここで、14kDaが、完全長α-シヌクレイン(FL-asyn)を表し、12kDaが、C末端切断フラグメント1~119/122(CT-asyn)を表す。それに加えて、SDS抵抗性オリゴマー種を表す可能性が最も高い、より高い分子量のバンドがあった。アイソタイプ対照抗体B12による併用処理は、タンパク質分解または取り込みのこのパターンを変化させなかった。
いくつかの研究により、組み換えαシヌクレイン線維状凝集体の外からの添加が、細胞内に入り、内因性α-シヌクレインを動員し(recruit)、LBに類似した、インビトロおよびインビボでのα-シヌクレイン凝集およびリン酸化を誘発し得ることが示されている(Volpicelli-Daley et al.2011,Luk et al.2012a,Luk et al.2012b,Recasens et al.2013,Peelaerts et al.2015)。組み換えα-シヌクレインシードによる内因性マウスα-シヌクレインのシーディングを調べるために、上記のように調製されたマウス初代皮質ニューロンが、96ウェルプレート(ウェル当たり15,000個の細胞)中で平板培養される。インビトロ培養の5日目(DIV)に、培地の50%を交換し、シトシンアラビノシド(1uMの最終濃度)を補充する。インビトロ培養の6日目(DIV6)に、培地の半分を、αシヌクレイン線維性材料、粗原線維シードまたは純粋なシードのいずれかを含むグリア馴化培地と交換する。粗原線維シードは、細菌から単離された組み換えモノマーヒトα-シヌクレインから作製され、モノマーを、Amicon Ultra 100.000カットオフフィルタ(Millipore cat.No UFC510096)に通してろ過し、PBS、pH7.4中1mg/mlの濃度に調整した。原線維粗シードを作製するために、モノマー溶液を、プラトーに達するまで(Thioflavin Sによる毎日の測定によって評価される)、連続混合(800rpm)しながら37Cで、thermomixer中でインキュベートした。蒸発を最小限に抑えるために、溶液を覆うように1滴の鉱油を加えた。インキュベーションの合計時間は5~7日間であり、純粋なシードは、粗原線維シードを遠心分離してそれらを精製したものから作製され、凝集されたペレットを、新鮮なPBS中で再懸濁させ、超音波処理する。抗体を、α-シヌクレイン粗シードとともにDIV6で1回加える。初代ニューロン中の培地の半分を、毎週、グリア馴化培地と交換して、それらをDIV21まで維持する。ニューロンを固定し、アミノ酸S129(abcam 51253)におけるα-シヌクレインのリン酸化に特異的なウサギ抗体、続いて蛍光標識抗ウサギ抗体を用いてホスホ-シヌクレインについて染色し、蛍光を、自動蛍光顕微鏡法、Cellomics Arrayscanを用いて定量化する。核を1つのチャネル内で検出し、有効な細胞の数を定義する。リン酸化α-シヌクレインスポットを、細胞の細胞質を表す核の周りの所定の環形成領域において別のチャネル内で検出した。細胞当たりのスポットの平均数を計算した。細胞染色の例が、図12Aに示される。リン酸化αシヌクレインスポットは、非処理のニューロンでは見られない。粗シードまたは純粋なシード(ウェル当たり1~10ng)とともにインキュベートされたニューロンは、αシヌクレインのリン酸化を誘発する(図12A)。神経突起において、リン酸化シヌクレインは、スポットまたは斑点として現われ、神経突起内のホスホ-シヌクレインの一部は細長く見える。
高い発現レベルのヒトα-シヌクレインが、マウスα-シヌクレインプロモータの制御下で野生型α-シヌクレインを過剰発現するモデルである、F28-sncaトランスジェニックマウスの海馬中に存在する(Westerlund M,et al.Mol Cell Neurosci.2008 Dec;39(4):586-91)。4~6月齢の雄F28-sncaトランスジェニックマウスおよび月齢をマッチさせた対照マウスにおける海馬のCA1領域におけるシナプス伝達および可塑性の評価を、インビボで電気生理学的に行った。データは、基底シナプス伝達が、月齢をマッチさせた対照マウスと比較してF28-sncaトランスジェニックマウスにおいて著しく低下したことを示す(図13)。
プッシュプル微小透析方法を用いて、脳間質液(ISF)におけるヒトα-シヌクレインのレベルを評価した。マウスを、制御された温度(22±1.5℃)および湿度条件(55~65%)において単一の小屋に収容し、12:12時間の明/暗サイクル(06:00hで照明をオンにする)で飼育した。食物および水は自由に摂取可能であった。この試験を、F28-sncaトランスジェニックマウス(50~54週齢)の海馬において行った。海馬における微小透析を可能にするために、マウスにイソフルランで麻酔をかけ、大脳内ガイドカニューレ(CMA)を、脳内に定位に埋め込み、PaxinosおよびFranklin 2001の図解にしたがって、微小透析プローブを海馬内で位置決めした(プローブ先端の配置:ブレグマの3.1mm後方および2.8mm側方、および硬膜に対して1.3mm)。固定ねじおよびアクリルセメントをガイドカニューレの固定に使用した。カニューレの埋め込みの後、マウスを、透析前の2~3日間にわたって外科手術から回復させた。
ラット中脳中のドーパミン作動性ニューロンに対するヒトα-シヌクレインの標的化された過剰発現が、組み換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)を用いて実現可能であり、これは、黒質中のドーパミン性細胞の進行性消失ならびに運動障害に関連している。
野生型マウスの背側線条体への、組み換えタンパク質から作製されたαシヌクレインにより予め形成された原線維の注入は、内因性マウスαシヌクレインを動員し、皮質、へんとう体および黒質中のニューロンの内部のSer-129リン酸化凝集体の形成を誘発する(Luk et al.2012,Science.2012 Nov 16;338(6109):949-53)。α-シヌクレイン特異的モノクローナル抗体GM37が、インビボでのα-シヌクレイン原線維に誘発されるリン酸化αシヌクレイン封入体形成の出現を減少させ得るかどうかを調べるために、合計45匹のマウスを使用した。マウスに、30mg/kg腹腔内(i.p)でGM37、GM37 15mg/kg静脈内(i.v.)、またはビヒクルip(PBS)を投与した。1日後、マウスに麻酔をかけ、既に記載されているように作製された2ulの組み換えヒトα-Syn粗シード(実施例6)(動物当たり合計2μgの粗シード)を片方の脳半球に定位で注入した。粗シードを注入するために、孔を空けることによって頭蓋骨を切開し、接種材料が背側線条体(硬膜の+2.6mm下)に向けられるように右前脳内に単一のガラスピペットを挿入した(配置:ブレグマの+0.5mm前方、正中線の+2.0mm側方)。回復の後、45日で殺処分するまで抗体の腹腔内(i.p.)または静脈内(i.v.)注入をマウスに週に1回受けさせた。15匹のマウス/群の群に、GM37 15mg/kgを静脈内に(iv)、GM37 30mg/kgを腹腔内に(ip)、またはPBS(10ml/kg)を腹腔内に(ip)週に1回投与した。
抗α-シヌクレイン抗体は、患者に使用するための臨床グレード材料を製造するのに使用される製造条件を模倣する条件下で、哺乳動物細胞培養物中で産生される。このように産生されたタンパク質は、抗体の治療有効性ならびに経時的な抗体の安定性に影響を与える生物物理学的特性の両方に影響を与え得る翻訳後修飾を起こすことが周知である。数十年の研究から確認された経験的知識により、特定の分子の発現性(developability)のリスクを生じることが知られている一連の翻訳後修飾が確認された。これらの翻訳後修飾は、重鎖および軽鎖タンパク質の一次配列中に存在するアミノ酸鎖と相関することが示されている。これらの配列を同定し、それらが治療用抗体の製造可能性および発現性に与える潜在的リスクを決定し得るアルゴリズムが作成された。
ともに温度を着実に上昇させ、凝集のレベルを、多角度光散乱(Prometheus
NT.48,NanoTemper Technologies)によって同時に測定し
た。凝集開始の温度は、GM37およびGM37-変異体について同様であることが分か
ったが、凝集の最も低いレベルは、GM37-Var2について観察された(図27)。
本発明は以下の態様を含み得る。
[1]
ヒトα-シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体であって、
ヒトα-シヌクレイン(配列番号10)のアミノ酸112~117(配列番号9(ILE
DMP))内のエピトープに結合する抗体、または前記エピトープに結合するその抗原結
合フラグメント。
[2]
前記抗体が、前記エピトープへの結合について、配列番号8の軽鎖可変領域および配列
番号7、30、31または32の重鎖可変領域を含む抗体と競合することが可能である、
請求項1に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
[3]
ヒトα-シヌクレイン(配列番号10))のアミノ酸112~115(配列番号19(
ILED)内のエピトープに特異的に結合することが可能である、請求項1に記載のモノ
クローナル抗体、または前記エピトープに結合するその抗原結合フラグメント。
[4]
前記抗体が、前記エピトープへの結合について、配列番号26の重鎖可変領域および配
列番号27の軽鎖可変領域を含む抗体と競合することが可能である、請求項1または3に
記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
[5]
無傷の抗体を含むかまたはそれからなる、請求項1~4のいずれか一項に記載のモノク
ローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
[6]
前記モノクローナル抗体が、サブタイプIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4
の抗体からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載のモノクローナル
抗体、またはその抗原結合フラグメント。
[7]
Fvフラグメント(例えば一本鎖Fvおよびジスルフィド結合Fv)、Fab様フラグ
メント(例えばFabフラグメント、Fab’フラグメントおよびF(ab)2フラグメ
ント)およびドメイン抗体(例えば単一のVH可変領域またはVL可変領域)からなる群
から選択される抗原結合フラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項1~6のいず
れか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
[8]
前記抗体または抗原結合フラグメントが、以下の特性:
a)1~5nMまたは1~2nMなどの、0.5~10nMのα-シヌクレインに対す
る結合親和性(KD);
b)α-シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する能力;
c)F28-sncaトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改
善する能力;
d)インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα-シヌクレインのレ
ベルを減少させる能力;
e)慢性的に投与されるとき、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回復
させる能力;
f)α-シヌクレインのシーディング(インビトロでのおよび/またはパーキンソン病
のマウスモデルにおける不溶性リン酸化αシヌクレインの蓄積など)を防ぐ能力;および
/または
g)ヒトの脳における切断α-シヌクレインに結合する能力
の1つまたは複数を示す、請求項1~7のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、ま
たはその抗原結合フラグメント。
[9]
ヒト、ヒト化、組み換えまたはキメラ抗体である、請求項1~8のいずれか一項に記載
のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
[10]
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、モノクローナル抗体または請求項1~2および5~9のいずれか一項に記載のモ
ノクローナル抗体、またはそのフラグメント。
[11]
配列番号7の重鎖可変領域または配列番号8の軽鎖可変領域を含む、請求項10に記載
のモノクローナル抗体。
[12]
配列番号7の可変領域からなる重鎖および配列番号8の可変領域からなる軽鎖を含む、
請求項11に記載のモノクローナル抗体。
[13]
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号33のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、モノクローナル抗体または請求項1~2および5~9のいずれか一項に記載のモ
ノクローナル抗体、またはそのフラグメント。
[14]
配列番号30の重鎖可変領域または配列番号8の軽鎖可変領域を含む、請求項13に記
載のモノクローナル抗体。
[15]
配列番号30の可変領域からなる重鎖および配列番号8の可変領域からなる軽鎖を含む
、請求項14に記載のモノクローナル抗体。
[16]
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号34のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、モノクローナル抗体または請求項1~2および5~9のいずれか一項に記載のモ
ノクローナル抗体、またはそのフラグメント。
[17]
配列番号31の重鎖可変領域または配列番号8の軽鎖可変領域を含む、請求項16に記
載のモノクローナル抗体。
[18]
配列番号31の可変領域からなる重鎖および配列番号8の可変領域を含む、請求項17
に記載のモノクローナル抗体。
[19]
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号35のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、モノクローナル抗体または請求項1~2および5~9のいずれか一項に記載のモ
ノクローナル抗体、またはそのフラグメント。
[20]
配列番号32の重鎖可変領域または配列番号8の軽鎖可変領域を含む、請求項19に記
載のモノクローナル抗体。
[21]
配列番号32の可変領域からなる重鎖および配列番号8の可変領域を含む、請求項20
に記載のモノクローナル抗体。
[22]
(a)配列番号20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;
(c)配列番号22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3;
(d)配列番号23のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(e)配列番号24のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(f)配列番号25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、モノクローナル抗体または請求項1、3および5~9のいずれか一項に記載のモ
ノクローナル抗体、またはそのフラグメント。
[23]
配列番号26の重鎖可変領域または配列番号27の軽鎖可変領域を含む、請求項22に
記載のモノクローナル抗体。
[24]
配列番号26の可変領域からなる重鎖および配列番号27の可変領域を含む、請求項2
3に記載のモノクローナル抗体。
[25]
請求項1~24のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む調製物であって、前
記調製物が、α-シヌクレインに結合することが可能でないかまたは前記調製物の抗α-
シヌクレイン機能性を実質的に変更しない自然発生する抗体を実質的に含まず、前記機能
性が、
(i)α-シヌクレインに対する前記抗α-シヌクレイン抗体の結合親和性(KD);
(ii)α-シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する、前記抗α-シヌクレ
イン抗体の能力;
(iii)F28-sncaトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障
害を改善する、前記抗α-シヌクレイン抗体の能力;
(iv)インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα-シヌクレイン
のレベルを減少させる、前記抗α-シヌクレイン抗体の能力;
(v)慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を
回復させる、前記抗α-シヌクレイン抗体の能力、
(vi)α-シヌクレインのシーディング(インビトロでのおよび/またはパーキンソ
ン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化αシヌクレインの蓄積など)を防ぐ能力;ま
たは
(vii)ヒトの脳における切断α-シヌクレインに結合する能力
からなる群から選択される調製物。
[26]
請求項1~24のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む調製物であって、前
記モノクローナル抗体が、天然抗α-シヌクレイン抗体の構造と比べて、そのアミノ酸配
列の構造変化を有し、前記構造変化により、前記モノクローナル抗体が、前記天然抗α-
シヌクレイン抗体によって示される機能性と比べて変化した機能性を示し、前記機能性が
、
(i)α-シヌクレインに対する前記抗α-シヌクレインモノクローナル抗体の結合親
和性(KD);
(ii)α-シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する、前記抗α-シヌクレ
インモノクローナル抗体の能力;
(iii)F28-sncaトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障
害を改善する、前記抗α-シヌクレインモノクローナル抗体の能力;
(iv)インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα-シヌクレイン
のレベルを減少させる、前記抗α-シヌクレインモノクローナル抗体の能力;
(v)慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を
回復させる、前記抗α-シヌクレインモノクローナル抗体の能力;
(vi)α-シヌクレインのシーディング(インビトロでのおよび/またはパーキンソ
ン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化αシヌクレインの蓄積など)を防ぐ能力;ま
たは
(vii)ヒトの脳における切断α-シヌクレインに結合する能力
からなる群から選択される調製物。
[27]
請求項1~24のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または請求項25~26の
いずれか一項に記載の調製物、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
[28]
請求項10~24のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントをコードする核酸。
[29]
治療に使用するための、請求項1~24のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、
またはその抗原結合フラグメント、または請求項25~26のいずれか一項に記載のその
調製物。
[30]
シヌクレイノパチーを治療するのに使用するための、請求項1~24のいずれか一項に
記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントまたは請求項25~26の
いずれか一項に記載のその調製物。
[31]
パーキンソン病、特発性および遺伝性のパーキンソン病、ゴーシェ病(GD)、びまん
性レビー小体病(DLBD)、レビー小体変異型アルツハイマー病(LBV)、複合され
たアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症または多系統萎縮症を治
療するのに使用するための、請求項30に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結
合フラグメント。
[32]
薬剤の製造に使用するための、請求項1~24のいずれか一項に記載のモノクローナル
抗体、またはその抗原結合フラグメントまたは請求項25~26のいずれか一項に記載の
その調製物。
[33]
パーキンソン病(特発性および遺伝性のパーキンソン病を含む)、ゴーシェ病(GD)
、びまん性レビー小体病(DLBD)、レビー小体変異型アルツハイマー病(LBV)、
複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症または多系統萎
縮症を治療するのに使用するための、請求項32に記載の薬剤。
[34]
被験体におけるパーキンソン病または他のシヌクレイノパチーを治療する方法であって
、請求項1~24のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグ
メント、または請求項25~26に記載の調製物または請求項27に記載の医薬組成物を
、有効量で前記被験体に投与する工程を含む方法。
[35]
前記治療が長期である、請求項34に記載の方法。
[36]
前記長期治療が、少なくとも2週間にわたる、請求項35に記載の方法。
[37]
前記被験体がヒトである、請求項34に記載の方法。
[38]
治療に使用するための、請求項1~24のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原
結合フラグメント、または請求項25~26のいずれか一項に記載の調製物、または請求
項27に記載の医薬組成物を含むキット。
[39]
検出可能に標識される、請求項1~24のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、
またはその抗原結合フラグメント。
[40]
前記検出可能な標識が、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識、放射性同位体標識また
は酵素標識である、請求項39に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント
。
[41]
被験体の脳における前記α-シヌクレインの存在または量を検出または測定するのに使
用するための、請求項39~40のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗原
結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
[42]
前記検出または測定が、前記α-シヌクレインに結合された前記抗シヌクレイン抗体の
インビボイメージングを含む、請求項39~41のいずれか一項に記載のモノクローナル
抗体、その抗原結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
[43]
前記検出または測定が、前記α-シヌクレインに結合された、前記抗シヌクレイン抗体
または前記その抗原結合フラグメントのエクスビボイメージングを含む、請求項39~4
1のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、調製物また
は医薬組成物。
[44]
シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングするための薬剤の製造に使用する
ための、請求項1~24のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結
合フラグメント、または請求項25~26のいずれか一項に記載の調製物、または請求項
27に記載の医薬組成物、または請求項39~40のいずれか一項に記載のモノクローナ
ル抗体またはその抗原結合フラグメント、または調製物または医薬組成物の使用。
[45]
前記薬剤が、パーキンソン病(特発性および遺伝性のパーキンソン病を含む)、ゴーシ
ェ病(GD)、びまん性レビー小体病(DLBD)、レビー小体変異型アルツハイマー病
(LBV)、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症お
よび多系統萎縮症を治療するのに使用するためのものである、請求項44に記載のモノク
ローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント、または調製物または医薬組成物の使用
。
[46]
被験体におけるパーキンソン病または他のシヌクレイノパチーを治療、診断またはイメ
ージングする方法であって、請求項1~24のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体
、またはその抗原結合フラグメント、または請求項25~26のいずれか一項に記載の調
製物、請求項27に記載の医薬組成物、または請求項39~40のいずれか一項に記載の
モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント、調製物または医薬組成物を、有
効量で前記被験体に投与する工程を含む方法。
[47]
前記治療が長期である、請求項46に記載の方法。
[48]
前記長期治療が、少なくとも2週間にわたる、請求項47に記載の方法。
[49]
前記被験体がヒトである、請求項48に記載の方法。
[50]
被験体の脳または体液中の前記α-シヌクレインの存在または量を検出または測定する
のに使用するための、請求項39~40のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、そ
の抗原結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
[51]
前記検出または測定が、前記α-シヌクレインに結合された前記抗シヌクレイン抗体の
インビボイメージングを含む、請求項50に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フ
ラグメント、調製物または医薬組成物。
[52]
前記検出または測定が、前記α-シヌクレインに結合された、前記抗シヌクレイン抗体
または前記その抗原結合フラグメントのエクスビボイメージングを含む、請求項51に記
載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
[53]
ヒト細胞株、非ヒト哺乳動物細胞株、昆虫、酵母または細菌細胞株などの細胞株におい
て生産または製造された、請求項1~24のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原
結合フラグメント。
[54]
CHO細胞株、HEK細胞株、BHK-21細胞株、マウス細胞株(骨髄腫細胞株など
)、線維肉腫細胞株、PER.C6細胞株、HKB-11細胞株、CAP細胞株およびH
uH-7ヒト細胞株において生産される、請求項53に記載の抗体、またはその抗原結合
フラグメント。
[55]
配列番号18に定義される定常領域および配列番号17に定義されるκ定常領域を含む
、請求項1~21のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメン
ト。
[56]
配列番号28に定義される定常領域および配列番号29に定義されるκ定常領域を含む
、請求項22~24のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメ
ント。
Claims (17)
- (a)配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3
を含む、ヒトα-シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 配列番号7の重鎖可変領域および配列番号8の軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- (a)配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1;
(b)配列番号33のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3
を含む、ヒトα-シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 配列番号30の重鎖可変領域および配列番号8の軽鎖可変領域を含む、請求項3に記載のモノクローナル抗体。
- (a)配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1;
(b)配列番号34のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3
を含む、ヒトα-シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 配列番号31の重鎖可変領域および配列番号8の軽鎖可変領域を含む、請求項5に記載のモノクローナル抗体。
- (a)配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1;
(b)配列番号35のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3
を含む、ヒトα-シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 配列番号32の重鎖可変領域および配列番号8の軽鎖可変領域を含む、請求項7に記載のモノクローナル抗体。
- (a)配列番号20のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1;
(b)配列番号21のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2;
(c)配列番号22のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3;
(d)配列番号23のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1;
(e)配列番号24のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2;および
(f)配列番号25のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3
を含む、ヒトα-シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 配列番号26の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域を含む、請求項9に記載のモノクローナル抗体。
- 無傷の抗体を含むかまたはそれからなる、請求項1~10のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、サブタイプIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の抗体からなる群から選択される、請求項1~11のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- Fvフラグメント、Fab様フラグメントおよびFabフラグメントからなる群から選択される抗原結合フラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項1~10のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒト、組み換えまたはキメラ抗体である、請求項1~13のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1~14のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントをコードする核酸。
- 治療に使用するための、請求項1~14のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- シヌクレイノパチー、またはパーキンソン病、特発性および遺伝性のパーキンソン病、ゴーシェ病(GD)、びまん性レビー小体病(DLBD)、レビー小体変異型アルツハイマー病(LBV)、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症または多系統萎縮症を治療するのに使用するための、請求項1~14のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
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