JP7138322B2 - シヌクレイノパチーの治療のための薬剤、使用および方法 - Google Patents

Description

本発明は、α－シヌクレインに特異的に結合する新規な種類のモノクローナル抗体、な
らびにシヌクレイノパチーの治療および診断にこれらの分子およびそれらのα－シヌクレ
イン結合フラグメントを使用する方法に関する。

配列表の参照：
本出願は、米国特許法施行規則（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．）第１．８２１条に従う１つまた
は複数の配列表（以下参照）を含み、これは、コンピュータ可読媒体（ファイル名：０９
９２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１６年６月２２日に作成され、４４ｋＢのサイズを有する
）で開示され、このファイルは、全体が参照により本明細書に援用される。

レビー小体病（ＬＢＤ）としても知られているシヌクレイノパチーは、タンパク質α－
シヌクレインが主要成分であるレビー小体（ＬＢ）および／またはレビー神経突起として
顕微鏡で見られる細胞内のタンパク質凝集体の堆積によって特徴付けられる（Ｊｅｌｌｉ
ｎｇｅｒ，Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ．２０１２ Ｊａｎ；２７（１）：８－３０；ＭｃＫｅ
ｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６）４７：１１１３－２４）。シヌ
クレイノパチーとしては、パーキンソン病（ＰＤ）（特発性および遺伝性のパーキンソン
病を含む）およびびまん性レビー小体（ＤＬＢ）病（レビー小体認知症（ＤＬＢ）として
も知られている、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイ
マー病およびパーキンソン病（ＣＡＰＤ）、純粋自律神経不全症（ＰＡＦ）および多系統
萎縮症（ＭＳＡ；例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレ
ーガー症候群））が挙げられる。シヌクレイノパチーは、パーキンソン病における主要な
運動障害（固縮、運動緩徐、安静時振戦）の原因となるドーパミン作動性黒質線条体系の
変性を有することが多いが、中枢神経系、末梢神経系および自律神経系および脳領域なら
びに認知症および自律神経系障害などの非運動機能障害に関連する他の器官におけるレビ
ー小体および変性レビー神経突起の広範な発生もある。非運動兆候および症状のいくつか
は、パーキンソン病および他のシヌクレイノパチーにおいて運動症状に先立って起こるも
のと考えられる。このような初期兆候としては、例えば、レム睡眠行動障害（ＲＢＤ）お
よび嗅覚の低下および便秘が挙げられる（Ｍａｈｏｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏ
ｌｏｇｙ（２０１０）７５：４８８－４８９）。シヌクレイノパチーは、高齢化する人口
において運動障害および認知力低下の一般的な原因であり続けている（Ｇａｌａｓｋｏ
ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９４）５１：８８８－９５）。

α－シヌクレインは、β－およびγ－シヌクレインおよびシノレチン（ｓｙｎｏｒｅｔ
ｉｎ）を含むタンパク質のファミリーの１つである。α－シヌクレインは、シナプスに関
連して正常な状態で発現され、シナプス小胞放出を調節し、それによって、神経伝達、可
塑性、学習および記憶に影響を与えるのに役割を果たすものと考えられる。

いくつかの研究により、α－シヌクレインがＰＤ発症に中心的役割を果たすことが示唆
されている。タンパク質は、病的状態において、凝集して細胞内の不溶性原線維を形成し
得る。例えば、ＬＢにおいてシヌクレインが蓄積する（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８８：８３９－４０；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２：３６７－７２；Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９７）２３９：４５－８）。稀な家族
性パーキンソン病では、α－シヌクレイン遺伝子の突然変異ならびにこの遺伝子の重複お
よび三重重複（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が共分離する（Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．
，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．（１９９８）１８：１０６－８；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏ
ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２０４５－７）。α－シヌクレ
インが、細胞外液中に分泌され、血漿および脳脊髄液（ＣＳＦ）中に存在し得るという重
要な発見があった。例えばＰａｃｈｅｃｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）およびその他（Ｐ
ａｃｈｅｃｏ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１５ Ｍａｒ；１３２（６）
：７３１－４；Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ（２０００）９７：５７１－５７６；Ｖｏｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．４２：７８７１－７８７８，２００３）によるいくつかの研究により、細胞外シ
ヌクレインが、脳において病因的役割を果たすことが示唆されている。それらの研究によ
り、細胞外α－シヌクレインオリゴマーが、脳神経細胞膜に対して神経毒性を有すること
が実証された。シヌクレイン分泌のデータに基づいた別の興味深い仮説は、α－シヌクレ
インのプリオン様の広がりが、パーキンソン病および他のシヌクレイノパチーの進行の根
底にあるというものである（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒ
ｏｌ．２０１４ Ｆｅｂ；１０（２）：９２－８；Ｈａｎｓｅｎ ａｎｄ Ｌｉ ２０１
２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１２ Ｍａｙ；１８（５）：２４８－５５）。
これらの発見により、細胞外シヌクレインが、免疫療法によって標的にされ得るという期
待が生じた（Ｖｅｋｒｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ
．２０１１ Ｎｏｖ；１０（１１）：１０１５－２５）。

天然α－シヌクレイン自己抗体は、ＰＤ患者および健常対照の両方において存在するこ
とが示されており（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．２０１２，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；
７（１２）：ｅ５２２８５；Ｍａｅｔｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４，ＰＬｏＳ Ｏｎ
ｅ．２０１４ Ｆｅｂ ２１；９（２）：ｅ８８６０４，Ｐａｐａｃｈｒｏｎｉ ｅｔ
ａｌ．２００７ Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００７ Ｍａｙ；１０１（３）：７４９－
５６およびＷｏｕｌｆｅ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００２ Ｍａ
ｙ １４；５８（９）：１４３５－６）、場合により、ＰＤにおいてα－シヌクレインに
対する自己抗体の増加されたレベル（Ｇｒｕｄｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｊ Ｎｅｕ
ｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ Ａｐｒ；２３３（１－２）：２２１－７，Ｇｒｕｄｅｎ
ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．２０１２；１
９（６）：３３４－４２およびＹａｎａｍａｎｄｒａ ２０１１，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２
０１１ Ａｐｒ ２５；６（４）：ｅ１８５１３）、または健常対照と比較してＰＤ患者
におけるα－シヌクレインに対する減少された自己抗体が報告された（Ｂｅｓｏｎｇ－Ａ
ｇｂｏ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１３ Ｊａｎ ８；８０（２
）：１６９－７５）。血中抗α－シヌクレイン自己抗体が、α－シヌクレイン凝集に関し
て保護的役割を果たし得る可能性が、この自己抗体の発見後、ごく早々に示唆された（Ｗ
ｏｕｌｆｅ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００２ Ｍａｙ １４；５
８（９）：１４３５－６）。

トランスジェニックマウスにおけるα－シヌクレインの過剰発現は、レビー小体病のい
くつかの病理学的側面に類似している。α－シヌクレインを過剰発現するマウスのいくつ
かの異なる遺伝子導入系が、過去１０年間で作成された（以下の報告に記載されている：
Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１４，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ｍａｙ ３１；
８（５）：ｅ６４６４９；Ｆｌｅｍｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓｅｌｅｔ，２００６，Ｂ
ｅｈａｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６ Ｓｅｐ；１７（５－６）：３８３－９１；Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｋａｈｌｅ ２００６，Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ Ｒｅｐ．２００６ Ｓｅｐ；６（５）：４３２－６）。Ｔｈｙ－１およびＰＤＧ
Ｆ－βプロモータを有するマウス系統が、運動障害および認知障害を発症し、インビボで
α－シヌクレインに対する抗体の神経保護的効果を実証するのに使用されている。しかし
ながら、ドーパミン作動性ニューロンの確固たる変性を有する遺伝子導入系はなく、多く
の場合、運動表現型が、運動ニューロンにおける発現によって駆動され、これは、通常、
パーキンソン病において悪化しない。したがって、潜在的疾患調節治療の好結果が、ドー
パミン作動性ニューロンまたは他の中枢神経系ニューロンに対する効果を介して仲介され
るかどうかは定かではない。

トランスジェニックマウスモデルにおける１つに確固たる発見は、ヒトα－シヌクレイ
ンの慢性過剰発現が、シナプス機能を損なうというものであった。インビトロおよびイン
ビボ系の両方における研究を用いて、野生型（ｗｔ）ヒトα－シヌクレインの過剰発現が
、海馬におけるシナプス伝達を損なったことが示された（Ｎｅｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．２
０１０，Ｎｅｕｒｏｎ．２０１０ Ｊａｎ １４；６５（１）：６６－７９；Ｐａｕｍｉ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ａｕｇ １；８（８）：ｅ
７０２７４）。これは、海馬のＣＡ１領域において示され、この領域では、両方の研究が
減少した基底シナプス伝達を発見した。この背景にある機構は、シナプス放出の機能不全
につながるα－シヌクレインの細胞内蓄積であると考えられた。しかしながら、シナプス
における細胞外空間中へのα－シヌクレインの分泌およびシナプス機能に対するα－シヌ
クレインオリゴマーの毒性作用に関する最近の発見は、シナプス機能障害における細胞外
α－シヌクレインの役割の可能性を開き、ひいては治療用抗体が障害を救う能力に扉を開
くものである。

α－シヌクレインを過剰発現するためのウイルスベクターの使用は、げっ歯類のＰＤを
モデル化する重要な方法であるが、その理由は、この手法が、マウスまたはラットにおけ
る遺伝子突然変異によってまだ再現されていない特徴である、黒質線条体ニューロンの比
較的速い進行性変性を生じるためである（Ｋｉｒｉｋ ａｎｄ Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，２
００３，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３ Ｊｕｌ；２６（７）：３８６－９
２）。さらに、ウイルス遺伝子送達は、ｗｔ α－シヌクレインが黒質線条体病変を誘発
する能力を明らかにし（Ｋｉｒｉｋ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２
００２ Ａｐｒ １；２２（７）：２７８０－９１）、これは、α－シヌクレイン重複お
よび三重重複を有する家族性のＰＤのエビデンスと一致する発見である（Ｌｅｅ ａｎｄ
Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，２００６，Ｎｅｕｒｏｎ．２００６ Ｏｃｔ ５；５２（１
）：３３－８）。ある研究では、α－シヌクレインに対するヤギ抗体のプールが、ドーパ
ミン作動性細胞死からＮ末端を保護し、パーキンソン病のＡＡＶ－α－シヌクレインに基
づくラットモデルの行動障害を改善したことが示されている（Ｓｈａｈａｄｕｚｚａｍａ
ｎ ｅｔ ａｌ ２０１５，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ｆｅｂ ６；１０（２）：ｅ
０１１６８４１）。

α－シヌクレイン病変のプリオン様の広がりは、α－シヌクレイン病変を発現させ、ド
ーパミン作動性細胞死も発現させることが最近示された（Ｌｕｋ ｅｔ ａｌ．２０１２
，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ｎｏｖ １６；３３８（６１０９）：９４９－５３）。こ
のモデルは、α－シヌクレイン抗体が、この病変を改善することができることを示すのに
使用された（Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１４ Ｊｕｎ
２６；７（６）：２０５４－６５）。このモデルにおいて、抗体治療は、いくつかの脳領
域（黒質にドーパミン作動性ニューロンを含む）におけるリン酸化α－シヌクレインの蓄
積を減少させ、運動障害の発現を減少させることができた。

突然変異に加えて、α－シヌクレイン遺伝子の選択的スプライシングおよびタンパク質
の翻訳後修飾（リン酸化、ユビキチン化、ニトロ化、および切断など）が、α－シヌクレ
インの凝集および／または毒性形態を形成する強化された能力を有するα－シヌクレイン
タンパク質形態を生じ得る（Ｂｅｙｅｒ ａｎｄ Ａｒｉｚａ，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉ
ｏｌ．２０１３ Ａｐｒ；４７（２）：５０９－２４）。しかしながら、α－シヌクレイ
ンの正確な病理学的な種は、依然として不明である。オリゴマーから原線維に及ぶ様々な
ミスフォールド／凝集／分泌された種、および様々な翻訳後修飾が、毒性と関連付けられ
ているが、実際に１つの毒性種があった場合でさえ、どれが最も重要かについての意見の
一致はない。

全体的に、ヒト、マウス、およびハエなどの様々な動物モデルにおける同様の形態学的
および神経学的変化を有するα－シヌクレインの蓄積は、この分子が、レビー小体病の発
症において中心的な役割を果たすことを示唆している。

α－シヌクレインに対するいくつかの異なる抗体が、前臨床動物モデルにおいて治療効
果を有することが示されている。α－シヌクレイン残基９１～９９を含むエピトープを標
的にする抗体およびα－シヌクレイン残基１１８～１２６を含むエピトープを標的にする
抗体は両方とも、トランスジェニックマウスの運動障害および認知障害に対する効果を与
えることが示されている（Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．
２０１４ Ｊｕｌ ９；３４（２８）：９４４１－５４）。最先端のこれらの抗体は、α
－シヌクレイン残基１１８～１２６を含むエピトープを標的にし、現在、臨床試験のフェ
ーズＩの段階にある、マウスモノクローナル抗体９Ｅ４に基づいたヒト化抗体である。α
－シヌクレイン残基１２０～１４０を含むエピトープを標的にするＣ末端抗体２７４（Ｂ
ａｅ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１２ Ｓｅｐ ２６；３２（
３９）：１３４５４－６９）も、前臨床モデルにおいて、細胞から細胞への病変の広がり
に対する効果を有することが示された。これらに加えて、α－シヌクレインのオリゴマー
および原線維などの立体配座種を標的にする抗体は、これらのおそらく毒性のα－シヌク
レイン種のレベルを少なくとも低下させることができることが示された（Ｌｉｎｄｓｔｒ
ｏｅｍ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２０１４ Ｓｅｐ；６９
：１３４－４３およびＳｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０
１４ Ｏｃｔ；２２（１０）：１７５３－６７）。ｍａｂ４７などの、インビボでα－シ
ヌクレインオリゴマーレベルを低下させるこれらの立体配座抗体も、アミノ酸１２１～１
２５からの、α－シヌクレインのＣ末端におけるエピトープを標的にすることが示された
（米国特許出願公開第２０１２０３０８５７２号明細書）。他の立体配座、原線維および
オリゴマー特異的抗体も、Ｃ末端配列を標的にする（Ｖａｉｋａｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｅ
ｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．２０１５；７９：８１－９９）。

α－シヌクレインの毒性形態は不明であるため、治療用抗体は、理想的には、選択的ス
プライシングまたは翻訳後修飾（切断など）によって形成されるα－シヌクレイン種の大
部分、ならびにオリゴマーおよび原線維形態に結合することができるべきである。上述さ
れるように、前臨床モデルにおいて治療薬として試験されている現在の抗体の１つの問題
は、それらの多くが、主な切断型のα－シヌクレインのいくつかにおいて見られないＣ末
端エピトープを標的にしていることである。例えば、９Ｅ４の結合に重要なアミノ酸は、
（米国特許出願公開第２０１４０１２７１３１号明細書に示されるアラニンスキャンによ
れば）アスパラギン１２２およびチロシン１２５であり、これは、この抗体が、パーキン
ソン病脳組織における主な切断種の一部である、アミノ酸１１９、および１２２において
切断されるα－シヌクレインに結合することができないことを意味する（Ｋｅｌｌｉｅ
ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１４；４：５７９７）。同じことが、抗体２７４およ
び抗体ｍａｂ４７の場合にも言えるであろう（米国特許第８，６３２，７７６号明細書）
。また、アミノ末端抗体は、おそらく、アミノ酸５～１４０に切断されたα－シヌクレイ
ンなどの、α－シヌクレインの最初のアミノ酸が欠如した主な切断種のいくつかに結合す
ることができないであろう。９Ｅ４抗体の場合、抗体が、プロテアーゼがα－シヌクレイ
ンを切断する同じ領域に結合するため、作用機序は、細胞外空間中のアミノ酸１１９～１
２２における切断の防止であることが示唆された（Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１４，
Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１４ Ｊｕｌ ９；３４（２８）：９４４１－５４）。同様
の作用機序が、この部位にごく近接した抗体でも見られ、したがって、この領域の周りの
多くの抗体が、この活性を有することが予測されるであろう。

動物モデルにおいて切断α－シヌクレイン種の毒性の役割に対するいくつかの裏付けが
ある。チロシン－ヒドロキシラーゼプロモータ下での切断α－シヌクレインの発現が、ト
ランスジェニックα－シヌクレインモデルにおいて通常見られない黒質線条体病変につな
がることが示された（Ｔｏｆａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．
２００６ Ａｐｒ １２；２６（１５）：３９４２－５０；Ｗａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ
ａｌ．２００６，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．２００８ Ａｐｒ；２９（４）：５
７４－８５）。例えば、Ａ５３Ｔ突然変異を有するヒトα－シヌクレインタンパク質のア
ミノ酸１～１３０の発現が、黒質緻密部におけるドーパミン作動性ニューロンの胚損失を
引き起こした一方、完全長タンパク質の発現はそれを引き起こさなかった（Ｗａｋａｍａ
ｔｓｕ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．２００８ Ａｐｒ；
２９（４）：５７４－８５）。カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ
Ｉα（ＣａｍＫＩＩ－α）プロモータ中での１２０アミノ酸α－シヌクレイン分子の発現
は、α－シヌクレイン凝集ならびにバーンズ迷路および新奇物体認識を含む皮質－海馬記
憶試験における進行的障害に関連付けられた（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｅｘｐ
Ｎｅｕｒｏｌ．２０１５ Ｆｅｂ；２６４：８－１３）。また、ラットＡＡＶモデルに
おいて、Ｃ末端が切断されたα－シヌクレインの共発現は、完全長α－シヌクレイン誘発
性の病変を促進した（Ｕｌｕｓｏｙ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ．２０１０ Ａｕｇ；３２（３）：４０９－２２）。

本発明において、毒性α－シヌクレインフラグメント１～１１９／１２２に結合し、こ
の切断型のα－シヌクレインを無効にし得る抗体（実施例に記載されている「ＧＭ３７」
および「ＧＭ２８５」）が生成された。ＧＭ３７およびＧＭ２８５などの、本発明の抗体
は、他のオリゴマー型のα－シヌクレインに結合し、疾患の拡大を抑えるように他のＣＮ
Ｓの常在細胞によるそれらの取り込みを変化させることが可能である。さらに、ＧＭ３７
および２８５などの、本発明の抗体は、ヒトの脳において異なるα－シヌクレイン種に結
合する際に、９Ｅ４などの先行技術の抗体より優れていることが意外にも分かり、細胞外
α－シヌクレインを除去し、インビボで異常なα－シヌクレインの存在によって誘発され
るシナプス伝達障害を正常化するのに意外なほど優れた効果を与える。それらの治療能力
をさらに説明すると、ＧＭ３７および２８５などの、本発明の抗体は、パーキンソン病の
ラットモデルにおいて疾患に関連する運動表現型の出現を防ぐことができる。最後に、抗
体ＧＭ３７およびＧＭ２８５は、初代マウスニューロンにおいて細胞外の加えられた組み
換え病理学的α－シヌクレインシードによって誘発される内因性α－シヌクレインの凝集
のシーディングおよびリン酸化を阻害することができる。ＧＭ３７および２８５などの抗
体は、パーキンソン病のマウスモデルを用いて、インビボでドーパミン作動性ニューロン
へのα－シヌクレイン病変のシーディングも阻害することができ、これは、病変の細胞間
の伝播を防ぐ際のこれらの抗体の治療能力をさらに裏付けている。これらのデータは、合
わせて、疾患病変がパーキンソン病患者のニューロン間で広がる機構の阻害によって疾患
を修飾することが可能な新しい治療剤としてのこれらの新規な抗体、ＧＭ３７およびＧＭ
２８５の使用を強く裏付けるものである。

本発明のさらなる態様において、ＧＭ３７抗体の３つのアミノ酸変異体が提供される。
全ての変異体は、親抗体、ＧＭ３７と同様の機能的読み出し（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒ
ｅａｄｏｕｔ）を有するが、製造可能性についての改良された特性を有する。これらの変
異体は、ＧＭ３７抗体の結合領域内で起こる翻訳後修飾のリスクを低下させ、抗体の産生
のいくらかの改良を提供する。これは、抗体の大規模な臨床的または商業的製造が、複雑
でかつ高価であり、薬剤に均質な製品を提供することが、特に免疫グロブリンおよびタン
パク質にとって重要であるため、有利である。

本発明は、α－シヌクレインにおけるアミノ酸１１２～１１７（配列番号９（ＩＬＥＤ
ＭＰ））内のエピトープに特異的に結合することが可能な、新規なモノクローナル抗体、
およびその抗原結合フラグメントを提供する。例示的な抗体「ＧＭ３７」、または「ＧＭ
２８５」などの、本発明の抗体またはその抗体結合フラグメントによって結合されるエピ
トープは、本明細書において「１１２～１１７エピトープ」と呼ばれる。本発明の抗体は
、１１２～１１７エピトープ内のエピトープに特異的に結合し、一実施形態によれば、ア
ミノ酸１１２～１１７内のエピトープへの結合について、抗体ＧＭ３７またはＧＭ２８５
と競合し得る。例えば、本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号
７の可変領域からなる重鎖および配列番号８の可変領域からなる軽鎖を有し、ヒトα－シ
ヌクレインのアミノ酸１１２～１１７内のエピトープへの結合について競合し得る。この
ような競合的な結合の阻害は、当該技術分野において周知のアッセイおよび方法を用いて
、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの非標識結合アッセイを用いて決定され得る
。例えば、ヒトα－シヌクレインを表面に固定し、試験される抗体または結合フラグメン
トを用いたインキュベーションの前に参照抗体‘ＧＭ３７’を用いてまたは用いずにイン
キュベートする。あるいは、ペアワイズマッピング手法が使用され得、この手法では、参
照抗体‘ＧＭ３７’が表面に固定され、ヒトα－シヌクレイン抗原が固定抗体に結合され
、次に、二次抗体がヒトα－シヌクレインに対する同時結合能力について試験される（開
示内容が参照により本明細書に援用される‘ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ａｓｓａｙ Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ’，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２９－
０１９４－００ ＡＡ ０５／２０１２を参照）。

より詳細には、ＧＭ２８５抗体は、α－シヌクレインの残基１１２～１１５（ＩＬＥＤ
；配列番号１９）を含む、α－シヌクレインの残基１１２～１１７内のエピトープに結合
する。

一実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体ＧＭ３７、その変異体（例えば、
ＧＭ３７変異体１、ＧＭ３７変異体２およびＧＭ３７変異体３）、またはＧＭ２８５に関
する。

特に、本発明は、モノクローナル抗体ＧＭ３７、その変異体（例えば、ＧＭ３７変異体
１、ＧＭ３７変異体２およびＧＭ３７変異体３）、またはＧＭ２８５を提供し、ヒトシヌ
クレインに特異的に結合することが可能な結合部位を形成するのに、十分な数（例えば、
１、２、または３つ）の軽鎖ＣＤＲおよび十分な数（例えば、１、２、または３つ）の重
鎖ＣＤＲを有するこのような抗体ならびにその誘導体を包含する。好ましくは、このよう
な抗体は、以下に規定されるように、３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲを有する
。この領域中のアミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ（登録商標）、国際ＩｍＭｕｎｏＧ
ｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）または、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ
．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎｎ，Ｋ．Ｓ．＆ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．
（１９９１）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
ｎｏ．９１－３２４２、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅ
ａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．＆ Ｌｅｓ
ｋ，Ａ．Ｍ．（１９８７）．Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏｒ ｔｈ
ｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ
ｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１－９１７にしたがって行われる。

一実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトα
－シヌクレインに特異的に結合することが可能な
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；および／または
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および／または
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；および／または
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；および／または
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および／または
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含むかまたはそれからなるシヌクレイン抗原結合フラグメントを有する。

別の実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト
α－シヌクレインに特異的に結合することが可能な
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３３、３４または３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３；
を含むかまたはそれからなるシヌクレイン抗原結合フラグメントを有する。

さらに別の実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは
、ヒトα－シヌクレインに特異的に結合することが可能な
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；および／または
（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；および／または
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；および／または
（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；および／または
（ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および／または
（ｆ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含むかまたはそれからなるシヌクレイン抗原結合フラグメントを有する。

一実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、天然抗
α－シヌクレイン抗体のものと異なり、かつ（このような天然抗α－シヌクレイン抗体と
比べて）：
（ｉ）α－シヌクレインに対する結合親和性（ＫＤ）の相違；
（ｉｉ）α－シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する能力の相違；
（ｉｉｉ）Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障
害を改善する能力の相違；
（ｉｖ）インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα－シヌクレイン
のレベルを減少させる能力の相違；および／または
（ｖ）慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を
回復させる能力の相違、
（ｖｉ）α－シヌクレインのシーディング（インビトロでのおよび／またはパーキンソ
ン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化α－シヌクレインの蓄積など）を防ぐ能力の
相違；および／または
（ｖｉｉ）ヒトの脳における切断α－シヌクレインに結合する能力の相違
を示すアミノ酸配列を（そのＣＤＲ、その可変領域、そのフレームワーク残基中またはそ
の定常領域中に）含むシヌクレイン抗原結合フラグメントを有する。

本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントは、パーキンソン病（（ＰＤ）、特発性
および遺伝性のパーキンソン病を含む）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小
体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、ゴーシェ病（ＧＤ）、複合されたアルツハイマー
病およびパーキンソン病（ＣＡＰＤ）、純粋自律神経不全症および多系統萎縮症などのシ
ヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングするための方法に使用され得る。

ハイブリドーマの作製のための免疫化プロトコルを示す。表は、ＧＭ３７およびＧＭ２８５の同定に使用される免疫原およびマウス株の相違を要約している。異なるＨＣｏ１７－Ｂａｌｂ／ｃおよびＨＣｏ１２／Ｂａｌｂ／ｃマウスを、別々に免疫した（これらのマウスの説明が以下に示される）。アミノ酸１～１４０原線維を含有する完全長α－シヌクレインで免疫され、完全長（ＦＬ）α－シヌクレイン（配列番号１０）の切断α－シヌクレインフラグメント１～６０および１～１１９を投与された（ｂｏｏｓｔｅｄ）マウスから、ハイブリドーマ発現ＧＭ３７を同定した。ハイブリドーマ発現抗体ＧＭ２８５は、ＨＣｏ１２－Ｂａｌｂ／ｃマウスが、完全長モノマーα－シヌクレイン、アミノ酸１～１４０で免疫され、続いて、完全長線維性α－シヌクレインを投与された免疫化プロトコル（実施例１）から得られた。 （パネルＡ～Ｃ）は、αシヌクレイン、α－シヌクレインホモログおよびオルソログへの結合についてのＧＭ３７のスクリーニングを示す。 Ａ）非洗浄溶液ベースのＥＬＩＳＡ（ＦＭＡＴ）を用いたα－シヌクレインへの抗体ＧＭ３７の結合。 Ｂ）ＳＰＲ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて、抗体ＧＭ３７の結合は、α－シヌクレイン（αパネル）に特異的であり、他の関連するシヌクレインファミリータンパク質、β－シヌクレイン（βパネル）およびγ－シヌクレイン（γパネル）に結合しない。ＳＰＲ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔｒｅｄ）を用いて測定を行い、ＧＭ３７は、カニクイザル（カニクイザルパネル）およびマウス（マウスパネル）に由来するα－シヌクレインへの同様の結合を示す（実施例１）。 Ｃ）ＳＰＲ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔｒｅｄ）を用いて、抗体ＧＭ２８５の結合は、α－シヌクレインに特異的であり、他の関連するシヌクレインファミリータンパク質、β－シヌクレインおよびγ－シヌクレインに結合しない。ＳＰＲ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔｒｅｄ）を用いて測定を行い、カニクイザル（カニクイザル）およびマウス（マウス）に由来するα－シヌクレインへのＧＭ２８５の同様の結合を示す（実施例１）。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 （パネルＡ～Ｃ）は、ＧＭ３７のリアルタイムの結合親和性を示す。 Ａ）ＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００）によって決定される際の時間（Ｘ軸）に対するＲＵ（相対単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｕｎｉｔ））（ｙ軸）で測定されるα－シヌクレインへの抗体ＧＭ３７の結合。ヤギ抗ヒトＩｇＧを、ＣＭ５チップ上に固定した。ＧＭ３７を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ固定化チップ上に捕捉し、一連の濃度のヒトα－シヌクレイン（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎＭ）を、表面への結合について試験した。各サイクル間でセンサー表面を再生した。 Ｂ）結合曲線に変換される異なる濃度における結合からの信号。 Ｃ）抗体ＧＭ３７（ｈｌｇＧ１－６００４－０３７－Ｃ１０６Ｓと示される）の計算された結合定数（実施例２）。 同上。 （パネルＡ～Ｃ）は、ＧＭ２８５のリアルタイムの結合親和性を示す。 Ａ）ＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００）によって決定される際の時間（Ｘ軸）に対するＲＵ（ｙ軸）で測定されるα－シヌクレインへの抗体ＧＭ２８５の結合。ヤギ抗ヒトＩｇＧを、ＣＭ５チップ上に固定した。ＧＭ２８５を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ固定化チップ上に捕捉し、一連の濃度のヒトα－シヌクレイン（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎＭ）を、表面への結合について試験した。各サイクル間でセンサー表面を再生した。 Ｂ）結合曲線に変換される異なる濃度における結合からの信号。 Ｃ）抗体ＧＭ２８５（ｈｌｇＧ１－６００４－２８５と示される）の計算された結合定数（実施例２）。 同上。 （パネルＡ～Ｃ）は、比較用抗体９Ｅ４のリアルタイムの結合を示す。 Ａ）ＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００）によって決定される際の時間（Ｘ軸）に対するＲＵ（ｙ軸）で測定されるα－シヌクレインへの９Ｅ４の結合を示す。ヤギ抗ヒトＩｇＧを、ＣＭ５チップ上に固定した。９Ｅ４を、チップに固定されたヤギ抗ヒトＩｇＧへのその結合によってチップ上に捕捉した。一連の濃度のヒトα－シヌクレイン（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎＭ）を、表面への結合について試験した。各サイクル間でセンサー表面を再生した。 Ｂ）結合曲線に変換される異なる濃度における結合からの信号。 Ｃ）抗体９Ｅ４についての計算された結合定数（実施例２）。 同上。 α－シヌクレインのアミノ酸配列を示す。ヒト脳組織において質量分析法によって特定される主な切断部位（矢印によって示される）（Ｋｅｌｌｉｅ ＪＦ，Ｈｉｇｇｓ ＲＥ，Ｒｙｄｅｒ ＪＷ，Ｍａｊｏｒ Ａ，Ｂｅａｃｈ ＴＧ，Ａｄｌｅｒ ＣＨ，Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ｋ，Ｋｎｉｅｒｍａｎ ＭＤ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｐｒｏｔｅｏｆｏｒｍｓ ｆｒｏｍ ｐｏｓｔ－ｍｏｒｔｅｍ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１４ Ｊｕｌ ２３；４：５７９７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０５７９７）。 （パネルＡ～Ｂ）は、抗体ＧＭ３７およびＧＭ２８５のエピトープマッピングを示す。α－シヌクレインアミノ酸配列９５～１３２に由来する連続ペプチド（２０量体）（他の非結合ペプチドは図示されていない）への抗体の結合の相対レベルを示すＥＬＩＳＡデータ。 Ａ）ＧＭ３７エピトープは、完全な結合のためにペプチド配列ＩＬＥＤＭＰ（配列番号９）を必要とする。 Ｂ）ＧＭ２８５は、完全な結合のためにペプチドＩＬＥＤ（配列番号１９）を必要とする（実施例３）。 （パネルＡ～Ｂ）は、切断型のα－シヌクレインの概略図を示す。 Ａ）ＧＭ３７／２８５（ＩＬＥＤＭＰ；配列番号９）および９Ｅ４（ＮＥＡＹＥ；配列番号３６）の結合エピトープが、α－シヌクレインアミノ酸配列（配列番号１０）において太字で示される。矢印は、図６からのｃ末端切断部位を示す。 Ｂ）ヒトの脳物質から同定された主な切断型のα－シヌクレイン。アミノ酸数に基づいたサイズが、右側に示される。完全長α－シヌクレインは、１４０個のアミノ酸である。エピトープから推論され得るように、ＧＭ３７、その変異体１～３、およびＧＭ２８５は、完全長および１～１１９／１２２、１～１３５フラグメントに結合するはずである。抗体９Ｅ４は、完全長および１～１３５フラグメントのみに結合するであろう。切断後に残ったより小さいｃ末端フラグメントの特異性は示されていない。 抗体ＧＭ３７およびＧＭ２８５が、ヒトの脳に由来する完全長α－シヌクレインならびに切断α－シヌクレインを免疫沈降させることを示す。ヒトＤＬＢ脳の粗ホモジネートを、試験抗体（ビーズ（抗体なし（Ｎｏ ａｂ））、α－シヌクレインに結合しないＢ１２－ヒトＩｇＧ１対照抗体、ＧＭ－３７、ＧＭ３７変異体２、ＧＭ－２８５およびマウス（ｍ）９Ｅ４）ならびに免疫枯渇させた上清とともにインキュベートし、免疫沈降させた材料をＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて分離した。ウエスタンブロットは、上清から枯渇され、抗体（ＩＰ）で免疫沈降された、完全長および様々な切断型のα－シヌクレインを表すバンドを示す。見て分かるように、ＧＭ３７、ＧＭ３７ｖ２およびＧＭ２８５抗体は、上清から主なα－シヌクレイン種を枯渇させ、ＩＰは、これらの種、切断種１～１３５、１～１１９／１２２および完全長αシヌクレインを示す。９Ｅ４は、１～１１９／１２２種に影響を与えないが、ＩＰ完全長および１～１３５のみに影響を与える（実施例４）。 アミノ酸１１９／１２２においてカルパインによって切断されるα－シヌクレイン原線維のタンパク質分解の概略図を示す。α－シヌクレイン原線維（ＰＦＦ）が、試験抗体を含む（ＰＦＦ＋）かまたは含まない（ＰＦＦ）培養物に加えられる。ＧＭ－３７／２８５の存在は、細胞内の切断α－シヌクレインの形成、および細胞培地への分泌を阻害する。 図１１Ａは、ＧＭ３７が、培地中およびＰＦＦで処理された初代マウス皮質培養物の細胞溶解物中の切断バンド（１２ＫＤ）の形成を阻害することを示す。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ウエスタンブロットして、α－シヌクレインの様々な種を検出した。ＰＦＦのみまたは対照抗体（Ｂ１２）で処理された細胞内で、２つのモノマーα－シヌクレインバンドが、１２および１４ｋＤａで検出され、これは、それぞれ切断および完全長α－シヌクレインを表す。ＧＭ－３７の存在下で、１２Ｋｄでかすかなバンドがあるに過ぎず、これは、切断の大部分が阻害されることを示す。この効果は、細胞の培地にも反映される。蓄積の相対レベルも、１４Ｋｄバンドの相対強度の低下に反映されるように、ＧＭ－３７の存在によって阻害され得る。あるいは、細胞による取り込みに利用可能な減少した量の１４Ｋｄバンドがあり得る（実施例５）。 図１１Ｂは、抗体ＧＭ３７、ＧＭ３７変異体２およびＧＭ２８５によるα－シヌクレイン原線維のタンパク質分解の用量依存的阻害を示す。低い抗体濃度（０．１ｕｇ／ｍｌ）における初代マウス皮質培養物に由来する細胞溶解物において、完全長（ＦＬ）α－シヌクレインを表すバンドおよびＣ末端切断（ＣＴ）α－シヌクレインを表すバンド（矢印によって示される）の両方がある。抗体濃度を１、５および１０ｕｇ／ｍｌに増加させると、細胞内のα－シヌクレイン原線維のタンパク質分解の減少につながる。これは、抗体ＧＭ３７、ＧＭ３７ｖ２およびＧＭ２８５の両方で観察される。対照試料は、α－シヌクレインを認識しないヒトＩｇＧ１抗体Ｂ１２で処理される。抗体を加えていない対照（抗体なし）、およびα－シヌクレイン原線維を加えていない細胞（Ａｓｙｎなし）もある。また、α－シヌクレインの総量が、Ｂ１２または「抗体なし」対照と比較して、３７、３７ｖ２および２８５で処理された試料において減少され、これは、全ての３つの抗体が、濃度依存的に細胞内のα－シヌクレインの蓄積を減少させることを示す。ゲルの上部におけるアクチンバンドは、試料の等量の充填を示す（実施例５）。 マウス初代皮質ニューロンにおいてα－シヌクレイン凝集のシーディングおよびα－シヌクレインリン酸化に対するＧＭ３７およびＧＭ２８５の影響を示す。 １２Ａ）細胞に、α－シヌクレインの１ｎｇの純粋なシードまたは粗シードのいずれかが播種されるとき、細胞内のスポットまたは点状の染色として現れる、リン酸化α－シヌクレインについて染色された初代ニューロンの画像の例。 １２Ｂ）可溶性画分および不溶性画分に分離される初代皮質ニューロンからのタンパク質のウエスタンブロット。ブロットを、ヒトα－シヌクレイン特異的抗体（４Ｂ１２／Ｈ ａ－ｓｙｎ）、ホスホ－Ｓｅｒ－１２９－α－シヌクレイン特異的抗体（ａｂ５１２５３／ｐＳ－ａ－Ｓｙｎ）およびマウスα－シヌクレイン特異的抗体（Ｄ３７Ａ２／Ｍ ａ－ｓｙｎ）で染色し、初代ニューロンへの粗シードの添加が、不溶性画分中の内因性マウスα－シヌクレインおよびリン酸化α－シヌクレインおよびα－シヌクレインのより高い分子量の多量体の蓄積をもたらすことを示す。 １２Ｃ）ＧＭ３７、ＧＭ３７変異体２およびＧＭ２８５は、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡＲＲＡＹＳＣＡＮ（商標）自動顕微鏡によって、細胞内のα－シヌクレインホスホセリン１２９陽性スポットの数として定量化されるリン酸化α－シヌクレインの出現を阻害する。ＧＭ３７、ＧＭ３７ｖ２およびＧＭ２８５は、用量依存的に細胞内のリン酸化α－シヌクレインスポットの量を減少させる。 １２Ｄ）最も高用量の抗体（１３３ｎＭ）で処理され、アクチン、ヒトα－シヌクレイン、リン酸化α－シヌクレインおよびマウスα－シヌクレインについて染色された初代皮質ニューロンからのホモジネートのウエスタンブロットは、抗体３７、３７ｖ２および２８５が、不溶性画分中の細胞によって取り込まれるα－シヌクレイン粗シードの切断を阻害することを示す。また、全ての抗体が、不溶性画分中のリン酸化、内因性マウスα－シヌクレインおよびリン酸化マウスα－シヌクレインのより高い分子量の多量体の蓄積を阻害する。ゲルの上部におけるアクチンバンドは、試料の等量の充填を示す（実施例６）。 同上。 同上。 同上。 同上。 Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスおよび月齢をマッチさせた対照マウスの海馬中のシャファー側枝－ＣＡ１シナプスにおける基底シナプス伝達を示す。興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）を、シャファー側枝に加えられる単一の刺激によって引き起こし、基底シナプス伝達を、刺激強度の関数としてｆＥＰＳＰの傾きを測定することによって評価した。短期シナプス可塑性を、二発刺激促通（ｐａｉｒｅｄ－ｐｕｌｓｅ ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ）の誘発によって評価した。様々な強度の刺激は、０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、および５００μＡであり、これを低い方から順に連続して加え、各強度で２～３回繰り返す。基底シナプス伝達は、月齢をマッチさせた対照マウスと比較して、野生型α－シヌクレインを過剰発現するＦ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおいて著しく低下されたことが分かった（実施例７）。 Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中のシャファー側枝－ＣＡ１シナプスにおける基底シナプス伝達の障害に対する単回用量のヒト９Ｅ４（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））の全身投与の効果を示す。興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）を、シャファー側枝に加えられる単一の刺激によって引き起こし、基底シナプス伝達を、刺激強度の関数としてｆＥＰＳＰの傾きを測定することによって評価した。ｈ９Ｅ４による急性治療により、Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害のかなりの改善が誘発された（Ｔｇ－ｓｎｃａ＋ｈ９Ｅ４対Ｔｇ－ｓｎｃａ＋ＰＢＳ、ｐ＝０．００２）。しかしながら、ｈ９Ｅ４による改善は、ＰＢＳで処理された同腹仔と比較して著しく低い基底シナプス伝達によって示されるように部分的であるに過ぎなかった（ｐ＝０．００７）（実施例７）。 Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中のシャファー側枝－ＣＡ１シナプスにおける基底シナプス伝達の障害に対する単回用量のヒトＧＭ３７（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ））またはアイソタイプ対照抗体（Ｂ１２）の全身投与の効果を示す。興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）を、シャファー側枝に加えられる単一の刺激によって引き起こし、基底シナプス伝達を、刺激強度の関数としてｆＥＰＳＰの傾きを測定することによって評価した。ＧＭ３７による急性治療により、Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害の完全な改善が誘発された（Ｔｇ－ｓｎｃａ＋ＧＭ３７対Ｔｇ－ｓｎｃａ＋Ｂ１２、ｐ＝０．００４）（実施例７）。 Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中のシャファー側枝－ＣＡ１シナプスにおける基底シナプス伝達の障害に対する単回用量のヒトＧＭ２８５（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ））の全身投与の効果を示す。興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）を、シャファー側枝に加えられる単一の刺激によって引き起こし、基底シナプス伝達を、刺激強度の関数としてｆＥＰＳＰの傾きを測定することによって評価した。ＧＭ２８５による急性治療により、Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害の完全な改善が誘発された（Ｔｇ－ｓｎｃａ＋ＧＭ２８５対Ｔｇ－ｓｎｃａ＋ＰＢＳ、ｐ＝０．００１）（実施例７）。 （パネルＡ～Ｂ）は、自由行動Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスの海馬中の間質液（ｉｓｆ）中のヒトα－シヌクレインのレベルに対するヒト９Ｅ４、ＧＭ３７またはアイソタイプ対照抗体（抗ＨＥＬ）の全身投与（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））の効果を示す。抗体処理の前の２～３つの基底値（４時間～６時間）の平均を、ベースラインとして取り、各動物について１００％に設定した。反復測定による二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、相違を分析した。海馬中のヒトα－シヌクレインの基底レベルは、８．１±１．１ｎｇ／ｍｌであった（平均±ＳＥＭ、ｎ＝２５、インビトロ透析プローブの回収率に対して補正されない）。ＧＭ３７の投与により、比較用抗体、ヒト９Ｅ４、および対照アイソタイプ、抗ＨＥＬの両方と比較して、Ｆ２８マウスの海馬中のヒトα－シヌクレインのより大きな減少が誘発された。ＧＭ３７で処理された動物または対照抗体の間のα－シヌクレインのレベルのかなりの差を示す時点が、星印によって示される（実施例８）。 図１９に示されるラットＡＡＶヒトα－シヌクレインモデルにおける抗体処理（下向き矢印）、ウイルス注入および行動評価（実施例９）についての時系列の概略図を示す。 抗体ＧＭ３７が、ラットＡＡＶモデルにおける長期治療後にパーキンソン病様運動障害を低減し得ることを示す。運動非対称性に対するＡＡＶ－ヒト－α－シヌクレインラットにおけるＧＭ３７またはＰＢＳによる長期治療の効果が、シリンダー試験において評価される。各ラットを、５分間監視することによって、前足の使用について試験した。右前足の使用（注入と同側）および左前足の使用（反対側＋右前足）のパーセンテージを、ＧＦＰ－ＰＢＳラットと比較して各動物について計算した（ｙ軸に示されるように）^＊、^＊＊ｐ＜０．０５および０．０１。ＰＢＳで処理されたラットは依然として、足の使用にかなりの非対称性を有する一方、抗体ＧＭ３７で処理された動物は、もはや有意な障害を有さない（実施例９）。 図２０Ａ－２０Ｃは、抗体ＧＭ３７による長期治療が、マウス線条体への病理学的α－シヌクレイン線維性シードの注入によって誘発される病理学的α－シヌクレインリン酸化を低減し得ることを示す。図２０Ａは、シード注入および細胞計数に関する相対的な処理時間を示す概略図を示す。抗体ＧＭ３７を、マウスの背側線条体への組み換えα－シヌクレイン線維性シードの注入の１日前、次に、６週間にわたって週に１回投与した。投与計画は、１５ｍｇ／ｋｇ静脈内（ｉｖ）または３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内（ｉｐ）のいずれかであった。図２０Ｂは、注入部位および用量に基づいた血漿中のＧＭ３７の曝露レベルを示す。週に１回、試料を新たな抗体用量の注入前に取った。図２０Ｃは、試験の最後における、用量および注入部位に基づいたＧＭ３７の曝露レベル（ｃｓｆ）を示す。図２０Ｄは、細胞の数を、ＧＭ３７またはＰＢＳ対照による処理後の黒質中の６つの部分ごとに計数されるリン酸化α－シヌクレイン陽性封入体と比較する。１５ｍｇ／ｋｇ静脈内（ｉｖ）および３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内（ｉｐ）の両方のＧＭ３７で処理されたマウスでは、ＰＢＳで処理されたマウスと比較して、リン酸化α－シヌクレイン封入体が、細胞内でかなり減少していた（実施例１０）。 同上。 同上。 同上。 ヒトα（配列番号１０）、β（配列番号３７）およびγ（配列番号３８）シヌクレインタンパク質のアラインメントを示す。α－シヌクレインと異なるアミノ酸残基がハイライトされる。ギャップはドットで示される。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ番号が括弧内に示される。 α－シヌクレインオルソログ（カニクイザル、配列番号３９；ラット、配列番号４０；マウス、配列番号４１）のアラインメントを示す。ヒトα－シヌクレイン（配列番号１０）と異なるアミノ酸残基がハイライトされる。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ番号が括弧内に示される。 ＧＭ３７（ＧＭ３７野生型（ｗｔ）と名付けられる、および３つのＧＭ３７変異体（ＧＭ３７ ｖａｒ １、２および３と名付けられる）の一過性発現を示す。星印は、データが、タンパク質Ａ精製および中和後に決定されることを示す。†は、データが、発現培養物の規模（０．４Ｌ）に対して、タンパク質Ａおよび中和後に得られる収量から計算されることを示す。 ヒトα－シヌクレインへの４つの抗体ＧＭ３７ ｗｔ、ＧＭ３７ ｖａｒ １、ＧＭ３７ ｖａｒ ２およびＧＭ３７ ｖａｒ ３の結合を測定する競合ＥＬＩＳＡを示す。α－シヌクレインで被覆されたプレートを用いて、増加する濃度のα－シヌクレイン（０～１０００ｎＭ）を含む各抗体（０．３μｇ／ｍｌ）の溶液中でのプレインキュベーション後に残っている抗体の量を検出する。全ての４つの抗体は、α－シヌクレインへの同様の結合を示す。 ＧＭ３７ｗｔおよび変異体１～３の結合速度動態パラメータを固定化組み換えヒトα－シヌクレインと比較する表を示す。ＳＰＲを用いて結合を測定し、１：１の結合アルゴリズム（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００）を用いて結合速度を決定した。 病理学的α－シヌクレイン線維性シードで処理されたマウス初代ニューロン中のリン酸化α－シヌクレインレベルに対するα－シヌクレイン抗体の効果を比較する。初代ニューロンを、４つのＧＭ３７、ＧＭ３７ ｖａｒ １、ＧＭ３７ ｖａｒ ２およびＧＭ３７ ｖａｒ ３（２μｇ）の存在下または非存在下で、シード（１０ｎｇ）で処理した。ニューロンを、３週間後に固定および染色し、α－シヌクレインホスホセリン１２９陽性スポットについてＣｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡＲＲＡＹＳＣＡＮ（商標）によって分析した。シード単独でまたはシードおよびアイソタイプ対照抗体（Ｂ１２）で処理された細胞は、かなり増加したレベルのリン酸化を示す。ＧＭ３７ｗｔおよび３つの変異体で処理された細胞は、α－シヌクレインのリン酸化を阻害することができ、それらは全て、シードを与えられなかった細胞と同じレベルのリン酸化を示す。データが、５つのウェル中で、ウェルにつき７つの画像から決定される平均±ＳＤとして示される。Ｎ＝２。 ｗｔ ＧＭ３７、ｖａｒ１、ｖａｒ２およびｖａｒ３の温度依存的凝集を比較する。抗体のそれぞれの試料を、時間とともに温度を着実に上昇させ、凝集のレベルを、多角度光散乱（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８，ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって同時に測定した。凝集開始の温度は、ＧＭ３７およびＧＭ３７－変異体について同様であるが、凝集の最も低いレベルが、ＧＭ３７－Ｖａｒ２について観察される。

定義
本明細書において使用される際、「α－シヌクレイン」という用語は、「α－シヌクレ
インタンパク質」と同義であり、α－シヌクレインタンパク質アイソフォーム（例えば、
Ｐ３７８４０、１－３としてＵｎｉＰｒｏｔにおいて同定される）のいずれかを指す。α
－シヌクレインのアミノ酸の番号付けは、以下に示されるように配列番号１０に対して示
され、メチオニン（Ｍ）は、アミノ酸残基１である：

本発明は、α－シヌクレイン、特に、ヒトα－シヌクレインに特異的に結合することが
可能な抗体および抗体のフラグメントに関する。特に、抗体およびそのフラグメントは、
ヒトα－シヌクレインの１１２～１１７内のエピトープに特異的に結合する能力を示す。

本発明の文脈における「抗体」（Ａｂ）という用語は、分子（「抗原」）のエピトープ
に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、または本発明のある実施形態に
よれば、免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。天然抗体は、典型的に、通常、少な
くとも２つの重（Ｈ）鎖および少なくとも２つの軽（Ｌ）鎖から構成される四量体を含む
。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される）および、３つの領域（
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される重鎖定常領域から構成される。重鎖は、Ｉ
ｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１お
よびＩｇＡ２サブタイプ）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む任意のアイソタイプのものであり
得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される）および軽鎖定常領
域（ＣＬ）から構成される。軽鎖は、κ鎖およびλ鎖を含む。重鎖および軽鎖可変領域が
、典型的に、抗原認識に関与する一方、重鎖および軽鎖定常領域は、免疫系の様々な細胞
（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主
組織または宿主因子への免疫グロブリンの結合を仲介し得る。ＶＨおよびＶＬ領域は、「
フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存される配列の領域が散在する「相補性
決定領域」と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミ
ノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ
３－ＣＤＲ３－ＦＲ４で配置される３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域から構成され
る。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含有する。特に関連が
あるのは、自然界に存在し得るものと異なる物理的環境中で存在するように「単離され」
ているか、またはアミノ酸配列中の天然抗体と異なるように修飾された抗体およびそれら
の抗原結合フラグメントである。

「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能な抗原決定基を意味する。エ
ピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面基（ｓｕｒｆａｃｅ ｇｒｏ
ｕｐｉｎｇ）からなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する
。立体配座エピトープおよび線状エピトープは、後者ではなく、前者への結合が、変性溶
媒の存在下で常に失われる点で区別される。エピトープは、特異的抗原結合ペプチドによ
って有効に遮断されるアミノ酸残基（言い換えると、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペ
プチドのフットプリント内にある）などの、結合に直接関与するアミノ酸残基および結合
に直接関与しない他のアミノ酸残基を含み得る。「１１２～１１７エピトープ」という用
語は、１１２～１１７ヒトα－シヌクレインの６つのアミノ酸残基のうちの少なくとも４
つを含有するヒトα－シヌクレインの領域を指し、１１２～１１７エピトープは、ヒトα
－シヌクレインの１～１１１のいずれかの残基（１０６～１１１のいずれかの残基を含む
）も、ヒトα－シヌクレインの１１８～１４０のいずれかの残基（残基１１８～１２０を
含む）も含まない。本明細書において使用される際、抗体が、１１２～１１７エピトープ
の６つのアミノ酸残基のうちの少なくとも４つに結合することによって、ヒトα－シヌク
レインに特異的に結合することが可能である場合、抗体は、「１１２～１１７エピトープ
」内のエピトープに特異的に結合することが可能であるといわれている。

本明細書において使用される際、「抗体の抗原結合フラグメント」という用語は、エピ
トープに特異的に結合することが可能な抗体のフラグメント、部分、領域（ｒｅｇｉｏｎ
）または領域（ｄｏｍａｉｎ）（それがどのように産生されるかにかかわらず（例えば、
切断により、組み換えにより、合成的になど））を意味し、したがって、「抗原結合」と
いう用語は、例えば、「抗体の抗原結合フラグメント」が「抗体のエピトープ結合フラグ
メント」と同じであることが意図されるように、「エピトープ結合」と同じことを意味す
ることが意図される。抗原結合フラグメントは、このような抗体のＣＤＲ領域の１、２、
３、４、５または６つ全てを含有してもよく、このようなエピトープに特異的に結合する
ことが可能であるが、このような抗体のものと異なるこのようなエピトープに対して特異
性、親和性または選択性を示し得る。しかしながら、好ましくは、抗原結合フラグメント
は、このような抗体のＣＤＲ領域の６つ全てを含有するであろう。抗体の抗原結合フラグ
メントは、単一のポリペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）の一部であるか、もしくはそれを
含んでもよく、またはアミノ末端およびカルボキシル末端（例えば、二重特異性抗体、Ｆ
ａｂフラグメント、Ｆａｂ_２フラグメントなど）をそれぞれ有する２つ以上のポリペプチ
ド鎖の一部であるか、もしくはそれを含んでもよい。抗原結合能力を示す抗体のフラグメ
ントは、例えば、無傷の抗体のプロテアーゼ切断によって得られる。より好ましくは、Ｆ
ｖフラグメントの２つの領域、ＶＬおよびＶＨが、別個の遺伝子によって天然にコードさ
れるが、またはこのような遺伝子配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、それらの
コードｃＤＮＡ）が、ＶＬおよびＶＨ領域が結合して一価抗原結合分子を形成する単一の
タンパク質鎖（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ
ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；およびＨｕｓｔｏｎ
ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８
５：５８７９－５８８３を参照）としてそれらが作製されるのを可能にするフレキシブル
リンカーによって、組み換え方法を用いて結合され得る。あるいは、単一のポリペプチド
鎖のＶＬおよびＶＨ領域が一緒に結合するのを可能にするには短すぎるフレキシブルリン
カー（例えば、約９個未満の残基）を用いることによって、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅ
ｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、または同様の分
子（２つのこのようなポリペプチド鎖が一緒に結合して、二価抗原結合分子を形成する）
を形成することができる（二重特異性抗体の説明については、例えばＰＮＡＳ ＵＳＡ
９０（１４），６４４４－８（１９９３）を参照）。本発明の範囲内に包含される抗原結
合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂ’またはＦａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、
ＣＬおよびＣＨ１領域からなる一価フラグメント、または国際公開第２００７０５９７８
２号パンフレットに記載されている一価抗体；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒ
ンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む
二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１領域から本質的になるＦｄフラグメント
；（ｉｖ）ＶＬおよびＶＨ領域から本質的になるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨ領域から
本質的になり、ドメイン抗体（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．２００３ Ｎｏｖ；２ｉ（ｌｌ）：４８４－９０）とも呼ばれるｄＡｂフラグメン
ト（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６（１９８９））；
（ｖｉ）ラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）またはナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ
；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊａｎ；５＿（ｌ）：ｌ
ｌｌ－２４）および（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さら
に、Ｆｖフラグメントの２つの領域、ＶＬおよびＶＨが、別個の遺伝子によってコードさ
れるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域が組み合わされて、一価分子を形成する単一のタ
ンパク質鎖（単一鎖抗体または単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えばＢｉ
ｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３－４２６（１９８８）およびＨｕ
ｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５，５８７９－５８８３（１９８８）を
参照）としてそれらが作製されるのを可能にする合成リンカーによって、組み換え方法を
用いて結合され得る。本発明の文脈におけるこれらのおよび他の有用な抗体フラグメント
は、本明細書においてさらに説明される。抗体という用語は、特に規定されない限り、キ
メラ抗体およびヒト化抗体などの抗体様ポリペプチド、ならびに酵素的切断、ペプチド合
成、および組み換え技術などの任意の公知の技術によって提供される、抗原（抗原結合フ
ラグメント）に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメントも含むことも理解され
るべきである。生成される抗体は、任意のアイソタイプを有し得る。本明細書において使
用される際、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブ
リンクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）を指す。このような
抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ；所望のエピトープに結
合することが可能な好適なフラグメントは、無傷の抗体と同じように有用性について容易
にスクリーニングされ得る。

「二重特異性抗体」という用語は、それぞれ独立した標的を標的にする２つの独立した
抗原結合フラグメントを含有する抗体を指す。これらの標的は、異なるタンパク質上に存
在するエピトープ、または同じ標的上に存在する異なるエピトープであり得る。二重特異
性抗体分子は、親単一特異性二価抗体分子のＨＣの定常領域における補償的アミノ酸改変
を用いて作製され得る。得られるヘテロ二量体抗体は、２つの異なる親単一特異性抗体か
ら与えられる１つのＦａｂを含有する。Ｆｃ領域におけるアミノ酸改変は、時間を経ても
安定した二重特異性を有するヘテロ二量体抗体の向上した安定性をもたらす（Ｒｉｄｇｗ
ａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９，６１７－６２１（
１９９６）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２８５，１９６３７－１
（２０１０）、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ３：６ ５４６－５５７（２０１
１）、Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，ＪＭＢ ４２０，２０４－２１９（２０１２）、Ｍｅ
ｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２５：１０ ５７１－
５８０（２０１２）、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １１０：１１３，５１
４５－５１５０（２０１３）、Ｓｐｒｅｔｅｒ Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ ｅ
ｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ５：５ ６４６－６５４（２０１３））。二重特異性抗体は、Ｓ
ｃＦｖ融合を用いて生成される分子も含み得る。次に、２つの単一特異性ｓｃｆｖは、独
立して、単一の二重特異性分子を生成するために安定したヘテロ二量体を形成することが
可能なＦｃ領域に結合される（Ｍａｂｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＥＤＳ ２３：３ １１５
－１２７（２０１０）。二重特異性分子は、二重の結合能を有する。例えば、ＣＮＳ疾患
を治療するために血液脳関門を横切って治療用抗体を送達するために、治療標的および経
細胞輸送表面受容体の両方を標的にする。

ＧＭ３７、ＧＭ－３７、ＧＭ３７野生型（ｗｔ）、ｍａｂ３７および６００４－３７と
いう用語は、本明細書において同義的に使用され、全て同じ抗体を指す。

抗体ＧＭ３７という用語は、ＣＤＲ１～３配列番号１～３において示される重鎖および
配列番号４～６において示される軽鎖ＣＤＲ１～３を含むかそれからなる抗体またはその
抗原結合フラグメントを含むことが意図される。一実施形態において、抗体ＧＭ３７また
はその抗原結合フラグメントは、配列番号７の重鎖可変領域および／または配列番号８の
軽鎖可変領域を含むかまたはそれからなり得る。例えば、抗体ＧＭ３７は、配列番号８の
可変領域および配列番号１７のκ定常領域からなる軽鎖と一緒に、配列番号７の可変領域
および配列番号１８の定常領域からなる重鎖を含むＩｇＧ抗体であり得る。

タンパク質、これらの場合、抗体の脱アミノ化は、製造および貯蔵中に、また生体内で
も、自然に起こり得るため、最終的な薬剤の品質を管理するのが難しい。脱アミノ化はま
た、場合によっては、分子の活性に影響を与え得る。脱アミノ化は、アスパラギン残基に
おいて起こるが、関連するアスパラギンの位置は、確実に予測するのが難しいことがある
が、場合によっては、アスパラギン－グリシンモチーフによって影響され得る。いくつか
の考えられる脱アミノ化モチーフが、ＧＭ３７抗体上で見られるが、脱アミノ化の見込み
がある１つの部位は、重鎖の残基５４であることが分かった。別のアミノ酸によるアスパ
ラギンのその後の置換は、簡単ではなく、ＧＭ３７の３つの変異体（ＧＭ３７変異体（ｖ
ａｒ）１、２および３）が、元のＧＭ３７（ＧＭ３７野生型（ｗｔ））の活性を保持する
ことが分かった。

ＧＭ３７変異体という用語は、脱アミノ化された変異体１、２または３を指し、ここで
、変異体１は、本明細書において上述されるＧＭ３７抗体と比較して、Ｎ５４Ｓ置換を有
し、変異体２は、Ｎ５４Ｑ置換を有し、変異体３は、Ｎ５４Ｈを有する。

ここで、抗体ＧＭ３７変異体（ｖａｒ）１、２および３は、ＧＭ３７からのＣＤＲ１お
よび３配列番号１および３に示される重鎖および配列番号４～６に示されるＧＭ３７から
の軽鎖ＣＤＲ１～３を含むかまたはそれからなるが、変異体１が、配列番号３３のＣＤＲ
２を有し、変異体２が、配列番号３４のＣＤＲ２を有し、変異体３が、配列番号３５のＣ
ＤＲ２を有するように、それらの重鎖ＣＤＲ２が異なる、抗体またはその抗原結合フラグ
メントを含むことが意図される。

一実施形態において、抗体ＧＭ３７変異体またはそれらの抗原結合フラグメントは、変
異体１、２および３のそれぞれについて配列番号３０、３１および３２の重鎖可変領域、
および配列番号８の軽鎖可変領域を含むかまたはそれからなり得る。抗体ＧＭ３７は、配
列番号８の可変領域および配列番号１７のκ定常領域からなる軽鎖と一緒に、配列番号３
０、３１または３２の可変領域および配列番号１８の定常領域からなる重鎖を含むＩｇＧ
抗体であり得る。

ＧＭ２８５、ＧＭ－２８５、ｍａｂ２８５および６００４－２８５という用語は、本明
細書において同義的に使用され、全て同じ抗体を指す。

抗体ＧＭ２８５という用語は、ＣＤＲ１～３配列番号２０～２２に示される重鎖および
配列番号２３～２５に示される軽鎖ＣＤＲ１～３を含むかまたはそれからなる抗体または
その抗原結合フラグメントを含むことが意図される。一実施形態において、抗体ＧＭ３７
またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２６の重鎖可変領域および／または配列番
号２７の軽鎖可変領域を含むかまたはそれからなり得る。例えば、抗体ＧＭ３７は、配列
番号２７の可変領域および配列番号２９のκ定常領域からなる軽鎖と一緒に、配列番号２
６の可変領域および配列番号２８の定常領域からなる重鎖を含むＩｇＧ抗体であり得る。

ＧＭ２８５抗体は、ヒトα－シヌクレイン（配列番号１０）の配列１１２～１１５（Ｉ
ＬＥＤ；配列番号１９）内のエピトープに特異的に結合する。

本明細書において特に規定されない限り、この領域におけるアミノ酸残基の番号付けは
、ＩＭＧＴ（登録商標）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）
または、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓ
ｍａｎｎ，Ｋ．Ｓ．＆ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．（１９９１）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ
ｅｄｉｔ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２、米国保健福祉省
（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ＨｕｍａｎＳｅｒｖｉ
ｃｅｓ）．Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．＆ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（１９８７）．Ｃａｎｏｎｉｃ
ａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａ
ｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６、９０１
－９１７）にしたがって行われる。

「抗α－シヌクレイン抗体」または「α－シヌクレイン抗体」（記載される文脈に応じ
て、本明細書において同義的に使用される）は、本明細書において上に定義されるα－シ
ヌクレインまたはα－シヌクレインフラグメント、特に、配列番号９および／または１９
に対応するα－シヌクレインの配列に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメ
ントである。

本明細書において使用される際の「ヒト抗体」という用語（「ｈｕｍＡｂ」または「Ｈ
ｕＭａｂ」と略記され得る）は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領
域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖
細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、
インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異によって、または遺伝子再構成中に
、または体細胞突然変異によって誘発される突然変異）。

本明細書において使用される際の「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体
組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を指す。従来のモノクロー
ナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。特
定の実施形態において、モノクローナル抗体は、２つ以上のＦａｂ領域から構成され得、
それによって、２つ以上の標的に対する特異性を高める。「モノクローナル抗体」または
「モノクローナル抗体組成物」という用語は、任意の特定の産生方法（例えば、組み換え
、トランスジェニック、ハイブリドーマなど）によって限定されることは意図されていな
い。

「ヒト化」という用語は、一般に組み換え技術を用いて調製される、非ヒト種に由来す
る免疫グロブリンから得られる抗原結合部位、およびヒト免疫グロブリンの構造および／
または配列に基づいた残りの免疫グロブリン構造を有する分子を指す。抗原結合部位は、
ヒト定常領域に融合された完全な非ヒト抗体可変領域、またはヒト可変領域の適切なヒト
フレームワーク領域に移植されたこのような可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみの
いずれかを含み得る。このようなヒト化分子のフレームワーク残基は、野生型（例えば、
完全ヒト）であってもよく、またはそれらは、配列がヒト化のための基盤として機能した
ヒト抗体に見られない１つまたは複数のアミノ酸置換を含むように修飾され得る。ヒト化
は、分子の定常領域がヒト個体における免疫原として働く可能性を低下させるかまたはな
くすが、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（ＬｏＢｕｇ
ｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）“Ｍｏｕｓｅ／Ｈｕｍａｎ Ｃｈｉｍｅｒｉ
ｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｍａｎ：Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ
．Ｓ．Ａ．）８６：４２２０－４２２４）。別の手法は、ヒト由来の定常領域を提供する
ことだけでなく、可変領域を改変して、それらをヒト型にできる限り近くなるように再形
成することにも焦点を当てている。重鎖および軽鎖の両方の可変領域が、該当する抗原に
対する応答が異なり、結合能を決定する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、これら
の相補性決定領域（ＣＤＲ）には、所与の種において比較的保存され、かつＣＤＲの足場
を提供すると考えられる４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接することが知られてい
る。非ヒト抗体が、特定の抗原に対して調製される場合、可変領域は、非ヒト抗体に由来
するＣＤＲを、改変されるヒト抗体中に存在するＦＲに移植することによって、「再形成
」または「ヒト化」され得る。様々な抗体に対するこの手法の適用は、Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅ
ｔ ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：８５１－８５６．Ｒｉｅｃｈｍａ
ｎｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）“Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒ
ｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）“Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ａｎ Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉ
ｔｙ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，
Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）“Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｍｏｕｓｅ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｙ ＣＤＲ－Ｇｒａｆｔｉｎｇ：Ｔｈｅ
Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ Ｏｆ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｏｎ Ｌｏｏ
ｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７
３－３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
Ｏｆ Ｒｅｓｈａｐｅｄ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ ＨＩＶ－Ｎ
ｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈ
ｙｂｒｉｄｏｍａ ２：１２４－１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９
１）“Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＣＤ４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ”
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：４１８１－４１８５
；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）“Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ａ Ｈｕ
ｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｈｕｍａｎ
Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉ
ｎ ｖｉｖｏ”，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６－２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．
ｅｔ ａｌ．（１９９１）“Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ａｎ
ｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ
．Ａ．）８８：２８６９－２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）“Ｈ
ｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎ Ａｎｔｉ－ｐ１８５ｈｅｒ２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８９：４２８５－４２８９；およびＣｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ
ａｌ．（１９９２）“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｆｏｒ Ｔｈｅ ＣＤ３３ Ａｎｔｉｇｅ
ｎ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９－１１５４によって報告されている。ある
実施形態において、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列（例えば、マウス抗体に由来する全
ての６つのＣＤＲを含むヒト化マウス抗体）を保存する。他の実施形態において、ヒト化
抗体は、元の抗体に対して改変された１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ
、５つ、６つ）を有し、これらは、元の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する
」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。抗原をヒト化する能力は周知である（例えば、
米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５
８５，０８９号明細書；同第５，８５９，２０５号明細書；同第６，４０７，２１３号明
細書；同第６，８８１，５５７号明細書を参照）。

本明細書において使用される際、抗体またはその抗原結合フラグメントは、別のエピト
ープと比べてそのエピトープと、より高頻度で、より迅速に、より長い期間および／また
はより高い親和性または結合活性で反応または会合する場合、別の分子（すなわち、エピ
トープ）の領域に「特異的に」結合するといわれる。一実施形態において、本発明の抗体
、またはその抗原結合フラグメントは、別の分子よりその標的（ヒトαシヌクレイン）に
少なくとも１０倍強く；好ましくは、少なくとも５０倍強く、より好ましくは少なくとも
１００倍強く結合する。好ましくは、抗体、またはその抗原結合フラグメントは、生理学
的条件下で、例えば、生体内で結合する。したがって、ヒトα－シヌクレインの残基１１
２～１１７（ＩＬＥＤＭＰ（配列番号９））内のエピトープに「特異的に結合する」こと
が可能な抗体は、このような特異性でおよび／またはこのような条件下で、ヒトα－シヌ
クレインの残基１１２～１１７内のエピトープに結合することが可能な抗体またはその抗
原結合フラグメントを包含する。このような結合を決定するのに好適な方法は、当業者に
公知であり、例示的な方法が、添付の実施例に記載されている。本明細書において使用さ
れる際、所定の抗原への抗体の結合の文脈における「結合」という用語は、典型的に、抗
原をリガンドとしておよび抗体を検体として用いてＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００
またはＴ２００機器のいずれかにおいて例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によっ
て決定した際の約１０^－７Ｍ以下、例えば約１０^－８Ｍ以下、例えば約１０^－９Ｍ以下の
ＫＤに対応する親和性での結合を指し、所定の抗原または密接に関連している抗原以外の
非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性より少なくとも
１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例え
ば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに対応す
る親和性で所定の抗原に結合する。親和性がより低くなる量は、抗体のＫＤに依存するた
め、抗体のＫＤが非常に低い（すなわち、抗体が非常に特異的である）場合、抗原に対す
る親和性が、非特異的抗原に対する親和性より低くなる量は、少なくとも１０，０００倍
であり得る。

本明細書において使用される際の「ｋｄ」（秒－１または１／秒）という用語は、特定
の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。

本明細書において使用される際の「ｋａ」（Ｍ－１×秒－１または１／Ｍ秒）という用
語は、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度定数を指す。

本明細書において使用される際の「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体－抗原相互
作用の解離平衡定数を指し、ｋｄをｋａで除算することによって得られる。

本明細書において使用される際の「ＫＡ」（Ｍ－１または１／Ｍ）という用語は、特定
の抗体－抗原相互作用の結合平衡定数を指し、ｋａをｋｄで除算することによって得られ
る。

一実施形態において、本発明は、以下の特性：
ｉ．１～５ｎＭまたは１～２ｎＭなどの、０．５～１０ｎＭのα－シヌクレインに対す
る結合親和性（ＫＤ）；
ｉｉ．α－シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する能力；
ｉｉｉ．Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害
を改善する能力；
ｉｖ．インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα－シヌクレインの
レベルを減少させる能力；
ｖ．慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回
復させる能力
ｖｉ．α－シヌクレインのシーディング（インビトロでのおよび／またはパーキンソン
病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化α－シヌクレインの蓄積など）を防ぐ能力；お
よび／または
ｖｉｉ．ヒトの脳における切断α－シヌクレインに結合する能力
の１つまたは複数を示す抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

α－シヌクレインに対する結合親和性（ＫＤ）は、例えば実施例２に記載されている当
該技術分野において周知の方法を用いて決定され得る。

「α－シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する能力」という用語は、初代皮
質ニューロン中のヒトαシヌクレインのフラグメント１～１１９～１２２のカルパイン－
１誘発性形成を阻害する能力を含む（実施例５を参照）。

「Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善
する能力」という用語は、例えば電気生理学的に測定した際に誘発されるｆＥＰＳＰの傾
きによって示されるように、Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける海馬の
ＣＡ１領域におけるシナプス伝達および可塑性の低下を改善する能力を含む（実施例６を
参照）。

「インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα－シヌクレインのレベ
ルを減少させる能力」という用語は、インビボ微小透析を用いて測定した際、海馬覚醒、
自由行動Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおけるヒトαシヌクレインのレベ
ルを低下させる能力を含む（実施例７を参照）。

「慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回復
させる能力」という用語は、パーキンソン病のラット組み換えアデノ随伴ウイルスベクタ
ー（ｒＡＡＶ）モデルにおける運動非対称性を減少させるかまたはなくす能力を含む（実
施例８を参照）。

いくつかの抗体において、ＣＤＲのごく一部、すなわち、ＳＤＲと呼ばれる、結合に必
要とされるＣＤＲ残基のサブセットが、ヒト化抗体において結合を保持するのに必要とさ
れる。関連するエピトープに接触せず、ＳＤＲ中にないＣＤＲ残基が、過去の研究に基づ
いて（例えばＣＤＲ Ｈ２中の残基Ｈ６０～Ｈ６５は、必要とされないことが多い）、Ｃ
ｈｏｔｈｉａ超可変ループの外側にあるＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から（Ｋａｂａｔ ｅ
ｔ ａｌ．（１９９２）ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵ
ＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏ
ｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，
Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏｒ
Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕ
ｌｉｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７を参照）、分子モデリング
によっておよび／または実験により、またはＧｏｎｚａｌｅｓ，Ｎ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（
２００４）“ＳＤＲ Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ｏｆ Ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｕｓｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ
Ｔｏ Ｍｉｎｉｍｉｚｅ Ｉｔｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ”，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．４１：８６３－８７２に記載されるように特定され得る。１つまたは複数のドナ
ーＣＤＲ残基が存在しないかまたは全ドナーＣＤＲが省略される位置におけるこのような
ヒト化抗体において、この位置を占めるアミノ酸は、受容体抗体配列において（Ｋａｂａ
ｔ番号付けによって）対応する位置を占めるアミノ酸であり得る。含まれるＣＤＲ中のド
ナーアミノ酸に対する受容体のこのような置換の数は、競合する考慮事項のバランスを反
映する。このような置換は、ヒト化抗体中のマウスアミノ酸の数を減少させ、結果として
、潜在的な免疫原性を低下させるのに潜在的に有利である。しかしながら、置換は、親和
性の変化も引き起こすことがあり、親和性の著しい低下は回避されるのが好ましい。ＣＤ
Ｒ内の置換の位置および置換するアミノ酸も、実験により選択され得る。

ＣＤＲ残基の単一のアミノ酸改変が、機能的結合の喪失をもたらし得るということ（Ｒ
ｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．ｅｔｃ．（１９８２）“Ｓｉｎｇｌｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓ
ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ａｌｔｅｒｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９（６）：
１９７９－１９８３）は、別の機能的ＣＤＲ配列を系統的に同定するための手段を提供す
る。このような変異体ＣＤＲを得るための１つの好ましい方法において、ＣＤＲをコード
するポリヌクレオチドが突然変異を起こされて（例えばランダム突然変異によって、また
は部位特異的方法（例えば、突然変異遺伝子座をコードするプライマーによるポリメラー
ゼ連鎖媒介性増幅）によって）、置換アミノ酸残基を有するＣＤＲを生成する。元の（機
能的）ＣＤＲ配列中の関連する残基の同一性を、置換される（非機能的）変異体ＣＤＲ配
列の同一性と比較することによって、その置換についてのＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換
スコアが特定され得る。ＢＬＯＳＵＭシステムは、信頼できるアラインメントについて配
列のデータベースを分析することによって作成されるアミノ酸置換のマトリックスを提供
する（Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．（２００４）“Ｗｈｅｒｅ Ｄｉｄ Ｔｈｅ ＢＬＯＳＵＭ６
２ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｃｏｍｅ Ｆｒｏｍ？”，Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（８）：１０３５－１０３６；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ
．（１９９２）“Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ
ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．（ＵＳＡ）８９：１０９１５－１０９１９；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９
０）“Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｔｈｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ
Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆｅａｔ
ｕｒｅｓ Ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅｓ”，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：２２６４－２２６８；Ａｌｔｓ
ｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９１）“Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ
Ｍａｔｒｉｃｅｓ Ｆｒｏｍ Ａｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ Ｐ
ｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９，５５５－５６５。現在、最先
端のＢＬＯＳＵＭデータベースは、ＢＬＯＳＵＭ６２データベース（ＢＬＯＳＵＭ６２．
ｉｉｊ）である。表１は、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを示す（スコアが高くな
るほど、置換がより保存的になり、ひいては置換が機能に影響を与えない可能性が高くな
る）。得られるＣＤＲを含む抗原結合フラグメントが、α－シヌクレインに結合できない
場合、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、不十分に保存的であると見なさ
れ、より高い置換スコアを有する新たな置換候補が選択され、生成される。したがって、
例えば、元の残基がグルタミン酸塩（Ｅ）であり、非機能的置換残基がヒスチジン（Ｈ）
である場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは０であり、より保存的な変化（アス
パラギン酸塩、アスパラギン、グルタミン、またはリジンなどへの）が好ましい。

したがって、本発明は、改良されたＣＤＲを同定するためのランダム突然変異の使用を
想定している。本発明の文脈において、保存的置換は、以下の３つの表の１つまたは複数
に反映されているアミノ酸の種類の範囲内の置換によって定義され得る。

より保存的な置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）としては、バリ
ン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラ
ニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンが挙げられる。

アミノ酸のさらなる基は、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（２ｄ Ｅ
ｄ．１９９３），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている原
理を用いて配合され得る。

ファージディスプレイ技術が、ＣＤＲ親和性を増加させる（または低下させる）のに代
わりに使用され得る。親和性成熟と呼ばれるこの技術は、突然変異または「ＣＤＲウォー
キング（ｗａｌｋｉｎｇ）」を用い、再選択（ｒｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）は、標的抗原
またはその抗原性の抗原結合フラグメントを使用して、初期抗体または親抗体と比較した
際に、抗原に対するより高い（またはより低い）親和性で結合するＣＤＲを有する抗体を
同定する（例えばＧｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
１４９：３９０３を参照）。単一のヌクレオチドではなくコドン全体の突然変異誘発は、
アミノ酸突然変異の半ランダム化レパートリーをもたらす。変異体クローンのプールから
なるライブラリーが構築され得、変異体クローンのそれぞれが、単一のＣＤＲ中の単一の
アミノ酸改変により異なり、各ＣＤＲ残基に対して各可能なアミノ酸置換を提示する変異
体を含む。抗原に対する増加した（または低下した）結合親和性を有する突然変異体は、
固定化突然変異体を標識抗原と接触させることによってスクリーニングされ得る。当該技
術分野において公知の任意のスクリーニング方法が、抗原に対する増加したまたは低下し
た親和性を有する突然変異体抗体を同定するのに使用され得る（例えば、ＥＬＩＳＡ）（
Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．
）９５：６０３７；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
１５５：１９９４を参照）。軽鎖をランダム化するＣＤＲウォーキングが、使用可能で
あり得る（Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２６３：５５
１を参照）。

このような親和性成熟を達成するための方法は、例えば：Ｋｒａｕｓｅ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ
ａｌ．（２０１１）“Ａｎ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｔｈａｔ Ｄｉ
ｓｔｏｒｔｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒ
ｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ”
，ＭＢｉｏ．２（１）ｐｉｉ：ｅ００３４５－１０．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ
．００３４５－１０；Ｋｕａｎ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ
－Ｍａｔｕｒｅｄ Ａｎｔｉ－Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＢ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏ
ｍａｓ Ａｎｄ Ｍｅｌａｎｏｍａｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０．１００２／
ｉｊｃ．２５６４５；Ｈａｃｋｅｌ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）“Ｓｔａｂｉｌ
ｉｔｙ Ａｎｄ ＣＤＲ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｂｉａｓｅｓ Ｅｎｒｉｃｈ Ｂｉ
ｎｄｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．４０１（１）：８４－９６；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００
９）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ
ｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｇａｉｎ
ｓｔ ＨＩＶ－１ ｇｐ４１”，ＭＡｂｓ １（５）：４６２－４７４；Ｇｕｓｔｃｈｉ
ｎａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００９）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｂｙ
Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ ＣＤＲ－Ｈ２
Ｌｏｏｐ Ｏｆ Ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｆａｂ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆｒｏｍ Ａ
Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｎａｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａ
ｎｄ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒｉｍｅｒｉ
ｃ Ｃｏｉｌｅｄ－Ｃｏｉｌ Ｏｆ Ｇｐ４１ Ｙｉｅｌｄｓ Ａ Ｓｅｔ Ｏｆ Ｆａ
ｂｓ Ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＨＩＶ－１ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｏ
ｔｅｎｃｙ Ａｎｄ Ｂｒｅａｄｔｈ”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９３（１）：１１２－１
１９；最後に、Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔ
ｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｒａｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒ Ａｎｔｉ
－ＲＡＧＥ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｒｅｖｅａｌｓ Ａ Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｏｆ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｓｔ
ｉｃｉｔｙ Ｂｏｔｈ Ｉｎｓｉｄｅ Ａｎｄ Ｏｕｔｓｉｄｅ Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔａｒｉｔｙ－Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３８８（３）：５４１－５５８；Ｂｏｓｔｒｏｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）“
Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｎｄ
Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”
，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２５：３５３－３７６；Ｓｔｅｉｄｌ，Ｓ．ｅ
ｔ ａｌ．（２００８）“Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ
Ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＧＭ－ＣＳＦ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ
ＣＤＲ－Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６（１）：１
３５－１４４；およびＢａｒｄｅｒａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００８）“Ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｂｙ
Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ）１０５（２６）：９０２９－９０３４に記載されている。

したがって、包含される抗体またはそれらの抗原結合フラグメントのＣＤＲ変異体の配
列は、置換によって；例えば置換される４つのアミノ酸残基、３つのアミノ酸残基、２つ
のアミノ酸残基または１つのアミノ酸残基によって、親抗体、ＧＭ３７、ＧＭ３７ ｖａ
ｒ １～３、または２８５のＣＤＲの配列と異なり得る。本発明の一実施形態によれば、
ＣＤＲ領域中のアミノ酸が、上記の３つの表において定義されるように、保存的置換で置
換され得ることがさらに想定される。

本明細書において使用される際の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療するこ
と（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患または障害の進行または重症度を改善し、
遅らせ、軽減し、または抑制すること、またはこのような疾患または障害の１つまたは複
数の症状または副作用を改善し、遅らせ、軽減し、または抑制することを意味する。本発
明の趣旨では、「治療」または「治療すること」は、有益なまたは所望の臨床結果を得る
ための手法をさらに意味し、ここで、「有益なまたは所望の臨床結果」としては、限定は
されないが、部分的であるかまたは全体的であるか、検出可能かまたは検出不可能かにか
かわらず、症状の軽減、障害または疾患の程度の減少、安定した（すなわち、悪化してい
ない）疾患または障害状態、疾患または障害状態の進行の遅延または緩徐化、疾患または
障害状態の改善または緩和、および疾患または障害の寛解が挙げられる。

「有効量」は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに適用される場合、意図
される生物学的効果または所望の治療結果（限定はされないが臨床結果を含む）を達成す
るのに、必要な投与量および期間にわたる、十分な量を指す。「治療的に有効な量」とい
う語句は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに適用される場合、障害もしく
は疾患の状態の進行、または障害もしくは疾患の症状の進行を改善し、緩和し、安定させ
、抑制し、遅らせ、軽減し、または遅延させるのに十分な、抗体、またはその抗原結合フ
ラグメントの量を表すことが意図される。一実施形態において、本発明の方法は、他の化
合物と組み合わせた、抗体、またはその抗原結合フラグメントの投与を提供する。このよ
うな場合、「有効量」は、意図される生物学的効果を引き起こすのに十分な組合せの量で
ある。

本発明の抗α－シヌクレイン抗体またはその抗原結合フラグメントの治療的に有効な量
は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに抗α－シヌクレイン抗体が個体にお
ける所望の応答を引き起こす能力などの要因に応じて変化し得る。治療的に有効な量はま
た、抗体または抗体部分の何らかの毒性または有害作用を、治療的に有益な効果が上回る
量である。

上に示されるように、本発明は、特に、ヒトα－シヌクレインのアミノ酸１１２～１１
７（配列番号９（ＩＬＥＤＭＰ））内のエピトープに特異的に結合することが可能なモノ
クローナル抗体に関する。一実施形態において、抗体は、α－シヌクレインの１１２～１
１７アミノ酸内のエピトープへの結合について抗体ＧＭ３７と競合することが可能である
。

ＧＭ３７、その変異体ＧＭ３７ ｖａｒ １～３およびＧＭ２８５によって例示される
本発明の抗体、ならびにそれらのα－シヌクレイン結合フラグメントは、α－シヌクレイ
ンの残基１～１１９／１２２からなる毒性α－シヌクレインフラグメントに結合し、（例
えば、α－シヌクレインフラグメントに細胞外で結合し、それによってそれが細胞に取り
込まれるのを防ぐことによってその毒性を中和することが可能である。意外なことに、α
－シヌクレインのアミノ酸１１２～１１７内のエピトープに結合することが可能な本発明
の抗体は、ヒト脳において毒性α－シヌクレイン種に結合する際に抗体９Ｅ４などの先行
技術の抗体より優れており、細胞外α－シヌクレインを除去し、インビボでα－シヌクレ
インによって誘発されるシナプス伝達障害を正常化するのに優れた効果を与える。本発明
の抗体は、パーキンソン病のラットモデルにおける関連する運動表現型の出現を改善する
こともできる。

本発明の抗体は、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。

本発明は、患者におけるα－シヌクレイン凝集体形成を減少させる方法であって、この
ような治療を必要とする患者に、治療的に有効な量の本発明の抗体を投与する工程を含む
方法も提供する。

さらに、抗体は、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または安定剤と一緒に組成
物中にあり得る。本発明の抗体は、治療に使用され得る。特に、本発明の抗体は、パーキ
ンソン病（特発性、遺伝性パーキンソン病を含む）、ゴーシェ病、びまん性レビー小体病
（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマ
ー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症および多系統萎縮症などのシヌクレイノ
パチーを治療するのに使用され得る。

本発明によって想定される治療は、長期であってもよく、患者は、少なくとも２週間、
例えば少なくとも１ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそれ以上治療され得る。

本発明のその抗原結合フラグメントの抗体は、様々な細胞株、例えばヒト細胞株、非ヒ
ト哺乳動物細胞株、および昆虫細胞株、例えばＣＨＯ細胞株、ＨＥＫ細胞株、ＢＨＫ－２
１細胞株、マウス細胞株（骨髄腫細胞株など）、線維肉腫細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株、
ＨＫＢ－１１細胞株、ＣＡＰ細胞株およびＨｕＨ－７ヒト細胞株において生産され得る（
内容が参照により本明細書に援用される、Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ，２０１５，Ｃｒｉ
ｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｅｐ １８：１－１３．）。

本発明の抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５
（１９７５）によって最初に記載されているハイブリドーマ方法によって産生されるモノ
クローナル抗体であってもよく、または組み換えＤＮＡ方法によって産生され得る。モノ
クローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５
２，６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏ
ｌ．２２２，５８１－５９７（１９９１）に記載されている技術を用いて、ファージ抗体
ライブラリーから単離され得る。モノクローナル抗体は、任意の好適な源から得られる。
したがって、例えば、モノクローナル抗体は、例えば、表面において抗原を発現する細胞
、または該当する抗原をコードする核酸の形態で、該当する抗原で免疫されたマウスから
得られるマウス脾臓Ｂリンパ球細胞から調製されるハイブリドーマから得られる。モノク
ローナル抗体はまた、免疫されたヒトまたは非ヒト哺乳動物（ラット、ウサギ、イヌ、ヒ
ツジ、ヤギ、霊長類など）の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから得られる。

一実施形態において、本発明の抗体は、ヒト抗体である。α－シヌクレインに対するヒ
トモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を有するトランスジェニッ
クまたは染色体導入マウスを用いて生成され得る。このようなトランスジェニックおよび
染色体導入マウスは、本明細書においてそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼
ばれるマウスを含む。

ＨｕＭＡｂマウスは、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異と一緒
に、再配列されていないヒト重鎖可変および定常（μおよびＹ）ならびに軽鎖可変および
定常（κ）鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座
（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３
６８，８５６－８５９（１９９４））。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはＩｇ
κの減少した発現を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子
が、クラススイッチおよび体細胞突然変異を起こして、高親和性ヒトＩｇＧ、κモノクロ
ーナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）、上記参照；Ｌ
ｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌｏｇｙ １１３，４９－１０１（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ Ｈ
ｕｓｚａｒ，Ｄ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３ ６５－９３
（１９９５）およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ａｎｎ．Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４ ５３６－５４６（１９９５）に概説されている）。Ｈｕ
ＭＡｂマウスの作製は、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０，６２８７－６２９５（１９９２）、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，６４７－６５６（１９
９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９１２－２
９２０（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６，５７９－５９１（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５－８５１（１９９
６）に詳細に記載されている。米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，
５６９，８２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３
３，４２５号明細書、米国特許第５，７８９，６５０号明細書、米国特許第５，８７７，
３９７号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，８１４，３１
８号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、米国特許第５，７７０，４２９号
明細書、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９８／２４８８４号パンフ
レット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９３／１２２７号パン
フレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／０３９１８号
パンフレットおよび国際公開第０１／０９１８７号パンフレットも参照されたい。

ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７およびＨＣｏ２０マウスは、それらの内因性軽鎖（
κ）遺伝子におけるＪＫＤ破壊（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２，８１１
－８２０（１９９３）に記載されているように）、それらの内因性重鎖遺伝子におけるＣ
ＭＤ破壊（国際公開第０１／１４４２４号パンフレットの実施例１に記載されているよう
に）、およびＫＣｏ５ヒトκ軽鎖導入遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５－８５１（１９９６）に記載されて
いるように）を有する。さらに、ＨＣｏ７マウスは、ＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子（米国
特許第５，７７０，４２９号明細書に記載されているように）を有し、ＨＣｏ１２マウス
は、ＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子（国際公開第０１／１４４２４号パンフレットの実施
例２に記載されているように）を有し、ＨＣｏ１７マウスは、ＨＣｏ１７ヒト重鎖導入遺
伝子（国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例２に記載されているように）
を有し、ＨＣｏ２０マウスは、ＨＣｏ２０ヒト重鎖導入遺伝子を有する。得られるマウス
は、内因性マウス重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の破壊のためにバックグラウンドのホモ接合
体においてヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖導入遺伝子を発現する。

ＫＭマウス株において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭ
ＢＯ Ｊ．１２，８１１－８２０（１９９３）に記載されているようにホモ接合的に破壊
されており、内因性マウス重鎖遺伝子は、国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの
実施例１に記載されているようにホモ接合的に破壊されている。このマウス株は、Ｆｉｓ
ｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５
－８５１（１９９６）に記載されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子、ＫＣｏ５を保有
する。このマウス株は、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載されているよ
うに、染色体１４フラグメントｈＣＦ（ＳＣ２０）から構成されるヒト重鎖導入染色体も
保有する。ＨＣｏ１２－Ｂａｌｂ／ｃ、ＨＣｏ１７－Ｂａｌｂ／ｃおよびＨＣｏ２０－Ｂ
ａｌｂ／ｃマウスは、国際公開第０９／０９７００６号パンフレットに記載されているよ
うに、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７およびＨＣｏ２０を、ＫＣｏ５［Ｊ／Ｋ］（Ｂａｌｂ）に
交差させることによって生成され得る。

ＫＭマウス株において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭ
ＢＯ Ｊ．１２，８１１－８２０（１９９３）に記載されているようにホモ接合的に破壊
されており、内因性マウス重鎖遺伝子は、国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの
実施例１に記載されているようにホモ接合的に破壊されている。このマウス株は、Ｆｉｓ
ｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５
－８５１（１９９６）に記載されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子、ＫＣｏ５を保有
する。このマウス株は、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載されているよ
うに、染色体１４抗原結合フラグメントｈＣＦ（ＳＣ２０）から構成されるヒト重鎖導入
染色体も保有する。

これらのトランスジェニックマウスに由来する脾細胞は、周知の技術にしたがって、ヒ
トモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成するのに使用され得る。本発明の
ヒトモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、または他の種に由来する本発明の抗体
はまた、該当する免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列についてトランスジェニックな別の
非ヒト哺乳動物または植物の生成、および回収可能な形態での抗体の産生によって遺伝子
導入的に生成され得る。哺乳動物におけるトランスジェニック産生に関連して、抗体は、
ヤギ、ウシ、または他の哺乳動物の乳汁中で産生され、それから回収され得る。例えば米
国特許第５，８２７，６９０号明細書、米国特許第５，７５６，６８７号明細書、米国特
許第５，７５０，１７２号明細書および米国特許第５，７４１，９５７号明細書を参照さ
れたい。

本発明の抗体は、任意のアイソタイプのものであり得る。アイソタイプの選択は、典型
的に、ＡＤＣＣ誘導などの所望のエフェクター機能によって導かれる。例示的なアイソタ
イプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域、κ
またはλのいずれかが使用され得る。必要に応じて、本発明の抗α－シヌクレイン抗体の
クラスは、公知の方法によってスイッチされ得る。例えば、元はＩｇＭであった本発明の
抗体は、本発明のＩｇＧ抗体にクラススイッチされ得る。さらに、クラススイッチ技術は
、あるＩｇＧサブクラスを別のＩｇＧサブクラスに、例えばＩｇＧｌからＩｇＧ２に変換
するのに使用され得る。したがって、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療的
使用のために、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体へのアイソタ
イプスイッチによって変更され得る。一実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１抗
体、例えばＩｇＧ１、κである。抗体は、そのアミノ酸配列が、他のアイソタイプと比べ
てそのアイソタイプに最も相同性が高い場合、特定のアイソタイプのものであるといわれ
る。

一実施形態において、本発明の抗体は、完全長抗体、好ましくは、ＩｇＧ抗体、特に、
ＩｇＧ１、κ抗体である。別の実施形態において、本発明の抗体は、抗体フラグメントま
たは一本鎖抗体である。

抗体およびその抗原結合フラグメントは、例えば従来の技術を用いた抗原結合断片化に
よって得られ、抗原結合フラグメントは、全抗体について本明細書に記載されるのと同じ
ように有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２抗原結合フラグ
メントは、抗体をペプシンで処理することによって生成され得る。得られるＦ（ａｂ’）
２抗原結合フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元するように処理されて、Ｆａｂ’抗
原結合フラグメントを生成し得る。Ｆａｂ抗原結合フラグメントはＩｇＧ抗体をパパイン
で処理することによって得られ；Ｆａｂ’抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ抗体のペプシ
ン消化により得られる。Ｆ（ａｂ’）抗原結合フラグメントはまた、チオエーテル結合ま
たはジスルフィド結合により、以下に記載されるＦａｂ’を結合することによって生成さ
れ得る。Ｆａｂ’抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド
結合を切断することによって得られる抗体抗原結合フラグメントである。Ｆａｂ’－抗原
結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２抗原結合フラグメントを、ジチオスレイトールなど
の還元剤で処理することによって得られる。抗体抗原結合フラグメントはまた、組み換え
細胞におけるこのような抗原結合フラグメントをコードする核酸の発現によって生成され
得る（例えばＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８４、１２
３－３８（１９９５）を参照）。例えば、Ｆ（ａｂ’）２抗原結合フラグメントの一部を
コードするキメラ遺伝子は、このような切断された抗体抗原結合フラグメント分子を生成
するために、Ｈ鎖のＣＨ１領域およびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、続いて翻訳停
止コドンを含み得る。

一実施形態において、抗α－シヌクレイン抗体は、一価抗体、好ましくは、ヒンジ領域
の欠失を有する国際公開第２００７０５９７８２号パンフレット（その全体が参照により
本明細書に援用される）に記載されている一価抗体である。したがって、一実施形態にお
いて、抗体は、一価抗体であり、前記抗α－シヌクレイン抗体は、ｉ）前記一価抗体の軽
鎖をコードする核酸構築物を提供する工程であって、前記構築物が、選択された抗原特異
的抗α－シヌクレイン抗体のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列およびＩｇの定常Ｃ
Ｌ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、選択された抗原特異的抗体のＶＬ
領域をコードする前記ヌクレオチド配列およびＩｇのＣＬ領域をコードする前記ヌクレオ
チド配列が、作動可能に一緒に連結され、ＩｇＧ１サブタイプの場合、ＣＬ領域をコード
するヌクレオチド配列は、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下でまたは動物もしくはヒト
に投与されるとき、ＣＬ領域の同一のアミノ酸配列を含む他のペプチドとともにジスルフ
ィド結合または共有結合を形成することが可能なアミノ酸をＣＬ領域が含まないように修
飾されている工程と；ｉｉ）前記一価抗体の重鎖をコードする核酸構築物を提供する工程
であって、前記構築物が、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードするヌクレオチ
ド配列およびヒトＩｇの定常ＣＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｃ
Ｈ領域をコードするヌクレオチド配列は、ヒンジ領域に対応する領域および、Ｉｇサブタ
イプによって必要とされるように、ＣＨ３領域などのＣＨ領域の他の領域が、ポリクロー
ナルヒトＩｇＧの存在下でまたは動物ヒトに投与されるとき、ヒトＩｇのＣＨ領域の同一
のアミノ酸配列を含む他のペプチドとともに、ジスルフィド結合または共有結合または安
定した非共有重鎖間結合の形成に関与するアミノ酸残基を含まないように修飾されており
、選択された抗原特異的抗体のＶＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列および前記Ｉ
ｇのＣＨ領域をコードする前記ヌクレオチド配列が、作動可能に一緒に連結される工程と
；ｉｉｉ）前記一価抗体を生成するために細胞発現系を提供する工程と；ｉｖ）（ｉｉｉ
）の細胞発現系の細胞内で（ｉ）および（ｉｉ）の核酸構築物を共発現することによって
、前記一価抗体を生成する工程とを含む方法によって構築される。

同様に、一実施形態において、抗α－シヌクレイン抗体は、
（ｉ）本明細書に記載される本発明の抗体の可変領域または前記領域の抗原結合部分、
および
（ｉｉ）免疫グロブリンのＣＨ領域またはＣＨ２およびＣＨ３領域を含むその領域
を含む一価抗体であり、ここで、ＣＨ領域またはその領域は、ヒンジ領域に対応する領域
および、免疫グロブリンがＩｇＧ４サブタイプでない場合、ＣＨ３領域などのＣＨ領域の
他の領域が、ポリクローナルヒトＩｇＧの存在下で、同一のＣＨ領域とともにジスルフィ
ド結合を形成するか、または同一のＣＨ領域とともに他の共有結合または安定した非共有
重鎖間結合を形成することが可能なアミノ酸残基を含まないように修飾されている。

さらなる実施形態において、一価抗α－シヌクレイン抗体の重鎖は、ヒンジ領域全体が
欠失しているように修飾されている。

別のさらなる実施形態において、前記一価抗体の配列は、それがＮ結合型グリコシル化
のための受容体部位を含まないように修飾されている。

本発明は、抗α－シヌクレイン結合領域（例えば、抗α－シヌクレインモノクローナル
抗体のα－シヌクレイン結合領域）が、２つ以上のエピトープを標的にする二価または多
価二重特異性骨格の一部である「二重特異性抗体」も含む（例えば、第２のエピトープは
、二重特異性抗体が、血液脳関門などの生物学的障壁を越える改良されたトランスサイト
ーシスを示し得るように、活性な輸送受容体のエピトープを含み得る）。したがって、別
のさらなる実施形態において、抗シヌクレイン抗体の一価Ｆａｂは、異なるタンパク質を
標的にするさらなるＦａｂまたはｓｃｆｖに結合されて、二重特異性抗体を生成し得る。
二重特異性抗体は、二重機能、例えば抗シヌクレイン結合領域によって与えられる治療機
能、および血液脳関門などの生物学的障壁を越える輸送を促進するために受容体分子に結
合し得る輸送機能を有し得る。

本発明の抗α－シヌクレイン抗体、およびその抗原結合フラグメントは、一本鎖抗体も
含む。一本鎖抗体は、重鎖および軽鎖Ｆｖ領域が結合されたペプチドである。一実施形態
において、本発明は、本発明の抗α－シヌクレイン抗体のＦｖにおける重鎖および軽鎖が
、ペプチド一本鎖において（典型的に、約１０、１２、１５つまたはそれ以上のアミノ酸
残基の）フレキシブルペプチドリンカーと結合される一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を提供する
。このような抗体を産生する方法が、例えば米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｐ
ｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒ
ｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１
５（１９９４）、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３－４２６（
１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５，５８７９－５８８
３（１９８８）およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５
５２－５５４（１９９０）に記載されている。一本鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみ
が使用される場合、一価であり、２つのＶＨおよびＶＬが使用される場合、二価であり、
または３つ以上のＶＨおよびＶＬが使用される場合、多価であり得る。

本明細書に記載される抗α－シヌクレイン抗体およびその抗原結合フラグメントは、任
意の好適な数の修飾アミノ酸の包含および／またはこのような共役置換基との結合によっ
て修飾され得る。これに関連する適合性は、一般に、非誘導体化親抗α－シヌクレイン抗
体に関連するα－シヌクレイン選択性および／または抗α－シヌクレイン特異性を少なく
とも実質的に保持する能力によって決定される。１つまたは複数の修飾アミノ酸の包含は
、例えば、ポリペプチド血清半減期を増加させ、ポリペプチド抗原性を低下させ、または
ポリペプチド貯蔵安定性を増加させるのに有利であり得る。アミノ酸は、例えば、組み換
え産生の際に翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）もしくは翻訳後に
（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）修飾されるか（例えば、哺乳類細胞にお
ける発現の際のＮ－Ｘ－Ｓ／ＴモチーフにおけるＮ結合型グリコシル化）または合成手段
によって修飾される。修飾アミノ酸の非限定的な例としては、グリコシル化アミノ酸、硫
酸化アミノ酸、プレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、
アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カル
ボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などが挙げられる。アミノ酸の修飾の当業者の指
針となるのに十分な言及は、文献全体を通して十分にある。例のプロトコルが、Ｗａｌｋ
ｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｏｎ ＣＤ－Ｒｏｍ，Ｈｕｍａ
ｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪに見られる。修飾アミノ酸は、例えば、グリコシ
ル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオ
チン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、または有機誘導化剤にコン
ジュゲートされたアミノ酸から選択され得る。

抗α－シヌクレイン抗体はまた、例えばそれらの血中半減期を増加させるために、ポリ
マーへの共有結合によって化学修飾され得る。例示的なポリマー、およびそれらをペプチ
ドに結合するための方法が、例えば米国特許第４，７６６，１０６号明細書、米国特許第
４，１７９，３３７号明細書、米国特許第４，４９５，２８５号明細書および米国特許第
４，６０９，５４６号明細書に示されている。さらなる例示的なポリマーとしては、ポリ
オキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、約１，０
００～約４０，０００、例えば約２，０００～約２０，０００、例えば、約３，０００～
１２，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧ）が挙げられる。

本発明の抗体は、診断法においてまたは画像診断用リガンドとしてさらに使用され得る
。

一実施形態において、１つまたは複数の放射性標識アミノ酸を含む抗α－シヌクレイン
抗体が提供される。放射性標識抗α－シヌクレイン抗体は、診断および治療目的の両方に
使用され得る（放射性標識分子への結合は、別の考えられる特徴である）。このような標
識の非限定的な例としては、限定はされないが、ビスマス（^２１３Ｂｉ）、炭素（^１１Ｃ
、^１３Ｃ、^１４Ｃ）、クロム（^５１Ｃｒ）、コバルト（^５７Ｃｏ、^６０Ｃｏ）、銅（^６４
Ｃｕ）、ジスプロシウム（^１６５Ｄｙ）、エルビウム（^１６９Ｅｒ）、フッ素（^１８Ｆ）
、ガドリニウム（^１５３Ｇｄ、^１５９Ｇｄ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、ゲルマ
ニウム（^６８Ｇｅ）、金（^１９８Ａｕ）、ホルミウム（^１６６Ｈｏ）、水素（^３Ｈ）、イ
ンジウム（^１１１Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１５Ｉｎ）、ヨウ素（^１２１Ｉ、^１
２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、イリジウム（^１９２Ｉｒ）、鉄（^５９Ｆｅ）、クリプト
ン（^８１ｍＫｒ）、ランタン（^１４０Ｌａ）、ルテチウム（^１７７Ｌｕ）、マンガン（^５
４Ｍｎ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、窒素（^１３Ｎ、^１５Ｎ）、酸素（^１５Ｏ）、パラジ
ウム（^１０３Ｐｄ）、リン（^３２Ｐ）、カリウム（^４２Ｋ）、プラセオジム（^１４２Ｐｒ
）、プロメチウム（^１４９Ｐｍ）、レニウム（^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ）、ロジウム（^１
０５Ｒｈ）、ルビジウム（^８１Ｒｂ、^８２Ｒｂ）、ルテニウム（^８２Ｒｕ、^９７Ｒｕ）、
サマリウム（^１５３Ｓｍ）、スカンジウム（^４７Ｓｃ）、セレン（^７５Ｓｅ）、ナトリウ
ム（^２４Ｎａ）、ストロンチウム（^８５Ｓｒ、^８９Ｓｒ、^９２Ｓｒ）、硫黄（^３５Ｓ）、
テクネチウム（^９９Ｔｃ）、タリウム（^２０１Ｔｌ）、スズ（^１１３Ｓｎ、^１１７Ｓｎ）
、キセノン（^１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（^１６９Ｙｂ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｙｂ）、
イットリウム（^９０Ｙ）および亜鉛（^６５Ｚｎ）が挙げられる。放射性標識アミノ酸およ
び関連するペプチド誘導体を調製するための方法は、当該技術分野において公知である（
例えばＪｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａ
ｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６５５－６８６（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｆｎｅ
ｒ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｒａｖｅｎ（１９９６））
ならびに米国特許第４，６８１，５８１号明細書、米国特許第４，７３５，２１０号明細
書、米国特許第５，１０１，８２７号明細書、米国特許第５，１０２，９９０号明細書（
米国再発行特許第３５，５００号明細書）、米国特許第５，６４８，４７１号明細書およ
び米国特許第５，６９７，９０２号明細書を参照。例えば、放射性同位体が、クロラミン
Ｔ法によって結合され得る（Ｌｉｎｄｅｇｒｅｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）“Ｃｈ
ｌｏｒａｍｉｎｅ－Ｔ Ｉｎ Ｈｉｇｈ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ－Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒａｄ
ｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎ－Ｓｕｃｃｉ
ｎｉｍｉｄｙｌ－３－（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｔａｎｎｙｌ）Ｂｅｎｚｏａｔｅ Ａｓ
Ａｎ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ”，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５（７）：６５９
－６６５；Ｋｕｒｔｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）“Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ Ｐｈｅｎｅｔｈｙ
ｌａｍｉｎｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｔｏ Ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ Ｌｏ
ｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｕｍｏｒ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６（９）：１２
５５－１２６１；Ｒｅａ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）“Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃａｌｌｙ ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔａｒｇｅ
ｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒｓ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０（３ Ｓｕｐｐｌ）：８５７ｓ
－８６１ｓ）。

本発明は、蛍光標識（希土類キレート（例えば、ユウロピウムキレート）など）、フル
オレセイン型標識（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、５－
カルボキシフルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン、ジクロロトリアジニルアミ
ンフルオレセイン）、ローダミン型標識（例えば、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）
５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＡＭＲＡ（登録商標）またはダンシルクロリド）、
ＶＩＶＯＴＡＧ ６８０ ＸＬ ＦＬＵＯＲＯＣＨＲＯＭＥ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ）、フィコエリトリン；ウンベリフェロン、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ；シアニン；フ
ィコエリトリン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ－ＳＥ（登録商標）（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）またはそれらの類似体（これらは全て、光学的検出に好適である）を用
いて検出可能に標識される抗α－シヌクレイン抗体およびその抗原結合フラグメントも提
供する。化学発光標識が、用いられてもよい（例えば、ルミノール、ルシフェラーゼ、ル
シフェリン、およびイクオリン）。このような診断および検出はまた、本発明の診断用分
子を、限定はされないが、様々な酵素、限定はされないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ
、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ
を含む酵素を含む検出可能な物質に、または限定はされないが、ストレプトアビジン／ビ
オチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族複合体に結合することによって行われ
得る。

化学発光標識が、用いられてもよい（例えば、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェ
リン、およびイクオリン）。このような診断および検出はまた、本発明の診断用分子を、
限定はされないが、様々な酵素、限定はされないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む
酵素を含む検出可能な物質に、または限定はされないが、ストレプトアビジン／ビオチン
およびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族複合体に結合することによって行われ得る。
常磁性標識も用いられ得、好ましくは、ポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）または単
一光子放射コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を用いて検出される。このような常磁
性標識としては、限定はされないが、アルミニウム（Ａｌ）、バリウム（Ｂａ）、カルシ
ウム（Ｃａ）、セリウム（Ｃｅ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、エルビウム（Ｅｒ）、ユウ
ロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ホルミウム（Ｈｏ）、イリジウム（Ｉｒ）、
リチウム（Ｌｉ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍ）、ネオ
ジム（Ｎｄ）、オスミウム（Ｏｓ）、酸素（Ｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、
ロジウム（Ｒｈ）、ルテニウム（Ｒｕ）、サマリウム（Ｓｍ）、ナトリウム（Ｎａ）、ス
トロンチウム（Ｓｒ）、テルビウム（Ｔｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、スズ（Ｓｎ）、チタン
（Ｔｉ）、タングステン（Ｗ）、およびジルコニウム（Ｚｉ）、特に、Ｃｏ^＋２、ＣＲ^＋
２、Ｃｒ^＋３、Ｃｕ^＋２、Ｆｅ^＋２、Ｆｅ^＋３、Ｇａ^＋３、Ｍｎ^＋３、Ｎｉ^＋２、Ｔｉ^＋
３、Ｖ^＋３、およびＶ^＋４の常磁性イオン、様々なポジトロン放出型断層撮影法を用いた
ポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンを含有する化合物が挙げられる。

したがって、一実施形態において、本発明の抗α－シヌクレイン抗体は、蛍光標識、化
学発光標識、常磁性標識、放射性同位体標識または酵素標識で標識され得る。標識抗体は
、被験体の脳における前記α－シヌクレインの存在または量を検出または測定するのに使
用され得る。この方法は、前記α－シヌクレインに結合された抗α－シヌクレイン抗体の
インビボイメージングの検出または測定を含んでもよく、前記α－シヌクレインに結合さ
れた前記抗α－シヌクレイン抗体のエクスビボイメージングを含み得る。

さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの１
つまたは複数のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターに関する。このような発現ベク
ターは、本発明の抗体および抗原結合フラグメントの組み換え産生に使用され得る。

本発明の文脈における発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター、および合
成核酸ベクター（好適な組の発現制御要素を含む核酸配列）を含む、任意の好適なＤＮＡ
またはＲＮＡベクターであり得る。このようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体
、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドお
よびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、およびウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態において、抗α－シヌクレイン抗体コード核酸
は、例えば、線形発現要素（ｌｉｎｅａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）（
例えば、Ｓｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １２，３５
５－５９（１９９７）に記載されているように）、圧縮（ｃｏｍｐａｃｔｅｄ）核酸ベク
ター（例えば米国特許第６，０７７，８３５号明細書および／または国際公開第００／７
００８７号パンフレットに記載されているように）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ １９／１８
、またはｐＵＣ １１８／１１９、「ミッジ（ｍｉｄｇｅ）」最小サイズ核酸ベクターな
どのプラスミドベクター（例えば、Ｓｃｈａｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＭｏＩ Ｔｈ
ｅｒ ３，７９３－８００（２００１）に記載されているように）を含む裸のＤＮＡまた
はＲＮＡベクターにおいて、またはＣａＰＯ_４沈殿構築物などの沈殿核酸ベクター構築物
（例えば、国際公開第００／４６１４７号パンフレット、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ａｎｄ
Ｒｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３，９５５１－５５（１９８６）、Ｗｉｇｌｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４，７２５（１９７８）、およびＣｏｒａｒｏ ａｎｄ
Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２，６０３（１９８１
）に記載されているように）として含まれる。このような核酸ベクターおよびその使用法
は、当該技術分野において周知である（例えば米国特許第５，５８９，４６６号明細書お
よび米国特許第５，９７３，９７２号明細書を参照）。

一実施形態において、ベクターは、細菌細胞における抗α－シヌクレイン抗体またはそ
の抗原結合フラグメントの発現に好適である。このようなベクターの例としては、Ｂｌｕ
ｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆
Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５５０３－５５０９（１９８９）
、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）など）などの発現ベクター
が挙げられる。

発現ベクターは、さらにまたは代わりに、酵母系における発現に好適なベクターであり
得る。酵母系における発現に好適な任意のベクターが用いられてもよい。好適なベクター
としては、例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなどの構成的または誘
導性プロモータを含むベクターが挙げられる（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ
．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）、Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３，５１６－５４４（１９８７）、Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ，Ｄ．
ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８２４，３２９－３５８（２０１２）
、Ｃｅｌｉｋ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３０（５），１１０８
－１１１８（２０１２）、Ｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．１４２（２），１０５－１２４（２００７）、Ｂｏｅｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａ
ｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（３），５１３－５２
３（２００７）、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖａａｒｔ，Ｊ．Ｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１７８，３５９－３６６（２００２）、およびＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８，３４９－３５７（２００２）に概説されている）。

本発明の発現ベクターにおいて、抗α－シヌクレイン抗体コード核酸は、任意の好適な
プロモータ、エンハンサー、および他の発現促進要素を含むかまたはそれらと結合され得
る。このような要素の例としては、強力な発現プロモータ（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプ
ロモータ／エンハンサーならびにＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ、およびＨＩ
Ｖ ＬＴＲプロモータ）、有効なポリ（Ａ）終止配列、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における
プラスミド産物の複製起点、選択可能なマーカーとしての抗生物質抵抗性遺伝子、および
／または好都合なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げられる。核酸は、Ｃ
ＭＶ ＩＥなどの構成的プロモータとは対照的に誘導性プロモータも含み得る（当業者は
、このような用語が、実際に、特定の条件下における遺伝子発現の程度の記述語であるこ
とを認識するであろう）。

本発明のその抗原結合フラグメントの抗体は、様々な細胞株、例えばヒト細胞株、非ヒ
ト哺乳動物細胞株、および昆虫細胞株、例えばＣＨＯ細胞株、ＨＥＫ細胞株、ＢＨＫ－２
１細胞株、マウス細胞株（骨髄腫細胞株など）、線維肉腫細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株、
ＨＫＢ－１１細胞株、ＣＡＰ細胞株およびＨｕＨ－７ヒト細胞株において生産され得る（
内容が参照により本明細書に援用される、Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ，２０１５，Ｃｒｉ
ｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｅｐ １８：１－１３．）。

さらに他の態様において、本発明は、本明細書に定義される本発明の抗体またはその抗
原結合領域または本明細書に定義される本発明の二重特異性分子を産生するトランスフェ
クトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）などの、組み換え真核生物または原核生物宿主細
胞に関する。宿主細胞の例としては、酵母、細菌、および哺乳類細胞（ＣＨＯまたはＨＥ
Ｋ細胞など）が挙げられる。例えば、一実施形態において、本発明は、本発明の抗α－シ
ヌクレイン抗体またはその抗原結合フラグメントの発現のための配列コードを含む細胞ゲ
ノムに安定に組み込まれた核酸を含む細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は
、本発明の抗α－シヌクレイン抗体の発現のための配列コードを含む、プラスミド、コス
ミド、ファージミド、または線形発現要素などの、融合されていない核酸を含む細胞を提
供する。

さらなる態様において、本発明は、本発明の抗α－シヌクレイン抗体を産生するための
方法であって、ａ）本明細書において上述されるように本発明のハイブリドーマまたは宿
主細胞を培養する工程と、ｂ）培地から本発明の抗体を精製する工程とを含む方法に関す
る。

一実施形態において、本発明は、調製物であって、このような用語が本明細書において
使用される際、本明細書に定義される抗α－シヌクレイン抗体を含み、α－シヌクレイン
に結合することが可能でないかまたは調製物の抗α－シヌクレイン機能性を実質的に変更
しない自然発生する抗体を実質的に含まない調製物に関する。したがって、このような調
製物は、自然発生する血清、またはこのような血清の精製誘導体を包含せず、抗α－シヌ
クレイン抗体と、調製物の抗α－シヌクレイン抗体の機能性を変更しない別の抗体との混
合物を含み；ここで、このような機能性は、
（ｉ）α－シヌクレインに対する抗α－シヌクレイン抗体の結合親和性（ＫＤ）；
（ｉｉ）α－シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する、抗α－シヌクレイン
抗体の能力；
（ｉｉｉ）Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障
害を改善する、抗α－シヌクレイン抗体の能力；
（ｉｖ）インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα－シヌクレイン
のレベルを減少させる、抗α－シヌクレイン抗体の能力；および
（ｖ）慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を
回復させる、抗α－シヌクレイン抗体の能力、
（ｖｉ）α－シヌクレインのシーディング（インビトロでのおよび／またはパーキンソ
ン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化α－シヌクレインの蓄積など）を防ぐ能力；
および／または
（ｖｉｉ）ヒトの脳における切断α－シヌクレインに結合する能力
からなる群から選択される。

本発明は、特に、天然抗α－シヌクレイン抗体の構造と比べてそのアミノ酸配列の構造
変化を（そのＣＤＲ、可変領域、フレームワーク残基および／または定常領域のいずれか
に）有するこのような抗α－シヌクレイン抗体の調製物であって、前記構造変化により、
抗α－シヌクレインモノクローナル抗体が、前記天然抗α－シヌクレイン抗体によって示
される機能性と比べて著しく変化した機能性（すなわち、機能性の２０％超の相違、４０
％超の相違、６０％超の相違、８０％超の相違、１００％超の相違、１５０％超の相違、
２倍超の相違、４倍超の相違、５倍超の相違、または１０倍超の相違）を示し；ここで、
このような機能性は、
（ｉ）α－シヌクレインに対する抗α－シヌクレインモノクローナル抗体の結合親和性
（ＫＤ）；
（ｉｉ）α－シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する、抗α－シヌクレイン
モノクローナル抗体の能力；
（ｉｉｉ）Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障
害を改善する、抗α－シヌクレインモノクローナル抗体の能力；
（ｉｖ）インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα－シヌクレイン
のレベルを減少させる、抗α－シヌクレインモノクローナル抗体の能力；および／または
（ｖ）慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を
回復させる、抗α－シヌクレインモノクローナル抗体の能力；
（ｖｉ）α－シヌクレインのシーディング（インビトロでのおよび／またはパーキンソ
ン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化α－シヌクレインの蓄積など）を防ぐ能力；
および／または
（ｖｉｉ）ヒトの脳における切断α－シヌクレインに結合する能力
であり、特に、このような変化した機能性は、構造変化の結果であり、したがってそれと
切り離すことができない。

自然発生する抗体を「実質的に含まない」という用語は、このような調製物におけるこ
のような自然発生する抗体の、または調製物のα－シヌクレイン結合特性を実質的に変更
しないこのような調製物におけるある濃度のこのような自然発生する抗体の包含の完全な
非存在を指す。抗体は、それが自然発生する対応物を有さないか、またはそれを自然に伴
う成分から分離もしくは精製されている場合、「単離」されているといわれる。

「自然発生する抗体」という用語は、それがこのような調製物に関する場合、生きたヒ
トまたは他の動物内で、それらの免疫系の機能の自然な結果として誘発される抗体（自然
発生する自己抗体を含む）を指す。

したがって、本発明の調製物は、抗α－シヌクレイン抗体、およびα－シヌクレインに
よって保有されないエピトープに結合することが可能な意図的に加えられるさらなる抗体
を含有するこのような調製物を除外せず、実際は明確にそれを包含する。このような調製
物は、特に、調製物が、パーキンソン病（特発性および遺伝性のパーキンソン病を含む）
、ゴーシェ病、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病
（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症お
よび多系統萎縮症などのシヌクレイノパチーを治療する際に向上した有効性を示すその実
施形態を含む。

さらに他の態様において、本発明は、
（ｉ）本明細書に定義される抗α－シヌクレイン抗体またはその抗原結合フラグメント
、または調製物であって、このような用語が本明細書において定義される際、このような
抗α－シヌクレイン抗体またはその抗原結合フラグメントを含む調製物、および
（ｉｉ）薬学的に許容できる担体
を含む医薬組成物に関する。

医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉ
ｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，
Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，２０１３に開示されて
いるものなどの従来の技術にしたがって、薬学的に許容できる担体または希釈剤ならびに
任意の他の公知の補助剤および賦形剤とともに製剤化され得る。

薬学的に許容できる担体または希釈剤ならびに任意の他の公知の補助剤および賦形剤は
、本発明の選択された化合物および選択された投与方法に好適であるべきである。医薬組
成物の担体および他の成分のための適合性は、本発明の選択された化合物または医薬組成
物の所望の生物学的特性に対する大きな悪影響がないことに基づいて決定される（例えば
、エピトープ結合に対するそれほど大きくない影響（１０％以下の相対的阻害、５％以下
の相対的阻害など））。

本発明の医薬組成物は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－
２０またはＴｗｅｅｎ－８０などの非イオン性洗浄剤）、安定剤（例えば、糖またはタン
パク質を含まないアミノ酸）、防腐剤、組織固定剤、可溶化剤、および／または医薬組成
物に含めるのに好適な他の材料も含み得る。希釈剤は、組合せの生物学的活性に影響を与
えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リ
ンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。さらに、医薬組成物または
製剤は、他の担体、または非毒性の、非治療的、非免疫原性安定剤なども含み得る。組成
物は、タンパク質、キトサンのような多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリ
マー（例えば、ラテックス機能化（ｌａｔｅｘ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）セファ
ロース、アガロース、セルロースなど）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、およ
び脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）などの、大型のゆっくりと代謝される高
分子も含み得る。

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物、およ
び投与方法に対する所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化
され得る。選択された投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、または
そのアミド、投与経路、投与時期、用いられる特定の化合物の排せつ速度、治療期間、用
いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または材料、
治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全体的な健康および過去の病歴、ならびに医
療分野において周知の同様の要因を含む様々な薬物動態学的要因に応じて決まる。

医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のための非経口、局所、経口または経
鼻手段を含む、任意の好適な経路および方法によって投与され得る。一実施形態において
、本発明の医薬組成物は、非経口的に投与される。本明細書において使用される際の「非
経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、通常、注射による、腸内およ
び局所投与以外の投与方法を意味し、表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼
窩内、心腔内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下
、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。インビボおよび
インビトロで本発明の化合物を投与するさらなる好適な経路が、当該技術分野において周
知であり、当業者によって選択され得る。一実施形態において、その医薬組成物は、静脈
内または皮下注射または注入によって投与される。

薬学的に許容できる担体としては、本発明の化合物と生理学的に適合性の、あらゆる好
適な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤、酸化防止剤および吸収
遅延剤などが挙げられる。

本発明の医薬組成物に用いられ得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、生
理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール（グリセロ
ール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混
合物、オリーブ油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油、およびゴマ油などの植物油
、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガカントガムおよび注射可能な有機酸
エステル（オレイン酸エチルなど）、および／または様々な緩衝液が挙げられる。他の担
体が、医薬品分野において周知である。

薬学的に許容できる担体は、滅菌注射用溶液または分散体の即時調製用の滅菌水溶液ま
たは分散体および滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬
剤の使用は、当該技術分野において公知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適
合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が想定される。

適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散体の
場合、所要の粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。

本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる酸化防止剤、例えば（１）水溶性酸化防止
剤（アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、
亜硫酸ナトリウムなど）；（２）油溶性酸化防止剤（パルミチン酸アスコルビル、ブチル
化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン
、没食子酸プロピル、α－トコフェロールなど）；および（３）金属キレート剤（クエン
酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）も含み
得る。

本発明の医薬組成物は、組成物中に糖類、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトー
ル、グリセロールなど）または塩化ナトリウムなどの等張剤も含み得る。

本発明の医薬組成物は、医薬組成物の保存可能期間または有効性を向上させ得る、防腐
剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、防腐剤または緩衝液などの、選択された投与経路に適切な
１つまたは複数の補助剤も含有し得る。本発明の化合物は、インプラント、経皮パッチ、
およびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの速放性から化合物を
保護する担体とともに調製され得る。このような担体は、ゼラチン、モノステアリン酸グ
リセリル、ジステアリン酸グリセリル、生分解性、生体適合性ポリマー（エチレン酢酸ビ
ニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳
酸など）を単独でまたはワックスまたは当該技術分野において周知の他の材料とともに含
み得る。このような製剤の調製のための方法は、一般に、当業者に公知である。例えば、
Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅ
ｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄ
ｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。

一実施形態において、本発明の化合物は、インビボでの適切な分配を確実にするように
製剤化され得る。非経口投与用の薬学的に許容できる担体は、滅菌注射用溶液または分散
体の即時調製用の滅菌水溶液または分散体および滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質の
ためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。従来の媒
体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれ
らの使用が想定される。補助的な活性化合物も、組成物に組み込まれ得る。

注射用の医薬組成物は、典型的に、製造および貯蔵の条件下で、滅菌性かつ安定性でな
ければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬剤
濃度に好適な他の規則構造として製剤化され得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリ
オール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および
それらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、および注射可能な有機酸エステル（
オレイン酸エチルなど）を含有する、水性または非水性溶媒または分散媒であり得る。適
切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合、所
要の粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合、
組成物中に等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール（グリセロール、マンニトール、ソル
ビトールなど）、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の
持続的吸収が、抗体の吸収を遅らせる物質、例えば、一ステアリン酸塩およびゼラチンを
組成物中に含むことによってもたらされ得る。滅菌注射用溶液は、例えば上に列挙される
ような成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に所要量の活性化合物を組み込むこと
、必要に応じて、その後の滅菌精密ろ過によって調製され得る。一般に、分散体は、塩基
性分散媒および例えば上に列挙される成分からの所要の他の成分を含む滅菌ビヒクル中に
活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末
の場合、調製方法の例は、予め滅菌ろ過されたそれらの溶液から活性成分および任意のさ
らなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。

滅菌注射用溶液は、上に列挙されるような成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中
に所要量の活性化合物を組み込むこと、必要に応じて、その後の滅菌精密ろ過によって調
製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒および上に列挙される成分からの所要の他
の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射
用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例は、予め滅菌ろ過されたそれらの溶
液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥およびフリーズド
ライ（凍結乾燥）である。

治療の上記の方法および本明細書に記載される使用における投与計画は、最適な望まし
い反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスが投与
されてもよく、いくつかの分割量が、時間をかけて投与されてもよく、または用量が、治
療状況の要件によって示されるように比例的に減少または増加されてもよい。非経口組成
物は、投与のしやすさおよび投与の均一性のために単位剤形で製剤化され得る。本明細書
において使用される際の単位剤形は、治療される被験体のための統一された投与量として
適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、所要の医薬担体に関連して所望の治療効果
を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は
、（ａ）活性化合物の独自の特性および得られる具体的な治療効果、ならびに（ｂ）個体
における敏感性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の治療のためのこのような活性化合物の配合
の技術分野に固有の制限に左右され、それらに直接依存する。

抗α－シヌクレイン抗体の有効投与量および投与計画は、治療される疾患または病態に
応じて決まり、当業者によって決定され得る。いずれの日も所定の投与量が投与され、投
与量は、約０．０００１～約１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は約０．０１～約５ｍｇ／ｋｇ
宿主体重の範囲であり得る。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ
体重または１～１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり得る。したがって、例示的な投与量と
しては、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．１～約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．
１～約２ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．１～約１ｍｇ／ｋｇ／体重、例えば約０．１５ｍｇ／
ｋｇ／体重、約０．２ｍｇ／ｋｇ／体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／
体重、約１．５ｍｇ／ｋｇ／体重、約２ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、また
は約１０ｍｇ／ｋｇ／体重が挙げられる。

当該技術分野において通常の技能を有する医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を
容易に決定および処方することができる。例えば、医師は、医薬組成物に用いられる抗α
－シヌクレイン抗体の用量を、所望の治療効果を得るために必要とされるより少ないレベ
ルから開始し、所望の効果が得られるまで投与量を徐々に増加し得る。一般に、本発明の
組成物の好適な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である化合物の量であ
ろう。このような有効用量は、一般に、上述される要因に応じて決まる。投与は、例えば
静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下投与であり得る。必要に応じて、医薬組成物の有効
１日用量は、任意選択的に単位剤形で、１日を通して適切な間隔で、別々に投与される２
回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の分割用量として投与され得る。本発明の化
合物は、単独で投与されることが可能であるが、上述されるように医薬組成物として化合
物を投与するのが好ましい。

本発明の標識抗体は、疾患または障害を検出、診断、または監視するために、診断目的
で使用され得る。本発明は、限定はされないが、パーキンソン病、特発性パーキンソン病
、家族性パーキンソン病、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツ
ハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神
経不全症または多系統萎縮症を含む、神経変性または認知疾患または障害の検出または診
断を提供し、（ａ）α－シヌクレインに特異的に結合する１つまたは複数の抗体を用いて
、被験体の細胞または組織試料内のα－シヌクレイン種およびフラグメントの存在を測定
する工程と；（ｂ）抗原のレベルを、制御レベル、例えば正常な組織試料におけるレベル
と比較し、それによって、抗原の制御レベルと比較した、抗原の測定レベルの増加が、疾
患または障害を示すか、または疾患または障害の重症度を示す工程とを含む。

本発明の抗体は、当該技術分野において周知の免疫組織化学法を用いて、生物学的試料
内のα－シヌクレインモノマー、オリゴマー、線維性形態またはα－シヌクレインのフラ
グメントを測定するのに使用され得る。タンパク質を検出するのに有用な他の抗体ベース
の方法としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）および
メソスケールディスカバリープラットフォーム（ｍｅｓｏｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒ
ｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ）ベースのアッセイ（ＭＳＤ）などの免疫測定法が挙げられる。好
適な抗体標識が、このようなキットおよび方法に使用され得、当該技術分野において公知
の標識としては、酵素標識（アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼなど
）；放射性同位体標識（ヨウ素（^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ
）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１２１Ｉｎ）、およびテクネチウム（^９９ｍＴｃ
）など）；および発光標識（ルミノールおよびルシフェラーゼなど）；および蛍光標識（
フルオレセインおよびローダミンなど）が挙げられる。

標識抗α－シヌクレイン抗体またはそれらのα－シヌクレイン結合フラグメントの存在
は、診断目的で、インビボで検出され得る。一実施形態において、診断は、ａ）有効量の
このような標識分子を被験体に投与する工程；ｂ）投与後、所定の時間間隔にわたって待
機して、標識分子を、Ａβ堆積の部位（もしあれば）で濃縮させ、非結合標識分子が、バ
ックグラウンドレベルになるまで除去されるのを可能にする工程；ｃ）バックグラウンド
レベルを決定する工程；およびｄ）バックグラウンドレベルを超える標識分子の検出が、
被験体が疾患または障害に罹患していることを示すか、または疾患または障害の重症度を
示すように、被験体中の標識分子を検出する工程を含む。このような実施形態によれば、
分子は、当業者に公知の特定のイメージングシステムを用いた検出に好適なイメージング
部分で標識される。バックグラウンドレベルは、検出された標識抗体の量を、特定のイメ
ージングシステムのために予め決定された標準値と比較することを含む、当該技術分野に
おいて公知の様々な方法によって決定され得る。本発明の診断法に使用され得る方法およ
びシステムとしては、限定はされないが、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ポジトロン
放出型断層撮影法（ＰＥＴ）などの全身スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超
音波検査法が挙げられる。

さらなる態様において、本発明は、医療に使用するための、本発明の抗体またはその抗
原結合フラグメントに関する。

さらなる態様において、本発明は、シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージン
グするのに使用するための、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

一実施形態において、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントは、パー
キンソン病、特発性パーキンソン病、家族性パーキンソン病、びまん性レビー小体病（Ｄ
ＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病
およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症または多系統萎縮症を治療するのに使用する
ためのものである。

さらなる態様において、本発明は、シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージン
グするための薬剤の製造における、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントの使
用に関する。

さらなる態様において、本発明は、有効投与量の本発明の抗体、またはその抗原結合フ
ラグメントを投与することを含む、パーキンソン病または他のシヌクレイノパチーの治療
、診断またはイメージングに関する。

好ましくは、本発明のそれらの態様の使用および方法において、治療は、長期であり、
好ましくは、少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月間、６ヶ月間、１年間またはそ
れ以上にわたる。

さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを
含むキットを提供する。

本発明の実施形態
本文および実施例から明らかであろうように、本発明はさらに、以下の実施形態に関す
る。

１．α－シヌクレインにおけるアミノ酸１１２～１１７（配列番号９（ＩＬＥＤＭＰ）
）内のエピトープに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体、またはその抗原
結合フラグメント。

２．前記エピトープへの結合について抗体ＧＭ３７と競合する、実施形態１に記載のモ
ノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

３．ＧＭ３７、ＧＭ３７変異体１、ＧＭ３７変異体２またはＧＭ３７変異体３である、
実施形態１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

４．α－シヌクレインにおけるアミノ酸１１２～１１５（配列番号１９（ＩＬＥＤ））
内のエピトープに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体、またはその抗原結
合フラグメント。

５．ＧＭ２８５である、実施形態１または４に記載のモノクローナル抗体、またはその
抗原結合フラグメント。

６．抗体が、無傷の抗体を含むかまたはそれからなる、先行する実施形態に記載のモノ
クローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

７．Ｆｖフラグメント（例えば一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フ
ラグメント（例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）_２フラ
グメント）およびドメイン抗体（例えば単一のＶ_Ｈ可変領域またはＶ_Ｌ可変領域）からな
る群から選択される抗原結合フラグメントを含むかまたはそれからなる、先行する実施形
態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

８．モノクローナル抗体が、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４
の抗体からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクロー
ナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

９．抗体または抗原結合フラグメントが、以下の特性：
（ｉ）１～５ｎＭまたは１～２ｎＭなどの、０．５～１０ｎＭのα－シヌクレインに対
する結合親和性（Ｋ_Ｄ）；
（ｉｉ）α－シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する能力；
（ｉｉｉ）Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障
害を改善する能力；
（ｉｖ）インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα－シヌクレイン
のレベルを減少させる能力；
（ｖ）慢性的に投与されるとき、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回
復させる能力；
（ｖｉ）α－シヌクレインのシーディング（インビトロでのおよび／またはパーキンソ
ン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化αシヌクレインの蓄積など）を防ぐ能力；お
よび／または
（ｖｉｉ）ヒトの脳における切断α－シヌクレインに結合する能力
の１つまたは複数を示す、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体
、またはその抗原結合フラグメント。

１０．ヒトまたはヒト化抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノク
ローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

１１．以下のＣＤＲ：
ａ）ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＴ（配列番号１）または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以
下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するア
ミノ酸配列；
ｂ）ＡＩＲＳ（Ｎ／Ｓ／Ｑ／Ｈ）ＧＤＲＴＤ ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２、３３、３
４、３５）または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下
のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列；または
ｃ）ＡＫＮＷＡＰＦＤＳ（配列番号３）または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下
のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミ
ノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または実施形態１～３および６～１０に
記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

１２．配列番号１および３ならびに配列番号２および３３、３４または３５のうちの１
つのＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、実施形態１１に記載のモノクローナル抗体または
その抗原結合フラグメント。

１３．

からなる群から選択される重鎖可変領域を含むかまたはそれからなる、実施形態１１に記
載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

１４．以下のＣＤＲ：
ａ）ＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号４）または４つ以下のアミノ酸差、または３つ
以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有する
アミノ酸配列；
ｂ）ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号５）または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下のア
ミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸
配列；または
ｃ）ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号６）または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下
のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミ
ノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または実施形態１～３および６～１３に
記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

１５．配列番号４、５および６のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、実施形態１４に記
載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

１６．アミノ酸配列：

を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態１４に記載の抗体またはその
抗原結合フラグメント。

１７．アミノ酸配列：

を含むかまたはそれからなる軽鎖を含む、実施形態１４に記載のモノクローナル抗体また
はその抗原結合フラグメント。

１８．配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配列
番号７、３３、３４または３５のいずれかで示されるアミノ酸を含むかまたはそれからな
る重鎖可変領域を含む、実施形態１～３および６～１７に記載のモノクローナル抗体また
はその抗原結合フラグメント。

１９．図２７に示されるように凝集またはアンフォールドを防ぐように増加された安定
性などの、増加した熱安定性を有し、ＧＭ３７ ｗｔと比較して６５℃超の温度で２％～
１０％高く安定性であり、ＧＭ３７ ｗｔと比較して６５℃超の温度で２％～８％高く安
定性であり、またはＧＭ３７ ｗｔと比較して６５℃超の温度で２％～５％高く安定性で
ある、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖および配列番号３４で
示されるアミノ酸を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態１～３およ
び６～１８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

２０．以下のＣＤＲ：
ａ）ＡＡＳＧＦＴＦＳＲＦＴＭＴ（配列番号２０）または４つ以下のアミノ酸差、また
は３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を
有するアミノ酸配列；
ｂ）ＡＩＳＧＳＧＧＧＴＳ ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）または４つ以下のアミノ
酸差、または３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のア
ミノ酸差を有するアミノ酸配列；または
ｃ）ＡＫＮＷＡＰＦＤＹ（配列番号２２）または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以
下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するア
ミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または実施形態１～１０に記載のモノク
ローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

２１．配列番号２０、２１および２２のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、実施形態２
０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

２２．アミノ酸配列

を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含む、実施形態２０に記載のモノクローナル
抗体またはその抗原結合フラグメント。

２３．以下のＣＤＲ：
ｄ）ＲＡＳＱＳＶＳＲＳＹＬＡ（配列番号２３）または４つ以下のアミノ酸差、または
３つ以下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有
するアミノ酸配列；
ｅ）ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２４）または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以下の
アミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するアミノ
酸配列；または
ｆ）ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２５）または４つ以下のアミノ酸差、または３つ以
下のアミノ酸差、または２つ以下のアミノ酸差、または１つ以下のアミノ酸差を有するア
ミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体または実施形態１～１０および２０～２
２のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。

２４．配列番号２３、２４および２５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、実施形態２
３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

２５．

のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態２４に記載の
抗体またはその抗原結合フラグメント。

２６．配列番号２７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域および配
列番号２６のいずれかで示されるアミノ酸を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域を含
む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フ
ラグメント。

２７．Ｆｃ領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体
またはその抗原結合フラグメント。

２８．物質の生体内半減期を増加させるための部分をさらに含む、先行する実施形態の
いずれか１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

２９．生体内半減期を増加させるための部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸およびデキストランからなる群から選択さ
れる、実施形態２８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

３０．抗体ポリペプチドが、検出可能な部分をさらに含む、先行する実施形態のいずれ
か１つに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

３１．検出可能な部分が、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識、放射性同位体標識ま
たは酵素標識である、実施形態３０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラ
グメント。

３２．検出可能な部分が、放射性同位体を含むかまたはそれからなる、実施形態３０ま
たは３１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

３３．放射性同位体が、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ，^８
９Ｚｒ、^１２３Ｉおよび^２０１Ｔｌからなる群から選択される、実施形態３２に記載のモ
ノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

３４．検出可能な部分が、常磁性同位体を含むかまたはそれからなる、実施形態３０に
記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

３５．常磁性同位体が、^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^１６２Ｄｙ、^５２Ｃｒおよび^５６Ｆｅ
からなる群から選択される、実施形態３４に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結
合フラグメント。

３６．検出可能な部分が、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学または超音波イメージン
グなどのイメージング技術によって検出可能である、実施形態３０～３５のいずれかに記
載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

３７．検出可能な部分が、結合部分を介して、間接的に抗体またはその抗原結合フラグ
メントに結合される、実施形態３０～３６のいずれかに記載のモノクローナル抗体または
その抗原結合フラグメント。

３８．結合部分が、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０
，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミン五
酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－
トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体および１，４，８，１
１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体からな
る群から選択される、実施形態３７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラ
グメント。

３９．先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント
またはその成分ポリペプチド鎖をコードする単離核酸分子。

４０．分子がｃＤＮＡ分子である、実施形態３９に記載の核酸分子。

４１．抗体重鎖またはその可変領域をコードする、実施形態３０または３１に記載の核
酸分子。

４２．抗体軽鎖またはその可変領域をコードする、実施形態３９～４１のいずれか１つ
に記載の核酸分子。

４３．実施形態３９～４２のいずれか１つに記載の核酸分子を含むベクター。

４４．実施形態３９～４２のいずれか１つに記載の核酸分子または実施形態４３に記載
のベクターを含む組み換え宿主細胞。

４５．実施形態１～２７のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合フラグメントを産
生するための方法であって、コードされた抗体またはその抗原結合フラグメントの発現を
可能にする条件下で、実施形態４４に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。

４６．実施形態１～３５のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体または抗原結合フ
ラグメントと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。

４７．医療に使用するための、実施形態１～３５に記載のモノクローナル抗体またはそ
の抗原結合フラグメント。

４８．シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングするのに使用するための、
実施形態１～３５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

４９．パーキンソン病（特発性および遺伝性のパーキンソン病を含む）、ゴーシェ病、
びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複
合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症および多系統萎縮
症を治療するのに使用するための、実施形態４８に記載のモノクローナル抗体またはその
抗原結合フラグメント。

５０．シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングするための薬剤の製造にお
ける、実施形態１～３５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの
使用。

５１．パーキンソン病（特発性および遺伝性のパーキンソン病を含む）、ゴーシェ病、
びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複
合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症および多系統萎縮
症を治療するための薬剤の製造における、実施形態５０に記載のモノクローナル抗体また
はその抗原結合フラグメントの使用。

５２．被験体におけるシヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングする方法で
あって、実施形態４６に記載の医薬組成物を、有効量で前記被験体に投与する工程を含む
方法。

５３．パーキンソン病（特発性および遺伝性のパーキンソン病を含む）、ゴーシェ病、
びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複
合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症および多系統萎縮
症を治療するための、実施形態４８に記載の使用のための抗体、またはその抗原結合フラ
グメント、または実施形態５０に記載の使用、または実施形態５２に記載の方法。

５４．治療が長期である、実施形態５２または５３に記載の使用のための抗体、または
その抗原結合フラグメント；または使用；または方法。

５５．長期治療が、少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月間、６ヶ月間、１年間
またはそれ以上にわたる、実施形態５２に記載の使用のための抗体、またはその抗原結合
フラグメント；または使用；または方法。

５６．被験体がヒトである、実施形態４７～５５のいずれか１つに記載の使用のための
抗体、またはその抗原結合フラグメント；または使用；または方法。

５７．実施形態１～３５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含むキット。

５８．医療に使用するための、実施形態５７に記載のキット。

５９．被験体の脳または体液中の前記α－シヌクレインの存在または量を検出または測
定するのに使用するための、実施形態３０～３５に記載のモノクローナル抗体またはその
抗原結合フラグメント。

６０．前記検出または測定が、前記α－シヌクレインに結合された前記抗シヌクレイン
抗体のインビボイメージングを含む、実施形態５９に記載のモノクローナル抗体またはそ
の抗原結合フラグメント。

６１．前記検出または測定が、前記α－シヌクレインに結合された前記抗シヌクレイン
抗体のエクスビボイメージングを含む、実施形態３０～３５に記載のモノクローナル抗体
またはその抗原結合フラグメント。

実施例１：抗体スクリーニング
１．免疫原およびリガンド産生
以下のタンパク質を、図１に示される免疫原として使用するための取得または産生した
。マウスを３つの免疫原で免疫した：完全長組み換えヒトα－シヌクレイン原線維；アミ
ノ酸１～６０を含有するヒトα－シヌクレイン組み換えタンパク質（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ，
Ｂｏｇａｒｔ，Ｇｅｏｒｇｉａ）およびアミノ酸１～１１９を含有するヒトα－シヌクレ
イン組み換えタンパク質。完全長α－シヌクレインから原線維を作製するために、Ｒｐｅ
ｐｔｉｄｅ（Ｂｏｇａｒｔ，Ｇｅｏｒｇｉａ）製の凍結乾燥製品（カタログ番号Ｓ－１０
０１－２）を使用した。これを、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質の濃度で、２０ｍＭのトリス
および３００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液に溶解させた。原線維を作製するために、７日間にわ
たって３７℃で、Ｖｏｒｔｅｍｐ ５６シェーカーインキュベータ（Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）において２００ｒｐｍで各ウェ
ル中に直径７０μｍのセラミックビーズを含む９６ウェルプレート中で、タンパク質溶液
を１７０μｌのアリコートでインキュベートし、原線維の形成の後、チオフラビンＴを加
え、ウェルの１つにおける蛍光を測定した。アミノ酸１～６０を含有する組み換えα－シ
ヌクレインを、水に溶解させて、１ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。

アミノ酸１～１１９を含有する組み換えα－シヌクレインを、以下の構築物を用いて作
製した：６つのアミノ酸ヒスチジンタグをコードする合成遺伝子、続いて、Ｘａ因子切断
部位およびヒトα－シヌクレインアミノ酸１～１１９をコードする配列：

を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成し、ｐＥＴ２４ａ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇ
ｅｎ）におけるＮｄｅＩ－ＸｈｏＩ部位へとクローニングした。

発現ベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１へと形質転換させ、Ｎｏｖａｇｅｎ
製のｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ自己誘導システム（Ｕｓｅｒ ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌ ＴＢ３８３ ｒｅｖ．Ｈ１００５）を用いて、単一コロニーを発現のために採取した
。規模は、５００ｍｌの最終培養物体積であった。細胞を６０００ｇで１０分間の遠心分
離によって採取し、続いて、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（Ｕｓｅｒ ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌ ＴＢ２４５ Ｒｅｖ．０３０４）を用いて溶解させた。溶解の後、試料を遠
心分離によって取り除き、上清をさらなる精製に使用した。

Ｈｉｓタグ化タンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．５、１ＭのＮａＣｌ
（Ａ－緩衝液）中で平衡化された５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃ
ａｒｅ）上で精製した。試料の適用およびＡ－緩衝液を用いた洗浄の後、タンパク質を、
２０カラム体積にわたってＡ－緩衝液中の０．２５Ｍのイミダゾールの勾配になるまで溶
離した。５ｍｌの画分を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。該当するタンパク
質を含む画分をプールし、濃縮し、１０ｍＭのトリスｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ
中でＳ２００（２６／６０）サイズ排除カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し
た。再度、画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける予測サイズを有するバンドの存在に応じて
プールした。

Ｎ末端タグを除去するために、精製されたｈｉｓタグ化α－シヌクレイン１～１１９を
、Ｎｏｖａｇｅｎキット（６９０３７－３ＦＲＸ）を用いて、１：５０の分配量で、Ｘａ
因子とともにインキュベートした。一晩のインキュベーションの後、Ｘａ因子を、Ｘａｒ
ｒｅｓｔアガロースを用いてバッチ式に除去した。切断されたα－シヌクレイン１～１１
９を、上述されるように許容（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）ＨｉｓＴｒａｐクロマトグラフィ
ーによって最後に精製した。通過画分（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）から、精製されたα
－シヌクレイン１～１１９が得られ、それを、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮装置を用いて約４
００μｇ／ｍｌになるまで濃縮した。

α－シヌクレイン（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ）を、２ｍｇ／ｍｌで、ＰＢＳ中で再水和し、ペ
ルオキシナイトライト（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｉｒｉｔｅ）（１００μＬ／ｍｇのタンパク
質）を、混合しながら滴下して加えた。次に、ニトロシル化α－シヌクレインを、５Ｌの
ＰＢＳ中で透析し、－２０℃で貯蔵した。

ドーパミンを用いて、α－シヌクレインを酸化した。１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４中
で調製されたドーパミン－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ Ｐ５２４４）の等体積の２００ｕＭの溶
液および１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４中のα－シヌクレイン（Ｒｐｅｐｔｉｄｅ）の２
８μＭの溶液を組み合わせた。得られた１４ｕＭのα－シヌクレイン／１００ｕＭのドー
パミンを、３７℃でＯ／Ｎ（一晩）インキュベートした。次に、酸化されたα－シヌクレ
インを、ＰＢＳ中で透析し、－２０℃で貯蔵した。

様々な天然およびキメラ形態のシヌクレインタンパク質を、抗α－シヌクレイン抗体の
多様なライブラリーをスクリーニングするために産生した。スクリーニング構築物は、以
下のものを含んでいた：ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルα－シヌクレイン、ヒ
トβ－シヌクレイン、ヒトγ－シヌクレイン（図２１および２２）および最後に、α－シ
ヌクレインの残基１２０～１４０が欠如したα－シヌクレイン誘導体。さらに、一連の４
つのシャッフル構築物（ｓｈｕｆｆｌｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）：Ａ－Ｓｙｎ－ＡＡＫＫ
－ＢＡＰ、Ａ－Ｓｙｎ－ＢＡＡＫ－ＢＡＰ、Ａ－Ｓｙｎ－ＢＢＡＡ－ＢＡＰ、Ａ－Ｓｙｎ
－ＢＢＫＫ－ＢＡＰ（配列番号１１～１４）を産生した。これらの構築物は、ヒトα－シ
ヌクレイン（Ａ）、ヒトβ－シヌクレイン（Ｂ）およびニワトリα－シヌクレイン（Ｋ）
の線形伸長（ｌｉｎｅａｒ ｓｔｒｅｔｃｈ）を含んでいた。リガンドのそれぞれの部位
特異的ビオチン化を促進するために、リガンドのＣ末端に融合されたビオチン受容体ペプ
チド（ＢＡＰ）タグを含む遺伝子をクローニングした。ビオチン化は、可溶性ＥＬＩＳＡ
フォーマットに使用されるビーズへのリガンドの結合を可能にした。様々なα－シヌクレ
インＢＡＰタグ融合構築物（ＡＳｙｎＢＡＰ）を保有する哺乳動物発現ベクターを構築し
た。リガンドを、一過性トランスフェクション（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）を用いて、ＨＥ
Ｋ ２９３細胞内で発現させた。

２．免疫化
抗体ＨｕＭａｂ－シヌクレインは、完全にマウスである抗体の発現を防ぐよう、マウス
免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖およびマウスκ軽鎖をダブルノックアウトされた、ＨｕＭＡ
ｂマウス株ＨＣｏ１７－ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＣｏ１２－ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化か
ら得られた（ヒトモノクローナル抗体；Ｍｅｄａｒｅｘ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，
ＣＡ，ＵＳＡ）。様々なマウス株を、ヒトＩｇ重鎖およびヒトＩｇ κ軽鎖遺伝子座の挿
入によってトランスジェニックにし、これは、ヒトＶＨ（重鎖の可変領域）およびＶＬ（
軽鎖の可変領域）遺伝子の数が異なる。

４８匹のマウスを、１４日間の間隔を空けて、２０μｇの抗原で腹腔内に（ＩＰ）およ
び同じ免疫原で皮下に（ＳＣ、尾基底に）交互に免疫した。４回のＩＰおよび４回のＳＣ
で、最大で８回の免疫化を行った。

第１の免疫化を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）中のα－シヌクレイン免疫原で行い、次の
免疫化を不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で行った。血清抗体価が十分である
ことが分かった（１／５０以下の血清の希釈物が、少なくとも２回連続の、隔週のスクリ
ーニング事象において、本明細書において上述される抗原特異的スクリーニングアッセイ
において陽性であることが分かった）とき、マウスに、融合の４および３日前に、１００
μＬのＰＢＳ中の１０μｇのα－シヌクレイン免疫原タンパク質を静脈内に（ＩＶ）２回
さらに投与した（ｂｏｏｓｔ）。

免疫化プロトコルが、図１に示される。

抗体３７は、アミノ酸１～６０および１～１１９を含むα－シヌクレインＣ末端切断型
と交互に、ヒト完全長α－シヌクレイン－原線維を使用した免疫化プロトコルから得られ
た。

抗体２８５は、ヒトα－シヌクレイン－モノマー１～１４０を最初の４回の免疫化に使
用した免疫化プロトコルから得られた。抗体価がない場合、免疫化を、原線維（ｉｐ／ｓ
ｃ）を用いて続け、あるいは、免疫化を、モノマーを用いて続けた。

３．ＨｕＭａｂハイブリドーマ生成
上に定義される十分な抗原特異的抗体価発現を有するＨｕＭＡｂマウスを殺処分し、腹
部大動脈および大静脈に隣接する脾臓およびリンパ節を採取した。マウス骨髄腫細胞株と
の脾細胞およびリンパ節細胞の融合は、基本的に製造業者の指示にしたがって、ＣＥＥＦ
５０ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いた電気融合によって行った。
融合細胞を、ＨｙＱ ｍＡＤＣＦ－Ｍａｂ（Ｐｅｒｂｉｏ）中の１０％のＦｅｔａｌ Ｃ
ｌｏｎｅ Ｉ Ｂｏｖｉｎｅ血清（Ｐｅｒｂｉｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｃ
ａｍｂｒｅｘ）、０．５Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．５Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン（
Ｃａｍｂｒｅｘ）、５０μＭの２－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、６
００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン６（ＩＬ－６）（Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ）、１×ＨＡ
Ｔ（Ｓｉｇｍａ）および０．５ｍｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含
有する融合培地に播種した。１０日後、上清を収集し、細胞を、ＨｙＱ ｍＡＤＣＦ－Ｍ
ａｂ中の１０％のＦｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ Ｉ Ｂｏｖｉｎｅ血清、０．５Ｕ／ｍＬのペ
ニシリン、０．５Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン、６００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６および１
×ｐｒｏＨＴ（Ｃａｍｂｒｅｘ）を含有する収集培地で洗浄した。ハイブリドーマ培養物
の上清を、一次スクリーニングアッセイによってスクリーニングした。上清を、８つの異
なるリガンドへの結合について特性評価した。これらは、４つのオルソログ：ヒト、マウ
ス、ラットおよびカニクイザル、ヒトα－シヌクレインβ－シヌクレインおよびヒトγ－
シヌクレイン（配列番号３７～４１）を含み、最後に、それらを、α－シヌクレインの残
基１２０～１４０が欠如したヒトα－シヌクレイン誘導体に結合するそれらの能力につい
て試験した。

抗α－シヌクレイン抗体のスクリーニングを、自動液体分注システム（ａｕｔｏｍａｔ
ｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）を用
いて、ハイスループット懸濁ＥＬＩＳＡフォーマットを用いて行った。プレートの読み取
りを、２つのシステムによって行い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＦＭＡ
Ｔ ８２００を用いて、３８４ウェルプレートを読み取り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖ
ｉｃｅｓ製のＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｖｅｌｏｓ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて、１５
３６ウェルプレートを読み取った。

一次スクリーニングにおいて、クローンを、８つの異なるリガンドに結合するそれらの
能力によって特性評価した。これらは、一連の４つのシャッフル構築物：Ａ－Ｓｙｎ－Ａ
ＡＫＫ－ＢＡＰ、Ａ－Ｓｙｎ－ＢＡＡＫ－ＢＡＰ、Ａ－Ｓｙｎ－ＢＢＡＡ－ＢＡＰ、Ａ－
Ｓｙｎ－ＢＢＫＫ－ＢＡＰ（配列番号１１～１４）、α－シヌクレイン１２０～１４０欠
失－ＢＡＰ、ニトロ化ヒトα－シヌクレイン－ＢＡＰおよび酸化ヒトα－シヌクレイン－
ＢＡＰを含んでいた。

簡潔に述べると、α－シヌクレイン特異的抗体を潜在的に含有する血清または上清を、
ビーズに加えて、α－シヌクレインおよび／またはα－シヌクレイン由来の構築物への結
合を可能にする。抗α－シヌクレイン抗体の結合は、蛍光コンジュゲート、ＤｙＬｉｇｈ
ｔ６４９共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を用いて検出される。２つの公知のマウス
抗α－シヌクレイン抗体、ＬＢ５０９およびＳｙｎ２１１が、陽性対照としてスクリーニ
ングに含まれていた。α－シヌクレイン抗体の特異的検出を確実にするために、抗α－シ
ヌクレイン血清プールが、３８４ウェルフォーマット抗体価スクリーニングにおいて陰性
対照として使用される一方、ヒトＣｈｒｏｍＰｕｒｅ ＩｇＧが、１５３６ウェルフォー
マット８－ビーズに基づくアッセイにおいて使用される。

最も良好な一次ウェルからのハイブリドーマ細胞を、４０％のＣｌｏｎｅＭｅｄｉａ（
Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）および６０％のＨｙＱ ２×完全培地（Ｈ
ｙｃｌｏｎｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）から作製された半固形培地に播種した。各一次
ウェルについて、Ｇｅｎｅｔｉｘ黒色６－ウェルプレートのウェルを播種した。各ウェル
から、ＣｌｏｎｅＰｉｘシステム（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を用いて２５個のサブクローンを採
取した。サブクローンを収集培地中に採取した。７日後、サブクローンの上清を、シヌク
レイン特異的ヒトＩｇＧ結合について再度スクリーニングし、ヒトＩｇＧ濃度を、Ｏｃｔ
ｅｔ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＵＳＡ）を用いて測定した。各一次ウ
ェルから、最も良好なサブクローンを選択し、６００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６、０．５Ｕ／
ｍＬのペニシリン、０．５Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１×ｐｒｏＨＴのみを含
有する展開培地（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）中で展開させた。このサブクロー
ンを、１つの９６ウェルプレートウェルから１つの２４ウェルプレートウェルへ、４つの
２４ウェルプレートウェルへ、６つの６ウェルプレートウェルへと展開させた。このプロ
セスによって得られたクローンを、初代クローン（ＰＣ）と表した。

さらなる抗体結合研究を、Ｏｃｔｅｔ ３８４ＲＥＤ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｍｅｎｌｏ
Ｐａｒｋ，ＵＳＡ）を用いて行った。２μｇ／ｍｌのＨｕＭａｂ抗体溶液を、試料希釈
剤（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，ａｒｔ．Ｎｏ．１８－５０２８）中での希釈によって作製した。
アミン反応性センサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，ａｒｔ．ｎｏ．１８－０００８）を、ＨｕＭ
ａｂの固定化に使用した。アミン反応性センサーへのカップリングの前に、ＨｕＭａｂを
、ＭＥＳ ｐＨ６．０緩衝液（１８－５０２７）中で希釈した。カップリングを、３０℃
および１０００ｒｐｍで、以下のとおりに行った：アミン反応性センサーを、ＰＢＳ中で
予め湿らせ、続いて、３００秒間にわたって（製造業者の指示にしたがって）ＥＤＣ／Ｎ
ＨＳ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ．Ａｒｔ．ｎｏ．１８－１０３３／１８－１０３４）活性化溶液
で活性化した。活性化センサーを、６００秒間、ＨｕＭａｂで固定化した。

組み換えヒト、カニクイザルおよびマウスα－シヌクレインへの、Ｏｃｔｅｔ中の３７
および２８５の結合、およびヒトβまたはγ－シヌクレインへの結合の欠如が図２に示さ
れる。

４．シヌクレイン特異的ＨｕＭａｂ可変領域の配列分析および発現ベクターにおけるクロ
ーニング
製造業者の指示にしたがって、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、全ＲＮＡを、０．２～５×１０６個のハ
イブリドーマ細胞から調製し、５’－ＲＡＣＥ－相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、１００ｎ
ｇの全ＲＮＡから調製した。ＶＨおよびＶＬコード領域を、ＰＣＲによって増幅させ、ラ
イゲーション非依存クローニング（Ａｓｌａｎｉｄｉｓ，Ｃ．ａｎｄ Ｐ．Ｊ．ｄｅ Ｊ
ｏｎｇ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９０；１８（２０）：６０６９－７
４）によって、ｐ３３Ｇ１ｆおよびｐ３３κ発現ベクター（ヒトＩｇＧ１／κ定常領域コ
ード配列を含む）中で、フレーム内で、直接クローニングした。各抗体について、１６個
のＶＬクローンおよび１６個のＶＨクローンをシークエンシングした。適切なオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するクローンを、さらなる研究および発現のために選
択した。重鎖および軽鎖の全ての組合せのベクターを、２９３ｆｅｃｔｉｎを用いて、Ｆ
ｒｅｅｓｔｙｌｅＴＭ ２９３－Ｆ細胞中で一時的に共発現させた。

ＧＭ３７の場合、ＶＨ領域のシークエンシングにより、位置１０６におけるＣＤＲ３領
域中の余分なシステインが同定された。誤った折り畳みの可能性およびジスルフィド結合
形成による抗体活性の低下の可能性を推定するために、システインを、位置１０６でセリ
ンへと突然変異させた。

比較用抗体９Ｅ４を、ハイブリドーマＰＴＡ－８２２１に由来するＶＨおよびＶＬ配列
（米国特許出願公開第２００８０１７５８３８号明細書）（配列番号４２および４３）に
基づいて作製した。

５．抗体の発現／精製
抗体を、一過性トランスフェクション剤としてｐＴＴ５ベクターおよびＰＥＩｐｒｏ（
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａ）を用いた
、ＨＥＫ２９３ ６Ｅ細胞中でのトランスフェクションによって産生した。簡潔に述べる
と、重鎖および軽鎖を、ＰＥＩｐｒｏ（ＶＷＲ）を用いてＨＥＫ２９３細胞へとトランス
フェクトし、トランスフェクションの２４時間後、細胞にＴＮ１（Ｓｉｇｍａ）を補充し
た。生存率が５０％に近づくまで細胞を増殖させ、抗体の収量をｅａｓｙ ＩｇＧ ｔｉ
ｔｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって測定した。培養物の上清を、０．２μｍのデッドエンド
フィルタ上でろ過し、５ｍＬのタンパク質Ａカラム（ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ，Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に充填し、０．１Ｍのクエン酸－ＮａＯＨ、ｐＨ
３で溶離した。溶出液を、２Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ９で直ちに中和し、１２．６ｍＭ
のＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）に対して一晩
（Ｏ／Ｎ）透析した。透析の後、試料を、０．２μｍのデッドエンドフィルタ上で滅菌ろ
過した。純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定し、濃度を比濁法および２８０ｎｍでの吸
光度によって測定した。精製された抗体を分割し、－８０℃で貯蔵した。

実施例２：表面プラズモン共鳴を用いた抗体の特性評価
α－シヌクレインへの抗体のリアルタイムの結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０
００を用いて測定した。捕捉表面を、ＣＭ５チップ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））の第
１のフローセル（Ｆｃ１）および第２のフローセル（Ｆｃ２）中で、ポリクローナルウサ
ギ抗マウス抗体（Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅ
ａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ．ｎｏ：ＢＲ－１００８－３８）の一部）をアミンカップリン
グすることによって調製した。マウス抗体を、約５００ＲＵのリガンドレベルを達成する
のに必要な濃度で、Ｆｃ２中で捕捉した。検体（ＡＳｙｎＢＡＰ）を３０μｌ／分でＦｃ
１～２中に注入する前に、ベースラインを１０分間安定させた。ＡＳｙｎＢＡＰを、それ
ぞれ１００～３２００ｎＭおよび２５～３２００ＲＵで試験した。それぞれの一連の滴定
における最高濃度は、二連で試験した。各サイクルの最後に、表面を１０ｍＭのグリシン
－ＨＣｌ、ｐＨ１．７（３０秒の注入）で再生して、捕捉されたマウス抗体および検体を
除去した。ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ：ＢＲ－１００１
－８８）を、全ての実験において試験緩衝液および試料希釈剤として使用し、アッセイを
２５℃で行った。全ての試料を、収集する前に４℃に保持した。

捕捉抗体が固定されたが、α－シヌクレイン抗体が捕捉されていない、Ｆｃ１に記録さ
れた応答値を、Ｆｃ２における応答値から差し引いた。１：１または２：１の結合アルゴ
リズムを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１．１を用いてデー
タセットに適合させた。結果が図３、４および５に見られ、これらの図は、ヒトα－シヌ
クレインへの抗体３７、２８５および９Ｅ４の結合を示す。

実施例３：エピトープマッピング
α－シヌクレインに対する抗体のエピトープマッピングを、Ｐｅｐｓｃａｎ（Ｐｅｐｓ
ｃａｎ Ｚｕｉｄｅｒｓｌｕｉｓｗｅｇ ２ ８２４３ ＲＣ Ｌｅｌｙｓｔａｄ，ｔｈ
ｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において一連の重複直鎖ペプチドを用いて行った。合成さ
れた２０量体ペプチドのそれぞれに対する抗体の結合を、Ｐｅｐｓｃａｎに基づくＥＬＩ
ＳＡにおいて試験した。α－シヌクレインの全コード配列をカバーする直鎖ペプチドアレ
イ、ならびに酸化メチオニンまたはニトロシル化チロシンを含む全てのペプチドを、（４
℃で一晩）一次抗体溶液とともにインキュベートした。洗浄後、ペプチドアレイを、２５
℃で１時間にわたって１／１０００希釈率の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＢ
Ａ，ｃａｔ．ｎｒ．２０１０－０５）とともにインキュベートした。洗浄後、ペルオキシ
ダーゼ基質２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンゾチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ
）および２μｌ／ｍｌの３パーセントのＨ２Ｏ２を加えた。１時間後、発色を測定した。
発色を、電荷結合素子（ＣＣＤ）－カメラおよび画像処理システムを用いて定量化した。
データ処理のために、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様に、０～３
０００ｍＡＵのＣＣＤカメラ範囲からの値を得た。結果を定量化し、Ｐｅｐｌａｂデータ
ベースに保存した。時々、ウェルは、偽陽性値をもたらす気泡を含み、カードを手動で調
べて、気泡によって生じる値を０として採点する。それぞれ配列ＩＬＥＤＭＰまたはＩＬ
ＥＤを含有するペプチドへの抗体３７および２８５の結合データが、図７に見られる。

実施例４：レビー小体認知症に罹患した患者に由来する帯状皮質のヒト脳ホモジネートか
らのα－シヌクレインの免疫沈降
ヒトＤＬＢまたは健常対照（^＊で印を付けられる）に由来する帯状皮質の粗ホモジネー
トからのα－シヌクレインに結合し、破壊する抗体の能力を、免疫沈降によって分析した
。ヒト帯状皮質に由来する凍結した試料（Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ，
Ｓｃｏｔｌａｎｄから入手した）を、低温保持装置中で切断し、１００ｍｇの試料を、プ
ロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する１６００μｌの
ｃｅｌｌｙｔｉｃ Ｍ細胞融解試薬（Ｓｉｇｍａ Ｃ２９７８）に加えた。５０００ｒｐ
ｍで４×３０秒間、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓビーズホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて試料が完全に溶解されるまで、脳組織を均質
化した。溶液を３０００×ｇで遠心分離し、上清を免疫沈降のための粗ホモジネートとし
て使用した。

免疫沈降のために、１０μｇの抗体を、製造業者の指示（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を用いて、磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓタンパク質Ｇビー
ズと混合した。粗脳ホモジネートを、溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中で３０倍希釈した。抗
体結合ｄｙｎａｂｅａｄｓを、５００ｕｌの希釈されたホモジネートと混合し、回転器中
で連続混合しながら、室温で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後、ビ
ーズを洗浄緩衝液中で洗浄し、結合抗原を、製造業者の指示（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｇ
ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ ＵＫ）にし
たがって、非変性溶出緩衝液を用いて溶離した。免疫沈降の収量を、検出マウスモノクロ
ーナル抗ヒトα－シヌクレイン抗体（４Ｂ１２，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
を用いたウエスタンブロット法によって視覚化した。破壊されているα－シヌクレインの
様々な分子量形態を表すバンドのパターンは、３７、３７ｖ２および２８５抗体が、主要
なα－シヌクレイン種、完全長α－シヌクレイン（ＦＬ ａｓｙｎ １～１４０）および
Ｃ末端末端切断種（１～１３５および１～１１９／１２２）を免疫沈降させ得る一方、抗
体９Ｅ４は、切断種１～１１９／１２２を免疫沈降させることができない点で、３７、３
７変異体２および２８５抗体と、比較用抗体９Ｅ４とで異なる（図９）。

実施例５：細胞培養物中の抗体によるα－シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断の阻害
組み換えα－シヌクレインモノマーおよび原線維は、培養物中で初代ニューロンによっ
て取り込まれ得る。図１０に概略的に示されるように、ニューロン中へのα－シヌクレイ
ンの取り込みの後、それは、アミノ酸１１９／１２２における主要なプロテアーゼ感受性
部位で、カルパインＩなどの細胞内プロテアーゼによってプロセシングされ得る。プロテ
アーゼによるα－シヌクレインの切断を調べるために、マウス初代皮質ニューロンを、Ｅ
ｌｖａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９（Ｅｌｖａｎｇ ｅｔ ａｌ．．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ．２００９；１１０（５）：１３７７－８７）に記載されるように調製し、星状膠細
胞の増殖を阻害するために、ＤＩＶ３（インビトロで３日間）で、シタラビンで処理した
。ＤＩＶ４（インビトロで４日間）で、ニューロンを、０．７μＭの最終濃度の（カップ
ホーン超音波処理器中で、５０％の電力で５分間）超音波処理された予め形成されたα－
シヌクレイン原線維（ＰＦＦ）で、単独でまたは示される濃度の抗体と一緒に処理した。
２４時間のインキュベーションの後、培地を収集し、細胞を溶解させた。ウエスタンブロ
ットを、４Ｂ１２抗体（図１１Ａ）（Ｐｉｅｒｃｅ ＭＡ１－９０３４６）および二次抗
マウス抗体を用いて、培地および細胞溶解物の両方において行った。４Ｂ１２＋抗マウス
でプローブした後、ブロットを剥がし、抗ヒト－ＩｇＧ抗体で再度プローブした。４Ｂ１
２でのブロット上では、ＰＦＦのみで処理された細胞からの培地において、１４および１
２ｋＤａにおいて強いバンドがあることが分かり、ここで、１４ｋＤａが、完全長α－シ
ヌクレイン（ＦＬ－ａｓｙｎ）を表し、１２ｋＤａが、Ｃ末端切断フラグメント１～１１
９／１２２（ＣＴ－ａｓｙｎ）を表す。それに加えて、ＳＤＳ抵抗性オリゴマー種を表す
可能性が最も高い、より高い分子量のバンドがあった。アイソタイプ対照抗体Ｂ１２によ
る併用処理は、タンパク質分解または取り込みのこのパターンを変化させなかった。

３７と一緒に原線維で処理された細胞からの培地において、主に、完全長α－シヌクレ
イン（１４ｋＤ）およびごく少量の末端が切断されたバンド（１２ｋＤ）があった。３７
と一緒に原線維で処理された細胞からの細胞溶解物において、完全長α－シヌクレインの
みがあり、これは、３７がＦＬ－α－シヌクレインの切断を防ぐことを示す。さらに、Ｆ
Ｌ－α－シヌクレインの総量が、ＰＦＦのみまたはＢ１２対照抗体で処理された細胞に関
して減少される。いくつかのグループ（Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ ｏｆ Ｐａ
ｔｈｏｌ，Ｖｏｌ．１８２，Ｎｏ．３，Ｍａｒｃｈ，２０１３；Ｒｉｔｃｈｉｅ ｅｔ
ａｌ，Ｈｅａｌｔｈ，Ｖｏｌ．４，Ｓｐｅｃｉａｌ Ｉｓｓｕｅ，１１６７－１１７７，
２０１２；Ｍｉｓｈｉｚｅｎ－Ｅｂｅｒｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，４４
，７８１８－７８２９；Ｄｕｆｔｙ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ，Ｖｏ
ｌ．１７０，Ｎｏ．５，Ｍａｙ ２００７）によって、α－シヌクレインがカルパイン－
１によって切断され得ることが示された。原線維化（ｆｉｂｒｉｌｌｉｚｅｄ）α－シヌ
クレインのためのカルパイン－１の切断部位が、領域１１４～１２２にあることが分かっ
た（Ｍｉｓｈｉｚｅｎ－Ｅｂｅｒｚ，Ｊ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，８６，８３６－８
４７，２００３）。インビボで、トランスジェニック動物およびヒト脳内で、１～１１９
／１２２が、α－シヌクレインにおける主な切断産物であるようであり、切断は、アスパ
ルテ（ａｓｐａｒｔｅ）１１９またはアスパラギン１２２の後にある可能性が高く、これ
は、アスパラギン酸塩へと脱アミド化され、カルパインまたは同様の切断特異性を有する
別のプロテアーゼによって切断される。これらの結果は、抗体３７が、α－シヌクレイン
のＣ末端切断を阻害することができることを示す。抗体３７のエピトープは、酵素カルパ
イン－１結合部位と重なるため、α－シヌクレインへの３７の結合は、カルパイン－１に
よって仲介される結合および切断を直接阻害し得る（図１０および１１）。

２８５のエピトープは、３７のエピトープを重なり、プロテアーゼ切断を阻害すること
も予測され得る。３７ｖ２のアミノ酸配列は、ＣＤＲにおいて１つのアミノ酸における３
７が異なるに過ぎず、３７と同様の結合を有するため、３７ｖ２も、３７と同様にプロテ
アーゼ切断を阻害することが予測されるであろう。抗体の効果が用量依存的であるかどう
かを調べるために、初代皮質ニューロンへのＰＦＦおよび抗体の同時添加による２４時間
実験を設定した。ＰＦＦの濃度は安定していたが（１０μｇ／ｍｌ）、試験される対照抗
体Ｂ１２、および抗体３７、３７ｖ２および２８５の濃度は、１０、５、１および０．１
ｕｇ／ｍｌであった。ウエスタンブロット上のα－シヌクレインを、１９０４／４Ｂ１２
抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて検出し、この抗体は、領域１０３～１０８内のエピトープを
有するため、ＦＬおよびＣ末端切断α－シヌクレインの両方に結合する（図１１Ｂ）。図
１１Ｂから分かるように、ＧＭ３７、３７ｖ２およびＧＭ２８５はいずれも、プロテアー
ゼ切断の用量依存的阻害を有し、高い濃度の抗体で切断のほぼ完全な阻害を有する。

実施例６：細胞培養物中のα－シヌクレイン凝集のシーディングの抗体に仲介される阻害
いくつかの研究により、組み換えαシヌクレイン線維状凝集体の外からの添加が、細胞
内に入り、内因性α－シヌクレインを動員し（ｒｅｃｒｕｉｔ）、ＬＢに類似した、イン
ビトロおよびインビボでのα－シヌクレイン凝集およびリン酸化を誘発し得ることが示さ
れている（Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ－Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｌｕｋ ｅｔ
ａｌ．２０１２ａ，Ｌｕｋ ｅｔ ａｌ．２０１２ｂ，Ｒｅｃａｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．
２０１３，Ｐｅｅｌａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．２０１５）。組み換えα－シヌクレインシ
ードによる内因性マウスα－シヌクレインのシーディングを調べるために、上記のように
調製されたマウス初代皮質ニューロンが、９６ウェルプレート（ウェル当たり１５，００
０個の細胞）中で平板培養される。インビトロ培養の５日目（ＤＩＶ）に、培地の５０％
を交換し、シトシンアラビノシド（１ｕＭの最終濃度）を補充する。インビトロ培養の６
日目（ＤＩＶ６）に、培地の半分を、αシヌクレイン線維性材料、粗原線維シードまたは
純粋なシードのいずれかを含むグリア馴化培地と交換する。粗原線維シードは、細菌から
単離された組み換えモノマーヒトα－シヌクレインから作製され、モノマーを、Ａｍｉｃ
ｏｎ Ｕｌｔｒａ １００．０００カットオフフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃａｔ．
Ｎｏ ＵＦＣ５１００９６）に通してろ過し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１ｍｇ／ｍｌの濃度
に調整した。原線維粗シードを作製するために、モノマー溶液を、プラトーに達するまで
（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｓによる毎日の測定によって評価される）、連続混合（８００
ｒｐｍ）しながら３７Ｃで、ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中でインキュベートした。蒸発を最
小限に抑えるために、溶液を覆うように１滴の鉱油を加えた。インキュベーションの合計
時間は５～７日間であり、純粋なシードは、粗原線維シードを遠心分離してそれらを精製
したものから作製され、凝集されたペレットを、新鮮なＰＢＳ中で再懸濁させ、超音波処
理する。抗体を、α－シヌクレイン粗シードとともにＤＩＶ６で１回加える。初代ニュー
ロン中の培地の半分を、毎週、グリア馴化培地と交換して、それらをＤＩＶ２１まで維持
する。ニューロンを固定し、アミノ酸Ｓ１２９（ａｂｃａｍ ５１２５３）におけるα－
シヌクレインのリン酸化に特異的なウサギ抗体、続いて蛍光標識抗ウサギ抗体を用いてホ
スホ－シヌクレインについて染色し、蛍光を、自動蛍光顕微鏡法、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ
Ａｒｒａｙｓｃａｎを用いて定量化する。核を１つのチャネル内で検出し、有効な細胞の
数を定義する。リン酸化α－シヌクレインスポットを、細胞の細胞質を表す核の周りの所
定の環形成領域において別のチャネル内で検出した。細胞当たりのスポットの平均数を計
算した。細胞染色の例が、図１２Ａに示される。リン酸化αシヌクレインスポットは、非
処理のニューロンでは見られない。粗シードまたは純粋なシード（ウェル当たり１～１０
ｎｇ）とともにインキュベートされたニューロンは、αシヌクレインのリン酸化を誘発す
る（図１２Ａ）。神経突起において、リン酸化シヌクレインは、スポットまたは斑点とし
て現われ、神経突起内のホスホ－シヌクレインの一部は細長く見える。

分別試験のために、細胞をリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中で収集し、遠心分離
した。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含む１％のｔｒｉｔｏｎ緩衝液中で再懸濁させ
た。試料を、１５分間にわたって氷上に保持した後、超音波処理した。試料を、４Ｃで３
０分間にわたって１００，０００×ｇで遠心分離した。上清を収集し、可溶性画分として
表示した。ペレットをｔｒｉｔｏｎ緩衝液中で１回洗浄し、１％のＳＤＳ緩衝液中で再懸
濁させた後、超音波処理した。試料を３０分間にわたって１００，０００×ｇで遠心分離
した。上清を不溶性画分として収集する。タンパク質濃度を測定し、試料を４～１２％の
ＳＤＳ＿ＰＡＧＥゲル上で試験し、膜上にブロットし、αシヌクレインおよびリン酸化α
シヌクレイン（Ｓ１２９Ｐ）を、それぞれ４Ｂ１２／１９０４抗体（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ：ＭＡ１－９０３４６－ヒトシヌクレイン）、Ｓ１２９Ｐ－ａｓｙｎ抗
体（ａｂｃａｍ ５１２５３）およびマウスシヌクレイン抗体（細胞シグナル伝達－Ｄ３
７Ａ６）によって検出する。

図１２Ｂは、粗シードを用いたおよび用いない、初代ニューロンに由来する可溶性およ
び不溶性画分のウエスタンブロットを示す。図１２Ｂから分かるように、シードの添加は
、細胞の不溶性画分内の内因性マウスα－シヌクレインおよびｐ－Ｓ１２９－α－シヌク
レインおよびリン酸化マウスα－シヌクレインの多量体の蓄積をもたらす。

抗体がシーディングを阻害し得るかどうかを試験するために、αシヌクレインシヌクレ
インシードを、６．６ｎＭ（１０ｎｇ／ウェル）の濃度で使用した。異なる濃度の抗体お
よびα－シヌクレインシードを、ＤＩＶ６で一緒に加えて、用量反応を形成した（１３３
ｎＭの最も高い抗体濃度から出発して１３３ｐＭまで）。ニューロンを再度固定し、ホス
ホ－シヌクレイン（ａｂｃａｍ ５１２５３）について染色し、細胞からの蛍光を、自動
蛍光顕微鏡法、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ａｒｒａｙｓｃａｎを用いて定量化した。細胞当た
りのスポット／斑点を、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ａｒｒａｙｓｃａｎにおいて計数した。図
１２Ｃから分かるように、抗体３７、３７ｖ２および抗体２８５はいずれも、用量依存的
にニューロン内のαシヌクレインリン酸化を低減し、３７、３７ｖ２および２８５につい
て同様の最大阻害率（約７０～７５％）および約５ｎＭのＥＣ５０を有していた。最も高
い濃度（１３３ｎＭ）における抗体による処理後の可溶性および不溶性画分への細胞タン
パク質の分別は、図１２Ｄから分かるように、抗体３７、３７ｖ２および２８５がいずれ
も、組み換え粗シードの切断およびＣ末端切断フラグメント（ＣＴ ａ－ｓｙｎ）の蓄積
を阻害し、不溶性画分内のリン酸化内因性マウスα－シヌクレインの蓄積および凝集形態
のマウスα－シヌクレインを低減したことを示す。

実施例７．インビボでのα－シヌクレイン抗体の急性の電気生理学的効果
高い発現レベルのヒトα－シヌクレインが、マウスα－シヌクレインプロモータの制御
下で野生型α－シヌクレインを過剰発現するモデルである、Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジ
ェニックマウスの海馬中に存在する（Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００８ Ｄｅｃ；３９（４）：５８６－９１）。４～６
月齢の雄Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスおよび月齢をマッチさせた対照マウ
スにおける海馬のＣＡ１領域におけるシナプス伝達および可塑性の評価を、インビボで電
気生理学的に行った。データは、基底シナプス伝達が、月齢をマッチさせた対照マウスと
比較してＦ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおいて著しく低下したことを示す
（図１３）。

４～６月齢のＦ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスおよび月齢をマッチさせた対
照雄マウス（ＣＲＯ育種、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｅｕｒｏｐｅ Ａ／Ｓ）を、制御された温度
（２２±１．５℃）および湿度条件（５５～６５％）において単一の小屋に収容し、１２
：１２時間の明／暗サイクル（０６：００ｈで照明をオンにする）で飼育した。食物およ
び水は自由に摂取可能であった。

動物に、ウレタン（１．２ｇ／ｋｇ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で麻酔をかけた。次に
、マウスを定位フレームに取り付け、マウスの体温を加熱パッドによって３７．５℃に調
整し、頭蓋骨を露出させた。白金線を、基準として働くように前頭骨に設置し、Ｐａｘｉ
ｎｏｓおよびＦｒａｎｋｌｉｎ（Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｆｒａｎｋｌｉｎ’ｓ ｔｈ
ｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ
，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）の図解にしたがって以下の配置で、海馬中への記
録および刺激電極の挿入のためにさらなる孔を空けた：記録、ブレグマの１．５～１．７
ｍｍ後方、正中線の１．０～１．２ｍｍ側方、脳の表面の１．４～１．７ｍｍ下；刺激、
ブレグマの１．８～２．０ｍｍ後方、正中線の１．５～１．７ｍｍ側方、脳の表面の１．
５～１．７ｍｍ下。動物を、記録の全期間を通して定位フレームに置いたままにし、それ
らの麻酔のレベルを定期的に調べた。

電場電位（ｆＥＰＳＰ）を、３０秒ごとのシャファー側枝の電気刺激によってＣＡ１に
おいて誘発し、記録電極の深さを、マイナスのｆＥＰＳＰが単極方形パルスに応答して記
録されるまで調整した。誘発されたｆＥＰＳＰの傾きを、ｆＥＰＳＰの最大振幅の３０～
７０％で測定した。

最適なｆＥＰＳＰが誘発されたら、基底シナプス伝達を、刺激強度と誘発されたｆＥＰ
ＳＰの傾きとの間の関係（入出力関係）によって評価した。様々な強度の刺激は、０、２
５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、および５００μＡであり、
これを低い方から順に連続して加え、各強度で２～３回繰り返す。基底シナプス伝達は、
月齢をマッチさせた対照マウスと比較してＦ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスに
おいて著しく低下したことが分かった。

Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の確認された障
害を用いて、αシヌクレインに仲介される影響を阻止する能力についてＧＭ３７、ＧＭ２
８５および比較用ｈ９Ｅ４を試験した。

１５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内（ｉ．ｐ．））の用量での単回用量の抗体の投与の３～６時間
後に、全ての実験において記録を行った。基底シナプス伝達を、可能であれば各動物の両
方の海馬において記録し、個々の実験として記録した。

ｈ９Ｅ４による急性治療は、Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底
シナプス伝達の障害のかなりの改善を誘発した（Ｔｇ－ｓｎｃａ＋ｈ９Ｅ４対Ｔｇ－ｓｎ
ｃａ＋ＰＢＳ、ｐ＝０．００２、図１４）。しかしながら、ｈ９Ｅ４による改善は、ＰＢ
Ｓで処理された同腹仔における基底シナプス伝達との著しい差によって示されるように（
ｐ＝０．００７）、部分的であるに過ぎなかった。

ＧＭ３７による急性治療は、Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底
シナプス伝達の障害のかなりの改善を誘発した（Ｔｇ－ｓｎｃａ＋ＧＭ３７対Ｔｇ－ｓｎ
ｃａ＋ＰＢＳ、ｐ＝０．００４、図１５）。ＧＭ３７で処理されたトランスジェニックマ
ウスにおける基底シナプス伝達は、ＰＢＳで処理された同腹仔における基底シナプス伝達
とそれほど異なっておらず、これは、障害の完全な改善を示す（図１５）。

ＧＭ２８５も、Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達
の障害のかなりの改善を誘発した（図１６）。ＧＭ２８５で処理されたトランスジェニッ
クマウスにおける基底シナプス伝達は、ＰＢＳで処理された同腹仔における基底シナプス
伝達とそれほど異なっておらず、これは、障害の完全な改善を示す。

実施例８．覚醒自由行動動物の脳におけるヒトα－シヌクレインを評価するための微小透
析
プッシュプル微小透析方法を用いて、脳間質液（ＩＳＦ）におけるヒトα－シヌクレイ
ンのレベルを評価した。マウスを、制御された温度（２２±１．５℃）および湿度条件（
５５～６５％）において単一の小屋に収容し、１２：１２時間の明／暗サイクル（０６：
００ｈで照明をオンにする）で飼育した。食物および水は自由に摂取可能であった。この
試験を、Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウス（５０～５４週齢）の海馬において
行った。海馬における微小透析を可能にするために、マウスにイソフルランで麻酔をかけ
、大脳内ガイドカニューレ（ＣＭＡ）を、脳内に定位に埋め込み、Ｐａｘｉｎｏｓおよび
Ｆｒａｎｋｌｉｎ ２００１の図解にしたがって、微小透析プローブを海馬内で位置決め
した（プローブ先端の配置：ブレグマの３．１ｍｍ後方および２．８ｍｍ側方、および硬
膜に対して１．３ｍｍ）。固定ねじおよびアクリルセメントをガイドカニューレの固定に
使用した。カニューレの埋め込みの後、マウスを、透析前の２～３日間にわたって外科手
術から回復させた。

実験の当日、２ｍｍの、１０００ｋＤａカットオフＣＭＡプローブを、ガイドカニュー
レに挿入した。プローブを、２つの流路を有する微小透析蠕動ポンプ（ＭＡＢ２０；Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｔｅｃｈ）に連結し、プッシュプルモードで操作した。微小透析プローブの
入口管を、プローブに人工脳脊髄液をかん流させる蠕動ポンプ（ａＣＳＦ；ｍＭ単位：１
４７ＮａＣｌ、２．７ＫＣｌ、１．２ＣａＣｌ_２、０．８５ＭｇＣｌ_２）に連結した。か
ん流液を管から引き出すことによる、プローブからのかん流液損失を防ぐために、蠕動ポ
ンプをさらに出口管に連結した。かん流緩衝液として、２５％のウシアルブミン画分Ｖ（
Ｓｉｇｍａ）を、使用当日に人工ＣＳＦで０．２％に希釈し、０．１μｍの膜に通してろ
過した。ポンプの実際の流量を、プローブを連結させずに測定した。試料管を、所与の期
間にわたってサンプリングする前および後に秤量し、流量を計算した。次に、ポンプを、
１μＬ／分の一定流量に設定した。１２０分のサンプリング計画を、実験期間を通して使
用した。組織損傷の干渉を避けるために、実験期間を、プローブ埋め込みの１４～４８時
間後に設定した。実験の開始の１４～１６時間後、ＧＭ３７、ヒト９Ｅ４またはアイソタ
イプ対照（抗ＨＥＬ）を、１５ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、さらなる６つ
の試料（１２時間の収集）を収集した。透析液を－８０℃で貯蔵した。ヒトαシヌクレイ
ンの濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｖａｎｃｅ ＥＬＩＳＡキット）によって決定した。

抗体処理の前の２～３つの基底値（４時間～６時間）の平均を、ベースラインとして取
り、各動物について１００％に設定した。統計的関連性を評価するために、データを、反
復測定による二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて評価した。海馬中のヒトα－シヌ
クレインの基底レベルは、８．１±１．１ｎｇ／ｍｌであった（平均±ＳＥＭ、ｎ＝２５
、インビトロ透析プローブ回収に対して補正されていない）。ＧＭ３７の投与は、比較用
抗体、ヒト９Ｅ４、およびアイソタイプ対照（抗ＨＥＬ）の両方と比較して、Ｆ２８マウ
スの海馬中のヒトα－シヌクレインの大幅な減少を誘発した（図１７）。

実施例９：インビボでのα－シヌクレイン抗体の慢性効果。抗体ＧＭ３７が、ラットパー
キンソン病モデルにおける運動表現型を改善する。
ラット中脳中のドーパミン作動性ニューロンに対するヒトα－シヌクレインの標的化さ
れた過剰発現が、組み換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を用いて実現可能で
あり、これは、黒質中のドーパミン性細胞の進行性消失ならびに運動障害に関連している
。

既に記載されているように、成体雌スプラーグドーリーラット（２２５～２５０ｇ）を
用いて、サイトメガロウイルスプロモータからのエンハンサー要素とともにニワトリβ－
アクチンプロモータを含有するＡＡＶ２／５血清型のアデノ随伴ウイルス、続いて、ヒト
α－シヌクレインｃＤＮＡおよびＷＰＲＥ要素の注入によって、黒質（ＳＮ）中のヒトα
－シヌクレインを発現させた（Ｘｕ Ｌ，Ｄａｌｙ Ｔ，Ｇａｏ Ｃ，Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ
Ｒ，Ｓｏｎｇ Ｓ，Ｂｙｒｎｅ ＢＪ，Ｓａｎｄｓ ＭＳ，Ｐｏｎｄｅｒ ＫＰ（２００
１）。このモデルにおいて、ヒトα－シヌクレイン発現が、ドーパミン作動性ニューロン
の神経変性につながることが示されている（Ｍａｉｎｇａｙ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＣＮＳ
Ｓｐｅｃｔｒ．２００５ Ｍａｒ；１０（３）：２３５－４４）。このモデルにおいてα
シヌクレイン治療用抗体の効果を試験するために、抗体処理を、ウイルス注入の２～４日
前に開始し、試験の終了まで続けた（図１８）。同じ体積（５ｍｌ／ｋｇ：ＩＰ）におけ
るＰＢＳ投与を、対照として使用した。ＧＭ３７を、１５ｍｇ／ｋｇ（ＩＰ）の用量で週
に２回投与した。ヒト野生型α－シヌクレインの遺伝子または緑色蛍光タンパク質（ＧＦ
Ｐ）を含有するウイルス粒子（ｒＡＡＶ２／５）を、ＳＮの片側に注射した。動物に、２
．０ｍｌ／ｋｇ皮下（ｓ．ｃ．）で、Ｈｙｐｎｏｒｍ（登録商標）とＤｏｒｍｉｃｕｍ（
登録商標）との組合せで麻酔をかけ、定位フレームに設置した。動物の体温を加熱パッド
によって３７．５℃に調整し、頭蓋骨を露出させた。ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎ
（Ｐａｘｉｎｏｓ ＆ Ｗａｔｓｏｎ，１９９８）の図解にしたがって、以下の配置で右
ＳＮの上に孔を空けた：ブレグマの５．５ｍｍ後方および２．０ｍｍ側方。３μＬのｒＡ
ＡＶ２／５－α－ｓｙｎまたはｒＡＡＶ２／５－ＧＦＰの単回注入を、定位注入器（ｓｔ
ｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）に連結されたＨａｍｉｌｔｏｎ製シリンジを用
いて、硬膜の７．２ｍｍ下の深さで、および０．２μＬ／分の流量で行った。ＳＮにおけ
るベクターの拡散を可能にするために、針をさらに５分間所定の位置に置いておいた。外
科手術の後、動物をホームケージに戻し、加熱された環境に置き、ここで、動物を麻酔か
ら回復させた。シリンダー試験における運動非対称性の試験を、ＡＡＶ注入の前、ならび
にＡＡＶ注入の３、７および１０週間後に評価した。示されたデータは、左前足および右
前足の両方の全使用と比較した右前足の使用の比率に対応している。シリンダーにおける
各動物の動作を合計５分間撮影し、５分間にわたって左前足および右前足を用いた接触の
回数の手動の採点を、ウイルス注入の１０週間後の試験最終日に行った。１０週の時点で
ＡＡＶ－ＧＦＰが注入されたラット（ｐ＝０．０１２）と比較してＡＡＶ－ｓｙｎにおい
て、著しい障害が存在する。ＧＭ３７処理された動物の動作がＧＦＰラットと異なる（ｇ
ｍ３７に対してそれぞれｐ＝０．１６３およびｐ＝０．４０７）ため、ＧＭ３７処理され
た動物の改善の傾向が示された。この発見は、抗体ＧＭ３７が、このラットモデルにおい
てパーキンソン病の運動表現型を改善することができることを示す（図１８および１９）
。

実施例１０：インビボでのαシヌクレイン抗体の慢性効果。抗体ＧＭ３７が、内因性マウ
スαシヌクレイン凝集のシーディングおよびリン酸化を阻害する。
野生型マウスの背側線条体への、組み換えタンパク質から作製されたαシヌクレインに
より予め形成された原線維の注入は、内因性マウスαシヌクレインを動員し、皮質、へん
とう体および黒質中のニューロンの内部のＳｅｒ－１２９リン酸化凝集体の形成を誘発す
る（Ｌｕｋ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ｎｏｖ １６；３３８
（６１０９）：９４９－５３）。α－シヌクレイン特異的モノクローナル抗体ＧＭ３７が
、インビボでのα－シヌクレイン原線維に誘発されるリン酸化αシヌクレイン封入体形成
の出現を減少させ得るかどうかを調べるために、合計４５匹のマウスを使用した。マウス
に、３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内（ｉ．ｐ）でＧＭ３７、ＧＭ３７ １５ｍｇ／ｋｇ静脈内（ｉ
．ｖ．）、またはビヒクルｉｐ（ＰＢＳ）を投与した。１日後、マウスに麻酔をかけ、既
に記載されているように作製された２ｕｌの組み換えヒトα－Ｓｙｎ粗シード（実施例６
）（動物当たり合計２μｇの粗シード）を片方の脳半球に定位で注入した。粗シードを注
入するために、孔を空けることによって頭蓋骨を切開し、接種材料が背側線条体（硬膜の
＋２．６ｍｍ下）に向けられるように右前脳内に単一のガラスピペットを挿入した（配置
：ブレグマの＋０．５ｍｍ前方、正中線の＋２．０ｍｍ側方）。回復の後、４５日で殺処
分するまで抗体の腹腔内（ｉ．ｐ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）注入をマウスに週に１回
受けさせた。１５匹のマウス／群の群に、ＧＭ３７ １５ｍｇ／ｋｇを静脈内に（ｉｖ）
、ＧＭ３７ ３０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に（ｉｐ）、またはＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を腹
腔内に（ｉｐ）週に１回投与した。

血漿中の抗体濃度を測定するために、頬の血液を、次の注入の直前に週に１回、すなわ
ち、最後の注入の７日後に抜き取った。血漿を２０００ｇの回転によって得て、室温で１
５分間インキュベートし、続いて、上清を－２０℃で凍結させた。ＣＳＦ試料を、試験の
終了時に取り、－２０℃で凍結させた。血漿およびＣＳＦ試料を分析して、ＭＳＤによっ
てヒトＩｇＧの濃度を決定した。簡潔に述べると、マウス抗ヒトＩｇＧ（クローンＭＨ１
６－１（Ｍ１２６８）を、捕捉のために使用し、ウェル中で血漿またはＣＳＦをインキュ
ベートし、続いて、スルホ－ＴＡＧヤギ抗ヒト（ＭＳＤ ｃａｔ ｎｏ：Ｒ３２ＡＪ－１
）を検出抗体として使用した。プレートを、ＭＳＤによって電気化学発光から分析した。

血漿中の抗体レベルが、図２０Ｂに示され、６週間の間の抗体血漿濃度および血漿中の
抗体の蓄積の用量依存的増加を示す。ｃｓｆ中の抗体レベルが、図２０Ｃに示され、血漿
中の約０．１％の抗体レベルがｃｓｆ中で測定され得ることを示す。

αシヌクレイン線維性シードの注入の時点から４５日で、マウスに麻酔をかけ、ＰＢＳ
を経心臓的にかん流させた後、中性緩衝パラホルムアルデヒド（４％）をかん流させた。
脳を取り出し、中性緩衝パラホルムアルデヒド中で後固定のために一晩インキュベートし
た。免疫組織化学を、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓによって厚さ４
５μＭの連続切片において行った。簡潔に述べると、ＭｕｌｔｉＢｒａｉｎ（登録商標）
技術を用いて、最大で２５個のマウス脳を、ブロックごとに一緒に、３つのブロック中に
埋め込み、前頭面中で、厚さ４５μｍの凍結切片を作製し、抗原保存溶液を含むカップに
収集した。６つ置きの切片を、Ｓｅｒ－１２９リン酸化α－シヌクレインに対する抗体（
抗αシヌクレイン（ホスホＳ１２９）抗体［Ｐｓｙｎ／８１Ａ］ａｂ１８４６７４）で染
色して、Ｓｅｒ１２９リン酸化αシヌクレイン反応性構造を明らかにした。

６つ置きの切片からの黒質全体をカバーする５～７つの切片からの、１０倍の倍率の画
像から免疫反応性陽性細胞を手動で計数することによって、ｐＳｙｎ病変の定量化を行っ
た。計数を盲検で行った。へんとう体および黒質における細胞計数を、一元配置ＡＮＯＶ
Ａ、続いてボンフェローニｔ検定によって分析し、ここで、ＧＭ３７抗体の効果をＰＢＳ
処理と比較した。

図２０Ｃから分かるように、抗体ＧＭ３７による処理は、腹腔内（ｉｐ）または静脈内
（ｉｖ）処理のいずれかによるＰＢＳ対照と比較して、黒質における細胞内封入体の数を
著しく減少させた。データは、抗体ＧＭ３７が、ニューロン間のその伝播を阻止し、およ
び／またはミクログリアへの取り込みによってＩＳＦからのクリアランスを促進すること
によって、ニューロンへの細胞外病理学的α－シヌクレインの侵入を阻止することによっ
て、ＰＤの治療効果を与え得ることを示す。封入体のこの出現が、ドーパミン作動性ニュ
ーロンの損失および動物モデルにおけるパーキンソン病様運動障害の発現に関連している
ため、抗体ＧＭ３７による処理は、ドーパミン性細胞の損失およびＰＤの運動障害の発現
に対する治療効果を与え得る。

実施例１１：ＧＭ３７およびＧＭ３７変異体の製造可能性
抗α－シヌクレイン抗体は、患者に使用するための臨床グレード材料を製造するのに使
用される製造条件を模倣する条件下で、哺乳動物細胞培養物中で産生される。このように
産生されたタンパク質は、抗体の治療有効性ならびに経時的な抗体の安定性に影響を与え
る生物物理学的特性の両方に影響を与え得る翻訳後修飾を起こすことが周知である。数十
年の研究から確認された経験的知識により、特定の分子の発現性（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉ
ｌｉｔｙ）のリスクを生じることが知られている一連の翻訳後修飾が確認された。これら
の翻訳後修飾は、重鎖および軽鎖タンパク質の一次配列中に存在するアミノ酸鎖と相関す
ることが示されている。これらの配列を同定し、それらが治療用抗体の製造可能性および
発現性に与える潜在的リスクを決定し得るアルゴリズムが作成された。

抗体の一次配列のインシリコ分析が、治療薬として開発される可能性のために分子のリ
スクを回避する（ｄｅｒｉｓｋ）のに使用され得る。特に、ＶＨおよびＶＬ領域の詳細な
分析が、経時的なその安定性に対する潜在的リスクにもなり得る分子活性に重要であると
考えられる独自のアミノ酸を特定し得る。配列特異的脱アミド化は、タンパク質構造に対
する潜在的リスクとして特定された。タンパク質脱アミド化は、グルタミンまたはアスパ
ラギン残基のアミド側鎖上で発生し、それらをカルボン酸基へと変換し得る（Ｌｏｒｅｎ
ｚｏ ｅｔ ａｌ．ＰＬＯＳｏｎｅ，ＤＯＩ：１０．１３７１，Ｄｅｃ．（２０１５））
。中性ｐＨにおける非酵素的脱アミド化が、アスパラギンについてより早く起こり、した
がって、グルタミンより高いリスクが考えられる。この活性は、配列内の後続のアミノ酸
によってさらに影響され、数日または数年の率で起こり得る。脱アミド化を起こすタンパ
ク質の実際の結果物は、その安定性および活性の両方に対する変化の影響を決定するため
に、実験的に評価する必要がある。

本発明者らは、ＧＭ３７のＶＨ領域内の脱アミド化のための部位を特定した。アミノ酸
残基５４は、位置５５におけるグリシン（Ｇ）が後続するアスパラギン（Ｎ）である。Ｎ
５４は、自然発生的な脱アミド化の高いリスクがある。このリスクを低下させるために、
本発明者らは、アスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）またはヒスチジン
（Ｈ）で置き換えた一連の３つの変異体を作製した。全ての３つの変異体を、一過性トラ
ンスフェクション方法を用いて哺乳動物細胞培養物中で生成した（実施例１．５）。全て
の３つの変異体は、ＧＭ３７ｗｔと同様の発現および精製特性を示した（図２３）。

８つの産物のそれぞれについて、４００ｍｌの一過性トランスフェクションを、最小で
２週間にわたって培養物中に入れていたＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ細胞を用いて行った
。細胞を、トランスフェクションの２４時間前に継代培養した。全てのトランスフェクシ
ョンを、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅ ＸＣｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いたエレクトロポレ
ーションによって行った。各トランスフェクションについて、生細胞を、２．８６×１０
^７個の細胞／ｍｌになるまで６ｍＭのＬ－グルタミンを補充した予め温めたＣＤ－ＣＨＯ
培地中で再懸濁させた。適切な重鎖および軽鎖を含有する、４０μｇのそれぞれの確立さ
れたＳＧＶ ＤＮＡを、各キュベット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒキュベッ
ト、０．４ｃｍの間隙、１６５－２０８８）に分割し、７００μｌの細胞懸濁液を加えた
。細胞を、３００Ｖ、９００μＦで電気穿孔した。トランスフェクトされた細胞を、エル
レンマイヤーフラスコ中の予め温めた培地に移し、予め温めた培地で２回すすいだキュベ
ットの内容物もフラスコに移した。トランスフェクタント培養物を、３６．５℃、５％の
ＣＯ_２、８５％の湿度、１４０ｒｐｍで６日間、振とう培養器中でインキュベートした。
細胞生存性を、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ自動細胞計数器（Ｒｏｓｃｈｅ）を用いて、採取
時に測定した。

ヒトα－シヌクレインへの結合における残基５４の重要性を評価するために、本発明者
らは、２つの異なる実験において変異体が結合する能力を分析した。競合ＥＬＩＳＡフォ
ーマットを用いて、本発明者らは、残基５４における変化が溶液中のα－シヌクレインに
結合するＧＭ３７の能力に与え得る影響を評価した。シヌクレインで被覆されたＥＬＩＳ
Ａプレートへの抗体の結合を阻害することが可能なシヌクレインの濃度を評価することに
よって、本発明者らは、全ての３つの変異体がＧＭ３７ｗｔと同じ結合を維持しており、
１～２ｎＭのＩＣ５０をもたらす高い親和性でα－シヌクレインに結合することを示した
（図２４）。室温で６０分間にわたって、０～１０００ｎＭの範囲のヒトα－シヌクレイ
ンを用いて、一定の濃度（０．３μｇ／ｍｌ）の以下の抗体、ＧＭ３７（ＧＭ３７ ｗｔ
と呼ばれる）、ＧＭ３７変異体１、ＧＭ３７変異体２およびＧＭ３７変異体３のそれぞれ
のプレインキュベーションを用いて競合アッセイを行った。残りの非結合抗体を捕捉し、
電気化学発光（ＭＳＤ，Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によって、抗ヒト検出抗体を用
いて、１００ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトα－シヌクレインで被覆されたＥＬＩＳＡプレー
ト上で測定した。相互作用のＩＣ５０は、ＧＭ３７ ｗｔ、ＧＭ３７変異体１、ＧＭ３７
変異体２およびＧＭ３７変異体３についてそれぞれ、１．９ｎＭ、１．６ｎＭ、２．１ｎ
Ｍおよび１．４ｎＭである（Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ（登録商標）を用いて決定し
た際）。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、本発明者らは、ＧＭ３７ ｗｔ（２バッチ）
および３つの変異体の結合のリアルタイム速度を評価した（実施例２）。ヒトα－シヌク
レインをスライド（リガンド）に捕捉し、抗体をそれぞれ、検体として複数の濃度で試験
した。複数の濃度における抗体の存在下での結合曲線の分析は、抗体を緩衝液から除去し
たときと同様に、オンレート（ｏｎ ｒａｔｅ）が全ての４つの抗体について同じであっ
たことを示し、測定されたオフレート（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）は、抗体間の統計学的差異を
示さなかった。１：１の結合アルゴリズムを用いて、全ての４つの抗体は、ほぼ同一の結
合定数を有する（図２５）。

Ｎ５４における変化がＧＭ３７の機能活性に対して与える影響を評価するために、本発
明者らは、初代ニューロンの培養物中のシヌクレインシーディング活性を阻止する抗体の
能力を分析した（実施例６）。シーディングのレベルが、ホスホ－シヌクレインに特異的
な抗体を用いて測定される。全ての３つの抗体が、ホスホ－シヌクレインシグナルによっ
て測定した際に、シーディングを阻止することができた（図２６）。さらに、阻害のレベ
ルは、全ての４つの抗体について同じであった。この細胞に基づくデータは、ＶＨ領域に
おけるアミノ酸５４が、ヒトα－シヌクレインに対する結合親和性に、または初代細胞に
基づくアッセイにおけるシーディングの阻害に必要とされないという結合データをさらに
確認する。さらに、本発明者らは、これらの抗体の３つ全てが、標準的な発現および精製
方法を用いた生産が可能であったことを見出した。興味深いことに、変異体Ｎ５４Ｑの１
つは、他の変異体を上回る生産の向上を示し、これは、抗体が大規模で商業的に生産され
る場合、非常に重要である。これらのデータは、有効性の低下に対する懸念を伴わずに、
アスパラギン（Ｎ）を別のアミノ酸で置き換えることによって、脱アミド化の潜在的リス
クを低下させる可能性を裏付けるものである。

抗体ｗｔ ＧＭ３７、ｖａｒ１、ｖａｒ２およびｖａｒ３のそれぞれの試料を、時間とともに温度を着実に上昇させ、凝集のレベルを、多角度光散乱（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８，ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって同時に測定した。凝集開始の温度は、ＧＭ３７およびＧＭ３７－変異体について同様であることが分かったが、凝集の最も低いレベルは、ＧＭ３７－Ｖａｒ２について観察された（図２７）。

本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
ヒトα－シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体であって、ヒトα－シヌクレイン（配列番号１０）のアミノ酸１１２～１１７（配列番号９（ＩＬＥＤＭＰ））内のエピトープに結合する抗体、または前記エピトープに結合するその抗原結合フラグメント。
［２］
前記抗体が、前記エピトープへの結合について、配列番号８の軽鎖可変領域および配列番号７、３０、３１または３２の重鎖可変領域を含む抗体と競合することが可能である、請求項１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
［３］
ヒトα－シヌクレイン（配列番号１０））のアミノ酸１１２～１１５（配列番号１９（ＩＬＥＤ）内のエピトープに特異的に結合することが可能である、請求項１に記載のモノクローナル抗体、または前記エピトープに結合するその抗原結合フラグメント。
［４］
前記抗体が、前記エピトープへの結合について、配列番号２６の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域を含む抗体と競合することが可能である、請求項１または３に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
［５］
無傷の抗体を含むかまたはそれからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
［６］
前記モノクローナル抗体が、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の抗体からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
［７］
Ｆｖフラグメント（例えば一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）およびドメイン抗体（例えば単一のＶＨ可変領域またはＶＬ可変領域）からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項１～６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
［８］
前記抗体または抗原結合フラグメントが、以下の特性：
ａ）１～５ｎＭまたは１～２ｎＭなどの、０．５～１０ｎＭのα－シヌクレインに対する結合親和性（ＫＤ）；
ｂ）α－シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する能力；
ｃ）Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する能力；
ｄ）インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα－シヌクレインのレベルを減少させる能力；
ｅ）慢性的に投与されるとき、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回復させる能力；
ｆ）α－シヌクレインのシーディング（インビトロでのおよび／またはパーキンソン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化αシヌクレインの蓄積など）を防ぐ能力；および／または
ｇ）ヒトの脳における切断α－シヌクレインに結合する能力
の１つまたは複数を示す、請求項１～７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
［９］
ヒト、ヒト化、組み換えまたはキメラ抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
［１０］
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、モノクローナル抗体または請求項１～２および５～９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント。
［１１］
配列番号７の重鎖可変領域または配列番号８の軽鎖可変領域を含む、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
［１２］
配列番号７の可変領域からなる重鎖および配列番号８の可変領域からなる軽鎖を含む、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
［１３］
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、モノクローナル抗体または請求項１～２および５～９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント。
［１４］
配列番号３０の重鎖可変領域または配列番号８の軽鎖可変領域を含む、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
［１５］
配列番号３０の可変領域からなる重鎖および配列番号８の可変領域からなる軽鎖を含む、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。
［１６］
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、モノクローナル抗体または請求項１～２および５～９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント。
［１７］
配列番号３１の重鎖可変領域または配列番号８の軽鎖可変領域を含む、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
［１８］
配列番号３１の可変領域からなる重鎖および配列番号８の可変領域を含む、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
［１９］
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、モノクローナル抗体または請求項１～２および５～９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント。
［２０］
配列番号３２の重鎖可変領域または配列番号８の軽鎖可変領域を含む、請求項１９に記載のモノクローナル抗体。
［２１］
配列番号３２の可変領域からなる重鎖および配列番号８の可変領域を含む、請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
［２２］
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、モノクローナル抗体または請求項１、３および５～９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのフラグメント。
［２３］
配列番号２６の重鎖可変領域または配列番号２７の軽鎖可変領域を含む、請求項２２に記載のモノクローナル抗体。
［２４］
配列番号２６の可変領域からなる重鎖および配列番号２７の可変領域を含む、請求項２３に記載のモノクローナル抗体。
［２５］
請求項１～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む調製物であって、前記調製物が、α－シヌクレインに結合することが可能でないかまたは前記調製物の抗α－シヌクレイン機能性を実質的に変更しない自然発生する抗体を実質的に含まず、前記機能性が、
（ｉ）α－シヌクレインに対する前記抗α－シヌクレイン抗体の結合親和性（ＫＤ）；
（ｉｉ）α－シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する、前記抗α－シヌクレイン抗体の能力；
（ｉｉｉ）Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する、前記抗α－シヌクレイン抗体の能力；
（ｉｖ）インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα－シヌクレインのレベルを減少させる、前記抗α－シヌクレイン抗体の能力；
（ｖ）慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回復させる、前記抗α－シヌクレイン抗体の能力、
（ｖｉ）α－シヌクレインのシーディング（インビトロでのおよび／またはパーキンソン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化αシヌクレインの蓄積など）を防ぐ能力；または
（ｖｉｉ）ヒトの脳における切断α－シヌクレインに結合する能力
からなる群から選択される調製物。
［２６］
請求項１～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む調製物であって、前記モノクローナル抗体が、天然抗α－シヌクレイン抗体の構造と比べて、そのアミノ酸配列の構造変化を有し、前記構造変化により、前記モノクローナル抗体が、前記天然抗α－シヌクレイン抗体によって示される機能性と比べて変化した機能性を示し、前記機能性が、
（ｉ）α－シヌクレインに対する前記抗α－シヌクレインモノクローナル抗体の結合親和性（ＫＤ）；
（ｉｉ）α－シヌクレイン原線維のプロテアーゼ切断を阻害する、前記抗α－シヌクレインモノクローナル抗体の能力；
（ｉｉｉ）Ｆ２８－ｓｎｃａトランスジェニックマウスにおける基底シナプス伝達の障害を改善する、前記抗α－シヌクレインモノクローナル抗体の能力；
（ｉｖ）インビボ微小透析によって測定した際のマウス海馬におけるα－シヌクレインのレベルを減少させる、前記抗α－シヌクレインモノクローナル抗体の能力；
（ｖ）慢性的に投与されるときの、パーキンソン病のラットモデルにおける運動機能を回復させる、前記抗α－シヌクレインモノクローナル抗体の能力；
（ｖｉ）α－シヌクレインのシーディング（インビトロでのおよび／またはパーキンソン病のマウスモデルにおける不溶性リン酸化αシヌクレインの蓄積など）を防ぐ能力；または
（ｖｉｉ）ヒトの脳における切断α－シヌクレインに結合する能力
からなる群から選択される調製物。
［２７］
請求項１～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または請求項２５～２６のいずれか一項に記載の調製物、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
［２８］
請求項１０～２４のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントをコードする核酸。
［２９］
治療に使用するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント、または請求項２５～２６のいずれか一項に記載のその調製物。
［３０］
シヌクレイノパチーを治療するのに使用するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントまたは請求項２５～２６のいずれか一項に記載のその調製物。
［３１］
パーキンソン病、特発性および遺伝性のパーキンソン病、ゴーシェ病（ＧＤ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症または多系統萎縮症を治療するのに使用するための、請求項３０に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
［３２］
薬剤の製造に使用するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントまたは請求項２５～２６のいずれか一項に記載のその調製物。
［３３］
パーキンソン病（特発性および遺伝性のパーキンソン病を含む）、ゴーシェ病（ＧＤ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症または多系統萎縮症を治療するのに使用するための、請求項３２に記載の薬剤。
［３４］
被験体におけるパーキンソン病または他のシヌクレイノパチーを治療する方法であって、請求項１～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、または請求項２５～２６に記載の調製物または請求項２７に記載の医薬組成物を、有効量で前記被験体に投与する工程を含む方法。
［３５］
前記治療が長期である、請求項３４に記載の方法。
［３６］
前記長期治療が、少なくとも２週間にわたる、請求項３５に記載の方法。
［３７］
前記被験体がヒトである、請求項３４に記載の方法。
［３８］
治療に使用するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント、または請求項２５～２６のいずれか一項に記載の調製物、または請求項２７に記載の医薬組成物を含むキット。
［３９］
検出可能に標識される、請求項１～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
［４０］
前記検出可能な標識が、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識、放射性同位体標識または酵素標識である、請求項３９に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント。
［４１］
被験体の脳における前記α－シヌクレインの存在または量を検出または測定するのに使用するための、請求項３９～４０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
［４２］
前記検出または測定が、前記α－シヌクレインに結合された前記抗シヌクレイン抗体のインビボイメージングを含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
［４３］
前記検出または測定が、前記α－シヌクレインに結合された、前記抗シヌクレイン抗体または前記その抗原結合フラグメントのエクスビボイメージングを含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
［４４］
シヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングするための薬剤の製造に使用するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント、または請求項２５～２６のいずれか一項に記載の調製物、または請求項２７に記載の医薬組成物、または請求項３９～４０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、または調製物または医薬組成物の使用。
［４５］
前記薬剤が、パーキンソン病（特発性および遺伝性のパーキンソン病を含む）、ゴーシェ病（ＧＤ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症および多系統萎縮症を治療するのに使用するためのものである、請求項４４に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント、または調製物または医薬組成物の使用。
［４６］
被験体におけるパーキンソン病または他のシヌクレイノパチーを治療、診断またはイメージングする方法であって、請求項１～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント、または請求項２５～２６のいずれか一項に記載の調製物、請求項２７に記載の医薬組成物、または請求項３９～４０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント、調製物または医薬組成物を、有効量で前記被験体に投与する工程を含む方法。
［４７］
前記治療が長期である、請求項４６に記載の方法。
［４８］
前記長期治療が、少なくとも２週間にわたる、請求項４７に記載の方法。
［４９］
前記被験体がヒトである、請求項４８に記載の方法。
［５０］
被験体の脳または体液中の前記α－シヌクレインの存在または量を検出または測定するのに使用するための、請求項３９～４０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
［５１］
前記検出または測定が、前記α－シヌクレインに結合された前記抗シヌクレイン抗体のインビボイメージングを含む、請求項５０に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
［５２］
前記検出または測定が、前記α－シヌクレインに結合された、前記抗シヌクレイン抗体または前記その抗原結合フラグメントのエクスビボイメージングを含む、請求項５１に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
［５３］
ヒト細胞株、非ヒト哺乳動物細胞株、昆虫、酵母または細菌細胞株などの細胞株において生産または製造された、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
［５４］
ＣＨＯ細胞株、ＨＥＫ細胞株、ＢＨＫ－２１細胞株、マウス細胞株（骨髄腫細胞株など）、線維肉腫細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株、ＨＫＢ－１１細胞株、ＣＡＰ細胞株およびＨｕＨ－７ヒト細胞株において生産される、請求項５３に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント。
［５５］
配列番号１８に定義される定常領域および配列番号１７に定義されるκ定常領域を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント。
［５６］
配列番号２８に定義される定常領域および配列番号２９に定義されるκ定常領域を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント。

Claims (16)

1. （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
   （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
   （ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
   （ｄ）配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
   （ｅ）配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
   （ｆ）配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
   を含むヒトα－シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。
2. 前記モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントが、 配列番号７の重鎖可変領域および配列番号８の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
3. （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
   （ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
   （ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
   （ｄ）配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
   （ｅ）配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
   （ｆ）配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
   を含むヒトα－シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。
4. 前記モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントが、 配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号８の軽鎖可変領域を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
5. （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
   （ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
   （ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
   （ｄ）配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
   （ｅ）配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
   （ｆ）配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
   を含むヒトα－シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。
6. 前記モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントが、 配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号８の軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
7. （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
   （ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
   （ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
   （ｄ）配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
   （ｅ）配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
   （ｆ）配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
   を含むヒトα－シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
8. 前記モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントが、 配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号８の軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
9. （ａ）配列番号２０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
   （ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
   （ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
   （ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
   （ｅ）配列番号２４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
   （ｆ）配列番号２５のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
   を含むヒトα－シヌクレインに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。
10. 前記モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントが、 配列番号２６の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記モノクローナル抗体が、 無傷の抗体を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
12. 前記モノクローナル抗体が、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の抗体からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
13. 前記抗原結合フラグメントが、 Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ様フラグメントおよびＦａｂフラグメントからなる群から選択される抗原結合フラグメントを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
14. 前記モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントが、 ヒト、組み換えまたはキメラ抗体である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
15. 治療に使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
16. シヌクレイノパチー、またはパーキンソン病、特発性および遺伝性のパーキンソン病、ゴーシェ病（ＧＤ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、レビー小体変異型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、複合されたアルツハイマー病およびパーキンソン病、純粋自律神経不全症または多系統萎縮症を治療するのに使用するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
    
    

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