TWI729992B - 用於治療共核蛋白病的藥劑、用途及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及新穎的單株抗α-突觸核蛋白抗體。可以使用該等抗體治療共核蛋白病，例如帕金森氏病(包括帕金森氏病的特發性和遺傳性形式)、彌漫性雷維體病(DLBD)、阿耳茨海默病的雷維體變體(LBV)、組合型阿耳茨海默和帕金森氏病、純自主神經衰竭和多系統萎縮。

Description

用於治療共核蛋白病的藥劑、用途及方法
本發明涉及新穎種類的、特異性結合α-突觸核蛋白的單株抗體，還涉及將該等分子及其α-突觸核蛋白結合片段用於治療和診斷共核蛋白病之方法。
序列表的引用
本申請包括一個或多個序列表(依照37 C.F.R.1.821等等)，其係以電腦可讀介質形式揭露的(檔案名：0992_ST25.txt，創建於2016年6月22日，並且大小為44kB)，將該文件藉由引用以其全部內容結合在此。
共核蛋白病(synucleinopathy)，也稱為雷維體疾病((LBD)，其特徵在於用顯微鏡可見為雷維體(LB)和/或路易神經突(其中蛋白α-突觸核蛋白係主要組分)的細胞內蛋白聚集體的沈積(耶林格爾((Jellinger)，運動障礙(Mov Disord)2012年1月；27(1)：8-30；麥克凱斯(McKeith)等人，神經病學(Neurology)(1996)47：1113-24)。共核蛋白病包括帕金森氏病(PD)(包括帕金森氏病的特發性和遺傳性形式)和彌漫性雷維體(DLB)病(也稱為雷維體失智(DLB)，阿耳茨海默病的雷維體變異(LBV)，組合型阿耳茨海默和帕金森氏病(CAPD)，純自主神經衰竭(PAF)和多系統萎縮(MSA；例如橄欖體腦橋小腦萎縮，紋狀體黑質變性和希一 德二氏綜合症(Shy-Drager Syndrome)))。共核蛋白病經常具有多巴胺能黑質紋狀體系統的變性，造成帕金森病中的核心運動缺陷(僵硬、運動徐緩、靜止性震顫)，但是在與非運動功能障礙(例如癡呆和自主神經系統缺陷)關聯的中樞、外周和自主神經系統和腦區以及其他器官中還存在雷維體和營養不良路易神經突的廣泛出現。在帕金森氏病和其他共核蛋白病中，若干非運動體征和症狀被認為先於運動症狀。例如此類早期體征包括快速眼動期睡眠行為障礙(RBD)和嗅覺的喪失以及便秘(馬霍瓦爾德(Mahowald)等人，神經病學(Neurology)(2010)75：488-489)。在老年人群體中，共核蛋白病仍舊是運動障礙和認知惡化的普通原因(蓋拉斯科(Galasko)等人，神經病學檔案(Arch.Neurol.)(1994)51：888-95)。
α-突觸核蛋白係蛋白家族的成員，包括β-和γ-突觸核蛋白和突觸素(synoretin)。α-突觸核蛋白表現在與突觸關聯的正常狀態下，並且被認為在調節突觸泡釋放中起作用，並且由此影響神經通信、可塑性、學習和記憶。
若干研究已經暗示，在PD發病機理中，α-突觸核蛋白具有中心作用。在病理條件下，該蛋白可以聚集以形成細胞內不溶性原纖維。例如，突觸核蛋白在LB中累積(斯皮蘭蒂尼(Spillantini)等人，自然(Nature)(1997)388：839-40；武田(Takeda)等人，病理學雜誌(J.Pathol.)(1998)152：367-72；若林(Wakabayashi)等人，神經科學快報(Neurosci.Lett.)(1997)239：45-8)。在α-突觸核蛋白基因的突變以及該基因的二倍和三倍重複與帕金森病罕見的家族形式共分離(克魯格(Kruger)等人，自然遺傳學(Nature Gen.)(1998)18：106-8；波利摩羅普洛斯(Polymeropoulos)等人，科學(Science) (1997)276：2045-7)。一個重要的發現一直認為α-突觸核蛋白可分泌到細胞外液並且存在於血漿和腦脊液(CSF)中。若干研究，例如帕切科(Pacheco)等人(2015)和其他人的研究(帕切科(Pacheco)等人，神經化學雜誌(J Neurochem)，2015年3月，132(6)：731-4；康韋(Conway)，美國國家科學院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)(2000)97：571-576；Volles等人，生物化學雜誌(J.Biochem.)42：7871-7878，2003年)已經表明，細胞外突觸核蛋白在大腦中起著致病作用。他們已證明細胞外α-突觸核蛋白寡聚體擁有對腦神經元質膜的神經毒性。基於突觸核蛋白分泌數據的另一個有趣的假設係α-突觸核蛋白的朊病毒樣傳播構成帕金森氏病和其他共核蛋白病進展的基礎(李等人，2014，自然評論神經病學(Nat Rev Neurol)，2014年2月，10(2)：92-8；漢森(Hansen)和李(Li)2012，分子醫學發展趨勢(Trends Mol Med)，2012年5月；18(5)：248-55)。該等發現產生了可以藉由免疫療法靶向細胞外突觸核蛋白的期望(Vekiarellis等人，2011，柳葉刀神經學(Lancet Neurol)，2011年11月，10(11)：1015-25)。
天然存在的α-突觸核蛋白自身抗體已經顯示存在於PD患者和健康對照中(史密斯(Smith)等人，2012，公共科學圖書館期刊(PLoS One)，2012，7(12)：e52285；Maetzler等人，2014，公共科學圖書館期刊(PLoS One)，2014年2月21日，9(2)：e88604；Papachroni等人，2007，神經化學雜誌(J Neurochem)，2007年5月，101(3)：749-56；以及沃爾夫(Woulfe)等人，2002，神經病學(Neurology)，2002年5月14日，58(9)：1435-6)，已經報導了相比健康對照有時在PD患者中增加水平的α-突觸核蛋白自身抗體(格魯登(Gruden)等人，2011，神經免疫學雜誌(J Neuroimmunol)，2011年4 月，233(1-2)：221-7；格魯登(Gruden)等人，2012，神經免疫調節(Neuroimmunomodulation)，2012，19(6)：334-42；以及Yanamandra，2011，公共科學圖書館期刊(PLoS One)，2011年4月25日，6(4)：e18513)或在PD患者中降低的α-突觸核蛋白自身抗體(Besong-Agbo等人，2013，神經病學(Neurology)，2013年1月8日，80(2)：169-75)。在發現自身抗體後很早就表明了循環的抗α-突觸核蛋白自身抗體可作為關於α-突觸核蛋白聚集的保護作用的可能性(沃爾夫(Woulfe)等人，2002，神經病學(Neurology)，2002年5月14日，58(9)：1435-6)。
在轉基因小鼠中過量表現α-突觸核蛋白模擬雷維體疾病的一些致病方面。在過去數十年就已經產生了若干過量表現α-突觸核蛋白的不同轉基因系的小鼠(描述在綜述科勒(Koehler)等人，2014，公共科學圖書館期刊(PLoS One)，2013年5月31日，8(5)：e64649；弗萊明(Fleming)和Chesselet，2006，行為藥理學(Behav Pharmacol)，2006年9月，17(5-6)：383-91；斯普林格(Springer)和卡爾(Kahle)，2006，當前神經病學和神經科學報告(Curr Neurol Neurosci Rep)，2006年9月，6(5)：432-6)。具有Thy-1和PDGF-β啟動子的小鼠系發展了運動障礙和認知缺陷，並已被用於證明在體內針對α-突觸核蛋白的抗體的神經保護作用。然而，沒有轉基因系具有強的多巴胺能神經元變性，並且通常運動表型係由運動神經元內的表現驅動，該等運動神經元在帕金森氏病中通常不會變性。因此，潛在的疾病修飾改治療的積極成果是否藉由對多巴胺能神經元或其他中樞神經系統神經元的影響來介導尚不清楚。
一個在轉基因小鼠模型中的強大發現係人α-突觸核蛋白的 長期過量表現損害突觸功能。使用體外和體內兩個系統的研究顯示在海馬迴中野生型(wt)人α-突觸核蛋白的過量表現損害突觸傳導(納馬尼(Nemani)等人，2010，神經元(Neuron)，2010年1月14日，65(1)：66-79；波米耶(Paumier)等人，2013，公共科學圖書館期刊(PLoS One)，2013年8月1日，8(8)：e70274)。這已顯示在海馬迴的CA1區域中，在該區域中兩個研究都發現減少的基礎突觸傳導。這後面的機制假設為α-突觸核蛋白細胞內的積累導致功能障礙的突觸釋放。然而，最近關於α-突觸核蛋白分泌到突觸中的細胞外間隙和α-突觸核蛋白寡聚物對突觸功能的毒性作用的發現打開了細胞外α-突觸核蛋白在突觸功能障礙中發揮作用的可能性，並因此打開了治療抗體以援救缺陷的能力。
使用病毒載體來過量表現α-突觸核蛋白代表在齧齒動物中模擬PD的一種重要的方式，因為這一方法產生黑質紋狀體神經元的相對快速進步的變性，這係在小鼠或大鼠中藉由遺傳突變沒有被重現的特性(基裡克(Kirik)和比約克隆(Bjorklund)，2003，神經科學發展趨勢(Trends Neurosci)，2003年7月，26(7)：386-92)。此外，病毒基因遞送揭示了野生型α-突觸核蛋白誘導黑質紋狀體病理的能力(基裡克(Kirik)等人，2002，神經科學雜誌(J Neurosci)，2002年4月1日，22(7)：2780-91)，這一發現與具有α-突觸核蛋白二倍和三倍重複的以家族形式的PD的證據一致(李(Lee)和特羅揚諾夫斯基(Trojanowski)，2006，神經元(Neuron)，2006年10月5日，52(1)：33-8)。在一個研究中已經顯示針對α-突觸核蛋白N末端的山羊抗體池使帕金森氏病的基於AAV-α-突觸核蛋白的大鼠模型免受多巴胺能細胞死亡並減輕行為缺陷(Shahaduzzaman等人，2015，公共科學 圖書館期刊(PLoS One)，2015年2月6日，10(2)：e0116841)。
最近已經顯示α-突觸核蛋白病理的朊病毒樣傳播發展了α-突觸核蛋白病理並且也發展了多巴胺能細胞死亡(盧克(Luk)等人，2012，科學(Science)，2012年11月16日，338(6109)：949-53)。這一模型已經被用來顯示α-突觸核蛋白抗體可以減輕該病理(德蘭(Tran)等人，2014，細胞報告(Cell Rep)，2014年6月26日，7(6)：2054-65)。在這個模型中，抗體治療能夠減少磷酸化α-突觸核蛋白在若干腦區域(包括黑質中的多巴胺能神經元)積累並減少運動缺陷的發展。
除了突變，α-突觸核蛋白基因的可變剪接和該蛋白質的翻譯後修飾，例如磷酸化作用、泛素化、硝化、和截短可以產生α-突觸核蛋白的蛋白形式，該蛋白形式具有形成α-突觸核蛋白的聚集的和/或有毒的形式的增加的能力(拜爾(Beyer)和阿裡薩(Ariza)，分子神經生物學(Mol Neurobiol)，2013年4月，47(2)：509-24)。然而，α-突觸核蛋白的精確的病理學的種類仍然未知。已經將各種從寡聚體至原纖維範圍的錯誤折疊的/聚集的/分泌的種類和不同翻譯後修飾與毒性關聯，但哪一個最重要還沒有達成一致(是否真的甚至只有單一的毒性種類)。
整體上，具有相似的形態學和神經學改變的α-突觸核蛋白在人、小鼠、和蒼蠅等不同動物模型中的積累表明這種分子在雷維體疾病的發病機制中具有中心作用。
已經顯示若干不同的α-突觸核蛋白抗體在臨床前動物模型中具有治療效果。已經顯示靶向涉及α-突觸核蛋白殘基91-99的表位的抗體和靶向涉及α-突觸核蛋白殘基118-126的表位的抗體兩者都對轉基因小 鼠的運動和認知缺陷有影響(蓋姆斯(Games)等人，2014，神經科學雜誌(J Neurosci)，2014年7月9日，34(28)：9441-54)。該等抗體中最先進的是基於小鼠單株抗體9E4的人源化抗體，該人源化抗體靶向涉及α-突觸核蛋白殘基118-126的表位並且現在處於I期臨床試驗。靶向涉及α-突觸核蛋白殘基120-140的表位的C末端抗體274(巴(Bae)等人，2012，神經科學雜誌(J Neurosci)，2012年9月26日，32(39)：13454-69)也顯示在臨床前模型中對從細胞至細胞的病理傳播有影響。除了該等，靶向構象的種類例如α-突觸核蛋白的寡聚體和原纖維的抗體已經顯示可以至少減少該等推測有毒的α-突觸核蛋白種類的水平(林斯特龍(Lindström)等人，2014，疾病神經生物學(Neurobiol Dis)，2014年9月，69：134-43以及斯潘塞(Spencer)等人，2014，分子治療(Mol Ther)，2014年10月，22(10)：1753-67)。在體內降低α-突觸核蛋白寡聚體水平的該等構象抗體，例如mab47，也顯示靶向α-突觸核蛋白胺基酸121-125的C末端表位(US 20120308572)。其他構象的、原纖維和寡聚體特異性抗體也靶向C末端序列(Vaikath等人，疾病神經生物學(Neurobiol Dis)，2015，79：81-99)。
因為α-突觸核蛋白的毒性形式係未知的，理想地治療性抗體應當可以結合大多數藉由可變剪接或翻譯後修飾(例如截短)形成的α-突觸核蛋白種類以及寡聚體和原纖維形式的α-突觸核蛋白種類。如以上所討論，已經檢測到使用目前的抗體在臨床前模型中進行治療的一個問題係它們中的許多靶向C末端的表位，在α-突觸核蛋白的主要截短形式的一些中未發現該等C末端的表位。例如對於結合9E4係重要的胺基酸係天冬醯胺122和酪胺酸125(根據專利US 20140127131中陳述的丙胺酸掃描)，並 且這意味著這個抗體不能結合在胺基酸119和122處截短的α-突觸核蛋白，該等α-突觸核蛋白係帕金森腦組織中的一些主要截短的種類(凱利(Kellie)等人，科學報告(Sci Rep)，2014，4：5797)。抗體274和抗體mab47係相同的情況(US 8,632,776)。並且，胺基末端抗體可能不能結合缺乏α-突觸核蛋白的第一胺基酸的主要截短的種類中的一些，例如截短至胺基酸5-140的α-突觸核蛋白。對於9E4抗體，一個建議的作用機理係在細胞外間隙預防胺基酸119-122處的截短，因為抗體將結合到與蛋白酶切割α-突觸核蛋白相同的區域(蓋姆斯(Games)等人，2014，神經科學雜誌(J Neurosci)，2014年7月9日，34(28)：9441-54)。也可以在抗體的該位點的近鄰區域發現相似的作用機制，並且因此預期這個區域周圍的許多抗體將具有這個活性。
有一些證據支持截短的α-突觸核蛋白種類在動物模型中的毒性作用。已經顯示在酪胺酸羥化酶啟動子下表現截短的α-突觸核蛋白導致黑質紋狀體病理，這在轉基因的α-突觸核蛋白模型中不常見(Tofaris等人，2006，神經科學雜誌(J Neurosci)，2006年4月12日，26(15)：3942-50；若松(Wakamatsu)等人，2006，衰老神經生物學(Neurobiol Aging)，2008年4月，29(4)：574-85)。例如，具有A53T突變的人α-突觸核蛋白的胺基酸1-130的表現造成在黑質緻密部的多巴胺能神經元的胚胎性丟失，然而全長蛋白的表現沒有(若松(Wakamatsu)等人，2006，衰老神經生物學(Neurobiol Aging)，2008年4月，29(4)：574-85)。在鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶IIα(CaMKII-α)啟動子下表現120個胺基酸的α-突觸核蛋白分子與α-突觸核蛋白聚集和在包括巴尼斯(Barnes)迷宮和新物體識別的皮質-海馬迴記 憶測試中漸進的缺陷有關(哈爾(Hall)等人，2015，實驗神經病學(Exp Neurol)，2015年2月，264：8-13)。此外，在大鼠AAV模型中共表現C末端截短的α-突觸核蛋白增強全長α-突觸核蛋白誘導的病理(Ulusoy等人，2010，歐洲神經科學雜誌(Eur J Neurosci)，2010年8月，32(3)：409-22)。
在本發明中，已產生的抗體(如“GM37”和“GM285”，描述於實例中)可以結合到毒性α-突觸核蛋白片段1-119/122並使α-突觸核蛋白的這個截短形式無效。本發明的抗體(如GM37和GM285)能夠結合到α-突觸核蛋白的其他寡聚體形式並以減少疾病傳播的方式由其他CNS固有細胞改變其攝取。此外，本發明的抗體(如GM37和285)被令人驚訝地發現在結合至人腦不同的α-突觸核蛋白的種類方面要優於先前技術的抗體如9E4，並且在清除細胞外α-突觸核蛋白和使由異常α-突觸核蛋白在體內的存在誘導的受損突觸傳遞正常化方面具有令人驚訝的優異效果。為了進一步說明它們的治療能力，本發明的抗體(如GM37和285)能夠預防在帕金森氏病大鼠模型中與運動表現相關的疾病的出現。最後，抗體GM37和GM285能夠抑制藉由在初級小鼠神經元中細胞外加入的重組病理α-突觸核蛋白種子誘導的聚集體的播種和內源性α-突觸核蛋白的磷酸化作用。抗體如GM37和285也可抑制使用帕金森氏病小鼠模型在體內將α-突觸核蛋白病理播種至多巴胺能神經元，進一步支持該等抗體在預防細胞至細胞傳播的病理方面的治療能力。總之，該等數據強烈支持使用該等新穎的抗體(如GM37和GM285)作為新的治療藥劑，該等藥劑能夠藉由抑制帕金森疾病的病理在神經元帕金森氏病患者之間的傳播的機制來改變疾病。
在本發明的另外的方面提供了該GM37抗體的3個胺基酸變體。所有該等變體具有與親本抗體(GM37)相似的功能資料解析，但具有可製造性方面改善的特性。變體降低GM37抗體的結合結構域內發生的翻譯後修飾的風險，並提供生產該抗體方面的一些改進。這係有利的，因為抗體的大規模臨床或商業製造係複雜和昂貴的，並且特別是對於免疫球蛋白和蛋白質在製藥藥物方面提供同質的產品係關鍵。
本發明涉及新穎的單株抗體及其抗原結合片段，它們能夠特異性結合到α-突觸核蛋白的胺基酸112-117(SEQ ID NO：9(ILEDMP))。被本發明的抗體或其抗體結合片段(如示例性抗體“GM37”或“GM285”)結合的表位在本文中被稱為“112-117表位”。本發明的抗體特異性結至該112-117表位內，並且可以(根據一個實施方式)在結合於胺基酸112-117方面與抗體GM37或GM285競爭。例如，根據本發明抗體或其抗原結合片段可以競爭結合到人α-突觸核蛋白的112-117表位，該α-突觸核蛋白具有包含SEQ ID NO：7的可變域的重鏈和包含SEQ ID NO：8的可變域的輕鏈。這種競爭性結合抑制可以使用本技術領域熟知的試驗和方法來測定，例如使用未標記結合試驗如表面電漿共振(SPR)。例如，使人α-突觸核蛋白固定在表面上並在與待測的抗體或結合片段培養前使用或不使用參考抗體‘GM37’培養。可替代地，可以使用成對映射方法，其中參考抗體‘GM37’被固定到表面，人α-突觸核蛋白抗原結合於固定的抗體，並且然後測試第二抗體同時結合至人α-突觸核蛋白的能力(見‘BIAcore®測定手冊’，GE醫療集團生命科學部(GE Healthcare Life Sciences)，29-0194-00 AA 05/2012；將其揭露藉由引用結合在此)。
更具體地說，GM285抗體結合α-突觸核蛋白的殘基112-117內的表位，該表位包括α-突觸核蛋白的殘基112-115(ILED；SEQ ID NO：19)。
在一個實施方式中，本發明涉及單株抗體GM37，其變體(例如，GM37變體1、GM37變體2和GM37變體3)，或GM285。
特別地，本發明提供單株抗體GM37，其變體(例如，GM37變體1、GM37變體2和GM37變體3)，或GM285，並且包含具有足夠數量(例如1、2、或3)的輕鏈CDR和足夠數量(例如1、2、或3)的重鏈CDR以形成能夠特異性結合人突觸核蛋白的結合位點的這樣的抗體及其衍生物。較佳的是，如下面所定義，這樣的抗體將擁有三個輕鏈CDR和三個重鏈CDR。這個區域中胺基酸殘基的編號係根據IMGT®，國際免疫遺傳學資訊系統®(the international ImMunoGeneTics information system®)或卡巴特‧E.A.(Kabat，E.A.)、吳‧T.T.(Wu，T.T.)、佩里‧H.M.(Perry，H.M.)、Gottesmann K.S.和Foeller C.(1991)，免疫學目的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，NIH出版號91-3242，美國健康與人服務部(U.S.Department of Health and Human Services)；喬西亞‧C.(Chothia，C.)和萊斯克‧A.M.(Lesk，A.M.)(1987)，免疫球蛋白高變結構域的典型結構(Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins)，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)196，901-917。
在一個實施方式中，該單株抗體或其抗原結合片段具有突觸核蛋白抗原結合片段，該突觸核蛋白抗原結合片段包括以下項或由其組成： (a)具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的重鏈CDR1；和/或(b)具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的重鏈CDR2；和/或(c)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的重鏈CDR3；和/或(d)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的輕鏈CDR1；和/或(e)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的輕鏈CDR2；和/或(f)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的輕鏈CDR3；該突觸核蛋白抗原結合片段可以特異性結合至人α-突觸核蛋白。
在一個實施方式中，該單株抗體或其抗原結合片段擁有突觸核蛋白抗原結合片段，該突觸核蛋白抗原結合片段包括以下項或由其組成：(a)具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的重鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：33、34或35的胺基酸序列的重鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的重鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的輕鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的輕鏈CDR3；該突觸核蛋白抗原結合片段可以特異性結合至人α-突觸核蛋白。
在另一個實施方式中，該單株抗體或其抗原結合片段擁有突觸核蛋白抗原結合片段，該突觸核蛋白抗原結合片段包括以下項或由其組成：(a)具有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的重鏈CDR1；和/或(b)具有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈CDR2；和/或(c)具有SEQ ID NO：22的胺基酸序列的重鏈CDR3；和/或 (d)具有SEQ ID NO：23的胺基酸序列的輕鏈CDR1；和/或(e)具有SEQ ID NO：24的胺基酸序列的輕鏈CDR2；和/或(f)具有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的輕鏈CDR3。
該突觸核蛋白抗原結合片段可以特異性結合至人α-突觸核蛋白。
在一個實施方式中，該單株抗體或抗原結合片段擁有突觸核蛋白抗原結合片段，該突觸核蛋白抗原結合片段包括如下胺基酸序列(在其CDR、其可變域、其骨架殘基或在其恒定域中)，該胺基酸序列不同於自然存在的抗α-突觸核蛋白抗體，並且該胺基酸序列展示(相對於這樣的天然存在的抗α-突觸核蛋白抗體)：(i)對α-突觸核蛋白的親和力(KD)不同；(ii)抑制α-突觸核蛋白的蛋白酶截短的能力不同；(iii)在E28-snca轉基因小鼠中逆轉基礎突觸傳導的損傷的能力不同；(iv)如藉由體內微透析測量的降低小鼠海馬迴內α-突觸核蛋白水平的能力不同；和/或(v)當長期給予時，在帕金森氏病的大鼠模型中恢復運動功能的能力不同；(Vi)預防α-突觸核蛋白播種(例如在體外和/或在帕金森氏病小鼠模型中不可溶的磷酸化的α-突觸核蛋白的積累)的能力不同；和/或(Vii)在人腦中結合截短的α-突觸核蛋白的能力不同。
本發明的抗體及其抗原結合片段可以在對以下共核蛋白病進行治療、診斷或成像的方法中使用，例如帕金森氏病((PD)，包括帕金森氏病的特發性和遺傳性形式)、彌漫性雷維體病(DLBD)、阿耳茨海默病 的雷維體變體(LBV)、高歇氏病(GD)、組合型阿耳茨海默和帕金森氏病(CAPD)、純自主神經衰竭和多系統萎縮。
圖1顯示用於產生融合瘤的免疫方案。下表列出了用於鑒定GM37和GM285的免疫原和小鼠品系的差異。獨立地對不同HCo17-Balb/c和HCo12/Balb/c小鼠進行免疫(以下提供該等小鼠的描述)。從小鼠中鑒定了表現GM37的融合瘤，該等小鼠使用包含胺基酸1-140原纖維的全長α-突觸核蛋白進行免疫，並用全長α-突觸核蛋白(SEQ ID NO：10)的截短的α-突觸核蛋白片段1-60和1-119進行強化。表現抗體GM285的融合瘤來自一個免疫方案，其中HCo12-Balb/c小鼠使用全長單體α-突觸核蛋白胺基酸1-140進行免疫，接著用全長纖絲α-突觸核蛋白進行強化(實例1)。
圖2顯示針對結合α-突觸核蛋白、α-突觸核蛋白同系物和直向同源物的GM37的篩選。
A)使用基於無洗滌液的ELISA(FMAT)將抗體GM37結合至α-突觸核蛋白。
B)使用SPR(Fortebio公司)結合抗體GM37對於α-突觸核蛋白係特異性的(α圖)，並且不結合其他相關突觸核蛋白家族蛋白、β-突觸核蛋白(β小圖)和γ-突觸核蛋白(γ小圖)。使用SPR(Fortebio Octetred)進行測量，GM37對來自食蟹猴(食蟹猴小圖)和小鼠(小鼠小圖)的α-突觸核蛋白顯示相似的結合。(實例1)。
C)使用SPR(Fortebio Octetred)結合抗體GM285對於α-突觸核蛋白係特異性的，並且不結合其他相關突觸核蛋白家族蛋白、β-突觸核蛋白和 γ-突觸核蛋白。使用SPR(Fortebio Octetred)進行測量，GM285對來自食蟹猴(食蟹猴小圖)和小鼠(小鼠小圖)的α-突觸核蛋白顯示相似的結合(實例1)。
圖3(小圖A-C)顯示GM37的即時結合親和力
A)如藉由SPR(BIAcore®3000)所確定的，以隨時間(x軸)變化的RU(相對單位)(y軸)測定抗體GM37對α-突觸核蛋白的結合。山羊抗人IgG被固定在CM5晶片上。GM37被捕獲在山羊抗人IgG固定化的晶片上並且測試了人α-突觸核蛋白的濃度系列(3.125、6.25、12.5、25、50、100nM)對表面的結合。每個循環之間重新產生感測器表面。
B)將來自在不同濃度結合的信號轉換成結合曲線。
C)計算了抗體GM37的結合常數(表示為hlgG1-6004-037-C106S)(實例2)。
圖4(小圖A-C)顯示GM285的即時結合親和力
A)如藉由SPR(BIAcore®3000)所確定的，以隨時間(x軸)變化的RU(y軸)測定抗體GM285對α-突觸核蛋白的結合。山羊抗人IgG被固定在CM5晶片上。GM285被捕獲在山羊抗人IgG固定化的晶片上並且測試了人α-突觸核蛋白的濃度系列(3.125、6.25、12.5、25、50、100nM)對表面的結合。每個循環之間重新產生感測器表面。
B)將來自在不同濃度結合的信號轉換成結合曲線。
C)計算了抗體GM285的結合常數(表示為hlgG1-6004-285)(實例2)。
圖5(小圖A-C)顯示對比抗體9E4的即時結合親和力
A)如藉由SPR(BIAcore®3000)所確定的，顯示以隨時間(x軸)變 化的RU(y軸)測定的9E4對α-突觸核蛋白的結合。山羊抗人IgG被固定在CM5晶片上。9E4藉由結合至山羊抗人IgG被捕獲在晶片上，該山羊抗人IgG被固定在晶片上。測試了人α-突觸核蛋白的濃度系列(3.125、6.25、12.5、25、50、100nM)對表面的結合。每個循環之間重新產生感測器表面。
B)將來自在不同濃度結合的信號轉換成結合曲線。
C)計算了抗體9E4的結合常數。(實例2)。
圖6顯示了α-突觸核蛋白的胺基酸序列。人腦組織中的主要截短位點(箭頭所示)藉由質譜法鑒定(凱利‧JE(Kellie JF)、希格斯‧RE(Kellie JF)、瑞得‧JW(Ryder JW)、梅傑‧A(Major A)、比奇‧TG(Beach TG)、阿德勒‧CH(Adler CH)、麥錢特‧K(Merchant K)、Knierman MD，藉由質譜法定量測定來自事後對照和帕金森氏病腦組織的完好的α-突觸核蛋白的蛋白形式(Quantitative measurement of intact alpha-synuclein proteoforms from post-mortem control and Parkinson's disease brain tissue by mass spectrometry)，科學報告(Sci Rep)，2014年7月23日，4：5797，doi：10.1038/srep05797)。
圖7(小圖A-B)顯示抗體GM37和GM285的表點陣圖。ELISA數據顯示抗體結合至來自α-突觸核蛋白胺基酸序列95-132的連續的多肽(20聚體)的相對水平(其他非結合多肽未示出)。
A)GM37表位要求多肽序列ILEDMP(SEQ ID NO：9)以完全結合。
B)GM285要求多肽ILED(SEQ ID NO：19)以完全結合。(實例3)。
圖8(小圖A-B)顯示α-突觸核蛋白的截短形式的示意圖。
A)GM37/285(ILEDMP；SEQ ID NO：9)和9E4(NEAYE；SEQ ID NO：36) 的結合表位在α-突觸核蛋白胺基酸序列(SEQ ID No：10)上以粗體顯示。箭頭指示圖6中C末端截短位點。
B)已經從人腦材料中鑒定出α-突觸核蛋白的主要截短形式。在右側顯示出基於胺基酸數量的大小。全長α-突觸核蛋白係140個胺基酸。因為可以從表位扣除，GM37、其變體1-3、和GM285應當結合全長和1-119/122、1-135片段。抗體9E4將僅結合全長和1-135片段。截短後留下的更小的C末端片段的特異性性質未示出。
圖9顯示抗體GM37和GM285、免疫沈澱物、人腦的全長α-突觸核蛋白和截短的α-突觸核蛋白。將人DLB大腦的粗勻漿與測試抗體(珠粒(無抗體(No ab)、不結合α-突觸核蛋白的B12-人IgG1對照抗體、GM-37、GM37變體2、GM-285、和小鼠(m)9E4)培養，並且將免疫耗盡的上清液和免疫沈澱物質在SDS-PAGE上分離。西方墨點(western blot)顯示了從上清液被耗盡和與抗體一起被免疫沈澱(IP)的表示α-突觸核蛋白的全長和不同截短形式的條帶。如可以看到的，GM37、GM37v2和GM285抗體從上清液耗盡主要的α-突觸核蛋白種類，並且IP顯示了該等種類，截短的1-135、1-119/122種類和全長的α-突觸核蛋白。該9E4不影響1-119/122種類，但只有IP全長和1-135(實例4)。
圖10顯示在胺基酸119/122被鈣蛋白酶(calpain)裂解的α-突觸核蛋白原纖維的蛋白質水解示意圖。添加α-突觸核蛋白原纖維(PFF)到具有(PFF+)或沒有(PFF)測試抗體的培養物。GM-37/285的存在抑制細胞中截短的α-突觸核蛋白的形成和分泌到細胞培養基。
圖11A顯示在培養基和使用PFF處理過的初級小鼠皮質培 養物的細胞裂解物兩者中GM37抑制截短的條帶(12KD)形成。蛋白藉由SDS-PAGE和蛋白質西方墨點分離以檢測α-突觸核蛋白的不同種類。在只有PFF或對照抗體(B12)處理的細胞中在12kDa和14kDa檢測到兩個單體α-突觸核蛋白的條帶，分別代表截短的和全長的α-突觸核蛋白。在GM-37存在下12Kd只有微弱的條帶，表明大部分裂解被阻止。這種影響也反映在細胞的培養基中。積累的相對水平也可以藉由GM-37的存在被抑制，如反映在14Kd條帶的相對強度的降低。可替代地，可用於細胞攝取的14Kd條帶的量能被減少。(實例5)。
圖11B顯示了由抗體GM37、GM37變體2和GM285進行的α-突觸核蛋白原纖維蛋白質水解的劑量依賴性抑制。在低抗體濃度(0,1ug/ml)下，在初級小鼠皮層培養物的細胞裂解物中有一個代表全長α-突觸核蛋白的條帶和一個代表C末端截短的α-突觸核蛋白的條帶(由箭頭表示)。增加抗體濃度至1ug/ml、5ug/ml和10ug/ml導致細胞中α-突觸核蛋白原纖維的蛋白質水解減少。使用抗體GM37、GM37v2和GM285都有觀察到這一現象。使用不能識別α-突觸核蛋白的人IgG1抗體B12處理對照樣品。也有不添加抗體(無抗體(No ab))的對照，和未添加α-突觸核蛋白原纖維(無α-突觸核蛋白(No Asyn))的細胞。相比B12或“無抗體”對照，使用37、37v2和285處理的樣品中α-突觸核蛋白的總量也被減少，表明所有三種抗體以濃度依賴性的方式減少細胞中α-突觸核蛋白的累積。在凝膠頂部的肌動蛋白(actin)條帶顯示等量的樣品載入(實例5)。
圖12顯示GM37和GM285對α-突觸核蛋白聚集和α-突觸核蛋白磷酸化在小鼠初級皮質神經元的播種的影響。
12A)當使用1ng α-突觸核蛋白的純種子或粗種子播種細胞時，沾有磷酸化α-突觸核蛋白的初級神經元(在細胞中以斑點或點狀著色出現)的圖像的實例。
12B)初級皮層神經元蛋白質的西方墨點分離為可溶性和不溶性部分。該墨點使用人α-突觸核蛋白特異性抗體(4B12/H a-syn)，磷酸絲胺酸-129-α-突觸核蛋白特異性抗體(ab51253/pS-a-Syn)和小鼠α-突觸核蛋白特異性抗體(D37A2/M a-syn)著色，並且該墨點顯示，在初級神經元中添加粗種子導致在不溶性部分中內源性小鼠α-突觸核蛋白和磷酸化α-突觸核蛋白的積累和α-突觸核蛋白的較高分子量多聚體的積累。
12C GM37、GM37變體2和GM285抑制磷酸化α-突觸核蛋白的出現，該磷酸化α-突觸核蛋白的數量藉由Cellomics ARRAYSCANTM自動顯微鏡測量為細胞中α-突觸核蛋白磷酸絲胺酸129陽性斑點的數量。GM37、GM37v2和GM285在細胞中以劑量依賴性方式減少磷酸化α-突觸核蛋白斑點的量。
12D以抗體最高劑量(133nM)處理，並沾有肌動蛋白、人α-突觸核蛋白、磷酸化α-突觸核蛋白和小鼠α-突觸核蛋白的初級皮質神經元勻漿的蛋白質墨點顯示，抗體37、37v2和285抑制在不溶性部分被細胞攝取的α-突觸核蛋白粗種子的截短。所有抗體也抑制磷酸化、內源性小鼠和較高分子量多聚體的磷酸化小鼠α-突觸核蛋白在不溶性部分中的積累。在凝膠頂部的肌動蛋白條帶顯示等量的樣品載入(實例6)。
圖13顯示在F28-snca轉基因的和年齡匹配的對照小鼠的海馬迴內的謝弗側枝(Schaffer collateral)CA1區突觸的基礎突觸傳遞。場興奮性突觸後電位(fEPSP)被應用到謝弗側枝的單一刺激誘發，並且基礎突 觸傳遞藉由測量隨著刺激強度而變化的fEPSP斜率進行評估。短期突觸可塑性係藉由誘導雙脈衝易化來評估。不同刺激強度為0、25、50、75、100、150、200、300、400、和500μA，並且以增加的順序依次施加，每個強度重複2至3次。相比年齡匹配的對照小鼠，基礎突觸傳遞在過量表現的野生型α-突觸核蛋白的F28-snca轉基因小鼠中發現被顯著損害(實例7)。
圖14顯示單一劑量人9E4(15mg/kg，腹膜內)的全身給藥對F28-snca轉基因小鼠的海馬迴內謝弗側枝CA1區突觸的基礎突觸傳遞損害的影響。場興奮性突觸後電位(fEPSP)被應用到謝弗側枝的單一刺激誘發，並且基礎突觸傳遞藉由測量隨著刺激強度而變化的fEPSP斜率進行評估。使用h9E4急性治療在F28-snca轉基因小鼠內誘導基礎突觸傳遞損害的顯著逆轉(Tg-snca+h9E4對比Tg-snca+PBS，p=0.002)。然而，藉由h9E4的逆轉只是局部的，如相比使用PBS處理的同窩仔畜顯著降低的基礎突觸傳遞指示的(p=0.007)(實例7)。
圖15顯示單一劑量人GM37(15mg/kg，腹膜內)或同種型對照抗體(B12)的全身給藥對F28-snca轉基因小鼠的海馬迴內謝弗側枝CA1區突觸的基礎突觸傳遞損害的影響。場興奮性突觸後電位(fEPSP)被應用到謝弗側枝的單一刺激誘發，並且基礎突觸傳遞藉由測量隨著刺激強度而變化的fEPSP斜率進行評估。使用GM37急性治療在F28-snca轉基因小鼠內誘導基礎突觸傳遞損害的完全逆轉(Tg-snca+GM37對比Tg-snca+B12，p=0.004)(實例7)。
圖16顯示單一劑量人GM285(15mg/kg，腹膜內)的全身給藥對F28-snca轉基因小鼠的海馬迴內謝弗側枝CA1區突觸的基礎突觸傳 遞損害的影響。場興奮性突觸後電位(fEPSP)被應用到謝弗側枝的單一刺激誘發，並且基礎突觸傳遞藉由測量隨著刺激強度而變化的fEPSP斜率進行評估。使用GM285急性治療誘導在F28-snca轉基因小鼠內基礎突觸傳遞損害的完全逆轉(Tg-snca+GM285對比Tg-snca+PBS，p=0.001)(實例7)。
圖17(圖A-B)顯示人9E4、GM37或同種型對照抗體(抗HEL)的全身給藥(15mg/kg，腹膜內)對自由移動的F28-snca轉基因小鼠的海馬迴內間質液(isf)內人α-突觸核蛋白的水平的影響。將每一個動物抗體治療之前2-3個基礎值(4h-6h)的平均值當作基線並設為100%。採用雙因素方差分析(ANOVA)與重複測量來分析差異。在海馬迴中人α-突觸核蛋白的基礎水平為8.1±1.1ng/ml(平均值±SEM，n=25，未對體外透析探針恢復進行修正)。相比兩個對比抗體(人9E4和對照同種型)，GM37的給予誘導了F28小鼠海馬迴內人α-突觸核蛋白較大減少，顯示使用GM37或對照抗體處理的動物之間的α-突觸核蛋白的水平顯著差異的抗HEL時間點由星號表示。(實例8)。
圖18顯示了抗體治療時間表的示意圖(向下箭頭)，在大鼠AAV人α-突觸核蛋白模型中的病毒注射和行為評估在圖19中示出(實例9)。
圖19顯示在大鼠AAV模型中抗體GM37在長期治療後可以減少帕金森病運動缺陷。在AAV-人α-突觸核蛋白大鼠中使用GM37或PBS長期治療對運動不對稱的影響在圓柱體試驗(cylinder test)中進行評估。藉由監測5分鐘來測試每只大鼠對前爪的使用。計算每只動物使用右前爪(注射同側)和使用左前爪(右前爪對側+)的百分比(如在y軸所示)，相比 GFP-PBS大鼠，*p<0.05和**p<0.01。使用PBS處理的大鼠仍然有爪子使用顯著不對稱，而使用抗體GM37處理的動物不再有顯著缺陷。(實例9)。
圖20A-20C顯示使用抗體GM37長期治療可以減少將病理α-突觸核蛋白纖絲種子注入到小鼠紋狀體誘導的病理α-突觸核蛋白磷酸化。圖20A顯示了表明關於種子注射和細胞計數的相對於處理時間的示意圖。在將重組α-突觸核蛋白纖絲種子注射入小鼠背側紋狀體一天前給予抗體GM37，然後每週一次持續六個星期。給藥方案係靜脈注射15mg/kg或腹膜內注射30mg/kg。圖20B顯示了根據注射部位和劑量，GM37在血漿中的暴露水平。注射新抗體劑量前取每週的樣品。圖20C顯示了在研究結束時根據劑量和注射部位GM37在腦脊液中的暴露水平。圖20D比較細胞的數量與使用GM37或PBS對照處理後在黑質中每個第六部分計入的磷酸化α-突觸核蛋白陽性包含物。使用靜脈注射15mg/kg GM37和腹膜內注射30mg/kg GM37處理的小鼠相比PBS處理的小鼠在細胞中具有顯著減少的磷酸化α-突觸核蛋白包含物(實例10)。
圖21顯示了人α(SEQ ID NO：10)、β(SEQ ID NO：37)和γ(SEQ ID NO：38)突觸核蛋白蛋白質的比對。突出了與α-突觸核蛋白不同的胺基酸殘基。缺口由點表示。括弧內是SwissProt號。
圖22顯示了α-突觸核蛋白直向同源物的比對(食蟹猴，SEQ ID NO：39；大鼠，SEQ ID NO：40；小鼠，SEQ ID NO：41)。突出了與人α-突觸核蛋白(SEQ ID NO：10)不同的胺基酸殘基。括弧內顯示的是SwissProt號。
圖23顯示GM37(名為GM37野生型(wt))和3個GM37 變體(名為GM37變體1、2和3)的暫態表現。星號表示後蛋白A的純化和中和確定的數據。†表示從產量達到的後蛋白A和涉及表現培養物比例(0.4L)的中和計算的數據。
圖24顯示了競爭性ELISA測量四種抗體GM37 wt、GM37變體1、GM37變體2和GM37變體3結合至人α-突觸核蛋白。塗有α-突觸核蛋白的板被用於檢測在每種抗體(0.3μg/ml)的溶液中與濃度增加的α-突觸核蛋白(0-1000nM)預培養後剩餘的抗體量。所有四種抗體顯示對α-突觸核蛋白相似的結合。
圖25顯示了一個表，該表比較GM37wt及其變體1-3與固定的重組人α-突觸核蛋白的結合率動力學參數。使用SPR測量該結合，並使用1：1結合演算法(BIAcore®T200)確定結合比率。
圖26比較α-突觸核蛋白抗體對使用病理α-突觸核蛋白纖絲種子處理的小鼠初級神經元內磷酸化α-突觸核蛋白水平的影響。在GM37、GM37變體1、GM37變體2和GM37變體3(2μg)四者存在或不存在時使用種子(10ng)處理初級神經元。3週後神經元被固定和著色，並且藉由Cellomics ARRAYSCANTM分析α-突觸核蛋白磷酸化絲胺酸120陽性斑點。使用單獨的種子或種子加同種型對照抗體(B12)處理的細胞顯示顯著上升水平的磷酸化。使用GM37wt和3個變體處理的細胞能夠抑制α-突觸核蛋白的磷酸化，它們都與沒有接受種子的細胞顯示相同水平的磷酸化。數據顯示為平均值±SD，如同在5個孔中從每孔7張圖像來確定。N=2。
圖27比較了GM37wt、變體1、變體2和變體3的溫度依賴性聚集。各抗體的樣品經受隨時間穩定增加的溫度，並且同時藉由多角度 光散射法測定聚集水平(普羅米修士NT.48(Prometheus NT.48)，NanoTemper技術公司)。開始聚集的溫度對於GM37和GM37變體是相似的，然而GM37-變體2觀察到最低水平的聚合。
定義
本文所用的術語“α-突觸核蛋白”與“α-突觸核蛋白蛋白質”同義，並且是指任何α-突觸核蛋白蛋白質亞型(例如在UniProt中鑒定為P37840，1-3)。關於如下顯示的SEQ ID NO：10，給予α-突觸核蛋白的胺基酸編號，其中蛋胺酸(M)係胺基酸殘基1：SEQ ID NO：10：
Figure 105121902-A0202-12-0024-1
本發明涉及抗體和能夠特異性地結合至α-突觸核蛋白(並尤其結合至人α-突觸核蛋白)的抗體片段。特別地，抗體及其片段展現出特異性地結合至人α-突觸核蛋白的112-117表位的能力。
本發明上下文中的術語“抗體(Ab)”係指免疫球蛋白分子，或根據本發明的一些實施方式係指能夠特異性地結合至分子(“抗原”)的表位的免疫球蛋白分子的片段。天然存在的抗體典型地包含四聚體，該四聚體通常由至少兩條重(H)鏈和至少兩條輕(L)鏈構成。每條重鏈由重鏈可變域(在此縮寫為VH)和重鏈恒定域構成，重鏈恒定域通常由3個結構域(CH1、CH2和CH3)構成。重鏈可以具有任何同種型，包括 IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞型)、IgA(IgA1和IgA2亞型)、IgM以及IgE。每條輕鏈由輕鏈可變域(在此縮寫為VL)和輕鏈恒定域(CL)構成。輕鏈包括κ鏈和λ鏈。重鏈和輕鏈可變域典型地負責抗原識別，而重鏈和輕鏈恒定域可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q))的結合。VH和VL區可以進一步細分成稱作“互補性決定區”的超變區，它們中間穿插著更保守的稱為“構架區”(FR)的區域。每個VH和VL由三個CDR域和四個FR域構成，按以下順序從胺基末端排到羧基末端：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重鏈和輕鏈可變域含有與抗原相互作用的結合域。特別相關的是已經“被分離”以便存在於與它可以在自然界中存在的不同於物理環境中的或者已經被修飾以便在胺基酸序列上不同於天然存在的抗體的抗體及其抗原結合片段。
術語“表位”意指能夠特異性結合抗體的抗原決定簇。表位通常由如胺基酸或糖側鏈分子的表面基團組成，並且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。構象表位和線性表位的區別在於，在變性溶劑的存在下常常喪失與前者而非後者的結合。表位可以包含直接牽涉在結合中的胺基酸殘基以及其他沒有直接牽涉在結合中的胺基酸殘基，如被特異性抗原結合肽有效阻斷的胺基酸殘基(換言之，胺基酸殘基在特異性抗原結合肽的影響範圍之內)。術語“112-117表位”係指含有112-117人α-突觸核蛋白的6個胺基酸殘基中的至少4個的人α-突觸核蛋白的一個區域，該表位不包括人α-突觸核蛋白的1-111的任何殘基(包括106-111中的任何殘基)，也不包括人α-突觸核蛋白的118-140(包括殘基118-120)的任 何殘基。如本文所使用的，抗體據說能夠免疫特異性地結合至“112-117表位”，如果它能夠藉由結合到112-117表位的6個胺基酸殘基中的至少4個來免疫特異性地結合至人α-突觸核蛋白。
如在此使用的，術語“抗體的抗原結合片段”意指能夠與表位特異性結合的抗體的片段、部分、區域或結構域(無論它係如何產生的(例如，經由切割、重組、合成等))，並且因此術語“抗原結合”旨在意指與“表位結合”是相同的，這樣使得例如，“抗體的抗原結合片段”旨在是與“抗體的表位結合片段”係相同的。抗原結合片段可以含有這樣的抗體的1、2、3、4、5或所有6個CDR域，並且儘管能夠特異性結合到這樣的表位，仍可以展現出對不同於這樣的抗體的表位的這樣的表位的特異性、親和力或選擇性。然而，較佳的是，抗原結合片段含有這樣的抗體的所有6個CDR域。抗體的抗原結合片段可以是單條多肽鏈(例如，scFv)的一部分或包含單條多肽鏈，或者可以是兩條或更多條多肽鏈(各自具有胺基末端和羧基末端)(例如，雙抗體、Fab片段、Fab2片段等)的一部分或包含兩條或更多條多肽鏈。可以例如藉由完整抗體的蛋白酶切割來獲得展現出抗原結合能力的抗體片段。更較佳的是，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨基因或編碼這樣的基因序列的多核苷酸(例如，其編碼cDNA)天然地編碼，但是可以將這兩個結構域使用重組方法藉由柔性接頭連接，該柔性接頭使得這兩個結構域能夠成為單條蛋白鏈，在該單條蛋白鏈中VL區和VH區締合以形成單價抗原結合分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，伯德(Bird)等人，(1988)科學(Science)242：423-426；和休斯頓(Huston)等人，(1988)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)) 85：5879-5883)。可替代地，藉由採用太短(例如，小於約9個殘基)的柔性接頭以使得單條多肽鏈的VL區和VH區締合在一起，可以形成雙特異性抗體、雙抗體或類似分子(其中兩條這樣的多肽鏈締合在一起以形成二價抗原結合分子)(關於雙抗體的描述，參見例如PNAS USA90(14)，6444-8(1993))。本發明所包括的抗原結合片段的實例包括(i)Fab'或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域組成的單價片段，或如描述於WO 2007059782中的單價抗體；(ii)F(ab')2片段，包含兩個由二硫鍵在鉸鏈結構域連接的Fab片段的二價片段；(iii)基本上由VH域和CH1域組成的Fd片段；(iv)基本上由VL域和VH域組成的Fv片段；(v)dAb片段(沃德(Ward)等人，自然(Nature)341，544-546(1989))，其基本上有VH域組成並且也稱為結構域抗體(奧爾特(Holt)等人，生物技術趨勢(Trends Biotechnol.)2003年11月；2i(ll)：484-90)；(vi)駱駝或奈米抗體(雷維特斯(Revets)等人，生物療法的專家意見(Expert Opin Biol Ther.)2005年1月；5_(l)：1 ll-24)以及(vii)分離的互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由分離基因編碼，但是可以使用重組方法藉由合成接頭將它們連接，該合成接頭使得它們能夠成為單條蛋白鏈，在該單條蛋白鏈中VL區和VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)；參見例如，伯德(Bird)等人，科學(Science)242，423-426(1988)和休斯頓(Huston)等人，PNAS USA 85，5879-5883(1988))。在此進一步討論在本發明的背景下的該等和其他有用抗體片段。還應理解的是，除非另外指明，否則術語抗體還包括抗體樣多肽，如藉由任何已知技術(如酶促切割、肽合成和重組技術)提供的嵌合抗體和人源化抗體以及保留與抗原特異性結合能力的抗體片段 (抗原結合片段)。這樣產生的抗體可以具有任何同種型。如在此使用的，“同種型”係指由重鏈恒定域基因編碼的免疫球蛋白類別(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。使用熟習該項技術者已知的常規技術獲得這類抗體片段；可以按與完整抗體相同的方式針對實用性容易地對能夠與希望的表位結合的適合片段進行篩選。
術語“雙特異性抗體”係指含有各自靶向獨立靶標的兩個獨立抗原結合片段的抗體。該等靶標可以是存在於不同蛋白質上的表位或存在於相同靶標上的不同表位。可以使用親本單特異性二價抗體分子的HC的恒定域中的補償胺基酸變化製備雙特異性抗體分子。所得異源二聚體抗體含有一個由兩個不同親本單特異性抗體貢獻的Fab。Fc域中的胺基酸變化導致具有隨時間穩定的雙特異性的異源二聚體抗體的穩定性增加。(裡奇韋(Ridgway)等人，蛋白質工程(Protein Engineering)9，617-621(1996)；古納塞克蘭(Gunasekaran)等人，JBC 285，19637-1(2010)；莫耳(Moore)等人，MAbs 3：6 546-557(2011)；施特羅普(Strop)等人，JMB 420，204-219(2012)；梅茨(Metz)等人，蛋白質工程25：10571-580(2012)；拉布賴恩(Labrijn)等人，PNAS 110：113，5145-5150(2013)；斯普雷特馮克魯德恩斯坦(Spreter Von Kreudenstein)等人，MAbs 5：5 646-654(2013))。雙特異性抗體還可以包括使用ScFv融合物產生的分子。然後將兩個單特異性scfv獨立地連接至能夠形成穩定異源二聚體的Fc域，以產生單個雙特異性分子(馬布裡(Mabry)等人，PEDS 23：3 115-127(2010))。雙特異性分子具有雙重結合能力。例如，出於輸送治療性抗體穿過血腦障壁以治療CNS疾病的目的，同時定位治療靶標和轉胞表面受體。
術語GM37、GM-37、GM37野生型(wt)、mab37和6004-37在本文中可互換使用，並且都指相同的抗體。
術語抗體GM37旨在包括抗體或其抗原結合片段，它們包含或由如在SEQ ID No：1-3中給出的重鏈CDR1-3和如在SEQ ID No：4-6中給出的輕鏈CDR1-3組成。在一個實施方式中，抗體GM37或其抗原結合片段可以包含或由SEQ ID NO：7的重鏈可變域和/或SEQ ID NO：8的輕鏈可變域組成。例如，該抗體GM37可以是IgG抗體，該IgG抗體包括由SEQ ID NO：7的可變域和SEQ ID NO：18的恒定域一起組成的重鏈以及由SEQ ID NO：8的可變域和SEQ ID NO：17的κ恒定域組成的輕鏈。
蛋白質(在此情況下抗體)的脫胺基作用可以在製造和儲存過程中自發發生，而且還可以在體內自發發生，並使得最終的製藥藥物的質量難以控制。在一些情況下脫胺基作用也會影響該分子的活性。脫胺基作用發生在天冬醯胺殘基，但相關的天冬醯胺的位置可能難以肯定地預測，但在一些情況下也可以被天冬醯胺-甘胺酸基序影響。在GM37抗體中發現若干可能的脫胺基基序，但是，脫胺基的一個可能位點被發現是在重鏈的殘基54處。天冬醯胺被另一個胺基酸後續取代不是直接的，但是GM37的3個變體(GM37變體(var)1、2和3)被發現保留了原始GM37(GM37野生型(wt))的活性。
術語GM37變體係指脫胺基的變體1、2或3，其中，相比本文上述的GM37抗體，變體1具有N54S替換，變體2具有N54Q替換和變體3具有N54H替換。
因而抗體GM37變體(var)1、2和3旨在包括抗體或其抗 原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含或由GM37的SEQ ID No：1和3中給出的重鏈CDR1和3以及由GM37的SEQ ID No：4-6中給出的輕鏈CDR1-3組成，但是它們的重鏈CDR2不同以至於變體1具有SEQ ID NO：33的CDR2，變體2具有SEQ ID NO：34的CDR2並且變體3具有SEQ ID NO：35的CDR2。
在一個實施方式中，抗體GM37變體或其抗原結合片段可以包含或由SEQ ID NO：30、31和32(分別對於變體1、2和3)的重鏈可變域和/或SEQ ID NO：8的輕鏈可變域組成。該抗體GM37可以是IgG抗體，該IgG抗體包括由SEQ ID NO：30、31或32的可變域和SEQ ID NO：18的恒定域一起組成的重鏈以及由SEQ ID NO：8的可變域和SEQ ID NO：17的κ恒定域組成的輕鏈。
術語GM285、GM-285、mab285和6004-285在本文中可互換使用，並且都指相同的抗體。
術語抗體GM285旨在包括抗體或其抗原結合片段，它們包含或由如在SEQ ID No：20-22中給出的重鏈CDR1-3和如在SEQ ID No：23-25中給出的輕鏈CDR1-3組成。在一個實施方式中，抗體GM37或其抗原結合片段可以包含或由SEQ ID NO：26的重鏈可變域和/或SEQ ID NO：27的輕鏈可變域組成。例如，該抗體GM37可以是IgG抗體，該IgG抗體包括由SEQ ID NO：26的可變域和SEQ ID NO：28的恒定域一起組成的重鏈以及由SEQ ID NO：27的可變域和SEQ ID NO：29的κ恒定域組成的輕鏈。
GM285抗體特異性地結合人α-突觸核蛋白(SEQ ID NO：10)的序列112-115(ILED；SEQ ID NO：19)。
除非本文另行說明，這個區域中胺基酸殘基的編號係根據IMGT®，國際免疫遺傳學資訊系統®(the international ImMunoGeneTics information system®)或卡巴特‧E.A.(Kabat，E.A.)、吳‧T.T.(Wu，T.T.)、佩里‧H.M.(Perry，H.M.)、Gottesmann K.S.和Foeller C.(1991)，免疫學目的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，NIH出版號91-3242，美國健康與人服務部(U.S.Department of Health and Human Services)；喬西亞‧C.(Chothia，C.)和萊斯克‧A.M.(Lesk，A.M.)(1987)，免疫球蛋白的高變結構域的典型結構(Canonical structures for the hypervariable domains of immunoglobulins)，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)196，901-917)。
如本文上面所定義的，“抗α-突觸核蛋白抗體”或“α-突觸核蛋白抗體”(在本文中可互換使用，這取決於其中書面的上下文)係特異性地結合至α-突觸核蛋白或α-突觸核蛋白片段，特別是對應於SEQ ID No 9和/或19的α-突觸核蛋白序列的抗體或其抗原結合片段。
如在此使用的，術語“人抗體”(其可以縮寫為“humAb”或“HuMab”)旨在包括具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變域和恒定域的抗體。本發明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，在體外藉由隨機或位點特異性誘變或在基因重排期間或在體內藉由體細胞突變引入的突變)。
如在此使用的術語“單株抗體”或“單株抗體組成物”係指單分子組成物的抗體分子製劑。常規的單株抗體組成物表現出對特定表位的單一結合特異性和親和力。在某些實施方式中，單株抗體可以由多於一種Fab域構成，由此增加對多於一種靶標的特異性。術語“單株抗體” 或“單株抗體組成物”並不旨在受限於任何具體產生方法(例如，重組的、轉基因的、融合瘤等)。
術語“人源化的”係指通常使用重組技術製備的具有衍生自來自非人物種的免疫球蛋白的抗原結合位點和基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的剩餘免疫球蛋白結構的分子。抗原結合位點可以包含融合至人恒定域的完全非人抗體可變域或僅包含接枝到人可變域的適當人構架區的此類可變域的互補決定區(CDR)。此類人源化分子的構架殘基可以是野生型的(例如，全人的)或者它們可以被修飾成包含一種或多種未在其序列已經充當人源化的基礎的人抗體中發現的胺基酸取代。人源化減小或消除該分子的恒定域充當人個體中的免疫原的可能性，但是仍存在對外源可變域做出免疫應答的可能性(洛布格利奧，A.F.(LoBuglio,A.F.)等人(1989)“人體內的小鼠/人嵌合單株抗體：動力學與免疫應答(Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man：Kinetics And Immune Response)”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))86：4220-4224)。另一種方法不僅集中於提供人衍生的恒定域，還集中於修飾可變域以便將它們改造地盡可能接近人形式。已知的是，重鏈和輕鏈兩者的可變域都含有三個互補決定區(CDR)，它們響應於所討論的抗原而改變並且決定結合能力，其側翼為四個構架區(FR)，該等構架區在給定物種中是相對保守的並且推定為CDR提供支架。當相對於特定抗原製備非人抗體時，可以藉由在有待修飾的人抗體中存在的FR上接枝衍生自非人抗體的CDR來“改造”或“人源化”可變域。已經由薩托，K.(Sato,K.)等人(1993)癌症研究(Cancer Res)53：851-856；萊克曼妮，L.(Riechmann,L.)等人(1988)“改造治療 用的人抗體(Reshaping Human Antibodies for Therapy)”，自然(Nature)332：323-327；費爾霍恩，M.(Verhoeyen,M.)等人(1988)“改造人抗體：接枝抗溶菌酶活性(Reshaping Human Antibodies：Grafting An Antilysozyme Actvity)”，科學(Science)239：1534-1536；凱特伯勒，C.A.(Kettleborough,C.A.)等人(1991)“藉由CDR-接枝人源化小鼠單株抗體：構架殘基在環構象中的重要性(Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafttng：The Importance Of Framework Residues On Loop C'onformation)”，蛋白質工程(Protein Engineering)4：773-3783；馬艾達，H.(Maeda,H.)等人(1991)“具有HIV中和活性的經改造的人抗體的構建(Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity)”，人抗體融合瘤(Human Antibodies Hybridoma)2：124-134；戈爾曼，S.D.(Gorman,S.D.)等人(1991)“改造治療用CD4抗體(Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody)”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))88：4181-4185；坦皮斯特，P.R.(Tempest,P.R.)等人(1991)“改造人單株抗體以抑制體內人呼吸道合胞病毒感染(Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo)”，生物/技術(Bio/Technology)9：266-271；科，M.S.(Co,M.S.)等人(1991)“抗病毒治療用的人源化抗體(Humanized Antibodies For Antiviral Therapy)”，美國國家科學院院刊88：2869-2873；卡特，P.(Carter,P.)等人(1992)“人癌症治療用的抗p185her2抗體的人源化(Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy)”，美國國家科學院院刊89：4285-4289；以及科，M.S.等人(1992)“對CD33抗原具有特異性的嵌 合和人源化抗體(Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen)”，(J.Immunol.)148：1149-1154報導了這種方法在各種抗體中的應用。在一些實施方式中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，含有來自小鼠抗體的所有六個CDR的人源化小鼠抗體)。在其他實施方式中，人源化抗體具有一個或多個CDR(一個、兩個、三個、四個、五個、六個)，它們相對於原始抗體是改變的，它們還被稱為一個或多個“衍生自”來自原始抗體的一個或多個CDR的CDR。人源化抗原的能力係眾所周知的(參見例如，美國專利號5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,407,213；6,881,557)。
如在此使用的，抗體或其抗原結合片段被說成“特異性地”結合另一分子的區域(即，表位)，如果它相對於替代表位與該表位更加頻繁地、更加快速地、以更長的持續時間和/或以更大的親和力或親合力反應或締合的話。在一個實施方式中，本發明的抗體或其抗原結合片段比另一個分子至少10倍更強烈地結合到其靶標(人α突觸核蛋白)；較佳的是強至少50倍並且更較佳的是強至少100倍。較佳的是，抗體或其抗原結合片段在生理條件下(例如，在體內)結合。因此，能夠“特異性結合”至人α-突觸核蛋白的殘基112-117(ILEDMP(SEQ ID No：9))的抗體包含能夠以這種特異性和/或在這樣的條件下結合於人α-突觸核蛋白的殘基112-117的抗體或其抗原結合片段。適合於確定這樣的結合的方法係熟習該項技術者已知的，並且示例性方法描述在所附實例中。如在此使用的，在抗體與預定抗原結合的背景下，術語“結合”典型地是指以對應於約10-7M或更小(如約10-8M或更小、如約10-9M或更小)的KD的親和力結合，當用抗原 作為配位基並且抗體作為分析物在BIAcore® 3000或T200儀器中藉由例如表面電漿共振(SPR)技術確定時，並且以對應於以下KD的親和力結合到預定抗原，該KD比該抗體對與除預定抗原或緊密相關抗原之外的非特異性抗原(例如，BSA、酪蛋白)結合的親和力低至少十倍，如低至少100倍、例如低至少1,000倍、如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍。親和力低的量依賴於抗體的KD，這樣使得當抗體的KD非常低(即，該抗體具高度特異性)時，低於對非特異性抗原的親和力的對抗原的親和力的量可以是至少10,000倍。
如在此使用的，術語“kd”(sec -1或1/s)係指特定抗體-抗原相互作用的解離速率常數。所述值又稱為koff值。
如在此使用的，術語“ka”(M-1 x sec-1或1/Msec)係指特定抗體-抗原相互作用的締合速率常數。
如在此使用的，術語“KD”(M)係指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數並且藉由kd除以ka獲得。
如在此使用的，術語“KA”(M-1或1/M)係指特定抗體-抗原相互作用的締合平衡常數並且藉由ka除以kd獲得。
在一個實施方式中，本發明涉及抗體或其抗原結合片段，其展現出以下特性中的一種或多種：i.對於α-突觸核蛋白的結合親和力(KD)，該結合親和力在0.5-10nM之間，例如1-5nM或1-2nM；ii.抑制α-突觸核蛋白原纖維的蛋白酶截短的能力；iii.在F28-snca轉基因小鼠中逆轉基礎突觸傳導的損傷的能力； iv.如藉由體內微透析測量的，在小鼠海馬迴內降低α-突觸核蛋白的水平的能力；v.當長期給予時，能在帕金森氏病的大鼠模型中恢復運動功能；vi.預防α-突觸核蛋白播種(例如在體外和/或在帕金森氏病小鼠模型中不可溶的磷酸化的α-突觸核蛋白的積累)的能力；和/或vii.在人腦中結合截短的α-突觸核蛋白的能力。
α-突觸核蛋白的結合親和力(KD)可以使用本技術領域熟知的方法(例如在實例2中所描述的)來測定。
術語“抑制α-突觸核蛋白原纖維蛋白酶截短的能力”包括抑制鈣蛋白酶-1誘導形成初級皮質神經元內人α-突觸核蛋白的片段1-119-122的能力(見實例5)。
術語“在F28-snca轉基因小鼠中逆轉基礎突觸傳遞受損的能力”包括在F28-snca轉基因小鼠的海馬迴CA1區逆轉突觸傳遞和可塑性的損害的能力，例如藉由電生理測量的誘發的fEPSP斜率表明的(見實例6)。
術語“如藉由體內微透析測定的降低小鼠海馬迴內α-突觸核蛋白水平的能力”包括如使用體內微量滲析測定的，降低海馬迴清醒、自由活動的F28-snca轉基因小鼠中人α-突觸核蛋白水平的能力(見實例7)。
術語“當長期給予時，在帕金森氏病的大鼠模型中恢復運動功能的能力”包括在帕金森氏病的大鼠重組腺相關病毒載體(rAAV)模型中減少或消除運動不對稱的能力(見實例8)。
在一些抗體中，僅需CDR的一部分(即結合所需的CDR殘基亞群，稱為SDR)在人源化抗體中保持結合。可以藉由分子建模和/或憑 經驗或者如在岡薩雷斯，N.R.(Gonzales,N.R.)等人，(2004)“使用多個人種系範本對鼠類抗體進行SDR接枝以最小化其免疫原性(SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity)”，分子免疫學(Mol.Immunol.)41：863-872中所述的，基於先前研究(例如CDR H2中的殘基H60-H65通常是不需要的)從位於喬西亞(Chothia)超變環外的卡巴特CDR區域(參見，卡巴特(Kabat)等人，(1992)免疫學關注的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)，公開號91-3242；喬西亞，C.(Chothia,C.)等人，(1987)“免疫球蛋白的超變區的典型結構(Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins)”，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)196：901-917)中鑒定不接觸相關表位並且不在SDR中的CDR殘基。在此類人源化抗體中，在一個或多個供體CDR殘基不存在或整個供體CDR被省略的位置處，佔據該位置的胺基酸可以是在受體抗體序列中佔據相應位置(藉由卡巴特編號)的胺基酸。在包含在內的CDR中受體對供體胺基酸的這樣的取代的數目反映了競爭考慮的平衡。這樣的取代在降低人源化抗體中的小鼠胺基酸的數目方面並且因此在降低潛在的免疫原性方面是潛在有利的。然而，取代還可以引起親和力變化，並且較佳的是避免親和力的顯著減少。還可以憑經驗選擇CDR內的取代位置和待取代的胺基酸。
CDR殘基的單個胺基酸改變可以導致失去功能性結合的事實(魯迪科夫，S.(Rudikoff,S.)等人(1982)“單個胺基酸取代改變抗原結合特異性(Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-binding Specificity)”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))79(6)：1979-1983)提供了用於系統性鑒定可替代的功能性CDR序列的手段。在一種用於獲得此類變體CDR的較佳的方法中，將編碼CDR的多核苷酸誘變(例如經由隨機誘變或藉由位點定向方法(例如，用編碼突變座位的引物進行聚合酶鏈式介導的擴增))以產生具有取代的胺基酸殘基的CDR。藉由比較原始(功能性)CDR序列中的相關殘基的身份與取代的(非功能性)變體CDR序列的身份，可以鑒定出該取代的BLOSUM62.iij取代得分。BLOSUM系統提供了藉由分析序列數據庫創建的胺基酸取代矩陣，用於可信比對(埃迪，S.R.(Eddy,S.R.)(2004)“BLOSUM62比對得分矩陣來自哪裡？(Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?)”，自然生物技術(Nature Biotech.)22(8)：1035-1036；赫尼科夫，J.G.(Henikoff,J.G.)(1992)“來自蛋白質嵌段的胺基酸取代矩陣(Amino acid substitution matrices from protein blocks)”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))89：10915-10919；卡林，S.(Karlin,S.)等人，(1990)“藉由使用通用評分方案評估分子序列特徵的統計顯著性的方法(Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes)”，美國國家科學院院刊87：2264-2268；阿爾丘爾，S.F.(Altschul,S.F.)(1991)“來自資訊理論視角的胺基酸取代矩陣(Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perrspective)”，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)219，555-565)。目前，最先進的BLOSUM數據庫係BLOSUM62數據庫(BLOSUM62.iij)。表1呈現了BLOSUM62.iij取代得分(得分越高取代越保守，並且因此更加可能地，該取代將不會影響功能)。如果 包含所得CDR的抗原結合片段不能結合到α-突觸核蛋白，例如，則BLOSUM62.iij取代得分被認為是不充分保守的，並且選擇且產生新的具有更高取代得分的候選取代。因此，例如，如果原始殘基係穀胺酸(E)並且非功能性取代殘基係組胺酸(H)，則BLOSUM62.iij取代得分將為0，並且更保守的變化(如到天冬胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺或賴胺酸)係較佳的。
Figure 105121902-A0202-12-0039-2
本發明因此考慮了隨機誘變用於鑒定改進的CDR的用途。在本發明的背景下，保守取代可以由反映在以下三個表中的一個或多個中的胺基酸類別內的取代定義：
保守取代的胺基酸殘基類別：
Figure 105121902-A0202-12-0040-3
替代性保守胺基酸殘基取代類別：
Figure 105121902-A0202-12-0040-4
胺基酸殘基的替代性物理和功能分類：
Figure 105121902-A0202-12-0041-5
更保守的取代分組包括：纈胺酸-亮胺酸-異亮胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、賴胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸以及天冬醯胺-穀胺醯胺。
還可以使用描述於例如克賴頓(Creighton)(1984)蛋白質：結構與分子特性(Proteins：Structure and Molecular Properties)(第2版1993)，W.H.弗裡曼公司(W.H.Freeman and Company)中的原理制定另外的胺基酸組群。
噬菌體展示技術可替代地被用於增加(或降低)CDR親和力。被稱為親和力成熟的這種技術採用誘變或“CDR步移”並且重選擇使用靶抗原或其抗原性抗原結合片段來鑒定具有如下CDR的抗體，該等CDR 當與初始抗體或親本抗體相比時以更高(或更低)親和力結合到抗原(參見例如，格拉澤(Glaser)等人(1992)免疫學雜誌(J.Immunology)149：3903)。誘變整個密碼子而不是單個核苷酸產生胺基酸突變的半隨機譜。可構建由一組變體殖株所組成的庫，每一殖株都在單個CDR中相差單個胺基酸改變，並且該等殖株包含代表了每個CDR殘基的每個可能胺基酸取代的變體。可藉由使固定化突變體與標記的抗原相接觸來篩選對抗原的結合親和力增加(或減少)的突變體。可以使用本領域已知的任何篩選方法來鑒定對抗原具有增加或減少的親和力的突變抗體(例如，ELISA)(參見吳(Wu)等人，1998，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))95：6037；耶爾頓(Yelton)等人，1995，免疫學雜誌(J.Immunology)155：1994)。可能可以使用隨機化輕鏈的CDR步移(參見，希爾(Schier)等人，1996，分子生物學雜誌(J.Mol.Bio.)263：551)。
用於完成此類親和力成熟的方法描述於以下中，例如：克勞斯，J.C.(Krause,J.C.)等人(2011)“使抗體結合部位構造變形的插入突變增強人抗體的功能(An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody)”，MBio.2(1)pii：e00345-10.doi：10.1128/mBio.00345-10；庫安，C.T.(Kuan,C.T.)等人(2010)“靶向惡性膠質瘤和黑色素瘤的親和力成熟的抗糖蛋白NMB重組免疫毒素(Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas)”，國際癌症雜誌(Int.J.Cancer)10.1002/ijc.25645；海克爾，B.J.(Hackel,B.J.)等人(2010)“穩定性和CDR組成偏移富集粘合劑功能性景觀(Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes)”，分子生物學(J.Mol.Biol.)401(1)：84-96；蒙哥馬利，D.L.(Montgomery,D.L.)等人(2009)“針對HIV-1 gp41的人單株抗體的親和力成熟與表徵(Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41)”，MAbs 1(5)：462-474；古斯特齊納，E.(Gustchina,E.)等人(2009)“藉由源自於合成的原初人抗體文庫的單株Fab的CDR-H2環的定向多樣化以及針對Gp41的內部三聚物的捲曲螺旋進行的親和力成熟產生一組具有改進的HIV-1中和效價以及幅度的Fab(Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naïve Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth)”，病毒學(Virology)393(1)：112-119；芬利，W.J.(Finlay,W.J.)等人(2009)“用於抗RAGE治療的人源化大鼠抗體的親和力成熟：綜合誘變揭示在互補決定區內部和外部兩者的高水平的突變可塑性(Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy：Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions)”，分子生物學(J.Mol.Biol.)388(3)：541-558；波斯特朗，J.(Bostrom,J.)等人(2009)“改進抗體結合親和力以及特異性用於治療性開發(Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development)”，分子生物學方法(Methods Mol.Biol.)525：353-376；史泰德，S.(Steidl,S.)等人(2008)“藉由定向CDR多樣化進行人GM-CSF抗體的體外親和力成熟(In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification)”，分子免疫學(Mol.Immunol.)46(1)：135-144；以及巴爾代雷斯，R.(Barderas,R.)等人(2008)“藉由電腦建模輔助的抗體親和力成熟(Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling)”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))105(26)：9029-9034。
因此，所包含的抗體或其抗原結合片段的CDR變體的序列可以藉由取代而不同於親本抗體GM37的CDR的序列；例如取代的4個胺基酸殘基、3個胺基酸殘基、2個胺基酸殘基或胺基酸殘基中的1個。根據本發明的實施方式，此外設想的是，CDR區中的胺基酸可以用保守取代進行取代，如在上面3個表中所定義的。
如在此使用的術語“治療(treatment)”或“治療(treating)”意指改善、減緩、減弱或逆轉疾病或障礙的進展或嚴重性，或者改善、減緩、減弱或逆轉這種疾病或障礙的一種或多種症狀或副作用。出於本發明的目的，“治療(treatment)”或“治療(treating)”另外意指用於獲得有益的或希望的臨床結果的方法，其中“有益的或希望的臨床結果”包括但不限於症狀的緩解、障礙或疾病程度的減小、穩定化的(即沒有惡化的)疾病或障礙狀態、疾病或障礙狀態進展的延緩或減緩、疾病或障礙狀態的改善或減輕以及疾病或障礙的緩解，不論是部分地或全部地、可檢出的或不可檢出的。
當應用於本發明的抗體或其抗原結合片段時，“有效量”係指以所需劑量並且持續所需時間段足以達到預期生物效應或希望的治療結果(包括但不限於臨床結果)的量。當應用於本發明的抗體或其抗原結合 片段時，短語“治療有效量”旨在表示足以改善、減輕、穩定、逆轉、減緩、減弱或延緩障礙或疾病狀態的進展，或者該障礙或疾病的症狀的進展的抗體或其抗原結合片段的量。在實施方式中，本發明的方法提供了抗體或其抗原結合片段與其他化合物組合的給藥。在此類情況下，“有效量”係足以引起預期的生物效應的該組合的量。
本發明的抗α-突觸核蛋白抗體或其抗原結合片段的治療有效量可以根據以下因素而變化，如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及抗α-突觸核蛋白抗體在個體中引起希望的應答的能力。治療有效量還是抗體或抗體部分的有益治療效果超過其任何毒性或有害效果的量。
如以上指出，本發明特別涉及單株抗體，該單株抗體能特異性結合到人α-突觸核蛋白(SEQ ID NO：9(ILEDMP))的胺基酸112-117內的表位。在一個實施方式中，該抗體能與抗體GM37競爭以結合至α-突觸核蛋白的112-117表位。
本發明的抗體(藉由GM37、其變體GM37變種1-3和GM285和它們的α-突觸核蛋白結合片段舉例說明)能夠結合由α-突觸核蛋白的殘基的1-119/122組成的毒性α-突觸核蛋白片段並中和其毒性(例如，藉由細胞外結合至α-突觸核蛋白片段，從而防止它被細胞攝取)。令人驚奇地，本發明的能夠結合到α-突觸核蛋白的112-117表位的抗體，在結合至人腦中的有毒α-突觸核蛋白種類方面優於先前技術的抗體(例如抗體9E4)，並且對清除細胞外α-突觸核蛋白和正常化體內由α-突觸核蛋白誘導的受損的突觸傳遞方面具有優異的效果。本發明的抗體還能夠減輕在帕金森氏病大鼠模型中相關運動表型的出現。
本發明的抗體較佳的是人或人源化抗體。
本發明還提供了在患者中減少α-突觸核蛋白聚集體的形成的方法，該方法包括向需要此類治療的患者給予治療有效量的本發明的抗體。
此外，抗體可以與藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或穩定劑一起處於組成物中。本發明的抗體可以在治療中使用。特別地，本發明的抗體可以被用於治療共核蛋白病，例如帕金森氏病(包括帕金森氏病的特發性和遺傳性形式)、高歇氏病、彌漫性雷維體病(DLBD)、阿耳茨海默病的雷維體變體(LBV)、組合型阿耳茨海默和帕金森氏病、純自主神經衰竭和多系統萎縮。
藉由本發明所設想的治療可以是長期的並且患者可以接受至少2週(如至少持續1個月、6個月、1年或更久)治療。
本發明的抗體或其抗原結合片段可以在不同細胞系中產生，如人細胞系、哺乳動物非人細胞系和昆蟲細胞系，例如CHO細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、鼠類細胞系(如骨髓瘤細胞系)、纖維肉瘤細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11細胞系、CAP細胞系和HuH-7人細胞系(杜蒙特(Dumont)等人，2015，生物技術評論性綜述(Crit Rev Biotechnol.)9月18日：1-13，將其內容藉由引用包括在此)。
本發明的抗體可以例如是藉由融合瘤方法產生的單株抗體，該方法首次由科勒(Kohler)等人，自然(Nature)256，495(1975)進行描述，或者可以是藉由重組DNA方法產生的單株抗體。還可以使用在例如克拉克森(Clackson)等人，自然(Nature)352,624-628(1991)和馬克思 (Marks)等人，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)222,581-597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體文庫分離單株抗體。單株抗體可以從任何適合的來源獲得。因此，例如，單株抗體可以從製備自鼠類脾臟B淋巴細胞的融合瘤獲得，該等淋巴細胞獲得自用感興趣的抗原或編碼感興趣的抗原的核酸免疫的小鼠，例如，該等淋巴細胞處於在表面表現該抗原的細胞的形式。單株抗體還可以從來源於免疫的人的或來自非人哺乳動物(如大鼠、兔、狗、綿羊、山羊、靈長類動物等)的表現抗體的細胞的融合瘤獲得。
在一個實施方式中，本發明的抗體係人抗體。可以使用攜帶部分人免疫系統而非小鼠系統的轉基因或轉染色體小鼠產生針對α-突觸核蛋白的人單株抗體。這樣的轉基因和轉染色體小鼠包括在此分別稱為HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠。
HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因微座位連同定向突變，該微座位編碼非重排人重鏈可變和恒定(μ和Y)以及輕鏈可變和恒定(κ)免疫球蛋白序列，該等定向突變使內源μ和κ鏈座位失活(朗伯格，N.(Lonberg,N.)等人，自然(Nature)368，856-859(1994))。因此，小鼠展現出減少的小鼠IgM或Ig κ表現，並且響應於免疫，所引入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變以產生高親和力人IgG,κ單株抗體(朗伯格，N.(Lonberg,N.)等人(1994)，見上文；綜述於朗伯格，N.，實驗藥物學手冊(Handbook of Experimental Pharmacology)113，49-101(1994)；朗伯格，N.和胡薩爾，D.(Huszar,D.)，國際免疫學評論(Intern.Rev.Immunol.)第13卷65-93(1995)哈丁，F.(Harding,F.)和朗伯格，N.，紐約科學院年刊(Ann.N.Y.Acad.Sci)764 536-546(1995))。HuMAb小鼠的製備詳細描述 於泰勒，L.(Taylor,L.)等人，核酸研究(Nucleic Acids Research)20，6287-6295(1992)；陳，J.(Chen,J.)等人，國際免疫學(International Immunology)5，647-656(1993)；圖愛隆(Tuaillon)等人，免疫學雜誌(J.Immunol.)152，2912-2920(1994)；泰勒，L.等人，國際免疫學6，579-591(1994)；菲施維爾德，D.(Fishwild,D.)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)。還參見US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,789,650、US 5,877,397、US 5,661,016、US 5,814,318、US 5,874,299、US 5,770,429、US 5,545,807、WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918以及WO 01/09187。
Hco7、HCo12、HCo17和HCo20小鼠在其內源輕鏈(κ)基因中具有JKD破壞(如描述於陳(Chen)等人，歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.)12，811-820(1993))，在其內源重鏈基因中具有種CMD破壞(如描述於WO01/14424的實例1)以及KCo5人κ輕鏈轉基因(如描述於菲施維爾德(Fishwild)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996))。此外，HCo7小鼠具有HCo7人重鏈轉基因(如描述於US 5,770,429)，HCo12小鼠具有HCo12人重鏈轉基因(如描述於WO 01/14424的實例2)，HCo17小鼠具有HCo17人重鏈轉基因(如描述於WO 01/09187的實例2)並且HCo20小鼠具有HCo20人重鏈轉基因。所得小鼠在對內源小鼠重鏈和κ輕鏈座位破壞純合的背景下表現人免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈轉基因。
在KM小鼠品系中，內源小鼠κ輕鏈基因已經被同型結合地破壞，如描述於陳(Chen)等人，歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.)12，811-820(1993)，並且內源小鼠重鏈基因已經被同型結合地破壞，如描述 於WO 01/09187的實例1。這個小鼠品系攜帶人κ輕鏈轉基因KCo5，如描述於菲施維爾德(Fishwild)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)。這個小鼠品系還攜帶由染色體14片段hCF(SC20)構成的人重鏈轉染色體，如描述於WO 02/43478中。HCo12-Balb/c、HCo17-Balb/c和HCo20-Balb/c小鼠可以藉由將HCo12、HCo17和HCo20與KCo5[J/K](Balb)雜交來產生，如描述於WO 09/097006中。
在KM小鼠品系中，內源小鼠κ輕鏈基因已經被同型結合地破壞，如描述於陳(Chen)等人，歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.)12，811-820(1993)，並且內源小鼠重鏈基因已經被同型結合地破壞，如描述於WO 01/09187的實例1。這個小鼠品系攜帶人κ輕鏈轉基因KCo5，如描述於菲施維爾德(Fishwild)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)中。這個小鼠品系還攜帶由染色體14抗原結合片段hCF(SC20)構成的人重鏈轉染色體，如描述於WO 02/43478中。
來自該等轉基因小鼠的脾細胞可以用於根據熟知的技術產生分泌人單株抗體的融合瘤。本發明的人單株抗體或多株抗體或者源於其他物種的本發明的抗體還可以藉由產生對於感興趣的免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列而言轉基因的另一非人哺乳動物或植物並且從其中產生可回收形式的抗體而轉基因地產生。與哺乳動物中的轉基因生產相結合，抗體可以從山羊、奶牛或其他哺乳動物的乳中產生和回收。參見例如US 5,827,690、US 5,756,687、US 5,750,172和US 5,741,957。
本發明的抗體可以具有任何同種型。同種型的選擇典型地將由希望的效應子功能(如ADCC誘導)來指導。示例性同種型係IgG1、IgG2、 IgG3和IgG4。可以使用人輕鏈恒定域κ或λ中任一者。如果希望的話，可以藉由已知方法轉換本發明的抗α-突觸核蛋白抗體的類別。例如，最初係IgM的本發明抗體可以類別轉換為本發明的IgG抗體。此外，類別轉換技術可以用來將一個IgG亞類轉化成另一亞類，例如從IgG1到IgG2。因此，本發明的抗體的效應子功能可以藉由同種型切換變為例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗體，用於各種治療用途。在一個實施方式中，本發明的抗體係IgG1抗體，例如IgG1,κ。抗體被說成屬於特定同種型，如果其胺基酸序列相對於其他同種型與該同種型大部分同源的話。
在一個實施方式中，本發明的抗體係全長抗體，較佳的是IgG抗體，特別是IgG1,κ抗體。在另一個實施方式中，本發明的抗體係抗體片段或單鏈抗體。
抗體及其抗原結合片段可以例如使用常規技術藉由抗原結合片段化來獲得，並且按與如在此針對完整抗體描述的相同方式針對實用性對抗原結合片段進行篩選。例如，F(ab')2抗原結合片段可以藉由用胃蛋白酶處理抗體而產生。可以處理所得F(ab')2抗原結合片段，以減少二硫鍵，從而產生Fab'抗原結合片段。Fab抗原結合片段可以藉由用木瓜蛋白酶處理IgG抗體而獲得；Fab'抗原結合片段可以用胃蛋白酶消化IgG抗體而獲得。F(ab')抗原結合片段還可以經由硫醚鍵或二硫鍵藉由結合以下描述的Fab’而產生。Fab'抗原結合片段係藉由切割F(ab')2的鉸鏈域的二硫鍵獲得的抗體抗原結合片段。Fab'-抗原結合片段可以藉由用還原劑(如二硫蘇糖醇)處理F(ab')2抗原結合片段而獲得。抗體抗原結合片段還可以藉由在重組細胞中表現編碼此類抗原結合片段的核酸而產生(參見例如埃文斯(Evans)等人， 免疫學方法雜誌(J.Immunol.Meth.)184,123-38(1995))。例如，編碼F(ab')2抗原結合片段的一部分的嵌合基因可以包括編碼H鏈的CH1區和鉸鏈域的DNA序列，隨後是翻譯終止密碼子，以產生這樣一種截短的抗體抗原結合片段分子。
在一個實施方式中，抗α-突觸核蛋白抗體係單價抗體，較佳的是具有鉸鏈結構域缺失的單價抗體，如在WO 2007059782(將其藉由引用以其全部結合在此)中所述。因此，在一個實施方式中，抗體係單價抗體，其中所述抗α-突觸核蛋白抗體藉由以下方法構建，該方法包括：i)提供編碼所述單價抗體的輕鏈的核酸構建體，所述構建體包含編碼所選抗原特異性抗α-突觸核蛋白抗體的VL區的核苷酸序列和編碼Ig的恒定CL區的核苷酸序列，其中編碼所選抗原特異性抗體的VL區的所述核苷酸序列和編碼Ig的CL區的所述核苷酸序列被可操作地連接在一起，並且其中，在IgG1亞型的情況下，編碼CL區的核苷酸序列已經被修飾，這樣使得在多株人IgG的存在下或當給予給動物或人時，該CL區不含有能夠與包含該CL區的一致胺基酸序列的其他肽形成二硫鍵或共價鍵的任何胺基酸；ii)提供編碼所述單價抗體的重鏈的核酸構建體，所述構建體包含編碼所選抗原特異性抗體的VH區的核苷酸序列和編碼人Ig的恒定CH區的核苷酸序列，其中編碼CH區的核苷酸序列已經被修飾，這樣使得在多株人IgG的存在下或當給予給動物、人時，對應於鉸鏈域和(如由Ig亞型所要求的)CH區的其他區域(如CH3區)的區域不包含參與和包含人Ig的CH區的一致胺基酸序列的其他肽形成二硫鍵或共價或穩定的非共價重鏈間鍵的任何胺基酸殘基，其中編碼所選抗原特異性抗體的VH區的所述核苷酸序列和編碼所述 Ig的CH區的所述核苷酸序列被可操作地連接在一起；iii)提供用於產生所述單價抗體的細胞表現系統；iv)藉由在(iii)的細胞表現系統的細胞中共表現(i)和(ii)的核酸構建體來產生所述單價抗體。
類似地，在一個實施方式中，抗α-突觸核蛋白抗體係單價抗體，其包含：(i)如在此描述的本發明抗體的可變域或所述區的抗原結合部分，以及(ii)免疫球蛋白的CH域或其包含CH2和CH3域的結構域，其中該CH域或其結構域已經被修飾，這樣使得對應於鉸鏈域和(如果該免疫球蛋白不是IgG4亞型的話)CH域的其他結構域(如CH3域)的結構域不包含任何胺基酸殘基，該等任何胺基酸殘基能夠與相同CH域形成二硫鍵或在多株人IgG的存在下與相同CH域形成其他共價或穩定的非共價重鏈間鍵。
在一個另外的實施方式中，單價α-突觸核蛋白抗體的重鏈已經被修飾，這樣使得已經缺失整個鉸鏈域。
在另一個另外的實施方式中，所述單價抗體的序列已經被修飾，這樣使得它不包含用於N-連接的糖基化的任何受體位點。
本發明還包括“雙特異性抗體”，其中抗α-突觸核蛋白結合區(例如，抗α-突觸核蛋白單株抗體的α-突觸核蛋白結合區)係靶向一種以上表位的二價或多價雙特異性支架的一部分(例如第二表位可以包含主動轉運受體的表位，這樣使得該雙特異性抗體將展現出跨生物障壁(如血腦障壁)的改進的胞轉作用)。因此，在另一個另外的實施方式中，抗突觸核蛋白抗體的單價Fab可以連接到另外的靶向不同蛋白的Fab或scfv，以產生雙特異性抗體。雙特異性抗體可以具有雙重功能，例如由抗突觸核蛋 白結合域賦予的治療功能和可以結合到受體分子以增強跨生物障壁(如血腦障壁)轉移的轉運功能。
本發明的抗α-突觸核蛋白抗體及其抗原結合片段還包括單鏈抗體。單鏈抗體係其中重鏈和輕鏈Fv區相連的肽。在一個實施方式中，本發明提供了單鏈Fv(scFv)，其中本發明的抗α-突觸核蛋白抗體的Fv中的重鏈和輕鏈由柔性肽接頭(典型地為約10、12、15或更多個胺基酸殘基)連接成單條肽鏈。產生此類抗體的方法描述於例如US 4,946,778；普拉克圖恩(Pluckthun)，在單株抗體藥理學(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，羅森伯格(Rosenburg)和莫耳(Moore)編輯，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，紐約，第269-315頁(1994)；伯德(Bird)等人，科學(Science)242，423-426(1988)；休斯頓(Huston)等人，PNAS USA 85，5879-5883(1988)和麥卡弗蒂(McCafferty)等人，自然(Nature)348，552-554(1990)。單鏈抗體可以是單價的，如果僅使用單個VH和VL的話；可以是二價的，如果使用兩個VH和VL的話；或可以是多價的，如果使用兩個以上VH和VL的話。
可以藉由包含任何適合數目的經修飾的胺基酸和/或與此類偶聯取代基締合來修飾在此描述的抗α-突觸核蛋白抗體及其抗原結合片段。在此背景下適合性通常由至少基本上保留與非衍生化親本抗α-突觸核蛋白抗體相關的α-突觸核蛋白選擇性和/或α-突觸核蛋白特異性的能力決定。一個或多個經修飾的胺基酸的包含在例如增加多肽血清半衰期、降低多肽抗原性或增加多肽儲存穩定性中可以是有利的。對一種或多種胺基酸進行修飾，例如，在重組產生的過程中與翻譯同時進行或在翻譯之後進行 (例如，在哺乳動物細胞中表現過程中在N-X-S/T基序上的N-連接的糖基化作用)，或藉由合成手段進行修飾。經修飾的胺基酸的非限制性實例包括糖基化的胺基酸、硫酸化的胺基酸、異戊二烯化(例如，法尼基化、香葉基-香葉基化(geranylgeranylated))的胺基酸、乙醯化的胺基酸、醯化的胺基酸、聚乙二醇化的胺基酸、生物素醯化的胺基酸、羧基化的胺基酸、磷酸化的胺基酸等。足夠指導熟習該項技術者進行胺基酸修飾的參考文獻在文獻中相當充分。示例性方案見於沃克(Walker)(1998)唯讀型光碟蛋白質指南(Protein Protocols On CD-Rom)，胡馬納出版社(Humana Press)，托托華(Totowa)，新澤西州。經修飾的胺基酸可以例如選自糖基化的胺基酸、聚乙二醇化的胺基酸、法尼基化的胺基酸、乙醯化的胺基酸、生物素醯化的胺基酸、偶聯到脂質部分的胺基酸或偶聯到有機衍化劑的胺基酸。
抗α-突觸核蛋白抗體還可以藉由共價偶聯到聚合物而化學地修飾，以例如增加其循環半衰期。示例性聚合物以及將它們附接到肽的方法說明於例如US 4,766,106；US 4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546中。另外的說明性聚合物包括聚氧乙基化的多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，分子量在約1,000與約40,000之間，如在約2,000與約20,000之間，例如約3,000-12,000g/mol的PEG)。
本發明的抗體可以進一步用在診斷方法中或用作診斷成像配位基。
在一個實施方式中，提供了包含一個或多個放射性標記的胺基酸的抗α-突觸核蛋白抗體。放射性標記的抗α-突觸核蛋白抗體可以用於診斷和治療兩種目的(偶聯到放射性標記的分子係另一可能特徵)。此類 標記的非限制性實例包括但不限於鉍(213Bi)、碳(11C、13C、14C)、鉻(51Cr)、鈷(57Co、60Co)、銅(64Cu)、鏑(165Dy)、鉺(169Er)、氟(18F)、釓(153Gd、159Gd)、鎵(68Ga、67Ga)、鍺(68Ge)、金(198Au)、鈥(166Ho)、氫(3H)、銦(111In、112In、113In、115In)、碘(121I、123I、125I、131I)、銥(192Ir)、鐵(59Fe)、氪(81mKr)、鑭(140La)、鑥(177Lu)、錳(54Mn)、鉬(99Mo)、氮(13N、15N)、氧(15O)、鈀(103Pd)、磷(32P)、鉀(42K)、鐠(142Pr)、鉕(149Pm)、錸(186Re、188Re)、銠(105Rh)、銣(81Rb、82Rb)、釕(82Ru、97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc)、硒(75Se)、鈉(24Na)、鍶(85Sr、89Sr、92Sr)、硫(35S)、鍀(99Tc)、鉈(201Tl)、錫(113Sn、117Sn)、氙(133Xe)、鐿(169Yb、175Yb、177Yb)、釔(90Y)以及鋅(65Zn)。用於製備放射性標記的胺基酸和相關肽衍生物的方法在本領域是已知的(參見例如，榮漢斯(Junghans)等人，在癌症化療和生物療法(Cancer Chemotherapy and Biotherapy)655-686(第2版，查弗尼爾(Chafner)和)隆哥(Longo)編輯，利平科特瑞文公司(Lippincott Raven)(1996))以及US 4,681,581、US 4,735,210、US 5,101,827、US 5,102,990(US RE35,500)、US 5,648,471和US 5,697,902)。例如，放射性同位素可以氯胺T方法進行偶聯(林德葛籣，S.(Lindegren,S.)等人(1998)“使用N-琥珀醯亞胺基-3-(三甲基錫烷基)苯甲酸酯作為中間體的抗體的高比活放射性碘化中的氯胺-T(Chloramine-T In High-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermediate)”，核醫學與生物學(Nucl.Med.Biol.)25(7)：659-665；庫爾特，M.(Kurth,M.)等人(1993)“放射性碘化的苯乙胺衍生物至單株抗體的位點特異性偶聯在腫瘤中產生增加的放射性(Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated Phenethylamine Derivative To A Monoclonal Antibody Results In Inoreased Radioactivity Localization In Tumor)”，藥物化學雜誌(J.Med.Chem.)36(9)：1255-1261；雷亞，D.W.(Rea,D.W.)等人(1990)“用於靶向腫瘤的位點特異性放射性碘化的抗體(Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors)”，癌症研究(Cancer Res.)50(3增刊)：857s-861s)。
本發明還提供了使用以下項可檢測地標記的抗α-突觸核蛋白抗體及其抗原結合片段：螢光標記(如稀土螯合物(例如，銪螯合物))、螢光素型標記(例如，螢光素、螢光素異硫氰酸酯、5-羧基螢光素、6-羧基螢光素、二氯三
Figure 105121902-A0202-12-0056-142
基胺螢光素)、羅丹明(rhodamine)型標記(例如，ALEXA FLUOR® 568(英傑公司(Invitrogen))、TAMRA®或丹磺醯氯)、VIVOTAG 680 XL FLUOROCHROMETM(珀金埃爾默公司(Perkin Elmer))、藻紅蛋白；傘形酮、麗絲胺；花菁；藻紅蛋白、德克薩斯紅、BODIPY FL-SE®(英傑公司)或其類似物，所有該等都適用於光學檢測。可以採用化學發光標記(例如，魯米諾、螢光素酶、螢光素和水母蛋白)。這種診斷和檢測還可以藉由將本發明的診斷分子偶合至可檢測物質(包括但不限於各種酶，酶包括但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶)或者偶合至輔基複合體(如但不限於鏈黴親和素/生物素和親和素/生物素)來完成。
可以採用化學發光標記(例如，魯米諾、螢光素酶、螢光素和水母蛋白)。這種診斷和檢測還可以藉由將本發明的診斷分子偶合至可檢測物質(包括但不限於各種酶，酶包括但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶)或者偶合至輔基複合體(如但不限 於鏈黴親和素/生物素和親和素/生物素)來完成。還可以採用順磁性標記，並且較佳的是使用正電子發射斷層掃描攝影術(PET)或單光子發射電腦斷層掃描攝影術(SPECT)進行檢測。這樣的順磁性標記包括但不限於含有鋁(Al)、鋇(Ba)、鈣(Ca)、鈰(Ce)、鏑(Dy)、鉺(Er)、銪(Eu)、釓(Gd)、鈥(Ho)、銥(Ir)、鋰(Li)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鉬(M)、釹(Nd)、鋨(Os)、氧(O)、鈀(Pd)、鉑(Pt)、銠(Rh)、釕(Ru)、釤(Sm)、鈉(Na)、鍶(Sr)、鋱(Tb)、銩(Tm)、錫(Sn)、鈦(Ti)、鎢(W)和鋯(Zi)並且特別是Co+2、CR+2、Cr+3、Cu+2、Fe+2、Fe+3、Ga+3、Mn+3、Ni+2、Ti+3、V+3和V+4的順磁離子的化合物，使用各種正電子發射斷層掃描攝影術的正電子發射金屬以及非放射性順磁金屬離子。
因此，在一個實施方式中，可以用螢光標記、化學發光標記、順磁性標記、放射性同位素標記或酶標記來標記本發明的抗α-突觸核蛋白抗體。可以使用經標記的抗體檢測或測量所述α-突觸核蛋白在受試者的腦中的存在或量。此方法可以包括檢測或測量結合到所述α-突觸核蛋白的抗α-突觸核蛋白抗體的體內成像，並且可以包括結合於所述抗α-突觸核蛋白的所述抗α-突觸核蛋白抗體的離體成像。
在另外的方面，本發明涉及編碼本發明的抗體或其抗原結合片段的一條或多條多肽鏈的表現載體。此類表現載體可以用於重組產生本發明的抗體和抗原結合片段。
在本發明的背景下，表現載體可以是任何適合的DNA或RNA載體，包括染色體載體、非染色體載體和合成核酸載體(包含一組適合的表現控制元件的核酸序列)。此類載體的實例包括SV40的衍生物、細 菌質粒、噬菌體DNA、杆狀病毒、酵母質粒、衍生自質粒與噬菌體DNA的組合的載體以及病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一個實施方式中，編碼抗α-突觸核蛋白抗體的核酸被包含在裸DNA或RNA載體中，包括例如線性表現元件(如描述於例如賽克斯(Sykes)和約翰斯頓(Johnston)，自然生物技術(Nat Biotech)12，355-59(1997))、緊湊型核酸載體(如描述於例如US 6,077,835和/或WO 00/70087)、質粒載體(如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119)、“侏儒(midge)”最小尺寸的核酸載體(如描述於例如斯查考斯基(Schakowski)等人，分子治療學(MoI Ther)3，793-800(2001))，或作為沈澱型核酸載體構建體，如CaPO4沈澱型構建體(如描述於例如WO 00/46147；本威尼斯提(Benvenisty)和雷瑟夫(Reshef)，PNAS USA 83，9551-55(1986)；威格爾(Wigler)等人，細胞(Cell)14，725(1978)以及柯拉科(Coraro)和皮爾森(Pearson)，體細胞遺傳學(Somatic Cell Genetics)2，603(1981))。此類核酸載體及其使用在本領域是熟知的(參見例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一個實施方式中，載體適用於在細菌細胞中表現抗α-突觸核蛋白抗體或其抗原結合片段。此類載體的實例包括以下表現載體，如BlueScript(Stratagene公司)、pIN載體(范黑克(Van Heeke)&舒斯特(Schuster)，生物化學雜誌(J Biol Chem)264，5503-5509(1989))、pET載體(Novagen公司，麥迪森，威斯康辛州)等。
表現載體還可以是或可替代地是適用於在酵母系統中進行表現的載體。可以採用任何適用於在酵母系統中進行表現的載體。適合的載體包括例如包含組成型或誘導型啟動子(如α因子、醇氧化酶和PGH) 的載體(綜述於：F.奧蘇貝爾(F.Ausubel)等人編輯分子生物學實驗指南(Current Protocols in Molecular Biology)，格林出版和威利國際科學(Greene Publishing and Wiley InterScience)紐約(1987)；格朗(Grant)等人，酶學方法(Methods in Enzymol)153，516-544(1987)；瑪塔諾維奇，D.(Mattanovich,D.)等人分子生物學方法(Methods Mol.Biol.)824，329-358(2012)；塞利克，E.(Celik,E.)等人生物技術進展(Biotechnol.Adv.)30(5)，1108-1118(2012)；李，P.(Li,P.)等人應用生物化學與生物技術(Appl.Biochem.Biotechnol.)142(2)，105-124(2007)；波爾，E.(Böer,E.)等人應用微生物學與生物技術(Appl.Microbiol.Biotechnol.)77(3)，513-523(2007)；範德法特，J.M.(van der Vaart,J.M.)分子生物學方法178，359-366(2002)和霍利格，P.(Holliger,P.)分子生物學方法178，349-357(2002))。
在本發明的表現載體中，編碼抗α-突觸核蛋白抗體的核酸可以包含任何適合的啟動子、增強子和其他有助於表現的元件或者與其締合。此類元件的實例包括強表現型啟動子(例如，人CMV IE啟動子/增強子連同RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR啟動子)、有效的聚(A)終止序列、用於在大腸桿菌中產生質粒的複製起點、作為選擇性標記的抗生素抗性基因和/或便利的複製位點(例如，多聚接頭)。核酸還可以包含與組成型啟動子(如CMV IE)相對的誘導型啟動子(熟習該項技術者應認識到此類術語實際上是在某些條件下的基因表現程度的描述語)。
本發明的抗體或其抗原結合片段可以在不同細胞系中產生，如人細胞系、哺乳動物非人細胞系和昆蟲細胞系，例如CHO細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、鼠類細胞系(如骨髓瘤細胞系)、纖維肉瘤 細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11細胞系、CAP細胞系和HuH-7人細胞系(杜蒙特(Dumont)等人，2015，生物技術評論性綜述(Crit Rev Biotechnol.)9月18日：1-13.，將其內容藉由引用包括在此)。
在甚至另外的方面，本發明涉及重組真核或原核宿主細胞(如轉染瘤)，其產生如在此定義的本發明的抗體或其抗原結合域或如在此定義的本發明的雙特異性分子。宿主細胞的實例包括酵母、細菌和哺乳動物細胞(如CHO或HEK細胞)。例如，在一個實施方式中，本發明提供了包含穩定地整合進細胞基因組中的核酸的細胞，該基因組包含編碼本發明的抗α-突觸核蛋白抗體或其抗原結合片段的表現的序列。在另一個實施方式中，本發明提供了包含非整合型核酸(如質粒、粘粒、噬菌粒或線性表現元件)的細胞，該核酸包含編碼本發明的抗α-突觸核蛋白抗體的表現的序列。
在另外的方面，本發明涉及用於產生本發明的抗α-突觸核蛋白抗體之方法，所述方法包括以下步驟：a)培養如在上文描述的本發明的融合瘤或宿主細胞，並且b)從培養基中純化本發明的抗體。
在一個實施方式中，本發明涉及一種製劑，如此術語在此使用的，該製劑包含如在此定義的抗α-突觸核蛋白抗體，並且基本上不含天然產生的不能結合到α-突觸核蛋白或不實質性地改變該製劑的抗α-突觸核蛋白功能性的抗體。因此，這樣一種製劑不包括天然產生的血清或這樣的血清的經純化的衍生物，該製劑包含抗α-突觸核蛋白抗體和另一種抗體的混合物，所述另一種抗體不改變該製劑的抗α-突觸核蛋白抗體的功能性；其中這樣的功能性選自由以下各項組成之群組： (i)該抗α-突觸核蛋白抗體對α-突觸核蛋白的結合親和力(KD)；(ii)該抗α-突觸核蛋白抗體抑制α-突觸核蛋白原纖維的蛋白酶截短的能力；(iii)在F28-snca轉基因小鼠中該抗α-突觸核蛋白抗體逆轉基礎突觸傳導的損傷的能力；(iv)如藉由體內微透析測量的，該抗α-突觸核蛋白抗體降低小鼠海馬迴內α-突觸核蛋白水平的能力；和(v)在帕金森氏病的大鼠模型中，當長期給予時，該抗α-突觸核蛋白抗體恢復運動功能的能力；(vi)預防α-突觸核蛋白播種(例如在體外和/或在帕金森氏病小鼠模型中不可溶的磷酸化的α-突觸核蛋白的積累)的能力；和/或(vii)在人腦中結合截短的α-突觸核蛋白的能力。
本發明具體涉及在其胺基酸序列中(在任何其CDR、可變域、構架殘基和/或恒定域中)相對於天然存在的抗α-突觸核蛋白抗體的結構具有結構改變的這樣一種抗α-突觸核蛋白抗體的製劑，其中所述結構改變使得抗α-突觸核蛋白抗體單株抗體相對於由所述天然存在的抗α-突觸核蛋白抗體展現出的功能性展現出顯著改變的功能性(即，在功能性方面，差異超過20%、差異超過40%、差異超過60%、差異超過80%、差異超過100%、差異超過150%、差異超過2倍、差異超過4倍、差異超過5倍或差異超過10倍)；其中這樣的功能性係：(i)該抗α-突觸核蛋白單株抗體對α-突觸核蛋白的結合親和力(KD)；(ii)該抗α-突觸核蛋白單株抗體抑制α-突觸核蛋白原纖維的蛋白酶 截短的能力；(iii)在F28-snca轉基因小鼠中該抗α-突觸核蛋白單株抗體逆轉基礎突觸傳導的損傷的能力；(iv)如藉由體內微透析測量的，該抗α-突觸核蛋白單株抗體降低小鼠海馬迴內α-突觸核蛋白水平的能力；和/或(v)在帕金森氏病的大鼠模型中，當長期給予時，抗α-突觸核蛋白單株抗體能恢復運動功能的能力；(vi)預防α-突觸核蛋白播種(例如在體外和/或在帕金森氏病小鼠模型中不可溶的磷酸化的α-突觸核蛋白的積累)的能力；和/或(vii)在人腦中結合截短的α-突觸核蛋白的能力。
尤其是其中這樣改變的功能性係結構改變的結果並且因此與它不可分。
術語“基本不含”天然產生的抗體係指在此類製劑中完全不存在此類天然產生的抗體，或在此類製劑中包含不實質上影響該等製劑的α-突觸核蛋白結合特性的濃度的此類天然產生的抗體。抗體被說成是“分離的”，如果它具有非天然產生的對應物或已經從天然伴隨它的組分中分離或純化出來的話。
當它涉及此類製劑時，術語“天然產生的抗體”係指作為活的人或其他動物的免疫系統發揮功能的自然結果在活的人或其他動物體內誘出的抗體(包括天然產生的自身抗體)。
因此，本發明的製劑不排除並且的確明確地包括含有抗α-突觸核蛋白抗體和有意添加的另外的抗體的此類製劑，該另外的抗體能夠 結合到不為α-突觸核蛋白所具有的表位。此類製劑具體包括製劑在治療以下共核蛋白病中展現出增強的功效的其實施方式，該共核蛋白病例如是帕金森氏病(包括帕金森氏病的先天性和遺傳性形式)、高歇氏病、彌漫性雷維體病(DLBD)、阿耳茨海默病的雷維體變體(LBV)、組合型阿耳茨海默和帕金森氏病、純自主神經衰竭和多系統萎縮。
在甚至另外的方面，本發明涉及醫藥組成物，其包含：(i)抗α-突觸核蛋白抗體或其抗原結合片段，兩者均如在此定義的，或包含這樣一種抗α-突觸核蛋白抗體或其抗原結合片段的製劑，如此術語在此定義的；(ii)藥學上可接受的載體。
醫藥組成物可以用藥學上可接受的載體或稀釋劑連同任何其他已知的佐劑和賦形劑根據常規技術配製，該等常規技術係如以下揭露的那些：雷明頓：藥學科學與實踐(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第22版，熱納羅(Gennaro)編輯，馬克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯頓，賓夕法尼亞州，2013。
藥學上可接受的載體或稀釋劑連同任何其他已知的佐劑和賦形劑應該適合於本發明的所選化合物和所選給藥方式。基於就表位結合而言對本發明的所選化合物或醫藥組成物的所希望的生物特性的顯著不利影響的缺少(例如，小於實質性影響(10%或更少相對抑制、5%或更少相對抑制等))來確定醫藥組成物的載體和其他組分的適合性。
本發明的醫藥組成物還可以包含稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、洗滌劑(例如，非離子型洗滌劑，如Tween-20或Tween-80)、穩定劑(例 如，糖或無蛋白胺基酸)、防腐劑、組織固定劑、增溶劑和/或適於包含在醫藥組成物中的其他材料。將稀釋劑選擇為不影響組合的生物活性。此類稀釋劑的實例為蒸餾水、生理磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液和漢克氏溶液。此外，醫藥組成物或配製物還可以包含其他載體，或無毒的、非治療性的、非免疫原性的穩定劑等。組成物還可以包含大的、緩慢代謝的大分子，如蛋白質、多糖(像殼聚糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如，乳膠功能化的交聯瓊脂糖、瓊脂糖、纖維素等)、聚合胺基酸、胺基酸共聚物以及脂質聚集體(例如，油滴或脂質體)。
本發明醫藥組成物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以獲得對於特定患者、組成物和給藥方式而言有效實現所希望的治療應答的活性成分量。所選的劑量水平將取決於多種藥代動力學因素，包括所採用的本發明具體組成物或其醯胺的活性，給藥路徑，給藥時間，所採用的具體化合物的排泄速率，治療持續時間，與所採用的具體組成物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料，所治療患者的年齡、性別、體重、病情、一般健康狀況和既往病史以及醫學領域熟知的類似因素。
醫藥組成物可以藉由任何適合的途徑和方式給予，包括：用於預防性和/或治療性治療的胃腸外、局部、口服或鼻內手段。在一個實施方式中，胃腸外地給予本發明的醫藥組成物。如在此使用的短語“胃腸外給藥(parenteral administration)”和“胃腸外地給藥(administered parenterally)”意指除腸內和局部給藥之外的給藥方式，通常是藉由注射，並且包括表皮、靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心內、真皮內、腹膜內、腱內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、 椎管內、顱內、胸腔內、硬膜外以及胸骨內注射和輸注。另外的適合的在體內和在體外給予本發明化合物的途徑在本領域是熟知的並且可以由熟習該項技術者進行選擇。在一個實施方式中，藉由靜脈內或皮下注射或輸注給予該醫藥組成物。
藥學上可接受的載體包括任何和所有適合的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑、抗氧化劑和吸收延遲劑以及可與本發明的化合物生理上相容的類似物。
可以在本發明醫藥組成物中採用的適合的水性和非水性載體的實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、乙醇、右旋糖、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適合的混合物、植物油(如橄欖油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油)、羧甲基纖維素膠體溶液、黃著膠和可注射有機酯(如油酸乙酯)和/或各種緩衝劑。其他載體在製藥領域是熟知的。
藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用於臨時製備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。使用此類介質和試劑用於藥物活性物質在本領域是已知的。除了在任何常規介質或試劑與活性化合物不相容的情況下，考慮了其在本發明醫藥組成物中的使用。
可以例如藉由使用包衣材料(如卵磷脂)，藉由維持所需的粒度(在分散體的情況下)和藉由使用表面活性劑來維持適當的流動性。
本發明的醫藥組成物還可以包含藥學上可接受的抗氧化劑，例如(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、 α-生育酚等；以及(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本發明的醫藥組成物還可以在組成物中包含等滲劑，如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇、甘油)或氯化鈉。
本發明的醫藥組成物還可以含有一種或多種適用於所選給藥途徑的佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、防腐劑或緩衝劑，該等試劑可以增強醫藥組成物的保質期或有效性。本發明的化合物可以與載體一起製備，該等載體可以保護化合物免於被快速釋放，如控釋配製物，包括植入物、透皮貼劑和微囊化遞送系統。此類載體可以包括明膠、單硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、可生物降解的生物相容聚合物(如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸)(單獨的或與蠟一起)或本領域熟知的其他材料。用於製備此類配製物的方法通常是熟習該項技術者已知的。參見例如，緩釋和控釋遞藥系統(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)，J.R.羅賓遜(J.R.Robinson)編輯，馬歇爾 德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，紐約，1978。
在一個實施方式中，可以將本發明的化合物配製成確保在體內恰當分佈。用於胃腸外給藥的藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用於臨時製備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。使用此類介質和試劑用於藥物活性物質在本領域是已知的。除了在任何常規介質或試劑與活性化合物不相容的情況下，考慮了其在本發明醫藥組成物中的使用。還可以將補充活性化合物摻入組成物中。
注射用醫藥組成物通常在生產和保存條件下典型地必須是 無菌且穩定的。可以將組成物配製為溶液、微乳液、脂質體或適於高藥物濃度的其他有序結構。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適合的混合物、植物油(如橄欖油)和可注射有機酯(如油酸乙酯)的水性或非水性溶劑或分散介質。可以例如藉由使用包衣材料(如卵磷脂)，藉由維持所需的粒度(在分散體的情況下)和藉由使用表面活性劑來維持適當的流動性。在許多情況下，較佳的是在組成物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。可注射組成物的延長吸收可以藉由在組成物中包括延遲抗體吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來實現。無菌可注射溶液可以藉由按需要將所需量的活性化合物與一種例如像上文列舉的成分或成分的組合摻在適當溶劑中，隨後滅菌微孔過濾來製備。通常，藉由將活性化合物摻入無菌載體中來製備分散體，該無菌載體含有基礎分散介質和例如來自上文列舉的那些的其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，製備方法的實例係真空乾燥和冷凍乾燥(凍乾)，這從其之前的無菌過濾溶液得到活性成分和任何另外的所希望成分的粉劑。
無菌可注射溶液可以藉由按需要將所需量的活性化合物與一種上文列舉的成分或成分的組合摻在適當溶劑中，隨後滅菌微孔過濾來製備。通常，藉由將活性化合物摻入無菌載體中來製備分散體，該無菌載體含有基礎分散介質和來自上文列舉的那些的其他所需成分。就用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末而言，製備方法的實例為真空乾燥和冷凍乾燥(凍乾法)，該等方法產生活性成分的粉末以及來自其先前的無菌過濾溶液的任何另外的所需成分。
調整在以上治療方法和在此描述的使用中的劑量方案，以提供最佳期望應答(例如，治療應答)。例如，可以給予單次推注，可以隨時間給予若干分次劑量或者可以由治療情況的緊迫性所指示的按比例減少或增加劑量。為了便於給藥和劑量統一，胃腸外組成物可以被配製為劑量單位形式。如在此使用的劑量單位形式係指作為針對待治療受試者的單一劑量適合的物理上離散的單位；每個單位含有經計算產生與所需藥物載體相關的所希望的治療效果的活性化合物的預定量。針對本發明的劑量單位形式的描述受指示於並且直接取決於(a)活性化合物的獨特特徵和待達到的具體治療效果，以及(b)在複合這樣的活性化合物以在個體中獲得靈敏治療的領域中固有的限制。
抗α-突觸核蛋白抗體的有效劑量和劑量方案取決於待治療的疾病或病症並且可以由熟習該項技術者確定。在劑量給予的任何一天，劑量的範圍可以從約0.0001至約100mg/kg宿主體重，並且更通常是從約0.01至約5mg/kg宿主體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg體重的範圍內。因而示例性劑量包括：從約0.1至約10mg/kg/體重，從約0.1至約5mg/kg/體重，從約0.1至約2mg/kg/體重，從約0.1至約1mg/kg/體重，例如約0.15mg/kg/體重，約0.2mg/kg/體重，約0.5mg/kg/體重，約1mg/kg/體重，約1.5mg/kg/體重，約2mg/kg/體重，約5mg/kg/體重，或約10mg/kg/體重。
具有本領域普通技術的醫師可以容易地確定並且開出所需醫藥組成物的有效量。例如，醫師可以按低於為了達到所希望的治療效果所需的水平開始給予醫藥組成物中採用的抗α-突觸核蛋白抗體，並且逐步 增加劑量直至達到所希望的效果。通常，本發明組成物的適合日劑量將是有效產生治療效果的最低劑量的化合物量。這樣一個有效劑量通常將取決於上述因素。給藥可以例如是靜脈內的、肌內的、腹膜內的或皮下的。如果希望的話，醫藥組成物的有效日劑量可以在一整天以適當的時間間隔分開為兩個、三個、四個、五個、六個或更多個子劑量來給予，任選地以單位劑型給予。雖然本發明的化合物可以單獨給予，但是較佳的是作為如上描述的醫藥組成物給予該化合物。
本發明的標記抗體可以用於診斷目的，以檢測、診斷或監測疾病或障礙。本發明提供了神經退行性或認知疾病或障礙的檢測或診斷，所述神經退行性或認知疾病或障礙包括但不限於帕金森氏病、特發性帕金森氏病、常見的帕金森氏病、彌漫性雷維體病(DLBD)、阿耳茨海默病的雷維體變體(LBV)、組合型阿耳茨海默和帕金森氏病、純自主神經衰竭和多系統萎縮，該檢測或診斷包括：(a)使用一種或多種特異性結合到α-突觸核蛋白上的抗體測定受試者的細胞或組織樣品中α-突觸核蛋白的種類和片段的存在；並且(b)將抗原的水平與對照水平(例如，正常組織樣品中的水平)進行比較，由此相比於抗原的對照水平該抗原的測定水平的增加指示疾病或障礙，或指示疾病或障礙的嚴重性。
使用本領域熟知的免疫組織化學方法，本發明的抗體可以用於測定生物樣品中的α-突觸核蛋白單體，α-突觸核蛋白的寡聚體、纖維形式或片段。有用於檢測蛋白質的其他基於抗體的方法包括免疫測定(如酶聯免疫測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA))以及基於中型發現平臺(mesoscale discovery platform)的測定(MSD)。適合的抗體標記可以用在此 類套組(kit)和方法中，並且本領域已知的標記包括酶標記，如鹼性磷酸酶和葡萄糖氧化酶；放射性同位素標記，如碘(125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(121In)和鍀(99mTc)；和發光標記，如魯米諾和螢光素酶；以及螢光標誌，如螢光素和羅丹明。
可以在體內檢測標記的抗α-突觸核蛋白抗體或其α-突觸核蛋白結合片段的存在，用於診斷目的。在一個實施方式中，診斷包括：a)向受試者給予有效量的這樣的標記分子；b)在給藥後等待一定時間間隔，以允許標記的分子在Aβ沈積位點(如果有的話)聚集並且以允許未結合的標記分子被清除至背景水平；c)測定背景水平；並且d)檢測受試者中的標記分子，這樣使得在背景水平之上的標記分子的檢測指示該受試者患有該疾病或障礙，或指示該疾病或障礙的嚴重性。根據這樣的實施方式，用成像部分標記分子，該成像部分適於使用熟習該項技術者已知的具體成像系統進行檢測。背景水平可以藉由本領域已知的多種方法測定，包括將檢測到的標記抗體的量與先前針對具體成像系統測定的標準值進行比較。可以用於本發明診斷方法的方法和系統包括但不限於電腦斷層掃描攝影術(CT)、全身掃描如正電子發射斷層掃描攝影術(PET)、磁共振成像(MRI)以及超音波檢查。
在另外的方面，本發明涉及用於在醫學中使用的抗體或其抗原結合片段。
在另外的方面，本發明涉及本發明的抗體或其抗原結合片段，用於在共核蛋白病的治療、診斷或成像中使用。
在一個實施方式中，單株抗體或其抗原結合片段被用於在帕 金森氏病從、特發性帕金森氏病、常見形式的帕金森氏病、彌漫性雷維體病(DLBD)、阿耳茨海默病的雷維體變體(LBV)、組合型阿耳茨海默和帕金森氏病、純自主神經衰竭和多系統萎縮的治療中使用。
在另外的方面，本發明涉及本發明的抗體或其抗原結合片段在生產用於對共核蛋白病進行治療、診斷或成像的藥物中的用途。
在另外的方面，本發明涉及對帕金森氏病或其他共核蛋白病進行治療、診斷或成像，包括給予有效劑量的本發明的抗體或其抗原結合片段。
較佳的是，在本發明的那些方面的用途和方法中，治療係長期的，並且較佳的是持續至少2週，如至少持續1個月、6個月、1年或更久。
在另外的方面，本發明提供了包含本發明的抗體或其抗原結合片段的套組。
Figure 105121902-A0202-12-0072-6
Figure 105121902-A0202-12-0073-7
本發明的實施方式
如應從文本和實例顯而易見的，本發明進一步涉及以下實施方式：
1.單株抗體或其抗原結合片段，能夠特異性結合到α-突觸核蛋白的胺基酸112-117內的表位(SEQ ID NO：9(ILEDMP))。
2.根據實施方式1所述的單株抗體或其抗原結合片段，與抗體GM37競爭結合所述表位。
3.根據實施方式1所述的單株抗體或其抗原結合片段，其係GM37、GM37變體1、GM37變體2或GM37變體3。
4.單株抗體或其抗原結合片段，能夠特異性結合到α-突觸核蛋白的胺基酸112-115內的表位(SEQ ID NO：19(ILED))。
5.根據實施方式1或4所述之單株抗體或其抗原結合片段，其係GM285。
6.根據以上實施方式所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含或由完整的抗體組成。
7.根據前述實施方式中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含或由抗原結合片段組成，該抗原結合片段選自下組，該組由以下項組成：Fv片段(例如單鏈Fv和二硫化物鍵合的Fv)，Fab樣片段(例如Fab片段，Fab'片段和F(ab)2片段)，和域抗體(例如單VH可變域或VL可變域)。
8.根據前述實施方式中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體係選自由以下各項組成之群組：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞型的抗體。
9.根據前述實施方式中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段展現出以下特性中的一種或多種：(i)對於α-突觸核蛋白的結合親和力(KD)，該結合親和力在0.5-10nM之間，例如1-5nM或1-2nM；(ii)抑制α-突觸核蛋白原纖維的蛋白酶截短的能力；(iii)在F28-snca轉基因小鼠中逆轉基礎突觸傳導的損傷的能力；(iv)如藉由體內微透析測量的，降低小鼠海馬迴內α-突觸核蛋白的水 平的能力；(v)當長期給予時，在帕金森氏病的大鼠模型中恢復運動功能的能力；(vi)預防α-突觸核蛋白播種(例如在體外和/或在帕金森氏病小鼠模型中不可溶的磷酸化的α-突觸核蛋白的積累)的能力；和/或(vii)在人腦中結合截短的α-突觸核蛋白的能力。
10.根據前述實施方式中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其係人的或人源化的。
11.一種單株抗體或根據實施方式1-3和6-10所述之單株抗體或其抗原結合片段，包括含有下列CDR的重鏈可變域：a)GFTFSSYAMT(SEQ ID NO：1)或具有不超過4個胺基酸差異，或不超過3個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列；b)AIRS(N/S/Q/H)GDRTD YADSVKG(SEQ ID No：2、33、34、35)或具有不超過4個胺基酸差異，或不超過3個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列；或c)AKNWAPFDS(SEQ ID NO：3)或具有不超過4個胺基酸差異，或不超過3個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列。
12.根據實施方式11所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID No：1和3以及SEQ ID No：2和33、34或35中一項的CDR。
13.根據實施方式11所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含或由選自 下組的重鏈可變域組成，該組由以下各項組成： a)
Figure 105121902-A0202-12-0076-9
Figure 105121902-A0202-12-0076-8
Figure 105121902-A0202-12-0076-10
(SEQ ID NO：7)， b)
Figure 105121902-A0202-12-0076-11
Figure 105121902-A0202-12-0076-12
Figure 105121902-A0202-12-0076-13
(SEQ ID NO：30)， c)
Figure 105121902-A0202-12-0076-14
Figure 105121902-A0202-12-0076-16
Figure 105121902-A0202-12-0076-17
(SEQ ID NO：31)，或 d)
Figure 105121902-A0202-12-0076-18
Figure 105121902-A0202-12-0076-20
Figure 105121902-A0202-12-0076-21
(SEQ ID NO：32)。
14.一種單株抗體或根據實施方式1-3和6-13所述之單株抗體或其抗原結合片段，包括含有下列CDR的輕鏈可變域：a)ASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：4)或具有不超過4個胺基酸差異，或不超過3個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列；b)GASSRAT(SEQ ID NO：5)或具有不超過4個胺基酸差異，或不超過3個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列；或c)QQYGSSPWT(SEQ ID NO：6)或具有不超過4個胺基酸差異，或不 超過3個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列。
15.根據實施方式14所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：4、5和6的CDR。
16.根據實施方式14所述的抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含或由以下胺基酸序列組成：
Figure 105121902-A0202-12-0077-22
Figure 105121902-A0202-12-0077-25
(SEQ ID NO：8)。
17.根據實施方式14所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含或由以下胺基酸序列組成：
Figure 105121902-A0202-12-0077-23
Figure 105121902-A0202-12-0077-24
(SEQ ID NO：8)。
18.根據實施方式1-3和6-17所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域以及重鏈可變域，該輕鏈可變域包含或由SEQ ID NO：8的胺基酸序列組成，該重鏈可變域包含或由SEQ ID No：7、33、34或35中任一項給定的胺基酸組成。
19.根據實施方式1-3和6-18所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域以及重鏈可變域，該輕鏈可變域包含或由SEQ ID NO：8的胺基酸序列組成，該重鏈可變域包含或由SEQ ID NO：34給定的胺基酸組成，該抗體及其抗原結合片段具有增加的熱穩定性，例如如圖27中顯示的預防聚集 和展開的增加的穩定性，與GM37 wt相比在溫度大於65℃時具有多於2%-10%的穩定性，與GM37 wt相比在溫度大於65℃時具有多於2%-8%的穩定性，或與GM37 wt相比在溫度大於65℃時具有多於2%-5%的穩定性。
20.一種單株抗體或根據實施方式1-10所述之單株抗體或其抗原結合片段，包括含有以下CDR的重鏈可變域：a)AASGFTFSRFTMT(SEQ ID NO：20)或具有不超過4個胺基酸差異，或不超過3個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列；b)AISGSGGGTS YADSVKG(SEQ ID NO：21)或具有不超過4個胺基酸差異，或不超過3個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列；或c)AKNWAPFDY(SEQ ID NO：22)或具有不超過4個胺基酸差異，或不超過22個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列。
21.根據實施方式20所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：20、21和22的CDR。
22.根據實施方式20所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含或由以下胺基酸序列組成
Figure 105121902-A0202-12-0078-26
Figure 105121902-A0202-12-0078-27
(SEQ ID NO 26)。
23.一種單株抗體或根據實施方式1-10和20-22所述之單株抗體或其抗 原結合片段，包括含有以下CDR的輕鏈可變域：d)RASQSVSRSYLA(SEQ ID NO：23)或具有不超過4個胺基酸差異，或不超過3個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列；e)GASSRAT(SEQ ID NO：24)或具有不超過4個胺基酸差異，或不超過3個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列；或f)QQYGSSPWT(SEQ ID NO：25)或具有不超過4個胺基酸差異，或不超過3個胺基酸差異，或不超過2個胺基酸差異，或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列。
24.根據實施方式23所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：23、24和25的CDR。
25.根據實施方式24所述的抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含或由以下胺基酸序列組成：
Figure 105121902-A0202-12-0079-28
Figure 105121902-A0202-12-0079-143
(SEQ ID NO：27)。
26.根據前述實施方式中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域以及重鏈可變域，該輕鏈可變域包含或由SEQ ID NO：27的胺基酸序列組成，該重鏈可變域包含或由SEQ ID NO：26中給定的胺基酸組成。
27.根據前述實施方式中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含Fc區。
28.根據前述實施方式中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，進一步包含用於增加藥劑在體內半衰期的部分。
29.根據實施方式28所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中用於增加在體內半衰期的部分係選自由以下各項組成之群組：聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基團、脂肪酸和葡聚糖。
30.根據前述實施方式中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體多肽進一步包含可檢測的部分。
31.根據實施方式30所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中可檢測的部分係螢光標記、化學發光標記、順磁性標記、放射性同位素標記或酶標記。
32.根據實施方式30或31所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該可檢測部分包含或由放射性同位素組成。
33.根據實施方式32所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該放射性同位素係選自由以下各項組成之群組：99mTc、111In、67Ga、68Ga、72As、89Zr、123I和201Tl。
34.根據實施方式30所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該可檢測部分包含或由順磁性同位素組成。
35.根據實施方式34所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該順磁性同位素係選自由以下各項組成之群組：157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。
36.根據實施方式30至35所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該可檢測部分可藉由成像技術例如SPECT、PET、MRI、光學或超音波成像檢測到。
37.根據實施方式30至36中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該可檢測部分經由連接部分間接地連接到該抗體或其抗原結合片段。
38.根據實施方式37所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該連接部分選自由以下各項組成之群組：1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)的衍生物、去鐵胺(DFO)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-異氰硫基苄基)-1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物以及1,4,8,11-四氮雜環十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物。
39.一種分離的核酸分子或其成分多肽鏈，編碼根據前述實施方式中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
40.根據實施方式39所述之核酸分子，其中該分子係cDNA分子。
41.根據實施方式30或31所述之核酸分子，編碼抗體重鏈或其可變域。
42.根據實施方式39至41中任一項所述之核酸分子，編碼抗體輕鏈或其可變域。
43.一種載體，包含根據實施方式39至42中任一項所述之核酸分子。
44.一種重組宿主細胞，包含根據實施方式39至42中任一項所述之核酸分子或根據實施方式43所述之載體。
45.一種用於產生根據實施方式1至27的任一項中所述的抗體或抗原結合片段之方法，該方法包括在允許表現所編碼的抗體或其抗原結合片段的條件下培養如在實施方式44中所定義的宿主細胞。
46.一種醫藥組成物，包含根據實施方式1至35中任一項所述之單株抗體或抗原結合片段，以及藥學可接受的載體。
47.根據實施方式1-35所述之單株抗體或其抗原結合片段，用於在醫學中使用。
48.根據實施方式1-35所述之單株抗體或其抗原結合片段，用於在共核蛋白病的治療、診斷或成像中使用。
49.根據實施方式48所述之單株抗體或其抗原結合片段，用於在帕金森氏病(包括帕金森氏病的特發性和遺傳性形式)、高歇氏病、彌漫性雷維體病(DLBD)、阿耳茨海默病的雷維體變體(LBV)、組合型阿耳茨海默和帕金森氏病、純自主神經衰竭和多系統萎縮的治療中使用。
50.如實施方式1-35所述之單株抗體或其抗原結合片段在生產用於對共核蛋白病進行治療、診斷或成像的藥物中之用途。
51.根據實施方式50所述之單株抗體或其抗原結合片段在生產用於對帕金森氏病(包括帕金森氏病的特發性和遺傳性形式)、高歇氏病、彌漫性雷維體病(DLBD)、阿耳茨海默病的雷維體變體(LBV)、組合型阿耳茨海默和帕金森氏病、純自主神經衰竭和多系統萎縮進行治療、診斷或成像的藥物中之用途。
52.一種在受試者中對共核蛋白病進行治療、診斷或成像的方法，所述方法包括向所述受試者給予有效劑量的如實施方式46所述之醫藥組成物。
53.根據實施方式48所述的供使用的抗體或其抗原結合片段，或根據實施方式50所述的用途，或根據實施方式52所述之方法，用於治療帕金森氏病(包括帕金森氏病的特發性和遺傳性形式)、高歇氏病、彌漫性雷維體病(DLBD)、阿耳茨海默病的雷維體變體(LBV)、組合型阿耳茨海默和帕金森氏病、純自主神經衰竭和多系統萎縮。
54.根據實施方式52或53所述的供使用的抗體或其抗原結合片段；或用途；或方法，其中該治療係長期的。
55.根據實施方式52所述的供使用的抗體或其抗原結合片段；或用途；或方法，其中該長期治療持續至少2週，如至少持續1個月、6個月、1年或更久。
56.根據實施方式47至55中任一項所述的供使用的抗體或其抗原結合片段；或用途；或方法，其中該受試者係人。
57.一種套組，包含根據實施方式1-35所述的抗體或其抗原結合片段。
58.根據實施方式57所述之套組，用於在醫學中使用
59.如實施方式30-35所述之單株抗體或其抗原結合片段，用於在檢測或測量所述α-突觸核蛋白在受試者的腦或體液中的存在或量中使用。
60.如實施方式59所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中所述檢測或測量包括對結合至所述α-突觸核蛋白的所述抗突觸核蛋白抗體進行體內成像。
61.如實施方式30-35所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中所述檢測或測量包括對結合至所述α-突觸核蛋白的所述抗突觸核蛋白抗體進行體外成像。
【實例】
實例1：抗體篩選
1. 免疫原和配位基生產
如圖1所示，獲得或生產以下蛋白質作為免疫原使用。使用3種免疫原使小鼠免疫，該等免疫原包括：全長重組的人α-突觸核蛋白原 纖維；包含胺基酸1-60的人α-突觸核蛋白重組蛋白質(Rpeptide，博加特(Bogart)，喬治亞(Georgia))和包含胺基酸1-119的人α-突觸核蛋白重組蛋白質。為了從全長α-突觸核蛋白中制得原纖維，使用了來自Rpeptide，博加特，喬治亞(目錄號S-1001-2)的凍乾產品。此物以1mg/ml的蛋白質濃度溶解在20mM Tris和300mM NaCl的緩衝液中。為了制得原纖維，蛋白質溶液以170μl等份在每個孔具有直徑為70μm的陶瓷珠的%孔板上以200rpm在Vortemp56搖床培養箱(美國新澤西州愛迪生市Labnet國際公司(Labnet International,Edison,NJ,USA))於37℃下培養7天，並且原纖維形成後接著加入硫磺素T並且在該等孔的一個中測量螢光。含有胺基酸1-60的重組α-突觸核蛋白溶解在水中以得到1mg/ml的濃度。
用下面的構建體製備包含胺基酸1-119的重組α-突觸核蛋白：編碼6個胺基酸的組胺酸標籤、接著是Xa因子切割位點和人α-突觸核蛋白胺基酸1-119的編碼序列的合成基因：
Figure 105121902-A0202-12-0084-31
Figure 105121902-A0202-12-0084-32
(SEQ ID NO：16)
該合成基因藉由金斯瑞(Genscript)合成並且被複製到pET24a(+)表現載體(Novagen)的NdeI-XhoI位點。
表現載體被轉化到大腸桿菌BL21並且挑選單個菌落用於表現，該表現使用來自Novagen公司(使用者協議TB383 rev.H1005)的隔夜表現自動誘導系統。規模為500ml的終培養體積。細胞藉由在6000g離心10分鐘收穫並且隨後使用BugBuster蛋白提取試劑(使用者協定TB245 Rev.0304)裂解。裂解後，樣品藉由離心分離，並且上清液被用於進一步純化。
His-標記的蛋白經5ml的HisTrap柱(GE醫療集團)純化，該柱在20mM磷酸鈉(pH 7.5)、1M NaCl(A緩衝液)中平衡。樣品上樣並使用A緩衝液沖洗後，蛋白質用20倍柱體積的A緩衝液以0.25M咪唑的梯度進行洗脫。收集5ml的級分並藉由SDS-PAGE進行分析。具有目的蛋白的級分被合併、濃縮，並應用到在10mM tris(pH 7.4)、300mM NaCl中的S200(26/60)尺寸排阻柱(GE醫療集團)。按照具有預期大小的條帶在SDS-PAGE中的存在再次合併級分。
為了去除N-末端標籤，使用Novagen公司套組(69037-3FRX)，將純化的his-標記的α-突觸核蛋白1-119與Xa因子以1：50的比例一起培養。過夜培養後，使用Xarrest瓊脂糖分批地去除Xa因子。如以上所述，最終藉由許可的HisTrap色譜純化切割的α-突觸核蛋白1-119。純化的α-突觸核蛋白1-119從流出的液體獲得並使用centricon濃縮裝置濃縮至約400μg/ml。
α-突觸核蛋白(Rpeptide)以2mg/ml在PBS中進行再水化並且在攪拌的同時逐滴地加入過氧亞硝酸鹽(100μL/mg蛋白質)。然後將亞硝基化α-突觸核蛋白在5L PBS中透析並儲存於-20℃。
多巴胺被用來氧化α-突觸核蛋白。合併相同體積的在10mM的PBS(pH7.4)中製備的200uM多巴胺-HCl(西格瑪(Sigma)P5244)溶液和在10mM的PBS(pH7.4)中的28μM α-突觸核蛋白(Rpeptide)溶液。所得的14uM α-突觸核蛋白/100uM多巴胺在37℃下過夜培養。然後，氧化的α-突觸核蛋白在PBS中透析並儲存於-20℃。
產生突觸核蛋白蛋白質的不同天然和嵌合形式以篩選抗α- 突觸核蛋白抗體的多樣性文庫。篩選的構建體包括以下：人、小鼠、大鼠和食蟹猴的α-突觸核蛋白，人β-突觸核蛋白，人γ-突觸核蛋白(圖17和18)以及最後缺乏α-突觸核蛋白殘基120-140的α-突觸核蛋白衍生物。此外，產生了一系列4個改組構建體：A-Syn-AAKK-BAP、A-Syn-BAAK-BAP、A-Syn-BBAA-BAP、A-Syn-BBKK-BAP(SEQ ID No：11-15)。該等構建體含有人α-突觸核蛋白(A)、人β-突觸核蛋白(B)和雞α-突觸核蛋白(K)(圖2)的線性延伸物。被複製的基因含有生物素受體肽(BAP)標記，該標記融合到配位基的C-末端以便於促進各配位基的位點特異性生物素醯化。生物素醯化允許配位基附著於被用於可溶性ELISA形式的珠粒。構建了哺乳動物表現載體，該載體攜帶不同的α-突觸核蛋白BAP標籤融合構建體(ASynBAP)。使用暫態轉染(Genrnab A/S)，配位基在HEK293細胞中表現。
2. 免疫
抗體HuMab-突觸核蛋白來源於HuMAb小鼠品系HCo17-BALB/c和HCo12-BALB/c小鼠的免疫、小鼠免疫球蛋白(Ig)重鏈和小鼠κ輕鏈的雙敲除(knock out)，其防止抗體的表現，該等抗體完全為小鼠的(人單株抗體；梅達瑞克斯公司(Medarex Inc.)，聖約瑟，加利福尼亞州，美國)。藉由插入人Ig重鏈和人Ig κ輕鏈座位使得不同小鼠品系成為轉基因的並且區別在於人VH(重鏈的可變域)和VL(輕鏈的可變域)基因的數目。
以14天的間隔交替使用20μg抗原經腹膜內(IP)和使用相同免疫原經皮下(SC，在尾根處)使48只小鼠免疫。進行最多八次免疫， 4次IP和4次SC。
用完全弗氏佐劑(CFA；Difco實驗室(Difco Laboratories)，底特律，密西根州，美國)中的α-突觸核蛋白免疫原進行第一次免疫，之後的免疫在不完全弗氏佐劑(IFA)中進行。當發現血清滴度足夠(針對至少兩個連續的、雙週的、篩選事件，在如上文描述的抗原特異性篩選測定中，發現1/50或更低的血清稀釋度呈陽性)時，在融合之前四天和三天，將小鼠另外用100μL PBS中的10μg α-突觸核蛋白免疫原蛋白靜脈內地(IV)強化兩次。
免疫方案示於圖1。
抗體37來自使用人全長α-突觸核蛋白原纖維的免疫方案，交替的使用具有胺基酸1-60和1-119的α-突觸核蛋白C-末端截短形式。
抗體285來自如下免疫方案，其中人α-突觸核蛋白單體1-140被用於第一個4次免疫。如果沒有滴度，免疫使用原纖維(腹膜內/皮下)繼續，否則使用單體繼續。
3. HuMab融合瘤產生
將具有如上定義的足夠抗原特異性滴度發生的HuMAb小鼠處死並且收集腹主動脈與腔靜脈兩側的脾臟和淋巴結。基本上根據製造商的說明書，使用CEEF 50電融合系統(細胞脈衝科學(Cyto Pulse Sciences)，葛籣伯尼，馬里蘭州，美國)藉由電融合進行脾細胞和淋巴結細胞與小鼠骨髓瘤細胞系的融合。將融合的細胞接種在融合培養基中，該培養基含有10% Fetal Clone I牛血清(普達生物公司(Perbio))、1mM丙酮酸鈉(康伯司公司(Cambrex))、0.5U/mL青黴素、0.5U/mL鏈黴素(康伯司公司)、50 μM 2-巰基乙醇(英傑公司)、600ng/mL白介素6(IL-6)(施特拉特曼公司(Strathmann))、1 x HAT(西格瑪公司(Sigma))和0.5mg/mL卡那黴素(英傑公司)，在HyQ mADCF-Mab(普達生物公司)中。十天之後，收穫上清液並且將細胞培養基更換為收穫培養基，該收穫培養基含有10% Fetal Clone I牛血清、0.5U/mL青黴素、0.5U/mL鏈黴素、600ng/mL IL-6和1 x proHT(康伯司公司)，在HyQ mADCF-Mab中。融合瘤培養物的上清液藉由初級篩選試驗進行篩選。上清液的特徵在於結合到八個不同的配位基。該等包括4種直向同源物：人、小鼠、大鼠和食蟹猴的人α-突觸核蛋白β-突觸核蛋白和人γ-突觸核蛋白(SEQ ID NO 37-41)，並且最後測試它們結合至缺乏α-突觸核蛋白殘基120-140的人α-突觸核蛋白衍生物的能力。
使用自動化液體處理系統(Genmab A/S)以高通量懸浮ELISA形式進行抗α-突觸核蛋白抗體的篩選。平板的讀數係由兩個系統進行的，來自應用生物系統公司(Applied Biosystems)的FMAT 8200被用來讀384孔板並且來自分子裝置公司(Molecular Devices)的ImageXpress Velos細胞分析儀被用來讀取1536孔板。
在初級篩選中，複製以結合8種不同配位基的能力為特徵。該等包括一系列的4個改組構建體：A-Syn-AAKK-BAP、A-Syn-BAAK-BAP、A-Syn-BBAA-BAP、A-Syn-BBKK-BAP(SEQ ID NOs：11-15)，α-突觸核蛋白120-140缺失-BAP，硝化的人α-突觸核蛋白-BAP和氧化的人α-突觸核蛋白-BAP。
簡言之，潛在包含α-突觸核蛋白特異性抗體的血清或上清液被加入到珠粒以允許結合於α-突觸核蛋白和/或α-突觸核蛋白衍生的構 建體。抗α-突觸核蛋白抗體的結合係使用螢光共軛、DyLight649共軛的山羊抗人IgG、Fc特異性來檢測。兩種已知的小鼠抗α-突觸核蛋白抗體，LB509和Syn211，作為陽性對照被列入篩選。為了確保α-突觸核蛋白抗體的特異性檢測，在384孔格式滴度篩選中，使用抗α-突觸核蛋白的血清池作為陰性對照，而在基於1536孔格式8珠粒的實驗中使用人ChromPure IgG。
將來自最佳初級孔的雜種瘤細胞接種於半固體培養基中，該培養基由40%殖株培養基(CloneMedia)(基因有限公司(Genetix)，漢普郡，英國)和60% HyQ 2x完全培養基(Hyclone公司，沃爾瑟姆，美國)製成。對於每個初級孔，接種Genetix黑色6孔板的孔。使用ClonePix系統(基因有限公司)從每個孔中挑取25個亞殖株。將亞殖株挑取在收穫培養基中。七天之後，針對突觸核蛋白特異性人IgG結合再次對亞殖株上清液進行篩選並且使用Octet(Fortebio公司，門洛派克，美國)測量人IgG濃度。從每個初級孔選擇最佳亞殖株並且在僅含有600ng/mL IL-6、0.5U/mL青黴素、0.5U/mL鏈黴素和1 x proHT的擴增培養基中進行擴增。將亞殖株從一個96孔板孔擴增到一個24孔板孔，到四個24孔板孔，到六個6孔板孔。藉由這種方法得到的殖株被指定為初級殖株(PC)。
使用Octet 384RED(Fortebio公司，美國門洛派克(Menlo Park,USA))進行另外的抗體結合研究。藉由稀釋於樣品稀釋劑(Fortebio公司，品號18-5028)中製備2μg/ml的HuMab抗體溶液。將胺反應性傳感蛋白(Fortebio公司，品號18-0008)用於HuMab的固定。在偶合至胺反應性傳感蛋白之前，將HuMab稀釋在MES pH 6.0緩衝液(18-5027)中。如下在30oC和1000rpm下進行偶合：將胺反應性傳感蛋白在PBS中預濕並且隨後 用EDC/NHS(Fortebio公司，品號18-1033/18-1034)活化溶液(根據製造商的說明書)活化300秒。在600秒期間用HuMab固定活化的傳感蛋白。
在Octet中，37和285結合至重組的人、食蟹猴和小鼠α-突觸核蛋白，並且不結合人β-或γ-突觸核蛋白，這顯示在圖2中。
4. 突觸核蛋白特異性HuMab可變域的序列分析和在表現載體中的複製
從0.2至5 x 106個融合瘤細胞製備總RNA並且根據製造商的說明書，使用SMART RACE cDNA擴增套組(克羅泰克公司(Clontech))從100ng總RNA製備5’-RACE-互補DNA(cDNA)。藉由PCR擴增VH和VL編碼區並且框內地直接在p33G1f和p33 κ表現載體(含有人類IgG1./κ恒定域編碼序列)中藉由連接獨立複製進行複製(阿斯拉尼迪斯，C.(Aslanidis,C.)和P.J.德容(P.J.de Jong)，核酸研究(Nucleic Acids Res)1990；18(20)：6069-74)。對於每個抗體，對16個VL殖株和16個VH殖株進行測序。選擇具有正確開放閱讀框(ORF)的殖株進行進一步研究和表現。使用293fectin在FreestyleTM 293-F細胞中暫態共表現重鏈和輕鏈的所有組合的載體。
在GM37的情況下VH區的測序確定了在CDR3結構域位置106處的額外的半胱胺酸。為了消除由於二硫鍵形成導致的錯誤折疊的可能性和抗體活性的潛在損失，將在位置106處的半胱胺酸突變為絲胺酸。
基於來源於融合瘤PTA-8221(美國專利20080175838)(SEQ ID NO：42和43)的VH和VL序列產生對比抗體9E4。
5. 抗體的表現/純化
使用pTT5載體和PEIpro作為暫態轉染試劑(加拿大國家研究理事會(National Research Council of Canada))，藉由在HEK293 6E細胞中進行轉染產生抗體。總之，使用PEIpro(VWR)將重鏈和輕鏈轉染到HEK293細胞中，並且轉染24小時後向細胞補充TN1(西格瑪公司)。細胞生長直至生存力接近50%，並且抗體的產量藉由簡單的IgG滴度(賽默公司(Thermo))測量。將培養物上清液經0.2μm死端過濾器進行過濾，裝載在5mL蛋白A柱(rProtein A FF，阿莫仙生物科學公司(Amersham Bioscience))上並且用0.1M檸檬酸-NaOH(pH 3)洗脫。將洗脫物立即用2M Tris-HCl(pH 9)中和並且用12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl，pH 7.4(貝朗公司(B.Braun))，O/N透析。透析之後，將樣品經0.2μm死端過濾器進行無菌過濾。藉由SDS-PAGE確定純度並且藉由比濁法和280nm處的吸光度測量濃度。將純化的抗體等分並且儲存在-80℃下。
實例2：利用表面電漿共振表徵抗體
使用BIAcore®3000測定抗體與α-突觸核蛋白的即時結合。在CM5晶片(BIAcore®)的第一流動細胞(Fc1)和第二流動細胞(Fc2)中藉由胺耦合的多株兔抗小鼠抗體(部分小鼠抗體捕獲套組(Mouse Antibody Capture Kit)，GE醫療集團，目錄號：BR-1008-38)製備捕獲表面。在Fc2中以達到約500RU的配位基水平所需的濃度捕獲小鼠抗體。在Fc1-2中以30μl/min注射分析物(ASynBAP)之前，基線被允許穩定10分鐘。ASynBAP分別以100-3200nM和25-3200RU運行。將最高濃度在每個滴定系列中重複一次運行。每一個週期結束時，用10mM甘胺酸-HCl(pH 1.7)(30秒注射)再生表面以去除捕獲的小鼠抗體和分析物。HBS-EP(GE醫療集團，目錄號： BR-1001-88)被用作運行緩衝液並且在所有實驗中的樣品稀釋和試驗在25℃下運行。在獲得前所有樣品保持在4℃。
將記錄在Fc1中的響應(其中捕獲抗體已被固定化但沒有α-突觸核蛋白抗體被捕獲)從在Fc2中的響應減去。使用BIA評估軟體(BIAevaluation software)版本4.1.1，將1：1或2：1結合演算法適合於數據集。顯示抗體37、285和9E4結合至人α-突觸核蛋白的結果可以在圖3、4和5中看到。
實例3：表位作圖
使用在Pepscan(Pepscan Zuidersluisweg 2 8243 RC，荷蘭萊利斯塔德(Lelystad,The Netherlands))上的重疊線性肽的陣列進行抗體與α-突觸核蛋白的表位作圖。抗體對每個合成的20聚體肽的結合在基於Pepscan的ELISA中進行檢測。覆蓋α-突觸核蛋白的整個編碼序列的線性肽陣列，以及具有氧化的蛋胺酸或亞硝基酪胺酸的所有肽，用初級抗體溶液(在4℃下過夜)培養。洗滌後，在25℃用1/1000稀釋的抗體過氧化物酶共軛物(SBA,cat.nr.2010-05)將肽陣列培養1小時。洗滌後，加入過氧化物酶底物2,2'-連氮基-二-3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽(ABTS)和2μl/ml的3% H2O2。1小時後，測定顯色。用電荷耦合裝置(CCD)-攝像機和影像處理系統定量顯色。對於數據處理，從CCD攝像機獲得範圍從0到3000mAU的值，類似於標準的96孔板ELISA閱讀器。將結果進行量化，並存儲到Peplab數據庫。偶爾一個孔包含導致假陽性值的氣泡，該卡被手動檢查並且氣泡造成的任何值都記錄為0。抗體37和285分別與包含序列ILEDMP或ILED的肽的結合數據可在圖7中看到。
實例4：來自雷維體失智患者扣帶皮層的人腦勻漿的α-突觸核蛋白的免疫沈澱反應
藉由免疫沈積作用分析抗體結合並拉低來自人DLB或健康對照(標有*)的扣帶皮層粗勻漿α-突觸核蛋白的能力。在低溫恒溫器中解剖來自人的扣帶皮層的冷凍樣品(從組織溶液公司(Tissue Solutions)，蘇格蘭獲得)，並且添加100mg樣品到1600μl celLytic M細胞裂解試劑(西格瑪C2978)中，該試劑包含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(羅氏公司(Roche))。使用Precellys珠勻漿器(貝爾坦技術公司(Bertin technologies)，法國)，以4×30秒、5000rpm使腦組織均勻化直到樣品完全溶解。溶液在3000×g離心並將上清液用作免疫沈澱作用的粗勻漿。
對於免疫沈澱作用，使用製造商的說明(英國佩斯利生命技術公司(Life Technologies,Paisley,UK))，將10μg抗體與磁性免疫磁珠(Dynabeads)蛋白G珠混合。粗腦勻漿物在裂解緩衝液(西格瑪)中稀釋30倍。抗體偶聯的免疫磁珠(dynabeads)與500ul稀釋的勻漿混合，並在室溫、旋轉器中連續混合條件下培養90分鐘。培養後，根據製造商的說明(免疫磁珠G試驗方案(Dynabeads G protocol)，英國佩斯利生命技術公司(Life Technologies,Paisley,UK))，在洗滌緩衝液中洗滌珠粒，並且使用非變性洗脫緩衝液洗脫結合的抗原。免疫沈澱作用的產率用蛋白質西方墨點顯現，使用的是檢測的小鼠單株抗人α-突觸核蛋白抗體(4B12，賽默科技公司(Thermo Scientific))進行。代表被拉低的α-突觸核蛋白的不同分子量形式的條帶圖案在37、37變體2和285抗體與對比抗體9E4之間不同，因為37、37v2和285抗體可以免疫沈澱主要的α-突觸核蛋白種類：全長 α-突觸核蛋白(FL asyn 1-140)和C-末端終端截短種類(1-135和1-119/122)，而抗體9E4不能免疫沈澱截短種類1-119/122。圖9。
實例5：細胞培養物中的抗體抑制α-突觸核蛋白原纖維的蛋白酶截短
重組的α-突觸核蛋白單體和原纖維可以藉由在培養基中的初級神經元攝取。如在圖10中示意性示出，在神經元中攝取α-突觸核蛋白後，它可以藉由細胞內的蛋白酶，如鈣蛋白酶I處理，該鈣蛋白酶I在胺基酸119/122具有主要的蛋白酶敏感位點。為了調查蛋白酶截斷α-突觸核蛋白，如在Elvang等人(2009)中所述製備小鼠初級皮層神經元(Elvang等人，神經化學雜誌(J Neurochem)2009，110(5)：1377-87)，並且在DIV3(體外3天)用阿糖胞苷處理以抑制星形細胞的生長。在DIV4(在體外4天)，用超音波(5分鐘，在杯角超音波器中以50%的功率)預形成的α-突觸核蛋白原纖維(PFF)以0.7μM的終濃度單獨或與指定濃度的抗體一起處理神經元。培養24小時後，將培養基收穫並裂解細胞。使用4B12抗體(圖11A)(Pierce Ma1-90346)和第二抗小鼠抗體，對培養基和細胞裂解物都進行蛋白質西方墨點。使用4B12+抗小鼠探測後，將墨點剝離並用抗人IgG抗體進行再探測。在使用4B12的墨點上可以看出，在使用PFF單獨處理細胞的培養基中，在14和12kDa有很強的條帶，其中14kDa代表全長α-突觸核蛋白(FL-ASYN)並且12kDa代表C末端截短的片段1-119/122(CT-asyn)。除此之外，還有較高分子量條帶，最有可能代表耐SDS的低聚物種類。使用同種型對照抗體B12共處理沒有改變蛋白水解或攝取的這種模式。
在來自使用原纖維與37一起處理的細胞的培養基中，主要 有全長α-突觸核蛋白(14kD)和少量的末端截條帶(12kD)。在來自使用原纖維與37一起處理的細胞的細胞裂解物中，只有全長α-突觸核蛋白，這表明37防止FL-α-突觸核蛋白的裂解。此外，FL-α-突觸核蛋白的總量相對於只用PFF或B12對照抗體處理的細胞減少了。若干團體已經顯示α-突觸核蛋白可以被鈣蛋白酶-1裂解(蓋姆斯(Games)等人，美國病理學雜誌(Am J of Pathol)，Vol.182，No.3，2013年3月；裡奇(Ritchie)等人，健康(Health)，Vol.4，特刊，1167-1177，2012；Mishizen-Eberz，生物化學(Biochemistry)，2005，44，7818-7829；達夫迪(Dufty)等人，美國病理學雜誌(Am J of Pathol)，Vol.170，No.5，2007年5月)。鈣蛋白酶-1對原纖維α-突觸核蛋白的裂解位點已被發現是在區域114-122(Mishizen-Eberz，神經化學雜誌(J of Neurochem)，86，836-847，2003)。在體內轉基因動物和人腦的1-119/122似乎是α-突觸核蛋白中主要的裂解產物，裂解可能是天門冬胺酸119或天冬醯胺122後，其被脫醯胺基為天冬胺酸，並且由鈣蛋白酶或具有類似的切割特異性的另一個蛋白酶切割。該等結果表明，抗體37能夠抑制α-突觸核蛋白的C-末端截短。抗體GM37的表位與酶鈣蛋白酶-1結合位點重疊，所以37結合到α-突觸核蛋白可以直接抑制由鈣蛋白酶-1介導的結合和裂解(圖10和11)。
285的表位與37的表位重疊，並也被預期抑制蛋白酶裂解。37v2的胺基酸序列與37僅在CDR的一個胺基酸處不同，並與37具有相似的結合，因此，它也被預期以與37類似的方式抑制蛋白酶切割。為了調查抗體的效應是否是劑量依賴性的，使用PFF和抗體共同加入初級皮質神經元來建立2.4小時實驗。PFF的濃度係穩定的(10μg/ml)，然而被測試的對 照抗體B12的濃度和抗體37、37v2和285的濃度為10、5、1和0.1ug/ml。使用1904/4B12抗體(艾碧康公司(Abcam))檢測蛋白質西方墨點上的α-突觸核蛋白，該1904/4B12抗體在區域103-108具有表位，從而結合到全長和C末端截短的α-突觸核蛋白(圖11B)。如從圖11B中可以看出，GM37、37v2和GM285具有蛋白酶裂解的劑量依賴性抑制，在抗體的高濃度具有幾乎完全的裂解抑制。
實例6：抗體介導的抑制α-突觸核蛋白聚集體在細胞培養物中播種
若干研究已經表明外源性添加的重組α突觸核蛋白纖絲狀聚集體可進入細胞並招募內源性α-突觸核蛋白，以及在體外和體內誘導α-突觸核蛋白聚集和磷酸化，這類似於LB。(Volpicelli-Daley等人，2011；盧克(Luk)等人，2012a；盧克(Luk)等人，2012b；Recasens等人，2013；Peelaerts等人，2015)。為了藉由重組α-突觸核蛋白種子研究內源性小鼠α-突觸核蛋白的播種，如上製備的小鼠初級皮質神經元被接種在96孔板(每孔15,000個細胞)。在體外培養(DIV)第5天，50%的培養基被改變並補充阿糖胞苷(終濃度1uM)。在DIV6，使用α-突觸核蛋白纖絲材料，無論是粗的原纖維種子或純種子，一半培養基被改變成具有神經膠質條件的培養基。粗的原纖維種子由重組的單體人α-突觸核蛋白製成，其從細菌中分離並且單體藉由Amicon Ultra 100.000切斷濾器(密理博公司(Millipore)，目錄號UFC510096)過濾，並在PBS(pH 7.4)中調節至1mg/ml的濃度。為了製成原纖維粗種子，單體溶液在加熱攪拌器中(37℃下)並伴隨連續攪拌(800rpm)培養，直到達到範本水平(用硫磺素S藉由日常措施評估)。為了儘量減少蒸發，加入礦物油的液滴以覆蓋溶液。培養的總時間為5-7 天，純種子從粗的原纖維種子製成，離心原纖維種子以純化它們並且將聚合的顆粒再懸浮在新鮮的PBS中並被超音波處理。在DIV6，抗體與α-突觸核蛋白粗種子一起一次性加入。將在初級神經元中一半培養基每週替換成神經膠質調節的培養基以保持它們直到DIV21。固定神經元，並使用對α-突觸核蛋白胺基酸S129的磷酸化特異的兔抗體(艾碧康51253)，接著使用螢光標記的抗兔抗體使磷酸突觸核蛋白染色，利用自動螢光顯微鏡(Cellomics Arrayscan)量化螢光。核在一個通道進行檢測，並確定有效細胞的數量。在核周圍預先定義的環形成區域中的另一通道中檢測磷酸化α-突觸核蛋白斑點，從而代表細胞的細胞質。計算每個細胞的斑點的平均數量。細胞染色的實例示於圖12A。磷酸化α突觸核蛋白斑點不會出現在未經處理的神經元。粗的或純種子培養的神經元(每孔1-10ng)誘導α-突觸核蛋白的磷酸化(圖12A)。在神經突，磷酸化突觸核蛋白以斑點或點狀出現，且有的磷酸化突觸核蛋白在神經突以伸長的形式出現。
對於級分研究，在磷酸鹽緩衝鹽溶液(PBS)中收穫細胞並離心。沈澱物再懸浮在含有蛋白酶抑制劑的1% Triton緩衝液中。樣品保持在冰上15分鐘，隨後進行超音波處理。將樣品在100,000×g、4℃下離心30分鐘。上清液被收集並標記為可溶級分。將沈澱在Triton緩衝液中洗滌一次，並重新懸浮在1% SDS緩衝液中，隨後進行超音波處理。樣品在100,000×g再次離心30分鐘。收集呈不溶性級分的上清液。測定蛋白質濃度並且樣品在4%-12% SDS_PAGE凝膠上運行，墨點於膜上，並且藉由4B12/1904抗體(賽默科技公司：MA1-90346人突觸核蛋白)、S129P-asyn抗體(艾碧康51253)和小鼠突觸核蛋白抗體(細胞信號-D37A6)分別檢測α-突觸核 蛋白和磷酸化α-突觸核蛋白(S129P)。
圖12B顯示具有和不具有粗種子時初級神經元的可溶性和不溶性級分的蛋白質西方墨點。從圖12B可以看出，種子的加入導致內源性小鼠α-突觸核蛋白及p-S129-α-突觸核蛋白和磷酸化小鼠α-突觸核蛋白的多聚體在細胞的不可溶級分中積累。
為了測試抗體是否能抑制播種，α-突觸核蛋白的突觸核蛋白種子以6.6nM(10ng/孔)的濃度被使用。不同濃度的抗體和α-突觸核蛋白種子在DIV6上一起添加以獲得劑量響應(從最高抗體濃度133nM開始降至133pM)。神經元再固定，並使磷酸突觸核蛋白(艾碧康51253)染色，並且細胞中的螢光使用自動螢光顯微鏡(Cellomics arrayscan)進行定量。每個孔的斑點/點在Cellomics arrayscan中進行計數。從圖12C中可以看出，抗體37、37v2和抗體285都以劑量依賴性的方式減少神經元中的α-突觸核蛋白磷酸化，其中使用約5nM的EC50時37、37v2和285具有類似的最大抑制(70%-75%左右)。使用最高濃度(133nM)的抗體治療後細胞蛋白分級為可溶性和不溶性級分，顯示抗體37、37v2和285抑制重組粗種子的截短和C末端截短片段(CT a-ayn)的積累，並降低了磷酸化的內源性小鼠α-突觸核蛋白和小鼠α-突觸核蛋白的聚集形式在不溶性級分中的積累，如在圖12D中所示。
實例7. α-突觸核蛋白抗體在體內急性電生理作用
人α-突觸核蛋白的高表現水平存在於F28-snca轉基因小鼠的海馬迴中，該小鼠係在小鼠α-突觸核蛋白啟動子的控制下過量表現野生型α-突觸核蛋白的模型(韋斯特隆德‧M(Westerlund M)等人，分子細胞 神經科學(Mol Cell Neurosci)，2008年12月，39(4)：586-91)。藉由體內電生理學對4至6個月大的雄性F28-snca轉基因和年齡匹配的對照小鼠中的海馬迴CA1區域的突觸傳遞和可塑性進行了評估。數據表明，相比年齡匹配的對照小鼠，基礎突觸傳遞在F28-snca轉基因小鼠中顯著受損(圖13)。
年齡為4至6個月的F28-snca轉基因小鼠和年齡匹配的對照雄性小鼠(CRO繁殖，Taconic Europe A/S)單個安置在受控制的溫度(22℃±1.5℃)和濕度(55%-65%)條件下並保持在12：12小時明/暗循環中(在06：00點開燈)。食物和水可隨意獲得。
動物用尿烷(1.2g/kg)經腹膜內(i.p.)注射麻醉。然後，將小鼠固定在立體定位框架，其溫度藉由加熱墊調節至37.5℃，並且顱骨被暴露。鉑絲置於額骨作為參考的作用，並且鑽出另外的孔用於在海馬迴中插入記錄和刺激電極，該孔根據大鼠腦立體定位圖譜集(Paxinos和佛蘭克林，立體定位座標中的小鼠腦(Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates)，第4版，2001)處於以下座標：記錄，前囟後1.5-1.7mm，中線側面1.0-1.2mm，大腦表面下方1.4-1.7mm；刺激，前囟後1.8-2.0mm，中線側面1.5-1.7mm，大腦表面下方1.5-1.7mm。在整個記錄持續時間動物留在立體定位架內，並定期檢查其麻醉水平。
每30秒藉由謝弗側枝的電刺激在CA1區誘發場電位(fEPSP)，並且調節記錄電極的深度直到響應單極矩形脈衝記錄下負fEPSP。誘發的fEPSP斜率被測定為fEPSP的最大振幅的30%和70%之間。
一旦最佳fEPSP被誘導，基礎突觸傳遞藉由刺激強度和誘發的fEPSP(輸入輸出關係)的斜率之間的關係進行評估。不同刺激強度為0、 25、50、75、100、150、200、300、400、和500μA，並且以增加的順序依次施加，每個強度重複2至3次。相比年齡匹配的對照小鼠，基礎突觸傳遞在F28-snca轉基因小鼠中發現被顯著損害。
在F28-snca轉基因小鼠中基礎突觸傳遞所識別的損傷被用來測試GM37、GM285和對比h9E4阻止α-突觸核蛋白介導的效應的能力。
以15mg/kg(i.p.)的劑量給予單劑量抗體3至6小時後在所有實驗中進行記錄。如果可能，在每個動物的兩個海馬迴中都記錄基礎突觸傳遞，並且記錄為單獨的實驗。
使用h9E4急性治療在F28-snca轉基因小鼠內誘導基礎突觸傳遞損害的顯著逆轉(Tg-snca+h9E4對比Tg-snca+PBS，p=0.002，圖14)。然而，藉由h9E4進行的逆轉只是局部的，如相比使用PBS處理的同窩仔畜中基礎突觸傳遞的顯著差異所指示的(p=0.007)。
使用GM37急性治療在F28-snca轉基因小鼠內誘導基礎突觸傳遞的損害的顯著逆轉(Tg-snca+GM37對比Tg-snca+PBS，p=0.004，圖15)。使用GM37處理的轉基因小鼠的基礎突觸傳遞與使用PBS處理的同窩基礎突觸傳遞沒有顯著不同，表示損害的完全逆轉(圖15)。
GM285也在F28-snca轉基因小鼠內誘導基礎突觸傳遞損害的顯著逆轉(圖16)。使用GM285處理的轉基因小鼠的基礎突觸傳遞與使用PBS處理的同窩基礎突觸傳遞沒有顯著不同，表示損害的完全逆轉。
實例8.用於評估在清醒自由活動動物的腦中人α-突觸核蛋白的微透析
使用推拉式微透析方法來評估在腦間質液(ISF)中的人α-突觸核蛋白的水平。將小鼠在受控的溫度(22℃±1.5℃)和濕度條件 (55%-65%)下單獨飼養並且保持12：12小時光/暗循環(在06：00h時開燈)。食物和水可自由採食。目前的研究係在F28-snca轉基因小鼠(50-54週齡)的海馬迴內進行。為了使得能夠在海馬迴中進行微透析，將小鼠用異氟烷麻醉並且將腦內引導套管(CMA)立體定向地植入腦中，從而根據大鼠腦立體定位圖譜集(the atlas of Paxinos and Franklin 2001)將微透析探針定位在海馬迴中(探針尖的座標：前囟後面3.1mm並且前囟側面2.8mm，並且相對於硬腦膜1.3mm)。固定螺栓和丙烯酸接合劑被用於固定導向套管。套管植入後，允許小鼠在透析前從手術恢復2-3天。
在實驗的當天，2-mm、1000kDa截斷CMA探針藉由引導套管插入。探針被連接到具有兩個通道(MAB20；Microbiotech)的微透析蠕動泵並以推拉模式運行。微透析探針的入口管連接到將人工腦脊液(aCSF；147mM NaCl、2.7mM KCl、1.2mM CaCl2、0.85mM MgCl2)灌注到探針的蠕動泵。蠕動泵也被連接到出口管以防止藉由拉動流體穿過管時灌注液從探針中丟失。作為灌注緩衝液，在使用的當天用人工CSF將25%牛血清白蛋白組分V(西格瑪公司)稀釋至0.2%，並通過0.1-μm濾膜過濾。在不連接探針的情況下確定泵的實際流速。在取樣前後對樣品管進行稱重持續給定時間段並且計算流速。然後將泵設置為1μL/min的恒流。在整個實驗期間使用120分鐘的採樣方案。為了避免組織損傷的干擾，探針植入後實驗視窗設置為從14小時至48小時。實驗開始後14-16小時，注射(腹膜內)15mg/kg的GM37、人9E4或同種型對照(抗HEL)，並且收集另外的6個樣品(收集12小時)。透析液被儲存在-80℃。人α-突觸核蛋白的濃度藉由ELISA(Covance公司的ELISA套組)進行測定。
將每一個動物抗體治療之前2-3個基礎值(4h-6h)的平均值當作基線並設為100%。採用雙因素方差分析(ANOVA)與重複測量來評估數據以評估統計相關性。在海馬迴中人α-突觸核蛋白的基礎水平為8.1±1.1ng/ml(平均值±SEM，n=25，未對體外透析探針恢復進行修正)。相比兩個對比抗體(人9E4和同種型對照(抗HEL))，GM37的給予誘導了F28小鼠海馬迴內人α-突觸核蛋白較大減少。(圖17)。
實例9：體內α-突觸核蛋白抗體的長期效果。抗體GM37改善大鼠帕金森模型中的運動表型。
人α-突觸核蛋白在大鼠中腦的多巴胺能神經元中的靶向表現可以使用重組腺相關病毒載體(rAAV)來實現，並與在黑質中的多巴胺能細胞的漸進損失以及運動障礙有關。
藉由注射AAV2/5血清型的腺相關病毒，成年雌性Sprague-Dawley大鼠(225-250g)被用於在黑質(SN)中表現人α-突觸核蛋白，如前所述，該腺相關病毒包含雞β-肌動蛋白啟動子、具有來自巨細胞病毒的啟動子的增強子元件、接著是人α-突觸核蛋白的cDNA和WPRE元件(徐‧L(Xu L)、達利‧T(Daly T)、高‧C(Gao C)、Flotte TR、宋‧S(Song S)、伯恩‧BJ(Byrne BJ)、桑茲‧MS(Sands MS)、龐德‧KP(Ponder KP)(2001))。在這個模型中，已經表明，人α-突觸核蛋白表現導致多巴胺能神經元的神經變性。Maingay M等人，中樞神經系統光譜(CNS Spectr)，2005年3月，10(3)：235-44)。為了檢驗在此模型中α-突觸核蛋白的治療性抗體的效果，在病毒注射前2至4天開始抗體治療，並且該治療持續直到研究結束(圖18)。以相同體積(5ml/kg：IP)的PBS給藥作為對照。GM37 以15mg/kg(IP)的劑量每週給藥兩次。包含人野生型α-突觸核蛋白或綠色螢光蛋白(GFP)基因的病毒顆粒(rAAV2/5)被單側注入到SN中。將動物用Hypnorm®和Dormicum®的組合以2.0ml/kg(皮下)麻醉並放置在立體定位架。它們的溫度係藉由加熱墊調節至37.5℃，並暴露其頭骨。根據大鼠腦立體定位圖譜集(Paxinos和沃森(Watson)，1998)，以下列座標在右SN上面鑽孔：前囟後部5.5mm和前囟側面2.0mm。在低於硬腦膜物質7.2mm深度進行3μL的rAAV2/5-α-syn或rAAV2/5-GFP的單次注射，並且使用Hamilton注射器以0.2μL/min的流速連接到立體注射器。針留在原地另外5分鐘以允許在SN下載體擴散。手術後，將動物返回到它們的飼養籠，並放置在加熱的環境中允許它們從麻醉中恢復。在AAV注射之前以及AAV注射3、7和10週以後，評價在圓柱體試驗中運動不對稱的測試。呈現的數據對應於使用右前爪相比左和右前爪全部使用兩者之間的比率。病毒注射10週後，拍攝每個動物在圓柱體中的表現共計5分鐘，並且在測試的最後一天對5分鐘內使用左前爪和右前爪觸摸的數量進行人工計分。相比AAV-GFP注射的大鼠，第10週在AAV-syn中存在顯著的損害(p=0.012)。顯示了對於GM37處理的動物的逆轉趨勢，因為它們的表現與GFP大鼠不同(對於gm37分別為p=0.163和p=0.407)。這一發現表明，抗體GM37能夠改善在此大鼠模型中帕金森病的運動表型(圖18和19)。
實例10：體內α-突觸核蛋白抗體的長期效果。抗體GM37抑制內源小鼠α-突觸核蛋白聚集體和磷酸化的播種
將重組蛋白製成的α-突觸核蛋白預成形的原纖維注射到野生型小鼠的背側紋狀體來招募內源小鼠α-突觸核蛋白，並在皮層、杏仁核 和黑質的神經元內誘導形成Ser-129磷酸化的聚合體(盧克(Luk)等人，2012，科學(Science)，2012年11月16日，338(6109)：949-53)。為了看出α-突觸核蛋白特異性單株抗體GM37係否能夠在體內降低α-突觸核蛋白原纖維誘導的磷酸化α-突觸核蛋白內含物形成的出現，使用了總共45只小鼠。小鼠被給予了30mg/kg GM37(腹膜內)、15mg/kg GM37(靜脈內)或運載體(腹膜內)(PBS)。一天后，將小鼠麻醉並立體定位在具有2ul重組人α-Syn的粗種子的一個半球中，如先前所描述來制得(實例6)(每只動物總共2μg粗種子)。為了注入粗種子，藉由鑽孔打開顱骨並且將單個玻璃吸管(座標：前囟前方+0.5mm，中線側面+2.0mm)插入右側前腦以將接種體定位於背側紋狀體(硬腦膜下+2.6mm)。在恢復之後，小鼠每週接受腹膜內或靜脈內抗體注射，直到45天被處死。15只/組的組的給藥係藉由靜脈注射15mg/kg的GM37、腹膜內注射30mg/kg的GM37、或腹膜內注射PBS(10ml/kg)，每週一次。
為了在血漿中測量抗體的濃度，下一次注射之前每週一次採集臉頰血液，即最後一次注射後7天。由2000g旋轉獲得血漿，在室溫下培養15分鐘，隨後在-20℃冷凍上清液。在研究結束時採集CSF樣品並在-20℃冷凍。血漿和CSF樣品藉由MSD進行了分析以確定人IgG的濃度。簡言之，小鼠抗-人IgG(殖株MH16-1(M1268)被用於捕獲，血漿或CSF在孔中培養，接著是磺基-TAG山羊抗人作為檢測抗體(MSD目錄號：R32AJ-1)。藉由MSD從電化學發光分析平板。
在血漿中的抗體水平顯示於圖20B中，並且顯示六週內抗體血漿濃度的劑量依賴性增加以及血漿抗體的積累。在csf的抗體水平顯示 於圖20C中，並且顯示0.1%左右的血漿抗體水平可在csf中進行測量。
在將α-突觸核蛋白原纖維種子注射45天后，將小鼠麻醉，用PBS經心臟灌注，接著用中性緩衝的多聚甲醛(4%)灌注。取出大腦並在中性緩衝的多聚甲醛中固定後培養過夜。藉由神經科學關聯物在45μm厚的連續切片上進行免疫組化法。簡要地說，使用MultiBrain®技術，每塊最多25個小鼠大腦包埋在一起，分成3塊，在冠狀面冷凍切片為45μm厚，並收集到含有抗原保存溶液的杯中。每第六節與抗體染色成Ser-129磷酸化α-突觸核蛋白(抗α-突觸核蛋白(磷酸S129)抗體[PSYN/81A]ab184674)以揭露Ser129磷酸化α-突觸核蛋白反應性結構。
藉由人工計數免疫反應陽性細胞來進行pSyn病理的定量，該細胞來自於從每第六部分的覆蓋了整個黑質的5-7部分的10倍放大率圖像。進行蒙蔽計數。在杏仁核和黑質中的細胞計數藉由單因素方差分析，然後藉由龐費洛尼t檢驗(Bonferroni t-test)進行分析，其中GM37抗體的效果與PBS處理進行比較。
從圖20C可以看出，與PBS對照相比，無論使用腹腔內或靜脈內治療，用抗體GM37治療顯著減少了黑質中細胞內包含物的數量。該等數據表明，藉由阻斷細胞外病理α-突觸核蛋白進入神經元，藉由阻斷其神經元之間的傳播和/或藉由攝取神經膠質細胞促進從ISF中清除，抗體GM37可以在PD中具有治療效果。內含物的這種出現已與在動物模型中多巴胺能神經元的喪失和帕金森病的運動障礙的發展相關聯，使用抗體GM37治療可能對PD中的多巴胺能細胞的損失和運動障礙的發展具有治療效果。
實例11：GM37和GM37變體的可製造性
抗α-突觸核蛋白抗體在哺乳動物細胞培養物中於模擬將被用於生產在患者中使用的臨床級材料的生產條件的條件下生產。眾所周知，以這種方式產生的蛋白質經受了可能影響抗體的治療效力和影響抗體隨時間的穩定性的生物物理屬性的翻譯後修飾。數十年的研究確定的經驗知識鑒定了一組已知為特定分子的顯影提供風險的翻譯後修飾。該等翻譯後修飾已顯示與存在於重鏈和輕鏈蛋白的一級序列中的胺基酸串相關。已經產生演算法，該演算法可以鑒別該等序列並確定它們對治療性抗體的製造性和顯影性的潛在風險。
抗體的一級序列的電腦分析可以用於有潛力被開發為治療劑的分子脫風險。特別地，VH和VL區的詳細分析可以鑒定被認為對分子活性重要的但也可以是其隨時間的穩定性的潛在危險獨特的胺基酸。序列特異性脫醯胺已被鑒定為蛋白質結構的潛在危險。蛋白質脫醯胺可以發生在穀胺醯胺或天冬醯胺殘基的醯胺側鏈並將它們轉化為羧酸酯基團(洛倫佐(Lorenzo)等人，公共科學圖書館期刊(PLOS one)，DOI：10.1371(2015年12月))。對於天冬醯胺，在中性pH下非酶脫醯胺發生更快，因此被認為比穀胺醯胺具有更高的風險。活性進一步被序列中的隨後的胺基酸影響，並且能以數天或數年的速率發生。蛋白質經歷脫醯胺的實際命運需要藉由實驗評估以確定改變對它的穩定性和活性兩者的影響。
我們鑒定了GM37的VH結構域內脫醯胺的位點。胺基酸殘基54係天冬醯胺(N)，接著是位置55上的甘胺酸(G)。N54有自發醯胺高風險。為了減輕這種風險，我們產生一組3個變體，用絲胺酸(S)、穀胺醯胺(Q)或組胺酸(H)取代天冬醯胺(N)。所有3個變體在哺乳動物 細胞培養物中使用暫態轉染方法生產(實例1.5)。所有3個變體顯示出與GM37wt類似的表現和純化特性。(圖23)。
對於八個產物中的每一個，使用已經在培養基中至少2週的CHOK1SV GS-KO細胞進行400ml暫態轉染。轉染前24小時，進行細胞傳代培養。所有轉染使用基因脈衝Xcell(伯樂公司(Bio-Rad))藉由電穿孔進行。對於每次轉染，將活細胞重懸於補充有6mM的L-穀胺醯胺的預熱的CD-CHO培養基中至2.86 x 107細胞/ml。將40μg包含適當的重鏈和輕鏈的各自建立的SGV DNA等分到每個反應杯(伯樂公司，GenePulser反應杯，0.4cm空隙，165-2088)中，並加入700μl細胞懸浮液。將細胞在300V、900μF進行電穿孔。轉染的細胞被轉移到在Erlenmeyer燒瓶中的rep-溫熱培養基中並且還將用預熱的培養基漂洗兩次的反應杯的內容物轉移到燒瓶中。轉染的培養物在振盪培養箱中於36.5℃、5% CO2、85%濕度、140rpm下培養6天。細胞活力在收穫時使用Cedex HiRes自動細胞計數器(羅舍公司(Rosche))測量。
為了評價殘基54在結合人α-突觸核蛋白中的重要性，我們在兩個不同的實驗中分析了變體結合的能力。使用競爭ELISA形式，我們評估了在殘基54上的變化將會對GM37結合溶液中的α-突觸核蛋白的能力的影響。藉由評估能夠抑制抗體結合到包被ELISA板的突觸核蛋白的突觸核蛋白的濃度，我們發現所有三種變體保持與GM37wt相同的結合並結合至α-突觸核蛋白具有導致1-2nM的IC50的高親和力(圖24)。在室溫下使用固定濃度(0.3μg/ml)的如下抗體中的每一種：GM37(即GM 37wt)、GM37變體1、GM37變體2和GM37變體3與0-1000nM範圍內的人α-突 觸核蛋白預培養60分鐘來進行競爭試驗。剩餘的未結合的抗體被捕獲，並在塗有100ng/ml重組人α-突觸核蛋白的ELISA平板上使用抗人檢測抗體藉由電化學發光(MSD，Gathersburg，MD)來測定。對於GM 37wt、GM37變體1、GM37變體2和GM37變體3，相互作用的IC50分別是1.9nM、1.6nM、2.1nM和1.4nM(如使用Prism Graphpad®確定的)。
使用表面胞漿素共振(SPR)，我們評估了GM37 wt(2批)和這三種變體(實例2)的結合的即時動力學。人α-突觸核蛋白被捕獲到載玻片(配位基)並且將抗體作為分析物在多個濃度下分別進行了測試。在多個濃度的抗體存在下的結合曲線的分析表明，所有四種抗體的速率係相同的，類似地，當抗體從緩衝液去除時測得的遠離速率顯示抗體之間無統計學差異。使用1：1的結合演算法，所有4種抗體具有幾乎相同的結合常數(圖25)。
為了評估在N54上的變化對GM37的功能活性的影響，我們分析了抗體阻斷初級神經元培養物中的突觸核蛋白播種活性的能力(實例6)。播種的水平使用特異於磷酸突觸核蛋白的抗體來測定。如由磷酸突觸核蛋白信號測得的，所有3種抗體都能夠阻斷播種(圖26)。此外，抑制水平對於所有4種抗體係相同的。這一基於要求的數據進一步證實了人α-突觸核蛋白的結合親和力和基於初級細胞試驗中的播種的抑制不需要在VH結構域的胺基酸54的結合數據。此外，我們發現所有這三種抗體均能夠使用標準表現和純化方法生產。有趣的是，N54Q變體中的一個顯示出比其他變體在生產上的改善，當抗體要大規模商業化生產時這係非常重要的。該等數據支援藉由使用其他胺基酸替換天冬醯胺(N)而不需要關注效 力損失來減少脫醯胺作用的潛在危險的可能性。
各抗體(野生型Gm37、變體1、變體2和變體3)的樣品經受隨時間而穩定增加的溫度，並且同時藉由多角度光散射法測定聚集水平(普羅米修士NT.48(Prometheus NT.48)，NanoTemper技術公司)。發現GM37和GM37變體開始聚集的溫度係相似的，然而GM37-變體2觀察到最低水平的聚集(圖27)。
<110> 丹麥商H．朗德貝克公司(H.Lundbeck A/S)
<120> 用於治療共核蛋白病的藥劑、用途及方法
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<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM37 CDR 1重鏈
<400> 1
Figure 105121902-A0305-02-0112-61
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM37 CDR2重鏈
<400> 2
Figure 105121902-A0305-02-0112-62
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM37 CDR3重鏈
<400> 3
Figure 105121902-A0305-02-0113-63
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM37 CDR1輕鏈
<400> 4
Figure 105121902-A0305-02-0113-64
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM37 CDR 2輕鏈
<400> 5
Figure 105121902-A0305-02-0113-65
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM37 CDR 3輕鏈
<400> 6
Figure 105121902-A0305-02-0114-66
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM37 CDR重鏈
<400> 7
Figure 105121902-A0305-02-0114-68
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM 37輕鏈
<400> 8
Figure 105121902-A0305-02-0115-69
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 表位112-117
<400> 9
Figure 105121902-A0305-02-0115-70
<210> 10
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> α-突觸核蛋白
<400> 10
Figure 105121902-A0305-02-0116-71
<210> 11
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> A-Syn-AAKK-BAP
<400> 11
Figure 105121902-A0305-02-0117-72
<210> 12
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> A-Syn-BAAK-BAP
<400> 12
Figure 105121902-A0305-02-0118-73
Figure 105121902-A0305-02-0119-74
<210> 13
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> A-Syn-BBAA-BAP
<400> 13
Figure 105121902-A0305-02-0119-75
Figure 105121902-A0305-02-0120-76
<210> 14
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> A-Syn-BBKK-BAP
<400> 14
Figure 105121902-A0305-02-0120-77
Figure 105121902-A0305-02-0121-78
<210> 15
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> A-Syn-120-140_Del-BAP
<400> 15
Figure 105121902-A0305-02-0121-79
Figure 105121902-A0305-02-0122-80
<210> 16
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> α-突觸核蛋白氨基酸1-119
<400> 16
Figure 105121902-A0305-02-0122-81
Figure 105121902-A0305-02-0123-82
<210> 17
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> κ(LC恒定區)
<400> 17
Figure 105121902-A0305-02-0123-83
<210> 18
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG1(HC恒定區)
<400> 18
Figure 105121902-A0305-02-0124-84
Figure 105121902-A0305-02-0125-85
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM285表位112-115
<400> 19
Figure 105121902-A0305-02-0125-86
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM285 CDR1重鏈
<400> 20
Figure 105121902-A0305-02-0126-87
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM285 CDR2重鏈
<400> 21
Figure 105121902-A0305-02-0126-88
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM285 CDR3重鏈
<400> 22
Figure 105121902-A0305-02-0126-89
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM285 CDR1輕鏈
<400> 23
Figure 105121902-A0305-02-0127-90
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM285 CDR2輕鏈
<400> 24
Figure 105121902-A0305-02-0127-91
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM285 CDR3輕鏈
<400> 25
Figure 105121902-A0305-02-0127-92
<210> 26
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM285 VH
<400> 26
Figure 105121902-A0305-02-0127-93
Figure 105121902-A0305-02-0128-94
<210> 27
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM285 VL
<400> 27
Figure 105121902-A0305-02-0128-95
Figure 105121902-A0305-02-0129-97
<210> 28
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM285 IgG1恒定區
<400> 28
Figure 105121902-A0305-02-0129-98
Figure 105121902-A0305-02-0130-2
Figure 105121902-A0305-02-0131-3
<210> 29
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM285 K鏈
<400> 29
Figure 105121902-A0305-02-0131-99
<210> 30
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM37變體1重鏈
<400> 30
Figure 105121902-A0305-02-0132-100
<210> 31
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM 37變體2重鏈
<400> 31
Figure 105121902-A0305-02-0133-101
<210> 32
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM 37變體3重鏈
<400> 32
Figure 105121902-A0305-02-0133-102
Figure 105121902-A0305-02-0134-4
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM37變體1重鏈CDR 2
<400> 33
Figure 105121902-A0305-02-0134-103
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM37變體2 CDR 2重鏈
<400> 34
Figure 105121902-A0305-02-0135-104
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GM37變體3 CDR 2重鏈
<400> 35
Figure 105121902-A0305-02-0135-105
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 9E4結合表位
<400> 36
Figure 105121902-A0305-02-0135-106
<210> 37
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人β-突觸核蛋白
<400> 37
Figure 105121902-A0305-02-0136-107
<210> 38
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人γ-突觸核蛋白
<400> 38
Figure 105121902-A0305-02-0137-5
<210> 39
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 食蟹猴α-突觸核蛋白直向同源物
<400> 39
Figure 105121902-A0305-02-0137-108
Figure 105121902-A0305-02-0138-6
<210> 40
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 大鼠α-突觸核蛋白直向同源物
<400> 40
Figure 105121902-A0305-02-0138-109
Figure 105121902-A0305-02-0139-7
<210> 41
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 小鼠α-突觸核蛋白直向同源物
<400> 41
Figure 105121902-A0305-02-0139-110
Figure 105121902-A0305-02-0140-8
<210> 42
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 9E4 HC
<400> 42
Figure 105121902-A0305-02-0140-112
Figure 105121902-A0305-02-0141-9
Figure 105121902-A0305-02-0142-11
<210> 43
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 9E4 LC
<400> 43
Figure 105121902-A0305-02-0143-114
Figure 105121902-A0305-02-0144-12

Claims (29)

  1. 一種單株抗體或其抗原結合片段，其能夠特異性結合至人α-突觸核蛋白，其中所述抗體或其抗原結合片段結合人α-突觸核蛋白(SEQ ID NO：10)之胺基酸112-117(SEQ ID NO：9(ILEDMP))內的表位，其中所述抗體或其抗原結合片段包含：(a)具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的重鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的重鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的重鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的輕鏈CDR2；和(f)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的輕鏈CDR3；或(a)具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的重鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列的重鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的重鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的輕鏈CDR2；和(f)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的輕鏈CDR3；或(a)具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的重鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列的重鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的重鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的輕鏈CDR1； (e)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的輕鏈CDR2；和(f)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的輕鏈CDR3；或(a)具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的重鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：35的胺基酸序列的重鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的重鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的輕鏈CDR2；和(f)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的輕鏈CDR3；或(a)具有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的重鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：22的胺基酸序列的重鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：23的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：24的胺基酸序列的輕鏈CDR2；和(f)具有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的輕鏈CDR3。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含或由完整的抗體組成。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體係選自由以下各項組成之群組：亞型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗體。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含選自由以下各項組成之群組的抗原結合片段或由選自由以下各項組成之群 組的抗原結合片段組成：Fv片段、Fab樣片段和域抗體。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段展現出以下特性中的一種或多種：a)對於α-突觸核蛋白的結合親和力，該結合親和力在0.5-10nM之間；b)抑制α-突觸核蛋白原纖維的蛋白酶截短的能力；c)在F28-snca轉基因小鼠中逆轉基礎突觸傳導的損傷的能力；d)藉由體內微透析測量，在小鼠海馬迴內降低α-突觸核蛋白的水平的能力；e)當長期給予時，在帕金森氏病的大鼠模型中恢復運動功能的能力；f)預防α-突觸核蛋白播種的能力；和/或g)在人腦中結合截短的α-突觸核蛋白的能力。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，係一種人的、人源化的、重組的或嵌合的抗體。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含SEQ ID NO：7的重鏈可變域或SEQ ID NO：8的輕鏈可變域。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含由SEQ ID NO：7的可變域組成的重鏈和由SEQ ID NO：8的可變域組成的輕鏈。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含SEQ ID NO：30的重鏈可變域或SEQ ID NO：8的輕鏈可變域。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含由SEQ ID NO：30的可變域組成的重鏈和由SEQ ID NO：8的可變域組成的輕鏈。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含SEQ ID NO：31的重鏈可變域或SEQ ID NO：8的輕鏈可變域。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含由SEQ ID NO：31的可變域組成的重鏈和由SEQ ID NO：8的可變域組成的輕鏈。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含SEQ ID NO：32的重鏈可變域或SEQ ID NO：8的輕鏈可變域。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含由SEQ ID NO：32的可變域組成的重鏈和由SEQ ID NO：8的可變域組成的輕鏈。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含SEQ ID NO：26的重鏈可變域或SEQ ID NO：27的輕鏈可變域。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含由SEQ ID NO：26的可變域組成的重鏈和由SEQ ID NO：27的可變域組成的輕鏈。
  17. 一種包含如申請專利範圍第1-16項中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述製劑基本上不含天然產生的抗體，所述天然產生的抗體不能結合到α-突觸核蛋白或不實質上改變該製劑的抗α-突觸核蛋白功能性，所述功能性選自由以下各項組成之群組：(i)抗α-突觸核蛋白抗體對α-突觸核蛋白的結合親和力；(ii)抗α-突觸核蛋白抗體抑制α-突觸核蛋白原纖維的蛋白酶截短的能力；(iii)在F28-snca轉基因小鼠中抗α-突觸核蛋白抗體逆轉基礎突觸傳導 的損傷的能力；(iv)藉由體內微透析測量，抗α-突觸核蛋白抗體降低小鼠海馬迴內α-突觸核蛋白水平的能力；和(v)在帕金森氏病的大鼠模型中，當長期給予時，抗α-突觸核蛋白抗體恢復運動功能的能力；(vi)預防α-突觸核蛋白播種的能力；和/或(vii)在人腦中結合截短的α-突觸核蛋白的能力。
  18. 一種包含如申請專利範圍第1-16項中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述單株抗體在其胺基酸序列中相對於天然存在的抗α-突觸核蛋白抗體的結構具有結構改變，其中所述結構改變使得所述單株抗體相對於由所述天然存在的抗α-突觸核蛋白抗體展現出的功能性展現出改變的功能性，其中所述功能性係：(i)抗α-突觸核蛋白單株抗體對α-突觸核蛋白的結合親和力；(ii)抗α-突觸核蛋白單株抗體抑制α-突觸核蛋白原纖維的蛋白酶截短的能力；(iii)在F28-snca轉基因小鼠中抗α-突觸核蛋白單株抗體逆轉基礎突觸傳導的損傷的能力；(iv)藉由體內微透析測量，該抗α-突觸核蛋白單株抗體降低小鼠海馬迴內α-突觸核蛋白水平的能力；和/或(v)在帕金森氏病的大鼠模型中，當長期給予時，抗α-突觸核蛋白單株抗體恢復運動功能的能力；(vi)預防α-突觸核蛋白播種的能力；和/或 (vii)在人腦中結合截短的α-突觸核蛋白的能力。
  19. 一種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第1-16項中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段以及藥學上可接受的載體。
  20. 一種核酸，編碼如申請專利範圍第1-16項中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段。
  21. 如申請專利範圍第1-16項中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，用於製造醫藥品中使用，該醫藥品係用於治療共核蛋白病。
  22. 如申請專利範圍第1-16項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其用於製造醫藥品中使用，該醫藥品係用於治療帕金森氏病、帕金森氏病的特發性和遺傳性形式、高歇氏病(Gauchers Disease)、彌漫性雷維體病(Diffuse Lewy Body Disease)、阿耳茨海默病的雷維體變體、組合型阿耳茨海默和帕金森氏病、純自主神經衰竭或多系統萎縮。
  23. 如申請專利範圍第1-16項中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其用於製造醫藥品中使用。
  24. 一種如申請專利範圍第1-16項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製造醫藥品，該醫藥品係用於治療患者之帕金森氏病或其他共核蛋白病。
  25. 一種如申請專利範圍第19項所述的醫藥組成物之用途，其係用於製造醫藥品，該醫藥品係用於治療患者之帕金森氏病或其他共核蛋白病。
  26. 如在申請專利範圍1-16的任一項中所定義的單株抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段已經在細胞系中產生或生產。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其在CHO 細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、鼠類細胞系、纖維肉瘤細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11細胞系、CAP細胞系以及HuH-7人細胞系中產生。
  28. 如申請專利範圍第1-14項中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含如在SEQ ID NO：18中定義的恒定域和如在SEQ ID NO：17中定義的κ恒定域。
  29. 如申請專利範圍第15-16項中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，包含如在SEQ ID NO：28中定義的恒定域和如在SEQ ID NO：29中定義的κ恒定域。
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