KR102573778B1 - 알파-시뉴클레인에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents

알파-시뉴클레인에 대한 항체 및 그의 용도 Download PDF

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마이클 케이. 알리자니안
제레 어니스트 주니어 메레디트
니노 데비드제
존 데이비드 그래프
에드워드 엘. 할크
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

단량체 α-시뉴클레인보다 올리고머 α-시뉴클레인에 우선적으로 결합하는 항-α-시뉴클레인 항체, 항체를 포함하는 치료 조성물, 및 항체를 사용하여 시뉴클레인병증을 치료하는 방법이 본원에 개시된다.

Description

알파-시뉴클레인에 대한 항체 및 그의 용도
관련 출원 정보
본 특허 출원은 2017년 2월 17일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/460,416의 이익을 청구한다. 상기 언급된 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
α-시뉴클레인 (αSyn)은 뉴런의 시냅스-전 말단에서 우선적으로 발현되는 140개의 아미노산 단백질이고, 여기서 시냅스 전달을 조절하는데 있어서 역할을 하는 것으로 생각된다 (Bendor et al., Neuron 2013;79:1044-66). 이는 천연적으로 언폴딩된 단량체 (Fauvet et al., JBC 2012;287:15345-64) 및 α-나선의 안정한 사량체 (Bartels et al., Nature 2011;477:107-10; Wang et al., PNAS 2011;108:17797-802) 둘 다로서 존재하는 것으로 제안되었고, 여러 번역후 변형을 거치는 것으로 밝혀졌다 (Beyer and Ariza, Mol Neurobiol 2013;47:509-24). 광범위하게 연구된 하나의 변형은 αSyn의 아미노산 잔기 세린 129 (S129)에서의 인산화이다. 통상적으로, 단지 적은 백분율의 αSyn이 S129에서 구성적으로 인산화 (pS129)되는 반면에, 병리학적 세포내 함유물에서 발견되는 대다수의 αSyn은 pS129 αSyn이다 (Oueslati, J Parkinsons Dis 2016;6:39-51). 이들 병리학적 함유물은 미스폴딩된 αSyn 단백질의 응집된 불용성 축적으로 이루어지고, 이는 집합적으로 시뉴클레인병증으로 공지되어 있는 신경변성 질환 군의 특징적인 특색이다 (Galvin et al., Arch Neurol 2001;58:186-90).
시뉴클레인병증에서, αSyn은 파킨슨병 (PD) 및 루이 소체 치매 (DLB) 둘 다의 특징인, 루이 소체로 공지된 뉴런에서의 병리학적 응집체를 형성할 수 있다. 추가적으로, 신경교 세포질 함유물 (GCI)로 불리는 비정상적인 αSyn-풍부 병변이 핍지교세포에서 발견되고, 이는 다계통 위축 (MSA)으로 공지된 신속하게 진행되는 치명적인 시뉴클레인병증의 병리학적 특징을 대표한다. 뇌 전체에 걸친 병리학적 αSyn의 전파에 대한 초기 증거는 PD에 기재된 뇌 병리학의 상동증적 진행 (Braak et al., 2003) 및 PD 환자에서의 αSyn 응집체의 숙주-대-이식편 확산의 증거 (Kordower et al., 2008)로부터 유래된다. 흥미롭게도, 핍지교세포에서의 검출불가능한 (Ozawa et al., Acta Neuropathologica 2001;102:188-190; Miller et al., J Neural Transm (Vienna) 2005;112:1613-24; Jin et al., Journal of Medical and Dental Sciences 2008;555:145-53) 또는 낮은 수준 (Asi et al., Glia 2014;62:964-70)의 αSyn mRNA 발현에 대한 보고는, αSyn의 일부 병리학적 형태가 그것이 고도로 발현되는 뉴런으로부터 핍지교세포로 전파된다는 것을 시사한다. 최근의 연구는 αSyn 전파의 이러한 아이디어를 지지하며, 이는 αSyn이 핍지교세포에 의해 흡수되고 (Reyes et al., Glia 2014;62:387-98) 뉴런에 의해 흡수된다 (Volpicelli-Daley et al., Neuron 2011; 72:57-71; Luk et al., Science 2012; 338: 949-953)는 것을 입증한다. 또한, MSA 환자로부터 인간 뇌 균질물의 αSyn 트랜스제닉 마우스에의 접종 또는 PD 뇌로부터의 정제된 LB 추출물의 마우스 및 비인간 영장류에의 접종은 신경계 기능장애 및 광범위한 pS129 뉴런 침착을 초래한다 (Watts et al., PNAS 2013;110:19555-60; Prusiner et al., PNAS 2015;112:E5308-17; Recasens et al., Annals Neurology 2014;75:351-62).
현재 αSyn 전파의 관점에서 시뉴클레인병증을 표적화하는 치료제는 부족하다. 따라서, 병리학적 형태의 αSyn을 우선적으로 표적화하는 치료제가 시뉴클레인병증, 예컨대 PD, DLB 및 MSA를 갖는 환자의 치료에서 바람직할 것이다.
α-시뉴클레인에 특이적으로 결합하고 바람직한 기능적 특성을 갖는 단리된 항체, 예컨대 모노클로날 항체가 본원에 제공된다. 이들 특성은 단량체 α-시뉴클레인과 비교하여 올리고머 α-시뉴클레인에 우선적으로 결합하는 것, 및 시험관내 및 생체내에서 가용성 또는 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)의 생성을 억제하는 능력을 포함한다. 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환의 패밀리인 시뉴클레인병증을 치료하고, 그의 중증도를 경감시키고, 그의 진행을 지연시키고, 발생할 위험을 감소시키고, 그의 발병을 지연시키고, 진단하는데 사용될 수 있다.
한 측면에서, α-시뉴클레인에 결합하고 하기 특성:
(a) 마우스 및 래트 α-시뉴클레인에 결합함;
(b) 인간 β-시뉴클레인 및 인간 γ-시뉴클레인에 결합함;
(c) α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 올리고머에 대해 더 큰 친화도를 가짐;
(d) α-시뉴클레인 올리고머-유도된 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)의 생성을 억제함;
(e) 뇌 내 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체를 갖는 환자로부터 제조된 PFF 및/또는 뇌 용해물로부터 가용성 또는 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)를 생산하는 분자 종을 고갈시킴;
(f) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)의 아미노산 위치 123-128의 전부 또는 일부에 결합함;
(g) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 125-128의 전부 또는 일부에 결합함;
(h) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-139의 전부 또는 일부에 결합함;
(i) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 119-126의 전부 또는 일부에 결합함; 및
(j) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-138의 전부 또는 일부에 결합함
중 1개 이상을 나타내는, 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는, 예를 들어 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 PFF이다. 일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 가용성 α-시뉴클레인 올리고머이다. 다른 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 불용성 α-시뉴클레인 올리고머이다.
일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은, 예를 들어 실시예 3에 기재된 바와 같이, 예를 들어 α-시뉴클레인 단량체/α-시뉴클레인 PFF 결합 비에 의해 평가된 바와 같이, α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 PFF, 가용성 응집체 (올리고머) 또는 불용성 응집체에 대해 더 큰 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 100 이상, 예를 들어, 500 이상, 700 이상, 1500 이상, 3000 이상, 또는 5000 이상의 α-시뉴클레인 단량체/α-시뉴클레인 PFF 결합 비를 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 단량체 α-시뉴클레인에 500 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 0.5 nM 이하의 EC50으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은, 예를 들어 실시예 10에 기재된 검정을 사용하여 평가된 바와 같이, PFF-유도된 α-시뉴클레인 세린-129 인산화를 0.1 nM 이하의 IC50으로 억제한다.
또 다른 측면에서, α-시뉴클레인에 특이적으로 결합하고, 서열식별번호: 8 및 9, 18 및 19, 28 및 29, 38 및 39, 48 및 49, 58 및 59, 68 및 69, 78 및 79, 94 및 95, 94 및 96, 94 및 97, 및 106 및 107로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로 3개의 가변 중쇄 CDR 및 3개의 가변 경쇄 CDR을 포함하는 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, α-시뉴클레인에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다:
(a) 각각 서열식별번호: 2-4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 5-7을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(b) 각각 서열식별번호: 22-24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 25-27을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(c) 각각 서열식별번호: 22-24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 28-30을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(d) 각각 서열식별번호: 37-39를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 40-42를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(e) 각각 서열식별번호: 47-49를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 50-52를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(f) 각각 서열식별번호: 57-59를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 60-62를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(g) 각각 서열식별번호: 67-69를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 70-72를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(h) 각각 서열식별번호: 77-79를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 80-82를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(i) 각각 서열식별번호: 87-89를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 90-92를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(j) 각각 서열식별번호: 87-89를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 93-95를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(k) 각각 서열식별번호: 87-89를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 96-98을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 또는
(l) 각각 서열식별번호: 107-109를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 110-112를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3.
또 다른 측면에서, α-시뉴클레인에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 8, 18, 31, 43, 53, 63, 73, 83, 99, 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, α-시뉴클레인에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, 및 114로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, α-시뉴클레인에 결합하고, (a) 서열식별번호: 8 및 9, 18 및 19, 31 및 32, 31 및 33, 43 및 44, 53 및 54, 63 및 64, 73 및 74, 83 및 84, 99 및 100, 99 및 101, 99 및 102; 및 서열식별번호: 113 및 114로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, α-시뉴클레인에 결합하고, 서열식별번호: 10 및 11, 20 및 21, 34 및 35, 34 및 36, 45 및 46, 55 및 56, 65 및 66, 75 및 76, 85 및 86, 103 및 104, 103 및 105, 103 및 106, 및 115 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 123-128의 전부 또는 일부에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 125-128의 전부 또는 일부에 결합한다. 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-139의 전부 또는 일부에 결합한다. 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 119-126의 전부 또는 일부에 결합한다. 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-138의 전부 또는 일부에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 래트 및 마우스 α-시뉴클레인에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 β-시뉴클레인 및 인간 γ-시뉴클레인에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 예를 들어 실시예 3에 기재된 바와 같이, α-시뉴클레인 단량체/α-시뉴클레인 PFF 결합 비 (단량체:PFF 결합 비)에 의해 평가된 바와 같이 α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 PFF, 가용성 응집체 (올리고머) 또는 불용성 응집체에 대해 더 큰 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 단량체:PFF 결합 비는 100 이상, 500 이상, 700 이상, 1500 이상, 3000 이상, 또는 5000 이상이다.
일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체 (예를 들어, 항체 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8)와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체 (예를 들어, 항체 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8)와 인간 α-시뉴클레인에의 결합에 대해 경쟁한다.
일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체, 또는 그의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 이펙터 기능이 감소되거나 부재하는 Fc 영역, 예를 들어 하기 돌연변이: L234A, L235E, 및 G257A를 갖는 무이펙터 IgG1 Fc를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 인간에서의 면역원성을 감소시키기 위해 변형된다. 한 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 각각 서열식별번호: 18 및 19에 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, 제2 결합 특이성을 갖는 분자에 연결된 항-α-시뉴클레인 항체를 포함하는 이중특이적 분자가 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분의 CDR, 또는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산, 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 발현 벡터로 형질전환된 세포가 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 모이어티, 예컨대 결합 모이어티, 표지 모이어티, 생물학적 활성 모이어티 또는 치료제에 연결된 항-α-시뉴클레인 항체를 포함하는 면역접합체가 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분, 및 담체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 또한 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 세포에서 항-α-시뉴클레인 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 발현시키는 단계 및 세포로부터 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 단리하는 단계를 포함하는, 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분을 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분, 이중특이적 항체, 또는 면역접합체와 샘플을, 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 α-시뉴클레인 사이에 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에 접촉시키는 단계, 및 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에서 α-시뉴클레인을 검출하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분, 이중특이적 항체, 또는 면역접합체의 유효량과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 불용성 또는 가용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)의 생성을 억제하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인을 함유하지 않는 불용성 또는 가용성 α-시뉴클레인 응집체의 생성을 억제한다. 일부 실시양태에서, 세린-129의 인산화는 α-시뉴클레인 올리고머에 의해 유도된다. 일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 사전-형성된 α-시뉴클레인 피브릴이다. 다른 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 시뉴클레인병증을 갖는 환자로부터의 뇌 샘플로부터 유래된다.
또 다른 측면에서, 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에게 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분, 이중특이적 항체, 또는 면역접합체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하고/거나, 그의 중증도를 경감시키고/거나, 그의 진행을 지연시키고/거나, 발생할 위험을 감소시키고/거나, 그의 발병을 지연시키는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서,
(a) 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분, 이중특이적 항체, 또는 면역접합체와 대상체로부터의 샘플을 접촉시켜 항체-항원 복합체가 형성되도록 하는 단계;
(b) 형성된 복합체의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 샘플에서의 복합체의 양과 대조군에서의 양을 비교하는 단계이며, 여기서 대조군에 비해 샘플에서의 복합체의 상승된 수준은 대상체가 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계
를 포함하는, 대상체에서 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 진단하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 뇌척수액, 뇌 조직 추출물, 소변 또는 혈액이다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 방법에서 질환은 파킨슨병, 파킨슨병 치매, 루이 소체 치매, 루이 소체 질환, 다계통 위축, 또는 순수 자율신경부전이다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 방법은 1종 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
도 1은 상이한 αSyn 펩티드로 코팅된 플레이트 상에서 인큐베이션된 7A10, 21A3, 15A5, 36A3, 11H11-1, 44B11, 1E8, 2E2, 및 23H8에 대한 에피토프 결합 데이터를 보여주는 일련의 그래프이다. 결합된 항체는 1-측 ELISA에 의해 측정하였다. 데이터는 단일 결정을 나타낸다.
도 2는 전장 인간 재조합 야생형 αSyn 단량체, αSyn PFF 또는 A53T αSyn PFF에 대한 7A10, 21A3, 15A5, 36A3, 11H11-1, 및 44B11의 결합의 일련의 그래프이다. αSyn 단량체, αSyn PFF 또는 A53T αSyn PFF의 농도를 증가시키면서 용액 중에서 항체를 인큐베이션하였다. 비결합 항체를 PFF-코팅된 플레이트 상에 포획하고, 1-측 ELISA에 의해 측정하였다. 데이터는 중복 결정에 대한 평균±sd를 나타낸다.
도 3은 전장 인간 재조합 야생형 αSyn 단량체, αSyn PFF 또는 A53T αSyn PFF에 대한 항체 1 (αSyn에 결합하는 것으로 공지된 항체)의 결합을 보여주는 그래프이다. 비결합 항체를 PFF-코팅된 플레이트 상에 포획하고, 1-측 ELISA에 의해 측정하였다. 데이터는 중복 결정에 대한 평균±sd를 나타낸다.
도 4는 7A10의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VK)의 면역원성 핫스팟 분석을 나타낸다. 아미노산의 넘버링은 카바트(Kabat) 규정에 따른다. 3개의 CDR 영역은 각각의 2개의 쇄에 대해 직사각형 상자로 표시되는 반면, 프레임워크 잔기는 FW1, FW2 및 FW3에 의해 표시된다. 각각의 아미노산 아래의 숫자는 그 아미노산을 중심으로 하는 15-mer 펩티드에 결합하는 대립유전자의 비율을 나타낸다. 예를 들어, 7A10_VH에서 Y52에서의 "5"는 Y52를 중심으로 한 15-mer 펩티드, 즉, LEWIGYI Y YSGRTKY를 지칭하고, 이는 (i) 이러한 펩티드가 인간 배선 매칭을 갖지 않고 (따라서 비-자기), (ii) 27개의 대립유전자의 50-60%는 이러한 펩티드에 대해 높은 결합 친화도를 나타낸다는 것을 표시한다. 숫자는 도면에서 관찰되는 바와 같이 색상의 정도가 다양한, 밝은 것 (면역원성일 가능성이 최소)으로부터 어두운 것 (면역원성 핫스팟일 가능성이 최고)으로 그레이스케일 상의 색상으로 할당된다. 3개의 굵은 화살표는 돌연변이체 선택의 결정을 보여준다: R56S, K58N, T93A.
도 5A 및 5B는 시험 항체에 대한 노출 7일 후에 양성 CD4+ 증식 반응을 갖는 건강한 지원자 인간 PBMC 공여자의 백분율의 그래프이다. 각각의 수평 막대는 1명의 양성 공여자를 나타낸다. 7A10 및 7A10 T93A를 상이한 검정 실행에서 시험하였다. 아바스틴은 항 VEGF A 모노클로날 항체이고, 음성 대조군으로서 사용된다. αIL-21R mAb는 완전 인간 항-IL-21R 모노클로날 항체이고, 양성 대조군으로서 사용된다.
도 6A 및 6B는 증가하는 농도의 마우스, 래트 및 인간 αSyn 펩티드 및 WT PFF에 대한 7A10 (도 6A) 및 7A10-T93A (도 6B)의 결합을 보여주는 그래프이다. 비결합 항체를 PFF-코팅된 플레이트 상에 포획하고, 1-측 ELISA에 의해 측정하였다. 데이터는 중복 결정에 대한 평균±sd를 나타낸다.
도 7은 전장 인간 재조합 야생형 αSyn, βSyn, γSyn 단량체에 대한 7A10, 21A3, 15A5, 36A3, 11H11-1, 및 44B11의 결합을 보여주는 일련의 그래프이고; αSyn PFF는 양성 대조군으로서 포함된다. 비결합 항체를 PFF-코팅된 플레이트 상에 포획하고, 1-측 ELISA에 의해 측정하였다. 데이터는 중복 결정에 대한 평균±sd를 나타낸다.
도 8A 및 8B는 야생형 단량체 αSyn 또는 PFF에 대한 7A10 및 항체 1의 결합의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석을 보여주는 그래프이다. 도 8A는 하부 곡선으로서 표면 포획된 7A10에 대한 단량체 wt αSyn의 결합, 및 7A10에 대한 다량체 PFF (상부 곡선)의 증진된 결합을 보여준다. 특히 wt αSyn의 해리 속도는 매우 빠른 반면에, PFF 해리는 매우 느리다. 도 8B는 항체 1에 대한 동일한 포맷의 데이터를 보여준다 (하부 곡선은 PFF에 상응하고, 상부 곡선은 wt αSyn에 상응함). 7A10과 대조적으로, 항체 1은 PFF 형태 대비 wt αSyn의 결합에서 인식가능한 선택성을 나타내지 않았다.
도 9A 및 9B는 7A10 및 7A10-T93A의 PFF에 대한 결합력을 추정하기 위한, 정밀화된 SPR 검정의 결과를 보여주는 그래프이다. 도 9A는 표면 상에 고정된 PFF에 대한 7A10-IgG1.3f의 여러 농도 (100 nM에서 0.4 nM까지 3-배 희석)의 결합력-영향 결합 동역학을 보여준다 (ka (1/Ms): 5.811E+7, kd (1/s): 0.009834, KD: 1.692E-10 M). 도 9B는 7A10-T93A-IgG1.3f에 대한 동일한 데이터 포맷을 보여준다 (ka (1/Ms): 8.946E+7, kd (1/s): 0.03873, KD: 4.329E-10 M).
도 10A는 증가하는 AAV-hA53T-αSyn MOI로 형질도입된 래트 해마 뉴런에서의 10 nM PFF를 사용한 처리 11일 후의 pS129의 유도 (비처리 대조군에 대해 정규화됨)를 보여주는 그래프이다. 도 10B는 11일 동안 hA53T-αSyn PFF (상부 (상승) 선) 또는 단량체 (하부 (편평) 선)로 처리된 형질도입된 (3K MOI AAV-hA53T αSyn) 래트 해마 뉴런에서의 pS129의 유도 (비처리 대조군에 대해 정규화됨)에 대한 농도 반응 곡선을 보여주는 그래프이다. 도 10C는 형질도입된 (3K MOI AAV-hA53T- αSyn) 래트 해마 뉴런의 9개의 상이한 MSA-환자 유래 뇌 샘플로부터의 용해물을 사용한 처리 11일 후의 pS129의 유도 (10 nM PFF 대조군에 대해 정규화됨)를 보여주는 그래프이다. 막대는 좌측으로부터 우측으로 10 nM PFF, MSA#1, MSA#2, MSA#3, MSA#4, MSA#5, MSA#6, MSA#7, MSA#8, 및 MSA#9에 상응한다. 도 10D는 완충제, 10nM PFF, 대조군 뇌로부터의 용해물, 또는 MSA 뇌로부터의 용해물을 사용한 처리 11일 후에 형질도입된 (3K MOI AAV-hA53T- αSyn) 래트 해마 뉴런에서 유도된 pS129 신호의 면역형광 영상을 보여준다. 뇌 용해물을 1:300 희석으로 적용하였다. 도 10E는 증가하는 농도의 PFF를 사용한 처리 11일 후에 형질도입된 (3K MOI AAV-hA53T- αSyn) 래트 해마 뉴런에서의 pS129 αSyn 유도 (비처리 대조군에 대해 정규화됨; 상승 선) 및 분지점 (비처리 대조군에 대해 정규화됨; 하행 선) 사이의 역 상관관계를 보여주는 그래프이다. 도 10F는 PFF, MSA 및 대조군 뇌 용해물 및 MSA 및 대조군 뇌 용해물로부터의 단리된 고속 원심분리 펠릿 및 남아있는 상청액을 사용한 처리 11일 후에 형질도입된 (3K MOI AAV-hA53T- αSyn) 래트 해마 뉴런에서의 pS129 αSyn의 유도 (비처리 대조군에 대해 정규화됨)를 보여주는 그래프이다. 막대는 좌측으로부터 우측으로 대조군, 1 nM PFF, MSA 뇌 (용해물), MSA (펠릿), MSA (상청액), 대조군 (용해물), 대조군 (펠릿), 및 대조군 (상청액)에 상응한다. 도 10G는 MSA 뇌 조직 용해물로부터 재현탁된 펠릿을 사용한 처리 후의 pS129 αSyn의 시간-의존성 유도 (10nM PFF 양성 대조군에 대해 정규화됨)를 보여주는 그래프이다. 막대는 좌측으로부터 우측으로 인큐베이션 7일 후, 인큐베이션 14일 후, 및 인큐베이션 18일 후에 상응한다. 도 10H는 10 nM PFF 및 MSA 뇌 조직 용해물 둘 다를 사용한 처리 11일 후의 pS129 유도 (비처리 대조군에 대해 정규화됨) 및 분지점 (비처리 대조군에 대해 정규화됨)을 보여주는 그래프이다. 대조군 (pS129 유도 막대는 부재하며, 이는 유도의 결여를 나타냄), PFF, 및 MSA 각각에 대해 제시된 막대 쌍은 pS129 유도 및 분지점의 순서이다.
도 11은 3명의 상이한 MSA 환자 (12-18, 01-03, 04-51)로부터 생성된 PFF 및 뇌 용해물의 항체 1 면역고갈에 대한 누적 농도 반응 곡선을 보여주는 일련의 그래프이다. 면역고갈된 샘플을 3K MOI hA53T αSyn AAV로 형질도입된 래트 해마 뉴런에서의 pS129의 유도에 대해 시험하였다. Y-축 값은 비고갈된 샘플에 대해 정규화된 pS129 강도를 나타낸다. 누적 데이터 세트를 사용하여 데이터 포인트 (평균± 95% CI) 및 피팅 곡선을 생성하였다. IC50을 각각의 실험에 대해 계산하였고, 평균±sd로 나타내었다.
도 12는 3명의 상이한 MSA 환자 (12-18, 01-03, 04-51)로부터 생성된 PFF 및 뇌 용해물의 7A10 면역고갈에 대한 누적 농도 반응 곡선을 보여주는 일련의 그래프이다. 면역고갈된 샘플을 3K MOI hA53T αSyn AAV로 형질도입된 래트 해마 뉴런에서의 pS129의 유도에 대해 시험하였다. Y-축 값은 비고갈된 샘플에 대해 정규화된 pS129 강도를 나타낸다. 누적 데이터 세트를 사용하여 데이터 포인트 (평균± 95% CI) 및 피팅 곡선을 생성하였다. IC50을 각각의 실험에 대해 계산하였고, 평균±sd로 나타내었다.
도 13은 3명의 상이한 MSA 환자 (12-18, 01-03, 04-51)로부터 생성된 PFF 및 뇌 용해물의 21A3 면역고갈에 대한 누적 농도 반응 곡선을 보여주는 일련의 그래프이다. 면역고갈된 샘플을 3K MOI hA53T αSyn AAV로 형질도입된 래트 해마 뉴런에서의 pS129의 유도에 대해 시험하였다. Y-축 값은 비고갈된 샘플에 대해 정규화된 pS129 강도를 나타낸다. 누적 데이터 세트를 사용하여 데이터 포인트 (평균± 95% CI) 및 피팅 곡선을 생성하였다. IC50을 각각의 실험에 대해 계산하였고, 평균±sd로 나타내었다.
도 14는 3명의 상이한 MSA 환자 (12-18, 01-03, 04-51)로부터 생성된 PFF 및 뇌 용해물의 36A3 면역고갈에 대한 누적 농도 반응 곡선을 보여주는 일련의 그래프이다. 면역고갈된 샘플을 3K MOI hA53T αSyn AAV로 형질도입된 래트 해마 뉴런에서의 pS129의 유도에 대해 시험하였다. Y-축 값은 비고갈된 샘플에 대해 정규화된 pS129 강도를 나타낸다. 누적 데이터 세트를 사용하여 데이터 포인트 (평균± 95% CI) 및 피팅 곡선을 생성하였다. IC50을 각각의 실험에 대해 계산하였고, 평균±sd로 나타내었다.
도 15는 3명의 상이한 MSA 환자 (12-18, 01-03, 04-51)로부터 생성된 PFF 및 뇌 용해물의 15A5 면역고갈에 대한 누적 농도 반응 곡선을 보여주는 일련의 그래프이다. 면역고갈된 샘플을 3K MOI hA53T αSyn AAV로 형질도입된 래트 해마 뉴런에서의 pS129의 유도에 대해 시험하였다. Y-축 값은 비고갈된 샘플에 대해 정규화된 pS129 강도를 나타낸다. 누적 데이터 세트를 사용하여 데이터 포인트 (평균± 95% CI) 및 피팅 곡선을 생성하였다. IC50을 각각의 실험에 대해 계산하였고, 평균±sd로 나타내었다.
도 16은 3명의 상이한 MSA 환자 (12-18, 01-03, 04-51)로부터 생성된 PFF 및 뇌 용해물의 11H11-1 면역고갈에 대한 누적 농도 반응 곡선을 보여주는 일련의 그래프이다. 면역고갈된 샘플을 3K MOI hA53T αSyn AAV로 형질도입된 래트 해마 뉴런에서의 pS129의 유도에 대해 시험하였다. Y-축 값은 비고갈된 샘플에 대해 정규화된 pS129 강도를 나타낸다. 누적 데이터 세트를 사용하여 데이터 포인트 (평균± 95% CI) 및 피팅 곡선을 생성하였다. IC50을 각각의 실험에 대해 계산하였고, 평균±sd로 나타내었다.
도 17은 3명의 상이한 MSA 환자 (12-18, 01-03, 04-51)로부터 생성된 PFF 및 뇌 용해물의 44B11 면역고갈에 대한 누적 농도 반응 곡선을 보여주는 일련의 그래프이다. Y-축 값은 비고갈된 샘플에 대해 정규화된 pS129 강도를 나타낸다. 면역고갈된 샘플을 3K MOI hA53T αSyn AAV로 형질도입된 래트 해마 뉴런에서의 pS129의 유도에 대해 시험하였다. 누적 데이터 세트를 사용하여 데이터 포인트 (평균± 95% CI) 및 피팅 곡선을 생성하였다. IC50을 각각의 실험에 대해 계산하였고, 평균±sd로 나타내었다.
도 18은 제1주-제3주에 최저점에서 및 제4주에 투여 24시간 후 수거시 채취된 혈장 샘플에서의 항체 3 (αSyn에 결합하는 것으로 공지된 항체), 항체 1, 7A10, 11H11-1, 15A5, 21A3, 36A3, 및 44B11의 혈장 농도를 보여주는 일련의 그래프이다. 상부 좌측 (제1주 혈장 최저), 상부 우측 (제2주 혈장 최저), 하부 좌측 (제3주 혈장 최저), 및 하부 우측 (제4주 혈장 투여 24시간 후).
도 19는 PFF 주사 부위에 대한 동측 및 대측의, 7A10, 21A3, 11H11-1, 15A5, 36A3, 44B11, 및 항체 1의 뇌 농도를 보여주는 그래프이다.
도 20은 ADA 활성이 부재 (원형) 및 존재 (삼각형)하는 샘플에 대한 제4주의 항체 3, 항체 1, 7A10, 21A3, 15A5, 및 44B11의 혈장 수준을 보여주는 그래프이다.
도 21은 마우스의 동측 편도체에서의 pS129 αSyn 병리상태의 유도를 입증하는 대표적인 면역조직화학 영상을 보여준다. 마우스에게 PBS 또는 A53T-PFF를 접종한 후, 4주 동안 매주 PBS 또는 하기 항체를 10 mg/kg으로 투여하였다: 항체 1, 7A10, 21A3, 항체 3, 15A5, 36A3, 44B11 및 11H11-1. 뇌 절편을 pS129 αSyn에 대해 염색하였다. 화살표는 A53T-PFF 대조군 절편에서 검출된 pS129 αSyn 응집체의 예를 강조표시한다. 영상은 10X 대물렌즈를 사용하여 획득하였다.
도 22A-22D는 선조체 A53T-PFF 주사 부위에 대해 동측인 운동 피질 (도 22A 및 22B) 및 편도체 (도 22C 및 22D)에서 pS129 염색에 대해 양성인 세포의 수를 보여주는 그래프이다. 군 평균 및 통계적 유의성 (도 22A 및 22C) 및 개별 동물 데이터 (도 22B 및 22D)가 제시된다. 통계적 분석은 대조군으로서 PFF 군을 사용하여 던넷 사후 검정과 함께 일원 ANOVA에 기초하였다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 23A-23D는 2개의 독립적 ELISA 검정을 사용하여 뇌 조직에서 측정된 αSyn 올리고머 수준을 보여주는 그래프이다. 주사 부위에 대해 대측 및 동측의 뇌 반구로부터의 가용성 추출물을 분석하였다. 군 평균 및 통계적 유의성 (도 23A 및 23C) 및 개별 동물 데이터 (도 23B 및 23D)가 제시된다. 통계적 분석은 대조군으로서 PFF 군을 사용하여 던넷 사후 검정과 함께 일원 ANOVA에 기초하였다 (**p<0.01, ***p<0.001).
도 24A-24D는 ELISA를 사용하여 뇌 조직에서 측정된 pS129 aSyn (도 24A 및 24B) 및 총 aSyn (도 24C 및 24D)의 수준을 보여주는 일련의 그래프이다. 주사 부위에 대해 대측 및 동측의 뇌 반구로부터의 가용성 추출물을 분석하였다. 군 평균 (도 24A 및 24C) 및 개별 동물 데이터 (도 24B 및 24D)가 제시된다. 군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다 (통계적 분석은 대조군으로서 PFF 군을 사용하여 던넷 사후 검정과 함께 일원 ANOVA에 기초함).
도 25는 αSyn 단량체 또는 αSyn PFF의 적정에 대한 지시된 항체의 결합을 보여주는 일련의 그래프이다. 비결합 항체를 PFF-코팅된 플레이트 상에 포획하고, 1-측 ELISA에 의해 측정하였다. 데이터는 중복 결정에 대한 평균±sd를 나타낸다.
도 26은 αSyn 단량체 또는 αSyn PFF의 적정에 대한 지시된 항체의 결합을 보여주는 일련의 그래프이다. 비결합 항체를 PFF-코팅된 플레이트 상에 포획하고, 1-측 ELISA에 의해 측정하였다. 데이터는 중복 결정에 대한 평균±sd를 나타낸다.
도 27은 ELISA 1E8.10+2E2.2 (1E8 포획 항체, 2E2 검출 항체) 및 MJFR14642+23H8.G3 (MJFR14642 포획 항체, 23H8 검출 항체)에 의한 aSyn 단량체 및 PFF의 검출을 보여주는 일련의 그래프이다. 실시예 농도 반응 곡선을 나타낸다. ELISA 전에 단량체 및 PFF 샘플을 초음파처리로 전처리하였다. 단량체 및 PFF 시뉴클레인 수준은 단량체 당량 ng/ml로서 표현된다. 데이터는 삼중 결정으로부터의 평균±sd를 나타낸다. CPS = 초당 계수.
도 28은 ELISA에 의한 αSyn 단량체 및 PFF의 검출을 보여주는 일련의 그래프이다. 실시예 농도 반응 곡선을 나타낸다. 포획 항체는 열거된 제1 항체이고, 검출 항체는 열거된 제2 항체이다. ELISA 전에 단량체 및 PFF 샘플을 초음파처리로 전처리하였다. 단량체 및 PFF 시뉴클레인 수준은 단량체 당량 ng/ml로서 표현된다. pS129 αSyn 펩티드의 검출을 MJFR1+MJFR13 ELISA로 평가하였다. 데이터는 삼중 결정으로부터의 평균±sd를 나타낸다. CPS = 초당 계수.
도 29는 ELISA에 의한 αSyn 및 αSyn 패밀리 구성원 β-시뉴클레인 및 γ-시뉴클레인의 검출을 보여주는 일련의 그래프이다. 포획 항체는 열거된 제1 항체이고, 검출 항체는 열거된 제2 항체이다. 실시예 농도 반응 곡선을 나타낸다. 데이터는 중복 결정으로부터의 평균±sd를 나타낸다. CPS = 초당 계수.
도 30은 1E8.10+2E2.2 올리고머 ELISA, MJFR14642+23H8.G3 올리고머 ELISA, MJFR1+4B12 총 ELISA 및 MJFR1+MJFR13 (pS129) ELISA를 사용하여 대조군, PD, AD 및 PSP 추출물에서 측정된 αSyn 수준을 보여주는 일련의 그래프이다. 포획 항체는 열거된 제1 항체이고, 검출 항체는 열거된 제2 항체이다. 수준은 총 단백질에 대해 정규화된 αSyn 단량체 당량 또는 pS129 펩티드 당량 (MJFR1+MJFR13)으로서 표현된다 (pg/mg 단백질). 통계는 대조군 대비 던넷 다중 비교와 함께 일원 ANOVA에 기초한다. 대조군 샘플의 대부분은 <LLQ였기 때문에 올리고머 검정 결과에 대해 통계를 수행하지 않았음을 주목한다. *p<0.05.
도 31은 1E8.10+2E2.2 올리고머 ELISA, MJFR14642+23H8.G3 올리고머 ELISA, MJFR1+4B12 총 ELISA 및 MJFR1+MJFR13 (pS129) ELISA를 사용하여 대조군, MSA, DLB 및 PD 추출물에서 측정된 αSyn 수준을 보여주는 일련의 그래프이다. 포획 항체는 열거된 제1 항체이고, 검출 항체는 열거된 제2 항체이다. 수준은 총 단백질에 대해 정규화된 αSyn 단량체 당량 또는 pS129 펩티드 당량 (MJFR1+MJFR13)으로서 표현된다 (pg/mg 단백질). 통계는 대조군 대비 던넷 다중 비교와 함께 일원 ANOVA에 기초한다. 대조군 샘플의 대부분은 <LLQ였기 때문에 올리고머 검정 결과에 대해 통계를 수행하지 않았음을 주목한다. **p<0.01, ***p<0.001.
도 32는 MJFR1+Syn303 N-말단 ELISA 및 MJFR1+4D6 C-말단 ELISA를 사용하여 대조군 MSA, DLB 및 PD 추출물에서 측정된 αSyn 수준을 보여주는 일련의 그래프이다. 포획 항체는 열거된 제1 항체이고, 검출 항체는 열거된 제2 항체이다. 수준은 총 단백질에 대해 정규화된 αSyn 단량체 당량으로서 표현된다 (pg/mg 단백질). 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (통계는 대조군 대비 던넷 다중 비교와 함께 일원 ANOVA에 기초함).
도 33은 1E8+2E2 올리고머 ELISA, MJFR14642+23H8 올리고머 ELISA, MJFR1+4B12 총 ELISA 및 MJFR1+MJFR13 (pS129) ELISA를 사용하여 MSA, DLB 및 PD 추출물에서 측정된 αSyn 수준의 상관관계를 보여주는 일련의 그래프이다. 포획 항체는 열거된 제1 항체이고, 검출 항체는 열거된 제2 항체이다. 수준은 αSyn 단량체 당량 또는 pS129 펩티드 당량 (MJFR1+MJFR13)으로서 표현된다. 1E8+2E2, MJFR14642+23H8, MJFR1+4B12 검정에서 단위는 ng/ml로서 표현된다는 것을 주목한다. 파선은 1:1 상관관계를 나타낸다.
도 34는 MJFR1+4B12 총 ELISA, MJFR1+Syn303 N-말단 ELISA, MJFR1+4D6 C-말단 ELISA 및 MJFR1+MJFR13 (pS129) ELISA를 사용하여 대조군, MSA, DLB 및 PD 추출물에서 측정된 αSyn 수준의 상관관계를 보여주는 일련의 그래프이다. 포획 항체는 열거된 제1 항체이고, 검출 항체는 열거된 제2 항체이다. 수준은 αSyn 단량체 당량 또는 pS129 펩티드 당량 (MJFR1+MJFR13)으로서 표현된다. MJFR1+4B12, MJFR1+Syn303, MJFR1+4D6 검정에서 단위는 ng/ml로서 표현된다는 것을 주목한다. 파선은 1:1 상관관계를 나타낸다.
도 35는 대조군, MSA, DLB 및 PD 추출물로부터 고속 단리된 펠릿에서의 올리고머의 검출 및 회수를 보여주는 일련의 그래프이다. 수준은 1E8+2E2 올리고머 ELISA 및 MJFR14642+23H8 올리고머 ELISA를 사용하여 측정되고, 이는 αSyn 단량체 당량으로서 표현된다. 포획 항체는 열거된 제1 항체이고, 검출 항체는 열거된 제2 항체이다. 파선은 1:1 상관관계를 나타낸다. % 회수는 출발 올리고머 수준에 기초하여 계산되고, 1E8+2E2 검정에 대해 제시된다.
도 36은 대조군 대상체 (11-46) 및 MSA 환자 (11-46) 뇌 조직 샘플로부터 생성된 추출물로부터 단리된 펠릿 및 상청액 (sup) 분획의 이뮤노블롯을 보여준다. 뇌 추출물을 SEC에 적용하고, 이어서 분획 5-14를 SDS-PAGE/이뮤노블롯에 의해 분석하였다. αSyn 단량체 표준물 (레인 A) 및 분자량 표준물을 또한 각 이뮤노블롯에 포함시켰다. 상청액 분획 내의 대부분의 αSyn은 ~60 kDa의 분자 반경에 상응하는 분획 10에서 용리되었고, SDS-PAGE/이뮤노블롯에 의해 단량체 및 절단 단편으로 분해되었다. 대조군 및 MSA 샘플 둘 다에 대해 유사한 결과가 관찰되었다. 펠릿 내의 대부분의 αSyn은 >670 kDa의 분자 반경에 상응하는 공극 부피 (분획 6)에서 용리되었고, SDS-PAGE/이뮤노블롯에 의해 단량체 및 절단 단편으로 분해되었다. aSyn 항체 4B12를 이뮤노블롯에 사용하였다.
도 37은 대조군, MSA, DLB 및 PD 환자 뇌 조직 샘플로부터 단리된 뇌 추출물 펠릿의 이뮤노블롯을 나타낸다. <20 kDa 분자량 영역에 대한 결과를 나타낸다. αSyn 항체 4B12, 4D6, EP1536Y 및 항-액틴 항체 대조군을 사용하여 샘플을 분석하였다.
도 38은 대조군, MSA, DLB 및 PD 환자 뇌 조직 샘플로부터 단리된 뇌 추출물 펠릿의 이뮤노블롯을 나타낸다. 30-40 kDa 분자량 영역에 대한 결과를 나타낸다. αSyn 항체 Syn303, 4B12, LB509, 81A, 4D6 및 IgG 항체 대조군을 사용하여 샘플을 분석하였다.
도 39는 대조군, MSA, DLB 및 PD 환자 뇌 조직 샘플로부터 단리된 뇌 추출물 펠릿의 이뮤노블롯을 나타낸다. 60-100 kDa 분자량 영역에 대한 결과를 나타낸다. αSyn 항체 Syn303, 4B12, LB509, 4D6 및 IgG 항체 대조군을 사용하여 샘플을 분석하였다.
도 40은 형질도입된 (AAV-hA53T-αSyn 3K MOI) 1차 래트 해마 뉴런에서의 pS129 αSyn의 유도를 보여주는 일련의 그래프이다. 추출 및 고정 전 11일 동안 뉴런을 대조군, PD, DLB 및 MSA 뇌 추출물로부터의 뇌 추출물 펠릿으로 처리하였다. 불용성 pS129 신호를 고함량 (HC) 분석에 의해 측정하고, PFF 처리 대조군 (10 nM)에 대해 정규화하였다. 대조군 추출물 펠릿에 의해 검출된 HC 신호는 배경 신호와 유사하였다. 각각의 펠릿에 대한 HC 신호의 수준은 1E8+2E2 ELISA를 사용하여 측정된 바와 같은 올리고머 신호와 상관되었다. 수준은 αSyn 단량체 당량으로서 표현된다.
도 41은 MSA, 진행성 핵상 마비 (PSP) 및 건강한 대조군으로부터의 인간 CSF 샘플로부터의 aSyn 올리고머 (1E8+2E2 및 MJFR14642+23H8) 및 총 aSyn (MJFR1+4B12) 수준을 보여주는 일련의 그래프이다. 포획 항체는 열거된 제1 항체이고, 검출 항체는 열거된 제2 항체이다. 분석 전에 CSF를 4-배 (1E8+2E2 및 MJFR14642+23H8) 및 20-배 (MJFR1+4B12) 희석하였다. 데이터는 희석 보정된, αSyn 단량체 당량 (pg/ml)으로서 표현된다. LLQ는 2 x 검정 배경으로 정의되고, 희석 보정된 LLQ가 각각의 검정에 표시된다. MJFR1+4B12 수준에 대한 평균 및 SD가 표에 제시된다.
도 42는 MSA 및 건강한 대조군으로부터의 인간 CSF 샘플로부터의 aSyn 올리고머 (1E8+2E2 및 MJFR14642+23H8) 및 총 aSyn (MJFR1+4B12) 수준을 보여주는 일련의 그래프이다. 분석 전에 CSF를 4-배 (1E8+2E2 및 MJFR14642+23H8) 및 20-배 (MJFR1+4B12) 희석하였다. 데이터는 희석 보정된, αSyn 단량체 당량 (pg/ml)으로서 표현된다. LLQ는 2 x 검정 배경으로 정의되고, 희석 보정된 LLQ가 각각의 검정에 표시된다. MJFR1+4B12 수준에 대한 평균 및 SD가 표에 제시된다.
단량체 α-시뉴클레인보다 올리고머α-시뉴클레인에 대해 우선적으로 결합하는 단리된 항체, 특히 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체가 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 특정한 중쇄 및 경쇄 배선 서열로부터 유래되고/거나, 특정한 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역과 같은 특정한 구조적 특색을 포함한다. 단리된 항체, 이러한 항체, 이러한 항체를 포함하는 면역접합체 및 이중특이적 분자를 제조하는 방법, 및 항체를 함유하도록 제제화된 제약 조성물이 본원에 제공된다. 또한, α-시뉴클레인의 불용성 응집체의 생성을 억제하기 위해 항체를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 따라서, 본원에 기재된 α-시뉴클레인 항체는 예를 들어 루이 소체 질환 및 시뉴클레인병증의 치료, 및 진단 검정을 포함한 매우 다양한 치료적 적용에서의 치료에 사용될 수 있다.
정의
본 기재내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
용어 "α-시뉴클레인" 및 "αSyn"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 하기 아미노산 서열 (야생형 인간 α-시뉴클레인)을 갖는 140개의 아미노산 폴리펩티드를 지칭한다:
Figure 112019092916809-pct00001
단백질은 3개의 인식되는 도메인, 아미노산 1-61을 커버하는 KTKE 반복 도메인, 약 아미노산 60-95에 걸쳐 이어지는 NAC (비-아밀로이드 성분) 도메인, 및 약 아미노산 98 내지 140에 걸쳐 이어지는 C-말단 산성 도메인을 갖는다. 달리 명시되지 않는 한, α-시뉴클레인 또는 그의 단편은 상기 천연 인간 야생형 아미노산 서열 및 그의 대립유전자 변이체를 포함한다. 예를 들어, 루이 소체 질환과 연관된 변이체 (예를 들어, E46K, A30P 및 A53T)가 또한 포괄된다. α-시뉴클레인 응집을 증진시키는 유도된 돌연변이 E83Q, A90V, A76T는 또한 개별적으로 또는 서로 및/또는 인간 대립유전자 변이체 E46K, A30P 및 A53T와 조합되어 존재할 수 있다.
본원에 사용된 "시뉴클레인병증"은 뉴런 및 신경교에서의 비정상적인 α-시뉴클레인 응집체의 축적의 존재를 특징으로 하는 신경변성 장애를 지칭하고, 예를 들어 파킨슨병 (PD), 치매 동반 PD (PDD), 루이 소체 치매 (DLB), 다계통 위축 (MSA), 고셔병 (GD), 뇌 철 축적을 동반한 신경변성 (NBIA), 알츠하이머병 (AD), 및 산필리포 증후군, 헌터 증후군, 테이-작스 및 샌드호프병 및 니만-픽 유형 C를 포함한 리소솜 축적 장애 (LSD)를 포함한다. 뉴런의 세포체 또는 신경돌기에서 발견되는 α-시뉴클레인 응집체의 축적은 각각 루이 소체 및 루이 신경돌기로 불리고, PD 및 DLB의 병리학적 특징이다. 핍지교세포에서 발견되는 α-시뉴클레인의 신경교 세포질 함유물 (GCI)의 존재는 MSA의 병리학적 특징이다.
"다계통 위축" 또는 "MSA"는 증상의 조합에 의해 나타내어지는 신경변성 질환이고; 운동, 혈압 및 다른 신체 기능에 영향을 미친다. MSA의 증상은 사람마다 발병의 분포 및 중증도가 다르다. 이 때문에, 이러한 범위의 증상을 달성하기 위해 초기에 3가지의 상이한 질환이 기재되었다; 샤이-드래거 증후군, 선조체흑질 변성 (SD), 및 올리브교뇌소뇌 위축 (OPCA).
본원에 사용된 용어 "α-시뉴클레인 올리고머"는 2개 이상의 α-시뉴클레인 단량체의 응집체를 지칭하고, 이는 소정 범위의 분자량을 가질 수 있다. 일반적으로 올리고머는 덜 가용성인 피브릴과 비교하여 가용성인 응집체의 종인 것으로 이해된다. 가용성 올리고머는 α-시뉴클레인 병리상태의 세포-대-세포 전파를 담당하는 α-시뉴클레인의 소위 "전달성 종"을 부분적으로 포함하는 것으로 여겨진다. 달리 명시되지 않는 한, "사전-형성된 피브릴" 또는 "PFF"는 α-시뉴클레인 올리고머, 예를 들어, 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 α-시뉴클레인 올리고머의 종이다. PFF는 재조합 인간 단량체 α-시뉴클레인으로부터 응집 및 원섬유화를 선호하는 조건 하에 제조되는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 "단량체/PFF 결합 비"는 α-시뉴클레인 단량체에 대한 항-α-시뉴클레인 항체의 결합 친화도 대 PFF에 대한 항체의 결합 친화도의 비를 지칭한다. 1 초과의 비는 단량체 α-시뉴클레인보다 PFF에의 결합에 대한 더 큰 선호도를 나타낸다. 예를 들어, 항체가, 예를 들어 실시예 3에 기재된 ELISA를 사용하여, 단량체 α-시뉴클레인에 291 nM의 EC50으로 및 PFF에 0.16 nM의 EC50으로 결합하는 경우에, 그러한 항체의 단량체/PFF 결합 비는 291/0.16= 1819일 것이다. 일부 실시양태에서, ELISA 이외의 검정을 사용하여 단량체/PFF 결합 비를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, PFF는 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, PFF 이외의 α-시뉴클레인 올리고머를 사용하여 단량체 대 올리고머 결합 친화도의 비를 생성한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함한다. "항체"는, 한 실시양태에서, 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질, 또는 그의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약기됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 특정 자연 발생 항체에서, 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 특정 자연 발생 항체에서, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
항체는 전형적으로 10-5 내지 10-11 M 또는 그 미만의 해리 상수 (KD)에 의해 반영되는 고친화도로 그의 동족 항원에 특이적으로 결합한다. 약 10-4 M 초과의 임의의 KD는 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 본원에 사용된 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체는 항원 및 실질적으로 동일한 항원에 고친화도로 결합하지만 (이는 10-7 M 이하, 바람직하게는 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5 x 10-9 M 이하, 및 가장 바람직하게는 10-8 M 내지 10-10 M 또는 그 미만의 KD를 갖는 것을 의미함), 비관련 항원에는 고친화도로 결합하지 않는 항체를 지칭한다. 항원이 주어진 항원에 대해 고도의 서열 동일성을 나타내는 경우에, 예를 들어 주어진 항원의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 나타내는 경우에, 항원은 주어진 항원과 "실질적으로 동일"하다.
이뮤노글로불린은 IgA, 분비형 IgA, IgG 및 IgM을 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상적으로 공지된 이소형 중 임의의 것으로부터의 것일 수 있다. IgG 이소형은 특정 종에서 하위부류로 나뉜다: 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 마우스에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3. 이뮤노글로불린, 예를 들어 IgG1은 최대 수개의 아미노산이 서로 상이한 여러 동종이형으로 존재한다. "항체"는 예로서, 자연 발생 및 비-자연 발생 항체 둘 다, 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 및 비인간 항체; 완전 합성 항체; 및 단일 쇄 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분"은 항원 (예를 들어, 인간 α-시뉴클레인)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 이러한 "단편"은, 예를 들어 약 8 내지 약 1500개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 745개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 300개, 예를 들어 약 8 내지 약 200개 아미노산, 또는 약 10 내지 약 50 또는 100개 아미노산 길이이다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 제시된 바 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법으로 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체도 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
"이중특이적" 또는 "이중기능적 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함한 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이하는 항체 또는 모든 항체가 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이하는 항체의 조성물을 지칭한다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 단일 결합 특이성을 나타내고 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 임의적인 불변 영역을 갖는 항체 또는 항체 조성을 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는, 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는, 배선 유전자에 의해 코딩되지만, 예를 들어 항체 성숙 동안 발생하는 후속 재배열 및 돌연변이를 포함하는 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 이용하는 가변 및 불변 영역을 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 (예를 들어, 문헌 [Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125] 참조), 가변 영역은, 재배열되어 외래 항원에 특이적인 항체를 형성하는, 다양한 유전자에 의해 코딩된 항원 결합 도메인을 함유한다. 재배열 이외에도, 가변 영역은 외래 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 다중 단일 아미노산 변화 (체세포 돌연변이 또는 과다돌연변이로 지칭됨)에 의해 추가로 변형될 수 있다. 불변 영역은 항원에 대해 추가로 반응하여 변화할 것이다 (즉, 이소형 스위치). 따라서, 항원에 반응하여 경쇄 및 중쇄 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 코딩하는, 재배열되고 체세포 돌연변이된 핵산 분자는 원래의 핵산 분자와 서열 동일성을 갖지 않을 수 있지만, 그 대신 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다 (즉, 적어도 80% 동일성을 가짐).
"인간" 항체 (HuMAb)는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된다. 본원에 기재된 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 용어 "인간" 항체 및 "완전 인간" 항체는 동의어로 사용된다.
"인간화" 항체는 비-인간 항체의 CDR 도메인 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두가 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 대체된 항체를 지칭한다. 인간화 형태의 항체의 한 실시양태에서, CDR 도메인 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두는 인간 이뮤노글로불린으로부터의 아미노산으로 대체된 반면에, 1개 이상의 CDR 영역 내의 일부, 대부분 또는 모든 아미노산은 변화되지 않는다. 아미노산의 작은 부가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은, 이들이 특정한 항원에 결합하는 항체의 능력을 제거하지 않는 한, 허용가능하다. "인간화" 항체는 원래 항체의 것과 유사한 항원 특이성을 보유한다.
"키메라 항체"는, 가변 영역은 한 종으로부터 유래되고, 불변 영역은 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역은 마우스 항체로부터 유래되고, 불변 영역은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE 항체)를 지칭한다.
"동종이형"은 소수의 아미노산이 상이한, 특정 이소형 군 내의 자연 발생 변이체를 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1] 참조). 본원에 기재된 항체는 임의의 동종이형을 가질 수 있다. 본원에 사용된 "IgG1f" 또는 "IgG1.3f" 이소형으로 지칭되는 항체는 각각 동종이형 "f"의, 즉 예를 들어 서열식별번호: 119에 제시된 바와 같은, 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 L234A, L235E, 및 G237A를 갖는, IgG1 및 무이펙터 IgG1.3 항체이다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다 (예를 들어, α-시뉴클레인에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 α-시뉴클레인 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나 α-시뉴클레인의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 상이한 종으로부터의 다른 α-시뉴클레인 단백질 (예를 들어, 마우스 또는 래트로부터의 α-시뉴클레인)과 교차-반응성을 가질 수 있다.
"이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용, 또는 그로부터 유발되는 생화학적 사건을 지칭한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 Clq 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, FcγR-매개 이펙터 기능 예컨대 ADCC 및 항체 의존성 세포-매개 식세포작용 (ADCP), 및 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 한다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한, FcγR 패밀리의 수용체를 포함한다. FcγR 패밀리는 3종의 활성화 (마우스에서 FcγRI, FcγRIII, 및 FcγRIV; 인간에서 FcγRIA, FcγRIIA, 및 FcγRIIIA) 및 1종의 억제 (FcγRIIB) 수용체로 이루어진다. 대다수의 선천성 이펙터 세포 유형은 1종 이상의 활성화 FcγR 및 억제 FcγRIIB를 공발현하고, 반면에 자연 킬러 (NK) 세포는 1종의 활성화 Fc 수용체 (마우스에서 FcγRIII 및 인간에서 FcγRIIIA)를 선택적으로 발현하지만 마우스 및 인간에서 억제 FcγRIIB는 발현하지 않는다. 인간 IgG1은 대부분의 인간 Fc 수용체에 결합하고, 그것이 결합하는 활성화 Fc 수용체의 유형과 관련하여 뮤린 IgG2a와 동등한 것으로 간주된다.
"Fc 영역" (결정화가능 단편 영역) 또는 "Fc 도메인" 또는 "Fc"는, 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 상에 위치하는 Fc 수용체 또는 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)에 대한 결합을 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 따라서, Fc 영역은 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인 (예를 들어, CH1 또는 CL)을 제외한 항체의 불변 영역을 포함한다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 제2 (CH2) 및 제3 (CH3) 불변 도메인으로부터 유래된, 2개의 동일한 단백질 단편을 포함하고; IgM 및 IgE Fc 영역은 각각의 폴리펩티드 쇄에 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH 도메인 2-4)을 포함한다. IgG의 경우에, Fc 영역은 이뮤노글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3, 및 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 C226 또는 P230에서의 아미노산 잔기 (또는 이들 2종의 아미노산 사이의 아미노산)로부터 중쇄의 카르복시-말단까지의 스트레치로 정의되고, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따른다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 약 아미노산 231로부터 약 아미노산 340까지 연장되는 반면에, CH3 도메인은 Fc 영역의 CH2 도메인의 C-말단 측에 위치하며, 즉, IgG의 약 아미노산 341로부터 약 아미노산 447까지 연장된다. 본원에 사용된 Fc 영역은 임의의 동종이형 변이체를 포함한 천연 서열 Fc, 또는 변이체 Fc (예를 들어, 비-자연 발생 Fc)일 수 있다. Fc는 또한 단리된 상태의 또는 Fc-포함 단백질 폴리펩티드 예컨대 "Fc 융합 단백질" (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신)로도 지칭되는 "Fc 영역을 포함하는 결합 단백질"의 문맥에서의 이러한 영역을 지칭할 수 있다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 이뮤노글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 인접 아미노산 (통상적으로 선형 에피토프) 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치되는 비인접 아미노산 (통상적으로 입체형태적 에피토프) 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 항상 그러한 것은 아니지만 전형적으로 변성 용매에의 노출 시 유지되고, 반면에 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리 시 상실된다. 에피토프는 고유한 공간 입체형태에 전형적으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 어떠한 에피토프가 주어진 항체에 의해 결합되는지 결정하는 방법 (즉, 에피토프 맵핑)은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 이뮤노블롯팅 및 면역침전 검정을 포함하고, 여기서 중첩 또는 인접 펩티드는 주어진 항체와의 반응성에 대해 시험된다. 에피토프의 공간 입체형태를 결정하는 방법은 관련 기술분야의 기술 및 본원에 기재된 기술, 예를 들어 X선 결정학, 2-차원 핵 자기 공명 및 HDX-MS를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [에피토프 Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)] 참조).
용어 "에피토프 맵핑"은 항체-항원 인식을 위한 분자 결정기의 확인 과정을 지칭한다.
2종 이상의 항체와 관련하여 용어 "동일한 에피토프에 결합하다"는 항체가 주어진 방법에 의해 결정 시 동일한 아미노산 잔기의 절편에 결합한다는 것을 의미한다. 항체가 본원에 기재된 항체와 "α-시뉴클레인 상의 동일한 에피토프"에 결합하는지 여부를 결정하는 기술은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 에피토프의 원자 해상도를 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 X선 분석, 및 수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)을 포함한다. 다른 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 것이며, 여기서 항원 서열 내의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 상실은 종종 에피토프 성분의 지표로 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑에 대한 컴퓨터 조합 방법이 또한 사용될 수 있다. 이들 방법은 관심 항체가 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특이적인 짧은 펩티드를 친화성 단리하는 능력에 의존한다. 동일한 VH 및 VL 또는 동일한 CDR1, 2 및 3 서열을 갖는 항체는 동일한 에피토프에 결합할 것으로 예상된다.
"표적에의 결합에 대해 또 다른 항체와 경쟁하는" 항체는 다른 항체의 표적에 대한 결합을 (부분적으로 또는 완전히) 억제하는 항체를 지칭한다. 2종의 항체가 표적에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하는지 여부, 즉 하나의 항체가 다른 항체가 표적에 결합하는 것을 억제하는지 여부 및 억제하는 정도는 공지된 경쟁 실험을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 또 다른 항체가 표적에 결합하는 것과 경쟁하고, 그의 결합을 억제한다. 경쟁 검정은 예를 들어, 문헌 [Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc ; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 또는 Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 경쟁 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접한 에피토프에 결합한다 (예를 들어, 입체 장애에 의해 입증되는 바와 같음).
다른 경쟁적 결합 검정은 하기를 포함한다: 고체상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)] 참조); 고체상 직접 표지된 검정, 고체상 직접 표지된 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)] 참조); I-125 표지를 사용한 고체상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Cheung et al., Virology 176:546 (1990)]); 및 직접 표지된 RIA. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)).
본원에 사용된 용어 "특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합하다" 및 "특이적으로 결합하다"는 미리 결정된 항원 상의 에피토프에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 (i) 예를 들어 분석물로서 미리 결정된 항원을 사용하고 리간드로서 항체를 사용하는 비아코어(BIACORE) 2000 기기에서의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술에 의해, 또는 항원 양성 세포에 대한 항체의 결합의 스캐차드 분석에 의해 결정하였을 때, 대략 10-7 M 미만, 예컨대 대략 10 -8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 심지어 그 미만의 평형 해리 상수 (KD)로 결합하고, (ii) 미리 결정된 항원 또는 밀접하게-관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 2-배 더 큰 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "kassoc" 또는 "ka"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것으로 의도되는 한편, 본원에 사용된 용어 "kdis" 또는 "kd"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "KD"는 kd 대 ka의 비 (즉, kd/ka)로부터 수득되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되고, 몰 농도 (M)로서 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것, 바람직하게는 바이오센서 시스템 예컨대 비아코어® 시스템 또는 유동 세포측정법 및 스캐차드 분석을 사용하는 것에 의한다.
항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하는 시험관내 또는 생체내 검정과 관련하여 용어 "EC50"은 최대 반응의 50%, 즉, 최대 반응과 기준선 사이의 중간인 반응을 유도하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 농도를 지칭한다.
"폴리펩티드"는 쇄의 길이에 대한 상한치 없이, 적어도 2개의 연속적으로 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 쇄를 지칭한다. 단백질 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 변형 예컨대, 비제한적으로, 글리코실화, 인산화 또는 디술피드 결합 형성을 함유할 수 있다. "단백질"은 1개 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, cDNA일 수 있다.
또한, 본원에 제시된 서열의 "보존적 서열 변형", 즉 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 또는 아미노산 서열을 함유하는 항체의 항원에 대한 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형이 제공된다. 이러한 보존적 서열 변형은 보존적 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 뿐만 아니라 뉴클레오티드 및 아미노산 부가 및 결실을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에서 정의되었다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 항-α-시뉴클레인 항체에서 예측되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)] 참조).
핵산의 경우에, 용어 "실질적 상동성"은 2개의 핵산 또는 그의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교된 경우에, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실에 의해 적어도 약 80%의 뉴클레오티드, 통상적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 뉴클레오티드에서 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 실질적 상동성은 절편이 선택적 혼성화 조건 하에 가닥의 상보체에 혼성화될 경우에 존재한다.
폴리펩티드의 경우, 용어 "실질적 상동성"은 2개의 폴리펩티드 또는 그의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교된 경우에, 적절한 아미노산 삽입 또는 결실에 의해 적어도 약 80%의 아미노산, 통상적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 아미노산에서 동일한 것을 나타낸다.
2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100). 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능)을 사용하여 결정될 수 있다. PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0) 내로 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))]의 알고리즘을 사용하여 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성을 또한 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능) 내로 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))] 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.
본원에 기재된 핵산 및 단백질 서열은 추가로, 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공중 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 워드길이 = 12로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여 본원에 기재된 핵산 분자에 상동인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 워드길이 = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본원에 기재된 단백질 분자에 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭드 BLAST(Gapped BLAST)를 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
핵산은 전세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 (예를 들어, 염색체의 다른 부분) 또는 단백질로부터, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것들을 포함한 표준 기술에 의해 정제되었을 때 "단리되거나" 또는 "실질적으로 순수해진다". 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조한다.
핵산, 예를 들어, cDNA는 유전자 서열을 제공하는 표준 기술에 따라 돌연변이될 수 있다. 코딩 서열의 경우에, 이들 돌연변이는 목적하는 바와 같이 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 천연 V, D, J, 불변, 스위치 및 본원에 기재된 다른 이러한 서열에 실질적으로 상동이거나 또는 그로부터 유래된 DNA 서열이 고려된다 (여기서 "유래된"은 서열이 또 다른 서열과 동일하거나 또는 이로부터 변형된 것임을 나타냄).
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그에 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게, "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로 재조합 DNA 기술에서 유용성이 있는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태로 존재하는 것이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 이는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나, 동등한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)가 또한 포함된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 세포에 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 세포를 지칭하는 것으로 의도되고, 이는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포, 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손까지 지칭하는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 임의의 천연 또는 합성 면역원성 물질, 예컨대 단백질, 펩티드 또는 합텐을 지칭한다. 항원은 α-시뉴클레인 또는 그의 단편일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결된"은 2개 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 연결은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 연결은 또한 유전자적일 수 있다 (즉, 재조합적으로 융합됨). 이러한 연결은 관련 기술분야에 인지된 매우 다양한 기술, 예컨대 화학적 접합 및 재조합 단백질 생산을 사용하여 달성될 수 있다.
본원에 사용된 "투여"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 대상체에게 치료제를 포함하는 조성물을 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 기재된 항체의 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 대안적으로, 본원에 기재된 항체는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다. 또한, 투여는 예를 들어 1회, 복수회, 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질환과 연관된 증상, 합병증, 상태 또는 생화학적 징후의 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전, 완화, 호전, 억제 또는 지연 또는 예방할 목적으로 대상체에 대해 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정, 또는 대상체에게 활성제를 투여하는 것을 지칭한다. 치료는 질환을 갖는 대상체 또는 질환을 갖지 않는 대상체 (예를 들어, 예방용)에 대한 것일 수 있다.
용어 "유효 용량" 또는 "유효 투여량"은 목적하는 효과를 달성하거나 또는 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로 정의된다. 약물 또는 치료제의 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 투여량"은 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 사용되는 경우에, 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상-부재 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지에 의해 입증되는 질환 퇴행을 촉진하는 약물의 임의의 양이다. 약물의 치료 유효량 또는 투여량은 "예방 유효량" 또는 "예방 유효 투여량"을 포함하며, 이는 질환이 발생할 위험 또는 질환의 재발을 겪을 위험이 있는 대상체에게 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 투여되는 경우에, 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하거나 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 치료제의 능력은 숙련된 진료의에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측해주는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 작용제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 뇌 내 루이 소체 또는 응집된 α-시뉴클레인의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치유적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
대상체가 적어도 하나의 공지된 위험-인자 (예를 들어, 유전적, 생화학적, 가족력, 상황 노출)를 가져서, 개체가 위험 인자를 갖지 않는 개체보다 통계적으로 유의하게 더 높은 질환 발생 위험이 있는 그러한 위험 인자를 갖는 것으로 평가된 경우에, 개체는 증가된 질환 위험에 있다.
용어 "증상"은 환자에 의해 지각되는 바와 같은, 변경된 걸음걸이와 같은 질환의 주관적 증거를 지칭한다. "징후"는 의사에 의해 관찰되는 바와 같은 질환의 객관적 증거를 지칭한다.
통계적 유의성은 p≤0.05를 의미한다.
용어 "샘플" 은 환자 또는 대상체로부터 채취한 조직, 체액, 또는 세포 (또는 임의의 상기한 것들의 분획)를 지칭한다. 통상적으로, 조직 또는 세포가 환자로부터 제거될 것이지만, 생체내 진단이 또한 고려된다.
본원에 사용된 용어 "약"은 명시된 값의 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "및/또는"은 1개 이상의 연관된 열거된 항목 중 임의의 것 및 모든 조합을 포함한다.
본 발명 및 첨부된 청구범위의 기재에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다.
개시내용의 다양한 측면이 하기 서브섹션에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
I. 항-α-시뉴클레인 (αSyn) 항체
특정한 기능적 특색 또는 특성을 특징으로 하는 항체, 예를 들어 단리된 항체, 예를 들어 완전 인간 단리된 항체가 본원에 기재된다. 예를 들어, 항체는 인간 α-시뉴클레인, 즉 단량체 인간 α-시뉴클레인 및 올리고머 인간 α-시뉴클레인 둘 다에 특이적으로 결합한다. 추가적으로, 항체는 하나 이상의 비-인간 종으로부터α-시뉴클레인, 예컨대 마우스 또는 래트 α-시뉴클레인, 또는 시뉴클레인의 상이한 이소형, 예컨대 β-시뉴클레인 및 γ-시뉴클레인과 교차 반응할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 마우스 및 래트 α-시뉴클레인에 결합함;
(b) β-시뉴클레인 및 γ-시뉴클레인에 결합함;
(c) α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)에 대해 더 큰 친화도를 가짐;
(d) α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)-유도된 가용성 또는 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)의 생성을 억제함;
(e) 뇌 내 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체를 갖는 환자로부터 제조된 PFF 및/또는 뇌 용해물로부터 가용성 또는 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)를 생산하는 분자 종을 고갈시킴;
(f) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 123-128의 전부 또는 일부에 결합함;
(g) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 125-128의 전부 또는 일부에 결합함;
(h) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-139의 전부 또는 일부에 결합함;
(i) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 119-126의 전부 또는 일부에 결합함; 및
(j) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-138의 전부 또는 일부에 결합함.
일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 PFF이다. 일부 실시양태에서, PFF는 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 가용성이다. 다른 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 불용성이다. 일부 실시양태에서, 항체는 불용성 또는 가용성 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체의 생성을 억제한다. 다른 실시양태에서, 항체는 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인을 함유하지 않는 불용성 또는 가용성 α-시뉴클레인 응집체의 생성을 억제한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)에 우선적으로 결합하고, 이는 α-시뉴클레인 단량체에 대한 결합 친화도 대 α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)에 대한 결합 친화도의 비로 제시될 수 있으며, 이는 또한 본원에서 α-시뉴클레인 단량체/α-시뉴클레인 올리고머 결합 비로 지칭될 수 있다. PFF가 α-시뉴클레인 올리고머 종인 경우에, 비는 α-시뉴클레인 단량체/PFF 결합 비 또는 "M/P 비"로 지칭되고, 이는 실시예 3에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 75 이상, 100 이상, 150 이상 200 이상, 250 이상, 300 이상, 350 이상, 400 이상, 450 이상, 500 이상, 600 이상, 700 이상, 800 이상, 900 이상, 1000 이상, 1500 이상, 2000 이상, 2500 이상, 3000 이상, 3500 이상, 4000 이상, 5000 이상, 6000 이상, 7000 이상, 8000 이상, 9000 이상, 10000 이상, 10 내지 10000, 50 내지 10000, 100 내지 10000, 500 내지 10000, 700 내지 10000, 1500 내지 10000, 3000 내지 10000, 5000 내지 10000, 7000 내지 10000, 100 내지 7000, 500 내지 7000, 700 내지 7000, 1500 내지 7000, 3000 내지 7000, 5000 내지 7000, 100 내지 5000, 500 내지 5000, 700 내지 5000, 700 내지 1500, 700 내지 3000, 700 내지 5000, 100 내지 3000, 500 내지 3000, 700 내지 3000, 1500 내지 3000, 100 내지 1500, 500 내지 1500, 700 내지 1500, 100 내지 700, 500 내지 700, 또는 100 내지 500의 M/P 비를 갖는다. 일부 실시양태에서, 단량체 및 올리고머 α-시뉴클레인에 대한 항체의 결합 친화도는 M/P 비를 계산하기 위해 ELISA를 사용하여, 예를 들어 실시예 3에 기재된 바와 같이 결정된다.
일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 단량체 α-시뉴클레인에 100 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 2 nM 이하의 EC50으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 단량체 α-시뉴클레인에 500 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 1 nM 이하의 EC50으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 단량체 α-시뉴클레인에 500 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 0.5 nM 이하의 EC50으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 단량체 α-시뉴클레인에 500 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 0.3 nM 이하의 EC50으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 단량체 α-시뉴클레인에 500 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 0.2 nM 이하의 EC50으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 단량체 α-시뉴클레인에 700 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 1 nM 이하의 EC50으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 단량체 α-시뉴클레인에 700 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 0.5 nM 이하의 EC50으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 단량체 α-시뉴클레인에 700 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 0.3 nM 이하의 EC50으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 단량체 α-시뉴클레인에 700 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 0.2 nM 이하의 EC50으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 올리고머 및 단량체 α-시뉴클레인에 대한 EC50 값은 ELISA를 사용하여, 예를 들어 실시예 3에 기재된 바와 같이 결정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 올리고머 α-시뉴클레인, 예를 들어, PFF (예를 들어, 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 PFF)에, ELISA에 의해 결정된 바와 같이, 예를 들어 실시예 3에 기재된 바와 같이, 50 nM 이하, 40 nM 이하, 30 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 4 nM 이하, 3 nM 이하, 2 nM 이하, 1 nM 이하, 0.9 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.07 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.03 nM 이하, 또는 0.01 이하의 EC50으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 PFF-유도된 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)의 생성을 억제할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항체는 PFF-유도된 α-시뉴클레인 세린-129 인산화를, 예를 들어 실시예 10에 기재된 고함량 면역형광 검정을 사용하여 평가된 바와 같이, 0.2 nM 이하, 0.15 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.09 nM 이하, 0.08 nM 이하, 0.07 nM 이하, 0.06 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.04 nM 이하, 0.03 nM 이하, 0.02 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.005 nM 이하의 IC50으로 억제한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 뇌 내에 루이 소체 또는 α-시뉴클레인 응집을 갖는 환자로부터 제조된 PFF 및/또는 뇌 용해물의 α-시뉴클레인 세린-129 인산화된 유도 활성을 고갈시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 α-시뉴클레인의 C-말단 영역의 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-α-시뉴클레인 항체는, 예를 들어 인간 α-시뉴클레인의 중첩 펩티드에의 항체의 결합에 의해 결정된 바와 같이 (실시예 2 참조), 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 123-128의 전부 또는 일부에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는, 예를 들어 인간 α-시뉴클레인의 중첩 펩티드에의 항체의 결합에 의해 결정된 바와 같이 (실시예 2 참조), 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 125-128의 전부 또는 일부에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는, 예를 들어 인간 α-시뉴클레인의 중첩 펩티드에의 항체의 결합에 의해 결정된 바와 같이 (실시예 2 참조), 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-139의 전부 또는 일부에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는, 예를 들어 인간 α-시뉴클레인의 중첩 펩티드에의 항체의 결합에 의해 결정된 바와 같이 (실시예 2 참조), 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 119-126의 전부 또는 일부에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는, 예를 들어 인간 α-시뉴클레인의 중첩 펩티드에의 항체의 결합에 의해 결정된 바와 같이 (실시예 2 참조), 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-138의 전부 또는 일부에 결합할 수 있다.
관련 기술분야에 공지되고 본원에 기재된 방법론에 따라 결정된 바와 같은 상기 기재된 기능적 특성 (예를 들어, 생화학적, 면역화학적, 세포적, 생리학적 또는 다른 생물학적 활성 등) 중 1종 이상을 나타내는 항체는, 항체의 부재 하에 (예를 들어, 또는 비관련 특이성의 대조군 항체가 존재하는 경우) 관찰되는 것에 비해 특정한 활성에 있어서의 통계적으로 유의한 차이와 관련된다는 것이 이해될 것이다. 바람직하게는, 측정된 파라미터에서의 항-α-시뉴클레인 항체-유도된 증가는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% (즉 2배), 3배, 5배 또는 10배 증가이다. 반대로, 측정된 파라미터에서의 항-α-시뉴클레인 항체-유도된 감소는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 감소이다.
예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함한, α-시뉴클레인 (예를 들어, 단량체 α-시뉴클레인 및 올리고머 α-시뉴클레인)에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 적합한 검정은 실시예에 상세하게 기재된다. 항체의 결합 동역학 (예를 들어, 결합 친화도)은 또한, 관련 기술분야에 공지된 표준 검정, 예컨대 비아코어 분석에 의해 평가될 수 있다. α-시뉴클레인의 기능적 특성에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 검정은 하기 및 실시예에 추가로 상세하게 기재된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 α-시뉴클레인 항체는 천연 항체가 아니거나, 또는 자연 발생 항체가 아니다.
II. 예시적인 항-α-시뉴클레인 (αSyn) 항체
본원에 기재된 특정한 항체는 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리되고 구조적으로 특징화된 항체 7A10, 7A10-T93A, 11H11 (11H11-1 및 11H11-2), 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8 (23H8-1, 23H8-2, 23H8-3), 및 1E8의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 갖는 항체, 예를 들어 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 그의 가변 영역 또는 CDR 서열에 대해 적어도 80% 동일성 (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성)을 갖는 항체이다. 7A10, 7A10-T93A, 11H11 (11H11-1 및 11H11-2), 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8, 및 1E8의 VH 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 8, 18, 31, 43, 53, 63, 73, 83, 99, 및 113에 제시된다. 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8의 VL 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, 및 114에 제시된다.
따라서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 8, 18, 31, 43, 53, 63, 73, 83, 99, 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다.
또한, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, 및 114로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 제공된다.
또한 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다:
(a) 각각 서열식별번호: 8 및 9를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(b) 각각 서열식별번호: 18 및 19를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(c) 각각 서열식별번호: 31 및 32를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(d) 각각 서열식별번호: 31 및 33을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(e) 각각 서열식별번호: 43 및 44를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(f) 각각 서열식별번호: 53 및 54를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(g) 각각 서열식별번호: 63 및 64를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(h) 각각 서열식별번호: 73 및 74를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(i) 각각 서열식별번호: 83 및 84를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(j) 각각 서열식별번호: 99 및 100을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(k) 각각 서열식별번호: 99 및 101을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(l) 각각 서열식별번호: 99 및 102를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; 및
(m) 각각 서열식별번호: 113 및 114를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열.
항-α-시뉴클레인 항체는 7A10 (및 7A10-T93A, 7A10과 VHCDR1-3 및 VLCDR1-3 서열을 공유함), 11H11 (11H11-1 및 11H11-2는 공통 VH를 공유하지만 상이한 VL을 가짐), 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8 (23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 이는 공통 VH를 공유하지만 상이한 VL을 가짐), 및 1E8, 또는 그의 조합의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함할 수 있다. 7A10 (및 7A10-T93A), 11H11, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8, 및 1E8의 VH CDR1의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 및 107에 제시된다. 7A10 (및 7A10-T93A), 11H11, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8, 및 1E8의 VH CDR2의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 및 108에 제시된다. 7A10 (및 7A10-T93A), 11H11, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8, 및 1E8의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4, 24, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 및 109에 제시된다. 7A10 (및 7A10-T93A), 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8의 VL CDR1의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, 및 110에 제시된다. 7A10 (및 7A10-T93A), 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8의 VL CDR2의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 6, 26, 29, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 94, 97, 및 111에 제시된다. 7A10 (및 7A10-T93A), 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8의 VL CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, 및 112에 제시된다. CDR 영역은 카바트 시스템 (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)을 사용하여 서술된다.
이들 항체 각각이 α-시뉴클레인에 결합하고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공된다는 것을 고려하면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"되어 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있지만, 각각의 항체는 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유하여야 함) 본원에 기재된 다른 항-α-시뉴클레인 결합 분자를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 α-시뉴클레인 결합은 상기 및 실시예에 기재된 결합 검정 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. 바람직하게는, VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 바람직하게는, 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 모노클로날 항체 7A10 (및 7A10-T93A), 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8에 대한 본원에 개시된 CDR 서열과 구조적으로 유사한 서열로 치환하는 것에 의해 신규 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
따라서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공되며:
(a) 서열식별번호: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 및 107로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열식별번호: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 및 108로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열식별번호: 4, 24, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 및 109로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열식별번호: 5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열식별번호: 6, 26, 29, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 94, 97, 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열식별번호: 7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, 및 112로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인에 특이적으로 결합한다.
한 실시양태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역은 하기를 포함하며;
(a) 서열식별번호: 2-4;
(b) 서열식별번호: 22-24;
(c) 서열식별번호: 37-39;
(d) 서열식별번호: 47-49;
(e) 서열식별번호: 57-59;
(f) 서열식별번호: 67-69;
(g) 서열식별번호: 77-79;
(h) 서열식별번호: 87-89; 또는
(i) 서열식별번호: 107-109,
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역은 하기를 포함하며;
(a) 서열식별번호: 5-7;
(b) 서열식별번호: 25-27;
(c) 서열식별번호: 28-30;
(d) 서열식별번호: 40-42;
(e) 서열식별번호: 50-52;
(f) 서열식별번호: 60-62;
(g) 서열식별번호: 70-72;
(h) 서열식별번호: 80-82;
(i) 서열식별번호: 90-92;
(j) 서열식별번호: 93-92
(k) 서열식별번호: 96-98; 또는
(l) 서열식별번호: 110-112,
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인에 특이적으로 결합한다.
특정한 실시양태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서
(a) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 2-4를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 5-7을 포함하거나;
(b) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 22-24를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 25-27을 포함하거나;
(c) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 22-24를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 28-30을 포함하거나;
(d) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 37-39를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 40-42를 포함하거나;
(e) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 47-49를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 50-52를 포함하거나;
(f) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 57-59를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 60-62를 포함하거나;
(g) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 67-69를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 70-72를 포함하거나;
(h) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 77-79를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 80-82를 포함하거나;
(i) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 87-89를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 90-92를 포함하거나;
(j) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 87-89를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 93-95를 포함하거나;
(k) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 87-89를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 96-98을 포함하거나; 또는
(l) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 107-109를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 110-112를 포함하며,
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인에 특이적으로 결합한다.
본원에 기재된 VH 도메인, 또는 그의 1개 이상의 CDR은 중쇄, 예를 들어 전장 중쇄를 형성하기 위해 불변 도메인에 연결될 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 VL 도메인, 또는 그의 1개 이상의 CDR은 경쇄, 예를 들어 전장 경쇄를 형성하기 위해 불변 도메인에 연결될 수 있다. 전장 중쇄 (C-말단 리신 (K) 제외 또는 C-말단 글리신 및 리신 (GK) 제외, 이는 부재할 수 있음) 및 전장 경쇄는 조합되어 전장 항체를 형성한다.
본원에 기재된 VH 도메인은, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 바와 같이 자연 발생된 또는 변형된 인간 IgG, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 불변 도메인에 융합될 수 있다. 예를 들어, VH 도메인은 하기 인간 IgG1 아미노산 서열에 융합된, 본원에 기재된 임의의 VH 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
Figure 112019092916809-pct00002
인간 IgG1 불변 도메인은 또한 동종이형 변이체의 것일 수 있다. 예를 들어, IgG1의 동종이형 변이체는 R107K, E189D 및 M191L (상기 밑줄표시됨)을 포함한다. 전장 중쇄 영역 내에서, 이들 아미노산 치환은 R214K, E356D 및 M358L로 넘버링된다.
본원에 기재된 VL 도메인은 인간 카파 또는 람다 경쇄의 불변 도메인에 융합될 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 하기 인간 IgG1 카파 경쇄 아미노산 서열에 융합된, 본원에 기재된 임의의 VL 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
Figure 112019092916809-pct00003
특정 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 C-말단에 리신 또는 또 다른 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 C-말단에 1개 이상의 아미노산이 결여되어 있고, 예를 들어 C-말단 서열 LSPG (서열식별번호: 127) 또는 LSP를 갖는다.
본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체의 예시적인 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 표 22에 제시된다.
일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 10, 20, 34, 45, 55, 65, 75, 85, 103 및 115에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기서 경쇄는 서열식별번호: 11, 21, 35, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 104, 105, 106 및 116에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기서 중쇄 및 경쇄는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
(a) 10 및 11,
(b) 20 및 21,
(c) 34 및 35,
(d) 34 및 36,
(e) 45 및 46,
(f) 55 및 56,
(g) 65 및 66,
(h) 75 및 76,
(i) 85 및 86,
(j) 103 및 104,
(k) 103 및 105,
(l) 103 및 106, 및
(m) 115 및 116.
표 22에 제시된 중쇄 또는 경쇄 중 임의의 것 (또는 그의 가변 영역)과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄, 예를 들어, 서열식별번호: 10, 11, 20, 21, 34, 35, 36, 45, 46, 55, 56, 65, 66, 75, 76, 85, 86, 103, 104, 105, 106, 115, 및 116이 목적하는 특징, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 것을 갖는 항-인간 α-시뉴클레인 항체를 형성하는데 사용될 수 있다. 예시적인 변이체는, 예를 들어 불변 도메인에서의 동종이형 변이, 및/또는 가변 또는 불변 영역에서의 돌연변이, 예컨대 본원에 개시된 돌연변이를 포함하는 것이다. 표 22에 제시된 중쇄 또는 경쇄 중 임의의 것 (또는 그의 가변 영역)과 최대 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산이 상이한 (치환, 부가 또는 결실에 의함) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄가 목적하는 특징, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 것을 갖는 항-α-시뉴클레인 항체를 형성하는데 사용될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 상기 기재된 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 마우스 및 래트 α-시뉴클레인에 결합함;
(b) β-시뉴클레인 및 γ-시뉴클레인에 결합함;
(c) α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)에 대해 더 큰 친화도를 가짐;
(d) α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)-유도된 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)의 생성을 억제함;
(e) 뇌 내 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체를 갖는 환자로부터 제조된 PFF 및/또는 뇌 용해물로부터 가용성 또는 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)를 생산하는 분자 종을 고갈시킴;
(f) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 123-128의 전부 또는 일부에 결합함;
(g) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 125-128의 전부 또는 일부에 결합함;
(h) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-139의 전부 또는 일부에 결합함;
(i) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 119-126의 전부 또는 일부에 결합함; 및
(j) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-138의 전부 또는 일부에 결합함.
일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 PFF이다. 일부 실시양태에서, PFF는 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 가용성이다. 다른 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 불용성이다.
이러한 항체는, 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 하기 서열의 전부 또는 일부에 결합하고:
EAYEMP (서열식별번호: 121),
이는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 123-128에 상응한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 하기 서열의 전부 또는 일부에 결합하고:
YEMP (서열식별번호: 122),
이는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 125-128에 상응한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 하기 서열의 전부 또는 일부에 결합하고:
EEGYQDYEPE (서열식별번호: 124),
이는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 130-139에 상응한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 하기 서열의 전부 또는 일부에 결합하고:
DPDNEAYE (서열식별번호: 125),
이는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 119-126에 상응한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 하기 서열의 전부 또는 일부에 결합하고:
EEGYQDYEP (서열식별번호: 123),
이는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 잔기 130-138에 상응한다.
또한 본원에 기재된 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항-α-시뉴클레인 항체, 예를 들어, 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8 중 임의의 것과 α-시뉴클레인에의 결합에 대해 경쟁하는 항-α-시뉴클레인 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 인간 α-시뉴클레인 (예를 들어, 단량체 α-시뉴클레인 또는 올리고머 α-시뉴클레인)에 대한 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8 중 임의의 것의 결합을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 억제한다. 경쟁 항체는 관련 기술분야에 공지된 표준 결합 검정 (예를 들어, 경쟁적 ELISA 검정)을 사용하여 α-시뉴클레인에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 그의 능력에 기초하여 확인될 수 있다.
또한 본원에 기재된 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항-α-시뉴클레인 항체, 예를 들어, 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8 중 임의의 것과 α-시뉴클레인 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항-α-시뉴클레인 항체가 본원에 제공된다. 항체가 본원에 기재된 항체와 α-시뉴클레인 상의 동일한 에피토프에 결합하는지 결정하는 방법은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 방법으로 여기서 항원 서열 내의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 상실은 에피토프 성분의 지표로 간주되는 것인 방법; MS-기반 단백질 풋프린팅, 및 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특정 짧은 펩티드 (천연 3차원 형태 또는 변성된 형태)를 친화도 단리하는 관심 항체의 능력을 평가하는 방법을 포함한다.
본원에 개시된 항체는 모든 공지된 형태의 항체 및 항체-유사 특성을 갖는 다른 단백질 스캐폴드를 포함한다. 예를 들어, 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이적 분자, 면역접합체, 키메라 항체, 또는 항체-유사 특성을 갖는 단백질 스캐폴드, 예컨대 피브로넥틴 또는 안키린 반복물일 수 있다. 항체는 또한 Fab, Fab'2, scFv, 아피바디(affibody)®, 아비머, 나노바디, 또는 도메인 항체일 수 있다. 항체는 또한 하기 이소형: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, 및 IgE 중 임의의 것을 포함한, 임의의 이소형을 가질 수 있다. IgG 항체가 바람직하다. 전장 항체는 표준 재조합 DNA 기술 및 가변 영역 서열에 작동가능하게 연결될 목적하는 불변 영역 서열을 코딩하는 핵산을 사용하여 VH 및 VL 서열로부터 제조될 수 있다.
III. 특정한 배선 서열을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 특정한 배선 중쇄 이뮤노글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정한 배선 경쇄 이뮤노글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 인간 항체는, 항체의 가변 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득되는 경우에, 특정한 배선 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키거나 또는 파지 상에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열과 서열 면에서 가장 근접한 (즉, 최대 % 동일성) 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적 도입으로 인해, 배선 서열과 비교 시 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 전형적으로 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열이 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 배선 서열)과 비교하였을 때 인간 항체를 인간의 것으로 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열 면에서 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정한 인간 배선 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 디스플레이할 수 있다.
IV. 상동 항체
본원에 기재된 바람직한 항체의 아미노산 서열과 상동인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항-α-시뉴클레인 항체가 본원에 포괄되고, 여기서 항체는 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 단리된 항-α-시뉴클레인 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 여기서:
(a) 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 8, 18, 31, 43, 53, 63, 73, 83, 99, 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 서열식별번호: 8, 18, 31, 43, 53, 63, 73, 83, 99, 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 또는 1-50개의 아미노산 변화 (즉, 아미노산 치환, 부가 또는 결실)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, 및 114로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 서열식별번호: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, 및 114로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 또는 1-50개의 아미노산 변화 (즉, 아미노산 치환, 부가 또는 결실)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 항체는 α-시뉴클레인에 특이적으로 결합하고,
(d) 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(1) 마우스 및 래트 α-시뉴클레인에 결합함;
(2) β-시뉴클레인 및 γ-시뉴클레인에 결합함;
(3) α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)에 대해 더 큰 친화도를 가짐;
(4) α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)-유도된 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)의 생성을 억제함;
(5) 뇌 내 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체를 갖는 환자로부터 제조된 PFF 및/또는 뇌 용해물로부터 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)를 생산하는 분자 종을 고갈시킴;
(6) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 123-128 (서열식별번호: 121)의 전부 또는 일부에 결합함;
(7) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 125-128 (서열식별번호: 122)의 전부 또는 일부에 결합함;
(8) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 130-139 (서열식별번호: 124)의 전부 또는 일부에 결합함;
(9) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 119-126 (서열식별번호: 125)의 전부 또는 일부에 결합함; 및
(10) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 130-138 (서열식별번호: 123)의 전부 또는 일부에 결합함.
일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 PFF이다. 일부 실시양태에서, PFF는 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 가용성이다. 다른 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 불용성이다.
일부 실시양태에서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공되며:
(a) 서열식별번호: 8 및 9;
(b) 서열식별번호: 18 및 19;
(c) 서열식별번호: 31 및 32;
(d) 서열식별번호: 31 및 33;
(e) 서열식별번호: 43 및 44;
(f) 서열식별번호: 53 및 54;
(g) 서열식별번호: 63 및 64;
(h) 서열식별번호: 73 및 74;
(i) 서열식별번호: 83 및 84;
(j) 서열식별번호: 99 및 100;
(k) 서열식별번호: 99 및 101;
(l) 서열식별번호: 99 및 102; 및
(m) 서열식별번호: 113 및 114,
여기서 항체는 α-시뉴클레인에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 8 및 9에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 18 및 19에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 31 및 32에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 31 및 33에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 43 및 44에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 37의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 41의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 53 및 54에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 48의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 49의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 50의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 51의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 63 및 64에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 57의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 58의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 60의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 61의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 62의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 73 및 74에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 68의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 83 및 84에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 82의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 99 및 100에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 91의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 92의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 99 및 101에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 99 및 102에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 96의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 97의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 98의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
한 실시양태에서, 각각 서열식별번호: 113 및 114에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 (예를 들어, 단리된 모노클로날 항체)가 제공되며, 여기서:
항체의 중쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
항체의 경쇄 가변 영역은 하기 CDR을 포함하고:
i. 서열식별번호: 110의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
ii. 서열식별번호: 111의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
iii. 서열식별번호: 112의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
여기서 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체이다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-α-시뉴클레인 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서:
(a) 중쇄는 서열식별번호: 10, 20, 34, 45, 55, 65, 75, 85, 103, 및 115로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 서열식별번호: 10, 20, 34, 45, 55, 65, 75, 85, 103, 및 115로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 또는 1-50개의 아미노산 변화 (즉, 아미노산 치환, 부가 또는 결실)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 단 특정 실시양태에서, 서열이 무이펙터 중쇄의 것이면, 중쇄를 무이펙터로 만드는 돌연변이는 변형되지 않고;
(b) 경쇄는 서열식별번호: 11, 21, 35, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 104, 105, 106, 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 서열식별번호: 11, 21, 35, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 104, 105, 106, 및 116으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 또는 1-50개의 아미노산 변화 (즉, 아미노산 치환, 부가 또는 결실)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 항체는 α-시뉴클레인에 특이적으로 결합하고,
(d) 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(1) 마우스 및 래트 α-시뉴클레인에 결합함;
(2) β-시뉴클레인 및 γ-시뉴클레인에 결합함;
(3) α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)에 대해 더 큰 친화도를 가짐;
(4) α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)-유도된 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)의 생성을 억제함;
(5) 뇌 내 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체를 갖는 환자로부터 제조된 PFF 및/또는 뇌 용해물로부터 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)를 생산하는 분자 종을 고갈시킴;
(6) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 123-128 (서열식별번호: 121)의 전부 또는 일부에 결합함;
(7) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 125-128 (서열식별번호: 122)의 전부 또는 일부에 결합함;
(8) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 130-139 (서열식별번호: 124)의 전부 또는 일부에 결합함;
(9) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 119-126 (서열식별번호: 125)의 전부 또는 일부에 결합함; 및
(10) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 130-138 (서열식별번호: 123)의 전부 또는 일부에 결합함.
일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 PFF이다. 일부 실시양태에서, PFF는 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 가용성이다. 다른 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 불용성이다.
일부 실시양태에서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 제공되며:
(a) 서열식별번호: 10 및 11,
(b) 서열식별번호: 20 및 21,
(c) 서열식별번호: 34 및 35,
(d) 서열식별번호: 34 및 36,
(e) 서열식별번호: 45 및 46,
(f) 서열식별번호: 55 및 56,
(g) 서열식별번호: 65 및 66,
(h) 서열식별번호: 75 및 76,
(i) 서열식별번호: 85 및 86,
(j) 서열식별번호: 103 및 104,
(k) 서열식별번호: 103 및 105,
(l) 서열식별번호: 103 및 106, 및
(m) 서열식별번호: 115 및 116,
여기서 항체는 α-시뉴클레인에 결합한다.
또한, 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및/또는 1E8의 상응하는 CDR과 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 또는 1-5개의 아미노산 변화 (즉, 아미노산 치환, 부가 또는 결실)에서 상이한 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및/또는 VLCDR3을 포함하는 항-α-시뉴클레인 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및/또는 1E8에서 상응하는 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR 각각에서 1-5개의 아미노산 변화를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및/또는 1E8의 CDR에 비해 모든 CDR에 걸쳐 총 1-5개의 아미노산 변화를 포함한다. 이들 변경된 항체는 이들이 상기 열거된 기능적 특성 중 하나 이상을 보유하는지 결정하기 위해, 본원 및 실시예에 기재된 시험관내 및 생체내 검정을 사용하여 시험될 수 있다.
7A10, 11H11 (11H11-1 및 11H11-2), 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8 (23H8-1, 23H8-2, 및 23H8-3), 및/또는 1E8의 것과 상동성을 갖는 서열, 예를 들어 각각 서열식별번호: 8, 18, 31, 43, 53, 63, 73, 83, 99, 및 113, 및 서열식별번호: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, 및 114의 VH 및 VL 영역, 또는 각각 서열식별번호: 10, 20, 34, 45, 55, 65, 75, 85, 103, 및 115, 및 서열식별번호: 11, 21, 35, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 104, 105, 106, 및 116의 중쇄 및 경쇄, 또는 CDR을 갖는 항체는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어, 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능에 대해 코딩된 변경된 항체를 시험하는 것에 의해 수득될 수 있다.
V. 보존적 변형을 갖는 항체
항-α-시뉴클레인 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 여기서 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 바람직한 항체에 기초한 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하고, 여기서 항체는 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 단리된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원 결합 부분은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 여기서:
(a) 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열식별번호: 4, 24, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 및 109로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함하고;
(b) 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열식별번호: 7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함하고;
(c) 항체는 α-시뉴클레인에 특이적으로 결합하고,
(d) 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(1) 마우스 및 래트 α-시뉴클레인에 결합함;
(2) β-시뉴클레인 및 γ-시뉴클레인에 결합함;
(3) α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)에 대해 더 큰 친화도를 가짐;
(4) α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)-유도된 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)의 생성을 억제함;
(5) 뇌 내 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체를 갖는 환자로부터 제조된 PFF 및/또는 뇌 용해물로부터 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)를 생산하는 분자 종을 고갈시킴;
(6) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 123-128 (서열식별번호: 121)의 전부 또는 일부에 결합함;
(7) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 125-128 (서열식별번호: 122)의 전부 또는 일부에 결합함;
(8) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 130-139 (서열식별번호: 124)의 전부 또는 일부에 결합함;
(9) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 119-126 (서열식별번호: 125)의 전부 또는 일부에 결합함; 및
(10) 인간 α-시뉴클레인의 아미노산 위치 130-138 (서열식별번호: 123)의 전부 또는 일부에 결합함.
일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 PFF이다. 일부 실시양태에서, PFF는 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 제조된다. 일부 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 가용성이다. 다른 실시양태에서, α-시뉴클레인 올리고머는 불용성이다.
바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열식별번호: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 및 108로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열식별번호: 6, 26, 29, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 94, 97, 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열식별번호: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 및 107로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열식별번호: 5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 항체는 상기 열거된 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 또한, CDR 이외의, 또는 CDR에 더하여, 항체의 부분들에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 변형은 프레임워크 영역에서 또는 Fc 영역에서 이루어질 수 있다. 가변 영역 또는 중쇄 또는 경쇄는 본원에 제공된 항-α-시뉴클레인 항체 서열에 비해, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 또는 1-50개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 보존적 및 비-보존적 아미노산 변형의 조합을 포함한다.
VI. 조작 및 변형된 항체
VH 및 VL 영역
또한, 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있는 조작 및 변형된 항체가 제공되며, 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 내 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는, 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 유형은 CDR 그라프팅이다. 항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 우세하게 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방한 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
따라서, 본원에 기재된 또 다른 실시양태는 각각 서열식별번호: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 및 107; 서열식별번호: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 및 108; 및 서열식별번호: 4, 24, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 및 109로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열식별번호: 5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, 및 110; 서열식별번호: 6, 26, 29, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 94, 97, 및 111; 및 서열식별번호: 7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체로부터의 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공중 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷상 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능함), 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of V-H Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836]에서 확인할 수 있고; 그의 각각의 내용은 명백하게 참조로 포함된다.
본원에 기재된 항체에 사용하기에 바람직한 프레임워크 서열은 본원에 기재된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 배선 서열과 비교하여 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
본원에 기재된 조작된 항체는, 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대한 변형이 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 항체가 유래된 배선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 구성으로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이"된 항체가 또한 포괄되는 것으로 의도된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로도 지칭되고, 미국 특허 공개 번호 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 관심 항체의 1개 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키는 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)를 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 다른 관심 기능적 특성이 본원에 기재되고 실시예에 제공된 바와 같이 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
따라서, 또한 (a) 서열식별번호: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 및 107로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 2, 22, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 및 107과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열식별번호: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 및 108로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 3, 23, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 및 108과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) 서열식별번호: 4, 24, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 및 109로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 4, 24, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 및 109와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; (d) 서열식별번호: 5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 5, 25, 28, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 93, 96, 및 110과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (e) 서열식별번호: 6, 26, 29, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 94, 97, 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 6, 26, 29, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 94, 97, 및 111과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 (f) 서열식별번호: 7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7, 27, 30, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 95, 98, 및 102와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-α-시뉴클레인 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분이 제공된다.
항체의 CDR 내의 메티오닌 잔기는 산화되어, 잠재적인 화학적 분해 및 이에 따른 항체의 효력의 감소를 발생시킬 수 있다. 따라서, 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 내의 1개 이상의 메티오닌 잔기가 산화성 분해를 겪지 않은 아미노산 잔기로 대체된 항-α-시뉴클레인 항체가 또한 제공된다.
유사하게, 탈아미드화 부위가 항-α-시뉴클레인 항체로부터, 특히 CDR에서 제거될 수 있다.
Fc 및 변형된 Fc
본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체 가변 영역은 Fc, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc에 연결 (예를 들어, 공유 연결 또는 융합)될 수 있고, 이는 임의의 동종이형 또는 이소동종이형, 예를 들어 IgG1의 경우에: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); IgG2의 경우에: G2m, G2m23(n); IgG3의 경우에: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v); 및 K의 경우에: Km, Km1, Km2, Km3일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1] 참조).
특정 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 FcR 결합을 갖지 않는, 또는 감소된 FcR 결합, 예를 들어 활성화 FcR에 대한 감소된 결합을 갖는 Fc 수용체를 갖는다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체 가변 영역은 무이펙터 또는 거의 무이펙터 Fc, 예를 들어 IgG2 또는 IgG4에 연결된다.
일반적으로, 본원에 기재된 가변 영역은, 전형적으로 항체의 1종 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 1종 이상의 변형을 포함하는 Fc에 연결될 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 항체는 항체의 1종 이상의 기능적 특성을 변경시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 그의 글리코실화가 변경되도록 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시양태가 하기에 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역에서의 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 것이다.
Fc 영역은 불변 영역의 단편, 유사체, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체를 포함하는, 이뮤노글로불린, 바람직하게는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역으로부터 유래된 도메인을 포괄한다. 적합한 이뮤노글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 다른 부류, 예컨대 IgA, IgD, IgE 및 IgM을 포함한다. 이뮤노글로불린의 불변 영역은 이뮤노글로불린 C-말단 영역과 상동인 자연 발생 또는 합성 제조된 폴리펩티드로서 정의되고, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH4 도메인을 개별적으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
이뮤노글로불린의 불변 영역은 Fc 수용체 (FcR) 결합 및 보체 고정을 포함한 많은 중요한 항체 기능을 담당한다. IgA, IgG, IgD, IgE, IgM으로 분류되는, 중쇄 불변 영역의 5종의 주요 부류가 존재하며, 각각은 이소형에 의해 지정된 특징적인 이펙터 기능을 갖는다. 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 공지된 4종의 하위부류로 분류된다.
Ig 분자는 세포 수용체의 다중 부류와 상호작용한다. 예를 들어 IgG 분자는 항체의 IgG 부류에 특이적인 Fcγ 수용체 (FcγR)의 3종의 부류, 즉 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII과 상호작용한다. FcγR 수용체에 대한 IgG의 결합을 위해 중요한 서열은 CH2 및 CH3 도메인에 위치하는 것으로 보고되었다. 항체의 혈청 반감기는 Fc 수용체 (FcR)에 결합하는 항체의 능력에 의해 영향을 받는다.
특정 실시양태에서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역, 예를 들어 바람직한 구조적 특색 및/또는 생물학적 활성을 제공하기 위해 모 Fc 서열 (예를 들어, 변이체를 생성하기 위해 후속 변형되는 비변형된 Fc 폴리펩티드)에 비해 변형된 (예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입에 의함) Fc 서열이다.
예를 들어, (a) 감소된 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 갖고/거나, (b) 감소된 보체 매개 세포독성 (CDC)을 갖고/거나, (c) 감소된 C1q에 대한 친화도를 갖고/거나, (d) 모 Fc에 비해 Fc 수용체에 대해 감소된 친화도를 갖는 Fc 변이체를 생성하기 위해 Fc 영역에서 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 Fc 영역 변이체는 일반적으로 Fc 영역에서 적어도 1개의 아미노산 변형을 포함할 것이다. 아미노산 변형을 조합하는 것은 특히 바람직한 것으로 생각된다. 예를 들어, 변이체 Fc 영역은 그 안에, 예를 들어 본원에서 확인된 특정 Fc 영역 위치의 2, 3, 4, 5개 등의 치환을 포함할 수 있다.
변이체 Fc 영역은 또한 디술피드 결합 형성에 수반되는 아미노산이 제거되거나 또는 다른 아미노산으로 대체되는 서열 변경을 포함할 수 있다. 이러한 제거는 본원에 기재된 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포에 존재하는 다른 시스테인-함유 단백질과의 반응을 피할 수 있다. 시스테인 잔기가 제거된 경우에도, 단일 쇄 Fc 도메인은 여전히 비-공유적으로 함께 유지되는 이량체 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 영역은 선택된 숙주 세포와 보다 상용성이도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)의 소화 효소, 예컨대 프롤린 이미노펩티다제에 의해 인식될 수 있는, 전형적인 천연 Fc 영역의 N-말단 근처의 PA 서열을 제거할 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인 내 1개 이상의 글리코실화 부위가 제거될 수 있다. 전형적으로 글리코실화되는 잔기 (예를 들어, 아스파라긴)는 세포용해 반응을 부여할 수 있다. 이러한 잔기는 결실되거나 비글리코실화된 잔기 (예를 들어, 알라닌)로 치환될 수 있다. 다른 실시양태에서, 보체와의 상호작용에 수반되는 부위, 예컨대 C1q 결합 부위가 Fc 영역으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1의 EKK 서열을 결실시키거나 치환할 수 있다. 특정 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합에 영향을 미치는 부위, 바람직하게는 샐비지 수용체 결합 부위 이외의 부위가 제거될 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 영역은 ADCC 부위가 제거되도록 변형될 수 있다. ADCC 부위는 관련 기술분야에 공지되어 있고; 예를 들어, IgG1 내 ADCC 부위에 관한 문헌 [Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)]을 참조한다. 변이체 Fc 도메인의 구체적 예는, 예를 들어, WO 97/34631 및 WO 96/32478에 개시되어 있다.
한 실시양태에서, Fc의 힌지 영역은 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. Fc의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 경쇄와 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 한 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내에 1개 이상의 아미노산 돌연변이가 도입된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은, 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것에 의해 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시키는 항체의 능력이 변경된다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.
Fc에 대해 이루어질 수 있는 다른 Fc 변형은 FcγR 및/또는 보체 단백질에 대한 결합을 감소 또는 제거하여, Fc-매개 이펙터 기능, 예컨대 ADCC, ADCP 및 CDC를 감소 또는 제거하는 것이다. 예시적인 변형은 위치 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325, 및 328에서의 치환, 삽입 및 결실을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 예시적인 치환은 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L, 및 328R을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. Fc 변이체는 236R/328R을 포함할 수 있다. FcyR 및 보체 상호작용을 감소시키기 위한 다른 변형은 치환 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331 S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P, 및 234V, 뿐만 아니라 돌연변이적 또는 효소적 수단에 의한 또는 단백질을 글리코실화하지 않는 유기체, 예컨대 박테리아에서의 생산에 의한 위치 297에서의 글리코실화의 제거를 포함한다. 이들 및 다른 변형은 문헌 [Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691]에 검토되어 있다.
임의로, Fc 영역은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 추가의 및/또는 대안적 위치에서의 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; 6,194,551; 7,317,091; 8,101,720; PCT 특허 공개 WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 및 WO 06/020114 참조).
Fc 영역의 그의 리간드에 대한 친화도 및 결합 특성은 관련 기술분야에 공지된 다양한 시험관내 검정 방법 (생화학적 또는 면역학적 기반 검정)에 의해 결정될 수 있고, 이는 평형 방법 (예를 들어, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 방사선면역검정 (RIA)) 또는 동역학적 (예를 들어, 비아코어 분석), 및 다른 방법, 예컨대 간접 결합 검정, 경쟁적 억제 검정, 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피 (예를 들어, 겔 여과)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 및 다른 방법은 검사되는 성분 중 1종 이상에 대한 표지를 이용할 수 있고/거나, 발색, 형광, 발광, 또는 동위원소 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 검출 방법을 사용할 수 있다. 결합 친화도 및 동역학의 상세한 설명은 문헌 [Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)]에서 찾아볼 수 있으며, 이는 항체-면역원 상호작용에 초점을 맞춘다.
특정 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 이는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화도를 증가시킴으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375에 기재된 바와 같이, 하기 잔기 중 1개 이상 또는 그 초과가 돌연변이 될 수 있다: 252, 254, 256, 433, 435, 436. 구체적인 예시적 치환은 하기 중 1개 이상을 포함한다: T252L, T254S 및/또는 T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취한 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다. FcRn에 대한 결합을 증가시키고/거나 약동학적 특성을 개선시키는 다른 예시적인 변이체는 위치 259, 308, 428, 및 434에서의 치환을 포함하고, 이는 예를 들어 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y, 및 434M을 포함한다. FcRn에 대한 Fc 결합을 증가시키는 다른 변이체는 하기를 포함한다: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 307Q, 31 1A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 31 1 S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524). FcRn 결합을 조정하기 위한 다른 변형은 문헌 [Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671]에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 특정한 생물학적 특징을 갖는 하이브리드 IgG 이소형이 사용될 수 있다. 예를 들어, CH2 및/또는 CH3 영역 내 IgG1 위치를 2종의 이소형이 상이한 위치에서의 IgG3으로부터의 아미노산으로 치환함으로써 IgG1/IgG3 하이브리드 변이체를 구축할 수 있다. 그에 따라, 1개 이상의 치환, 예를 들어 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221, 435R, 및 436F를 포함하는 하이브리드 변이체 IgG 항체가 구축될 수 있다. 본원에 기재된 다른 실시양태에서, CH2 및/또는 CH3 영역 내 IgG2 위치를 2종의 이소형이 상이한 위치에서의 IgG1로부터의 아미노산으로 치환함으로써 IgG1/IgG2 하이브리드 변이체를 구축할 수 있다. 따라서 1개 이상의 치환, 예를 들어 하기 아미노산 치환: 233E, 234L, 235L, -236G (위치 236에서의 글리신의 삽입을 지칭함) 및 327A 중 1개 이상을 포함하는 하이브리드 변이체 IgG 항체가 구축될 수 있다.
특정 실시양태에서, FcγR에 대해 감소된 결합을 갖는 Fc가 선택된다. 감소된 FcγR 결합을 갖는 예시적인 Fc, 예를 들어 IgG1 Fc는 하기 3개의 아미노산 치환: L234A, L235E 및 G237A를 포함한다. 이러한 삼중 돌연변이체 IgG1 Fc는 본원에서 "IgG1.3f"로 지칭된다.
특정 실시양태에서, 감소된 보체 고정을 갖는 Fc가 선택된다. 감소된 보체 고정을 갖는 예시적인 Fc, 예를 들어 IgG1 Fc는 하기의 2개의 아미노산 치환: A330S 및 P331S를 갖는다.
특정 실시양태에서, 이펙터 기능을 본질적으로 갖지 않는, 즉 FcγR에 대해 감소된 결합 및 감소된 보체 고정을 갖는 Fc가 선택된다. 무이펙터인 예시적인 Fc, 예를 들어, IgG1 Fc는 하기 5개의 돌연변이: L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 포함한다.
IgG4 불변 도메인을 사용하는 경우에, IgG1의 힌지 서열을 모방함으로써 IgG4 분자를 안정화하는 치환 S228P를 포함시키는 것이 통상적으로 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비-글리코실화된 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화를 변경하여, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내에 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 발생시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 행하여 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
불변 영역의 N297 상에서의 글리코실화는 N297 잔기를 또 다른 잔기로, 예를 들어, N297A로 돌연변이시킴으로써 및/또는 인접한 아미노산, 예를 들어 298을 돌연변이시켜 N297 상의 글리코실화를 감소시킴으로써 방지될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 글리코실화 유형을 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본원에 기재된 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하기 위한 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hanai et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되어, 또한 숙주 세포에서 발현된 항체를 저푸코실화시키는 변이체 CHO 세포주, Lec13 세포를 기재한다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내고 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 발생시킨다 (또한, 문헌 [Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
본원에 기재된 항체의 또 다른 변형은 PEG화이다. 항체는 예를 들어, 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해, 항체 또는 그의 단편은 전형적으로 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되도록 하는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응된다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하는데 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화된 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 기재된 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.
VII. 핵산 분자
본원에 기재된 또 다른 측면은 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 (예를 들어, 다른 염색체 DNA, 예를 들어 자연에서 단리된 DNA에 연결된 염색체 DNA) 또는 단백질로부터, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 제한 효소, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것을 포함하는 표준 기술에 의해 정제되었을 때 "단리되거나" 또는 "실질적으로 순수하게 된다". 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본원에 기재된 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본원에 기재된 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 하기에 추가로 기재된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우에, 하이브리도마에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득될 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득되는 항체의 경우에 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술 사용), 항체를 코딩하는 핵산은 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
본원에 기재된 바람직한 핵산 분자는 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8 모노클로날 항체의 VH 및 VL 서열을 코딩하는 것이다 (예를 들어, 표 22 참조).
항-α-시뉴클레인 항체를 제조하는 방법은 각각 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포주에서 중쇄 및 경쇄를 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 또는 이들 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터)를 포함하는 숙주 세포는 본원에 포괄된다.
VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작할 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이러한 문맥에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결된 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (힌지, CH1, CH2 및/또는 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역, 예를 들어 IgG1 영역일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우에, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4 -Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결하여, VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어 VH 및 VL 서열이 연속 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 한다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554] 참조).
또한, 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8 모노클로날 항체의 것 (예를 들어, 표 22에 제시된 것)과 상동인 VH 및 VL 서열을 코딩하는 핵산 분자가 본원에 제공된다. 예시적인 핵산 분자는 7A10, 7A10-T93A, 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11, 2E2, 23H8-1, 23H8-2, 23H8-3, 및 1E8 모노클로날 항체의 VH 및 VL 서열 (예를 들어, 표 22에 제시된 것)을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 70% 동일한, 예를 들어 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 서열을 코딩한다. 또한, 벡터, 예를 들어 핵산을 코딩하는 발현 벡터, 뿐만 아니라 상기 기재된 벡터 또는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또한, 예를 들어 코돈 최적화를 위해, 침묵 치환 (즉, 핵산 분자의 번역시 생성되는 아미노산 서열을 변경시키지 않는 치환)을 갖는 핵산 분자가 본원에 제공된다.
VIII. 항체 생산
본원에 기재된 모노클로날 항체는 다양한 공지된 기술, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)]에 기재된 표준 체세포 혼성화 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 바람직하지만, 원칙적으로는, 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환, 인간 항체 유전자의 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 기술이 또한 이용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하는데 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.
본원에 기재된 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득되고 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조)).
한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 인간 모노클로날 항체이다. α-시뉴클레인에 대해 지시된 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하며, 이는 본원에서 집합적으로 "인간 Ig 마우스"로 지칭된다.
HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 대한 반응으로, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 부류 전환 및 체세포 돌연변이를 거쳐 높은 친화도의 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 (Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌; 문헌 [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 검토됨). HuMab 마우스의 제조 및 용도, 및 이러한 마우스가 보유하는 게놈 변형은 문헌 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; 및 Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있고, 이들 모두의 내용은 구체적으로 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가로 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429 (모두 Lonberg 및 Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani et al.); PCT 공개 번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg 및 Kay); 및 PCT 공개 번호 WO 01/14424 (Korman et al.)를 참조한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모솜 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 생성된다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되며, PCT 공개 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세하게 기재되어 있다.
추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안의 트랜스제닉 동물 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하고 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 (아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))로 지칭되는 대안적 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있으며; 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하고 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜 둘 다를 보유하는 마우스가 사용될 수 있으며; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 추가로, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 관련 기술분야에 기재되어 있고 (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894), 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
인간 항체를 생성하기 위한, 관련 기술분야에 기재된 추가의 마우스 시스템은 (i) 내인성 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역이, 상동 재조합을 통해, 내인성 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 대체되어, 키메라 항체 (인간 V/마우스 C)가 마우스에서 생성되고, 이어서 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 완전 인간 항체로 후속 전환되는, 벨로크이뮨(VelocImmune)® 마우스 (레게네론 파마슈티칼스, 인크.(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)); 및 (ii) 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 영역 및 단일 재배열된 인간 공통 경쇄 가변 영역을 함유하는 마우스인 메모(MeMo)® 마우스 (메루스 바이오파마슈티칼스, 인크.(Merus Biopharmaceuticals, Inc.))를 포함한다. 이러한 마우스, 및 항체를 생성하기 위한 그의 용도가, 예를 들어, WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 및 US 2012/0073004에 기재되어 있다.
본원에 기재된 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al.)을 참조한다.
본원에 기재된 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화 시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.
면역화
α-시뉴클레인에 대한 완전 인간 항체를 생성하기 위해, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 함유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스 (예를 들어, HCo12, HCo7 또는 KM 마우스)는, 다른 항원에 대해 예를 들어 문헌 [Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 및 WO 98/24884]에 기재된 바와 같이, α-시뉴클레인 항원 및/또는 α-시뉴클레인 또는 그의 단편을 발현하는 세포의 정제된 또는 풍부화된 제제로 면역화될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 마우스는 재조합 인간 αSyn WT로 면역화된다. 또 다른 실시양태에서, 마우스는 αSyn A53T-PFF 돌연변이체 단백질로 면역화된다. 또 다른 실시양태에서, 마우스는 αSyn WT-PFF로 면역화된다. 또 다른 실시양태에서, 마우스는 가교된 αSyn WT로 면역화된다. 또 다른 실시양태에서, 마우스는 가교된 A53T PFF로 면역화된다. 또 다른 실시양태에서, 마우스는 αSyn WT-PFF, αSyn A53T-PFF, 가교된 αSyn WT-PFF, 및 가교된 αSyn A53T-PFF의 혼합물로 면역화된다. 대안적으로, 마우스는 인간 α-시뉴클레인을 코딩하는 DNA 또는 그의 단편으로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 제1 주입 시 6-16주령일 것이다. 예를 들어, 재조합 α-시뉴클레인 항원의 정제된 또는 풍부화된 제제 (5-50 μg)가 HuMAb 마우스를 복강내로 면역화시키는데 사용될 수 있다. α-시뉴클레인 항원의 정제된 또는 풍부화된 제제를 사용한 면역화가 항체를 발생시키지 않는 사건에서, 마우스는 또한 면역 반응을 촉진하기 위해 α-시뉴클레인을 발현하는 세포, 예를 들어 세포주로 면역화될 수 있다. 예시적인 세포주는 α-시뉴클레인-과다발현 안정한 CHO 및 Raji 세포주를 포함한다.
다양한 항원을 사용한 누적 경험은 HuMAb 트랜스제닉 마우스가 리비(Ribi) 아주반트 중의 항원에 의해 복강내로 (IP) 또는 피하로 (SC) 초기 면역화된 다음, 격주로 리비 아주반트 중의 항원에 의해 IP/SC 면역화 (최대 총 10회)되는 경우에 최상으로 반응한다는 것을 제시한 바 있다. 면역 반응은 안와후 채혈에 의해 수득되는 혈장 샘플을 사용하여 면역화 프로토콜 과정에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 혈장은 ELISA 및 FACS (하기 기재된 바와 같음)에 의해 스크리닝될 수 있고, 충분한 역가의 항-α-시뉴클레인 인간 이뮤노글로불린을 갖는 마우스가 융합을 위해 사용될 수 있다. 마우스는 희생 및 비장 및 림프절 제거 3일 전에 항원으로 정맥내로 부스팅될 수 있다. 각각의 면역화를 위해 2-3회 융합이 수행될 필요가 있을 수 있는 것으로 예상된다. 각각의 항원에 대해 전형적으로 6 내지 24마리의 마우스를 면역화한다. 통상적으로, HCo7, HCo12, 및 KM 계통이 사용된다. 또한, HCo7 및 HCo12 둘 다의 트랜스진이 2종의 상이한 인간 중쇄 트랜스진을 갖는 단일 마우스로 함께 교배될 수 있다 (HCo7/HCo12).
α-시뉴클레인에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본원에 기재된 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성되는 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단세포 현탁액을 50% PEG를 갖는 Sp2/0 비분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1581)에 융합시킬 수 있다. 세포를 대략 2 x 105개로 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅하고, 이어서 10% 태아 클론 혈청, 18% "653" 조건화 배지, 5% 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 단위/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (시그마)를 함유하는 선택 배지에서 2주 인큐베이션한다. 대략 2주 후에, HAT를 HT로 대체한 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개별 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상적으로 10-14일 후에 배지를 관찰할 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 모노클로날 항체를 한계 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관내 배양하여 조직 배양 배지 중에 특징화를 위한 소량의 항체를 생성할 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제를 위한 2-리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과하고 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)로 친화성 크로마토그래피할 수 있다. 순도를 보장하기 위해 용리된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 체크할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환하고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고, -80℃에서 저장할 수 있다.
α-시뉴클레인에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
항체는, 예를 들어 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다 (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이러한 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 제공하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션된 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나 또는 둘 다의 유전자는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터(들) 내로 삽입된다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이들을 목적하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입하여 VH 절편이 벡터 내 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 절편이 벡터 내 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 인-프레임으로 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자에 더하여, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유할 수 있다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))]에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터의 설계가 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위해 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 추가로, 조절 요소는 상이한 공급원으로부터의 서열, 예컨대 SV40초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복부로부터의 서열을 함유하는 SRα 프로모터 시스템으로 구성된다 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 Axel et al.) 참조). 예를 들어, 전형적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에서의 사용을 위함) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위함)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로의 외인성 DNA의 도입을 위해 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것은 이론상 가능하지만, 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서의 항체의 발현이 가장 바람직하며, 이는 이러한 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비할 가능성이 원핵 세포보다 높기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 발현은 높은 수율의 활성 항체의 생산에 비효과적인 것으로 보고된 바 있다 (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
본원에 기재된 재조합 항체의 발현을 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같이 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포 내로 도입한 경우에, 항체는, 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하는데, 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로 항체의 분비를 허용하는데 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
IX. 검정
본원에 기재된 항체는, 예를 들어 표준 ELISA에 의해, 실시예에 기재된 것과 같은 표준 기술을 사용하여 α-시뉴클레인에의 결합에 대해 시험될 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 ELISA 검정을 사용하여 α-시뉴클레인 면역원과의 양성 반응성을 제시하는 항체, 및 그에 따라 항체를 생산하는 하이브리도마가 스크리닝될 수 있다. 이어서 바람직하게는 높은 친화도로 α-시뉴클레인에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 서브클로닝하고 추가로 특징화할 수 있다. 이어서 (ELISA에 의해) 모 세포의 반응성을 보유하는 각각의 하이브리도마로부터의 1종의 클론이 세포 은행의 제조를 위해, 및 항체 정제를 위해 선택될 수 있다.
선택된 항-α-시뉴클레인 모노클로날 항체가 고유한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 각각의 항체를 상업적으로 입수가능한 시약 (피어스(Pierce), 일리노이주 록포드)을 사용하여 비오티닐화할 수 있다. 비오티닐화된 MAb 결합은 스트렙타비딘 표지된 프로브로 검출할 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 비오티닐화된 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구를 상기 기재된 바와 같이 α-시뉴클레인 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다.
항체 사이의 경쟁을 평가하기 위한 기술은, 예를 들어 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합을 차단하는 (또는 차단하지 않는) 항체의 능력을 보여주는 면역검정, 즉 경쟁적 결합 검정을 포함한다. 경쟁적 결합은 시험 하의 이뮤노글로불린이 공통 항원, 예컨대 α-시뉴클레인에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에서 결정된다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 검정, 예를 들어: 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정; 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA; 고체 상 직접 표지된 검정, 고체 상 직접 표지된 샌드위치 검정; 고체 상 직접 125I 표지된 RIA; 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA; 및 직접 표지된 RIA가 공지되어 있다. 표면 플라즈몬 공명이 또한 이러한 목적에 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 검정은 이들, 비표지된 시험 이뮤노글로불린, 및 표지된 참조 이뮤노글로불린 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 이뮤노글로불린의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 시험 이뮤노글로불린은 전형적으로 과량으로 존재한다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우에, 이는 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과만큼 억제할 것이다.
본원에 개시된 항체에 의해 결합되는 에피토프를 결정하기 위한 다른 스크리닝 기술은, 예를 들어 에피토프의 원자 해상도를 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 X-선 분석을 포함한다. 다른 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 것으로, 항원 서열 내의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 상실은 종종 에피토프 성분의 지표로 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합 방법이 또한 사용될 수 있다. 이들 방법은 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특정 짧은 펩티드를 친화도 단리하는 관심 항체의 능력에 의존한다. 이어서, 펩티드는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 항체에 상응하는 에피토프를 정의하기 위한 리드로서 간주된다. 에피토프 맵핑을 위해 컴퓨터 알고리즘이 또한 개발되어 있고, 이는 입체형태적 불연속 에피토프를 맵핑하는 것으로 제시된 바 있다.
정제된 항체의 이소형을 결정하기 위해, 특정한 이소형의 항체에 특이적인 시약을 사용하여 이소형 ELISA를 수행할 수 있다.
항-α-시뉴클레인 항체는 웨스턴 블롯팅에 의해 α-시뉴클레인 항원과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게, α-시뉴클레인을 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 제조하여 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용할 수 있다. 전기영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 20% 마우스 혈청으로 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙할 것이다. IgG 결합은 항-IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제 (시그마 켐. 캄파니(Sigma Chem. Co.), 미주리주 세인트 루이스)로 발색시킬 수 있다.
다양한 항-α-시뉴클레인 항체의 결합 친화도, 교차-반응성, 및 결합 동역학을 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지된 표준 검정, 예를 들어 비아코어™ 2000 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기기 (비아코어 아베, 스웨덴 웁살라)를 사용하는 비아코어™ SPR 분석을 포함한다.
항-α-시뉴클레인 항체는 또한 α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 올리고머에 대한 그의 우선적 결합에 대해 시험될 수 있다. "단량체/PFF 결합 비"는 본원에서 항-α-시뉴클레인 항체의 PFF 및 α-시뉴클레인 단량체에 대한 결합 거동을 기재하기 위한 인덱스로서 사용된다. 1 초과의 비는 α-시뉴클레인 단량체보다 PFF에 대한 결합의 더 큰 선호도를 나타낸다. 예를 들어, 항체가 예를 들어 실시예 3에 기재된 바와 같이 ELISA에 의할 때 단량체 α-시뉴클레인에 291 nM의 EC50으로 결합하고 PFF에 0.16 nM의 EC50으로 결합하는 경우, 그러한 항체의 단량체/PFF 결합 비는 291/0.16 = 1819일 것이다. 일부 실시양태에서, PFF는 실시예 3에 기재된 방법에 따라 제조된다.
항-α-시뉴클레인 항체는, 예를 들어 실시예 11에 기재된 검정, 또는 실시예 12에 기재된 올리고머 ELISA를 사용하여, 뇌 내 α-시뉴클레인 올리고머의 응집체를 소거하는 그의 능력에 대해 시험될 수 있다. 항체는 또한 예를 들어 실시예 10 및 11에 기재된 방법을 사용하여 α-시뉴클레인의 S129의 α-시뉴클레인 올리고머 (PFF)-유도된 인산화를 감소시키거나 억제하는 그의 능력, 또는 뇌 내 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체를 갖는 환자로부터 제조된 PFF 및/또는 뇌 용해물 (예를 들어, 시뉴클레인병증, 예를 들어, MSA를 갖는 환자로부터 제조된 뇌 용해물)로부터 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)를 생산하는 분자 종을 고갈시키는 능력에 대해 시험될 수 있다.
X. 면역접합체, 항체 유도체 및 진단
본원에 기재된 항체는 샘플 시험 및 생체내 영상화를 포함한 진단 목적에 사용될 수 있고, 이러한 목적을 위해 항체 (또는 그의 결합 단편)를 적절한 검출가능한 작용제에 접합시켜 면역접합체를 형성할 수 있다. 진단 목적을 위한 적절한 작용제는 전신 영상화를 위한 방사성동위원소, 및 샘플 시험을 위한 방사성동위원소, 효소, 형광 표지 및 다른 적합한 항체 태그를 포함하는 검출가능한 표지이다.
검출가능한 표지는, 금속 졸, 예컨대 콜로이드성 금, 동위원소 예컨대 예를 들어 N2S2, N3S 또는 N4 유형의 펩티드성 킬레이트화제와 함께 제공되는 I125 또는 Tc99, 형광 마커, 발광 마커, 인광 마커 등을 포함한 발색단을 포함한 미립자 표지, 뿐만 아니라 주어진 기질을 검출가능한 마커로 전환시키는 효소 표지, 및 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 증폭 후에 나타나는 폴리뉴클레오티드 태그를 포함하는, 시험관내 진단학 분야에서 현재 사용되는 임의의 다양한 유형일 수 있다. 적합한 효소 표지는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 등을 포함한다. 예를 들어, 표지는 1,2 디옥세탄 기질 예컨대 아다만틸 메톡시 포스포릴옥시 페닐 디옥세탄 (AMPPD), 디소듐 3-(4-(메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로{3.3.1.1 3,7}데칸}-4-일) 페닐 포스페이트 (CSPD), 뿐만 아니라 CDP 및 CDP-스타(CDP-star)® 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 발광 기질, 예를 들어 적합한 란타나이드 예컨대 테르븀(III) 및 유로퓸(III)의 킬레이트의 전환 후에 화학발광의 존재 또는 형성을 측정함으로써 검출되는, 효소 알칼리성 포스파타제일 수 있다. 검출 수단은 선택된 표지에 의해 결정된다. 표지 또는 그의 반응 생성물의 출현은 표지가 미립자이고 적절한 수준으로 축적된 경우에는 육안을 사용하여, 또는 분광광도계, 발광측정기, 형광계 등과 같은 기기를 모두 표준 관례에 따라 사용하여 달성할 수 있다.
바람직하게는, 접합 방법은 실질적으로 (또는 거의) 비-면역원성인 연결, 예를 들어 펩티드- (즉 아미드-), 술피드-, (입체 장애), 디술피드-, 히드라존-, 및 에테르 연결을 발생시킨다. 이들 연결은 거의 비-면역원성이고, 혈청 내에서 합리적인 안정성을 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244]; WO 2009/059278; WO 95/17886 참조).
모이어티 및 항체의 생화학적 성질에 따라, 상이한 접합 전략이 사용될 수 있다. 모이어티가 50 내지 500개 아미노산의 자연 발생 또는 재조합인 경우에, 단백질 접합체의 합성을 위한 화학을 기재한 텍스트 북에 표준 절차가 존재하고, 이는 통상의 기술자가 용이하게 따를 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hackenberger, C. P. R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074] 참조). 한 실시양태에서, 말레인이미도 모이어티와 항체 또는 모이어티 내의 시스테인 잔기의 반응이 사용된다. 이는, 예를 들어 항체의 Fab 또는 Fab'-단편이 사용되는 경우에, 특히 적합한 커플링 화학이다. 대안적으로 한 실시양태에서, 항체 또는 모이어티의 C-말단 단부에의 커플링이 수행된다. 예를 들어 Fab-단편의 단백질의 C-말단 변형이 예를 들어 기재된 바와 같이 수행될 수 있다 (Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371).
일반적으로, 부위 특이적 반응 및 공유 커플링은 천연 아미노산을, 존재하는 다른 관능기의 반응성과 직교하는 반응성을 갖는 아미노산으로 변환하는 것에 기초한다. 예를 들어, 드문 서열 맥락 내의 특정 시스테인은 알데히드에서 효소적으로 전환될 수 있다 (문헌 [Frese, M. A., and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427] 참조). 또한, 주어진 서열 맥락에서 천연 아미노산과 함께 특정 효소의 특이적 효소 반응성을 사용함으로써 목적하는 아미노산 변형을 수득하는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136] 참조; 문헌 [Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403]에는 프로테아제-촉매된 C--N 결합의 형성이 사용됨).
부위 특이적 반응 및 공유 커플링은 또한 말단 아미노산과 적절한 변형 시약의 선택적 반응에 의해 달성될 수 있다.
N-말단 시스테인과 벤조니트릴의 반응성 (문헌 [Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662] 참조)을 사용하여 부위-특이적 공유 커플링을 달성할 수 있다.
천연 화학적 라이게이션은 또한 C-말단 시스테인 잔기에 의존할 수 있다 (Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96).
EP 1 074 563은 양으로 하전된 아미노산의 스트레치에 위치하는 시스테인보다 음으로 하전된 아미노산의 스트레치 내의 시스테인의 보다 신속한 반응에 기초한 접합 방법을 기재한다.
모이어티는 또한 합성 펩티드 또는 펩티드 모방체일 수 있다. 폴리펩티드가 화학적으로 합성되는 경우에, 직교 화학적 반응성을 갖는 아미노산이 이러한 합성 동안 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295] 참조). 매우 다양한 직교 관능기가 존재하고 합성 펩티드 내로 도입될 수 있기 때문에, 이러한 펩티드의 링커에의 접합은 표준 화학이다.
단일-표지된 폴리펩티드를 수득하기 위해, 1:1 화학량론을 갖는 접합체를 크로마토그래피에 의해 다른 접합 부산물로부터 분리할 수 있다. 이러한 절차는 염료 표지된 결합 쌍 구성원 및 하전된 링커를 사용함으로써 용이해질 수 있다. 전하 및 분자량의 차이가 분리를 위해 사용될 수 있기 때문에, 이러한 종류의 표지되고 고도로 음으로 하전된 결합 쌍 구성원을 사용함으로써, 단일 접합된 폴리펩티드는 비-표지된 폴리펩티드 및 1개 초과의 링커를 보유하는 폴리펩티드로부터 용이하게 분리된다. 형광 염료는 표지된 1가 결합제와 같이, 비-결합 성분으로부터 복합체를 정제하는데 유용할 수 있다.
한 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체에 부착되는 모이어티는 결합 모이어티, 표지 모이어티, 및 생물학적 활성 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 항체는 또한 치료제에 접합되어 면역접합체, 예컨대 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성할 수 있다. 적합한 치료제는 항대사물, 알킬화제, DNA 작은 홈 결합제, DNA 삽입제, DNA 가교제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 핵 유출 억제제, 프로테아솜 억제제, 토포이소머라제 I 또는 II 억제제, 열 쇼크 단백질 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항생제 및 항유사분열제를 포함한다. ADC에서, 항체 및 치료제는 바람직하게는 절단가능한 링커, 예컨대 펩티딜, 디술피드, 또는 히드라존 링커를 통해 접합된다. 보다 바람직하게는, 링커는 펩티딜 링커, 예컨대 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (서열식별번호: 128), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu이다. ADC는 미국 특허 번호 7,087,600; 6,989,452; 및 7,129,261; PCT 공개 WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; 및 WO 08/103693; 미국 특허 공개 20060024317; 20060004081; 및 20060247295에 기재된 바와 같이 제조될 수 있고, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
항-α-시뉴클레인 항체, 예를 들어 본원에 기재된 것은 또한 α-시뉴클레인, 예컨대 인간 α-시뉴클레인, 예를 들어 조직 또는 조직 샘플 내 인간 α-시뉴클레인을 검출하는데 사용될 수 있다. 항체는 예를 들어, ELISA 검정 또는 유동 세포측정법에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 세포, 예를 들어 조직 내 세포와, 특이적 결합이 발생하는 적절한 시간 동안 접촉되고, 이어서 시약, 예를 들어 항-α-시뉴클레인 항체를 검출하는 항체가 첨가된다. 항-α-시뉴클레인 항체는 완전 인간 항체일 수 있거나, 또는 키메라 항체, 예컨대 인간 가변 영역 및 뮤린 불변 영역을 갖는 항체 또는 그의 부분일 수 있다. 샘플 (세포 또는 조직 샘플)에서 α-시뉴클레인, 예를 들어 인간 α-시뉴클레인을 검출하는 예시적인 방법은 (i) 샘플을 항-α-시뉴클레인 항체와, 샘플에서 항-α-시뉴클레인 항체의 α-시뉴클레인에 대한 특이적 결합을 허용하는 충분한 시간 동안 접촉시키고, (2) 샘플을 검출 시약, 예를 들어 항-α-시뉴클레인 항체, 예컨대 항-α-시뉴클레인 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜, 항-α-시뉴클레인 항체에 의해 결합된 α-시뉴클레인을 검출하는 것을 포함한다. 세척 단계가 항체 및/또는 검출 시약과의 인큐베이션 후에 포함될 수 있다. 별개의 검출 작용제가 사용될 수 있기 때문에, 이들 방법에 사용하기 위한 항-α-시뉴클레인 항체는 표지 또는 검출 작용제에 연결되어야 하는 것은 아니다.
XI. 이중특이적 분자
본원에 기재된 항체는 이중특이적 분자를 형성하는데 사용될 수 있다. 항-α-시뉴클레인 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도체화되거나 또는 이에 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 예를 들어, 항-α-시뉴클레인 항체는 조합 치료를 위한 잠재적 표적으로서 사용될 수 있는 임의의 단백질, 예컨대 본원에 기재된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 scFv에 연결될 수 있다. 본원에 기재된 항체는 실제로, 1종 초과의 다른 기능적 분자로 유도체화되거나 또는 이에 연결되어, 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고, 이러한 다중특이적 분자도 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포괄되는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본원에 기재된 항체는 1종 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결되어 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 또는 그 이외의 것에 의함) 이중특이적 분자를 발생시킬 수 있다.
따라서, α-시뉴클레인에 대한 적어도 1종의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자가 본원에 제공된다. 이중특이적 분자가 다중특이적인 본원에 기재된 한 실시양태에서, 분자는 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 분자는 결합 특이성으로서 적어도 1종의 항체, 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 쇄 Fv (scFv)를 포함한 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner et al.)에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있고, 그의 내용은 명확하게 참조로 포함된다.
인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본원에 기재된 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본원에 기재된 이중특이적 분자는 구성성분 결합 특이체를 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이체를 개별적으로 생성한 다음 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제가 사용될 수 있다. 가교결합제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), 및 Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 바람직한 접합제는 SATA 및 술포-SMCC이며, 둘 다는 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드)로부터 입수가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 분자는 뇌 내로의, 예를 들어, 혈액-뇌-장벽을 가로지르는 분자의 수송을 증가시키는 제2 결합 특이성을 갖는다.
결합 특이체가 항체인 경우에, 이들을 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술프히드릴 결합을 통해 접합시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수, 바람직하게는 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 둘 다의 결합 특이체가 동일한 벡터 내에 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, mAb x (scFv)2, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 이중특이적 항체는 각각의 중쇄의 C-말단에 scFv를 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 이중특이적 분자는 1개의 단일 쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자가 그의 특이적 표적에 결합하는 것은 관련 기술분야-인식 방법, 예컨대 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (RIA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 검정을 사용하여 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용하여 특정한 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
XII. 조성물
제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체 중 1종 또는 그의 조합 또는 다른 표적에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 부분(들)과의 조합을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물이 추가로 제공된다. 이러한 조성물은 (예를 들어, 2종 이상의 상이한) 항체 중 1종 또는 그의 조합, 또는 본원에 기재된 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 제약 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 또는 상보적 활성을 갖는 항체 (또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 조성물은 항-α-시뉴클레인 항체를 적어도 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 1-300 mg/ml, 또는 100-300 mg/ml의 농도로 포함한다.
본원에 기재된 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉 다른 작용제와 조합되어 (동일한 조성물 또는 개별 조성물로) 투여될 수 있다. 조합 요법에 사용될 수 있는 치료제의 예는, 예를 들어 레보도파, 아만타딘 (시메트렐(Symmetrel)), 항콜린제 (트리헥시페니딜, 벤즈트로핀 메실레이트, 프로시클리딘, 아르탄, 코젠틴), 브로모크립틴 (팔로델(Parlodel)), 페르골리드 (페르맥스(Permax)), 로피니롤 (레큅(Requip)), 프라미펙솔 (미라펙스(Mirapex)), 모노아미녹시다제-B 억제제 (MAO) 예컨대 셀레길린 (데프레닐(Deprenyl) 또는 엘데프릴(Eldepryl)), 카테콜-O-메틸트랜스퍼라제 억제제 (COMT) 예컨대 엔타카폰, 타스마르 또는 톨카폰, 콜린에스테라제 억제제, D2 수용체 길항제, DA 효능제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, (예를 들어, α-시뉴클레인에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오티드), 키나제 억제제, 및 류신-풍부 반복 키나제 2 (LRRK2) 억제제를 포함한다. 추가의 작용제는 예를 들어 시뉴클레인병증의 병리상태에 수반되는 것으로 공지된 치료 표적화 분자, 예컨대 핑크(PINK), 파킨(PARKIN), DJ1, 글루코세레브로시다제 (GBA), 및 반응성 산소 종을 표적화하는 작용제를 포함한다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 투여 경로에 의존하여, 활성 화합물, 즉 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
본원에 기재된 제약 화합물은 1종 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 바람직하지 않은 어떠한 독성학적 효과도 제공하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본원에 기재된 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본원에 기재된 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한, 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재를 방지하는 것은 상기의 멸균 절차, 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시키는 것 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써, 주사가능한 제약 형태의 지속 흡수를 달성할 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 용도가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본원에 기재된 제약 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 제약 조성물은 보존제를 포함할 수 있거나, 보존제가 없을 수 있다. 보충 활성 화합물이 조성물 내로 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로, 제작 및 저장 조건 하에 멸균이고 안정적이어야 한다. 이러한 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴을 사용하고, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써, 주사가능한 조성물의 지속 흡수를 달성할 수 있다.
적절한 용매 중의 필요한 양의 활성 화합물을, 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 1종 또는 그의 조합과 함께 혼입시킨 다음, 멸균 마이크로여과함으로써, 멸균 주사가능한 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을, 기본 분산 매질 및 본원에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 분산액을 제조한다. 멸균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 플러스 이전의 그의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료하고자 하는 대상체, 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로, 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 100 퍼센트 중에서, 제약상 허용되는 담체와 조합되는 활성 성분 약 0.01% 내지 약 99 퍼센트의 범위, 바람직하게는 활성 성분 약 0.1% 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 범위일 것이다.
투여 요법은 목적하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 여러 분할 용량을 시간의 경과에 따라 투여할 수 있거나 또는 용량은 치료 상황의 위급성에 의해 제시되는 바와 같이 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며; 각 단위는 목적하는 제약 담체와 연합하여 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 본원에 기재된 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서의 감수성을 치료하기 위해 이러한 활성 화합물의 배합 기술분야에 내재된 제한사항에 의해 좌우되고 직접적으로 그에 의존한다.
항체를 투여하는 경우에, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 및 보다 통상적으로 0.01 내지 5 또는 10 mg/kg 범위이다. 예를 들어 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중, 또는 1-10 mg/kg의 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월 1회, 3개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 균일 용량으로 투여될 수 있다 (균일 용량 요법).
일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2종 이상의 모노클로날 항체를 동시에 투여하며, 이 경우에 투여되는 각 항체의 투여량은 표시된 범위 내에 속한다. 항체는 통상적으로 다중 투여된다. 단일 투여 사이의 간격은, 예를 들어 매주, 매월, 3개월마다 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 제시되는 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 약 1-1000 μg/ml의 혈장 항체 농도 및 일부 방법에서 약 25-300 μg/ml를 달성하도록 투여량이 조정된다.
항체는 지속 방출 제제로서 투여될 수 있고, 이러한 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 제시하고, 이어서 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서는, 비교적 적은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 여생 동안 계속 치료받는다. 치료적 적용에서는, 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 제시할 때까지 비교적 짧은 간격으로의 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 요법이 투여될 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 아니면서, 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 유효한 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 사용된 본원에 기재된 특정한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용된 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지된 다른 인자를 포함한 다양한 약동학적 인자에 의존할 것이다.
본원에 기재된 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 1종 이상을 사용하여 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본원에 기재된 항체에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 경장 및 국소 투여 이외의, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
대안적으로, 본원에 기재된 항체는 비-비경구 경로를 통해, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질내로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 화합물의 급속 방출을 방지할 담체와 함께, 예컨대 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제를 제조하기 위한 많은 방법이 특허되었거나 또는 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 관련 기술분야에 공지된 의료 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 치료 조성물은 무바늘 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체와 함께 사용하기 위한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 의약을 제어된 속도로 분배하기 위한 이식가능한 마이크로-주입 펌프를 개시한 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 장치를 개시한 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시한 미국 특허 번호 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능 주입 장치를 개시한 미국 특허 번호 4,447,224; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 번호 4,475,196을 포함한다. 이들 특허는 본원에 참조로 포함된다. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 생체 내에서 적당한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본원에 기재된 치료 화합물이 (경우에 따라, 예를 들어 뇌암의 경우에) BBB를 가로지르기 위해서는, 이들을, 예를 들어 리포솜에 제제화시킬 수 있다. 리포솜을 제작하는 방법에 관해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조할 수 있다. 리포솜은 특이적 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되는 1종 이상의 모이어티를 포함할 수 있으므로, 표적화된 약물 전달을 증강시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 엽산 또는 비오틴 [예를 들어, 미국 특허 5,416,016 (Low et al.) 참조]; 만노시드 (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체 (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함하며; 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
XIII. 키트
또한 임의로 단일 바이알 또는 용기 내에 담긴 본원에 개시된 항-α-시뉴클레인 항체, 이중특이적 항체, 또는 면역접합체를 포함하고, 예를 들어, 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 응집체의 존재와 연관된 질환을 치료 또는 진단하는데 있어서의 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 키트의 내용물의 의도되는 용도를 표시한 라벨을 포함할 수 있다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나, 또는 달리 키트에 동봉되는 임의의 기록물, 마케팅 자료 또는 기록 자료를 포함한다. 이러한 키트는 단위 투여 형태의, 예컨대 단일 용량 바이알 또는 단일 용량 사전-로딩 시린지의 항체, 이중특이적 항체 또는 면역접합체를 포함할 수 있다.
XIV. 용도 및 방법
뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체 (예를 들어, 인간 환자)를 치료하는 방법, 뿐만 아니라 이들 질환을 예방하는 방법이 본원에 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에게 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 항원-결합 부분의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에게 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 항원-결합 부분의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 중증도를 경감시키는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에게 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 항원-결합 부분의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 진행을 지연시키는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환이 발생할 위험이 있는 대상체에게 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 항원-결합 부분의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환이 발생할 위험을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환이 발생할 위험이 있는 대상체에게 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 항원-결합 부분의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 발병을 지연시키는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 치료될 대상체는 시뉴클레인병증의 증상 (징후), 예컨대 신경정신적 징후 (우울증, 치매, 환각, 불안, 무감동, 무쾌감증), 자율신경성 변화 (기립성 저혈압, 방광 장애, 변비, 변실금, 타액과다증, 연하곤란, 성 기능장애, 뇌 혈류에서의 변화), 감각 변화 (후각, 통증, 색 구별 비정상적 감각), 수면 장애 (REM 수면 행동 장애 (RBD), 하지 불안 증후군/주기성 사지 운동, 과다수면, 불면증), 및 다른 징후 및 증상 (피로, 복시, 흐린 시각, 지루, 체중 감소/증가)을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 치료될 대상체는 질환의 증상을 나타내지는 않지만, 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환이 발생할 유전적 위험을 갖는 것으로 공지된다. 예를 들어, 이러한 개체는 질환과 관련성을 가질 수 있거나, 또는 그의 위험은 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 결정된다. 예를 들어, A30P, E46K, H50Q, G51D, 및 A53T를 포함한 SNCA (PARK1, α-시뉴클레인을 코딩함)에서의 돌연변이, 뿐만 아니라 전체 SNCA 유전자의 중복 및 삼중복은 PD의 상염색체 우성 형태를 유발한다. LRRK2 (PARK8, 류신-풍부 반복 키나제 2)에서의 돌연변이 및 VPS35 (PARK17, 공포성 단백질 분류 35)에서의 돌연변이도 또한 PD의 상염색체 우성 형태를 유발한다 (Hernandez et al., (2016) Genetics in Parkinson disease: Mendelial versus non-Medndelian inheritance. Journal of Neurochemistry 10.1111/jnc.13593). PINK1 (PARK6, PTEN-유도된 키나제 1), DJ-1 (PARK7), Parkin (PARK2), ATP13A2 (PARK9, ATPase 유형 13A2), FBXO7 (PARK15, F-박스 단독 단백질 7), 및 PLA2GB (PARK14, 포스포리파제 A2, 군 VI)에서의 돌연변이는 상염색체 열성 PD/파킨슨증을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 또한, SNCA, LRRK2, GBA/SYT11, MAPT, HLA-DRB5, GAK, GCH1, NUCKS1/RAB7L1, SLC41A1, BST1, SIPA1L2, ACMSD/TMEM163, STK39, MCCC1, TMEM175/GAK/DGKQ, FAM47E/SCARB2, GPNMB, FGF20, INPP5F, MIR4697, CCDC62, GCH1, VPS13C, BCKDK/STX1B, SREBF/RAI1, RIT2 및 DDRGK1을 포함하여, PD 및 관련 시뉴클레인병증과 연관된 28종의 상이한 유전적 위험 유전자좌가 확인되었다 (Nalls et al. (2014) Large-scale meta-analysis of genome-wide association data identifies six new risk loci for Parkinson's disease. Nature Genetics 46(9): 989-993). 따라서, 예방 용도에서, 본원에 기재된 항체, 또는 이를 포함하는 제약 조성물은 질환에 감수성이 있거나 달리 질환의 위험이 있는 환자에게 질환의 위험을 감소시키거나, 중증도를 경감시키거나, 또는 질환의 적어도 1종의 징후 또는 증상의 발병을 지연시키는데 효과적인 요법 (용량, 빈도 및 투여 경로)으로 투여된다. 일부 예방 용도에서, 요법은 뇌 내 α-시뉴클레인의 축적을 억제 또는 지연시키는데, 및/또는 그의 독성 효과를 억제 또는 지연시키는데 및/또는 환자의 거동 결함의 발생을 억제 또는 지연시키는데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 방법은 환자에서 유익한 치료 반응 (대상체에서 예를 들어, 뇌 내 α-시뉴클레인 응집체의 감소, 개선된 인지 기능, 및/또는 인지 저하의 반전, 치료 또는 방지)을 생성한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환이 의심되거나 이미 이를 앓고 있는 환자에게 질환의 적어도 1종의 징후 또는 증상의 추가의 악화를 완화시키거나 또는 적어도 억제하는데 효과적인 요법 (용량, 빈도 및 투여 경로)으로 투여된다. 일부 치료 용도에서, 요법은 α-시뉴클레인의 수준, 연관 독성, 및/또는 거동 결함의 추가의 증가를 감소시키거나 또는 적어도 억제하는데 효과적이다. 특정 실시양태에서, 치료는 치료 개시 전에 비해 또는 비치료 대조군 환자의 집단과 비교하여, 예를 들어 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상의 뇌 내 α-시뉴클레인 응집체의 감소를 발생시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환은 파킨슨병 (특발성 파킨슨병 포함), DLB, DLBD, LBVAD, 순수 자율신경부전, 루이 소체 연하곤란, 비증상 LBD, 유전성 LBD (예를 들어, SNCA (PARK1), LRRK2 (PARK8), VPS35 (PARK17), PINK1 (PARK6), DJ-1 (PARK7), 파킨 (PARK2), ATP13A2 (PARK9), FBXO7 (PARK15) 및 PLA2GB (PARK14)의 돌연변이), 또는 다계통 위축 (MSA; 예를 들어, 올리브교뇌소뇌 위축, 선조체흑질 변성 및 샤이-드래거 증후군)이다.
또한 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체, 또는 그의 항원-결합 부분의 유효량과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 (시험관내 또는 생체내) 불용성 α-시뉴클레인 응집체 (예를 들어, 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체)의 생성을 억제하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세린-129의 인산화는 α-시뉴클레인 올리고머 (예를 들어, PFF)에 의해 유도된다.
또한 시냅스 형성 (시냅토피신) 및/또는 수상돌기 (MAP2)의 마커를 사용하여 측정되는 바와 같은, 시냅스 밀도 및/또는 수지상 밀도를 보존하거나 증가시키는 방법이 제공된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체로 치료된 대상체는 치료 개시 전에 비해 또는 비치료 대조군 환자의 집단과 비교하여, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상의 시냅스 또는 수지상 밀도의 상승을 나타낸다.
본원에 개시된 항체는 또한, 예를 들어 본원에 개시된 항체와 (예를 들어, 생체외 또는 생체내에서) 대상체로부터의 세포를 접촉시키고, 세포 상의 α-시뉴클레인에 대한 결합 수준을 측정하는 것에 의해 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 진단하거나 예후하는데 사용될 수 있고, 여기서 α-시뉴클레인에 대한 비정상적으로 높은 결합 수준은 대상체가 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는다는 것을 나타낸다. 진단 또는 예후 목적상, 본원에 기재된 항체는 환자의 신체 내로 정맥내 주사에 의해, 또는 두개내 주사에 의해 또는 두개골을 통해 구멍을 뚫음으로써 직접 뇌 내로 투여될 수 있다. 시약의 투여량은 치료 방법과 동일한 범위 내에 있어야 한다. 적합한 표지는, 예를 들어 형광 표지 (예를 들어, 광학 검출을 위함), 상자성 표지 (예를 들어, 외과적 개입 없이 단층촬영 검출을 위함), 및 방사성 표지 (예를 들어, PET 또는 SPECT를 사용하는 검출을 위함)를 포함한다. 표지된 유전자좌의 수, 크기 및/또는 강도를 상응하는 기준선 값과 비교함으로써 진단을 수행한다. 기준선 값은 비이환된 개체의 집단에서의 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기준선 값은 또한 동일한 환자에서 결정된 이전 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 기준선 값은 치료 시작 전에 환자에서 결정될 수 있고, 그 후 측정 값은 기준선 값과 비교될 수 있다. 기준선 대비 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 시사한다.
한 실시양태에서,
(a) 본원에 기재된 항체, 또는 그의 항원-결합 부분과 대상체로부터의 샘플을 접촉시켜 항체-항원 복합체가 형성되도록 하는 단계;
(b) 형성된 복합체의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 샘플에서의 복합체의 양과 대조군에서의 양을 비교하는 단계이며, 여기서 대조군에 비해 샘플에서의 복합체의 상승된 수준은 대상체가 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계
를 포함하는, 대상체에서 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 진단하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 뇌척수액, 뇌 조직 추출물, 소변 또는 혈액이다. 일부 실시양태에서, 대조군은 질환의 증상을 나타내지 않고 질환 (예를 들어, 시뉴클레인병증)에 대한 유전적 소인이 없는 건강한 대상체의 집단이다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 유의하게 독성이 아니다. 예를 들어, 항-α-시뉴클레인 항체는, 예를 들어 임상 시험에서 결정된 바와 같이, 인간의 기관, 예를 들어 간, 신장, 뇌, 폐 및 심장 중 하나 이상에 대해 유의하게 독성이 아니다. 특정 실시양태에서, 항-α-시뉴클레인 항체는 바람직하지 않은 면역 반응, 예를 들어 자가면역 또는 염증을 유의하게 촉발시키지 않는다.
항체는 단독으로, 또는 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인 응집체와 연관된 질환 (예를 들어, 다계통 위축)을 치료하기 위해 항체와 협력하거나 상승작용적으로 작용하는 또 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다.
본원에 기재된 항체와 조합하여 사용하는데 적합한 예시적인 치료 작용제는, 예를 들어, 레보도파, 아만타딘 (시메트렐), 항콜린제 (트리헥시페니딜, 벤즈트로핀 메실레이트, 프로시클리딘, 아르탄, 코젠틴), 브로모크립틴 (팔로델), 페르골리드 (페르맥스), 로피니롤 (레큅), 프라미펙솔 (미라펙스), 모노아미녹시다제-B 억제제 (MAO) 예컨대 셀레길린 (데프레닐 또는 엘데프릴), 카테콜-O-메틸트랜스퍼라제 억제제 (COMT) 예컨대 엔타카폰, 타스마르 또는 톨카폰, 콜린에스테라제 억제제, D2 수용체 길항제, DA 효능제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, (예를 들어, α-시뉴클레인에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오티드), 키나제 억제제, 및 류신-풍부 반복 키나제 2 (LRRK2) 억제제를 포함한다. 추가의 작용제는 예를 들어 시뉴클레인병증의 병리상태에 수반되는 것으로 공지된 치료 표적화 분자, 예컨대 핑크, 파킨, DJ1, 글루코세레브로시다제 (GBA), 및 반응성 산소 종을 표적화하는 작용제를 포함한다.
추가의 치료제는 본원에 기재된 항체와 함께 (예를 들어, 공동으로 또는 순차적으로) 또는 개별적으로 (예를 들어, 시간 또는 일 간격으로) 투여될 수 있다.
또한, 인간 α-시뉴클레인에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 예를 들어 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 샘플 및 대조군 샘플을, 항체 또는 그의 부분과 인간 α-시뉴클레인 사이에 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플에서 인간 α-시뉴클레인 항원의 존재를 검출하거나 또는 인간 α-시뉴클레인 항원의 양을 측정하는 방법이 포괄된다. 이어서, 복합체의 형성이 검출되며, 여기서 대조군 샘플과 비교하여 샘플 사이의 복합체 형성에서의 차이는 샘플 중 인간 α-시뉴클레인 항원의 존재를 나타낸다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 면역친화성 정제를 통해 인간 α-시뉴클레인을 정제하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 생물학적 샘플 (예를 들어, 생검)에서 α-시뉴클레인 단백질의 양을 검출하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-α-시뉴클레인 항체는 α-시뉴클레인 단백질을 검출하기 위해 시험관내 검정 (예를 들어, 면역검정 예컨대 웨스턴 블롯, 방사선면역검정, ELISA)에서 사용될 수 있다.
XV. 예시적 실시양태
1. α-시뉴클레인에 결합하고 하기 특성:
(a) 마우스 및 래트 α-시뉴클레인에 결합함;
(b) 인간 β-시뉴클레인 및 인간 γ-시뉴클레인에 결합함;
(c) α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 올리고머에 대해 더 큰 친화도를 가짐;
(d) α-시뉴클레인 올리고머-유도된 불용성 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체의 생성을 억제함;
(e) 뇌 내 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체를 갖는 환자로부터 제조된 PFF 및/또는 뇌 용해물로부터 세린-129 인산화를 특징으로 하는 가용성 불용성 α-시뉴클레인 응집체를 생산하는 분자 종을 고갈시킴;
(f) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 123-128의 전부 또는 일부에 결합함;
(g) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 125-128의 전부 또는 일부에 결합함;
(h) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-139의 전부 또는 일부에 결합함;
(i) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 119-126의 전부 또는 일부에 결합함; 및
(j) 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-138의 전부 또는 일부에 결합함
중 1개 이상을 나타내는, 단리된 항체, 또는 그의 항원-결합 부분.
2. 실시양태 1에 있어서, α-시뉴클레인 올리고머가 PFF인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
3. 실시양태 2에 있어서, PFF가 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 것인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
4. 실시양태 1-3 중 어느 하나에 있어서, α-시뉴클레인 올리고머가 가용성 α-시뉴클레인 올리고머인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
5. 실시양태 1-3 중 어느 하나에 있어서, α-시뉴클레인 올리고머가 불용성 α-시뉴클레인 올리고머인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
6. 실시양태 1-5 중 어느 하나에 있어서, α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 PFF에 대한 더 큰 친화도가 발광-기반 결합 검정 (예를 들어, 실시예 3에 기재된 바와 같음)에 의해 결정되는 바와 같은 α-시뉴클레인 단량체/α-시뉴클레인 PFF 결합 비를 사용하여 측정되는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
7. 실시양태 6에 있어서, 100 이상의 α-시뉴클레인 단량체/α-시뉴클레인 PFF 결합 비를 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
8. 실시양태 7에 있어서, 단량체/PFF 결합 비가 500 이상인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
9. 실시양태 8에 있어서, 단량체/PFF 결합 비가 700 이상인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
10. 실시양태 9에 있어서, 단량체/PFF 결합 비가 1500 이상인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
11. 실시양태 10에 있어서, 단량체/PFF 결합 비가 3000 이상인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
12. 실시양태 11에 있어서, 단량체/PFF 결합 비가 5000 이상인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
13. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 단량체 α-시뉴클레인에 100 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 2 nM 이하의 EC50으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
14. 실시양태 13에 있어서, 단량체 α-시뉴클레인에 500 nM 이상의 EC50으로 결합하고, PFF에 0.5 nM 이하의 EC50으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
15. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 실시예 10에 기재된 검정을 사용하여 평가된 바와 같이, PFF-유도된 α-시뉴클레인 세린-129 인산화를 0.1 nM 이하의 IC50으로 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
16. α-시뉴클레인에 특이적으로 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로 3개의 가변 중쇄 CDR 및 3개의 가변 경쇄 CDR을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 서열식별번호: 8 및 9;
(b) 서열식별번호: 18 및 19;
(c) 서열식별번호: 20 및 21;
(d) 서열식별번호: 31 및 32;
(e) 서열식별번호: 31 및 33;
(f) 서열식별번호: 43 및 44;
(g) 서열식별번호: 53 및 54;
(h) 서열식별번호: 63 및 64;
(i) 서열식별번호: 73 및 74;
(j) 서열식별번호: 83 및 84;
(k) 서열식별번호: 99 및 100;
(l) 서열식별번호: 99 및 101;
(m) 서열식별번호: 99 및 102; 및
(n) 서열식별번호: 113 및 114.
17. 하기를 포함하는, α-시뉴클레인에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 각각 서열식별번호: 2-4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 5-7을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(b) 각각 서열식별번호: 12-14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 15-17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(c) 각각 서열식별번호: 22-24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 25-27을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(d) 각각 서열식별번호: 22-24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 28-30을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(e) 각각 서열식별번호: 37-39를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 40-42를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(f) 각각 서열식별번호: 47-49를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 50-52를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(g) 각각 서열식별번호: 57-59를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 60-62를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(h) 각각 서열식별번호: 67-69를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 70-72를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(i) 각각 서열식별번호: 77-79를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 80-82를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(j) 각각 서열식별번호: 87-89를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 90-92를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(k) 각각 서열식별번호: 87-89를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 93-95를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
(l) 각각 서열식별번호: 87-89를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 96-98을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 또는
(m) 각각 서열식별번호: 107-109를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 110-112를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3.
18. α-시뉴클레인에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 8, 18, 31, 43, 53, 63, 73, 83, 99, 및 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
19. α-시뉴클레인에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9, 19, 32, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 100, 101, 102, 및 114로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
20. α-시뉴클레인에 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 서열식별번호: 8 및 9;
(b) 서열식별번호: 18 및 19;
(c) 서열식별번호: 31 및 32;
(d) 서열식별번호: 31 및 33;
(e) 서열식별번호: 43 및 44;
(f) 서열식별번호: 53 및 54;
(g) 서열식별번호: 63 및 64;
(h) 서열식별번호: 73 및 74;
(i) 서열식별번호: 83 및 84;
(j) 서열식별번호: 99 및 100;
(k) 서열식별번호: 99 및 101;
(l) 서열식별번호: 99 및 102; 및
(m) 서열식별번호: 113 및 114.
21. 실시양태 20에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 (a)-(m)으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 적어도 95%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
22. α-시뉴클레인에 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(n) 서열식별번호: 10 및 11,
(o) 서열식별번호: 20 및 21,
(p) 서열식별번호: 34 및 35,
(q) 서열식별번호: 34 및 36,
(r) 서열식별번호: 45 및 46,
(s) 서열식별번호: 55 및 56,
(t) 서열식별번호: 65 및 66,
(u) 서열식별번호: 75 및 76,
(v) 서열식별번호: 85 및 86,
(w) 서열식별번호: 103 및 104,
(x) 서열식별번호: 103 및 105,
(y) 서열식별번호: 103 및 106, 및
(z) 서열식별번호: 115 및 116.
23. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 맵핑 (예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같음)에 의해 결정된 바와 같이, 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 123-128의 전부 또는 일부에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
24. 실시양태 23에 있어서, 펩티드 맵핑 (예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같음)에 의해 결정된 바와 같이, 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 125-128의 전부 또는 일부에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
25. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 맵핑 (예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같음)에 의해 결정된 바와 같이, 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-139의 전부 또는 일부에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
26. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 맵핑 (예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같음)에 의해 결정된 바와 같이, 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 119-126의 전부 또는 일부에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
27. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 맵핑 (예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같음)에 의해 결정된 바와 같이, 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)의 아미노산 위치 130-138의 전부 또는 일부에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
28. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 래트 및 마우스 α-시뉴클레인에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
29. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 β-시뉴클레인 및 인간 γ-시뉴클레인에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
30. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 발광-기반 결합 검정 (예를 들어, 실시예 3에 기재된 바와 같음)에 의해 결정된 바와 같은 α-시뉴클레인 단량체/α-시뉴클레인 PFF 결합 비 (단량체:PFF 결합 비)에 의해 평가된 바와 같이, α-시뉴클레인 단량체보다 α-시뉴클레인 PFF에 대해 더 큰 친화도를 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
31. 실시양태 30에 있어서, 단량체:PFF 결합 비가 100 이상, 500 이상, 700 이상, 1500 이상, 3000 이상, 또는 5000 이상인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
32. 실시양태 21의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
33. 실시양태 21의 항체와 인간 α-시뉴클레인에의 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
34. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
35. 실시양태 34에 있어서, IgG1 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
36. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 이펙터 기능이 감소되거나 부재하는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
37. 실시양태 36에 있어서, 하기 돌연변이: L234A, L235E, 및 G257A를 포함하는 무이펙터 IgG1 Fc를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
38. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
39. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간에서의 면역원성을 감소시키기 위해 변형된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
40. 실시양태 39에 있어서, 각각 서열식별번호: 18 및 19에 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
41. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 모노클로날 항체인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
42. 제2 결합 특이성을 갖는 분자에 연결된 상기 실시양태 중 어느 하나의 항체를 포함하는 이중특이적 분자.
43. 실시양태 42에 있어서, 제2 결합 특이성이 뇌 내로의 분자의 수송을 증가시키는 것인 이중특이적 분자.
44. 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 이중특이적 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산.
45. 실시양태 44의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
46. 실시양태 45의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
47. 모이어티에 연결된 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항체 또는 이중특이적 항체를 포함하는 면역접합체.
48. 실시양태 47에 있어서, 모이어티가 결합 모이어티, 표지 모이어티, 생물학적 활성 모이어티 또는 치료제인 면역접합체.
49. 실시양태 1-43, 47 및 48 중 어느 하나의 항체, 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
50. 실시양태 1-43, 47 및 48 중 어느 하나의 항체, 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 이중특이적 분자, 또는 면역접합체, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
51. 실시양태 46의 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 발현시키는 단계 및 세포로부터 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 단리하는 단계를 포함하는, 항-α-시뉴클레인 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제조하는 방법.
52. 실시양태 1-43, 47 및 48 중 어느 하나의 항체, 또는 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역접합체의 유효량과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 불용성 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체의 생성을 억제하는 방법.
53. 실시양태 52에 있어서, 세린-129의 인산화가 α-시뉴클레인 올리고머에 의해 유도되는 것인 방법.
54. 실시양태 53에 있어서, α-시뉴클레인 올리고머가 사전-형성된 α-시뉴클레인 피브릴인 방법.
55. 실시양태 53에 있어서, α-시뉴클레인 올리고머가 시뉴클레인병증을 갖는 환자로부터의 뇌 샘플로부터 유래된 것인 방법.
56. 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에게 실시양태 1-43, 47 및 48 중 어느 하나의 항체, 또는 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역접합체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법.
57. 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에게 실시양태 1-43, 47 및 48 중 어느 하나의 항체, 또는 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역접합체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 중증도를 경감시키는 방법.
58. 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에게 실시양태 1-43, 47 및 48 중 어느 하나의 항체, 또는 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역접합체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 진행을 지연시키는 방법.
59. 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환이 발생할 위험이 있는 대상체에게 실시양태 1-43, 47 및 48 중 어느 하나의 항체, 또는 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역접합체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환이 발생할 위험을 감소시키는 방법.
60. 뇌 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환이 발생할 위험이 있는 대상체에게 실시양태 1-43, 47 및 48 중 어느 하나의 항체, 또는 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역접합체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 발병을 지연시키는 방법.
61.
(a) 실시양태 1-43, 47 및 48 중 어느 하나의 항체, 또는 그의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역접합체와 대상체로부터의 샘플을 접촉시켜 항체-항원 복합체가 형성되도록 하는 단계;
(b) 형성된 복합체의 양을 측정하는 단계; 및
(c) 샘플에서의 복합체의 양과 대조군에서의 양을 비교하는 단계이며, 여기서 대조군에 비해 샘플에서의 복합체의 상승된 수준은 대상체가 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계
를 포함하는, 대상체에서 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 진단하는 방법.
62. 실시양태 61에 있어서, 샘플이 뇌척수액, 뇌 조직 추출물, 소변 또는 혈액인 방법.
63. 실시양태 56-62 중 어느 하나에 있어서, 질환이 파킨슨병, 파킨슨병 치매, 루이 소체 치매, 루이 소체 질환, 다계통 위축, 또는 순수 자율신경부전인 방법.
64. 실시양태 56-63 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
65. 실시양태 1-43, 47 및 48 중 어느 하나의 항체, 또는 그의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역접합체와 샘플을, 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 α-시뉴클레인 사이에 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에 접촉시키는 단계, 및 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에서 α-시뉴클레인을 검출하는 방법.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용되는 모든 도면 및 모든 참고문헌, 진뱅크 서열, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명확하게 본원에 참조로 포함된다. 특히, PCT 공개 WO 09/045957, WO 09/073533, WO 09/073546, WO 09/054863 및 PCT/US2013/072918, 및 미국 특허 공개 번호 2011/0150892의 개시내용은 명확하게 본원에 참조로 포함된다.
실시예
하기 실시예에서 언급되는 상업적으로 입수가능한 시약을, 달리 나타내지 않는 한, 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명은 재조합 DNA 기술의 표준 절차, 예컨대 상기 및 하기 문헌: [Sambrook et al., 상기 문헌; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991]에 기재된 것을 사용한다.
실시예 1: 항-알파-시뉴클레인 (항-αSyn) 항체의 생성
본 실시예는 αSyn 단량체보다 인간 재조합 야생형 αSyn으로 구성된 사전형성된 피브릴 (PFF)에 우선적으로 결합하는 완전 인간 항-αSyn 모노클로날 항체 (mAb)의 생성을 기재한다.
인간 항-αSyn 모노클로날 항체를 HuMAb® 트랜스제닉 마우스 ("HuMAb"는 뉴저지주 프린스턴 소재의 메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.)의 상표임)의 HCo42 계통 및 KM 마우스 (KM 마우스® 계통은 PCT 공개 WO 02/43478에 기재된 바와 같은 SC20 트랜스크로모솜을 함유함)에서 생성하였다.
재조합 인간 αSyn WT 또는 αSyn A53T-PFF 돌연변이체 단백질 및 가교된 αSyn WT 또는 A53T PFF를 사용하여 재조합 인간 트랜스제닉 마우스를 면역화하였다. 융합 5448에 사용된 마우스는 리비(Ribi) 아주반트 중 αSyn A53T-PFF의 마우스당 25 μg의 복강내 (IP) 및 피하 (SC) 주사를 통해 면역화하였다. 융합 5450에 사용된 HCo42 마우스는 αSyn WT-PFF, αSyn A53T-PFF, αSyn WT-PFF 가교된 것, 및 αSyn A53T-PFF 가교된 것의 혼합물 (1:1:1:1)의 마우스당 25 μg의 IP + Sc + Hock으로 면역화하였다. 각각의 1 mg/mL 스톡 PFF (WT, A53T, 및 가교된 WT 및 A53T) 200 μL를 혼합하여 스톡 PFF 항원 믹스를 제조하였다. 항원을 리비 아주반트 중에 현탁시켰다. 융합 및 하이브리도마 생성을 위해 선택된 마우스에게 융합 3일 전 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DPBS) 중 항원의 추가의 정맥내/복강내 (IV/IP) 부스트를 제공하였다.
비장세포 또는 림프절과 P3x63Ag8.653 세포의 융합 후, 융합 플레이트를 인간 감마/인간 카파 mAb의 존재에 대해 시험함으로써 항원-특이적 항체에 대해 스크리닝하였다. 융합 플레이트로부터의 세포를 αSyn PFF 또는 천연 αSyn 단량체에 대한 결합 특이성에 대해 시험하였다. 기능적 스크리닝으로부터 선택된 αSyn PFF-양성 하이브리도마를 세포주 안정성 및 하이브리도마 모노클로날성을 보장하기 위해 단일 세포 서브클로닝에 의해 서브클로닝하였다. 각각의 서브클론을 ELISA에 의해 항원-특이적 결합 (즉, αSyn PFF 결합)에 대해 다시 시험하여, 하기 서브클론: 11H11-1, 11H11-2, 15A5, 7A10, 36A3, 44B11, 및 21A3을 수득하였다. 이소형 분석은 ELISA에 의해 모든 6종의 항체가 인간 IgG1/카파라는 것을 밝혀내었다. 중쇄 및 경쇄, 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 및 경쇄 CDR1-3의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 표 22에 제공한다.
7A10의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 8 및 9로 이루어진다. 11H11-1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 28 및 29로 이루어진다. 11H11-2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 28 및 29로 이루어진다. 15A5의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 38 및 39로 이루어진다. 21A3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 48 및 49로 이루어진다. 36A3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 58 및 59로 이루어진다. 44B11의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 68 및 69로 이루어진다. 2E2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 78 및 79로 이루어진다. 23H8-1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 94 및 95로 이루어진다. 23H8-2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 94 및 96으로 이루어진다. 23H8-3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 94 및 97로 이루어진다. 1E8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 아미노산 서열 106 및 107로 이루어진다.
상기 기재된 항-αSyn 항체의 무-이펙터 기능 버전을 또한 생성하였다. 본원에 사용된 바와 같이, hIgG1f는 서열식별번호: 117에 제시된 아미노산 서열을 갖는 IgG1의 동종이형을 지칭하고, hIgG1.3f는 Fc 감마 수용체 결합 및 이펙터 기능이 결여된 hIgG1f (L234A, L235E, G237A)의 삼중 돌연변이체 버전을 지칭한다. hIgG1.3f는 서열식별번호: 119에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
실시예 2: 항-αSyn 항체의 에피토프 맵핑
실시예 1에 기재된 항-αSyn 항체의 에피토프 결합 부위를 일련의 중첩 αSyn 펩티드를 사용하여 결정하였다.
N-말단 비오틴 기 및 PEG4 링커 및 C-말단 CONH2를 사용하여 인간 αSyn 서열의 10개의 a.a.를 갖는 일련의 중첩 펩티드를 생성하였다 (표 1). 펩티드를 DPBS 중에 1 mg/ml로 가용화시켰다. 맵핑 연구를 위해, DPBS 중 0.25 μg/ml α-시뉴클레인 펩티드 100 μL를 뉴트라비딘(NeutrAvidin) 코팅된 고용량 96-웰 플레이트 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 매사추세츠주 월섬)에 첨가하고, RT에서 2시간 동안 (또는 4℃에서 밤새) 인큐베이션하였다. 플레이트를 ~300 μL의 세척 완충제 (DPBS 중 0.05% 트윈(Tween))로 3회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 RT에서 ~2시간 동안 (또는 4℃에서 밤새) DPBS 중 3% BSA (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스) 150 μl 로 차단하였다. 샘플 완충제 (0.1% BSA/0.05% 트윈/dPBS, 50 ml 완충제 중 프로테아제 억제제-(로슈 컴플리트(Roche complete), 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스)의 2개의 펠릿) 중에 희석된 시험 샘플 100 μL를 플레이트 상에서 RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하였다. PBSTB (1% BSA/0.2% 트윈/DPBS) 중에 1:1000으로 희석된 2차 항체 100 μL를 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 각각의 세척에 대해 5~10분 동안 3회 세척하였다. 100 μL의 AP 기질 (트로픽스 CDP 스타 레디-투-유즈 위드 사파이어 II(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II), 써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)을 첨가하고, RT에서 30분 동안 발색시켰다. 발광 계수를 퍼킨 엘머 엔비전(Perkin Elmer EnVision) (2102 멀티라벨 리더(2102 Multilabel Reader), 퍼킨엘머, 매사추세츠주 월섬)으로 판독하였다. 플레이트를 검정 동안 일정한 진탕 (적정 플레이트 진탕기) 하에 유지시켰다. 사용된 2차 항체는 알칼리성 포스파타제-아피니퓨어 당나귀 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 펜실베니아주 웨스트 그로브), 알칼리성 포스파타제-아피니퓨어 당나귀 항-토끼 IgG (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브), 알칼리성 포스파타제-아피니퓨어 당나귀 항-마우스 IgG (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브)를 포함하였다. 모든 2차 항체를 50% 글리세롤 최종 농도로 희석하였다.
초기 실험은 모든 항체가 αSyn의 C-말단 영역 내에 위치한 에피토프를 인식한다는 것을 결정하였다. 표 1에 제시된 중첩 펩티드를 사용하여 각각의 항체의 에피토프 결합 부위를 추가로 정밀화하였다.
표 1: 에피토프 맵핑 펩티드
Figure 112019092916809-pct00004
a N-말단 비오틴 기 및 PEG4 링커 및 C-말단 CONH2를 사용하여 인간 αSyn 서열의 10개의 a.a.를 갖는 중첩 펩티드를 생성하였다.
에피토프 맵핑의 결과를 도 1에 제시한다. 데이터는 7A10, 21A3, 15A5, 36A3, 및 1E8이 아미노산 서열 EAYEMP (서열식별번호: 121)에 상응하는 αSyn의 아미노산 123-128 내에 결합하고; 11H11-1은 아미노산 서열 YEMP (서열식별번호: 122)에 상응하는 αSyn의 아미노산 125-128 내에 결합하고; 44B11은 아미노산 서열 EEGYQDYEPE (서열식별번호: 124)에 상응하는 αSyn의 아미노산 130-139 내에 결합하고; 2E2는 아미노산 서열 DPDNEAYE (서열식별번호: 125)에 상응하는 αSyn의 아미노산 119-126 내에 결합하고; 23H8은 아미노산 서열 EEGYQDYEP (서열식별번호: 123)에 상응하는 αSyn의 아미노산 130-138 내에 결합한다는 것을 보여준다.
실시예 3: αSyn 단량체 대비 αSyn-PFF에 대한 항-αSyn 항체의 선택성
본 실시예는 항-αSyn 항체가 αSyn 단량체보다 αSyn-PFF에 대해 우선적으로 결합한다는 것을 입증한다.
재조합 야생형 인간 αSyn (알펩티드(rPeptide), 조지아주 보가트) 및 A53T 돌연변이를 함유하는 인간 αSyn (알펩티드, 조지아주 보가트)을 20mM 트리스/HCl, 100 mM NaCl, PH7.4 중에 1 mg/ml로 재구성하였다. PFF를 표준 프로토콜을 사용하여 생성하였다 (Luk et al., PNAS 2007;106:20051-6). 간략하게, 단량체를 2 ml 안전-잠금 에펜도르프 튜브 (~1ml/바이알)에서 37℃에서 일정한 진탕 (적정 플레이트 진탕기) 하에 4일 동안 인큐베이션하고, 이어서 100,000g에서 RT에서 20분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 PBS로 1 mg/ml의 최종 PFF 농도로 재현탁시켰다.
αSyn의 원섬유화를 티오플라빈 T 결합 검정, 변성 (SDS-PAGE) 및 비-변성 (천연) 겔 전기영동, 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC-HPLC)에 의해 모니터링하였다. 티오플라빈-T 검정의 경우, 샘플을 PBS 중 0.5 mg/ml로 희석하고, 동등 부피의 25 μM 티오플라빈-T에 첨가하였다. 이어서, 여기 및 방출 파장이 485 및 535 nm로 각각 설정된 엔비전 멀티라벨 플레이트 판독기 (퍼킨엘머, 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 샘플을 측정하였다. 총 단백질 수준을 마이크로 BCA 단백질 검정 키트 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 및 임페리얼 단백질 염색 검정 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 둘 다로 평가하였다.
SDS-PAGE 분석의 경우, NuPAGE 샘플 환원제 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 중의 PFF 샘플을 10분 동안 가열 블록 (70℃)에서 인큐베이션하고, 200V의 정전압 하에 4-12% 비스-트리스 겔을 사용하는 SDS-PAGE (1μg/10μl/레인) (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)에 의해 MES SDS 구동 완충제 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 분리하고, 이어서 정전압 50V 하에, 1.5시간에 10% 메탄올을 함유하는 트리스/글리신 완충제 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 니트로셀룰로스 막 (0.45um 세공 크기, 써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)으로 옮겼다. 네이티브-PAGE(Native-PAGE)의 경우, PFF 샘플을 정전압 150V 하에 3-12% 비스-트리스 단백질 겔을 사용하는 네이티브PAGE (1 μg/10 μl/레인) (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)에 의해 네이티브PAGE 구동 완충제 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 분리하고, 이어서 정전압 50V 하에, 1.5시간에 NuPAGE 전송 완충제 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 PVDF 막 (0.45um 세공 크기, 써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)으로 옮겼다. PVDF 막을 메탄올로 30초, dH20로 2분 및 전송 완충제로 10분 동안 전처리하였다. 막을 0.1% 트윈/TBS 중의 5% 탈지 분유 (써모 피셔 사이언티픽, 월섬)로 RT에서 2시간 동안 차단한 후, 1% BSA/0.1% 트윈/TBS 중에 1:1000으로 희석된 1차 항체 4B12 (바이오레전드(BioLegend), 캘리포니아주 샌디에고)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 막을 0.1% 트윈/TBS로 3회 세척한 후 (각각 5~10분 세척), 1% BSA/0.1% 트윈/TBS 중에 1:10,000으로 희석된 항-마우스 IgG (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브, 퍼옥시다제 접합된 친화도 정제된 Fab2)와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 막을 상기와 같이 3회 세척한 다음, 슈퍼시그널 웨스트 펨토 맥시멈(SuperSignal West Femto Maximum) 감수성 기질 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 검출은 GE 아머샴(GE Amersham) 이미저 600을 사용하여 수행하였다. 매직마크(MagicMark)™ XP 웨스턴 단백질 표준물 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 및 시블루 플러스 2(SeeBlue plus 2) (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)를 SDS-PAGE에 사용하였다. 네이티브마크 비염색 단백질 표준물 (인비트로젠(Invitrogen))을 천연 겔에 사용하였다. 세척 완충제 (TBST)는 트리스 완충 염수 중 0.1% 트윈-20으로 이루어졌다.
결합 검정을 위해, 96 웰 플레이트 (높은 결합 마이크로플레이트)를 RT에서 2시간 동안 (또는 4℃에서 밤새) DPBS 중 1 μg/ml αSyn WT PFF 100 μL로 코팅하였다. 플레이트를 ~300 μL의 세척 완충제 (DPBS 중 0.05% 트윈)로 3회 세척하였다. 플레이트를 150 μl의 3% BSA/DPBS로 RT에서 2시간 동안 (또는 4℃에서 밤새) 차단하였다. PFF (2 μg/ml로부터 출발함) 및 α-syn WT 단량체 (20 μg/ml로부터 출발함)의 3-배 연속 희석물을 샘플 완충제 (0.1% BSA/0.05% 트윈/DPBS, 50ml 완충제 중 프로테아제 억제제 (로슈 컴플리트, 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스)의 2개의 펠릿) 중에서 제조하였다. 항체 인큐베이션의 경우, 동등 부피의 2-배 검정 농도의 αSyn PFF 또는 단량체를 BD 팔콘 낮은 결합 플레이트에서 2-배 검정 농도의 항체와 혼합하고, RT에서 ~2시간 동안 인큐베이션하였다. 항체 및 PFF 또는 단량체의 혼합물 100 μL를 PFF 코팅된 플레이트에 첨가하고, RT에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하였다. PBSTB (1% BSA/0.2% 트윈/dPBS) 중에 1:1000으로 희석된 당나귀 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브, 50% 글리세롤 함유) 100 μL를 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척당 5~10분 동안 3회 세척하였다. 100 μL의 AP 기질 (트로픽스 CDP 스타 레디-투-유즈 위드 사파이어 II, 써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)을 첨가하고, RT에서 30분 동안 발색시켰다. 발광 계수를 퍼킨 엘머 엔비전 (2102 멀티라벨 리더, 퍼킨엘머, 매사추세츠주 월섬)으로 판독하였다. PFF를 항체에 의한 코팅 또는 항체와의 혼합 전 1초 펄스로 15회 초음파처리하였다. 플레이트를 검정 동안 일정한 진탕 (적정 플레이트 진탕기) 하에 유지시켰다.
도 2에 제시된 바와 같이, 항-αSyn 항체를 αSyn 단량체에 대한, 및 WT 또는 A53T αSyn PFF에 대한 결합 효력에 대해 평가하였다. 대조군 항체 1에 대한 데이터를 또한 도 3에 제시한다. WT PFF 및 A53T PFF에 대한 유사한 결합이 시험된 모든 항체에 대해 관찰되었다. 대조군 항체 항체 1 및 항체 2를 제외하고, 모든 6종의 항-αSyn 항체는 αSyn 단량체보다 αSyn PFF에, 적어도 500의 M/P 비로 우선적으로 결합하였다. 결합 데이터의 요약을 표 2에 제시한다.
표 2: 결합 검정 결과의 요약
Figure 112019092916809-pct00005
a M/P = 단량체/PFF 결합 비 (더 낮은 비는 PFF에 대한 더 높은 선호도를 의미함)
b 항체 1 및 항체 2는 항체 대조군이다.
실시예 4: 항-αSyn 항체의 탈면역화
본 실시예는 항-αSyn 항체의 하위세트를 탈면역화하는 것이 αSyn 단량체 및 αSyn PFF에의 결합에 대해 미치는 효과를 결정하였다.
인간화를 통해 가능한 면역원성 핫스팟을 제거하기 위해, 7A10의 중쇄 및 경쇄의 서열을 면역원성에 대해 분석하였다. 세계 인구 대립유전자에서 통상적으로 발견되는 27종의 HLA에의 결합에 대한 7A10의 분석 및 비-배선 절편의 확인을 수행하여 가능한 면역원성 핫스팟을 결정하였다.
동족 펩티드 (세포내이입 및 수지상 세포에 의한 생물제제의 분해의 부산물로서 형성됨)의 MHC-II 대립유전자에 대한 결합, 이어서 수지상 세포의 표면 상에의 제시는 적응 면역 반응에 중요하다. 그러나, MHC-II 대립유전자에 대한 결합에 더하여, 제시된 펩티드는 CD4+ T-세포 수용체가 그에 결합하고 (T-세포 인식) 이에 따라 활성화 및 T-세포 증식으로 이어지기 위해 비-고유 (비-자기)이어야 한다. 이들 효과를 컴퓨터적으로 시뮬레이션하고 다양한 공여자의 효과를 모델링하기 위해, 항체를 먼저 N-말단으로부터 출발하여 한 번에 1개의 아미노산씩 C-말단을 향해 체계적으로 이동시켜 15-mer 펩티드로 분해하였다. 수득된 각각의 15-mer 펩티드를 (i) 세계 인구에서 통상적으로 발견되는 27종의 HLA 각각에 대한 결합, 및 (ii) 인간 면역글로불린 배선 서열에 대한 완벽한 서열 매칭에 대해 평가하였다. 완벽한 배선 매칭의 경우에, 15-mer 펩티드는 "자기"로 간주되고, 따라서 항원성인 것으로 간주되지 않는다. 다른 한편으로는, "비-자기" (완벽한 배선 매칭의 부재)로 결정되는 경우, 27종의 대립유전자 중 일부에 충분한 친화도로 결합한다면 잠재적으로 항원성인 것으로 간주된다.
IEDB (면역 에피토프 데이터베이스) 분석 자원 컨센서스 도구를 사용하여 펩티드/MHCII 결합 친화도 예측을 수행하였다. 예측된 친화도는 5종의 상이한 펩티드 MHC-II 결합 예측 방법의 컨센서스에 기초한 백분위수 등급으로서 보고되었다.
7A10의 중쇄 및 경쇄의 면역원성 분석을 도 4에 제시한다. 분석 결과는 경쇄 (VK)가 대부분 비-면역원성인 것으로 예측되고, 전형적으로 에피토프 결합에 수반되는 CDR3에 유일하게 핫스팟이 있다는 것을 보여준다. 중쇄 (VH)는 핫스팟이 넓은 영역, 즉, CDR2 (잔기 49-65) 및 FW3-CDR3 (잔기 90-98)에 걸쳐 퍼져있는 것으로 제시된 2개의 영역을 갖는다. 8개 미만의 스트레치 길이인 핫스팟을 무시하면, VH 쇄에 오직 2개의 영역 (49-65, 90-98)만이 돌연변이유발을 통한 위험제거 영역으로 간주되었다.
도 4에서 각각의 아미노산 아래의 숫자는 그러한 아미노산의 중심의 15-mer 펩티드에 결합하는 대립유전자의 비율을 나타낸다. 예를 들어, 7A10_VH의 Y52에서 "5"는 Y52 중심의 15-mer 펩티드, 즉, LEWIGYI Y YSGRTKY를 지칭하고, (i) 이러한 펩티드가 인간 배선 매칭을 갖지 않고 (따라서 비-자기), (ii) 27 대립유전자의 50-60% 사이가 이러한 펩티드에 대해 높은 결합 친화도를 나타낸다는 것을 보여준다. 숫자는 척도상 담회색 (면역원성일 가능성이 최소)에서 암회색 (면역원성 핫스팟일 가능성이 최고)의 색상으로 배정된다. 3개의 굵은 화살표는 돌연변이체 선택을 위한 위치를 나타낸다: R56S, K58N, 및 T93A.
시험관내 인간 PBMC 증식 검정을 사용하여 7A10 및 탈면역화된 7A10-T93A에 대해 인간 면역원성 위험을 평가하였다. 아바스틴 및 αIL-21R mAb는 그의 임상 면역원성이 시험관내 면역원성 검정 결과와 양으로 상관되었기 때문에 음성 및 양성 검정 대조군으로서 사용하였다. 피콜(Ficoll) (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 구배 원심분리에 의해 건강한 지원자로부터 PBMC를 단리하고, 올리고뉴클레오티드 프로브 (프로이뮨(ProImmune))에 의한 폴리머라제 연쇄 반응 증폭 및 혼성화를 사용하여 인간 백혈구 항원 (HLA) 부류 II를 특징화하였다. 세계 인구 빈도와 근접하게 매칭되는 HLA 부류 II 유형으로 구성된 40명의 PBMC 공여자 패널을 각각의 검정 실행에 사용하였다. PBMC를 CFSE (카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르, 인비트로젠)로 표지하여 증식을 모니터링하고, 10% 인간 AB 혈청 (바이오리클레메이션(Bioreclamation)), 비-필수 아미노산 (깁코(Gibco)), 및 페니실린-스트렙토마이신 (깁코)을 함유하는 RPMI (론자(Lonza)) 중 웰당 200,000개의 세포로 96 웰 플레이트에 6회 반복 플레이팅하였다. α 시뉴클레인 항체 및 대조군 단백질을 PBMC와 함께 1 μM로 7일 동안 배양한 후, 배지를 세척하고, 세포를 APC (알로피코시아닌, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))에 접합된 항-인간 CD4 mAb로 표지하였다. 세척 단계에 의해 미결합 항-CD4 mAb를 제거한 후, 나머지 세포를 PBS 중의 3.7% 포르말린 (시그마)으로 고정시키고, 유동 세포측정법에 의해 분석하여 증식 CD4+ T 세포의 백분율을 결정하였다. 특정한 항체에 대한 증식 CD4+ T 세포의 백분율이 배지 단독에 의한 증식 CD4+ T 세포의 백분율보다 플러스 2 표준 편차 더 큰 경우에 공여자는 양성으로 간주된다. 데이터는 양성 증식 신호를 나타낸 40명의 공여자의 백분율로서 제시된다.
이들 항체와의 인큐베이션 후 유의한 CD4+ T 세포 증식 반응을 나타내는 공여자의 백분율을 도 5에 한다. 7A10은 PBMC 공여자의 40명 중 21명 (52.5%)에서 증식 반응을 발생시켰고, 7A10-T93A는 40명의 공여자 중 5명 (12.5%)에서 증식 반응을 나타내었다.
실시예 5: αSyn 단량체 및 αSyn PFF에 대한 탈면역화된 항-αSyn 항체의 결합
본 실시예는 실시예 3에 기재된 바와 같은 ELISA에 의해 실시예 4에 기재된 7A10의 탈면역화된 버전, 뿐만 아니라 21A3의 탈면역화된 버전, 즉, 21A3-V82L의 αSyn 단량체 및 αSyn PFF에 대한 결합을 평가하였다.
표 3에 제시된 바와 같이, 7A10-T93A 및 21A3-V82L 복귀는 모 항체에 대해 측정된 효력의 2-배 내의 PFF 결합 효력을 나타내었고; 단량체 결합 값은 이들 상대적으로 약한 효력에 대해 정확한 농도-반응 곡선을 생성하는 것에 대한 어려움으로 인해 보다 가변적이었다. K58Y-T93A 복귀는 PFF 결합에 대해 7A10 모 항체와 비교하여 >10X 더 약했고, 한편 R56S-T93A 및 R56S-K58N-T93A의 PFF 결합 효력은 7A10의 2X 내였다.
표 3: 탈면역화된 αSyn 변이체의 결합 요약
Figure 112019092916809-pct00006
a 제시된 데이터는 표시된 바와 같은 Fc 불활성 인간 이소형 IgG1.3에 대한 것이다.
b 허용되는 대조군 신호를 생성하는데 필요한 항체의 농도
실시예 6: 항-αSyn 항체와 래트, 마우스, 및 인간 αSyn의 교차-종 반응성
종 교차-반응성을 평가하기 위해, 항-αSyn 항체를 래트, 마우스 및 인간 αSyn의 a.a. 111-140으로 나타내어지는 펩티드에의 결합에 대해 시험하였다 (표 4). 위치 121-122의 αSyn 서열은 인간, 래트 및 마우스 사이에 상이하다. 결합 검정을 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다.
표 4: 인간, 래트, 및 마우스 αSyn 111-140 펩티드
Figure 112019092916809-pct00007
*마우스 111-140 (서열식별번호: 156), 래트 111-140 (서열식별번호: 157), 인간 111-140 (서열식별번호: 158)
항-αSyn 항체는 상응하는 인간 펩티드와 비교하여 래트 및 마우스 αSyn 111-140 펩티드에 유사한 결합을 나타내었다 (도 6). 펩티드 결합 결과의 요약을 표 5에 제시한다. 전체적으로, 항-αSyn 항체는 상응하는 인간 펩티드와 비교하여 설치류 111-140 펩티드에의 결합에 대해 2-3-배 더 약한 효력을 나타내었다.
표 5: 인간, 래트, 및 마우스 αSyn 111-140 펩티드에 대한 결합의 요약
Figure 112019092916809-pct00008
실시예 7: 항-αSyn 항체와 인간 αSyn, βSyn, 및 γSyn의 교차-반응성
본 실시예에서, 항-αSyn 항체를 실시예 3에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 인간 βSyn 및 인간 γSyn에 대한 결합 및 그와의 교차-반응성에 대해 시험하였다.
도 7에 제시된 바와 같이, 항체는 인간 αSyn, βSyn, 또는 γSyn 사이를 구별하지 않았다. PFF에 결합하는 것은 양성 대조군으로 포함시켰다.
실시예 8: 항-αSyn 항체의 생물물리학적 특징화
본 실시예는 다양한 방법을 사용한 항-αSyn 항체의 생물물리학적 특성의 특징화를 기재한다. 열적 안정성, 분자량, pI, 소수성 분석의 결과를 표 6에 요약한다.
표 6: 생물물리학적 특성
Figure 112019092916809-pct00009
시차 주사 열량측정 (DSC)을 위해, 샘플을 1 mg/ml 항체로 60℃/hr의 온도로 스캐닝하였다. 표 6에 제시된 바와 같이, 모든 7A10 항체는 바람직한 폴딩 안정성을 나타내었다.
표 6에 제시된 모든 3종의 7A10 항체의 정체를 무손상 질량 분광분석법 (MS) 분석에 의해 평가하였다. 분석은 액퀴티(ACQUITY) UPLC/워터스 시냅트(Waters Synapt) G2 질량 분광계를 사용하였다. 샘플을 DTT (100 mM)에 의해 1 mg/mL로 환원시켰다. UPLC/MS 조건: BEH C4 RP 칼럼 상에의 1 μg 샘플 주입, 2.1 x 150 mm, 300 Å, 1.7 mm 입자, 60℃, 20분 구배: 10분 내 10%에서 38% (이동상 B), LC 유량 200 μL/분, 양성 MS 이온 모드. 이러한 방법을 또한 글리코실화 프로파일 분석에 사용하였다.
모든 3종의 7A10 항체의 정체를, 측정된 질량과 아미노산 서열로부터 이론적으로 예측되는 질량 사이의 일치에 기초하여, 무손상 질량 분광분석법 (MS) 분석에 의해 확인하였다. 추가적으로, 글리코실화 프로파일을 결정하였고, 이는 N297에서 글리코실화된 mAb에 대해 전형적인 것으로 확인되었다.
다음으로, 전하 균질성을 iCIEF에 의해 하기 조건: 프로테인심플 iCE3 기기; 1분 1500V 프리-포커스, 10분 3000V 포커스를 사용하여 측정하였고, 샘플을 0.35% 메틸 셀룰로스, 2.0 M 우레아, 1% v/v 파마라이트 5-8, 및 3% v/v 파마라이트 8-10.5 중 0.2 mg/mL로 실행시켰다. pI 마커 5.8 및 10.10. 표 6은 측정된 pI 값이 거의 9이고, 84-87%가 주요 피크로서 나타나며, 11-13%는 산성 변이체이고, 나머지는 염기성이다.
항체의 동질성을 또한 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의해 하기 조건: 도소 TSKgel 부틸 NPR 칼럼, 이동상 A: 0.1M 인산나트륨 pH 7.0, 2M 황산암모늄, 이동상 B: 0.1M 인산나트륨 pH 7.0, 유량: 1.0 mL/분을 사용하여 프로빙하였다. 표 6에 제시된 바와 같이, 모든 3종의 항체는 100%가 주요 피크로서 나타났다.
항체가 응집되었는지 또는 말단절단되었는지 평가하기 위해, 분석 SEC를 하기 조건: 쇼덱스 K403-4F 칼럼, 완충제 = 100 mM 인산나트륨 150 mM 염화나트륨, pH7.3, 유량 = 0.3 mL/분을 사용하여 수행하였다. 표 6에 제시된 바와 같이, 7A10의 모든 버전은 어떠한 검출가능한 HMW 종도 나타내지 않았다.
7A10-IgG1f, 7A10-IgG1.3f, 및 7A10-T93A-IgG1.3f의 안정성을 또한, 고농도 및 고온을 포함한, 강제 안정성 조건 하에 시험하였다. 항체를 20 mM 히스티딘, 250 mM 수크로스, pH 6.0 중에 100 mg/ml 초과로 농축시키고, 4주 동안 4℃에서 저장하였다. 이어서, 항체를 HMW 또는 LMW 종의 증가에 대해 분석하였다. 표 7에 제시된 바와 같이, 어떠한 유형의 종에서도 거의 증가가 없었고, 이는 7A10이 매우 유리한 농축력 거동을 갖는다는 것을 나타낸다.
항체를 또한 동일한 히스티딘 완충제 내로 10 mg/ml의 최종 항체 농도로 투석하고, 40℃에서 4주 동안 인큐베이션하여, 임의의 잠재적인 화학적 또는 물리적 분해를 강제하였다. 표 7에 제시된 바와 같이, 검사된 3종의 7A10 항체 중 어떠한 것에서도 HMW 종의 증가는 없었다. 소량의 LMW 종 (2.5-5%)의 출현이 존재하였다.
항체의 전하 프로파일을 또한 CIEF에 의해 측정하였다. 항체는 대부분 주요 피크의 전형적인 분포를 나타내었고, 산성 종은 다음으로 가장 큰 집단이었고, 염기성은 가장 작았다. 4주 동안 40℃에 노출 시 이들 하전된 종의 비율에 있어서의 변화도 또한 항체에 대해 전형적이다.
표 7: 강제 안정성
Figure 112019092916809-pct00010
실시예 9: 사전형성된 αSyn 피브릴에 대한 항-αSyn 항체의 결합력
본 실시예는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용한 7A10의 αSyn 결합 거동을 기재한다.
도 8은 표면 상에 포획된 항체 및 용액 중의 야생형 단량체 αSyn을 사용한 결합 거동을 보여준다. 이러한 포맷은 1가 친화도를 측정가능하게 한다. 야생형 αSyn은 매우 낮고 약한 결합을 나타내었다. 대조적으로, PFF를 용액 분석물로서 시험하였을 때, 훨씬 더 큰 질량의 αSyn이 결합한 것으로 관찰되었다. 이는 다가 PFF의 2가 결합력으로 인한 견고함의 증가와 일치한다. 대조군 항-인간 αSyn 항체 1을 또한 시험하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, 항체 1은 단량체 및 PFF αSyn에 유사한 회합률 및 해리율로 결합하였고, 이는 이러한 항체와 2가/결합력으로 인한 어떠한 검출가능한 결합 증진도 없다는 것을 시사한다.
다음으로, 결합력의 추정을 용이하게 하기 위해 SPR 검정의 포맷을 최적화하였다. PFF는 다량체이고, 7A10은 정상 2가 모노클로날 항체임을 주목한다. 따라서, 결합 데이터는 결합력 효과로 인한 결합 친화도의 증진을 반영한다 (도 8 참조).
도 9에 제시된 바와 같이, 7A10 및 7A10-T93A는 표면 상에 고정된 PFF에 유사한 결합력으로 결합하였다 (7A10: ka (1/Ms): 5.811E+7, kd (1/s): 0.009834, KD: 1.692E-10 M; 7A10-T93A: ka (1/Ms): 8.946E+7, kd (1/s): 0.03873, KD: 4.329E-10 M). 둘 다에 대한 회합 동역학은 매우 빠른 것으로 확인되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 검정 포맷에서 결합력에 있어서 식별가능한 차이가 존재하는지 결정하기 위해 2개의 데이터 세트를 가능한 한 정확하게 1:1 결합 모델로 분석하였다. 곡선-피팅에 기초하여, 항체는 표면에 고정된 PFF에 4-배 이내인 결합력으로 결합하는 것으로 보인다.
실시예 10: 시험관내 항-αSyn 항체에 의한 불용성, 응집된 αSyn의 차단 유도
본 실시예는 항-αSyn 항체가 시험관내 유도된 PFF 또는 MSA 뇌 용해물에 의한 αSyn의 세포내, 세제 불용성, 인산화된 (pS129) 응집체의 생성을 차단하는 능력을 기재한다.
αSyn의 세포내, 세제 불용성, 인산화된 (pS129) 응집체는 배양된 세포에서 PFF 또는 MSA 뇌 용해물에 의한 처리 후에 유도될 수 있다 (Prusiner et al., PNAS 2015:112:E5308-17; Luk et al., PNAS 2007;106:20051-6). 유사한 시스템을 래트 해마 뉴런을 사용하여, 인간 A53T αSyn을 과다발현시키고, 세포를 11일 동안 PFF 또는 MSA 뇌 용해물 샘플에 노출시킨 후 불용성 pS129 αSyn의 유도를 측정함으로써 개발하였다.
방법
a. PFF의 제조 및 원섬유화의 분석
PFF를 제조하고, 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 분석하였다.
b. 인간 뇌 용해물의 제조
피질 뇌 샘플을 배너 헬스 리서치 인스티튜트(Banner Health Research Institute) (애리조나주 선 시티)로부터 입수하였다. 환자 12-18, 01-03 및 04-51로부터의 MSA 뇌 조직을 면역고갈 실험에 사용하였다. 뇌 샘플을 여과된 PBS (1 ml PBS/100 mg 조직 습윤 중량) 중에서 콘테스 마이크로(KONTES Micro) 초음파 세포 교란기 (출력 40, 튠 50)를 사용하여 2 x 10초 동안 초음파처리하였다. 샘플을 2 ml 에펜도르프 튜브에 넣고, 튜브를 초음파처리 동안 습식 얼음 상에 유지시켰다. 뇌 용해물을 3,000 g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액 분취물을 액체 질소 중에서 동결시키고, -80℃에서 저장하였다. αSyn ELISA (총 & pS129)를 포함한 QC 검정을 수행하였다. 펠릿을 고속-회전 단리하기 위해, PBS 중 100 mg/ml로 이전에 제조된 뇌 균질물을 빙냉 PBS 중에서 33.3 mg/ml로 3-배 희석한 후, 4℃에서 30분 동안 100,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 폐기하였다. 펠릿을 출발 샘플과 동일한 부피로 빙냉 PBS 중에 재현탁시켰다.
c. 1차 세포 배양 단리
1차 래트 해마 뉴런 배양물을 ~7마리의 한배새끼로부터 배아 제19일 (E19)째에 파파인 해리 시스템을 사용하여 제조업체의 지침 (워팅턴 바이오케미칼(Worthington Biochemical))에 따라 매주 제조하였다. 래트 해마 세포를 PDL 코팅된 96 웰 BD 영상화 플레이트 (주당 ~16개 플레이트) 상에 1X B-27 (써모피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)이 보충된 신경 기초 배지 (써모피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 및 0.5mM 글루타맥스 (써모피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)를 함유하는 뉴런 배양 배지 중 30,000/웰로 플레이팅하였다.
d. 면역침전
이전에 제조된 뇌 균질물 (100 mg/ml)을 완전 뉴로베이슬 배지 (NBM) (pen/strep, 글루타맥스, 및 B-27 보충물을 함유하는 뉴로베이슬 배지) (써모피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 중에 150-배 희석하였다. 항체의 시험 농도를 희석된 뇌 균질물의 분취물에 첨가함으로써 시뉴클레인 항체의 농도 반응 함수를 시험하였다. 샘플을 4℃에서 엔드 오버 엔드 인큐베이션에 의해 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 1:10 희석된 세척 및 차단된 단백질 A/G 아가로스 비드 슬러리를 샘플에 첨가하고, 이어서 4℃에서 엔드 오버 엔드 인큐베이션에 의해 밤새 인큐베이션하였다. 단백질 A/G 아가로스 비드 (써모피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)를 PBS + 0.05% 트윈-20으로 1회, PBS로 3-회 세척한 다음, PBS + 1% BSA 중에서 4℃에서 2시간 동안 차단하였고; 각 단계의 경우 2 비드 부피였고; 최종 비드 샘플 슬러리는 PBS:비드 펠릿으로 1:1이었다. 인큐베이션 후, 샘플을 1500g에서 2분 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화하였다. 고갈된 상청액을 빼내어, 면역형광 검정에서 처리에 사용하였다.
e. 면역형광 검정
시험관내 (DIV) 제4일에, 래트 해마 뉴런을 A53T 돌연변이를 보유하는 인간 αSyn에 대한 cDNA를 함유하는 아데노-연관 바이러스 벡터, AAV1 (진디텍트(GeneDetect), 플로리다주 브레이든턴)로 MOI 3,000으로 형질도입하였다. DIV 제7일에 세포를 시험 샘플로 처리하였다 (처리당 6개의 웰). 모든 처리는 절반 배지 교환에 의해 행하였다. 각각의 플레이트는 음성 대조군 (비처리 상태), 양성 대조군 (10 nM PFF) 및 비-고갈된 유도인자 대조군을 함유하였다. DIV 제18일에 (처리 11일 후), 세포를 고정시키고, 불용성 αSyn에 대해 염색하였다. 고정을 위해, 4% 파라포름알데히드 및 4% 수크로스 및 1% 트리톤을 함유하는 용액을 15분 동안 첨가하였다. 고정 후, DPBS 플러스 0.05% 트윈을 함유하는 세척 완충제로 세포를 3회 세척하였다. 이어서, 세포를 DPBS 중 3% BSA 및 0.3% 트리톤으로 1-2시간 동안 차단하여 비-특이적 신호를 차단하였다. 차단 단계 후, 세포를 차단 완충제 중에서 밤새 1차 항체로 처리하였다. 사용된 1차 항체는 항-aSyn 및 베타 시뉴클레인 (EP1646Y, 밀리포어(Millipore)/압캠(Abcam); 영국 캠브리지; N-말단 토끼 모노클로날, 1:100 희석), 항-αSyn, 포스포 S129 (81A, 코반스(Covance)/바이오레전드(Biolegend), 보가르트(Bogart), GA마우스 모노클로날, 1:1000 희석), 및 항-MAP2 (ab5392, 압캠; 영국 캠브리지; 닭 폴리클로날, 1:10,000 희석)이었다. 다음 날, 플레이트를 0.05% 트윈을 함유하는 DPBS로 3회 세척한 후 형광-접합된 2차 항체와 1시간 인큐베이션하였다. 사용된 2차 항체는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 염소 항-마우스 IgG, 1:500 희석; 알렉사 플루오르 488 염소 항-토끼 IgG, 1:500 희석, 알렉사 플루오르 568 염소 항-닭 IgG, 1:500 희석 및 훽스트, 1:800 희석이었다. 모든 2차 항체는 인비트로젠으로부터 입수하였다. 이어서 플레이트를 DPBS 플러스 0.05% 트윈으로 각각 15분 동안 3회 세척하였고, DPBS 단독으로 최종 세척하였다.
f. 고함량 면역형광 분석
영상을 어레이스캔(ArrayScan)™ VTi 자동화 현미경 및 영상 분석 시스템 (셀로믹스 인크.(Cellomics Inc.), 펜실베니아주 피츠버그) 상에서 x10 대물렌즈로 획득하였다. 영상화된 플레이트를 하이 콘텐트 스튜디오 3.0(High Content Studio 3.0) 소프트웨어 패키지 (셀로믹스, 미국)에 의해 뉴런 프로파일링 어플리케이션을 사용하여 분석하였다. 세포를 핵 영역을 규정하는 훽스트 형광에 의해 확인하고, 신경돌기를 MAP2 염색에 의해 확인하였다. 핵 및 MAP2 염색을 중첩시켜 세포 몸체를 확인하였다. 총 불용성 αSyn 및 S129에서의 총 인산화된 αSyn (pS129)을 2개의 추가의 채널에서 형광 강도에 의해 확인하였다. 유도는 신경돌기에 공동국재화된 총 pS129 스팟 강도에 의해 정량화하였다. 배수 유도는 음성 대조군 웰의 평균에 대해 정규화함으로써 결정하였다. 정규화된 핵 계수, 정규화된 뉴런 계수, 및 정규화된 신경돌기 길이를 곱하여 독성 인덱스를 계산하였고, 각각의 웰을 음성 대조군 웰의 각각의 평균 값에 대해 정규화하였다. 독성 점수가 0.6 미만인 웰은 분석에서 제외하였다. 각각의 항체 시험 농도에 대한 배수 유도 값을 비고갈된 유도인자로 처리된 웰의 평균에 대해 정규화하였다. 방정식 Y=최저 + (최고-최저)/ (1+10^((X-LogIC50))) 및 각각의 실험에 대해 계산된 IC50을 사용하여 프리즘 (그래프패드(GraphPad))에서 최소 제곱에 의해 농도 반응 곡선을 생성하였다.
결과
도 10A에 제시된 바와 같이, AAV-hA53T-αSyn을 사용한 A53T αSyn의 과다발현은 고함량 면역형광 분석에 의해 측정된 바와 같이 PFF-유도된 pS129 신호에서 강건한 증가를 발생시켰다. PFF-유도된 pS129 신호는 용량 의존적이었고, 이는 최고 300 nM까지의 다양한 농도의 hA53T-αSyn 단량체에 의해서는 도출될 수 없었다 (도 10B). 추가적으로, 9개의 상이한 MSA 뇌 용해물 샘플에 의한 처리는 또한 pS129 신호 (도 10C)를 유도하였지만; 대조군 뇌 용해물에 의해서는 유도가 관찰되지 않았다 (도 10D). pS129 신호의 PFF-의존성 증가는 MAP2-양성 뉴런의 감소된 분지점과 상관되었다 (도 10E). MSA 용해물에서의 유도 활성은 고속 원심분리에 의해 단리될 수 있었고 (도 10F), 이는 이들 샘플에서의 유도인자가 고분자량 응집체임을 시사한다. 또한, pS129 신호의 시간-의존성 증가가 MSA 펠릿에 의한 처리 후에 관찰되었다 (7일 인큐베이션: 10nM PFF의 0.22±0.06, n=6; 14일 인큐베이션: 10nM PFF의 0.32±0.05, n=6; 18일 인큐베이션: 10nM PFF의 0.52±0.08, n=6) (도 10G). 마지막으로, hA53T-aSyn PFF에 의해 관찰된 유도된 병리상태와 유사하게, MSA 뇌 용해물 샘플에 의한 처리 후 분지점의 감소가 또한 관찰되었다 (10nM PFF: 0.50±0.16, n=4300; MSA: 0.58±0.17, n=1842; 도 10H).
다음으로, 고함량 검정을 사용하여, 상이한 αSyn 항체가 PFF 및 MSA 뇌 용해물 샘플로부터 유도 활성 (즉, S129의 PFF-유도된 인산화)을 면역고갈시키는 능력을 평가하였다. 3명의 상이한 MSA 환자, 12-18, 01-03, 04-51로부터 제조된 용해물을 시험하였다. 면역고갈을 위해, 샘플을 일정 범위의 항체 농도와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 면역-복합체를 제거하고, 고갈된 샘플을 뉴런 배양물과 함께 11d 동안 인큐베이션하였다. 유도는 비고갈된 대조군 웰의 평균에 대해 정규화된 pS129 강도에 의해 측정하였다. 벤치마크 항-αSyn 항체 항체 1을 사용한 면역결핍에 대한 예시적인 농도 반응 곡선을 도 11에 제시하고, IC50을 표 8-11에 요약한다. 항체 1은 PFF 및 MSA 뇌 용해물 둘 다로부터 유도인자의 강력하고 완전한 고갈을 나타내었다. 이들 결과는 MSA 용해물에서의 유도 활성이 αSyn에 의존한다는 것을 확인시켜준다. 항체 1은 MSA 용해물 (5.47 nM, 2.48 nM 및 0.43 nM, 표 9-11)과 비교하여 PFF (0.032 nM, 표 8)로부터 유도 활성을 고갈시키는데 더 강력하였고, 이는 이들 유도 종의 수준 또는 입체형태에서 차이가 있을 수 있다는 것을 시사한다.
다음으로, 항체 7A10, 21A3, 36A3, 15A5, 11H11-1, 및 44B11을 PFF 및 MSA 뇌 용해물로부터의 유도 활성의 면역고갈에 대해 시험하였다. 7A10, 21A3, 36A3, 15A5, 11H11-1, 및 44B11에 대한 예시적인 농도 반응 곡선을 각각 도 12-17에 제시한다. PFF, MSA 12-18, MSA 01-03, MSA 04-51에 대한 평균 IC50 값의 요약은 각각 표 8-11에 요약한다. 항체 1과 유사하게, 모든 6종의 항체는 PFF로부터의 유도 활성을 농도-의존적 방식으로 고갈시켰다 (도 12-17). 평균 IC50은 0.018 nM 내지 0.066 nM 범위였고, 항체 1에 대한 IC50과 유의하게 상이하지 않았다 (표 8). 모든 6종의 항체는 또한 MSA 용해물을 농도-의존적 방식으로 완전히 고갈시켰지만; PFF에 의한 결과와 대조적으로, 일부 항체는 항체 1보다 유의하게 더 강력하였다 (표 9-11). 예를 들어, 7A10은 모든 3종의 MSA 용해물로부터의 유도 활성의 고갈에 대해 항체 1보다 유의하게 더 강력하였고: 7A10은 MSA 12-18 고갈에 대해 항체 1보다 14-배 더 강력하였고 (p < 0.001, 표 9), MSA 01-03에 대해 9-배 (p < 0.05, 표 10) 및 MSA 04-51에 대해 12-배 (p < 0.01, 표 11) 더 강력하였다. 유사하게, 21A3은 MSA 12-18에 대해 항체 1보다 34-배 더 강력하였고 (p < 0.01, 표 9), MSA 01-03에 대해 7-배 (유의하지 않음, 표 10), 및 MSA 04-51에 대해 10-배 (p < 0.01) 더 강력하였다. 관련 항체 15A5 및 36A3은 유사한 경향을 나타내었다 (표 9-11). 11H11-1은 항체 1과 비교하여 효력에서 덜 강건한 차이를 나타내었다 (표 9-11). 별개의 에피토프에 결합하는 44B11은 MSA 용해물 12-18의 면역고갈에 대해 9E4보다 3-배 더 강력하였고 (p < 0.05, 표 9) 및 MSA 용해물 01-03 (표 10) 및 MSA 용해물 04-51 (표 11) 고갈에 대해 항체 1과 동등효력이었다. 관찰된 효력에서의 상대적인 차이는 항체 에피토프의 노출 또는 접근성에 영향을 미치는 유도인자의 입체형태 또는 계통의 차이와 연관될 수 있다.
표 8: PFF IC50 데이터의 요약
Figure 112019092916809-pct00011
a 항체 1에 상대적이고 대응표본 t-검정에 기초한 통계. ns: p>0.05; * p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. t-검정 결과는 달리 나타내지 않는 한 ns이다.
표 9: MSA 12-18 용해물에 대한 IC50 데이터의 요약
Figure 112019092916809-pct00012
a 항체 1에 상대적이고 대응표본 t-검정에 기초한 통계. ns: p>0.05; * p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. t-검정 결과는 달리 나타내지 않는 한 ns이다.
표 10: MSA 01-03 용해물에 대한 IC50 데이터의 요약
Figure 112019092916809-pct00013
a 항체 1에 상대적이고 대응표본 t-검정에 기초한 통계. ns: p>0.05; * p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. t-검정 결과는 달리 나타내지 않는 한 ns이다.
표 11: MSA 04-51 용해물에 대한 IC50 데이터의 요약
Figure 112019092916809-pct00014
a 항체 1에 상대적이고 대응표본 t-검정에 기초한 통계. ns: p>0.05; * p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. t-검정 결과는 달리 나타내지 않는 한 ns이다.
7A10 및 21A3의 탈면역화된 변이체를 또한 MSA 12-18 추출물의 면역고갈에 대해 시험하여 항체 활성에 대한 아미노산 변형의 영향을 평가하였다. 표 12에 제시된 바와 같이, 7A10-T93A는 7A10 모 항체 (0.52 nM)와 비교하여 MSA 12-18로부터의 유도 활성을 고갈시키는데 유사한 효력을 나타내었고 (0.66 nM); 대조적으로, 다른 7A10 변이체는 7A10 모 항체보다 10-100-배 더 약했다. 21A3의 V82L 변이체는 21A3 모 항체와 유사한 효력을 나타내었다 (표 12). 종합하면, 이들 결과는 7A10-T93A 및 21A3-V82L에서의 변형이 전반적인 항체 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
표 12: MSA 12-18 용해물에 의한 IC50 데이터의 요약
Figure 112019092916809-pct00015
a 7A10 또는 21A3 모 항체에 상대적이고 대응표본 t-검정에 기초한 통계. ns: p>0.05; * p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. t-검정 결과는 달리 나타내지 않는 한 ns이다.
결론적으로, 7A10, 21A3, 36A3, 15A5, 11H11-1, 및 44B11은 PFF 및 3종의 상이한 MSA 용해물로부터의 응집체-유도 활성의 강력하고 완전한 고갈을 나타내었다. 이들 결과는, 이전의 실시예로부터의 결과와 함께, 항체가 병리상태의 확산에 기여할 수 있는 이들 질환 뇌 추출물에서 발견되는 αSyn의 형태에 우선적으로 결합하고, 이에 따라 생체내 αSyn 병리상태의 전파를 차단하는데 효과적일 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 11: 생체내 항-αSyn 항체에 의한 αSyn 병리상태의 차단
본 실시예는 마우스 모델에서 αSyn 병리상태의 확산 및 전파를 억제하는 항-αSyn 항체의 능력을 기재한다.
방법
a. 마우스
연구에 사용된 마우스는 마우스 Snca 녹아웃 배경에 인간 A53T 돌연변이를 보유하는 2-3-개월령, 수컷 및 암컷 [PAC-Tg(SNCAA53T)+/+;Snca-/-] (PAC-A53T) 마우스였고 (Kuo et al., Human Molecular Genetics 2010:19:1633-50), 이를 생체내 효능 연구에 사용하였다. 마우스를 음식물 및 물을 자유롭게 이용가능한 온도 제어 수용 룸에 4마리의 군으로 수용하였다.
b. 항체 처리 및 정위 수술
수컷 및 암컷 PAC-A53T 마우스의 하위세트로부터 안와후 채혈을 통해 대략 40 μl 혈액을 수집하여 항체 및 항-약물-항체 (ADA) 수준에 대한 기준선을 설정하였다. 마우스의 전체 코호트를 2개의 군: 대조군 및 처리군으로 나누었다. 대조군의 마우스에 복강내 (i.p) 염수 주사를 행한 후, 선조체 내로 PBS 주사하고, 실험 완료시까지 4회 추가의 매주 염수 주사를 수행하였다 (n= 8). 제2 군의 마우스를 9개의 하위 치료군으로 나누었다: 염수 (n=11), 항체 1 (n=12), 7A10 (n=12), 11AH11 (n=12), 15A5 (n=11), 21A3 (n=11), 36A3 (n=11), 44B11 (n=12), 및 항체 3 (n=5). 제2 군 내의 모든 마우스에게 먼저 염수 또는 선택된 항체의 i.p. 투여 후 재조합 A53T-PFF를 접종하였다. 대조군과 유사하게, 처리군에게 염수 또는 선택된 항체의 4회의 추가의 매주 i.p. 주사를 제공하였다. 모든 처리군에서 항체 용량은 10 mg/kg이었다. 항체 용량의 선택은 연구 I의 결과에 기초하였고, 여기서 항체 3 항체는 PAC-A53T 마우스에서 pSer129 병리상태를 효과적으로 감소시켰다. 모든 처리군에서 약동학 (PK) 및 가능한 ADA 수준을 평가하기 위해 마우스 하위세트에서 안와후 채혈에 의해 매주 항체 처리를 선행하였다. 마우스를 A53T-PFF 접종 30일 후 및 마지막 항체 처리로부터 24시간 후에 희생시켰다.
정위 주사: 일측 선조체 주사를 위해, 마우스를 이소플루란 (1-4%) 흡입을 통해 마취시키고, 절차 전반에 걸쳐 이소플루란-유도된 마취를 유지하기 위해 노즈 콘을 부착시켜 정위 프레임으로 위치시켰다. 수술 부위를 베타딘에 이어서 70% 이소프로필 알콜로 준비하고, 1-2 cm 피부 절개를 만들어 두개골 및 참조 표지점 위치를 노출시켰다. 멸균 면봉을 사용하여 두개골을 부드럽게 세정하였다. 멸균 카바이드 마이크로-버 비트를 사용하여 두개골 표면을 통해 0.5-1 mm 깊이의 구멍을 뚫었다. 마우스에게 10 ug A53T-PFF 또는 PBS (대조군)를 외측 선조체로 일측 주사하였다 (AP 0.2, ML -2.0, DV-3.6). 물질을 해밀턴 시린지를 통해 분당 0.25 μl의 속도 (마우스당 총 2.5 μl)로 주사하였고, 바늘을 표적에 ≥10분 동안 그대로 두었다. 마우스가 수술로부터 완전히 회복되면 마우스를 그의 수용 룸으로 옮겼다.
c. 면역조직화학 (IHC)
A53T-PFF 주사 30일 후에 병리상태의 평가를 위해 마우스를 희생시켰다. 조직학적 연구를 위해, 뇌를 4% 파라포름알데히드 (PFA) 중에서 48시간 동안, 이어서 15% 수크로스 중에서 24시간 동안, 이어서 30% 수크로스 용액 중에서 48시간 동안 (또는 사용시까지) 고정시켰다. 슬라이딩 마이크로톰 (레이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems), 일리노이주 버팔로 그로브) 상에서 관상, 40 μm 연속 뇌 절편을 제조하고, IHC 분석 시까지 동결보호제 중에 두었다. IHC 절차는 하기 단계를 포함하였다: 뇌 절편을 염색 디쉬로 이동시키고, 포스페이트 완충 염수 (PBS, 써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)에서 3회 (5분/헹굼) 헹구었다. 이어서, 절편을 (PBS 중) 3.7% 포름알데히드 중에서 10분 동안 후고정시켰다. 이어서, 이들을 PBS (10분/헹굼)에서 2회 헹구었다. 다음으로, 절편을 30분 동안 PBS 중 신선한 3% H2O2, 10% 메탄올 중에서 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 제거하였다. 절편을 PBS 중에서 3회 헹구고 (10분/헹굼), 이어서 실온에서 PBS 중의 10% 정상 혈청 (2차 항체의 종으로부터의 혈청 사용) 플러스 0.3% 트리톤 X-100 중에서 1시간 차단 단계를 수행하였다. 이어서, 슬라이스를 PBS (10분/헹굼)에서 3회 헹구었다. 뇌 슬라이스를, 부드럽지만 균일하게 절편을 교반하는 속도의 마이크로-타이터 플레이트 진탕기 상에서 4℃에서 1차 항체 [항-알파-syn pSer129 (압캠, 영국 캠브리지; ab51253), 1:100,000 희석] 중에서 밤새 인큐베이션하였다. IHC의 제2일에, 뇌 절편을 PBS (10분/헹굼)에서 x4회 헹군 후, 비오티닐화된 2차 항체 (PBS 중 1:500 염소 항-토끼, 벡터 BA-1000)에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 절편을 PBS에서 헹구고 (4회, 10분/헹굼), 후속해서 PBS 중에서 제조된 ABC 복합체에서 60분 동안 실온에서 인큐베이션하였다 (엘리트 ABC 키트(Elite ABC kit), 벡터 래보러토리즈(Vector laboratories), 캘리포니아주 벌링게임). PBS에서 헹군 후 (4회, 10분/헹굼), 절편을 퍼옥시다제 기질 (벡터 Cat. # SK-4100, 벡터 래보러토리즈, 캘리포니아주 벌링게임)에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 뇌 절편을 PBS에서 헹구고 (4회, 10분/헹굼), 슈퍼프로스트 플러스 마이크로 슬라이드 (VWR, 펜실베니아주 라드너) 상에 마운팅하였다. 슬라이드를 공기-건조시킨 후, 헤마톡실린 및 스코트의 청색 용액에서 대조염색하고, 이어서 일련의 에탄올 헹굼하였다. 슬라이드를 최종적으로 페르마운트(Permount) 및 마이크로 커버 유리 (VWR, 미국 펜실베니아주 라드더)를 사용하여 커버 슬립하고, 스캐닝 및 IHC 정량화 분석을 위해 건조되게 하였다.
IHC 정량화: 유리 슬라이드 상에 마운팅된 뇌 절편을 아페리오(Aperio) AT2 슬라이드 스캐너를 사용하여 영상화하였다. 각각의 연구 내의 모든 슬라이드를 동일한 조명력 및 카메라 노출을 사용하여 영상화하였다. 각각의 동물로부터 대략 2개의 슬라이드를 분석하였고, 각각은 ~20개의 마운팅된 관상 뇌 절편을 갖는다. 영상 획득 후에, 관심 영역 (ROI), a) 대상회 영역과 함께 1차 피질 (이간 5.48 mm-2.96 mm, 전정 1.69 mm-0.83 mm, 6-10 절편) 및 b) 편도체 영역 (이간 2.72 mm-1.76 mm, 전정 1.07 mm-2.03 mm, 4-6 절편)을 함유하는 뇌 절편을, 할로(HALO) 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 각각의 동물에 대해 확인하였다. ROI는 동측 측면 (주사 측면) 및 둘 다의 영역에 대해 상응하는 대측 측면 상의 pS129 염색에 의해 점유된 전체 면적에 대해 개략화되었다. 이어서, 각 동물에 대한 모든 ROI 개략화된 절편으로부터의 평균 염색을 알고리즘 (인디카 랩스(Indica Labs)) - 면적 정량화를 사용하여 정량화하였다. 모든 영상을 동일한 역치 설정을 사용하여 동시에 분석하여 양성 염색된 영역을 확인하였다. 조직 면적 (μm2), 총 염색 면적 (μm2), 염색이 약한 면적 & 강한 면적 (μm2), % 염색 양성 조직, % 염색이 약한 및 % 염색이 강한 양성 조직을 분석하였다. 일원 ANOVA에 이은 던넷 사후 검정을 사용하여 처리 효과를 결정하였다.
d. 혈장 및 뇌에서의 항체 수준의 측정
ELISA 플레이트 (코스타 3925(Costar 3925))를 PBS (깁코 cat#14190) 중에 희석된 1 μg/ml PFF (α-시뉴클레인 WT로부터 제조됨, 프로테오스(PROTEOS)) 100 μl로 실온 (RT)에서 2시간 동안 코팅하였다. PFF를 코팅 전 매초 일시정지하면서 15초 초음파처리하였다. 플레이트를 둘베코 PBS (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), #14040-117) 중의 0.05% 트윈으로 4회 세척하고, DPBS 중의 3% BSA (소 혈청 알부민, 프로테아제 무함유, 분획 V, 로슈 다이아그노스틱(Roch Diagnostic) #03117332001) 150 μl로 2~3시간 동안 RT에서 또는 4℃에서 밤새 차단하였다. 표준물, 혈장 및 뇌 샘플을 로슈 프로테아제 억제제 (로슈 11836145001, 1 펠릿/25 ml)를 함유하는 1% BSA/0.05% 트윈/DPBS 중에 희석하였다. 샘플 (3~4 희석) 100 μL/웰을 이중으로 로딩하고, RT에서 ~2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% 트윈/DPBS로 4회 세척한 후, 1% BSA/0.2% 트윈/DPBS 중에 1:1000으로 희석된 100 μl의 2차 항체 (알칼리성 포스파타제-아피니퓨어 당나귀 항-인간 IgG, 잭슨이뮤노(JacksonImmuno) #709-055-149, 50% 글리세롤 함유)를 첨가하고, 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 4회 세척 후, 플레이트를 100 μL의 알칼리성 포스파타제 기질 (트로픽스 CDP 스타 레디-투-유즈 위드 사파이어 II, T-2214, 라이프 테크놀로지스)로 30분 동안 발색시켰다. 발광 계수를 퍼킨 엘머 엔비전 (2102 멀티라벨 리더)으로 측정하였다. 플레이트를 검정 동안 일정한 진탕 (적정 플레이트 진탕기, 속도 3) 하에 유지시켰다.
e. 항-약물 항체 (ADA)의 측정
항체 1, 7A10, 11AH11, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11 및 항체 3으로 처리된 마우스에서 항체 1, 항-7A10 항체, 항-11AH11 항체, 항-15A5 항체, 항-21A3 항체, 항-36A3 항체, 항-44B11 항체, 및 항체 3의 가능한 발생을 검출하기 위해 비-정량적 면역원성 검정을 개발하였다. 이러한 효소-연결된 면역흡착 검정에서, 항체 1, 7A10, 11AH11, 15A5, 21A3, 36A3, 44B11 및 항체 3을 맥시소르프 편평-바닥 96-웰 플레이트 상에 4℃에서 밤새 코팅하였다. 1:100으로 희석된 혈청 샘플을 실온에서 밤새 인큐베이션하여 잠재적 항-약물 항체 (ADA)를 포획하였다. 포획된 항체를 염소 항-마우스 이뮤노글로불린 G (IgG) 및 이뮤노글로불린 M (IgM) 양고추냉이 퍼옥시다제 효소 (HRP) 접합된 항체로 검출하였다. 염소 항-인간 이뮤노글로불린 G (IgG) 및 이뮤노글로불린 M (IgM) 양고추냉이 퍼옥시다제 효소 (HRP) 접합된 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다. 테트라메틸벤지딘 (TMB)은 혈청 샘플에 존재하는 항체 1, 항-7A10 항체, 항-11AH11 항체, 항-15A5 항체, 항-21A 항체 3, 항-36A3 항체, 항-44B11 항체, 및 항체 3의 양에 비례하여 광학 밀도 (OD450)를 생성하는 HRP에 대한 비색 기질로서 첨가하였다.
f. 뇌 조직에서의 αSyn 수준의 측정
간략하게, ELISA 플레이트 (코스타 3925)를 BupH 카르보네이트-비카르보네이트 완충제, pH 9.4 (써모 피셔 사이언티픽 # 28382) 중에 희석된 100 μl의 각각의 포획 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 포획 항체 MJFR1 (압캠 ab138501)을 0.1 μg/ml (총 α-시뉴클레인 검정) 또는 0.35 μg/ml (pS129 검정)의 농도로 사용하고, MJFR14-6-4-2 (압캠 ab209538)는 0.1 μg/ml, 및 1E8 (BMS 5446.1E8.10)은 0.3 μg/ml의 농도로 사용하였다. 플레이트를 둘베코 PBS (써모 피셔 사이언티픽, #14040-117)로 4회 세척하고, DPBS 중의 3% BSA (소 혈청 알부민, 프로테아제 무함유, 분획 V, 써모 피셔 사이언티픽)로 2~3시간 동안 실온 (RT)에서 또는 4℃에서 밤새 차단하였다. 표준물, 뇌 샘플 및 QC 샘플을 로슈 프로테아제 억제제 (써모 피셔 사이언티픽, 1 펠릿/25ml) 및 포스파타제 억제제 2&3 (시그마 알드리치, P5726 & P0044, 1:100)을 함유하는 1% BSA/0.05% 트윈/DPBS로 희석하였다. 표준물은 α-시뉴클레인 WT (알펩티드 S-1001), pS129 (aa89-140, AATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHH-CONH2; 서열식별번호: 129) 또는 PFF (α-시뉴클레인 WT로부터 제조됨, 프로테오스)였다. 샘플 50 μL/웰을 이중으로 로딩하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 RT로 평형화한 후, 1% BSA/0.1% 트윈/DPBS 중에 1:4000으로 희석된 50 μl 검출 항체를 첨가하고, 샘플과 RT에서 ~2시간 동안 공동-인큐베이션하였다. 검출 항체 (바이오레전드 SIG39730로부터의 4B12, 압캠 ab168381로부터의 MBJR13, 2E2, 및 23H8)를 알칼리성 포스파타제 (노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals)로부터의 AP 키트 #702-0010)와 사전-접합시켰다. 이어서 플레이트를 0.05% 트윈/PBS로 4회 세척하고, 100 μL의 알칼리성 포스파타제 기질 (트로픽스 CDP 스타 레디-투-유즈 위드 사파이어 II, T-2214, 써모 피셔 사이언티픽)로 30분 동안 발색시켰다. 발광 계수를 퍼킨 엘머 엔비전 (2102 멀티라벨 리더)으로 측정하였다. 플레이트를 검정 동안 일정한 진탕 (적정 플레이트 진탕기, 속도 3) 하에 유지시켰다.
결과
PFF-접종된 마우스에게 PBS (n=11) 또는 항체 1 (n=12), 7A10 (n=12), 11AH11 (n=12), 15A5 (n=11), 21A3 (n=11), 36A3 (n=11), 44B11 (n=12), 및 항체 3(n=5)을 4주 동안 IP 주사에 의해 매주 투여하였다. PBS-접종된 마우스에게 음성 대조군으로서 PBS (n= 8)를 IP 주사에 의해 투여하였다. 모든 항체는 10 mg/kg으로 투여하였다. 약동학 (PK) 및 가능한 ADA 수준을 평가하기 위해, 마우스 하위세트에서 안와후 채혈에 의해 매주 항체 처리를 선행하였다. 마우스를 접종 30일 후 및 마지막 항체 처리 24시간 후에 수거하였다. 항체 수준을 마우스의 하위세트로부터의 뇌 조직에서 측정하였다. pS129 αSyn 병리상태를 선택된 뇌 영역에서 면역조직화학에 의해 측정하였다.
혈장 항체 노출을 도 18에 요약한다. 혈장 노출은 항체 사이에서 ~100-배 달랐고, 1 μg/ml 내지 100 μg/ml 범위였다. 일부 항체 (특히 21A3 및 항체 1)의 낮은 노출은 아마도 ADA로 인한 것일 수 있었다. 항체 3 대조군 항체의 혈장 농도는 제1 처리 연구에서 관찰된 수준과 유사하였다. 뇌 조직 추출물에서의 항체 수준을 도 19에 제시한다. 뇌 노출은 항체 사이에서 ~10-배 달랐고, ~ 25 ng/ml 내지 250 ng/ml 범위였다. 유사한 항체 수준이 뇌 반구에서 주사 부위에 대해 동측 및 대측에서 관찰되었다. ADA를 혈장 샘플에서 측정하였다 (표 13 및 14). ADA는 일부 동물에서 항체 3 (n=3), 항체 1 (n=6), 7A10 (n=1), 21A3 (n=7), 15A5 (n=1), 36A3 (n=1), 및 44B11 (n=1)에 대해 관찰되었다. ADA는 항체 11H11-1에 의해서는 관찰되지 않았다. 보다 낮은 혈장 항체 수준은 항체 1- 및 21A3-처리된 경우 ADA와 연관되었다 (도 20). 대조적으로, 혈장 항체 수준은 항체 3, 7A10, 15A5 및 44B11의 경우 ADA의 존재에 의해 유해한 영향을 받지 않았다.
표 13: 혈장 샘플에서의 항-약물 항체 활성a
Figure 112019092916809-pct00016
a 유의한 ADA 활성을 갖는 샘플만을 제시한다. 11H11-1의 경우에 ADA가 관찰되지 않았다.
b ID#은 샘플 수집 주수 (wk1, wk2, wk3 또는 wk4) 및 동물 ID#를 나타낸다.
c 450 nm에서 비색 기질의 광학 밀도 측정.
d 비히클 대조군 샘플의 2X 평균 OD에 기초한 컷오프. 컷오프 한계를 초과하는 OD 값을 유의한 것으로 간주하였다. 각각의 검정 플레이트에 대해 계산된 컷오프를 제시한다.
표 14: 항체 1 및 항체 3 대조군 항체에 대한 항-약물 항체 활성a
Figure 112019092916809-pct00017
a 유의한 ADA 활성을 갖는 샘플만을 제시한다.
b ID#은 샘플 수집 주수 (wk1, wk2, wk3 또는 wk4) 및 동물 ID#를 나타낸다.
c 450 nm에서 비색 기질의 광학 밀도 측정.
d 비히클 대조군 샘플의 2X 평균 OD에 기초한 컷오프. 컷오프 한계를 초과하는 OD 값을 유의한 것으로 간주하였다. 각각의 검정 플레이트에 대해 계산된 컷오프를 제시한다.
병리상태의 전파 및 확산에 대한 수동 면역화의 효과를 평가하기 위해, aSyn pS129를 운동 피질 및 편도체에서 면역조직화학에 의해 측정하였다. 대표적인 영상을 도 21에 제시하고, 그래프 요약을 도 22에 제시한다. A53T-PFF가 주사된 PAC 마우스는 PBS 대조군과 비교하여 운동 피질 (일원 ANOVA, p<0.05) 및 편도체 (일원 ANOVA, p<0.001) 둘 다에서 pS129 병리상태의 유의한 증가를 나타내었다 (도 22). 대조군 항체 항체 3에 의한 수동 면역화는 동측 편도체 (일원 ANOVA, p<0.001)에서 병리상태의 유의한 감소를 발생시켰고 동측 운동 피질에 감소된 병리상태 경향을 발생시켰다. 항체 3에 더하여, 편도체에서 병리상태를 유의하게 감소시키는 다른 항체는 7A10 (p<0.01), 11H11-1 (p<0.001), 15A5 (p<0.01), 21A3 (p<0.05), 36A3 (p<0.01), 및 44B11 (p<0.05)이었다. 오직 항체 1만이 편도체에서 병리상태의 유의한 감소를 나타내지 않았다. 운동 피질에서, 오직 44B11만이 병리상태의 유의한 감소를 나타낸 한편 (p<0.05), 다른 항체는 감소 경향을 나타내었다. 운동 피질에서의 유의한 효과의 결여는 아마도 관찰된 가변 PFF-매개 유도로 인한 것일 수 있다.
다음으로, 뇌 추출물 중 αSyn의 가용성 수준에 대한 수동 면역화의 효과를 결정하였다. 뇌 추출물을 ELISA에 의해 aSyn 올리고머, pS129 αSyn, 및 총 αSyn 수준에 대해 측정하였고, 이를 도 23 및 24에 제시한다. αSyn 올리고머의 유의한 증가가 PBS (Veh) 대조군과 비교하여 A53T-PFF를 접종한 동물에서 관찰되었고; 유사한 결과가 2회의 독립적인 αSyn 올리고머 ELISA (1E8+2E2 및 MJFR14642+23H8, 둘 다 실시예 12에 기재됨)에 의해 수득되었다 (도 23). A53T-PFF 군과 비교하여 감소된 올리고머 수준의 경향이 항체 처리된 동물 모두에 대해 관찰되었다. 올리고머 결과와 대조적으로, pS129 αSyn 및 총 αSyn 수준은 A53T-PFF 접종 또는 수동 면역화에 의해 영향을 받지 않았다 (도 24). IHC에 의해 관찰된 pS129 신호에서의 변화는 추출물에 존재하는 상대적으로 높은 수준의 배경 pS129로 인해 pS129 ELISA에 의해 검출되지 않을 수 있다.
실시예 11에 기재된 방법을 사용한 90일 지속기간의 제2 연구에서, 7A10-Vh-T93A-IgG1.3f를 3, 10, 및 30 mg/kg의 용량으로 매주 복강내 주사를 통해 투여하였다. 명확성을 위해, 실시예 11에서 시험된 항체는 7A10 hIgG1.3f였다. 7A10-Vh-T93A-IgG1.3f를 사용한 제2 연구에서, 항-약물 항체의 존재는 처리된 동물의 44%에서 검출되었다. 이러한 연구의 결과는 고도로 가변적이었고, 병리상태에 대한 어떠한 유의한 효과도 관찰되지 않았다.
요약하면, 항-αSyn 항체 7A10, 11H11-1, 15A5, 21A3, 36A3 및 44B11은 생체내 αSyn 병리상태의 전파를 차단하는데 효과적이다.
실시예 12: 올리고머-특이적 ELISA를 사용한 뇌 추출물 및 CSF에서의 αSyn 올리고머 수준의 평가
본 실시예는 인간 뇌 용해물 및 CSF에서 αSyn 올리고머 수준을 측정하기 위한 올리고머-특이적 ELISA의 개발을 기재한다.
방법
a. 에피토프 맵핑
에피토프 맵핑 연구를 위한 αSyn 펩티드를 이노셉(InnoPep) (캘리포니아주 샌디에고)에서 구입하였다. N-말단 바이오틴 기 및 PEG4 링커 및 C-말단을 사용하여 인간 αSyn 서열의 중첩 펩티드의 2개 세트를 생성하였다. 펩티드를 PBS 중에서 1mg/ml로 가용화시켰다. 맵핑 연구를 위해, PBS 중 0.25μg/ml α-시뉴클레인 펩티드 100μL를 뉴트라비딘 코팅된 고용량 96 웰 플레이트 (써모 피셔 사이언티픽)에 첨가하고, 실온 (RT)에서 2시간 동안 (또는 4℃에서 밤새 (O/N)) 인큐베이션하였다. 플레이트를 ~300μL의 세척 완충제 (PBS 중 0.05%트윈)로 3-회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 RT에서 ~2시간 동안 (또는 4℃에서 O/N) PBS 중 3% BSA 150μl 로 차단하였다. 샘플 완충제 (0.1% BSA/0.05% 트윈/PBS, 50ml 완충제 중 로슈 프로테아제 억제제의 2개의 펠릿) 중에 희석된 시험 샘플 100μL를 플레이트 상에서 RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 3회 세척하였다. PBSTB (1% BSA/0.2% 트윈/dPBS) 중에 1:1000으로 희석된 2차 항체 100μL를 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척당 5~10분 동안 3회 세척하였다. 100μL의 AP 기질 (트로픽스 CDP 스타 레디-투-유즈 위드 사파이어 II, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems); Cat #T-2214)을 첨가하고, RT에서 30분 동안 발색시켰다. 발광 계수를 퍼킨 엘머 엔비전 (2102 멀티라벨 리더)으로 판독하였다. 플레이트를 검정 동안 일정한 진탕 (적정 플레이트 진탕기, 속도 3) 하에 유지시켰다. 사용된 2차 항체는 알칼리성 포스파타제-아피니퓨어 당나귀 항-인간 IgG (잭슨이뮤노 #709-055-149), 알칼리성 포스파타제-아피니퓨어 당나귀 항-토끼 IgG (잭슨이뮤노 #711-055-152), 알칼리성 포스파타제-아피니퓨어 당나귀 항-마우스 IgG (잭슨이뮤노 #715-055-151)를 포함하였다. 모든 2차 항체를 50% 글리세롤 최종 농도로 희석하였다.
b. PFF의 제조 및 피브릴화의 분석
PFF를 제조하고, 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 분석하였다.
c. αSyn 결합 검정
항체를 인간 αSyn 단량체, 인간 βSyn 단량체, 인간 γSyn 단량체, 인간 αSyn으로부터 생성된 PFF, 인간 A53T αSyn으로부터 생성된 PFF, 및 인간, 래트 및 마우스 서열을 함유하는 αSyn 펩티드 a.a. 111-140에의 결합에 대해 시험하였다. 인간, 래트 및 마우스 서열을 함유하는 αSyn 펩티드 a.a. 111-140은 인노펩(InnoPep)(캘리포니아주 샌디에고)에서 구입하였다. 인간 αSyn 단량체, 인간 βSyn 단량체, 및 인간 γSyn 단량체는 알펩티드 (조지아주 보가트)에서 구입하였다.
결합 검정을 위해, 96 웰 플레이트 (코스타 #3925, 높은 결합 마이크로플레이트)를 RT에서 2시간 동안 (또는 4℃에서 O/N) PBS 중 1μg/ml αSyn WT PFF 100μL로 코팅하였다. 플레이트를 ~300μL의 세척 완충제 (dPBS 중 0.05%트윈)로 3-회 세척하였다. 플레이트를 150μl의 3% BSA/PBS로 RT에서 2시간 동안 (또는 4℃에서 O/N) 차단하였다. PFF (2μg/ml로부터 출발함) 및 α-syn WT 단량체 (20μg/ml로부터 출발함)의 3-배 연속 희석물을 샘플 완충제 (0.1% BSA/0.05% 트윈/PBS, 50ml 완충제 중 로슈 컴플리트 프로테아제 억제제의 2개의 펠릿) 중에서 제조하였다. 항체 인큐베이션의 경우, 동등 부피의 2-배 검정 농도의 αSyn PFF 또는 단량체를 BD 팔콘 낮은 결합 플레이트에서 2-배 검정 농도의 항체와 혼합하고, RT에서 ~2시간 동안 인큐베이션하였다. 항체 및 PFF 또는 단량체의 혼합물 100μL를 PFF 코팅된 플레이트에 첨가하고, RT에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3-회 세척하였다. PBSTB (1% BSA/0.2% 트윈/dPBS) 중에 1:1000으로 희석된 당나귀 항-인간 IgG (잭슨이뮤노 #709-055-149, 50% 글리세롤 함유) 100μL를 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척당 5~10분 동안 3-회 세척하였다. 100μL의 AP 기질 (트로픽스 CDP 스타 레디-투-유즈 위드 사파이어 II, 어플라이드 바이오시스템즈)을 첨가하고, 플레이트를 RT에서 30분 동안 발색시켰다. 발광 계수를 퍼킨 엘머 엔비전 (2102 멀티라벨 리더)을 사용하여 측정하였다. PFF를 항체에 의한 코팅 또는 항체와의 혼합 전 1초 펄스로 15-회 초음파처리하였다. 플레이트를 검정 동안 일정한 진탕 (적정 플레이트 진탕기, 속도 3) 하에 유지시켰다.
d. ELISA
ELISA 플레이트 (코스타)를 BupH 카르보네이트-비카르보네이트 완충제, pH 9.4 (써모 피셔 사이언티픽) 중에 희석된 100μl의 각각의 포획 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 포획 항체 MJFR1 (압캠)을 0.1μg/ml (총 α-시뉴클레인 검정) 또는 0.35μg/ml (pS129 검정)의 농도로 사용하고, MJFR14642 (압캠)는 0.1μg/ml 및 1E8은 0.3μg/ml의 농도로 사용하였다. 플레이트를 둘베코 PBS (써모 피셔 사이언티픽)로 4-회 세척하고, PBS 중의 3% BSA (소 혈청 알부민, 프로테아제 무함유, 분획 V)로 2~3시간 동안 RT에서 또는 4℃에서 밤새 차단하였다. 표준물, 뇌 샘플 및 QC 샘플을 로슈 컴플리트 프로테아제 억제제 (1 펠릿/25ml) 및 포스파타제 억제제 2&3 (시그마 알드리치, 1:100)을 함유하는 1% BSA/0.05% 트윈/PBS로 희석하였다. 표준물은 α-시뉴클레인 WT (알펩티드), pS129 (aa89-140,AATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHH-CONH2; 서열식별번호: 129) 또는 PFF였다. PFF 및 단량체의 초음파처리는 콘테스 마이크로 초음파 세포 교란기 (출력 40, 튠 50)를 사용하여 수행하였다. 샘플을 1초/펄스로 15-회 초음파처리하였다. 샘플 50μL/웰을 이중으로 로딩하고, 4℃에서 O/N 인큐베이션하였다. 플레이트를 RT로 평형화한 후, 1% BSA/0.1% 트윈/DPBS 중에 1:4000으로 희석된 50μl 검출 항체를 첨가하고, 샘플과 RT에서 ~2시간 동안 공동-인큐베이션하였다. 검출 항체 (코반스(Covance)로부터의 4B12, 압캠으로부터의 MBJR13, 2E2, 및 23H8)를 알칼리성 포스파타제 (노부스 바이올로지칼스로부터의 AP 키트)와 사전-접합시켰다. 이어서 플레이트를 0.05% 트윈/PBS로 4-회 세척하고, 100μL의 알칼리성 포스파타제 기질 (트로픽스 CDP 스타 레디-투-유즈 위드 사파이어 II, T-2214, 써모 피셔 사이언티픽)로 30분 동안 발색시켰다. 발광 계수를 퍼킨 엘머 엔비전 (2102 멀티라벨 리더)으로 측정하였다. 플레이트를 검정 동안 일정한 진탕 (적정 플레이트 진탕기, 속도 3) 하에 유지시켰다. 데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 분석하였다.
e. 인간 뇌 용해물의 제조
뇌 샘플을 여과된 PBS (깁코, #70011, 1 ml PBS/100 mg 조직 습윤 중량) 중에서 콘테스 마이크로 초음파 세포 교란기 (출력 40, 튠 50)를 사용하여 2 x 10초/펄스로 초음파처리하였다. 샘플을 2 ml 에펜도르프 튜브에 넣고, 튜브를 초음파처리 동안 습식 얼음 상에 유지시켰다. 뇌 용해물을 3,000 g, 4℃에서 5분 동안 회전시켰다. 상청액 분취물을 액체 질소 중에서 동결시키고, -80℃에서 저장하였다. αSyn ELISA (총 & pS129) 및 BCA를 포함한 QC 검정을 수행하였다.
펠릿을 고속-회전 단리하기 위해, 1XPBS 중 100mg/ml로 이전에 제조된 뇌 균질물을 빙냉 1X PBS 중에서 33.3mg/ml로 3-배 희석한 후, 4℃에서 30분 동안 100,000Xg에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 폐기하였다. 펠릿을 출발 샘플과 동일한 부피로 빙냉 1X PBS 중에 재현탁시켰다.
f. 뇌 추출물의 면역침전
하기 샘플을 동등 비율로 조합하여 풀링된 인간 뇌 추출물을 제조하였다: PD (PD1, PD3 및 PD5), MSA (12-18, 01-03 및 14-49), 및 DLB (13-37, 05-31 및 08-26). 풀링된 샘플을 PBSTB 완충제 (1%BSA + 0.05% 트윈 + PBS)로 100-배 희석하였다. 면역침전을 위해, 뇌 추출물을 항체와 함께 4℃에서 2시간 동안 엔드 오버 엔드 회전에 의해 인큐베이션하였다. 이어서 단백질 A/G 아가로스 비드 (써모 피셔 사이언티픽)를 첨가하고, 샘플을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 단백질 A/G 비드를 제조하기 위해, 1.2ml 비드 슬러리를 1000 x g에서 2분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 저장 완충제를 제거하고, 비드를 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS 0.6ml로 1-회 세척하고, 상기와 같이 원심분리하고, 비드를 0.6ml PBS로 3-회 세척하였다. 최종 회전 후, 비드를 PBS 중 1% BSA 0.6ml의 첨가에 의해 차단하고, 4℃에서 2시간 동안 엔드 오버 엔드 인큐베이션에 의해 인큐베이션하였다. 차단 후, 비드를 원심분리에 의해 단리하고, 0.6ml PBS 중에 1.2ml의 최종 부피로 재현탁시켰다. 비드 슬러리를 1:10 (vol:vol) 희석으로 각각의 뇌 추출물에 첨가하였다. 밤샘 면역침전 후, 샘플을 원심분리하여 비드를 제거하고, 고갈된 뇌 샘플을 단리하고, ELISA에 의해 평가하였다. 하기 항체를 면역침전에 사용하였다: 26D6 (인간 A베타에 특이적인 마우스 IgG 대조군 항체 (a.a. 1-12), MJFR-14642 (압캠), LB509 (코반스), 클론 42 (BD), 7A10, 및 1E8.
g. 1차 세포 배양 단리
1차 래트 해마 뉴런을 실시예 10에 기재된 바와 같이 제조하였다.
h. 면역형광 검정
면역형광을 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행하였다.
i. 고함량 면역형광 검정
고함량 면역형광 검정을 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행하였다.
j. SDS-PAGE/이뮤노블롯 분석
MSA 및 PD 뇌 조직으로부터의 뇌 균질물을 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. 각각의 뇌 균질물의 200 μl를, PBS (써모 피셔 사이언티픽)의 첨가에 의해 400 μl의 총 부피가 되게 하였다. 희석된 샘플을 100,000 x g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하여 고분자량 응집체를 단리하였다. 펠릿을 200 μl PBS 중에 재현탁시켰다. 4X NuPAGE 로딩 염료 (써모 피셔 사이언티픽) 50 μl 및 NuPAGE 10X 환원제 (써모 피셔 사이언티픽) 20 μl를 펠릿 균질물 130 μl에 첨가하였다. 샘플을 95℃에서의 5분 인큐베이션에 의해 변성시킨 다음, 샘플 10 μl를 4-12% NuPAGE 비스-트리스 겔 상에서 1X MES 구동 완충제 (써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 분획화하였다. 겔을 200 V에서 50분 동안 전개시킨 후, 0.4 μm 니트로셀룰로스 (써모 피셔 사이언티픽)로 30 V에서 1시간 동안 옮겼다. 이어서, 블롯을 TBST (0.1% 트윈-20 함유 TBS (프로메가(Promega))) 중 5% 우유 중에서 차단하였다. 이어서, 블롯을 TBST 중 1% BSA (바이오라드(BioRad)) 중에 1:5000으로 희석된 하기 항체와 함께 진탕하면서 4℃에서 밤새 프로빙하였다: 4B12 (바이오레전드), 4D6 (바이오레전드), Syn-303 (바이오레전드), 81A (바이오레전드), EP1536Y (압캠), LB509 (바이오레전드), 마우스 IgG (써모 피셔 사이언티픽), 항-액틴 (시그마). 모든 항체를 바이오라드 EZ-연결 접합 키트를 사용하여 HRP에 접합시켰다. 밤샘 인큐베이션 후, 블롯을 TBST로 세척하였다. HRP-표지된 항체를 슈퍼시그널 웨스트 펨토 맥시멈 (써모 피셔 사이언티픽) 검출 시약을 사용하여 검출하였고, GE AI600 CCD 카메라를 사용하여 영상을 포획하였다.
k. SEC-HPLC 분석
100 μl의 MSA 뇌 균질물 11-46 및 대조군 뇌 균질물 11-49를 PBS 400 μl에 첨가하고, 샘플을 100,000 x g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액 (sup)을 보관하고, 나머지 펠릿을 120 μl PBS 중에 재현탁시켰다. 크기 배제 크로마토그래피를 위해, sup 또는 펠릿 100 μl를 애질런트(Agilent) 1100 HPLC 상의 바이오세크(BioSec)-5 300Å SEC 칼럼 (7.8mm 직경 x 300mm, 애질런트)에 주입하였다. 1 ml 분획을 20 ml 실행 시간에 걸쳐 수집하였다. 사용된 이동상은 PBS였다. 칼럼을 1 ml/분 및 37℃ 칼럼 온도에서 실행시켰다. SEC 분획을 농축시키기 위해, 샘플을 워터스 오아시스(Waters Oasis) SPE HLB 카트리지를 사용하여 고체 상 추출 (SPE)에 적용하였다. 1 ml의 각각의 SEC 분획을 1000 μl 4% 인산으로 희석하였다. SPE 칼럼을 1 ml 메탄올로 조건화한 다음, 1 ml H2O로 평형화시켰다. 이어서, 산성화된 샘플을 첨가하였다. 로딩된 칼럼을 1 ml 5% 메탄올로 세척하고, 샘플을 1 ml 100% 메탄올로 용리시켰다. 용리액을 밤새 신속 진공 하에 건조시켰다. SPE 정제된 SEC-HPLC 분획을 SDS-PAGE/이뮤노블롯 분석 시까지 -20℃에서 건조 저장하였다.
결과
a. 항체의 특징화
본 연구에 사용된 항체의 요약을 표 15에 제공한다.
표 15: 항체 요약
Figure 112019092916809-pct00018
a 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방식으로 맵핑된 에피토프; 도 1 참조.
b 판매업체에 의해 제공된 에피토프
c J Duda, et al., Ann Neurol 2002; H Tran, et al., Cell Reports, 2014
d M Baba, et al., Am J Path 1998; R Jakes, et al., Neurosci Letts 1999
e Waxman and B Giasson, J Neuropath Exp Neurol 2008
상기 기재된 항체를 αSyn 단량체 및 αSyn PFF에 대한 결합 효력에 대해 평가하였다. αSyn 단량체 또는 PFF의 농도를 증가시키면서 용액 중에서 항체를 인큐베이션하였다. 비결합 항체를 PFF로 코팅된 플레이트 상에 포획하고, 항체 수준을 1-측 ELISA에 의해 측정하였다. 도 25에 제시된 바와 같이, 항체 1E8, 2E2, 23H8, 및 MJFR14642는 단량체와 비교하여 PFF에 대해 더 강력한 결합을 나타내었고, 단량체-PFF 결합 효력 비는 각각 902, 236, 3258 및 7234였다 (표 16). 대조적으로, 항체 MJFR1, 4B12, 및 Syn303은 PFF와 비교하여 단량체에의 결합이 더 강력하였고 (도 26), 단량체-PFF 결합 효력 비는 각각 0.27, 0.24 및 0.47이었다 (표 16). 항체 4D6 및 LB509는 보통정도로 PFF-선택적이었고, 단량체-PFF 결합 효력 비는 각각 26 및 34였다. 종합하면, 이들 결과는 항체 1E8, 2E2, 23H8, 및 MJFR14642가 고도로 PFF/올리고머-선택적이라는 것을 나타낸다.
표 16: 항체 결합 요약
Figure 112019092916809-pct00019
b. 올리고머-특이적 ELISA의 개발
상기 기재된 단량체 및 PFF 결합 데이터에 기초하여, 다양한 항체 쌍 조합을 개발하여, aSyn 단량체 및 aSyn PFF/올리고머의 검출을 위한 샌드위치 ELISA에서 평가하였고; 확인된 최적 ELISA 쌍 및 이들 검정의 특이성의 요약을 표 17에 제시한다.
표 17: ELISA 요약
Figure 112019092916809-pct00020
a 검출 항체는 알칼리성 포스파타제 (AP)와 접합되었다.
b LLQ (최저 정량화 수준)는 검정 배경의 2-배에 의해 규정된다. 단량체 LLQ는 초음파처리된 단량체에 대한 결과에 기초하였고; 유사한 결과가 비-초음파처리된 단량체에 의해 관찰되었다. PFF LLQ는 초음파처리된 PFF에 대한 결과에 기초하였다. pS129 ELISA (MJFR1+MJFR13)의 경우 LLQ는 2 pg/ml였다 (pS129 펩티드).
ELISA 쌍 1E8.10+2E2.2 및 MJFR14642+23H8.G3은 PFF/올리고머의 민감하고 특이적인 검출을 나타내었지만 αSyn 단량체는 그렇지 않았다 (표 17; 도 27). PFF의 초음파처리는 둘 다의 검정에서 전반적인 신호를 증진시켰고, 이는 검정이 응집체 크기에 민감하고, 초음파처리가 추가의 항체 결합 부위를 노출시킬 수 있다는 것을 시사한다. 대조적으로, 초음파처리는 항체가 단량체를 검출하는 능력에는 어떠한 영향도 미치지 않았다. 둘 다의 검정은 초음파처리된 PFF를 검출하는데 대략 30 pg/ml (단량체 당량)의 유사한 감도를 나타내었다. 시험된 최고 농도인 최대 10 ng/ml의 단량체 농도에 의해서는 단지 배경 신호만이 관찰되었다. 종합하면, 이들 결과는 1E8+2E2 및 MJFR14642+23H8을 사용한 ELISA가 PFF/올리고머-특이적이라는 것을 확립한다.
또한, αSyn의 N-말단 도메인 (Syn303), 중간 도메인 (4B12), C-말단 (4D6), 및 pS129 (MJFR13)에 특이적인 항체를 포함한 상이한 검출 항체와 커플링된 동일한 포획 항체 (MJFR1)를 혼입하여 추가의 ELISA 쌍 조합을 개발하였다. ELISA 쌍 MJFR1+Syn303, MJFR1+4B12 및 MJFR1+4D6은 αSyn 단량체 및 αSyn PFF 둘 다의 민감한 검출을 나타내었다 (표 17; 도 28). 모든 3종의 검정은 초음파처리된 PFF를 올리고머 ELISA와 유사한 감도로 검출하였다 (표 17). 올리고머 검정과 달리, MJFR1+Syn303 및 MJFR1+4B12에 의한 PFF의 검출은 초음파처리에 의해 영향을 받지 않았고, 이는 이들 에피토프의 노출이 응집체 크기에 덜 민감하다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 초음파처리는 MJFR1+4D6에 의한 PFF의 검출을 증진시켰고, 이는 4D6이 올리고머-선택성 항체와 유사하게 C-말단 에피토프에 결합한다는 사실과 잠재적으로 관련된다. 올리고머-특이적 검정과 대조적으로, MJFR1+Syn303, MJFR1+4B12 및 MJFR1+4D6은 각각 23, 8, 및 27 pg/ml의 LLQ로 αSyn 단량체의 민감한 검출을 나타내었다. 단량체의 검출은 초음파처리에 의해 영향을 받지 않았다. MJFR1+MJFR13 ELISA는 pS129 αSyn 펩티드의 민감하고 특이적인 검출을 입증하였고, 오직 그의 pS129 특이성만을 확인시켜주었다.
특이성을 추가로 평가하기 위해, MJFR1+Syn303, MJFR1+4B12, 및 MJFR1+4D6을 또한 αSyn 패밀리 구성원, β-시뉴클레인 및 γ-시뉴클레인의 검출에 대해 시험하였다. 도 29에 제시된 바와 같이, 모든 3종의 검정은 β-시뉴클레인 또는 γ-시뉴클레인과 거의 교차-반응성을 나타내지 않았고, 이는 그의 αSyn 특이성을 확인시켜준다. 종합하면, 이들 결과는 MJFR1+Syn303, MJFR1+4B12 및 MJFR1+4D6이 αSyn에 특이적이고, 단량체 및 올리고머 둘 다를 검출할 수 있으므로, "총" αSyn 검정으로서 그의 유용성을 지지한다는 것을 나타낸다.
c. 뇌 추출물에서의 αSyn 수준의 측정
ELISA를 사용하여 대조군 및 질환 조직 (AD, PSP, MSA, PD, DLB)으로부터 생성된 뇌 추출물에서 올리고머, pS129, 및 총 αSyn 수준을 측정하였다. 뇌 추출물 ELISA 신호 특이성을 희석-선형성 및 면역고갈 연구에 의해 확인하였다. 도 30에 제시된 바와 같이, 다른 신경변성 질환 (AD, PSP) 및 대조군으로부터의 추출물과 비교하여 PD 뇌 추출물에서 강건한 수준의 αSyn 올리고머 (1E8+2E2 및 MJFR14642+23H8)가 검출되었다. PD 추출물에서의 평균 올리고머 수준은 1E8+2E2 ELISA에서 36 ng/mg 총 단백질이었고, MJFR14642+23H8.G2 ELISA에서 40 ng/mg 총 단백질이었다 (표 18). 대부분의 AD, PSP 및 대조군 추출물의 경우에 올리고머 수준은 <LLQ였다. 올리고머 결과와 대조적으로, MJFR1+4B12 검정을 사용하여 측정 시 모든 추출물에 걸쳐 유사한 수준의 총 aSyn이 관찰되었다 (도 30; 표 18). pS129 αSyn은 모든 추출물에서 검출되었지만, 그 수준은 PD에서 상승되었고, 대조군과 비교하여 유의하게 더 높았다 (도 30; 표 18).
표 18: 대조군, PD, AD 및 PSP 뇌 추출물에서의 αSyn 수준의 요약
Figure 112019092916809-pct00021
a 데이터는 총 단백질에 대해 정규화되었고, 단량체 당량 (pg/mg 총 단백질) 또는 pS129 펩티드 당량 (pg/mg 총 단백질)으로서 표현되었다. 총 단백질 수준은 mg/ml로서 표현되었다.
αSyn 올리고머가 또한 다른 시뉴클레인병증 환자로부터의 뇌 조직에 존재하는지 결정하기 위해, 추출물을 또한 MSA 및 DLB로부터 생성하고, 올리고머 ELISA를 사용하여 분석하였다. 도 31에 제시된 바와 같이, 유사하고 강건한 수준의 올리고머가 모든 3종의 시뉴클레인병증 뇌 추출물 (MSA, DLB 및 PD)에서 검출된 한편, 대조군 추출물에서의 수준은 ≤LLQ였고; 유사한 결과가 둘 다의 올리고머 검정에서 관찰되었다. 대조적으로, MJFR1+4B12를 사용하여 측정 시 총 αSyn의 수준은 대조군을 포함하여 모든 추출물에 걸쳐 유사하였다 (도 31). pS129 수준은 또한 시뉴클레인병증 추출물에서 유사한 정도로 상승되었고, 대조군과 비교하여 유의하게 더 높거나 (MSA, DLB) 또는 보다 높은 경향이었다 (PD) (도 31). N-말단 영역 (MJFR1+Syn303) 및 C-말단 영역 (MJFR1+4D6)에 민감한 ELISA를 사용하여 총 αSyn 수준을 또한 측정하였다. 도 32에 제시된 바와 같이, 총 αSyn 수준에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. ELISA 결과를 표 19에 요약한다.
표 19: 대조군, MSA, DLB, 및 PD 추출물에서의 aSyn 수준의 요약
Figure 112019092916809-pct00022
a 데이터는 총 단백질에 대해 정규화되었고, 단량체 당량 (pg/mg 총 단백질) 또는 pS129 펩티드 당량 (pg/mg 총 단백질)으로서 표현되었다. 총 단백질 수준은 mg/ml로서 표현되었다.
1E8+2E2 및 MJFR14642+23H8 ELISA에서 측정된 올리고머 수준은 상이한 시뉴클레인병증 뇌 추출물 (MSA, DLB, PD)에 걸쳐 고도로 상관되었다 (도 33, 표 20). 절대 올리고머 수준은 2종의 올리고머 검정에서 대등하였다. pS129 (MJFR1+MJFR13)의 수준은 또한 올리고머 수준과 고도로 상관되었다. 대조적으로, MJFR1+4B12 검정에서 측정된 바와 같은 총 αSyn 수준은 올리고머 수준 또는 pS129 수준과 유의하게 상관되지 않았다 (도 33, 표 20). 그러나, MJFR1+4B12 검정에서 총 αSyn 수준은 MJFR1+4D6 검정에서의 수준과 유의하게 상관되었고, MJFR1+Syn303 검정에서 측정된 수준과 상관 경향을 나타내었다 (도 34, 표 21). 이들 결과는 상이한 검정에서의 신호 특이성의 추가의 확인을 제공한다. 올리고머-특이적 ELISA 및 pS129 ELISA 사이의 상관관계는 올리고머 종이 인산화될 가능성이 있다는 것을 시사한다.
표 20: 올리고머 수준의 상관관계a
Figure 112019092916809-pct00023
a MSA, DLB 및 PD 뇌 추출물의 분석으로부터의 데이터. 유의한 상관관계 (p<0.001)에 대해 피어슨 r 값이 제시된다. NS는 p>0.05를 나타낸다.
표 21: 총 aSyn 수준의 상관관계a
Figure 112019092916809-pct00024
a 대조군, MSA, DLB 및 PD 뇌 추출물의 분석으로부터의 데이터. 유의한 상관관계 (p<0.001)에 대해 피어슨 r 값이 제시된다. NS는 p>0.05를 나타낸다.
d. 뇌 추출물의 올리고머의 생화학적 특징화
고속 원심분리를 사용하여 αSyn PFF를 정제할 수 있고, 이는 뇌 추출물로부터 타우 단백질의 고분자량 응집체를 단리하는데 사용되어 왔다. 시뉴클레인병증 뇌 추출물에 존재하는 αSyn 응집체의 단리 및 특징화를 보조하는데 유사한 전략을 사용하였다. 대조군, MSA, DLB 및 PD 뇌 추출물을 고속 원심분리에 적용하고, 가용성 (supe) 및 불용성 (펠릿) 물질을 단리하고 올리고머 ELISA에 의해 분석하였다. 도 35에 제시된 바와 같이, 대조군 뇌 조직으로부터 생성된 추출물을 포함한 뇌 추출물 펠릿에서 올리고머가 검출되었다. 이들 ELISA 신호의 특이성을 희석 선형성에 의해 확인하였다. 유사한 결과가 둘 다의 올리고머 ELISA에 의해 관찰되었다. 출발 추출물에서의 수준에 비해 펠릿에서 올리고머의 전체 회수율은 20-80% 범위였다 (도 35). 대조적으로, 올리고머는 뇌 추출물 중 임의의 것으로부터의 상청액에서는 검출되지 않았다. 이들 발견은 올리고머가 고분자량 응집체로서 존재한다는 것을 시사하고, 또한 올리고머가 대조군 뇌 추출물에 존재하지만 질환 추출물과 비교하여 더 낮은 수준으로 존재한다는 것을 나타낸다.
뇌 추출물 내의 고분자량 응집체를 추가로 특징화하기 위해, 대조군 및 MSA 뇌 추출물로부터 단리된 펠릿 및 상청액 분획을 크기 배제 크로마토그래피에 적용하고, 분획을 SDS-PAGE/이뮤노블롯에 의해 분석하였다. 도 36에 제시된 바와 같이, 대조군 및 MSA 추출물 둘 다로부터의 상청액 SEC 분획 내의 대부분의 aSyn은 ~60 kDa의 분자 반경에 상응하는 분획 10에서 용리되었고, 이는 이러한 종이 사량체라는 것을 시사한다. 이러한 사량체는 SDS-PAGE/이뮤노블롯에 의한 분석 시 단량체 및 보다 저분자량 절단 단편으로 분해되었다. 대조적으로, 펠릿 분획 내의 단리된 대부분의 aSyn은 >670 kDa의 분자 반경에 상응하는 SEC에 의한 공극 부피 (분획 6)에서 용리되었다. 대조군 및 MSA 샘플 둘 다에 대해 유사한 결과가 관찰되었고, 이는 대조군 추출물에서의 응집체의 존재를 확인시켜준다. 이들 고분자량 응집체는 또한 SDS-PAGE/이뮤노블롯에 의해 단량체 및 절단 단편으로 분해되었다. 또한, 펠릿 단리물로부터의 aSyn이 분획 6에서 또한 검출되었고, 이는 고분자량 응집체가 사량체 종과 신속하게 평형을 이루었음을 시사한다. 종합하면, 이들 결과는 MSA 및 대조군 추출물 둘 다에서 고분자량 응집체의 존재를 확인시켜주고, 이는 응집체가 크기가 >670 kDa이고 응집체가 변성 조건 (SDS 및 비등) 하에 파괴된다는 것을 나타낸다.
고분자량 응집체에서 잠재적인 차이를 추가로 조사하기 위해, 대조군, MSA, DLB 및 PD로부터 단리된 추출물 펠릿을 상이한 aSyn 항체를 사용한 SDS-PAGE/이뮤노블롯에 의해 분석하였다. 결과는 <20 kDA (도 37), 30-40 kDa (도 38), 및 60-100 kDa (도 39)의 분자량 범위로 제시된다. aSyn 신호 특이성을 IgG 항체 대조군을 사용하여 확인하였다. 도 37에 제시된 바와 같이, 모든 뇌 추출물 펠릿 (4B12, 4D6)에 걸쳐 단량체 (~14 kDa)로서 이동하는 대등한 수준의 aSyn이 검출되었다. 그러나, 절단 생성물의 수준 및 정도는 PD 및 대조군과 비교하여 MSA 및 DLB 펠릿에서 더 높은 것으로 보였다 (4B12). aSyn의 C-말단 도메인을 인식하는 4D6 항체를 사용한 결과는 절단 단편에서 이러한 C-말단 영역이 결여되어 있음을 나타낸다. pS129 신호 (EP1536Y)는 DLB에서 가장 높았고 >MSA>PD>>대조군이었다. 액틴은 펠릿 단리물에 존재하였고, 수준은 샘플에 걸쳐 대등하였다. IgG 대조군 항체와의 비특이적 반응성은 관찰되지 않았고, 이는 이러한 분자량 영역 내의 aSyn 특이성을 확인시켜 준다.
30-40 kDa의 현저한 종이 모든 추출물 펠릿에서 대등한 수준으로 검출되었고, 이는 아마도 aSyn의 이량체에 상응한다 (도 38). 항체 Syn 303 및 4D6에 의한 결과는 이러한 종이 각각 무손상 N- 및 C-말단 도메인을 함유한다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, 현저한 이량체는 항체 4B12를 사용하면 용이하게 검출되지 않았지만, DLB 펠릿에서 낮은 수준의 반응성이 존재하였다. 이들 결과는 4B12 에피토프가 이량체 종에서 차폐된다는 것을 나타내고, 4B12 반응성은 이량체 입체형태의 민감한 지시자일 수 있다는 것을 시사한다. 항체 81A에 의한 결과는 이량체 종이 S129에서 인산화되고, 최고 수준이 DLB 펠릿에서 관찰된다는 것을 나타낸다.
다중 종이 60-100 kDa 분자량 범위에서 검출되었다 (도 39). ~60 kDa (Syn303, 4B12, 4D6) 및 ~80-100 kDa (4B12, LB509, 4D6)의 잠재적인 aSyn 응집체가 검출되었다. 전체적으로, 상이한 aSyn 항체에 의해 관찰된 면역반응성의 패턴은 모든 뇌 추출물 펠릿에 걸쳐 유사하였다.
e. 세포에서의 불용성, pS129 aSyn 응집체의 유도
시뉴클레인병증 환자 뇌 조직으로부터 단리된 αSyn PFF 및 추출물은 배양물 중의 1차 뉴런에 첨가한 경우 αSyn의 불용성의 고도로 인산화된 응집체의 형성을 유도하였다. 또한, 유도는 뇌 추출물에 존재하는 αSyn의 고분자량 종에 의존적이었다. 이들 발견은 αSyn 병리상태가 프리온-유사 방식으로 전파될 수 있다는 아이디어를 지지하고, 전파가능한 종이 αSyn의 응집체임을 시사한다. 인간 A53T aSyn을 과다발현하는 1차 뉴런에서의 불용성 pS1290 αSyn의 유도에 대해, 대조군, MSA, DLB 및 PD 추출물로부터의 펠릿 분획에서 단리된 고분자량 응집체를 평가하였다. 11일 동안 MSA 뇌 추출물 펠릿으로 처리한 후 불용성 pS129의 강건한 유도가 관찰되었고; 대조적으로, PD 및 DLB 추출물 펠릿에 의해서는 10-배 더 낮은 유도 수준이 관찰되었고, 대조군 추출물 펠릿에 의해서는 단지 배경 신호만이 관찰되었다 (도 40). 유도는 펠릿 단리물에 존재하는 올리고머의 수준과 관련되지 않았다. 이들 결과는 MSA 추출물 펠릿에 의해 관찰되는 강건한 유도가 PD, DLB 및 대조군과 비교하여 MSA 고분자량 종의 입체형태 및/또는 변형에서의 차이와 관련될 수 있고, 이들 차이는 수용자 세포 내에서의 흡수 및/또는 주형화된 응집을 개시하는 능력에 영향을 미칠 가능성이 있다는 것을 시사한다.
f. 인간 CSF에서의 aSyn 수준의 측정
aSyn 올리고머 ELISA 1E8+2E2 및 MJFR14642+23H8을 사용하여 MSA 시뉴클레인병증 환자 및 대조군으로부터의 CSF를 평가하였고; 총 αSyn ELISA MJFR1+4B12를 또한 비교를 위해 포함시켰다. 희석 선형성 및 첨가 회수 분석을 사용하여 인간 CSF에 대한 검정을 검증하고 최적 희석을 확인하였다. 도 41에 제시된 바와 같이, MSA, 진행성 핵상 마비 (PSP) 및 대조군을 포함한 코호트 1의 모든 CSF 샘플의 경우 올리고머 수준은 <LLQ였다. 유사한 결과가 1E8+2E2 및 MJFR14642+23H8 ELISA 둘 다에서 관찰되었다. 대조적으로, MJFR1+4B12 검정에서 ~1000 pg/ml의 총 aSyn 수준이 관찰되었고, 수준은 MSA, PSP 및 대조군 사이에서 유사하였다. MSA 및 대조군 CSF 샘플의 제2 코호트를 분석하였다 (도 42). 코호트 1에 대해 관찰된 바와 같이, 대부분의 샘플에서의 올리고머 수준은 <LLQ였지만; 1E8+2E2 ELISA에서 7개의 CSF 샘플 (6개 MSA 및 1개 대조군)에 대해 정량화가능한 올리고머 수준이 검출되었다. MJFR1+4B12에 의해 측정된 총 aSyn 수준은 MSA 및 대조군 CSF 샘플 사이에 유사하였고, 이는 ~1000 pg/ml로, 코호트 1로부터의 결과와 일치하였다.
표 22. 서열의 요약
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Figure 112019092916809-pct00026
Figure 112019092916809-pct00027
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등가물:
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험을 사용하여 본원에 개시된 구체적 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나 또는 그를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY <120> ANTIBODIES TO ALPHA-SYNUCLEIN AND USES THEREOF <130> MXI-554PC <140> PCT/US2018/000032 <141> 2018-02-16 <150> US 62/460,416 <151> 2017-02-17 <160> 182 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human alpha-synuclein <400> 1 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 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Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal sequence <400> 127 Leu Ser Pro Gly 1 <210> 128 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Peptide linker <400> 128 Pro Val Gly Val Val 1 5 <210> 129 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: pS219 peptide <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(40) <223> PHOSPHORYLATION <400> 129 Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu 1 5 10 15 Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp 20 25 30 Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu 35 40 45 Pro Glu Ala His His His His His His 50 55 <210> 130 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: alpha-Syn 105-115 <400> 130 Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp 1 5 10 <210> 131 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: alpha-Syn 106-116 <400> 131 Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met 1 5 10 <210> 132 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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agaaccagtt ctccctgaag 300 ctgagctctg tgaccgctgc ggacacggcc gtgtattact gtgcgagaga gagggggtac 360 cttgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct cagctagcac caagggccca 420 tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 480 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 660 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 720 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgaagggg ccccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tccccgggtt ga 1392 <210> 160 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 7A10-LC DNA (for both 7A10 and 7A10-T93A); same LC sequence shared with 21A3 and 15A5 <400> 160 atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccgggc gcgccttggc cgaaattgtg 60 ttgacgcagt ctccaggcac cctgtctttg tctccagggg aaagagccac cctctcctgc 120 agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcctggt accagcagaa acctggccag 180 gctcccaggc tcctcatcta tggtgcatcc agcagggcca ctggcatccc agacaggttc 240 agtggcagtg ggtctgggac agacttcact ctcaccatca gcagactgga gcctgaagat 300 tttgcagtgt attactgtca gcagtatggt agctcaccgc tcactttcgg cggagggacc 360 aaggtggaga tcaaacgtac ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 420 gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 480 gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 540 gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 600 aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660 tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttag 699 <210> 161 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 7A10 VH DNA <400> 161 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtcgtt actactggag ctggatccgg 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gagaaccaag 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tacgagagag 300 agggggtacc ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 162 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 7A10 VL DNA (for both 7A10 and 7A10-T93A); same VL sequence shared with 21A3 and 15A5 <400> 162 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct cactttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaa 324 <210> 163 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 7A10-T93A VH DNA <400> 163 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtcgtt actactggag ctggattcgg 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gagaaccaag 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 agggggtacc ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 164 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 21A3 VH DNA <400> 164 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc aatcgtaatt actactggag ctggatccgg 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gaggaccaag 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagg tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 agggggcggt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 165 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 21A3 VL DNA <400> 165 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct cactttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaa 324 <210> 166 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 1E8 VL DNA <400> 166 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctct cactttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaa 324 <210> 167 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 2E2 VH DNA <400> 167 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaaggggt 300 tcggggagtt attataactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 168 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 2E2 VL DNA <400> 168 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa a 321 <210> 169 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 23H8 VH DNA <400> 169 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtagtagtac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acggctgtgt attactgtgc taactgggga 300 tcctactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctca 339 <210> 170 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 23H8 VL1 DNA <400> 170 gaaattgtgt tgacgcagtc 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60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 173 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 11H11VH DNA <400> 173 gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt tcgccaggct 120 ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcagct attggtactg gtggtggcac atactatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaactgg 300 gaatttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 174 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 11H11VL1 DNA <400> 174 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccatt cactttcggc 300 cctgggacca aagtggatat caaa 324 <210> 175 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 11H11VL2 DNA <400> 175 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaaggtccc gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatcttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctttcgg cggagggacc 300 aaggtggaga tcaaa 315 <210> 176 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 15A5VH DNA <400> 176 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtagtt actactggtg ctggatccgg 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggatc gggtatatct attacagtgg gcgcaccaag 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 agggggcggt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 177 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 15A5VL DNA <400> 177 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct cactttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaa 324 <210> 178 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 36A3VH DNA <400> 178 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtagtt actactggag ctggatccgg 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gagaaccaag 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccag gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 aggggctggc tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 179 <211> 317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 36A3VL DNA <400> 179 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggtcaccttc ggccaaggga 300 cacgactgga gattaaa 317 <210> 180 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 44B11VH DNA <400> 180 gaggtgcagt tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt agcaaataca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atgtatagcg gtggtagaag atactatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggggatcgg 300 ggtgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct ca 342 <210> 181 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 44B11VL DNA <400> 181 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatcac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa a 321 <210> 182 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 1E8 VH DNA <400> 182 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtagtt actactggag ctggatccgg 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatct attacagtgg gagaaccaag 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgaggtctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgtgagagag 300 aggggctggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351

Claims (35)

  1. 하기 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역:
    i. 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    ii. 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
    iii. 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR3; 및
    하기 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역:
    i. 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    ii. 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및
    iii. 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR3
    을 포함하며; 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  2. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 123-128 중 적어도 1개 이상에 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  3. 제1항에 있어서, 각각 서열식별번호: 18 및 19에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  4. 제1항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  5. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 119에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  6. 제1항에 있어서, 각각 서열식별번호: 20 및 21에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  7. 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 단리된 항체이며, 여기서 각각의 중쇄는 서열식별번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 경쇄는 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 항체는 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합하는 것인, 단리된 항체.
  8. 제1항에 있어서, 키메라, 인간화 또는 인간 항체인, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  9. 제1항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는, 단리된 이중특이적 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  10. 제1항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자.
  11. 제10항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항의 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포.
  13. 모이어티에 연결된, 제1항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 면역접합체.
  14. 제1항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 뉴런 및/또는 신경교 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에서 상기 질환을 치료하거나 또는 질환의 중증도를 경감시키기 위한 조성물.
  15. 제11항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 항-α-시뉴클레인 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 발현되는 것인 단계; 및
    세포로부터 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 단리하는 단계
    를 포함하는, 항-α-시뉴클레인 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제조하는 방법.
  16. 제1항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 유효량을 포함하는, 세포에서 불용성 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체의 생성을 억제하기 위한 조성물이며, 여기서 세포는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 접촉하는 것인, 조성물.
  17. 제1항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 유효량을 포함하는, 뉴런 및/또는 신경교 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에서 상기 질환을 치료하거나 또는 질환의 중증도를 경감시키기 위한 제약 조성물이며, 여기서 대상체는 인간이고, 제약 조성물은 대상체에게 투여되는 것인, 제약 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 질환이 파킨슨병, 파킨슨병 치매, 루이 소체 치매, 루이 소체 질환, 다계통 위축, 또는 순수 자율신경부전인 제약 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제가 대상체에게 투여되는 것인 제약 조성물.
  20. 인간으로부터의 샘플과 제1항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분을, 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 α-시뉴클레인 사이에 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에 접촉시키는 단계, 및 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 인간으로부터의 샘플에서 α-시뉴클레인을 검출하는 방법.
  21. 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  22. 서열식별번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, 인간 α-시뉴클레인 (서열식별번호: 1)에 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  23. 제21항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 유효량을 포함하는, 세포에서 불용성 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체의 생성을 억제하기 위한 조성물이며, 여기서 세포는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 접촉하는 것인, 조성물.
  24. 제21항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 유효량을 포함하는, 뉴런 및/또는 신경교 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에서 상기 질환을 치료하거나 또는 질환의 중증도를 경감시키기 위한 제약 조성물이며, 여기서 대상체는 인간이고, 제약 조성물은 대상체에게 투여되는 것인, 제약 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 질환이 파킨슨병, 파킨슨병 치매, 루이 소체 치매, 루이 소체 질환, 다계통 위축, 또는 순수 자율신경부전인 제약 조성물.
  26. 제22항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 유효량을 포함하는, 세포에서 불용성 세린-129 인산화된 α-시뉴클레인 응집체의 생성을 억제하기 위한 조성물이며, 여기서 세포는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 접촉하는 것인, 조성물.
  27. 제22항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 유효량을 포함하는, 뉴런 및/또는 신경교 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에서 상기 질환을 치료하거나 또는 질환의 중증도를 경감시키기 위한 제약 조성물이며, 여기서 대상체는 인간이고, 제약 조성물은 대상체에게 투여되는 것인, 제약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 질환이 파킨슨병, 파킨슨병 치매, 루이 소체 치매, 루이 소체 질환, 다계통 위축, 또는 순수 자율신경부전인 제약 조성물.
  29. 제21항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 유효량을 포함하는, 세포에서 불용성 또는 가용성 α-시뉴클레인 응집체의 생성을 억제하기 위한 조성물이며, 여기서 세포는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 접촉하는 것인, 조성물.
  30. 제22항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 유효량을 포함하는, 세포에서 불용성 또는 가용성 α-시뉴클레인 응집체의 생성을 억제하기 위한 조성물이며, 여기서 세포는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 접촉하는 것인, 조성물.
  31. 제21항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 유효량을 포함하는, 시뉴클레인병증을 갖는 인간 대상체에서 시뉴클레인병증을 치료하거나 또는 시뉴클레인병증의 중증도를 경감시키기 위한 제약 조성물로서, 대상체에게 투여되는 것인 제약 조성물.
  32. 제22항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 유효량을 포함하는, 시뉴클레인병증을 갖는 인간 대상체에서 시뉴클레인병증을 치료하거나 또는 시뉴클레인병증의 중증도를 경감시키기 위한 제약 조성물로서, 대상체에게 투여되는 것인 제약 조성물.
  33. 제1항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는, 뉴런 및/또는 신경교 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에서 상기 질환을 치료하거나 또는 질환의 중증도를 경감시키기 위한 키트.
  34. 제21항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는, 뉴런 및/또는 신경교 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에서 상기 질환을 치료하거나 또는 질환의 중증도를 경감시키기 위한 키트.
  35. 제22항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는, 뉴런 및/또는 신경교 내 루이 소체 또는 α-시뉴클레인의 병리학적 응집체의 존재를 특징으로 하는 질환을 갖는 대상체에서 상기 질환을 치료하거나 또는 질환의 중증도를 경감시키기 위한 키트.
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