CN109490542A - γ突触核蛋白的胶体金检测装置及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

一种γ突触核蛋白的胶体金检测装置，所述装置包括条状基材，在所述条状基材上依次设置样本垫、胶体金结合物垫、反应膜和滤纸；其中，所述胶体金结合物垫上包被胶体金标记的鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2，所述反应膜上的检测区(T)喷点鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG1、质控区(C)喷点羊抗鼠免疫球蛋白IgG；并且所述胶体金检测装置包含酪蛋白钠作为稳定剂。本发明提供了所述装置的制备方法和用途。本发明提供的装置在检测过程无需任何其他实验设备，检测成本低，对膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌和乳腺癌的诊断具有重要的临床价值。

Description

γ突触核蛋白的胶体金检测装置及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体地，本发明涉及用于检测γ突触核蛋白(SNCG)的胶体金检测装置，本发明还涉及所述装置的制备方法和及其在制备疾病检测装置中的用途。
背景技术
近年来，恶性肿瘤已成为全球范围内严重危害人类健康及生命的重大疾病之一。人们谈癌色变，并普遍认为癌症为不治之症，这主要源于其治愈率、死亡率高并具有广泛的分布性。数据显示，2015年，我国新发癌症病例429.2万例，死亡281.4万例。我国癌症发病率接近世界水平，但死亡率高于世界水平。
癌症死亡率居高不下，一个重要原因在于我国癌症发现较多处于中晚期。美国近些年来癌症的发病率有所下降，其5年生存率大约在60％至70％，而我国肿瘤患者5年生存率大约在30％左右。
现有数据表明，2015年全国新发病例最多的是肺癌，其次是胃癌、食管癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌和膀胱癌等(Wanqing Chen等，Cancer Statistics in China，2015.CACANCER J CLIN 2016；66:115–132.)。癌症高发增加的不仅仅是患者的伤痛，还给家庭、社会带来沉重的经济负担。相关资料估计，每年全国因肿瘤造成的门诊和住院花费数百亿元，远高于其他慢性病的医疗费用，是卫生总费用上涨的重要因素之一。
癌症的高致死率主要由于癌细胞具有转移和侵袭能力，约90％的癌症病人死于癌细胞的转移，然而早期的治疗干预则会提高治疗效果。在肿瘤确诊之前若病灶已经发生多处微小转移，即便有些癌症仍可能治愈，但希望大大降低。因此，早期诊断和治疗对于提高癌症病人的生存率具有至关重要的意义。发展中国家癌症患者的死亡率高于发达国家的一个很重要原因即是诊断不及时，未在早期及时发现癌症。
当前一些较为常见的检测手段，如X线、超声、PET-CT、核磁共振成像等影像学方法在癌症诊断方面的作用是值得肯定的，但由于准确度等问题，它们在临床应用上仍存在着局限性，有时甚至会与病理诊断结果存在出入，对于一般家庭而言，多次使用核磁共振检测所需花费太大，这就导致了在癌症检测时间上的延误；一些有一定放射性的检测方法，如X线、CT、PET或其组合，也不适于频繁检测；而通过穿刺获取病人组织样本进行组织化学分析这一方法，耗时长、操作复杂且对病人损害较大。相比而言，肿瘤早期检测期望实现对正常人群及疑似患病人群初步诊断并允许频繁检测的目标，从这些角度来看，以上方法不适合用于广泛人群的癌症早期检测。
发展成本低、易操作、便携式、低损伤、高准确性和快速的癌症早期检测方法为当前所急需的。随着科技日新月异，飞速发展，基因类分子诊断的研究也正蓬勃发展，但由于检测指标的成熟度及项目准入审批等原因，目前临床应用仍较少。
肿瘤蛋白标记物是肿瘤细胞产生和释放的某种物质，常以抗原、酶、蛋白或肽类激素等代谢产物的形式存在于病人肿瘤细胞组织内或宿主体液、排除物中，根据其生化或免疫特性可以识别或诊断肿瘤。肿瘤蛋白标记物在临床上主要用于对原发肿瘤的发现、肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断肿瘤治疗效果的观察和评价以及肿瘤复发和预后的预测等。近年来，新的肿瘤标记物不断发现、检查手段不断完善和改进，使得其灵敏性和准确性不断提高，为肿瘤患者的早期诊断和早期治疗提供更确切充足的依据。在免疫试剂产品的实际检测应用中，抗原抗体反应是关键。
γ突触核蛋白(γ-synuclein，γ-SYN)是通过比较cDNA文库的方法筛选出的一个在浸润性乳腺癌文库中高表达而在正常乳腺组织中无表达的基因，序列比对发现其与已知的生长因子和癌基因没有同源性，但与一类神经相关蛋白SYN有着很好的同源性，从而作为SYN家族第3个成员而被命名为γ-SYN。γ-SYN作为SYN家族的一员，与该家族的另两个成员α-SYN、β-SYN的基因定位于不同染色体区域，分别位于4q21.3-q22(α-SYN)、5q35(β-SYN)和10q23(γ-SYN)。γ-SYN与α-SYN、β-SYN有着55.9％和54.3％的氨基酸序列同源性，SYN家族蛋白是14000大小的细胞浆蛋白，在生理状态下主要特异性地表达在神经系统。γ-SYN被证实在肿瘤尤其是雌激素相关肿瘤中发挥着与肿瘤增生、浸润和转移相关的重要作用。
γ-SYN作为一种与乳腺癌发生、转移相关的癌基因，其过表达并不是由于γ-SYN基因扩增引起的。通过序列分析也并未发现γ-SYN点突变的存在，预示γ-SYN的过表达是在mRNA转录调控水平上发生了改变，通过对γ-SYN启动子调控区进行分析，发现在γ-SYN的第1个外显子区存在一个CpG岛，而高表达的乳腺癌细胞系和组织中该CpG岛均有去甲基化现象，不同肿瘤中存在不同的去甲基化谱，这与γ-SYN表达的组织特异性有关。
RNA印迹分析(Northern blot)发现γ-SYN在大脑黑质、丘脑中呈高度表达，而在正常的乳腺、肝、前列腺、肺和小肠等组织中均无表达，但在乳腺癌组织中，通过反转录聚合酶链反应和原位杂交的方法均检测到了γ-SYN的异常表达，随后在蛋白水平上利用印迹分析(Western blot)和组织化学的方法均检测到了γ-SYN的表达，并发现其表达与乳腺癌分期相关。Liu等(Liu H等，Loss of epigenetic control of synuclein-gamma gene as amolecular indicator of metastasis in a wide range of human cancers.CancerRes.2005 Sep 1；65(17):7635-7643)利用免疫组化的方法，发现γ-SYN(即SNCG，以下简称SNCG)在肝癌、胃癌、食管癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和子宫内膜癌等肿瘤中均存在较高的表达，而与之对应的正常组织几乎没有表达，同时在I期肿瘤中SNCG的表达低于II、III期肿瘤，表明SNCG的表达与多种肿瘤的分期均有相关性。
目前，在临床检测领域尚无SNCG的检测方法，在专利和科研文献领域，有使用ELISA技术平台检测SNCG的报道，但ELISA检测过程要繁琐和耗时，且无法实现床边检测(POCT)。
因此，当前对更方便、快捷、经济、高效的SNCG检测方法存在需求。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种SNCG胶体金检测装置，本发明还提供了该装置的制备方法及其在制备检测疾病的装置中的用途。本发明使用胶体金方法制备的SNCG胶体金检测装置，除了可以在医院完成常规检测外，还可以带至家中自行完成检测，相比ELISA具有方便、快捷、经济、高效的特点，更加适用于疾病，例如肿瘤的普筛。
一方面，本发明提供了一种γ突触核蛋白的胶体金检测装置，所述装置包括条状基材，在所述条状基材上依次设置样本垫、胶体金结合物垫、反应膜和滤纸；其中，所述胶体金结合物垫上包被胶体金标记的鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2，所述反应膜上的检测区(T)喷点鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG1、质控区(C)喷点羊抗鼠免疫球蛋白IgG；并且所述胶体金检测装置包括酪蛋白钠作为稳定剂。
其中，所述αSNCG1由保藏号为CGMCC NO.2468的杂交瘤细胞株αSNCG1分泌；
所述αSNCG2由保藏号为CGMCC NO.2469的杂交瘤细胞株αSNCG2分泌。
所述杂交瘤细胞株αSNCG1和杂交瘤细胞株αSNCG2描述于申请号为200810105770.7；发明名称为“SNCG单克隆抗体及其应用”的中国专利申请，通过引用将其整体并入本文。
另一方面，本发明还提供了上述装置的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)胶体金颗粒的制备：利用氯金酸与柠檬酸三钠在沸水中发生氧化还原反应制备胶体金颗粒；
2)胶体金结合物的制备：采用物理吸附法，在pH7.5～8.5下，使胶体金颗粒与待标记的鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2结合，并加入酪蛋白钠溶液作为稳定剂，从而形成胶体金标记的鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2结合物，并离心纯化；
优选地，所述胶体金颗粒与鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2的质量比为13～26：1，优选比例为20:1；
优选地，所述酪蛋白钠溶液中酪蛋白钠的质量分数为5％～15％，优选地为10％；
3)胶体金结合物垫的制备：将步骤2)得到的胶体金结合物用胶体金结合物重悬液复溶至原体积，并按0.015～0.018ml/cm2的喷金量喷点在金标垫上，干燥；
优选地，所述喷金量为0.0166ml/cm2；
优选地，所述金标垫的规格为1cm*30cm/条；
4)反应膜制备：分别将0.6～1.2mg/ml鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG1、0.8～1.2mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗体包被到硝酸纤维素膜的检测区(T)和质控区(C)，干燥即得；
优选地，所述鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG1的浓度为1.0mg/ml；
优选地，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1.0mg/ml；
5)将滤纸、步骤3)制备的金结合物垫、步骤4)制备的反应膜、吸水纸依次粘贴在基材上。
优选地，在步骤1)中，所述氯金酸浓度为10％(g/ml)，柠檬酸三钠浓度为10％(g/ml)，煮沸时间为5分钟；
优选地，在步骤1)中，氯金酸与柠檬酸三钠的体积之比为1：2。
优选地，步骤2)包括以下步骤：
a.取100.0mL 0.02g～0.04g的胶体金于三角瓶中；
优选地，所述胶体金的重量为0.03g；
b.加入3.5mL 0.1M的碳酸钾溶液，混匀，静置10分钟；
c.取鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2，其中，所述胶体金与鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2的质量比为(13～26)：1，优选为20:1；在搅拌条件下，将鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2逐滴加入到三角瓶中，室温放置20～60分钟，优选为40分钟；取5.0mL质量分数为10％的酪蛋白钠溶液，在快速搅拌条件下，逐滴加入到三角瓶中，室温静置15分钟；12000rpm、4℃下离心40分钟，加入胶体金结合物重悬液至原体积；
优选地，在离心40分钟后，快速倒去上清液，将离心管底向上、离心管口斜向下30-60度角，用粗纤维滤纸将离心管壁的液体吸掉。
优选地，在步骤4)中，检测区包被液的制备包括以下步骤：
取鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG1 6.0-12.0mg，加入到3.0-6.0mL 0.05MPBS中，充分混匀后用0.05M PBS缓冲液定容至终体积10.0mL，使αSNCG1的终浓度为0.6-1.2mg/mL；
优选地，在步骤4)中，质控区包被液的制备包括以下步骤：
取羊抗鼠IgG多克隆抗体8.0-12.0mg，加入到4.0-6.0mL 0.05M PBS缓冲液中，充分混匀后用0.05MPBS缓冲液定容至终体积10.0mL，使羊抗鼠IgG多克隆抗体的终浓度为0.8-1.2mg/mL。
再一方面，本发明提供了一种γ突触核蛋白胶体金检测试剂盒，其包括上述装置或根据上述方法制备的装置。
再另一方面，本发明提供了本发明的装置、本发明的方法制备的装置或本发明的试剂盒在制备检测疾病的装置中的用途；优选地，所述疾病为肿瘤；更优选地，所述疾病选自膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌或乳腺癌中的一种或多种。
优选地，其中，所述检测的样本选自血液、血清、血浆或尿液中的一种或多种，更优选为尿液。
再另一方面，本发明提供了本发明的装置、本发明的方法制备的装置或本发明的试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供人源样本；
优选地，所述人源样本选自血液、血清、血浆、尿液，更优选为尿液；更进一步优选地为非晨尿样本；
b)使用本发明的装置在12h内检测样本；
c)根据显色结果进行结果判读：
①阳性：在检测区(T)与质控区(C)均出现一条红色条带；
②阴性：只在质控区(C)出现一条红色条带，检测区(T)无红色条带出现；
③无效：质控区(C)和检测区(T)均无红色条带出现，或只在检测区(T)出现一条红色条带，表明试验无效，应用新的检测试纸条重新测试；
优选地，所述步骤b)包括以下步骤：
1)取出条状基材平放于平面上；
2)吸取尿液滴加2～3滴到条状基材上；
3)加样后10分钟，判读结果。
与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
使用αSNCG1和αSNCG2的组合，通过制备胶体金检测装置，可实现疾病，特别是膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌和乳腺癌的检测，其灵敏性和特异性显著优于现有的其他肿瘤标志物。
具体而言，根据本发明的具体实施方式，检测膀胱癌的灵敏性可以达到80％，前列腺癌的灵敏性为80％，肾癌的灵敏性为40％，子宫内膜癌的灵敏性为50％，乳腺癌的灵敏性为45％。本发明提供的检测装置在全部检测过程无需任何其他实验设备，检测成本低，对上述疾病的诊断具有重要的临床价值。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示根据本发明的试剂盒中的胶体金试纸条的组成；
图2显示本发明的试剂盒中胶体金试纸条的判读标准。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。
实施例1SNCG胶体金试剂盒的制备
1.液体配制
1.1 10％氯金酸溶液的配制：
取氯金酸1.0g，平衡至室温，量取2.0mL纯化水，加入装有氯金酸的玻璃瓶中，反复吹打至氯金酸完全溶解。将溶解的氯金酸倒入容器中，并用纯化水反复冲洗氯金酸玻璃瓶5次，洗液倒回容器中。用纯化水将溶液定容至10.0mL。盖紧瓶盖，充分摇晃15分钟，混合均匀。
1.2金结合物重悬液的配制:
称取三羟甲基氨基甲烷6.06g，蔗糖50.0g，牛血清白蛋白5.00，PEG20000 10g，吐温20 5.00mL，PC300 1ml，加纯化水700.0mL，搅拌使充分溶解后，加入浓盐酸适量，搅拌均匀，调节pH至7.4。充分搅拌溶解后定容至1000mL。
1.3胶体金的制备:
量取10％氯金酸溶液0.3mL，加入到100.0mL纯化水中，边加热边搅拌至沸腾。量取0.6mL的10％柠檬酸三钠溶液，迅速、一次性加入到沸腾的氯金酸溶液中，继续加热煮沸2min，关掉热源用预热加热5min。冷却至室温后加纯化水定容至100.0mL。
1.4胶体金标记鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体的制备:
取100.0mL(0.03g)胶体金于三角瓶中，准确加入3.5mL 0.1M的碳酸钾溶液，混匀，静置10分钟。取1.5mg αSNCG2，在快速搅拌条件下，将αSNCG2逐滴加入到三角瓶中，室温放置40分钟。取5.0mL 10％酪蛋白钠溶液，在快速搅拌条件下，逐滴加入到三角瓶中，室温静置15分钟。12000rpm，4℃离心40分钟，小心弃去上清液，加入胶体金结合物重悬液至原体积。
1.5 γ突触核蛋白(SNCG)检测试剂盒检测区包被液的配制:
取αSNCG1 10.0mg，加入到5.0mL 0.05M PBS中，充分混匀后用0.05MPBS缓冲液定容至终体积10.0mL，使αSNCG1的终浓度为1.0mg/mL。
1.6 γ突触核蛋白(SNCG)检测试剂盒质控区包被液的配制:
取羊抗鼠IgG多克隆抗体10.0mg，加入到5.0mL 0.05M PBS缓冲液中，充分混匀后用0.05MPBS缓冲液定容至终体积10.0mL，使羊抗鼠IgG多克隆抗体的终浓度为1.0mg/mL。
2.反应膜制备
2.1胶体金结合物垫制备
在金标垫上喷点胶体金标记鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体，喷点量：0.0166ml/cm2(0.83μL/mm，喷两次)。喷点完毕后置于干燥间干燥3小时即得胶体金结合物垫，之后于室温干燥器内保存。
2.2 γ突触核蛋白(SNCG)检测试剂盒反应膜包被：
按照喷点量1μL/cm分别将C、T线包被缓冲液包被在NC膜的C、T区域。包被完毕后反应膜放入干燥车间干燥3小时。
2.3切割装配：
将金结合物垫、样本垫依次组装到反应膜上，将此反应板进行切割，切割宽度为4mm±0.2mm。
2.4组装
将切好的无破损的试纸条组装入卡壳，完成卡式试剂盒的生产制备。
同时，需要说明的是，针对不同的使用现场需求，除了组装成卡式试剂盒外，还可以制备成建议的条式试纸条(试剂盒)。
实施例2酪蛋白钠与BSA作为稳定剂对性能的影响比较
使用实施例1制备的试剂盒(酪蛋白钠做稳定剂)与对照试剂盒(10％的BSA做稳定剂，其余条件同实施例1)同时检测10例膀胱癌、10例肾癌、10前列腺癌、10例子宫内膜癌、10例乳腺癌患者在治疗前的尿液样本和10例正常人的尿液样本(均获得自博尔诚(北京)科技有限公司)，对比两种不同制备工艺的试剂盒的灵敏性和特异性，按照以下方法完成检测：
1)取出检测卡平放于平面上，本实施例中，所使用的检测卡为实施例一种制备的卡式试剂盒；
2)用滴管吸取尿液滴加2～3滴到检测卡加样孔S；
3)加样后10分钟后，参照以下标准进行结果判读(详见图2所示)：
a)阳性：在检测区(T)与质控区(C)均出现一条红色条带；
b)阴性：只在质控区(C)出现一条红色条带，检测区(T)无红色条带出现；
c)无效：质控区(C)和检测区(T)均无红色条带出现，或只在检测区(T)出现一条红色条带，表明试验无效，应用新的检测试纸条重新测试。
最后，测得10例膀胱癌、10例肾癌、10例前列腺癌、10例子宫内膜癌、10例乳腺癌治疗前尿液样本和10例正常人的尿液结果如下表1所示。
表1.不同制备工艺试剂盒的对比
根据上表的检测结果，针对相同的样本，当使用酪蛋白钠作为稳定剂时，针对膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌和乳腺癌的检出率(灵敏性)均要高于传统工艺(BSA)，说明本发明提供的试剂盒使用酪蛋白钠做稳定剂，不仅操作方便易于控制，性能也取得了出乎意料的效果。
实施例3 SNCG在膀胱癌和正常健康人样本中的检测
以25例膀胱癌治疗前尿液样本(均获得自博尔诚(北京)科技有限公司)和54例正常人的尿液样本(均获得自博尔诚(北京)科技有限公司)为检测对象，按照以下方法完成检测：
1)取出检测卡平放于平面上，本实施例中，所使用的检测卡为实施例一种制备的卡式试剂盒；
2)用滴管吸取尿液滴加2～3滴到检测卡加样孔S；
3)加样后10分钟后，参照以下标准进行结果判读(详见图2所示)：
a)阳性：在检测区(T)与质控区(C)均出现一条红色条带；
b)阴性：只在质控区(C)出现一条红色条带，检测区(T)无红色条带出现；
c)无效：质控区(C)和检测区(T)均无红色条带出现，或只在检测区(T)出现一条红色条带，表明试验无效，应用新的检测试纸条重新测试。
最后，测得25例膀胱癌治疗前尿液样本和54例正常人的尿液结果如下表2所示。
表2.膀胱癌和正常人尿液样本检测结果
根据上表的检测结果，本试剂盒检测膀胱癌的灵敏性为80.0％(20/25)，在正常人中的特异性为85.2％(46/54)。
实施例4 SNCG在前列腺癌和正常健康人样本中的检测
以20例前列腺癌治疗前尿液样本(均获得自博尔诚(北京)科技有限公司)和54例正常人的尿液样本(均获得自博尔诚(北京)科技有限公司)为检测对象，按照以下方法完成检测：
1)取出检测卡平放于平面上，本实施例中，所使用的检测卡为实施例一种制备的卡式试剂盒；
2)用滴管吸取尿液滴加2～3滴到检测卡加样孔S；
3)加样后10分钟后，参照以下标准进行结果判读(详见图2所示)：
a)阳性：在检测区(T)与质控区(C)均出现一条红色条带；
b)阴性：只在质控区(C)出现一条红色条带，检测区(T)无红色条带出现；
c)无效：质控区(C)和检测区(T)均无红色条带出现，或只在检测区(T)出现一条红色条带，表明试验无效，应用新的检测试纸条重新测试。
最后，测得20例前列腺癌治疗前尿液样本和54例正常人的尿液结果如下表3所示。
表3.前列腺癌和正常人尿液样本检测结果
根据上表的检测结果，本试剂盒检测前列腺癌的灵敏性为80.0％(16/20)，在正常人中的特异性为85.2％(46/54)。
实施例5 SNCG在肾癌和正常人样本中的检测
以20例前肾癌治疗前尿液样本(均获得自博尔(北京)诚科技有限公司)和54例正常人的尿液样本(均获得自博尔诚(北京)科技有限公司)为检测对象，按照以下方法完成检测：
1)取出检测卡平放于平面上，本实施例中，所使用的检测卡为实施例一种制备的卡式试剂盒；
2)用滴管吸取尿液滴加2～3滴到检测卡加样孔S；
3)加样后10分钟后，参照以下标准进行结果判读(详见图2所示)：
a)阳性：在检测区(T)与质控区(C)均出现一条红色条带；
b)阴性：只在质控区(C)出现一条红色条带，检测区(T)无红色条带出现；
c)无效：质控区(C)和检测区(T)均无红色条带出现，或只在检测区(T)出现一条红色条带，表明试验无效，应用新的检测试纸条重新测试。
最后，测得20例肾癌治疗前尿液样本和54例正常人的尿液结果如下表4所示。
表4.肾癌和正常人尿液样本检测结果
根据上表的检测结果，本试剂盒检测肾癌的灵敏性为40.0％(8/20)，在正常人中的特异性为85.2％(46/54)。
实施例6 SNCG在子宫内膜癌和正常人样本中的检测
以20例子宫内膜癌治疗前尿液样本和54例正常人的尿液样本为检测对象，按照以下方法完成检测：
1)取出检测卡平放于平面上，本实施例中，所使用的检测卡为实施例一种制备的卡式试剂盒；
2)用滴管吸取尿液滴加2～3滴到检测卡加样孔S；
3)加样后10分钟后，参照以下标准进行结果判读(详见图2所示)：
a)阳性：在检测区(T)与质控区(C)均出现一条红色条带；
b)阴性：只在质控区(C)出现一条红色条带，检测区(T)无红色条带出现；
c)无效：质控区(C)和检测区(T)均无红色条带出现，或只在检测区(T)出现一条红色条带，表明试验无效，应用新的检测试纸条重新测试。
最后，测得20例子宫内膜癌治疗前尿液样本和54例正常人的尿液结果如下表5所示。
表5.子宫内膜癌和正常人尿液样本检测结果
根据上表的检测结果，本试剂盒检测子宫内膜癌的灵敏性为50.0％(10/20)，在正常人中的特异性为85.2％(46/54)。
实施例7 SNCG在乳腺癌和正常人样本中的检测
以20例乳腺癌治疗前尿液样本和54例正常人的尿液样本为检测对象，按照以下方法完成检测：
1)取出检测卡平放于平面上，本实施例中，所使用的检测卡为实施例一种制备的卡式试剂盒；
2)用滴管吸取尿液滴加2～3滴到检测卡加样孔S；
3)加样后10分钟后，参照以下标准进行结果判读(详见图2所示)：
a)阳性：在检测区(T)与质控区(C)均出现一条红色条带；
b)阴性：只在质控区(C)出现一条红色条带，检测区(T)无红色条带出现；
c)无效：质控区(C)和检测区(T)均无红色条带出现，或只在检测区(T)出现一条红色条带，表明试验无效，应用新的检测试纸条重新测试。
最后，测得20例子宫内膜癌治疗前尿液样本和54例正常人的尿液结果如下表6所示。
表6.乳腺癌和正常人尿液样本检测结果
根据上表的检测结果，本试剂盒检测乳腺癌的灵敏性为45.0％(9/20)，在正常人中的特异性为85.2％(46/54)。
实施例8本试剂盒与ELISA试剂盒的对比
以10例膀胱癌、10例肾癌、10前列腺癌、10例子宫内膜癌、10例乳腺癌治疗前尿液样本和10例正常人的尿液样本为检测对象，分别使用本发明提供的试剂盒和《SNCG的单克隆抗体及其应用，申请号：200810105770.7》提供的ELISA试剂盒完成检测，其中本发明提供的试剂盒按照以下方法完成检测，ELISA试剂盒按照《SNCG的单克隆抗体及其应用，申请号：200810105770.7》推荐的方法完成检测：
1)取出检测卡平放于平面上，本实施例中，所使用的检测卡为实施例1制备的卡式试剂盒；
2)用滴管吸取尿液滴加2～3滴到检测卡加样孔S；
3)加样后10分钟后，参照以下标准进行结果判读(详见图2所示)：
a)阳性：在检测区(T)与质控区(C)均出现一条红色条带；
b)阴性：只在质控区(C)出现一条红色条带，检测区(T)无红色条带出现；
c)无效：质控区(C)和检测区(T)均无红色条带出现，或只在检测区(T)出现一条红色条带，表明试验无效，应用新的检测试纸条重新测试。
最后，测得10例膀胱癌、10例肾癌、10例前列腺癌、10例子宫内膜癌、10例乳腺癌治疗前尿液样本和10例正常人的尿液结果如下表7所示。
表7.本发明试剂盒与ELISA试剂盒的对比
根据上表的检测结果，针对相同的样本，在平行测试本发明提供的试剂盒与ELISA试剂盒时，针对不同种类的癌症尿液样本，本发明提供的试剂盒检出率(灵敏性)均高于文献报道的ELISA试剂盒，说明本发明提供的试剂盒的性能要优于已有的其他类方法。
综上所述，本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性、高灵敏性、高特异性、检测快速准确等突出优点，对膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌和乳癌癌的诊断均具有重要的临床价值，尤其是膀胱癌和前列腺癌。此外，本发明提供的试剂盒，其性能优于现有的其他类方法。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种γ突触核蛋白的胶体金检测装置，所述装置包括条状基材，在所述条状基材上依次设置样本垫、胶体金结合物垫、反应膜和滤纸；其中，所述胶体金结合物垫上包被胶体金标记的鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2，所述反应膜上的检测区(T)喷点鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG1、质控区(C)喷点羊抗鼠免疫球蛋白IgG；并且所述胶体金检测装置包含酪蛋白钠作为稳定剂。
2.根据权利要求1所述的装置的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)胶体金颗粒的制备：利用氯金酸与柠檬酸三钠在沸水中发生氧化还原反应制备胶体金颗粒；
2)胶体金结合物的制备：采用物理吸附法，在pH7.5～8.5下，使胶体金颗粒与待标记的鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2结合，并加入酪蛋白钠溶液作为稳定剂，从而形成胶体金标记的鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2结合物，并离心纯化；
优选地，所述胶体金颗粒与鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2的质量比为13～26：1，优选比例为20:1；
优选地，所述酪蛋白钠溶液中酪蛋白钠的质量分数为5％～15％，优选地为10％；
3)胶体金结合物垫的制备：将步骤2)得到的胶体金结合物用胶体金结合物重悬液复溶至原体积，并按0.015～0.018ml/cm2的喷金量喷点在金标垫上，干燥；
优选地，所述喷金量为0.0166ml/cm2；
优选地，所述金标垫的规格为1cm*30cm/条；
4)反应膜制备：分别将0.6～1.2mg/ml鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG1、0.8～1.2mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗体包被到硝酸纤维素膜的检测区(T)和质控区(C)，干燥即得；
优选地，所述鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG1的浓度为1.0mg/ml；
优选地，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1.0mg/ml；
5)将滤纸、步骤3)制备的金结合物垫、步骤4)制备的反应膜、吸水纸依次粘贴在基材上。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，在步骤1)中，所述氯金酸浓度为10％(g/ml)，柠檬酸三钠浓度为10％(g/ml)，煮沸时间为5分钟；
优选地，在步骤1)中，氯金酸与柠檬酸三钠的体积之比为1：2。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，在步骤2)包括以下步骤：
a.取100.0mL 0.02g～0.04g的胶体金于三角瓶中；
优选地，所述胶体金的重量为0.03g；
b.加入3.5mL 0.1M的碳酸钾溶液，混匀，静置10分钟；
c.取鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2，其中，所述胶体金与鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2的质量比为(13～26)：1，优选为20:1；在搅拌条件下，将鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG2逐滴加入到三角瓶中，室温放置20～60分钟，优选为40分钟；取5.0mL质量分数为10％的酪蛋白钠溶液，在快速搅拌条件下，逐滴加入到三角瓶中，室温静置15分钟；12000rpm、4℃下离心40分钟，加入胶体金结合物重悬液至原体积；
优选地，在离心40分钟后，快速倒去上清液，将离心管底向上、离心管口斜向下30-60度角，用粗纤维滤纸将离心管壁的液体吸掉。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中，在步骤4)中，检测区包被液的制备包括以下步骤：
取鼠抗γ突触核蛋白单克隆抗体αSNCG1 6.0-12.0mg，加入到3.0-6.0mL 0.05M PBS中，充分混匀后用0.05M PBS缓冲液定容至终体积10.0mL，使αSNCG1的终浓度为0.6-1.2mg/mL；
优选地，在步骤4)中，质控区包被液的制备包括以下步骤：
取羊抗鼠IgG多克隆抗体8.0-12.0mg，加入到4.0-6.0mL 0.05M PBS缓冲液中，充分混匀后用0.05MPBS缓冲液定容至终体积10.0mL，使羊抗鼠IgG多克隆抗体的终浓度为0.8-1.2mg/mL。
6.一种γ突触核蛋白胶体金检测试剂盒，其包括根据权利要求1所述的装置或根据权利要求2-5中任一项所述的方法制备的装置。
7.根据权利要求1所述的装置、权利要求2-5中任一项所述的方法制备的装置或根据权利要求6所述的试剂盒在制备检测疾病的装置中的用途；优选地，所述疾病为肿瘤；更优选地，所述疾病选自膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌或乳腺癌中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述检测的样本选自血液、血清、血浆或尿液中的一种或多种，更优选为尿液。
9.根据权利要求1所述的装置、权利要求2-5中任一项所述的方法制备的装置或根据权利要求6所述的试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供人源样本；
优选地，所述人源样本选自血液、血清、血浆、尿液，更优选为尿液；更进一步优选地为非晨尿样本；
b)使用所述装置在12h内检测样本；
c)根据显色结果进行结果判读：
①阳性：在检测区(T)与质控区(C)均出现一条红色条带；
②阴性：只在质控区(C)出现一条红色条带，检测区(T)无红色条带出现；
③无效：质控区(C)和检测区(T)均无红色条带出现，或只在检测区(T)出现一条红色条带，表明试验无效，应用新的检测试纸条重新测试。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述步骤b)包括以下步骤：
1)取出条状基材平放于平面上；
2)吸取尿液滴加2～3滴到条状基材上；
3)加样后10分钟，判读结果。
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