CN110506057A - Alpha突触核蛋白抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了相比于单体α‑突触核蛋白优先结合寡聚体α‑突触核蛋白的抗α‑突触核蛋白抗体，包含所述抗体的治疗组合物，和使用这些抗体治疗突触核蛋白病的方法。

Description

ALPHA突触核蛋白抗体及其应用
相关申请信息
本申请主张2017年2月17日提交的美国临时专利申请62/460,416的权益。将上述临时申请的全部内容援引并入本申请。
背景
α-突触核蛋白(αSyn)是一种140个氨基酸的蛋白质，它优先在神经元中的突触前末梢处表达，人们认为它在此处发挥调节突触传导的作用(Bendor et al.,Neuron 2013；79:1044-66)。有人提出，它在天然状态下以去折叠的单体(Fauvet et al.,JBC 2012；287:15345-64)以及α-螺旋的稳定三聚体(Bartels et al.,Nature 2011；477:107-10；Wang etal.,PNAS 2011；108:17797-802)两种形式存在，而且已证明其经历若干翻译后修饰(Beyerand Ariza,Mol Neurobiol 2013；47:509-24)。已经得到大量研究的一种修饰是αSyn在第129位丝氨酸(S129)处的磷酸化。正常情况下，只有一小部分αSyn在S129处组成型磷酸化，而绝大部分在病理性细胞内包涵体中发现的αSyn是pS129 αSyn(Oueslati,J ParkinsonsDis 2016；6:39-51)。这些病理性包涵体是由错误折叠的αSyn蛋白聚集成的不溶性积团构成的，是一群神经变性疾病(合称为突触核蛋白病synucleinopathies)(Galvin et al.,Arch Neurol 2001；58:186-90)的表征性特征。
在突触核蛋白病中，αSyn可以在神经元中形成病理性聚集体，称为路易体(Lewybodies)，路易体是帕金森病(PD)以及路易体痴呆(dementia with Lewy bodies,DLB)这两种疾病的特征。此外，在少突胶质细胞中找到了异常的富含αSyn的病灶，称为胶质胞质包涵体(glial cytoplasmic inclusions,GCIs)，胶质胞质包涵体是一种进展快速的致死性突触核蛋白病，名为多系统萎缩症(MSA)的病理标志。病理性αSyn播散到全脑的最初证据来自PD中描述的脑病理的模式化的进展(Braak et al.,2003)、以及PD患者中αSyn聚集体从宿主到移植物扩散的证据(Kordower et al.,2008)。有意思的是，关于αSyn mRNA在少突胶质细胞中检测不到表达的报道(Ozawa et al.,Acta Neuropathologica 2001；102:188-190；Miller et al.,J Neural Transm(Vienna)2005；112:1613-24；Jin et al.,Journal ofMedical and Dental Sciences 2008；555:145-53)或表达水平低的报道(Asi et al.,Glia 2014；62:964-70)提示，αSyn的某些病理形式是从神经元——在其中αSyn高度表达——播散到少突胶质细胞的。新近的工作支持了这种αSyn播散的概念，证明αSyn被少突胶质细胞(Reyes et al.,Glia 2014；62:387-98)以及神经元(Volpicelli-Daley et al.,Neuron 2011；72:57–71；Luk et al.,Science 2012；338:949-953)摄取。此外，将来自MSA患者的人脑匀浆物接种到αSyn转基因小鼠中，或者将来自PD脑的纯化的LB提取物接种到小鼠和非人灵长类中，导致神经元功能失调和广泛的pS129神经元沉积(Watts et al.,PNAS2013；110:19555-60；Prusiner et al.,PNAS 2015；112:E5308-17；Recasens et al.,Annals Neurology 2014；75:351–62)。
目前缺少从αSyn播散的角度靶向突触核蛋白病的治疗手段。相应地，优先靶向αSyn的病理形式的治疗剂可能是患有PD、DLB、MSA等突触核蛋白病的患者的治疗所期望的。
概要
本文提供了分离的抗体，例如单克隆抗体，其特异性结合α-突触核蛋白并具有期望的功能特性。这些特性包括：与单体α-突触核蛋白相比优先结合寡聚α-突触核蛋白，以及在体外和体内抑制能够可溶性或不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如丝氨酸-129磷酸化α-突触核蛋白聚集体)的产生。本文所述的抗α-突触核蛋白抗体可用于治疗突触核蛋白病——一类以脑中路易体或α-突触核蛋白的病理性聚集体的存在为特征的疾病，减轻突触核蛋白病严重性，延迟突触核蛋白病进展，降低突触核蛋白病发发病风险，延迟突触核蛋白病发作，以及诊断突触核蛋白病。
在一个实施方案中，本文提供了抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白，并展现一种或多种下述的性质：
(a)结合小鼠和大鼠α-突触核蛋白；
(b)结合人β-突触核蛋白和人γ-突触核蛋白；
(c)对α-突触核蛋白寡聚体的亲和力大于对α-突触核蛋白单体的亲和力；
(d)抑制α-突触核蛋白寡聚体诱导的不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的生成；
(e)耗竭从脑中含有α-突触核蛋白病理性聚集体的患者制备的PFF和/或脑裂解物来源的、产生可溶性或不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的分子种类；
(f)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第123-128位氨基酸的全部或一部分；
(g)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第125-128位氨基酸的全部或一部分；
(h)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-139位氨基酸的全部或一部分；
(i)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第119-126位氨基酸的全部或一部分；和
(j)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-138位氨基酸的全部或一部分。
在特定的实施方案中，α-突触核蛋白寡聚体是PFF，例如，如实施例3中描述的那样制备的。在某些实施方案中，α-突触核蛋白寡聚体是可溶性α-突触核蛋白寡聚体。在其他实施方案中，α-突触核蛋白寡聚体是不溶性α-突触核蛋白寡聚体。
在某些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分对于α-突触核蛋白PFF、可溶性聚集体(寡聚体)或不溶性聚集体具有比α-突触核蛋白单体更高的亲和力，例如通过α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白聚集体结合比评估的，例如如实施例3描述的。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段具有100或更高，例如500或更高，700或更高，1500或更高，3000或更高，或5000或更高的α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白PFF结合比。
在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分以500nM或更高的EC50结合单体型α-突触核蛋白，且以0.5nM或更低的EC50结合PFF。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分以0.1nM或更低的IC50抑制PFF诱导的α-突触核蛋白丝氨酸-129磷酸化，例如使用实施例10所述的测定法评估的。
在另一个方面，本文提供了分离单克隆抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分特异性结合α-突触核蛋白，并且包含选自下组的可变重链与可变轻链对中的三个可变重链CDR及三个可变轻链CDR：SEQ ID NO:8和9、18和19、28和29、38和39、48和49、58和59、68和69、78和79、94和95、94和96、94和97、106和107。
在另一个方面，本文提供了结合α-突触核蛋白的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)分别包含SEQ ID NO:2-4的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:5-7的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(b)分别包含SEQ ID NO:22-24的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:25-27的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(c)分别包含SEQ ID NO:22-24的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:28-30的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(d)分别包含SEQ ID NO:37-39的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:40-42的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(e)分别包含SEQ ID NO:47-49的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:50-52的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(f)分别包含SEQ ID NO:57-59的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:60-62的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(g)分别包含SEQ ID NO:67-69的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:70-72的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(h)分别包含SEQ ID NO:77-79的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:80-82的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(i)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:90-92的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(j)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:93-95的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(k)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:96-98的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；or
(l)分别包含SEQ ID NO:107-109的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQID NO:110-112的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3。
在另一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分结合α-突触核蛋白并且包含重链和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、18、31、43、53、63、73、83、99和113。
在另一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分结合α-突触核蛋白并且包含重链和轻链可变区，其中所述轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、19、32、33、44、54、64、74、84、100、101、102和114。
在另一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分结合α-突触核蛋白并且包含与选自下组的氨基酸序列至少90％、95％、98％、99％或100％相同的重链和轻链可变区序列：(a)SEQ ID NO:8和9、18和19、31和32、31和33、43和44、53和54、63和64、73和74、83和84、99和100、99和101、99和102；以及SEQ ID NO:113和114。
在另一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分结合α-突触核蛋白并且包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％99％或100％相同的重链和轻链序列：SEQ ID NO:10和11、20和21、34和35、34和36、45和46、55和56、65和66、75和76、85和86、103和104、103和105、103和106、和115和116。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第123-128位氨基酸的全部或部分。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第125-128位氨基酸的全部或部分。抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-139位氨基酸的全部或部分。抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第119-126位氨基酸的全部或部分。抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-138位氨基酸的全部或部分。
在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分结合大鼠和小鼠α-突触核蛋白。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分结合人β-突触核蛋白和人γ-突触核蛋白。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分对α-突触核蛋白PFF、可溶性聚集体(寡聚体)或不溶性聚集体比α-突触核蛋白单体具有更高的亲和力，如通过α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白PFF结合比(单体:PFF结合比)评估的，如在例如实施例3中描述的。在一些实施方案中，单体:PFF结合比为100以上，500以上，700以上，1500以上，3000以上，或5000以上。
在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分与本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体(例如，抗体7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8)结合相同的表位。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分与本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体(例如，抗体7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8)竞争与人α-突触核蛋白的结合。
在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分为igG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体，或其变体。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体包含具有降低的效应器功能或没有效应器功能的Fc区，例如具有下述突变的无效应器(effectorless)IgG1 Fc:L234A、L235E和G257A。
在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分被修饰以降低人体中的免疫原性。在一个实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分包含分别如SEQ ID NO:18和19中所示的重链和轻链可变区。
在另一个方面，本文提供了双特异性分子，其包含抗α-突触核蛋白抗体及与之连接的具有第二结合特异性的分子。
在另一个方面，本文提供了编码如本文中所描述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分的CDR或重链和/或轻链可变区或重链和/或轻链的核酸，包含上述核酸分子的表达载体，以及转化有上述表达载体的细胞。
在另一个方面，本文提供了免疫缀合物，其包含抗α-突触核蛋白抗体以及与之相连的模块，例如结合模块、标记模块、生物活性模块或治疗剂。
在另一个方面，本文提供了组合物，其包含抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分以及载体。还提供了试剂盒，其包含抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分，以及使用说明。
在另一个方面，本文提供了制备抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分的方法，包括在细胞中表达抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分，并且从该细胞分离抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分。
在另一个方面，本文提供了在样品中检测α-突触核蛋白的方法，包括使样品与本文所描述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体、或免疫缀合物在允许该抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分与α-突触核蛋白之间形成复合物的条件下接触，并检测复合物的形成。
在另一个方面，本文提供了在细胞中抑制不溶性或可溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的生成的方法，包括使细胞与有效量的本文所描述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体、或免疫缀合物接触。在一些实施方案中，抗体抑制不含丝氨酸-129磷酸化α-突触核蛋白的不溶性或可溶性α-突触核蛋白聚集体的生成。在一些实施方案中，丝氨酸-129的磷酸化是由α-突触核蛋白寡聚体诱导的。在一些实施方案中，α-突触核蛋白寡聚体是预形成的α-突触核蛋白纤丝。在其他实施方案中，α-突触核蛋白寡聚体衍生自来自于α-突触核蛋白病患者的脑样品。
在另一个方面，本文提供了一种治疗疾病、减轻疾病的严重性、延迟疾病的进展、减少发生疾病的风险、和/或延迟疾病的发作的方法，所述疾病以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征，所述方法包括对受试者施用有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物。
在另一个方面，本文提供了诊断受试者中以路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的方法，包括
(a)使来自于受试者的样品与本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物接触，使得抗体-抗原复合物形成；
(b)测量所形成的复合物的量；和
(c)比较样品中的所述复合物的量和对照中的所述复合物的量，其中样品中该复合物的水平相对于对照的水平高，表明受试者患有以路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病。在一些实施方案中，样品是脑脊液、脑组织提取物、尿、或血。
在一些实施方案中，上述方法中的疾病是帕金森病、帕金森病痴呆、路易体痴呆、路易体病、多系统萎缩、或单纯性自主神经衰竭。在一些实施方案中，上述的方法进一步包括施用一种或多种其他治疗剂。
附图简要说明
图1是显示了在包被有不同的αSyn肽的平板上温育的7A10、21A3、15A5、36A3、11H11-1、44B11、1E8、2E2和23H8的表位结合数据的一系列线图。结合的抗体用单侧ELISA测量。数据代表单次测定。
图2是7A10、21A3、15A5、36A3、11H11-1和44B11与全长人重组野生型αSyn单体、αSyn PFF或A53T αSyn的结合的一系列线图。将抗体在溶液中与递增浓度的αSyn单体、αSynPFF或A53T αSyn一起温育。未结合的抗体被捕获在PFF包被的平板上，并使用单侧ELISA测量。数据代表一式二份测定的均值±SD。
图3是显示抗体1(一种已知可结合αSyn的抗体)与全长人重组野生型αSyn单体、αSyn PFF或A53T αSyn的结合的线图。未结合的抗体被捕获在PFF包被的平板上，并使用单侧ELISA测量。数据代表一式二份测定的均值±SD。
图4显示7A10的重链(VH)和轻链(VK)的免疫原性热点分析。氨基酸编号按照Kabat规则。两条链中每一条的三个CDR区用方框标记，而框架残基用FW1、FW2和FW3标记。每个氨基酸下面的数字表示结合以该氨基酸为中心的15聚体肽的等位基因的比例。例如，7A10_VH的Y52中的“5”指向以Y52为中心的15聚体肽，即LEWIGYIYYSGRTKY，并且意味着(i)该肽没有人种系匹配者(因此是非自体性的)，并且(ii)27个等位基因中50-60％显示与该肽的高结合亲和力。各数字被分配一个从亮(最不可能是免疫原性)至暗(最可能是免疫原性的热点)的灰度表上的颜色，从图上可见不同的色度。3个粗体箭头显示了选用突变体的选项：R56S、K58N、T93A。
图5A和5B是健康人PBMC志愿供体暴露于测试抗体7日后的阳性CD4+扩增应答的比例的线图。每个水平条代表一名阳性供体。7A10和7A10T93A在不同次测定中测试。Avastin是一种抗VEGF A单克隆抗体，用作阴性对照。αIL-21R mAb是一种全人抗IL-21R单克隆抗体，用作阳性对照。
图6A和6B是显示7A10(图6A)和7A10-T93A(图6B)对递增浓度的小鼠、大鼠及人αSyn肽，以及WT PFF的结合的线图。未结合的抗体被捕获在PFF包被的平板上，并使用单侧ELISA测量。数据代表一式二份测定的均值±SD。
图7是显示7A10、21A3、15A5、36A3、11H11-1和44B11对全长人重组野生型αSyn、βSyn、γSyn单体的结合的一系列线图；纳入了αSyn PFF作为阳性对照。未结合的抗体被捕获在PFF包被的平板上，并使用单侧ELISA测量。数据代表一式二份测定的均值±SD。
图8A和8B是显示7A10和抗体1对野生型单体αSyn或PFF的结合的表面等离子体共振(SPR)分析的线图。图8A显示，单体wt αSyn(下面的曲线)对表面捕获的7A10的结合以及多聚体性PFF(上面的曲线)对7A10的增强的结合。具体而言，wt αSyn的解离速率非常迅速，而PFF解离非常缓慢。图8B显示了抗体1的同样格式的数据(下面的曲线对应PFF，上面的曲线对应wt αSyn)。与7A10相对照的是，抗体1对wt αSyn和PFF形式的结合没有显示可分辨的选择性。
图9A和9B是显示一种用于估计7A10和7A10-T93A对PFF的亲合力的改进的SPR测定法的结果的线图。图9A显示了几种浓度(3倍稀释物，100nM至0.4nM)的7A10-IgG1.3f对表面上固定化的PFF的亲合力影响的结合动力学(ka(1/Ms):5.811E+7,kd(1/s):0.009834,KD:1.692E-10M)。图9B显示了7A10-T93A-IgG1.3f(ka(1/Ms)的相同格式的数据:8.946E+7,kd(1/s):0.03873,KD:4.329E-10M)。
图10A是显示在用递增的AAV-hA53T-αSyn MOI转导的大鼠海马神经元中，用10nMPFF处理10日之后pS129的诱导(对未处理的对照归一化)的线图。图10B是显示在用hA53T-αSyn PFF(上部(上升)线)或者用单体(下部(平)线)处理11日的、经转导的(3K MOI AAV-hA53T αSyn)大鼠海马神经元中pS129的诱导(对未处理的对照归一化)的浓度应答曲线的线图。图10C是显示的经转导的(3K MOI AAV-hA53T-αSyn)大鼠海马神经元用来自9种不同的来自MSA患者来源的脑样品的裂解物处理11日后pS129的诱导(对10nM PFF对照归一化)的线图。从左到右的条形对应10nM PFF、MSA#1、MSA#2、MSA#3、MSA#4、MSA#5、MSA#6、MSA#7、MSA#8和MSA#9的线图。图10D显示在经转导(3K MOI AAV-hA53T-αSyn)的大鼠海马神经元中，用缓冲液、10nM PFF、来自对照脑的裂解物或来自MSA脑的裂解物处理11日之后，诱导的pS129信号的免疫荧光图像。脑裂解物以1:300稀释度施用。图10E是显示在在经转导(3KMOI AAV-hA53T-αSyn)的大鼠海马神经元中，用递增浓度的PFF处理11日后，pS129 αSyn诱导(对未处理的对照归一化，上升线)和分支点数(对未处理的对照归一化，下降线)之间的反相关关系的线图。图10F是显示在经转导的(3K MOI AAV-hA53T-αSyn)大鼠海马神经元中，用PFF、MSA、和对照脑裂解物，以及来自MSA和对照脑裂解物的分离的高速离心沉淀以及残余的上清液处理11日之后，pS129 αSyn诱导(对未处理对照归一化)的线图。条形从左到右对应：对照、1nM PFF、MSA脑(裂解物)、MSA(离心沉淀)、MSA(上清)、对照(裂解物)、对照(离心沉淀)、和对照(上清)。图10G是显示的线图在用来自MSA脑组织裂解物的重悬的离心沉淀处理之后，pS129 αSyn的时间依赖性诱导(对10nM PFF阳性对照归一化)的线图。条形从左到右对应：温育后7日，温育后14日，和温育后18日。图10H是显示在用10nM PFF和MSA脑组织裂解物二者处理11日之后，pS129 αSyn诱导(对未处理对照归一化)和分枝点数(相对于未处理对照归一化)的线图。对于对照(由于缺少诱导，没有pS129诱导条形)、PFF、MSA中的每一个，成对的条形的顺序是：pS129诱导和分枝点数。
图11是一系列线图，显示PFF以及从三名不同MSA患者(12-18、01-03、04-51)生成的脑裂解物的抗体1免疫耗竭的累积浓度响应曲线。对于经免疫耗竭的样品，在经3K MOIhA53T αSyn AAV转导的大鼠海马神经元中测试pS129诱导。Y轴值代表相对于未经耗竭的样品归一化的pS129强度。数据点(均值±95％CI)和拟合的序列是用累积数据集生成的。计算了每次实验的IC50，并显示了均值±sd。
图12是一系列线图，显示PFF以及从三名不同MSA患者(12-18、01-03、04-51)生成的脑裂解物的7A10免疫耗竭的累积浓度响应曲线。对于经免疫耗竭的样品，在经3K MOIhA53T αSyn AAV转导的大鼠海马神经元中测试pS129诱导。Y轴值代表相对于未经耗竭的样品归一化的pS129强度。数据点(均值±95％CI)和拟合的序列是用累积数据集生成的。计算了每次实验的IC50，并显示了均值±sd。
图13是一系列线图，显示PFF以及从三名不同MSA患者(12-18、01-03、04-51)生成的脑裂解物的21A3免疫耗竭的累积浓度响应曲线。对于经免疫耗竭的样品，在经3K MOIhA53T αSyn AAV转导的大鼠海马神经元中测试pS129诱导。Y轴值代表相对于未经耗竭的样品归一化的pS129强度。数据点(均值±95％CI)和拟合的序列是用累积数据集生成的。计算了每次实验的IC50，并显示了均值±sd。
图14是一系列线图，显示PFF以及从三名不同MSA患者(12-18、01-03、04-51)生成的脑裂解物的36A3免疫耗竭的累积浓度响应曲线。对于经免疫耗竭的样品，在经3K MOIhA53T αSyn AAV转导的大鼠海马神经元中测试pS129诱导。Y轴值代表相对于未经耗竭的样品归一化的pS129强度。数据点(均值±95％CI)和拟合的序列是用累积数据集生成的。计算了每次实验的IC50，并显示了均值±sd。
图15是一系列线图，显示PFF以及从三名不同MSA患者(12-18、01-03、04-51)生成的脑裂解物的15A5免疫耗竭的累积浓度响应曲线。对于经免疫耗竭的样品，在经3K MOIhA53T αSyn AAV转导的大鼠海马神经元中测试pS129诱导。Y轴值代表相对于未经耗竭的样品归一化的pS129强度。数据点(均值±95％CI)和拟合的序列是用累积数据集生成的。计算了每次实验的IC50，并显示了均值±sd。
图16是一系列线图，显示PFF以及从三名不同MSA患者(12-18、01-03、04-51)生成的脑裂解物的11H11-1免疫耗竭的累积浓度响应曲线。对于经免疫耗竭的样品，在经3K MOIhA53T αSyn AAV转导的大鼠海马神经元中测试pS129诱导。Y轴值代表相对于未经耗竭的样品归一化的pS129强度。数据点(均值±95％CI)和拟合的序列是用累积数据集生成的。计算了每次实验的IC50，并显示了均值±sd。
图17是一系列线图，显示PFF以及从三名不同MSA患者(12-18、01-03、04-51)生成的脑裂解物的44B11免疫耗竭的累积浓度响应曲线。Y轴值代表相对于未经耗竭的样品归一化的pS129强度。对于经免疫耗竭的样品，在经3K MOI hA53T αSyn AAV转导的大鼠海马神经元中测试pS129诱导。数据点(均值±95％CI)和拟合的序列是用累积数据集生成的。计算了每次实验的IC50，并显示了均值±sd。
图18是一系列线图，显示抗体3(一种已知可结合αSyn的抗体)、抗体1、7A10、11H11-1、15A5、21A3、36A3和44B11在第1-3周低谷时采取的血浆样品及第4周给药后24小时收获时采取的血浆样品中的血浆浓度。上左(第1周血浆低谷)，上右(第2周血浆低谷)，下左(第3周血浆低谷)，下右(第4周血浆给药后24小时)。
图19是显示PFF注射部位对侧和同侧的7A10、21A3、11H11-1、15A5、36A3、44B11和抗体1的脑浓度的线图。
图20是显示对于无ADA活性(圆圈)和有ADA活性(三角形)的样品，抗体3、抗体1、7A10、21A3、15A5和44B11在第4周的血浆水平的线图。
图21显示代表性的免疫组化图像，展现小鼠同侧杏仁核中的pS129αSyn病理。小鼠用PBS或A53T-PFF接种，然后用PBS或10mg/kg的下列抗体每周一次定量给药4周：抗体1、7A10、21A3、抗体3、15A5、36A3、44B11和11H11-1。脑切片对pS129 αSyn染色。箭头突出显示在A53T-PFF对照切片中检测到的pS129 αSyn聚集体的实例。图像用10X物镜获取。
图22A-22D是显示在与纹状体A53T-PFF注射部位同侧的运动皮质(图22A和22B)和杏仁核(图22C和22D)中pS129染色阳性的细胞的数量的线图。显示了组平均和统计学显著性(图22A和22C)以及动物个体数据(图22B和22D)。统计学分析基于单因素方差分析，并使用PFF组作为对照进行Dunnett事后检验(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
图23A-23D是显示利用两个独立的ELISA测定在脑组织中测量得到的αSyn寡聚体水平的线图。分析了来自与注射部位对侧和同侧的脑半球的可溶性提取物。显示了组平均(图23A和23C)以及个体动物数据(图23B和23D)。统计学分析基于单因素方差分析，并使用PFF组作为对照进行Dunnett事后检验**p<0.01,***p<0.001)。
图24A-24D是一系列线图，显示利用ELISA在脑组织中测量的pS129 αSyn(图24A和24B)以及总αSyn(图24C和24D)水平。分析了来自与注射部位对侧和同侧的脑半球的可溶性提取物。显示了组平均(图24A和24C)以及个体动物数据(图24B和24D)。各组之间没有统计学显著的差异(统计学分析基于单因素方差分析，并使用PFF组作为对照进行Dunnett事后检验)。
图25是一系列线图，显示标明的抗体与滴定量的αSyn单体或αSyn PFF的结合。未结合的抗体被捕获在PFF包被的平板上，且通过单侧ELISA测量。数据代表一式二份测定的均值±SD。
图26是一系列线图，显示标明的抗体与滴定量的αSyn单体或αSyn PFF的结合。未结合的抗体被捕获在PFF包被的平板上，且通过单侧ELISA测量。数据代表一式二份测定的均值±SD。
图27是一系列线图，显示通过1E8.10+2E2.2(1E8捕捉抗体，2E2检测抗体)和MJFR14642+23H8.G3(MJFR14642捕捉抗体，23H8检测抗体)两种ELISA检测αSyn单体。显示了实例浓度响应曲线。单体和PFF样品在ELISA之前用超声预处理。单体和PFF突触核蛋白水平作为单体当量ng/ml表示。数据代表一式三份测定的均值±SD。CPS＝每秒计数。
图28是一系列线图，显示了通过ELISA检测αSyn单体和PFF。显示了实例浓度响应曲线。捕捉抗体是第一个列出的抗体，检测抗体是第二个列出的抗体。单体和PFF样品在ELISA之前用超声预处理。单体和PFF突触核蛋白水平作为单体当量ng/ml表示。PS129 αSyn肽的检测用MJFR1+MJFR13 ELISA来评估。数据代表一式三份测定的均值±SD。CPS＝每秒计数。
图29是一系列线图，显示通过ELISA检测αSyn及αSyn家族成员β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白by ELISA。捕捉抗体是第一个列出的抗体，检测抗体是第二个列出的抗体。显示了实例浓度响应曲线。数据代表一式二份测定的均值±SD。CPS＝每秒计数。
图30是一系列线图，显示在对照、PD、AD和PSP提取物中使用1E8.10+2E2.2寡聚体ELISA、MJFR14642+23H8.G3寡聚体ELISA、MJFR1+4B12总ELISA和MJFR1+MJFR13(pS129)ELISA测得的αSyn水平。捕捉抗体是第一个列出的抗体，检测抗体是第二个列出的抗体。各水平作为对总蛋白归一化的αSyn单体当量或pS129肽当量(MJFR1+MJFR13)表示(pg/mg蛋白)。统计学基于单因素方差分析，并相对对照组进行Dunnett多重比较。注意，未对寡聚体测定结果进行统计学分析，因为大部分对照样品<LLQ。*p<0.05。
图31是一系列线图，显示在对照、MSA、DLB和PD提取物中使用1E8.10+2E2.2寡聚体ELISA、MJFR14642+23H8.G3寡聚体ELISA、MJFR1+4B12总ELISA以及MJFR1+MJFR13(pS129)ELISA测得的αSyn水平。捕捉抗体是第一个列出的抗体，检测抗体是第二个列出的抗体。各水平作为对总蛋白归一化的αSyn单体当量或pS129肽当量(MJFR1+MJFR13)表示(pg/mg蛋白)。统计学基于单因素方差分析，并相对对照组进行Dunnett多重比较。注意，未对寡聚体测定结果进行统计学分析，因为大部分对照样品<LLQ。**p<0.01,***p<0.001。
图32是一系列线图，显示在对照、MSA、DLB和PD提取物中使用MJFR1+Syn303 N-末端ELISA和MJFR1+4D6 C-末端ELISA测得的αSyn水平。捕捉抗体是第一个列出的抗体，检测抗体是第二个列出的抗体。各水平作为对总蛋白归一化的αSyn单体当量(pg/mg蛋白)表示。未观察到显著差异(统计学基于单因素方差分析，并相对对照组进行Dunnett多重比较)。
图33是一系列线图，显示在对照、MSA、DLB和PD提取物中使用1E8+2E2寡聚体ELISA、MJFR14642+23H8寡聚体ELISA、MJFR1+4B12总ELISA和MJFR1+MJFR13(pS129)ELISA测得的αSyn水平的相关性。捕捉抗体是第一个列出的抗体，检测抗体是第二个列出的抗体。各水平作为αSyn单体当量或者pS129肽当量(MJFR1+MJFR13)表示。注意1E8+2E2,MJFR14642+23H8,MJFR1+4B12测定中的单位以ng/ml表示。虚线代表1:1相关性。
图34是一系列线图，显示在对照、MSA、DLB和PD提取物中使用MJFR1+4B12总ELISA、MJFR1+Syn303 N-末端ELISA、MJFR1+4D6 C-末端ELISA和MJFR1+MJFR13(pS129)ELISA测得的αSyn水平的相关性。捕捉抗体是第一个列出的抗体，检测抗体是第二个列出的抗体。各水平作为αSyn单体当量或者pS129肽当量(MJFR1+MJFR13)表示。注意MJFR1+4B12,MJFR1+Syn303,MJFR1+4D6测定中的单位以ng/ml表示。虚线代表1:1相关性。
图35是一系列线图，显示对照、MSA、DLB和PD提取物分离的高速离心沉淀中寡聚体的检测和回收。各水平使用1E8+2E2寡聚体ELISA和MJFR14642+23H8寡聚体ELISA测量，并且作为αSyn单体当量表示。捕捉抗体是第一个列出的抗体，检测抗体是第二个列出的抗体。虚线代表1:1相关。％回收基于起始的寡聚体水平，并且对于1E8+2E2测定示出。
图36显示从对照受试者(11-46)和MSA患者(11-46)脑组织样品产生的提取物分离的离心沉淀和上清液(上清)级分的免疫印迹。将脑提取物进行SEC，然后通过SDS-PAGE/免疫印迹分析级分5-14。每个印迹上还包括了αSyn单体标准品(泳道A)和分子量标准品。上清液级分中的αSyn大多数在第10级分中洗脱，对应于～60kDa的分子半径，并且通过SDS-PAGE/免疫印迹被解离为单体和切割片段。对照样品和MSA样品观察到了相似的结果。离心沉淀中的αSyn大部分在死体积(第6级分)中洗脱，对应于>670kDa的分子半径，通过SDS-PAGE/免疫印迹被解离为单体和切割片段。免疫印迹使用αSyn抗体4B12。
图37显示从对照、MSA、DLB和PD患者脑组织样品分离的脑提取物离心沉淀的免疫印迹。显示了<20kDa分子量区域的结果。样品使用αSyn抗体4B12、4D6、EP1536Y以及抗肌动蛋白抗体对照分析。
图38显示从对照、MSA、DLB和PD患者脑组织样品分离的脑提取物离心沉淀的免疫印迹。显示了30-40kDa分子量区域的结果。样品使用αSyn抗体Syn303、4B12、LB509、81A、4D6以及IgG抗体对照分析。
图39显示从对照、MSA、DLB和PD患者脑组织样品分离的脑提取物离心沉淀的免疫印迹。显示了600-100kDa分子量区域的结果。样品使用αSyn抗体Syn303、4B12、LB509、4D6以及IgG抗体对照分析。
图40是显示在经转导(AAV-hA53T-αSyn 3K MOI)的原代大鼠海马神经元中pS129αSyn的诱导的一系列线图。神经元在被提取和固定之前，用来自对照、PD、DLB和MSA脑提取物的脑提取物离心沉淀处理11日。通过高含量(HC)分析测量不溶性pS129信号，并且对PFF处理对照(10nM)归一化。使用对照提取物离心沉淀时检测到的信号与背景信号相似。将每种离心沉淀的HC信号的水平与利用1E8+2E2 ELISA测量得到的寡聚体信号相关联。各水平以αSyn单体当量的形式表示。
图41是显示来自MSA、进行性核上性麻痹及健康对照的人CSF样品的αSyn寡聚体(1E8+2E2和MJFR14642+23H8)与总αSyn(MJFR1+4B12)水平的一系列线图。捕捉抗体是列出的第一个抗体，检测抗体是列出的第二个抗体。在分析之前，CSF被稀释4倍(1E8+2E2和MJFR14642+23H8)及20倍(MJFR1+4B12)。数据以校正了稀释倍数和αSyn单体当量(pg/ml)的形式表示。LLQ定义为2x测定背景，标明了每个测定的稀释倍数校正的LLQ。MJFR1+4B12水平的均值和SD示于表中。
图42是显示来自MSA与健康对照的人CSF样品的αSyn寡聚体(1E8+2E2和MJFR14642+23H8)以及总aSyn(MJFR1+4B12)水平的一系列线图。在分析之前，CSF被稀释4倍(1E8+2E2和MJFR14642+23H8)及20倍(MJFR1+4B12)。数据以校正了稀释倍数和αSyn单体当量(pg/ml)的形式表示。LLQ定义为2x测定背景，标明了每个测定的稀释倍数校正的LLQ。MJFR1+4B12水平的均值和SD示于表中。
详细说明
本文描述了分离的抗体，特别是单克隆抗体，例如人单克隆抗体，其相比单体α-突触核蛋白优先结合寡聚α-突触核蛋白。在某些实施方案中，本文所述的抗体衍生自特定的重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR区。本文提供了分离的抗体，制备此类抗体的方法，免疫缀合物和包含此类抗体的双特异性分子，以及配制成含有抗体的药物组合物。本文还提供了使用抗体抑制α-突触核蛋白的不溶性聚集体的产生的方法。因此，本文所述的α-突触核蛋白抗体可用于多种治疗应用的治疗，包括例如路易体病和突触核蛋白病的治疗，以及诊断测定。
定义
为了本说明更容易被人理解，首先定义某些术语。在详细说明的全文中还会给出其他定义。
术语“α-突触核蛋白”和“αSyn”在本文中可互换使用，指一种140个氨基酸的多肽，具有下述氨基酸序列(野生型人α-突触核蛋白)：
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA(SEQID NO:1；GenBank登录号P37840)
这种蛋白具有三个公认的结构域：一个KTKE重复结构域，覆盖氨基酸1-61；一个NAC(非淀粉样蛋白组分)结构域，范围大致在氨基酸60-95；以及一个C末端酸性结构域，范围大致为氨基酸98-140。除非另外具体说明，否则α-突触核蛋白或其片段包括上述的天然人野生型氨基酸序列以及它们的定位基因变体。例如，还涵盖于路易体病相关的变体(例如E46K、A30P和A53T)。被诱导的突变E83Q、A90V、A76T，它们可增强α-突触核蛋白聚集，也可以单独地存在或者彼此组合存在，和/或与人等位基因变体E46K、A30P和A53T组合存在。
如本文所用的，“突触核蛋白病”是指这样的神经退行性病症，它们以神经元和胶质细胞组合α-突触核蛋白聚集体的异常积累的存在为特征，且包括，例如，帕金森病(PD)、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、多系统萎缩(MSA)、戈谢病(GD)、具有脑铁积累的神经变性(NBIA)、阿尔茨海默病(AD)、以及溶酶体贮积症(LSD)包括沙费利波综合征、亨特氏综合征、Tay-Sachs和Sandhoff病，以及尼曼匹克病C型。在神经元的细胞体或神经突中发现的α-突触核蛋白聚集体的累积分别称为路易体和路易神经突(Lewy Neurites)，并且是PD和DLB的病理学标志。在少突胶质细胞中发现的α-突触核蛋白(GCI)的胶质细胞质包涵体的存在是MSA的病理学标志。
“多系统萎缩”或“MSA”是一种以症状的组合为特征的神经变性性疾病；影响运动、血压和其他身体功能。MSA的症状在发作的分布和的严重程度方面人与人之间有所不同。因此，最初描述了三种不同的疾病来涵盖这一系列的症状：Shy-Drager综合征，纹状体神经变性(SD)和橄榄体脑小脑萎缩(OPCA)。
如本文所用的，术语“α-突触核蛋白寡聚体”是指两个或更多个α-突触核蛋白单体的聚集体，可具有一定范围内的分子量。通常，寡聚体被理解为与较不可溶的纤丝(fibrils)相比而言可溶的聚集物种类。据信，可溶性低聚物部分地包含α-突触核蛋白的所谓“可传播种类”，这样的种类是α-突触核蛋白病理学从细胞到细胞播散的原因。除非另有说明，否则“预形成的纤丝”或“PFF”是α-突触核蛋白寡聚体的一个种类，例如，如实施例3中所述制备的α-突触核蛋白寡聚体。PFF应理解为在有利于聚集和纤丝化的条件下，由重组人单体α-突触核蛋白制作得到。
如本文所用的，“单体/PFF结合比”是指抗α-突触核蛋白抗体对α-突触核蛋白单体的结合亲和力与该抗体对PFF的结合亲和力之比。大于1的比值表明与单体α-突触核蛋白相比更优先结合PFF。例如，如果抗体与单体α-突触核蛋白结合的EC50为291nM，与PFF结合的EC50为0.16nM，例如使用实施例3中描述的ELISA来测定，则该抗体的单体/PFF结合比为291/0.16＝1819。在一些实施方案中，可以使用除ELISA之外的测定来产生单体/PFF结合比。在一些实施方案中，使用实施例3中描述的方法制备PFF。在一些实施方案中，使用除PFF以外的α-突触核蛋白寡聚体来产生单体与寡聚体结合亲和力之比。
本文使用的术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。在一个实施方案中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。在某些天然存在的抗体中，重链恒定区由三个结构域CH1，CH2和CH3组成。在某些天然存在的抗体中，每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为：具有高度可变性的区域，称为互补决定区(CDR)，以及其中散在的保守性更高的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应器细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)，的结合。
抗体通常以高亲和力(由10-5M至10-11M或更小的解离常数(KD)反映)特异性结合其关联抗原。通常将大于约10-4M的任何KD视为指示非特异性结合。如本文所用的，“特异性结合”至抗原的抗体指以高亲和力(此意味着KD为10-7M或更小、优选10-8M或更小、更优选5×10-9M或更小、最优选介于10-8M与10-10M之间或更小)结合抗原及实质上相同抗原、但不以高亲和力结合无关抗原的抗体。如果抗原与给定抗原表现出高度的序列同一性，例如，如果它表现出至少80％，至少90％，优选至少95％，更优选至少90％，与给定抗原的序列至少97％，或甚至更优选至少99％的序列同一性，则抗原与给定抗原“基本上相同”。
免疫球蛋白可来自普遍已知的同种型中的任一者，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG及IgM。IgG同种型在某些物种中分成亚类：在人类中为IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，在小鼠中为IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3。免疫球蛋白(例如IgG1)存在若干异型，这些异型在至多少数个氨基酸中彼此不同。“抗体”举例而言包括天然及非天然抗体；单克隆及多克隆抗体；嵌合及人源化抗体；人及非人抗体；全合成抗体；及单链抗体。
如本文所用术语抗体的“抗原结合部分”指抗体的保持特异性结合抗原(例如，人α-突触核蛋白)的能力的一个或多个片段。这些“片段”的长度为，例如，介于约8个与约1500个氨基酸之间，适宜地介于约8个与约745个氨基酸之间，适宜地约8个至约300个、例如约8个至约200个氨基酸、或约10个至约50个或100个氨基酸。已显示，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。抗体的“抗原结合部分”这一术语内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种二价片段，包含两个在铰链区由二硫桥键连接的Fab片段；(iii)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；及(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)两个或更多个可视情况由合成接头接合的分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL及VH)是由各别的基因编码的，但其可使用重组方法通过合成接头接合在一起，该合成接头使其能够成为单一蛋白链(称作单链Fv(scFv))，其中VL及VH区配对形成单价分子；例如，参见Bird等人，(1988)Science 242:423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体亦意欲涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段系使用本领域技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式筛选片段是否有效用。抗原结合部分可通过重组DNA技术、或通过酶或化学裂解完整免疫球蛋白来产生。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见，例如，Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny etal.,J.Immunol.148,1547-1553(1992))。
如本文所用的，术语“单克隆抗体”指对抗体的特定表位或组合物展示单一结合特异性及亲和力的抗体，其中所有抗体皆对特定表位展示单一结合特异性及亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”指展示单一结合特异性且具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区(及任选地恒定区)的抗体或抗体组合物。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括自转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，其基因组包含与永生化细胞融合的人重链转基因及人轻链转基因。
如本文所用术语“重组人抗体”包括所有通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，例如(a)自对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或自其制备的杂交瘤分离的抗体；(b)自经转化以表达抗体的宿主细胞、例如自转染瘤分离的抗体；(c)自重组的组合人抗体文库分离的抗体；及(d)通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的方式制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体包含可变区及恒定区，其利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列，但包括在(例如)抗体成熟期间发生的后续重排及突变。如本领域已知的(例如参见Lonberg,(2005)NatureBiotech.23(9):1117-1125)，可变区含有抗原结合结构域，抗原结合结构域由多种基因编码，这些基因为形成对外来抗原具有特异性的抗体而重排。除重排外，可变区可通过多个单一氨基酸变化(称作体细胞突变或超突变)进一步修饰，以增加抗体对外来抗原的亲和力。恒定区将进一步因应于抗原发生变化(即，同种型切换)。因此，响应于抗原而经过重排且体细胞突变的编码轻链及重链免疫球蛋白多肽的核酸分子可不与初始核酸分子具有序列同一性，而是将实质上相同或类似(即，具有至少80％同一性)。
“人”抗体(HuMAb)指具有可变区的抗体，其中框架及CDR区二者皆源自人种系免疫球蛋白序列。此外，若抗体含有恒定区，则恒定区亦源自人种系免疫球蛋白序列。本文所述抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过活体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用术语“人抗体”并不意欲包括源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已移植至人框架序列上的抗体。术语“人”抗体及“完全人”抗体同义使用。
“人源化”抗体指非人抗体的CDR结构域外的一些、大部分或所有氨基酸经源自人免疫球蛋白的相应氨基酸置换的抗体。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR结构域外的一些、大部分或所有氨基酸经人免疫球蛋白的氨基酸置换，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或所有氨基酸未改变。可允许存在氨基酸的小的添加、缺失、插入、取代或修饰，只要其不消除抗体结合给定抗原的能力即可。“人源化”抗体保留类似于初始抗体的抗原特异性的抗原特异性。
“嵌合抗体”指可变区源自一个物种且恒定区源自另一物种的抗体，例如可变区源自小鼠抗体且恒定区源自人抗体的抗体。
如本文所用的，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD和IgE抗体)。
“同种异型”是指特定同种型组内的天然存在的变体，这些变体在几个氨基酸中不同(参见，例如，Jefferis等人(2009)mAbs 1:1)。本文描述的抗体可以是任何同种异型。如本文所用的，称为“IgG1f”或“IgG1.3f”同种型的抗体分别是属于同种异型“f”的IgG1和无效应器的IgG1.3抗体，即根据如Kabat中所示的EU索引具有L234A，L235E和G237A，例如，如SEQ ID NO:119所示。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
“分离的抗体”，如本文所用的，意指这样的抗体，其基本上不含其它具有不同抗原特异性的抗体(例如，特异性结合α-突触核蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合α-突触核蛋白之外的抗原的抗体)。不过，特异性结合α-突触核蛋白的表位的抗体可能可以与来自不同物种的其他α-突触核蛋白蛋白(例如来自小鼠或大鼠的α-突触核蛋白)具有交叉反应性。
“效应器功能”指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用或自其产生的生物化学事件。示例性“效应器功能”包括C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应器功能(例如ADCC及抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP))及细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调。此类效应器功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合。
“Fc受体”或“FcR”是结合免疫球蛋白的Fc区的受体。结合IgG抗体的FcR包含FcγR家族的受体，包括此类受体的等位基因变体及选择性剪接形式。FcγR家族由三种活化受体(小鼠中为FcγRI、FcγRIII及FcγRIV；人类中为FcγRIA、FcγRIIA及FcγRIIIA)及一种抑制受体(FcγRIIB)组成。大多数先天效应细胞类型共表达一种或多种活化FcγR及抑制FcγRIIB，而天然杀伤(NK)细胞选择性表达一种活化Fc受体(小鼠中为FcγRIII且人类中为FcγRIIIA)而不表达小鼠及人类中的抑制FcγRIIB。人类IgG1结合大部分人类Fc受体且关于其结合的活化Fc受体的类型认为其等效于鼠类IgG2a。
“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc结构域”或“Fc”系指介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合(包括结合位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体或经典补体系统的第一组分(C1q))的抗体的重链的C-末端区。因此，Fc区包含排除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)的抗体的恒定区。在IgG、IgA及IgD抗体同种型中，Fc区包含两个相同的蛋白片段，衍生自该抗体的两条重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定结构域；IgM及IgE Fc区在每一多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域Cγ2及Cγ3及Cγ1与Cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变，但通常将人类IgG重链Fc区定义为自位置C226或P230处的氨基酸残基(或该两个氨基酸之间的氨基酸)延伸至重链的羧基-末端，其中编号系根据如Kabat中的EU索引。人类IgGFc区的CH2结构域自约氨基酸231延伸至约氨基酸340，而CH3结构域位于Fc区中的CH2结构域的C-末端侧上，即其自IgG的约氨基酸341延伸至约氨基酸447。如本文所用的，Fc区可为天然序列Fc(包括任何异型变体)或变体Fc(例如，非天然Fc)。Fc亦可指与包含Fc的蛋白多肽(例如“包含Fc区的结合蛋白”(亦称作“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘附素)))分离或在其背景下的此区。
术语“表位”或“抗原决定簇”系指免疫球蛋白或抗体特异性结合抗原上的位点。表位可自通过蛋白质的三级折叠(通常构象表位)并置的邻接氨基酸(通常线性表位)或非邻接氨基酸形成。在暴露于变性溶剂时，通常但不总是保留自邻接氨基酸形成的表位，而在用变性溶剂处理时通常损失通过三级折叠形成的表位。在独特空间构象中，表位通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定由给定抗体结合表位的方法(即表位定位)已为本领域熟知，且包括(例如)免疫印迹及免疫沉淀测定法，其中测试重叠或邻接的肽与给定抗体的反应性。确定表位的空间构象的方法包括本领域现有技术及本文所述那些，例如，x射线结晶学及2维核磁共振及HDX-MS(例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris编辑，(1996))。
术语“表位定位”或“表位作图”指鉴定抗体-抗原识别的分子决定簇的方法。
术语“结合相同表位”在提及两种或更多种抗体时，意指各抗体结合相同的氨基酸残基区段，如通过给定方法所测定的。确定抗体与本文所述抗体是否结合“α-突触核蛋白上的相同表位”的技术包括，例如，表位定位方法，例如抗原:抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供表位的原子拆分及氢/氘交换质谱(HDX-MS)。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变化形式的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰所致的结合损失经常被视为可指示表位组分。另外，亦可使用表位定位的计算组合方法。此类方法取决于目标抗体自组合噬菌体展示肽文库亲和分离特异性短肽的能力。预计具有相同的VH及VL或相同CDR1、2及3序列的抗体结合相同表位。
“与另一抗体竞争结合靶标”的抗体指抑制(部分或完全)另一抗体与靶标结合的抗体。可使用已知竞争实验确定两个抗体是否彼此竞争结合靶标，即一个抗体是否抑制另一抗体与靶标结合及其抑制程度。在某些实施方案中，抗体与另一抗体竞争靶标结合且将该结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。竞争测定可如以下中所述地进行：例如，Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harb Protoc；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277，或“Using Antibodies”的第11章，Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA 1999。竞争抗体结合相同表位、重叠表位或毗邻表位(例如，如由立体位阻所证明的)。
其他竞争性结合测定法包括：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心式竞争测定(参见Stahli等人，Methods in Enzymology 9:242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人，J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记的测定、固相直接标记的夹心式测定(参见Harlow及Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人，Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176:546(1990))；及直接标记的RIA。(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32:77(1990))。
如本文所用术语“特异性结合”(“specific binding”)、“选择性结合”(“selective binding”)、“选择性结合”(“selectively binds”)及“特异性结合”(“specifically binds”)系指结合预定抗原上的表位的抗体。通常，抗体(i)在通过(例如)在BIACORE 2000仪器中使用预定抗原作为分析物及抗体作为配体的表面等离子共振(SPR)技术测定时，以约小于10-7M、例如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的平衡解离常数(KD)结合，或抗体对抗原阳性细胞的Scatchard分析，及(ii)较其与除预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的结合亲和力大至少两倍的亲和力结合预定抗原。
如本文所用的术语“k缔合”或“ka”欲指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用的术语“k解离”或“kd”欲指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。本文所用术语“KD”欲指解离常数，其系自kd对ka的比率(亦即kd/ka)获得且以摩尔浓度(M)表示。可使用业内充分确立的方法测定抗体的KD值。测定抗体的KD的优选方法系通过使用表面等离子共振、优选使用生物传感器系统(例如系统)或流式细胞术及Scatchard分析。
术语“EC50”在使用抗体或其抗原结合片段的体外或体内分析的上下文中指诱导系最大反应的50％的反应、即介于最大反应与基线之间的一半的抗体或其抗原结合部分的浓度。
“多肽”指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，其中链的长度无上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可含有例如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键形成等修饰。“蛋白质”可包含一种或多种多肽。
如本文所用术语“核酸分子”意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cDNA。
亦提供本文中所述的序列的“保守序列修饰”，即，不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸及氨基酸序列修饰。此类保守序列修饰包括保守核苷酸及氨基酸取代、以及核苷酸及氨基酸添加及缺失。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基经具有类似侧链的氨基酸残基置换者。本领域已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族。此类家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗OX40抗体中预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基置换。鉴别不消除抗原结合的核苷酸及氨基酸保守取代的方法为本领域所熟知(例如，参见Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；及Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997))。
对于核酸而言，术语“实质同源性”指示，两个核酸或其指定序列在最优选比对及比较(其中适当插入或缺失核苷酸)时有至少约80％的核苷酸、通常至少约90％至95％且更佳至少约98％至99.5％的核苷酸同一。或者，当区段将在选择性杂交条件下与链的互补物杂交时存在实质同源性。
对于多肽而言，术语“实质同源性”指示，两个多肽或其指定序列在最优选比对及比较(其中适当插入或缺失氨基酸)时有至少约80％的氨基酸、通常至少约90％至95％且更优选至少约98％至99.5％的氨基酸同一。
两个序列之间的同一性百分比是该两个序列享有的相同位置数的函数(即同源性％＝同一位置数/总位置数乘以100)，其中考虑为达成两个序列最佳比对而需要引入的空位数及各空位长度。两个序列之间的序列比较及同一性百分比测定可使用数学算法来完成，如下文非限制性实例中所述的。
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用GCG软件包(可于http://www.gcg.com获得)中的GAP程序使用NWSgapdna.CMP矩阵及40、50、60、70或80的空位权重及1、2、3、4、5或6的长度权重来测定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989))使用PAM120权重残基表来测定，该算法已纳入ALIGN程序(2.0版)中，空位长度罚分为12且空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵来确定，该算法已纳入GCG软件包(可于http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，且空位权重为16、14、12、10、8、6或4且长度权重为1、2、3、4、5或6。
本文所述核酸及蛋白序列可进一步用作“查询序列”以针对公开数据库实施搜索以(例如)鉴定相关序列。此类搜索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程序(2.0版)实施。BLAST核苷酸搜索可利用NBLAST程序实施(评分＝100，字长＝12)以获得与本文所述核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可利用XBLAST程序实施(评分＝50，字长＝3)以获得与本文所述蛋白质分子同源的氨基酸序列。出于比较目的，为获得加空位比对，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述来利用Gapped BLAST。在利用BLAST及Gapped BLAST程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST及NBLAST)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
此类核酸可存在于全细胞中，存在于细胞裂解物中，或以部分纯化或实质上纯的形式存在。当通过标准技术实施纯化以清除其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如染色体的其他部分)或蛋白质)时，核酸是“分离的”或“实质上纯化的”，此类标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳及本领域熟知的其他方法。参见F.Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishingand Wiley Interscience,New York(1987)。
可根据标准技术使核酸(例如cDNA)突变以提供基因序列。对于编码序列而言，此类突变可如期望的那样影响氨基酸序列。具体而言，涵盖与本文所述的天然V、D、J序列、恒定序列、转换序列及其他此类序列实质上同源或自它们衍生的DNA序列(其中“衍生”表示序列相同或者自其它序列修饰)。
如本文所用术语“载体”指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，其指额外DNA区段可连接至其中的环形双链DNA环。另一类载体为病毒载体，其中额外DNA区段可连接至病毒基因组中。某些载体能够在已将其引入其中的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞中时整合至该宿主细胞的基因组中，并藉此随宿主基因组一同复制。此外，某些载体能够引导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称作“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体经常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”与“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，亦包括可起等效功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒及腺伴随病毒)。
如本文所用术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)欲指包含在细胞中非天然存在的核酸的细胞，且可以是其中已经引入了重组表达载体的细胞。应了解，这些术语不仅欲指特定主题细胞，而且亦指此细胞的后代。由于突变或环境影响可使后续各代发生某些改变，因此，此后代实际上可能与亲本细胞不同但仍包括于本文所用术语“宿主细胞”的范畴内。
如本文所用的，术语“抗原”指任何天然或合成免疫原性物质，例如蛋白质、肽或半抗原。抗原可以是α-突触核蛋白或其片段。
如本文所用的，术语“连接”指两个或更多个分子的缔合。连接可为共价的或非共价的。连接亦可是基因上的(即，重组融合)。此类连接可使用多种本领域公认的技术(例如化学偶联及重组蛋白产生)来达成。
如本文所用，“施用”指使用本领域普通技术人员已知的各种方法及递送系统中的任一者向受试者物理引入包含治疗剂的组合物。本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊柱或其他非经肠施用途径(例如通过注射或输注)。如本文所用片语“非经肠施用”意指除经肠及局部施用以外的施用模式，通常通过注射，且包括(但不限于)静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、经囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注、以及体内电穿孔。或者，本文所述抗体可经由非经肠途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如经鼻内、经口、经阴道、经直肠、经舌下或经局部。施用亦可(例如)实施一次、复数次及/或在一个或多个延长时段内实施。
如本文中使用的，术语“治疗”或“处理”指以反转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症、病情或与疾病有关的生化标记的发作、进展、发展、严重程度或复发为目的而对受试者进行的干预或处理，或将活性剂给予受试者。治疗可以是对于患有疾病的受试者进行，也可以对没有疾病的受试者进行(例如为了预防)。
术语“有效剂量”(effective dose或effective dosage)定义为足以达到，或者至少部分达到期望的效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”，是药物单独使用或与另一种治疗剂联合使用时，任何可促进疾病衰退(表现为疾病症状严重程度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加、或免遭罹患疾病所致的损害或失能)的量。药物的治疗有效量或剂量包括了“预防有效量”或“预防有效剂量”，这是指药物单独给药或与另一种治疗剂联合给药至处于疾病发展或遭受疾病复发的风险中的受试者时，任何可抑制疾病发病或复发的量。治疗剂促进疾病衰退的能力可利用熟练的从业者已知的各种方法来评估，诸如在临床试验期间的人受试者中，在预示人中效力的动物模型系统中，或通过在体外测定法中测定所述药剂的活性。
如本文中使用的，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本文中描述的方法和组合物可以用于治疗患有以脑中路易体或者聚集的α-突触核蛋白的存在为特征的疾病的受试者。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人类或其他哺乳动物受试者。
如果受试者具有至少一种已知的风险因子(例如遗传性、生化性、家族史、情景暴露(situational exposure)，所述风险因子使得具有该风险因子的个体相比于不具有该风险因子的个体具有统计学上显著地更大的发生某种疾病的风险，则称该个体处于该疾病的增加的风险中。
术语“症状”(symptom)是指由患者感知的疾病的主观证据，例如改变的步态。“体征”(sign)是由医生观察到的疾病的客观证据。
统计学上显著意味着p≤0.05。
术语“样品”指自患者或受试者采取的组织、体液或细胞(例如前述任意者的级分)。通常，所述组织或细胞将会从患者被移除，但也想到了体内诊断。
如本文所用的，术语“约”意指明示的值加或减10％。
如本文中所用的，术语“和/或”包括相关的列举的项目的任何及全部组合。
如在发明描述及随附的权利要求书中使用的，单数形式“一个”“该”也意在包括复数形式，除非上下文另有明示。
在下面各节中更详细地描述本公开的不同方面。
I.抗α-突触核蛋白(αSyn)抗体
本文描述了以特定的功能特征或性质为特征的抗体，例如分离的抗体，例如全人分离抗体。例如，抗体特异性地结合人α-突触核蛋白，及单体人α-突触核蛋白和寡聚体人α-突触核蛋白二者。此外，抗体可以与来自一种或多种非人物种的α-突触核蛋白(例如小鼠或大鼠α-突触核蛋白)交叉反应，或突触核蛋白的不同同种型(例如β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白)交叉反应。
此外，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体展现下列功能性质中的一种或多种：
(a)结合小鼠和大鼠α-突触核蛋白；
(b)结合β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白；
(c)对α-突触核蛋白寡聚体(例如PFF)具有比对α-突触核蛋白单体更高的亲和力；
(d)抑制α-突触核蛋白寡聚体(例如PFF)诱导的可溶性或不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的生成；
(e)从PFF和/或脑裂解物中耗竭产生可溶性或不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的分子种类，所述PFF和/或脑裂解物是从脑中具有α-突触核蛋白的病理性聚集体的患者制备的；
(f)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第123-128位氨基酸的全部或一部分；
(g)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第125-128位氨基酸的全部或一部分；
(h)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-139位氨基酸的全部或一部分；
(i)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第119-126位氨基酸的全部或一部分；和
(j)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-138位氨基酸的全部或一部分。
在一些实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是PFF。在一些实施方案中，PFF是使用实施例3描述的方法制备的。在一些实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是可溶性的。在其他实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是不溶性的。在一些实施方案中，所述抗体抑制可溶性或不溶性的丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体的生成。在其他实施方案中，所述抗体抑制不含有丝氨酸-129磷酸化的α-突触核蛋白的可溶性或不溶性α-突触核蛋白聚集体的生成。
本文所述的抗α-突触核蛋白抗体与α-突触核蛋白单体相比优先与α-突触核蛋白寡聚体(例如，PFF)结合，这可以表示对α-突触核蛋白单体的结合亲和力与对α-突触核蛋白单体的结合亲和力之比，在本文中也称为α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白寡聚体结合比。当PFF是α-突触核蛋白寡聚体种类时，该比称为α-突触核蛋白单体/PFF结合比，或“M/P比”，并且可以如实施例3中所述地测定。
在一些实施方案中，本文中所述的抗α-突触核蛋白抗体的M/P比为10或更高，20或更高，30或更高，40或更高，50或更高，75或更高，100或更高，150或更高，200或更高，250或更高，300或更高，350或更高，400或更高，450或更高，500或更高，600或更高，700或更高，800或更高，900或更高，1000或更高，1500或更高，2000或更高，2500或更高，3000或更高，3500或更高，4000或更高，5000或更高，6000或更高，7000或更高，8000或更高，9000或更高，10000或更高，10至10000、50至10000、100至10000、500至10000、700至10000、1500至10000、3000至10000、5000至10000、7000至10000、100至7000、500至7000、700至7000、1500至7000、3000至7000、5000至7000、100至5000、500至5000、700至5000、700至1500、700至3000、700至5000、100至3000、500至3000、700至3000、1500至3000、100至1500、500至1500、700至1500、100至700、500至700或100至500。在一些实施方案中，所述抗体对单体和寡聚α-突触核蛋白的亲和力是使用ELISA(例如，如实施例3所述的)计算M/P比来确定的。
在一些实施方案中，所述抗α-突触核蛋白抗体以100nM以上的EC50结合单体α-突触核蛋白，并且以2nM以下的EC50结合PFF。在一些实施方案中，所述抗α-突触核蛋白抗体以500nM以上的EC50结合单体α-突触核蛋白，并且以1nM以下的EC50结合PFF。在一些实施方案中，所述抗α-突触核蛋白抗体以500nM以上的EC50结合单体α-突触核蛋白，并且以0.5nM以下的EC50结合PFF。在一些实施方案中，所述抗α-突触核蛋白抗体以500nM以上的EC50结合单体α-突触核蛋白，并且以0.3nM以下的EC50结合PFF。在一些实施方案中，所述抗α-突触核蛋白抗体以500nM以上的EC50结合单体α-突触核蛋白，并且以0.2nM以下的EC50结合PFF。在一些实施方案中，所述抗α-突触核蛋白抗体以700nM以上的EC50结合单体α-突触核蛋白，并且以1nM以下的EC50结合PFF。在一些实施方案中，所述抗α-突触核蛋白抗体以700nM以上的EC50结合单体α-突触核蛋白，并且以0.5nM以下的EC50结合PFF。在一些实施方案中，所述抗α-突触核蛋白抗体以700nM以上的EC50结合单体α-突触核蛋白，并且以0.3nM以下的EC50结合PFF。在一些实施方案中，所述抗α-突触核蛋白抗体以700nM以上的EC50结合单体α-突触核蛋白，并且以0.2nM以下的EC50结合PFF。在一些实施方案中，对寡聚体和单体α-突触核蛋白的EC50值是使用ELISA，例如，如实施例3所述地测定的。
在一些实施方案中，通过ELISA(例如，如实施例3所述)测定，本文所述的抗α-突触核蛋白抗体以50nM以下，40nM以下，30nM以下，20nM以下，10nM以下，5nM以下，4nM以下，3nM以下，2nM以下，1nM以下，0.9nM以下，0.8nM以下，0.7nM以下，0.6nM以下，0.5nM以下，0.4nM以下，0.3nM以下，0.2nM以下，0.1nM以下，0.07nM以下，0.05nM以下，0.03nM以下，或0.01nM以下的EC50结合寡聚α-突触核蛋白，例如PFF(例如，如实施例3所述地制备的PFF)。
在一些实施方案中，本文所述的抗α-突触核蛋白抗体可抑制PFF诱导的α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的生成。相应地，在一些实施方案中，所述抗体以0.2nM以下，0.15nM以下，0.1nM以下，0.09nM以下，0.08nM以下，0.07nM以下，0.06nM以下，0.05nM以下，0.04nM以下，0.03nM以下，0.02nM以下，0.01nM以下，或0.005nM以下的IC50抑制PFF诱导的α-突触核蛋白丝氨酸-129磷酸化，例如使用实施例10所描述的高含量免疫荧光测定所评估的。
在一些实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体可耗竭PFF和/或脑裂解物的诱导α-突触核蛋白丝氨酸-129磷酸化的活性，所述PFF和/或脑裂解物是自在脑中具有路易体或α-突触核蛋白聚集的患者制备的。
在一些实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体可以结合α-突触核蛋白的C末端区域的表位。例如，抗α-突触核蛋白抗体可以结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸123-128的全部或部分，例如通过该抗体对人α-突触核蛋白的重叠肽的结合而确定的(见实施例2)。在另一个实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体可以结合人α-突触核蛋白(SEQID NO:1)的氨基酸125-128的全部或部分，例如通过该抗体对人α-突触核蛋白的重叠肽的结合而确定的(见实施例2)。在另一个实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体可以结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸130-139的全部或部分，例如通过该抗体对人α-突触核蛋白的重叠肽的结合而确定的(见实施例2)。在另一个实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体可以结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸119-126的全部或部分，例如通过该抗体对人α-突触核蛋白的重叠肽的结合而确定的(见实施例2)。在另一个实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体可以结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸130-138的全部或部分，例如通过该抗体对人α-突触核蛋白的重叠肽的结合而确定的(见实施例2)。
展现一种或多种上文所述的功能性质(例如生物化学活性、免疫化学活性、细胞活性、生理活性或其他生物学活性，等等)的抗体，如根据本领域已知的和本文中描述的方法学所确定的，应当理解为涉及具体的活性相对于在没有抗体存在下(例如，或者当存在具有无关的特异性的对照抗体存在时)的统计学上显著的差异。优选地，所测得的参数的抗α-突触核蛋白抗体诱导的增加为至少10％的增加，更优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％(即2倍)、3倍、5倍或10倍的增加。反过来，所测得的参数的抗α-突触核蛋白抗体诱导的减少是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的减少。
用于评估抗体对α-突触核蛋白(例如，单体α-突触核蛋白和寡聚体α-突触核蛋白)的结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如ELISA，Western印迹和RIA。在实施例部分详细描述了合适的测定法。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法评估，例如通过Biacore分析。评估抗体对α-突触核蛋白功能特性的影响的测定法在下文和实施例部分中进一步详细描述。
在某些实施方案中，本文描述的α-突触核蛋白抗体不是天然抗体或不是天然存在的抗体。
II.示例性的抗α-突触核蛋白(αSyn)抗体
本文中具体描述的抗体是这样的抗体，例如：单克隆抗体，其具有如实施例1所述分离和结构表征的抗体7A10、7A10-T93A、11H11(11H11-1和11H11-2)、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8(23H8-1、23H8-2、23H8-3)和1E8的CDR和/或可变区序列，以及与它们的可变区或CDR序列具有至少80％同一性(例如至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性)的抗体。7A10、7A10-T93A、11H11(11H11-1和11H11-2)、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8和1E8的VH氨基酸序列分别在SEQ ID NO:8、18、31、43、53、63、73、83、99和113中列出。7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8的VL氨基酸序列分别在SEQ ID NO:9、19、32、33、44、54、64、74、84、100、101、102和114中列出。
因此，本文提供了分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链可变区，其中重链可变区包含选自SEQ ID NO:8、18、31、43、53、63、73、83、99和113的氨基酸序列。
本文还提供了分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链可变区，其中轻链可变区包含选自SEQ ID NO:9、19、32、33、44、54、64、74、84、100、101、102和114的氨基酸序列。
本文还提供了分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含
(a)分别包含SEQ ID NO:8和9的重链和轻链可变区序列；
(b)分别包含SEQ ID NO:18和19的重链和轻链可变区序列；
(c)分别包含SEQ ID NO:31和32的重链和轻链可变区序列；
(d)分别包含SEQ ID NO:31和33的重链和轻链可变区序列；
(e)分别包含SEQ ID NO:43和44的重链和轻链可变区序列；
(f)分别包含SEQ ID NO:53和54的重链和轻链可变区序列；
(g)分别包含SEQ ID NO:63和64的重链和轻链可变区序列；
(h)分别包含SEQ ID NO:73和74的重链和轻链可变区序列；
(i)分别包含SEQ ID NO:83和84的重链和轻链可变区序列；
(j)分别包含SEQ ID NO:99和100的重链和轻链可变区序列；
(k)分别包含SEQ ID NO:99和101的重链和轻链可变区序列；
(l)分别包含SEQ ID NO:99和102的重链和轻链可变区序列；和
(m)分别包含SEQ ID NO:113和114的重链和轻链可变区序列。
抗α-突触核蛋白抗体可包含7A10(以及7A10-T93A、它与7A10具有相同的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列)、11H11(11H11-1和11H11-2具有共同的VH但不同的VL)、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8(23H8-1、23H8-2、23H8-3，具有共同的VH但不同的VL)和1E8，或其组合的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3。7A10(以及7A10-T93A)、11H11、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8和1E8的VH CDR1的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:2、22、37、47、57、67、77、87和107中列出。7A10(和7A10-T93A)、11H11、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8和1E8的VH CDR2的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:3、23、38、48、58、68、78、88和108中列出。7A10(和7A10-T93A)、11H11、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8和1E8的VH CDR3的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、24、39、49、59、69、79、89和109中列出。7A10(和7A10-T93A)、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8的VL CDR1的氨基酸序列分别在SEQID NO:5、25、28、40、50、60、70、80、90、93、96和110中列出。7A10(和7A10-T93A)、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8的VL CDR2的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:6、26、29、41、51、61、71、81、91、94、97和111中列出。7A10(和7A10-T93A)、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8的VLCDR3的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、27、30、42、52、62、72、82、92、95、98和112中列出。CDR区域是利用Kabat系统划分的(Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health和HumanServices,NIH Publication No.91-3242)。
鉴于这些抗体结合α-突触核蛋白，且抗原结合亲和力主要是由CDR1、2、3区域提供的，因此可以将VH CDR1、2、3序列和VL CDR1、2、3序列“混合匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以混合和匹配，虽然每个抗体必须含有VH CDR1、2、3和VL CDR1、2、3)，以创造本文中所述的其他抗α-突触核蛋白结合分子。此类“混合匹配”抗体的α-突触核蛋白结合可以使用如上所述的、以及实施例部分中描述的结合测定法(例如ELISA)来测试。优选地，当混合匹配VHCDR序列时，将来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列用结构上相似的CDR序列替换。类似地，当混合匹配VL CDR序列时，优选将来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列用结构上相似的CDR序列替换。本领域技术人员容易想到，用来自本文就单克隆抗体7A10(和7A10-T93A)、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8公开的CDR序列的结构上类似地序列替换一个或多个VH和/或VL CDR区域序列，可以创造新的VH和VL序列。
因此，本文提供了分离的抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)包含选自SEQ ID NO:2、22、37、47、57、67、77、87和107的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
(b)包含选自SEQ ID NO:3、23、38、48、58、68、78、88和108的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
(c)包含选自SEQ ID NO:4、24、39、49、59、69、79、89和109的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
(d)包含选自SEQ ID NO:5、25、28、40、50、60、70、80、90、93、96和110的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
(e)包含选自SEQ ID NO:6、26、29、41、51、61、71、81、91、94、97和111的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
(f)包含选自SEQ ID NO:7、27、30、42、52、62、72、82、92、95、98和112的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
其中该抗体特异性结合人α-突触核蛋白。
在一个实施方案中，抗体包含重链和轻链可变区，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3包含：
(a)SEQ ID NO:2-4；
(b)SEQ ID NO:22-24；
(c)SEQ ID NO:37-39；
(d)SEQ ID NO:47-49；
(e)SEQ ID NO:57-59；
(f)SEQ ID NO:67-69；
(g)SEQ ID NO:77-79；
(h)SEQ ID NO:87-89；或
(i)SEQ ID NO:107-109，
其中所述抗体特异性结合人α-突触核蛋白。
在一个实施方案中，抗体包含重链和轻链可变区，其中轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3包含：
(a)SEQ ID NO:5-7；
(b)SEQ ID NO:25-27；
(c)SEQ ID NO:28-30；
(d)SEQ ID NO:40-42；
(e)SEQ ID NO:50-52；
(f)SEQ ID NO:60-62；
(g)SEQ ID NO:70-72；
(h)SEQ ID NO:80-82；
(i)SEQ ID NO:90-92；
(j)SEQ ID NO:93-92
(k)SEQ ID NO:96-98；或
(l)SEQ ID NO:110-112，
其中所述抗体特异性结合人α-突触核蛋白。
在一个特定的实施方案中，抗体包含重链和轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:2-4，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:5-7；
(b)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:22-24，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:25-27；
(c)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:22-24，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:28-30；
(d)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:37-39，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:40-42；
(e)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47-49，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:50-52；
(f)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:57-59，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:60-62；
(g)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:67-69，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:70-72；
(h)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:77-79，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:80-82；
(i)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:87-89，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:90-92；
(j)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:87-89，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:93-95；
(k)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:87-89，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:96-98；或
(l)重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:107-109，且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:110-112，
其中所述抗体特异性结合人α-突触核蛋白。
本文中描述的VH结构域或其一个或多个CDR可以与恒定结构域连接以形成重链，例如全长重链。类似地，本文中描述的VL结构域或其一个或多个CDR可以与恒定结构域连接以形成轻链，例如全长轻链。全长重链[除了C末端的赖氨酸(K)或者除了C末端的甘氨酸和赖氨酸(GK)之外，它们可能不存在]与全长轻链结合形成全长抗体。
本文所述的VH可以融合于人IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的恒定域，该恒定域可以是天然存在的或者是修饰的，例如如本文进一步描述的。例如，VH域可包含本文所述的任何VH的氨基酸序列，以及与之融合的下述人IgG1氨基酸序列：
人IgG1恒定域也可以是同种异型体的恒定域。例如，IgG1的同种异型体包含R107K、E189D和M191L(上文加下划线)。在全长重链中，这些氨基酸取代编号为R214K、E356D和M358L。
本文中描述的VL域可以与人κ或λ轻链的恒定域融合。例如，VL域可包含任何本文所述的VL域的氨基酸序列以及与之融合的下述人IgG1κ轻链氨基酸序列：
在某些实施方案中，重链恒定区在C末端包含赖氨酸或另一氨基酸。在某些实施方案中，重链恒定区在C末端缺少一个或多个氨基酸，并且具有，例如，C末端氨基酸序列LSPG(SEQ ID NO:127)或LSP。
本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体的示例性重链和轻链的氨基酸序列在表22中列出。
在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ IDNO:10、20、34、45、55、65、75、85、103和115中显示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体包含重链和轻链，其中轻链包含SEQ IDNO:11、21、35、36、46、56、66、76、86、104、105、106和116中显示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体包含重链和轻链，其中重链和轻链包含选自下组的氨基酸序列：
(a)10和11，
(b)20和21，
(c)34和35，
(d)34和36，
(e)45和46，
(f)55和56，
(g)65和66，
(h)75和76，
(i)85和86，
(j)103和104，
(k)103和105，
(l)103和106，和
(m)115和116。
包含与表22中列出的任何重链或轻链(或它们的可变区)，例如SEQ ID NO:10、11、20、21、34、35、36、45、46、55、56、65、66、75、76、85、86、103、104、105、106、115和116，至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％或70％相同的氨基酸序列的重链和轻链，可以用来形成具有期望的特征，例如本文中进一步描述的那些特征的抗α-突触核蛋白抗体。示例性的变体是包含同种异型体变异，例如恒定域中的同种异型体变异，和/或可变区或恒定区中的突变，例如本文公开的突变者。包含与表22所示的任何重链或轻链(或它们的可变区)相差至多1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸(通过取代、添加或缺失)的氨基酸序列的重链和轻链可以用来形成具有期望的性质、例如本文进一步描述的那些性质的抗α-突触核蛋白抗体。
在多个实施方案中，上述的抗体展现下述功能性质中的一种或多种：
(a)结合小鼠和大鼠α-突触核蛋白；
(b)结合β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白；
(c)对α-突触核蛋白寡聚体(例如PFF)具有比对α-突触核蛋白单体更高的亲和力；
(d)抑制α-突触核蛋白寡聚体(例如PFF)诱导的不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的生成；
(e)从PFF和/或脑裂解物中耗竭产生可溶性或不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的分子种类，所述PFF和/或脑裂解物是从脑中具有α-突触核蛋白的病理性聚集体的患者制备的；
(f)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第123-128位氨基酸的全部或一部分；
(g)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第125-128位氨基酸的全部或一部分；
(h)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-139位氨基酸的全部或一部分；
(i)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第119-126位氨基酸的全部或一部分；和
(j)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-138位氨基酸的全部或一部分。
在一些实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是PFF。在一些实施方案中，PFF是使用实施例3描述的方法制备的。在一些实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是可溶性的。在其他实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是不溶性的。
这样的抗体包括，例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在一个实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体结合人α-突触核蛋白的下述序列的全部或一部分(SEQ ID NO:1)：
EAYEMP(SEQ ID NO:121)，
对应人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基123-128。
在另一个实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的下述序列的全部或一部分：
YEMP(SEQ ID NO:122)，
对应人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基125-128。
在另一个实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的下述序列的全部或一部分：
EEGYQDYEPE(SEQ ID NO:124)，
对应人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基130-139。
在另一个实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的下述序列的全部或一部分：
DPDNEAYE(SEQ ID NO:125)，
对应人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基119-126。
在另一个实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的下述序列的全部或一部分：
EEGYQDYEP(SEQ ID NO:123)，
对应人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基130-138。
还提供了这样的抗α-突触核蛋白抗体，该抗体与包含如本文所述的CDR或可变区、例如7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8的CDR或可变区的抗α-突触核蛋白抗体竞争对α-突触核蛋白的结合。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体将7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8中的任一者对人α-突触核蛋白(例如单体α-突触核蛋白或寡聚体α-突触核蛋白)抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。就竞争性抗体而言，可以使用本领域中已知的标准结合测定法(例如，竞争性ELISA测定法)，基于它们竞争性抑制对α-突触核蛋白的结合来鉴定。
本文还提供了这样的抗α-突触核蛋白抗体，该抗体与包含如本文所述的CDR或可变区、例如7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8的CDR或可变区的抗α-突触核蛋白抗体结合α-突触核蛋白上相同的表位。用于确定抗体是否与本文描述的抗体结合α-突触核蛋白上的相同表位的方法包括，例如，表位作图方法，监测抗体与抗原片段的结合或抗原的突变变异，其中由于抗原序列中的氨基酸残基的修饰引起的结合丧失被认为是表位组分的指示(例如，丙氨酸扫描)；基于MS的蛋白质足迹和评估感兴趣的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特异性短肽(或者处于天然的三维构象中，或者是变性形式)的能力。
本文公开的抗体包括所有已知形式的抗体和具有抗体样特性的其他蛋白质支架。例如，抗体可以是人抗体，人源化抗体，双特异性抗体，免疫缀合物，嵌合抗体或具有抗体样特性的蛋白质支架，例如纤连蛋白或锚蛋白重复序列。抗体还可以是Fab，Fab'2，scFv，avimer，纳米抗体或结构域抗体。抗体还可以具有任何同种型，包括以下任何同种型：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAsec，IgD和IgE。IgG抗体是优选的。可以使用标准重组DNA技术从VH和VL序列，以及与可变区序列可操作连接的编码所需恒定区序列的核酸连接制备全长抗体。
III具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链。
如本文所用的，如果人抗体的可变区获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统，则人抗体包含是特定种系序列的“产物”或“衍生自”所述特定种系序列的重链和轻链可变区。此类系统包括用感兴趣的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或用感兴趣的抗原筛选噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。对于是人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体，可以通过将该人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择序列上与人抗体的序列最接近(即最大％同一性)的人种系免疫球蛋白序列，而将其鉴定为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列。是特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与种系序列相比可以包含氨基酸差异，该差异可以是例如天然存在的体细胞突变或有意引入的定点突变所造成的。然而，所选用的人抗体通常在氨基酸序列上与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％相同，并且包含这样的氨基酸残基：当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)相比时，这样的残基表明该人抗体是“人的”。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95％、或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，衍生自特定人种系序列的人抗体与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比将显示不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，人抗体可以展示与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的不超过5个、或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
V.同源抗体
涵盖这样的抗α-突触核蛋白抗体，其重链和轻链可变区包含与本文所描述的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中这样的抗体保留了本文所描述的抗α-突触核蛋白抗体的期望的功能特性。
例如，分离的α-突触核蛋白或其抗原结合部分可包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)重链可变区包含这样的氨基酸序列：该序列与选自SEQ ID NO:8、18、31、43、53、63、73、83、99和113的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或包含相对于选自SEQ ID NO:8、18、31、43、53、63、73、83、99和113的氨基酸序列的1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸改变(即氨基酸取代、添加或缺失)；
(b)轻链可变区包含这样的氨基酸序列：该序列与选自SEQ ID NO:9、19、32、33、44、54、64、74、84、100、101、102和114的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或包含相对于选自SEQ ID NO:9、19、32、33、44、54、64、74、84、100、101、102和114的氨基酸序列的1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸改变(即氨基酸取代、添加或缺失)；
(c)该抗体特异性结合α-突触核蛋白，并且
(d)该抗体结合下述功能性质中的一种或多种：
(1)结合小鼠和大鼠α-突触核蛋白；
(2)结合β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白；
(3)对α-突触核蛋白寡聚体(例如PFF)具有比对α-突触核蛋白单体更高的亲和力；
(4)抑制α-突触核蛋白寡聚体(例如PFF)诱导的不溶性α-突触核蛋白聚集体的生成(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)；
(5)耗竭从脑中含有α-突触核蛋白病理性聚集体的患者制备的PFF和/或脑裂解物来源的、产生可溶性或不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的分子种类；
(6)结合人α-突触核蛋白的第123-128位氨基酸(SEQ ID NO:121)的全部或一部分；
(7)结合人α-突触核蛋白的第125-128位氨基酸(SEQ ID NO:122)的全部或一部分；
(8)结合人α-突触核蛋白的第130-139位氨基酸(SEQ ID NO:124)的全部或一部分；
(9)结合人α-突触核蛋白的第119-126位氨基酸(SEQ ID NO:125)的全部或一部分；和
(10)结合人α-突触核蛋白的第130-138位氨基酸(SEQ ID NO:123)的全部或一部分。
在一些实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是PFF。在一些实施方案中，PFF是使用实施例3描述的方法制备的。在一些实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是可溶性的。在其他实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是不溶性的。
在一些实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含与选自下组的重链和轻链可变区序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链和轻链可变区序列：
(a)SEQ ID NO:8和9；
(b)SEQ ID NO:18和19；
(c)SEQ ID NO:31和32；
(d)SEQ ID NO:31和33；
(e)SEQ ID NO:43和44；
(f)SEQ ID NO:53和54；
(g)SEQ ID NO:63和64；
(h)SEQ ID NO:73和74；
(i)SEQ ID NO:83和84；
(j)SEQ ID NO:99和100；
(k)SEQ ID NO:99和101；
(l)SEQ ID NO:99和102；和
(m)SEQ ID NO:113和114，
其中该抗体结合α-突触核蛋白。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:8和9中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:18和19中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:31和32中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:31和33中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:43和44中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:53和54中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:63和64中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:73和74中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:83和84中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:99和100中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:99和101中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:99和102中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其包含这样的重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与在SEQ ID NO:113和114中列出的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中：
所述抗体的重链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR3；和
所述抗体的轻链可变区包含下述CDR：
i.具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR3；和
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在一些实施方案中，分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分可以包含重链和轻链，其中：
(a)重链可包含这样的氨基酸序列，该序列与选自SEQ ID NO:10、20、34、45、55、65、75、85、103和115的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或者相对于选自SEQ ID NO:10、20、34、45、55、65、75、85、103和115的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸改变(即氨基酸取代、添加或缺失)，条件是，在特定的实施方案中，如果该序列是无效应器(effectorless)的重链的序列，则导致重链无效应器的突变不被修饰；
(b)轻链可包含这样的氨基酸序列，该序列与选自SEQ ID NO:11、21、35、36、46、56、66、76、86、104、105、106和116的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或者相对于选自SEQ ID NO:11、21、35、36、46、56、66、76、86、104、105、106和116的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸改变(即氨基酸取代、添加或缺失)；
(c)该抗体特异性结合α-突触核蛋白，且
(d)该抗体展示下述功能性质中的一种或多种：
(1)结合小鼠和大鼠α-突触核蛋白；
(2)结合β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白；
(3)对α-突触核蛋白寡聚体(例如PFF)具有比对α-突触核蛋白单体更高的亲和力；
(4)抑制α-突触核蛋白寡聚体(例如PFF)诱导的不溶性α-突触核蛋白聚集体的生成(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)；
(5)耗竭从脑中含有α-突触核蛋白病理性聚集体的患者制备的PFF和/或脑裂解物来源的、产生可溶性或不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的分子种类；
(6)结合人α-突触核蛋白的第123-128位氨基酸(SEQ ID NO:121)的全部或一部分；
(7)结合人α-突触核蛋白的第125-128位氨基酸(SEQ ID NO:122)的全部或一部分；
(8)结合人α-突触核蛋白的第130-139位氨基酸(SEQ ID NO:124)的全部或一部分；
(9)结合人α-突触核蛋白的第119-126位氨基酸(SEQ ID NO:125)的全部或一部分；和
(10)结合人α-突触核蛋白的第130-138位氨基酸(SEQ ID NO:123)的全部或一部分。
在一些实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是PFF。在一些实施方案中，PFF是使用实施例3描述的方法制备的。在一些实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是可溶性的。在其他实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是不溶性的。
在一些实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链和轻链氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:10和11，
(b)SEQ ID NO:20和21，
(c)SEQ ID NO:34和35，
(d)SEQ ID NO:34和36，
(e)SEQ ID NO:45和46，
(f)SEQ ID NO:55和56，
(g)SEQ ID NO:65和66，
(h)SEQ ID NO:75和76，
(i)SEQ ID NO:85和86，
(j)SEQ ID NO:103和104，
(k)SEQ ID NO:103和105，
(l)SEQ ID NO:103和106，和
(m)SEQ ID NO:115和116，
其中所述抗体结合α-突触核蛋白。
本文还提供了这样的抗α-突触核蛋白抗体，其包含与7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和/或1E8的对应CDR相差1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸改变(即，氨基酸取代、添加或缺失)的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和/或VLCDR3。在某些实施方案中，相对于7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和/或1E8中的对应序列，抗α-突触核蛋白抗体在1、2、3、4、5或6个CDR中分别包含1-5个氨基酸改变。在特定实施方案中，相对于7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和/或1E8中的CDR，所述抗α-突触核蛋白抗体在全部CDR中总共包含1-5个氨基酸改变。可以使用本文实施例中描述的体外和体内测定法测试这些经过改变的抗体，以确定它们是否保留一种或多种上文列出的功能性质。
与7A10、11H11(11H11-1和11H11-2)、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8(23H8-1、23H8-2和23H8-3)和/或1E8的序列具有同源性的序列，例如SEQ ID NO:8、18、31、43、53、63、73、83、99和113的VH区，以及SEQ ID NO:9、19、32、33、44、54、64、74、84、100、101、102和114的VL区，或者分别SEQ ID NO:10、20、34、45、55、65、75、85、103和115的重链和SEQ ID NO:11、21、35、36、46、56、66、76、86、104、105、106和116的轻链，或者CDR，可以这样获得：对编码氨基酸序列的核酸序列进行诱变(例如定点诱变和PCR介导的诱变)，然后利用本文中描述的功能测定法，测试编码的改变的抗体是否保留了功能。
V.具有保守修饰的抗体
抗α-突触核蛋白抗体可包含：包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含给予本文所述的优选抗体的特定的氨基酸序列，或其保守修饰，且其中所述抗体保留本文所述的抗α-突触核蛋白抗体的期望的功能性质。相应地，分离的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分可包含：包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、24、39、49、59、69、79、89和109，及其保守修饰，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；
(b)轻链可变区CDR序列包含选自下组的氨基酸序列：7、27、30、42、52、62、72、82、92、95、98和102，及其保守修饰，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；
(c)该抗体特异性结合α-突触核蛋白，和
(d)该抗体展示下述功能性质中的一种或多种：
(1)结合小鼠和大鼠α-突触核蛋白；
(2)结合β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白；
(3)对α-突触核蛋白寡聚体(例如PFF)具有比对α-突触核蛋白单体更高的亲和力；
(4)抑制α-突触核蛋白寡聚体(例如PFF)诱导的不溶性α-突触核蛋白聚集体的生成(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)；
(5)耗竭从脑中含有α-突触核蛋白病理性聚集体的患者制备的PFF和/或脑裂解物来源的、产生可溶性或不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的分子种类；
(6)结合人α-突触核蛋白的第123-128位氨基酸(SEQ ID NO:121)的全部或一部分；
(7)结合人α-突触核蛋白的第125-128位氨基酸(SEQ ID NO:122)的全部或一部分；
(8)结合人α-突触核蛋白的第130-139位氨基酸(SEQ ID NO:124)的全部或一部分；
(9)结合人α-突触核蛋白的第119-126位氨基酸(SEQ ID NO:125)的全部或一部分；和
(10)结合人α-突触核蛋白的第130-138位氨基酸(SEQ ID NO:123)的全部或一部分。
在一些实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是PFF。在一些实施方案中，PFF是使用实施例3描述的方法制备的。在一些实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是可溶性的。在其他实施方案中，所述α-突触核蛋白寡聚体是不溶性的。
在一个优选地实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:3、23、38、48、58、68、78、88和108，及其保守修饰，例如，1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；且轻链可变区CDR2序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、26、29、41、51、61、71、81、91、94、97和111，及其保守修饰，例如，1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在另一个优选的实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、22、37、47、57、67、77、87和107，及其保守修饰，例如，1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；且轻链可变区CDR1序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、25、28、40、50、60、70、80、90、93、96和110，及其保守修饰，例如，1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。
在不同的实施方案中，抗体可展示上面列出的功能性质的一种或多种。这样的抗体可以为，例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
保守氨基酸取代还可以在抗体的CDR之外(包括或不包括CDR)的其他区域进行。例如，保守氨基酸修饰可以在框架区或Fc区中进行。
可变区或重链或轻链相对于本文中提供的抗α-突触核蛋白抗体序列可包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个保守氨基酸取代。在特定的实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体包含保守氨基酸修饰和非保守氨基酸修饰的组合。
VI.经改造及经修饰的抗体
VH及VL区
亦提供经改造及经修饰的抗体，其可使用具有本文公开的VH及/或VL序列中的一或多者的抗体作为起始材料以改造经修饰抗体来制备，该经修饰抗体可具有自起始抗体改变的性质。抗体可通过修饰一个或两个可变区(即VH及/或VL)内、例如一个或多个CDR区内及/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来改造。另外/或者，抗体可通过修饰恒定区内的残基以例如改变抗体的效应器功能来改造。
可实施的一种可变区改造类型是CDR嫁接。抗体与靶抗原主要经由位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基相互作用。出于此原因，CDR内的氨基酸序列较CDR外的序列在各个抗体之间的变化更大。由于CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，故可通过构建包括来自嫁接至具有不同性质的不同抗体的框架序列的特定的天然存在的抗体的CDR序列的表达载体表达模拟特定的天然存在的抗体的性质的重组抗体(例如参见Riechmann,L.等人(1998)Nature 332:323-327；Jones,P.等人(1986)Nature 321:522-525；Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad。参见U.S.A.86:10029-10033；颁予Winter的美国专利第5,225,539号、及颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号及第6,180,370号)
因此，本文中描述的另一实施方案是关于分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区及轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2及CDR3序列，所述CDR1、CDR2及CDR3序列分别包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、22、37、47、57、67、77、87和107；SEQ ID NO:3、23、38、48、58、68、78、88和108；SEQ ID NO:4、24、39、49、59、69、79、89和109，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2及CDR3序列，所述CDR1、CDR2及CDR3序列分别包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、25、28、40、50、60、70、80、90、93、96和110；SEQ ID NO:6、26、29、41、51、61、71、81、91、94、97和111；和SEQ ID NO:7、27、30、42、52、62、72、82、92、95、98和102。因此，此类抗体含有单克隆抗体7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8的VH及VL CDR序列，但可含有来自这些抗体的不同的框架序列。
此类框架序列可自包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开的参考文献来获得。举例而言，人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可参见“VBase”人类种系序列数据库(可在互联网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)以及Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生及公共服务部，NIH公开案第91-3242号；Tomlinson,I.M.等人(1992)“The Repertoire of HumanGermline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J,Mol.Biol.227:776-798；及Cox,J.P.L.等人(1994)“A Directoryof Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage”Eur.J.Immunol.24:827-836；每一者的内容都通过提述明确并入本文中。
优选用于本文所述抗体中的框架序列在结构上类似于本文所述的抗体所使用的框架序列。可将VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列移植至具有与发现于衍生出框架序列的种系免疫球蛋白基因中的序列同一的序列的框架区上，或可将CDR序列嫁接至与种系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。举例而言，已发现，在某些情况下，有益地突变框架区内的残基以维持或增强抗体的抗原结合能力(例如，参见颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及第6,180,370号)。
本文所述的经改造的抗体包括已对VH及/或VL内的框架残基进行修饰以(例如)改善抗体的性质的那些。通常，进行此类框架修饰以降低抗体的免疫原性。举例而言，一种方式是将一个或多个框架残基“回复突变”成相应种系序列。更特定而言，已经过受体细胞突变的抗体可含有与衍生出该抗体的种系序列不同的框架残基。此类残基可通过比较抗体框架序列与衍生出该抗体的种系序列来鉴定。为使框架区序列回复至其种系构形，可通过(例如)定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”成种系序列。亦意欲涵盖此类“回复突变”抗体。另一类型的框架修饰涉及突变框架区或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。此方法亦称作“去免疫化”(deimmunization)，在Carr等人的美国专利公布号20030153043有进一步详细阐述。
另一类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基以改善感兴趣抗体的一种或多种结合性质(例如亲和力)。可实施定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，且可在如本文所阐述且于实施例中提供的体外或体内测定中评估对所关注抗体结合或其他功能性质的效应。优选引入保守修饰(如上文所论述)。突变可为氨基酸取代、添加或缺失，但优选取代。此外，通常改变CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，本文亦提供包含重链可变区的分离的抗α-突触核蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分，该重链可变区包含：(a)VH CDR1区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、22、37、47、57、67、77、87和107，或与SEQ ID NO:2、22、37、47、57、67、77、87和107相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、23、38、48、58、68、78、88和108，或与SEQ ID NO:3、23、38、48、58、68、78、88和108相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、24、39、49、59、69、79、89和109，或与SEQ ID NO:4、24、39、49、59、69、79、89和109相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:5、25、28、40、50、60、70、80、90、93、96和110，或与SEQ ID NO:5、25、28、40、50、60、70、80、90、93、96和110相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、26、29、41、51、61、71、81、91、94、97和111，或与SEQ ID NO:6、26、29、41、51、61、71、81、91、94、97和111相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；及(f)VL CDR3区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、27、30、42、52、62、72、82、92、95、98和102，或与SEQ ID NO:7、27、30、42、52、62、72、82、92、95、98和102相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
抗体的CDR中的甲硫氨酸残基会被氧化，引起抗体的潜在化学降解及因此降低功效。因此，还提供了这样的抗α-突触核蛋白抗体，其重链及/或轻链CDR中的一个或多个甲硫氨酸残基被替换为不会经受氧化降解的氨基酸残基。
类似地，可自抗α-突触核蛋白抗体，尤其是CDR中去除去酰胺位点。
Fc及修饰的Fc
本文所述抗α-突触核蛋白抗体可变区可连接(例如，共价连接或融合)于Fc，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，其可属任何异型或同种异型，例如对于IgG1：G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z)；对于IgG2：G2m、G2m23(n)；对于IgG3：G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)；且对于K：Km、Km1、Km2、Km3(例如，参见Jefferies等人(2009)mAbs 1:1)。
在某些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体具有这样的Fc受体，其没有FcR结合或者具有降低的FcR结合，例如降低的对活化性FcR的结合。
在某些实施方案中，本文所述的抗α-突触核蛋白抗体可变区连接至无效应器的或大体上无效应器的Fc，例如IgG2或IgG4。
通常，本文所述可变区可连接至包含一个或多个修饰通常以改变抗体的一种或多种功能性质(例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合及/或抗原依赖性细胞细胞毒性)的Fc。此外，本文所述抗体可经化学修饰(例如可将一个或多个化学部分附接至该抗体)或经修饰以改变其糖基化，以改变抗体的一种或多种功能性质。这些实施方案分别进一步详细描述于下文中。Fc区中残基的编号系Kabat的EU索引的编号。
Fc区涵盖源自免疫球蛋白(优选人免疫球蛋白)的恒定区(包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体或衍生物)的结构域。适宜免疫球蛋白包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其他类别，例如IgA、IgD、IgE及IgM。免疫球蛋白的恒定区定义为与免疫球蛋白C-末端区同源的天然或合成产生的多肽，且可包括单独的CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域或CH4结构域，或其组合。
免疫球蛋白的恒定区负责许多重要抗体功能，包括Fc受体(FcR)结合及补体结合。存在五种主要类别的重链恒定区，分类为IgA、IgG、IgD、IgE、IgM，每一类具有特征性效应器功能(由同型指定)。举例而言，将IgG分成四个子类，称作IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
Ig分子与多个类别的细胞受体相互作用。举例而言，IgG分子与三类Fcγ受体(FcγR)(即FcγRI、FcγRII及FcγRIII)相互作用，这些Fcγ受体对抗体的IgG类别是特异性的。已报导对于IgG与FcγR受体的结合重要的序列位于CH2及CH3结构域中。抗体的血清半衰期受抗体结合Fc受体(FcR)的能力的影响。
在某些实施方案中，Fc区是变体Fc区，例如相对于亲本Fc序列(例如，随后经修饰以生成变体的未经修饰的Fc多肽)经修饰(例如，通过氨基酸取代、缺失及/或插入)的Fc序列，以提供期望的结构特征及/或生物活性。
举例而言，可在Fc区中进行修饰以生成如下Fc变体：(a)具有降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(b)具有降低补体介导的细胞毒性(CDC)，(c)具有降低的对C1q的亲和力及/或(d)相对于亲本Fc具有增加或降低的对Fc受体的亲和力。这些Fc区变体通常将包含Fc区中的至少一个氨基酸修饰。任何氨基酸修饰的组合尤其是期望的。举例而言，变体Fc区中可包括两个、三个、四个、五个等取代，例如本文中鉴别的具体Fc区位置的取代。
变体Fc区亦可包含序列改变，其中去除参与二硫键形成的氨基酸或其经其他氨基酸置换。这样的去除可避免与用于产生本文所述抗体的宿主细胞中存在的其他含有半胱氨酸的蛋白质反应。即使在去除半胱氨酸残基时，单链Fc结构域仍可形成非共价保持在一起的二聚体Fc结构域。在其他实施方案中，Fc区可经修饰以使得其与所选宿主细胞更相容。举例而言，可去除典型天然Fc区的N-末端附近的PA序列，该序列可被大肠杆菌(E.coli)中的消化酶(例如脯氨酸亚胺基肽酶)识别。在其他实施方案中，可去除Fc结构域内的一个或多个糖基化位点。通常被糖基化的残基(例如，天冬酰胺)可赋予细胞溶解反应。这些残基可缺失或经非糖基化残基(例如，丙氨酸)取代。在其他实施方案中，可自Fc区去除参与与补体相互作用的位点(例如C1q结合位点)。举例而言，可缺失或取代人IgG1的EKK序列。在某些实施方案中，可去除影响与Fc受体的结合的位点，优选补救受体结合位点之外的位点。在其他实施方案中，Fc区可经修饰以去除ADCC位点。ADCC位点为本领域已知；关于IgG1中的ADCC位点，参见(例如)Molec.Immunol.29(5):633-9(1992)。变体Fc结构域的具体实施例公开于例如WO 97/34631及WO 96/32478中。
在一个实施方案中，Fc的铰链区经修饰以改变(例如增加或减少)铰链区中的半胱氨酸残基数。此方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利第5,677,425号中。改变Fc的铰链区中的半胱氨酸残基数以(例如)有利于轻链及重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。在一个实施方案中，抗体的Fc铰链区经突变以缩短抗体的生物半衰期。更特定而言，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域中，以使得该抗体与葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合相对于具有天然Fc-铰链结构域的抗体与SpA的结合削弱。此方法进一步详细描述于Ward等人的美国专利第6,165,745号中。
在再一些实施方案中，通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应器功能。举例而言，一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320及322的氨基酸可经不同氨基酸残基置换，使得抗体具有改变的对效应器配体的亲和力，但保留亲代抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应器配体可为(例如)Fc受体或补体的C1组分。此方法进一步详细描述于Winter等人的美国专利第5,624,821号及第5,648,260号中。
在另一实例中，一个或多个选自氨基酸残基329、331及322的氨基酸可被不同氨基酸残基置换，以使抗体具有经改变的C1q结合及/或降低或消除补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法进一步详细描述于Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中。
在另一实例中，改变氨基酸位置231及239内的一个或多个氨基酸残基以藉此改变抗体结合补体的能力。此方法进一步描述于Bodmer等人的PCT公布号WO 94/29351中。
可对Fc进行的其他Fc修饰是用于降低或除去与FcγR及/或补体蛋白的结合，藉此降低或除去Fc介导的效应器功能(例如ADCC、ADCP及CDC)的修饰。示例性修饰包括(但不限于)位置234、235、236、237、267、269、325及328处的取代、插入及缺失，其中编号是根据EU索引。示例性取代包括(但不限于)234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L及328R，其中编号是根据EU索引。Fc变体可包含236R/328R。用于降低FcyR及补体相互作用的其他修饰包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P及234V、以及通过突变或酶方式或通过在不糖基化蛋白的生物体(例如细菌)中产生去除位置297处的糖基化。这些及其他修饰参阅Strohl,2009,Current Opinion inBiotechnology 20:685-691。
任选地，Fc区可在本领域技术人员已知的额外及/或替代位置处包含非天然氨基酸残基(例如，参见美国专利第5,624,821号、第6,277,375号、第6,737,056号、第6,194,551号、第7,317,091号、第8,101,720号；PCT专利公开案WO 00/42072、WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO 05/070963、WO 05/040217、WO 05/092925及WO 06/020114)。
Fc区对其配体的亲和力及结合性质可通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来测定，这些方法包括(但不限于)平衡方法(例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如，BIACORE分析)及其他方法，例如间接结合测定、竞争抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳及层析(例如，凝胶过滤)。这些及其他方法可在一个或多个被检查组分的上利用标记物，及/或采用多种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力及动力学的详细说明可参见Paul,W.E.编辑，Fundamental Immunology,第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其关注抗体-免疫原相互作用。
在某些实施方案中，抗体经修饰以延长其生物半衰期。多种方式是可行的。举例而言，这可通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来进行。举例而言，可使以下残基中的一或多者突变：252、254、256、433、435、436，如美国专利第6,277,375号中所述。具体示例性取代包括以下中的一或多者：T252L、T254S及/或T256F。或者，为延长生物半衰期，抗体可在CH1或CL区内经改变以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利第5,869,046号及第6,121,022号中所述。增加与FcRn的结合及/或改良药物动力学性质的其他示例性变体包括位置259、308、428及434处的取代，包括(例如)259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y及434M。增加与FcRn的Fc结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hinton等人2006Journal of Immunology 176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、31 1A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal of BiologicalChemistry,2001,276(9):6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、31 1S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等人Journal of Immunology,2002,169:5171-5180,Dall'Acqua等人，2006,Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)。用于调节FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等人，2010,J Immunol,182:7663-7671中。在某些实施方案中，可使用具有特定生物特征的杂合IgG同型。举例而言，IgG1/IgG3杂合变体可以这样构建：将IgG1的CH2及/或CH3区中的位置替换为IgG3中在这两种同型之间存在差异的位置上的氨基酸。因此，可构建杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R及436F。在本文所述其他实施方案中，可将IgG2的CH2及/或CH3区中的位置替换为IgG1中在这两种同型之间存在差异的位置上的氨基酸，来构建IgG1/IgG2杂合变体。因此，可构建杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如以下氨基酸取代中的一或多者：233E、234L、235L、-236G(指在位置236处插入甘氨酸)及327A。
在某些实施方案中，选择具有降低的与FcγR的结合的Fc。具有降低的FcγR结合的示例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下三个氨基酸取代：L234A、L235E及G237A。这种三重突变体IgG1 Fc在本文中称为“IgG1.3f”。
在某些实施方案中，选择具有降低的补体结合的Fc。具有降低的补体结合的示例性Fc(例如IgG1 Fc)具有以下两个氨基酸取代：A330S及P331S。
在某些实施方案中，选择基本上无效应器功能，即，具有降低的与FcγR的结合及降低的补体结合，的Fc。无效应器的示例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下五个突变：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
在使用IgG4恒定结构域时，其通常优选包括取代S228P，该取代模拟IgG1中的铰链序列且藉此稳定IgG4分子。
在另一实施方案中，抗体的糖基化是经修饰的。举例而言，可制备无糖基化抗体(即抗体缺少糖基化)。可改变糖基化以(例如)增加抗体对抗原的亲和力。这些糖修饰可通过(例如)改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。举例而言，可制备一个或多个氨基酸取代以消除一个或多个可变区框架糖基化位点，以藉此消除该位点处的糖基化。该无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此方法进一步详细描述于Co等人的美国专利第5,714,350号及第6,350,861号中。
可通过将N297残基突变成另一残基(例如N297A)及/或通过突变毗邻氨基酸(例如298)以藉此降低上N297的糖基化，来防止恒定区N297上的糖基化。
另外/或者，可制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有降低量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已展示，这些改变的糖基化模式可增加抗体的ADCC能力。这些糖修饰可通过(例如)在具有经改变的糖基化机构的宿主细胞中表达抗体来完成。具有经改变糖基化机构的细胞已于本领域有所描述，且可用作其中表达本文所述重组抗体的宿主细胞，以藉此产生具有改变的糖基化的抗体。举例而言，Hanai等人的EP 1,176,195描述具有功能被破坏的FUT8基因的细胞系，所述功能被破坏的FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得该细胞系中表达的抗体展现低岩藻糖基化。Presta的PCT公开案WO 03/035835描述变体CHO细胞系Lec13细胞，该细胞将岩藻糖附接至Asn(297)连接的糖的能力降低，亦导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(亦参见Shields,R.L.等人，(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开案WO99/54342描述一种细胞系，该细胞系经过工程化而表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在经改造细胞系中表达的抗体展现增加的二等分GlcNac结构，从而增强抗体的ADCC活性(亦参见Umana等人，(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。
本文所述抗体的另一修饰是聚乙二醇化。抗体可经聚乙二醇化以(例如)延长抗体的生物(例如血清)半衰期。为聚乙二醇化抗体，通常在一个或多个PEG基团附接至抗体或抗体片段的条件下使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。优选地，聚乙二醇化是通过与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来实施。如本文所用术语“聚乙二醇”意欲涵盖PEG的已用于衍生其他蛋白质的任一形式，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，欲聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域已知且可适用于本文所述抗体。参见(例如)Nishimura等人的EP 0 154 316及Ishikawa等人的EP 0 401 384。
VII.核酸分子
本文所述另一方面涉及编码本文所述的抗α-突触核蛋白抗体的核酸分子。这些核酸可存在于全细胞中，存在于细胞溶解物中，或以部分纯化或实质上纯的形式存在。当通过标准技术实施纯化以清除了其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如其他染色体DNA，例如连接至自然界中分离的DNA的染色体DNA)或蛋白质)时，核酸是“分离的”或“使得实质上纯的”，这些标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、限制酶、琼脂糖凝胶电泳及本领域熟知的其他方法。参见F.Ausubel等人编辑，(1987)Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本文所述核酸可为(例如)DNA或RNA且可含有或不含有内含子序列。在某些实施方案中，核酸为cDNA分子。
本文所述核酸可使用标准分子生物学技术来获得。对于由杂交瘤(例如自携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步描述)表达的抗体，编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链及重链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术来获得。对于自免疫球蛋白基因文库获得(例如使用噬菌体展示技术)的抗体，可自文库回收编码抗体的核酸。
本文中的优选核酸分子是编码7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8单克隆抗体的VH和VL序列(参见例如表22)的核酸分子。
用于制备抗α-突触核蛋白抗体的方法可包括使重链及轻链在包含分别编码重链及轻链核苷酸序列的细胞系中表达。本文中涵盖包含这些核苷酸序列(例如，或包含这些核苷酸序列的载体)的宿主细胞。
一旦获得编码VH及VL区段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，以(例如)将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质的另一DNA片段(例如抗体恒定区或柔性接头)。如本上下文中使用的术语“可操作地连接”欲指两个DNA片段接合，使得由该两个DNA片段编码的氨基酸序列保持合框。
可通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2及/或CH3)的另一DNA分子，将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列为本领域已知的(例如，参见Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开案第91-3242号)，且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如IgG1区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
可通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列为本领域已知的(例如，参见Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开案第91-3242号)且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区。
为产生scFv基因，将编码VH及VL的DNA片段可操作地连接至编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段，使得VH及VL序列可表达为邻接单链蛋白，其中VL及VH区通过柔性接头接合(例如，参见Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348:552-554)。
本文亦提供编码与7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8单克隆抗体的VH及VL序列(例如，表22中所示者)同源的VH及VL序列的核酸分子。示例性核酸分子编码与编码7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8单克隆抗体的VH及VL序列(例如，表22中所示者)的核酸分子至少70％相同(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同)的VH及VL序列。本文亦提供了编码所述核酸的载体，例如表达载体，以及包含如上所述的载体或核酸的宿主细胞。本文亦提供具有沉默取代(即，在核酸分子翻译时不改变所得氨基酸序列的取代)的核酸分子，例如用于密码子优化。
XI.抗体产生
本文所述单克隆抗体可使用多种已知技术(例如由Kohler及Milstein,Nature256:495(1975)描述的标准体细胞杂交技术)来产生。尽管体细胞杂交程序是优选的，但原则上亦可采用产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化、使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。
制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是已充分建立的程序。本领域已知分离融合用免疫脾细胞的免疫方案及技术。亦已知融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)及融合程序。
本文所述的嵌合或人源化抗体可基于如上文所述制备的鼠类单克隆抗体的序列而制备。可自所关注鼠类杂交瘤获得编码重链及轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准分子生物学技术工程化，以使之含有非鼠类(例如，人)免疫球蛋白序列。举例而言，为产生嵌合抗体，可使用本领域已知方法(例如，参见颁予Cabilly等人的美国专利第4,816,567号)将鼠类可变区连接至人恒定区。为产生人源化抗体，可使用本领域已知方法(例如，参见颁予Winter的美国专利第5,225,539号及颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及第6,180,370号)将鼠类CDR区插入人框架中。
在一个实施方案中，本文所述抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统而非小鼠系统的部分的转基因或转染色体小鼠来产生针对α-突触核蛋白的这些人单克隆抗体。这些转基因及转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb小鼠及KM小鼠的小鼠，且在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb(Medarex公司)含有编码非重排人重链(μ及γ)及κ轻链免疫球蛋白序列以及使内源性μ及κ链基因座不活化的靶突变的人免疫球蛋白基因迷你基因座(例如，参见Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠展现降低的小鼠IgM或κ表达，且响应于免疫，所引入的人重链及轻链转基因经历类别切换及体细胞突变而生成高亲和力人IgGκ单克隆(Lonberg,N.等人(1994),上文文献；参阅Lonberg,N.(1994)Handbookof Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.及Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93及Harding,F.及Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMab小鼠的制备及使用及由这些小鼠携带的基因体修饰进一步描述于以下中：Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6:579-591；及Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851，所有参考文献的内容系全文以引用方式明确并入本文中。进一步参见颁予Lonberg及Kay的美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,789,650号、第5,877,397号、第5,661,016号、第5,814,318号、第5,874,299号及第5,770,429号；颁予Surani等人的美国专利第5,545,807号；所有皆颁予Lonberg及Kay的PCT公开案第WO 92/03918号、第WO 93/12227号、第WO 94/25585号、第WO97/13852号、第WO 98/24884号及第WO 99/45962号；及颁予Korman等人的PCT公开案第WO01/14424号。
在某些实施方案中，本文所述抗体是使用在转基因及转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人重链转基因及人轻链转染色体的小鼠)产生的。这些小鼠(在本文中称作“KM小鼠”)详细描述于颁予Ishida等人的PCT公开案WO 02/43478中。
此外，本领域可获得其他表达人免疫球蛋白基因的替代性转基因动物系统，且可使用其来产生本文所述抗α-突触核蛋白抗体。举例而言，可使用称作Xenomouse(Abgenix公司)的替代性转基因系统；这些小鼠描述于(例如)颁予Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598号、第6,075,181号、第6,114,598号、第6,150,584号及第6,162,963号中。
此外，本领域可获得表达人免疫球蛋白基因的替代性转染色体动物系统且可使用其来产生本文所述抗α-突触核蛋白抗体。举例而言，可使用携带人重链转染色体及人轻链转染色体的小鼠，称作“TC小鼠”；这些小鼠描述于Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727中。此外，携带人重链及轻链转染色体的牛已在本领域有描述(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)且可使用其来产生本文所述抗α-突触核蛋白抗体。
本领域描述的用于产生人抗体的其他小鼠系统包括(i)小鼠(Regeneron Pharmaceuticals公司)，其中内源性小鼠重链及轻链可变区已经由同源重组经人重链及轻链可变区置换，可操作地连接至内源小鼠恒定区，使得在小鼠中产生嵌合抗体(人V/小鼠C)，且随后使用标准重组DNA技术转化成完全人抗体；及(ii)小鼠(Merus Biopharmaceuticals公司)，其中小鼠含有非重排人重链可变区而非单一重排人常见轻链可变区。这些小鼠及其产生抗体的用途描述于(例如)WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861及US 2012/0073004中。
本文所述人单克隆抗体亦可使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。用于分离人抗体的这些噬菌体展示方法已于本领域确立。参见(例如)：颁予Ladner等人的美国专利第5,223,409号、第5,403,484号及第5,571,698号；颁予Dower等人的美国专利第5,427,908号及第5,580,717号；颁予McCafferty等人的美国专利第5,969,108号及第6,172,197号；及颁予Griffiths等人的美国专利第5,885,793号、第6,521,404号、第6,544,731号、第6,555,313号、第6,582,915号及第6,593,081号。
本文所述人单克隆抗体亦可使用SCID小鼠来制备，其中已经重建了人免疫细胞，使得一旦免疫后能产生人抗体反应。此类小鼠描述于(例如)颁予Wilson等人的美国专利第5,476,996号及第5,698,767号中。
免疫
为生成α-突触核蛋白的完全人抗体，可利用α-突触核蛋白抗原及/或表达α-突触核蛋白或其片段的细胞的纯化或富集制剂免疫含有人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体小鼠(例如，HCo12、HCo7或KM小鼠)，如针对其他抗原由(例如)Lonberg等人(1994)Nature368(6474):856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851及WO 98/24884所述。例如，在一个实施方案中，用重组人αSyn WT免疫小鼠。在另一个实施方案中，用αSyn A53T-PFF突变蛋白免疫小鼠。在另一个实施方案中，用αSyn WT-PFF免疫小鼠。在另一个实施方案中，用交联的αSyn WT免疫小鼠。在另一个实施方案中，用交联的A53T PFF免疫小鼠。在另一个实施方案中，用αSyn WT-PFF、αSyn A53T-PFF、交联的αSyn WT-PFF、和交联的αSyn A53T PFF的混合物免疫小鼠。或者，可以用编码人α-突触核蛋白或其片段的DNA免疫小鼠。优选地，小鼠在首次输注时为6-16周龄。举例而言，可使用重组α-突触核蛋白抗原的纯化或富集制剂(5-50μg)对HuMAb小鼠实施腹膜内免疫。倘若使用α-突触核蛋白抗原的纯化或富集制剂的免疫不产生抗体，亦可利用表达α-突触核蛋白的细胞(例如细胞系)对小鼠实施免疫以促进免疫应答。示例性细胞系包括过表达α-突触核蛋白的稳定CHO及Raji细胞系。
利用各种抗原的累积经验已显示，在最初用Ribi的佐剂中的抗原经腹膜内(IP)或皮下(SC)实施免疫、而后用Ribi的佐剂中的抗原每隔一周IP/SC免疫(直至总共10次)时，HuMAb转基因小鼠反应最佳。可在免疫方案过程中利用血浆样品监测免疫应答，这些血浆样品系通过眶后取血获得。通过ELISA及FACS(如下文所述)筛选血浆，且可使用具有抗α-突触核蛋白人免疫球蛋白的足够效价的小鼠进行融合。可在处死及去除脾及淋巴结之前3天将小鼠用抗原静脉内加强免疫。预计对于每次免疫可需要实施2-3次融合。通常对于每一抗原对介于6只与24只之间的小鼠实施免疫。通常，使用HCo7、HCo12及KM菌株。另外，可将HCo7及HCo12转基因一起配种成具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo12)的单一小鼠。
产生α-突触核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤的生成
为生成产生本文所述人单克隆抗体的杂交瘤，可自免疫小鼠分离脾细胞及/或淋巴结细胞并融合至适当永生细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。对所得的杂交瘤可筛选是否产生抗原特异性抗体。举例而言，使用50％PEG将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液融合至Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)。将细胞以约2×105平铺于平底微量滴定板中，而后在含有10％胎牛克隆血清、18％“653”条件化培养基、5％奥瑞金(origen，IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素(penicillin)、50mg/ml链霉素(streptomycin)、50mg/ml庆大霉素(gentamycin)及1×HAT(Sigma)的选择性培养基中温育两周。约两周后，可在HAT更换为HT的培养基中培养细胞。然后可通过ELISA针对人单克隆IgM及IgG抗体筛选个别孔。一旦出现杂交瘤广泛生长，通常即可在10-14天后观察培养基。可将分泌抗体的杂交瘤再平铺，再次筛选，且若对人IgG仍呈阳性，则可通过限制性稀释将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后可在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为纯化人单克隆抗体，可使所选杂交瘤在两升旋转烧瓶中生长用于单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，然后使用蛋白质A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和层析。可通过凝胶电泳及高效液相层析检查所洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液更换为PBS，且可使用1.43消光系数通过OD280来测定浓度。可将单克隆抗体等分并储存于-80℃下。
产生α-突触核蛋白的单克隆抗体的转染瘤的生成
抗体可在宿主细胞转染瘤中使用(例如)如本领域所熟知的重组DNA技术及基因转染方法的组合产生(Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。
举例而言，为表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如使用表达所关注抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链及重链的DNA，且可将DNA插入表达载体中，使得这些基因可操作地连接至转录及翻译控制序列。在此背景下，术语“可操作地连接”欲指使抗体基因接合至载体中，使得该载体内的转录及翻译控制序列发挥其调控抗体基因的转录及翻译的预期功能。表达载体及表达控制序列经选择与所用表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因及抗体重链基因插入单独载体中，或将两种基因插入同一表达载体中。通过标准方法(例如将抗体基因片段上的互补限制位点与载体接合，或若不存在限制位点，则利用平端接合)将抗体基因插入表达载体中。可使用本文所述抗体的轻链及重链可变区通过将其插入已编码期望同型的重链恒定区及轻链恒定区的表达载体中来产生任何抗体同型的全长抗体基因，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段，且使VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。
另外/或者，重组表达载体可编码有利于自宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体中，使得信号肽在框架内连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链基因外，重组表达载体可携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。术语“调控序列”意欲包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子及其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。这些调控序列描述于(例如)Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。本领域技术人员应了解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可依赖于诸如欲转化的宿主细胞的选择、期望蛋白质的表达程度等因素而定。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中引导较高蛋白质表达程度的病毒元件，例如源自以下各项的启动子及/或增强子：巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及多瘤病毒。或者，可使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-球蛋白启动子。此外，调控元件由来自不同来源(例如SRα启动子系统)的序列构成，该SRα启动子系统含有来自SV40早期启动子的序列及人T细胞1型白血病病毒的长末端重复(Takebe,Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。
除抗体链基因及调控序列外，重组表达载体亦可携带额外序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)及选择标记物基因。选择标记物基因有利于选择其中已引入载体的宿主细胞(例如，参见所有皆由Axel等人的美国专利第4,399,216号、第4,634,665号及第5,179,017号)。举例而言，通常选择标记物基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤)的抗性。优选选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(针对dhfr-宿主细胞用于甲氨蝶呤选择/扩增)及neo基因(针对G418选择)。
对于轻链及重链的表达，通过标准技术将编码重链及轻链的表达载体转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意欲涵盖常用于将外源性DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染，等等。尽管理论上可在原核或真核宿主细胞中表达本文所述抗体，但在真核细胞(且优选哺乳动物宿主细胞)中表达抗体是优选的，这是因为真核细胞，具体而言，哺乳动物细胞，较原核细胞更有可能装配并分泌经适当折叠且具有免疫活性的抗体。已报导抗体基因的原核表达对高产率从的活性抗体的产生无效(Boss,M.A.及Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13)。
用于表达本文所述重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub及Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中，与DHFR选择标记物一起使用，例如如R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。具体而言，对于与NSO骨髓瘤细胞的使用，另一优选表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中公开的GS基因表达系统。在将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，将宿主细胞培养足够的时间，足以容许抗体在宿主细胞中表达(或更优选地，使抗体分泌至生长宿主细胞的培养基)，来产生抗体。可使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收抗体。
IX.测定法
可以通过，例如，标准ELISA，使用标准技术，例如实施例部分描述的那些，测试本文中描述的抗体对α-突触核蛋白的结合。。
如上文所述的ELISA测定法可用于筛选显示与α-突触核蛋白免疫原的阳性反应性的抗体，且由此筛选产生这样的抗体的杂交瘤。对于产生结合α-突触核蛋白、优选以高亲和力结合α-突触核蛋白的抗体的杂交瘤，随后可亚克隆并进一步表征。随后可选择来自每一杂交瘤的一个克隆(其保留亲本细胞的反应性(通过ELISA))用于制备细胞库并用于抗体纯化。
为确定所选的抗α-突触核蛋白单克隆抗体是否结合独特表位，可使用市售试剂(Pierce,Rockford,IL)生物素化每一抗体。可利用链霉抗生物素蛋白标记的探针检测生物素化MAb结合。可使用如上文所述α-突触核蛋白包被的ELISA板实施使用未经标记的单克隆抗体及生物素化单克隆抗体的竞争研究。
用于评估抗体之间竞争的技术包括，例如，免疫测定，其显示一种抗体阻断(或不阻断)另一种抗体与靶抗原的结合的能力，即竞争性结合测定。在这样的测定法中确定竞争性结合：在测定中，所测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原(例如α-突触核蛋白)的特异性结合。已知的竞争性结合测定法有许多类型，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心竞争测定；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA；固相直接标记测定，固相直接标记夹心测定；固相直接125I标记的RIA；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA；和直接标记的RIA。表面等离子体共振也可用于此目的。通常，这种测定法涉及下述者的使用：结合于固体表面的纯化抗原或者携带这些抗原细胞、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白。通过测定在测试免疫球蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。测试免疫球蛋白典型地过量存在。通常，当竞争性抗体过量存在时，它会抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或更多。
用于确定本文公开的抗体结合的表位的其他筛选技术包括，例如，抗原晶体的X射线分析：抗体复合物，其提供表位的原子分辨率。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变体变异的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失通常被认为是表位组分的指示。此外，还可以使用用于表位定位的计算组合方法。这些方法依赖于感兴趣的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特异性短肽的能力。然后将这些肽视为前导物，用来定义筛选肽文库的抗体所对应的表位。对于表位定位，也已经开发出证明可定位构象不连续表位的计算算法。
为测定纯化抗体的同种型，可使用对特定同种型的抗体具有特异性的试剂实施同型ELISA。
可通过Western印迹法针对与α-突触核蛋白抗原的反应性进一步测试抗α-突触核蛋白抗体。简言之，可自表达α-突触核蛋白的细胞制备细胞提取物，对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后，将分离抗原转移至硝酸纤维素膜，用20％小鼠血清封闭，并用欲测试的单克隆抗体探测。可使用抗IgG碱性磷酸酶检测IgG结合并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.公司St.Louis,MO)对其显色。
用于分析各种抗α-突触核蛋白抗体的结合亲和力、交叉反应性及结合动力学的方法包括本领域已知的标准测定，例如使用BiacoreTM 2000 SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析。
还可以测试抗α-突触核蛋白抗体与对α-突触核蛋白单体相比对α-突触核蛋白寡聚体的优先结合。“单体/PFF结合比”在本文中用作描述抗α-突触核蛋白抗体与PFF和α-突触核蛋白单体的结合行为的指标。大于1的比率表明与α-突触核蛋白单体相比更优先于结合PFF。例如，如果抗体通过ELISA与单体α-突触核蛋白结合的EC50为291nM，而与PFF结合的EC50为0.16nM，例如如实施例3中所述，则该抗体的单体/PFF结合比率将为291/0.16＝1819。在一些实施方案中，根据实施例3中描述的方法制备PFF。
可以使用例如实施例11中描述的测定法或实施例12中描述的寡聚体ELISA来测试抗α-突触核蛋白抗体清除脑中α-突触核蛋白寡聚体聚集体的能力。也可以使用例如实施例10和11中描述的方法，测试抗体减少或抑制α-突触核蛋白寡聚体(PFF)诱导的α-突触核蛋白S129磷酸化的能力，或者测试抗体从PFF和/或从脑中具有α-突触核蛋白的病理聚集体的患者制备的脑裂解物(例如，由具有突触核蛋白病，例如MSA的患者制备的脑裂解物)耗竭产生不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸-129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的分子种类的能力。
X.免疫缀合物、抗体衍生物及诊断
本文所述抗体可用于诊断目的，包括样品测试及体内成像，且为此目的，抗体(或其结合片段)可缀合至适当可检测的试剂，以形成免疫缀合物。为诊断目的，适当试剂是可检测的标记，其包括用于全身成像的放射性同位素、及用于样品测试的放射性同位素、酶、荧光标记及其他适宜抗体标记。
可检测标记可为体外诊断领域中当前所用的各种类型中的任一者，包括包括金属溶胶(例如胶状金)的颗粒标记、提供有(例如)N2S2、N3S或N4类型的肽螯合剂的同位素(例如I125或Tc99)、发色团(包括荧光标记物、发光标记物、磷光标记物、诸如此类)、以及将给定底物转化成可检测标记物的酶标记及在通过(例如)聚合酶链式反应扩增后显示的多核苷酸标记。适宜酶标记包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、诸如此类。举例而言，标记可为酶碱性磷酸酶，其系在1,2二氧杂环丁烷底物(例如金刚烷基甲氧基磷酰基氧基苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环{3.3.1.1 3,7}癸}-4-基)苯基磷酸二钠(CSPD)、以及CDP及或本领域技术人员熟知的其他发光底物(例如适宜镧系元素(例如铽(III)及铕(III))的螯合物)转化后通过测量化学发光的存在或形成来检测。通过所选标记测定检测方式。在标记为颗粒且以适当程度累积的情况下，标记或其反应产物可使用裸眼看到，或使用仪器(例如分光光度计、发光仪、荧光计，等等)显现，均根据标准实践来进行。
优选地，缀合方法产生实质上(或几乎)非免疫原性的联接，例如肽-(即酰胺-)、硫化-(立体阻碍)、二硫化物-、腙-及醚联接。这些联接几乎是非免疫原性的，且在血清内显示合理的稳定性(例如，参见Senter,P.D.,Curr.Opin.Chem.Biol.13(2009)235-244；WO2009/059278；WO 95/17886)。
可利用不同缀合策略，视部分及抗体的生物化学性质而定。在所述部分是50至500个天然或重组氨基酸的情况下，在描述蛋白缀合物之合成的化学法的教科书中有标准程序，本领域技术人员容易地遵循这些标准程序(例如，参见Hackenberger,C.P.R.及Schwarzer,D.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.47(2008)10030-10074)。在一个实施方案中，使用抗体或部分内的马来酰亚胺基部分与半胱氨酸残基的反应。在使用抗体的Fab或Fab'-片段的情况下，这是非常适宜的一种缀合化学。或者，在一个实施方案中，缀合至抗体或部分的C-末端。蛋白质(例如Fab-片段)的C-末端修饰可如(例如)所述实施(Sunbul,M.及Yin,J.,Org.Biomol.Chem.7(2009)3361-3371)。
一般而言，位点特异性反应及共价缀合是基于将天然氨基酸转变成具有与存在的其他官能基的反应性正交的反应性的氨基酸。举例而言，处于稀有序列背景中的特定半胱氨酸可经酶转化成醛(参见Frese,M.A.及Dierks,T.,ChemBioChem.10(2009)425-427)。亦可通过利用某些酶与给定序列背景中的天然氨基酸特异性酶反应性来获得期望氨基酸修饰(例如，参见Taki,M.等人，Prot.Eng.Des.Sel.17(2004)119-126；Gautier,A.等人，Chem.Biol.15(2008)128-136；及Protease-catalyzed formation of C--N bonds isused by Bordusa,F.,Highlights in Bioorganic Chemistry(2004)389-403)。
亦可通过末端氨基酸与适当修饰试剂的选择性反应实现位点特异性反应及共价缀合。
N-末端半胱氨酸与苄腈的反应性(参见Ren,H.等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48(2009)9658-9662)可用于实现位点特异性共价缀合。
天然化学接合亦可依赖于C-末端半胱氨酸残基(Taylor,E.Vogel；Imperiali,B,Nucleic Acids and Molecular Biology(2009),22(Protein Engineering),65-96)。
EP 1 074 563描述缀合方法，其是基于一段带负电荷氨基酸内的半胱氨酸与位于一段带正电氨基酸中的半胱氨酸的较快反应。
所述部分亦可为合成肽或肽模拟物。在多肽为化学合成的情况下，合成期间可纳入具有正交化学反应性的氨基酸(例如，参见de Graaf,A.J.等人，Bioconjug.Chem.20(2009)1281-1295)。由于有许多正交官能基可用且可引入合成肽中，故该肽与接头的缀合是一种标准化学。
为获得单标记的多肽，可通过层析分离具有1:1化学计量的缀合物与其他缀合副产物。可通过使用染料标记的结合对成员及带电荷的接头易化此程序。通过使用此类经标记且带高负电荷的结合对成员，容易将单缀合的多肽与未经标记的多肽及携带一个以上接头的多肽分离开来，这是因为电荷及分子量的差异可以被用于进行分离。荧光染料可用于纯化复合物与未结合的组分，如经标记的单价结合物。
在一个实施方案中，附接至抗α-突触核蛋白抗体的部分选自下组：结合部分、标记部分及生物活性部分。
本文所述抗体亦可缀合至治疗剂以形成免疫缀合物，例如抗体-药物缀合物(ADC)。适宜治疗剂包括抗代谢物、烷基化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组织蛋白去乙酰酶抑制剂、出核转运抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素及抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体及治疗剂优选经由可裂解接头(例如肽基、二硫化物或腙接头)缀合。更优选地，接头是肽基接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO:128)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可如下文中所述：美国专利第7,087,600号、第6,989,452号及第7,129,261号；PCT公开案WO 02/096910、WO 07/038658、WO 07/051081、WO 07/059404、WO 08/083312及WO 08/103693；美国专利公开案20060024317、20060004081及20060247295；其公开内容通过提述并入本文中。
抗α-突触核蛋白抗体(例如那些本文所述者)亦可用于检测α-突触核蛋白，例如人α-突触核蛋白，例如组织或组织样品中的人α-突触核蛋白。这些抗体可用于(例如)ELISA测定或流式细胞术中。在某些实施方案中，使抗α-突触核蛋白抗体与细胞(例如组织中的细胞)接触对于发生特异性结合适宜的一段时间，且随后添加试剂(例如检测抗α-突触核蛋白抗体的抗体)。抗α-突触核蛋白抗体可为完全人抗体，或其可为嵌合抗体，例如具有人可变区及鼠类恒定区或其部分的抗体。用于检测样品(细胞或组织样品)中的α-突触核蛋白(例如人α-突触核蛋白)的示例性方法包含(i)使样品与抗α-突触核蛋白抗体接触足以容许抗α-突触核蛋白抗体与样品中的α-突触核蛋白特异性结合的一段时间，及(2)使样品与特异性结合抗α-突触核蛋白抗体(例如结合抗α-突触核蛋白抗体的Fc区)的检测试剂(例如抗体)接触，藉此检测由抗α-突触核蛋白抗体结合的α-突触核蛋白。在与抗体及/或检测试剂一起温育后，可包括洗涤步骤。用于这些方法中的抗α-突触核蛋白抗体不必连接至标记或检测试剂，因为可以使用单独的检测试剂。
XIV.双特异性分子
本文所述的抗体可用于形成双特异性分子。抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分可衍生或连接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如受体的另一抗体或配体)，以生成结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。举例而言，抗α-突触核蛋白抗体可连接至特异性结合可用作组合治疗的潜在靶标的任何蛋白质(例如本文所述蛋白质)的抗体或scFv。本文所述抗体事实上可衍生或连接至一个以上的其他功能分子，以生成结合两个以上不同结合位点及/或靶分子的多特异性分子；这些多特异性分子亦欲涵盖于如本文所用的术语“双特异性分子”中。为产生本文所述双特异性分子，本文所述抗体可以有功能地连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子，例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，使得产生双特异性分子。
因此，本文提供包含至少一种对α-突触核蛋白的第一结合特异性及对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。在一个本文所述的实施方案中，双特异性分子是多特异性的，分子可进一步包括第三结合特异性。
在一个实施方案中，本文所述双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv))作为结合特异性。抗体亦可为轻链或重链二聚体或其任何最小片段，例如Fv或单链构建物，如Ladner等人，美国专利第4,946,778号中所述，其内容通过提述明确并入。
尽管人单克隆抗体是优选的，但本文所述双特异性分子中可采用的其他抗体为鼠类的、嵌合的、及人源化的单克隆抗体。
本文所述的双特异性分子可使用本领域已知的方法通过偶联各组成部分的结合特异性来制备。举例而言，双特异性分子的每一结合特异性可单独生成，随后彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂进行共价偶联。交联剂的实施例包括蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻伸苯基二马来酰亚胺(oPDM)、丙酸N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)酯(SPDP)及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-SMCC)(例如，参见Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括那些描述于以下中者：Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.编号78，118-132；Brennan等人(1985)Science 229:81-83)，及Glennie等人(1987)J.Immunol.139:2367-2375)。优选偶联剂是SATA及磺基-SMCC，其皆可自PierceChemical公司(Rockford,IL)购得。
在一些实施方案中，本文中描述的双特异性抗体具有可增加分子向脑中的转运，例如跨越血脑屏障转运的第二结合特异性。
当结合特异性是抗体时，其可经由两条重链的C-末端铰链区的巯基键结来偶联。在特别优选的实施方案中，铰链区经修饰在偶联之前含有奇数个(优选一个)巯基残基。
或者，两种结合特异性可在同一载体中编码且在同一宿主细胞中表达并装配。此方法在双特异性分子为mAb×mAb、mAb×Fab、mAb×(scFv)2、Fab×F(ab')2或配体×Fab融合蛋白时尤其有用。双特异性抗体可包含在每一重链的C-末端处包含scFv的抗体。本文所述双特异性分子可为包含一种单链抗体及结合决定簇的单链分子、或包含两种结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两种单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于(例如)美国专利第5,260,203号；美国专利第5,455,030号；美国专利第4,881,175号；美国专利第5,132,405号；美国专利第5,091,513号；美国专利第5,476,786号；美国专利第5,013,653号；美国专利第5,258,498号；及美国专利第5,482,858号中。
双特异性分子与其特异性靶的结合可使用本领域公认的方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或Western印迹测定)来确认。这些分析测定通常都采用对受特别关注的蛋白质-抗体复合物特异性的标记试剂(例如抗体)来检测该受关注的复合物的存在。
XII.组合物
进一步提供组合物，例如药物组合物，其含有一种本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或本文所述的抗α-突触核蛋白抗体的组合，或本文所述的抗α-突触核蛋白抗体与针对其他靶标的抗体的组合，或本文所述的抗α-突触核蛋白抗体的抗原结合部分，与医药上可接受的载体配制在一起。这些组合物可包括本文所述抗体或免疫缀合物或双特异性分子中的一种或组合(例如两种或更多种不同者)。举例而言，本文所述的药物组合物可包含抗体(或免疫缀合物或双特异性物)的组合，其中各抗体结合靶抗原上的不同表位或具有互补的活性。
在某些实施方案中，组合物包含至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、1-300mg/ml或100-300mg/ml的浓度的抗α-突触核蛋白抗体。
本文所述药物组合物亦可以组合疗法、即与其他药剂组合施用(在同一组合物中或分别的组合物中)。可以用于联合疗法的治疗剂的例子包括，例如左旋多巴，金刚烷胺(Symmetrel)，抗胆碱能药(三己芬迪，苯甲磺酸甲磺酸盐，环丙啶，安坦(artane)，苯扎托品(cogentin))，溴隐亭(Parlodel)，培高利特(Permax)，罗匹尼罗(Requip)，普拉克索(Mirapex)，单胺氧化酶B抑制剂(MAO)如司来吉兰(Diprenyl或Eldepryl)，儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂(COMT)如恩他卡朋(entocapone)，Tasmar或托卡朋，胆碱酯酶抑制剂，D2受体拮抗剂，DA激动剂，反义寡核苷酸(例如，针对α-突触核蛋白的反义寡核苷酸)，激酶抑制剂和富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)抑制剂。另外的试剂包括，例如，靶向已知与突触核蛋白病的病理学有关的分子的治疗剂，例如PINK，PARKIN，DJ1，葡萄糖脑苷脂酶(GBA)，以及靶向活性氧种类的作用剂。
如本文所使用，“医药上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及生理上相容的类似试剂。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、非经肠、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。依赖于施用途径而定，可于材料中对活性化合物(即抗体、免疫缀合物或双特异性分子)进行包衣以保护化合物免受酸及其他可使化合物失活的天然条件的作用。
本文所述医药化合物可包括一种或多种医药上可接受的盐。“医药上可接受的盐”指保留亲本化合物的期望生物活性且不赋予任何不期望毒理学效应的盐(例如，参见Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这些盐的实施例包括酸加成盐及碱加成盐。酸加成盐包括那些源自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸，等等)以及源自无毒有机酸(例如脂肪族单及二羧酸、经苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族磺酸，等等)者。碱加成盐包括那些源自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙，等等)以及源自无毒有机胺(例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)，等等)者。
本文所述药物组合物亦可包括医药上可接受的抗氧化剂。医药上可接受的抗氧化剂的实施例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、氢氯酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠，等等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚，等等；及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸，等等。
可用于本文所述药物组合物中的适宜水性及非水性载体的实施例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)及其适宜混合物、植物油(例如橄榄油)及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。可(例如)通过使用诸如卵磷脂等包衣材料、通过维持所需粒径(在分散剂的情形下)及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
这些组合物亦可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。通过上述灭菌程序并通过纳入各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸，等等)二者可确保阻止微生物的存在。这些组合物中亦可期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠，等等。另外，可通过引入吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝及明胶)来实现可注射医药形式的长效吸收。
医药上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。本领域已知用于医药活性物质的这些介质及药剂的使用。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则亦涵盖常规介质或药剂在所述药物组合物中的使用。药物组合物可包含防腐剂或可不含防腐剂。这些组合物中亦可纳入附加活性化合物。
治疗组合物通常必须无菌且在制造及储存条件下稳定。可将组合物调配成溶液、微乳液、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液体聚乙二醇，等等)及其适宜混合物。可(例如)通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过维持所需粒径(在分散液情形下)且通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情形下，优选可将等渗剂(例如糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)或氯化钠)纳入组合物中。可通过向组合物中纳入延迟吸收剂(例如，单硬脂酸盐及明胶)实现可注射组合物的长效吸收。
无菌可注射溶液可通过以下方式来制备：将所需量的活性化合物纳入具有上文所列举成分中的一者或组合(视需要)的适宜溶剂中，而后进行无菌微滤。通常，可通过将活性化合物纳入含有基本分散介质及来自那些上文所列举者的所需其他成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情形下，优选制备方法是真空干燥及冷冻-干燥(冻干)，其可自其预先经无菌过滤的溶液产生活性成分加上任一所期望额外成分的粉末。
可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量将依赖于所治疗受试者及特定施用方式而变化。可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量通常可为产生治疗效应的组合物的量。通常，在100％中，此量将在与医药上可接受的载体组合的约0.01％至约99％的活性成分、优选约0.1％至约70％、最佳约1％至约30％活性成分范围内。
可对剂量方案进行调节以提供最佳期望反应(例如治疗反应)。举例而言，可施用单次推注，可随时间施用若干个分次剂量或可根据治疗状况紧急程度所指示按比例减少或增加剂量。尤其有利地将非经肠组合物调配成剂量单位形式以便于剂量的施用及均匀性。如本文所使用的剂量单元形式指适于作为单位剂量供欲治疗受试者使用的物理离散单元；各单元含有预定量的活性化合物，此预定量经计算与所需医药载体一起产生期望治疗效应。本文所述剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于下列因素：(a)活性化合物的独特特性及欲实现的特定治疗效应，及(b)复合此活性化合物以治疗受试者敏感性的技术中的固有限制条件。
对于抗体的施用，剂量将在约0.0001mg/kg至100mg/kg且更通常0.01mg/kg至5mg/kg或10mg/kg宿主体重的范围内。举例而言，剂量可为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1mg/kg至10mg/kg范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体可以固定剂量(固定剂量方案)施用。
在一些方法中，同时施用两种或更多种经由不同结合特异性的单克隆抗体，在该情形下，所施用的每一抗体的剂量均在所指示的范围内。抗体通常在多个时机施用。单一剂量之间的间隔可为(例如)每周、每月、每三个月或每年。间隔亦可如通过测量患者的针对靶抗原的抗体血液含量所指示而不规则。在一些方法中，对剂量进行调节以实现约1-1000μg/ml、且在一些方法中为约25-300μg/ml的血浆抗体浓度。
抗体可以持续释放配制剂的形式施用，在该情形下需要频率较低的施用。剂量及频率依赖于抗体在患者中的半衰期而变化。通常，人抗体显示最长的半衰期，其后为人源化抗体、嵌合抗体及非人抗体。施用剂量及频率可依赖于治疗为预防性抑或或治疗性而变化。在预防性应用中，以相对较不频繁之间隔经较长时间段施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要相对较短间隔的相对较高的剂量直至减轻或终止疾病进展且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可向患者施用预防性方案。
本文所述药物组合物中活性成分的实际剂量可有所变化，以便获得对于特定患者、组合物及施用方式有效达到期望治疗反应而对患者不具毒性的活性成分量。所选剂量量将依赖于多种药物代谢动力学因素而定，这些因素包括所用本文所述特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物及/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、身体状况、一般健康情况及先前病史及已为医学技术中所熟知的类似因素。
本文所述组合物可使用本领域中已知的多种方法中的一种或多种、经由一个或多个施用途径施用。如本领域技术人员应了解，施用途径及/或方式应视所期望结果而变化。本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜腔内、皮下、脊柱或其他非经肠施用途径，例如通过注射或输注。本文所用短语“非经肠施用”意指除经肠及局部施用以外的施用方式，通常通过注射，且包括(但不限于)静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼窝内、心内、皮内、腹膜腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、经囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。
或者，本文所述抗体可经由非经肠途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如经鼻内、经口、经阴道、经直肠、经舌下或经局部。
活性化合物可利用保护化合物免于快速释放的载体来制备，例如控制释放配制剂，包括植入体、经皮贴剂及微囊封递送系统。可使用生物可降解的生物相容聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸。用于制备此等配制剂的许多方法已获得专利权或通常已为本领域技术人员所知。参见(例如)Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker公司，New York,1978。
治疗组合物可利用本领域已知的医学器件施用。举例而言，在优选实施方案中，本文所述治疗组合物可利用无针皮下注射(例如器件公开于美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号或第4,596,556号中的器件)来施用。与本文所述抗α-突触核蛋白抗体一起使用的熟知植入体及模组的实施例包括：美国专利第4,487,603号，其公开用于以控制速率分配用药的可植入微输注泵；美国专利第4,486,194号，其公开用于经由皮肤施用药物的治疗器件；美国专利第4,447,233号，其公开用于以精确输注速率递送用药的用药输注泵；美国专利第4,447,224号，其公开用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，其公开经由多室隔间的渗透药物递送系统；及美国专利第4,475,196号，其公开渗透药物递送系统。此等专利皆以引用方式并入本文中。许多其他植入体、递送系统及模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，本文所述抗α-突触核蛋白抗体可经配制以确保体内的适当分布。举例而言，血脑障壁(BBB)可排除许多高度亲水性化合物。为确保本文所述治疗化合物跨越BBB(视期望，例如，针对脑癌)，则其可以例如配制在脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见(例如)美国专利4,522,811；5,374,548；及5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性运输至特定细胞或器官中、由此增强靶向药物递送的部分(例如，参见V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(例如，参见颁予Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；亦参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
XIII.试剂盒
还提供了试剂盒，其包含本文公开的抗α-突触核蛋白抗体、双特异性抗体或免疫缀合物的，任选包含在单个小瓶或容器中，且包括例如用于治疗或诊断与脑中路易体或α-突触核蛋白聚集体的存在有关的疾病的说明。试剂盒可包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。标签一词包括附于试剂盒上或者与试剂盒一并提供的、或者其他方式随附于试剂盒的任何文字，营销材料或记录材料。此类试剂盒可以包含单位剂型(例如单剂量药瓶或单剂量预装注射器)的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物。
XIV.用途和方法
本文提供了治疗患有以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的受试者(例如人患者)的方法，以及用于预防这些疾病的方法。
因此，在一个方面，本文提供了治疗以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本文提供了减轻以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的严重性的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本文提供了延迟以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的进展的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本文提供了减少发生以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的风险的方法，包括对具有发生该疾病的风险的受试者施用有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本文提供了延迟以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的发作的方法，包括对具有发生该疾病的风险的受试者施用有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，待治疗的受试者表现出突触核蛋白病的症状(体征)，例如神经精神病学表现(抑郁，痴呆，幻觉，焦虑，麻木，性欲低下)，自主神经变化(体位性低血压，膀胱紊乱，便秘，大便失禁，流涎，吞咽困难，性功能障碍，脑血流变化)，感觉变化(嗅觉，痛觉，辨色异常感觉)，睡眠障碍(REM睡眠行为障碍(RBD)，不安腿综合征/周期性肢体运动，嗜睡症，失眠)和其他体征和症状(疲劳，复视，视力模糊，皮脂溢，体重减轻/增加)。
在一些实施方案中，要治疗的受试者可能不表现疾病的症状，但已知其具有发生以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的遗传风险。例如，这样的个体可能有患有该疾病的亲属，或者通过遗传或生化标志物的分析确定了他们的风险。例如，SCNA(PARK1，编码α-突触核蛋白)中的突变，包括A30P、E46K、H50Q、G51D和A53T，以及整个SNCA基因的重复和三次重复，可导致PD的常染色体显性形式。LRRK2(PARK8，富亮氨酸重复激酶2)中的突变，以及VPS35(PARK17，液泡蛋白分选35)中的突变也会导致PD的常染色体显性形式(Hernandez et al.、(2016)Genetics in Parkinson disease:Mendelialversus non-Medndelian inheritance.Journal of Neurochemistry 10.1111/jnc.13593)。PINK1(PARK6、PTEN-诱导的激酶1)、DJ-1(PARK7)、Parkin(PARK2)、ATP13A2(PARK9、ATP酶13A2型)、FBXO7(PARK15、仅F-框蛋白7)和PLA2GB(PARK14，磷酸脂肪酶A2、组VI)中的突变已经被证明可导致常染色体隐性PD/帕金森综合征。此外，已经鉴定了28种不同的与PD以及相关的突触核蛋白病关联的遗传风险座位，包括SNCA、LRRK2、GBA/SYT11、MAPT、HLA-DRB5、GAK、GCH1、NUCKS1/RAB7L1、SLC41A1、BST1、SIPA1L2、ACMSD/TMEM163、STK39、MCCC1、TMEM175/GAK/DGKQ、FAM47E/SCARB2、GPNMB、FGF20、INPP5F、MIR4697、CCDC62、GCH1、VPS13C、BCKDK/STX1B、SREBF/RAI1、RIT2和DDRGK1(Nalls et al.(2014)Large-scalemeta-analysis of genome-wide association data identifies six new risk locifor Parkinson’s disease.Nature Genetics 46(9):989-993)。因此，在预防性应用中，将本文所述的抗体或包含该抗体的药物组合物以一定的方案(剂量、施用频率和施用途径)施用于易患疾病或具有该疾病风险的患者，该方案可有效降低该疾病的风险、减轻该疾病的严重程度或延缓该疾病的至少一种体征或症状的发作。在某些预防性应用中，该方案可有效抑制或延缓脑内α-突触核蛋白在脑中的积累，和/或抑制或延缓其毒性作用和/或抑制或延缓患者行为缺陷的发展。
在一些实施方案中，上述方法在患者中产生有益的治疗反应(例如，受试者的脑中α-突触核蛋白聚集减少，认知功能改善，和/或逆转、治疗或防止认知下降)。因此，在一些实施方案中，将本文所述的抗体以一定的方案(剂量、施用频率和施用途径)施用于怀疑患有或已经患有以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的患者，该方案可有效改善疾病的至少一种体征或症状或至少抑制疾病的至少一种体征或症状的进一步恶化。在某些治疗应用中，该方案可有效减少α-突触核蛋白水平、相关的毒性和/或行为缺陷，或至少抑制α-突触核蛋白水平、相关的毒性和/或行为缺陷的进一步增高。在某些实施方案中，相对于治疗开始前，或与未经治疗的对照患者的群体相比，所述治疗可导致，例如，脑中的α-突触核蛋白聚集减少10％或更多，20％或更多，30％或更多，40％或更多，50％或更多，60％，更多，70％或更多，80％或更多或90％或更多。
在一些实施方案中，以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病是帕金森病(包括特发性帕金森病)、DLB、DLBD、LBVAD、单纯性自主神经衰竭、路易体吞咽困难(Lewy body dysphagia)、偶发性LBD，遗传的LBD(例如，SNCA(PARK1)、LRRK2(PARK8)、VPS35(PARK17)，PINK1(PARK6)、DJ-1(PARK7)、Parkin(PARK2)、ATP13A2(PARK9)、FBXO7(PARK15)和PLA2GB(PARK14)的突变)或多系统萎缩症(MSA；例如，少脑桥小脑萎缩症，纹状体黑质变性和Shy-Drageri综合征)。
还提供了抑制细胞(体外或体内)中不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)产生的方法，包括使细胞与有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分接触。在一些实施方案中，丝氨酸129的磷酸化是被α-突触核蛋白低聚物(例如，PFF)诱导的。
还提供了用于维持或增加突触密度和/或树突密度的方法，所述突触密度和/或树突密度使用突触形成标记(突触素)和/或树突(MAP2)进行测量。因此，在一些实施方案中，相对于开始治疗前，或与未经治疗的对照患者群体相比，用本文所述的抗体治疗的受试者的突触或树突密度可显示10％或更多，20％或更多，30％或更多，40％或更多或50％或更多的升高。
本文公开的抗体还可以用于诊断或预后以脑中存在路易体或α-突触核蛋白的病理聚集体为特征的疾病，例如，通过使本文公开的抗体与来自受试者的细胞接触(例如离体或体内)，并测量细胞上与α-突触核蛋白的结合水平，其中与α-突触核蛋白的异常高结合水平表明该受试者患有脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病。为了诊断或预后目的，本文所述的抗体可以通过静脉内注射至患者体内或通过颅内注射或通过在颅骨上钻孔而直接注射至脑内来施用。试剂的剂量应在与治疗方法相同的范围内。合适的标记包括，例如，荧光标记(例如，用于光学检测)，顺磁标记(例如，用于无手术介入的断层摄影检测)和放射性标记(例如，用于使用PET或SPECT进行检测)。通过将被标记的基因座的数量、大小和/或强度与相应的基线值进行比较来进行诊断。基线值可以代表一群未患病个体的平均水平。基线值也可以代表同一患者中以前确定的水平。例如，可以在开始治疗之前测定患者的基线值，然后再将测量值与基线值进行比较。值相对于基线信号的降低表示对治疗的积极反应。
在一个实施方案中，本文提供了一种用于诊断以受试者中的路易体或α-突触核蛋白的病理聚集体的存在为特征的疾病的方法，其包括：
(a)使来自受试者的样品与本文所述的抗体或其抗原结合部分接触，从而形成抗体-抗原复合物；
(b)测量形成的复合物的量；和
(c)将样品中复合物的量与对照中的量进行比较，其中样品中复合物的水平相对于对照升高表明受试者患有以路易体或α-突触核蛋白的病理性聚集体的存在为特征的疾病。在一些实施方案中，样品是脑脊液、脑组织提取物、尿液或血液。在一些实施方案中，对照是一群健康受试者，这些受试者没有表现出该疾病(例如，突触核神经病)的症状，也不具有该疾病的遗传倾向。
在优选的实施方案中，本文所述的抗α-突触核蛋白抗体没有显著毒性。例如，抗α-突触核蛋白抗体对人体，例如肝脏、肾脏、脑，肺和心脏中的一个或多个器官没有明显毒性(例如在临床试验中确定的)。在某些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体不会显著触发不良的免疫反应，例如自身免疫或炎症。
该抗体可以单独施用，也可以与另一种与该抗体联合作用或协同作用的治疗剂一起施用，以治疗与路易体或脑中α-突触核蛋白聚集体有关的疾病(例如，多系统萎缩症)。
适合与本文所述抗体结合使用的示例性治疗剂包括，例如，左旋多巴，金刚烷胺(Symmetrel)，抗胆碱能药(三己芬迪，苯甲磺酸甲磺酸盐，环丙啶，安坦(artane)，苯扎托品(cogentin))，溴隐亭(Parlodel)，培高利特(Permax)，罗匹尼罗(Requip)，普拉克索(Mirapex)，单胺氧化酶B抑制剂(MAO)如司来吉兰(Diprenyl或Eldepryl)，儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂(COMT)如恩他卡朋(entocapone)，Tasmar或托卡朋，胆碱酯酶抑制剂，D2受体拮抗剂，DA激动剂，反义寡核苷酸(例如，针对α-突触核蛋白的反义寡核苷酸)，激酶抑制剂和富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)抑制剂。另外的试剂包括，例如，靶向已知与突触核蛋白病的病理学有关的分子的治疗剂，例如PINK，PARKIN，DJ1，葡萄糖脑苷脂酶(GBA)，以及靶向活性氧种类的作用剂。
其他治疗剂可与本文所述抗体一起(例如，同时或依次)或分开(例如，相隔数小时或数天)一起施用。
还涵盖了检测样品中人α-突触核蛋白抗原的存在或测量人α-突触核蛋白抗原的量的方法，包括使样品和对照样品与特异性结合人α-突触核蛋白的单克隆抗体(例如人单克隆抗体)或其抗原结合部分在容许该抗体或其部分与人α-突触核蛋白之间形成复合物的条件下接触。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品之间复合物形成的差异表明样品中存在人α-突触核蛋白抗原。在一个实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体可用于通过免疫亲和纯化来纯化人α-突触核蛋白。在另一个实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体可用于检测生物样品(例如活检)中α-突触核蛋白蛋白的量。在又一个实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体可用于体外测定法(例如，诸如Western印迹的免疫测定，放射免疫测定，ELISA)以检测α-突触核蛋白。
XV.示例性实施方案
1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白并展示下述的一种或多种性质：
(a)结合小鼠和大鼠α-突触核蛋白；
(b)结合人β-突触核蛋白和人γ-突触核蛋白；
(c)对α-突触核蛋白寡聚体的亲和力大于对α-突触核蛋白单体的亲和力；
(d)抑制α-突触核蛋白寡聚体诱导的不溶性丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体的生成；
(e)耗竭从脑中含有α-突触核蛋白病理性聚集体的患者制备的PFF和/或脑裂解物来源的、产生可溶性或不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的分子种类；
(f)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第123-128位氨基酸的全部或一部分；
(g)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第125-128位氨基酸的全部或一部分；
(h)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-139位氨基酸的全部或一部分；
(i)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第119-126位氨基酸的全部或一部分；和
(j)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-138位氨基酸的全部或一部分。
2.实施方案1的抗体或其抗原结合部分，其中所述α-突触核蛋白寡聚体是PFF。
3.实施方案2的抗体或其抗原结合部分，其中PFF是如实施例3中所述地制备的。
4.实施方案1-3中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中α-突触核蛋白寡聚体是可溶性α-突触核蛋白寡聚体。
5.实施方案1-3中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中α-突触核蛋白寡聚体是不溶性α-突触核蛋白寡聚体。
6.实施方案1-5中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中对α-突触核蛋白PFF相比于对α-突触核蛋白单体更大的亲和力是用α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白PFF结合比来度量的，α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白PFF结合比通过基于荧光的测定法(例如如实施例3所述)而测定的。
7.实施方案6的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分具有100或更大的α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白PFF结合比。
8.实施方案7的抗体或其抗原结合部分，其中单体/PFF结合比为500或更大。
9.实施方案8的抗体或其抗原结合部分，其中单体/PFF结合比为700或更大。
10.实施方案9的抗体或其抗原结合部分，其中单体/PFF结合比为1500或更大。
11.实施方案10的抗体或其抗原结合部分，其中单体/PFF结合比为3000或更大。
12.实施方案11的抗体或其抗原结合部分，其中单体/PFF结合比为5000或更大。
13.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中通过ELISA测量，所述抗体或其抗原结合部分以100nM或更大的EC50结合单体α-突触核蛋白，且以2nM或更小的EC50结合PFF。
14.实施方案13的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以500nM或更大的EC50结合单体α-突触核蛋白，且以0.5nM或更小的EC50结合PFF。
15.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中通过使用如实施例10所述的测定法评估，所述抗体或其抗原结合部分以0.1nM或更小的IC50抑制PFF诱导的α-突触核蛋白丝氨酸129磷酸化。
16.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性地结合α-突触核蛋白，并且包含选自下组的可变重链和可变轻链对中的三个可变重链CDR和三个可变轻链CDR：
(a)SEQ ID NO:8和9；
(b)SEQ ID NO:18和19；
(c)SEQ ID NO:20和21；
(d)SEQ ID NO:31和32；
(e)SEQ ID NO:31和33；
(f)SEQ ID NO:43和44；
(g)SEQ ID NO:53和54；
(h)SEQ ID NO:63和64；
(i)SEQ ID NO:73和74；
(j)SEQ ID NO:83和84；
(k)SEQ ID NO:99和100；
(l)SEQ ID NO:99和101；
(m)SEQ ID NO:99和102；和
(n)SEQ ID NO:113和114。
17.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白，且包含：
(a)分别包含SEQ ID NO:2-4的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:5-7的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(b)分别包含SEQ ID NO:12-14的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:15-17的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(c)分别包含SEQ ID NO:22-24的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:25-27的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(d)分别包含SEQ ID NO:22-24的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:28-30的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(e)分别包含SEQ ID NO:37-39的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:40-42的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(f)分别包含SEQ ID NO:47-49的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:50-52的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(g)分别包含SEQ ID NO:57-59的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:60-62的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(h)分别包含SEQ ID NO:67-69的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:70-72的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(i)分别包含SEQ ID NO:77-79的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:80-82的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(j)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:90-92的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(k)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:93-95的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
(l)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:96-98的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；or
(m)分别包含SEQ ID NO:107-109的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQID NO:110-112的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3.
18.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白且包含重链和轻链可变区，其中重链可变区包含与选自SEQ ID NO:8、18、31、43、53、63、73、83、99和113的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
19.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白且包含重链和轻链可变区，其中轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:9、19、32、33、44、54、64、74、84、100、101、102和114的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
20.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白并且包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的重链和轻链可变区序列：
(a)SEQ ID NO:8和9；
(b)SEQ ID NO:18和19；
(c)SEQ ID NO:31和32；
(d)SEQ ID NO:31和33；
(e)SEQ ID NO:43和44；
(f)SEQ ID NO:53和54；
(g)SEQ ID NO:63和64；
(h)SEQ ID NO:73和74；
(i)SEQ ID NO:83和84；
(j)SEQ ID NO:99和100；
(k)SEQ ID NO:99和101；
(l)SEQ ID NO:99和102；和
(m)SEQ ID NO:113和114。
21.实施方案20的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链和轻链可变区包含与选自(a)-(m)的重链和轻链可变区至少95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
22.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白并且包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的重链和轻链序列：
SEQ ID NO:10和11，
SEQ ID NO:20和21，
SEQ ID NO:34和35，
SEQ ID NO:34和36，
SEQ ID NO:45和46，
SEQ ID NO:55和56，
SEQ ID NO:65和66，
SEQ ID NO:75和76，
SEQ ID NO:85和86，
SEQ ID NO:103和104，
SEQ ID NO:103和105，
SEQ ID NO:103和106，和
SEQ ID NO:115和116。
23.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中通过肽作图(例如，如实施例1所述地)，所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第123-128位氨基酸的全部或一部分。
24.实施方案23的抗体或其抗原结合部分，其中通过肽作图(例如，如实施例1所述地)，所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第125-128位氨基酸的全部或一部分。
25.实施方案1-22中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中通过肽作图(例如，如实施例1所述地)，所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-139位氨基酸的全部或一部分。
26.实施方案1-22中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中通过肽作图(例如，如实施例1所述地)，所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第119-126位氨基酸的全部或一部分。
27.实施方案1-22中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中通过肽作图(例如，如实施例1所述地)，所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-138位氨基酸的全部或一部分。
28.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合大鼠和小鼠α-突触核蛋白。
29.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合人β-突触核蛋白和人γ-突触核蛋白。
30.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中，以通过基于发光的结合测定法(例如实施例3所述的)确定的α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白PFF结合比(单体:PFF结合比)评估，所述抗体对α-突触核蛋白PFF具有比对α-突触核蛋白单体更大的亲和力。
31.实施方案30的抗体或其抗原结合部分，其中单体:PFF结合比为100或更大、500或更大、700或更大、1500或更大、3000或更大、或5000或更大。
32.一种抗体或其抗原结合部分，其与实施方案21的抗体结合相同的表位。
33.一种抗体或其抗原结合部分，其与实施方案21的抗体竞争对人α-突触核蛋白的结合。
34.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体选自由下述者组成的群组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，或它们的变体。
35.实施方案34的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是IgG1抗体。
36.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含具有降低的效应器功能或没有效应器功能的Fc区。
37.实施方案36的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含无效应器的IgG1 Fc，所述无效应器的IgG1 Fc包含下列突变：L234A、L235E和G257A。
38.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分为嵌合、人源化或人抗体。
39.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体被修饰以降低在人中的免疫原性。
40.实施方案39的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含分别在SEQ ID NO:18和19中列出的重链和轻链可变区。
41.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其是单克隆抗体。
42.一种双特异性分子，其包含任一前述实施方案的抗体以及与之连接的具有第二结合特异性的分子。
43.实施方案42所述的双特异性分子，其中所述第二结合特异性增加该分子向脑中的转运。
44.一种核酸，其编码实施方案1-43中任一项的抗体或其抗原结合部分或双特异性抗体的重链和/或轻链可变区。
45.一种表达载体，其包含实施方案44的核酸分子。
46.一种细胞，其转化有实施方案45的表达载体。
47.一种免疫缀合物，其包含实施方案1-43中任一项所述的抗体或双特异性抗体，以及与之连接的部分。
48.实施方案47的免疫缀合物，其中所述部分是结合部分、标记部分、生物活性部分、或治疗剂。
49.一种组合物，其包含：实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物，以及医药上可接受的载体。
50.一种试剂盒，其包含：实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物，以及使用说明。
51.一种制备抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分的方法，包括在实施方案46的细胞中表达该抗体或其抗原结合部分，并从该细胞分离所述抗体或其抗原结合部分。
52.一种抑制细胞中不溶性丝氨酸129磷酸化α-突触核蛋白聚集体的生成的方法，包括使细胞与有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物接触。
53.实施方案52的方法，其中丝氨酸129的磷酸化是被α-突触核蛋白寡聚体诱导的。
54.实施方案53的方法，其中所述α-突触核蛋白寡聚体是预形成的α-突触核蛋白纤丝。
55.实施方案53的方法，其中所述α-突触核蛋白寡聚体衍生自来自具有突触核蛋白病的患者的脑样品。
56.一种治疗以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物。
57.一种减轻以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的严重性的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物。
58.一种延迟以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的进展的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物。
59.一种降低发生以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的风险的方法，包括对有发生该疾病的风险的受试者施用有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物。
60.一种延迟以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的发作的方法，包括对有发生该疾病的风险的受试者施用有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物。
61.一种诊断受试者中以路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的方法，该方法包括：
(a)使来自受试者的样品与实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物接触，使得形成抗体-抗原复合物；
(b)测量所形成的复合物的量；和
(c)比较样品中复合物的量与对照中的量，其中样品中复合物相对于对照水平升高表明患者具有以路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病。
62.实施方案61的方法，其中所述样品是脑脊液、脑组织提取物、尿或血。
63.实施方案56-62中任一项的方法，其中所述疾病是帕金森病、帕金森病痴呆、路易体痴呆、路易体病、多系统萎缩、或单纯性自主神经衰竭。
64.实施方案56-63中任一项的方法，包括使用一种或多种额外的治疗手段(therapeutics)。
65.一种检测样品中的α-突触核蛋白的方法，包括使样品与实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物在容许所述抗体或其抗原结合部分和α-突触核蛋白形成复合物的条件下接触，并检测所述复合物的形成。
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通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为进一步的限制。本申请中引用的所有附图和所有参考文献，Genbank序列，专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。尤其是PCT公布案WO 09/045957、WO 09/073533、WO 09/073546、WO 09/054863和PCT/US2013/072918和美国的公开案2011/0150892通过提述明确地并入本文。
实施例
下面的实施例中提到的可商购的试剂，除了另有说明之外，是按照制造商的说明使用的。除了另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准程序，例如本文前述部分和下面的教科书中描述的那些：Sambrook et al.,同上；Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.,1989)；Innis et al.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(AcademicPress,Inc.:N.Y.,1990)；Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Press:Cold Spring Harbor,1988)；Gait,Oligonucleotide Synthesis(IRL Press:Oxford,1984)；Freshney,Animal Cell Culture,1987；Coligan et al.,Current Protocols in Immunology,1991。
实施例1:抗α-突触核蛋白(抗-αSyn)抗体的生成
本实施例描述全人抗α-突触核蛋白单克隆抗体(mAb)的生成，所述抗体相比于αSyn单体优先结合由人重组野生型αSyn组成的预形成的纤丝(PFF)。
在转基因小鼠的HCo42株(“HuMAb”是Medarex，Inc.，Princeton，NewJersey的商标)和KM小鼠(KM品系含有如PCT申请号中所述的WO 02/43478SC20转染色体)中产生人抗αSyn单克隆抗体。
用重组人αSynWT或αSynA53T-PFF突变蛋白、以及和交联的αSynWT或A53T PFF来免疫重组人转基因小鼠。Fusion 5448中使用的小鼠通过在通过腹膜内(IP)和皮下(SC)注射每只小鼠25μg的αSyn A53T-PFF(于Ribi佐剂中)来免疫。Fusion 5450中使用的HCo42小鼠用αSynWT-PFF、αSynA53T-PFF、交联αSynWT-PFF和交联αSyn A53T-PFF的混合物(1:1:1:1)，每只小鼠25μg进行腹膜内+皮下+跗关节(IP+Sc+Hock)免疫。通过将每种1mg/mL PFF储液(WT、A53T和交联的WT、A53T)各200μL混合，制成PFF抗原混合物储液。将抗原悬浮在Ribi佐剂中。被选择用于融合和杂交瘤的小鼠在融合前3天进一步接受抗原的静脉内/腹膜内(IV/IP)增强免疫，所述抗原溶于Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS)中。
脾细胞或淋巴结与P3x63Ag8.653细胞融合后，通过检测人γ/人κmAb的存在，筛选融合板中的抗原特异性抗体。测试来自融合板的细胞对αSynPFF或天然αSyn单体的结合特异性。从功能筛选中筛选出的αSynPFF阳性杂交瘤通过单细胞亚克隆进行亚克隆，以确保细胞系稳定性和杂交瘤单克隆性。再次通过ELISA测试每个亚克隆的抗原特异性结合(即αSynPFF结合)，产生以下亚克隆：11H11-1、11H11-2、15A5、7A10、36A3、44B11和21A3。通过ELISA，同种型分析显示所有6种抗体均为人IgG1/κ。表22提供了重链和轻链、重链和轻链可变区、以及重链和轻链CDR1-3的氨基酸和核苷酸序列。
7A10的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列8和9组成。11H11-1的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列28和29组成。11H11-2的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列28和29组成。15A5的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列38和39组成。21A3的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列48和49组成。36A3的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列58和59组成。44B11的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列68和69组成。2E2的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列78和79组成。23H8-1的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列94和95组成。23H8-2的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列94和96组成。23H8-3的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列94和97组成。1E8的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列106和107组成。
还产生了上述抗αSyn抗体的无效应器功能版本。如本文所用的，hIgG1f是指IgG1的具有SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的同种异型，而hIgG1.3f是指hIgG1f的三重突变体版本(L234A，L235E，G237A)，其缺乏Fcγ受体结合且缺乏效应器功能。hIgG1.3f具有在SEQID NO:119中列出的氨基酸序列。
实施例2：抗αSyn抗体的表位作图
通过使用一系列重叠的αSyn肽来确定实施例1中描述的抗αSyn抗体的表位结合位点。
产生了一系列重叠肽，这些肽具有人αSyn序列的10个氨基酸，并具有N端生物素基团、PEG4接头以及C端CONH2(表1)。将肽以1mg/ml溶解在DPBS中。为了作图研究，将100μL0.25μg/mlα-突触核蛋白肽(溶于D-PBS中)添加到NeutrAvidin包被的高容量96孔板(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中，在室温温育2h(或在4℃过夜)。用～300μL洗涤缓冲液(0.05％Tween溶于DPBS中)将板洗涤3次。然后在室温下，用150μl 3％BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，溶于DPBS中，封闭板约2h(或在4℃过夜)。将稀释在样品缓冲液(0.1％BSA/0.05％Tween/dPBS，2片蛋白酶抑制剂(Roche complete，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中的测试样品100μL在50ml缓冲液中在平板上室温温育2h。将板洗涤3次，加入在PBSTB(1％BSA/0.2％Tween/DPBS)中以1:1000稀释的二抗100μL，室温温育1hr。洗涤平板3次，每次洗涤5～10分钟。添加100μL AP底物(Tropix CDP Star Ready-to-use，带Sapphire II，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)并在室温下显影30分钟。用PerkinElmer EnVision(2102Multilabel Reader，PerkinElmer，Waltham，MA)读取发光计数，在测定全过程中板保持恒定摇动(滴定板摇床)，使用的二抗包括：碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA))，碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。将所有二抗稀释至甘油终浓度为50％。
初步实验确定，所有抗体均识别位于αSyn的C末端区域的表位。表1中显示的重叠肽被用来精细化每种抗体的表位结合位点。
表1:表位作图肽
a生成了具有人αSyn序列的10个氨基酸的重叠肽，它们具有N末端生物素基团以及PEG4接头盒C末端CONH2。
表位作图的结果如图1所示。数据显示7A10、21A3、15A5、36A3和1E8在αSyn的氨基酸123-128内结合，对应于氨基酸序列EAYEMP(SEQ IDNO:121)；11H11-1在αSyn的氨基酸125-128内结合，对应于氨基酸序列YEMP(SEQ ID NO:122)；44B11在αSyn的氨基酸130-139内结合，对应于氨基酸序列EEGYQDYEPE(SEQ ID NO:124)；2E2在αSyn的氨基酸119-126内结合，对应于氨基酸序列DPDNEAYE(SEQ ID NO:125)；而23H8结合在αSyn的氨基酸130-138中，对应于氨基酸序列EEGYQDYEP(SEQ ID NO:123)。
实施例3：抗αSyn抗体相比于αSyn单体对αSyn-PFF的选择性
该实施例表明，抗αSyn抗体相比于αSyn单体优先结合αSyn-PFF。
在20mM Tris/HCl，100mM NaCl，PH7.4中将重组的野生型人αSyn(rPeptide，Bogart，GA)和含有A53T突变的人αSyn(rPeptide，Bogart，GA)重构为1mg/ml。使用标准规程生成PFF(Luk等人，PNAS 2007；106:20051-6)。简而言之，将单体在2ml带安全帽的Eppendorf管(～1ml/管)中于37℃持续摇动下(滴定板摇床)温育4天，然后在100,000g的室温下离心20分钟。将离心沉淀重悬于PBS中以使最终PFF浓度为1mg/ml。
通过硫代黄素T结合测定法、变性(SDS-PAGE)和非变性(天然)凝胶电泳、以及尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)来监测αSyn的纤丝化。对于硫代黄素-T测定，将样品在PBS中稀释至0.5mg/ml，并添加至等体积的25μM硫代黄素-T中。然后使用Envision多标记酶标仪(PerkinElmer，Waltham，MA)测量样品，激发和发射波长分别设置为485和535nm。使用MicroBCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)和Imperial ProteinStain(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)评估总蛋白质水平。
为了进行SDS-PAGE分析，将NuPAGE样品还原剂(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中的PFF样品在加热块(70℃)中温育10分钟，通过SDS-PAGE(1μg/10μl/泳道)分离，SDS-PAGE使用4-12％Bis-Tris凝胶(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)和MESSDS运行缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)在200V恒压下进行，然后转移至硝酸纤维素膜(孔径为0.45um，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)，转移使用含10％甲醇的Tris/甘氨酸缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)，恒压50V，1.5h。对于非变性PAGE(Native-PAGE)，PFF样品用NativePAGE分离(1μg/10μl/泳道)，NativePAGE使用3-12％Bis-Tris蛋白凝胶(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)和NativePAGE运行缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)在150V恒压下进行，然后使用NuPAGE转移缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)在50V，1.5h恒压下转移到PVDF膜(孔径为0.45um，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)上。PVDF膜分别用甲醇预处理30sec，dH2O预处理2min和转移缓冲液预处理10min。在室温下，用5％脱脂奶粉(ThermoFisher Scientific，Waltham)(溶于0.1％Tween/TBS中)封闭膜2h，然后与一抗4B12(BioLegend，San Diego，CA，1％BSA/0.1％Tween/TBS中1:1000稀释)在4℃下温育过夜。然后将膜用0.1％Tween/TBS洗涤3次(每次洗涤5～10分钟)，然后与抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA，过氧化物酶缀合的亲和纯化Fab2，以1％BSA/0.1％Tween/TBS稀释1:10,000)在室温下温育1h。然后将膜如上洗涤3次，然后与SuperSignalWest Femto最大灵敏度底物(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)温育5分钟。使用GEAmersham成像仪600进行检测。SDS-PAGE使用MagicMarkTMXP Western蛋白标准品(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)和SeeBlue plus 2(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)。非变性凝胶则使用未染色蛋白标准品(Invitrogen)。洗涤缓冲液(TBST)由Tris缓冲盐水中的0.1％Tween-20组成。
对于结合测定法，将96孔板(高结合微孔板)用100μL的1μg/mlαSynWT PFF(溶于DPBS中)室温下包被2h(或在4℃过夜)。用～300μL洗涤缓冲液(溶于DPBS中的0.05％Tween)将板洗涤3次。在室温下将板用150μl 3％BSA/DPBS封闭2h(或在4℃过夜)。在样品缓冲液(0.1％BSA/0.05％Tween/DPBS，2片蛋白酶抑制剂(Roche complete，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，溶于50ml缓冲液)中制备了PFF(从2μg/ml开始)和α-synWT单体(从20μg/ml开始)的三倍系列稀释液。为了进行抗体温育，将等体积的2倍测定浓度的αSynPFF或单体与2倍测定浓度的抗体在BD falcon低结合平板中混合，并在室温下温育约2小时。将100μL抗体和PFF或单体的混合物添加到PFF包被的板，并在室温下温育10分钟。将板洗涤3次。加入100μL驴抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，含50％甘油，PBSTB(1％BSA/0.2％Tween/dPBS)中1:1000稀释)，并将板在室温下温育1小时。将板洗涤3次，每次洗涤5-10分钟。加入100μL AP底物(Tropix CDP Star Ready-to-Use，含Sapphire II，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，在室温下显影30分钟。用Perkin Elmer EnVision(2102Multilabel Reader，PerkinElmer，Waltham，MA)读取发光计数。在包被或与抗体混合之前，以15次1秒脉冲对PFF进行超声处理。在测定期间，将板保持恒定摇动(滴定板摇床)。
如图2所示，评估了抗αSyn抗体对αSyn单体和对WT或A53T αSyn PFF的结合强度。对照抗体1的数据也显示在图3中。对于所有测试的抗体，观察到与WT PFF和A53T PFF的相似结合。除对照抗体1和2以外，所有六种抗-αSyn抗体均相比于αSyn单体优先与αSyn PFF结合，M/P比率至少为500。结合数据汇总如表2所示。
表2:结合测定结果汇总
a M/P＝单体/PFF结合比(比值越低意味着对PFF的偏好越高)
b抗体1和抗体2为对照抗体
实施例4:抗αSyn抗体的去免疫化
该实施例确定了将一部分抗αSyn抗体去免疫化对与αSyn单体和αSynPFF结合的影响。
为了通过人源化去除可能的免疫原性热点，分析了7A10的重链和轻链序列的免疫原性。分析了7A10与世界人群等位基因中27种常见HLA的结合，并鉴定了非种系区段，以确定可能的免疫原性热点。
同源肽(作为内吞作用和树突状细胞降解生物物质的副产物而产生)与MHC-II等位基因结合，然后呈递到树突状细胞的表面，对于适应性免疫应答是至关重要的。但是，除了与MHC-II等位基因结合外，所呈递的肽还必须是非固有的(非自身的)，CD4+ T细胞受体才能与其结合(T细胞识别)，从而导致活化和T细胞增殖。为了通过计算机模拟这些作用并模拟多种多样的供体的作用，首先将抗体分解为15-mer的肽，从N端起，一次一个氨基酸地系统性向C端移动。对于每个获得的15-mer肽，评价其(i)与世界人口中27种常见的HLA的结合，和(ii)与人免疫球蛋白种系序列的完美序列匹配。如果有种系完美匹配，则该15-mer肽被认为是“自身”的，因此不具有抗原性。另一方面，如果确定为“非自身的”(在不存在完美的种系匹配的情况下)，则如果它与27个等位基因中的某些具有足够的亲和力，则被认为具有潜在的抗原性。
肽/MHCII结合亲和力的预测是使用IEDB(Immune Epitope Database,免疫表位数据库)分析资源共识工具进行的。预测的亲和力以百分位数等级的形式报告，基于五种不同的肽MHC-II结合预测方法的共识。
图4显示了7A10重链和轻链的免疫原性分析。分析结果表明，轻链(VK)被预测为大体上是非免疫原性的，仅有的热点位于CDR3中——CDR3通常涉及与抗原决定簇的结合。重链(VH)具有两个显示热点分布在较大区域上的区域，即CDR2(残基49-65)和FW3-CDR3(残基90-98)。忽略长度小于8个延伸点的热点，仅考虑了对VH链中的两个区域(49-65、90-98)通过诱变来降低风险。
图4中每个氨基酸下方的数字表示结合以该氨基酸为中心的15-mer肽的等位基因的比例。例如，7A10_VH中Y52处的“5”是指以Y52为中心的15-mer肽，即LEWIGYIYYSGRTKY，且表示(i)该肽不具有人类种系匹配(因此是非自身的)，并且(ii)27个等位基因中有50-60％表现出对该肽的高结合亲和力。数字根据从浅灰色(最不可能具有免疫原性)到深灰色(最可能具有免疫原性的热点)的量表来指配。三个粗体箭头表示突变体选择的位置：R56S，K58N和T93A。
使用体外人PBMC增殖测定法评估了7A10和去免疫化的7A10-T93A的人免疫原性风险。Avastin和αIL-21RmAb用作阴性和阳性测定对照，因为它们的临床免疫原性与体外免疫原性测定结果呈正相关。通过Ficoll(GEHealthcare)梯度离心从健康志愿者中分离出PBMC，并利用聚合酶链反应扩增以及与寡核苷酸探针(ProImmune)的杂交来表征II类人白细胞抗原(HLA)。每次测定均使用由40名PBMC供体组成的小组，该小组的II类HLA组成与世界人口频率紧密相符。用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，Invitrogen)标记PBMC以监测增殖，并以200,000个细胞/孔的形式以96个孔板铺板在RPMI(Lonza)中，其中含有10％人源AB血清(Bioreclamation)，非必需氨基酸(Gibco)和青链霉素(Gibco)。将1μM的α突触核蛋白抗体和对照蛋白与PBMC培养7天，然后洗去培养基，并用缀合APC(别藻蓝蛋白，BDBiosciences)的抗人CD4 mAb标记细胞。用洗涤步骤除去未结合的抗CD4 mAb之后，将剩余细胞用3.7％福尔马林(Sigma)的PBS固定，并通过流式细胞仪分析以确定增殖的CD4+ T细胞的百分比。当特定抗体的CD4+ T细胞增殖百分比大于仅含培养基的CD4+ T细胞增殖百分比加两个标准偏差时，则认为供体是阳性的。将显示阳性增殖信号的40个供体的百分比作为数据呈现。
与这些抗体温育后显示出显著CD4+ T细胞增殖反应的供体的百分比如图5所示。7A10在40个PBMC供体中21个(52.5％)中产生了增殖反应，而7A10-T93A在40个供体中的5个(12.5％)中显示出增殖反应。
实施例5：去免疫化的抗αSyn抗体与αSyn单体和αSynPFF的结合
该实施例通过ELISA评估了实施例4中所述的去免疫化版本7A10、和21A3的去免疫化版本即21A3-V82L与αSyn单体和αSynPFF的结合。ELISA如实施例3所述进行。
如表3所示，在7A10-T93A和21A3-V82L版本展示的PFF结合强度在亲本抗体测得的强度的2倍以内；而单体结合值的可变性更大，这是由于对于这些相对较弱的强度，难以生成准确的浓度-反应曲线。与7A10亲本相比，K58Y-T93A的PFF结合弱>10倍，而R56S-T93A和R56S-K58N-T93A的PFF结合强度在7A10的2倍以内。
表3:去免疫化的α-突触核蛋白变体的结合汇总
a如标明的，显示的数据是Fc惰性人同种型IgG1.3的数据
b为产生可接受的对照信号所需的抗体浓度
实施例6：抗-Syn抗体与大鼠、小鼠和人αSyn的种间反应性
为了评估物种的交叉反应性，测试了抗αSyn抗体与代表大鼠、小鼠和人αSyn中氨基酸111-140的肽的结合(表4)。人、大鼠和小鼠的αSyn序列之间在121-122位不同。结合测定如实施例3中所述进行。
表4:人、大鼠和小鼠αSyn 111-140肽
*小鼠111-140(SEQ ID NO:156)、大鼠111-140(SEQ ID NO:157)、人111-140(SEQID NO:158)
与相应的人肽相比，抗αSyn抗体对大鼠和小鼠的/Syn-111-140肽具有相似的结合(图6)。肽结合结果的汇总示于表5中。总体而言，抗αSyn抗体与啮齿动物111-140肽的结合强度比对相应的人肽弱2-3倍。
表5:对人、大鼠和小鼠αSyn 111-140肽结合的汇总
表5:对人、大鼠和小鼠αSyn 111-140肽结合的汇总
实施例7：抗αSyn抗体与人αSyn、βSyn和γSyn的交叉反应性
在该实施例中，如实施例3中所述，通过ELISA测试了抗αSyn抗体与人βSyn和人γSyn的结合和交叉反应性。
如图7所示，抗体未区分人αSyn、βSyn或γSyn。包括了与PFF的结合作为阳性对照。
实施例8：抗-Syn抗体的生物物理表征
该实施例描述了使用各种方法表征抗αSyn抗体的生物物理特性。表6总结了热稳定性、分子量、pI、疏水性分析的结果。
表6:生物物理性质
对于差示扫描量热法(DSC)，以1mg/ml的抗体以60℃/hr升温对样品进行扫描。如表6所示，所有7A10抗体均表现出良好的折叠稳定性。
表6中显示的所有三种7A10抗体均通过完整质谱(MS)分析评估了身份。分析使用ACQUITY UPLC/Waters Synapt G2质谱仪。样品用1mg/mL的DTT(100mM)还原。UPLC/MS条件：1μg样品注射到BEH C4 RP柱上，2.1x 150mm，1.7mm粒度，60℃，20分钟梯度：10min内10％至38％(流动相B)，LC流速200μL/min，正MS离子模式。该方法也用于糖基化谱分析。
通过完整质谱(MS)分析，根据测得的质量与根据氨基酸序列理论预测的质量之间的一致性，确认了所有三种7A10抗体的身份。此外，测定了糖基化谱，发现是N297位糖基化的mAb的典型谱。
接下来，用iCIEF在以下条件下测量电荷均质性：ProteinSimple iCE3仪器；1分钟1500V预聚焦，10分钟3000V聚焦，样品在0.2mg/mL的0.35％甲基纤维素，2.0M尿素，1％v/vPharmalyte 5-8和3％v/v Pharmalyte 8-10.5。pI标记物5.8和10.10的条件下运行。表6列出了测得的pI值接近9，84-87％的主峰，11-13％的酸性变体，及其余的碱性变体。
还通过疏水相互作用色谱法(HIC)检测抗体的均质性，使用以下条件：TosohTSKgel丁基NPR柱，流动相A：0.1M磷酸钠pH 7.0、2M硫酸铵；流动相B：0.1M磷酸钠pH 7.0；流速：1.0mL/min。如表6所示，所有三种抗体均100％显示为主峰。
为了评估抗体是否聚集或被截短，在以下条件下进行了SEC分析：Shodex K403-4F柱，缓冲液＝100mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH7.3，流速＝0.3mL/min。如表6所示，所有版本的7A10均未检测到HMW种类。
还在受迫稳定条件下，包括高浓度和高温条件下，对7A10-IgG1f、7A10-IgG1.3f和7A10-T93A-IgG1.3f的稳定性进行了测试。将抗体在20mM组氨酸，250mM蔗糖，pH 6.0中浓缩至100mg/ml以上，并在4℃下保存4周。然后分析抗体中HMW或LMW种类的增加。如表7所示，上述两个种类几乎没有增加，表明7A10具有很好的可浓缩行为。
还将抗体以10mg/ml的最终抗体浓度对相同的组氨酸缓冲液透析，并在40℃下温育4周，以迫使任何潜在的化学或物理降解发生。如表7所示，所检测的三种7A10抗体中的HMW种类均未增加。出现少量的LMW种类(2.5-5％)。
还通过CIEF测量了抗体的电荷谱。抗体表现出典型的峰分布，其中大部分是主峰，酸性种类是第二大的群体，而碱性种类是最小的群体。这些带电种类在暴露于40℃4周后的比例变化也是抗体的典型现象。
表7:受迫下的稳定性
实施例9：抗-αSyn抗体与预形成的-αSyn原纤维的结合亲和力
该实施例描述了使用表面等离子体共振(SPR)的7A10的αSyn结合行为。
图8显示了与捕获在表面的抗体和溶液中的野生型单体αSyn的结合行为。这种格式可以测量单价亲和力。野生型αSyn显示出非常低和弱的结合。相比之下，当将PFF作为溶液分析物进行测试时，观察到质量大得多的αSyn的结合。这与由于多价PFF的二价亲合力导致的紧密度增加是一致的。还测试了对照抗人αSyn抗体1。如图8所示，抗体1以相似的缔合和解离速率结合单体和PFFαSyn，提示对于该抗体，二价/亲合力没有带来可检测到的结合增强。
接下来，对SPR分析的格式进行了优化，以方便估计结合亲合力。注意，PFF是多聚体，而7A10是正常的二价单克隆抗体。因此，结合数据反映了由于亲合力效应所致的结合亲和力的增强(参见图8)。
如图9所示，7A10和7A10-T93A与固定在表面的PFF具有相似的亲合力(7A10：ka(1/Ms)：5.811E+7，kd(1/s)：0.009834，KD：1.692E-10M；7A10-T93A：ka(1/Ms)：8.946E+7，kd(1/s)：0.03873，KD：4.329E-10M)。发现两者的缔合动力学都非常快。尽管如此，还是以1:1结合模型对这两个数据集进行了尽可能精确的分析，以确定在这种测定形式中亲合力是否存在可辨别的差异。根据曲线拟合，似乎两种抗体结合固定在表面上的PFF的亲合力相差4倍以内。
实施例10：体外抗αSyn抗体阻断不溶、聚集的αSyn的诱导
该实施例描述了抗αSyn抗体能够在体外阻断PFF或MSA脑裂解物诱导αSyn的细胞内、去污剂不溶性的磷酸化(pS129)聚集体的产生。
用PFF或MSA脑裂解液处理后，可在培养细胞中诱导αSyn的胞内、去污剂不溶性的磷酸化(pS129)聚集体(Prusiner等人，PNAS 2015：112：E5308-17；Luk等人，PNAS 2007；106:20051-6)。开发了类似的系统，其中使用大鼠海马神经元过表达人A53T αSyn，将细胞暴露于PFF或MSA脑裂解物样品11天后，测量不溶性pS129αSyn的诱导。
方法
a.PFF的制备和纤丝化(fibrillization)分析
使用实施例3中所述的方法制备和分析PFF。
b.人脑裂解物的制备
大脑皮层样本取自Banner Health Research Institute(Sun City，AZ)。将来自12-18、01-03和04-51号患者的MSA脑组织用于免疫耗竭实验。对脑样本进行超声处理，其中超声处理用KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter(输出40，调谐50)在经过滤的PBS(1ml PBS/100mg组织湿重)中进行2x 10秒。将样品置于2ml Eppendorf管中，管在超声处理期间将置于湿冰上。将脑溶解液在3,000g，4℃下离心5分钟。将上清液的等分试样在液氮中冷冻并保存在-80℃。进行了包括αSyn ELISA(总的，以及pS129)在内的QC测定。为了分离高速旋转离心沉淀，将先前在PBS中以100mg/ml制备的脑匀浆物在冰冷PBS中稀释3倍至33.3mg/ml，然后在100,000x g下于4℃离心30分钟。除去上清液并丢弃。将离心沉淀以与起始样品相同的体积重悬于冰冷的PBS中。
c.原代细胞培养分离
使用木瓜蛋白酶解离系统(Worthington Biochemical)，按照制造商的说明，在胚胎第19天(E19)每周从约7窝幼鼠制备原代大鼠海马神经元培养物。将大鼠海马细胞在神经元培养基中以30,000/孔接种到PDL包被的96孔BD成像板上(每周约16个板)，其中，神经元培养基含有神经基础培养基(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)和0.5mM GlutaMax(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，且补充有1X B-27(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)。
d.免疫沉淀
将先前制备的脑匀浆(100mg/ml)在完全神经基础培养基(NBM)(含有青链霉素、Glutamax和B-27补充剂的神经基础培养基)(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中稀释150倍。通过将抗体的测试浓度添加到一个等分试样的稀释的脑匀浆中用于测试突触核蛋白抗体的浓度响应函数。将样品在4℃下温育，并连续颠倒温育2小时，然后以1:10的稀释度向样品中添加经洗涤和封闭的Protein A/G琼脂糖珠浆，然后在4℃下连续颠倒温育过夜。Protein A/G琼脂糖珠(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)用PBS+0.05％吐温20洗涤一次、用PBS洗涤3次、然后在PBS+1％BSA中于4℃封闭2小时；每个步骤2倍珠体积；最终珠样品浆液的PBS:珠离心沉淀的比例为1：1。温育后，将样品以1500g离心2分钟，使珠粒沉淀。移出经过耗竭的上清液用于免疫荧光测定法中的处理。
e.免疫荧光测定
在体外培养(DIV)第4日，用含有人αSyn(含A53T突变)的cDNA的腺伴随病毒载体AAV1(GeneDetect，Bradenton，Florida)转导大鼠海马神经元，转导的MOI为3,000。在DIV第7日，用测试样品处理细胞(每个处理6个孔)。所有处理均通过半量更换培养基来完成。每块板均包含阴性对照(无处理条件)、阳性对照(10nM PFF)和无耗竭诱导剂对照。在DIV第18日(处理后11日)，将细胞固定并染色检测不溶性αSyn。为了固定，加入含有4％多聚甲醛、4％蔗糖和1％Triton的溶液15分钟。固定后，将细胞用含DPBS+0.05％吐温的洗涤缓冲液洗涤3次。然后将细胞用DPBS中的3％BSA和0.3％Triton阻断1-2小时以阻断非特异性信号。封闭步骤后，将细胞在封闭缓冲液中用一抗处理过夜。使用的一抗为抗αSyn和β突触核蛋白(EP1646Y，Millipore/Abcam；Cambridge,UK；N末端兔单克隆抗体，1:100稀释液)，抗S129磷酸化αSyn(81A，Covance/Biolegend，Bogart，GA小鼠单克隆，1:1000稀释)和抗MAP2(ab5392，Abcam；Cambridge，UK；鸡多克隆，1:10,000稀释)。第二天，将板用含0.05％吐温的DPBS洗涤3次，然后与荧光偶联的二抗温育1小时。使用的二抗为：Alexa Fluor 647山羊抗小鼠IgG，1:500稀释；Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG，1:500稀释；Alexa Fluor 568山羊抗鸡IgG，1:500稀释；和Hoechst，1:800稀释。所有第二抗体均获自Invitrogen。然后将板用DPBS加0.05％吐温洗涤3次，每次15分钟，最后一次洗涤仅用DPBS。
f.高含量免疫荧光分析
在ArrayScanTMVTi自动显微镜和图像分析系统(Cellomics Inc.，Pittsburgh，PA)上以10倍物镜采集图像。成像的板使用High Content Studio 3.0软件包(Cellomics，USA)中的神经元分析应用程序分析。利用Hoechst荧光(其定义核区域)来鉴定细胞，而通过MAP2染色来鉴定神经突。通过将核染色和MAP2染色重叠来鉴定细胞体。通过另外两个通道中的荧光强度来鉴定总的不溶性αSyn和总的S129磷酸化的αSyn(pS129)。诱导通过共定位于神经突中的总pS129斑点强度来定量。通过对阴性对照孔的平均值归一化来确定诱导倍数。通过将归一化的核计数、归一化的神经元计数和归一化神经突长度相乘来计算毒性指数，然后将每个孔对阴性对照孔的各自平均值归一化。毒性得分低于0.6的孔排除出分析。将每种抗体测试浓度的诱导倍数对用未耗竭的诱导剂处理的孔的平均值归一化。通过Prism(GraphPad)中的最小二乘拟合生成浓度响应曲线，使用公式Y＝底+(顶-底)/(1+10^((X-LogIC50)))，并为每个实验计算IC50。
结果
如图10A所示，通过高含量免疫荧光分析测量，使用AAV-hA53T-αSyn过表达A53T αSyn导致PFF诱导的pS129信号的强劲增加。PFF诱导的pS129信号是剂量依赖性的，并且用高至300nM的各种浓度的hA53T-αSyn单体均无法引发该信号(图10B)。另外，用9种不同的MSA脑裂解液样品处理也诱导了pS129信号(图10C)；但是，对照脑裂解物未观察到诱导(图10D)。pS129信号的PFF依赖性增加与MAP2阳性神经元的分枝点减少相关(图10E)。MSA裂解物中的诱导活性可以通过高速离心分离(图10F)，提示这些样品中的诱导剂是高分子量的聚集体。另外，用MSA离心沉淀处理后，pS129信号随时间而增加(7d温育：10nM PFF的0.22±0.06，n＝6；14d温育：10nM PFF的0.32±0.05，n＝6；18d温育：10nM PFF的0.52±0.08，n＝6)(图10G)。最后，与用hA53T-aSyn PFF所致的病理相似，用MSA脑裂解液处理后，分支点也减少了(10nM PFF：0.50±0.16，n＝4300；MSA：0.58±0.17，n＝1842；图10H)。
然后使用高含量测定法评估了不同的αSyn抗体免疫耗竭PFF和MSA脑裂解物样品中的诱导活性(即PFF诱导的S129磷酸化)的能力。测试了来自3名MSA患者，12-18号、01-03号、04-51号患者的裂解物。为了进行免疫耗竭，将样品与一系列浓度的抗体温育过夜。然后去除免疫复合物，将经过耗竭的样品与神经元培养物一起温育11天。通过对未经耗竭的对照孔的平均值的pS129强度归一化来测量诱导。图11中显示了用基准抗αSyn抗体抗体1进行的免疫耗竭的示例性浓度响应曲线，表8-11中汇总了IC 50。抗体1对PFF和MSA脑裂解物均显示出强效而完全的诱导剂消耗。这些结果证实了MSA裂解物中的诱导活性是依赖αSyn的。与对MSA裂解物(5.47nM，2.48nM和0.43nM，表9-11)相比，抗体1对PFF的诱导活性的耗竭更强(0.032nM，表8)，这提示这些诱导性种类在水平或构型方面可能存在差异。
接下来，测试了抗体7A10、21A3、36A3、15A5、11H11-1和44B11对PFF和MSA脑裂解物的诱导活性的免疫耗竭作用。7A10、21A3、36A3、15A5、11H11-1和44B11的浓度响应曲线示例分别如图12-17所示。表8-11分别总结了PFF，MSA 12-18，MSA 01-03，MSA 04-51的平均IC50值。与抗体1相似，所有6种抗体均以浓度依赖的方式耗竭了PFF的诱导活性(图12-17)。平均IC50为0.018nM至0.066nM，与抗体1的IC50无显著差异(表8)。所有6种抗体也以浓度依赖的方式完全耗竭了MSA裂解物；但是，与PFF结果相反，一些抗体的效力明显强于抗体1(表9-11)。例如，7A10在3种MSA裂解物中的诱导活性的耗竭均显著强于抗体1：7A10对MSA 12-18的耗竭是抗体1的14倍强(p<0.001，表9)，对MSA 01-03为抗体1的9倍强(p<0.05，表10)，对MSA 04-51为抗体1的12倍强(p<0.01，表11)。同样，21A3对于MSA 12-18的效力是抗体1的34倍强(p<0.01，表9)，对于MSA 01-03的效力是抗体1的7倍强(无显著性，表10)，对于MSA 04-51的效力是抗体1的10倍强(p<0.01)。相关的抗体15A5和36A3表现出相似的趋势(表9-11)。11H11-1与抗体1相比，效能差异的鲁棒性较小(表9-11)。44B11，其结合不同的表位，对MSA裂解物12-18的免疫耗竭是9E4的3倍强(p<0.05，表9)，且对MSA裂解物01-03(表10)和MSA裂解物04-51的耗竭与抗体1效力相当(表11)。观察到的效力的相对差异可能与诱导物的构象或菌株的差异有关，此类差异可能影响抗体表位的暴露或可及性。
表8:PFF IC50数据汇总
a统计数字相对于抗体1且基于配对t检验。ns:p>0.05；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001.除非另外标明，t检验结果为ns
表9:MSA 12-18裂解物的IC50数据汇总
a统计数字相对于抗体1且基于配对t检验。ns:p>0.05；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001.除非另外标明，t检验结果为ns
表10:使用MSA 01-03裂解物时的IC50数据汇总
a统计数字相对于抗体1且基于配对t检验.ns:p>0.05；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001.除非另外标明，t检验结果为ns
表11:MSA 04-51裂解物的IC50数据汇总
a统计数字相对于抗体1且基于配对t检验。ns:p>0.05；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001.除非另外标明，t检验结果为ns
还测试了去免疫化变体7A10和21A3对MSA 12-18提取物的免疫耗竭，以评估氨基酸修饰对抗体活性的影响。如表12所示，7A10-T93A与7A10亲本抗体(0.52nM)相比，展示出相似的耗竭MSA 12-18的诱导活性(0.66nM)；相反，其他7A10变体与7A10亲本相比弱化10-100倍。21A3的V82L变体表现出与21A3亲本相似的效力(表12)。这些结果加在一起表明，7A10-T93A和21A3-V82L中的修饰不影响总体抗体活性。
表12:使用MSA12-18时的IC50数据汇总
表12:使用MSA12-18时的IC50数据汇总
a统计数字相对于7A10或21A3亲本且基于配对t检验。ns:p>0.05；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001.除非另外标明，t检验结果为ns
结论是，7A10、21A3、36A3、15A5、11H11-1和44B11对PFF和3种不同的MSA裂解物的聚集诱导活性表现出强效而完全的耗竭作用。这些结果，与在先实施例的结果结合起来，提示这些抗体优先结合这些疾病脑提取物中发现的某种αSyn形式，这种形式可能与病理传播有关，因此这些抗体可能可以有效地阻止αSyn病理在小鼠体内的传播。
实施例11：抗αSyn抗体体内阻断αSyn病理
该实施例描述了抗αSyn抗体在小鼠模型中抑制αSyn病理的扩散和传播的能力。
方法
a.小鼠
该研究中使用的小鼠为2-3月龄的雄性和雌性[PAC-Tg(SNCAA53T)+/+；Snca-/-](PAC-A53T)小鼠，其在小鼠Snca基因敲除背景下带有人A53T突变(Kuo等人，HumanMolecular Genetics 2010:19:1633-50)，用于体内功效研究。小鼠以四只一组的形式收容在温度受控的容纳室中，随意提供食物和水。
b.抗体处理和立体定位手术
通过眶后抽血从一个子群的雄性和雌性PAC-A53T小鼠中收集大约40μl血液，用于设定抗体和抗药物抗体(ADA)水平的基线。整个小鼠群组分为两组：对照组和处理组。对照组的小鼠先进行腹膜内(i.p)生理盐水注射，然后向纹状体中注射PBS，每周一次的生理盐水注射4次，直到实验完成(n＝8)。第二组小鼠分为9个亚处理组：生理盐水(n＝11)，抗体1(n＝12)，7A10(n＝12)，11AH11(n＝12)，15A5(n＝11)，21A3(n＝11)，36A3(n＝11)，44B11(n＝12)和抗体3(n＝5)。第二组的所有小鼠在第一次腹膜内注射给药盐水或所选的抗体后均接种重组A53T-PFF。与对照组相似，处理组另外每周一次腹腔注射盐水或选定的抗体共4次。所有处理组的抗体剂量均为10mg/kg。抗体剂量的选择是基于研究I的结果，在研究I中，抗体3抗体有效减轻了PAC-A53T小鼠的pSer129病理。每周进行抗体处理之前，先在小鼠亚组中进行眼眶后采血，以评估所有处理组中的药代动力学(PK)和可能的ADA水平。A53T-PFF接种后30天和最后一次抗体治疗后24h处死小鼠。
立体定向注射：对于单侧纹状体注射，通过吸入异氟烷(1-4％)麻醉小鼠，并将小鼠放置在带有附加鼻锥的立体定位框架中，以在整个过程中维持异氟烷诱导的麻醉。先后用甜菜碱和70％异丙醇准备手术部位，然后切开1-2厘米的皮肤切口以暴露颅骨和参考标志性部位。用无菌棉拭子轻轻擦干净头骨。使用无菌的硬质合金微钻头在颅骨表面钻出0.5-1mm的孔。小鼠单侧注射10ug A53T-PFFs或PBS(对照组)至外侧纹状体(AP 0.2，ML-2.0，DV-3.6)。通过汉密尔顿注射器以每分钟0.25μl(每只小鼠总共2.5μl)的速率注射材料，并将针头保持在目标位置≥10min。一旦小鼠从手术中完全康复，就转移到容纳室中。
c.免疫组织化学(IHC)
在A53T-PFF注射后30天，处死小鼠以评估病理。对于组织学研究，将脑在4％多聚甲醛(PFA)中固定48小时，然后在15％蔗糖中固定24小时，然后在30％蔗糖溶液中固定48小时(或直到使用)。在滑动切片机(Leica Microsystems，Buffalo Grove，IL)上制备冠状、40μm系列脑切片，并放入冷冻保护剂中直至进行IHC分析。IHC程序包括以下步骤：将脑切片移入染色皿中，并在磷酸盐缓冲盐水(PBS，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中漂洗3次(5分钟/次)。然后将切片在3.7％甲醛(在PBS中)中后固定(postfix)10分钟。然后将它们在PBS中漂洗两次(10分钟/漂洗)。接下来，将切片在新鲜的含3％H2O2、10％甲醇的PBS中温育30分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。将切片在PBS中漂洗3次(10分钟/漂洗)，然后在室温下于10％正常血清(使用来自二抗物种的血清)加0.3％Triton X-100的PBS中封闭1小时。然后将切片在PBS中漂洗3次(10分钟/漂洗)。将脑切片在微量滴定板摇床中以4℃在一抗[抗-alpha-syn pSer129(Abcam，Cambridge，UK；ab51253)以1:100,000稀释)中温育过夜，其中摇床以轻柔但可均匀地搅动切片的速度运行。在IHC的第二天，将脑切片在PBS中漂洗4次(10分钟/漂洗)，然后在生物素化2°抗体(PBS中的1:500山羊抗兔抗体，Vector BA-1000)中温育60分钟。然后将切片在PBS中漂洗(4次，10分钟/漂洗)，然后在室温下在PBS中制成的ABC复合物中温育60分钟(Elite ABC试剂盒，Vector laboratories，Burlingame，CA)。在PBS中漂洗(4次，10分钟/漂洗)后，将切片在过氧化物酶底物(Vector目录号SK-4100，Vector实验室，Burlingame，CA)中温育10分钟。最后，将脑切片用PBS冲洗(4次，10分钟/冲洗)，并装载在Superfrost Plus Micro Slides(VWR，Randor，PA)上。将玻片风干，然后在苏木精和Scott的蓝色溶液中复染，然后进行一系列乙醇漂洗。最后使用Permount和微型盖玻片(VWR，Randor，PA)将玻片盖上盖玻片，然后干燥以进行扫描和IHC定量分析。
IHC定量：使用Aperio AT2玻片扫描仪对装载在玻片上的脑切片进行成像。每个研究中的所有玻片均使用相同的照明功率和相机曝光进行成像。对每只动物的大约2个玻片进行了分析，每个玻片载有约20个冠状脑切片。在图像采集之后，使用HALO图像分析软件为每只动物鉴定包含下述感兴趣区域(ROI)的切片：a)初级皮质以及扣带回区域(耳间5.48mm-2.96mm，前囟1.69mm-0.83mm，6-10个切片)；和b)杏仁核区域(耳间2.72mm-1.76mm，前囟1.07mm-2.03mm，4-6个切片)。对于这两个区域，在同侧(注射侧)和相应的对侧上pS129染色占据的总面积描画出ROI。然后使用算法(Indica Labs)-面积定量(AreaQuantification)对每只动物的所有ROI描画部分的平均染色进行定量。使用相同的阈值设置同时分析所有图像以识别阳性染色区域。分析了组织面积(μm2)、总染色面积(μm2)、弱染色面积和强染色面积(μm2)、％染色阳性组织、％染色弱组织和％染色强阳性组织。用单变量方差分析，随后Dunnett事后检验采来确定治疗效果。
d.测量血浆和脑中的抗体水平
ELISA板(Costar 3925)用100μl 1μg/ml PFF(由α-突触核蛋白WT制备，PROTEOS)室温(RT)下包被2小时，其中PFF是在PBS(GIBCO目录号14190)中稀释的。包被前，将PFF超声处理15秒，每秒暂停一次。将板用含0.05％Tween的Dulbecco PBS(Life Technologies，#14040-117)洗涤四次，并用150μl溶于DPBS的3％BSA(牛血清白蛋白，无蛋白酶，级分V，RochDiagnostic#03117332001)封闭，室温2～3h或4℃过夜。将标准品、血浆和脑样品在含Roche蛋白酶抑制剂(Roche 11836145001、1片/25ml)的1％BSA/0.05％Tween/DPBS中稀释。一式两份加载100μL/孔的样品(3～4个稀释度)，并在室温下温育约2小时。用0.05％Tween/DPBS洗涤平板四次之后，加入100μl二抗(碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗人IgG，JacksonImmuno#709-055-149，含50％甘油；1％BSA/0.2％Tween/DPBS中1:1000稀释)，室温下温育1小时。洗涤四次后，用100μL碱性磷酸酶底物(Tropix CDP StarReady-to-Use，含Sapphire II，T-2214，Life Technologies)显影30分钟。用Perkin Elmer EnVision(2102MultilabelReader)测量发光计数。在测定期间，将板保持恒定摇动(滴定板摇床，速度3)。
e.抗药物抗体(ADAs)的测量
开发了一套非定量免疫原性测定法，用来检测在用抗体1、7A10、11AH11、15A5、21A3、36A3、44B11和抗体3处理的小鼠中抗体1、抗7A10抗体、抗11AH11抗体、抗15A5抗体、抗21A3抗体、抗36A3抗体、抗44B11抗体和抗体3的可能生成。在这种酶联免疫吸附测定中，将抗体1、7A10、11AH11、15A5、21A3、36A3、44B11和抗体3包被在Maxisorp平底96孔板上4℃过夜。将以1:100稀释的血清样品在室温下温育过夜，以捕获潜在的抗药物抗体(ADAs)。捕获的抗体用山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体来加以检测。使用山羊抗人免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体作为阳性对照。加入四甲基联苯胺(TMB)作为HRP的比色底物，其产生的光密度(OD450)与血清样品中存在的抗体1、抗7A10抗体、抗11AH11抗体、抗15A5抗体、抗21A抗体3、抗-36A3抗体、抗-44B11抗体和抗体3的量成正比。
f.脑组织中αSyn水平的测量
简而言之，将ELISA板(Costar 3925)用100μL的各种捕获抗体4℃包被过夜，其中捕获抗体是在BupH碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.4(Thermo Fisher Scientific#28382)中稀释的。捕获抗体MJFR1(Abcam ab138501)的使用浓度为0.1μg/ml(总α-突触核蛋白测定)或0.35μg/ml(pS129测定)，MJFR14-6-4-2-2(Abcam ab209538)的浓度为0.1μg/ml，1E8(BMS 5446.1E8.10)的浓度为0.3μg/ml。将平板用Dulbecco氏PBS(Thermo FisherScientific，#14040-117)洗涤四次，并用DPBS中的3％BSA(牛血清白蛋白，无蛋白酶，级分V，Thermo Fisher Scientific)封闭，室温(RT)下2～3h或在4℃过夜。将标准品、脑样品和质控样品用含有Roche蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific，1片/25ml)和磷酸酶抑制剂2&3(Sigma Aldrich，P5726和P0044、1：100)的1％BSA/0.05％Tween/DPBS稀释。标准品是：α-突触核蛋白WT(rSeptide S-1001)，pS129(aa89-140，AATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHHH-CONH2；SEQ ID NO:129)或PFF(由α-突触核蛋白制备，PROTEOS)。将样品以50μL/孔一式两份上样，并在4℃下温育过夜。将板平衡至RT后，加入50μl检测抗体(在1％BSA/0.1％Tween/DPBS中1:4000稀释)，并在室温下与样品共温育约2小时。检测抗体(来自BioLegend SIG39730的4B12，来自Abcam ab168381的MBJR13、2E2和23H8)是与碱性磷酸酶(来自Novus Biologicals#702-0010的AP试剂盒)预缀合的。然后将板用0.05％Tween/PBS洗涤四次，并用100μL碱性磷酸酶底物(Tropix CDP Star Ready-to-Use，带Sapphire II，T-2214，Thermo Fisher Scientific)显影30分钟。用Perkin ElmerEnVision(2102Multilabel Reader)测量发光计数。在测定期间，将板保持恒定摇动(滴定板摇床，速度3)。
结果
PFF接种的小鼠每周一次通过IP注射PBS(n＝11)或抗体1(n＝12)，7A10(n＝12)，11AH11(n＝12)，15A5(n＝11)，21A3(n＝11)，36A3(n＝11)，44B11(n＝12)和抗体3(n＝5)。接种了PBS的小鼠通过IP注射给药PBS(n＝8)作为阴性对照。所有抗体的剂量为10mg/kg。在每周抗体处理之前，在一部分小鼠中进行眼眶后取血，以评估药代动力学(PK)和可能的ADA水平。接种后30天和最后一次抗体处理后24小时收获小鼠。测量了一部分小鼠脑组织中的抗体水平。通过免疫组织化学在选定的大脑区域中测量了pS129αSyn病理。
血浆抗体暴露总结在图18中。抗体之间的血浆暴露变异～100倍，范围为1μg/ml至100μg/ml。某些抗体(例如21A3和抗体1)的低暴露可能是由于ADAs所致。抗体3对照抗体的血浆浓度与首次治疗研究中观察到的浓度相似。脑组织提取物中的抗体水平如图19所示。在不同抗体之间，脑暴露的变异～10倍，范围为～25ng/ml至250ng/ml。在与注射部位同侧和对侧的脑半球中观察到相似的抗体水平。在血浆样品中测量了ADA(表13和14)。对于抗体3(n＝3)、抗体1(n＝6)、7A10(n＝1)、21A3(n＝7)、15A5(n＝1)、36A3(n＝1)和44B11(n＝1)，在某些动物中观察到ADA。抗体11H11-1未观察到ADA。对于抗体1和21A3处理，较低的血浆抗体水平与ADA相关(图20)。与之相反，抗体3、7A10、15A5和44B11的ADA的存在对血浆抗体水平没有不利影响。
表13:血浆样品a中的抗药物抗体活性
a仅显示了具有显著的ADA活性的样品。11H11-1未观察到ADA
b ID#表示收集样品的周数(wk1、wk2、wk3或wk4)和动物ID#
c比色底物在450nm的光密度测量值
d截断值基于溶媒对照样品的平均OD的2X。截断以上的OD值认为是显著的。显示了每个测定板计算的截断值。
表14:抗体1和抗体3对照抗体的抗药物抗体活性a
a仅显示了具有显著的ADA活性的样品。11H11-1未观察到ADA
b ID#表示收集样品的周数(wk1、wk2、wk3或wk4)和动物ID#
c比色底物在450nm的光密度测量值
d截断值基于溶媒对照样品的平均OD的2X。截断以上的OD值认为是显著的。显示了每个测定板计算的截断值。
为了评估被动免疫对病理的传播和扩散的影响，采用免疫组织化学方法检测了运动皮层和杏仁核中αSyn pS129的表达。代表性图片如图21所示，图形汇总如图22所示。与PBS对照相比(p<0.001)，注射A53T-PFF的PAC小鼠在运动皮层(单因素ANOVA，p<0.05)和杏仁核(单因素ANOVA，p<0.001)中均显示pS1292显著增加(图22)。对照抗体3的被动免疫导致同侧杏仁核中的病理显著减少(单因素ANOVA，p<0.001)，以及同侧运动皮层中有病理减少的趋势。除抗体3之外，杏仁核中的病理明显减少的其他抗体还有7A10(p<0.01)，11H11-1(p<0.001)，15A5(p<0.01)，21A3(p<0.05)，36A3(p<0.01)和44B11(p<0.05)。仅抗体1没有表现出杏仁核中病理的显著减少。在运动皮层中，只有44B11展现出病理的显著减少(p<0.05)，而其他抗体显示出减少的趋势。运动皮层中缺乏显著的效果可能是由于观察到的PFF介导的诱导的变异。
接下来，确定了被动免疫对脑提取物中αSyn可溶性水平的影响。用ELISA法测量了脑提取物中的aSyn寡聚体、pS129αSyn和总αSyn水平，如图23和24所示。与PBS(Veh)对照相比，接种A53T-PFF的动物中αSyn寡聚体显著增加；通过两个独立的αSyn寡聚体ELISA(1E8+2E2和MJFR14642+23H8，两者均在实施例12中进行了描述)获得了类似的结果(图23)。在所有抗体处理的动物中均观察到与A53T-PFF组相比寡聚体水平降低的趋势。与寡聚体的结果相反，pS129αSyn和总αSyn水平不受接种A53T-PFF或被动免疫的影响(图24)。由于提取物中存在高水平的背景pS129，因此用pS129 ELISA不太可能检测到通过IHC观察到的pS129信号变化。
在第二项为期90天的研究中，使用实施例11中所述的方法，每周以3、10和30mg/kg的剂量通过腹膜内注射给予7A10-Vh-T93A-IgG1.3f。为了清楚起见，实施例11中测试的抗体是7A10 hIgG1.3f。该第二项研究中，使用7A10-Vh-T93A-IgG1.3f，在44％的处理动物中检测到了抗药物抗体的存在。这项研究的结果是高度可变的，且没有观察到对病理的显著影响。
综上所述，抗αSyn抗体7A10、11H11-1、15A5、21A3、36A3和44B11可在体内有效阻断αSyn病理的传播。
实施例12：使用寡聚体特异性ELISA评估脑提取物和CSF中αSyn寡聚体的水平
该实施例描述了用以测量人脑裂解物和CSF中的αSyn寡聚体水平的寡聚体特异性ELISA的开发。
方法
a.表位作图
用于表位作图研究的αSyn肽购自InnoPep(San Diego，CA)。产生了两组人αSyn序列的重叠肽，这些肽都具有N-末端生物素基团和PEG4接头及C末端。将肽以1mg/ml溶解在PBS中。为了作图研究，将100μL的PBS中的0.25μg/mlα-突触核蛋白肽添加到NeutrAvidin包被的高容量96孔板(Thermo Fisher Scientific)中，并在室温(RT)下温育2小时(或4℃过夜)(O/N))。用～300μL洗涤缓冲液(PBS中0.05％Tween)将板洗涤3次。然后在室温下用150μl的溶于PBS的3％BSA封闭板约2小时(或者对于O/N为4℃)。将100μL测试样品在室温下在板上温育2h，其中测试样品稀释于样品缓冲液(0.1％BSA/0.05％Tween/PBS，2片Roche蛋白酶抑制剂，于50ml缓冲液中)中。然后将板洗涤3次。加入100μL二抗并在室温下温育1小时，所述二抗是在PBSTB(1％BSA/0.2％Tween/dPBS)中以1:1000稀释的。将板洗涤3次，每次洗涤5-10分钟。加入100μL的AP底物(Tropix CDP Star Ready-to-Use，带有Sapphire II，Applied Biosystems；目录号T-2214)，在室温下显影30分钟。用Perkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)读取发光计数。在测定过程中，将板保持恒定摇动(滴定板摇床，速度3)。使用的二抗包括：碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗人IgG(JacksonImmuno#709-055-149)，碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗兔IgG(JacksonImmuno#711-055-152)，碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗小鼠IgG(JacksonImmuno#715-055-151)。将所有二抗稀释至甘油终浓度为50％。
b.PFF的制备和纤丝化分析
使用实施例3中所述的方法制备和分析PFF。
c.αSyn结合测定
测试了抗体与人αSyn单体、人βSyn单体、人γSyn单体、人αSyn产生的PFF、人A53TαSyn产生的PFF、和包含人、大鼠和小鼠的序列的αSyn肽氨基酸111-140的结合。含有人、大鼠和小鼠序列的αSyn肽氨基酸111-140购自InnoPep(San Diego，CA)。人αSyn单体、人βSyn单体和人γSyn单体购自rPeptide(Bogart，GA)。
为了进行结合测定，将96孔板(Costa#3925，高结合微孔板)用100μL的1μg/mlαSynWT PFF(在PBS中)室温下包被2h(或者4℃过夜)。用～300μL洗涤缓冲液(dPBS中的0.05％Tween)将板洗涤3次。在室温下用150μl的3％BSA/PBS封闭板2小时(或者4℃过夜)。在样品缓冲液(0.1％BSA/0.05％Tween/PBS，2片罗氏完全蛋白酶抑制剂-于50ml缓冲液中)中制备了PFF(从2μg/ml开始)和α-synWT单体(从20μg/ml开始)的3倍系列稀释液。为了进行抗体温育，将等体积的2倍测定浓度的αSynPFF或单体与2倍测定浓度的抗体在BD falcon低结合平板中混合，并在室温下温育～2小时。将抗体与PFF或单体的混合物100μL添加至PFF包被的板中，并在室温下温育10分钟。将板洗涤3次。加入100μL驴抗人IgG[JacksoImmuno#709-055-149，含50％甘油；在PBSTB(1％BSA/0.2％Tween/dPBS)中1:1000稀释]，并将板在室温下温育1小时。将板洗涤3次，每次洗涤5-10分钟。加入100μL的AP底物(Tropix CDPStar Ready-to-Use，带Sapphire II，Applied Biosystems)，并在室温下将平板显影30分钟。使用Perkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)测量发光计数。在包被或与抗体混合之前，以15次1秒脉冲对PFF进行超声处理。在测定期间，将板保持恒定摇动(滴定板摇床，速度3)。
d.ELISA
ELISA平板(Costar)用100μl的各种捕获抗体4℃过夜包被，其中抗体稀释在BupH碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.4(Thermo Fisher Scientific)中。使用的捕获抗体MJFR1(Abcam)的浓度为0.1μg/ml(总α-突触核蛋白测定)或0.35μg/ml(pS129测定)；MJFR14642(Abcam)的浓度为0.1μg/ml；1E8的浓度为0.3μg/ml。将板用Dulbecco氏PBS(Thermo FisherScientific)洗涤4次，并用PBS中的3％BSA(牛血清白蛋白，无蛋白酶，级分V)室温2～3h或于4℃过夜封闭。标准品、脑样品和QC样品用含有罗氏完全蛋白酶抑制剂(1片/25ml)和磷酸酶抑制剂2和3(Sigma Aldrich，1:100)的1％BSA/0.05％Tween/PBS稀释。标准品为：α-突触核蛋白WT(rPeptide)，pS129(aa89-140，AATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHHH-CONH2；SEQ ID NO:129)或PFF。使用KONTES Micro Ultrasonic CellDisrupter(输出40，调谐50)对PFF和单体进行超声处理。将样品超声处理15次1秒/脉冲。样品50μL/孔一式两份上样，并在4℃下温育过夜。在将板平衡至RT之后，加入50μl检测抗体(在1％BSA/0.1％Tween/DPBS中稀释1:4000)，并与样品在室温共温育2小时。检测抗体(Covance的4B12、Abcam的MBJR13、2E2和23H8)是与碱性磷酸酶(Novus Biologicals的AP试剂盒)预缀合的。然后将板用0.05％Tween/PBS洗涤4次，并用100μL碱性磷酸酶底物(TropixCDP Star Ready-to-Use，带Sapphire II，Thermo Fisher Scientific)显影30分钟。用Perkin Elmer EnVision(2102Multilabel Reader)测量发光计数。在测定期间，将板保持恒定摇动(滴定板摇床，速度3)。使用GraphPad Prism分析数据。
e.人脑裂解物的制备
用KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter(输出40，调谐50)将脑样品在经过滤的PBS(Gibco，#70011，1ml PBS/100mg组织湿重)中超声处理2x 10秒/脉冲。将样品置于2ml Eppendorf管中，管在超声处理期间保持于湿冰上。将脑裂解物在3,000g，4℃下离心5分钟。将上清液等分试样在液氮中冷冻并保存在-80℃。实施了包括αSynELISA(总的，以及pS129)和BCA在内的QC测定。
为了分离高速离心沉淀，将先前在1XPBS中以100mg/ml制备的脑匀浆在冰冷的1XPBS中稀释3倍至33.3mg/ml，然后在100,000Xg在4℃下离心30分钟。除去上清液并丢弃。将离心沉淀以与起始样品相同的体积重悬于冰冷的1X PBS中。
f.脑提取物的免疫沉淀
通过将以下样品按等比例混池，制备混池的人脑提取物：PD(PD1、PD3和PD5)，MSA(12-18、01-03和14-49)和DLB(13-37、05-31和08-26)。将混池后的样品用PBSTB缓冲液(1％BSA+0.05％Tween+PBS)稀释100倍。为了进行免疫沉淀，将脑提取物与抗体在4℃反复颠倒下温育2小时。然后加入Protein A/G琼脂糖珠(Thermo Fisher Scientific)，将样品在4℃下温育过夜。为了制备Protein A/G珠，将1.2ml珠浆在4℃下1000×g离心2分钟。除去储存缓冲液，并将珠子用含0.05％tween-20的0.6ml PBS洗涤1次，如上离心，再用0.6ml PBS洗涤3次。最后一次离心后，加入0.6ml含1％BSA的PBS，4℃下温育2小时，以封闭珠子。封闭后，通过离心分离珠子，并重悬于0.6ml PBS中至终体积为1.2ml。将珠浆以1:10(体积:体积)的稀释度添加到每个脑提取物中。过夜免疫沉淀后，将样品离心以除去珠子，分离经耗竭的脑样品，并通过ELISA进行评估。以下抗体用于免疫沉淀：26D6(特异性针对人Abeta的小鼠IgG对照抗体(氨基酸1-12)、MJFR-14642(Abcam)、LB509(Covance)、克隆42(BD)、7A10和1E8。
g.原代细胞培养分离
如实施例10所述制备原代大鼠海马神经元。
h.免疫荧光测定
如实施例10所述进行免疫荧光。
i.高含量免疫荧光测定
如实施例10所述进行高含量免疫荧光测定。
j.SDS-PAGE/免疫印迹分析
如上所述产生了来自MSA和PD脑组织的脑匀浆。取每个脑匀浆200μl，通过添加PBS(Thermo Fisher Scientific)使达到总体积400μl。将稀释的样品在4℃下以100,000x g的速度离心30分钟以分离高分子量的聚集体。将离心沉淀重悬于200μl PBS中。将50μl 4XNuPAGE上样染料(Thermo Fisher Scientific)和20μl NuPAGE 10X还原剂(Thermo FisherScientific)添加到130μl离心沉淀匀浆中。通过在95℃下温育5分钟使样品变性，然后将10μl样品在4-12％NuPAGE Bis-Tris凝胶上分级分离，使用1X MES运行缓冲液(ThermoFisher Scientific)。凝胶在200V下运行50分钟，然后在30V下历时1小时转移至0.4μm硝酸纤维素(Thermo Fisher Scientific)。然后将印迹溶于TBST[含0.1％Tween-20(Promega)的TBS]中5％牛奶中封闭。然后用在含1％BSA的TBST(BioRad)中1:5000稀释的以下抗体探查印迹，4℃下震荡过夜：4B12(BioLegend)，4D6(BioLegend)，Syn-303(BioLegend)，81A(BioLegend)，EP1536Y(Abcam)，LB509(BioLegend)，小鼠IgG(Thermo FisherScientific)，抗肌动蛋白(Sigma)。所有抗体均利用BioRad EZ-link缀合试剂盒与HRP缀合。过夜温育后，用TBST洗涤印迹。使用Supersignal West Femto Maximum(Thermo FisherScientific)检测试剂检测HRP标记的抗体，并使用GE AI600 CCD相机捕获图像。
k.SEC-HPLC分析
将100μl的MSA脑匀浆11-46和对照脑匀浆11-49添加到400μl PBS中，并将样品在100,000x g下于4℃离心30分钟。保存上清液(sup)，将剩余的离心沉淀重悬于120μl PBS中。对于尺寸排阻色谱，将100μl上清液或离心沉淀注入Agilent 1100 HPLC上的BioSec-5SEC色谱柱(直径7.8mm x 300mm，Agilent)。在整个20ml运行时间内收集1ml级分。使用的流动相是PBS。该柱以1ml/分钟、37℃柱温运行。为了浓缩SEC级分，使用Waters OasisSPE HLB柱对样品进行固相萃取(SPE)。将每个SEC级分1ml用1000μl 4％磷酸稀释。SPE色谱柱用1ml甲醇预处理，然后用1ml H2O平衡。然后加入酸化的样品。上完样的色谱柱用1ml5％甲醇洗涤，样品用1ml 100％甲醇洗脱。将洗脱物在真空旋转干燥器中干燥过夜。将SPE纯化的SEC-HPLC级分干燥保存在-20℃下，直到进行SDS-PAGE/免疫印迹分析为止。
结果
a.抗体表征
表15总结了该研究中使用的抗体。
表15:抗体汇总
a表位按照与实施例2相似的方式作图。见图1。
b表位由售货商提供
c J Duda,et al.,Ann Neurol 2002 H Tran,et al.,Cell Reports,2014
d M Baba,et al.,Am J Path 1998R Jakes,et al.,Neurosci Letts 1999
e Waxman and B Giasson,J Neuropath Exp Neurol 2008
评价了上述抗体与αSyn单体和αSynPFF的结合强度。将抗体在溶液中与浓度递增的αSyn单体或PFF一起温育。将未结合的抗体捕获在包被有PFF的板上，并通过单侧ELISA测定抗体水平。如图25所示，抗体1E8、2E2、23H8和MJFR14642显示出与单体相比更强的与PFF的结合力，单体-PFF的结合强度比分别为902、236、3258和7234(表16)。相反，抗体MJFR1、4B12和Syn303与PFF相比，对单体的结合力更强(图26)，单体-PFF的结合强度比分别为0.27、0.24和0.47(表16)。抗体4D6和LB509的PFF选择性不高，单体与PFF的结合强度比分别为26和34。总的来看，这些结果表明，抗体1E8、2E2、23H8和MJFR14642具有高度的PFF/寡聚体选择性。
表16:抗体结合汇总
b.寡聚体特异性ELISA的开发
基于如上所述的单体和PFF结合数据，开发了多种抗体组合配对，并且在夹心式ELISA中评估了它们对αSyn单体和αSyn PFF/寡聚体的检测。
表17中显示了鉴定的最优ELISA对以及那些测定法的特异性的汇总。
表17:ELISA汇总
a检测抗体与碱性磷酸酶(AP)缀合
b LLQ(定量最低水平)定义为测定背景X2。单体LLQ基于超声处理单体的结果；非超声处理的单体观察到了类似的结果。PFF LLQ基于超声处理的PFF。pS129 ELISA(MJFR1+MJFR13)的LLQ为2pg/ml(pS129肽)。
1E8.10+2E2.2和MJFR14642+23H8.G3这两个ELISA配对表现出对PFF/寡聚体的灵敏而特异性的检测，但对αSyn单体却没有(表17；图27)。对PFF的超声处理在两种测定中均增强了总体信号，表明这些测定对聚集体大小敏感，并且超声处理可能会暴露其他抗体结合位点。相比之下，超声处理对抗体检测单体的能力没有任何影响。两种测定对于检测经超声的PFF显示出相似的灵敏度，约为30pg/ml。在高至10ng/ml的单体浓度——所测试的最高浓度下，仅观察到背景信号。总的来看，这些结果证明，采用了1E8+2E2和MJFR14642+23H8的ELISA是PFF/寡聚体特异性的。
还开发了另外的ELISA配对组合，其中纳入了相同的捕获抗体(MJFR1)与不同的检测抗体的搭配，包括对N末端域(Syn303)，中间域(4B12)，C末端(4D6)和αSyn的pS129(MJFR13)特异性的抗体。MJFR1+Syn303、MJFR1+4B12和MJFR1+4D6这些ELISA配对均表现出对αSyn单体和αSynPFF二者的灵敏检测(表17；图28)。所有这三种测定法均以与寡聚体ELISA相似的灵敏度检测到经超声处理的PFF(表17)。与寡聚体测定法不同，MJFR1+Syn303和MJFR1+4B12对PFF的检测不受超声处理的影响，这提示这些表位的暴露对聚集体的大小较不敏感。有趣的是，超声处理确实增强了MJFR1+4D6对PFF的检测，这可能与这一事实有关：4D6结合与寡聚体选择性抗体相似，结合到C末端表位。与寡聚体特异性测定法相反，MJFR1+Syn303、MJFR1+4B12和MJFR1+4D6对αSyn单体表现出灵敏的检测，LLQ分别为23、8和27pg/ml。对单体的检测不受超声处理的影响。MJFR1+MJFR13 ELISA展示了对pS129αSyn肽的灵敏和特异性检测，仅确证了其pS129特异性。
为了进一步评估特异性，还检测了MJFR1+Syn303，MJFR1+4B12和MJFR1+4D6对αSyn家族成员β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白检测。如图29所示，所有三种测定均与γ-突触核蛋白或γ-突触核蛋白几乎没有交叉反应，确证了它们的αSyn特异性。综上所述，这些结果表明，MJFR1+Syn303、MJFR1+4B12和MJFR1+4D6对αSyn具有特异性，并且可以检测单体和寡聚体，从而支持它们作为“总”αSyn测定法的效用。
c.脑提取物中αSyn水平的测定
使用ELISA来测量从对照和疾病组织(AD、PSP、MSA、PD、DLB)产生的脑提取物中的寡聚体、pS129和总αSyn水平。稀释度线性和免疫耗竭研究证实了脑提取物ELISA信号的特异性。如图30所示，与其他神经退行性疾病(AD，PSP)和对照组的提取物相比，在PD脑提取物中检出了稳健水平的αSyn寡聚体(1E8+2E2和MJFR14642+23H8)。PD提取物中的平均寡聚体水平在1E8+2E2 ELISA中为36ng/mg总蛋白，在MJFR14642+23H8.G2 ELISA中为40ng/mg总蛋白(表18)。在大部分AD、PSP和对照提取物中的寡聚体水平<LLQ。与寡聚体结果相反，使用MJFR1+4B12测定法测得的所有提取物中的总aSyn水平相似(图30；表18)。在所有提取物中均检测到了pS129αSyn，但与对照相比，PD中的水平升高并且显著更高(图30；表18)。
表18:对照、PD、AD和PSP脑提取物中αSyn水平的汇总
a数据对总蛋白归一化，并且表示为单体当量(pg/mg总蛋白)或pS129肽当量(pg/mg总蛋白)。总蛋白水平表示为mg/ml
为了确定在来自其他突触核蛋白病患者的脑组织中是否也存在αSyn寡聚体，还生成了MSA和DLD的提取物，并使用这些寡聚体ELISA进行了分析。如图31所示，在所有三种突触核蛋白病脑提取物(MSA、DLB、PD)中均检测到相似的、稳健的寡聚体水平，而在对照提取物中水平则≤LLQ；在两种寡聚体测定法中观察到相似的结果。与之相反，利用MJFR1+4B12测得的总αSyn水平在所有提取物中都是类似的，包括对照(图31)。突触核蛋白病提取物中的pS129水平也有相似程度的提高，且显著高于(MSA、DLB)或者倾向于高于(PD)对照(图31)。还使用对N末端区敏感的ELISA(MJFR1+Syn303)和对C末端区敏感的ELISA(MJFR1+4D6)测量了总αSyn水平。如图32所示，没有观察到总αSyn水平的差异。ELISA结果汇总在表19中。
表19:对照、MSA、DLB和PD提取物中αSyn水平的汇总
a数据对总蛋白归一化，并且表示为单体当量(pg/mg总蛋白)或pS129肽当量(pg/mg总蛋白)。总蛋白水平表示为mg/ml
全部不同的突触核蛋白病脑提取物(MSA、DLB、PD)在1E8+2E2和MJFR14642+23H8ELISA中测得的寡聚体水平均高度相关(图33、表20)。在两种寡聚体测定中的绝对寡聚体水平是可比较的。pS129(MJFR1+MJFR13)的水平也与寡聚体水平高度相关。与之相比，MJFR1+4B12测定法中测得的总αSyn水平与寡聚体水平或pS129水平都没有显著的相关性(图33，表20)。然而，MJFR1+4B12测定法中的总αSyn与MJFR1+4D6测定法中的水平显著相关，并且显示出与MJFR1+Syn303测定法中测得的水平相关的趋势(图24，表21)。这些结果进一步验证了不同测定法中的信号特异性。寡聚体特异性ELISA与pS129 ELISA之间的关联性提示寡聚体种类很可能是磷酸化的。
表20:寡聚体水平的相关性a
a来自对MSA、DLB和PD脑提取物的分析的数据。显示了显著相关(p<0.001)的Pearsonr值。NS代表p>0.05
表21:总αSyn水平的相关性a
a来自对MSA、DLB和PD脑提取物的分析的数据。显示了显著相关(p<0.001)的Pearsonr值。NS代表p>0.05
d.对脑提取物中寡聚体的生化表征
高速离心可用于纯化αSynPFF，已被用于从脑提取物中分离出tau蛋白的高分子量聚集体。采用了类似的策略来帮助分离和表征突触核蛋白脑提取物中存在的αSyn聚集体。将对照、MSA、DLB和PD脑提取物进行高速离心，分离出可溶性(上清液)和不溶性(沉淀)物质，并通过寡聚体ELISA进行分析。如图35所示，在脑提取物离心沉淀(包括从对照脑组织产生的提取物)中检测到寡聚体。这些ELISA信号的特异性通过稀释线性得到了证实。两种寡聚体ELISA观察到相似的结果。离心沉淀中寡聚体相对于起始提取物中的水平的总回收率为20-80％(图35)。相反，在任何脑提取物中的上清液中均未检测到寡聚体。这些发现表明，寡聚体以高分子量聚集体形式存在，并且还表明，寡聚体存在于对照脑提取物中，但与疾病提取物相比含量较低。
为了进一步表征脑提取物中的高分子聚集体，将从对照和MSA脑提取物中分离的颗粒和上清级分进行大小排阻色谱，并通过SDS-PAGE/免疫印迹分析级分。如图36所示，来自对照和MSA提取物二者的上清液SEC级分中的大部分aSyn均在级分10中洗脱，对应的分子半径为～60kDa，提示该种类是四聚体。当通过SDS-PAGE/免疫印迹分析时，该四聚体分解为一个单体和较低分子量的裂解片段。与之相反，在离心沉淀级分中分离出的大部分aSyn通过SEC在空隙体积中(级分6)洗脱，对应的分子半径>670kDa。对照样品和MSA样品均观察到相似的结果，证实了对照提取物中存在聚集体：这些高分子量聚集体还通过SDS-PAGE/免疫印迹解析为单体和裂解片段。另外，在级分6中也检测到了来自离心沉淀分离物的aSyn，这提示高分子量聚集体与四聚体种类快速平衡。合起来看，这些结果证实了MSA和对照提取物中均存在高分子量聚集体，表明聚集体的大小>670kDa，并且在变性条件下(SDS加煮沸)聚集体被破坏。
为了进一步研究高分子量聚集体的潜在差异，使用不同的aSyn抗体通过SDS-PAGE/免疫印迹分析了从对照、MSA、DLB和PD中分离的提取物离心沉淀。显示了分子量范围分别为<20kDA(图37)，30-40kDa(图38)和60-100kDa(图39)的结果。使用IgG抗体对照确认了aSyn信号特异性。如图37所示，在所有脑提取物离心沉淀(4B12、4D6)中检测到可比较水平的作为单体迁移的aSyn(～14kDa)。然而，与PD和对照相比，MSA和DLB颗粒中裂解产物的水平和程度似乎更高(4B12)。识别aSyn的C末端结构域的4D6抗体的结果表明切割片段缺少该C末端区域。pS129信号(EP1536Y)在DLB最高中，>MSA>PD>>对照。肌动蛋白存在于离心沉淀分离物中，并且其水平在各样品之间相当。未观察到与IgG对照抗体的非特异性反应性，证实了在该分子量区域内的aSyn特异性。
在所有提取物沉淀中以可比较的水平检测到一个30-40kDa的突出种类，可能对应于aSyn的二聚体(图38)。Syn 303和4D6抗体的结果分别表明该种类包含完整的N和C末端结构域。有趣的是，使用抗体4B12并不能轻易检测到该突出的二聚体，尽管在DLB离心沉淀中存在低水平的反应性。这些结果表明4B12表位在该二聚体种类中被掩盖了，而且提示4B12反应性可能是二聚体构象的一个灵敏的指标。抗体81A的结果表明，该二聚体种类在S129处被磷酸化，并且在DLB离心沉淀中观察到最高水平。
在60-100kDa的分子量范围内检测到多种物质(图39)。检测到约60kDa(Syn303、4B12、4D6)和约80-100kDa(4B12，LB509、4D6)的潜在aSyn聚集体。总体而言，在所有脑提取物离心沉淀中，使用不同的aSyn抗体观察到的免疫反应性模式均相似。
e.细胞中不溶性，pS129 aSyn聚集体的诱导
当从突触核蛋白病患者脑组织中分离出的αSyn PFF和提取物添加到培养的原代神经元中时，会诱导形成不溶的、高度磷酸化的αSyn聚集体。此外，该诱导作用依赖于脑提取物中存在的αSyn高分子量种类。这些发现支持了αSyn病理可以以病毒粒子样的方式传播的观点，并且提示可传播的种类是αSyn的聚集体。对于在来自对照、MSA、DLB和PD提取物离心沉淀中分离的高分子量聚集体，评估了它们对过表达人A53T aSyn的原代神经元中不溶性的pS1290 αSyn的诱导作用。用MSA脑提取物离心沉淀处理11天后观察到了不溶性pS129的强健的诱导；相反，PD和DLB提取物离心沉淀观察到的诱导水平降低了10倍，而对照提取物离心沉淀仅观察到背景信号(图40)。诱导作用与离心沉淀分离物中存在的寡聚体水平无关。这些结果提示，MSA提取物离心沉淀所观察到的强健诱导作用可能与MSA高分子量种类与PD、DLB和对照相比的构象和/或修饰差异有关，并且这些差异可能会影响接收细胞的摄取和/或在接收细胞中启动模板聚合的能力。
f.人脑脊液中aSyn水平的测量
用aSyn寡聚体ELISA 1E8+2E2和MJFR14642+23H8来评估来自MSA突触核蛋白病患者和对照的脑脊液；还包括了总αSyn ELISA MJFR1+4B12用于比较。使用稀释度线性度和加标回收率分析来验证人脑脊液的检测方法并确定最佳稀释度。如图41所示，群组1中所有CSF样品(包括MSA，进行性核上性麻痹(PSP)和对照)的寡聚体水平均<LLQ。在1E8+2E2和MJFR14642+23H8 ELISA中都观察到了相似的结果。与之形成对照的是，在MJFR1+4B12测定中观察到的总aSyn水平为～1000pg/ml，且MSA、PSP与对照组之间的水平相似。分析了第二个群组的MSA和对照CSF样品(图42)。和群组1中观察到的一样，大多数样品中的寡聚体水平均＜LLQ；但是，在1E8+2E2 ELISA中有7个CSF样品(6个MSA和1个对照)检出了可定量的寡聚体水平。用MJFR1+4B12测得的总aSyn水平在MSA和对照CSF样品之间相似，为～1000pg/ml，与群组1的结果一致。
表22序列汇总
等同方案：
本领域技术人员仅通过常规实验即可认识到或能够确定本文公开的特定实施方案的许多等同方案。这些等同方案意欲被所附的权利要求所涵盖。

Claims (20)

1.一种抗体，其包含：
包含下列CDR的重链可变区：
i.具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3；和
包含下列CDR的轻链可变区：
i.具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1；
ii.具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2；和
iii.具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3；
其中所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)。
2.权利要求1的抗体，其中该抗体结合SEQ ID NO:1的氨基酸残基123-128中的至少一个或多个。
3.权利要求1或2的抗体，其中，通过如实施例3所述的α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白PFF结合比(单体:PFF结合比)评估，该抗体对α-突触核蛋白PFF具有比对α-突触核蛋白单体更大的亲和力。
4.任一前述权利要求的抗体，其中所述抗体包含分别与SEQ ID NO:18和19的氨基酸序列至少95％相同的重链和轻链可变区序列。
5.任一前述权利要求的抗体，其中所述抗体选自下述者组成的群组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，或它们的变体。
6.任一前述权利要求的抗体，其中所述抗体包含Fc域，该Fc域包含在SEQ ID NO:119中示出的氨基酸序列。
7.任一前述权利要求的抗体，其中所述抗体包含分别与SEQ ID NO:20和21的氨基酸序列至少95％相同的重链和轻链序列。
8.任一前述权利要求的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
9.任一前述权利要求的抗体，其是双特异性抗体。
10.一种核酸，其编码前述任一项权利要求所述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
11.一种表达载体，其包含权利要求10的核酸分子。
12.一种细胞，其转化有权利要求11的载体。
13.一种免疫缀合物，其包含权利要求1-9中任一项的抗体和与之连接的模块。
14.一种组合物，其包含权利要求1-9和13中的任一项的抗体或免疫缀合物，以及医药上可接受的载体。
15.一种制备抗α-突触核蛋白抗体的方法，包括：
培养包含权利要求11的表达载体的宿主细胞，其中所述抗体被表达；和
从所述细胞中分离出所述抗体。
16.一种抑制细胞中不溶性丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体的生成的方法，该方法包括使细胞与有效量的权利要求1-9、13和14中任一项的抗体、免疫缀合物或组合物接触。
17.一种治疗疾病或减轻疾病严重性的方法，所述疾病以脑中路易体或α-突触核蛋白的病理性聚集体的存在为特征，所述方法包括向具有所述疾病的受试者施用有效量的权利要求1-9、13和14中任一项的抗体、免疫缀合物或组合物。
18.权利要求17的方法，其中所述疾病为帕金森病、帕金森病痴呆、路易体痴呆、路易体病、多系统萎缩、或单纯性自主神经衰竭。
19.权利要求17或18的方法，包括施用一种或多种其他治疗剂。
20.一种用于检测样品中的α-突触核蛋白的方法，该方法包括使样品与权利要求1-9和13中任一项的抗体或免疫缀合物在允许该抗体或免疫缀合物和α-突触核蛋白之间形成复合物的条件下接触，并检测所述复合物的形成。
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