JP2020513791A - アルファ−シヌクレインに対する抗体およびその使用 - Google Patents

アルファ−シヌクレインに対する抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

ここに開示されるのは、モノマーα−シヌクレインを超えてオリゴマーα−シヌクレインに優先的に結合する抗α−シヌクレイン抗体、該抗体を含む治療組成物およびシヌクレイン病処置のための該抗体の使用方法である。

Description

関連出願情報
本特許出願は、２０１７年２月１７日出願の米国特許仮出願６２／４６０,４１６の利益を請求する。該仮出願の全内容を、引用により本明細書に包含させる。
背景
α−シヌクレイン(αＳｙｎ)はシナプス前末端で神経細胞に優先的に発現する１４０アミノ酸タンパク質であり、そこでシナプス伝達の制御に役割を有すると考えられている(Bendor et al., Neuron 2013;79:1044-66)。それはα−ヘリックスの折り畳まれていない単量体(Fauvet et al., JBC 2012;287:15345-64)および安定な四量体(Bartels et al., Nature 2011;477:107-10; Wang et al., PNAS 2011;108:17797-802)の両者として天然に存在するとの仮説が提案されており、いくつかの翻訳後修飾を受けることも示されている(Beyer and Ariza, Mol Neurobiol 2013;47:509-24)。詳しく調べられている一つの修飾は、アミノ酸残基セリン１２９(Ｓ１２９)でのαＳｙｎのリン酸化である。通常、Ｓ１２９で構成的にリン酸化される(ｐＳ１２９)αＳｙｎの割合はほんの僅かであるが、病理学的細胞内封入体にみられる圧倒的大部分のαＳｙｎは、ｐＳ１２９ αＳｙｎである(Oueslati, J Parkinsons Dis 2016;6:39-51)。これらの病理学的封入体は、誤って折り畳まれたαＳｙｎタンパク質の凝集した、不溶性蓄積物であり、包括的にシヌクレイン病として知られる一群の神経変性疾患に特有の特徴である(Galvin et al., Arch Neurol 2001;58:186-90)。
シヌクレイン病において、αＳｙｎは神経細胞にレビー小体として知られる病理学的凝集体を形成でき、これは、パーキンソン病(ＰＤ)およびレビー小体型認知症(ＤＬＢ)両者の特徴である。さらに、グリア細胞質封入体(ＧＣＩ)と称される異常αＳｙｎ富病変がオリゴデンドロサイトにみられ、多系統萎縮症(ＭＳＡ)として知られ、急速に進行する、致死的シヌクレイン病の病理学的ホールマークを表す。脳の至る箇所のαＳｙｎの伝播についての最初の証拠は、ＰＤについて記載された脳病理の常同的進行(Braak et al., 2003)およびＰＤ患者におけるαＳｙｎ凝集体の宿主から移植片への伝播の証拠(Kordower et al., 2008)に由来する。興味深いことに、オリゴデンドロサイトにおける検出不能な(Ozawa et al., Acta Neuropathologica 2001;102:188-190; Miller et al., J Neural Transm (Vienna) 2005;112:1613-24; Jin et al., Journal of Medical and Dental Sciences 2008;555:145-53)または低レベル(Asi et al., Glia 2014;62:964-70)のαＳｙｎ ｍＲＮＡ発現の報告が、ある病理学的形態のαＳｙｎが、高度に発現される場所である神経細胞からオリゴデンドロサイトへ伝播されることを示唆する。最近の研究は、αＳｙｎ伝播のこの推測を支持し、αＳｙｎがオリゴデンドロサイト(Reyes et al., Glia 2014;62:387-98)および神経細胞(Volpicelli-Daley et al., Neuron 2011; 72:57-71; Luk et al., Science 2012; 338: 949-953)により取り込まれることを示す。さらに、ＭＳＡ患者からのヒト脳ホモジネートのαＳｙｎ遺伝子導入マウスへの接種またはＰＤ脳からの精製ＬＢ抽出物のマウスおよび非ヒト霊長類への接種は、神経学的機能不全および広範なｐＳ１２９神経細胞沈着をもたらす(Watts et al., PNAS 2013;110:19555-60; Prusiner et al., PNAS 2015;112:E5308-17; Recasens et al., Annals Neurology 2014;75:351-62)。
αＳｙｎ伝播の視点からシヌクレイン病を標的とする治療は現在ない。従って、病原形態のαＳｙｎを優先的に標的とする治療剤は、ＰＤ、ＤＬＢおよびＭＳＡなどのシヌクレイン病を有する患者の処置に望ましい。
概要
ここに提供されるのは、α−シヌクレインに特異的に結合し、望ましい機能的性質を有するモノクローナル抗体などの単離抗体である。これらの性質は、モノマーα−シヌクレインと比較してオリゴマーα−シヌクレインへの優先的結合およびインビトロおよびインビボでの可溶性または不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)産生を阻害する能力を含む。ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる一群の疾患であるシヌクレイン病の処置、重症度軽減、進行遅延、発症リスク低減、発症遅延および診断のために使用し得る。
ある態様において、ここに提供されるのは、α−シヌクレインに結合し、１以上の次の性質を示す抗体またはその抗原結合部分である：
(ａ)マウスおよびラットα−シヌクレインに結合する；
(ｂ)ヒトβ−シヌクレインおよびヒトγ−シヌクレインに結合する；
(ｃ)α−シヌクレインオリゴマーに対してα−シヌクレインモノマーを超える親和性を有する；
(ｄ)α−シヌクレインオリゴマー誘導不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する；
(ｅ)ＰＦＦおよび／または脳にα−シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから可溶性または不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる；
(ｆ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２３〜１２８位の全てまたは一部に結合する；
(ｇ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２５〜１２８位の全てまたは一部に結合する；
(ｈ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３９位の全てまたは一部に結合する；
(ｉ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１１９〜１２６位の全てまたは一部に結合する；および
(ｊ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３８位の全てまたは一部に結合する。
ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは、例えば、実施例３に記載のとおり調製した、ＰＦＦである。ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは可溶性α−シヌクレインオリゴマーである。他の実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは不溶性α−シヌクレインオリゴマーである。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、例えば、実施例３に記載の、例えば、α−シヌクレインモノマー／α−シヌクレインＰＦＦ結合比により評価して、α−シヌクレインＰＦＦ、可溶性凝集体(オリゴマー)または不溶性凝集体に対して、α−シヌクレインモノマーを超える親和性を有する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、１００以上、例えば、５００以上、７００以上、１５００以上、３０００以上または５０００以上のα−シヌクレインモノマー／α−シヌクレインＰＦＦ結合比を有する。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、モノマーα−シヌクレインに５００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに０.５nM以下のＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、例えば、実施例１０に記載のアッセイを使用して評価して、０.１nM以下のＩＣ５０でＰＦＦ誘導α−シヌクレインセリン−１２９リン酸化を阻害する。
他の態様において、ここに提供されるのは、α−シヌクレインに特異的に結合し、配列番号８と９、１８と１９、２８と２９、３８と３９、４８と４９、５８と５９、６８と６９、７８と７９、９４と９５、９４と９６、９４と９７および１０６と１０７からなる群から選択される可変重鎖および可変軽鎖対である３個の可変重鎖ＣＤＲおよび３個の可変軽鎖ＣＤＲを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
他の態様において、ここに提供されるのは
(ａ)それぞれ配列番号２〜４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号５〜７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｂ)それぞれ配列番号２２〜２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号２５〜２７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｃ)それぞれ配列番号２２〜２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号２８〜３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｄ)それぞれ配列番号３７〜３９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号４０〜４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｅ)それぞれ配列番号４７〜４９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号５０〜５２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｆ)それぞれ配列番号５７〜５９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号６０〜６２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｇ)それぞれ配列番号６７〜６９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号７０〜７２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｈ)それぞれ配列番号７７〜７９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号８０〜８２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｉ)それぞれ配列番号８７〜８９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号９０〜９２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｊ)それぞれ配列番号８７〜８９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号９３〜９５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｋ)それぞれ配列番号８７〜８９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号９６〜９８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または
(ｌ)それぞれ配列番号１０７〜１０９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１１０〜１１２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３
を含む、α−シヌクレインに結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
他の態様において、ここに提供されるのは、α−シヌクレインに結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号８、１８、３１、４３、５３、６３、７３、８３、９９および１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
他の態様において、ここに提供されるのは、α−シヌクレインに結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域が配列番号９、１９、３２、３３、４４、５４、６４、７４、８４、１００、１０１、１０２および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
他の態様において、ここに提供されるのは、α−シヌクレインに結合し、(ａ)配列番号８と９、１８と１９、３１と３２、３１と３３、４３と４４、５３と５４、６３と６４、７３と７４、８３と８４、９９と１００、９９と１０１、９９と１０２および配列番号１１３と１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
他の態様において、ここに提供されるのは、α−シヌクレインに結合し、配列番号１０と１１、２０と２１、３４と３５、３４と３６、４５と４６、５５と５６、６５と６６、７５と７６、８５と８６、１０３と１０４、１０３と１０５、１０３と１０６および１１５と１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２３〜１２８位の全てまたは一部に結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２５〜１２８位の全てまたは一部に結合する。抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３９位の全てまたは一部に結合する。抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１１９〜１２６位の全てまたは一部に結合する。抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３８位の全てまたは一部に結合する。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分はラットおよびマウスα−シヌクレインに結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分はヒトβ−シヌクレインおよびヒトγ−シヌクレインに結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、例えば、実施例３に記載する、α−シヌクレインモノマー／α−シヌクレインＰＦＦ結合比(モノマー：ＰＦＦ結合比)により評価して、α−シヌクレインＰＦＦ、可溶性凝集体(オリゴマー)または不溶性凝集体に対してα−シヌクレインモノマーよりも大きな親和性を有する。ある実施態様において、モノマー：ＰＦＦ結合比は１００以上、５００以上、７００以上、１５００以上、３０００以上または５０００以上である。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体(例えば、抗体７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８)と同じエピトープに結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体(例えば、抗体７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８)とヒトα−シヌクレインへの結合について競合する。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体またはそのバリアントである。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、エフェクター機能が減少しているかまたはないＦｃ領域、例えば、次のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２５７Ａの変異を有するエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃを含む。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、ヒトにおける免疫原性が低減するように修飾される。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、それぞれ配列番号１８および１９に示す重鎖および軽鎖可変領域を含む。
他の態様において、ここに提供されるのは、第二結合特異性を有する分子に連結した抗α−シヌクレイン抗体を含む二特異性分子である。
他の態様において、ここに提供されるのは、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分のＣＤＲまたは重鎖および／または軽鎖可変領域または重鎖および／または軽鎖をコードする核酸、該核酸分子を含む発現ベクターおよび該発現ベクターで形質転換された細胞である。
他の態様において、ここに提供されるのは、結合部分、標識部分、生物学的活性部分または治療剤などの部分に連結した抗α−シヌクレイン抗体を含む免疫複合体である。
他の態様において、ここに提供されるのは、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分および担体を含む組成物である。またここに提供されるのは、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分および使用指示を含むキットである。
他の態様において、ここに提供されるのは、抗体またはその抗原結合部分を細胞で発現させ、該抗体またはその抗原結合部分を細胞から単離することを含む、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分を製造する方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、サンプルとここに記載する抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を、該抗体またはその抗原結合部分とα−シヌクレインの間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させ、該複合体の形成を検出することを含む、サンプル中のα−シヌクレインを検出する方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、細胞と有効量のここに記載する抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を接触させることを含む、細胞における不溶性または可溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する方法である。ある実施態様において、抗体は、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレインを含まない不溶性または可溶性α−シヌクレイン凝集体の産生を阻害する。ある実施態様において、セリン−１２９のリン酸化は、α−シヌクレインオリゴマーにより誘導される。ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは、予め形成されたα−シヌクレイン原線維である。他の実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは、シヌクレイン病を有する患者からの脳サンプル由来である。
他の態様において、ここに提供されるのは、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患の処置、重症度軽減、進行遅延、発症リスク軽減および／または発症遅延をする方法であって、該疾患を有する対象に有効量のここに記載する抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を投与することを含む方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、対象におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を診断する方法であって、
(ａ)対象からのサンプルと、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を、抗体−抗原複合体が形成されるように接触させ；
(ｂ)形成された複合体の量を測定し；そして
(ｃ)サンプルにおける複合体の量と対照における量を比較することを含み、ここで、対照と比較してサンプルにおける複合体のレベルの上昇は、該対象がレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を有することを示す、方法である。ある実施態様において、サンプルは脳脊髄液、脳組織抽出物、尿または血液である。
ある実施態様において、上記方法における疾患は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症、レビー小体病、多系統萎縮症または純粋自律神経失調症である。ある実施態様において、上記方法は、１以上の付加的治療剤の投与をさらに含む。
図１は、種々のαＳｙｎペプチドで被覆したプレートでインキュベートした、７Ａ１０、２１Ａ３、１５Ａ５、３６Ａ３、１１Ｈ１１−１、４４Ｂ１１、１Ｅ８、２Ｅ２および２３Ｈ８についてのエピトープ結合データを示す一連のグラフである。結合抗体を片側ＥＬＩＳＡにより測定した。データは一回判定を表す。
図２は、完全長ヒト組み換え野生型αＳｙｎモノマー、αＳｙｎ ＰＦＦまたはＡ５３Ｔ αＳｙｎ ＰＦＦへの７Ａ１０、２１Ａ３、１５Ａ５、３６Ａ３、１１Ｈ１１−１および４４Ｂ１１の結合の一連のグラフである。抗体を、αＳｙｎモノマー、αＳｙｎ ＰＦＦまたはＡ５３Ｔ αＳｙｎ ＰＦＦの濃度を増加させている溶液とインキュベートした。非結合抗体をＰＦＦ被覆プレートで捕捉し、片側ＥＬＩＳＡにより測定した。データは、２回判定の平均±ｓｄを表す。
図３は、抗体１(αＳｙｎに結合することが知られる抗体)の完全長ヒト組み換え野生型αＳｙｎモノマー、αＳｙｎ ＰＦＦまたはＡ５３Ｔ αＳｙｎ ＰＦＦへの結合を示すグラフである。非結合抗体をＰＦＦ被覆プレートに捕捉し、片側ＥＬＩＳＡにより測定した。データは、２回判定の平均±ｓｄを表す。
図４は、７Ａ１０の重(ＶＨ)鎖および軽(ＶＫ)鎖の免疫原性ホットスポット分析を示す。アミノ酸のナンバリングは、Ｋａｂａｔ協定(Kabat Convention)に従う。３個のＣＤＲ領域は、２鎖の各々について四角の箱で示し、一方フレームワーク残基はＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３により示す。各アミノ酸の下の数字は、そのアミノ酸を中心とする１５量体ペプチドに結合するアレルの比を示す。例えば、７Ａ１０＿ＶＨのＹ５２での「５」は、Ｙ５２を中心とする１５量体ペプチド、すなわち、LEWIGYIYYSGRTKYであり、(ｉ)このペプチドはヒト生殖系列マッチを有しないこと(それ故に非自己であること)および(ii)２７アレルの５０〜６０％がこのペプチドに高結合親和性を示すことを示す。数字は、グレースケールで明(免疫原性である可能性が低い)から暗(免疫原性ホットスポットである可能性が最も高い)の色で割り当て、これは、図に示すとおり色度を変える。３つの太い矢印は、変異体選択のための選択を示す：Ｒ５６Ｓ、Ｋ５８Ｎ、Ｔ９３Ａ。
図５Ａおよび５Ｂは、試験抗体への７日間の暴露後の陽性ＣＤ４＋増殖応答を有する健常ボランティアヒトＰＢＭＣドナーのパーセンテージのグラフである。各水平棒は１陽性ドナーを表す。７Ａ１０および７Ａ１０ Ｔ９３Ａを、異なるアッセイランで試験した。アバスチンは抗ＶＥＧＦ Ａモノクローナル抗体であり、陰性対照として使用されている。αＩＬ−２１Ｒ ｍＡｂは完全ヒト抗ＩＬ−２１Ｒモノクローナル抗体であり、陽性対照として使用されている。
図６Ａおよび６Ｂは、漸増濃度のマウス、ラットおよびヒトαＳｙｎペプチドおよびＷＴ ＰＦＦへの７Ａ１０(図６Ａ)および７Ａ１０−Ｔ９３Ａ(図６Ｂ)の結合を示すグラフである。非結合抗体をＰＦＦ被覆プレートに捕捉し、片側ＥＬＩＳＡにより測定した。データは、２回判定の平均±ｓｄを表す。
図７は、完全長ヒト組み換え野生型αＳｙｎ、βＳｙｎ、γＳｙｎモノマーへの７Ａ１０、２１Ａ３、１５Ａ５、３６Ａ３、１１Ｈ１１−１および４４Ｂ１１の結合を示す一連のグラフである；αＳｙｎ ＰＦＦを陽性対照として包含させた。非結合抗体をＰＦＦ被覆プレートに捕捉し、片側ＥＬＩＳＡにより測定した。データは、２回判定の平均±ｓｄを表す。
図８Ａおよび８Ｂは、７Ａ１０および抗体１の野生型モノマーαＳｙｎまたはＰＦＦへの結合の表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析を示すグラフである。図８Ａは、モノマーｗｔ αＳｙｎの表面捕捉７Ａ１０への結合を下部曲線として示し、７Ａ１０への多量体ＰＦＦの結合増強(上部曲線)を示す。特に、ｗｔ αＳｙｎの解離速度は極めて迅速であり、一方ＰＦＦ解離は極めて遅い。図８Ｂは、抗体１について同じ形式のデータを示す(下部曲線はＰＦＦにおよび上部曲線はｗｔ αＳｙｎに対応)。７Ａ１０とは対照的に、抗体１は、ＰＦＦ形式に対してｗｔ αＳｙｎの結合に認識できる選択性は示さない。
図９Ａおよび９Ｂは、７Ａ１０および７Ａ１０−Ｔ９３ＡのＰＦＦへのアビディティーを概算するための精密化ＳＰＲアッセイの結果を示すグラフである。図９Ａは、表面に固定化したＰＦＦへの数濃度(３倍希釈１００nM〜０.４nM)の７Ａ１０−ＩｇＧ１.３ｆのアビディティーにより影響される結合反応速度を示す(ｋａ(１／Ｍｓ)：５.８１１Ｅ＋７、ｋｄ(１／ｓ)：０.００９８３４、ＫＤ：１.６９２Ｅ−１０Ｍ)。図９Ｂは７Ａ１０−Ｔ９３Ａ−ＩｇＧ１.３ｆについて同じデータ形式で示す(ｋａ(１／Ｍｓ)：８.９４６Ｅ＋７、ｋｄ(１／ｓ)：０.０３８７３、ＫＤ：４.３２９Ｅ−１０Ｍ)。
図１０Ａは、ＡＡＶ−ｈＡ５３Ｔ−αＳｙｎ ＭＯＩを増加させながら形質導入したラット海馬神経細胞において１１日間の１０nM ＰＦＦ処理後のｐＳ１２９(未処理対照に対して正規化)の誘導を示すグラフである。図１０Ｂは、ｈＡ５３Ｔ−αＳｙｎ ＰＦＦ(上部(上昇)線)またはモノマー(下部(平)線)で１１日間処理した、形質導入(３Ｋ ＭＯＩ ＡＡＶ−ｈＡ５３Ｔ αＳｙｎ)ラット海馬神経細胞におけるｐＳ１２９(未処理対照に対して正規化)の誘導の濃度応答曲線を示すグラフである。図１０Ｃは、９の異なるＭＳＡ患者由来脳サンプルからのライセートでの形質導入(３Ｋ ＭＯＩ ＡＡＶ−ｈＡ５３Ｔ−αＳｙｎ)ラット海馬神経細胞の１１日間の処理後のｐＳ１２９(１０nM ＰＦＦ対照に対して正規化)の誘導を示すグラフである。棒は左から右に１０nM ＰＦＦ、ＭＳＡ＃１、ＭＳＡ＃２、ＭＳＡ＃３、ＭＳＡ＃４、ＭＳＡ＃５、ＭＳＡ＃６、ＭＳＡ＃７、ＭＳＡ＃８およびＭＳＡ＃９に対応する。図１０Ｄは、緩衝液、１０nM ＰＦＦ、対照脳からのライセートまたはＭＳＡ脳からのライセートで処理１１日後の形質導入(３Ｋ ＭＯＩ ＡＡＶ−ｈＡ５３Ｔ−αＳｙｎ)ラット海馬神経細胞における誘導ｐＳ１２９シグナルの免疫蛍光画像を示す。脳ライセートは１：３００希釈で適用した。図１０Ｅは、ＰＦＦの濃度を増加させて１１日間の処理後の形質導入(３Ｋ ＭＯＩ ＡＡＶ−ｈＡ５３Ｔ−αＳｙｎ)ラット海馬神経細胞におけるｐＳ１２９ αＳｙｎ誘導(未処理対照に対して正規化；上昇線)と分岐点(未処理対照に対して正規化；下降線)の逆相関を示すグラフである。図１０Ｆは、ＰＦＦ、ＭＳＡおよび対照脳ライセートならびにＭＳＡおよび対照脳ライセートからの単離高速遠心分離ペレットおよび残存上清で１１日間の処理後の形質導入(３Ｋ ＭＯＩ ＡＡＶ−ｈＡ５３Ｔ−αＳｙｎ)ラット海馬神経細胞におけるｐＳ１２９ αＳｙｎ(未処理対照に対して正規化)の誘導を示すグラフである。棒は左から右に対照、１nM ＰＦＦ、ＭＳＡ脳(ライセート)、ＭＳＡ(ペレット)、ＭＳＡ(上清)、対照(ライセート)、対照(ペレット)および対照(上清)に対応する。図１０Ｇは、ＭＳＡ脳組織ライセートからの再懸濁ペレットで処理後のｐＳ１２９ αＳｙｎ(１０nM ＰＦＦ陽性対照に対して正規化)の時間依存的誘導を示すグラフである。棒は左から右にインキュベーション７日後、インキュベーション１４日後およびインキュベーション１８日後に対応する。図１０Ｈは、１０nM ＰＦＦおよびＭＳＡ脳組織ライセート両者での処理後１１日のｐＳ１２９誘導(未処理対照に対して正規化)および分岐点(未処理対照に対して正規化)を示すグラフである。対照(誘導の欠失を仮定して、ｐＳ１２９誘導棒がない)、ＰＦＦおよびＭＳＡの各々について示すは、ｐＳ１２９誘導および分岐点の順番である。
図１１は、３つの異なるＭＳＡ患者(１２−１８、０１−０３、０４−５１)から産生したＰＦＦおよび脳ライセートの抗体１免疫枯渇についての累積濃度応答曲線を示す一連のグラフである。免疫枯渇サンプルを、３Ｋ ＭＯＩ ｈＡ５３Ｔ αＳｙｎ ＡＡＶで形質導入したラット海馬神経細胞におけるｐＳ１２９の誘導について試験した。Ｙ軸値は、非枯渇サンプルに対して正規化したｐＳ１２９強度を表す。データ点(平均±９５％ＣＩ)および適合曲線を、累積データセットを使用して作成した。各実験について計算したＩＣ５０および平均±ｓｄを示す。
図１２は、３つの異なるＭＳＡ患者(１２−１８、０１−０３、０４−５１)から産生したＰＦＦおよび脳ライセートの７Ａ１０免疫枯渇についての累積濃度応答曲線を示す一連のグラフである。免疫枯渇サンプルを、３Ｋ ＭＯＩ ｈＡ５３Ｔ αＳｙｎ ＡＡＶで形質導入したラット海馬神経細胞におけるｐＳ１２９の誘導について試験した。Ｙ軸値は、非枯渇サンプルに対して正規化したｐＳ１２９強度を表す。データ点(平均±９５％ＣＩ)および適合曲線を、累積データセットを使用して作成した。各実験について計算したＩＣ５０および平均±ｓｄを示す。
図１３は、３つの異なるＭＳＡ患者(１２−１８、０１−０３、０４−５１)から産生したＰＦＦおよび脳ライセートの２１Ａ３免疫枯渇についての累積濃度応答曲線を示す一連のグラフである。免疫枯渇サンプルを、３Ｋ ＭＯＩ ｈＡ５３Ｔ αＳｙｎ ＡＡＶで形質導入したラット海馬神経細胞におけるｐＳ１２９の誘導について試験した。Ｙ軸値は、非枯渇サンプルに対して正規化したｐＳ１２９強度を表す。データ点(平均±９５％ＣＩ)および適合曲線を、累積データセットを使用して作成した。各実験について計算したＩＣ５０および平均±ｓｄを示す。
図１４は、３つの異なるＭＳＡ患者(１２−１８、０１−０３、０４−５１)から産生したＰＦＦおよび脳ライセートの３６Ａ３免疫枯渇についての累積濃度応答曲線を示す一連のグラフである。免疫枯渇サンプルを、３Ｋ ＭＯＩ ｈＡ５３Ｔ αＳｙｎ ＡＡＶで形質導入したラット海馬神経細胞におけるｐＳ１２９の誘導について試験した。Ｙ軸値は、非枯渇サンプルに対して正規化したｐＳ１２９強度を表す。データ点(平均±９５％ＣＩ)および適合曲線を、累積データセットを使用して作成した。各実験について計算したＩＣ５０および平均±ｓｄを示す。
図１５は、３つの異なるＭＳＡ患者(１２−１８、０１−０３、０４−５１)から産生したＰＦＦおよび脳ライセートの１５Ａ５免疫枯渇についての累積濃度応答曲線を示す一連のグラフである。免疫枯渇サンプルを、３Ｋ ＭＯＩ ｈＡ５３Ｔ αＳｙｎ ＡＡＶで形質導入したラット海馬神経細胞におけるｐＳ１２９の誘導について試験した。Ｙ軸値は、非枯渇サンプルに対して正規化したｐＳ１２９強度を表す。データ点(平均±９５％ＣＩ)および適合曲線を、累積データセットを使用して作成した。各実験について計算したＩＣ５０および平均±ｓｄを示す。
図１６は、３つの異なるＭＳＡ患者(１２−１８、０１−０３、０４−５１)から産生したＰＦＦおよび脳ライセートの１１Ｈ１１−１免疫枯渇についての累積濃度応答曲線を示す一連のグラフである。免疫枯渇サンプルを、３Ｋ ＭＯＩ ｈＡ５３Ｔ αＳｙｎ ＡＡＶで形質導入したラット海馬神経細胞におけるｐＳ１２９の誘導について試験した。Ｙ軸値は、非枯渇サンプルに対して正規化したｐＳ１２９強度を表す。データ点(平均±９５％ＣＩ)および適合曲線を、累積データセットを使用して作成した。各実験について計算したＩＣ５０および平均±ｓｄを示す。
図１７は、３つの異なるＭＳＡ患者(１２−１８、０１−０３、０４−５１)から産生したＰＦＦおよび脳ライセートの４４Ｂ１１免疫枯渇についての累積濃度応答曲線を示す一連のグラフである。Ｙ軸値は、非枯渇サンプルに対して正規化したｐＳ１２９強度を表す。免疫枯渇サンプルを、３Ｋ ＭＯＩ ｈＡ５３Ｔ αＳｙｎ ＡＡＶで形質導入したラット海馬神経細胞におけるｐＳ１２９の誘導について試験した。データ点(平均±９５％ＣＩ)および適合曲線を、累積データセットを使用して作成した。各実験について計算したＩＣ５０および平均±ｓｄを示す。
図１８は、１〜３週目のトラフに採り、４週目の投与２４時間後に採取した血漿サンプルにおける抗体３(αＳｙｎに結合することが知られる抗体)、抗体１、７Ａ１０、１１Ｈ１１−１、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３および４４Ｂ１１の血漿濃度を示す一連のグラフである。上部左(１週目血漿トラフ)、上部右(２週目血漿トラフ)、下部左(３週目血漿トラフ)および下部右(４週目血漿投与２４時間後)。
図１９は、ＰＦＦ注射部位に対して同側性および対側性の、７Ａ１０、２１Ａ３、１１Ｈ１１−１、１５Ａ５、３６Ａ３、４４Ｂ１１および抗体１の脳濃度を示すグラフである。
図２０は、ＡＤＡ活性を有しない(丸)および有する(三角)サンプルについて４週目の抗体３、抗体１、７Ａ１０、２１Ａ３、１５Ａ５および４４Ｂ１１の血漿レベルを示すグラフである。
図２１は、マウスの同側性扁桃体におけるｐＳ１２９ αＳｙｎ病理の誘導を示す代表的免疫組織化学的画像である。マウスにＰＢＳまたはＡ５３Ｔ−ＰＦＦを接種し、次いでＰＢＳまたは次の抗体を１０mg／kgで毎週４週間投与した：抗体１、７Ａ１０、２１Ａ３、抗体３、１５Ａ５、３６Ａ３、４４Ｂ１１および１１Ｈ１１−１。脳切片をｐＳ１２９ αＳｙｎについて染色した。矢印は、Ａ５３Ｔ−ＰＦＦ対照切片で検出されたｐＳ１２９ αＳｙｎ凝集体の例を強調する。画像を１０倍対物レンズを使用して獲得した。
図２２Ａ〜２２Ｄは、線条体Ａ５３Ｔ−ＰＦＦ注射部位に同側性の運動皮質(図２２Ａおよび２２Ｂ)および扁桃体(図２２Ｃおよび２２Ｄ)におけるｐＳ１２９染色陽性細胞数を示すグラフである。群平均および統計学的有意性(図２２Ａおよび２２Ｃ)および個々の動物データ(図２２Ｂおよび２２Ｄ)を示す。統計分析は、対照としてＰＦＦ群を使用する一元配置ＡＮＯＶＡとダネットの後検定に基づいた(＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００１)。
図２３Ａ〜２３Ｄは、２つの独立したＥＬＩＳＡアッセイを使用する脳組織で測定したαＳｙｎオリゴマーレベルを示すグラフである。注射部位に対して対側性および同側性の脳半球からの可溶性抽出物を分析した。群平均および統計学的有意性(図２３Ａおよび２３Ｃ)および個々の動物データ(図２３Ｂおよび２３Ｄ)を示す。統計分析は、対照としてＰＦＦ群を使用する一元配置ＡＮＯＶＡとダネットの後検定に基づいた＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００１)。
図２４Ａ〜２４Ｄは、ｐＳ１２９ ａＳｙｎ(図２４Ａおよび２４Ｂ)のレベルを示す一連のグラフであり、総ａＳｙｎ(図２４Ｃおよび２４Ｄ)は、ＥＬＩＳＡを使用して脳組織で測定した。注射部位に対して対側性および同側性の脳半球からの可溶性抽出物を分析した。群平均(図２４Ａおよび２４Ｃ)および個々の動物データ(図２４Ｂおよび２４Ｄ)を示す。群間に統計学的に有意な差はなかった(統計分析は、対照としてＰＦＦ群を使用する一元配置ＡＮＯＶＡとダネットの後検定に基づいた)。
図２５は、示されている抗体の用量設定のαＳｙｎモノマーまたはαＳｙｎ ＰＦＦへの結合を示す一連のグラフである。非結合抗体をＰＦＦ被覆プレートで捕捉し、片側ＥＬＩＳＡにより測定した。データは、２回判定の平均±ｓｄを表す。
図２６は、示されている抗体の用量設定のαＳｙｎモノマーまたはαＳｙｎ ＰＦＦへの結合を示す一連のグラフである。非結合抗体をＰＦＦ被覆プレートで捕捉し、片側ＥＬＩＳＡにより測定した。データは、２回判定の平均±ｓｄを表す。
図２７は、ＥＬＩＳＡ １Ｅ８.１０＋２Ｅ２.２(１Ｅ８捕捉抗体、２Ｅ２検出抗体)およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８.Ｇ３(ＭＪＦＲ１４６４２捕捉抗体、２３Ｈ８検出抗体)によるａＳｙｎモノマーおよびＰＦＦの検出を示す一連のグラフである。濃度応答曲線例が示される。モノマーおよびＰＦＦサンプルを、ＥＬＩＳＡ前に超音波処理で前処理した。モノマーおよびＰＦＦシヌクレインレベルをモノマー当量ng／mlとして表す。データは、３回判定の平均±ｓｄを表す。ＣＰＳ＝カウント毎秒。
図２８は、ＥＬＩＳＡによるαＳｙｎモノマーおよびＰＦＦの検出を示す一連のグラフである。濃度応答曲線例が示される。捕捉抗体は最初に挙げた抗体であり、検出抗体は二番目に挙げる。モノマーおよびＰＦＦサンプルを、ＥＬＩＳＡ前に超音波処理で前処理した。モノマーおよびＰＦＦシヌクレインレベルをモノマー当量ng／mlとして表す。ＰＳ１２９ αＳｙｎペプチドの検出をＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３ ＥＬＩＳＡで評価した。データは、３回判定の平均±ｓｄを表す。ＣＰＳ＝カウント毎秒。
図２９は、ＥＬＩＳＡによるαＳｙｎおよびαＳｙｎファミリーメンバーβ−シヌクレインおよびγ−シヌクレインの検出を示す一連のグラフである。捕捉抗体は最初に挙げた抗体であり、検出抗体は二番目に挙げる。濃度応答曲線例が示される。データは、２回判定の平均±ｓｄを表す。ＣＰＳ＝カウント毎秒。
図３０は、１Ｅ８.１０＋２Ｅ２.２オリゴマーＥＬＩＳＡ、ＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８.Ｇ３オリゴマーＥＬＩＳＡ、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２総ＥＬＩＳＡおよびＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３(ｐＳ１２９)ＥＬＩＳＡを使用して対照、ＰＤ、ＡＤおよびＰＳＰ抽出物で測定したαＳｙｎレベルを示す一連のグラフである。捕捉抗体は最初に挙げた抗体であり、検出抗体は二番目に挙げる。レベルは、総タンパク質(pg／mgタンパク質)に対して正規化したαＳｙｎモノマー当量またはｐＳ１２９ペプチド当量(ＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３)として示す。統計は、対照群に対する一元配置ＡＮＯＶＡとダネット多重比較に基づいた。対照サンプルの大部分が＜ＬＬＱであったため、オリゴマーアッセイ結果についての統計処理は実施していないことに注意。＊ｐ＜０.０５。
図３１は、１Ｅ８.１０＋２Ｅ２.２オリゴマーＥＬＩＳＡ、ＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８.Ｇ３オリゴマーＥＬＩＳＡ、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２総ＥＬＩＳＡおよびＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３(ｐＳ１２９)ＥＬＩＳＡを使用して対照、ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ抽出物で測定したαＳｙｎレベルを示す一連のグラフである。捕捉抗体は最初に挙げた抗体であり、検出抗体は二番目に挙げる。レベルは、総タンパク質(pg／mgタンパク質)に対して正規化したαＳｙｎモノマー当量またはｐＳ１２９ペプチド当量(ＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３)として示す。統計は、対照群に対する一元配置ＡＮＯＶＡとダネット多重比較に基づいた。対照サンプルの大部分が＜ＬＬＱであったため、オリゴマーアッセイ結果についての統計処理は実施していないことに注意。＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００１。
図３２は、ＭＪＦＲ１＋Ｓｙｎ３０３ Ｎ末端ＥＬＩＳＡおよびＭＪＦＲ１＋４Ｄ６ Ｃ末端ＥＬＩＳＡを使用して対照、ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ抽出物で測定したαＳｙｎレベルを示す一連のグラフである。捕捉抗体は最初に挙げた抗体であり、検出抗体は二番目に挙げる。レベルは、総タンパク質(pg／mgタンパク質)に対して正規化したαＳｙｎモノマー当量として表す。有意差は観察されなかった(統計は、対照群に対する一元配置ＡＮＯＶＡとダネット多重比較に基づいた)。
図３３は、１Ｅ８＋２Ｅ２オリゴマーＥＬＩＳＡ、ＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８オリゴマーＥＬＩＳＡ、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２総ＥＬＩＳＡおよびＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３(ｐＳ１２９)ＥＬＩＳＡを使用してＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ抽出物で測定したαＳｙｎレベルの相関を示す一連のグラフである。捕捉抗体は最初に挙げた抗体であり、検出抗体は二番目に挙げる。レベルはαＳｙｎモノマー当量またはｐＳ１２９ペプチド当量(ＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３)として表す。１Ｅ８＋２Ｅ２、ＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２アッセイにおける単位はng／mlとして表すことに注意。点線は１：１相関を表す。
図３４は、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２総ＥＬＩＳＡ、ＭＪＦＲ１＋Ｓｙｎ３０３ Ｎ末端ＥＬＩＳＡ、ＭＪＦＲ１＋４Ｄ６ Ｃ末端ＥＬＩＳＡおよびＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３(ｐＳ１２９)ＥＬＩＳＡを使用して対照、ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ抽出物で測定したαＳｙｎレベルの相関を示す一連のグラフである。捕捉抗体は最初に挙げた抗体であり、検出抗体は二番目に挙げる。レベルはαＳｙｎモノマー当量またはｐＳ１２９ペプチド当量(ＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３)として表す。ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２、ＭＪＦＲ１＋Ｓｙｎ３０３、ＭＪＦＲ１＋４Ｄ６アッセイにおける単位はng／mlとして表すことに注意。点線は１：１相関を表す。
図３５は、対照、ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ抽出物から単離した高速ペレットにおけるオリゴマーの検出および回収を示す一連のグラフである。レベルは、１Ｅ８＋２Ｅ２オリゴマーＥＬＩＳＡおよびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８オリゴマーＥＬＩＳＡを使用して測定し、αＳｙｎモノマー当量として表す。捕捉抗体は最初に挙げた抗体であり、検出抗体は二番目に挙げる。点線は１：１相関を表す。％回収は出発オリゴマーレベルに基づき計算し、１Ｅ８＋２Ｅ２アッセイについて表す。
図３６は、対照対象(１１−４６)およびＭＳＡ患者(１１−４６)脳組織サンプルから産生した抽出物から単離したペレットおよび上清(ｓｕｐ)フラクションの免疫ブロットである。脳抽出物をＳＥＣに付し、次いでフラクション５〜１４をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットにより分析した。αＳｙｎモノマー標準(レーンＡ)および分子量標準も各免疫ブロットに包含させた。上清フラクションにおけるαＳｙｎの大部分は、約６０kDaの分子半径に対応するフラクション１０で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットによりモノマーおよび切断フラグメントに分解された。対照およびＭＳＡ両サンプルで類似結果が観察された。ペレットにおけるαＳｙｎの大部分は、＞６７０kDaの分子半径に対応する空隙容量(フラクション６)で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットによりモノマーおよび切断フラグメントに分解された。ａＳｙｎ抗体４Ｂ１２を免疫ブロットに使用した。
図３７は、対照、ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ患者脳組織サンプルから単離した脳抽出物ペレットの免疫ブロットを示す。＜２０kDa分子量領域の結果を示す。サンプルを、αＳｙｎ抗体４Ｂ１２、４Ｄ６、ＥＰ１５３６Ｙおよび抗アクチン抗体対照を使用して分析した。
図３８は、対照、ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ患者脳組織サンプルから単離した脳抽出物ペレットの免疫ブロットを示す。３０〜４０kDa分子量領域の結果を示す。サンプルをαＳｙｎ抗体Ｓｙｎ３０３、４Ｂ１２、ＬＢ５０９、８１Ａ、４Ｄ６およびＩｇＧ抗体対照を使用して分析した。
図３９は、対照、ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ患者脳組織サンプルから単離した脳抽出物ペレットの免疫ブロットを示す。６０〜１００kDa分子量領域を示す。サンプルをαＳｙｎ抗体Ｓｙｎ３０３、４Ｂ１２、ＬＢ５０９、４Ｄ６およびＩｇＧ抗体対照を使用して分析した。
図４０は、形質導入(ＡＡＶ−ｈＡ５３Ｔ−αＳｙｎ ３Ｋ ＭＯＩ)初代ラット海馬神経細胞におけるｐＳ１２９ αＳｙｎの誘導を示す一連のグラフである。神経細胞を、抽出および固定化１１日前に対照、ＰＤ、ＤＬＢおよびＭＳＡ脳抽出物からの脳抽出物ペレットで処理した。不溶性ｐＳ１２９シグナルをハイコンテンツ(ＨＣ)分析で測定し、ＰＦＦ処理対照(１０nM)に対して正規化した。対照抽出物ペレットで検出されたＨＣシグナルは背景シグナルと同等であった。各ペレットのＨＣシグナルレベルは、１Ｅ８＋２Ｅ２ ＥＬＩＳＡを使用して測定したオリゴマーシグナルと相関した。レベルをαＳｙｎモノマー当量として表す。
図４１は、ＭＳＡ、進行性核上性麻痺(ＰＳＰ)および健常対照からのヒトＣＳＦサンプルからのａＳｙｎオリゴマー(１Ｅ８＋２Ｅ２およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８)および総ａＳｙｎ(ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２)レベルを示す一連のグラフである。捕捉抗体は最初に挙げた抗体であり、検出抗体は二番目に挙げる。ＣＳＦを、分析前に４倍(１Ｅ８＋２Ｅ２およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８)および２０倍(ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２)希釈した。データを希釈補正し、αＳｙｎモノマー当量(pg／ml)として表す。ＬＬＱを２×アッセイ背景として定義し、希釈補正ＬＬＱを各アッセイについて示した。ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２レベルについての平均およびＳＤを表に示す。
図４２は、ＭＳＡおよび健常対照からのヒトＣＳＦサンプルからのａＳｙｎオリゴマー(１Ｅ８＋２Ｅ２およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８)および総ａＳｙｎ(ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２)レベルを示す一連のグラフである。ＣＳＦを、分析前に４倍(１Ｅ８＋２Ｅ２およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８)および２０倍(ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２)希釈した。データを希釈補正し、αＳｙｎモノマー当量(pg／ml)として表す。ＬＬＱを２×アッセイ背景として定義し、希釈補正ＬＬＱを各アッセイについて示した。ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２レベルについての平均およびＳＤを表に示す。
詳細な記載
ここに記載されるのは、モノマーα−シヌクレインよりオリゴマーα−シヌクレインに優先的に結合する単離抗体、特にモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体であり。ある実施態様において、ここに記載される抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列に由来するおよび／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。ここに提供されるのは、単離抗体、このような抗体の製造方法、このような抗体を含む免疫複合体および二特異性分子および該抗体を含むように製剤された医薬組成物である。またここに提供されるのは、α−シヌクレインの不溶性凝集体産生を阻害するために該抗体を使用する方法である。従って、ここに記載するα−シヌクレイン抗体は、例えば、レビー小体病およびシヌクレイン病の処置を含む多様な治療適用ならびに診断アッセイに使用し得る。
定義
本明細書がより容易に理解され得るように、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な記載を通して示される。
用語「α−シヌクレイン」および「αＳｙｎ」は、ここでは相互交換可能に使用し、次のアミノ酸配列(野生型ヒトα−シヌクレイン)を有する１４０アミノ酸ポリペプチドをいう：
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA(配列番号１；GenBank Accession No. P37840)
本タンパク質は３個の認識されるドメインである、アミノ酸１〜６１にわたるＫＴＫＥ反復ドメイン、約アミノ酸６０〜９５に伸びるＮＡＣ(非アミロイド成分)ドメインおよび約アミノ酸９８〜１４０に伸びるＣ末端酸性ドメインを有する。特に断らない限り、α−シヌクレインまたはそのフラグメントは、上記天然ヒト野生型アミノ酸配列およびその対立遺伝子バリアントを含む。例えば、また含まれるのは、レビー小体病と関連するバリアント(例えば、Ｅ４６Ｋ、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔ)である。α−シヌクレイン凝集を増強する誘導変異Ｅ８３Ｑ、Ａ９０Ｖ、Ａ７６Ｔも、個々にまたは互いにおよび／またはヒト対立遺伝子バリアントＥ４６Ｋ、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔと組み合わせて存在し得る。
ここで使用する「シヌクレイン病」は、神経細胞およびグリア細胞におけるα−シヌクレイン凝集体の異常な蓄積の存在により特徴づけられる神経変性障害をいい、例えば、パーキンソン病(ＰＤ)、認知症を伴うＰＤ(ＰＤＤ)、レビー小体型認知症(ＤＬＢ)、多系統萎縮症(ＭＳＡ)、ゴーシェ病(ＧＤ)、脳鉄蓄積を伴う神経変性(ＮＢＩＡ)、アルツハイマー病(ＡＤ)ならびにサンフィリポ症候群、ハンター症候群、テイ・サックスおよびサンドホフ病およびニーマン・ピックＣ型を含むリソソーム蓄積障害(ＬＳＤ)を含む。神経細胞の細胞体または神経突起にみられるα−シヌクレイン凝集体の蓄積はそれぞれレビー小体およびレビー神経突起と称され、ＰＤおよびＤＬＢの病理学的ホールマークである。オリゴデンドロサイトにみられるα−シヌクレイン(ＧＣＩ)のグリア細胞質封入体存在は、ＭＳＡの病理学的ホールマークである。
「多系統萎縮症」または「ＭＳＡ」は、運動、血圧および他の身体機能に影響する症状の組み合わせにより特徴づけられる神経変性疾患である。ＭＳＡの症状は、発症と重症度の分布が人毎に異なる。このため、シャイ・ドレーガー症候群、線条体黒質変性症(ＳＤ)およびオリーブ橋小脳萎縮症(ＯＰＣＡ)の３つの異なる疾患が、この範囲の症状を達成するために最初に述べられていた。
ここで使用する用語「α−シヌクレインオリゴマー」は、２以上のα−シヌクレインモノマーの凝集体であり、一定範囲の分子量を有し得る。一般にオリゴマーは、低溶解性原線維と比較して、凝集体の可溶性種と理解される。可溶性オリゴマーは、一部α−シヌクレイン病理の細胞間伝播を担うα−シヌクレインのいわゆる「伝達可能種」を含むと考えられる。特に断らない限り、「予め形成された原線維」または「ＰＦＦ」は、α−シヌクレインオリゴマー、例えば、実施例３に記載のとおり製造したα−シヌクレインオリゴマーの種である。ＰＦＦは、凝集および線維化を支持する条件下で、組み換えヒトモノマーα−シヌクレインから製造されると理解される。
ここで使用する「モノマー／ＰＦＦ結合比」は、α−シヌクレインモノマーに対する抗α−シヌクレイン抗体の結合親和性対該抗体のＰＦＦへの結合親和性の比をいう。１より大きい比は、モノマーα−シヌクレインよりもＰＦＦへの結合の大きな優先性を示す。例えば、実施例３に記載するＥＬＩＳＡを使用して、抗体がモノマーα−シヌクレインに２９１nMのＥＣ５０およびＰＦＦに０.１６nMのＥＣ５０で結合したら、その抗体のモノマー／ＰＦＦ結合比は、２９１／０.１６＝１８１９である。ある実施態様において、ＥＬＩＳＡ以外のアッセイを使用して、モノマー／ＰＦＦ結合比を得ることができる。ある実施態様において、ＰＦＦを、実施例３に記載する方法を使用して調製する。ある実施態様において、ＰＦＦ以外のα−シヌクレインオリゴマーを使用して、モノマー対オリゴマー結合親和性比を得る。
ここで使用する用語「抗体」は、抗体全体およびそのあらゆる抗原結合フラグメント(すなわち、「抗原結合部分」)または一本鎖を含む。「抗体」は、ある実施態様において、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分をいう。各重鎖は、１重鎖可変領域(ここでＶＨと略す)および１重鎖定常領域からなる。ある天然に存在する抗体において、重鎖定常領域は、３ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。ある天然に存在する抗体において、各軽鎖は１軽鎖可変領域(ここでＶＬと略す)および１軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１ドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、フレームワーク領域(ＦＲ)と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性領域に細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端方向で次の順番に配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典補体系の第一成分(Ｃｌｑ)を含む宿主組織または因子への、免疫グロブリンの結合に介在し得る。
抗体は、一般に１０５〜１０１１Ｍ以下の解離定数(ＫＤ)により反映される高親和性で、その同族抗原に特異的に結合する。約１０４Ｍを超えるあらゆるＫＤは、一般に非特異的結合を示すと考えられる。ここで使用する抗原に「特異的に結合する」抗体は、１０７Ｍ以下、好ましくは１０８Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０９Ｍ以下および最も好ましくは１０８Ｍ〜１０１０Ｍ以下のＫＤを有することを意味する高親和性で該抗原および実質的に同一の抗原に結合するが、無関係の抗原に高親和性で結合しない抗体をいう。抗原は、ある抗原に高度の配列同一性を示すならば、例えば、該抗原の配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％またはさらにより好ましくは少なくとも９９％配列同一性を示すならば、当該抗原と「実質的に同一」である。
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない一般に知られるアイソタイプの何れかであり得る。ＩｇＧアイソタイプは、種によってサブクラスに分割され、ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に、そしてマウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３に分けられる。免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１はいくつかのアロタイプで存在し、それらは相互に多くて数個のアミノ酸が異なる。「抗体」は、例えば、天然に存在するおよび天然に存在しない抗体、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラおよびヒト化抗体、ヒトおよび非ヒト抗体、完全合成抗体、および一本鎖抗体を含む。
ここで使用する抗体の「抗原結合部分」なる用語は、抗原(例えば、ヒトα−シヌクレイン)に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１以上のフラグメントをいう。このような「フラグメント」は、例えば約８〜約１５００アミノ酸長、好適には約８〜約７４５アミノ酸長、好適には約８〜約３００、例えば約８〜約２００アミノ酸または約１０〜約５０または１００アミノ酸長である。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントにより発揮され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合フラグメントの例は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる単価フラグメントであるＦａｂフラグメント；(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ’)２フラグメント；(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；(iv)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；および(vi)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)または(vii)所望により合成リンカーにより結合されていてもよい２以上の単離ＣＤＲの組み合わせを含む。さらに、Ｆｖフラグメント、ＶＬおよびＶＨの２個のドメインが別々の遺伝子によりコードされ得るが、組み換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域対が単価分子を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを製造することを可能とする合成リンカーにより結合され得る(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られる従来技術を使用して得て、有用性について、フラグメントをインタクト抗体と同じ方法でスクリーニングすることにより得ることができる。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技法またはインタクト免疫グロブリンを酵素もしくは化学開裂することにより製造され得る。
「二特異性」または「二機能性抗体」は、２個の異なる重／軽鎖対および２個の異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む多様な方法により製造され得る。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)参照。
ここで使用する用語「モノクローナル抗体」は、特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す１個の抗体または１個の組成物を構成する複数の抗体のすべてが特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す抗体の当該組成物をいう。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、単一結合特異性を示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および必要に応じて定常領域を有する、抗体または抗体組成物をいう。ある実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入非ヒト動物、例えば、遺伝子導入マウスから得たＢ細胞を含むハイブリドーマによって製造される。
ここで使用する用語「組み換えヒト抗体」は、組み換え手段により製造、発現、創造または単離された全ヒト抗体、例えば(ａ)ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子導入または染色体導入された動物(例えば、マウス)またはそこから調製したハイブリドーマから単離された抗体、(ｂ)例えば、トランスフェクトーマから抗体を発現するようにトランスフォームした宿主細胞から単離された抗体、(ｃ)組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および(ｄ)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列から他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む何らかの他の手段により製造、発現、創製または単離された抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によりコードされるが、例えば、抗体成熟中に起こり得るその後の再配列および変異を含む、特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する、可変および定常領域を含む。当分野で知られるとおり(例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125参照)、可変領域は、外来性抗原に特異的な抗体を形成するように再配列される種々の遺伝子によりコードされる、抗原結合ドメインを含む。再配列に加えて、可変領域は、外来性抗原に対する抗体の親和性を増加させるために、複数の一アミノ酸変化(ここでは体細胞変異または超変異と称する)によりさらに修飾され得る。定常領域は、抗原へのさらなる応答により変化する(すなわち、アイソタイプスイッチ)。それ故に、抗原に応答して軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再配列され、体細胞変異した核酸分子は、元の核酸分子と配列同一性を有しないが、代わりに実質的に同一または類似である(すなわち、少なくとも８０％同一性を有する)。
「ヒト」抗体(ＨｕＭＡｂ)は、フレームワークおよびＣＤＲ領域両者がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体をいう。さらに、抗体が定常領域を含むならば、該定常領域もまたヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である。ここに記載する抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロで無作為もしくは部位特異的変異またはインビボで体細胞変異により導入した変異)を含み得る。しかしながら、ここで使用する用語「ヒト抗体」は、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同義に使用される。
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てがヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置換される抗体をいう。抗体のヒト化形態のある実施態様において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全ては、ヒト免疫グロブリンからのアミノ酸で置換され、一方１以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分または全ては未変化である。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、抗体が特定の抗原に結合する能力を消失させない限り、許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体に類似する抗原特異性を維持する。
「キメラ抗体」は、可変領域がマウス抗体由来であり、定常領域がヒト抗体由来である抗体のような、可変領域がある種由来であり、定常領域が他の種由来である抗体をいう。
ここで使用する「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)をいう。
「アロタイプ」は、特定のアイソタイプ群内の天然に存在するバリアントをいい、このバリアントは数アミノ酸異なる(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照)。ここに記載する抗体は、何れのアロタイプでもよい。ここで使用する「ＩｇＧ１ｆ」または「ＩｇＧ１.３ｆ」アイソタイプと称する抗体は、それぞれアロタイプ「ｆ」の、すなわち、例えば、配列番号１１９に示すとおり、Ｋａｂａｔ式表記におけるＥＵ指標に従いＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを有する、ＩｇＧ１およびエフェクターレスＩｇＧ１.３抗体である。
用語「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、ここで用語「抗原に特異的に結合する抗体」と相互交換可能に使用される。
ここで使用する「単離抗体は」、異なる抗原特異性を有する他の抗体(例えば、α−シヌクレインに特異的に結合する単離抗体は、α−シヌクレイン以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)を実質的に含まない抗体をいうことを意図する。α−シヌクレインのエピトープに特異的に結合する単離抗体は、しかしながら、異なる種からの他のα−シヌクレインタンパク質(例えば、マウスまたはラットからのα−シヌクレイン)と交差反応性であり得る。
「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体もしくはリガンドの相互作用またはそれに由来する生化学的事象をいう。「エフェクター機能」の例は、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)などのＦｃγＲ介在エフェクター機能ならびに細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)の下方制御をいう。このようなエフェクター機能には、一般にＦｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と結合することが必要である。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、ＦｃγＲファミリーの受容体であり、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的にスプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲファミリーは、３個の活性化受容体(マウスでＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIIおよびＦｃγＲIV；ヒトでＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲIIＡおよびＦｃγＲIIIＡ)および１個の阻害性受容体(ＦｃγＲIIＢ)を含む。先天性エフェクター細胞型の大部分は、１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲIIＢを発現し、一方ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は、１個の活性化Ｆｃ受容体(マウスでＦｃγＲIIIおよびヒトでＦｃγＲIIIＡ)を選択的に発現するが、マウスおよびヒトで阻害性ＦｃγＲIIＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は大部分のヒトＦｃ受容体に結合し、結合する活性化Ｆｃ受容体のタイプに関して、マウスＩｇＧ２ａに相当すると考えられる。
「Ｆｃ領域」(結晶性フラグメント領域)または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)に位置するＦｃ受容体または古典補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)への結合を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合に介在する、抗体重鎖のＣ末端領域をいう。それ故に、Ｆｃ領域は、第一定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、ＣＨ１またはＣＬ)以外の抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２個の重鎖の第二(ＣＨ２)および第三(ＣＨ３)定常ドメインに由来する２個の同一タンパク質フラグメントを含み；ＩｇＭおよびＩｇＥ Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３個の重鎖定常ドメイン(ＣＨドメイン２−４)を含む。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３およびＣγ１とＣγ２の間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常Ｃ２２６位またはＰ２３０位のアミノ酸残基(またはこれらアミノ酸間のアミノ酸)から、重鎖のカルボキシ末端に伸びると定義され、ここで、ナンバリングはＫａｂａｔ式表記におけるＥＵ指標に従う。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、約アミノ酸２３１〜約アミノ酸３４０まで伸び、一方ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、ＩｇＧの約アミノ酸３４１〜約アミノ酸４４７に伸びる。ここで使用するＦｃ領域は、あらゆるアロタイプバリアントまたはバリアントＦｃ(例えば、天然に存在しないＦｃ)を含む天然配列Ｆｃであり得る。Ｆｃはまた単離されたまたは「Ｆｃ融合タンパク質」(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)とも称する「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」などのＦｃ含有タンパク質ポリペプチドの状況におけるこの領域も意味し得る。
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原の部位をいう。エピトープは、隣接アミノ酸(通常直線状エピトープ)またはタンパク質の三次元折り畳みにより並置される非隣接アミノ酸(通常立体構造エピトープ)の両者から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、一般に、しかし常にではなく、変性溶媒への暴露において維持されるが、他方三次元折り畳みにより形成されるエピトープは、一般に変性溶媒での処理により消失する。エピトープは、一般に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸を、特有の空間的高次構造で含む。どのエピトープがどの抗体に結合するかを決定する方法(すなわち、エピトープマッピング)は当分野で周知であり、例えば、重複または隣接ペプチドと抗体との反応性について試験する、免疫ブロッティングおよび免疫沈降アッセイを含む。エピトープの空間的高次構造を決定する方法は、文献における技法およびここに記載のもの、例えば、ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴およびＨＤＸ−ＭＳを含む(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照)。
用語「エピトープマッピング」は、抗体−抗原認識についての分子決定基を同定する過程をいう。
２以上の抗体について言う「同一エピトープに結合する」なる用語は、これら抗体が、ある方法により決定して、アミノ酸残基の同一セグメントに結合することを意味する。抗体がここに記載する抗体と「α−シヌクレイン上の同一エピトープ」に結合するか否かを決定する技法は、例えば、エピトープの原子解析を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析および水素／重水素交換マススペクトロメトリー(ＨＤＸ−ＭＳ)などのエピトープマッピング方法を含む。他の方法は、抗原配列内のアミノ酸残基修飾による結合の喪失が、しばしばエピトープ成分の指標であると考えられる、抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異種への結合のモニターである。さらに、エピトープマッピングのためのコンピューターによるコンビナトリアル法も使用し得る。これらの方法は、目的の抗体が、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的短ペプチドを親和性単離する能力に依存する。同一ＶＨおよびＶＬまたは同一ＣＤＲ１、２および３配列を有する抗体は、同一エピトープに結合することが予測される。
「標的への結合について他の抗体と競合する」抗体は、該他の抗体の標的への結合を(部分的にまたは完全に)阻害する抗体である。２抗体が標的への結合について互いに競合するか否か、すなわち、ある抗体が、他の抗体の標的への結合を阻害するか否かおよびその程度を、既知競合実験を使用して決定し得る。ある実施態様において、抗体は、他の抗体と競合し、標的への結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc ; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 or in Chapter 11 of “Using Antibodies” by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999の記載に従って実施され得る。競合する抗体は、同一エピトープ、重複エピトープまたは隣接エピトープ(例えば、立体障害により証明される)に結合する。
他の競合的結合アッセイは、固相直接および間接ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、固相直接および間接酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)参照)；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)参照)；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)参照)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al., Virology 176:546 (1990))；および直接標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))を含む。
ここで使用する用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」は、所定の抗原上のエピトープへの抗体結合をいう。一般に、抗体は、(ｉ)例えば、所定の抗原を検体として、抗体をリガンドとして使用するＢＩＡＣＯＲＥ ２０００装置における表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)テクノロジーまたは抗体の抗原陽性細胞への結合のスキャッチャード分析により決定して、約１０−７Ｍ未満、例えば１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下の平衡解離定数(ＫＤ)で結合するおよび(ii)所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原(例えば、ＢＳＡ、カゼイン)への結合親和性より少なくとも２倍大きな親和性で所定の抗原と結合する。
ここで使用する用語「ｋassoc」または「ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度をいうことを意図し、一方ここで使用する用語「ｋdis」または「ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度をいうことを意図する。ここで使用する用語「ＫＤ」は、解離定数をいうことを意図し、これはｋｄ対ｋａ比(すなわちｋｄ／ｋａ)から得られ、モル濃度(Ｍ)として表す。抗体のＫＤ値は、当分野で十分に確立されている方法を使用して決定され得る。抗体のＫＤを決定する好ましい方法は、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ(登録商標)システムなどのバイオセンサーシステムを使用する、表面プラズモン共鳴またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード分析の使用による。
抗体またはその抗原結合フラグメントを使用するインビトロまたはインビボアッセイにおける用語「ＥＣ５０」は、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの中間の応答を誘導する抗体またはその抗原結合部分の濃度をいう。
「ポリペプチド」は、少なくとも２個の連続的に連結したアミノ酸残基を含む鎖をいい、鎖長の上限はない。タンパク質内の１以上のアミノ酸残基は、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成のような、しかしこれらに限定されない修飾を含み得る。「タンパク質」は１以上のポリペプチドを含み得る。
ここで使用する用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよく、ｃＤＮＡであり得る。
また提供されるのは、ここに示す配列の「保存的配列修飾」、すなわち、該ヌクレオチド配列によりコードされるまたは該アミノ酸配列を含む抗体の抗原への結合を消失させないヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾である。このような保存的配列修飾は、保存的ヌクレオチドおよびアミノ酸置換、ならびに、ヌクレオチドおよびアミノ酸付加および欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられているものを含む。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは文献において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それ故に、抗α−シヌクレイン抗体の予想される非必須アミノ酸残基は、好ましくは同一側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えられる。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当分野で周知である(例えば、Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); and Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)参照)。
核酸について、用語「実質的相同性」は、２核酸またはそれらの指定配列を、最適にアラインし、比較したとき、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴い、少なくともヌクレオチドの約８０％、通常少なくともヌクレオチドの約９０％〜９５％およびより好ましくは少なくとも約９８％〜９９.５％同一であることを示す。あるいは、セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下、鎖の相補体とハイブリダイズするとき、実質的相同性が存在する。
ポリペプチドについて、用語「実質的相同性」は、２ポリペプチドまたはそれらの指定配列を、最適にアラインし、比較したとき、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴い、少なくともアミノ酸の約８０％、通常少なくともアミノ酸の約９０％〜９５％およびより好ましくは少なくとも約９８％〜９９.５％が同一であることを示す。
２配列間のパーセント同一性は、２配列の最適アラインメントのために導入することが必要であったギャップ数および各ギャップ長を考慮して、これら配列により共有される同一位置の数の関数である(すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×１００)。配列の比較および２配列間のパーセント同一性の決定は、下記非限定的例のような数学アルゴリズムを使用して達成され得る。
２ヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム(http://www.gcg.comで利用可能)を使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ.ＣＭＰマトリクスおよびギャップ荷重４０、５０、６０、７０または８０および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定され得る。２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性も、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれているE. MeyersおよびW. Miller(CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、決定され得る。さらに、２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定され得る。
ここに記載する核酸およびタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として使用して、例えば、関連配列を同定するために公的データベースに対するサーチを実施し得る。このようなサーチは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施して、ここに記載する核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチをＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、ワード長＝３で実施して、ここに記載するタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のとおり利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメータを使用し得る。www.ncbi.nlm.nih.gov参照。
核酸は全細胞、細胞ライセートまたは部分的に精製したもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動法および当分野で周知のその他を含む標準技法により他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞性核酸(例えば、染色体の他の部分)またはタンパク質から精製して離されたとき、「単離され」または「実質的に純粋にされ」ている。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。
核酸、例えば、ｃＤＮＡを、標準技法により変異させて、遺伝子配列を提供し得る。コード配列について、これらの変異は、アミノ酸配列に所望の影響を与え得る。特に、天然Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよびここに記載される他のこのような配列と実質的に相同であるまたはそれに由来するＤＮＡ配列が意図される(ここで、「由来」は、配列が他の配列と同一であるかまたは修飾されたことを示す)。
ここで使用する用語「ベクター」は、連結された他の核酸の輸送ができる核酸分子を意味することを意図する。一つのタイプのベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲートされ得る、環状二本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。他のタイプのベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るウイルスベクターである。あるベクターは、導入された宿主細胞で自己複製可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により、宿主細胞のゲノムに統合され、その結果、宿主ゲノムと共に複製され得る。さらに、あるベクターは、操作可能に結合した遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、ここでは「組み換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と称する。一般に、組み換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般に使用されるベクターの形態であるため、相互交換可能に使用され得る。しかしながら、またこれに含まれるのは、同等の機能を有する、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などの他の形態の発現ベクターである。
ここで使用する用語「組み換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)は、該細胞に天然に存在しない核酸を含む細胞を意味することを意図し、多くの場合組み換え発現ベクターが導入されている細胞である。このような用語は、当該対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味することが意図されていることが理解されるべきである。後代においては、変異または環境的影響による修飾が生じ得るため、このような子孫は、実際、親細胞と同一ではない可能性があるが、なおここで使用する用語「宿主細胞」の範囲内にある。
ここで使用する用語「抗原」は、タンパク質、ペプチドまたはハプテンなどのあらゆる天然または合成免疫原性物質をいう。抗原はα−シヌクレインまたはそのフラグメントであり得る。
ここで使用する用語「連結」は、２以上の分子の結合をいう。結合は共有結合でも非共有結合でもよい。結合はまた遺伝的(すなわち、組み換え的融合)であり得る。このような結合は、化学的結合および組み換えタンパク質産生などの多様な技術分野において認知されている技法を使用して達成し得る。
ここで使用する「投与する」は、当業者に知られる種々の方法および送達システムの何れかを使用する、対象への治療剤を含む組成物の物理的導入をいう。ここに記載する抗体のための好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語「非経腸投与」は、通常、経腸および局所投与以外の注射による投与方式を意味し、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴、ならびにインビボエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的などの非経腸ではない経路から投与し得る。投与はまた、例えば、１回、複数回および／または１回以上の長期にわたっても実施され得る。
ここで使用する用語「処置する」および「処置」は、疾患と関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候の進行、進展、重症化または再発の回復、軽減、好転、阻止または減速もしくは予防を目的として、対象に実施するあらゆる形態の介入もしくは操作または活性剤投与をいう。処置は、疾患を有する対象または疾患を有しない対象(例えば、予防のため)に対するものであり得る。
用語「有効量」または「有効投与量」は、所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義する。薬物または治療剤の「治療有効量」または「治療有効投与量」は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて使用したとき、疾患症状の重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛が原因の機能障害もしくは身体障害の予防により証明される、疾患退縮を促進する薬物の任意の量である。薬物の治療有効量または投与量は、疾患を発症するまたは疾患の再発のリスクにある対象に、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与したとき、疾患の進展または再発を阻止する薬物の任意の量であって、「予防有効量」または「予防有効投与量」を含む。治療剤が疾患を退縮させるまたは疾患の進展もしくは再発を阻止する能力は、ヒト対象で臨床治験中、ヒトにおける有効性の予想である動物モデル系でまたはインビトロアッセイにおける薬剤の活性のアッセイによるなど、熟練技術者に知られる多様な方法を使用して評価され得る。
ここで使用する用語「対象」は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、ここに記載する方法および組成物を、脳におけるレビー小体または凝集したα−シヌクレインの存在により特徴づけられる疾患を有する対象の処置に使用し得る。
用語「患者」は、予防または治療処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
個体は、対象が少なくとも一つの既知リスク因子(例えば、遺伝的、生化学的、家族歴、状況暴露)を有し、該リスク因子を有する該個体が、リスク因子を有しない個体より疾患を発症する統計学的に有意な大きなリスクにあるならば、疾患リスクが高い。
用語「症状」は、患者により認知される、異常歩行などの疾患の主観的証拠をいう。「徴候」は、医師により観察される疾患の客観的証拠をいう。
統計学的有意はｐ≦０.０５を意味する。
用語「サンプル」は、患者または対象から採った組織、体液または細胞(またはこれらの何れかの部分)をいう。通常、組織または細胞は患者から採取されるが、インビボ診断も考慮される。
ここで使用する用語「約」は、特定した値の±１０％をいう。
ここで使用する用語「および／または」は、関連する列記項目の１以上の任意かつ全ての組み合わせを含む。
本発明の記載および添付する特許請求の範囲で使用する、単数表現は、特にそうでないことが明確に指示されない限り、同様に複数表現を含むことを意図する。
本開示の種々の態様を次のサブセクションでさらに詳述する。
Ｉ. 抗α−シヌクレイン(αＳｙｎ)抗体
ここに記載するのは、特定の機能的特徴または性質により特徴づけられる抗体、例えば、単離抗体、例えば、完全ヒト単離抗体である。例えば、抗体は、ヒトα−シヌクレイン、すなわち、モノマーヒトα−シヌクレインおよびオリゴマーヒトα−シヌクレイン両者に特異的に結合する。さらに、抗体は、マウスまたはラットα−シヌクレインなどの１以上の非ヒト種からのα−シヌクレインまたはβ−シヌクレインおよびγ−シヌクレインなどのシヌクレインの種々のアイソフォームと交差反応する。
従って、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体次の機能的性質の１以上を示す：
(ａ)マウスおよびラットα−シヌクレインに結合する；
(ｂ)β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインに結合する；
(ｃ)α−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)にα−シヌクレインモノマーを超える大きな親和性を有する；
(ｄ)α−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)誘導可溶性または不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する；
(ｅ)ＰＦＦおよび／または脳にα−シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから可溶性または不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる；
(ｆ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２３〜１２８位の全てまたは一部に結合する；
(ｇ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２５〜１２８位の全てまたは一部に結合する；
(ｈ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３９位の全てまたは一部に結合する；
(ｉ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１１９〜１２６位の全てまたは一部に結合する；および
(ｊ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３８位の全てまたは一部に結合する。
ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーはＰＦＦである。ある実施態様において、ＰＦＦは実施例３に記載する方法を使用して調製される。ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは可溶性である。他の実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは不溶性である。ある実施態様において、抗体は不溶性または可溶性セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体の産生を阻害する。他の実施態様において、抗体はセリン−１２９リン酸化α−シヌクレインを含まない不溶性または可溶性α−シヌクレイン凝集体の産生を阻害する。
ある実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、α−シヌクレインモノマーよりα−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)に優先的に結合し、これは、ここでα−シヌクレインモノマー／α−シヌクレインオリゴマー結合比とも称するα−シヌクレインモノマーに対する結合親和性対α−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)に対する結合親和性比として表し得る。ＰＦＦがα−シヌクレインオリゴマー種であるとき、比はα−シヌクレインモノマー／ＰＦＦ結合比または「Ｍ／Ｐ比」と称し、実施例３に記載されるように決定され得る。
ある実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、７５以上、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、１０００以上、１５００以上、２０００以上、２５００以上、３０００以上、３５００以上、４０００以上、５０００以上、６０００以上、７０００以上、８０００以上、９０００以上、１００００以上、１０〜１００００、５０〜１００００、１００〜１００００、５００〜１００００、７００〜１００００、１５００〜１００００、３０００〜１００００、５０００〜１００００、７０００〜１００００、１００〜７０００、５００〜７０００、７００〜７０００、１５００〜７０００、３０００〜７０００、５０００〜７０００、１００〜５０００、５００〜５０００、７００〜５０００、７００〜１５００、７００〜３０００、７００〜５０００、１００〜３０００、５００〜３０００、７００〜３０００、１５００〜３０００、１００〜１５００、５００〜１５００、７００〜１５００、１００〜７００、５００〜７００または１００〜５００のＭ／Ｐ比を有する。ある実施態様において、モノマーおよびオリゴマーα−シヌクレインに対する抗体の結合親和性は、Ｍ／Ｐ比を計算するために、例えば、実施例３に記載の、ＥＬＩＳＡを使用して決定される。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、モノマーα−シヌクレインに１００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに２nM以下のＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、モノマーα−シヌクレインに５００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに１nM以下のＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、モノマーα−シヌクレインに５００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに０.５nM以下のＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、モノマーα−シヌクレインに５００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに０.３nM以下のＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、モノマーα−シヌクレインに５００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに０.２nM以下のＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、モノマーα−シヌクレインに７００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに１nM以下のＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、モノマーα−シヌクレインに７００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに０.５nM以下のＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、モノマーα−シヌクレインに７００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに０.３nM以下のＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、モノマーα−シヌクレインに７００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに０.２nM以下のＥＣ５０で結合する。ある実施態様において、オリゴマーおよびモノマーα−シヌクレインについてのＥＣ５０値は、例えば、実施例３に記載の、ＥＬＩＳＡを使用して決定する。
ある実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、オリゴマーα−シヌクレイン、例えば、ＰＦＦ(例えば、実施例３に記載のとおり調製したＰＦＦ)に、例えば、実施例３に記載の、ＥＬＩＳＡにより決定して、５０nM以下、４０nM以下、３０nM以下、２０nM以下、１０nM以下、５nM以下、４nM以下、３nM以下、２nM以下、１nM以下、０.９nM以下、０.８nM以下、０.７nM以下、０.６nM以下、０.５nM以下、０.４nM以下、０.３nM以下、０.２nM以下、０.１nM以下、０.０７nM以下、０.０５nM以下、０.０３nM以下または０.０１以下のＥＣ５０で結合する。
ある実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、ＰＦＦ誘導不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)産生を阻害し得る。従って、ある実施態様において、抗体は、ＰＦＦ誘導α−シヌクレインセリン−１２９リン酸化を、例えば、実施例１０に記載のハイコンテンツ免疫蛍光アッセイを使用して評価して、０.２nM以下、０.１５nM以下、０.１nM以下、０.０９nM以下、０.０８nM以下、０.０７nM以下、０.０６nM以下、０.０５nM以下、０.０４nM以下、０.０３nM以下、０.０２nM以下、０.０１nM以下または０.００５nM以下のＩＣ５０で阻害する。
ある実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、ＰＦＦおよび／または脳にレビー小体またはα−シヌクレイン凝集を有する患者から調製した脳ライセートのα−シヌクレインセリン−１２９リン酸化誘導活性を枯渇させ得る。
ある実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、α−シヌクレインのＣ末端領域のエピトープに結合し得る。例えば、抗α−シヌクレイン抗体は、例えば、抗体のヒトα−シヌクレインの重複ペプチドへの結合により決定して(実施例２参照)、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２３〜１２８の全てまたは一部に結合し得る。他の実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、例えば、抗体のヒトα−シヌクレインの重複ペプチドへの結合により決定して(実施例２参照)、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２５〜１２８の全てまたは一部に結合し得る。他の実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、例えば、抗体のヒトα−シヌクレインの重複ペプチドへの結合により決定して(実施例２参照)、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３９の全てまたは一部に結合し得る。他の実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、例えば、抗体のヒトα−シヌクレインの重複ペプチドへの結合により決定して(実施例２参照)、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１１９〜１２６の全てまたは一部に結合し得る。他の実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、例えば、抗体のヒトα−シヌクレインの重複ペプチドへの結合により決定して(実施例２参照)、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３８の全てまたは一部に結合し得る。
当分野で知られ、ここに記載する方法により決定して、上記機能的性質(例えば、生化学的、免疫化学的、細胞性、生理学的または他の生物学的活性など)の１以上を示す抗体は、抗体の非存在下(例えばまたは無関係の特異性の対照抗体が存在するとき)にみられるものと比較して、特定の活性の統計学的有意差に関係すると理解される。好ましくは、測定パラメータの抗α−シヌクレイン抗体誘導増加は、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％(すなわち２倍)、３倍、５倍または１０倍の増加である。逆に、測定パラメータの抗α−シヌクレイン抗体誘導減少は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の減少である。
例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡを含む、抗体のα−シヌクレイン(例えば、モノマーα−シヌクレインおよびオリゴマーα−シヌクレイン)への結合能を評価する標準アッセイは当分野で知られる。適切なアッセイは、実施例に詳述される。抗体の結合反応速度(例えば、結合親和性)も、Ｂｉａｃｏｒｅ分析などの当分野で知られる標準アッセイにより評価され得る。α−シヌクレインの機能的性質に対する抗体の効果を評価するアッセイは、下におよび実施例にさらに詳述される。
ある実施態様において、ここに記載するα−シヌクレイン抗体は、天然抗体ではなく、または天然に存在する抗体ではない。
II. 抗α−シヌクレイン(αＳｙｎ)抗体の例
特定のここに記載する抗体は、実施例１に記載のとおり単離され、構造的に特徴づけられた、抗体７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１(１１Ｈ１１−１および１１Ｈ１１−２)、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８(２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３)および１Ｅ８のＣＤＲおよび／または可変領域配列を有する抗体、例えば、モノクローナル抗体、ならびにそれらの可変領域またはＣＤＲ配列と少なくとも８０％同一性(例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一性)を有する抗体である。７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１(１１Ｈ１１−１および１１Ｈ１１−２)、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８および１Ｅ８のＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号８、１８、３１、４３、５３、６３、７３、８３、９９および１１３に示す。７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８のＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９、１９、３２、３３、４４、５４、６４、７４、８４、１００、１０１、１０２および１１４に示す。
従って、ここに提供されるのは、重鎖および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号８、１８、３１、４３、５３、６３、７３、８３、９９および１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその抗原結合部分である。
また提供されるのは、重鎖および軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域が配列番号９、１９、３２、３３、４４、５４、６４、７４、８４、１００、１０１、１０２および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離抗体または抗原結合部分である。
またここに提供されるのは、
(ａ)それぞれ配列番号８および９を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｂ)それぞれ配列番号１８および１９を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｃ)それぞれ配列番号３１および３２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｄ)それぞれ配列番号３１および３３を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｅ)それぞれ配列番号４３および４４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｆ)それぞれ配列番号５３および５４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｇ)それぞれ配列番号６３および６４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｈ)それぞれ配列番号７３および７４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｉ)それぞれ配列番号８３および８４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｊ)それぞれ配列番号９９および１００を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｋ)それぞれ配列番号９９および１０１を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；
(ｌ)それぞれ配列番号９９および１０２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列；または
(ｍ)それぞれ配列番号１１３および１１４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列
を含む単離抗体またはその抗原結合部分である。
抗α−シヌクレイン抗体は、７Ａ１０(および７Ａ１０とＶＨ ＣＤＲ１〜３およびＶＬ ＣＤＲ１〜３配列が共通する７Ａ１０−Ｔ９３Ａ)、１１Ｈ１１(１１Ｈ１１−１および１１Ｈ１１−２は、同じＶＨを共有するが、ＶＬは異なる)、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８(同じＶＨを共有するが、ＶＬは異なる２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３)および１Ｅ８またはこれらの組み合わせの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み得る。７Ａ１０(および７Ａ１０−Ｔ９３Ａ)、１１Ｈ１１、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８および１Ｅ８のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、２２、３７、４７、５７、６７、７７、８７および１０７に示す。７Ａ１０(および７Ａ１０−Ｔ９３Ａ)、１１Ｈ１１、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８および１Ｅ８のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３、２３、３８、４８、５８、６８、７８、８８および１０８に示す。７Ａ１０(および７Ａ１０−Ｔ９３Ａ)、１１Ｈ１１、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８および１Ｅ８のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、２４、３９、４９、５９、６９、７９、８９および１０９に示す。７Ａ１０(および７Ａ１０−Ｔ９３Ａ)、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５、２５、２８、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９３、９６および１１０に示す。７Ａ１０(および７Ａ１０−Ｔ９３Ａ)、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６、２６、２９、４１、５１、６１、７１、８１、９１、９４、９７および１１１に示す。７Ａ１０(および７Ａ１０−Ｔ９３Ａ)、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７、２７、３０、４２、５２、６２、７２、８２、９２、９５、９８および１１２に示す。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ式表記を使用して区画化される(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。
これらの抗体の各々がα−シヌクレインに結合し、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２および３領域により提供されることを考えると、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列は、他のここに記載する抗α−シヌクレイン結合分子を創製するために、「混合および適合」され得る(すなわち、異なる抗体からのＣＤＲを混合および適合させ得るが、各抗体はＶＨ ＣＤＲ１、２および３およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３を含まなければならない)。このような「混合および適合」された抗体のα−シヌクレイン結合を、上におよび実施例に記載する結合アッセイ(例えば、ＥＬＩＳＡ)を使用して試験し得る。好ましくは、ＶＨ ＣＤＲ配列が混合および適合されたとき、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換える。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列が混合および適合されるとき、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、好ましくは構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換える。１以上のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、モノクローナル抗体７Ａ１０(および７Ａ１０−Ｔ９３Ａ)、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８についてここに開示するＣＤＲ配列からの構造的に類似する配列で置き換えることにより、新規ＶＨおよびＶＬ配列を創製し得ることは、当業者には容易に明らかである。
従って、ここに提供されるのは、
(ａ)配列番号２、２２、３７、４７、５７、６７、７７、８７および１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｂ)配列番号３、２３、３８、４８、５８、６８、７８、８８および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
(ｃ)配列番号４、２４、３９、４９、５９、６９、７９、８９および１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
(ｄ)配列番号５、２５、２８、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９３、９６および１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
(ｅ)配列番号６、２６、２９、４１、５１、６１、７１、８１、９１、９４、９７および１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
(ｆ)配列番号７、２７、３０、４２、５２、６２、７２、８２、９２、９５、９８および１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、該抗体はヒトα−シヌクレインに特異的に結合する。
ある実施態様において、抗体は重鎖および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は：
(ａ)配列番号２〜４；
(ｂ)配列番号２２〜２４；
(ｃ)配列番号３７〜３９；
(ｄ)配列番号４７〜４９；
(ｅ)配列番号５７〜５９；
(ｆ)配列番号６７〜６９；
(ｇ)配列番号７７〜７９；
(ｈ)配列番号８７〜８９；または
(ｉ)配列番号１０７〜１０９
を含み、ここで、該抗体はヒトα−シヌクレインに特異的に結合する。
他の実施態様において、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は：
(ａ)配列番号５〜７；
(ｂ)配列番号２５〜２７；
(ｃ)配列番号２８〜３０；
(ｄ)配列番号４０〜４２；
(ｅ)配列番号５０〜５２；
(ｆ)配列番号６０〜６２；
(ｇ)配列番号７０〜７２；
(ｈ)配列番号８０〜８２；
(ｉ)配列番号９０〜９２；
(ｊ)配列番号９３〜９２
(ｋ)配列番号９６〜９８；または
(ｌ)配列番号１１０〜１１２
を含み、ここで、該抗体はヒトα−シヌクレインに特異的に結合する。
特定の実施態様において、抗体は重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで：
(ａ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２〜４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５〜７を含む；
(ｂ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２２〜２４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２５〜２７を含む；
(ｃ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２２〜２４を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２８〜３０を含む；
(ｄ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３７〜３９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４０〜４２を含む；
(ｅ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４７〜４９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５０〜５２を含む；
(ｆ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５７〜５９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６０〜６２を含む；
(ｇ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６７〜６９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号７０〜７２を含む；
(ｈ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号７７〜７９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８０〜８２を含む；
(ｉ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８７〜８９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９０〜９２を含む；
(ｊ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８７〜８９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９３〜９５を含む；
(ｋ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８７〜８９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９６〜９８を含む；または
(ｌ)重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１０７〜１０９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１１０〜１１２を含み、
ここで、該抗体はヒトα−シヌクレインに特異的に結合する。
ここに記載するＶＨドメインまたはそのＣＤＲの１以上を、重鎖、例えば、完全長重鎖を形成するために定常ドメインと連結させ得る。同様に、ここに記載するＶＬドメインまたはそのＣＤＲの１以上を、軽鎖、例えば、完全長軽鎖を形成するために定常ドメインと連結させ得る。完全長重鎖(無くてよいＣ末端リシン(Ｋ)を例外とするまたはＣ末端グリシンおよびリシン(ＧＫ)を例外とする)および完全長軽鎖を合わせて、完全長抗体を形成する。
ここに記載するＶＨドメインを、例えば、ここに記載のとおり天然に存在するまたは修飾されているヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常ドメインと融合させ得る。例えば、ＶＨドメインは、次のヒトＩｇＧ１アミノ酸配列に融合したここに記載するＶＨドメインの何れかのアミノ酸配列を含み得る：
ヒトＩｇＧ１定常ドメインは、アロタイプバリアントのものであり得る。例えば、ＩｇＧ１のアロタイプバリアントは、Ｒ１０７Ｋ、Ｅ１８９ＤおよびＭ１９１Ｌ(上で下線)を含む。完全長重領域内で、これらのアミノ酸置換はＲ２１４Ｋ、Ｅ３５６ＤおよびＭ３５８Ｌと番号付けされる。
ここに記載するＶＬドメインは、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖の定常ドメインと融合させ得る。例えば、ＶＬドメインは、次のヒトＩｇＧ１カッパ軽鎖アミノ酸配列に融合したここに記載するＶＬドメインの何れかのアミノ酸配列を含み得る：
ある実施態様において、重鎖定常領域は、Ｃ末端のリシンまたは他のアミノ酸を含む。ある実施態様において、重鎖定常領域は、Ｃ末端の１以上のアミノ酸を欠き、例えば、Ｃ末端配列ＬＳＰＧ(配列番号１２７)またはＬＳＰを有する。
ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体の重鎖および軽鎖例のアミノ酸配列を表２２に示す。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖は配列番号１０、２０、３４、４５、５５、６５、７５、８５、１０３および１１５に示すアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は重鎖および軽鎖を含み、ここで、軽鎖は配列番号１１、２１、３５、３６、４６、５６、６６、７６、８６、１０４、１０５、１０６および１１６に示すアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖および軽鎖は、
(ａ)１０および１１、
(ｂ)２０および２１、
(ｃ)３４および３５、
(ｄ)３４および３６、
(ｅ)４５および４６、
(ｆ)５５および５６、
(ｇ)６５および６６、
(ｈ)７５および７６、
(ｉ)８５および８６、
(ｊ)１０３および１０４、
(ｋ)１０３および１０５、
(ｌ)１０３および１０６および
(ｍ)１１５および１１６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
表２２に示す重鎖または軽鎖(またはそれらの可変領域)、例えば、配列番号１０、１１、２０、２１、３４、３５、３６、４５、４６、５５、５６、６５、６６、７５、７６、８５、８６、１０３、１０４、１０５、１０６、１１５および１１６の何れかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を使用して、所望の特性、例えば、ここにさらに記載するものを有する抗ヒトα−シヌクレイン抗体を形成し得る。例示的バリアントは、例えば、定常ドメインにアロタイプバリエーションおよび／または可変もしくは定常領域に変異、例えばここに開示する変異を含むものである。表２２に示す重鎖または軽鎖(またはそれらの可変領域)の何れかから最大１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２または１アミノ酸(置換、付加または欠失による)異なるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を使用して、所望の特性、例えば、ここにさらに記載するものを有する抗α−シヌクレイン抗体を形成し得る。
種々の実施態様において、上記抗体は、次の機能的性質の１以上を示す：
(ａ)マウスおよびラットα−シヌクレインに結合する；
(ｂ)β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインに結合する；
(ｃ)α−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)にα−シヌクレインモノマーを超える大きな親和性を有する；
(ｄ)α−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)誘導不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する；
(ｅ)ＰＦＦおよび／または脳にα−シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから可溶性または不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる；
(ｆ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２３〜１２８位の全てまたは一部に結合する；
(ｇ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２５〜１２８位の全てまたは一部に結合する；
(ｈ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３９位の全てまたは一部に結合する；
(ｉ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１１９〜１２６位の全てまたは一部に結合する；および
(ｊ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３８位の全てまたは一部に結合する。
ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーはＰＦＦである。ある実施態様において、ＰＦＦは実施例３に記載する方法を使用して調製される。ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは可溶性である。他の実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは不溶性である。
このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体を含む。
ある実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸残基１２３〜１２８に対応する、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)の配列の次の全てまたは一部：
EAYEMP(配列番号１２１)
に結合する。
他の実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸残基１２５〜１２８に対応する、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)の配列の次の全てまたは一部：
YEMP(配列番号１２２)
に結合する。
他の実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸残基１３０〜１３９に対応する、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)の配列の次の全てまたは一部：
EEGYQDYEPE(配列番号１２４)
に結合する。
他の実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸残基１１９〜１２６に対応する、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)の配列の次の全てまたは一部：
DPDNEAYE(配列番号１２５)
に結合する。
他の実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸残基１３０〜１３８に対応する、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)の配列の次の全てまたは一部：
EEGYQDYEP(配列番号１２３)
に結合する。
またここに提供されるのは、ここに記載するＣＤＲまたは可変領域、例えば、７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８の何れかのものを含む抗α−シヌクレイン抗体とα−シヌクレインへの結合について競合する抗α−シヌクレイン抗体である。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８の何れかのヒトα−シヌクレイン(例えば、モノマーα−シヌクレインまたはオリゴマーα−シヌクレイン)への結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。競合する抗体は、当分野で知られる標準結合アッセイ(例えば、競合的ＥＬＩＳＡアッセイ)を使用して、α−シヌクレインへの結合を競合的に阻害する能力に基づき、同定され得る。
またここに提供されるのは、ここに記載するＣＤＲまたは可変領域、例えば、７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８の何れかを含む抗α−シヌクレイン抗体とα−シヌクレイン上の同一エピトープに結合する抗α−シヌクレイン抗体である。抗体がここに記載する抗体とα−シヌクレイン上の同一エピトープに結合するかを決定する方法は、例えば、エピトープマッピング方法、抗原配列内のアミノ酸残基修飾による結合の喪失が、エピトープ成分の指標であると考えられる抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異種への結合のモニタリング(例えば、アラニンスキャニング)；ＭＳベースのタンパク質フットプリンティングおよび目的の抗体がコンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的短ペプチド(天然三次元形態または変性形態何れか)を親和性単離する能力の評価を含む。
ここに開示する抗体は、全ての既知形態の抗体および抗体様性質を有する他のタンパク質スキャフォールドを含む。例えば、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二特異性抗体、免疫複合体、キメラ抗体またはフィブロネクチンもしくはアンキリンリピートなどの抗体様性質を有するタンパク質スキャフォールドであり得る。抗体はまたＦａｂ、Ｆａｂ’２、ｓｃＦｖ、アフィボディ(登録商標)、アビマー、ナノボディまたはドメイン抗体でもあり得る。抗体は、次のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤおよびＩｇＥのアイソタイプの何れかを含む、任意のアイソタイプでもあり得る。ＩｇＧ抗体が好ましい。完全長抗体は、標準組み換えＤＮＡ技法および可変領域配列に操作可能に結合させる所望の定常領域配列をコードする核酸を使用して、ＶＨおよびＶＬ配列から調製され得る。
III. 特定の生殖系列配列を有する抗体
ある実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。
ここで使用するヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られるならば、特定の生殖系列配列「の産物である」または「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。このような系は、目的の抗原でヒト免疫グロブリン遺伝子を担持する遺伝子導入マウスを免疫化するまたは目的の抗原についてファージ上にディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物である」または「に由来する」ヒト抗体を、ヒト抗体のアミノ酸配列とヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較し、ヒト抗体の配列と配列が最も近いヒト生殖系列免疫グロブリン配列(すなわち、最大％同一性)を選択することにより、同定し得る。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物である」または「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞変異または部位特異的変異の意図的導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸差異を含み得る。しかしながら、選択したヒト抗体は、一般にヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較して、ヒト抗体をヒトとして特定させるアミノ酸残基を含む。ある場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。一般に、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と１０を超えないアミノ酸差異を示す。ある場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と５を超えないまたはさらに４、３、２または１を超えないアミノ酸差異を示し得る。
IV. 相同抗体
ここに包含されるのは、ここに記載する好ましい抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する抗α−シヌクレイン抗体であり、ここで、抗体は、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体の所望の機能的性質を保持する。
例えば、単離抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み得て、ここで：
(ａ)重鎖可変領域は、配列番号８、１８、３１、４３、５３、６３、７３、８３、９９および１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるまたは配列番号８、１８、３１、４３、５３、６３、７３、８３、９９および１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４、１−５、１−１０、１−１５、１−２０、１−２５または１−５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む；
(ｂ)軽鎖可変領域は、配列番号９、１９、３２、３３、４４、５４、６４、７４、８４、１００、１０１、１０２および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるまたは配列番号９、１９、３２、３３、４４、５４、６４、７４、８４、１００、１０１、１０２および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４、１−５、１−１０、１−１５、１−２０、１−２５または１−５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む；
(ｃ)抗体はα−シヌクレインに特異的に結合するおよび
(ｄ)抗体は次の機能的性質の１以上を示す：
(１)マウスおよびラットα−シヌクレインに結合する；
(２)β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインに結合する；
(３)α−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)にα−シヌクレインモノマーを超える大きな親和性を有する；
(４)α−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)誘導不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する；
(５)ＰＦＦおよび／または脳にα−シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる；
(６)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１２３〜１２８位(配列番号１２１)の全てまたは一部に結合する；
(７)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１２５〜１２８位(配列番号１２２)の全てまたは一部に結合する；
(８)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１３０〜１３９(配列番号１２４)の全てまたは一部に結合する；
(９)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１１９〜１２６(配列番号１２５)の全てまたは一部に結合する；および
(１０)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１３０〜１３８(配列番号１２３)の全てまたは一部に結合する。
ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーはＰＦＦである。ある実施態様において、ＰＦＦは実施例３に記載する方法を使用して調製される。ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは可溶性である。他の実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは不溶性である。
ある実施態様において、提供されるのは、
(ａ)配列番号８および９；
(ｂ)配列番号１８および１９；
(ｃ)配列番号３１および３２；
(ｄ)配列番号３１および３３；
(ｅ)配列番号４３および４４；
(ｆ)配列番号５３および５４；
(ｇ)配列番号６３および６４；
(ｈ)配列番号７３および７４；
(ｉ)配列番号８３および８４；
(ｊ)配列番号９９および１００；
(ｋ)配列番号９９および１０１；
(ｌ)配列番号９９および１０２；および
(ｍ)配列番号１１３および１１４
からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、該抗体はα−シヌクレインに結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号８および９に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であり、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号１８および１９に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であり、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号３１および３２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であって、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号３１および３３に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であって、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号４３および４４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であって、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号４１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号５３および５４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であって、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号４７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号４８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号５０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号５１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号６３および６４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であって、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号５７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号６１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号７３および７４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であって、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号６７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号６８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号６９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号７０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号７１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号７２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号８３および８４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であって、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号７７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号７８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号７９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号８０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号８１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号８２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号９９および１００に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であり、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号８７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号８８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号８９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号９１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号９９および１０１に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であり、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号８７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号８８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号８９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号９４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号９５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号９９および１０２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であり、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号８７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号８８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号８９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号９６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号９７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号９８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、提供されるのは、それぞれ配列番号１１３および１１４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体(例えば、単離モノクローナル抗体)であり、ここで：
抗体の重鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
抗体の軽鎖可変領域は次のＣＤＲを含み：
ｉ. 配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
ii. 配列番号１１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
iii.配列番号１１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；そして
ここで、抗体はヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する。
ある実施態様において、抗体はヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。
ある実施態様において、単離抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は重鎖および軽鎖を含んでよく、ここで：
(ａ)重鎖は、配列番号１０、２０、３４、４５、５５、６５、７５、８５、１０３および１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかまたは配列番号１０、２０、３４、４５、５５、６５、７５、８５、１０３および１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４、１−５、１−１０、１−１５、１−２０、１−２５または１−５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含み(但し、ある実施態様において、配列がエフェクターレス重鎖のものであるならば、重鎖をエフェクターレスとする変異は修飾されないアミノ酸配列を含む)；
(ｂ)軽鎖は、配列番号１１、２１、３５、３６、４６、５６、６６、７６、８６、１０４、１０５、１０６および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかまたは配列番号１１、２１、３５、３６、４６、５６、６６、７６、８６、１０４、１０５、１０６および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４、１−５、１−１０、１−１５、１−２０、１−２５または１−５０アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含み；
(ｃ)抗体はα−シヌクレインに特異的に結合する、そして
(ｄ)抗体は次の機能的性質の１以上を示す：
(１)マウスおよびラットα−シヌクレインに結合する；
(２)β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインに結合する；
(３)α−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)にα−シヌクレインモノマーを超える大きな親和性を有する；
(４)α−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)誘導不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する；
(５)ＰＦＦおよび／または脳にα−シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる；
(６)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１２３〜１２８位(配列番号１２１)の全てまたは一部に結合する；
(７)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１２５〜１２８位(配列番号１２２)の全てまたは一部に結合する；
(８)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１３０〜１３９(配列番号１２４)の全てまたは一部に結合する；
(９)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１１９〜１２６(配列番号１２５)の全てまたは一部に結合する；および
(１０)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１３０〜１３８(配列番号１２３)の全てまたは一部に結合する。
ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーはＰＦＦである。ある実施態様において、ＰＦＦは実施例３に記載する方法を使用して調製される。ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは可溶性である。他の実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは不溶性である。
ある実施態様において、提供されるのは、
(ａ)配列番号１０および１１、
(ｂ)配列番号２０および２１、
(ｃ)配列番号３４および３５、
(ｄ)配列番号３４および３６、
(ｅ)配列番号４５および４６、
(ｆ)配列番号５５および５６、
(ｇ)配列番号６５および６６、
(ｈ)配列番号７５および７６、
(ｉ)配列番号８５および８６、
(ｊ)配列番号１０３および１０４、
(ｋ)配列番号１０３および１０５、
(ｌ)配列番号１０３および１０６および
(ｍ)配列番号１１５および１１６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖配列を含む抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、該抗体はα−シヌクレインに結合する。
また提供されるのは、７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および／または１Ｅ８の対応するＣＤＲと１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４または１−５アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)で異なるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ３を含む、抗α−シヌクレイン抗体である。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および／または１Ｅ８の対応する配列に比してＣＤＲの１、２、３、４、５または６の各々に１−５アミノ酸変化を含む。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および／または１Ｅ８のＣＤＲに比して、全ＣＤＲにわたり、計１−５アミノ酸変化を含む。これらの改変抗体を、ここにおよび実施例に記載するインビトロおよびインビボアッセイを使用して試験し、それらが上記機能的性質の１以上を保持しているか否かを決定し得る。
７Ａ１０、１１Ｈ１１(１１Ｈ１１−１および１１Ｈ１１−２)、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８(２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２および２３Ｈ８−３)および／または１Ｅ８、例えば、それぞれ配列番号８、１８、３１、４３、５３、６３、７３、８３、９９および１１３および配列番号９、１９、３２、３３、４４、５４、６４、７４、８４、１００、１０１、１０２および１１４のＶＨおよびＶＬ領域またはそれぞれ配列番号１０、２０、３４、４５、５５、６５、７５、８５、１０３および１１５および配列番号１１、２１、３５、３６、４６、５６、６６、７６、８６、１０４、１０５、１０６および１１６の重鎖および軽鎖またはＣＤＲと相同性がある配列を有する抗体を、該アミノ酸配列をコードする核酸分子の変異誘導(例えば、部位特異的またはＰＣＲ介在変異誘導)により得ることができ、その後、該コード化改変抗体をここに記載する機能的アッセイを使用して保持機能について試験する。
Ｖ. 保存的修飾を有する抗体
抗α−シヌクレイン抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み得て、ここで、これらＣＤＲ配列の１以上は、ここに記載する好ましい抗体またはその保存的修飾体に基づく特定したアミノ酸配列を含み、ここで、該抗体は、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体の所望の機能的性質を保持する。従って、単離抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み得て、ここで、
(ａ)重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号４、２４、３９、４９、５９、６９、７９、８９および１０９ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４または１−５保存的アミノ酸置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
(ｂ)軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号７、２７、３０、４２、５２、６２、７２、８２、９２、９５、９８および１０２ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４または１−５保存的アミノ酸置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
(ｃ)抗体はα−シヌクレインに特異的に結合するおよび
(ｄ)抗体は次の機能的性質の１以上を示す：
(１)マウスおよびラットα−シヌクレインに結合する；
(２)β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインに結合する；
(３)α−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)にα−シヌクレインモノマーを超える大きな親和性を有する；
(４)α−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)誘導不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する；
(５)ＰＦＦおよび／または脳にα−シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる；
(６)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１２３〜１２８位(配列番号１２１)の全てまたは一部に結合する；
(７)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１２５〜１２８位(配列番号１２２)の全てまたは一部に結合する；
(８)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１３０〜１３９(配列番号１２４)の全てまたは一部に結合する；
(９)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１１９〜１２６(配列番号１２５)の全てまたは一部に結合する；および
(１０)ヒトα−シヌクレインのアミノ酸１３０〜１３８(配列番号１２３)の全てまたは一部に結合する。
ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーはＰＦＦである。ある実施態様において、ＰＦＦは実施例３に記載する方法を使用して調製される。ある実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは可溶性である。他の実施態様において、α−シヌクレインオリゴマーは不溶性である。
好ましい実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号３、２３、３８、４８、５８、６８、７８、８８および１０８ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４または１−５保存的アミノ酸置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号６、２６、２９、４１、５１、６１、７１、８１、９１、９４、９７および１１１ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４または１−５保存的アミノ酸置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の好ましい実施態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号２、２２、３７、４７、５７、６７、７７、８７および１０７ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４または１−５保存的アミノ酸置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号５、２５、２８、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９３、９６および１１０ならびにその保存的修飾体、例えば、１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４または１−５保存的アミノ酸置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
種々の実施態様において、抗体は上記機能的性質の１以上を示し得る。このような抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
保存的アミノ酸置換は、抗体のＣＤＲ以外の部分にまたはＣＤＲに加えて他の部分にもなし得る。例えば、保存的アミノ酸修飾は、フレームワーク領域またはＦｃ領域になし得る。可変領域または重鎖または軽鎖は、ここに提供する抗α−シヌクレイン抗体配列に比して、１、２、３、４、５、１−２、１−３、１−４、１−５、１−１０、１−１５、１−２０、１−２５または１−５０保存的アミノ酸置換を含み得る。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、保存的アミノ酸修飾と非保存的アミノ酸修飾の組み合わせを含み得る。
VI. 設計および修飾された抗体
ＶＨおよびＶＬ領域
また提供されるのは、修飾抗体を設計するために、出発物質としてここに開示するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１以上を有する抗体を使用して製造できる設計および修飾された抗体であり、該修飾抗体は、出発抗体から改変された性質を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域内(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)、例えば１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上の残基の修飾により設計され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を変えるために、定常領域内の残基を修飾することにより設計され得る。
実施し得る可変領域設計の一つのタイプは、ＣＤＲ移植である。抗体は、主に６個の重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも、個々の抗体間で多様性に富む。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用を担うため、異なる性質を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された、特定の天然に存在する抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターの構築により特定の天然に存在する抗体の性質を模倣する組み換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033；Winterの米国特許５,２２５,５３９ならびにQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。
従って、ここに記載する他の実施態様は、それぞれ配列番号２、２２、３７、４７、５７、６７、７７、８７および１０７；配列番号３、２３、３８、４８、５８、６８、７８、８８および１０８；および配列番号４、２４、３９、４９、５９、６９、７９、８９および１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにそれぞれ配列番号５、２５、２８、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９３、９６および１１０；配列番号６、２６、２９、４１、５１、６１、７１、８１、９１、９４、９７および１１１；および配列番号７、２７、３０、４２、５２、６２、７２、８２、９２、９５、９８および１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。それ故に、このような抗体は、モノクローナル抗体７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含み、なおこれらの抗体と異なるフレームワーク配列を含み得る。
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースまたは公開された引用文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のための生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース(インターネットでwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用可能)およびKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836に見ることができ；この各々の内容を明示的に引用により本明細書に包含させる。
ここに記載される抗体で使用するために好ましいフレームワーク配列は、ここに記載する抗体により使用されるフレームワーク配列に構造的に類似するものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見られるのと同一配列を有するフレームワーク領域に移植できまたはＣＤＲ配列を、該生殖系列配列と比較して１以上の変異を含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、いくつかの例において、抗体の抗原結合能を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を変異させるのが有益であることが判明している(例えば、Queen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。
ここに記載する設計された抗体は、例えば、抗体の性質を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾がなされているものを含む。一般にこのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低減するためになされる。例えば、一つの試みは、１以上のフレームワーク残基の対応する生殖系列配列への「復帰変異」である。より具体的に、体細胞変異を受けている抗体は、該抗体が由来する生殖系列配列からのものと異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、該抗体が由来する生殖系列配列と比較することにより同定し得る。フレームワーク領域配列をその生殖系列配置に戻すために、体細胞変異を、例えば、部位特異的変異誘導またはＰＣＲ介在変異誘導により、生殖系列配列に「復帰変異」させ得る。このような「復帰変異」抗体も包含されることが意図される。
他のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の免疫原性の可能性を減じるための、フレームワーク領域または１以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基の変異を含む。この試みは、「脱免疫化」とも称され、Carr et al.の米国特許公開２００３０１５３０４３にさらに詳述される。
他のタイプの可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基の変異であり、それにより目的の抗体の１以上の結合性質(例えば、親和性)を改善させる。部位特異的変異誘導またはＰＣＲ介在変異誘導を変異導入のために実施でき、抗体結合または興味ある他の機能的性質に対する影響を、ここに記載し、実施例に提供するインビトロまたはインビボアッセイにより評価し得る。好ましくは保存的修飾(上記のとおり)が導入される。変異はアミノ酸置換、付加または欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、一般にＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５を超えない残基が改変される。
従って、また提供されるのは、(ａ)配列番号２、２２、３７、４７、５７、６７、７７、８７および１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２、２２、３７、４７、５７、６７、７７、８７および１０７と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１領域；(ｂ)配列番号３、２３、３８、４８、５８、６８、７８、８８および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号３、２３、３８、４８、５８、６８、７８、８８および１０８と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２領域；(ｃ)配列番号４、２４、３９、４９、５９、６９、７９、８９および１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号４、２４、３９、４９、５９、６９、７９、８９および１０９と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３領域；(ｄ)配列番号５、２５、２８、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９３、９６および１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号５、２５、２８、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９３、９６および１１０と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１領域；(ｅ)配列番号６、２６、２９、４１、５１、６１、７１、８１、９１、９４、９７および１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６、２６、２９、４１、５１、６１、７１、８１、９１、９４、９７および１１１と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２領域；および(ｆ)配列番号７、２７、３０、４２、５２、６２、７２、８２、９２、９５、９８および１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号７、２７、３０、４２、５２、６２、７２、８２、９２、９５、９８および１０２と比較して、１、２、３、４または５アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変領域を含む単離抗α−シヌクレインモノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
抗体のＣＤＲにおけるメチオニン残基は酸化されていてよく、抗体の潜在的化学分解および結果としての結果としての効力減少をもたらす。従って、また提供されるのは、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲにおける１以上のメチオニン残基が酸化的分解を受けないアミノ酸残基で置換されている、抗α−シヌクレイン抗体である。
同様に、脱アミド化部位を抗α−シヌクレイン抗体から、特にＣＤＲから除去し得る。
Ｆｃおよび修飾Ｆｃ
ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ(これは、任意のアロタイプまたはイソアロタイプ、例えば、ＩｇＧ１について：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１(ａ)、Ｇ１ｍ２(ｘ)、Ｇ１ｍ３(ｆ)、Ｇ１ｍ１７(ｚ)；ＩｇＧ２について：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３(ｎ)；ＩｇＧ３について：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１(ｇ１)、Ｇ３ｍ２８(ｇ５)、Ｇ３ｍ１１(ｂ０)、Ｇ３ｍ５(ｂ１)、Ｇ３ｍ１３(ｂ３)、Ｇ３ｍ１４(ｂ４)、Ｇ３ｍ１０(ｂ５)、Ｇ３ｍ１５(ｓ)、Ｇ３ｍ１６(ｔ)、Ｇ３ｍ６(ｃ３)、Ｇ３ｍ２４(ｃ５)、Ｇ３ｍ２６(ｕ)、Ｇ３ｍ２７(ｖ)；およびＫについて：Ｋｍ、Ｋｍ１、Ｋｍ２、Ｋｍ３であり得る)と連結(例えば、共有結合的連結または融合)させてよい(例えば、Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、ＦｃＲ結合がないまたは低減された、例えば、活性化ＦｃＲへの結合が低減されたＦｃ受容体を有する。
ある実施態様において、ここに記載される抗α−シヌクレイン抗体可変領域は、エフェクターレスまたは大部分エフェクターレスＦｃ、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４に連結される。
一般に、ここに記載する可変領域は、一般に、血清半減期、補体固定化、Ｆｃ受容体結合および／または抗体依存性細胞傷害などの抗体の機能的性質の１以上を改変するために、１以上の修飾を含むＦｃに連結され得る。さらに、ここに記載する抗体は、抗体の機能的性質の１以上を改変するために、化学的修飾され得るか(例えば、１以上の化学部分が抗体に結合され得る)またはそのグリコシル化を変えるために修飾され得る。これらの実施態様の各々を、下にさらに詳述する。Ｆｃ領域の残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ方式のＥＵ表記である。
Ｆｃ領域は、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの定常領域(定常領域のフラグメント、アナログ、バリアント、変異体または誘導体を含む)に由来するドメインを含む。適当な免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭなどの他のクラスを含む。免疫グロブリンの定常領域は、免疫グロブリンＣ末端領域に相同な天然に存在するまたは合成的に産生されたポリペプチドとして定義され、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ４ドメインを、別々にまたは組み合わせて含み得る。
免疫グロブリンの定常領域は、Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)結合および補体固定化を含む多くの重要な抗体機能を担う。重鎖定常領域の５つの主要なクラスがあり、各々アイソタイプにより指定される特徴的エフェクター機能を有するＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭと分類される。例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４として知られる４サブクラスに分かれる。
Ｉｇ分子は、複数クラスの細胞性受容体と相互作用する。例えばＩｇＧ分子は、ＩｇＧクラスの抗体に特異的な３クラスのＦｃγ受容体(ＦｃγＲ)、すなわちＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIと相互作用する。ＩｇＧのＦｃγＲ受容体への結合に重要な配列は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに位置すると報告されている。抗体の血清半減期は、その抗体がＦｃ受容体(ＦｃＲ)に結合する能力により影響される。
ある実施態様において、Ｆｃ領域は、望ましい構造的特徴および／または生物学的活性を提供するために、バリアントＦｃ領域、例えば、親Ｆｃ配列(例えば、その後修飾されてバリアントを産生する非修飾Ｆｃポリペプチド)に比して修飾(例えば、ｂｙアミノ酸置換、欠失および／または挿入)されているＦｃ配列である。
例えば、親Ｆｃに比して、(ａ)抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)が減少している、(ｂ)補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)が減少している、(ｃ)Ｃ１ｑに対する親和性が減少しているおよび／または(ｄ)Ｆｃ受容体に対する親和性が減少しているＦｃバリアントを産生するために、Ｆｃ領域に修飾をなし得る。このようなＦｃ領域バリアントは、一般にＦｃ領域に少なくとも１個のアミノ酸修飾を含み得る。アミノ酸修飾の組み合わせは、特に望ましいと考えられ得る。例えば、バリアントＦｃ領域は、例えばここに記載する特定のＦｃ領域位置に、その中に２、３、４、５個などの置換を含み得る。
バリアントＦｃ領域は、ジスルフィド結合形成に関与するアミノ酸が除去されるかまたは他のアミノ酸で置き換えられる、配列変更も含み得る。このような除去は、ここに記載する抗体の産生に使用する宿主細胞に存在する、他のシステイン含有タンパク質との反応を回避させ得る。システイン残基が除去されたときでさえ、一本鎖Ｆｃドメインは、非共有結合的に結合される二量体Ｆｃドメインをなお形成できる。他の実施態様において、Ｆｃ領域は、選択した宿主細胞とより適合性とするために、修飾され得る。例えば、プロリンイミノペプチダーゼなどの大腸菌の消化酵素により認識され得る、典型的天然Ｆｃ領域のＮ末端近くのＰＡ配列を除去し得る。他の実施態様において、Ｆｃドメイン内の１以上のグリコシル化部位が除去され得る。一般にグリコシル化される残基(例えば、アスパラギン)は、細胞溶解性応答を与え得る。このような残基を欠失させるかまたは非グリコシル化残基(例えば、アラニン)で置換し得る。他の実施態様において、Ｃ１ｑ結合部位などの補体との相互作用に関連する部位をＦｃ領域から除去し得る。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させるかまたは置換し得る。ある実施態様において、Ｆｃ受容体への結合、好ましくはサルベージ受容体結合部位以外の部位に影響する部位を除去できる。他の実施態様において、Ｆｃ領域を修飾して、ＡＤＣＣ部位を除去し得る。ＡＤＣＣ部位は当分野で知られる；例えば、ＩｇＧ１におけるＡＤＣＣ部位に関してMolec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)参照。バリアントＦｃドメインの具体例は、例えば、ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８に開示される。
ある実施態様において、Ｆｃのヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基数が改変されるように、例えば、増加または減少されるように、修飾される。この試みは、Bodmer et al.の米国特許５,６７７,４２５にさらに記載される。Ｆｃのヒンジ領域のシステイン残基数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合の促進または抗体の安定性の増加または低減のために、改変される。ある実施態様において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期の減少のために変異される。より具体的に、抗体が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐ結合に比して障害されたブドウ球菌プロテインＡ(ＳｐＡ)結合を有するように、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に１以上のアミノ酸変異を導入し得る。この試みは、Ward et al.の米国特許６,１６５,７４５にさらに詳述される。
さらに他の実施態様において、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を改変するために少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることにより、改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１以上のアミノ酸を、抗体のエフェクターリガンドへの親和性が改変されるが、親抗体の抗原結合能が保持されるように、異なるアミノ酸残基で置き換え得る。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。この試みは、両方ともWinter et al.の米国特許５,６２４,８２１および５,６４８,２６０にさらに詳述される。
他の例において、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１以上のアミノ酸を、抗体のＣ１ｑ結合が改変されるおよび／または補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)が低減または消失するように、異なるアミノ酸残基で置き換え得る。この試みは、Idusogie et al.の米国特許６,１９４,５５１にさらに詳述される。
他の例において、アミノ酸２３１〜２３９位内の１以上のアミノ酸残基が改変され、それにより抗体が補体を固定する能力が改変される。この試みは、Bodmer et al.のＰＣＴ公報ＷＯ９４／２９３５１にさらに詳述される。
Ｆｃになし得る他のＦｃ修飾は、ＦｃγＲおよび／または補体タンパク質への結合を低減または消失させ、それにより、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣなどのＦｃ介在エフェクター機能を低減または消失させるためのものである。例示的修飾は、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２６７位、２６９位、３２５位および３２８位の置換、挿入および欠失を含むが、これらに限定されず、ここで、ナンバリングはＥＵ表記に従う。例示的置換は、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌおよび３２８Ｒを含むが、これらに限定されず、ここで、ナンバリングはＥＵ表記に従う。Ｆｃバリアントは２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を減少させるための他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖ、ならびに変異的または酵素的手段またはタンパク質をグリコシル化しない細菌などの生物における産生による２９７位のグリコシル化の除去を含む。これらおよび他の修飾は、Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691にレビューされる。
所望により、Ｆｃ領域は、当業者に知られる付加および／または代替位置に天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る(例えば、米国特許５,６２４,８２１；６,２７７,３７５；６,７３７,０５６；６,１９４,５５１；７,３１７,０９１；８,１０１,７２０；ＰＣＴ特許公報ＷＯ００／４２０７２；ＷＯ０１／５８９５７；ＷＯ０２／０６９１９；ＷＯ０４／０１６７５０；ＷＯ０４／０２９２０７；ＷＯ０４／０３５７５２；ＷＯ０４／０７４４５５；ＷＯ０４／０９９２４９；ＷＯ０４／０６３３５１；ＷＯ０５／０７０９６３；ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５およびＷＯ０６／０２０１１４参照)。
Ｆｃ領域のそのリガンドに対する親和性および結合性は、平衡方法(例えば、酵素結合免疫吸着法(ＥＬＩＳＡ)またはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ))または動力学的方法(例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析)ならびに間接結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)などの他の方法を含むが、これらに限定されない、多様なインビトロアッセイ方法(生化学または免疫学ベースのアッセイ)により決定し得る。これらおよび他の方法は、試験する成分の１以上における標識を使用するおよび／または発色、蛍光、発光または同位体標識を含むが、これらに限定されない多様な検出方法を用いることができる。結合親和性および動力学の詳細な記載は、抗体−免疫原相互作用に焦点をあてたPaul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見ることができる。
ある実施態様において、抗体を、その生物学的半減期を延長するために修飾し得る。種々の試みが可能である。例えば、これは、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合親和性の増加によりなし得る。例えば、米国特許６,２７７,３７５に記載のとおり、次の残基の１以上を変異させ得る：２５２、２５４、２５６、４３３、４３５、４３６。具体的な例示的置換は、次の１以上を含む：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓおよび／またはＴ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を延長させるために、抗体を、Presta et al.の米国特許５,８６９,０４６および６,１２１,０２２に記載のとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２個のループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内を改変させ得る。ＦｃＲｎへの結合を増加させるおよび／または薬物動態性質を改善する他の例示的バリアントは、例えば２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍを含む、２５９位、３０８位、４２８位および４３４位での置換を含む。ＦｃＲｎへのＦｃ結合を増加させる他のバリアントは：２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ(Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604)、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ(Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)を含む。ＦｃＲｎ結合調節のための他の修飾は、Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671に記載される。ある実施態様において、特定の生物学的特性を有するハイブリッドＩｇＧアイソタイプが使用され得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ１位置を、２アイソタイプが異なる場所である位置でＩｇＧ３からのアミノ酸で置換することにより構築し得る。それ故に、１以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２１、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。ここに記載する他の実施態様において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ２位置を、２アイソタイプが異なる場所である位置でＩｇＧ１からのアミノ酸で置換することにより構築し得る。それ故に、１以上の置換、例えば、次のアミノ酸置換の１以上：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ(２３６位へのグリシン挿入をいう)および３２７Ａを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。
ある実施態様において、ＦｃγＲへの結合が低減したＦｃを選択する。ＦｃγＲ結合が低減した例示的Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃは、次の３アミノ酸置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含む。この三重変異体ＩｇＧ１ Ｆｃをここでは「ＩｇＧ１.３ｆ」と称する。
ある実施態様において、補体固定化が低減したＦｃを選択する。補体固定化が低減した例示的Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃは、次の２アミノ酸置換：Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む。
ある実施態様において、本質的にエフェクター機能がない、すなわち、ＦｃγＲが低減したおよび補体固定化が低減したＦｃを選択する。エフェクターレスである例示的Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃは、次の５変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む。
ＩｇＧ４定常ドメインを使用するとき、置換Ｓ２２８Ｐを含むのが通常好ましく、これはＩｇＧ１のヒンジ配列を模倣し、それによりＩｇＧ４分子を安定化させる。
さらに他の実施態様において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が製造され得る(すなわち、抗体はグリコシル化を欠く)。グリコシル化は、例えば、抗体の抗原への親和性増加のために、改変され得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１以上のグリコシル化部位の改変により達成され得る。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それによりその部位でのグリコシル化を除去する、１以上のアミノ酸置換をなし得る。このような非グリコシル化は、抗体の抗原への親和性を増加させ得る。このような試みは、Co et al.の米国特許５,７１４,３５０および６,３５０,８６１にさらに詳述される。
定常領域のＮ２９７のグリコシル化を、Ｎ２９７残基を他の残基、例えば、Ｎ２９７Ａに変異させるおよび／または隣接アミノ酸、例えば、２９８を変異させ、それによりＮ２９７のグリコシル化を低減させることにより阻止し得る。
これに加えてまたはこれとは別に、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体またはバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などのグリコシル化タイプが改変された抗体を製造し得る。このような改変グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが示されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞での抗体の発現により達成され得る。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は文献に記載されており、ここに記載する組み換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が改変された抗体を産生する、宿主細胞として使用され得る。例えば、Hanai et al. のＥＰ１,１７６,１９５は、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子(これはフコシルトランスフェラーゼをコードする)を有する細胞株で発現される抗体が低フコシル化を示すような、細胞株を記載する。PrestaのＰＣＴＷＯ０３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ(２９７)結合炭水化物に結合させる能力が減少したバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞を記載し、同様にその宿主細胞で発現された抗体の低フコシル化をもたらす(Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと)。Umana et al. によるＰＣＴＷＯ９９／５４３４２は、設計細胞株で発現された抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性をもたらすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、ベータ(１,４)−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII))を発現するよう設計された細胞株を記載する(Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照のこと)。
ここに記載する抗体の他の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期延長のためにペグ化し得る。抗体ペグ化のために、抗体またはそのフラグメントを、一般にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントに結合するようになる条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子(または類似の反応性水可溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により行う。ここで使用する用語「ポリエチレングリコール」は、モノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質の誘導体化に使用されている、ＰＥＧの形態の何れも含むことを意図する。ある実施態様において、ペグ化する抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当分野で知られ、ここに記載する抗体に適用し得る。例えば、Nishimura et al. のＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.のＥＰ０４０１３８４参照。
VII. 核酸分子
ここに記載する他の態様は、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞ライセートまたは部分的に精製されたまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動法および当分野で周知のその他を含む標準技法により、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞性核酸(例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、本来単離ＤＮＡに連結している染色体ＤＮＡ)またはタンパク質から精製して分離されたとき、単離されまたは実質的に純粋にされる。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。ここに記載する核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、イントロン配列を含んでも、含まなくてもよい。ある実施態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
ここに記載する核酸は、標準分子生物学技法を使用して得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、さらに下に記載するとおり、ヒト免疫グロブリン遺伝子担持遺伝子導入マウスから調製されたハイブリドーマ)により発現される抗体について、該ハイブリドーマにより産生される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技法により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー(例えば、ファージディスプレイ技法を使用)から得た抗体について、該抗体をコードする核酸をライブラリーから取得し得る。
ここに記載される好ましい核酸分子は、７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである(例えば、表２２参照)。
抗α−シヌクレイン抗体を製造する方法は、それぞれ重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む細胞株で重鎖および軽鎖を発現させることを含む。これらのヌクレオチド配列を含む宿主細胞(例えばまたはこれらのヌクレオチド配列を含むベクター)はここに包含される。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントを、標準組み換えＤＮＡ技法によりさらに操作して、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換し得る。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨコード化ＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域または可動性リンカーなどの他のタンパク質をコードする他のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合される。この文脈で使用する用語「操作可能に結合」は、２個のＤＮＡフラグメントが、２個のＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように結合されることを意味することを意図する。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨコード化ＤＮＡを重鎖定常領域(ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３)をコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に結合させることにより、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅により得られ得る。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子について、ＶＨコード化ＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に結合させ得る。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬコード化ＤＮＡを軽鎖定常領域、ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に結合させることにより、完全長軽鎖遺伝子(ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子)に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で知られ(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅により得られ得る。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。
ｓｃＦｖ遺伝子を創製するために、ＶＨおよびＶＬコード化ＤＮＡフラグメントを、可動性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)３をコードする他のフラグメントに、ＶＨおよびＶＬ配列が隣接一本鎖タンパク質として発現され得て、ＶＬおよびＶＨ領域が可動性リンカーにより結合されるように、操作可能に結合させる(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554参照)。
またここに提供されるのは、７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８モノクローナル抗体のもの(例えば、表２２に示すもの)と相同であるＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子である。例示的核酸分子は、７Ａ１０、７Ａ１０−Ｔ９３Ａ、１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１、２Ｅ２、２３Ｈ８−１、２３Ｈ８−２、２３Ｈ８−３および１Ｅ８モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子(例えば、表２２に示すもの)と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるＶＨおよびＶＬ配列をコードする。またここに提供されるのは、該配列をコードするベクター、例えば、発現ベクターおよび上記ベクターまたは核酸を含む宿主細胞である。またここに提供されるのは、例えば、コドン最適化のための、サイレント置換(すなわち、核酸分子の翻訳により得られたアミノ酸配列を変えない置換)を有する核酸分子である。
VIII. 抗体産生
ここに記載するモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)により記載の標準体細胞ハイブリダイゼーション技法などの多様な既知技法により産生され得る。体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、原則的に、モノクローナル抗体を産生する他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技法も用い得る。
ハイブリドーマ調製のための好ましい動物系はマウス系である。マウスでのハイブリドーマ産生は、非常によく確立された方法である。融合のための免疫化プロトコールおよび免疫化脾細胞の単離のための技法は当分野で知られる。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合法も知られる。
ここに記載するキメラまたはヒト化抗体は、上記のとおり調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づき、調製され得る。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、標準分子生物学技法を使用して、興味あるマウスハイブリドーマから得て、非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含むように設計し得る。例えば、キメラ抗体を創製するために、マウス可変領域を、当分野で知られる方法を使用して、ヒト定常領域に連結させ得る(例えば、Cabilly et al.の米国特許４,８１６,５６７参照)。ヒト化抗体の創製のために、マウスＣＤＲ領域を、当分野で知られる方法を使用してヒトフレームワークに挿入し得る(例えば、Winterの米国特許５,２２５,５３９ならびにQueen et al.の米国特許５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。
ある実施態様において、ここに記載される抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなα−シヌクレインに対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の一部を担持する遺伝子導入または染色体導入マウスを使用して、産生され得る。これらの遺伝子導入および染色体導入マウスは、ここでそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称し、集合的に「ヒトＩｇマウス」と称するマウスを含む。
ＨｕＭＡｂマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、内在性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化変異と共に、再配列されていないヒト重(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む(例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859参照)。従って、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの減少した発現を示し、免疫化に応答して、導入ヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子はクラススイッチングおよび体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを産生する(Lonberg, N. et al. (1994), supra; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546にレビュー)。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用ならびにこのようなマウスにより担持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; and Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載され、この全ての内容を全体として引用により本明細書に明示的に包含させる。さらに、全てLonberg and Kayの米国特許５,５４５,８０６；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,８７７,３９７；５,６６１,０１６；５,８１４,３１８；５,８７４,２９９；および５,７７０,４２９；Surani et al.米の国特許５,５４５,８０７；全てLonberg and KayのＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２；およびKorman et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４もさらに参照のこと。
ある実施態様において、ここに記載される抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスなどの導入遺伝子および導入染色体にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを使用して誘導する。ここで「ＫＭマウス」と称するこのようなマウスは、Ishida et al.のＰＣＴ公報ＷＯ０２／４３４７８にさらに記載される。
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の遺伝子導入動物系は当分野で利用可能であり、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体の誘導に使用し得る。例えば、Xenomouse(Abgenix, Inc.)と称する別の遺伝子導入系が使用でき、このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許５,９３９,５９８；６,０７５,１８１；６,１１４,５９８；６,１５０,５８４および６,１６２,９６３に記載される。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の染色体導入動物系は当分野で利用可能であり、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体の誘導に使用し得る。例えば、ここで「ＴＣマウス」と称するヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体両方を担持するマウスを使用でき、このようなマウスはTomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載される。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが文献に記載されており(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体の誘導に使用し得る。
ヒト抗体誘導のために文献に記載されているさらなるマウス系は、(ｉ)キメラ抗体(ヒトＶ／マウスＣ)がマウスで誘導され、その後標準組み換えＤＮＡ技法を使用して完全ヒト抗体に変換されるように、内在性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、内在性マウス定常領域に操作可能に結合したヒト重鎖および軽鎖可変領域に相同組換えにより置き換えられているＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)；および(ii)マウスが再配列されていないヒト重鎖可変領域だけでなく、単一再配列ヒト共通軽鎖可変領域を含むＭｅＭｏ(登録商標)マウス(Merus Biopharmaceuticals, Inc.)を含む。このようなマウスおよび抗体誘導のためのその使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７、ＵＳ２０１０／００６９６１４、ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／０９７６０３、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／１４８８７３、ＵＳ２０１２／００７０８６１およびＵＳ２０１２／００７３００４に記載される。
ここに記載するヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーのスクリーニングのためのファージディスプレイ方法を使用しても調製され得る。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ方法は、当分野で確立されている。例えば：Ladner et al.の米国特許５,２２３,４０９；５,４０３,４８４；および５,５７１,６９８；Dower et al.の米国特許５,４２７,９０８および５,５８０,７１７；McCafferty et al.の米国特許５,９６９,１０８および６,１７２,１９７；ならびにGriffiths et al.の米国特許５,８８５,７９３；６,５２１,４０４；６,５４４,７３１；６,５５５,３１３；６,５８２,９１５および６,５９３,０８１参照。
ここに記載するヒトモノクローナル抗体はまたヒト免疫細胞が、免疫化によりヒト抗体応答が産生されるように再構成されている、ＳＣＩＤマウスを使用しても調製され得る。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許５,４７６,９９６および５,６９８,７６７に記載される。
免疫化
α−シヌクレインに対する完全ヒト抗体を取得するために、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４に他の抗原について記載のとおり、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子導入または染色体導入マウス(例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス)を、精製または富化調製物および／またはα−シヌクレインまたはそのフラグメントを発現する細胞で免疫化し得る。例えば、ある実施態様において、マウスを、組み換えヒトαＳｙｎ ＷＴで免疫化する。他の実施態様において、マウスを、αＳｙｎ Ａ５３Ｔ−ＰＦＦ変異体タンパク質で免疫化する。他の実施態様において、マウスを、αＳｙｎ ＷＴ−ＰＦＦで免疫化する。他の実施態様において、マウスを、架橋αＳｙｎ ＷＴで免疫化する。他の実施態様において、マウスを、架橋Ａ５３Ｔ ＰＦＦで免疫化する。他の実施態様において、マウスを、αＳｙｎ ＷＴ−ＰＦＦ、αＳｙｎ Ａ５３Ｔ−ＰＦＦ、架橋αＳｙｎ ＷＴ−ＰＦＦおよび架橋αＳｙｎ Ａ５３Ｔ−ＰＦＦの混合物で免疫化する。あるいは、マウスを、ヒトα−シヌクレインまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡで免疫化し得る。好ましくは、マウスは、最初の注入時６〜１６週齢である。例えば、組み換えα−シヌクレイン抗原の精製または富化調製物(５〜５０μg)を使用して、ＨｕＭＡｂマウスを腹腔内免疫化し得る。精製または富化調製物を使用する免疫化が抗体を誘導しない場合には、マウスを、免疫応答を促進するために、α−シヌクレインを発現する細胞、例えば、細胞株で免疫化してよい。細胞株の例は、α−シヌクレイン過発現安定ＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞株を含む。
種々の抗原での経験の積み重ねにより、ＨｕＭＡｂ遺伝子導入マウスは、リビアジュバント中の抗原で最初に腹腔内(ＩＰ)または皮下(ＳＣ)に免疫化し、その後隔週でリビアジュバント中の抗原でＩＰ／ＳＣ免疫化(計１０回まで)したとき、最良に応答することが示されている。免疫応答を、後眼窩採血により得た血漿サンプルで、免疫化プロトコールの間モニターし得る。血漿を、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ(下記のとおり)でスクリーニングし、十分な力価の抗α−シヌクレインヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合に使用し得る。マウスを、屠殺３日前に抗原を静脈内投与し、脾臓およびリンパ節を摘出することによりブーストし得る。各免疫化あたり２〜３融合を実施する必要があると考えられる。一般に６〜２４匹のマウスを、各抗原について免疫化する。通常、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子を、２個の異なるヒト重鎖導入遺伝子(ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２)を有する単一マウスに繁殖させ得る。
α−シヌクレインに対するモノクローナル抗体を取得するハイブリドーマの取得
ここに記載するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得するために、免疫化マウスからの脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株と融合し得る。得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体産生についてスクリーニングし得る。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、Ｓｐ２／０非分泌型マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８１)に、５０％ＰＥＧを用いて融合させ得る。細胞を、約２×１０５で平底マイクロタイタープレートに播種し、その後１０％胎児クローン血清、１８％“６５３”条件培地、５％ｏｒｉｇｅｎ(ＩＧＥＮ)、４mM Ｌ−グルタミン、１mM ピルビン酸ナトリウム、５mM ＨＥＰＥＳ、０.０５５mM ２−メルカプトエタノール、５０単位／mlペニシリン、５０mg／ml ストレプトマイシン、５０mg／mlゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ(Sigma)含有選択培地で２週間インキュベーションさせる。約２週間後、細胞を、ＨＡＴをＨＴに置き換えた培地で培養し得る。次いで個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡでスクリーニングし得る。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、培地を通常１０〜１４日後に観察し得る。抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、なおヒトＩｇＧについて陽性であるならば、該モノクローナル抗体を少なくとも２回、限界希釈によりサブクローン化し得る。次いで安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのために組織培養培地で少量の抗体を産生させる。
ヒトモノクローナル抗体精製のために、選択したハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のための２リットルスピナーフラスコで増殖させ得る。上清を濾過し、濃縮し、その後プロテインＡ−セファロース(Pharmacia, Piscataway, N.J.)で親和性クロマトグラフィーし得る。溶出ＩｇＧをゲル電気泳動法および高速液体クロマトグラフィーで確認して、純度を確認する。緩衝液をＰＢＳに交換してよく、濃度を１.４３消衰係数を使用するＯＤ２８０により決定し得る。モノクローナル抗体を等分し、−８０℃で保存し得る。
α−シヌクレインに対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの取得
抗体を、例えば、当分野で周知の組み換えＤＮＡ技法と遺伝子トランスフェクション方法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマで産生させ得る(Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、部分的または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを標準分子生物学技法(例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング)により得ることができ、ＤＮＡを、該遺伝子が転写および翻訳制御配列に操作可能に結合するように発現ベクターに挿入し得る。ここで、用語「操作可能に結合」は、抗体遺伝子がベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳の制御のその意図する機能を果たすようにベクター内にライゲートされることを意味する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合性であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入してよく、または両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は、標準方法(例えば、抗体遺伝子フラグメントとベクターの相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しないならば、平滑断端ライゲーション)により発現ベクターに挿入される。ここに記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用して、それらを、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに操作可能に結合し、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに操作可能に結合するように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターに挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子の創製に使用できる。
これに加えてまたはこれとは別に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローン化し得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)であり得る。
抗体鎖遺伝子に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を担持し得る。用語「制御配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図する。このような制御配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載される。制御配列の選択を含む発現ベクターの選択は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子により得ることは、当業者が認識している。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ))およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの哺乳動物細胞で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントを含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス制御配列を使用し得る。なおさらに、ＳＶ４０早期プロモーターからの配列とヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の末端反復配列を含むＳＲαプロモーター系などの異なる起源からの配列からなる制御エレメントも使用され得る(Takebe, Y. et al. (1988)) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列(例えば、複製起点)および選択可能マーカー遺伝子などの付加的配列を担持し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする(例えば、Axel et al.の米国特許４,３９９,２１６、４,６３４,６６５および５,１７９,０１７参照)。例えば、一般に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(ｄｈｆｒ−宿主細胞でメトトレキサート選択／増幅と使用するため)およびｎｅｏ遺伝子(Ｇ４１８選択のため)を含む。
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準技法により宿主細胞にトランスフェクトする。種々の形態の用語「トランスフェクション」は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなど、外来ＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞に導入するために一般に使用される多様な技法を包含することを意図する。ここに記載する抗体を原核生物または真核生物宿主細胞で発現させることが理論的に可能であるが、真核生物細胞および最も好ましくは哺乳動物宿主細胞での抗体の発現が、このような真核生物細胞、特に哺乳動物細胞が、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が原核生物細胞よりはるかに高いため、非常に好ましい。抗体遺伝子の原核生物発現は、高収率の活性抗体の産生には無効であることが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。
ここに記載する組み換え抗体の発現のための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621１に記載のＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用するUrlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に使用するために、他の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８,８４１に開示のＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されたら、抗体を、宿主細胞で抗体を発現させるのに、または、より好ましくは、抗体を宿主細胞が増殖している培養培地に分泌させるのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生させる。抗体を、標準タンパク質精製方法を使用して培養培地から回収し得る。
IX. アッセイ
ここに記載する抗体を、実施例に記載のような標準技法を使用して、例えば、標準ＥＬＩＳＡにより、α−シヌクレインへの結合について試験し得る。
上記ＥＬＩＳＡアッセイを、抗体を、故に、α−シヌクレイン免疫原と陽性反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングに使用し得る。α−シヌクレインに、好ましくは高親和性で、結合する抗体を産生するハイブリドーマを、次いでサブクローン化し、さらに特徴づけし得る。次いで、親細胞の反応性を維持する(ＥＬＩＳＡによる)各ハイブリドーマからの１クローンを細胞バンク作製および抗体精製のために選択し得る。
選択した抗α−シヌクレインモノクローナル抗体が特有のエピトープに結合するかを決定するために、各抗体を、市販試薬(Pierce, Rockford, IL)を使用してビオチニル化し得る。ビオチニル化ＭＡｂ結合をストレプトアビジン標識プローブを用いて検出し得る。非標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を使用する競合試験を、上記のとおりα−シヌクレイン被覆ＥＬＩＳＡプレートを使用して実施し得る。
抗体間の競合を評価する技法は、例えば、ある抗体が他の抗体の標的抗原への結合を遮断する(または遮断しない)能力を示すイムノアッセイ、すなわち、競合的結合アッセイを含む。競合的結合は、試験下の免疫グロブリンが、対照抗体のα−シヌクレインなどの共通抗原への特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定される。多数のタイプの競合的結合アッセイが知られ、例えば固相直接および間接ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、固相直接および間接酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ；固相直接１２５Ｉ標識ＲＩＡ；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ；および直接標識ＲＩＡである。表面プラズモン共鳴もこの目的で使用され得る。一般に、このようなアッセイは、固体表面に結合した精製抗原または非標識試験免疫グロブリンおよび標識対照免疫グロブリンまたはこれらの何れかを担持する細胞の使用を含む。競合的阻害を、試験免疫グロブリン存在下、固体表面または細胞に結合する標識の量の決定により測定する。試験免疫グロブリンは、一般に過剰に存在する。通常、競合する抗体が過剰に存在するとき、対照抗体の共通抗原への特異的結合を、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上阻害する。
ここに開示する抗体によるエピトープ結合を決定する他のスクリーニング技法は、例えば、エピトープの原子解析を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線分析を含む。他の方法は、抗原配列内のアミノ酸残基修飾による結合の喪失が、しばしばエピトープ成分の指標であると考えられる、抗体の抗原フラグメントまたは抗原の変異種への結合のモニターである。さらに、エピトープマッピングのためのコンピューターによるコンビナトリアル方法も使用され得る。これらの方法は、目的の抗体が、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的短ペプチドを親和性単離する能力に依存する。次いで、ペプチドをペプチドライブラリーのスクリーニングに使用する抗体に対応するエピトープの定義のためのリードとして考える。エピトープマッピングのために、立体構造不連続エピトープをマッピングすることが示されている、コンピューターによるアルゴリズムも開発されている。
精製抗体のアイソタイプを決定するために、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用してアイソタイプＥＬＩＳＡを実施し得る。
抗α−シヌクレイン抗体を、ウェスタンブロッティングによりα−シヌクレイン抗原との反応性についてさらに試験し得る。簡潔には、α−シヌクレインを発現する細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し得る。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、２０％マウス血清でブロックし、試験するモノクローナル抗体でプローブする。ＩｇＧ結合を、抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)で展開し得る。
種々の抗α−シヌクレイン抗体の結合親和性、交差反応性および結合反応速度を分析する方法は、当分野で知られる標準アッセイ、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ ２０００ ＳＰＲ装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用するＢｉａｃｏｒｅＴＭ表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析を含む。
抗α−シヌクレイン抗体をまた、そのα−シヌクレインオリゴマーへのα−シヌクレインモノマーを超える優先的結合についても試験し得る。「モノマー／ＰＦＦ結合比」を、ここでは、ＰＦＦおよびα−シヌクレインモノマーへの抗α−シヌクレイン抗体の結合行動を述べる指数として使用する。１より大きい比は、α−シヌクレインモノマーよりもＰＦＦへの結合の大きな優先性を示す。例えば、実施例３に記載のＥＬＩＳＡで、例えば、抗体がモノマーα−シヌクレインに２９１nMのＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに０.１６nMのＥＣ５０で結合するならば、その抗体のモノマー／ＰＦＦ結合比は２９１／０.１６＝１８１９である。ある実施態様において、ＰＦＦは、実施例３に記載する方法により製造する。
抗α−シヌクレイン抗体を、例えば、実施例１１に記載のアッセイまたは実施例１２に記載のオリゴマーＥＬＩＳＡを使用して、脳におけるα−シヌクレインオリゴマーの凝集体を除去する能力について試験し得る。抗体はまた、例えば、実施例１０および１１に記載の方法を使用して、α−シヌクレインのＳ１２９のα−シヌクレインオリゴマー(ＰＦＦ)誘導リン酸化を減少または阻止する能力またはＰＦＦおよび／または脳にα−シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセート(例えば、シヌクレイン病、例えば、ＭＳＡを有する患者から調製した脳ライセート)から不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる能力について試験し得る。
Ｘ. 免疫複合体、抗体誘導体および診断
ここに記載する抗体を、サンプル試験およびインビボ造影を含む診断目的で使用でき、この目的のために、抗体(またはその結合フラグメント)を、免疫複合体を形成するための適切な検出可能な薬剤とコンジュゲートさせ得る。診断目的で、適切な薬剤は、全身造影のための放射性同位体ならびにサンプル試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適当な抗体タグを含む、検出可能標識である。
検出可能標識は、金コロイドなどの金属ゾル、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳまたはＮ４タイプのペプチド性キレート剤と共に存在するＩ１２５またはＴｃ９９などの同位体、蛍光マーカー、発光マーカー、リン光マーカーを含む発色団などを含む粒子標識ならびにある基質を検出可能マーカーに変換する酵素標識およびポリメラーゼ連鎖反応などによる増幅後明らかにされるポリヌクレオチドタグを含む、インビトロ診断の分野で現在使用されている種々のタイプの何れでもよい。適当な酵素標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどを含む。例えば、標識は、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン(ＡＭＰＰＤ)、ジナトリウム３−(４−(メトキシスピロ{１,２−ジオキセタン−３,２’−(５’−クロロ)トリシクロ{３.３.１.１ ３,７}デカン}−４−イル)フェニルホスフェート(ＣＳＰＤ)などの１,２−ジオキセタン基質の変換後化学発光の存在または形成の測定により検出される酵素アルカリホスファターゼならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ｓｔａｒ(登録商標)または当分野で周知の他の発光基質、例えばテルビウム(III)およびユーロピウム(III)などの適当なランタニドであり得る。検出手段は選択した標識により決定される。標識またはその反応産物の出現は、標識が粒子であり、適切なレベルで蓄積するならば肉眼でまたは分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計などの装置を使用して、全て標準実務に従い、達成され得る。
好ましくは、コンジュゲーション方法は、実質的に(またはほぼ)非免疫原性の、例えば、ペプチド−(すなわちアミド−)、スルフィド−、(立体障害)、ジスルフィド−、ヒドラゾン−およびエーテル結合である結合をもたらす。これらの結合はほぼ非免疫原性であり、血清中で合理的な安定性を示す(例えばSenter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244；ＷＯ２００９／０５９２７８；ＷＯ９５／１７８８６参照)。
部分および抗体の生化学的性質によって、異なるコンジュゲーション戦略が用いられ得る。部分が天然に存在するまたは組み換えの５０〜５００アミノ酸である場合、タンパク質コンジュゲート合成の化学を記載する教科書に標準法があり、当業者は容易にそれに従い得る(例えばHackenberger, C. P. R. and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074参照)。ある実施態様において、マレイミド部分と抗体または部分内のシステイン残基の反応が使用される。これは、抗体の例えばＦａｂまたはＦａｂ’−フラグメントが使用されるとき、特に適するカップリング化学である。あるいは、ある実施態様において、抗体または部分のＣ末端へのカップリングが実施される。タンパク質、例えばＦａｂ−フラグメントのＣ末端修飾は、例えば記載のとおり実施され得る(Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371)。
一般に、部位特異的反応および共有結合性カップリングは、天然アミノ酸に存在する他の官能基の反応性と直交的である反応性によって他のアミノ酸へ変換することに基づく。例えば、稀な配列内の特異的システインを、アルデヒドに酵素的に変換し得る(Frese, M. A. and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427参照)。ある配列の天然アミノ酸に、ある酵素の特定の酵素反応を利用して、所望のアミノ酸修飾を行うことも可能である(例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; and Protease-catalyzed formation of C--N bonds is used by Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403参照)。
部位特異的反応および共有結合性カップリングはまた適切な修飾剤での末端アミノ酸の選択的反応によっても達成され得る。
Ｎ末端システインとベンゾニトリルの反応性(Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662参照)を使用して、部位特異的共有結合性カップリングを達成し得る。
天然化学ライゲーションはまたＣ末端システイン残基にも依存し得る(Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96)。
ＥＰ１０７４５６３は、負荷電アミノ酸鎖内のシステインと正荷電アミノ酸鎖に位置するシステインのより速い反応に基づく結合方法を記載する。
構造部分はまた合成ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ポリペプチドを化学合成する場合には、直交的反応性のアミノ酸を該合成中に導入し得る(例えばde Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295参照)。多様な直交性官能基が利用可能であって、合成ペプチドに導入することができるので、このようなペプチドのリンカーの結合は常套的化学となっている。
単標識ポリペプチドを得るために、１：１化学量論でのコンジュゲートを、他のコンジュゲーション副産物からクロマトグラフィーにより分離し得る。この方法は、色素標識結合対メンバーおよび荷電リンカーの使用により促進され得る。この種の標識および高度に負荷電の結合対メンバーの使用により電荷および分子量差異を分離に使用できるため、単標識ポリペプチドが、非標識ポリペプチドおよび１個を超えるリンカーを有するポリペプチドから容易に分離される。蛍光色素は、標識一価結合剤などの非結合成分から複合体を精製するのに有用であり得る。
ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体に結合する部分は、結合部分、標識部分および生物学的活性部分からなる群から選択される。
ここに記載する抗体はまた抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)などの免疫複合体を形成するために、治療剤とコンジュゲートさせ得る。適当な治療剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核排出阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはII阻害剤、ヒートショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および有糸分裂阻害剤を含む。ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、好ましくはペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーなどの開裂可能リンカーによりコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ(配列番号１２８)、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許７,０８７,６００；６,９８９,４５２；および７,１２９,２６１；ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０；ＷＯ０７／０３８６５８；ＷＯ０７／０５１０８１；ＷＯ０７／０５９４０４；ＷＯ０８／０８３３１２；およびＷＯ０８／１０３６９３；米国特許公開２００６００２４３１７；２００６０００４０８１；および２００６０２４７２９５に記載のとおり製造でき；これらの内容を引用により本明細書に包含させる。
抗α−シヌクレイン抗体、例えば、ここに記載のものは、α−シヌクレイン、例えばヒトα−シヌクレイン、例えば、組織または組織サンプルにおけるヒトα−シヌクレインの検出にも使用され得る。抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーで使用され得る。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体を、細胞、例えば、組織中の細胞と、特異的結合が生じるのに適切な時間接触させ、次いで試薬、例えば、抗α−シヌクレイン抗体を検出する抗体を加える。抗α−シヌクレイン抗体は完全ヒト抗体であってよくまたはヒト可変領域およびマウス定常領域またはその一部を有する抗体などのキメラ抗体であり得る。サンプル(細胞または組織サンプル)中のα−シヌクレイン、例えば、ヒトα−シヌクレインを検出する例示的方法は、(ｉ)サンプルと抗α−シヌクレイン抗体を、抗α−シヌクレイン抗体とサンプル中のα−シヌクレインの特異的結合をさせるのに十分な時間接触させ、そして(２)サンプルと、抗α−シヌクレイン抗体のＦｃ領域などの抗α−シヌクレイン抗体と特異的に結合する検出試薬、例えば、抗体を接触させ、それにより抗α−シヌクレイン抗体によるα−シヌクレイン結合を検出することを含む。洗浄工程を、抗体および／または検出試薬とのインキュベーション後に含めてもよい。これらの方法で使用する抗α−シヌクレイン抗体は、別の検出剤を使用し得るため、標識または検出剤と連結させる必要はない。
XI. 二特異性分子
ここに記載する抗体は、二特異性分子の形成に使用し得る。抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分を、他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド)と誘導体化または連結して、少なくとも２個の異なる結合部位または標的分子に結合する二特異性分子を産生し得る。例えば、抗α−シヌクレイン抗体を、ここに記載するタンパク質などの、組み合わせ処置の潜在的標的として使用し得る任意のタンパク質と特異的に結合する抗体またはｓｃＦｖと連結できる。ここに記載する抗体は、実際１を超える他の機能的分子と誘導体化または連結させて、２を超える異なる結合部位および／または標的分子と結合する多特異的分子を産生し得る；このような多特異的分子は、ここで使用する用語「二特異性分子」に包含されることも意図する。ここに記載する二特異性分子を創製するために、ここに記載する抗体を、二特異性分子がもたらされるように、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣体などの１以上の他の結合分子と機能的に連結(例えば、化学カップリング、遺伝的融合、非共有結合性結合またはその他)させ得る。
従って、ここに提供されるのは、α−シヌクレインに対する少なくとも一つの第一結合特異性および第二標的エピトープに対する第二結合特異性を含む、二特異性分子である。二特異性分子が多特異的であるここに記載する実施態様において、該分子はさらに第三結合特異性を含み得る。
ある実施態様において、ここに記載する二特異性分子は、結合特異性として、少なくとも一つの抗体または、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)を含むその抗体フラグメントを含む。抗体はまた軽鎖または重鎖二量体またはLadner et al. 米国特許４,９４６,７７８(その内容を引用により明示的に本明細書に包含させる)に記載のＦｖまたは一本鎖構築物などのその任意の最小フラグメントであり得る。
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、ここに記載される二特異性分子で用い得る他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
ここに記載する二特異性分子は、当分野で知られる方法を使用して成分結合特異性をコンジュゲートすることにより製造し得る。例えば、二特異性分子の各結合特異性を別々に作成し、次いで互いにコンジュゲートし得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、種々のカップリングまたは架橋剤を、共有結合性コンジュゲーションのために使用し得る。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)、ｏ−フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)を含む(例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648参照)。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83)およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載のものを含む。好ましいコンジュゲート剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両者ともPierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手可能である。
ある実施態様において、ここに記載する二特異性分子は、分子の脳への輸送、例えば、血液脳関門通過を増加させる第二結合特異性を有する。
結合特異性が抗体であるとき、それらは、２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によりコンジュゲートされ得る。特に好ましい実施態様において、ヒンジ領域は、コンジュゲーション前に奇数、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
あるいは、両結合特異性が同一ベクターでコードされ、同一宿主細胞で発現および構築され得る。この方法は、二特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、ｍＡｂ×(ｓｃＦｖ)２、Ｆａｂ×Ｆ(ａｂ’)２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき、特に有用である。二特異性抗体は、各重鎖のＣ末端にｓｃＦｖを含む抗体を含み得る。ここに記載する二特異性分子は、一つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２個の結合決定基を含む一本鎖二特異性分子であり得る。二特異性分子は、少なくとも２個の一本鎖分子を含み得る。二特異性分子を製造する方法は、例えば米国特許５,２６０,２０３；米国特許５,４５５,０３０；米国特許４,８８１,１７５；米国特許５,１３２,４０５；米国特許５,０９１,５１３；米国特許５,４７６,７８６；米国特許５,０１３,６５３；米国特許５,２５８,４９８；および米国特許５,４８２,８５８に記載される。
二特異性分子の特異的標的への結合は、酵素結合免疫吸着法(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)またはウェスタンブロットアッセイなどの当分野で認識される方法を使用して確認できる。これらのアッセイの各々は、一般に特に興味のあるタンパク質−抗体複合体の存在を、興味のある複合体に特異的な標識剤(例えば、抗体)を用いて検出する。
XII. 組成物
さらに提供されるのは、薬学的に許容される担体と製剤された、ここに記載する一つのもしくは組み合わせた抗α−シヌクレイン抗体または他の標的への抗体もしくはその抗原結合部分との組み合わせを含む、組成物、例えば、医薬組成物である。このような組成物は、ここに記載する抗体または免疫複合体または二特異性分子を１個または組み合わせ(例えば、２以上の異なる)で含み得る。例えば、ここに記載する医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するまたは相補性活性を有する抗体の組み合わせ(または免疫複合体または二特異性)を含み得る。
ある実施態様において、組成物は、少なくとも１mg／ml、５mg／ml、１０mg／ml、５０mg／ml、１００mg／ml、１５０mg／ml、２００mg／ml、１〜３００mg／mlまたは１００〜３００mg／mlの濃度で抗α−シヌクレイン抗体を含む。
ここに記載する医薬組成物はまた組み合わせ治療で、すなわち、他の薬剤と組み合わせて(同一組成物または別々の組成物)投与され得る。組み合わせ治療で使用し得る治療剤の例は、例えば、レボドパ、アマンタジン(シンメトレル)、抗コリン剤(トリヘキシフェニジル、メシル酸ベンズトロピン、プロシクリジン、アーテン、ｃｏｇｅｎｔｉｎ)、ブロモクリプチジン(パーロデル)、ペルゴリド(ペルマックス)、ロピニロール(レキップ)、プラミペキソール(ミラペックス)、モノアミンオキシダーゼ−Ｂ阻害剤(ＭＡＯ)、例えばセレギリン(ＤｉｐｒｅｎｙｌまたはＥｌｄｅｐｒｙｌ)、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤(ＣＯＭＴ)、例えばエンタカポン、タスマールまたはトルカポン、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｄ２受容体アンタゴニスト、ＤＡアゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、α−シヌクレインに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)、キナーゼ阻害剤およびロイシンリッチリピートキナーゼ２(ＬＲＲＫ２)阻害剤を含む。さらなる薬剤は、例えば、ＰＩＮＫ、ＰＡＲＫＩＮ、ＤＪ１、グルコセレブロシダーゼ(ＧＢＡ)および活性酸素種を標的とする薬剤などの、シヌクレイン病の病理に関与することが知られている分子をターゲティングする治療剤を含む。
ここで使用する「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性である任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与(例えば、注射または注入による)に適する。投与経路によって、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二特異性分子を、該化合物を不活性化し得る酸の作用および他の天然条件から化合物を保護する物質でコーティングし得る。
ここに記載する医薬化合物は、１以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、如何なる望ましくない毒性効果も与えない、塩をいう(例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19参照)。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸などの非毒性無機酸ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカノン酸、ヒドロキシアルカノン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属ならびにＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものを含む。
ここに記載する医薬組成物はまた薬学的に許容される抗酸化剤も含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、(１)水可溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システインヒドロクロライド、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；(２)油可溶性抗酸化剤、例えばアスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；および(３)金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などを含む。
ここに記載する医薬組成物で用い得る適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適当な混合物、植物油、例えばオリーブ油および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持され得る。
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含み得る。微生物の存在の予防は、上記滅菌法および種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含の両方により確実にされ得る。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを組成物に包含させることも、望ましい。さらに、注射用医薬形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の包含により達成され得る。
薬学的に許容される担体は、無菌水溶液または分散体および無菌注射用溶液または分散体の用事調製のための無菌粉末を含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で知られる。既知媒体または薬剤が活性化合物と不適合性でない限り、ここに記載する医薬組成物へのその使用が意図され得る。医薬組成物は防腐剤を含んでも含まなくてもよい。補助的活性化合物を組成物に包含させ得る。
治療組成物は、一般に無菌であり、かつ製造および貯蔵条件下安定でなければならない。組成物は溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適する他の秩序構造に製剤され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適当な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持により、または界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物に包含させるのが好ましい。注射用医薬形態の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンの包含により達成され得る。
無菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒に、必要に応じて、上に挙げた成分の一つまたは組み合わせと共に取り込み、その後滅菌微量濾過して製造し得る。一般に、分散体は、活性化合物を、塩基性分散媒体および上に挙げたものからの必要な他の成分を含む無菌媒体に取り込むことにより製造される。無菌注射用溶液調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、先に無菌濾過したその溶液からの活性成分と任意のさらなる所望の成分を含む、粉末を生じる真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。
単一投与量形態を産生するための担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、処置する対象および特定の投与方式により変わる。単一投与量形態を製造するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、一般に治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００パーセント中、この量は薬学的に許容される担体と組み合わせた、約０.０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分の範囲、好ましくは約０.１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲である。
投与量レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療応答)を提供するために調節される。例えば、単一ボーラスを投与してよく、数分割用量を経時的に投与してよくまたは治療状況の必要性により示されるとおり、用量を比例的に減少または増加させてよい。非経腸組成物を投与の容易さおよび投与量均一性のために投与量単位形態で製剤するのが特に有利である。ここで使用する投与量単位形態は、処置する対象のための単位投与量として適する物理的に分離した単位をいい、各単位は、必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含む。ここに記載される投与量単位形態の明細は、(ａ)活性化合物の特有の特性および達成すべき特定の治療効果および(ｂ)個々の感受性の処置のためのこのような活性化合物の配合における分野固有の制限により指示され、直接依存する。
抗体投与のための、投与量は、約０.０００１〜１００mg／kgおよびより一般には０.０１〜５または１０mg／kg宿主体重の範囲である。例えば投与量は、０.３mg／kg体重、１mg／kg体重、３mg／kg体重、５mg／kg体重または１０mg／kg体重または１〜１０mg／kgの範囲内である。例示的処置レジメは、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月に１回、３か月に１回または３〜６か月に１回の投与を含む。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、一定用量(一定用量レジメン)で投与され得る。
ある方法において、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投与量は示されている範囲内に入る。抗体は、通常複数回投与される。各投与の間隔は、例えば、週、月、３か月毎または年であり得る。間隔は、患者の標的抗原に対する抗体の血中濃度測定により示されるように、不規則でもよい。ある方法において、投与量を、約１〜１０００μg／mlおよびある方法において約２５〜３００μg／mlの血漿抗体濃度を達成するように調節する。
抗体を、徐放性製剤で投与でき、この場合、必要な投与頻度は少ない。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期により変わる。一般に、ヒト抗体が最長半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与の投与量および頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかにより変わり得る。予防適用では、比較的低投与量が、比較的頻繁ではない間隔で、長期間にわたり投与される。一部患者は、処置を一生受け続ける。治療適用では、疾患進行が低減するかまたは停止するまで、好ましくは患者が疾患症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高投与量が必要であることがある。その後、患者に予防レジメを投与し得る。
ここに記載する医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与方式で所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るために変わり得る。選択した投与量レベルは、用いるここに記載する特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置の期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および病歴および医薬分野で周知のこのような因子を含む、多様な薬物動態因子による。
ここに記載する組成物は、多様な当分野で知られる方法の１以上を使用して、１以上の投与経路で投与され得る。当業者には認識されるとおり、経路および／または投与方式は所望の結果により変わる。ここに記載する抗体のための好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路である。ここで使用する用語「非経腸投与」は、経腸および局所投与以外の、通常注射による投与方式をいい、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含むが、これらに限定されない。
あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的などの非経腸ではない経路で投与し得る。
活性化合物を、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、化合物を迅速な放出から保護する担体と製造し得る。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤の調製のための多くの方法が特許されまたは当業者に一般に知られる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
治療組成物を、当分野で知られる医薬デバイスで投与し得る。例えば、好ましい実施態様において、ここに記載する治療組成物を、米国特許５,３９９,１６３；５,３８３,８５１；５,３１２,３３５；５,０６４,４１３；４,９４１,８８０；４,７９０,８２４；または４,５９６,５５６に開示のデバイスなどの無針皮下注射器で投与し得る。ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体での使用のための周知のインプラントおよびモジュールの例は、制御された速度で医薬を分配するための植込み型マイクロインフュージョンポンプを開示する米国特許４,４８７,６０３；皮膚から医薬を投与するための治療デバイスを開示する米国特許４,４８６,１９４；正確な注入速度で医薬を送達するための投薬注入ポンプを開示する米国特許４,４４７,２３３；連続的薬物送達のための可変流量植込み型注入装置を開示する米国特許４,４４７,２２４；多チャンバー区画を有する浸透性薬物送達系を開示する米国特許４,４３９,１９６；および浸透性薬物送達系を開示する米国特許４,４７５,１９６を含む。これらの特許を引用により本明細書に包含させる。多くの他のこのようなインプラント、送達系およびモジュールが当業者に知られる。
ある実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は、インビボでの適切な分配を確実にするよう製剤され得る。例えば、血液脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。ここに記載する治療化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために(例えば、脳腫瘍のために、所望であれば)、例えば、リポソームに製剤され得る。リポソームの製造方法について、例えば、米国特許４,５２２,８１１；５,３７４,５４８；および５,３９９,３３１を参照のこと。リポソームは、特異的細胞または臓器に選択的に送達され、それゆえに標的化薬物送達を増強する１以上の部分を含む(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。標的化部分の例は、葉酸またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許５,４１６,０１６参照)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)を含み；K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273もまた参照のこと。
XIII. キット
また提供されるのは、所望により、単一バイアルまたは容器に含まれ、例えば、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの凝集体の存在と関係する疾患の処置または診断における使用指示を含む、ここに開示する抗α−シヌクレイン抗体、二特異性抗体または免疫複合体を含むキットである。キットは、キットの中身の意図する用途を示すラベルを含み得る。用語ラベルは、キット上にまたはキットと共に提供されるまたは他の方法でキットに付随するあらゆる書面、販売資料または記録媒体を含む。このようなキットは、単一用量バイアルまたは単一用量充填済シリンジなどの単位投与量形態で抗体、二特異性抗体または免疫複合体を含み得る。
XIV. 使用および方法
ここに提供されるのは、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を有する対象(例えば、ヒト患者)を処置する方法ならびにこれらの疾患を予防する方法である。
従って、ある態様において、ここに提供されるのは、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を処置する方法であって、該疾患を有する対象に有効量のここに記載する抗α−シヌクレイン抗体または抗原結合部分を投与することを含む、方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患の重症度を軽減する方法であって、該疾患を有する対象に有効量のここに記載する抗α−シヌクレイン抗体または抗原結合部分を投与することを含む、方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患の進行を遅延させる方法であって、該疾患を有する対象に有効量のここに記載する抗α−シヌクレイン抗体または抗原結合部分を投与することを含む、方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患の発症のリスクを低減する方法であって、該疾患を発症するリスクのある対象に有効量のここに記載する抗α−シヌクレイン抗体または抗原結合部分を投与することを含む、方法である。
他の態様において、ここに提供されるのは、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患の発症を遅延する方法であって、該疾患を発症するリスクのある対象に有効量のここに記載する抗α−シヌクレイン抗体または抗原結合部分を投与することを含む、方法。
ある実施態様において、処置する対象は、シヌクレイン病の症状(徴候)、例えば神経精神医学的所見(うつ病、認知症、幻覚、不安、感情鈍麻、快感消失)、自律神経性変化(起立性低血圧、膀胱障害、便秘、便失禁、流涎症、嚥下障害、性機能不全、脳内血流量変化)、感覚性変化(嗅覚、疼痛、色識別異常感覚)、睡眠障害(ＲＥＭ睡眠行動障害(ＲＢＤ)、下肢静止不能症候群／周期性四肢運動、過眠症、不眠症)および他の徴候および症状(疲労、複視、霧視、脂漏、体重減少／増加)を示す。
ある実施態様において、処置する対象は疾患症状を示さないが、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を発症する遺伝的リスクを有することが知られる。例えば、このような個体は、該疾患を有する近親者がいるまたはリスクが遺伝的または生化学的マーカーにより分析される。例えば、Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、Ｈ５０Ｑ、Ｇ５１ＤおよびＡ５３Ｔを含むＳＮＣＡ(ＰＡＲＫ１、α−シヌクレインをコード)の変異ならびにＳＮＣＡ遺伝子全体の重複および三重化は、常染色体優性形態のＰＤをもたらす。ＬＲＲＫ２(ＰＡＲＫ８、ロイシンリッチリピートキナーゼ２)の変異およびＶＰＳ３５(ＰＡＲＫ１７、液胞局在タンパク質３５)の変異も、常染色体優性形態のＰＤをもたらす(Hernandez et al., (2016) Genetics in Parkinson disease: Mendelial versus non-Medndelian inheritance. Journal of Neurochemistry 10.1111/jnc.13593)。ＰＩＮＫ１(ＰＡＲＫ６、ＰＴＥＮ誘導キナーゼ１)、ＤＪ−１(ＰＡＲＫ７)、Ｐａｒｋｉｎ(ＰＡＲＫ２)、ＡＴＰ１３Ａ２(ＰＡＲＫ９、ＡＴＰａｓｅタイプ１３Ａ２)、ＦＢＸＯ７(ＰＡＲＫ１５、Ｆボックスオンリータンパク質７)およびＰＬＡ２ＧＢ(ＰＡＲＫ１４、ホスホリパーゼＡ２、VI群)の変異は、常染色体劣性ＰＤ／パーキンソニズムを起こすことが示されている。さらに、ＰＤおよび関連シヌクレイン病と関連する２８の異なる遺伝的リスク遺伝子座が同定されており、ＳＮＣＡ、ＬＲＲＫ２、ＧＢＡ／ＳＹＴ１１、ＭＡＰＴ、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＧＡＫ、ＧＣＨ１、ＮＵＣＫＳ１／ＲＡＢ７Ｌ１、ＳＬＣ４１Ａ１、ＢＳＴ１、ＳＩＰＡ１Ｌ２、ＡＣＭＳＤ／ＴＭＥＭ１６３、ＳＴＫ３９、ＭＣＣＣ１、ＴＭＥＭ１７５／ＧＡＫ／ＤＧＫＱ、ＦＡＭ４７Ｅ／ＳＣＡＲＢ２、ＧＰＮＭＢ、ＦＧＦ２０、ＩＮＰＰ５Ｆ、ＭＩＲ４６９７、ＣＣＤＣ６２、ＧＣＨ１、ＶＰＳ１３Ｃ、ＢＣＫＤＫ／ＳＴＸ１Ｂ、ＳＲＥＢＦ／ＲＡＩ１、ＲＩＴ２およびＤＤＲＧＫ１を含む(Nalls et al. (2014) Large-scale meta-analysis of genome-wide association data identifies six new risk loci for Parkinson's disease. Nature Genetics 46(9): 989-993)。従って、予防適用において、ここに記載する抗体またはそれを含む医薬組成物を、該疾患の素因があるまたは他にリスクがある患者に、リスクを低減する、重症度を軽減または該疾患の少なくとも一つの徴候または症状の発症を遅延するのに有効なレジメ(投与の用量、頻度および経路)で投与する。ある予防適用において、レジメは、脳へのα−シヌクレインの蓄積の阻止または遅延および／またはその毒作用の阻止または遅延および／または患者の行動の欠陥の進展の阻止または遅延に有効である。
ある実施態様において、上記方法は、対象の患者に有益な治療応答を生じる(例えば、脳のα−シヌクレイン凝集体の減少、認知機能改善および／または認知低下の回復、処置または予防)。従って、ある実施態様において、ここに記載される抗体は、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患が疑われるまたは既に罹患している患者に、疾患の少なくとも一つの徴候または症状の軽減にまたは少なくともさらなる悪化の阻止に有効なレジメ(投与の用量、頻度および経路)で投与する。ある治療適用において、レジメは、α−シヌクレイン、関連毒性および／または行動の欠陥のレベルの減少または少なくともさらなる増加の阻止に有効である。ある実施態様において、処置は、例えば、処置開始前に対してまたは未処置対照患者集団と比較して、脳のα−シヌクレイン凝集体の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の減少をもたらす。
ある実施態様において、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患は、パーキンソン病(特発性パーキンソン病)、ＤＬＢ、ＤＬＢＤ、ＬＢＶＡＤ、純粋自律神経失調症、レビー小体嚥下障害、偶発的ＬＢＤ、遺伝性ＬＢＤ(例えば、ＳＮＣＡ(ＰＡＲＫ１)、ＬＲＲＫ２(ＰＡＲＫ８)、ＶＰＳ３５(ＰＡＲＫ１７)、ＰＩＮＫ１(ＰＡＲＫ６)、ＤＪ−１(ＰＡＲＫ７)、Ｐａｒｋｉｎ(ＰＡＲＫ２)、ＡＴＰ１３Ａ２(ＰＡＲＫ９)、ＦＢＸＯ７(ＰＡＲＫ１５)およびＰＬＡ２ＧＢ(ＰＡＲＫ１４)の変異)または多系統萎縮症(ＭＳＡ；例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレーガー症候群)を含む。
また提供されるのは、細胞(インビトロまたはインビボ)における不溶性α−シヌクレイン凝集体(例えば、セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する方法であって、細胞と有効量のここに記載する抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分を接触させることを含む、方法である。ある実施態様において、セリン−１２９のリン酸化はα−シヌクレインオリゴマー(例えば、ＰＦＦ)により誘導される。
また提供されるのは、シナプス形成(シナプトフィジン)および／または樹状突起(ＭＡＰ２)のマーカーを使用して測定して、シナプス密度および／または樹状突起密度を保持または増加させる方法である。従って、ある実施態様において、ここに記載する抗体で処置した対象は、処置開始前に対してまたは未処置対照患者集団と比較して、シナプスまたは樹状突起密度の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上または５０％以上の上昇を示す。
ここに開示する抗体はまた、例えば、ここに開示する抗体(例えば、エクスビボまたはインビボ)と対象からの細胞を接触させ、細胞上のα−シヌクレインへの結合のレベルを測定し、ここでα−シヌクレインへの異常に高レベルの結合は、該対象が脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を有することを示すことによる、脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患の診断または予後診断にも使用され得る。診断または予後診断目的で、ここに記載する抗体を、患者の体内に静脈内注射によりまたは頭蓋内注射によりもしくは頭蓋骨に削孔することにより直接脳に投与し得る。薬剤の投与量は、処置方法と同一範囲内である。適当な標識は、例えば、蛍光標識(例えば、光学検出のため)、常磁性標識(例えば、外科的介入のない断層撮影検出のため)および放射性標識(例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴを使用する検出のため)を含む。診断は、対応するベースライン値に対する標識遺伝子座の数、サイズおよび／または強度の比較により実施する。ベースライン値は、非罹患個体集団の平均レベルを表し得る。ベースライン値はまた同じ患者で決定した以前のレベルでもあり得る。例えば、ベースライン値を、処置開始前に患者で決定し、その後の測定値を該ベースライン値と比較し得る。ベースラインと比較して減少した値は、処置に対する陽性応答を示す。
ある実施態様において、ここに提供されるのは、対象におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を診断する方法であって：
(ａ)対象からのサンプルとここに記載する抗体またはその抗原結合部分を、抗体−抗原複合体が形成されるように接触させ；
(ｂ)形成された複合体の量を決定し；そして
(ｃ)サンプルにおける複合体の量と対照における量を比較することを含み、ここで、対照と比較してサンプルにおける複合体のレベルの上昇は、該対象がレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を有することを示す、方法である。ある実施態様において、サンプルは脳脊髄液、脳組織抽出物、尿または血液である。ある実施態様において、対照は、疾患症状を示さず、該疾患(例えば、シヌクレイン病)の遺伝的素因がない健常対象の集団である。
好ましい実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体は顕著に毒性ではない。例えば、抗α−シヌクレイン抗体は、例えば、臨床治験で決定して、ヒトの臓器、例えば、肝臓、腎臓、脳、肺および心臓の１以上に顕著に毒性ではない。ある実施態様において、抗α−シヌクレイン抗体は、望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫または炎症を誘導しない。
抗体は単独でまたは脳のレビー小体またはα−シヌクレインの凝集体と関連する疾患(例えば、多系統萎縮症)の処置に抗体と併せてまたは相乗的に作用する他の治療剤と組み合わせて投与し得る。
ここに記載する抗体と組み合わせて使用するのに適する治療剤は、例えば、レボドパ、アマンタジン(シンメトレル)、抗コリン剤(トリヘキシフェニジル、メシル酸ベンズトロピン、プロシクリジン、アーテン、ｃｏｇｅｎｔｉｎ)、ブロモクリプチジン(パーロデル)、ペルゴリド(ペルマックス)、ロピニロール(レキップ)、プラミペキソール(ミラペックス)、モノアミンオキシダーゼ−Ｂ阻害剤(ＭＡＯ)、例えばセレギリン(ＤｉｐｒｅｎｙｌまたはＥｌｄｅｐｒｙｌ)、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤(ＣＯＭＴ)、例えばエンタカポン、タスマールまたはトルカポン、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｄ２受容体アンタゴニスト、ＤＡアゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、(例えば、α−シヌクレインに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)、キナーゼ阻害剤およびロイシンリッチリピートキナーゼ２(ＬＲＲＫ２)阻害剤を含む。さらなる薬剤は、例えば、シヌクレイン病の病理に関与することが知られている分子をターゲティングする治療剤、例えばＰＩＮＫ、ＰＡＲＫＩＮ、ＤＪ１、グルコセレブロシダーゼ(ＧＢＡ)および活性酸素種を標的とする薬剤を含む。
さらなる治療剤を、ここに記載する抗体と共に(例えば、同時にまたは連続的に)または別々に(例えば、数時間または数日離れて)投与し得る。
また含まれるのは、サンプルおよび対照サンプルと、ヒトα−シヌクレインに特異的に結合するモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を、抗体またはその一部とヒトα−シヌクレインの間で複合体の形成をさせる条件下接触させることを含む、サンプル中のヒトα−シヌクレイン抗原の存在を検出するまたはヒトα−シヌクレイン抗原の量を測定する方法である。次いで複合体の形成を検出し、ここで対照サンプルと比較したサンプルの複合体形成差異が、サンプル中のヒトα−シヌクレイン抗原の存在の指標である。ある実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体を使用して、ヒトα−シヌクレインを免疫親和性精製により精製し得る。他の実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体を使用して、生物学的サンプル(例えば、生検)のα−シヌクレインタンパク質の量を検出し得る。さらに他の実施態様において、ここに記載する抗α−シヌクレイン抗体をインビトロアッセイ(例えば、イムノアッセイ、例えばウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ)で使用して、α−シヌクレインタンパク質を検出し得る。
XV. 例示的実施態様
１. Α−シヌクレインに結合し、次の性質の１以上を示す、単離抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)マウスおよびラットα−シヌクレインに結合する；
(ｂ)ヒトβ−シヌクレインおよびヒトγ−シヌクレインに結合する；
(ｃ)α−シヌクレインオリゴマーに対してα−シヌクレインモノマーを超える親和性を有する；
(ｄ)α−シヌクレインオリゴマー誘導不溶性セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体の産生を阻害する；
(ｅ)ＰＦＦおよび／または脳にα−シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートからセリン−１２９リン酸化により特徴づけられる可溶性および不溶性α−シヌクレイン凝集体を産生する分子種を枯渇させる；
(ｆ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２３〜１２８位の全てまたは一部に結合する；
(ｇ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２５〜１２８位の全てまたは一部に結合する；
(ｈ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３９位の全てまたは一部に結合する；
(ｉ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１１９〜１２６位の全てまたは一部に結合する；および
(ｊ)ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３８位の全てまたは一部に結合する。
２. α−シヌクレインオリゴマーはＰＦＦである、実施態様１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
３. ＰＦＦが実施例３に記載のとおり製造される、実施態様２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
４. α−シヌクレインオリゴマーは可溶性α−シヌクレインオリゴマーである、実施態様１〜３の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
５. α−シヌクレインオリゴマーは不溶性α−シヌクレインオリゴマーである、実施態様１〜３の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
６. α−シヌクレインモノマーを超えるα−シヌクレインＰＦＦに対する大きな親和性が、発光ベースの結合アッセイ(例えば、実施例３に記載)で決定して、α−シヌクレインモノマー／α−シヌクレインＰＦＦ結合比を使用して測定される、実施態様１〜５の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
７. 抗体またはその抗原結合部分が１００以上のα−シヌクレインモノマー／α−シヌクレインＰＦＦ結合比を有する、実施態様６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
８. モノマー／ＰＦＦ結合比が５００以上である、実施態様７に記載の抗体またはその抗原結合部分。
９. モノマー／ＰＦＦ結合比が７００以上である、実施態様８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
１０. モノマー／ＰＦＦ結合比が１５００以上である、実施態様９に記載の抗体またはその抗原結合部分。
１１. モノマー／ＰＦＦ結合比が３０００以上である、実施態様１０に記載の抗体またはその抗原結合部分。
１２. モノマー／ＰＦＦ結合比が５０００以上である、実施態様１１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
１３. 抗体またはその抗原結合部分が、ＥＬＩＳＡにより測定してモノマーα−シヌクレインに１００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに２nM以下のＥＣ５０で結合する、先の実施態様の何れかにに記載の抗体またはその抗原結合部分。
１４. 抗体またはその抗原結合部分がモノマーα−シヌクレインに５００nM以上のＥＣ５０で結合し、ＰＦＦに０.５nM以下のＥＣ５０で結合する、実施態様１３に記載の抗体またはその抗原結合部分。
１５. 抗体またはその抗原結合部分が、実施例１０に記載のアッセイを使用して評価して０.１nM以下のＩＣ５０でＰＦＦ誘導α−シヌクレインセリン−１２９リン酸化を阻害する、先の実施態様の何れかにに記載の抗体またはその抗原結合部分。
１６. α−シヌクレインに特異的に結合し、次のものからなる群から選択される可変重鎖および可変軽鎖対である３個の可変重鎖ＣＤＲおよび３個の可変軽鎖ＣＤＲを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)配列番号８および９；
(ｂ)配列番号１８および１９；
(ｃ)配列番号２０および２１；
(ｄ)配列番号３１および３２；
(ｅ)配列番号３１および３３；
(ｆ)配列番号４３および４４；
(ｇ)配列番号５３および５４；
(ｈ)配列番号６３および６４；
(ｉ)配列番号７３および７４；
(ｊ)配列番号８３および８４；
(ｋ)配列番号９９および１００；
(ｌ)配列番号９９および１０１；
(ｍ)配列番号９９および１０２；および
(ｎ)配列番号１１３および１１４。
１７.
(ａ)それぞれ配列番号２〜４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号５〜７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｂ)それぞれ配列番号１２〜１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１５〜１７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｃ)それぞれ配列番号２２〜２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号２５〜２７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｄ)それぞれ配列番号２２〜２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号２８〜３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｅ)それぞれ配列番号３７〜３９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号４０〜４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｆ)それぞれ配列番号４７〜４９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号５０〜５２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｇ)それぞれ配列番号５７〜５９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号６０〜６２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｈ)それぞれ配列番号６７〜６９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号７０〜７２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｉ)それぞれ配列番号７７〜７９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号８０〜８２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｊ)それぞれ配列番号８７〜８９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号９０〜９２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｋ)それぞれ配列番号８７〜８９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号９３〜９５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；
(ｌ)それぞれ配列番号８７〜８９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号９６〜９８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または
(ｍ)それぞれ配列番号１０７〜１０９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１１０〜１１２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３
を含む、α−シヌクレインに結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
１８.α−シヌクレインに結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、重鎖可変領域が、配列番号８、１８、３１、４３、５３、６３、７３、８３、９９および１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
１９.α−シヌクレインに結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、軽鎖可変領域が、配列番号９、１９、３２、３３、４４、５４、６４、７４、８４、１００、１０１、１０２および１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
２０. α−シヌクレインに結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ａ)配列番号８および９；
(ｂ)配列番号１８および１９；
(ｃ)配列番号３１および３２；
(ｄ)配列番号３１および３３；
(ｅ)配列番号４３および４４；
(ｆ)配列番号５３および５４；
(ｇ)配列番号６３および６４；
(ｈ)配列番号７３および７４；
(ｉ)配列番号８３および８４；
(ｊ)配列番号９９および１００；
(ｋ)配列番号９９および１０１；
(ｌ)配列番号９９および１０２；および
(ｍ)配列番号１１３および１１４。
２１. 重鎖および軽鎖可変領域が(ａ)〜(ｍ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様２０に記載の抗体またはその抗原結合部分。
２２. α−シヌクレインに結合し、次のものからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
(ｎ)配列番号１０および１１、
(ｏ)配列番号２０および２１、
(ｐ)配列番号３４および３５、
(ｑ)配列番号３４および３６、
(ｒ)配列番号４５および４６、
(ｓ)配列番号５５および５６、
(ｔ)配列番号６５および６６、
(ｕ)配列番号７５および７６、
(ｖ)配列番号８５および８６、
(ｗ)配列番号１０３および１０４、
(ｘ)配列番号１０３および１０５、
(ｙ)配列番号１０３および１０６および
(ｚ)配列番号１１５および１１６。
２３. 抗体が、ペプチドマッピング(例えば、実施例１に記載)により決定して、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２３〜１２８の全てまたは一部位に結合する、先の実施態様の何れかにに記載の抗体またはその抗原結合部分。
２４. 抗体が、ペプチドマッピング(例えば、実施例１に記載)により決定して、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１２５〜１２８位の全てまたは一部位に結合する、実施態様２３に記載の抗体またはその抗原結合部分。
２５. 抗体が、ペプチドマッピング(例えば、実施例１に記載)により決定して、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３９位の全てまたは一部位に結合する、実施態様１〜２２の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
２６. 抗体が、ペプチドマッピング(例えば、実施例１に記載)により決定して、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１１９〜１２６位の全てまたは一部位に結合する、実施態様１〜２２の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
２７. 抗体が、ペプチドマッピング(例えば、実施例１に記載)により決定して、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)のアミノ酸１３０〜１３８位の全てまたは一部位に結合する、実施態様１〜２２の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
２８. 抗体がラットおよびマウスα−シヌクレインに結合する、先の実施態様の何れかにに記載の抗体またはその抗原結合部分。
２９. 抗体がヒトβ−シヌクレインおよびヒトγ−シヌクレインに結合する、先の実施態様の何れかにに記載の抗体またはその抗原結合部分。
３０. 抗体が、発光ベースの結合アッセイ(例えば、実施例３に記載)により決定して、α−シヌクレインモノマー／α−シヌクレインＰＦＦ結合比(モノマー：ＰＦＦ結合比)により評価してα−シヌクレインモノマーよりもα−シヌクレインＰＦＦに大きな親和性を有する、先の実施態様の何れかにに記載の抗体またはその抗原結合部分。
３１. モノマー：ＰＦＦ結合比が１００以上、５００以上、７００以上、１５００以上、３０００以上または５０００以上である、実施態様３０に記載の抗体またはその抗原結合部分。
３２. 実施態様２１に記載の抗体と同一エピトープに結合する、抗体またはその抗原結合部分。
３３. 実施態様２１に記載の抗体とヒトα−シヌクレインへの結合について競合する、抗体またはその抗原結合部分。
３４. 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントからなる群から選択される、先の実施態様の何れかにに記載の抗体またはその抗原結合部分。
３５. 抗体がＩｇＧ１抗体である、実施態様３４に記載の抗体またはその抗原結合部分。
３６. 抗体がエフェクター機能が減少しているかまたはないＦｃ領域を含む、先の実施態様の何れかにに記載の抗体またはその抗原結合部分。
３７. 抗体またはその抗原結合部分が次の変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２５７Ａを含むエフェクターレスＩｇＧ１ Ｆｃを含む、実施態様３６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
３８. 抗体またはその抗原結合部分がキメラ、ヒト化またはヒト抗体である、先の実施態様の何れかにに記載の抗体またはその抗原結合部分。
３９. 抗体がヒトでの免疫原性が低減されるように修飾されている、先の実施態様の何れかにに記載の抗体またはその抗原結合部分。
４０. 抗体がそれぞれ配列番号１８および１９に示す重鎖および軽鎖可変領域を含む、実施態様３９に記載の抗体またはその抗原結合部分。
４１. モノクローナル抗体である、先の実施態様の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
４２. 第二結合特異性を有する分子に連結された先の実施態様の何れかに記載の抗体を含む、二特異性分子。
４３. 第二結合特異性が脳への分子の輸送を増加させる、実施態様４２に記載の二特異性分子。
４４. 実施態様１〜４３の何れかに記載の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域またはその抗原結合部分または二特異性抗体をコードする、核酸。
４５. 実施態様４４に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
４６. 実施態様４５に記載の発現ベクターで形質転換されている、細胞。
４７. 部分に連結された実施態様１〜４３の何れかに記載の抗体または二特異性抗体を含む、免疫複合体。
４８. 部分が結合部分、標識部分、生物学的活性部分または治療剤である、実施態様４７に記載の免疫複合体。
４９. 実施態様１〜４３、４７および４８の何れかに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二特異性分子または免疫複合体および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
５０. 実施態様１〜４３、４７および４８の何れかに記載の抗体もしくはその抗原結合部分または二特異性分子または免疫複合体および使用指示を含む、キット。
５１. 実施態様４６に記載の細胞において抗体またはその抗原結合部分を発現させ、該細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離することを含む、抗α−シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分を製造する方法。
５２. 細胞における不溶性セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体の産生を阻害する方法であって、細胞と有効量の実施態様１〜４３、４７および４８の何れかに記載の抗体もしくは抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を接触させることを含む、方法。
５３. セリン−１２９のリン酸化がα−シヌクレインオリゴマーにより誘導される、実施態様５２に記載の方法。
５４. α−シヌクレインオリゴマーが予め形成されたα−シヌクレイン原線維である、実施態様５３に記載の方法。
５５. α−シヌクレインオリゴマーがシヌクレイン病を有する患者からの脳サンプル由来である、実施態様５３に記載の方法。
５６. 脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を処置する方法であって、該疾患を有する対象に有効量の実施態様１〜４３、４７および４８の何れかに記載の抗体もしくは抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を投与することを含む、方法。
５７. 脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患の重症度を軽減する方法であって、該疾患を有する対象に有効量の実施態様１〜４３、４７および４８の何れかに記載の抗体もしくは抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を投与することを含む、方法。
５８. 脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患の進行を遅延させる方法であって、該疾患を有する対象に有効量の実施態様１〜４３、４７および４８の何れかに記載の抗体もしくは抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を投与することを含む、方法。
５９. 脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患の発症のリスクを低減する方法であって、該疾患を発症するリスクのある対象に有効量の実施態様１〜４３、４７および４８の何れかに記載の抗体もしくは抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を投与することを含む、方法。
６０. 脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患の発症を遅延する方法であって、該疾患を発症するリスクのある対象に有効量の実施態様１〜４３、４７および４８の何れかに記載の抗体もしくは抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を投与することを含む、方法。
６１. 対象におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を診断する方法であって：
(ａ)対象からのサンプルと実施態様１〜４３、４７および４８の何れかに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を、抗体−抗原複合体が形成されるように接触させ；
(ｂ)形成された複合体の量を測定し；そして
(ｃ)サンプルにおける複合体の量と対照における量を比較することを含み、ここで、対照と比較してサンプルにおける複合体のレベルの上昇は、該対象がレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を有することを示す、方法。
６２. サンプルが脳脊髄液、脳組織抽出物、尿または血液である、実施態様６１に記載の方法。
６３. 疾患がパーキンソン病、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症、レビー小体病、多系統萎縮症または純粋自律神経失調症である、実施態様５６〜６２の何れかに記載の方法。
６４. １以上の付加的治療剤を投与することを含む、実施態様５６〜６３の何れかに記載の方法。
６５. サンプルと実施態様１〜４３、４７および４８の何れかに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を、該抗体またはその抗原結合部分とα−シヌクレインの間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させ、該複合体の形成を検出することを含む、サンプルにおけるα−シヌクレインを検出する方法。
本発明を、次の実施例によりさらに説明し、これはさらに限定するものと解釈してはならない。本出願を通して引用する全ての図および全ての引用文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願は、明示的に引用により本明細書に包含させる。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ０９／０４５９５７、ＷＯ０９／０７３５３３、ＷＯ０９／０７３５４６、ＷＯ０９／０５４８６３およびＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７２９１８および米国特許公開２０１１／０１５０８９２の開示を引用により本明細書に包含させる。
下記実施例で参照する市販試薬は、特に断らない限り製造業者の指示に従い使用した。特に断らない限り、本発明は、上におよび次の教科書に記載のもののような組み換えＤＮＡテクノロジーの標準法を使用する：Sambrook et al., supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboラットory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991。
実施例１：抗アルファ−シヌクレイン(抗αＳｙｎ)抗体の取得
この実施例は、αＳｙｎモノマーよりも、ヒト組み換え野生型αＳｙｎからなる予め形成された原線維(ＰＦＦ)に優先的に結合する完全ヒト抗αＳｙｎモノクローナル抗体(ｍＡｂ)の取得を記載する。
ヒト抗αＳｙｎモノクローナル抗体は、ＨｕＭＡｂ(登録商標)遺伝子導入マウスのＨＣｏ４２系統(「ＨｕＭＡｂ」はMedarex, Inc., Princeton, New Jerseyの商標である)およびＫＭマウス(ＫＭマウス(登録商標)系統はＰＣＴ公報ＷＯ０２／４３４７８に記載のとおりＳＣ２０導入染色体を有する)で取得した。
組み換えヒトαＳｙｎ ＷＴまたはαＳｙｎ Ａ５３Ｔ−ＰＦＦ変異体タンパク質および架橋αＳｙｎ ＷＴまたはＡ５３Ｔ ＰＦＦを、組み換えヒト遺伝子導入マウスの免疫化に使用した。融合５４４８に使用したマウスは、マウスあたりリビアジュバント中２５μgのαＳｙｎ Ａ５３Ｔ−ＰＦＦの腹腔内(ＩＰ)および皮下(ＳＣ)注射により免疫化した。融合５４５０に使用したＨＣｏ４２マウスは、マウスあたり２５μgのαＳｙｎ ＷＴ−ＰＦＦ、αＳｙｎ Ａ５３Ｔ−ＰＦＦ、αＳｙｎ ＷＴ−ＰＦＦ架橋およびαＳｙｎ Ａ５３Ｔ−ＰＦＦ架橋の混合物(１：１：１：１)でＩＰ＋Ｓｃ＋Ｈｏｃｋで免疫化した。保存ＰＦＦ抗原混合物を、２００μLの各１mg／mL 保存ＰＦＦ(ＷＴ、Ａ５３Ｔおよび架橋ＷＴおよびＡ５３Ｔ)の混合により製造した。抗原をリビアジュバントに懸濁した。融合およびハイブリドーマ取得のために選択したマウスは、融合３日前、ダルベッコリン酸緩衝化食塩水(ＤＰＢＳ)中の抗原でさらなる静脈内／腹腔内(IV／ＩＰ)ブーストを受けた。
脾細胞またはリンパ節とＰ３ｘ６３Ａｇ８.６５３細胞の融合後、融合プレートを、ヒトガンマ／ヒトカッパｍＡｂの存在について試験することにより、抗原特異的抗体をスクリーニングした。融合プレートからの細胞を、αＳｙｎ ＰＦＦまたは天然αＳｙｎモノマーへの結合特異性について試験した。機能的スクリーニングから選択したαＳｙｎ ＰＦＦ陽性ハイブリドーマを、単一細胞サブクローニングによりサブクローン化し、細胞株安定性およびハイブリドーマ単クローン性を確実にした。各サブクローンを、再び抗原特異的結合(すなわち、αＳｙｎ ＰＦＦ結合)についてＥＬＩＳＡで試験し、次のサブクローン：１１Ｈ１１−１、１１Ｈ１１−２、１５Ａ５、７Ａ１０、３６Ａ３、４４Ｂ１１および２１Ａ３を取得した。アイソタイプ分析は、全６抗体がヒトＩｇＧ１／カッパであることをＥＬＩＳＡにより確認した。重鎖および軽鎖、重鎖および軽鎖可変領域および重鎖および軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸およびヌクレオチド配列は表２２に提供する。
７Ａ１０の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列８および９からなる。１１Ｈ１１−１の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列２８および２９からなる。１１Ｈ１１−２の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列２８および２９からなる。１５Ａ５の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列３８および３９からなる。２１Ａ３の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列４８および４９からなる。３６Ａ３の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列５８および５９からなる。４４Ｂ１１の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列６８および６９からなる。２Ｅ２の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列７８および７９からなる。２３Ｈ８−１の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列９４および９５からなる。２３Ｈ８−２の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列９４および９６からなる。２３Ｈ８−３の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列９４および９７からなる。１Ｅ８の重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれアミノ酸配列１０６および１０７からなる。
上記抗αＳｙｎ抗体のエフェクター無機能バージョンも取得した。ここで使用するｈＩｇＧ１ｆは、配列番号１１７に示すアミノ酸配列を有するＩｇＧ１のアロタイプをいい、ｈＩｇＧ１.３ｆは、Ｆｃガンマ受容体結合およびエフェクター機能を欠くｈＩｇＧ１ｆ(Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ)の三重変異体バージョンをいう。ｈＩｇＧ１.３ｆは、配列番号１１９に示すアミノ酸配列を示す。
実施例２：抗αＳｙｎ抗体のエピトープマッピング
実施例１に記載する抗αＳｙｎ抗体のエピトープ結合部位を、一連の重複αＳｙｎペプチドを使用して決定した。
ヒトαＳｙｎ配列の１０アミノ酸の一連の重複ペプチドを、Ｎ末端ビオチン基およびＰＥＧ４リンカーおよびＣ末端ＣＯＮＨ２を伴い取得した(表１)。ペプチドを１mg／mlでＤＰＢＳに可溶化した。マッピング試験のため、１００μLのＤＰＢＳ中０.２５μg／ml α−シヌクレインペプチドを、ニュートラアビジン被覆高容量９６ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)に加え、ＲＴで２時間(または一夜、４℃で)インキュベートした。プレートを約３００μLの洗浄緩衝液(ＤＰＢＳ中０.０５％Ｔｗｅｅｎ)で３回洗浄した。次いでプレートを１５０μlのＤＰＢＳ中３％ＢＳＡ(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で、ＲＴで約２時間(または一夜、４℃)遮断した。サンプル緩衝液(５０ml緩衝液中０.１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ｄＰＢＳ、２ペレットのプロテアーゼ阻害剤(Roche complete, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO))で希釈した１００μLの試験サンプルを、プレート上でＲＴで２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した。ＰＢＳＴＢ(１％ＢＳＡ／０.２％Ｔｗｅｅｎ／ＤＰＢＳ)で１：１０００希釈した１００μLの二次抗体を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを各洗浄５〜１０分で３回洗浄した。１００μLのＡＰ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を加え、ＲＴで３０分展開させた。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader, PerkinElmer, Waltham, MA)で読んだ。プレートをアッセイ中一定振盪下(Titer plate shaker)に置いた。使用した二次抗体はアルカリホスファターゼ−affinipureロバ抗ヒトＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、アルカリホスファターゼ−affinipureロバ抗ウサギＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、アルカリホスファターゼ−affinipureロバ抗マウスＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を含んだ。全二次抗体を５０％グリセロール最終濃度に希釈した。
最初の実験は、全抗体がαＳｙｎのＣ末端領域内に位置するエピトープを認識したことを決定した。表１に示す重複ペプチドを、各抗体のエピトープ結合部位のさらなる精密化に使用した。
ａ ヒトαＳｙｎ配列の１０アミノ酸を有する重複ペプチドをＮ末端ビオチン基およびＰＥＧ４リンカーおよびＣ末端ＣＯＮＨ２を伴い取得した。
エピトープマッピングの結果を図１に示す。データは、７Ａ１０、２１Ａ３、１５Ａ５、３６Ａ３および１Ｅ８がアミノ酸配列ＥＡＹＥＭＰ(配列番号１２１)に対応するアミノ酸１２３〜１２８内と結合し、１１Ｈ１１−１がアミノ酸配列ＹＥＭＰ(配列番号１２２)に対応するアミノ酸１２５〜１２８内と結合し、４４Ｂ１１がアミノ酸配列ＥＥＧＹＱ色素ＰＥ(配列番号１２４)に対応するアミノ酸１３０〜１３９内と結合し、２Ｅ２がアミノ酸配列ＤＰＤＮＥＡＹＥ(配列番号１２５)；に対応するアミノ酸１１９〜１２６内と結合し、そして２３Ｈ８がアミノ酸配列ＥＥＧＹＱ色素Ｐ(配列番号１２３)に対応するアミノ酸１３０〜１３８内と結合することを示す。
実施例３：抗αＳｙｎ抗体のαＳｙｎモノマーを超えるαＳｙｎ−ＰＦＦへの選択性
この実施例は、抗αＳｙｎ抗体が、αＳｙｎモノマーを超えてαＳｙｎ−ＰＦＦに優先的に結合することを示す。
組み換え野生型ヒトαＳｙｎ(rPeptide, Bogart, GA)およびＡ５３Ｔ変異を含むヒトαＳｙｎ(rPeptide, Bogart, GA)を、２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００mM ＮａＣｌ、ＰＨ７.４に１mg／mlで再構成した。ＰＦＦを標準プロトコールを使用して調製した(Luk et al., PNAS 2007;106:20051-6)。簡潔には、モノマーを、２ml セーフロックエッペンドルフチューブ(約１ml／バイアル)中、３７℃で一定振盪下(Titer plate shaker)４日間インキュベートし、次いで１００,０００ｇでＲＴで２０分間遠心分離した。ペレットを、１mg／mlの最終ＰＦＦ濃度でＰＢＳに再懸濁した。
αＳｙｎの線維化をチオフラビンＴ結合アッセイ、変性(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)および非変性(天然)ゲル電気泳動法およびサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ−ＨＰＬＣ)でモニターした。チオフラビン−Ｔアッセイについて、サンプルをＰＢＳで０.５mg／mlに希釈し、等体積の２５μM チオフラビン−Ｔに加えた。サンプルを、次いでそれぞれ４８５nmおよび５３５nmの励起および放出波長のEnvision multilabel plate reader(PerkinElmer, Waltham, MA)を使用して測定した。総タンパク質レベルをMicro BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)およびインペリアルタンパク質染色アッセイ(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)両者で評価した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析について、ＮｕＰＡＧＥサンプル還元剤(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)中のＰＦＦサンプルをヒートブロック(７０℃)で１０分間インキュベートし、２００Ｖの一定電圧でＭＥＳ ＳＤＳランニング緩衝液(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)と共に４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１μg／１０μl／レーン)で分離し、次いで一定電圧５０Ｖで、１.５時間、１０％メタノール含有Ｔｒｉｓ／グリシン緩衝液(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を使用してニトロセルロース膜(０.４５μm孔サイズ、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)に移した。天然ＰＡＧＥについて、ＰＦＦサンプルを、一定電圧１５０Ｖで天然ＰＡＧＥランニング緩衝液(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)と共に３〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲル(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を使用して天然ＰＡＧＥ(１μg／１０μl／レーン)により分離し、次いで一定電圧５０Ｖで、１.５時間、ＮｕＰＡＧＥ移行緩衝液(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を使用して、ＰＶＤＦ膜(０.４５μm孔サイズ、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)に移した。ＰＶＤＦ膜をメタノールで３０秒間、ｄＨ２Ｏで２分間および移行緩衝液で１０分間前処理した。膜を、０.１％Ｔｗｅｅｎ／ＴＢＳ中５％脱脂粉乳(Thermo Fisher Scientific, Waltham)でＲＴで２時間遮断し、次いで、１％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ／ＴＢＳで１：１０００希釈した一次抗体４Ｂ１２(BioLegend, San Diego, CA)と４℃で一夜インキュベートした。次いで膜を０.１％Ｔｗｅｅｎ／ＴＢＳで３回洗浄し(各洗浄５〜１０分)、次いで１％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ／ＴＢＳで１：１０,０００希釈した抗マウスＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA、ペルオキシダーゼコンジュゲート親和性精製Ｆａｂ２)とＲＴで１時間インキュベートした。次いで膜を上記のとおり３回洗浄し、次いでSuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)と５分間インキュベートした。GE Amersham imager 600を使用して検出した。MagicMarkTM XP Western Protein Standard(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)およびSeeBlue plus 2(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)をＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用した。NativeMark Unstained Protein Standard(Invitrogen)を天然ゲルに使用した。洗浄緩衝液(ＴＢＳＴ)は、Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水中０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含んだ。
結合アッセイ、９６ウェルプレート(高結合マイクロプレート)を、ＤＰＢＳ中１００μLの１μg／ml αＳｙｎ ＷＴ ＰＦＦでＲＴで２時間(または一夜、４℃で)被覆した。プレートを約３００μLの洗浄緩衝液(ＤＰＢＳ中０.０５％Ｔｗｅｅｎ)で３回洗浄した。プレートを１５０μlの３％ＢＳＡ／ＤＰＢＳでＲＴで２時間(または一夜、４℃で)遮断した。ＰＦＦ(２μg／mlから開始)およびα−ｓｙｎ ＷＴモノマー(２０μg／mlから開始)の３倍連続希釈をサンプル緩衝液(５０ml緩衝液中０.１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＤＰＢＳ、２ペレットのプロテアーゼ阻害剤(Roche complete, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO))で調製した。抗体インキュベーションのために、等体積の２倍アッセイ濃度のαＳｙｎ ＰＦＦまたはモノマーを、ＢＤファルコン低結合プレート中２倍アッセイ抗体の濃度と混合し、ＲＴで約２時間インキュベートした。１００μLの抗体とＰＦＦまたはモノマーの混合物をＰＦＦ被覆プレートに加え、ＲＴで１０分インキュベートした。プレートを３回洗浄した。ＰＢＳＴＢ(１％ＢＳＡ／０.２％Ｔｗｅｅｎ／ｄＰＢＳ)で１：１０００希釈した１００μLのロバ抗ヒトＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA、５０％グリセロール含有)を加え、プレートをＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄あたり５〜１０分で３回洗浄した。１００μLのＡＰ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を加え、ＲＴで３０分展開させた。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader, PerkinElmer, Waltham, MA)で読んだ。ＰＦＦを、コーティングまたは個体との混合前に、１５回、１秒パルスで超音波処理した。プレートをアッセイ中一定振盪下(Titer plate shaker)に置いた。
図２に示すとおり、抗αＳｙｎ抗体を、αＳｙｎモノマーおよびＷＴまたはＡ５３Ｔ αＳｙｎ ＰＦＦへの結合能について評価した。対照抗体１のデータも図３に示す。ＷＴ ＰＦＦおよびＡ５３Ｔ ＰＦＦへの同等な結合が試験した全抗体で観察された。対照抗体抗体１および抗体２以外、全６抗αＳｙｎ抗体がαＳｙｎモノマーを超えてαＳｙｎに優先的に結合し、少なくとも５００のＭ／Ｐ比であった。結合データの概要を表２に示す。

ａ Ｍ／Ｐ＝モノマー／ＰＦＦ結合比(比が低いほど、ＰＦＦへの高い優先性を意味する)
ｂ 抗体１および抗体２は対照抗体である
実施例４：抗αＳｙｎ抗体の脱免疫化
この実施例は、抗αＳｙｎ抗体のサブセットの脱免疫化がαＳｙｎモノマーおよびαＳｙｎ ＰＦＦへの結合に有する効果を決定する。
ヒト化における免疫原性ホットスポットの可能性を排除するために、７Ａ１０の重鎖および軽鎖配列を免疫原性について分析した。世界人口での２７の一般的に見られるＨＬＡのアレルへの結合および非生殖系列セグメントの同定のための７Ａ１０の分析を、免疫原性ホットスポットの可能性を排除するために実施した。
同族ペプチドのＭＨＣ−IIアレル(樹状細胞による生物学的物質のエンドサイトーシスおよび分解の副産物として形成)への結合と、その後の樹状細胞の表面への提示は、適応免疫応答に重要である。ＭＨＣ−IIアレルへの結合に加えて、しかしながら、提示ペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞受容体に結合し(Ｔ細胞認識)、そうして活性化およびＴ細胞伝播に至るために、ＣＤ４＋Ｔ細胞受容体に非常在性(非自己)ではければならない。これらの効果をコンピューター的に模倣し、多様なドナーの効果をモデル化するために、抗体をまずＮ末端から開始し、１度に１アミノ酸で系統的にＣ末端に向かい、１５量体ペプチドに破壊する。得られた１５量体ペプチドの各々を、(ｉ)世界人口で２７の一般的に見られるＨＬＡの各々への結合および(ii)ヒト免疫グロブリン生殖系列配列への完全配列マッチについて評価する。完全生殖系列マッチの場合、１５量体ペプチドは「自己」と見なされ、それ故に抗原性ではないと考えられる。他方で、「非自己」(パーフェクト生殖系列マッチなし)の場合、２７アレルの一部と十分な親和性で結合するならば、潜在的に抗原性と見なされる。
ペプチド／ＭＨＣII結合親和性予測を、ＩＥＤＢ(免疫エピトープデータベース)分析リソースコンセンサスツールを使用して行った。予想される親和性を、５つの異なるペプチドＭＨＣ−II結合予測方法の一致に基づくパーセンタイル順位として報告した。
７Ａ１０の重鎖および軽鎖の免疫原性分析を図４に示す。分析結果は、軽鎖(ＶＫ)が大部分非免疫原性と予想され、唯一のホットスポットがエピトープ結合に一般に関与するＣＤＲ３に存在することを示す。重鎖(ＶＨ)は、大きな領域、すなわち、ＣＤＲ２(残基４９〜６５)およびＦＷ３−ＣＤＲ３(残基９０〜９８)に広がるホットスポットを示す、２領域を有する。８未満のストレッチ長のホットスポットを無視して、ＶＨ鎖における２領域のみ(４９〜６５、９０〜９８)が変異誘導を介してリスク回避のために考慮された。
図４の各アミノ酸の下の数字は、そのアミノ酸を中心とする１５量体ペプチドに結合するアレルの割合を示す。例えば、例えば、７Ａ１０＿ＶＨのＹ５２での「５」は、Ｙ５２を中心とする１５量体ペプチド、すなわち、LEWIGYIYYSGRTKYであり、(ｉ)このペプチドはヒト生殖系列マッチを有しない(それ故に非自己である)および(ii)２７アレルの５０〜６０％がこのペプチドに高結合親和性を示すことを示す。数字は、グレースケールで明(免疫原性である可能性が低い)から暗(免疫原性ホットスポットである可能性が最も高い)の色で割り当てる。３つの太い矢印は、変異体選択のための選択を示す：Ｒ５６Ｓ、Ｋ５８ＮおよびＴ９３Ａ。
ヒト免疫原性リスクを、７Ａ１０および脱免疫化７Ａ１０−Ｔ９３Ａについて、インビトロヒトＰＢＭＣ増殖アッセイを使用してアッセイした。アバスチンおよびαＩＬ−２１Ｒ ｍＡｂを、その臨床的免疫原性がインビトロ免疫原性アッセイ結果と臨床的に創刊するため、陰性および陽性アッセイ対照として使用した。健常ボランティアからのＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ(GE Healthcare)勾配遠心分離により単離し、ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)クラスIIオリゴヌクレオチドプローブ(ProImmune)とのポリメラーゼ連鎖反応増幅およびハイブリダイゼーションを利用して特徴づけした。世界人口頻度と密接にマッチするＨＬＡクラスIIタイプからなる一団の４０のＰＢＭＣドナーを各アッセイランに使用した。ＰＢＭＣをＣＦＳＥ(カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、Invitrogen)で標識して増殖をモニターし、１０％ヒトＡＢ血清(Bioreclamation)、非必須アミノ酸(Gibco)およびペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco)を含むＲＰＭＩ(Lonza)中、２００,０００細胞／ウェルで６複写物で９６ウェルプレートに播種した。αシヌクレイン抗体および対照タンパク質を、１μMのＰＢＭＣと７日間培養し、その後培地を洗い流し、細胞をＡＰＣ(アロフィコシアニン、BD Biosciences)にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ４ ｍＡｂで標識した。洗浄工程で非結合抗ＣＤ４ ｍＡｂ除去後、残存細胞をＰＢＳ中３.７％ホルマリン(Sigma)で固定し、フローサイトメトリーにより分析して、増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを決定した。ドナーは、培地のみでの増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージより、プラス２標準偏差で特定の抗体に対する増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージが大きいとき、陽性と見なす。データを、陽性増殖シグナルを示す４０ドナーのパーセンテージとして示す。
これらの抗体とのインキュベーション後有意なＣＤ４＋Ｔ細胞増殖応答を示すドナーのパーセンテージを図５に示す。７Ａ１０は、４０のＰＢＭＣドナー中２１(５２.５％)で増殖応答を生じ、７Ａ１０−Ｔ９３Ａは４０ドナー中５(１２.５％)で増殖応答を示した。
実施例５：脱免疫化抗αＳｙｎ抗体のαＳｙｎモノマーおよびαＳｙｎ ＰＦＦへの結合
この実施例は、実施例４に記載する７Ａ１０の脱免疫化バージョン、ならびに２１Ａ３の脱免疫化バージョン、すなわち、２１Ａ３−Ｖ８２ＬのαＳｙｎモノマーおよびαＳｙｎ ＰＦＦへの結合の、実施例３に記載するＥＬＩＳＡによる評価を示す。
表３に示すとおり、７Ａ１０−Ｔ９３Ａおよび２１Ａ３−Ｖ８２Ｌ復帰変異は、親抗体で測定された能力の２倍以内のＰＦＦ結合能を示した；モノマー結合値は、これらの比較的弱い能力のために正確な濃度−応答曲線を作成するのが困難であったため、より可変性であった。Ｋ５８Ｙ−Ｔ９３Ａ復帰変異は、７Ａ１０親と比較してＰＦＦ結合が＞１０倍弱く、一方Ｒ５６Ｓ−Ｔ９３ＡおよびＲ５６Ｓ−Ｋ５８Ｎ−Ｔ９３ＡのＰＦＦ結合能は７Ａ１０の２×以内であった。


ａ 示すデータは示すＦｃ不活性ヒトアイソタイプＩｇＧ１.３についてである
ｂ 許容される対照シグナル検出に必要な抗体の濃度
実施例６：ラット、マウスおよびヒトαＳｙｎとの抗αＳｙｎ抗体の異種間反応性
種交差反応性を評価するために、抗αＳｙｎ抗体を、ラット、マウスおよびヒトαＳｙｎのアミノ酸１１１〜１４０(表４)を表すペプチドへの結合について試験した。１２１〜１２２位でαＳｙｎ配列はヒト、ラットおよびマウスで異なる。結合アッセイは、実施例３に記載のとおり実施した。
＊マウス１１１〜１４０(配列番号１５６)、ラット１１１〜１４０(配列番号１５７)、ヒト１１１〜１４０(配列番号１５８)
抗αＳｙｎ抗体は、対応するヒトペプチドと比較して、ラットおよびマウスαＳｙｎ １１１〜１４０ペプチドに同等な結合を示した(図６)。ペプチド結合結果の概要を表５に示す。全体として、抗αＳｙｎ抗体は、対応するヒトペプチドと比較して、齧歯類１１１〜１４０ペプチドに２〜３倍弱い結合能を示した。
実施例７：抗αＳｙｎ抗体とヒトαＳｙｎ、βＳｙｎおよびγＳｙｎの交差反応性
この実施例において、抗αＳｙｎ抗体を、実施例３に記載するＥＬＩＳＡによりヒトβＳｙｎおよびヒトγＳｙｎへの結合および交差反応性について試験した。
図７に示すとおり、抗体はヒトαＳｙｎ、βＳｙｎまたはγＳｙｎを区別しなかった。ＰＦＦへの結合を陽性対照として包含させた。
実施例８：抗αＳｙｎ抗体の生物物理学的特徴づけ
この実施例は、種々の方法を使用する抗αＳｙｎ抗体のｆ生物物理学的性質の特徴づけを記載する。熱的安定性、分子量、ｐＩ、疎水性分析の結果を表６に要約する。
示差走査熱量測定(ＤＳＣ)のために、サンプルを、鋳型で６０℃／時間で１mg／ml抗体で上方に走査した。表６に示すとおり、全７Ａ１０抗体は好都合な折り畳み安定性を示した。
表６に示す全３つの７Ａ１０抗体の同一性は、インタクト質量分析(ＭＳ)分析により評価した。分析は、ACQUITY UPLC/Waters Synapt G2 Mass Spectrometerを使用した。サンプルを１mg／mLのＤＴＴ(１００mM)で還元した。ＵＰＬＣ／ＭＳ条件：１μgサンプル注入をＢＥＨ Ｃ４ ＲＰカラム、２.１×１５０mm、３００Å、１.７mm粒子に、６０℃、２０分勾配：１０％〜３８％(移動相Ｂ)を１０分、ＬＣ流速２００μL／分、陽ＭＳイオンモード。この方法を同様にグリコシル化プロファイル分析に使用した。
全３つの７Ａ１０抗体の同一性を、測定質量とアミノ酸配列から理論的に予想される質量の一致に基づき、インタクト質量分析(ＭＳ)分析により確認した。さらに、グリコシル化プロファイルを決定し、ｍＡｂがＮ２９７でグリコシル化されるのが典型的であると判明した。
次に、電荷均一性を、次の条件を用いてｉＣＩＥＦにより測定した：ProteinSimple iCE3装置；１分間１５００Ｖプレフォーカス、１０分間３０００Ｖフォーカス、サンプルラン０.２mg／mLで０.３５％メチルセルロース、２.０Ｍ 尿素、１％ｖ／ｖ ファルマライト５−８および３％ｖ／ｖ ファルマライト８−１０.５中。ｐＩマーカー５.８および１０.１０。表６は、約９の測定ｐＩ値と主ピークとして８４〜８７％、１１〜１３％酸性バリアントおよび残りが塩基性であることを示す。
抗体の均一性を、次の条件を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)によってもプローブした：Tosoh TSKgel Butyl NPRカラム、移動相Ａ：０.１Ｍ リン酸ナトリウムｐＨ７.０、２Ｍ硫酸アンモニウム、移動相Ｂ：０.１Ｍ リン酸ナトリウムｐＨ７.０、流速：１.０mL／分。表６に示すとおり、全３抗体は、１００％を主ピークとして示した。
抗体が凝集するかまたはトランケートされるかを評価するために、分析的ＳＥＣを次の条件で実施した：Shodex K403-4Fカラム、緩衝液＝１００mM リン酸ナトリウム１５０mM 塩化ナトリウム、ｐＨ７.３、流速＝０.３mL／分。表６に示すとおり、７Ａ１０の全バージョンは、検出可能ＨＭＷ種を示さなかった。
７Ａ１０−ＩｇＧ１ｆ、７Ａ１０−ＩｇＧ１.３ｆおよび７Ａ１０−Ｔ９３Ａ−ＩｇＧ１.３ｆの安定性も、高濃度および高温を含む強制安定性条件下試験した。抗体を、２０mMヒスチジン、２５０mM スクロース、ｐＨ６.０中１００mg／mlまで濃縮し、４週間、４℃で保存した。次いで抗体をＨＭＷまたはＬＭＷ種の増加について評価した。表７に示すとおり、何れのタイプの種もほとんど増加がなく、７Ａ１０は極めて好都合な濃縮可能性状を示す。
抗体をまた１０mg／mlの最終抗体濃度で同一ヒスチジン緩衝液に透析し、４０℃で４週間インキュベートして、あらゆる潜在的化学的または物理的分解をさせた。表７に示すとおり、試験した３つの７Ａ１０抗体の何れもＨＭＷ種増加を示さなかった。少量のＬＭＷ種(２.５〜５％)が出現した。
抗体の電荷プロファイルもＣＩＥＦにより測定した。抗体は、大部分主ピーク、酸性種が次に大きな集団および塩基性が最小の典型的分配を示した。４０℃で４週間暴露後のこれらの荷電種の比率の変化も抗体に典型的であった。

実施例９：抗αＳｙｎ抗体の予め形成されたαＳｙｎ原線維への結合アビディティー
この実施例は、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)を使用する７Ａ１０のαＳｙｎ結合行動を記載する。
図８は、表面に捕捉した抗体および野生型モノマーαＳｙｎの溶液中の結合行動を示す。この形式は、単価親和性の測定を可能とする。野生型αＳｙｎは極めて低くかつ弱い結合を示す。対照的に、ＰＦＦを溶液検体として試験したとき、αＳｙｎのはるかに大きな質量が結合することが観察された。これは、多価ＰＦＦの二価アビディティーによる堅固さの増加に一致する。対照抗ヒトαＳｙｎ抗体１も試験した。図８に示すとおり、抗体１は、モノマーおよびＰＦＦ αＳｙｎに類似の会合速度および解離速度で結合し、この抗体との二価性／アビディティーによる検出可能な結合増強はないことが示唆された。
次に、ＳＰＲアッセイの形式を、結合アビディティーの推定を容易にするために促進した。ＰＦＦは多量体であり、７Ａ１０は通常の二価モノクローナル抗体であることに注意すべきである。それ故に、結合データは、アビディティー効果による結合親和性の増強を反映する(図８参照)。
図９に示すとおり、７Ａ１０および７Ａ１０−Ｔ９３Ａは、表面に固定化したＰＦＦに同等なアビディティーで結合する(７Ａ１０：ｋａ(１／Ｍｓ)：５.８１１Ｅ＋７、ｋｄ(１／ｓ)：０.００９８３４、ＫＤ：１.６９２Ｅ−１０Ｍ；７Ａ１０−Ｔ９３Ａ：ｋａ(１／Ｍｓ)：８.９４６Ｅ＋７、ｋｄ(１／ｓ)：０.０３８７３、ＫＤ：４.３２９Ｅ−１０Ｍ)。両者の会合動力学は極めて迅速であることが判明した。それにも関わらず、２つのデータセットを、このアッセイ形式でアビディティーに識別可能な差異があるか否かを決定するために、１：１結合モデルんい対して可能な限り厳密に分析した。カーブフィッティングに基づき、抗体は、表面に固定したＰＦＦに４倍以内であるアビディティーで結合するように見える。
実施例１０：インビトロでの抗αＳｙｎ抗体による不溶性の凝集αＳｙｎの誘導遮断
この実施例は、インビトロで、ＰＦＦまたはＭＳＡ脳ライセートにより誘導されるαＳｙｎの細胞内、界面活性剤不溶性、リン酸化(ｐＳ１２９)凝集体の産生を、抗αＳｙｎ抗体が遮断する能力を記載する。
αＳｙｎの細胞内、界面活性剤不溶性、リン酸化(ｐＳ１２９)凝集体は、培養細胞でＰＦＦまたはＭＳＡ脳ライセートでの処理後誘導され得る(Prusiner et al., PNAS 2015:112:E5308-17; Luk et al., PNAS 2007;106:20051-6)。類似の系が、ヒトＡ５３Ｔ αＳｙｎを過発現するラット海馬神経細胞を使用し、細胞をＰＦＦまたはＭＳＡ脳ライセートサンプルに１１日間曝した後、不溶性ｐＳ１２９ αＳｙｎの誘導を測定することにより開発された。
方法
ａ. ＰＦＦの調製および線維化の分析
ＰＦＦを、実施例３に記載する方法を使用して調製し、分析した。
ｂ. ヒト脳ライセートの調製
皮質脳サンプルを、Banner Health Research Institute(Sun City, AZ)から得た。患者１２−１８、０１−０３および０４−５１からのＭＳＡ脳組織を免疫枯渇実験に使用した。脳サンプルを、濾過ＰＢＳ(１ml ＰＢＳ／１００mg 組織湿重量)中、KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter(出力４０、チューン５０)で２×１０秒間超音波処理した。サンプルを２ml エッペンドルフチューブに入れ、チューブを超音波処理の間湿氷上に維持した。脳ライセートを、３,０００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上清アリコートを液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。αＳｙｎ ＥＬＩＳＡ(総＆ｐＳ１２９)を含むＱＣアッセイを実施した。高速回転ペレットを単離するために、ＰＢＳ中１００mg／mlで先に調製した脳ホモジネートを氷冷ＰＢＳで３３.３mg／mlに３倍希釈し、その後１００,０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。上清を除去し、廃棄した。ペレットを、出発サンプルと同一体積の氷冷ＰＢＳに再懸濁した。
ｃ. 初代細胞培養単離
初代ラット海馬神経細胞培養物を、製造業者の指示に従い(Worthington Biochemical)Papain Dissociation Systemを使用して、胎齢１９日目(Ｅ１９)に約７リットルから毎週調製した。ラット海馬細胞を、、１×Ｂ−２７(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)を添加したNeural Basal Medium(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)および０.５mM ＧｌｕｔａＭａｘ(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)を含む神経細胞培養培地中３０,０００／ウェルでＰＤＬ被覆９６ウェルＢＤ造影プレート(約１６プレート／週)に播種した。
ｄ. 免疫沈降
予め調製した脳ホモジネート(１００mg／ml)を、完全Neurobasal Medium(ＮＢＭ)(ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＧｌｕｔａｍａｘおよびＢ−２７サプリメント含有Neurobasal Medium)(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)で１５０倍希釈した。シヌクレイン抗体の濃度応答関数を、抗体の試験濃度を希釈脳ホモジネートに添加することにより試験した。サンプルを、４℃で２時間、回転インキュベーションでインキュベートし、その後洗浄かつ遮断したプロテインＡ／Ｇアガロースビーズスラリーを１：１０希釈でサンプルに加え、その後、一夜、４℃で回転インキュベーションでインキュベーションした。プロテインＡ／Ｇアガロースビーズ(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)は、ＰＢＳ＋０.０５％ｔｗｅｅｎ−２０で１回、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで２時間、４℃でＰＢＳ＋１％ＢＳＡで遮断した；各工程２ビーズ体積；最終ビーズサンプルスラリーは、ＰＢＳ：ビーズペレット１：１であった。インキュベーション後、サンプルを１５００ｇで２分間遠心分離し、ビーズをペレット化させた。枯渇上清を除去し、免疫蛍光アッセイでの処理に使用した。
ｅ. 免疫蛍光アッセイ
インビトロ日(ＤＩＶ)４日目、ラット海馬神経細胞を、Ａ５３Ｔ変異を担持するヒトαＳｙｎについてのｃＤＮＡを含むアデノ随伴ウイルスベクター、ＡＡＶ１(GeneDetect, Bradenton, Florida)で３,０００のＭＯＩで形質導入した。ＤＩＶ７日目細胞を試験サンプルで処理した(６ウェル／処理)。全処理を、半培地交換により行った。各プレートは陰性対照(処理条件なし)、陽性対照(１０nM ＰＦＦ)および非枯渇誘導因子対照を含んだ。ＤＩＶ１８日目(処置１１日後)、細胞を固定し、不溶性αＳｙｎについて染色した。固定化のために、４％パラホルムアルデヒドおよび４％スクロースおよび１％トリトンを含む溶液を１５分間加えた。固定化後、細胞をＤＰＢＳと０.０５％ｔｗｅｅｎを含む洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで細胞を３％ＢＳＡおよび０.３％トリトンのＤＰＢＳで１〜２時間遮断し、非特異的シグナルを遮断した。遮断工程後、細胞を、遮断緩衝液中、一夜一次抗体で処理した。使用した一次抗体は、抗αＳｙｎおよびベータシヌクレイン(EP1646Y、Millipore/Abcam；Cambridge, UK；Ｎ末端ウサギモノクローナル、１：１００希釈)、抗αＳｙｎ、ホスホＳ１２９(８１Ａ、Covance/Biolegend, Bogart、ＧＡマウスモノクローナル、１：１０００希釈)および抗ＭＡＰ２(ａｂ５３９２、Abcam；Cambridge, UK；ニワトリポリクローナル、１：１０,０００希釈)であった。次の日、プレートを０.０５％ｔｗｅｅｎ含有ＤＰＢＳで３回洗浄し、その後蛍光コンジュゲート二次抗体と１時間インキュベーションした。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ、１：５００希釈；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１：５００希釈、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ヤギ抗ニワトリＩｇＧ、１：５００希釈およびＨｏｅｃｈｓｔ、１：８００希釈であった。全二次抗体をInvitrogenから得た。次いでプレートを、各１５分、ＤＰＢＳと０.０５％ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、最終洗浄はＤＰＢＳ単独であった。
ｆ. ハイコンテンツ免疫蛍光分析
ＡｒｒａｙＳｃａｎTM ＶＴｉ全自動顕微鏡および画像分析システム(Cellomics Inc., Pittsburgh, PA)で×１０対物レンズで画像を得た。造影プレートをHigh Content Studio 3.0 software package(Cellomics, USA)で神経細胞プロファイリング適用を使用して分析した。細胞をを核領域を規定するＨｏｅｃｈｓｔ蛍光により同定し、神経突起をＭＡＰ２染色により同定した。細胞体を重複核およびＭＡＰ２染色により同定した。総不溶性αＳｙｎおよびＳ１２９での総リン酸化αＳｙｎ(ｐＳ１２９)を、さらに２チャネルの蛍光強度により同定した。誘導を、神経突起と共存する総ｐＳ１２９スポット強度により定量した。誘導倍率は、陰性対照ウェルの平均に対して正規化することにより決定した。毒性指数は、正規化核数、正規化神経細胞数および正規化神経突起長を乗算し、各ウェルは陰性対照ウェルの各平均値に対して正規化されている。０.６未満の毒性スコアのウェルを分析から除外した。各抗体試験濃度の誘導倍率値を、非枯渇誘導因子処理ウェルの平均に対して正規化した。濃度応答曲線を、式Ｙ＝底＋(頂上−底)／(１＋１０＾((Ｘ−ＬｏｇＩＣ５０)))を使用してＰｒｉｓｍ(ＧｒａｐｈＰａｄ)で最小二乗フィットにより作成し、ＩＣ５０を各実験について計算した。
結果
図１０Ａに示すとおり、ＡＡＶ−ｈＡ５３Ｔ−αＳｙｎを使用するＡ５３Ｔ αＳｙｎの過発現は、ハイコンテンツ免疫蛍光分析で測定して、ＰＦＦ誘導ｐＳ１２９シグナルの力強い増加を示した。ＰＦＦ誘導ｐＳ１２９シグナルは用量依存的であり、３００nMまでの種々の濃度のｈＡ５３Ｔ−αＳｙｎモノマーで誘導できなかった(図１０Ｂ)。さらに、９の異なるＭＳＡ脳ライセートサンプルでの処理もｐＳ１２９シグナルを誘導した(図１０Ｃ)；しかしながら、誘導は対照脳ライセートでは観察されなかった(図１０Ｄ)。ＰＳ１２９シグナルのＰＦＦ依存的増加はＭＡＰ２陽性神経細胞の分岐点の減少と相関した(図１０Ｅ)。ＭＳＡライセートの誘導活性は、高速遠心分離により単離され(図１０Ｆ)、これらのサンプルにおける誘導因子は、高分子量凝集体であることが示唆された。さらに、ｐＳ１２９シグナルの時間依存的増加がＭＳＡペレットでの処理後にみられた(７日間インキュベーション：０.２２±０.０６の１０nM ＰＦＦ、ｎ＝６；１４日間インキュベーション：０.３２±０.０５の１０nM ＰＦＦ、ｎ＝６；１８日間インキュベーション：０.５２±０.０８の１０nM ＰＦＦ、ｎ＝６)(図１０Ｇ)。最後に、ｈＡ５３Ｔ−αＳｙｎ ＰＦＦでみられる誘導病理に類似して、分岐点の減少もＭＳＡ脳ライセートサンプルでの処理後観察された(１０nM ＰＦＦ：０.５０±０.１６、ｎ＝４３００；ＭＳＡ：０.５８±０.１７、ｎ＝１８４２；図１０Ｈ)。
次にハイコンテンツアッセイを使用して、種々のαＳｙｎ抗体がＰＦＦおよびＭＳＡ脳ライセートサンプルから誘導活性(すなわち、Ｓ１２９のＰＦＦ誘導リン酸化)を免疫枯渇させる能力を評価した。３の異なるＭＳＡ患者、１２−１８、０１−０３、０４−５１から製造したライセートを試験した。免疫枯渇について、サンプルを、一夜一定範囲の抗体濃度とインキュベートした。次いで免疫複合体を除去し、枯渇サンプルを神経細胞培養物と１１日間インキュベートした。誘導を、非枯渇対照ウェルの平均に対して正規化したｐＳ１２９強度により測定した。ベンチマーク抗αＳｙｎ抗体抗体１で免疫枯渇した例示的濃度応答曲線を図１１に示し、ＩＣ５０を表８〜１１に要約する。抗体１は、ＰＦＦおよびＭＳＡ脳ライセート両者から誘導因子の強力かつ完全な枯渇を示した。これらの結果は、ＭＳＡライセートの誘導活性がαＳｙｎ依存的であることを確認する。抗体１は、ＭＳＡライセート(５.４７nM、２.４８nMおよび０.４３nM、表９〜１１)と比較してＰＦＦ(０.０３２nM、表８)からの誘導活性をより強力に枯渇させ、これらの誘導種のレベルまたは高次構造の差異があり得ることを示唆した。
次に、抗体７Ａ１０、２１Ａ３、３６Ａ３、１５Ａ５、１１Ｈ１１−１および４４Ｂ１１を、ＰＦＦおよびＭＳＡ脳ライセートからの誘導活性の免疫枯渇について試験した。７Ａ１０、２１Ａ３、３６Ａ３、１５Ａ５、１１Ｈ１１−１および４４Ｂ１１の例示的濃度応答曲線をそれぞれ図１２〜１７に示す。ＰＦＦ、ＭＳＡ １２−１８、ＭＳＡ ０１−０３、ＭＳＡ ０４−５１の平均ＩＣ５０値の概要を、それぞれ表８〜１１に要約する。抗体１に類似して、全６抗体は、濃度依存的方法でＰＦＦからの誘導活性を枯渇させた(図１２〜１７)。平均ＩＣ５０は０.０１８nM〜０.０６６nMの範囲であり、抗体１のＩＣ５０(表８)と統計的に異ならなかった。全６抗体はまた濃度依存的方法でＭＳＡライセートを完全に枯渇させた；しかしながら、ＰＦＦでの結果と対照的に、いくつかの抗体は、抗体１より統計的により強力であった(表９〜１１)。例えば、７Ａ１０は、全３ＭＳＡライセートからの誘導活性枯渇に抗体１より有意に協力であり：７Ａ１０は、抗体１よりＭＳＡ １２−１８枯渇に１４倍(ｐ＜０.００１、表９)、ＭＳＡ ０１−０３に９倍(ｐ＜０.０５、表１０)およびＭＳＡ ０４−５１に１２倍(ｐ＜０.０１、表１１)強力であった。同様に、２１Ａ３は、抗体１よりＭＳＡ １２−１８に３４倍(ｐ＜０.０１、表９)、ＭＳＡ ０１−０３に７倍(有意ではない、表１０)およびＭＳＡ ０４−５１に１０倍(ｐ＜０.０１)強力であった。関連抗体１５Ａ５および３６Ａ３は、類似する傾向を示した(表９〜１１)。１１Ｈ１１−１は、抗体１と比べて、あまり強固ではない効力差異を示した(表９〜１１)。別のエピトープに結合する４４Ｂ１１は、ＭＳＡライセート１２−１８の免疫枯渇について９Ｅ４より３倍強力であり(ｐ＜０.０５、表９)、ＭＳＡライセート０１−０３(表１０)およびＭＳＡライセート０４−５１(表１１)枯渇に抗体１と等効力であった。観察された効力の相対的差異は、抗体エピトープの露出または到達性に影響する誘導因子の高次構造または系統の差異とリンクする。


ａ 抗体１に対するおよび対応のあるｔ検定に基づく統計。ｎｓ：ｐ＞０.０５；＊ ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１。ｔ検定結果は特に断らない限りｎｓである

ａ 抗体１に対するおよび対応のあるｔ検定に基づく統計。ｎｓ：ｐ＞０.０５；＊ ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１。ｔ検定結果は特に断らない限りｎｓである

ａ 抗体１に対するおよび対応のあるｔ検定に基づく統計。ｎｓ：ｐ＞０.０５；＊ ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１。ｔ検定結果は特に断らない限りｎｓである

ａ 抗体１に対するおよび対応のあるｔ検定に基づく統計。ｎｓ：ｐ＞０.０５；＊ ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１。ｔ検定結果は特に断らない限りｎｓである
７Ａ１０および２１Ａ３の脱免疫化バリアントも、抗体活性に対するアミノ酸修飾の影響を評価するために、ＭＳＡ １２−１８抽出物の免疫枯渇についても試験した。表１２に示すとおり、７Ａ１０−Ｔ９３Ａは、７Ａ１０親抗体(０.５２nM)と比較して、ＭＳＡ １２−１８(０.６６nM)の誘導活性の枯渇について類似する効力を示した；対照的に、他の７Ａ１０バリアントは、７Ａ１０親より１０〜１００倍弱かった。２１Ａ３のＶ８２Ｌバリアントは、２１Ａ３親と類似の効力を示した(表１２)。まとめて、これらの結果は、７Ａ１０−Ｔ９３Ａおよび２１Ａ３−Ｖ８２Ｌの修飾が全体的抗体活性に影響しないことを示す。


ａ ７Ａ１０または２１Ａ３親に対するおよび対応のあるｔ検定に基づく統計。ｎｓ：ｐ＞０.０５；＊ ｐ＜０.０５；＊＊ｐ＜０.０１；＊＊＊ｐ＜０.００１。ｔ検定結果は特に断らない限りｎｓである
結論として、７Ａ１０、２１Ａ３、３６Ａ３、１５Ａ５、１１Ｈ１１−１および４４Ｂ１１は、ＰＦＦおよび３の異なるＭＳＡライセートからの凝集体誘導活性の強力かつ完全な枯渇を示した。これらの結果は、先の実施例の結果と合わせて、抗体が病理の拡散を担い得るこれらの疾患脳抽出物でみられるαＳｙｎの形態に優先的に結合し、故にインビボでαＳｙｎ病理の伝達の遮断に有効であり得ることを示唆する。
実施例１１：インビボでの抗αＳｙｎ抗体によるαＳｙｎ病理遮断
この実施例は、抗αＳｙｎ抗体がマウスモデルでαＳｙｎ病理の拡散および伝達を阻止する能力を試験する。
方法
ａ. マウス
本試験に使用したマウスは、マウスＳｎｃａノックアウトバックグラウンドでヒトＡ５３Ｔ変異を担持する２〜３か月齢、雄および雌[ＰＡＣ−Ｔｇ(ＳＮＣＡＡ５３Ｔ)＋／＋；Ｓｎｃａ−／−](ＰＡＣ−Ａ５３Ｔ)マウス(Kuo et al, Human Molecular Genetics 2010:19:1633-50)であり、インビボ有効性試験に使用した。マウスを、餌および水は自由に摂取できる温度制御室で４匹の群で飼育した。。
ｂ. 抗体処置および定位的手術
約４０μl血液を、雄および雌ＰＡＣ−Ａ５３Ｔマウスのサブセットから後眼窩採血により集め、抗体および抗薬物−抗体(ＡＤＡ)レベルのベースラインを設定した。マウスのコホート全体を対照および処置群の２群に分けた。対照群のマウスに腹腔内(ｉ.ｐ)食塩水注射を与え、その後ＰＢＳ注射を線条体にし、さらに４回毎週食塩水注射を実験完了まで与えた(ｎ＝８)。マウスの第２群を、食塩水(ｎ＝１１)、抗体１(ｎ＝１２)、７Ａ１０(ｎ＝１２)、１１ＡＨ１１(ｎ＝１２)、１５Ａ５(ｎ＝１１)、２１Ａ３(ｎ＝１１)、３６Ａ３(ｎ＝１１)、４４Ｂ１１(ｎ＝１２)および抗体３(ｎ＝５)の９下位処置群に分けた。第二群の全マウスに、食塩水または選択抗体を最初にｉ.ｐ.投与し、続いて組み換えＡ５３Ｔ−ＰＦＦを接種した。対照群と同様、処置群は、さらに４回毎週食塩水または選択抗体のｉ.ｐ.注射を受けた。全処置群の抗体用量は１０mg／kgであった。抗体用量の選択は、抗体３抗体がＰＡＣ−Ａ５３ＴマウスにおけるｐＳｅｒ１２９病理を効果的に減少させた研究Ｉの結果に基づいた。毎週抗体処置の前に、全処置群で薬物動態(ＰＫ)および可能性があるＡＤＡレベルを評価するために、マウスのサブセットで後眼窩採血を行った。マウスをＡ５３Ｔ−ＰＦＦ接種３０日後かつ最後の抗体処置２４時間後に屠殺した。
定位的注射：一側性線条体注射のために、マウスをイソフルラン(１〜４％)吸入で麻酔し、処理中イソフルラン誘導麻酔を維持するためにノーズコーンが付属した定位フレームに入れた。手術部位をベタイン、その後７０％イソプロピルアルコールで準備し、１〜２cm皮膚切開を、頭蓋および対照位置を露出させるために行った。無菌綿棒を使用して、頭蓋を穏やかに浄化した。無菌カーバイドマイクロバービットを使用して、頭蓋表面から０.５〜１mmの深さに穴を開けた。マウスに一側性に１０μg Ａ５３Ｔ−ＰＦＦまたはＰＢＳ(対照群)を後方線条体(ＡＰ ０.２、ＭＬ −２.０、ＤＶ−３.６)に注射した。物質をハミルトンシリンジで、０.２５μl／分(計２.５μl／マウス)の速度で、針を≧１０分間、標的に入れて注射した。マウスを、手術から完全に回復したら、飼育室に戻した。
ｃ. 免疫組織化学(ＩＨＣ)
マウスを、Ａ５３Ｔ−ＰＦＦ注射３０日後病理評価のため屠殺した。組織学的試験のため、脳を４％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)で４８時間、その後２４時間１５％スクロース、次いで４８時間(または使用するまで)３０％スクロース溶液で固定した。冠状４０μm連続脳切片を、スライド式ミクロトーム(Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL)で調製し、ＩＨＣ分析まで凍結保護物質に入れた。ＩＨＣ手順は次の工程を含んだ：脳切片を染色皿に移し、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)で３回濯いだ(５分／濯ぎ)。次いで切片を１０分間、３.７％ホルムアルデヒド(ＰＢＳ中)で後固定した。次いでＰＢＳで２回濯いだ(１０分／濯ぎ)。次に、切片を新鮮３％Ｈ２Ｏ２、ＰＢＳ中１０％メタノールで３０分間インキュベートして、内在性ペルオキシダーゼ活性を除去した。切片をＰＢＳ(１０分／濯ぎ)で３回濯ぎ、その後１時間、室温でＰＢＳ中１０％標準血清(二次抗体の種からの血清を使用)と０.３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で遮断工程を行った。次いで切片をＰＢＳ(１０分／濯ぎ)で３回濯いだ。脳切片を一夜、一次抗体[１：１００,０００希釈の抗アルファ−ｓｙｎ ｐＳｅｒ１２９(Abcam, Cambridge, UK；ａｂ５１２５３)]で、４℃でマイクロタイタープレートシェーカーで、穏やかであるが、なお切片を均一に撹拌する速度でインキュベートした。ＩＨＣの２日目、脳切片をＰＢＳ(１０分／濯ぎ)で４回濯ぎ、次いでビオチニル化二次抗体(ＰＢＳ中１：５００ヤギ抗ウサギ、Vector BA-1000)と６０分間インキュベートした。次いで切片をＰＢＳ(４回、１０分／濯ぎ)で濯ぎ、その後ＰＢＳ中で製造したＡＢＣ複合体と６０分間、室温でインキュベートした(Elite ABC kit, Vector laboratories, Burlingame, CA)。ＰＢＳ(４回、１０分／濯ぎ)で濯いだ後、切片を１０分間、ペルオキシダーゼ基質(Vector Cat. # SK-4100, Vector laboratories, Burlingame, CA)とインキュベートした。最後に、脳切片をＰＢＳ(４回、１０分／濯ぎ)で濯ぎ、Superfrost Plus Micro Slides (VWR, Randor, PA)にマウントした。スライドを空気乾燥させ、その後ヘマトキシリンおよびScott's blue溶液で対比染色し、その後一連のエタノール濯ぎを行った。スライドを最後にパーマウントおよびマイクロカバーガラス(VWR, Randor, PA)を使用してカバーガラスで覆い、スキャニングおよびＩＨＣ定量分析のために乾燥させた。
ＩＨＣ定量：スライドガラスにマウントした脳切片を、Ａｐｅｒｉｏ ＡＴ２スライドスキャナーを使用して造影した。各試験内の全スライドを、同一光力およびカメラ露出を使用して造影した。各動物から約２枚のスライドを分析し、各々約２０のマウントした冠状脳切片であった。画像取得後、目的の領域(ＲＯＩ)、ａ)帯状回領域に沿った初生皮層(両耳間５.４８mm〜２.９６mm、十字縫合１.６９mm〜０.８３mm、６〜１０切片)およびｂ)扁桃体領域(両耳間２.７２mm〜１.７６mm、十字縫合１.０７mm〜２.０３mm、４〜６切片)を含む脳切片を、各動物でＨＡＬＯ画像分析ソフトウェアを使用して同定した。ＲＯＩを、両領域について、同側性側(注射の側)および対応する対側性側でｐＳ１２９染色により占拠される全体的な領域について輪郭を描いた。各動物の全ＲＯＩ輪郭切片からの平均染色を、次いでAlgorithm (Indica Labs)-Area Quantificationを使用して定量した。全画像をを、陽性染色面積同定のために、同一閾値設定を使用して同時に分析した。組織面積(μm２)、総染色面積(μm２)、弱染色面積＆強面積(μm２)、％染色陽性組織、％弱染色および％強染色陽性組織を分析した。一元配置ＡＮＯＶＡその後ダネットの後検定を、処置効果の決定のために使用した。
ｄ. 血漿および脳における抗体レベルの測定
ＥＬＩＳＡプレート(Costar 3925)を、ＰＢＳ(GIBCO cat#14190)で希釈した１００μlの１μg／ml ＰＦＦ(α−シヌクレインＷＴ、PROTEOSから調製)で、２時間、室温(ＲＴ)で被覆した。ＰＦＦを、コーティング前に毎秒休止しながら15秒間超音波処理した。プレートをダルベッコＰＢＳ(Life Technologies, #14040-117)中０.０５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、１５０μlのＤＰＢＳ中３％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン、プロテアーゼフリー、Fraction V, Roch Diagnostic #03117332001)で２〜３時間、ＲＴまたは一夜、４℃で遮断した。標準、血漿および脳サンプルを、Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤(Roche 11836145001、１ペレット／２５ml)含有１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＤＰＢＳで希釈した。１００μL／ウェルのサンプル(３〜４希釈)をデュプリケートで乗せ、約２時間、ＲＴでインキュベートした。０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＤＰＢＳで４回プレートを洗浄後、１％ＢＳＡ／０.２％Ｔｗｅｅｎ／ＤＰＢＳで１：１０００希釈した１００μlの二次抗体(アルカリホスファターゼ−affinipureロバ抗ヒトＩｇＧ、JacksonImmuno #709-055-149、５０％グリセロール含有)を加え、１時間、ＲＴでインキュベートした。４回の洗浄後、プレートを１００μLのアルカリホスファターゼ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II, T-2214, Life Technologies)で３０分間展開した。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で測定した。プレートをアッセイ中一定の振盪(Titer plate shaker、速度３)に維持した。
ｅ. 抗薬物抗体(ＡＤＡ)の測定
非定量的免疫原性アッセイを、抗体１、７Ａ１０、１１ＡＨ１１、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１および抗体３で処置したマウスにおける抗体１、抗７Ａ１０抗体、抗１１ＡＨ１１抗体、抗１５Ａ５抗体、抗２１Ａ３抗体、抗３６Ａ３抗体、抗４４Ｂ１１抗体および抗体３の可能性がある進展を検出するために開発した。この酵素結合免疫吸着法において、抗体１、７Ａ１０、１１ＡＨ１１、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３、４４Ｂ１１および抗体３をMaxisorp平底９６ウェルプレートに、一夜、４℃で被覆させた。１：１００希釈した血清サンプルを一夜、室温でインキュベートして、潜在的抗薬物抗体(ＡＤＡ)を捕捉した。捕捉抗体をヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)および免疫グロブリンＭ(ＩｇＭ)ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素(ＨＲＰ)コンジュゲート抗体で検出した。ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)および免疫グロブリンＭ(ＩｇＭ)ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素(ＨＲＰ)コンジュゲート抗体を陽性対照として使用した。テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)を、血清サンプルに存在する抗体１、抗７Ａ１０抗体、抗１１ＡＨ１１抗体、抗１５Ａ５抗体、抗２１Ａ抗体３、抗３６Ａ３抗体、抗４４Ｂ１１抗体および抗体３の量に比例して光学密度(ＯＤ４５０)を生じるＨＲＰの発色基質として加えた。
ｆ. 脳組織におけるαＳｙｎレベルの測定
簡潔には、ＥＬＩＳＡプレート(Costar 3925)を、ＢｕｐＨ炭酸−重炭酸緩衝液、ｐＨ９.４(Thermo Fisher Scientific # 28382)で希釈した１００μlの各捕捉抗体で、一夜、４℃で被覆した。捕捉抗体ＭＪＦＲ１(Abcam ab138501)を
０.１μg／ml(総α−シヌクレインアッセイ)または０.３５μg／ml(ｐＳ１２９アッセイ)、ＭＪＦＲ１４−６−４−２(Abcam ab209538)を０.１μg／mlおよび１Ｅ８(ＢＭＳ ５４４６.１Ｅ８.１０)を０.３μg／mlの濃度で使用した。プレートををダルベッコＰＢＳ(Thermo Fisher Scientific, #14040-117)で４回洗浄し、ＤＰＢＳ中の３％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン、プロテアーゼフリー、Fraction V, Thermo Fisher Scientific)で２〜３時間、室温(ＲＴ)または一夜、４℃で遮断した。標準、脳サンプルおよびＱＣサンプルを、Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤(Thermo Fisher Scientific、１ペレット／２５ml)およびホスファターゼ阻害剤２＆３(Sigma Aldrich, P5726 & P0044、１：１００)含有１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＤＰＢＳで希釈した。標準は、α−シヌクレインＷＴ(rPeptide S-1001)、ｐＳ１２９(aa89-140, AATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHH-CONH2；配列番号１２９)またはＰＦＦ(α−シヌクレインＷＴ、PROTEOSから調製)であった。サンプル５０μL／ウェルをデュプリケートで乗せ、一夜、４℃でインキュベートした。プレートをＲＴに平衡化後、１％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ／ＤＰＢＳで１：４０００希釈した５０μl検出抗体を加え、サンプルとＲＴで約２時間共インキュベートした。検出抗体(4B12はBioLegend SIG39730から, MBJR13はAbcam ab168381, 2E2および23H8から)をアルカリホスファターゼ(Novus Biologicals #702-0010からのＡＰキット)とプレコンジュゲートした。次いでプレートを０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで４回洗浄し、１００μLのアルカリホスファターゼ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II、Ｔ−２２１４、Thermo Fisher Scientific)で３０分間展開した。発光カウントを、Perkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で測定した。プレートををアッセイ中一定の振盪(Titer plate shaker、速度３)に維持した。
結果
ＰＦＦ接種マウスに、ＰＢＳ(ｎ＝１１)または抗体１(ｎ＝１２)、７Ａ１０(ｎ＝１２)、１１ＡＨ１１(ｎ＝１２)、１５Ａ５(ｎ＝１１)、２１Ａ３(ｎ＝１１)、３６Ａ３(ｎ＝１１)、４４Ｂ１１(ｎ＝１２)および抗体３(ｎ＝５)を４週間毎週ＩＰ注射により投与した。ＰＢＳ接種マウスに、陰性対照としてＰＢＳ(ｎ＝８)をＩＰ注射により投与した。全抗体を１０mg／kgで投与した。毎週抗体処置の前に、薬物動態(ＰＫ)および可能性があるＡＤＡレベルを評価するためにマウスのサブセットで後眼窩採血を行った。マウスを、接種３０日後かつ最後の抗体処置２４時間後に屠殺した。抗体レベルを、マウスのサブセットからの脳組織で測定した。ｐＳ１２９ αＳｙｎ病理を、免疫組織化学により選択脳領域で検定した。
血漿抗体暴露を図１８に概説する。血漿暴露は、抗体間で約１００倍変わり、１μg／ml〜１００μg／mlの範囲であった。一部抗体(例えば２１Ａ３および抗体１)の低暴露は、ＡＤＡによる可能性があった。抗体３対照抗体の血漿濃度は、最初の処置試験で観察されたレベルに類似した。脳組織抽出物の抗体レベルを図１９に示す。脳暴露は抗体間で約１０倍代わり、約２５ng／ml〜２５０ng／mlの範囲であった。類似する抗体レベルが、脳半球の注射部位に対して同側性および対側性で観察された。ＡＤＡを血漿サンプルで測定した(表１３および１４)。ＡＤＡは、抗体３(ｎ＝３)、抗体１(ｎ＝６)、７Ａ１０(ｎ＝１)、２１Ａ３(ｎ＝７)、１５Ａ５(ｎ＝１)、３６Ａ３(ｎ＝１)および４４Ｂ１１(ｎ＝１)について一部動物で観察された。ＡＤＡは抗体１１Ｈ１１−１では観察されなかった。低血漿抗体レベルは、抗体１および２１Ａ３処置についてはＡＤＡと関連した(図２０)。対照的に、血漿抗体レベルは、抗体３、７Ａ１０、１５Ａ５および４４Ｂ１１についてＡＤＡ存在下で不利に影響しなかった。

a 顕著なＡＤＡ活性があるサンプルのみを示す。ＡＤＡは１１Ｈ１１−１では観察されなかった
b ＩＤ＃は、サンプル採取週(ｗｋ１、ｗｋ２、ｗｋ３またはｗｋ４)および動物ＩＤ＃を示す
c 光学密度は４５０nmの発色基質で測定した。
d カットオフは媒体対照サンプルの平均ＯＤの２×に基づいた。カットオフ限界を上回るＯＤ値は有意と見なされる。各アッセイプレートについて計算されたカットオフを示す。

a 顕著なＡＤＡ活性があるサンプルのみを示す。
b ＩＤ＃は、サンプル採取週(ｗｋ１、ｗｋ２、ｗｋ３またはｗｋ４)および動物ＩＤ＃を示す
c 光学密度は４５０nmの発色基質で測定した。
d カットオフは媒体対照サンプルの平均ＯＤの２×に基づいた。カットオフ限界を上回るＯＤ値は有意と見なされる。各アッセイプレートについて計算されたカットオフが示される。
病理の伝播および拡散における受動免疫化の効果を評価するために、αＳｙｎ ｐＳ１２９を、免疫組織化学により運動皮質および扁桃体で測定した。代表的画像を図２１に示し、グラフ要約を図２２に示す。Ａ５３Ｔ−ＰＦＦを注射されたＰＡＣマウスは、ＰＢＳ対照と比較して運動皮質(一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０.０５)および扁桃体(一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０.００１)でｐＳ１２９病理の有意な増加を示した(図２２)。対照抗体抗体３での受動免疫化は、同側性扁桃体で病理の有意な減少(一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０.００１)および同側性運動皮質で病理減少の傾向を示した。抗体３に加えて、扁桃体の病理を有意に減少させた他の抗体は、７Ａ１０(ｐ＜０.０１)、１１Ｈ１１−１(ｐ＜０.００１)、１５Ａ５(ｐ＜０.０１)、２１Ａ３(ｐ＜０.０５)、３６Ａ３(ｐ＜０.０１)および４４Ｂ１１(ｐ＜０.０５)であった。抗体１のみが扁桃体の病理の有意な減少を示さなかった。運動皮質において、４４Ｂ１１のみが病理の有意な減少(ｐ＜０.０５)を示し、一方他の抗体は減少の傾向を示した。運動皮質で有意な効果がないことは、おそらく観察された可変ＰＦＦ介在誘導によるもおである。
次に、脳抽出物のαＳｙｎの可溶性レベルにおける受動免疫化の効果を決定した。脳抽出物を、ＥＬＩＳＡによりαＳｙｎオリゴマー、ｐＳ１２９ αＳｙｎおよび総αＳｙｎレベルについて測定し、図２３および２４に示す。αＳｙｎオリゴマーの、ＰＢＳ(Ｖｅｈ)対照と比較して有意な増加が、Ａ５３Ｔ−ＰＦＦを接種された動物で観察された；同等な結果が２つの独立したαＳｙｎオリゴマーＥＬＩＳＡ(１Ｅ８＋２Ｅ２およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８、両者とも実施例１２に記載)(図２３)で得られた。Ａ５３Ｔ−ＰＦＦ群と比較してオリゴマーレベルの減少の経口が、全抗体処置動物で観察された。オリゴマー結果と対照的に、ｐＳ１２９ αＳｙｎおよび総αＳｙｎレベルは、Ａ５３Ｔ−ＰＦＦの接種または受動免疫化により影響されなかった(図２４)。ＩＨＣで観察されたｐＳ１２９シグナルの変化は、抽出物に存在する比較的高レベルの背景ｐＳ１２９のため、ｐＳ１２９ ＥＬＩＳＡで検出されなかった可能性がある。
実施例１１に記載する方法を使用する９０日期間の第二の試験で、７Ａ１０−Ｖｈ−Ｔ９３Ａ−ＩｇＧ１.３ｆを、毎週３mg／kg、１０mg／kgおよび３０mg／kgの用量で腹腔内注射により投与した。明確化のために、実施例１１で試験した抗体は７Ａ１０ ｈＩｇＧ１.３ｆであった。７Ａ１０−Ｖｈ−Ｔ９３Ａ−ＩｇＧ１.３ｆを使用する第二の試験において、抗薬物抗体の存在は、処置動物の４４％で観察された。この試験の結果は高度に可変性であり、病理に対する顕著な効果は観察されなかった。
纏めると、抗αＳｙｎ抗体７Ａ１０、１１Ｈ１１−１、１５Ａ５、２１Ａ３、３６Ａ３および４４Ｂ１１はインビボでαＳｙｎ病理の伝達の遮断に有効である。
実施例１２：オリゴマー特異的ＥＬＩＳＡを使用する脳抽出物およびＣＳＦにおけるαＳｙｎオリゴマーレベルの評価
本実施例は、ヒト脳ライセートおよびＣＳＦでαＳｙｎオリゴマーレベルを測定するためのオリゴマー特異的ＥＬＩＳＡの開発を記載する。
方法
ａ. エピトープマッピング
エピトープマッピング試験用αＳｙｎペプチドをInnoPep(San Diego, CA)から購入した。ヒトαＳｙｎ配列の２セットの重複ペプチドを、Ｎ末端ビオチン基およびＰＥＧ４リンカーおよびＣ末端を伴い産生した。ペプチドを１mg／mlでＰＢＳに可溶化した。マッピング試験のために、１００μLのＰＢＳ中０.２５μg／ml α−シヌクレインペプチドをニュートラアビジン被覆高容量９６ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific)に加え、室温(ＲＴ)で２時間(または４℃で一夜(Ｏ／Ｎ))インキュベートした。プレートを約３００μLの洗浄緩衝液(ＰＢＳ中０.０５％Ｔｗｅｅｎ)で３回洗浄した。次いでプレートを１５０μlのＰＢＳ中３％ＢＳＡでＲＴで約２時間(または４℃でＯ／Ｎ)遮断した。サンプル緩衝液(０.１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ、２ペレットのＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤−５０ml緩衝液中)で希釈した１００μLの試験サンプルを、プレート上でＲＴで２時間インキュベートした。次いでプレートを３回洗浄した。ＰＢＳＴＢ(１％ＢＳＡ／０.２％Ｔｗｅｅｎ／ＤＰＢＳ)で１：１０００希釈した１００μLの二次抗体を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄あたり５〜１０分で３回洗浄した。１００μLのＡＰ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II、Applied Biosystems; Cat #T-2214)を加え、ＲＴで３０分間展開した。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で読んだ。プレートをアッセイ中一定振盪下(Titer plate shaker、速度３)に置いた。使用した二次抗体はルカリホスファターゼ−affinipureロバ抗ヒトＩｇＧ(JacksonImmuno #709-055-149)、アルカリホスファターゼ−affinipureロバ抗ウサギＩｇＧ(JacksonImmuno #711-055-152)、アルカリホスファターゼ−affinipureロバ抗マウスＩｇＧ(JacksonImmuno #715-055-151)を含んだ。全二次抗体を５０％グリセロール最終濃度に希釈した。
ｂ. ＰＦＦ調製および線維化分析
ＰＦＦを、実施例３に記載する方法を使用して調製し、分析した。
ｃ. αＳｙｎ結合アッセイ
抗体を、ヒトαＳｙｎモノマー、ヒトβＳｙｎモノマー、ヒトγＳｙｎモノマー、ヒトαＳｙｎから取得したＰＦＦ、ヒトＡ５３Ｔ αＳｙｎから取得したＰＦＦならびにヒト、ラットおよびマウス配列を含むαＳｙｎペプチドアミノ酸１１１〜１４０への結合について試験した。ヒト、ラットおよびマウス配列を含むαＳｙｎペプチドアミノ酸１１１〜１４０はInnoPep(San Diego, CA)から購入した。ヒトαＳｙｎモノマー、ヒトβＳｙｎモノマーおよびヒトγＳｙｎモノマーは、rPeptide (Bogart, GA)から購入した。
結合アッセイのために、９６ウェルプレート(Costa #3925、高結合マイクロプレート)を、１００μLのＰＢＳ中１μg／ml αＳｙｎ ＷＴ ＰＦＦでＲＴで２時間(または４℃でＯ／Ｎ)被覆した。プレートをを約３００μLの洗浄緩衝液(ＤＰＢＳ中０.０５％Ｔｗｅｅｎ)で３回洗浄した。プレートを１５０μlの３％ＢＳＡ／ＰＢＳでＲＴで２時間(または４℃でＯ／Ｎ)遮断した。ＰＦＦ(２μg／mlから開始)およびα−ｓｙｎ ＷＴモノマー(２０μg／mlから開始)の３倍連続希釈をサンプル緩衝液(０.１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ、２ペレットのＲｏｃｈｅ完全プロテアーゼ阻害剤−５０ml緩衝液中)中で調製した。抗体インキュベーションのために、等体積の２倍アッセイ濃度のαＳｙｎ ＰＦＦまたはモノマーを、ＢＤファルコン低結合プレート中２倍アッセイ抗体の濃度と混合し、ＲＴで約２時間インキュベートした。１００μLの抗体とＰＦＦまたはモノマーの混合物をＰＦＦ被覆プレートに加え、ＲＴで１０分間インキュベートした。プレートを３回洗浄した。ＰＢＳＴＢ(１％ＢＳＡ／０.２％Ｔｗｅｅｎ／ｄＰＢＳ)で１：１０００希釈した１００μLのロバ抗ヒトＩｇＧ(JacksoImmuno #709-055-149、５０％グリセロール含有)を加え、プレートＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄あたり５〜１０分で３回洗浄した。１００μLのＡＰ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II、Applied Biosystems)を加え、プレートＲＴで３０分間展開した。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で測定した。ＰＦＦを、１５回１秒間パルスで超音波処理し、その後抗体でコーティングまたは混合した。プレートをアッセイ中一定振盪下(Titer plate shaker、速度３)に置いた。
ｄ. ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート(Costar)を、ＢｕｐＨ炭酸−重炭酸緩衝液、ｐＨ９.４(Thermo Fisher Scientific)で希釈した１００μlの各捕捉抗体で一夜、４℃で被覆した。捕捉抗体ＭＪＦＲ１(Abcam)を０.１μg／ml(総α−シヌクレインアッセイ)または０.３５μg／ml(ｐＳ１２９アッセイ)、ＭＪＦＲ１４６４２(Abcam)を０.１μg／mlおよび１Ｅ８を０.３μg／mlの濃度で使用した。プレートをダルベッコＰＢＳ(Thermo Fisher Scientific)で４回洗浄し、ＰＢＳ中３％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン、プロテアーゼフリー、Fraction V)で２〜３時間、ＲＴまたは一夜、４℃で遮断した。標準、脳サンプルおよびＱＣサンプルを、Ｒｏｃｈｅ完全プロテアーゼ阻害剤(１ペレット／２５ml)およびホスファターゼ阻害剤２＆３(Sigma Aldrich、１：１００)含有１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで希釈した。標準はα−シヌクレインＷＴ(rPeptide)、ｐＳ１２９(ａａ８９−１４０,AATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHH-CONH2；配列番号１２９)またはＰＦＦであった。ＰＦＦおよびモノマーの超音波処理を、KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter(出力４０、チューン５０)を使用して行った。サンプルを１５回１秒／バルスで超音波処理した。サンプル５０μL／ウェルをデュプリケートで乗せ、Ｏ／Ｎ、４℃でインキュベートした。プレートをＲＴに平衡化後、１％ＢＳＡ／０.１％Ｔｗｅｅｎ／ＤＰＢＳで１：４０００希釈した５０μl検出抗体を加え、サンプルとＲＴで約２時間共インキュベートした。検出抗体(4B12はCovanceから, MBJR13はAbcam, 2E2および23H8から)をアルカリホスファターゼ(Novus BiologicalsからのＡＰキット)とプレコンジュゲートした。次いでプレートを０.０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで４回洗浄し、１００μLのアルカリホスファターゼ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II、Ｔ−２２１４、Thermo Fisher Scientific)で３０分間展開した。発光カウントを、Perkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で測定した。プレートををアッセイ中一定の振盪(Titer plate shaker、速度３)に維持した。データをGraphPad Prismを使用して分析した。
ｅ. ヒト脳ライセートの調製
脳サンプルｗを、濾過ＰＢＳ(Gibco, #70011、１ml ＰＢＳ／１００mg 組織湿重量)中、KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter(出力４０、チューン５０)で２×１０秒／パルスで超音波処理した。サンプルを２ml エッペンドルフチューブに入れ、チューブを超音波処理の間、湿氷上に維持した。脳ライセートを３,０００ｇ、４℃で５分間遠沈させた。上清アリコートを液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。αＳｙｎ ＥＬＩＳＡ(総＆ｐＳ１２９)を含むＱＣアッセイおよびＢＣＡを実施した。
高速回転ペレットを単離するために、１×ＰＢＳ中１００mg／mlで予め調製した脳ホモジネートを、氷冷１×ＰＢＳで３倍の３３.３mg／mlに希釈し、その後１００,０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。上清を除去し、廃棄した。ペレットを、出発サンプルと同一体積の氷冷１×ＰＢＳに再懸濁した。
ｆ. 脳抽出物の免疫沈降
プールしたヒト脳抽出物を、次のサンプルを等比率で合わせることにより調製した：ＰＤ(ＰＤ１、ＰＤ３およびＰＤ５)、ＭＳＡ(１２−１８、０１−０３および１４−４９)およびＤＬＢ(１３−３７、０５−３１および０８−２６)。プールしたサンプルをＰＢＳＴＢ緩衝液(１％ＢＳＡ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ＋ＰＢＳ)で１００倍希釈した。免疫沈降のために、脳抽出物を、抗体と４℃で２時間上下回転させながらインキュベートした。次いでプロテインＡ／Ｇアガロースビーズ(Thermo Fisher Scientific)を加え、サンプルを一夜、４℃でインキュベートした。プロテインＡ／Ｇビーズ調製のために、１.２mlビーズスラリーを１０００×ｇで２分間、４℃で遠心分離した。貯蔵緩衝液を除去し、ビーズを０.０５％ｔｗｅｅｎ−２０含有０.６ml ＰＢＳで１回洗浄し、上記のとおり遠心分離し、ビーズを０.６ml ＰＢＳで３回洗浄した。最終回転後、ビーズを０.６ml ＰＢＳ中１％ＢＳＡを加え、４℃で２時間回転インキュベーションして遮断した。遮断後、ビーズを遠心分離により単離し、１.２mlの最終体積まで０.６ml ＰＢＳに再懸濁した。ビーズスラリーを、１：１０(ｖｏｌ：ｖｏｌ)希釈で各脳抽出物に加えた。一夜免疫沈降後、サンプルを遠心分離してビーズを除去し、枯渇脳サンプルを単離し、ＥＬＩＳＡにより評価した。次の抗体を免疫沈降に使用した：２６Ｄ６(ヒトＡベータに特異的なマウスＩｇＧ対照抗体(アミノ酸１〜１２)、ＭＪＦＲ−１４６４２(Abcam)、ＬＢ５０９(Covance)、クローン４２(ＢＤ)、７Ａ１０および１Ｅ８。
ｇ. 初代細胞培養単離
初代ラット海馬神経細胞を実施例１０に記載のとおり調製した。
ｈ. 免疫蛍光アッセイ
免疫蛍光を実施例１０に記載のとおり実施した。
ｉ. ハイコンテンツ免疫蛍光アッセイ
ハイコンテンツ免疫蛍光アッセイを実施例１０に記載のとおり実施した。
ｊ. ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット分析
ＭＳＡおよびＰＤ脳組織からの脳ホモジネートを上記のとおり取得した。２００μlの各脳ホモジネートを、ＰＢＳ(Thermo Fisher Scientific)の添加により４００μlの総体積とした。希釈サンプルを１００,０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離して、高分子量凝集体を単離した。ペレットを２００μl ＰＢＳに再懸濁した。５０μlの４×ＮｕＰＡＧＥローディング・ダイ(Thermo Fisher Scientific)および２０μlのＮｕＰＡＧＥ １０×還元剤(Thermo Fisher Scientific)を１３０μlのペレットホモジネートに加えた。サンプルを９５℃で５分間インキュベーションすることにより変性させ、次いで１０μlのサンプルを、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで１×ＭＥＳランニング緩衝液(Thermo Fisher Scientific)で分画した。ゲルを、２００Ｖで５０分間流し、その後０.４μm ニトロセルロース(Thermo Fisher Scientific)に３０Ｖで１時間移した。次いでブロットをＴＢＳＴ(０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ(Promega))中５％ミルクで遮断した。次いでブロットを一夜、４℃で振盪しながら、ＴＢＳＴ中１％ＢＳＡ(ＢｉｏＲａｄ)で１：５０００希釈した次の抗体でプローブした：４Ｂ１２(BioLegend)、４Ｄ６(BioLegend)、Ｓｙｎ−３０３(BioLegend)、８１Ａ(BioLegend)、ＥＰ１５３６Ｙ(Abcam)、ＬＢ５０９(BioLegend)、マウスＩｇＧ(Thermo Fisher Scientific)、抗アクチン(Sigma)。全抗体を、BioRad EZ-linkコンジュゲーションキットを使用してＨＲＰにコンジュゲートした。一夜インキュベーション後、ブロットをＴＢＳＴで洗浄した。ＨＲＰ標識抗体をSupersignal West Femto Maximum(Thermo Fisher Scientific)検出試薬を知央して検出し、画像をＧＥ ＡＩ６００ ＣＣＤカメラを使用して撮った。
ｋ. ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
１００μlのＭＳＡ脳ホモジネート１１−４６および対照脳ホモジネート１１−４９を４００μlのＰＢＳに加え、サンプルを１００,０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。上清(ｓｕｐ)を保存し、残存ペレットを１２０μl ＰＢＳに再懸濁した。サイズ排除クロマトグラフィーのために、１００μlのｓｕｐまたはペレットをAgilent 1100 HPLCのBioSec-5 300Å SECカラム(７.８mm直径×３００mm、Agilent)に注入した。１mlフラクションを、２０mlランタイムをとおして採取した。使用した移動相はＰＢＳであった。カラを、１ml／分および３７℃カラム温度で流した。ＳＥＣフラクションを濃縮するために、サンプルをWaters Oasis SPE HLBカートリッジを使用する固相抽出(ＳＰＥ)に付した。１mlの各ＳＥＣフラクションを１０００μl ４％リン酸で希釈した。ＳＰＥカラムを１ml メタノールで条件付けし、次いで１ml Ｈ２Ｏで平衡化した。次いで酸化サンプルを加えた。充填カラムを１ml ５％メタノールで洗浄し、サンプルを１ml １００％メタノールで溶出した。溶離液を、speed vacで一夜乾燥させた。ＳＰＥ精製ＳＥＣ−ＨＰＬＣフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット分析まで−２０℃で乾燥で保存した。
結果
ａ. 抗体の特徴づけ
この使用に使用した抗体の概要を表１５に記載する。


a 実施例２に記載の方法に準じてエピトープマップ；図１参照。
b ベンダーにより提供されたエピトープ
c J Duda, et al., Ann Neurol 2002; H Tran, et al., Cell Reports, 2014
d M Baba, et al., Am J Path 1998; R Jakes, et al., Neurosci Letts 1999
e Waxman and B Giasson, J Neuropath Exp Neurol 2008
上記抗体を、αＳｙｎモノマーおよびαＳｙｎ ＰＦＦへの結合能について評価した。抗体をαＳｙｎモノマーまたはＰＦＦの濃度を増加させている溶液とインキュベートした。非結合抗体をＰＦＦで被覆したプレートに捕捉し、抗体レベルを片側ＥＬＩＳＡにより測定した。図２５に示すとおり、抗体１Ｅ８、２Ｅ２、２３Ｈ８およびＭＪＦＲ１４６４２は、モノマーと比較して、より強力なＰＦＦへの結合を示し、それぞれモノマー−ＰＦＦ結合能比は９０２、２３６、３２５８および７２３４であった(表１６)。対照的に、抗体ＭＪＦＲ１、４Ｂ１２およびＳｙｎ３０３は、ＰＦＦと比較してモノマーへの結合がより強力であり(図２６)、モノマー−ＰＦＦ結合能比はそれぞれ０.２７、０.２４および０.４７であった(表１６)。抗体４Ｄ６およびＬＢ５０９は中程度にＰＦＦ選択的であり、それぞれモノマー−ＰＦＦ結合能比２６および３４であった。まとめて、これらの結果は抗体１Ｅ８、２Ｅ２、２３Ｈ８およびＭＪＦＲ１４６４２が高度にＰＦＦ／オリゴマー選択的であることを示す。
ｂ. オリゴマー特異的ＥＬＩＳＡの開発
上記モノマーおよびＰＦＦ結合データに基づき、種々の抗体ペア組み合わせを開発し、αＳｙｎモノマーおよびαＳｙｎ ＰＦＦ／オリゴマーの検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡで評価した；同定された最適ＥＬＩＳＡペアの概要およびこれらのアッセイの特異性を表１７に示す。


ａ 検出抗体をアルカリホスファターゼ(ＡＰ)とコンジュゲートした
ｂ ＬＬＱ(定量下限)を、アッセイ背景の２倍と定義する。モノマーＬＬＱは超音波処理モノマーの結果に基づく；同等な結果が非超音波処理モノマーで得られた。ＰＦＦ ＬＬＱは超音波処理ＰＦＦに基づく。ｐＳ１２９ ＥＬＩＳＡ(ＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３)のＬＬＱは２pg／ml(ｐＳ１２９ペプチド)である。
ＥＬＩＳＡペア１Ｅ８.１０＋２Ｅ２.２およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８.Ｇ３は、ＰＦＦ／オリゴマーの高感度かつ特異的検出を示したが、αＳｙｎモノマーには示さなかった(表１７；図２７)。ＰＦＦの超音波処理は、両アッセイでシグナル全体を増強させ、本アッセイが凝集体サイズに高感度であり、超音波処理がさらなる抗体結合部位を露出させ得ることを示唆する。対照的に、超音波処理は、抗体のモノマーを検出する能力に何ら影響を与えなかった。両アッセイは、超音波処理ＰＦＦ検出について約３０pg／ml(モノマー当量)の類似する感受性を示した。背景シグナルのみが、最高試験濃度、１０ng／mlまでのモノマー濃度で観察された。まとめて、これらの結果は、１Ｅ８＋２Ｅ２およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８を用いるＥＬＩＳＡがＰＦＦ／オリゴマー特異的であることを確立する。
さらなるＥＬＩＳＡペア組み合わせも、αＳｙｎのＮ末端ドメイン(Ｓｙｎ３０３)、ドメイン中央(４Ｂ１２)、Ｃ末端(４Ｄ６)およびｐＳ１２９(ＭＪＦＲ１３)に特異的な抗体を含む種々の検出抗体と結合させた同じ捕捉抗体(ＭＪＦＲ１)を取り込むことにより開発した。ＥＬＩＳＡペアＭＪＦＲ１＋Ｓｙｎ３０３、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２およびＭＪＦＲ１＋４Ｄ６は、αＳｙｎモノマーおよびαＳｙｎ ＰＦＦ両者の高感度検出を示した(表１７；図２８)。全３アッセイは、超音波処理ＰＦＦをオリゴマーＥＬＩＳＡに類似する感受性で検出した(表１７)。オリゴマーアッセイと異なり、ＭＪＦＲ１＋Ｓｙｎ３０３およびＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２によるＰＦＦ検出は超音波処理に影響されず、３エピトープの暴露が、凝集体サイズに低感受性であることを示唆した。興味深いことに、超音波処理はＭＪＦＲ１＋４Ｄ６によるＰＦＦの検出を増加させ、４Ｄ６が、オリゴマー選択的抗体に類似してＣ末端エピトープに結合するとの事実とおそらく関連した。オリゴマー特異的アッセイと対照的に、ＭＪＦＲ１＋Ｓｙｎ３０３、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２およびＭＪＦＲ１＋４Ｄ６は、それぞれ２３pg／ml、８pg／mlおよび２７pg／mlのＬＬＱでαＳｙｎモノマーを高感度検出した。モノマーの検出は超音波処理に影響を受けなかった。ＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３ ＥＬＩＳＡは、ｐＳ１２９ αＳｙｎペプチドの高感度かつ特異的検出を証明し、ｐＳ１２９特異性のみ確認された。
特異性をさらに評価するために、ＭＪＦＲ１＋Ｓｙｎ３０３、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２およびＭＪＦＲ１＋４Ｄ６をαＳｙｎファミリーメンバー、β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインの検出についても試験した。図２９に示すとおり、全３アッセイは、β−シヌクレインまたはγ−シヌクレインとほとんど交差反応性を示さず、そのαＳｙｎ特異性が確認された。まとめて、これらの結果は、ＭＪＦＲ１＋Ｓｙｎ３０３、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２およびＭＪＦＲ１＋４Ｄ６がαＳｙｎに特異的であり、モノマーおよびオリゴマー両者を検出でき、「総」αＳｙｎアッセイとしてのその有用性が支持されることを示す。
ｃ. 脳抽出物におけるαＳｙｎレベルの測定
ＥＬＩＳＡを使用して、対照および疾患組織(ＡＤ、ＰＳＰ、ＭＳＡ、ＰＤ、ＤＬＢ)から取得した脳抽出物におけるオリゴマー、ｐＳ１２９および総αＳｙｎレベルを測定した。脳抽出物ＥＬＩＳＡシグナル特異性は、希釈直線性および免疫枯渇試験により確認された。図３０に示すとおり、他の神経変性疾患(ＡＤ、ＰＳＰ)および対照からの抽出物と比較して、強固なレベルのαＳｙｎオリゴマー(１Ｅ８＋２Ｅ２およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８)が、ＰＤ脳抽出物で検出された。ＰＤ抽出物の平均オリゴマーレベルは、１Ｅ８＋２Ｅ２ ＥＬＩＳＡで３６ng／mg総タンパク質およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８.Ｇ２ ＥＬＩＳＡで４０ng／mg総タンパク質であった(表１８)。オリゴマーレベルは、ＡＤ、ＰＳＰおよび対照抽出物の大部分で＜ＬＬＱであった。オリゴマー結果と対照的に、類似するレベルの総αＳｙｎが、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２アッセイを使用して測定して、全抽出物にわたり観察された(図３０；表１８)。ｐＳ１２９ αＳｙｎは全抽出物で検出されたが、レベルはＰＤで増加し、対照と比較して有意に高かった(図３０；表１８)。

ａ データは総タンパク質に対して正規化し、モノマー当量(pg／mg総タンパク質)またはｐＳ１２９ペプチド当量(pg／mg総タンパク質)として表す。総タンパク質レベルはmg／mlとして表す
αＳｙｎオリゴマーが他のシヌクレイン病患者からの脳組織に存在するかを決定するために、ＭＳＡおよびＤＬＢからの抽出物もまた取得し、オリゴマーＥＬＩＳＡを使用して分析した。図３１に示すとおり、類似するおよび強固なレベルのオリゴマーが全３つのシヌクレイン病脳抽出物(ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ)で検出され、対照抽出物におけるレベルは≦ＬＬＱであった；同等な結果が両オリゴマーアッセイで観察された。対照的に、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２を使用して測定した総αＳｙｎのレベルは、対照を含む全抽出物で類似した(図３１)。ｐＳ１２９レベルもまたシヌクレイン病抽出物の類似の程度まで増加し、対照と比較して有意に高く(ＭＳＡ、ＤＬＢ)または高い傾向(ＰＤ)にあった(図３１)。総αＳｙｎレベルをまたＮ末端領域(ＭＪＦＲ１＋Ｓｙｎ３０３)およびＣ末端領域(ＭＪＦＲ１＋４Ｄ６)に感受性のＥＬＩＳＡを使用しても測定した。図３２に示すとおり、総αＳｙｎレベルの差異は観察されなかった。ＥＬＩＳＡ結果を表１９に要約する。


ａ データは総タンパク質に対して正規化し、モノマー当量(pg／mg総タンパク質)またはｐＳ１２９ペプチド当量(pg／mg総タンパク質)として表す。総タンパク質レベルはmg／mlとして表す。
１Ｅ８＋２Ｅ２およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８ ＥＬＩＳＡで測定したオリゴマーレベルは、種々のシヌクレイン病脳抽出物(ＭＳＡ、ＤＬＢ、ＰＤ)について高度に相関した(図３３、表２０)。絶対オリゴマーレベルは、２つのオリゴマーアッセイで同等であった。ｐＳ１２９(ＭＪＦＲ１＋ＭＪＦＲ１３)のレベルもオリゴマーレベルと高度に相関した。対照的に、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２アッセイで測定した総αＳｙｎレベルは、オリゴマーレベルまたはｐＳ１２９レベルと有意に相関しなかった(図３３、表２０)。しかしながら、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２アッセイの総αＳｙｎレベルは、ＭＪＦＲ１＋４Ｄ６アッセイにおけるレベルと相関し、ＭＪＦＲ１＋Ｓｙｎ３０３アッセイで測定したレベルと相関傾向を示した(図３４、表２１)。これらの結果は、種々のアッセイにおけるシグナル特異性をさらに確認する。オリゴマー特異的ＥＬＩＳＡとｐＳ１２９ ＥＬＩＳＡの相関はｍオリゴマー種がリン酸化されている可能性を示唆する。

ａ データはＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ脳抽出物の分析から。有意な相関についてのピアソンのｒ値(ｐ＜０.００１)を示す。ＮＳはｐ＞０.０５を表す


ａ データは対照、ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ脳抽出物の分析から。有意な相関についてのピアソンのｒ値(ｐ＜０.００１)を示す。ＮＳはｐ＞０.０５を表す
ｄ. 脳抽出物におけるオリゴマーの生化学的特徴づけ
高速遠心分離を使用してαＳｙｎ ＰＦＦを精製でき、脳抽出物からのタウタンパク質の高分子量凝集体の単離に使用されている。類似戦略を使用して、シヌクレイン病脳抽出物に存在するαＳｙｎ凝集体を単離し、特徴づけした。対照、ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ脳抽出物を高速遠心分離に付し、可溶性(ｓｕｐｅ)および不溶性(ペレット)物質を単離し、オリゴマーＥＬＩＳＡにより分離した。図３５に示すとおり、オリゴマーは、対照脳組織から取得した抽出物を含む脳抽出物ペレットで検出された。これらのＥＬＩＳＡシグナルの特異性は、希釈直線性により確認された。同等な結果が両オリゴマーＥＬＩＳＡで得られた。出発抽出物のレベルに相対的なペレットにおけるオリゴマーの全体的回収は、２０〜８０％の範囲であった(図３５)。対照的に、オリゴマーは脳抽出物の何れの上清でも検出されなかった。これらの発見は、オリゴマーが高分子量凝集体として存在することを示し、またオリゴマーが対照脳抽出物に存在するが、疾患抽出物より低レベルであることも示唆する。
脳抽出物における高分子凝集体をさらに特徴づけするために、対照およびＭＳＡ脳抽出物から単離したペレットおよび上清フラクションをサイズ排除クロマトグラフィーに付し、フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットで分析した。図３６に示すとおり、αＳｙｎの大部分は、対照およびＭＳＡ抽出物両者からの上清ＳＥＣフラクションにあり、、フラクション１０で溶出し、約６０kDaの分子半径に対応し、この種が四量体であることを示唆する。この四量体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットにより分析したときモノマーおよび低分子量切断フラグメントに分割された。対照的に、ペレットフラクションにおいて単離されたαＳｙｎの大部分はＳＥＣによる空隙容量(フラクション６)で溶出し、＞６７０kDaの分子半径に対応した。同等な結果が対照およびＭＳＡサンプルの両者で得られ、対照抽出物における凝集体の存在が確認された。これらの高分子量凝集体はまたＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットによりモノマーおよび切断フラグメントに分割された。さらに、ペレット単離体からのαＳｙｎはフラクション６でも検出され、高分子量凝集体が四量体種と迅速平衡にあることを示唆する。まとめて、これらの結果は、ＭＳＡおよび対照抽出物両者における高分子量凝集体の存在を確認し、凝集体が＞６７０kDaのサイズであり、凝集体が変性条件下(沸騰を伴うＳＤＳ)で破壊されることを示唆する。
高分子量凝集体の潜在的差異をさらに探求するために、対照、ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤから単離した抽出物ペレットを、種々のαＳｙｎ抗体を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットにより分析した。結果を、＜２０kDA(図３７)、３０〜４０kDa(図３８)および６０〜１００kDaの分子量範囲で示す(図３９)。αＳｙｎシグナル特異性をＩｇＧ抗体対照を使用して確認した。図３７に示すとおり、モノマー(約１４kDa)として移動する同等レベルのαＳｙｎが全脳抽出物ペレットにわたり検出された(４Ｂ１２、４Ｄ６)。しかしながら、切断産物のレベルおよび程度は、ＰＤおよび対照(４Ｂ１２)と比較してＭＳＡおよびＤＬＢペレットで高く見えた。αＳｙｎのＣ末端ドメインを認識する４Ｄ６抗体での結果は、切断フラグメントがこのＣ末端領域を欠くことを示す。ｐＳ１２９シグナル(ＥＰ１５３６Ｙ)は、ＤＬＢ＞ＭＳＡ＞ＰＤ＞＞対照で最高であった。アクチンはペレット単離体に存在し、レベルはサンプル間で同等であった。ＩｇＧ対照抗体との非特異的反応性は観察されず、この分子量領域内でのαＳｙｎ特異性が確認された。
３０〜４０kDaの顕著な種が同等レベルで全抽出物ペレットで検出され、αＳｙｎの二量体に対応する可能性があった(図３８)。抗体Ｓｙｎ ３０３および４Ｄ６での結果は、この種がそれぞれインタクトＮ末端およびＣ末端ドメインを含むことを示す。興味深いことに、顕著な二量体は、抗体４Ｂ１２を使用しては容易に検出されなかったが、低レベルの反応性がＤＬＢペレットで存在した。これらの結果は、４Ｂ１２エピトープが二量体種でマスクされることを示し、４Ｂ１２反応性が二量体高次構造の感受性指標であり得ることを示唆する。抗体８１Ａでの結果は、二量体種がＳ１２９でリン酸化され、最高レベルがＤＬＢペレットで得られることを示す。
複数種が、６０〜１００kDa分子量範囲で検出された(図３９)。約６０kDa(Ｓｙｎ３０３、４Ｂ１２、４Ｄ６)および約８０〜１００kDa(４Ｂ１２、ＬＢ５０９、４Ｄ６)の潜在的αＳｙｎ凝集体が検出された。全体として、種々のαＳｙｎ抗体で観察された免疫反応性パターンは、全脳抽出物ペレットにわたり類似した。
ｅ. 細胞における不溶性、ｐＳ１２９ αＳｙｎ凝集体の誘導
αＳｙｎ ＰＦＦおよびシヌクレイン病患者脳組織から単離した抽出物は、培養中の初代神経細胞に加えたとき、αＳｙｎの不溶性、高度にリン酸化した凝集体の形成を誘導した。さらに、誘導は、脳抽出物に存在するαＳｙｎの高分子量種に依存した。これらの発見は、αＳｙｎ病理がプリオン様方式で伝播され得るとの考えを支持し、伝達性種がαＳｙｎの凝集体であることを示唆する。対照、ＭＳＡ、ＤＬＢおよびＰＤ抽出物のペレットフラクションから単離された高分子量凝集体の、ヒトＡ５３Ｔ αＳｙｎを過発現する初代神経細胞における不溶性、ｐＳ１２９０ αＳｙｎ誘導について評価した。不溶性ｐＳ１２９の強固な誘導が、ＭＳＡ脳抽出物ペレット処置後１１日間観察された；対照的に、ＰＤおよびＤＬＢ抽出物ペレットで１０倍低レベルの誘導が観察され、対照抽出物ペレットでは背景シグナルしか観察されなかった(図４０)。誘導はペレット単離体に存在するオリゴマーのレベルと関連しなかった。これらの結果は、ＭＳＡ抽出物ペレットで観察された強固な誘導が、ＰＤ、ＤＬＢおよび対照と比較してＭＳ高分子量種の高次構造および／または修飾の差異と関連し得て、これらの差異がおそらくレシピエント細胞内の取り込みおよび／または鋳型凝集開始の能力に影響する可能性があることを示唆する。
ｆ. ヒトＣＳＦにおけるαＳｙｎレベルの測定
αＳｙｎオリゴマーＥＬＩＳＡ １Ｅ８＋２Ｅ２およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８を使用して、ＭＳＡシヌクレイン病患者および対照からのＣＳＦを評価した；総αＳｙｎ ＥＬＩＳＡ ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２も比較のため包含させた。希釈直線性および添加回収率分析を使用して、ヒトＣＳＦについてアッセイを検証し、最適希釈を同定した。図４１に示すとおり、オリゴマーレベルは、ＭＳＡ、進行性核上性麻痺(ＰＳＰ)および対照を含むコホート１の全ＣＳＦサンプルで＜ＬＬＱであった。同等な結果が１Ｅ８＋２Ｅ２およびＭＪＦＲ１４６４２＋２３Ｈ８ ＥＬＩＳＡの両者で得られた。対照的に、約１０００pg／mlの総αＳｙｎレベルがＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２アッセイで観察され、レベルはＭＳＡ、ＰＳＰおよび対照間で類似した。ＭＳＡおよび対照ＣＳＦサンプルの第二コホートを分析した(図４２)。コホート１で観察されたとおり、大部分のサンプルのオリゴマーレベルは＜ＬＬＱであった；しかしながら、定量化可能オリゴマーレベルが１Ｅ８＋２Ｅ２ ＥＬＩＳＡの７つのＣＳＦサンプル(６つのＭＳＡおよび１つの対照)で検出された。コホート１での結果に一致して、ＭＪＦＲ１＋４Ｂ１２で測定した総αＳｙｎレベルはＭＳＡと対照ＣＳＦサンプルで類似し、約１０００pg／mlであった。
均等物：
当業者は、日常的なレベルを超える実験を実施せずに、ここに開示する特定の実施態様の多くの均等物を認識し、または確認できる。このような均等物は、次の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (20)

  1. 次のＣＤＲを含む重鎖可変領域：
    ｉ. 配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
    ii. 配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
    iii.配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；および
    次のＣＤＲを含む軽鎖可変領域：
    ｉ. 配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
    ii. 配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
    iii.配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；
    を含む抗体であって、ヒトα−シヌクレイン(配列番号１)に結合する、抗体。
  2. 抗体が配列番号１のアミノ酸残基１２３〜１２８の少なくとも１以上に結合する、請求項１に記載の抗体。
  3. 抗体が実施例３に記載に記載のα−シヌクレインモノマー／α−シヌクレインＰＦＦ結合比(モノマー：ＰＦＦ結合比)により評価して、α−シヌクレインモノマーより大きな親和性をα−シヌクレインＰＦＦに有する、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 抗体がそれぞれ配列番号１８および１９に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、請求項１〜３の何れかに記載の抗体。
  5. 抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントからなる群から選択される、請求項１〜４の何れかに記載の抗体。
  6. 抗体が配列番号１１９に示すアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む、請求項１〜５の何れかに記載の抗体。
  7. 抗体がそれぞれ配列番号２０および２１に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、請求項１〜６の何れかに記載の抗体。
  8. 抗体がキメラ、ヒト化またはヒト抗体である、請求項１〜７の何れかに記載の抗体。
  9. 二特異性抗体である、請求項１〜８の何れかに記載の抗体。
  10. 請求項１〜９の何れかに記載の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする、核酸。
  11. 請求項１０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  12. 請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換された、細胞。
  13. 部分と連結された、請求項１〜９の何れかに記載の抗体を含む免疫複合体。
  14. 請求項１〜９および１３の何れかに記載の抗体または免疫複合体および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
  15. 抗α−シヌクレイン抗体を製造する方法であって
    請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、ここで該抗体が発現され；そして
    該抗体を該細胞から単離すること
    を含む、方法。
  16. 細胞における不溶性セリン−１２９リン酸化α−シヌクレイン凝集体の産生を阻害する方法であって、細胞と有効量の請求項１〜９、１３および１４の何れかに記載の抗体、免疫複合体または組成物を接触させることを含む、方法。
  17. 脳におけるレビー小体またはα−シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を処置するまたは重症度を低減する方法であって、該疾患を有する対象に有効量の請求項１〜９、１３および１４の何れかに記載の抗体、免疫複合体または組成物を投与することを含む、方法。
  18. 疾患がパーキンソン病、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症、レビー小体病、多系統萎縮症または純粋自律神経失調症である、請求項１７に記載の方法。
  19. １以上の付加的治療剤を投与することを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. サンプルにけるα−シヌクレインを検出する方法であって、サンプルと請求項１〜９および１３の何れかに記載の抗体または免疫複合体を、該抗体または免疫複合体とα−シヌクレインで複合体の形成をさせる条件下で接触させ、該複合体の形成を検出することを含む、方法。
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