EA013752B1 - Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к улучшенным агентам и способам лечения заболеваний, ассоциированных с синуклеинопатическими заболеваниями, включая образование телец Леви альфа-синуклеина в головном мозге пациентов. Указанные способы заключаются во введении агентов, которые индуцируют благоприятный иммунный ответ против телец Леви. Указанные способы особенно полезны для профилактики и лечения болезни Паркинсона.

Description

Патология головного мозга, ассоциированная с α-синуклеином (альфа-δΝ), является характерной чертой некоторых нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона (ΡΌ, от англ. Рагктδοη'δ О15са5С). деменцию с тельцами Леви (ПЬВ, ОстспЦа \νί11ι Ье\\у Воб1С5). вариант болезни Альцгеймера с образованием телец Леви (ЬУВАЭ, от англ. Ьс\\у Вобу Уапап! оН Л1х11сппсг'5 О15еа5е), множественную системную атрофию (М8А, от англ. Ми1бр1у 8у51ет5 Айорйу) и нейродегенерацию с отложением железа в головном мозге типа-1 (ΝΒΕΑ-1, от англ. №игобедепегайоп \νί11ι Вгат 1гоп

Ассити1абоп Туре-1). Общей чертой всех указанных заболеваний, обозначаемых термином синуклеинопатии, является образование белковых нерастворимых включений в нейронах и клетках глии, которые состоят главным образом из альфа-δΝ.

Тельца Леви и нейриты Леви представляют собой интранейрональные включения, сформированные главным образом из альфа-δΝ. Тельца Леви и нейриты Леви являются нейропатологическим маркером болезни Паркинсона (ΡΌ). ΡΌ и другие синуклеинопатические заболевания объединены общим термином заболевания с тельцами Леви (ЬВО, от англ. Ье\\у Вобу Э15еа5е). ЬВЭ характеризуются дегенерацией дофаминергической системы, моторными нарушениями, когнитивными расстройствами и формированием телец Леви (ЬВ5) (МсКейй е! а1., Сйшса1 апб ра11ю1ощса1 б1адпо515 оН бетепйа \νίΐ1ι Ье^у Ьоб1е5 (ПЬВ): Верой оН !Не СЭЬВ 1п!ета!юпа1 Аогк5Йор, №иго1оду (1996), 47:1113-24). Другими примерами ЬВЭ являются диффузные заболевания с тельцами Леви (ПЬВП, от англ. ЭгНизе Ье^у Вобу О15еа5е), вариант болезни Альцгеймера с образованием телец Леви (ЕУВАЭ), сочетание болезни Паркинсона (ΡΌ) и болезни Альцгеймера (АО) и множественная системная атрофия. Деменция с тельцами Леви (ЭЬВ) термин, используемый для нивелирования различий в терминологии ЬВЭ.

Заболевания, сопровождающиеся образованием ЬВ5, часто являются причиной двигательных нарушений и когнитивных расстройств у пожилых людей (Оа1а5ко е! а1., С11шса1-пеигора!йо1одюа1 согге1айоп8 ίη А1/йе1тег'5 б15еа5е апб ге1а(еб б1теп5юп5. Агсй. №иго1. (1994), 51:888-95). Несмотря на то что частота возникновения этих заболеваний увеличивается, что представляет серьезную проблему для общественного здоровья, к настоящему моменту данные заболевания являются инкурабельными и предотвратить их развитие невозможно, поэтому существует необходимость в изучении причин и патогенеза ΡΌ, что позволит разработать новые способы лечения (Таппег е! а1., Ер1бетю1оду оН Ρа^к^η5оη'5 б15еа5е апб актебс 5упбготе5. Сигг. Орт. №иго1. (2000) 13:427-30). Причины ΡΌ являются спорными, многие факторы предположительно играют роль в развитии данного заболевания, включая различные нейротоксические факторы и генетическую предрасположенность.

В последние годы появилась новая надежда в понимании патогенеза ΡΌ. В частности, некоторые исследования показали, что центральную роль в патогенезе ΡΌ играет синаптический белок альфа-δΝ, поскольку (1) именно этот белок откладывается в ЬВ5 (ЪрШапШн е! а1., №1Шге (1997), 388:839-40; Такеба е! а1., АМ. 1. Ρι^Ε (1998), 152:367-72; АакаЬауа5Ы е! а1., №иго5сг Ьей. (1997), 239:45-8); (2) мутации в гене альфа-δΝ ассоциированы с редкими семейными формами паркинсонизма (Кгидег е! а1., №т.1ге Оеп. (1998), 18:106-8; Ρо1уте^орои1о5 М.Н., е! а1., 8аепсе (1997) 276:2045-7) и (3) наблюдается гиперэкспрессия указанного белка у трансгенных мышей (Ма511ай е! а1., 8аепсе (2000), 287:1265-9), а у мух вида Пго5орЫ1а (Ееапу е! а1., ΝιΙιιιό (2000), 404:394-8) удается воспроизвести некоторые патологические аспекты ΡΌ. Таким образом, тот факт, что аккумуляция альфа-δΝ в головном мозге ассоциирована с одинаковыми морфологическими и неврологическими изменениями у различных видов животных, таких как люди, мыши и мухи, позволяет сделать предположение о том, что именно эта молекула лежит в основе патогенеза ΡΌ.

Фрагмент альфа-δΝ, первоначально считавшийся составляющим элементом АО амилоидных бляшек, обозначался термином неамилоидный-бета (не-Λβ) компонент АО амилоида (ЛАС, от англ. Ноп-ашу1о1б-Ье1а Сотропеп!) (Ι\νηί А., ВюсНет. Вюр11у5. Ас1а (2000), 1502:95-109); Ма5Йай е! а1., АМ. 1. Ρι^Ε (1996), 148:201-10; Иеба е! а1., Ριόο Νη11. Асаб. δθ. ^А (1993), 90:11282-6). Несмотря на то что функция NΑС до настоящего времени не установлена, он может играть важную роль в событиях, происходящих на уровне синапса, таких как нейрональная пластичность во время развития, а также формирование и дегенерация нервных окончаний в патологических условиях при ЬВО, АО и других заболеваниях (На51то!о е! а1., А1рйа^упис1ет т Ье\\у Ьобу б15еа5е апб А1/Не ί те г'5 б15еа5е, Вгат Ρ^ΙμΕ (1999), 9:707-20; Ма5Йай е! а1. (2000).

АО, ΡΌ и деменция с тельцами Леви (ПЬВ) являются наиболее часто встречающимися нейродегенеративными заболеваниями у пожилых людей. Несмотря на то что распространенность указанных заболеваний увеличивается, что представляет собой серьезную проблему современного здравоохранения, к настоящему времени данные заболевания являются инкурабельными и не подлежат профилактике. Последние эпидемиологические исследования показали, что существует стойкая клиническая ассоциация между АО и ΡΌ, поскольку около 30% пациентов с болезнью Альцгеймера также страдают ΡΌ. По сравнению с остальной популяцией пожилых людей у пациентов с болезнью Альцгеймера с большей вероятностью развивается сопутствующая ΡΌ. Кроме того, у пациентов с ΡΌ, у которых развилась деменция, обычно также развивается классическая клиническая картина АО. Несмотря на то что при каждом ней

- 1 013752 родегенеративном заболевании в патологический процесс вовлекаются специфические участки головного мозга и популяции клеток, что проявляется различными клиническими особенностями, ΡΌ, ΑΌ, ПЬВ и ЬВЭ имеют общие патологические маркеры. У пациентов с семейной ΑΌ, синдромом Дауна и спорадической ΑΌ ЬВз появляются в мозжечковых миндалинах, что является классическим нейропатологическим маркером ΡΌ. Кроме того, каждое заболевание ассоциировано с дегенерацией нейронов, межнейрональных синаптических контактов и последующей смертью клеток, истощением запасов нейромедиаторов и патологической аккумуляцией белков с неправильной укладкой цепей, предшественники которых обеспечивают нормальное функционирование центральной нервной системы. Биохимические исследования подтвердили связь между ΑΌ, ΡΌ и ПЬВ.

Нейритные бляшки, которые являются классическим патологическим маркером ΑΌ, содержат бетаамилоидный (Ав) пептид и не-бета-амилоидный компонент (ΝΑΟ). Ав образуется из большого белка предшественника, обозначаемого как белок предшественник амилоида (АРР, от англ. Αιηνίοίά Ргеситзот РерДбе). ΝΑΟ образуется из большого белка предшественника, обозначаемого как не-бета-амилоидный компонент АРР, в настоящее время наиболее часто используется название альфа-δΝ. ΝΑΟ включает аминокислотные остатки 60-87 или 61-95 альфа-δΝ. Оба белка, Άβ и ΝΑΟ, впервые были обнаружены в амилоидных бляшках в виде протеолитических фрагментов соответствующих полноразмерных белков, для которых полноразмерные молекулы кДНК были идентифицированы и клонированы.

Альфа-δΝ принадлежит к большому семейству белков, включая бета- и гамма-синуклеин и синоретин. Альфа-δΝ экспрессируется в норме в синапсе и отвечает, как считается, за нервную пластичность, обучение и память. Были идентифицированы мутации в альфа-δΝ человека (11). которые приводят к усилению аккумуляции альфа-δΝ (Л1а30Рго и Α1α53Τ1τ), и ассоциированы с редкими формами аутосомнодоминантных форм ΡΌ. Механизм, по которому указанные мутации усиливают склонность альфа-δΝ к агрегации, неизвестен.

Несмотря на то что в популяции можно обнаружить множество мутаций в генах АРР и альфа-δΝ, большинство случаев ΑΌ являются спорадическими. Наиболее часто встречающиеся спорадические формы заболеваний ассоциированы с патологической аккумуляцией Ав и альфа-δΝ соответственно. Однако причины такой избыточной аккумуляции указанных белков неизвестны. Ав секретируется нейронами и аккумулируется во внеклеточных амилоидных бляшках. Кроме того, Ав может быть обнаружен и внутри нейронов. Альфа-δΝ аккумулирует во внутринейрональных включениях, называемых ЬВз. Несмотря на то что оба белка обычно вместе обнаруживаются во внеклеточных нейритных ΑΌ бляшках, их также иногда определяют вместе и во внутриклеточных включениях.

Механизм, по которому аккумуляция альфа-δΝ приводит к нейродегенерации и развитию характерных симптомов ΡΌ, неясен. Однако идентификация основных факторов, способствующих и/или препятствующих агрегации альфа-δΝ, является ключевым моментом для понимания патогенеза ЬВЭ и разработки новых способов ассоциированных с ними заболеваний. Исследования в этой области и разработка способов лечения направлены на поиск соединений, которые уменьшают агрегацию альфа-δΝ (НазЫто!о, е! а1.), а также на изучение факторов роста, которые будут способствовать регенерации и/или выживанию дофаминергических нейронов, клеток, которые, в первую очередь, вовлекаются в патологический процесс (П)а1бе!11 е! а1., №\ν 1йетар1ез Гог Ρа^к^изои'з б1зеазе, 1. Деиго1. (2001), 248: 357-62; Кшк е! а1., ^оид-!е^т^ΑΑV-теб^а!еб депе 1гапзГег о£ ΟΌΝΡ ίη Не га! Ρа^к^изои'з тобе1; ш!газ!па1а1 Ьи! по! ш!ташдта1 бапзбис!юп ртошо!ез Гипсбопа1 тедепетайоп ίη Не 1езюпеб шдгоз1па1а1 зуз!еш, 1. Деигозс! (2000), 20:4686-4700). Последние исследования на трансгенных мышиных моделях ΑΌ показали, что антитела к Ав1-42 усиливают и стимулируют исчезновение амилоида из головного мозга, улучшают ΑΌ-подобную симптоматику, что, в свою очередь, приводит к улучшению когнитивного поведения (8сйепк е! а1., 1ттши/а1юп \νί11ι ату1о1б-в а!!епиа!ез Α1ζйе^те^-б^зеазе-1^ке ра!йо1оду ш ΡΌΑΡΡ тоизе, МИиге (1999), 408: 173-177; Могдап е! а1., Α-^ώ рерйбе уассша!юп ргеуеп!з тетогу 1озз ш ашта1 тобе1 оГ Α1ζйе^те^'з б1зеазе, МИиге (2000), 408: 982-985; 1апиз е! а1., Α-^ώ рерббе ^ттии^ζаί^ои гебисез Ьейауюга1 1тра1гтеп! апб р1ас.|иез ш а тобе1 оГ Α1ζйе^те^'з б1зеазе, №11иге (2000), 408:979-82). В отличие от внеклеточных амилоидных бляшек, обнаруживаемых в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера, тельца Леви представляют собой внутриклеточные образования, а антитела обычно не проникают внутрь клеток.

Удивительно, что, принимая во внимание внутриклеточную природу ЬВз в мозговой ткани, исследователям удалось добиться уменьшения числа включений у трансгенных мышей, иммунизированных синуклеином. Настоящее изобретение наряду с прочим относится к способам лечения ΡΌ и других заболеваний, ассоциированных с ЬВз, заключающимся во введении пациентам синуклеина, фрагментов синуклеина, антигенов, которые имитируют синуклеин или его фрагменты, или антител к определенным эпитопам синуклеина при условиях, которые способствуют генерированию благоприятного иммунного ответа у пациента. Исследователи также неожиданно достигли успехов в снижении количества включений у трансгенных мышей, иммунизированных Ав. Настоящее изобретение также, помимо прочего, относится к способам лечения ΡΌ и других заболеваний, ассоциированных с ЬВз, заключающимся во введении пациентам Ав, фрагментов Ав, антигенов, имитирующих Ав или его фрагменты, или антител к определенным эпитопам Ав при условиях, которые способствуют генерированию благоприятного им

- 2 013752 мунного ответа у пациента. Таким образом, изобретение удовлетворяет длительно существующую необходимость в создании лечебных режимов для профилактики или уменьшения нейропатологии и у некоторых пациентов когнитивных расстройств, ассоциированных с ΡΌ и другими заболеваниями, связанными с образованием ЬВк.

Краткое описание изобретения

Согласно одному своему аспекту настоящее изобретение относится к способам профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией альфа-δΝ в головном мозге. Указанные способы заключаются в индукции иммунного ответа против альфа-δΝ. Такая индукция может быть достигнута путем активного введения иммуногена или пассивного введения антитела или производного антитела к синуклеину. Согласно некоторым способам у пациента отсутствуют симптомы заболевания. Согласно некоторым способам у пациента имеется заболевание, но отсутствуют симптомы. Согласно некоторым способам у пациента имеется фактор риска развития заболевания и нет симптомов. Согласно некоторым способам заболевание представляет собой болезнь Паркинсона. Согласно некоторым способам заболевание представляет собой болезнь Паркинсона и введение агента способствует улучшению двигательных функций у пациента. Согласно некоторым способам заболевание представляет собой болезнь Паркинсона и введение агента предотвращает ухудшение двигательных функций у пациента. Согласно некоторым способам у пациента нет болезни Альцгеймера.

Для лечения пациентов, страдающих от наличия телец Леви или агрегации альфа-δΝ в головном мозге, один лечебный режим включает введение пациенту дозы альфа-δΝ или его активного фрагмента с целью индукции иммунного ответа. Согласно некоторым способам альфа-δΝ или его активный фрагмент вводится во множественных дозах в течение периода времени, составляющего по крайней мере 6 месяцев. Альфа-δΝ или его активный фрагмент может вводиться, например, периферически, интраперитонеально, перорально, подкожно, интракраниально, внутримышечно, местно, интраназально или внутривенно. Согласно некоторым способам альфа-δΝ или его активный фрагмент вводится вместе с адъювантом, который усиливает иммунный ответ к альфа-δΝ или его активному фрагменту. Согласно некоторым способам индукция иммунного ответа включает образование антител к альфа-δΝ или его активному фрагменту.

Согласно некоторым способам активный агент представляет собой аминокислоты 35-65 альфа-δΝ. Согласно некоторым способам активный агент включает аминокислоты 130-140 альфа-δΝ и в целом содержит менее 40 аминокислот. Согласно некоторым способам активный агент включает аминокислоты 130-136 альфа-δΝ и в целом состоит менее чем из 40 аминокислот. Согласно некоторым способам С-концевые участки аминокислот в составе агента представляют собой С-концевые участки альфа-δΝ. Согласно некоторым из описанных выше способов альфа-δΝ или его активный фрагмент связан с носителем на Ν-концевом участке альфа-δΝ или его активного фрагмента. Согласно некоторым способам активный агент включает аминокислоты 1-10 альфа-δΝ и в целом состоит менее чем из 10 аминокислот Согласно некоторым способам Ν-концевые участки аминокислот агента представляют собой Ν-концевые участки аминокислот альфа-δΝ. Согласно некоторым из описанных выше способов альфа-δΝ или его активный фрагмент связан с носителем на С-концевом участке альфа-δΝ или его активного фрагмента. Согласно некоторым из описанных выше способов альфа-δΝ или его активный фрагмент связан с молекулой носителя с формированием конъюгата. Согласно некоторым способам агент вводится пациенту путем введения полинуклеотида, который кодирует полипептид, включающий фрагмент альфа-δΝ.

Для лечения пациентов, страдающих от наличия телец Леви или агрегации альфа-δΝ в головном мозге, один из лечебных режимов включает введение пациенту дозы антитела к альфа-δΝ или его активному фрагменту с целью индукции иммунного ответа. Используемое антитело может представлять собой человеческое, гуманизированное, химерное или поликлональное антитело, а также может быть моноклональным или поликлональным. Согласно некоторым способам изотип антитела представляет собой 1дС1 человека. Согласно некоторым способам антитело получают путем иммунизации человека пептидом альфа-δΝ, при этом человек может быть пациентом, который подлежит лечению с помощью антитела. Согласно некоторым способам антитело связывается с наружной поверхностью нейрональных клеток, содержащих тельца Леви, что способствует их разрушению. Согласно некоторым способам антитело проникает во внутреннее пространство нейрональных клеток с тельцами Леви, что способствует разрушению последних.

Согласно некоторым способам антитело вводится совместно с фармацевтическим носителем в составе фармацевтической композиции. Согласно некоторым способам антитело вводится в дозировке от 0,0001 до 100 мг/кг, предпочтительно в дозировке, составляющей по крайней мере 1 мг/кг антитела на 1 кг веса больного. Согласно некоторым способам антитело вводится в множественных дозировках в течение длительного периода времени, например в течение 6 месяцев. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитела могут вводиться в составе фармацевтической композиции с замедленным высвобождением. Антитело может вводиться, например, периферически, интрапериотеально, перорально, подкожно, интракраниально, внутримышечно, местно, интраназально или внутривенно. Согласно некоторым способам во время лечения пациенту осуществляется мониторинг уровня антитела в крови.

- 3 013752

Согласно некоторым способам антитело вводится путем введения пациенту полинуклеотида, кодирующего по крайней мере одну цепь антитела. Полинуклеотид в организме пациента экспрессируется с образованием антительной цепи. Необязательно полинуклеотид кодирует тяжелую и легкую цепи антитела и экспрессируется в организме пациента с образованием тяжелой и легкой цепей антитела.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим любое из антител к альфа-δΝ, описанных в настоящем изобретении, а также фармацевтически доступный носитель.

Согласно другому своему аспекту настоящее изобретение относится к способам профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией альфа-δΝ в головном мозге, заключающимся во введении агента, который индуцирует иммунный ответ против альфа-δΝ, а также во введении второго агента, который индуцирует иммунный ответ против Αβ у пациента. Согласно некоторым способам агент представляет собой Ав или его активный фрагмент. Согласно некоторым способам агент представляет собой антитело к Ав.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способам профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви и агрегацией альфа-δΝ в головном мозге, заключающимся во введении пациенту агента, индуцирующего иммунный ответ против Ав. Согласно некоторым способам агент представляет собой Ав или его активный фрагмент. Согласно некоторым способам агент представляет собой антитело к Ав. Согласно некоторым способам заболевание представляет собой болезнь Паркинсона. Согласно некоторым способам пациент не страдает болезнью Альцгеймера и не имеет факторов риска ее развития. Некоторые способы также включают дополнительный мониторинг проявлений или симптомов болезни Паркинсона у пациентов. Согласно некоторым способам болезнь представляет собой болезнь Паркинсона и введение агента приводит к улучшению клинической картины и уменьшению симптомов и проявлений заболевания.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим агент, эффективный для индукции иммунного ответа против компонента телец Леви у пациента, как описано выше, а также фармацевтически доступный адъювант. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения агент представляет собой альфа-δΝ или его активный фрагмент, например ΝΑ^ или любой из С-концевых фрагментов, описанных в данном изобретении. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим специфическое антитело к компоненту телец Леви.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим агент, эффективный для индукции иммунного ответа против NΑС компонента синуклеина амилоидной бляшки у пациента. Согласно некоторым способам осуществления настоящего изобретения агент представляет собой альфа-δΝ или его активный фрагмент, например ΝΑ^ или любой из С-концевых фрагментов α-синуклеина, описанных в данном изобретении, и, необязательно, адъювант. Согласно другим вариантам осуществления настоящего изобретения агент представляет собой антитело или его фрагмент, которое специфически связывается с альфа-δΝ или его фрагментом, и, необязательно, фармацевтический носитель.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способам изучения активности антитела при профилактике и лечении заболевания, ассоциированного с тельцами Леви. Указанные способы включают обеспечение контакта нейрональной клетки, экспрессирующей синуклеин, с антителом. Затем устанавливают, насколько указанное взаимодействие приводит к уменьшению депозитов синуклеина в клетках по сравнению с контрольными клетками, не контактирующими с антителом.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способам изучения активности антитела при профилактике и лечении заболевания, ассоциированного с тельцами Леви, у пациента. Указанные способы заключаются в обеспечении контакта антитела с полипептидом, содержащим по крайней мере пять последовательных аминокислот альфа-δΝ. Затем устанавливают, происходит ли специфическое связывание антитела с полипептидом, наличие такого связывания указывает на активность антитела для лечения заболевания. Настоящее изобретение также относится к способам эффективной профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге. Способ заключается во введении пациенту, имеющему факторы риска развития заболевания или страдающему от заболевания, полипептида, содержащего иммуногенный фрагмент α-синуклеина, эффективного для индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с ЗЕС Ш ΝΟ:1, что обеспечивает эффективную профилактику и лечение заболевания.

Необязательно, иммуногенный фрагмент α-синуклеина не содержит остатки 1-69 α-синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с ЗЕС Ш ΝΟ:1.

Необязательно, иммунный ответ включает образование антител, которые специфически связываются с α-синуклеином человека по эпитопу, выбранному из группы, включающей 3Ν83-101, 3Ν107-125, 3Ν110-128 и 3Ν124-140, остатки пронумерованы в соответствии с ЗЕС ΙΌ ΝΟ:1. Необязательно, в им

- 4 013752 мунный ответ не вовлекаются антитела, специфически связывающиеся с остатками α-синуклеина человека, не входящими в состав эпитопа.

Необязательно, иммуногенный фрагмент имеет от 5 до 20 последовательных аминокислот из положений 70-140 α-синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с §ЕО ГО N0:1.

Необязательно, иммуногенный фрагмент имеет от 5 до 20 последовательных аминокислот из положений 120-140 α-синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с §ЕО ГО N0:1.

Необязательно, иммуногенный фрагмент включает сегмент α-синуклеина человека, выбранный из группы, включающей §N87-97, §N111-121, §N114-124 и §N126-136, и содержит в целом не более 40 последовательных аминокислотных остатков α-синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с §ЕО ГО N0:1.

Необязательно, иммуногенный фрагмент включает §N125-140 и в целом содержит не более 40 последовательных аминокислот α-синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с §Е0 ГО N0:1.

Необязательно, иммуногенный фрагмент включает §N130-140 и содержит в целом не более 40 последовательных аминокислотных остатков α-синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с §ЕО ГО N0:1.

Необязательно, иммуногенный фрагмент включает §N83-140, остатки пронумерованы в соответствии с §ЕО ГО N0:1.

Необязательно, иммуногенный фрагмент выбран из группы, включающей §N124-140, §N125-140, §N133-140, §N127-139, §N130-139, §N137-139, §N130-138, §N125-137, §N133-137, §N129-136, §N127-140, §N135-140, §N124-139, §N131-139, §N124-138, §N132-138, §N127-137, §N135-137, §N128-140, §N136-140, §N125-139, §N132-139, §N125-138, §N133-138, §N128-137, §N124-136, §N129-140, §N137-140, §N126-139, §N133-139, §N126-138, §N134-138, §N129-137, §N125-136, §N130-140, §N124-139, §N127-139, §N134-139, §N127-138, §N135-138, §N130-137, §N126-136, §N131-140, §N125-139, §N128-139, §N135-139, §N128-138, §N136-138, §N131-137, §N127-136, §N132-140, §N126-139, §N129-139, §N136-139, §N129-138, §N124-137, §N132-137, §N128-136, §N126-140, §N134-140, §N128-139, §N131-139, §N124-138, §N131-138, §N126-137, §N134-137, §N130-136, §N131-136, §N132-136, §N133-136, остатки пронумерованы согласно §ЕО ГО N0:1.

Необязательно, иммунный ответ включает образование антител, которые специфически связываются с α-синуклеином человека по эпитопу, выбранному из группы, включающей §N1-20, §N-21, §N2-23 и §N1-14, остатки пронумерованы в соответствии с §ЕО ГО N0:1.

Необязательно, в иммунный ответ не вовлекаются антитела, которые специфично связываются с остатками α-синуклеина человека в пределах участка §N25-69, §N25-140, §N40-69, §N40-140 или §N70-140.

Необязательно, иммуногенный фрагмент имеет от 5 до 20 последовательных аминокислот из положений 1-40 α-синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с §Е0 ГО N0:1.

Необязательно, иммуногенный фрагмент имеет от 5 до 20 последовательных аминокислот из положений 1-20 и от 5 до 20 аминокислот из положений 120-140 α-синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с §Е0 ГО N0:1.

Необязательно, иммуногенный фрагмент в целом содержит не более 40 последовательных остатков α-синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с §Е0 ГО N0:1.

Необязательно, иммунный ответ включает образование антител, которые специфически связываются с α-синуклеином человека по эпитопу в пределах остатков 1-20 α-синуклеина человека и по эпитопу в пределах остатков 70-140 α-синуклеина человека.

Необязательно, иммунный ответ включает образование антител, которые специфически связываются с α-синуклеином человека по эпитопу в пределах остатков 1-20 α-синуклеина человека и по эпитопу в пределах остатков 120-140 α-синуклеина человека.

Необязательно, в иммунный ответ не вовлекаются антитела, которые специфически связываются с α-синуклеином человека по эпитопу в пределах остатков 41 и 119 α-синуклеина человека.

Необязательно, иммуногенный фрагмент связан с носителем с формированием конъюгата.

Необязательно, полипептид включает иммуногенный фрагмент, слитый с носителем.

Необязательно, иммуногенный фрагмент связан с молекулой переносчика на С-концевом участке фрагмента α-синуклеина.

Необязательно, множественные копии фрагмента связаны с множественными копиями носителя.

Необязательно, иммуногенный фрагмент вводится вместе с адъювантом.

Желательно, этапное введение приводит к рассасыванию, по крайней мере, некоторых телец Леви.

Желательно, этапное введение приводит к дезагрегации телец Леви.

Желательно, этапное введение приводит к уменьшению уровней олигомеров α-синуклеина в синапсах.

Желательно, этапное введение приводит к рассасыванию синуклеина путем активации лизосомаль ного пути.

Желательно, иммунный ответ индуцируется введением единичного полипептида или белка слияния.

- 5 013752

Желательно, иммунный ответ индуцируется введением более чем одного полипептида (например, двух полипептидов).

Желательно иммунный ответ индуцируется введением первого полипептида, включающего первый иммуногенный фрагмент α-синуклеина, эффективный в отношении индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 α-синуклеина человека, а также введением второго полипептида, включающего второй иммуногенный фрагмент α-синуклеина, эффективный в отношении индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 70-140, предпочтительно по остаткам 120-140 α-синуклеина человека.

Необязательно, иммунный ответ индуцируется введением двух или более полипептидов в комбинации. Необязательно, указанные два и более полипептида вводятся совместно и находятся в составе одной лекарственной композиции.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей первый полипептид, включающий первый иммуногенный фрагмент α-синуклеина, и второй полипептид, включающий второй иммуногенный фрагмент α-синуклеина, при этом первый иммуногенный фрагмент эффективно индуцирует иммунный ответ с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 α-синуклеина человека, а второй иммуногенный фрагмент α-синуклеина эффективно индуцирует иммунный ответ с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 120-140 α-синуклеина человека. Необязательно, композиция не содержит иммуногенный фрагмент α-синуклеина, включающий остатки 25-69 α-синуклеина. Первый и второй иммуногенные фрагменты могут быть физически связаны (например, в форме конъюгата или белка слияния). Первый и второй иммуногенные фрагменты могут находиться в составе одной лекарственной композиции.

Настоящее изобретение также относится к способам эффективной профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения указанные способы заключаются во введении пациенту, имеющему риск развития заболевания или страдающему от заболевания, антитела в эффективном режиме, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с БЕО Ш N0:1.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения указанные способы заключаются во введении пациенту, имеющему риск развития заболевания или страдающему от заболевания, антитела в эффективном режиме, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-40 α-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с БЕО Ш N0:1.

Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения указанные способы заключаются во введении пациенту, имеющему риск развития заболевания или страдающему от заболевания, первого антитела, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-40 α-синуклеина человека, и второго антитела, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с БЕО Ш N0:1.

В том случае, когда антитело специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека, остатки нумеруются в соответствии с БЕО Ш N0:1, антитело может также специфически связываться с эпитопом по остаткам 83-140 α-синуклеина человека, остатки нумеруются в соответствии с БЕО Ш N0:1. Антитело может также специфически связываться с эпитопом по остаткам 120-140 α-синуклеина человека. Антитело может также связываться с эпитопом в пределах сегмента α-синуклеина человека, выбранного из группы, включающей Б№3-101, Б№07-125, БШ10-128, БЮ24140, остатки пронумерованы в соответствии с БЕО Ш N0:1.

В том случае, когда антитело специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-70 α-синуклеина человека, остатки нумеруются в соответствии с БЕО Ш N0:1, антитело может также специфически связываться с эпитопом по остаткам 1-20 или по остаткам 1-10 α-синуклеина человека, остатки нумеруются в соответствии с БЕО Ш N0:1.

Когда первое антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-40 α-синуклеина человека, и второе антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека, остатки нумеруют в соответствии с БЕО Ш N0:1, второе антитело также может специфически связываться с эпитопом по остаткам 120-140 α-синуклеина человека. Первое и второе антитело могут вводиться одновременно. Первое и второе антитела могут вводиться во время одного курса лечения.

Антитело может представлять собой моноклональное антитело. Возможно антитело относится к популяции поликлональных антител, неспособных специфически связываться с остатками α-синуклеина человека, расположенными вне эпитопа.

- 6 013752

Антитело может представлять собой гуманизированное антитело. Антитело может представлять собой человеческое антитело. Антитело может представлять собой антитело человека, имеющее изотип [дС1. Антитело может вводиться вместе с фармацевтическим носителем в форме фармацевтической композиции. Желательно, антитело вводится в дозировке, составляющей от 0,0001 до 100 мг/кг, предпочтительно по крайней мере 1 мг на 1 кг веса пациента. Антитело может вводиться множественными дозами в течение 6 месяцев. Антитело может вводиться в составе фармацевтической композиции с замедленным высвобождением. Антитело может вводиться интраперитонеально, перорально, подкожно, интракраниально, внутримышечно, местно, интраназально или внутривенно. Антитело может проникать во внутреннее пространство нейрональных клеток, содержащих тельца Леви, что приводит к рассасыванию последних. Антитело может связываться с α-синуклеином на наружной поверхности нейрональных клеток, что обеспечивает перекрестное связывание с α-синуклеином, при этом этапное введение антитела приводит к дезагрегации телец Леви. Этапное введение антитела приводит к снижению уровней олигомеров α-синуклеина в синапсах. Этапное введение антитела может приводить к выведению α-синуклеина человека путем активации лизосомального пути. Согласно некоторым способам заболевание представляет собой болезнь Паркинсона. Антитело специфически связывается с денатурированным α-синуклеином, что определяется с помощью иммуноблоттинга.

Антитело связывается с денатурированным α-синуклеином человека с аффинностью, составляющей по крайней мере 10⁹ М^-1. Желательно, антитело специфически связывается с синапсом, что определяется с помощью иммуноцитохимических исследований.

Настоящее изобретение также относится к композиции для профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, включающей первое моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-20 α-синуклеина человека, и второе моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 (и предпочтительно остаткам 120-140) α-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с §ЕО ΙΌ N0:1.

Настоящее изобретение также относится к набору для профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, включающему первый контейнер, содержащий антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-20 α-синуклеина человека, и второй контейнер, содержащий антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 (и предпочтительно по остаткам 120-140) α-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с §ЕО ΙΌ N0:1.

Настоящее изобретение также относится к способам эффективной профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге. Указанные способы заключаются во введении пациенту, страдающему от заболевания или имеющему факторы риска развития заболевания, агента в эффективном режиме, который индуцирует иммунный ответ с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с §ЕО ΙΌ N0:1, что способствует эффективной профилактике и лечению заболевания. В иммунный ответ могут не вовлекаться антитела, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-69 α-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с §ЕО ΙΌ N0:1. В иммунный ответ могут также вовлекаться антитела, которые специфически связываются с сегментом α-синуклеина человека, выбранным из группы, включающей §N83-101, §N107-125, §N110-128 и §N124-140, остатки пронумерованы в соответствии с §Е0 ΙΌ N0:1.

Настоящее изобретение также относится к способам контролирования активности агента, полезного для лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви. Указанные способы включают обеспечение контакта агента с трансгенным животным (не человеком), предрасположенным к развитию заболевания, характеризующегося образованием телец Леви; и определение, насколько агент влияет на распространенность или показатель развития телец Леви по сравнению с контрольным трансгенным животным (не человеком). Агент представляет собой (1) фрагмент α-синуклеина, который индуцирует образование антител, которые специфически связываются по крайней мере с одним эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека; или (ίί) антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с §Е0 ΙΌ N0:1.

Трансгенное животное (не человек) может содержать трансген, экспрессирующий α-синуклеин человека. Указанный способ может также заключаться в исследовании множества тестируемых антител на предмет связывания с денатурированным α-синуклеином человека и отборе в качестве агента того антитела, которое обладает наивысшей связывающей способностью. Указанный способ может также заключаться в исследовании множества тестируемых антител на предмет связывания с отложениями синуклеина в срезах тканей с помощью иммуногистохимических методов и отбор в качестве агента того антитела, которое обладает наивысшей связывающей способностью.

- 7 013752

Настоящее изобретение также относится к способу гуманизирования моноклонального антитела 8А5 или 6Н7, который заключается в определении аминокислотной последовательности СЭР участков моноклонального антитела; отборе акцепторного антитела и получении гуманизированного антитела, содержащего ΟΌΒδ из моноклонального антитела и каркасные вариабельные участки из акцепторного антитела.

Настоящее изобретение также относится к способу получения химерных форм моноклонального антитела 6А5 или 6Н7, который заключается в определении аминокислотной последовательности вариабельных участков легких и тяжелых цепей моноклонального антитела; выборе константных участков легких и тяжелых цепей; получении химерного антитела, содержащего легкую цепь, включающую вариабельный участок легкой цепи, слитый с константным участком тяжелой цепи, и тяжелую цепь, включающую вариабельный участок тяжелой цепи, слитый с константным участком тяжелой цепи.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность альфа-δΝ (8ЕО ΙΌ N0:1) в сопоставлении с двумя аминокислотными последовательностями ΝΑΟ 8Е0 ΙΌ N0:2 и 8Е0 ΙΌ N0:3 соответственно.

На фиг. 2 представлены иммунологически окрашенные гистологические срезы головного мозга нетрансгенных мышей (панели А, Е и I), альфа-δΝ трансгенных мышей, иммунизированных только адъювантом (панели В, Е и 1), и альфа-δΝ трансгенных мышей, иммунизированных альфа-δΝ, с образованием низких титров (панели С, О и К) и высоких титров (панели Ό, Н и I) антител к альфа-δΝ. Срезы обрабатывают антителом к α-синуклеину для определения уровней синуклеина (панели Е-Н), анти-1дС антителом для определения общего уровня 1дО в срезах (панели Е-Н), а также определяют в них наличие глиального фибриллярного кислого протеина (ОЕАР, от англ. СНа1 ИЬгШагу Αοίάίο Рго1сш) - маркера астроглиальных клеток.

На фиг. 3 представлено влияние анти-ιηδΥΝ поликлонального антитела на агрегацию синуклеина в трансфецированных 0Т1-7 клетках, определяемое с помощью световой микроскопии.

На фиг. 4 представлены уровни синуклеина в цитоплазме (С) и мембранах (Р) 0Т1-7 α-куи клеток, обработанных предварительно иммунизированной сывороткой и антителом 67-10 в концентрации (1:50) за 48 ч до анализа, осуществленного с помощью вестерн-блоттинга.

На фиг. 5 представлены результаты анализа влияния иммунизации Ав 1-42 на отложение амилоида в головном мозге нетрансгенных, 8ΥΝ, АРР и 8ΥΝ/ΑΡΡ трансгенных мышей. Определяемые уровни амилоида, обнаруженные у АРР и 8ΥΝ/ΑΡΡ мышей, снижаются после иммунизации Ав 1-42.

На фиг. 6 представлены результаты анализа влияния иммунизации Ав 1-42 на формирование включений синуклеина в головном мозге нетрансгенных, 8ΥΝ, АРР и 8ΥΝ/ΑΡΡ трансгенных мышей. Включения синуклеина, обнаруживаемые в головном мозге 8ΥΝ и 8ΥΝ/ΑΡΡ мышей, снижаются после иммунизации Ав 1-42.

На фиг. 7 представлены прямой и непрямой механизмы блокирования антителами агрегации альфа-δΝ.

На фиг. 8 представлено картирование эпитопов антител. Антитела, полученные от мышей в высоком титре и с высокой аффинностью к α-синуклеину человека, картируют с помощью методики ЕЫ8А. В большинстве образцов антисыворотки, полученных от вакцинированных мышей, распознанные эпитопы располагаются в пределах С-концевых участков α-синуклеина человека. В сыворотке от контрольных животных, обработанных СЕА, эпитопы не определяются.

На фиг. 9 представлен визуальный анализ уровней иммунореактивности α-синуклеина человека и других маркеров нейродегенерации:

А - среднее количество Ηα-синуклеин-позитивных включений в височной коре головного мозга. Вакцинация α-синуклеином человека приводит к значительному уменьшению количества включений по сравнению с контролем. Указанный эффект более выражен у мышей из II группы по сравнению с I группой;

В - процентное содержание нейропилей, имеющих синаптофизин-иммунореактивные участки, в лобной коре головного мозга. У трансгенных мышей (1д), получавших только СЕА, количество синаптофизин-иммуномеченых участков уменьшилось на 20%, в то время как уровень синаптофизиниммунореактивности на синапс остался неизменным;

С - уровни ΟΌ45 иммунореактивности (маркер микроглии) в височной коре незначительно выше в головном мозге мышей, вакцинированных α-синуклеином;

Ό - процентное содержание нейропилей, имеющих иммунореактивные участки к α-синуклеину человека, в височной коре головного мозга. У 1д-мышей, вакцинированных α-синуклеином человека, отмечается уменьшение аккумуляции α-синуклеина в синаптофизин-иммунореактивных участках.

* = значительные различия по сравнению α-синуклеин 1д-мышами, обработанными только СЕА (р<0,05, студенческий Т тест).

- 8 013752

На фиг. 10 представлен уровень α-синуклеина человека и иммунореактивности к синаптофизину у вакцинированных животных, определенный с помощью вестерн-блоттинга. По сравнению с головным мозгом 1д-мышей, обработанных только СЕЛ (линии 1-3), у йа-синуклеин вакцинированных 1д-мышей (линии 4-6) уровни как олигомеров, так и мономеров α-синуклеина человека снижались (верхняя панель), при этом уровни иммунореактивности синаптофизина снижались в последней группе (нижняя панель).

На фиг. 11 представлен анализ интранейрональных агрегатов α-синуклеина после внутримозговой инъекции анти-а-синуклеиновых антител. С-концевое антитело 8А5 и Ν-концевое антитело 6Н7 оказывают рассасывающее действие. 1§С1, 1дС2а и 1дС2й представляют собой контроли изотипа. Горизонтальные черточки указывают на средние величины.

На фиг. 12 представлены гистологические срезы головного мозга с контрлатеральной (левая панель; круглые коричневые точки внутри среза представляют собой агрегаты α-синуклеина) и ипсилатеральной стороны (правая панель) у мышей, которым вводили моноклональное антитело 8А5. Иммунологическое окрашивание осуществляют поликлональным антителом к α-синуклеину. Интранейрональные агрегаты α-синуклеина на контрлатеральной стороне обведены.

Определения

Термин полная идентичность означает, что две пептидные последовательности, при условии их оптимального сопоставления, такого, которое достигается, например, при применении программ САР или ΒΕ8ΤΕΙΤ с заданными по умолчанию весовыми интервалами, по крайней мере на 65% идентичны, предпочтительно по крайней мере на 80 или 90% идентичны, более предпочтительно по крайней мере на 95% или более идентичны (например, идентичны на 99% или более). Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, различаются за счет консервативных аминокислотных замен.

Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность выступает как контрольная, с которой сравниваются тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемая и контрольная последовательности вводятся в компьютер, задаются координаты последовательностей и, если это необходимо, программные параметры алгоритма по сравнению последовательностей. Затем алгоритм сравнения последовательностей подсчитывает процентную идентичность тестируемой последовательности (последовательностей) по отношению к контрольной последовательности, основываясь на заданных программных параметрах.

Оптимальное сопоставление последовательностей для их сравнения может быть осуществлено, например, с помощью локального гомологичного алгоритма Зтйй & №а1сгтап. Αάν. Арр1. Ма1й. 2:482 (1981), с помощью гомологичного алгоритма сопоставления №еб1етаи & №ипксй, 1. Мо1. Βίο1. 48:443 (1970), с помощью способа поиска идентичности Реагкоп & Ыртаи, Ргос. Να(1 Асаб. 8е1 И8А. 85:2444 (1988), с помощью компьютеризованных воплощений указанных алгоритмов (САР, ΒΕ8ΤΡΙΤ, ЕА8ТА и ТЕА8ТА в базе №1ксоикт Сеиейск 8ой\саге Раскаде, Сеиейск СотрШег Сгоир, 578 8с1епсе Ότ., Маб1коп, №1) или же путем визуального сопоставления (см. Аикйе1 е1 а1., кирга). Одним примером алгоритма, который подходит для определения процентной идентичности и аналогичности последовательностей является алгоритм ВЙ-АЗК который описан у Айксйи1 е1 а1., 1. Мо1. Вю1. 215:403-410 (1990). Программное обеспечение для осуществления Β^Α8Τ анализа является общедоступным и выложено на сайте Национального центра биотехнологической информации ЩСВЬ от англ. №1бопа1 Сеп1ег Гог Вю1есйпо1оду 1пГогта1юп). Обычно для осуществления сравнения последовательностей могут быть использованы беГаиЙ программные параметры, хотя параметры производителя также могут использоваться. Для аминокислотных последовательностей программа ВЕАЗ'Г'Р использует в качестве заданных параметров длину кода (№), равную 3, математическое ожидание (Е), равное 10, и подсчитывающую матрицу ВЬОЗиМ62 (см. НешкоГГ, Ргос. №11. Асаб. Зск ИЗА. 89, 10915 (1989)).

Для того чтобы классифицировать аминокислотные замены как консервативные и неконсервативные, аминокислоты группируют следующим образом:

группа I (гидрофобные боковые цепи): норлейцин, Мер А1а, Уа1, Ьеи, Не;

группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): Сук, Зет, ΤΙιγ;

группа III (кислые боковые цепи): Акр, С1и;

группа IV (основные боковые цепи): Акп, С1п, Н1к, Ьук, Агд;

группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): С1и, Рго;

группа VI (ароматические боковые цепи): Τιρ, Τ\τ, Рйе.

Консервативные замены включают замены аминокислот из одной группы. Неконсервативные замены подразумевают замены аминокислоты одной из трех групп на аминокислоту из другой группы.

Терапевтические агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, обычно полностью очищены от нежелательных побочных продуктов. Это означает, что агент по крайней мере на 50% в/в (вес./вес.) очищен, а также полностью свободен от нежелательных белков и загрязнителей. Иногда агенты очищены по крайней мере на 80% в/в и более предпочтительно по крайней мере на 90 или на 95% в/в. Однако при использовании стандартных методик очистки белков могут быть получены белки, очищенные по крайней мере на 99% в/в.

- 9 013752

Фраза о том, что молекула специфически связывается с мишенью, означает, что связывание молекулы происходит при условиях присутствия гетерогенной популяции других биологических веществ. Таким образом, при заданных иммуннологических условиях специфическая молекула связывается преимущественно с определенной мишенью и не связывается с другими биологическими веществами, присутствующими в образце, даже если присутствует в избыточном количестве. Специфическое связывание антитела с мишенью при таких условиях требует, чтобы антитело было отобрано на основании своей специфичности по отношению к мишени. Для отбора антител, которые специфически иммунологически реагируют с определенными белками, могут использоваться различные форматы иммунологических исследований. Например, для отбора моноклональных антител, которые специфическим образом вступают в иммунологические реакции с белком, обычно используют твердофазный иммунологический анализ с помощью ЕБ18А. См., например, Наг1о\т апб Ьапе (1988), ЛпЕЬоб1С5. А БаЬогаЮгу Мапиа1., Со1б 8рппд НатЬот РиЬПсаПопз, №\ν Уотк, где описаны форматы иммунологических исследований и условий, которые могут быть использованы для определения специфической иммунореактивности. Специфическое связывание между двумя молекулами означает, что аффинность составляет по крайней мере 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10¹⁰ М^-1. Аффинность более 10⁸ М^-1 является предпочтительной.

Термином антитело или иммуноглобулин обозначается интактное антитело и его связывающие фрагменты. Обычно фрагменты конкурируют с интактным антителом, из которого они были получены, за специфическое связывание с антигеном. К фрагментам относятся отдельные тяжелые цепи, легкие цепи, ТаЬ, ТаЬ'Т(аЬ')2, ТаЬс и Ρν. Фрагменты получают с помощью рекомбинантных ДНК технологий или путем ферментативного или химического разделения интактных иммуноглобулинов.

Термин антитело также относится к одной или более иммуноглобулиновым цепям, которые химически конъюгированы с белками слияния или же экспрессируются как белки слияния.

Термин антитело также относится к биспецифическому антителу. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различные пары тяжелых/легких цепей и два различных участка связывания. Биспецифические антитела могут быть получены с помощью различных способов, включая слияние гибридом или связывание РаЬ' фрагментов. См., например, 8опд§М1а1 & Ьасйтапп, С1ш. Ехр. 1ттипо1. 79:315-321 (1990); Ко§!е1пу е! а1., 1. 1ттипо1. 148, 1547-1553 (1992). Термин антитело также относится к одноцепочечным антителам, в которых вариабельные домены тяжелых и легких цепей связаны посредством спейсера.

АРР⁶⁹⁵, АРР⁷⁵² и АРР⁷⁷⁰ относятся к полипептидам, имеющим длину соответственно 695, 751 и 770 аминокислотных остатков и кодируемым геном АРР человека. См. Капд. е! а1., №Ш.1ге 325, 773 (1987); Роп!е е! а1., №Ш.1ге 331, 525 (1988); и КйадисЫ е! а1., №Ш.1ге 331, 530 (1988). Аминокислотам в составе белка предшественника амилоида человека (АРР) присваивают номера в соответствии с последовательностью его изоформы АРР770. Такие термины, как Λβ39, Αβ340, Αβ41, Αβ42 и Λβ43 относятся к Ав-пептиду, имеющему в своем составе аминокислотные остатки 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 и 1-43.

Термин антиген относится к веществу, с которым специфически связывается молекула.

Термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к участку антигена, с которым взаимодействуют В- и/или Т-клетки. Эпитопы В-клеток могут быть сформированы как смежными, так и несмежными аминокислотами, которые накладываются друг на друга при образовании третичной структуры белка. Эпитопы, сформированные смежными аминокислотами, обычно сохраняются при экспозиции денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные при формировании третичной белковой структуры, обычно разрушаются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно имеет в своем составе по крайней мере 3 и более часто по крайней мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения 8райа1 конформации эпитопов включают, например, рентгенокристаллографию и двумерный ядерно-магнитный резонанс. См., например, Ерйоре Марршд РгоЮсоР ш Ме11юб5 ш Мо1еси1аг Вю1оду, νо1. 66, О1епп Е. Мотк. Еб. (1996). Антитела, которые распознают один и тот же эпитоп, могут быть идентифицированы с помощью простого иммунологического анализа, выявляющего способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с заданным антигеном. Т-клетки распознают эпитопы, включающие около 9 аминокислот для СЭ8 клеток или около 13-15 аминокислот для СЭ4 клеток. Т-клетки, которые распознают эпитоп, могут быть идентифицированы с помощью ш νίΙΐΌ исследований, которые позволяют измерить антигензависимую пролиферацию, которая определяется включением ³Н-тимидина первичными Т-клетками в ответ на взаимодействие с эпитопом (Витке, е! а1., 1. 1пР. Όίδ. 170, 1110-19 (1994)), с помощью антигензависимого киллинга (цитотоксическое Т-клеточное иммунное исследование, Т1дде8 е! а1., 1. 1ттипо1. 156, 3901-3910) или с помощью секреции цитокинов.

Термин иммунологический или иммунный ответ означает развитие благоприятного гуморального (опосредованного антителами) и/или клеточного (опосредованного антигенспецифическими Т-клетками или продуктами их секреции) ответа, направленного против амилоидного пептида или пассивного ответа, индуцированного введением антитела или праймированных Т-клеток. Клеточный иммунный ответ индуцируется презентацией полипептидных эпитопов в ассоциации с молекулами МНС I или II класса для активации антигенспецифичных СЭ4' Т-хелперных клеток и/или СЭ8' цитотоксиче

- 10 013752 ских клеток. Иммунный ответ также может включать активацию моноцитов, макрофагов, ΝΚ-клеток, базофилов, дендритных клеток, астроцитов, микроглиальных клеток, эозинофилов или других компонентов естественного иммунитета. Клеточно-опосредованный иммунный ответ может быть установлен с помощью исследований пролиферации (СИ4⁺ Т-клеток) или СТЬ (цитотоксические Т-клетки), см. Вигке, кирга; Т1ддек, кирга. Относительный вклад гуморального или клеточного иммунного ответа в защитный или терапевтический эффект иммуногена может быть определен путем выделения антител и Т-клеток из организма иммунизированного сингенного животного и измерения защитного или терапевтического эффекта у второго субъекта.

Термин иммуногенный агент или иммуноген относится к агенту, способному индуцировать иммунологический ответ против самого себя при его введении в организм млекопитающего, предпочтительно вместе с адъювантом.

Термин полностью Ό относится к пептиду, у которого >75, >80, >90, >95 и 100% аминокислот имеют Ό-конфигурацию.

Термин оголенный полинуклеотид относится к полинуклеотиду, который не связан с коллоидными материалами. Оголенные полинуклеотиды иногда клонируют в плазмидном векторе.

Термин адъювант относится к соединению, которое при введении совместно с антигеном усиливает иммунный ответ против антигена, но при введении отдельно не генерирует иммунный ответ, направленный против антигена. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ с помощью нескольких механизмов, включая рекрутинг лимфоцитов, стимуляцию В- и/или Т-клеток и стимуляцию макрофагов

Термин пациент относится к человеку или другому млекопитающему, получающему профилактическое или терапевтическое лечение.

Конкуренцию между антителами определяют с помощью исследования, в котором иммуноглобулин, подлежащий анализу, ингибирует специфическое связывание контрольного антитела с известным антигеном, таким как альфа-δΝ. Известно несколько типов исследований конкурентного связывания, например твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (К1А), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (Е1А), сэндвич-конкурентный анализ (см. 8ΐη1ι1ί е1 а1., Мебюбк ίη Епхуто1оду. 9:242-253 (1983)); твердофазный прямой биотин-авидин Е1А (см. КпИапб е1 а1., 1. 1ттипо1. 137:3614-3619)); твердофазный прямой анализ с меткой, твердофазный прямой сэндвичанализ с меткой (см. Наг1о\\' апб Ьапе, АпбЬоб1ек, А ЬаЬота1огу Мапиа1., Со1б 8ртшд НатЬот Ргекк (1988)); твердофазный прямой К1А с меткой с использованием 1-125 (см. Моге1 е1 а1., Мо1ес. 1ттипо1. 25(1):715(1988)) и прямой К1А с меткой (Мо1бепйаиет е1 а1., 8сапб. 1. 1ттипо1. 32:77-82 (1990)). Обычно такое исследование включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клетками, несущими как немеченый тестируемый иммуноглобулин так и меченый контрольный иммуноглобулин. Конкурентное связывание измеряют путем определения количества метки, связавшейся с твердой поверхностью, или клетками в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Антитела, идентифицированные с помощью исследования конкурентного связывания (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и контрольное антитело, и антитела, связывающиеся с прилежащим эпитопом, расположенным достаточно проксимально по отношению к эпитопу, с которым связывается контрольное антитело, за счет стерического несоответствия. Обычно в том случае, если конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание контрольного антитела с известным антигеном по крайней мере на 50 или 75%.

Термин симптом или клинический симптом относится к субъективному проявлению заболевания, например, такому как нарушение походки, ощущаемому пациентом.

Термин признак относится к субъективному проявлению заболевания, наблюдаемому врачом.

Термин в комбинации, при использовании его по отношению к введению двух или более антител к α-синуклеину человека (т.е. каждое антитело распознает разный эпитоп) или к введению двух или более полипептидов или иммуногенов, которые индуцируют антительный ответ к α-синуклеину человека, подразумевает их одновременное введение или введение во время одного курса лечения. Одновременное введение агентов подразумевает их введение в форме белка слияния или конъюгата (например, когда они физически связаны между собой) в составе одной композиции (например, в которой агенты скомбинированы или объединены в одной лекарственной форме, например композиции с замедленным высвобождением или депо), введение в составе различных композиций с интервалом от нескольких минут до 2 ч (совместное введение) либо введение в составе различных композиций, но в один день. Введение во время одного курса лечения означает, что оба агента вводятся пациенту для лечения или профилактики одного состояния. Каждый агент может вводиться однократно или несколько раз. Например, один агент вводится первым, а второй агент вводится на следующий день или на следующей неделе. Аналогично, два агента могут вводиться более чем однократно, например, каждый день, или через день, или через неделю, или согласно другому режиму (например, таким образом, что благоприятный для пациента эффект оказывается лучше, чем при введении только одного агента).

- 11 013752

Фрагмент, обозначаемый как δΝχ-у, означает фрагмент α-синуклеина, который начинается с аминокислоты X и заканчивается аминокислотой Υ. Такой фрагмент может быть связан с гетерологичным полипептидом, но не с другими аминокислотами α-синуклеина, таким образом, что фрагмент начинается до X и заканчивается после Υ.

Аминокислотные остатки α-синуклеина или его фрагменты нумеруются согласно δΕΟ ΙΌ N0:1, при этом α-синуклеин или фрагмент максимально соответствует δΕΟ ΙΌ N0:1, как описано выше при использовании беГаиН параметров.

Композиции или способы, включающие один или более гесйеб элементов, могут также включать и другие элементы, специфически не гесйеб. Например, композиция, включающая альфа-8№пептид, содержит изолированный пептид альфа-δΝ и пептид альфа-δΝ в составе большей полипептидной последовательности.

Детальное описание изобретения

I. Общие положения.

Настоящее изобретение относится к способам профилактики и лечения некоторых заболеваний и патологических состояний, характеризующихся наличием отложений пептида альфа-δΝ, агрегированных в нерастворимые образования, в головном мозге пациента, в форме телец Леви. Указанные заболевания обозначаются общим термином заболевания с тельцами Леви (ΗΒΌ) и включают болезнь Паркинсона (ΡΌ). Указанные заболевания характеризуются наличием агрегатов альфа-δΝ, которые имеют β-складчатую конформацию, и окрашиваются тиофлавином-δ и конго-красным (см. На81шо1о, 1Ыб). Настоящее изобретение также относится к способам лечения указанных заболеваний, заключающимся в использовании агента, который может генерировать иммунный ответ к альфа-δΝ. Иммунногенный ответ способствует предотвращению формирования или исчезновению депозитов α-синуклеииа в клетках головного мозга. Хотя понимание механизма не является существенным для осуществления практической части изобретения, иммунный ответ может индуцировать исчезновение агрегатов в результате образования антител к синуклеину, которые захватываются клетками как сами по себе, так и вместе с α-синуклеином. Результаты, представленные в примерах, свидетельствуют о том, что антитела к α-синуклеину при их периферическом введении проходят гематоэнцефалический барьер и попадают внутрь клеток, содержащих агрегаты α-синуклеина, как сами по себе, так и вместе с α-синуклеином. Антитела, попавшие внутрь клеток, могут способствовать дезагрегации α-синуклеина посредством активации липосомального пути. Антитела внутри клеток с аффинностью к α-синуклеину в денатурированной форме также могут стабилизировать молекулы в дезагрегированной форме. Альтернативно или дополнительно, антитела могут препятствовать агрегации синуклеина на наружной поверхности клеток. Например, антитела к α-синуклеину могут распознавать и перекрестно связывать белки с неправильной конформацией на поверхности нейрональных клеток. Согласно некоторым способам очищающий эффект может быть достигнут частично с помощью фагоцитоза, опосредованного Ге-рецептором. Иммунизация синуклеином может снижать аккумуляцию синуклеина в синапсах и нейрональных клетках в головном мозге. Хотя понимание механизма не является существенным для осуществления практической части изобретения, результат может быть объяснен захватом антител к синуклеину нейрональными клетками (например, с помощью синаптических везикул).

Возможно агенты, генерирующие иммунный ответ к альфа-δΝ, могут использоваться в комбинации с агентами, которые генерируют иммунный ответ к Ав. Иммунный ответ способствует исчезновению депозитов Ав у пациентов, имеющих такие депозиты (например, у пациентов, страдающих от болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона одновременно); однако иммунный ответ также способствует исчезновению депозитов синуклеина. Таким образом, настоящее изобретение подразумевает использование таких агентов отдельно или в комбинации с агентами, генерирующими иммунный ответ в α-синуклеину, у пациентов с ЬВО, но не страдающих от болезни Альцгеймера и не имеющих факторов риска ее развития.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям и способам профилактики и лечения амилоидогенных заболеваний. Было показано, что альфа- и бета-синуклеин вовлечены в образование депозитов амилоида при определенных амилоидогенных заболеваниях, в частности при болезни Альцгеймера (С1ау1ои, Ό.Γ., е1 а1., ΤΙΝδ, 21(6):249-255, 1998). Более специфично, фрагмент NΑС домена альфа- или бета-синуклеина (остатки 61-95) был выделен из амилоидных бляшек у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера; указанный фрагмент составляет около 10% бляшки и остается нерастворимым после растворения додецилсульфатом натрия (δΌδ), Сеогде, 1.М. е! а1., №иго8сг №\\έ 1: 12-17, 1995. Кроме того, сообщается, что полноразмерный альфа-δΝ и его NΑС фрагмент усиливает агрегацию в-амилоидного пептида в нерастворимый амилоид ίη уйго (Сау!оп, кирга). NΑС-компонент амилоидных бляшек является мишенью для иммунологической терапии, заявленной в соответствии с настоящим изобретением, что уточняется ниже. Согласно одному варианту своего осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим агенты, эффективные для индуцирования иммунного ответа к синуклеин^АС компоненту амилоидных бляшек у пациента. Указанные композиции могут быть эффективны для профилактики, замедления или уменьшения отложения амилоида в головном мозге при амилоидных заболеваниях.

- 12 013752

II. Агенты, генерирующие иммунный ответ к α-синуклеину.

Иммунный ответ может быть активным, когда иммуноген вводится для индуцирования образования антител, взаимодействующих с альфа-δΝ у пациента, или пассивным, когда вводится антитело, которое само связывает альфа-δΝ в организме пациента.

1. Агенты, индуцирующие активный иммунный ответ.

Лекарственные агенты индуцируют иммунный ответ, специфически направленный к определенным эпитопам альфа-δΝ пептида. Предпочтительными агентами являются сам альфа-δΝ пептид и его фрагменты. В заявке на патент Л8 № 60/471929 от 19 мая 2003 г. и заявке РСТ \УО 05/013889, обе представлены здесь в качестве ссылок, описаны новые фрагменты α-синуклеина, которые могут использоваться в качестве лекарственных средств, возможно, в комбинации с адъювантом. Варианты указанных фрагментов, их аналоги и миметики натурального альфа-δΝ пептида, которые индуцируют образование антител к предпочтительным эпитопам альфа-δΝ пептида или перекрестно реагируют с ними, также могут использоваться. В заявке И8 № 60/471929 от 19 мая 2003 г. и заявке РСТ \УО 05/013889, обе включены в настоящее изобретение в качестве ссылок, описаны новые фрагменты α-синуклеина, полезные для лечения и профилактики синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний. Указанные фрагменты могут также использоваться в комбинации с адъювантом.

Альфа-синуклеин был первоначально идентифицирован в головном мозге людей как белокпредшественник не-в-амилоидный компонент NΑС АО бляшек (Леба с1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И.8.А. 90(23):1, 1282-11286 (1993). Альфа-синуклеин, также обозначаемый как предшественник не-А[/ компонента АО амилоида (ΝΑΟΡ), представляет собой пептид из 140 аминокислот. Альфа-δΝ имеет следующую аминокислотную последовательность:

МОУРМКОЬЗКАКЕСУУАААЕКТКООУАЕААОКТКЕОУЬУУОЗКТКЕСУУНО νΑΤνΑΕΚΤΚΕφνΤΝνΟΟΑννΤΟνΤΑνΆφΚΤνΕΟΆΟδΙΆΆΆΤΟΓνΚΚϋφΕΠΚΝΕΕΟΑ ΡΟΕΠΙίΕϋΜΡνΟΡΟΝΕΑΥΕΜΡΪΕΕΟΥφΟΥΕΡΕΑ (ЗЕф ГО N0:1) (Леба е1 а1., 1Ыб.; ОепВапк ассеззюп питЬег: Р37840).

Нс-Λβ компонент АО амилоида (ЛАС) получают из альфа-δΝ. NΑС, сильно гидрофобный домен α-синуклеина, представляет собой пептид, состоящий по крайней мере из 28 аминокислотных остатков (остатки 60-87) (8ЕО ГО ΝΟ:3) и, возможно, из 35 аминокислотных остатков (остатки 61-95) (8ЕО ГО ΝΟ:2). См. фиг. 1. NΑС демонстрирует тенденцию к формированию бета-складчатой структуры (Итак с1 а1., ВюсйстМгу. 34:10139-10145). Лпъсп с1 а1. сообщают, что NΑС имеет следующую аминокислотную последовательность:

ΕφνΤΝνΟσΑνντσνΤΑνΑφΚΤνΕΟΑΟδΙΑΑΑΤαΡν (8ЕС> ГО N0:2) (Ъпзеп е! а!„ ВюсЪеш. I. 310(Р1.1): 91-94 (1995); СгепВапк ассеззюп пшпЬег 856746).

Леба с1 а1. сообщают, что NΑС имеет следующую аминокислотную последовательность: ΚΕΟνΤΝνΟΘΑννΤΟνΤΑνΑφΚΤνΕΟΟδ (8Еф ГО ΝΟ: 3) (Леба е1 αΐ., ΡΝΑ8 ϋ8Α

90:11282-11286(1993).

Дезагрегированный альфа-δΝ или его фрагменты, включая NΑС, представляют собой мономерные пептидные единицы. Дезагрегированный альфа-δΝ или его фрагменты в целом являются растворимыми и обладают способностью к самоагрегации с формированием растворимых олигомеров. Олигомеры альфа-δΝ и его фрагменты обычно являются растворимыми и существуют, главным образом, в форме альфа-спиралей. Мономеры альфа-δΝ могут быть получены ίη νίΐτο путем растворения лиофилизированного пептида в чистом ΌΜ8Ο с последующей обработкой ультразвуком. Полученный раствор центрифугируют для удаления всех нерастворенных частиц. Агрегированный альфа-δΝ или его фрагменты, включая NΑС, представляют собой олигомеры альфа-δΝ или его фрагменты, которые были ассоциированы в нерастворимые бета-складчатые структуры. Агрегированный альфа-δΝ или его фрагменты, включая NΑС, также представляют собой фибриллярные полимеры. Фибриллы обычно являются нерастворимыми. Некоторые антитела связываются как с растворимым альфа-δΝ или его фрагментами, так и с агрегированным альфа-δΝ или его фрагментами. Некоторые антитела связываются с олигомерами α-синуклеина с большей силой, чем с его мономерными или фибриллярными формами. Некоторые антитела связываются как с растворимым, так и с агрегированным альфа-δΝ или его фрагментами и, желательно, также и с его олигомерными формами.

Альфа-δΝ, основной компонент телец Леви, характерных для РИ, а также его эпитопные фрагменты, такие как, например, NΑС, или отличные от NΑС фрагменты, могут использоваться для индукции иммунного ответа. Предпочтительно указанные фрагменты содержат четыре или более аминокислоты альфа-δΝ или его аналогов. Некоторые активные фрагменты включают эпитоп на С-концевом участке альфа-δΝ или рядом с ним (например, в пределах аминокислот 70-140, 100-140, 120-140, 130-140 или 135-140). В некоторых активных фрагментах С-концевой остаток эпитопа является С-концевым остатком альфа-δΝ. Другие компоненты телец Леви, например синфилин-1, паркин, убиквитин, нейрофиламент, бета-кристаллин и их эпитопные фрагменты, также могут использоваться для индукции иммунного ответа.

- 13 013752

Как было отмечено, определенные предпочтительные фрагменты α-синуклеиина выделяют из С-концевой молекулы. Такие фрагменты не содержат остатки 1-69 α-синуклеина человека. Иммунизация такими фрагментами генерирует иммунный ответ с образованием антител к одному или нескольким эпитопам по остаткам 70-140 α-синуклеина человека. К иммуногенным С-концевым фрагментам относятся §N85-99, §N109-123, §N112-126 и §N126-138, как показано на фиг. 8, а также другие фрагменты, отличающиеся от одного из указанных наличием вплоть до 2 или нескольких дополнительных аминокислот на каждом конце. Другим предпочтительным фрагментом является §N83-140, который включает все указанные эпитопы. Некоторые фрагменты α-синуклеина вызывают образование антител, которые специфически связываются с одним или более из следующих эпитопов: §N83-101, §N107-125, §N110-128 и §N124-140 α-синуклеина человека. Некоторые фрагменты вызывают образование антител, которые специфически связываются только с одним из перечисленных выше четырех фрагментов. Например, фрагмент §N83-101 начинается с остатка 83 и заканчивается остатком 101 αсинуклеина и приводит к образованию антител, которые специфически связываются только с §N83-101.

Некоторые фрагменты в общем имеют в своем составе не более 40 последовательных аминокислотных остатков α-синуклеина. Некоторые из указанных фрагментов включают §N125-140, §N130-140, §N87, 97, §N111-121, §N114-124 или §N128-136. Некоторые фрагменты имеют в своем составе в целом 5-20 последовательных аминокислот С-концевого участка α-синуклеина (т.е. остатки 70-140). Некоторые фрагменты имеют 5-20 последовательных аминокислот, расположенных между остатками 120-140 α-синуклеина. К наиболее предпочтительным фрагментам относятся §N124-140, §N125-140, §N126-140, §N127-140, §N135-140, §N124-139, §N132-139, §N125-138, §N133-138, §N128-137, §N124-136, §N132-136, §N133-136 и §N134-136.

§N128-140, §N136-140, §N125-139, §N133-139, §N126-138, §N134-138, §N129-137, §N125-136, §N129-140, §N137-140, §N126-139, §N134-139, §N127-138, §N135-138, §N130-137, §N126-136, §N130-140, §N124-139, §N127-139, §N135-139, §N128-138, §N136-138, §N131-137, §N127-136, §N131-140, §N125-139, §N128-139, §N136-139, §N129-138, §N124-137, §N132-137, §N128-136, §N132-140, §N126-139, §N129-139, §N137-139, §N130-138, §N125-137, §N133-137, §N129-136, §N133-140, §N127-139, §N130-139, §N124-138, §N131-138, §N126-137, §N134-137, §N130-136, §N134-140, §N128-139, §N131-139, §N124-138, §N132-138, §N127-137, §N135-137, §N131-136,

Другие фрагменты α-синуклеина, полезные для эффективной профилактики и лечения заболеваний, характеризующихся образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге (например, болезнь Паркинсона), выделяют из й-концевого участка молекулы. Иммунизация фрагментами генерирует иммунный ответ с образованием антител к одному или более эпитопу по остаткам 1-20 или в некоторых случаях к одному или более эпитопу по остаткам 1-10. Как показано в примере IX, введение 6Н7, антитела, которое распознает аминоконцевой участок α-синуклеина, приводит к уменьшению агрегации α-синуклеина в головном мозге трансгенных мышей, в избытке экспрессирующих α-синуклеин человека. Ожидается, что иммунизация фрагментами α-синуклеина, имеющими в своем составе аминоконцевой участок α-синуклеина, также будет приводить к уменьшению агрегации α-синуклеина и/или предотвра щать такую агрегацию.

Таким образом, согласно одному своему аспекту настоящее изобретение относится к способу эффективной профилактики или лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, который заключается во введении пациенту, имеющему риск развития заболевания или страдающему от заболевания, полипептида, имеющего в своем составе иммуногенный фрагмент α-синуклеина, эффективный для индуцирования иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-40, остаткам 1-20 или остаткам 1-10 α-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с §ЕЦ ΙΌ N0:1. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения иммуногенный фрагмент α-синуклеина не имеет остатков 70-140 α-синуклеина. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения иммуногенный фрагмент не содержит остатки 41-140 α-синуклеина. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения иммуногенный фрагмент не содержит остатков 25-140 α-синуклеина.

К подходящим иммуногенам, эффективным для профилактики и лечения заболевания, характеризующегося тельцами Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, относятся, без ограничений указанными, фрагменты, имеющие в своем составе от 5 до 20 смежных аминокислотных остатков аминоконцевого участка α-синуклеина. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанный фрагмент имеет в своем составе первый (аминоконцевой) остаток αсинуклеина. Таким образом, примерные фрагменты включают последовательность остатков 1-Л_а последовательности §ЕЦ ΙΌ N0:1, где N равно от 5 до 20 (например, МОУЕМКСЬ§КАКЕ СУУАААЕ; МОУЕМКС Ь§КАКЕСУУААА; МОУЕМКСЬ§КАКЕСУУАА; МССЕМКСЕ§КАКЕ СУУА; МОУЕМКСБ§КАКЕСУУ; МОУЕМКСЬ§КАКЕСУ; МОУЕМКСЬ§КАКЕС; МОУЕМКСЬ§КАК; МОУЕМКСЬ§КА; МОУЕМКСЬ§К; МОУЕМКСЬ§; МОУЕМКСЬ; МОУЕМКС; МОУЕМК и МОУЕМ.

- 14 013752

Согласно другим предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения, указанные фрагменты не содержат аминоконцевой участок α-синуклеина, но имеют в своем составе второй или третий остаток α-синуклеина. Таким образом, примерные фрагменты имеют последовательность от 2 до Ν, и 3-Ν последовательности 8ΕΟ ГО N0:1, где Ν, составляет от 6 до 21, а Ν составляет от 7 до 22 (например, ΌνΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟννΑΑΑΕΚ; ΌΥΕΜ ΚΟΕδΚΑΚΕΟννΑΑΑΕ; ΌνΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟννΑΑΑ; ΌνΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟννΑΑ; ΌνΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟννΑ;

ΌνΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟνν; ΌνΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟν; ΌνΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟ; ΌνΕΜΚΟΕδΚΑΚ; ΌνΕΜΚΟΕδΚΑ; ΌνΕΜΚΟΕδΚ; ΙΧΤΑΙΚΟΕΑ ΌνΕΜΚΟΕ; ΌνΕΜΚΟ; ΌνΕΜΚ, νΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟννΑΑΑΕΚΤ; νΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟννΑΑΑΕΚ; νΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟννΑΑΑΕ; νΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟννΑΑΑ; νΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟννΑΑ; νΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟννΑ; νΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟνν; νΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟν; νΕΜΚΟΕδΚΑΚΕΟ; νΕΜΚΟΕδΚΑΚ; νΕΜΚΟΕδΚΑ; νΕΜΚΟΕδΚ; ΧΤΑΙΚΟΕΑ νΕΜΚΟ и νΕΜΚΟ).

Как обсуждается ниже, описанные выше фрагменты могут быть связаны с молекулой носителя (например, конъюгатом или белком слияния, см. 8ес. II (3)). Альтернативно, как описывается ниже, рассмотренные выше фрагменты могут вводиться путем вакцинирования субъекта нуклеиновой кислотой, кодирующей фрагмент (см. 8ес. II (4)).

Ссылки на молекулы альфа-δΝ включают натуральные аминокислотные последовательности человека, обозначаемые выше как аналоги, включающие аллельные, видовые и искусственные варианты, полноразмерные формы и их иммуногенные фрагменты. Альфа-синуклеин человека, под которым подразумевается белок, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как и 8Ε0 ГО N0:1, является предпочтительным для всех вариантов осуществления настоящего изобретения. Аналоги обычно отличаются от существующих в природе пептидов по одной, двум или нескольким аминокислотным позициям и создаются путем консервативных аминокислотных замен. Аналоги обычно имеют последовательность, по крайней мере на 80 или 90% идентичную последовательности природных пептидов. Позиции аминокислот в аналогах природного α-синуклеина обозначаются номерами соответствующих аминокислот в природном α-синуклеине, когда аналог и природный α-синуклеин максимально выровнены. Некоторые аналоги также имеют в своем составе синтетические аминокислоты или модификации Ν- или С-концевых аминокислот по одной, двум или нескольким позициям. Например, природный остаток глутаминовой кислоты в положении 139 альфа-δΝ может быть замещен изоаспарагиновой кислотой. Примерами синтетических аминокислот являются Ό, альфа, альфа- дизамещенные аминокислоты, Ν-алкилированные аминокислоты, молочная кислота, 4-гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат, ипсилон-И,И,И-триметиллизин, ипсилон-И-ацетиллизин, 0-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксиллизин, омега-N-метиларгинин, бета-аланин, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, тироксин, гамма-аминомасляная кислота, гомосерин, цитруллин и изоаспарагиновая кислота.

К терапевтическим агентам также относятся аналоги фрагментов альфа-δΝ. Примерами некоторых терапевтических агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, являются все Ό-пептиды, например все О-альфа-δΝ или все Ό-ΝΑ0, а также все Ό-пептидные аналоги. Аналоги специфически связываются с популяцией поликлональных антител к природному α-синуклеину человека. Эффективность аналогов и фрагментов в отношении профилактики и лечения может быть изучена на моделях трансгенных животных при сравнении с контрольными животными, не получавшими лечения или получавшими плацебо, как описано ниже.

Альфа-δΝ, его фрагменты и аналоги могут быть синтезированы с помощью твердофазного пептидного синтеза или с помощью рекомбинантной экспрессии или могут быть выделены из природных источников. Способы автоматического пептидного синтеза являются коммерчески доступными и предоставляются многими поставщиками, такими как Αρρ^ά ВюкукХетк, ЕокХег С1Ху, СайЕогша. Рекомбинантная экспрессия может происходить в организме бактерий, таких как Е.соН. дрожжи, клетки насекомых или млекопитающих. Методики рекомбинантной экспрессии описаны у 8атЬгоок еХ а1., ΜοΕ^Ιατ С1ошид: Α ЬаЬогаХогу Μаηиа1 (С.8.Н.Р. Ргекк, ΝΥ 2^пб еб., 1989). Некоторые формы альфа-δΝ также являются коммерчески доступными, например в компании ВАСНЕМ и Λте^^саη РерХ1бе Сотрапу, Ечс.

К терапевтическим агентам также относятся длинные пептиды, к которым относятся, например, активный фрагмент альфа-δΝ вместе с другими аминокислотами. Например, к предпочтительным агентам относятся белки слияния, включающие сегмент альфа-δΝ, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью, которая индуцирует Т-хелперный ответ, направленный против гетерологичной аминокислотной последовательности, и, как следствие, В-клеточный ответ против сегмента альфа-δΝ. Профилактическая и терапевтическая активность указанных полипептидов может быть изучена на контрольных животных моделях при сравнении с контрольными животными, не получавшими лечения или получавшими плацебо, как описано ниже. Пептид альфа-δΝ, его аналог или активный фрагмент или другой полипептид могут вводиться в ассоциированной или мультимерной форме или диссоциированной форме, к терапевтическим агентам также относятся мультимеры мономерных иммуногенных агентов. Терапевтические агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут также включать полилизиновые последовательности.

- 15 013752

Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения иммуногенный пептид, такой как фрагмент альфа-З№ может быть представлен вирусом или бактерией как часть иммуногенной композиции. Нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуногенный пептид, включают в геном или эписому вируса или бактерии. Нуклеиновую кислоту могут включать таким образом, чтобы иммуногенный фрагмент экспрессировался как белок секреции или как белок слияния с белком наружной поверхности вируса или с трансмембранным белком бактерии таким образом, что пептид б1кр1ауеб. Бактерии и вирусы, используемые для таких целей, должны быть непатогенными или аттенуированными. К подходящим вирусам относятся аденовирусы, НЗУ, вирус венесуэльского энцефалита лошадей и другие альфавирусы, вирус везикулярного стоматита и другие рабдо-вирусы, вирус коровьей оспы и оспы птиц. К подходящим бактериям относятся За1топе11а и ЗЫде11а. Слияние иммуногенного пептида с НЬкАд НВУ является особенно предпочтительным.

К терапевтическим агентам также относятся пептиды и другие соединения, чьи аминокислотные последовательности необязательно полностью идентичны последовательности альфа-З№ но тем не менее выполняют функцию миметиков альфа-ЗN и индуцируют аналогичный иммунный ответ. Например, любые пептиды или белки, формирующие альфа-складчатые структуры, могут быть скринированы на предмет возможности их использования. Антиидиотипические антитела к моноклональным антителам к альфа-ЗN или другим компонентам телец Леви также могут использоваться. Указанные анти-1б антитела мимикрируют антиген и генерируют иммунный ответ к нему (см. Е88епйа1 1ттипо1оду, Кой еб., В1аск\ге11 Зйепбйс РиЫкайопк, Ра1о Ако, СА 6^!к еб., р. 181). Агенты, отличные от альфа-З№ должны индуцировать иммуногенный ответ к одному или нескольким предпочтительным сегментам альфа-З№ представленным выше (например, МАС). Предпочтительно указанные агенты индуцируют иммунный ответ, который специфически направлен к одному или нескольким из указанных сегментов и при этом не затрагивает другие сегменты альфа-ЗК

Множественные библиотеки пептидов или других соединений также могут быть изучены на предмет возможности их использования в целях настоящего изобретения. Комбинаторные библиотеки могут быть созданы для многих типов соединений, которые могут быть синтезированы в несколько этапов. К указанным соединениям относятся полипептиды, бета-обратные миметики, полисахариды, фосфолипиды, гормоны, простагландины, стероиды, ароматические соединения, гетероциклические соединения, бензодиазепины, олигомерные Ν-замещенные глицины и олигокарбаматы. Большие комбинаторные библиотеки соединений могут быть сконструированы с помощью метода кодируемых синтетических библиотек (ЕЗЬ, от англ. Епсобеб ЗупШейс МЬгапек), описанного АГГутах, XVΟ 95/12608, АГГутах, νΟ 93/06121, Со1итЫа итуегкйу, νΟ 94/08051, Ркагтасоре1а, νΟ 95/35503 и Зспррк, νΟ 95/30642 (все указанные заявки включены в настоящее изобретение в качестве ссылок). Пептидные библиотеки также могут быть созданы с помощью фагово-дисплейного метода. См., например, Оеу1т, νΟ 91/18980.

Комбинаторные библиотеки и другие соединения первоначально скринируют на их способность связываться с антителами или лимфоцитами (В или Т), специфичными для альфа-ЗN или других компонентов телец Леви. Например, первоначальные тесты могут быть осуществлены с любым поликлональным сывороточным или моноклональным антителом к альфа-ЗN или его фрагменту. Предпочтительно библиотеки скринируют на их способность связываться с антителами, которые, в свою очередь, специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 или 70-140 α-синуклеина человека. Затем соединения могут быть скринированы на специфическое связывание со специфическими эпитопами альфа-ЗN (например, 8Ν1-20, ЗN83-101, ЗN107-125, ЗШ10-128 и З№24-140). Соединения могут быть тестированы с помощью тех же методик, которые описаны для картирования специфичности эпитопов антител. Соединения, идентифицированные с помощью таких методик, затем дополнительно анализируют на их способность индуцировать образование антител или реактивных лимфоцитов к альфа-ЗN или его фрагментам. Например, множественные разведения сыворотки могут быть протестированы на планшетах для микротитрования, которые предварительно покрывают альфа-ЗN или его фрагментами, а для определения реактивных антител к альфа-ЗN или его фрагментам может быть осуществлена стандартная ЕЫЗА. Затем изучают профилактическую и терапевтическую эффективность соединений на трансгенных животных, предрасположенных к развитию заболевания, ассоциированного с наличием телец Леви, как описано в примерах. К указанным трансгенным животным относятся, например, трансгенные мыши, избыточно экспрессирующие альфа-ЗN или его мутантные формы (например, замена аланина на треонин в положении 53), как описано, например, в заявке νΟ 98/59050, Маккак, е1 а1., Заепсе 287:1265-1269 (2000) и уап бег Рийег, е1 а1., 1. №иго8с1епсе 20:6025-6029 (2000), или такие трансгенные мыши, которые также избыточно экспрессируют АРР или его мутантные формы. Наиболее предпочтительными являются такие трансгенные мыши, которые несут 717 мутацию АРР, описанные Сатек е1 а1., №11иге 373, 523 (1995), а также трансгенные мыши, несущие Шведскую мутацию 670/671 АРР, как описано МсСоп1одие е! а1., ИЗ 5612486 и Нк1ао е! а1., Зс1епсе, 274, 99 (1996); З!аи£епЫе1 е! а1., Ргос. №111. Асаб. Зсг ИЗА, 94, 13287-13292 (1977); З!игск1ег-Р1егга! е! а1., Ргос. ЫаИ. Асаб. Зск ИЗА, 94, 13287-13292 (1997); Вогске1! е! а1., №игоп, 19, 939-945 (1997)). Примеры указанных синуклеин/АРР трансгенных животных описаны в заявке νΟ 01/60794. Дополнительными животными моделями РО являются 6-гидроксидопармин, ротенон и 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МРТР), М. Е1т! Веа1., №11иге Кеу1е\\ъ №иго8с1епсе,

- 16 013752

2:325-334 (2001). Аналогичный подход может использоваться для анализа других потенциальных аналогов альфа-δΝ и более длинных пептидов, включая фрагменты альфа-δΝ, описанные выше, и другие компоненты телец Леви, а также их аналоги и фрагменты.

ί) Активная иммунизация для инициации иммунного ответа к эпитопам на обоих концах α-синуклеина.

Как описано в настоящем изобретении, введение антител, распознающих эпитопы в аминоконцевых и карбоксиконцевых участках α-синуклеина (например, 8А5 и 6Н7), приводит к уменьшению агрегации α-синуклеина в головном мозге трансгенных мышей, избыточно экспрессирующих α-синуклеин человека (см., например, пример ИС). На основании указанного открытия было сделано предположение о том, что индукция иммунного ответа к эпитопам на обоих концевых участках α-синуклеина будет являться более эффективной для профилактики и лечения. Таким образом, согласно одному своему аспекту настоящее изобретение относится к способу профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, заключающемуся в индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 или, альтернативно, по остаткам 1-10 α-синуклеина человека и с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения иммунный ответ включает образование антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 α-синуклеина человека и остаткам 120-140 α-синуклеина человека. Иммунный ответ, который включает образование антител к эпитопам на обоих концевых участках белка, может быть обозначен как двойной иммунный ответ. Двойной иммунный ответ может быть индуцирован различными способами, настоящее изобретение не ограничивается каким-либо определенным способом индукции указанного иммунного ответа.

Двойной иммунный ответ может быть индуцирован путем вакцинации единичным полипептидом, который является эффективным в отношении индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 α-синуклеина человека, и антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека. Согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения антитела специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-10 и/или по остаткам 120-140 α-синуклеина человека. Также может использоваться полипептид, не имеющий в своем составе по крайней мере остатков 25-69 α-синуклеина человека, по крайней мере остатков 30-110 α-синуклеина человека или по крайней мере остатков 21-119 α-синуклеина человека. Когда используются указанные полипептиды, в иммунном ответе не участвуют антитела, специфически связывающиеся с эпитопом по остаткам 25-68 α-синуклеина человека.

Двойной иммунный ответ также может быть индуцирован путем вакцинации комбинацией двух (или более) полипептидов, при этом один полипептид индуцирует иммунный ответ, включающий образование антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 1-20 α-синуклеина человека, а другой полипептид индуцирует иммунный ответ, включающий образование антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитела специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-10 и/или по остаткам 120-140 α-синуклеина человека. Таким образом, лечебный или профилактический эффект может быть достигнут введением первого иммуногенного фрагмента α-синуклеина, который индуцирует иммунный ответ с образованием антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 1-20 α-синуклеина человека, и второго иммунного фрагмента, который индуцирует иммунный ответ с образованием антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 70-140 (или 120-140) α-синуклеина человека. Фрагменты α-синуклеина человека могут вводиться в комбинации, как описано выше (например, вводиться в форме белка слияния или конъюгата, в составе одной лекарственной формы или во время одного курса лечения).

ίί) Композиции и наборы.

Настоящее изобретение относится к композициям, полезным для индукции иммунного ответа к эпитопам обоих концевых участков α-синуклеина. Композиции содержат дозированные формы и лекарственные формы, включающие два или более полипептида, как описано выше, при этом один полипептид индуцирует иммунный ответ с образованием антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 1-20 α-синуклеина человека, и антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения полипептиды индуцируют образование антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-10 и/или по остаткам 120-140 α-синуклеина человека. Примерные композиции (подходящие для совместного применения полипептидов) известны специалистам в данной области и включают те, которые описаны ниже в разделе VII (Лечебные режимы).

- 17 013752

Настоящее изобретение также относится к наборам для индукции иммунного ответа к эпитопам обоих концевых участках α-синуклеина. Указанные наборы включают два или более агента, которые индуцируют иммунный ответ с образованием антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 1-20 α-синуклеина человека, и антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека. Агенты могут быть скомбинированы в одной лекарственной форме для одновременного введения. Агенты могут находиться в составе различных контейнеров (например, флаконах, шприцах, тюбиках и т. п.), каждый из которых содержит свой полипептид, для одновременного, последовательного или раздельного введения. Указанные агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут также вводиться в комбинации с другими агентами, которые, по крайней мере частично, эффективны для лечения заболеваний с тельцами Леви. Наборы также могут содержать агенты, которые усиливают прохождение агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, через гематоэнцефалический барьер, а также другие адъюванты и материалы для введения пациенту.

2. Агенты для индукции пассивного иммунного ответа.

К терапевтическим агентам, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, также относятся антитела, которые специфически связываются с альфа-§N или другими компонентами телец Леви. Настоящее изобретение также относится к антителам, которые специфически связываются с NΑС компонентом синуклеина амилоидной бляшки. Антитела, иммунореактивные в отношении альфа-§^ хорошо известны специалистам (см., например, Апша. с1 а1., Впав Век. 808:93-100 (1988); Сго\\111сг с1 а1., №иго5С1епсе Ьей. 292:128-130 (2000); §рй1апйш, е1 а1. №1иге 388:839-840 (1997). Указанные антитела могут быть поликлональными и моноклональными. Некоторые из указанных антител специфически связываются с нерастворимыми агрегатами альфа-§N без специфического связывания с растворимыми мономерными формами. Некоторые антитела специфически связываются с растворимыми мономерными формами без специфического связывания с нерастворимыми агрегированными формами. Некоторые антитела специфически связываются как с растворимыми мономерными формами, так и с нерастворимыми формами. Некоторые указанные антитела специфически связываются с природными короткими формами альфа-§N (например, NАС) без специфического связывания с природным полноразмерным альфа-§К Некоторые антитела специфически связываются с полноразмерной формой без связывания с короткой формой альфа-§№ Некоторые антитела специфически связываются с альфа-§N без связывания с другими компонентами ЬВк. Некоторые антитела специфически связываются с альфа-§N без специфического связывания с другими компонентами амилоидных бляшек. См. заявку РСТ А0 05/0138889 и заявку на патент и§ № 60/471929 от 19 мая 2003 г., которые включены в настоящее описание в качестве ссылок; в указанных заявках раскрываются специфические антитела, которые специфически связываются с фрагментами α-синуклеина без специфического связывания непосредственно с интактным α-синуклеином. Указанные антитела являются полезными для профилактики и лечения синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний.

В экспериментах, осуществленных для раскрытия настоящего изобретения, ргебюбуе ех νίνο анализ (пример νΙΙ) используют для тестирования антитела, специфически связывающегося с NАС компонентом синуклеина. Обеспечивают контакт антитела к NАС с образцом ткани головного мозга, содержащим амилоидные бляшки и микроглиальные клетки. В качестве контроля используют сыворотку кролика. Последующий мониторинг выявил значительное уменьшение количества и размеров бляшек, что свидетельствует об очищающем эффекте антитела.

Из представленных данных можно сделать вывод, что амилоидная нагрузка, ассоциированная с болезнью Альцгеймера и другими амилоидными заболеваниями, может быть значительно уменьшена путем применения иммунных агентов, направленных против эпитопов NАС, которые являются эффективными в отношении уменьшения амилоидной нагрузки. Также понятно, что в указанных композициях может использоваться широкий спектр антител. Как обсуждалось выше, заявка на патент и§ № 60/471929 от 19 мая 2003 г., раскрывает специфические антитела, которые специфически связываются с фрагментами α-синуклеина без специфического связывания с интактным α-синуклеином рег ке.

Антитела, используемые в лечебных целях, обычно имеют интактный константный участок или по крайней мере достаточную часть константного участка для взаимодействия с Рс-рецептором. Изотип Ι§Ο1 человека является предпочтительным, поскольку он имеет наиболее высокую аффинность по отношению к РсВВрецептору фагоцитарных клеток из всех изотипов человека. Также могут использоваться биспецифические РаЬ-фрагменты, в которых одно плечо антитела является специфичным для альфа-§Н а другое - для Рс-рецептора. Некоторые антитела связываются с альфа-§Н возможно в денатурированной форме, таким образом, что при обработке §Ό§ аффинность связывания достигает 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10¹⁰ М^-1 и более. Некоторые антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, специфически связываются с α-синуклеином человека в синапсах или телах нейрональных клеток, что определяется с помощью иммуноцитогистохимических способов.

- 18 013752

Поликлональная сыворотка обычно содержит смешанные популяции антител, связывающихся с несколькими эпитопами на протяжении альфа-§№ Однако поликлональная сыворотка может быть специфичной по отношению к определенному сегменту альфа-§Н такому как NΑС. Поликлональная сыворотка, которая является специфичной по отношению к определенному сегменту, содержит антитела, которые специфически связываются с указанным сегментом, и не содержит антител, которые специфически связываются с другими сегментами альфа-§№ Моноклональные антитела связываются со специфическим эпитопом альфа-§Н который может представлять собой конформационный и неконформационный эпитоп. Неконформационные эпитопы сохраняются при денатурации альфа-§N §Ό§. Профилактическая и терапевтическая эффективность антител может быть оценена с использованием методик на модельных трансгенных животных, как описано ниже в примерах. Некоторые моноклональные антитела связываются с эпитопом участка NΑС. Согласно некоторым способам используют множественные моноклональные антитела, обладающие специфичностью связывания по отношению к различным эпитопам. Такие антитела могут вводиться одновременно или последовательно. Также могут использоваться антитела к другим компонентам телец Леви, отличным от альфа-§№ Например, антитела могут быть направлены против нейрофиламента, убиквитина или синфилина. К терапевтическим агентам также относятся антитела, направленные против аналогов альфа-§N и его фрагментов. Некоторые терапевтические агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, все, представляют собой Ό-пептиды, например все - ^-альфа-§N или все - О-ИАС.

Когда говорят о том, что антитело связывается в эпитопом по специфическим остаткам, таким как, например, альфа-8К1-5, это означает, что антитело специфически связывается с полипептидом, в составе которого имеются указанные остатки (т.е. с альфа-§Ш-5. как в данном примере). Указанное антитело необязательно вступает в контакт с каждым из остатков 1-5, также как не каждая единичная аминокислотная замена или делеция в пределах альфа-§№-5 обязательно существенно влияет на афинность связывания. Эпитопная специфичность антитела может быть определена, например, путем формирования фагово-дисплейной библиотеки, разные члены которой представляют различные последовательности альфа-§№ Затем из фагово-дисплейной библиотеки выбирают те члены, которые специфически связываются с тестируемым антителом. Семейство последовательностей изолируют. Обычно указанное семейство включает общую основную последовательность и различные по длине и фланкирующие последовательности других членов библиотеки. Самая короткая основная последовательность, демонстрирующая специфическое связывание с антителом, представляет собой эпитоп, связываемый антителом. Эпитопная специфичность антител также может быть определена с помощью анализа конкурентного связывания с использованием антител, чья эпитопная специфичность уже была установлена.

Некоторые антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, специфически связываются с эпитопом участка NАС. Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом гликозилированной формы синуклеина массой 22 кДа, например Р22-синуклеином (Н. §Ытига с1 а1., §с1епсе 2001 1и1. 13:293 (5528):224-5).

Некоторые антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, связываются с эпитопом на ^концевом участке альфа-§N (например, с эпитопом по аминокислотным остаткам 1-20 или остаткам 1-10 α-синуклеина, пронумерованным в соответствии с §ЕО ΙΌ N0:1). Некоторые антитела связываются с эпитопом, в котором ^концевой остаток представляет собой ^концевой участок полноразмерного альфа-§№ Указанные антитела не связываются с делеционными мутационными формами α-синуклеина, в которых отсутствует 1 остаток. Некоторые из указанных антител не связываются с полноразмерным α-синуклеином, в котором ^концевая аминокислота связана с гетерологичным полипептидом. Некоторые антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-69 или 1-20 α-синуклеина человека. Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом сегмента α-синуклеина человека, выбранного из остатков 1-Ы_а последовательности §Е0 ΙΌ N0:1, где N составляет от 5 до 20; остатков 2-Ы_ь последовательности §Е0 ΙΌ N0:1, где N5 составляет от 6 до 21; или остатков 3-Ы_с последовательности §Е0 ΙΌ N0:3, где N составляет от 7 до 22. Некоторые антитела связываются с эпитопом сегмента α-синуклеина, выбранного из группы, включающей §N1-5, §N1-6, §N1-7, §N1-8, §N1-9, §N1-10, §N1-11, §N1-12, §N1-13, §N1-14, §N1-15, §N1-16, §N1-17, §N1-18, §N1-19 и §N1-20.

Некоторые антитела связываются с эпитопом, расположенным на или около С-концевого участка альфа-§N (например, по аминокислотным остаткам 70-140, 100-140, 120-140, 130-140 или 135-140). Некоторые антитела связываются с эпитопом, в котором С-концевой аминокислотный остаток представляет собой С-концевой остаток (полноразмерного) альфа-§№ Указанные антитела не связываются с делеционными мутантами α-синуклеина, в которых отсутствует 140 остаток. Некоторые из указанных антител не связываются с полноразмерным α-синуклеином, в котором С-концевая аминокислота связана с гетерологичным полипептидом. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитело специфически связывается с NАС без связывания с полноразмерным альфа-§№

- 19 013752

Некоторые антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, специфически связываются с эпитопом по остаткам 70-140 или 83-140 α-синуклеина человека. Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом по остаткам 120-140 α-синуклеина человека. Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом сегмента α-синуклеина человека, выбранным из группы, включающей

83-101,107-125, 110-128 и 124-140. Некоторые антитела связываются с эпитопом сегмента α-синуклеина человека, выбранным из группы, включающей

Б^ 128-140.

Б^ 136-140.

Б^ 125-139.

Б^ 133-139.

Б^ 126-138.

Б^ 133-138.

Б^ 128-137.

Б^ 124-136.

Б^ 129-140.

Б^ 137-140.

Б^ 126-139.

Б^ 134-139.

Б^ 127-138.

Б^ 134-138.

Б^ 129-137.

Б^ 125-136.

Б№30-140,

Б№24-139,

Б№27-139,

Б№35-139,

Б№28-138,

Б№35-138,

Б№30-137,

Б№26-136, §N131-140,

Б^ 125-139.

Б^ 128-139.

Б^ 136-139.

Б^ 129-138.

Б^ 136-138. §N131-137,

Б^ 127-136.

Б№24-140, Б^ 132-140. Б^ 126-139. Б^ 129-139. Б^ 137-139. Б^ 130-138. Б^ 124-137. Б^ 132-137. Б^ 128-136.

Б^И 125-140,

Б^ 133-140,

Б^ 127-139,

Б^ 130-139,

Б^ 124-138,

БМ31-138,

Б^ 125-137,

Б^ 133-137,

Б^ 129-136,

Б№26-140,

Б^ 134-140,

Б^ 128-139,

БМ31-139,

Б^ 124-138,

БМ31-138,

Б^ 126-137,

Б^ 134-137,

Б^ 130-136,

БШ27-140.

Б^ 135-140,

Б^ 124-139,

Б^ 132-139,

Б^ 125-138,

Б^ 132-138,

Б^ 127-137,

Б^ 135-137,

БМ31-136,

Б№32-136, Б№33-136 и БМ43-136.

Моноклональные антитела, связывающиеся с С-концевыми эпитопами, предпочтительно связываются с α-синуклеином человека с высокой аффинностью, составляющей по крайней мере 10⁸, 10⁹ или 10¹⁰ М^-1.

Моноклональные или поликлональные антитела, которые специфически связываются с предпочтительным сегментом альфа-БN без специфического связывания с другими участками альфа-БН имеют ряд преимуществ по сравнению с моноклональными антителами, связывающимися с другими участками или поликлональной сывороткой к интактному альфа-БА Во-первых, для равных массовых дозировок дозы антител, которые специфически связываются с предпочтительными сегментами, включают более высокие молярные дозировки антител, эффективных для растворения амилоидных бляшек. Во-вторых, антитела, специфически связывающиеся с предпочтительными сегментами, могут индуцировать иммунный ответ, способствующий исчезновению ЬВ§, без индукции иммунного ответа к интактному альфа-БН что приводит к уменьшению вероятности возникновения побочных эффектов.

Профилактическая или терапевтическая активность антител может быть протестирована на трансгенных животных, моделях заболеваний с ЬВ§, как описано выше. Коллекция антител может быть также предварительно протестирована на наличие контрольного связывания с денатурированным α-синуклеином или его фрагментом. Контрольные аффинности связывания могут быть определены на основании контрольной интенсивности сигналов в иммуноблоттинге. Антитело, имеющее контрольную аффинность связывания, превышающую среднюю величину, или предпочтительно антитело, имеющее наибольшую установленную аффинность связывания, отбирают для дальнейшего анализа на трансгенных животных. Аналогичное предварительное скринирование может быть осуществлено для тестирова ния антител на предмет связывания с агрегированным α-синуклеином в тканевых срезах с помощью иммуногистохимических способов. Тканевые срезы могут быть приготовлены из головного мозга больных людей или модельных трансгенных животных.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения антитело, обозначаемое как 6Н7, или антитело, которое конкурирует с 6Н7 за специфическое связывание с α-синуклеином, используется для пассивной иммунизации. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения антитело, обозначаемое как 8А5, или антитело, которое конкурирует с 8А5 за специфическое связывание с α-синуклеином, используется для пассивной иммунизации. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения 6Н7 или 8А5 используют в комбинации друг с другом или с другими антителами к α-синуклеину.

ί) Активная иммунизация для индукции иммунного ответа, направленного против эпитопов на обоих концевых участках α-синуклеина.

Как описано в настоящем изобретении, введение антител, распознающих эпитопы на аминоконцевых и карбоксиконцевых участках α-синуклеина (например, 8А5 или 6Н7), приводит к уменьшению агрегации α-синуклеина в головном мозге трансгенных мышей, избыточно эксперессирующих α-синуклеин человека (см. пример IX). На основании указанного открытия авторами было сделано предположение, что введение комбинации антител, которые распознают №концевой эпитоп (например, как описано выше), и антител, которые распознают С-концевой эпитоп (например, как описано выше), будет особенно эффективным для профилактики и лечения. Следовательно, согласно одному своему аспекту настоящее изобретение относится к способу профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, который заключается во введении пациенту, страдающему от указанного заболевания или имеющему риск его развития, первого антитела, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-20 α-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с БЕО Ш N0:1, и второго антитела, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 α-синуклеина человека, в эффективном режиме. Предпочтительно первое

- 20 013752 антитело связывается с эпитопом α-синуклеина с последовательностью, состоящей из остатков 1-Ν ЗЕО ГО N0:1, где Ν₃ составляет от 5 до 20; с последовательностью остатков 2-Ν 8Е0 ГО N0:1, где N составляет от 6 до 21; и/или с последовательностью остатков 3-Ν 8Е0 ГО N0:1, где N составляет от 7 до 22. Предпочтительно второе антитело специфически связывается с эпитопом по остаткам 120-140 α-синуклеина человека. Первое и второе антитела могут вводиться одновременно (например, в составе одной лекарственной формы), в один день, в один месяц и/или во время одного курса лечения.

ίί) Композиции и наборы.

Настоящее изобретение относится к композициям для профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, включающей одно или более антитело, которое связывается с концевым участком α-синуклеина и, например, имеет специфичность, как описано выше. Композиции включают дозированные формы и лекарственные формы, содержащие два и более антитела. Примерные лекарственные формы (подходящие для одновременного введения антител) хорошо известны специалистам в данной области и включают лекарственные формы, описанные в разделе VII (Лечебные режимы).

Настоящее изобретение также относится к наборам для профилактики и лечения заболевания, харастеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге. Указанные наборы содержат два (или более) антитела, при этом первое антитело связывается с эпитопом на Ν-концевом участке α-синуклеина человека, а второе антитело связывается с эпитопом на С-концевом участке α-синуклеина человека. Указанные антитела могут быть объединены в одной лекарственной форме или в одном наборе для одновременного введения. Альтернативно, антитела могут находиться в разных контейнерах (например, фалконах, шприцах, тюбиках и т.д.) в составе набора для одновременного, последовательного или раздельного использования. Указанные антитела могут также вводиться в комбинации с другими агентами, которые, по крайней мере частично, эффективны для лечения заболеваний с образованием телец Леви. Набор также может содержать агенты, которые улучшают прохождение антител, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, через гемато-энцефалический барьер, а также другие адъюванты и материалы для введения пациенту.

ϊϊΐ) Общая характеристика иммуноглобулинов.

Основная структурная единица антитела, как известно, представляет собой тетрамер субъединиц. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая из пар имеет одну легкую (около 25 кДа) и одну тяжелую цепь (около 50-70 кДа). Аминоконцевой отдел каждой из цепей имеет вариабельный участок, состоящий приблизительно из 100-110 или более аминокислот, который отвечает, в первую очередь, за распознавание антигена. Карбоксиконцевой отдел каждой цепи включает константный участок, отвечающий главным образом за эффекторную функцию.

Легкие цепи классифицируют на две группы: каппа и лямбда. Тяжелые цепи классифицируют на гамма, мю, альфа, дельта и ипсилон цепи, в соответствии с чем разделяют следующие изотипы антител: 1дО, 1дМ, 1дА, 1§ϋ и 1дЕ соответственно. В составе легких и тяжелых цепей вариабельный и константный участки соединены участком I, состоящим приблизительно из 12 аминокислот, при этом тяжелые цепи также имеют Ό участок, состоящий приблизительно из 10 или более аминокислот (см. в общем Еипбатеп!а1 1ттипо1о§у, Раи1, ^., еб., 2^пб еб. Вауеп Ргекк, Ν.Υ., 1989, СИ. 7 (включена в настоящее описание в качестве ссылки).

Вариабельные участки каждой пары легкой/тяжелой цепей формируют антигенсвязывающий сайт антитела. Таким образом, интактное антитело имеет два связывающих сайта. За исключением бифункциональных или биспецифических антител указанные два связывающих сайта являются одинаковыми. Все цепи имеют одинаковую общую структуру относительно консервативных каркасных участков (ЕВ, от англ. Егате^огк Ведюп), связанных тремя гипервариабельными участками, которые также обозначают как участки, определяющие комплементарность или СГОВк (от англ. Сотр1етеп!агйу Ое1епптд Ведюп). СГОВк двух цепей каждой пары сближены за счет каркасных участков, что обеспечивает связывание со специфическим эпитопом. От Ν-концевого участка до С-концевого участка обе, легкая и тяжелая, цепи включают следующие домены: ЕВ1, СГОВЕ ЕВ2, СЭВ2, ЕВ3, СГОВ3 и ЕВ4. Распределение аминокислот в каждом домене соответствует тому, что приведено у КаЬа!, Зесщепсек о£ Рго!етк о£ 11птипо1оДса1 1п1егек1 (№1юпа1 1пк1йи1ек о£ НеаЙИ, ВеШекба, ΜΌ; 1987 и 1991); СИойа & Ьекк, I. Мо1. Вю1. 196:901-917 (1987) или Ско!Ыа е! а1., Уинге 342:878-883 (1989).

ίν) Получение нечеловеческих антител.

Химерные и гуманизированные антитела имеют такую же или аналогичную специфичность связывания и аффинность, как и мышиные или другие нечеловеческие антитела, которые являются стартовым материалом для конструирования химерных или гуманизированных антител. Химерные антитела представляют собой антитела, чьи гены тяжелых и легких цепей были выделены, обычно с помощью генной инженерии, из генных сегментов иммуноглобулинов, принадлежащих другим видам животных. Например, вариабельные (V) сегменты генов моноклональных антител мышей могут быть присоединены к константным (С) сегментам человека, таким как 1дС1 и 1дС4. Изотип 1дС1 человека является предпочтительным. Согласно некоторым способам изотипом антитела является 1дС1 человека. Также согласно не

- 21 013752 которым способам могут использоваться антитела класса М. Типичное химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из V или антигенсвязывающего домена мышиного антитела и С или эффекторного домена антитела человека.

В гуманизированных антителах каркасные аминокислотные остатки вариабельного участка почти полностью заменены остатками из антитела человека (обозначаемого как акцепторное антитело), а участки, определяющие комплементарность выделены из мышиного антитела (обозначаемого как донорский иммуноглобулин). См., Оиееп е! а1., Ργοο. Ναΐί. Асаб. 8οί. И8А, 86:10029-10033 (1989), \У0 90/07861, υδ 5693762, υδ 5693761, υδ 5585089, υδ 5530101 и Χνίη^Γ υδ 5225539 (все документы приведены здесь в качестве ссылок). Константные участки, в случае их наличия, также частично или полностью представлены участками иммуноглобулина человека. Человеческие вариабельные домены обычно выбирают из антител человека, чьи каркасные последовательности имеют высокий процент идентичности с мышиными вариабельными доменами, из которых получают СЭРк. Каркасные аминокислотные остатки вариабельных участков тяжелых и легких цепей могут быть выделены из одинаковых или различных последовательностей антител человека. Последовательность антитела человека может представлять собой последовательность природных антител человека или может представлять собой последовательность, сконструированную из нескольких антител человека. См. Сайег е! а1., \¥0 92/22653.

3. Фагово-дисплейные способы.

Другой подход для получения человеческих анти-альфа-δΝ антител заключается в скринировании библиотеки ДНК из В-клеток человека в соответствии с общим протоколом, изложенным Нике е! а1., 8с1епсе, 246:1275-1281 (1989). Как было описано для триомной методики, указанные В-клетки могут быть получены из организма человека, иммунизированного альфа-δΝ, его фрагментом, более длинным полипептидом, имеющим в своем составе альфа-δΝ или его фрагменты, или антиидиотипическим антителом. В-клетки также могут быть получены из организма человека, который в будущем будет получать лечение указанными антителами. Антитела, связывающиеся с альфа-δΝ или его фрагментом, отбирают. Последовательности, кодирующие указанные антитела (или связывающие фрагменты), затем клонируют и амплифицируют. Методика, описанная Нике, наиболее эффективна в комбинации с фагово-дисплейной методикой. См., например, Όο\\όγ е! а1., XV 0 91/17271 и МсС’аГГеЦу е! а1., XV0 92/01407, υδ 5877218, υδ 5871907, υδ 5858657, υδ 5837242, υδ 5733743 и υδ 5565332 (все источники приведены здесь в качестве ссылок). Согласно указанным способам создают фаговые библиотеки, члены которых экспонируют различные антитела на своей внешней поверхности. Антитела обычно представлены как Εν- или ЕЬ-фрагменты. Фаги, экспонирующие антитела с желаемой специфичностью, отбирают с помощью аффинного обогащения с использованием альфа-δΝ пептида или его фрагмента.

С помощью одного из вариантов фагово-дисплейного способа можно получить человеческие антитела, обладающие специфичностью связывания отобранного мышиного антитела. См. XVI Шег, Χν0 92/20791. Согласно указанному способу в качестве стартового материала используют вариабельные участки как легких, так и тяжелых цепей отобранного мышиного антитела. В том случае, если в качестве стартового материала выбирают вариабельный участок легкой цепи, фаговую библиотеку конструируют так, чтобы ее члены экспонировали тот же вариабельный участок легкой цепи (т. е. в качестве стартового материала используют мышиное антитело) и другой вариабельный участок тяжелой цепи. Вариабельные участки тяжелой цепи получают из библиотеки перегруппированных вариабельных участков тяжелых цепей антител человека. Фаг, демонстрирующий сильную специфичность связывания с альфа-δΝ (например, по крайней мере 10⁸ М^-1и предпочтительно по крайней мере 10⁹ М^-1), отбирают. Вариабельный участок тяжелой цепи человека указанного фага затем используют в качестве стартового материала для конструирования дополнительной фаговой бибилиотеки. В указанной библиотеке каждый фаг экспонирует такой же вариабельный участок тяжелой цепи (т.е. участок, идентифицированный в первой фаговой-дисплейной библиотеки) и другой вариабельный участок легкой цепи. Вариабельные участки легкой цепи получают из библиотеки перегруппированных вариабельных участков легких цепей антител человека. Аналогично, фаг, демонстрирующий сильную специфичность связывания с альфа-δΝ, отбирают. Указанный фаг экспонирует вариабельные участки полностью человеческих анти-альфа-δΝ антител. Указанные антитела обычно имеют такую же или аналогичную эпитопную специфичность, как и стартовые мышиные антитела.

ί) Отбор константных участков.

Вариабельные участки тяжелых и легких цепей химерных, гуманизированных или человеческих антител могут быть соединены по крайней мере с частью константных участков человека. Выбор константного участка зависит частично от того, требуется ли антитело-зависимая комплемент- и/или клеточноопосредованная токсичность. Например, изотипы ЦС1 и !дС3 обладают способностью активировать комплемент, а изотипы !дС2 и !дС4 - нет. Выбор изотипа также может повлиять на прохождение антитела через гематоэнцефалический барьер. Антитела могут экспрессироваться как тетрамеры, содержащие две легкие и две тяжелые цепи, как отдельные тяжелые цепи, легкие цепи, ЕаЬ, ЕаЬ' Е(аЬ')₂ и Εν-фрагменты, как одноцепочечные антитела, в которых вариабельные домены легких и тяжелых цепей соединены через спейсер.

- 22 013752 ίί) Экспрессия рекомбинантных антител.

Химерные, гуманизированные и человеческие антитела обычно получают с помощью рекомбинантной экпрессии. Рекомбинантные полинуклеотидные конструкты обычно включают последовательность контроля экспрессии, оперативно связанную с последовательностью, кодирующей цепи антитела, включая природные ассоциированные и гетерологичные промоторные участки. Предпочтительно последовательности контроля экспрессии являются эукариотическими промоторными системами в векторах, способных трансформировать или трансфецировать эукариотические клетки-хозяева. После того как вектор был включен в организм подходящего хозяина, для хозяина поддерживают условия, подходящие для высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей, а также для отбора и очищения перекрестно-реагирующих антител.

Указанные векторы экспрессии обычно являются реплицируемыми в организмах хозяев как эписомы и как интегральная часть хромосомальной ДНК хозяина. Обычно векторы экспрессии имеют маркеры селекции, например устойчивость к ампициллину или гидромицину, что позволяет установить те клетки, которые были трансформированы желаемой ДНК последовательностью.

Е.сой представляет собой пример прокариотической клетки-хозяина, которая особенно приемлема для клонирования ДНК последовательностей, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Микробы, такие как, например, дрожжи, также подходят для экспрессии. Сахаромицеты являются предпочтительными дрожжевыми клетками-хозяевами с подходящими векторами, включающими последовательность контроля экспрессии, точку начала репликации, терминирующие последовательности и пр., при необходимости. К типичным промоторам относятся 3-фосфоглицераткиназа и другие гликолитические ферменты. К индуцибельным дрожжевым промоторам относятся, среди прочих, промоторы из алкогольдегидрогеназы, изоцитохрома С и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы.

Клетки млекопитающих являются предпочтительными хозяевами для экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих иммуноглобулины или их фрагменты. См. ХУтпаскег Ггот Сепек 1о С1опек (УСН РиЬНкйегк, ΝΥ, 1987). В настоящее время был создан целый ряд подходящих клеточных линий, способных секретировать интактные гетерологичные белки, примерами являются клеточные линии СНО, различные клеточные линии С0δ, НеЬа клетки, Ь-клетки, эмбриональные почечные клетки человека и миеломные клеточные линии. Предпочтительно, клетки имеют нечеловеческую природу. Векторы экспрессии для указанных клеток могут включать последовательности контроля экспрессии, такие как точка начала репликации, промотор, энхансер (Онееп е! а1., 1ттипо1. Кеу. 89:49 (1986)), а также необходимые информационные сайты процессинга, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминирования транскрипции. Предпочтительные последовательности контроля экспрессии представляют собой промоторы, выделенные из эндогенных генов, цитомегаловируса, δν40, аденовируса, папилломавируса коров и т.д. См. Со е! а1., I. 1ттипо1. 148:1149 (1992).

Альтернативно, последовательности, кодирующие антитела, могут быть включены в трансгены для встраивания в геном трансгенного животного и последующей экспрессии в молоке трансгенного животного (см., например, υδ 5741957, υδ 5304489, υδ 5849992). К подходящим трансгенам относятся последовательности, кодирующие легкие и/или тяжелые цепи, оперативно связанные с промотором или энхансером из специфического гена железы млекопитающего, такого как ген казеина или лактоглобулина.

Векторы, содержащие ДНК сегменты, представляющие интерес, могут быть перенесены в клеткухозяин с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области, в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, перенос с помощью хлорида кальция обычно используют для прокариотических клеток, в то время как обработка фосфатом кальция, электропорация, липофекция, биолистика или вирус-опосредованная трансфекция используются для других клеток-хозяев. К другим способам, используемым для трансформации клеток млекопитающих, относятся использование полибрена, протопластическое слияние, липосомы, электропорация и микроинъекция (см., δатЬ^оок е! а1., кирга). Для получения трансгенных животных трансгены могут быть микроинъецированы в оплодотворенные ооциты или включены в геном эмбриональных стволовых клеток, а ядра указанных клеток переносят в энуклеированные ооциты.

После экспрессии антитела могут быть очищены с помощью стандартных методик, хорошо известных специалистам в данной области, включая НРЬС очищение, хроматографию на колонке, электрофорез в геле и т.д. (см. δсорек, Рго!ет РипЕсайоп ^рппдег-Уег1ад, ΝΥ, 1982)).

4. Конъюгаты.

Некоторые агенты для индукции иммунного ответа имеют в своем составе подходящий эпитоп для индукции иммунного ответа к ЬВк, но являются слишком маленькими молекулами для того, чтобы быть иммуногенными. В таком случае пептидный иммуноген может быть соединен с подходящей молекулой носителя с формированием конъюгата, который будет способствовать индукции иммунного ответа. К подходящим носителям относятся альбумины сыворотки, гемоцианин моллюска фисуреллы, молекулы иммуноглобулинов, тиреоглобулин, овальбумин, столбнячный токсин или токсин другой патогенной бактерии, такой как бактерии дифтерии, Е.соН, холера или Н.ру1оп, или аттенуированные производные токсинов. Эпитопы Т-клеток также являются подходящими носителями. Некоторые конъюгаты могут

- 23 013752 быть сформированы путем связывания агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, с иммуностимулирующей полимерной молекулой (например, трипальмитоил-8-глицерин цистеином (Рат₃Су§), маннаном (полимером маннозы) или гликаном (бета 1^-2 полимером)), цитокинами (например, 1Ь-1, 1Ь-1 альфа и бета-пептиды, 1Ь-2, гамма-ΙΝΕ, 1Ь-10, СМ-С8Р) и хемокинами (например, М1Р1 альфа и бета и ΚΑΝΤΈ8). Иммуногенные агенты также могут быть соединены с пептидами, которые усиливают проникновение в ткани, как описано у О'Майопу, \νϋ 97/17613 и \νϋ 97/17614. Иммуногены могут быть присоединены к носителям, имеющим в своем составе спейсерные аминокислоты (например, д1у-д1у) или не имеющим их.

Некоторые конъюгаты могут быть сформированы путем связывания агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, по крайней мере с одним Т-клеточным эпитопом. Некоторые Т-клеточные эпитопы являются промискуитетными, в то время как другие являются универсальными. Промискуитетные Т-клеточные эпитопы обладают способностью усиливать индукцию Т-клеточного иммунитета у большого круга субъектов, демонстрирующих различные НЬА типы. В отличие от промискуитетных Т-клеточных эпитопов универсальные Т-клеточные эпитопы обладают способностью усиливать индукцию Т-клеточного иммунитета у большого процента (по крайней мере у 75%) субъектов, экспонирующих различные НЬА молекулы, кодируемые различными НЬА-ЭК аллелями.

Известно большое количество природных Т-клеточных эпитопов, например столбнячный токсин (например, эпитопы Р2 и Р30), поверхностный антиген вируса гепатита В, коклюшный токсин, Р белок вируса кори, большой основной мембранный белок С11атуб1а !гасйота!18, дифтеритический токсин, циклоспорозоит Т.Р1а§тобшт £а1арагит, С8 антиген Р1а§тобшт £а1с1рагит, триозофосфатизомераза 8с1и5Ю5ота тапкош, ТгаТ Е.со11, гемаглюттинин вируса гриппа (НА). Иммуногенные пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, также могут быть конъюгированы с Т-клеточными эпитопами, описанными 81шдад11а Р. е! а1., №!иге, 336:778-780 (1988); С’1ис/ К.М. е! а1., I. Ехр. Меб., 178:2747 (1993); Наттег I. е! а1., Се11, 74: 197-203 (1993); Ра1к К. е! а1., 1ттиподепейс8, 39:230-242 (1994); νϋ 98/23635; 8ои111\уооб 8. е! а1., I. 1ттипо1оду, 160:3363-3373 (1998) - все источники литературы приведены здесь в качестве ссылок.

Другими примерами являются

Гемаглюттинин вируса гриппа: ΗΑ₃ο7-3ΐ9ΡΚΥνΚφΝΤΤΓΕΚΣΑΤ (ЗЕО ГО N0:4)

Малярийный С8: ТЗ эпитоп ЕКК1АКМЕКА83УИ8У (ЗЕО ГО N0:5)

Поверхностный антиген вируса гепатита В: НЬнАд^.г® РРЬЬТВ1ЬТ1 (ЗЕО ГО N0:6)

Белок теплового шока 65: Ьвр65133-171 ООЗЮОЫАЕАМОКУΟΝΕΟ (ЗЕО ГО N0:7)

Бацилла Кальметта-Герина: ОУНЕОРЬРРАУУКЕ (ЗЕО ГО N0: 8)

Столбнячный токсин: ТТвзо-ш 03ΤΚΑΝ3ΚΡΙΟΙΤΕΕ (ЗЕО ГО N0: 9)

Столбнячный токсин: ТТ₉₄7-9б7 ΓΝΝΡΤν8Γ\νΤΚ.νΡΚν8Α3ΗΕΕ (ЗЕО ГО ΝΟ: 10)

Ηΐν §р 120 Т1: КОШЧМЗУрЕУОКАМУА (ЗЕО ГО ΝΟ: 11)

Альтернативно, конъюгаты могут быть сформированы путем связывания агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, по крайней мере с одним Т-клеточным эпитопом, способным связывать большую часть молекул МНС II класса, таким как эпитоп рап ΌΚ (РАОКЕ). РАОКЕ описан в патенте И8 5736142 и заявке νϋ 95/07707, а также у А1ехапбег I. е! а1., Iттишίу, 1:751-762 (1994), все источники литературы представлены здесь в качестве ссылок. Предпочтительный пептид РАОКЕ имеет последовательность АКХУАА^ТЬКААА (8Е0 ГО N0:12) (типичные остатки выделены жирным шрифтом), где X предпочтительно представляет собой циклогексилаланин, тирозин или фенилаланин, при этом циклогексилаланин является наиболее предпочтительным.

Иммуногенные агенты могут быть связаны с носителями с помощью химического перекрестного связывания. Методики связывания иммуногена с носителем включают формирование дисульфидных связей с использованием №сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионата (8РИР) и сукцинимидил-4-(№ малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (8МСС) (в том случае, если в пептиде отсутствует сульфигидрильная группа, ее включение может быть обеспечено добавлением остатка цистеина). Указанные реагенты создают дисульфидную связь между собой и обеспечивают включение остатка цистеина на одном белке, а также амидную связь между ипсилон-амино на лизине или другие три свободные аминогруппы на других аминокислотах. Различные дисульфид/амид-формирующие агенты описаны в Iттиη. Ксу. 62, 185 (1982). Другие бифункциональные соединяющие агенты формируют тиоэфиры, равно как и дисульфидные связи. Многие указанные тиоэфир-формирующие агенты являются коммерчески доступными и включают реактивные сложные эфиры 6-малеимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты и 2-йодуксусной кислоты, 4-(№малеимидо-метил)циклогексан-1-карбоксильной кислоты. Карбоксильные группы могут быть активированы путем их комбинирования с сукцинимидом или 1-гидроксил2-нитро-4-сульфоновой кислотой, ее натриевой солью.

- 24 013752

Иммуногенность может быть повышена путем добавления спейсерных остатков (например, С1у-С1у) между Τι-эпитопом и пептидным иммуногеном, заявленным в соответствии с настоящим изобретением. Помимо физического разделения Τ,-эпитопа и В-клеточного эпитопа (т.е. пептидного иммуногена), остатки глицина могут препятствовать образованию искусственных вторичных структур, создаваемых при соединении Τ-эпитопа и пептидного иммуногена, что будет препятствовать взаимодействию между Т- и/или В-клеточным иммунным ответом. Конформационное разделение хелперного эпитопа и домена антитела обеспечивает более эффективное взаимодействие присутствующего иммуногена и подходящих Τ_ι- и В-клеток.

Для того чтобы усилить индукцию Т-клеточного иммунитета у большого процента субъектов, экспонирующих различные типы НЬА, к иммуногену, заявленному в соответствии с настоящим изобретением, может быть получена смесь конъюгатов с различными Τι,-клеточными эпитопами. Смесь может содержать смесь по крайней мере двух конъюгатов с различными Τ-клеточными эпитопами, смесь по крайней мере трех конъюгатов с различными Τ,-клеточными эпитопами или смесь по крайней мере четырех конъюгатов с различными Τ-клеточными эпитопами. Смесь может вводиться вместе с адъювантами.

Иммуногенные пептиды также могут экспрессироваться как белки слияния с носителями (т.е. как гетерологичные пептиды). Иммуногенный пептид может быть соединен с носителем через аминоконцевой участок, через карбоксиконцевой участок или через оба концевых участка. В белке слияния могут присутствовать множественные повторы иммуногенного пептида. Иммуногенный пептид может быть связан с множественными копиями гетерологичного пептида, например, как на Ν, так и на С-концевых участках пептида. Некоторые носители обладают способностью индуцировать хелперный Т-клеточный ответ к пептиду-носителю. Индуцированные хелперные Т-клетки, в свою очередь, индуцируют В-клеточный ответ к иммуногенному пептиду, связанному с пептидом-носителем.

Некоторые агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают белок слияния, в котором Ν-концевой фрагмент альфа-δΝ связан на своем С-концевом участке с пептидомносителем. В указанных агентах Ν-концевой остаток фрагмента альфа-δΝ составляет Ν-концевой остаток белка слияния. Соответственно указанные белки слияния являются эффективными для индукции образования антител, которые связываются с эпитопом, который требует свободного Ν-концевого остатка альфа-δΝ. Некоторые агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают множественные повторы NΑС, соединенные на С-концевом участке с одной или более копией пептиданосителя. Некоторые белки слияния содержат различные сегменты альфа-δΝ в тандеме.

Некоторые агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают белок слияния, в котором С-концевой фрагмент альфа-δΝ связан на своем Ν-концевом участке с пептидомносителем. В указанных агентах С-концевой остаток фрагмента альфа-δΝ составляет С-концевой остаток белка слияния. Соответственно указанные белки слияния являются эффективными для индукции образования антител, которые связываются с эпитопом, который требует свободного С-концевого остатка альфа-δΝ. Некоторые агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают множественные повторы С-концевого пептида, такого как 3Ν125-140, связанные на Ν-концевом участке с одной или более копией пептида-носителя. Некоторые белки слияния содержат различные сегменты альфа-δΝ в тандеме.

В некоторых белках слияния NΑС на своем Ν-концевом участке слит с гетерологичным пептидомносителем. NΑС может использоваться вместе с С-концевыми слияниями. Некоторые белки слияния включают гетерологичный пептид, связанный с Ν-концевым участком или С-концевым участком NΑС, который, в свою очередь, связан с одним или более дополнительным NΑС сегментом альфа-δΝ в тандеме. Некоторые белки слияния включают множественные копии С-концевого пептида α-синуклеина, как описано выше, и множественные копии гетерологичного пептида, связанные между собой.

Некоторые примеры белков слияния, подходящих для использования в соответствии с настоящим изобретением, представлены ниже. Некоторые из указанных белков слияния содержат сегменты альфа3Ν (включая любые фрагменты, описанные выше), связанные с эпитопами столбнячного токсина, как описано в ИЗ 5196512, ЕР 378881 и ЕР 427347. Некоторые белки слияния включают сегменты альфа-ЗН связанные по крайней мере с одним РАЭКЕ. Некоторые гетерологичные пептиды являются промискуитетными Т-клеточными эпитопами, в то время как другие гетерологичные пептиды являются универсальными Т-клеточными эпитопами. Согласно некоторым способам осуществления настоящего изобретения агент для введения представляет собой простой белок слияния с сегментом альфа-ЗН связанным с гетерологичным сегментом, в линейной конфигурации. Терапевтические агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть представлены с помощью формулы. Например, согласно некоторым способам агент представляет собой мультимер белков слияния, представленной формулой 2^х, где х представляет собой целое число от 1 до 5. Предпочтительно х равен 1, 2 или 3, где 2 является наиболее предпочтительным. Когда х=2, такой мультимер имеет четыре белка слияния, соединенных в предпочтительной конфигурации, обозначаемой как МАР4 (см. ИЗ 5229490).

- 25 013752

Конфигурация МАР4 представлена ниже, где разветвленные структуры образуются путем инициирующего пептидного синтеза на аминах ^концевой и боковой цепей лизина. В зависимости от того, сколько раз остаток лизина включают в последовательность и позволяют ему разветвляться, в конечной структуре будут присутствовать множественные ^концевые участки. В данном примере четыре идентичных ^концевых участка синтезируют на разветвленном лизинсодержащем ядре. Такая множественность значительно усиливает реактивность соответствующих В-клеток

Ζ относится к NАС пептиду, фрагменту NАС пептида или другому активному фрагменту альфа-§^ как описано в разделе Ι.2;

Ζ может представлять собой более чем один активный фрагмент, например

Ζ = альфа-8Ν 60-72 (ΝΑΟ участок) пептид = ΝΗ2-ΚΕ0νΤΝν06ΟΑννΤ-ΟΟΟΗ (8Ер ГО

N0:13)

Ζ = альфа-8Ы 73-84 (ΝΑΟ участок) пептид = ΝΗ2-ΟΫΤΑААрКТУЕСО-СЮОН (8Е0 ГО

ΝΟ: 14)

Ζ = альфа-δΝ 102-112 пептид = МН2-С-амино-энантовая кислота-КЕЕЕСтАРС'ОЕСт-СООН (8ЕС> ГО N0:15).

альфа-δΝ 128-140 пептид

Другими примерами белков слияния являются

Ζ-столбнячный токсин 830-844 в МАР4 конфигурации: Ζ-0Υ1ΚΑΝ8ΚΕΙΟ1ΤΕΙ- |8ЕО ГО

N0:16)

Ζ-столбнячпый токсин 947-967 в МАР4 конфигурации: Ζ-ΓΝΝΤΤν8ΕΑΤΚλ'ΤΚν8Α8ΗΕΕ (8Ер ГО ΝΟ: 17)

Ζ-столбнячный токсин₈зо_844 в МАР4 конфигурации: Ζ-φΥΤΚΑΝδΚϊΊΟΙΤΕΕ (8Е0 ГО

N0:18)

Ζ-столбнячный токсин8зо-я4⁺ Столбнячный токсин947.9б7 в линейной конфигурации:

Ζ-ρΥΙΚΑΝ8ΚΓΙΟΙΤΕΕΓΝΝΓΤν8ΡΤ¥ΕΚνΡΚν8Α8ΗΕΕ (8Ер ГО N0:19)

Пептид РАПКЕ (все в линейной конфигурации), где X предпочтительно представляет собой циклогексилаланин, тирозин или фенилаланин, где циклогексилаланин является наиболее предпочтительным ΑΚΧνΑΑ\νΤΕΚΑΑΑ-Ζ (8Еф ГО N0:20)

3Ζ-ΡΑΟΕΕ пептид:

Ζ-Ζ-Ζ-ΑΚΧνΑΑΨΤΙ,ΚΑΑΑ (8Еф ГО N0:21)

- 26 013752

Другими примерами белков слияния являются ΑΚΧνΑΑΛνΊΤΚΑΑΑ-Ζ-Ζ-Ζ-Ζ (5Еф ГО N0: 22)

Ζ-ΑΚΧΥΑΑ УПЕКАЛА (ЗЕО ГО N0: 23) г-130АУНААНАЕМЕАСк (ЗЕО ГО N0: 24)

ΡΚΥνΕΟΝΤΣΚΕΑΤ-Ζ-Ζ-Ζ (ЗЕО П> N0: 25)

Ζ-ΡΚΥνΚΟΝΤΕΚΙΑΤ-Ζ (ЗЕО ® N0: 26)

Ζ-Ζ-Ζ-ΡΚΥνΚΟΝΤΙ,ΚΕΑΤ (ЗЕО ® ΝΟ: 27)

Ζ-Ζ-ΡΚΥνΚΟΝΤΕΚΙΑΤ (ЗЕО Ю ΝΟ: 28)

Ζ-ΡΚΥνΚΟΝΤΕΚΕΑΤ-ΕΚΚΪΑΚΜΕΚΑ83\ΤΝν-ΟύΊΚΑΝ3ΚΕΚ3ΙΤΕΙ.·

ΓΝΝΡΓν8Εν^νΡΚν8Α8ΗΕΕ-Ζ-Ζ-Ζ-Ζ-0ΥΙΚΑΝ8ΚΡΙΟ]ΤΕΕΡΝΝΕΤνβΡνΕΚνΡΚνΒАЗНЬЕ (ЗЕО ГО ΝΟ: 29)

Ζ-ΟΥ1Κ.ΑΜΚΚΡ·ΙΟΙΤΕΕΟΡΚΝ1^?Τν3ΡΛ·ΕΚ\ΤΚν5Α3ΗΕΕ-Ζ0λΤΚ ΑΝ8ΚΓΐαΤΤΕΕ€ΡΝΝΕΓν.3Ε\νΤ.Κ\ΤΤ<ν8Α3Τπ Ε-Ζ (ЗЕО ГО N0: 30)

Ζ-ΟΥΪΚΑΝΑΚΕΙΕίίΤΕΙ. (ЗЕО ГО ЙО: 31) на 2-разветвленной камеди:

ΕΟνΤΝνθΟΑΙδρΑνΗΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΚ. (ЗЕО ГО N0: 32) (Белок слияния фрагмента синуклеина в МАР4 конфигурации)

Похожие или аналогичные белки-носители и методы связывания могут использоваться для создания иммуногенов, применяющихся для индукции иммунного ответа с образованием антител к альфа-δΝ для пассивной иммунизации. Например, альфа-δΝ или его фрагмент, связанный с переносчиком, может вводиться в организм лабораторного животного для получения моноклональных антител к альфа-δΝ.

5. Нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтические агенты.

Иммунный ответ, направленный против телец Леви, также может быть индуцирован путем введения нуклеиновых кислот, кодирующих сегменты пептида альфа-δΝ или его фрагменты, другие иммуногенные пептиды или антитела или компоненты из цепей, используемые для пассивной иммунизации. Указанные нуклеиновые кислоты могут представлять осбой ДНК или РНК. Сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий иммуноген, обычно соединен с регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер, которые обеспечивают экспрессию сегмента ДНК в предполагаемых клетках-мишенях пациента. Для непосредственной экспрессии в клетках крови, что является наиболее желательным для индукции иммунного ответа, наиболее подходящими являются промотор и энхансер генов тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов или основной промежуточный ранний промотор и энхансер СМУ. Соединенные регуляторные последовательности и кодирующие последовательности часто клонируют в векторе. Для введения антител с двойными цепями две цепи могут быть клонированы как в одном, так и в разных векторах. Нуклеиновая кислота, кодирующая терапевтические агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, может также кодировать по крайней мере один Т-клеточный эпитоп. Представления, изложенные в настоящем описании и касающиеся использования адъювантов могут быть (с известными поправками) справедливы и для использования нуклеиновых кислот, кодирующих терапевтические агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением.

В настоящее время доступно множество вирусных векторных систем, включая ретровирусные системы (см., например, Ьа^пс апб Титю, Сиг. СспсЕ Эсус1ор. 3, 102-109 (1993)); аденовирусные векторы (см., например, Веб е! а1., 1. νίτοί. 61, 5911 (1993)); аденоассоциированные вирусные векторы (см., например, Ζΐιοιι е! а1., 1. Ехр. Меб. 179, 1867 (1994)), вирусные векторы из семейства вирусов оспы, включая вирус коровьей оспы и вирусы птичьей оспы, вирусные векторы из семейства альфа вирусов, такие как векторы, полученные из вирусов 8тбЫз и вируса лихорадки леса Семлики (см., например, ЭиЬепзку е! а1., 1. νίτοί. 70, 508-519 (1996)), вирус венесуэльского энцефалита лошадей (см., И8 5643576) и рабдовирусы, такие как вирус васкулярного стоматита (см. νθ 96/34625) и папилломавирусы (Оке е! а1., Нитап Сепе Ткегару 6, 325-333 (1995); νοο е! а1., νθ 94/12629 и Χίηο & Вгапбзта, М.1с1е1с Ас1бз. Кез. 24, 26302622 (1996)).

- 27 013752

ДНК, кодирующая иммуноген, или вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, могут быть упакованы в липосомы. Подходящие липиды и их аналоги описаны в патентах υδ 5208036, 52647618, 5279833 и 5283185. Векторы и ДНК, кодирующая иммуноген, также могут быть адсорбированы на поверхности частиц-носителей или ассоциированы с ними, примерами указанных частиц являются полимеры полиметилметакрилата и полилактиды и поли(лактид-со-гликолиды), см., например, МсСее е! а1., 1. М1сго. Епсар. 1996.

Векторы для генной терапии или голая ДНК могут доставляться ш у1уо путем их введения конкретному пациенту, обычно путем системного введения (например, внутривенного, интраперитонеального, назального, гастрального, внутрикожного, внутримышечного, подкожного или интракраниального) или местного нанесения (см., например, патент υδ 5339346). Указанные векторы могут дополнительно включать усиливающие агенты, такие как бупивацин (см., например, патент υδ 5593970). ДНК также может вводиться с помощью генного ружья, см. Х1ао & Вгапбзта, зирга. ДНК, кодирующая иммуноген, преципитирована на поверхности микроскопических металлических бусин. Микроснаряды с помощью ударной волны или расширяющегося гелиевого газа проникают в ткани на глубину нескольких клеточных слоев. Например, подходящим устройством является устройство для доставки генов Αссе1™ от Αдасе!из, 1пс. М1бб1е!оп, ^1. Альтернативно, голая ДНК может проникать через кожу в системный кровоток просто после нанесения ее на поверхность кожи с помощью химической или механической ирритации (см. заявку \УО 95/05853).

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения векторы, кодирующие иммуногены, могут доставляться в клетки ех у1уо, например в клетки, выделенные от конкретного пациента (например, лимфоциты, аспират костного мозга или тканевая биопсия), или в гемопоэтические клетки универсального донора с последующей реимплантацией указанных клеток пациенту, обычно после отбора тех клеток, в которых произошло включение вектора.

III. Агенты для индукции иммунного ответа, направленного против Ав.

Ав, также известный как в-амилоидный пептид, или А4 пептид (см. υδ 4666829; С1еппег & ^опд, ВюсНеш. Вюрйуз. Рез. Соттип. 120, 1131 (1984)), представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера. Ав получают путем процессинга большого АРР белка с помощью двух ферментов, обозначаемых как в- и γ-секретазы (см. Нагб1у, ΤΙΝ8 20, 154 (1997)). Известные мутации АРР, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, происходят проксимально к сайту в- и γ-секретаз или захватывают Ав. Например, положение 717 является проксимальным по отношению к сайту расщепления АРР γ-секретазой во время процессинга в Ав, а положения 670/671 располагаются проксимально к сайту расщепления в-секретазой. Считается, что мутации приводят к развитию ΑΌ в результате воздействия на реакции расщепления, за счет которых формируется Ав, что приводит к увеличению количества 42/43 аминокислотных форм Ав.

Ав обладает уникальным свойством - способностью фиксировать и активировать как классический, так и альтернативный каскад комплемента. В частности, он связывается с С 1с| и, главным образом, с С3Ь1. Указанная ассоциация обеспечивает связывание с макрофагами, что приводит к активации В-клеток. Кроме того, С3Ь1 отсоединяется и затем связывается с СР2 на В-клетках Т-клеточнозависимым образом, что усиливает активацию указанных клеток в 10000 раз. Указанный механизм способствует тому, что Ав генерирует иммунный ответ в избытке по сравнению с другими антигенами.

В природе существует несколько форм Ав. Ав формы человека включают Ав39, Ав40, Ав41, Ав42 и Ав43. Последовательности указанных пептидов и их взаимодействие с АРР предшественником представлены на фиг. 1 Нагбу е! а1., ΤΙΝ8 20, 155-158 (1997). Например, Αβ42 имеет следующую последовательность:

ΌΑΕΕΡΗΌδΟΥΕνΗΗρΚΕνΕΕΑΕΌνΟδΝΚΟΟΑΙΙΟΕΜνΟΟννίΑΤ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ:33).

Ав41, Ав40 и Ав39 отличаются от Ав42 отсутствием ΑΠ, ΑΠ-ΙΡ и Α1Η-Πο-ν31 соответственно на С-концевом участке. Ав43 отличается от Ав42 наличием остатка Τΐιιι на С-концевом участке.

Агенты, аналогичные описанным выше для альфа-δΝ, предварительно были описаны для Ав (см. \УО 98/25386 и \УО 00/72880, обе заявки включены в настоящее изобретение в качестве ссылок). К указанным агентам относятся Ав и его активные фрагменты, конъюгаты Ав и конъюгаты активных фрагментов Ав, антитела к Ав и его активным фрагментам (например, мышиные, гуманизированные, человеческие и химерные антитела), а также нуклеиновые кислоты, кодирующие цепи антител. Активные фрагменты с Ν-концевого участка Ав являются предпочтительными. К предпочтительным иммуногенным фрагментам относятся Αβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3 и 1-4. Обозначение Ав1-5 означает, например, что фрагмент включает остатки 1-5 Ав и не включает другие остатки Ав. Фрагменты, начинающиеся с остатков 1-3 Ав и заканчивающиеся остатками 7-11 Ав, являются наиболее предпочтительными.

Все изложенные в настоящем изобретении представления, касающиеся агентов, индуцирующих активный иммунный ответ, агентов, индуцирующих пассивный иммунный ответ, конъюгатов и нуклеиновых кислот, кодирующих терапевтические агенты (см. раздел ΙΙ, 1-5) справедливы и для Ав и его фрагментов.

- 28 013752

Все представления, касающиеся пациентов, подлежащих лечению, а также лечебных режимов (см. разделы Ιν и V), справедливы и для использования Ав и его фрагментов.

Дезагрегированный Ав и его фрагменты представляют собой мономерные пептидные единицы. Дезагрегированный Ав и его фрагменты являются полностью растворимыми, а также обладают способно стью к самоагрегации с формированием растворимых олигомеров. Олигомеры Ав и его фрагменты обычно являются растворимыми и существуют, главным образом, в форме альфа-спиралей и статистических спиралей. Агрегрированный Ав или его фрагменты представляют собой олигомеры альфа-§N или его фрагментов, которые были ассоциированы в нерастворимые бета-складчатые структуры. Агрегированный Ав и его фрагменты также могут представлять собой фибриллярные полимеры. Фибриллы обычно являются нерастворимыми. Некоторые антитела связываются как с растворимым Ав и его фрагментами, так и с агрегированным Ав и его фрагментами. Некоторые антитела связываются как с растворимым Ав и его фрагментами, так и с агрегированным Ав и его фрагментами.

Некоторые примеры конъюгатов включают

ΑΝ90549 (ΑβΙ-7-столбнячный токсин 830-844 в МАР4 конфигурации): ( 8ЕЦ Ш N0: 34) ηΑΕΕΚΗϋ-ΟΥΙΚΑΝδΚΕΙΟΙΤΕΕ

ΑΝ90550 (ΑβΙ-7-столбнячный токсин 947-967 в МАР4 конфигурации): (5Е0 ГО N0: 35) ΟΑΕΕΚΗΒ-ΓΝΝΕΤν8ΓΨΕΚνΡΚν8Α8ΗΕΕ (8Εζ) ГО N0:35)

ΑΝ90542 (ΑβΙ-7-столбнячный токсин 830-844+ 947-967 в линейной конфигурации): Τ)ΑΕΓΚΗ1)-ρΥΙΚΑΝ8ΚΕ46ίΤΕΤ,ΕΝΝΕΤν8ΕΑΤ.Ε\ΤΚ Υ8 Α.8ΗΙ.Ε (5ЕЦ ГО N0: 36)

ΑΝ90576: (АвЗ-9)-столбнячный токсин 830-844 в МАР4 конфигурации):

ЕПУПЗКб-ОУПСАКЗКГЮПЕЬ (ЗЕЦ ГО N0: 37)

РАЭВЕ пептид (всегда в линейной конфигурации), где X предпочтительно представляет собой циклогексилаланин, тирозин или фенилаланин, где циклогексилаланин является наиболее предпочтительным

ΑΝ90562 (ΡΑΏΚΕ-ΑβΙ-7):

ΑΚΧΥΑΑΑΊΕΑΑΑ-ΏΑΕΕΒΗϋ (8ЕС) ГО ΝΟ: 38)

ΑΝ90543 (3 РАОКЕ- Αβ1-7):

ΟΑΕΡΚΗϋ-ΟΑΕΡΚΗϋ-ϋΑΕΕΚΗϋ-ΑΚΧνΑΑΨΤΕΚΑΑΑ (8Еф ГО N0:39)

- 29 013752

Другими примерами белков слияния (иммуногенный эпитоп Άβ выделен жирным шрифтом) являются

ΑΚΧνΑΑλνΤΙ КА АА-ПАЕЕКНГЕП АЕЕКНПВАЕ1КНВ (ЗЕО Ю N0: 40)

ОАЕЕКНО-АКХУААТУТЬКААА (ЗЕф ГО ΝΟ: 41)

ΟΑΕΓΚΗΒ-ΙδΟΑνΗΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΚ. (ЗЕО ГО ΝΟ: 42)

ΕΚΗϋΚΟΥ-ΙδΟΑνΗΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΒ. (ЗЕО ГО N0: 43)

ЕЕКНО8С-180АУНААНАЕ1МЕАСК (8Ер ГО N0: 44)

ΡΚ1ΑΚ0ΝΤΕΚΕΑΙ ПАЕЕ’КНВ-ПАЕГКНП-ПАЕЕКНГ) (5Е<2 ГО ΝΟ: 45)

ΟΑΕΕΚΗΟ-ΡΚΥνΚΟΝΤΕΚΙΑΤ-ΟΑΕΓΚΗϋ 9 (ЗЕО ГО ΝΟ: 46)

ΟΑΕΓΚΙΐηΟΑΕΕΚΗΟ-βΑΕΓΚΙΙΒ-ΡΚΥΧΚΟΚΤΕΚΕΑΓ (8Е0 ГО N0: 47) ϋΑΕΓΚΗϋ-ΟΑΕΓΚΗΟ-ΡΚΥνΚΟΝΤΕΚΕΑΤ (8Е0 ГО N0: 48) ϋΑΕΕΚΗΟ-ΡΚΥνΚΟΝΤΕΚΕΑΤ-ΕΚΚΙΑΚΜΕΚΑδδνΕΝνΟΥΙΚΑΝδΚΕΙΟΙΤΕΕЕЖТТУ8Р%ТРЛТКУ8А8НЬЕГОАЕР1ШГ) (8Е0 ГО ΝΟ: 49) ϋΑΕΕΚΗΒ-ΟΑΕΓΚΉΟ-ΟΑΕΓΚΗΒ-0ΥΙΚΑΝ3ΚΓΙ61ΤΕΕΝΝΓΤν3Ε\νΕΚνΡΚν3Λ8ΗΕΕ (8Е0 ГО ΝΟ: 50)

ΒΑΕΕΚΗϋ-0ΥΙΚΑΝ8ΚΗΟΠΈΕΟΓΝΝΡΤν8ΓλνΕΚνΡΚν8Α8ΗΕΕ (ЗЕО ГО N0: 51)

ΟΑΕΓΚΙΙΒ-ΟΥΙΙΕΑΝ3ΚΓΙΟΙΤΕΕΟΓΝΝΓΤν3Ε\νΕ1<νΡΚν8Α3ΗΕΕ-ΟΑΕΕ1<ΗΙ) (8Е0 ГО

ОАЕТТШО-ОА7КАК8КИОГГЕЬ (8Εζ) ГО N0; 53) на 2-разветвленной камеди: ϋΑΕΕΚΗΟЬуя-СИу-Суя ϋΑΕΡΚΗΟ

Предпочтительные моноклональные антитела связываются с эпитопом по остаткам 1-10 Άβ (первый ^концевой остаток природного Άβ обозначается 1). Некоторые предпочтительные моноклональные антитела связываются с эпитопом по аминокислотам 1-5, а некоторые - по эпитопам 5-10. Некоторые предпочтительные антитела связываются с эпитопами по аминокислотам 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 или 3-7. Некоторые предпочтительные антитела связываются с эпитопом, начинающимся на остатках 1-3 и заканчивающимся на остатках 7-11 Άβ. К другим антителам относятся такие антитела, которые связываются с эпитопом по остаткам 13-280 (например, моноклональное антитело 266). Предпочтительные антитела имеют изотип 1дС1 человека.

IV. Изучение очищающей активности антител.

Настоящее изобретение относится к способам изучения очищающей активности антител в отношении телец Леви или любого другого антигена или ассоциированной биологической молекулы, для которой желательно наличие указанной активности. Для изучения активности в отношении телец Леви образец ткани головного мозга пациента с ΡΌ или модельного животного, имеющего характерную патологию типа болезни Паркинсона, обрабатывают фагоцитирующими клетками, несущими Ес-рецептор, такими как микроглиальные клетки, а также антителами, подлежащими анализу, в среде ίη νίνο. Фагоцитирующие клетки могут представлять собой первичную культуру клеток или клеточную линию, такую как Βν-2, С8-В4 или ТНР-1. Согласно некоторым способам компоненты комбинируют на микроскопическом стекле для обеспечения микроскопического контроля. Согласно некоторым способам осуществляют множество реакций параллельно на лунках планшета для микротитрования. В таком случае отдельные миниатюрные предметные стекла могут быть закреплены в отдельных лунках или же может быть ис

- 30 013752 пользован немикроскопический способ определения реакций, такой как определение альфа-δΝ с помощью ЕЫБА. Предпочтительно производится серия измерений количества телец Леви в реакционной смеси ш уйго, начиная от базовой величины перед началом реакции, и одной или более тестовых величин во время реакции. Антиген может быть выявлен с помощью окрашивания, например, антителом к альфаδΝ или другим компонентам ЬВ5, меченным флуоресцентной меткой. Антитело, используемое для окрашивания, может быть тем же антителом, что и тестируемое антитело, либо может представлять собой другое антитело. Если во время реакции отмечается уменьшение количества телец Леви ниже базовой линии, это свидетельствует о том, что тестируемое антитело оказывает очищающий эффект. Такие антитела являются полезными для профилактики и лечения ΡΌ и других ЬВЭ.

Аналогичные способы могут использоваться для изучения активности антител в отношении других типов биологических вешеств. Анализ может использоваться для определения очищающей активности антител в отношении практически любого типа биологического вещества. Обычно биологическое вещество играет какую-либо роль в заболевании человека или животного. Биологическое вещество может представлять собой образец ткани или какую-либо изолированную форму. Если используется образец ткани, он обычно является нефиксированным для того, чтобы обеспечить быстрый доступ к компонентам образца и предотвратить их разрушение в результате фиксации. К образцам тканей, которые могут быть изучены во время такого исследования, относятся раковая ткань, предраковая ткань, ткани, содержащие доброкачественные изменения, такие как папилломы и родинки, ткани, инфицированные патогенетическими микроорганизмами, ткани, инфильтрированные воспалительными клетками, ткани, имеющие патологическое межклеточное вещество (например, фибринозный перикардит), ткани, несущие абберантные антигены, а также рубцовые ткани. Примерами изолированных биологических веществ, которые могут использоваться в такого рода исследованиях, являются альфа-δΝ, вирусные антигены или вирусы, протеогликаны, антигены других патогенных микроорганизмов, опухолевые антигены и молекулы адгезии. Указанные антигены могут быть выделены из природных источников, а также получены с помощью рекомбинантной экспрессии или химического синтеза, среди прочего. Образец ткани или изолированное биологическое вещество обрабатывают фагоцитирующими клетками, несущими Ес-рецептор, такими как моноцитарные или микроглиальные клетки, а также антителом, подлежащим исследованию, в среде. Антитело может быть направлено против изучаемого биологического вещества либо против ассоциированного с ним антигена. В последнем случае биологическое вещество фагоцитируется вместо объекта, подлежащего исследованию. Обычно, но необязательно, биологическое вещество и антитело контактируют между собой (иногда и с ассоциированным антигеном) перед добавлением фагоцитирующих клеток. Концентрацию биологического вещества и/или ассоциированного антигена, если он присутствует, остающуюся в среде, затем измеряют. Уменьшение количества или концентрации антигена или ассоциированного биологического вещества в среде свидетельствует о том, что антитело обладает очищающим эффектом в отношении антигена и/или ассоциированного биологического вещества совместно с фагоцитирующими клетками.

Активность антител и других агентов в отношении телец Леви также может быть изучена с помощью анализа ш уйго, описанного в примере II. Нейрональные клетки, трансфецированные вектором экспрессии, экспрессирующим синуклеин из синуклеиновых включений, могут быть визуализированы с помощью микроскопа. Очищающая активность антитела или другого агента в отношении указанных включений может быть определена при сравнении уровня синуклеина в трансфецированных клетках, обработанных агентом, с уровнем синуклеина в контрольных клетках, не обработанных агентом. Уменьшение размера и интенсивности синуклеиновых включений или уменьшение уровня синуклеина свидетельствует о наличии очищающей активности в отношении синуклеина. Активность может оцениваться как путем визуализации синуклеиновых включений с помощью микроскопии, так и путем пропускания клеточных экстрактов через гель и визуализации полоски синуклеина. Как описано в примере I, раздел 2, изменение уровня синуклеина является наиболее показательным в том случае, когда экстракты фракционируют на цитозольную и мембранную фракции и анализируют отдельно мембранную фракцию.

Активность антител и других агентов в отношении телец Леви также может быть изучена с помощью исследования ш у1уо, описанного в примере IX. Вкратце, тестируемое антитело вводят в неокортекс трансгенной мыши, избыточно экспрессирующей α-синуклеин человека и имеющей интранейрональные агрегаты α-синуклеина. Согласно одному подходу используют гетерозиготных трансгенных мышей в возрасте от 4 до 8 месяцев, в избытке экспрессирующих α-синуклеин человека дикого типа в головном мозге, под контролем транскрипции ΡΌΟΕ промотора (см. Майай, 2000, δс^еηсе, 287:1265-69). Тестируемое антитело (например, иррелевантные, изотипически-меченые антитела) перед введением мышам растворяют в подходящем растворителе (например, в стерильном физиологическом растворе с фосфатным буфером). Каждой мыши под наркозом в глубокие слои теменного неокортекса правого полушария головного мозга стереотоксически вводят 2 мкл раствора антитела в концентрации 2 мг/мл (ипсилатеральная сторона). Левые полушария (контралатеральная сторона) выступают в качестве основного контроля у каждого животного. На места введения антитела накладывают швы и мышей оставляют под наблюдение до выхода из наркоза. Через 2 недели после инъекции мышей умерщвляют, извлекают головной мозг и

- 31 013752 фиксируют его в 4% парафармальдегиде в течение 48 ч, после чего изготавливают фронтальные срезы толщиной 40 мкм. Срезы, захватывающие место инъекции, обрабатывают антителом к α-синуклеину (например, ЕЬАО^-47, распознающим аминокислоты 115-122 α-синуклеина). В каждом срезе подсчитывают количество интранейрональных агрегатов α-синуклеина в 4 полях микроскопа (20х объектив) вокруг места инъекции и на ипсилатеральной стороне, а также в 4 полях, соответствующих полям в контралатеральном контрольном полушарии. Для каждого животного складывают количество агрегатов α-синуклеина в двух срезах, разница количества агрегатов в двух полушариях позволяет определить влияние тестируемого антитела на исчезновение агрегатов у каждого конкретного животного. Уменьшение количества агрегатов α-синуклеина в обработанном полушарии свидетельствует о наличии у антител или других агентов очищающей активности в отношении телец Леви. Предпочтительно наблюдается уменьшение количества агрегатов по крайней мере на 10%. Более предпочтительно, если наблюдается уменьшение количества агрегатов, по крайней мере на 20%, по крайней мере на 40%, по крайней мере на 60%, по крайней мере на 80%.

ν. Пациенты, подлежащие лечению препаратами, направленными против компонентов телец Леви.

К пациентам, подлежащим такому лечению, относятся пациенты, имеющие индивидуальный риск развития синуклеинопатического заболевания, но не имеющие симптомов указанного заболевания, а также пациенты, у которых уже имеются клинические симптомы. К пациентам, подлежащим такому лечению, также относятся пациенты, имеющие риск развития ЬВО, но не имеющие симптомов, а также пациенты, у которых в настоящее время отмечаются клинические симптомы. К указанным заболеваниям относятся болезнь Паркинсона (включая идиопатическую болезнь Паркинсона), ОЬВ, ΌΕΒΌ, ЬВУАЭ, истинная автономная недостаточность, дисфагия с тельцами Леви, вторичные ЬВО, наследственные ЬВЭ (например, мутации гена альфа-δΝ, РАКК3 или РАКК4) и множественная системная атрофия (например, оливопонтомозжечковая атрофия, стриатонигральная дегенерация и синдром Ши-Драгера). Кроме того, способы, заявленные в настоящем изобретении, могут использоваться для профилактики указанных заболеваний у пациентов, у которых имеется генетический риск развития ЬВЭ. К таким пациентам относятся люди, имеющие родственников, страдающих от данной патологии, а также люди, у которых риск был установлен в результате генетического анализа или анализа биохимических маркеров. Генетическими маркерами риска РО являются мутации генов синуклеина или Паркина, иСНЫ и СУР2Э6; в особенности мутации в положении 53 гена синуклеина. Пациенты, страдающие болезнью Паркинсона, могут быть легко установлены на основании имеющейся у них клинической симптоматики, включающей тремор покоя, мышечную ригидность, брадикинезию и постуральную нестабильность.

Согласно некоторым способам у пациента не имеется клинических симптомов, проявлений и/или риска любого амилоидогенного заболевания, однако он страдает по крайней мере от одного синуклеинопатического заболевания.

Согласно некоторым способам у пациента не имеется клинических симптомов, проявлений и/или риска любого заболевания, характеризующегося образованием внеклеточных отложений амилоида.

Согласно некоторым способам у пациента не имеется заболевания, характеризующегося образованием амилоидных отложений Ав пептида.

Согласно некоторым способам у пациента нет клинических симптомов, проявлений и/или факторов риска болезни Альцгеймера, когнитивных нарушений, умеренных когнитивных нарушений и синдрома Дауна.

Согласно некоторым способам пациент страдает от двух конкурирующих заболеваний: болезни Альцгеймера и заболевания, характеризующегося образованием телец Леви.

Согласно некоторым способам пациент страдает от двух конкурирующих заболеваний: болезни Альцгеймера и заболевания, характеризующегося аккумуляцией синуклеина.

Согласно некоторым способам пациент имеет два конкурирующих заболевания: болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера.

У пациентов, не имеющих симптомов, лечение можно начинать в любом возрасте (например, 10, 20 или 30 лет). Однако обычно нет необходимости начинать лечение до тех пор, пока пациент не достигнет возраста 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение обычно подразумевает введение множественных доз в течение определенного периода времени. Эффективность лечения может контролироваться путем исследования антител или активированного Т- или В-клеточного ответа на терапевтический агент (например, альфа-δΝ пептид, или Ав, или оба) в течение периода времени. Если уровень ответа снижается, показано введение повторной дозы.

Желательно, наличие или отсутствие симптомов, проявлений или факторов риска заболевания определяют перед началом лечения.

νΙ. Пациенты, подлежащие лечению препаратами, направленными против компонентов амилоида.

К пациентам, подлежащим такому лечению, относятся пациенты, имеющие риск развития заболевания, но не имеющие клинических симптомов, а также пациенты, у которых в настоящее время имеются симптомы амилоидоза. В случае болезни Альцгеймера у человека потенциально имеется риск развития данного заболевания, если он имеет большую продолжительность жизни. Кроме того, способы, заявлен

- 32 013752 ные в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться для профилактики данных заболеваний в популяции, без необходимости установления риска у каждого конкретного пациента. Способы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, особенно подходят для пациентов, у которых имеется установленный генетический риск болезни Альцгеймера или любого другого генетического амилоидогенного заболевания.

К таким пациентам относятся люди, имеющие родственников, страдающих от указанных заболеваний, а также люди, у которых риск был установлен в результате генетического анализа или анализа биохимических маркеров. К генетическим маркерам болезни Альцгеймера относятся мутации гена АРР, особенно мутации по положениям 717, 670 и 671, которые обозначаются как мутация Харди и Шведская мутация соответственно (см. Нагку, ΉΝδ, кирга). Другими маркерами риска являются мутации в генах презенилина, Ρδ1 и Ρδ2 и АроЕ4; семейный анамнез АО, гиперхолестеринемия или атеросклероз.

Пациенты, страдающие болезнью Альцгеймера, могут быть легко установлены на основании имеющейся у них характерной деменции, а также на основании наличия факторов риска, описанных выше. Кроме того, в настоящее время для выявления пациентов с АО существует целый ряд диагностических тестов. К ним относится измерение уровней СδΕ !аи и Ав42. Увеличение уровня !аи и снижение уровня Ав42 свидетельствует о наличии АО. Диагностика АО также может осуществляться с помощью критериев ΜΜδΕ и АОВОА, описанных в примерах. У пациентов, не имеющих симптомов, можно начинать лечение в любом возрасте (например, 10, 20 или 30 лет). Однако обычно нет необходимости начинать лечение до тех пор, пока пациент не достигнет возраста 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение обычно подразумевает введение множественных доз в течение определенного периода времени. Эффективность лечения может контролироваться путем исследования антител или активированного Т- или В-клеточного ответа на терапевтический агент (например, NΑС) в течение периода времени согласно правилам, описанным ниже в разделе VII Способы контроля и диагностики. Если уровень ответа снижается, показано введение повторной дозы.

VII. Лечебные режимы.

В целом, лечебный режим подразумевает введение агента, эффективного для индукции иммунного ответа к альфа-δΝ и/или агента, эффективного для индукции иммунного ответа к Ав в организме пациента. В профилактических целях фармацевтические композиции или лекарственные средства вводят пациенту, предрасположенному к развитию заболевания или имеющему факторы риска развития ЬВО или другого синуклеинопатического заболевания, в режиме, включающем введение композиции или лекарственного средства в таком количестве и с такой частотой, чтобы это оказалось достаточным для уменьшения риска развития, снижения тяжести течения или отсрочки манифестации заболевания, включая физиологические, биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические проявления заболевания, появляющиеся во время его развития. В лечебных целях композиции и лекарственные средства вводят пациенту, предрасположенному к развитию заболевания или уже страдающему от него, в режиме, включающем введение композиций или лекарственного средства в таком количестве и с такой частотой, чтобы это оказалось достаточным для ликвидации или, по крайней мере, частичного уменьшения симптомов заболевания (физиологических, биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая его осложнения и промежуточные патологические проявления, появляющиеся во время его развития.

Например, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения лечебный эффект проявляется, по крайней мере, частичным исчезновением телец Леви, по крайней мере, частичной дезагрегацией телец Леви и/или уменьшением уровня олигомеров α-синуклеина в синапсах. Количество, достаточное для достижения терапевтического или профилактического эффекта, обозначают термином терапевтически или профилактически эффективная доза. Сочетание количества и частоты введения, достаточное для достижения терапевтического или профилактического эффекта, обозначают термином терапевтически или профилактически эффективный режим. При использовании как профилактического, так и терапевтического режима агенты обычно вводят в нескольких дозах до тех пор, пока не будет достигнут достаточный иммунный ответ. Обычно иммунный ответ контролируют и, если он начинает снижаться, вводят повторные дозы активного агента.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения введение активных агентов приводит к снижению внутриклеточных уровней агрегированного синуклеина.

Согласно некоторым способам введение агента приводит к улучшению клинической картины при ЬВО, в частности к улучшению моторной функции в случае болезни Паркинсона.

Согласно некоторым способам снижение внутриклеточных уровней агрегированного синуклеина или улучшение клинической симптоматики заболевания наблюдается через интервалы после введения агента.

Эффективные дозы композиций, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, для лечения указанных выше состояний различаются в зависимости от многих факторов, включая способ введения, орган-мишень, физиологическое состояния пациента, является пациент человеком или животным, имеет ли место прием других лекарственных средств, а также от того, является режим терапевтическим

- 33 013752 или профилактическим. Обычно пациентом является человек, хотя другие млекопитающие, включая трансгенных мышей, также могут получать лечение. Лечебные дозы должны быть оттитрованы для обеспечения безопасности и эффективности лечения. Количество иммуногена зависит от того, применяется ли адъювант: в случае его отсутствия требуются более высокие дозы иммуногена. Количество иммуногена для введения иногда варьирует от 1 до 500 мкг для одного пациента и чаще от 5 до 500 мкг на одну инъекцию, если пациент является человеком. Иногда используют более высокие дозы, составляющие от 1 до 2 мг на одну инъекцию. Обычно для одной инъекции человеку используются дозы, равные 10, 20, 50 или 100 мкг. Используемая масса иммуногена также зависит от массового соотношения иммуногенного эпитопа в составе иммуногена и массы всего иммуногена. Обычно на 1 мкг иммуногена используют 10^-3-10^-5 мкмоль иммуногенного эпитопа. Режим введения агента по времени также может быть различным, от 1 раза в день до 1 раза в год или в декаду. В любой день, когда вводится иммуноген, его доза превышает 1 мкг для одного пациента и обычно превышает 10 мкг для одного пациента в том случае, если одновременно вводится адъювант; в случае отсутствия адъюванта доза обычно превышает 10 мкг для одного пациента и чаще превышает 100 мкг для одного пациента. Типичный режим введения включает первичную иммунизацию с последующими повторными инъекциями с определенными интервалами, например с интервалом 6 недель. Другой режим подразумевает иммунизацию с последующими повторными инъекциями через 1, 2 и 12 месяцев. Еще один режим включает введение агента каждые 2 месяца в течение всей жизни пациента. Альтернативно, повторные инъекции могут осуществляться нерегулярно, в зависимости от уровня иммунного ответа.

Для пассивной иммунизации доза антитела варьирует от 0,0001 до 100 мг/кг массы хозяина, обычно от 0,01 до 5 мг/кг. Например, дозы могут составлять 1 или 10 мг/кг или варьировать в пределах от 1 до 10 мг/кг либо, другими словами, составлять 70 или 700 мг или варьировать в пределах от 70 до 700 мг для пациента весом 70 кг. Примерный режим введения включает однократную инъекцию каждые 2 недели или каждый месяц или однократную инъекцию каждые 3-6 месяцев. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения одновременно вводят два или более моноклональных антитела с различной специфичностью связывания, в этом случае доза каждого антитела соответствует приведенным выше границам. Антитело обычно вводится множество раз. Интервал между введениями может быть равен 1 неделе, 1 месяцу или 1 году. Интервалы также могут быть нерегулярными, что зависит от уровня антител к альфа-ЗN в крови пациента. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения дозу подбирают таким образом, чтобы концентрация активного вещества в плазме составляла от 1 до 1000 мкг/мл и в некоторых случаях - от 25 до 300 мкг/мл. Альтернативно, антитело может вводиться в составе композиции с замедленным высвобождением вещества, в этом случае требуется меньшая частота введения. Доза и частота введения зависят от периода полураспада антитела в организме пациента. В целом, антитела человека имеют наибольший период полураспада, затем в этом списке идут гуманизированные антитела, химерные антитела и нечеловеческие антитела. Доза и частота введения также зависят от того, является режим профилактическим или терапевтическим. В случае профилактического режима относительно небольшие дозы вводятся с относительно длительными интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение в течение всей жизни. В случае терапевтического режима относительно высокие дозы вводятся с относительно короткими интервалами до тех пор, пока не будет отмечен прогресс или не уменьшатся клинические проявления заболевания, и предпочтительно до тех пор, пока у пациента не будет отмечаться полное или частичное исчезновение симптомов. После чего пациент переходит на профилактический режим.

Дозы нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноген, варьируют от 10 нг до 1 г, от 100 нг до 100 мг, от 1 мкг до 10 мг или от 30-300 мкг ДНК для одного пациента. Дозы инфицирующих вирусных векторов варьируют от 10 до 100 или более вирионов на одну дозу.

Агенты для индукции иммунного ответа в профилактических или лечебных целях могут вводиться парентерально, местно, внутривенно, перорально, подкожно, внутриартериально, интракраниально, интратрахеально, интраперитонеально, интраназально или внутримышечно. Наиболее часто используемым является подкожный способ введения иммуногенного агента, хотя другие способы введения также являются эффективными. Другим распространенным способом введения является внутримышечный способ. Обычно инъекцию осуществляют в мышцы верхних или нижних конечностей.

Согласно некоторым способам агенты вводят непосредственно в ту определенную ткань, где сосредоточены агрегаты, например путем интракраниальной инъекции. Внутримышечные инъекции и внутривенные инфузии являются предпочтительными способами введения антител.

Согласно некоторым способам определенные терапевтические антитела вводят непосредственно в полость черепа.

Согласно некоторым способам антитела вводят в составе композиции с замедленным высвобождением вещества или с помощью специального устройства, такого как Меб1раб™.

Как упоминалось выше, агенты, индуцирующие иммунный ответ к альфа-ЗN и Ав, могут вводиться в комбинации. Агенты могут быть скомбинированы в одной лекарственной форме или наборе для одновременного, последовательного или раздельного введения. Агенты могут находиться в различных фла

- 34 013752 конах в составе препарата или набора, или в одном флаконе. Агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут вводиться в комбинации с другими агентами, которые, по крайней мере, частично эффективны для лечения БВЭ. В случае болезни Паркинсона и синдрома Дауна, когда ЬВк появляются в ткани головного мозга, агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут вводиться совместно с другими агентами, которые улучшают прохождение агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, через гематоэнцефалический барьер.

Иммуногенные агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, такие как пептиды, иногда вводят в комбинации с адъювантом. В комбинации с пептидом, таким как альфа-δΝ, для индукции иммунного ответа могут использоваться различные адъюванты. Предпочтительные адъюванты вызывают эндогенный иммунный ответ на иммуноген без конформационных изменений последнего, что влияет на качество иммунного ответа. К предпочтительным адъювантам относится гидроксид алюминия и фосфат алюминия, 3-де-О-ацилированный монофосфориловый липид А (МРЬ™) (см. патент СВ 2220211, В1Ь1 1ттипоСИет. ВекеагсИ 1пс., НатШоп, Моп!апа, поте рай о£ Сопха). Зйти1оп™ 08-21 представляет собой тритерпеновый гликозид или сапонин, выделенный из коры дерева 0ш11а)а Заропапа Мойпа, растущего в Южной Америке (см. Кепкй е! а1., ш νη^ίικ Эекщп: ТИе ЗиЬипй апб Аб^ап! АрргоасИ (ебк. Ротее11 & №тетап, Р1епит Ргекк, ΝΥ, 1995); патент ИЗ № 5057540, ЛсщНа ВюРИагтасеийса1к, ЕгаттдИат, МА). Другие адъюванты представляют собой эмульсии масло в воде (например, скваленовое или арахисовое масло), возможно, в комбинации с иммуностимуляторами, такими как монофосфориловый липид А (см. З!ои!е е! а1., Ν. Епд1. I. Меб. 336, 86-91 (1997)), блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена и убитые микобактерии. Другим адъювантом является СрС (\У0 98/40100). Альтернативно, альфа-ЗN или Ав могут быть присоединены к адъюванту. Однако такая связь не должна существенно изменять конформацию альфа-ЗУ равно как и влиять на природу иммунного ответа к нему. Адъюванты могут вводиться как компоненты терапевтической композиции вместе с активным агентом, так и отдельно от введения агента, перед его введением, одновременно с ним или после введения терапевтического агента.

Предпочтительными адъювантами являются соли алюминия, такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия. Указанные адъюванты могут использоваться отдельно или совместно с другими специфическими иммуностимулирующими агентами, такими как МРЬ или 3-ЭМР, ОЗ-21, полимеры или мономеры аминокислот, такие как полиглутаминовая кислота или полилизин. Другим классом адъювантов является эмульсия масло-в-воде. Указанные адъюванты могут использоваться отдельно или совместно с другими специфическими иммуностимулирующими агентами, такими как мурамиловые пептиды (например, Ν-ацетилмурамил-Ь-треонил-Э-изоглутамин (!йг-МЭР), Ν-ацетилнонмурамил-Ь-аланил-Э-изоглутамин (нор-МЭР), Ν-ацетилмурамил-Ь-аланил-Э-изоглутаминил-Ьаланин-2-(1'-2'дипалмитоил-кп-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ), Ν-ацетилглюкозаминил-№ацетилмурамил-Е-А1-Э-изоглу-Е-А1а-дипалмитоксипропиламид (ЭТР-ЭРР) терамидТМ) или другие компоненты клеточной стенки бактерий. К эмульсиям масло-в-воде относятся (а) МЕ59 (\У0 90/14837), содержащая 5% Сквален, 0,5% Твин 80 и 0,5% Спан 85 (и, возможно, содержащая различные количества МТР-РЕ), заключенная в субмикронные частицы с помощью микрофлюидизатора, такого как Мобе1 110Υ (Мюгойшбюк, №те!оп МА); (Ь) ЗАЕ, содержащая 10% Сквален, 0,4% Твин 80, 5% и блоксополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена Ь121, и !йг-МЭР, также микрофлюидизированная на субмикронную эмульсию или полученная с помощью встряхивания эмульсия с большим размером частиц; и (с) В1Ь1™ адъювантная система (ВАЗ) (В1Ь1 1ттипоСИет, Натй!оп, МТ), содержащая 2% сквален, 0,2% Твин 80, и один или более компонент клеточной стенки бактерий из группы, включающей монофосфориллипид А (МРЬ), трегалозы димиколат (ТЭМ) и скелет клеточной стенки (С^З), предпочтительно МРЬ+САУЗ (Эе!ох™).

Другим предпочтительным классом адъювантов являются адъюванты класса сапонинов, такие как Зйти1оп™ (ОЗ-21, Адш1а, Егаттйдат, МА), или частицы, генерированные на их основе, такие как 1ЗС0Мк (иммуностимулирующие комплексы) и 1ЗС0МАТВ1Х. К другим адъювантам относятся ВС-529, СМ-СЗЕ, полный адъювант Фрейнда (СЕА) и неполный адъювант Фрейнда (1ЕА). К другим адъювантам относятся цитокины, такие как интерлейкины (например, 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-12, 1Б-13 и 1Ь-15), макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-СЗЕ), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-СЗЕ) и фактор некроза опухолей (ΊΝΕ). Другим классом адъювантов являются аналоги гликолипида, включая Ν-гликозиламиды, Ν-глюкозилмочевины и Ν-гликозилкарбаматы, каждый из которых по остатку сахара замещен аминокислотой, как иммуномодуляторы или адъюванты (см. патент ИЗ № 4855283). Белки теплового шока, например НЗР70 или НЗР90, также могут использоваться как адъюванты.

Адъювант может вводиться вместе с иммуногеном в составе одной композиции или может вводиться перед введением иммуногена, совместно с ним или после введения последнего. Иммуноген и адъювант могут быть упакованы в один флакон или в отдельные флаконы, содержимое которых смешивают перед введением. Иммуноген и адъювант обычно упаковывают вместе с инструкцией, в которой указаны показания к применению. В том случае, если иммуноген и адъювант упакованы отдельно, упаковка

- 35 013752 обычно содержит инструкцию по их смешиванию перед использованием. Выбор адъюванта и/или носителя зависит от стабильности иммуногенной композиции, содержащей адъювант, способа ее введения, режима дозирования, эффективности адъюванта для вида вакцинируемого животного и, у человека, от того, был ли данный фармацевтически доступный адъювант утвержден для использования у человека соответствующими регулирующими организациями. Например, полный адъювант Фрейнда не подходит для использования у человека. Соли алюминия, МРЬ и ОБ-21 являются наиболее предпочтительными. К предпочтительным комбинациям относятся соли алюминия и МРЬ, соли алюминия и ОБ-21. МРЬ и ОБ-21. МРЬ или КС-529 и ОМ-СБЕ; а также соли алюминия, ОБ-21 и МРЬ вместе. Также может использоваться неполный адъювант Фрейнда (Сйаид с1 а1., Л^аисей Эгад ΌβΙίνβΓγ Кеу1ете, 32, 173-186 (1998)), возможно в комбинации с любой солью алюминия, ОБ-21 и МРЬ, и с любыми их сочетаниями.

Агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, обычно вводятся в составе фармацевтических композиций, содержащих терапевтический агент и множество других фармацевтически доступных компонентов. См. КетшдФи'к Р11агтасеиНса1 Баеисе (15'¹' ей., Маск РиЬНкЫид Сотрапу, Еак1ои, Реиикукаша, 1980). Таким образом, любой агент (например, фрагмент α-синуклеина или антитело, специфически связывающееся с α-синуклеином) может использоваться для создания лекарственного средства для лечения синуклеинопатического заболевания. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого пути введения и терапевтического применения. Композиции могут также включать, в зависимости от желаемой лекарственной формы, фармацевтически доступные, нетоксичные носители или растворители, обозначаемые в общем как носители и обычно используемые для создания фармацевтических композиций для введения животным и человеку. Растворитель подбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность комбинации. Примерами таких растворителей являются дистиллированная вода, физиологический раствор с фосфатным буфером, раствор Рингера, раствор декстрозы и раствор Ханка. Кроме того, фармацевтическая композиция или лекарственная форма также может содержать другие носители, адъюванты или нетоксичные, нелекарственные, неиммуногенные стабилизаторы и им подобные соединения.

Фармацевтические композиции также могут включать большие, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, такие как хитозан, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты и сополимеры (такие как функционализированная латексом сефароза (ХМ), агароза, целлюлоза и им подобные соединения), полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и липидные агрегаты (такие как масляные капли или липосомы). Кроме того, указанные носители могут выполнять функцию иммуностимулирующих агентов (т.е. адъювантов).

Для парентерального введения агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут вводиться в составе лекарственных форм в виде растворов или суспензий активного вещества в физиологически доступном растворителе вместе с фармацевтически доступным носителем, который может представлять собой стерильную жидкость, такую как воду, масло, солевой раствор, глицерол или этанол. Кроме того, в композициях могут присутствовать вспомогательные соединения, такие как увлажняющие или эмульсифицирующие агенты, сурфактанты, соединения для поддержания рН и им подобные соединения. Другие компоненты фармацевтических композиций могут быть животной, растительной, синтетической природы или представлять собой нефтепродукты, например кокосовое масло, соевое масло, минеральное масло. В целом, гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, являются предпочтительными жидкими носителями, в особенности для инъекционных растворов. Антитела могут вводиться с помощью специальных депо-инъекций или имплантируемых систем, которые обеспечивают замедленное высвобождение активного ингредиента. Примерная композиция содержит моноклональное антитело в дозе 5 мг/мл в водном буфере, включающем 50 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №1С1 с рН 6,0, полученным с помощью НС1. Композиции для парентерального введения обычно являются полностью стерильными, полностью изотоничными и создаются при условиях ОМР, заданных ΕΌΆ или другой подобной организацией. Например, композиции, содержащие биологические вещества, обычно стерилизуют путем стерилизации фильтрованием.

Обычно композиции входят в состав лекарственных форм для инъекций как жидких растворов или суспензий, так и твердых лекарственных форм для растворения или суспензирования в жидком носителе перед введением. Композиция может быть также эмульсифицирована или инкапсулирована в липосомы или микрочастицы, такие как полилактид, полигликолид или сополимер, для усиленного адъювантного эффекта, как обсуждалось выше (см. Ьаидег, Бшеисе 249, 1527 (1990) и Напек, ЛАапсей Эгид Эек'егу Кеν^е^5 28, 97-119 (1997). Агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут вводиться с помощью специальных депо-инъекций или имплантируемых систем, которые обеспечивают замедленное или пульсирующее высвобождение активного ингредиента. Композиции могут входить в состав одной дозированной формы (т.е. композиция содержит достаточное количество активного ингредиента для введения одной дозы пациенту).

К другим композициям, подходящим для других способов введения, относятся композиции для перорального, интраназального и легочного введения, суппозитории и трансдермальные пластыри.

- 36 013752

В суппозиториях связывающие агенты и носители представляют собой, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть сформированы из смеси, содержащей активный ингредиент в количестве от 0,5 до 10%, предпочтительно от 1 до 2%. Лекарственные формы для перорального применения содержат наполнители, такие как фармацевтически доступный маннитол, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза или карбонат магния. Указанные композиции могут быть в форме растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, композиций с замедленным высвобождением вещества, или порошков и содержать 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%.

Местное применение может осуществляться с помощью трансдермальной или интрадермальной доставки. Местное поступление может быть усилено путем совместного введения агента и холерного токсина, или его детоксифицированных производных или субъединиц, или других аналогичных бактериальных токсинов (см. С1епп е! а1., №1иге 391, 851 (1998)). Совместное введение может осуществляться путем использования компонентов в виде простой смеси или в виде связанных молекул, полученных с помощью химического связывания или экспрессируемых в виде белка слияния.

Альтернативно, трансдермальная доставка может осуществляться с помощью кожного пластыря или с помощью трансферосом (Раи1 е! а1., Еиг. 1. Iттипο1. 25, 3521-24 (1995); Сеνс е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Ас!а. 1368, 201-15 (1998)).

VIII. Способы контроля и диагностики.

Настоящее изобретение относится к способам определения иммунного ответа к альфа-ЗN пептиду и/или Ав пептиду у пациента, страдающего от ЙВЭ или предрасположенного к нему. Указанные способы особенно полезны для осуществления контроля над результатами лечения у пациентов. Указанные способы могут использоваться как для контроля результатов во время терапевтического лечения у пациентов, имеющих симптомы, так и для контроля во время профилактического лечения у асимптоматических пациентов. Способы приемлемы для контроля как активной иммунизации (например, антител, вырабатываемых в ответ на введение иммуногена), так и пассивной иммунизации (например, для измерения уровня введенного антитела).

1. Активная иммунизация.

Некоторые способы подразумевают определение основной величины иммунного ответа у пациента перед введением дозы агента и сравнение ее с величиной иммунного ответа после лечения. Значительное увеличение (т.е. большее, чем стандартный предел экспериментальной ошибки при повторных измерениях в одном образце, выраженное как одно стандартное отклонение от средней величины таких измерений) величины иммунного ответа свидетельствует о положительном результате лечения (т.е. введение агента стимулировало развитие иммунного ответа). Если величина иммунного ответа существенно не изменилась или снизилась, это свидетельствует об отрицательном результате лечения. В целом, у пациентов, получающих первичный курс лечения иммуногенным агентом в достаточных дозах, отмечается увеличение величины иммунного ответа, которая впоследствии достигает фазы плато. Введение агента продолжают до тех пор, пока наблюдается увеличение величины иммунного ответа. Достижение плато является индикатором того, что введение может быть прекращено либо дозы и частота введения могут быть уменьшены.

Согласно другим способам контрольную величину (т.е. среднее и стандартное отклонение) иммунного ответа определяют для контрольной популяции. Обычно пациенты из контрольной популяции не получали предварительного лечения. Полученные величины иммунного ответа у пациента после введения терапевтического агента затем сравнивают с контрольной величиной. Существенное увеличение измеренной величины по сравнению с контрольной (т. е. более чем одно стандартное отклонение от средней величины) свидетельствует о положительном результате лечения. Отсутствие существенного увеличения или снижение величины иммунного ответа свидетельствуют об отрицательном результате лечения. Введение агента продолжают до тех пор, пока отмечается увеличение величины иммунного ответа по сравнению с контрольной. Как и в предыдущем случае, достижение фазы плато является индикатором того, что введение агента или лечение могут быть прекращены или могут быть уменьшены дозы и частота введения агента.

Согласно другим способам контрольные величины иммунного ответа (т.е. среднее и стандартное отклонения) определяют в контрольной популяции пациентов, которые получали лечение терапевтическим агентом и чей иммунный ответ достиг фазы плато в ответ на лечение. Измеренные величины иммунного ответа у пациентов сравнивают с контрольной величиной. В том случае, если полученная величина существенно (т. е. более чем на одно стандартное отклонение) не отличается от контрольной величины, лечение может быть прекращено. В том случае, если уровень иммунного ответа у пациента значительно ниже контрольной величины, введение агента необходимо продолжить. Если же уровень иммунного ответа у пациента остается ниже контрольной величины, возможно, требуется изменение лечебного режима или использование другого адъюванта.

Согласно другим способам у пациента, который в настоящее время не получает лечения, но получил предварительный курс лечения, контролируют иммунный ответ для того, чтобы определить, требуется ли возобновление лечения. Величину иммунного ответа у пациента можно сравнить с величиной иммунного ответа, которая была достигнута во время предыдущего курса лечения. Значительное умень

- 37 013752 шение по сравнению с первичным измерением (т. е. более чем средняя величина ошибки при повторных измерениях в одном образце) является показанием к возобновлению лечения. Альтернативно, величину иммунного ответа, измеренную у пациента, сравнивают с контрольной величиной (среднее плюс стандартное отклонение), определенной в контрольной популяции пациентов после курса лечения. Альтернативно, величину иммунного ответа, измеренную у пациента, можно сравнить с контрольной величиной в популяции пациентов, получавших профилактическое лечение и не имеющих симптомов заболевания, или в популяции пациентов, получавших терапевтическое лечение, у которых наблюдается уменьшение прогрессирования заболевания. Во всех указанных случаях значительное уменьшение величины иммунного ответа по сравнению с контрольной (т. е. более чем на одно стандартное отклонение) является показанием к возобновлению лечения пациента.

Образец ткани для анализа обычно представляет собой образец крови, плазмы, сыворотки, слизистой оболочки или цереброспинальной жидкости пациента. Образец исследуют на предмет наличия иммунного ответа к любой форме альфа-δΝ, обычно NΑС или Ав. Иммунный ответ может быть определен на основании наличия, например, антител к Т-клеткам, которые специфически связываются с альфа-δΝ или Ав. Способы индикации антител, специфичных по отношению к альфа-δΝ, с помощью ΕΟδΑ описаны в Примерах. Способы индикации реактивных Т-клеток были описаны выше (см. раздел Определения). Согласно некоторым способам иммунный ответ определяют с помощью исследования очищающего эффекта, как описано выше в разделе ΙΙΙ. Согласно указанным способам образец крови или ткани пациента, подлежащий исследованию, обрабатывают ЬВз (например, из синуклеин/ΗΑΡΡ трансгенных мышей) и фагоцитирующими клетками, несущими Ес-рецепторы. Затем контролируют последующее исчезновение ЬВз. Наличие и продолжительность очищающего ответа позволяет определить выработку и уровень антител, эффективных для удаления альфа-δΝ из тканевого образца пациента.

2. Пассивная иммунизация.

В целом все способы контроля пассивной иммунизации аналогичны способам контроля активной иммунизации, описанным выше. Однако профиль антительного ответа после пассивной иммунизации характеризуется наличием промежуточного пика концентрации антител, после которого следует экспоненциальное ее снижение. Без введения дополнительной дозы такое снижение концентрации приводит к достижению тех уровней, которые наблюдались до лечения, в течение периода времени от нескольких дней до нескольких месяцев, в зависимости от периода полураспада введенного антитела. Например, период полураспада некоторых человеческих антител составляет около 20 дней.

Согласно некоторым способам первоначальное измерение уровня антител к альфа-δΝ у пациента осуществляют перед введением антител, второе измерение производят сразу после их введения для определения пика концентрации антител, после чего осуществляют дополнительные измерения с интервалами для контроля за снижением концентрации антител. Когда уровень антител опускается до исходного уровня либо отмечается его снижение ниже исходного уровня (например, на 50, 25 или 10%), вводится дополнительная доза антитела. Согласно некоторым способам пиковые или последующие измеренные уровни антител ниже исходных сравнивают с предварительно измеренными контрольными уровнями для того, чтобы составить наиболее благоприятный профилактический или лечебный режим для других пациентов. В том случае, если измеренный уровень антител значительно ниже контрольного (например, менее чем средний минус одно стандартное отклонение контрольной величины в популяции пациентов с благоприятными результатами лечения) требуется введение дополнительной дозы антител.

3. Диагностические наборы.

Настоящее изобретение также относится к диагностическим наборам для осуществления диагностических тестов, описанных выше. Обычно указанные наборы включают агент, который специфически связывается с антителами к альфа-δΝ. Набор также содержит метку. Для индикации антител к альфа-δΝ метка обычно представляет собой меченые антиидиотипические антитела. Для определения антител агент может быть предварительно прикреплен к твердому носителю, например к лункам или планшету для микротитрования. Наборы обычно содержат этикетку с инструкциями по использованию набора. Этикетка также может содержать схему или другую соответствующую информацию, позволяющую сопоставить измеренный уровень метки с уровнем антител к альфа-δΝ. Термин этикетка относится к любому написанному тексту, который прикреплен к набору или сопровождает набор во время его создания, транспортировки, продажи и использования. Например, термин этикетка объединяет все рекламные листы, брошюры, упаковку, инструкции, аудио- или видеокассеты, компьютерные диски, а также надписи, напечатанные непосредственно на контейнере, в котором содержится набор.

Настоящее изобретение также относится к диагностическим наборам для осуществления исследований 1п у1уо. Такие наборы обычно содержат антитело, специфически связывающееся с эпитопом альфа-δΝ, предпочтительно с ΝΑΟ Предпочтительно антитело является меченым либо в набор входит второй меченый агент. Предпочтительно в набор входят инструкции по осуществлению исследования ш У1уо.

- 38 013752

IX. Исследования ίη νίνο.

Настоящее изобретение относится к способам определения ЬВк у пациентов ίη νίνο. Указанные способы полезны для диагностики или подтверждения диагноза ΡΌ или других заболеваний, ассоциированных с присутствием ЬВк в головном мозге, а также для определения предрасположенности к указанным заболеваниям. Например, указанные способы могут использоваться у пациентов, имеющих симптомы деменции. Если у пациента имеются ЬВк, скорее всего, он страдает ΡΌ. Указанные способы могут использоваться и у пациентов, не имеющих симптомов. Наличие патологических отложений амилоида свидетельствует о предрасположенности к развитию заболевания. Указанные способы также полезны для контролирования прогрессирования заболевания и/или ответа на лечение у пациентов с диагносцированной ΡΌ.

Способы заключаются во введении реагента, такого как антитела, которое связывается с альфа-δΝ в организме пациента, с последующей индикацией агента после связывания. Предпочтительные антитела связываются с альфа-δΝ в составе отложений, имеющихся у пациента, без связывания с полноразмерным NΑСΡ полипептидом. Антитела, связывающиеся с эпитопом альфа-δΝ в составе NΑС, являются наиболее предпочтительными. Если необходимо, очищающего эффекта можно избежать путем использования антительных фрагментов, не имеющих полноразмерного константного участка, таких как ЕаЬк. Согласно некоторым способам одно и то же антитело может выполнять функцию лечебного и диагностического агента. В целом, антитела, связывающиеся с Ν-концевыми эпитопами альфа-δΝ, не демонстрируют такого сильного сигнала, как антитела, связывающиеся с С-концевыми эпитопами, главным образом потому, что Ν-концевые эпитопы являются недосягаемыми в ЬВк (8ρί11ηηΙίηί с1 а1. РХАЗ, 1998). Соответственно указанные антитела являются менее предпочтительными.

Диагностические реагенты могут вводиться путем внутривенных инъекций в организм пациента, или путем интракраниальной инъекции непосредственно в головной мозг, или путем просверливания отверстия в черепе. Дозы диагностических агентов должны находиться в тех же пределах, что и лечебные дозы. Обычно реагент является меченым, хотя согласно некоторым способам первичный реагент с аффинностью к альфа-δΝ является немеченым, а для связывания первичного реагента используется второй меченый агент. Выбор метки зависит от способа индикации. Например, флуоресцентная метка подходит для оптической индикации. Использование парамагнитных меток подходит для томографической индикации без хирургического вмешательства. Радиоактивные метки также могут быть определены с помощью РЕТ или 8РЕСТ.

Диагностику осуществляют путем сравнения количества, размера и/или интенсивности меченых участков и соответствующих исходных величин. Исходные величины могут представлять средние уровни в популяции здоровых людей. Исходные величины также могут представлять собой уровни, предварительно определенные у того же пациента. Например, исходные величины могут быть определены у пациента перед началом лечения, с ними затем сравнивают измеренные величины после лечения. Снижение измеренных величин по сравнению с исходным уровнем свидетельствует о положительном ответе на лечение.

Примеры

Пример I. Иммунизация трансгенных мышей α-синуклеином человека, приводящая к образованию высокого титра анти-а-синуклеиновых антител, которые проникают через гематоэнцефалический барьер.

Полноразмерный рекомбинантный альфа-δΝ человека ресуспендируют в концентрации 1мг/мл в 1Х физиологического раствора с фосфатным буфером (РВ8). Для каждой инъекции используют 5 мкл альфа8Ν; что дает конечную концентрацию в 50 мкл на одну инъекцию, к которой добавляют 150 мкл 1Х РВ8. Затем добавляют полный адъювант Фрейнда (СЕА) в соотношении 1:1 как к альфа-δΝ, так и к РВ8 (контроль), после чего смесь встряхивают и обрабатывают ультразвуком до полного суспендирования эмульсии. Для первичной иммунизации восьми трансгенным мышатам линии Ό в возрасте 4-7 месяцев (МакНай, с1 а1. 8аепсе, 287:1265-1269 (2000) вводят альфа-δΝ человека в СЕА, в качестве контроля четырем трансгенным мышатам линии Ό вводят РВ8 в СЕА. Мыши в целом получают 6 инъекций. Три инъекции осуществляют с интервалом в 2 недели, затем еще три инъекции с месячным интервалом. Через 5 месяцев после начала эксперимента мышей умерщвляют, используя руководство ΝΣΗ по гуманному обращению с животными. После того как собирают образцы крови для определения титров антител, головной мозг фиксируют с погружением в 4% параформальдегид в РВ8 на 4 дня. На основании титров антител мышей разделяют на две группы. У первой группы титр антител составляет в среднем 2-8,000. У второй группы отмечается более высокий титр антител, в среднем 12000-30000. У контрольных мышей не регистрируется никакого титра. Нейропатологический анализ показывает, что у мышей, продуцирующих антитела в высоких титрах, наблюдается заметное уменьшение размера синуклеиновых включений. У мышей, продуцирующих антитела в небольшом титре, отмечается менее выраженный эффект.

На фиг. 2 (панели а-б) показаны включения синуклеина у (а) нетрансгенных мышей, (Ь) трансгенных мышей, получивших только СЕА, (с) трансгенных мышей, иммунизированных α-синуклеином и СЕА и продуцирующих средний титр антител, и (б) трансгенных мышей, иммунизированных α-синуклеином и СЕА и продуцирующих антитела в высоком титре. Образцы визуализируют путем им

- 39 013752 мунологического окрашивания антителом к альфа-δΝ человека. На фиг. 2 показаны включения синуклеина, панель (Ь), не (а). На панели (с), где представлены результаты, полученные для мышей, продуцирующих средние титры антител, видно, что произошло некоторое уменьшение интенсивности включений. На панели (б) видно значительное уменьшение интенсивности включений. На панелях (е)-(й) представлены уровни анти-1дС в головном мозге тех четырех мышей, что представлены на панелях (а)-(б) соответственно. Видно, что 1дС присутствуют на панели (д) и на большем протяжении на панели (11). Указанные данные свидетельствуют о том, что антитела к альфа-δΝ, введенные в периферический кровоток, проходят гематоэнцефалический барьер и проникают в головной мозг. На панелях (1)-(1) представлены результаты окрашивания на САР, маркер астроглиальных клеток, опять для тех же четырех мышей, что и в первых 2 частях рисунка. Видно, что на панелях (к) и (1) имеется более яркое окрашивание, чем на панелях (ί) и ()). Эти данные говорят о том, что рассасывание включений синуклеина сопровождается незначительной реакцией микроглиальных и астроглиальных клеток.

Таблица 1

Группа	Генотип	η =	Возраст умерщвления	Лечение/ Продолжительность	Титр	Включения 8уп(+)/ мм2
I	ЗупТд	4	10-13	а-зуп+СГА 50 мкг на инъекцию для двух инъекций с 2-х недельным ипт. и трех с мес. инт	2,000- 8,000	15-29
П	8упТ§	4	10-13	а-зуп+СГА 50 мкг на инъекцию в для двух инъекций с 2-х недельным инт. и трех с мес. инт	12,000- 30,000	10-22
ш	8уп Т§	4	10-13	РВ8+СГА 50 мкг на инъекцию для двух инъекций с 2-х недельным инт. и трех с мес. инт	0	18-29

Пример II. 1п уйго исследование антител, обладающих очищающим эффектом в отношении синуклеиновых включений.

СТ1-7 нейрональные клетки (Нкие е! а1. Ат. 1. Ра!йо1. 157:401-410 (2000)) трансфецируют рСК3.1-Т вектором экспрессии (1пуйгодеп, Саг1кЬаб, СА), экспрессирующим мьшиный альфа-δΝ, и сравнивают с клетками, трансфецированными только вектором экспрессии (фиг. 3, панели А и В соответственно). Клетки, трансфецированные только вектором (панель А), имеют фенотип фибробластов, в то время как клетки, трансфецированные альфа-δΝ, являются круглыми, при этом включения визуализируются вблизи поверхности клеток как при световой, так и при конфокальной сканирующей микроскопии. Затем трансфецированные клетки обрабатывают преиммунной сывороткой кролика (панель С) или 67-10, аффинным очищенным поликлональным антителом кролика к С-концевым остаткам 131-140 мышиного альфа-δΝ (йуне е! а1., №игоп, 14:467 (1995), панель Ό. Можно заметить, что включения окрашены менее интенсивно на панели Ό, чем на панели С, что свидетельствует о том, что антитело к α-синуклеину оказалось эффективным для очищения или профилактики образования указанных включений. На фиг. 4 представлен анализ корпускулярных и цитозольных фракций СТ1-7 трансфецированных клеток, обработанных преиммунной сывороткой кролика и 67-10 поликлональным антителом, в геле. Можно заметить, что уровень синуклеина в цитозольной фракции остается неизменным после обработки преиммунной сывороткой или антителом к альфа-δΝ. Однако участки отложения альфа-δΝ исчезают в мембранной фракции СТ1-7 клеток, обработанных антителом к альфа-δΝ. Полученные данные свидетельствуют о том, что активность антитела к альфа-δΝ приводит к исчезновению синуклеина, ассоциированного с мембранами клеток.

Трансфецированные СТ1-4 клетки могут использоваться для скринирования активности антител в отношении синуклеиновых включений с последующим иммуногистохимическим анализом, световой микроскопией, как показано на фиг. 3, или с анализом в геле, как на фиг. 4.

Пример III. Профилактическая и терапевтическая эффективность иммунизации α-синуклеином. ί) Иммунизация α-синуклеином (альфа-δΝ) человека трансгенных мышей.

Для этого исследования используют гетерозиготных по α-синуклеину человека трансгенных мышей, линия Ό (Макйай е! а1., 2000, δ^ι^, 286:1265-69), и нетрансгенных мышей в качестве контроля. Экспериментальных животных разделяют на три группы.

В группе I тестируют превентивные эффекты ранней иммунизации (иммунизация мышей в течение 8 месяцев начиная с двухмесячного возраста).

В группе II молодых мышей начиная с шестимесячного возраста вакцинируют в течение 8 месяцев для определения того, способна ли иммунизация снизить прогрессию заболевания при установленной

- 40 013752 умеренной патологии.

В группе III более взрослых мышей начиная с двенадцатимесячного возраста вакцинируют в течение 4 месяцев для определения того, способна ли иммунизация снизить тяжесть симптомов заболевания при установленной тяжелой патологии.

Во всех группах мышей иммунизируют рекомбинантным альфа-δΝ человека и СЕА или одним СЕА и в каждом эксперименте используют 20 трансгенных и 10 нетрансгенных мышей. Среди них 10 трансгенных мышей иммунизируют альфа-δΝ человека+СЕА и остальных 10 трансгенных мышей иммунизируют СЕА. Сходным образом, 5 нетрансгенных мышей иммунизируют альфа-δΝ человека+СЕА, а остальных 10 нетрансгенных мышей иммунизируют СЕА. Коротко говоря, протокол иммунизации включает первоначальную инъекцию очищенного рекомбинантного альфа-δΝ человека (2 мг/мл) в СЕА и последующую инъекцию через 1 месяц комбинации альфа-δΝ человека и СЕА. Далее мышей повторно инъецируют указанной смесью 1 раз в месяц. В небольшой субпопуляции трансгенных мышей, иммунизированных альфа-δΝ человека (п=3; возраст 6 месяцев), и нетрансгенных мышей, иммунизированных альфа-δΝ человека (п=3; возраст 6 месяцев), проводят дополнительные эксперименты, заключающиеся в том, что мышей иммунизируют альфа-δΝ мыши, бета-синуклеином человека или мутантным (А53Т) альфа-δΝ человека.

Уровни антител к альфа-δΝ определяют при использовании 96-луночных планшетов, покрытых 0,4 мкг на лунку очищенного полноразмерного альфа-δΝ, при инкубировании в течение ночи при 4°С в натрий-карбонатном буфере, рН 9,6. Лунки отмывают 4Х 200 мкл ΡΒδ, содержащего 0,1% Твина, и блокируют в течение 1 ч ΡΒδ -1% ΒδΑ при 37°С. Образцы сыворотки последовательно разводят в лунках в соотношении 1:3, начиная с ряда А, варьируя разведения от 1:150 до 1:328050. В контрольных экспериментах образец моноклонального антитела мыши тестируют против альфа-δΝ и только буферного раствора без белка. Образцы инкубируют в течение ночи при 4°С и далее в течение 2 ч с антителами козы против мыши, конъюгированными с щелочной фосфатазой (1:7500, Ρ^отеда, Маб15оп, А^. Далее добавляют субстрат для щелочной алкалинфосфатазы Аио-р1ю5 в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты считывают при длине волны 450 нм для экстинции и 550 нм для эмиссии. Результаты выражают в виде полулогарифмического графика с относительными единицами флуоресценции по оси ординат и разведениями сыворотки по оси абсцисс. Титр антител определяют как разведение, при котором наблюдается 50%-ное снижение максимального антительного связывания.

В каждой группе животных в конце эксперимента мышей исследуют в моторном ротароде, как описано Ма511ай, е! а1. (2000). После этого мышей умерщвляют и удаляют мозг для детального нейрохимического и нейропатологического исследования, как раскрыто ниже. Коротко говоря, правое полушарие головного мозга замораживают и гомогенизируют с целью выявления агрегированной и неагрегированной иммунореактивности альфа-δΝ человека вестерн-блоттингом (Ма511ай, е! а1. (2000)). Левое полушарие фиксируют в 4%-ном параформальдегиде, делают серийные срезы на вибратоме для иммуноцитохимического и ультраструктурного анализа.

ίί) Иммуноцитохимический и ультраструктурный анализ.

Для оценки эффективности иммунизации срезы с агрегированным альфа-δΝ человека окрашивают поликлональными антителами кролика к альфа-δΝ человека (1:500). После инкубирования в течение ночи при 4°С срезы инкубируют с биотинилированным вторым антителом кролика и далее с комплексом Авидин Ό-пероксидаза хрена (1:200, АВС Е11!е, Уес!ог). Срезы также окрашивают только вторым антителом к антителам кролика, мыши и человека. Эксперименты со вторым антителом к антителам мыши выявляют, проникают ли антитела к альфа-δΝ человека в головной мозг. Реакцию визуализируют с помощью 0,1%-ного 3,3-диаминобензидинтетрагидрохлорида (ИАВ) в 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,4) с добавлением 0,001%-ного Н₂О₂ и срезы исследуют в аппарате Еп!е11ап. Уровни иммунореактивности полуколичественно оценивают по оптической денситометрии в анализаторе Онапбте! 570С. Срезы также изучают в исследовании создания воображения для выявления числа альфа-δΝ иммунореактивных включений, и это надежное измерение агрегации альфа-δΝ служит достоверным показателем противодействующего агрегации эффекта вакцинации (Ма511а1, е! а1. (2000)).

Характер нейродегенеративных изменений определяют анализом синаптических и дендритных уплотнений в гиппокампе, лобной, височной коре и базальном ганглии на вибратомных срезах при двойном иммуномечении на синаптофизин и белок 2, ассоциированный с микротрубочками (МАР2), и визуализируют с помощью Ρδί'Μ. Дополнительное исследование нейродегенерации осуществляют выявлением иммунореактивности тирозингидроксилазы (ТН) в хвостатом ядре, скорлупе чечевицеобразного ядра и черной субстанции, как описано ранее (Ма511ай, е! а1. (2000)). Срезы проявляют с помощью ΡδίΜ и каждое индивидуальное изображение интерактивно увеличивают таким образом, чтобы ТН-иммунореактивность могла быть окончательно выражена в линейном значении по отношению к интенсивности изображения в пикселях. Шкала позволяет определить отношение пикселя к микронам. Затем полученную информацию используют для вычисления % области нейропиля с ТН-иммунореактивностью. Те же самые срезы также используют для определения числа ТН-нейронов в δΝ.

- 41 013752

Для определения характера иммунного ответа на иммунизацию проводят иммуноцитохимический и ультраструктурный анализ с антителами против 6ΕΑΡ, МНС II класса, Мас 1, ΤΝΕ-альфа, !Ь-1-бета и ГЬ-6 человека в срезах головного мозга !д-мышей и поп!д-мышей, иммунизированных рекомбинантным альфа-δΝ человека и контрольными иммуногенами.

ίίί) Анализ поведения.

Мышей исследуют на локомоторную активность в течение 2 дней в ротароде (δηπ О1едо Шк^тепй, δаη О1едо, СА), как описано ранее (Макйай, е! а1. (2000)). В первый день мышей тестируют в 5 экспериментах: в первом при 10 об/мин, во втором при 20 об/мин и далее при 40 об/мин. На второй день мышей тестируют в 7 экспериментах при 40 об/мин каждый. Мышей по отдельности помещают на цилиндр и увеличивают скорость вращения от 0 до 40 об/мин в течение 240 с. Время, в течение которого животное остается на стержне, фиксируют, и оно служит показателем их моторной активности.

Пример IV. Иммунизация фрагментами α-синуклеина.

Трансгенных по альфа-δΝ человека мышей в возрасте 10-13 месяцев иммунизируют 9 различными фрагментами альфа-δΝ для того, чтобы определить, какие эпитопы вызывают эффективный ответ. Девять различных иммуногенов и контрольный препарат инъецируют интраперитонеально, как описано выше. Иммуногены представляют собой четыре пептидных конъюгата альфа-δΝ человека с антителами овцы против мыши, полученными за счет цистеиновой связи. В качестве положительного и отрицательного контролей используют альфа-δΝ и ΡΒδ соответственно. Титры контролируют, как описано выше, и мышей умерщвляют по окончании 3-12 месяцев инъекций. Посмертно проводят гистохимический и токсикологический анализ, а также определяют уровни альфа-δΝ.

ί) Получение иммуногенов.

Получение связанных альфа^^пептидов: конъюгаты альфа^^пептидов человека получают связыванием искусственного цистеина, добавленного к альфа^^пептиду, при использовании перекрестносвязывающего реагента сульфо-ЕΜСδ. Производные альфа^^пептида синтезируют с указанными ниже конечными аминокислотными последовательностями. В каждом случае локализация встроенного остатка цистеина подчеркнута альфа-синуклеин 60-72 (ΝΑΟ участок) пептид:

ИН2-КЕОУТКУСООАУУТ-СООН (ЗЕф ГО N0:54) альфа-си нуклеин 73-84 (ΝΑΟ участок) пептид:

ΝΗ2-σνΤΑνΑΟΚΤνΕΟΟ-ΟΟΟΗ (ЗЕф ГО N0:55) альфа-синуклеин 102-112 пептид:

ЙН2-С-аминогептановая кислота -ΚΝΕΕΟΑΡΟΟΕΟ-ΟΟΟΗ (ЗЕф ГО N0:56) альфа-синуклеин 128-140 пептид:

Αο-ΝΗ-Ρ8ΕΕΟΥΟΟΥΕΡΕΟΑ-ΟΟΟΗ (8Е0 ГО N0:57)

Для осуществления реакции связывания 10 мг антител овцы против мыши (1асккоп [ттипоЕекеагсй ЬаЬога!опек) диализуют в течение ночи против 10 мМ натрий боратного буфера, рН 8,5. Затем диализованные антитела концентрируют до объема 2 мл в пробирке Атюоп Сепйгргер. Затем 10 мг сульфо-ЕΜСδ |Ы-(е-малеимидокупроилокси)сукцинимида] (Мо1еси1аг δοίοικοκ Со.) растворяют в 1 мл деионизованной воды. 40-кратный молярный избыток сульфо-ЕΜСδ добавляют по каплям при перемешивании к антителам овцы против мыши и раствор дополнительно перемешивают в течение 10 мин. Активированные антитела овцы против мыши очищают и вытесняют буфером при нанесении на гель-фильтрационную колонку объемом 10 мл Щетсе Ρ^еκ!о Со1итп, поставляется Ρ^е^се Сйетка1к), уравновешенную 0,1 М ΝβΡ0₄, 5 мМ ЕИТА, рН 6,5. Фракции, содержащие антитела, идентифицируют по поглощению при 280 нм, объединяют и разводят до концентрации около 1 мг/мл, принимая за коэффициент экстинции 1,4 мг в расчете на единицу 0Ό. 40-кратный молярный избыток альфа^^пептида растворяют в 20 мл 10 мМ NаΡ0₄, рН 8,0, за исключением того, что 10 мг данного пептида сначала растворяют в 0,5 мл ^ΜδΟ и далее разводят до 20 мл с помощью 10 мМ NаΡ0₄ буфера. Каждый из растворов пептида добавляют к 10 мл активированных антител овцы против мыши и покачивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Полученные конъюгаты концентрируют до конечного объема менее 10 мл в пробирке Атюоп Сеп!пргер и затем диализуют против ΡΒδ для обмена буфера и удаляют свободный пептид. Конъюгаты пропускают через фильтры размером пор 0,22 мкм для стерилизации и разливают в аликвотные фракции по 1 мг и хранят в замороженном состоянии при -20°С. Концентрацию конъюгатов определяют в анализе с ВСА Щетсе Сйетюа1к) при использовании лошади для стандартной кривой. Конъюгацию отслеживают по увеличению молекулярной массы конъюгированных пептидов по отношению к

- 42 013752 активированным антителам овцы против 1д мыши.

Пример V. Пассивная иммунизация антителами к α-синуклеину.

Трансгенных по альфа-ЗN человека мышей инъецируют 0,5 мг в РВЗ моноклональными антителами к альфа-З№ как описано ниже. Все препараты антител очищают для понижения уровня эндотоксина. Моноклональные антитела получают, иммунизируя мышей фрагментами альфа-ЗN различной длины. Затем получают гибридомы и скринируют их на продукцию антител, которые специфически связываются с нужным фрагментом альфа-ЗN и не связываются с другими неперекрывающимися фрагментами альфа-ЗК

Мышей инъецируют по мере необходимости интраперитонеально в течение 4 месяцев для поддержания концентрации циркулирующих антител, составляющей более 1:1000, что измеряется ЕЬ1ЗА по отношению к альфа-ЗN или другому иммуногену. Титры контролируют, как описано выше, и мышей умерщвляют по окончании 6 месяцев инъекций. Посмертно проводят гистохимический и токсикологический анализ, а также определяют уровни альфа-ЗК

Пример VI. Ав-иммунизация Зуп/АРР трансгенных мышей.

Эксперимент сравнивает эффекты Ав-иммунизации трех типов трансгенных мышей: трансгенных мышей с трансгеном α-синуклеина (8ΥΝ), мышей АРР с трансгеном АРР (Сатек е! а1.) и трансгенных мышей по двум генам ЗΥN/ΑРР, полученных путем скрещивания одинарных трансгенов. Двойные трансгенные мыши описаны Мак11ак, е! а1., РNΑЗ ИЗА. 98:12245-12250 (2001). Эти мыши являются моделью индивидуумов, страдающих одновременно болезнью Альцгеймера и болезнью Паркинсона. В табл. 2 указаны различные группы животных, возраст используемых мышей, методики исследования и титры антител к Ав. Можно видеть, что значительные титры получены во всех трех группах мышей. На фиг. 5 показан % области, занятой амилоидными бляшками Ав в головном мозге животных, определенный исследованием срезов головного мозга обработанных животных под микроскопом. Значительные отложения обнаружены у АРР и ЗΥN/ΑРР мышей, но не у мышей ЗΥN и контрольных животных. Отложения более ярко выражены у ЗΥN/ΑРР двойных трансгенных мышей. Иммунизация Ав 1-42 снижает отложения у АРР и ЗΥN/ΑРР мышей. На фиг. 6 показаны отложения синуклеина у мышей различных групп, что определено конфокальным лазерным сканированием и световой микроскопией. Отложения синуклеина аккумулируются у ЗΥN и З ΥΝ/АРР мышей, иммунизированных только СЕА. Однако у тех же животных, иммунизированных Ав 1-42 и СЕА, выявляется существенное уменьшение уровня отложений синуклеина. Эти данные свидетельствуют о том, что иммунизация Ав эффективна не только для уменьшения отложений Ав, но и для уменьшения отложений синуклеина. Таким образом, иммунизация антителами к Ав эффективна не только для лечения болезни Альцгеймера, но и для лечения болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона одновременно, а также для лечения болезни Паркинсона у пациентов, не страдающих болезнью Альцгеймера. Титр антител к Ав у мышей ЗΥN/ΑРР коррелирует с уменьшением образования включений синуклеина (г=0,71; р менее 0,01).

Таблица 2

Группа	п =	Возраст	Лечение/ Продолжительность	Титры АЪ
8ΥΝ	4	12-20	Антитело в дозе 50 мкг на инъекцию в течение 6 месяцев	10,000-58,000
8ΥΝ	2	12-20	Физ. р-р в течение 6 месяцев	0
АРР	2	12-20	Антитело в дозе 50 мкг на инъекцию в течение 6 месяцев	25,000
АРР	2	12-20	Физ. р-р в течение 6 месяцев	0
3ΥΝ/ΑΡΡ	4	12-20	Антитело в дозе 50 мкг на инъекцию в течение 6 месяцев	1,000-50,000
8ΥΝ/ΑΡΡ	2	12-20	Физ. р-р в течение 6 месяцев	0

Пример VII. Ех у1уо исследование активности антител к амилоидным депозитам.

Для исследования активности антител в отношении рассасывания амилоидных бляшек авторы настоящего изобретения осуществляют ех у1уо исследование, в котором первичные микроглиальные клетки культивируют с нефиксированными криостатными срезами головного мозга РЭАРР мышей или людей, страдающих АО. Микроглиальные клетки получают из коры головного мозга новорожденных мышат ЭВА/ΣΝ (1-3 дня от роду). Кору головного мозга механически измельчают в НВЗЗ (Напкк'к

- 43 013752

Ва1апсеб §а1Г §ο1υΙίοη. §1дта; сбалансированный солевой раствор Хэнкса) с 50 мкг/мл ДНКазы I (§1дта). Диссоциированные клетки фильтруют через 100 мкм клеточный фильтр (Еа1соп) и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок повторно суспендируют в ростовой среде (ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 10% ЕВ§, 25 нг/мл гтСМ-С§Е), после чего клетки помещают в пластиковую культуральную колбу (из следующего расчета: клетки, выделенные из головного мозга двух мышат, на одну Т-75 колбу). Через 7-9 дней колбы вращают в ротационном шейкере при 200 об/мин в течение 2 ч при 37°С. Клеточную суспензию центрифугируют при 1000 об/мин и повторно суспендируют в исследуемой среде.

10-мкм криостатные срезы головного мозга РЭАРР мышей и людей, страдающих АО (время после смерти <3 ч), размораживают и помещают на покрытые полилизином круглые стеклянные предметные стекла, которые помещают на лунки 24-луночного планшета для культивирования тканей. Предметные стекла дважды отмывают исследуемой средой, включающей Н-§ЕМ (гибридомная бессывороточная среда, С1Ьсо ВКЬ) с 1% ЕВ§, глутамин, пенициллин/стрептомицин и 5 нг/мл гтСМ-С§Е (Β&Ό). Контрольные или анти-Ав антитела добавляют в 2х концентрации (5 мкг/мл, конечная) в течение 1 ч. Микроглиальные клетки затем высевают с плотностью 0,8x10 клеток/мл исследуемой среды. Культуру поддерживают во влажном инкубаторе (37°С, 5% СО₂) в течение 24 ч или более. После инкубации культуры фиксируют 4%-ным парафармальдегидом и делают проницаемыми с помощью 0,1% Тритона-Х100. Срезы окрашивают биотинилированным 3Ό6, а затем конъюгатом стрептавидин/Су3 Цасккоп 1ттипоКе8еагсй). Экзогенные микроглиальные клетки визуализируют путем окрашивания ядер (ΌΛΡΙ). Культуры изучают в обратном флуоресцентном микроскопе (Мком, ТЕ300) и делают микрофотографии с помощью §Р0Т цифровой камеры с использованием программного обеспечения §Р0Т (Э1адпоШс йШгитепй). Для вестерн-блот анализа культуры экстрагируют в 8М мочевины, разводят в соотношении 1:1 в восстанавливающем трициновом буфере и наносят на 16% трициновый гель (Нохех). После переноса на иммуноблот, блоты обрабатывают 5 мкг/мл раЬАв42, а затем НКР-конъюгированным антимышиным антителом, после чего обрабатывают ЕСЬ (Атеткйат).

Когда исследование осуществляют с использованием срезов головного мозга РЭАРР мышей в присутствии антитела к NΛС, отмечается заметное уменьшение числа и размера бляшек, что свидетельствует о наличии у антитела очищающей активности. Антитело к NΛС контактирует с образцом ткани головного мозга, содержащим бляшки и микроглиальные клетки, как описано выше. Сыворотку кролика используют в качестве контроля.

Аналогичное исследование осуществляют с использованием срезов головного мозга РЭАРР мышей в присутствии нескольких антител к Ав. Сравнивают способность антител индуцировать фагоцитоз в исследовании ех у1уо и снижать амилоидную нагрузку в исследовании пассивного переноса. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эффективность ш у1уо обусловлена непосредственным очищающим эффектом антител в отношении бляшек в ЦНС, а результаты исследования ех у1уо позволяют предсказать эффективность ш у1уо (см. табл. 16 и 17 примера Х1У заявки \У0 00/72880 и табл. 16 примера Х1У заявки \У0 0072876, обе заявки включены в настоящее описание в качестве ссылок).

Пример УШ. Активная иммунизация α-синуклеином.

А. Материалы и методы.

Вакцинация Ιια-синуклеин трансгенных мышей.

Для данного исследования используют гетерозиготных трансгенных мышей (линия Ό), экспрессирующих Ηα-синуклеин, под регуляторным контролем промотора фактора роста в, выделенного из тромбоцитов (Макай, 2000, §с1епсе 287:1265-69). Указанные животные были отобраны, поскольку у них обнаруживались иммунореактивные включения йα-синуклеина в головном мозге, а также нейродегенеративная и моторная недостаточность, которая имитирует определенные симптомы ЬВЭ.

Экспериментальных животных делят на две группы.

В первой группе 20 молодых трансгенных мышей (возраст 3 месяца) иммунизируют в течение 8 месяцев рекомбинантным альфа-§N человека (п=10) или только адъювантом (п=10).

Во второй группе 20 молодых трансгенных мышей (возраст 6 месяцев) иммунизируют в течение 8 месяцев рекомбинантным альфа-§N человека (п=10) или только адъювантом (п=10).

Протокол иммунизации включает первую инъекцию рекомбинантного альфа-§N человека (80 мкг/мл; 100 мкл) в полном адъюванте Фрейнда (СЕА). Две недели спустя мыши получают другую инъекцию рекомбинантного альфа-§N человека (80 мкг/мл; 100 мкл) в неполном адъюванте Фрейнда и далее по одной инъекции в месяц (в последующие 7 месяцев) рекомбинантного альфа-§N человека (80 мкг/мл; 100 мкл) в фосфатном буферном растворе. Рекомбинантный альфа-§N человека получают и очищают, как описано Макйай еГ а1., 2005, №итоп 46:857-68, и тестируют на присутствие эндотоксина.

- 44 013752

Определение титров антител и относительной аффинности альфа-§N человека.

Уровень антител к альфа-§N человека в плазме крови определяют при использовании 96-луночных планшетов для микротитрования, нагруженных 0,4 мкг на лунку очищенного полноразмерного альфа8К Образцы инкубируют в течение ночи при 4°С, затем отмывают и инкубируют с антителами козы к Ιβ мыши, конъюгированными с щелочной фосфатазой (1:7500, Рготеда, Майкоп, ΑΙ). Планшеты считывают при длине волны 450 нм для экстинции и 550 нм для эмиссии. Результаты выражают в виде полулогарифмического графика с единицами относительной флуоресценции по оси ординат и разведением сыворотки по оси абсцисс. Титр антител вычисляют как разведение, при котором происходит 50%-ное снижение максимального антительного связывания.

Для определения относительной аффинности антител к альфа-§^ образовавшихся в организме иммунизированных мышей, проводят две серии экспериментов.

В первой серии гомогенаты головного мозга не иммунизированных альфа-§N человека трансгенных мышей разгоняют в минигеле, используя многодорожковый прибор (Ιηνίίτο^η, СагкЬай, СА). Каждую дорожку инкубируют с разведенной сывороткой каждой мыши, помещают на нитроцеллюлозу и инкубируют со вторым антителом (антителом кролика к Ι§ мыши) и далее с меченым I¹²⁵ белком А (А1Гогй е( а1., I. НкЮсНет. СуФсйет, 42:283-287 (1994)). Блоты визуализируют и анализируют с помощью РНокрНоНтадег (Мо1еси1аг Оупатюк, Ркса1атау, N1). Иммунореактивную полосу оценивают количественно с помощью компьютерной программы ПпадеОиаШ (Атегкйат Вюкаепсек, Р1кса1а^ау, N1).

Во второй серии экспериментов последовательные срезы головного мозга не иммунизированных альфа-§N человека ΐβ-мышей инкубируют с разведением сыворотки каждой обработанной мыши и далее с биотинилированными антителами лошади к Ιβ мыши (1:100, Vесΐο^) и связанной с авидином Ό пероксидазой хрена (НВР, 1:200, АВС Е1Ае, Vесΐο^) и проводят реакцию с диаминобензидинтетрагидрохлоридом (ΌΛΒ), содержащим 0,001% Н₂О₂. После микроскопического исследования срезы оценивают на мечение клеточных компартментов (нейрональные клеточные тельца, синапсы и включения) и степень иммунореактивности (0=отсутствует, 1=очень слабая, 2=слабая, 3=умеренная и 4=интенсивная).

Эпитопное картирование антител к альфа-§N человека.

Эпитопы, распознаваемые антителами к альфа-§N человека, выявляют методом ЕЫ§А, который показывает связывание антител с перекрывающимися линейными пептидами, которые охватываются всей последовательностью альфа-§№ С-концевые биотинилированные пептиды с последовательностями альфа-§N человека (М1то1орек, §ап П1едо, СА) представляют собой пептиды длиной 15 аминокислот (ак) с перекрыванием 12 остатков и шагом 3 остатка на пептид. Всего используют 43 пептида для тестирования 140 ак-последовательностей альфа-§N человека и последний пептид имеет перекрывание в 13 ак с шагом 2 ак. Кроме того, последние три пептида повторяются, но биотинилирование проводят по Ь-концевому участку пептида. Это сделано для улучшения доступа к С-концевому участку пептидов антител и обеспечения возможности идентификации свободных антител, специфических к С-концевым участкам. Более того, в данном эксперименте дополнительно исследуют взаимодействия между антителами и неамилоидным в (Ав) компонентом (ЛАС) участка (61-95) альфа-§N человека. Поскольку 21-й пептид в этом исследовании уже содержит свободный ^концевой участок NАС-области, для завершения исследования дополнительно используют ^концевой биотинилированный пептид, содержащий свободный С-концевой участок NАС-области, и в целом для анализа используют 47 пептидов.

В исследовании указанные биотинилированные пептиды наслаивают в течение ночи в количестве 5 нМ на планшеты для ЕЫ§А, предварительно нагруженные стрептавидином (Р1егсе, ВоскГогй, ГЬ). Планшеты затем отмывают и образцы сыворотки, разведенные до эквивалента титра 6, добавляют в планшеты при 1-часовой инкубации. Образцы сыворотки с титром менее 5000 разводят в соотношении 1:1000 для указанной инкубации. После еще одного отмывания связанные антитела выявляют с помощью видоспецифических вторых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена в колориметрическом ЕЫ§А.

Обработка тканей.

Мышей умерщвляют и удаляют головной мозг для детального нейрохимического и нейрофизиологического анализа, как описано ниже. Коротко говоря, правое полушарие головного мозга замораживают и гомогенизируют с целью выявления агрегированной и неагрегированной иммунореактивности альфа§N человека вестерн-блоттингом (МакИак, е( а1. (2000)). Левое полушарие фиксируют в 4%-ном параформальдегиде и делают серийные срезы на вибратоме (Ъеюа, Ае121аг, Сегтапу) для иммуноцитохимического и ультраструктурного анализа.

Синаптосомальные препараты и метод иммуноблоттинга.

Для оценки эффектов иммунизации мышей на отложение альфа-§N в головном мозге (д-животных приготовляют синптосомальные фракции при использовании градиента сахарозы и анализируют их методом §Э§-РАСЕ в 10%-ном Трис-ацетатном полиакриламидном геле ЩиРАСЕ™, БгсЦгодеп). Иммуноблоты обрабатывают первыми антителами к альфа-§N человека (БВ509, 1:1000, Тгапкйисбоп ЬаЬогаФпек, §ап П1едо, СА) и синаптофизином (1:20, Сйетюп, Тетеси1а, СА) и вторыми антителами козы к Ιβ мыши, связанными с пероксидазой хрена (1:5000, §ап1аСгнх Вю1есйпо1оду, Шс., §ап(а Сп.!/,

- 45 013752

СΑ), визуализируют по усиленной хемилюминесценции и анализируют в приборе, создающем изображение, Vе^забос ХЬ (ВюРаб, Негси1ез, СΑ).

Иммуноцитохимический и ультраструктурный анализ.

Коротко говоря, как ранее описано МазНаЪ, е! а1. (2000), для оценки эффективности иммунизации в отношении образования отложений альфа-δΝ человека последовательные срезы головного мозга животных (кодированные вслепую) инкубируют в течение ночи при 4°С с афинно-очищенными специфическими антителами к альфа-δΝ человека (72-10, поликлональные антитела кролика, 1:500), приготовленными, как ранее описано МазНак, е! а1. (2000), при иммунизации кроликов синтетическими пептидами альфа-δΝ человека, содержащими 101-124 ак. После инкубирования с первыми антителами срезы инкубируют с биотинилированными антителами козы к [д кролика (1:100, Vес!о^) и связанной с авидином Ό пероксидазой хрена (ΈΡΡ, 1:200, Е11!е, Vес!о^) и проводят реакцию с диаминобензидинтетрагидрохлоридом (^ЛВ), содержащим 0,001% Н₂О₂. Срезы также анализируют с помощью прибора ОиапНте1 570С (Ьека) для выявления числа иммунореактивных включений альфа-δΝ человека в неокортексе. Для каждого случая исследуют три среза, результаты усредняют и подсчитывают количество включений в расчете на мм². Далее проводят иммуноцитохимический анализ при окрашивании срезов антителами к глиальным маркерам, в том числе ί.Ό45 (1:1000, ПакоСу!отабоп, Сагршкпа, СΑ) и глиальному фибриллярному кислому белку (6ΕΑΡ, 1:500, Скеткоп).

Двойной иммуноцитохимический анализ осуществляют, как описано ранее (НазЫто!о е! а1., №игоп 32:213-223 (2001), для выявления эффектов иммунизации на конечную плотность нервов и накопление альфа-δΝ человека в синапсах. С этой целью срезы, полученные на вибратоме, дважды метят поликлональными антителами к альфа-δΝ человека (1:1000) и моноклональными антителами к синаптофизину (Скеткоп). Альфа-δΝ человека определяют по окрашиванию тирамидовым красным (1:2000, РосНе), а синаптофизин выявляют с помощью антител лошади к мыши, меченными флуоресцеинизотиоцианатом (ЕГГС). В каждом случае срезы в повторах метят иммунной меткой и анализируют с помощью сканирующего лазерного конфокального микроскопа (ИБСМ) и компьютерной программы ΝΙ4 Ийаде 1.43 для вычисления в процентах области нейропиля, занятой синаптофизин-иммунореактивными нервными окончаниями в неокортексе (Миске е! а1., I. Деигозс! 20:4050-4058 (2000), и пропорции синаптофизиниммунореактивных нервных окончаний, которые положительны по альфа-δΝ человека. Для подтверждения специфичности первых антител осуществляют контрольные эксперименты, в которых срезы инкубируют в течение ночи в отсутствие первых антител и далее с первыми антителами, преадсорбированными в течение 48 ч с 20-кратным избытком соответствующего пептида или преиммунной сыворотки.

Все срезы исследуют одновременно в одних и тех же условиях и эксперименты дублируют с целью обеспечения воспроизводимости результатов. Срезы просматривают в объективе 2е1зз 63Х (ΝΑ. 1.4) под микроскопом ΑχΟι^Ι 35 (2е1зз, Сегтапу) с системой прикрепления МРС1024 ИБСМ (ВюРаб, ХУаИГогб, ИК) ((МазНак, е! а1. (2000)).

Статистический анализ.

Статистические сравнения между группами животных осуществляют с помощью стандартного теста Стьюдента. Анализ линейной регрессии проводят для подтверждения взаимосвязи между вариациями. Для вычисления множественных сравнений используют метод коррекции Бонферрони.

- 46 013752

В. Результаты.

Титры антител, аффинность и эпитопное картирование.

Титры антител определяют в три временные точки (2 недели, 6 и 9 месяцев после иммунизации) в обеих экспериментальных группах. Титры антител у животных значительно варьируют. У иммунизированных альфа-δΝ человека животных первой группы титры антител составляют от 200 до 20000 (табл. 3).

Таблица 3

Суммарные данные титров α-синуклеина и аффинности в иммуноблоттинге (с коррекцией на титр)

Группа	Аффинность антитела в иммуноблоте	Аффинность антитела к синапсам	Аффинность антитела к включениям	Титры Антител (первый забор крови)	Титры Антител (второй забор крови)	Титры Антител (третий забор крови)
Группа 1/а-8уп	109147±2700	1.9±0.73	1.2±0.4	2332±500	2772±1176	3644±2365
Группа 1/СТА	113±113	0.4±0.1	0	19±6.7	30±12	7±4
Группа П/а- 8уп	235747±74000	4.1±0.9	2.8±1.0	3813Т1200	292б±976	1468-641
Группа И/СРА	4ОО±358	0.3±0.2	0.Η0.1	23±9	21±14	0.6±0.6

В данной группе средние титры антител нарастали достаточно медленно. Аналогично, для группы II у животных, иммунизированных Ηα-синуклеином, отмечались титры антител в пределах от 200 до 13,000 (см. табл. 3). Однако средние титры при первом измерении были выше, после чего наблюдалось их снижение с течением времени. Иммуноблоттинг также выявляет значительную вариабельность мышей в отношении их способности распознавать Ιια-синуклеин. В целом уровень относительной аффинности антител был выше у мышей из группы II по сравнению с иммунизированными мышами из группы I (табл. 4).

Таблица 4

Суммарные данные корреляций между аффинностью в иммуноблоттинге, нейропатологией и титрами антител

Нейропатологические маркеры	Аффинность антитела в миниблоте	Аффинность антитела к синапсу	Аффинность антитела к включениям	Аффинность антитела к нейронам	Титры антител (первый забор крови)
Количество включений а-синуклеина (+)	-0.11	0.04	0.12	-0.21	0.1
% площади нейропильных а-синуклеин (+) синапсов	-0.46 (р-0.003)	-0.41 (р = 0.009)	-0.43 (р = 0.005)	0.06	-0.47 (р = 0.007)
% площади нейропильных синаптофизин (+)синапсов	0.06	0.35 (р = 0.04)	0.01	0.04	0.12
Аффинность антител в миниблоте		0.74 (р=0.0001)	0.70 (р = 0.0001)	-0.16	0.85 (р = 0.0001)
Титры антител (первый забор крови)	0.85 (р=0.0001)	0.62 (р = 0.0001)	-0.18	0.81 (р = 0.0001)

- 47 013752

При исследовании с помощью ЮС выявляется, что нейроны, интранейрональные включения и пресинаптические окончания оказываются меченными сывороткой мышей, вакцинированных Ια-синуклеином. В противоположность этому, при исследовании клеток мышей, вакцинированных только адъювантом, отмечается диффузное и неспецифическое умеренное окрашивание. Сыворотка от мышей из группы II демонстрирует высокую аффинность и способность к распознаванию Ια-синуклеина в синапсах и нейронах по сравнению с сывороткой иммунизированных мышей из группы I (табл. 4).

Картирование эпитопов показывает, что у мышей, вакцинированных Ια-синуклеином, антитела чаще распознают пептидные эпитопы С-концевого участка Ια-синуклеина (фиг. 8). Кроме того, антитела к дополнительным эпитопам также иногда распознаются. В противоположность этому, в сыворотке мышей, вакцинированных только СЕА, не было выявлено какой-либо реактивности или антительных эпитопов.

Иммунизация приводит к уменьшению аккумуляции Ια-синуклеина и позволяет сохранить плотность синапсов в головном мозге трансгенных мышей.

Для того чтобы определить влияние иммунотерапии на аккумуляцию Ια-синуклеина, срезы помечают антителами к Ια-синуклеину и анализируют с помощью микроскопии в ярком поле или с помощью ЬЗСМ. У трансгенных мышей отмечается значительная иммунореактивность в нейропилях и в интранейрональных включениях. По сравнению с трансгенными мышами, вакцинированными только СЕА, у иммунизированных мышей из обеих групп отмечается сравнительное уменьшение (приблизительно на 25%) количества включений в коре височных областей головного мозга (фиг. 9А). Кроме того, иммунизация приводит к уменьшению иимунореактивности к Ια-синуклеину в нейропилях. При сравнении с трансгенными мышами, вакцинированными только СЕА, указанный эффект был более выражен у мышей из группы II, чем у мышей из группы I (фиг. 9 А). Для того чтобы установить, насколько эффект иммунизации был также обусловлен способностью антител уменьшать нейрональную аккумуляцию Ια-синуклеина или маскирующими эффектами, осуществляют контрольные эксперименты по сравнению уровней иммунореактивности β синуклеина у трансгенных мышей, вакцинированных только СЕА, и мышей, вакцинированных Ια-синуклеином. Учитывая известное распределение β синуклеина, его гомологичность β-синуклеину (Ъ\ш е! а1., Неигоп, 14:467-475 (1994)), значительная иммунореактивность к β синуклеину отмечалась в нейропилях и пресинаптических окончаниях, но весьма умеренное иммунологическое окрашивание наблюдалось в телах нейронов, но не во включениях. По сравнению с мышами, вакцинированными только СЕА, у мышей, вакцинированных Ια-синуклеином, не было отмечено существенных различий в распределении и уровнях β синуклеина. Для дополнительного определения специфичности эффектов антител к Ιβ-синуклеину сравнивают уровни мышиной (т) α-синуклеин иммунореактивности у мышей, вакцинированных только СЕА, и мышей, вакцинированных Ια-синуклеином. Аналогично Ια-синуклеин, тα-синуклеин иммунореактивность была значительной в нейропилях и нервных окончаниях, но отсутствовала в телах нейрональных клеток и включениях. Уровни и распределение тα-синуклеина были сопоставимыми у мышей, вакцинированных СЕА, и у мышей, вакцинированных Ια-синуклеином. Если объединить результаты указанных исследований, можно предположить, что вакцинация специфически влияет на Ια-синуклеин, но не на другие родственные синаптические молекулы.

Для дополнительного уточнения эффекта иммунотерапии на целостность нейропилей срезы иммунологически окрашивают антителом к синаптофизину и изучают с помощью электронной микроскопии. По сравнению с нетрансгенными мышами у трансгенных мышей, вакцинированных только СЕА, отмечается умеренное (около 20%) уменьшение количества синаптофизин-иммуномеченых окончаний, при этом уровень иммунореактивности синаптофизина на синапс остается неизменным (фиг. 9В). В противоположность этому, у иммунизированных мышей из обеих групп уровень иммунореактивности синаптофизина сопоставим с уровнем у нетрансгенных контрольных животных (фиг. 9В). Дополнительный иммуноцитохимический анализ с антителами к глиальным маркерам, таким как СЕАР и СЭ45, выявляет тенденцию к увеличению иммунореактивности в головном мозге трансгенных мышей, вакцинированных Ια-синуклеином (фиг. 9С). В соответствии с указанными открытиями с помощью ультраструктурного анализа выявлено, что в головном мозге трансгенных мышей, иммунизированных Ια-синуклеином, нейропиль хорошо сохранен, пресинаптические окончания и дендриты остаются интактными, а нервные окончания содержат множество чистых везикул и формируют постсинаптические уплотнения. В нейрональных отростках были идентифицированы лишь единичные электроплотные агрегаты, при этом митохондрии и миелин хорошо сохранены.

Для лучшей характеристики эффектов вакцинации на агрегацию Ια-синуклеина в синапсах осуществляют двойной иммуноцитохимический анализ и вестерн-блоттинг с синаптосомальными препаратами. В физиологических условиях Ια-синуклеин помещают непосредственно в пресинаптические утолщения (Ъ\ш е! а1., 1994, кирга), и при ЙВЭ у трансгенных мышей усиленная аккумуляция Ια-синуклеина в синапсах ассоциируется с функциональным дефицитом и потерей синапсов (Накй1то!о е! а1., 2001, кирга). Для подтверждения влияния вакцинации на аккумуляцию Ια-синуклеина в нервных окончаниях осуществляют двойные иммунологические исследования с меткой с использованием антител

- 48 013752 к пресинаптическому терминальному маркеру синаптофизину и Εα-синуклеину и АВ анализ с синаптосомальными препаратами. Конфокальный анализ срезов, меченных двойными метками, показывает, что при сравнении с Εα-синуклеин трансгенными мышами, вакцинированными только СЕЛ (фиг. 9Ό), у мышей, вакцинированных Εα-синуклеином, отмечается уменьшение аккумуляции Εα-синуклеина в синатопсин-иммунореактивных нервных окончаниях в неокортексе (фиг. 9Ό).

Соответственно результатам иммуноцитохимического анализа иммуноблоттинг показал, что у трансгенных мышей, вакцинированных только СЕА, у которых отмечаются интенсивные высокомолекулярные зоны, данное явление, возможно, отражает аккумуляцию Εα-синуклеин-иммунореактивных включений в синапсах (фиг. 10). У иммунизированных мышей отмечается существенное уменьшение аккумуляции высокомолекулярных зон Ιια-синуклеина и нативных зон, однако нет никакого влияния на уровни тα-синуклеина. Кроме того, при сравнении с трансгенными мышами, вакцинированными только СЕА, уровни синаптофизин-иммунореактивности были выше в синаптосомальных препаратах от иммунизированных мышей (фиг. 10). Если объединить полученные результаты, можно предположить, что иммунотерапия может уменьшить нейрональное повреждение в головном мозге трансгенных мышей за счет снижения аккумуляции потенциально токсичных олигомеров Ιια-синуклеина в синапсах.

Эффект иммунизации зависит от относительной аффинности антител и их способности распознавать синаптические окончания.

Для лучшего понимания того, какие факторы позволяют предсказать эффективность иммунотерапии, осуществляют линейный регрессионный анализ между нейропатологическими маркерами аккумуляции Ιια-синуклеина и титром и аффинностью антител. Указанный анализ показывает существенную корреляцию между относительной аффинностью антител, определенной с помощью иммуноблоттинга, и уровнем Ιια-синуклеин иммунореактивности в синапсах, но не с количеством нейрональных включений. Аналогично, относительная аффинность антител к распознаванию синапсов, определенная с помощью 1СС, обратно коррелирует с уровнями Ιια-синуклеина в синапсах и прямо коррелирует с площадью, оккупированной синаптофизин-мечеными нервными окончаниями, но не с количеством нейрональных включений. Уровни реактивности антител, определенные с помощью иммуноблоттинга и 1СС, строго коррелируют с титрами антител в ЕЫБА. Титры антител также коррелируют с площадью нейропилей, меченных анти-йα-синуклеин-антителом, но не с количеством нейрональных включений (табл. 4). Если объединить указанные результаты, можно предположить, что относительная реактивность анти-ΐιαсинуклеин-антител, определенная с помощью иммуноблоттинга, и до некоторой степени титры антител в ЕЫБА коррелируют со степенью уменьшения нейрональной аккумуляции а-синуклеина человека.

Антитела к α-синуклеину человека интернализируются, связываются с синапсами и нейронами, содержащими включения, у трансгенных мышей.

Для того чтобы установить, распознают ли мигрирующие антитела характерные нейрональные сайты, где аккумулирует α-синуклеин в головном мозге трансгенных мышей, осуществляют одиночный и двойной иммуноцитохимический анализ с антимышиными 1дО антителами лошади. Указанные антитела предположительно распознают античеловеческий α-синуклеин у иммунизированных животных, но не у СЕА-контрольных животных. Цифровая микроскопия иммуномеченых срезов в ярком поле показывает, что у мышей, иммунизированных Εα-синуклеином, биотинилированные антимышиные 1дС диффузно помечают тела нейрональных клеток и нейрональные отростки в составе нейропиля. У трансгенных животных, иммунизированных только СЕА, отмечается незначительное иммунологическое окрашивание кровеносных сосудов и отдельных клеток, напоминающих микроглию. Двойное исследование с иммунологическим окрашиванием подтверждает, что у вакцинированных мышей отмечается окрашивание тел нейронов Е1ТС-меченными антимышиными антителами, демонстрирующими Ιια-синуклеиниммунореактивность. По сравнению с трансгенными мышами, вакцинированными только СЕА, у Εα-синуклеин-вакцинированных мышей в некоторых нейронах антимышиные 1дС и Ιια-синуклеиниммунореактивность отмечалась на периферии клеточных телец, только две метки были обнаружены в нейрональных отростках и синапсах. Кроме того, в нескольких нейронах, содержащих Εα-синуклеин, были выявлены две метки в гранулярных субклеточных структурах, имеющих средний размер 0,4-0,8 мкм в диаметре. Дополнительные двойные исследования с меткой показали, что указанные гранулярные структуры демонстрируют иммунореактивность к Ό катепсину, на чем основывается предположение о том, что интернализированные антитела к Ιια-синуклеину человека взаимодействуют с синуклеином в составе липосом. В подтверждение вышеуказанных открытий с помощью ультраструктурного анализа в некоторых нейронах мышей, вакцинированных Εα-синуклеином, были идентифицированы электроплотные ламинированные структуры, напоминающие лизосомы и фаголизосомы. Если объединить полученные результаты, можно предположить, что вакцинация α-синуклеином человека может способствовать деградации указанной молекулы посредством активации лизосомального пути.

- 49 013752

Пример IX. Очищение агрегатов α-синуклеина ш νί\Ό путем введения антител к α-синуклеину.

Указанный пример демонстрирует очищение интранейрональных агрегатов α-синуклеина с помощью моноклональных антител к α-синуклеину, которые распознают концевые участки α-синуклеина. Моноклональные антитела вводят в некортекс трансгенных мышей, которые избыточно экспрессируют α-синуклеин человека и имеют интранейрональные агрегаты α-синуклеина. Два антитела, одно к Ν-концевому участку, другое к С-концевому участку α-синуклеина, способствуют уменьшению интранейрональных агрегатов α-синуклеина вплоть до 80% по сравнению с контрольными иррелевантными антителами (фиг. 11).

Способы.

Для введения мышам моноклональные антитела, распознающие различные эпитопы α-синуклеина и иррелевантные, изотипически-меченые контрольные антитела, растворяют в стерильном физиологическом растворе с фосфатным буфером (табл. 5). Используют 4-8-месячных гетерозиготных трансгенных мышей, избыточно экспрессирующих α-синуклеин человека дикого типа в головном мозге под транскрипционным контролем РЭСР промотора. Для исследования каждого антитела используют от 4 до 6 разных трансгенных мышей.

Таблица 5

Антитела к α-синуклеину и контроли, используемые для внутримозговой инъекции у трансгенных моделей нейрональной синуклеинопатии

Моноклональное антитело	Эпитоп/Специфичность	Изотип
11А5	α-синуклеин фосфоЗЕК! 29	1§С1
8А5	а-синуклеин С-концевой участок	1§О1
905	а-синуклеин 91-96	ΙβΟΙ
23Е8	а-синуклеин 40-55	1§01
6Н7	а-синуклеин Ν-концевой участок	1еО1
4В1	а-синуклеин С-концевой участок	ЦС2а
5С12	а-синуклеин 109-120	1дО2Ъ
21-1	контроль	Ιβθΐ
ΤΥ11-15	контроль	1§С2а
5В7	контроль	1цО2Ь

Каждому животному под наркозом стереотактически в глубокие слои теменного неокортекса правого полушария головного мозга (ипсилатеральная сторона) вводят 2 мкл раствора антитела в концентрации 2 мг/мл. Левое полушарие (контрлатеральная сторона) используют в качестве контроля для каждого животного. На места введения антитела накладывают швы и мышей оставляют под наблюдение до выхода из наркоза. Исследователь, осуществляющий введение антител, не знает, какое антитело вводит во время каждой инъекции. Через 2 недели мышей умерщвляют согласно существующему руководству. Головной мозг извлекают, фиксируют в 4%-ном формальдегиде в течение 48 ч и изготавливают венечные срезы толщиной 40 мкм с помощью вибратома Ьеюа. Два среза каждого животного (вокруг места инъекции) окрашивают иммунопероксидазным способом поликлональными антителами к α-синуклеину (ЕЬАО^-47, распознающими аминокислоты 115-122 α-синуклеина). В каждом срезе подсчитывают количество интранейрональных агрегатов α-синуклеина в 4 полях микроскопа (20 х объектив) вокруг места инъекции и на ипсилатеральной стороне, а также в 4 полях, соответствующих полям в контрлатеральном контрольном полушарии. Количество агрегатов в двух срезах для каждого полушария суммируют. В итоге, для каждого животного определяют разницу между общим количеством агрегатов α-синуклеина в обоих полушариях и выражают ее как % различие между ипсилатеральной и контрлатеральной стороной, что позволяет измерить влияние антител к α-синуклеину на рассасывание агрегатов у каждого конкретного животного. Срезы кодируют вслепую, код вскрывают после завершения исследования.

Животных можно разделить на три категории в зависимости от введенных антител.

Группа 1. Мыши, получившие 11А5, 8А5 или ^01 контроль.

Группа 2. Мыши, получившие 905, 23Е8, 6Н7 или !дС1 контроль.

Группа 3. Мыши, получившие 4В1, 5С12, [дС2а или [дС2Ь контроль.

- 50 013752

Результаты.

Результаты исследования представлены на фиг. 11 и 12.

Интранейрональные агрегаты α-синуклеина были удалены двумя антителами: 8А5 (также обозначается как Ш4.8А5) и 6Н7 (также обозначается как ΙΗ17.6Η7), оба описаны в заявке РСТ \УО 05047860А2 (Антитела к α-синуклеину, от 26 мая 2005 г.) и в патентной публикации № 10/984192, оба документа включены в настоящее описание в качестве ссылок. МаЬ (моноклональное антитело) 6Н7 было создано как антитело рекомбинантного α-синуклеина человека, экспрессируемого Е.со11 и распознает аминоконцевой участок α-синуклеина человека и мыши. Оно распознает эпитоп, который включает первые три аминокислоты α-синуклеина. МаЬ 6Н7 обладает способностью распознавать белки слияния синуклеина, в которых 1ад протеин слит с Ν-концевым участком синуклеина, что позволяет предположить, что наличие свободного аминоконцевого участка не является обязательным (хотя и желательным). МаЬ 8А5 было создано как антитело к очищенным синуклеинам быка (смесь α и β) и распознает эпитоп на карбоксиконцевом участке α-синуклеина человека и мыши. МаЬ 8А5 может связываться с усеченным синуклеином, заканчивающимся аминокислотным остатком 139. Предварительные исследования позволяют предположить, что 8А5 в 4-5 раз предпочтительнее связывается с синуклеином, имеющим свободный С-концевой участок, чем с синуклеином, у которого С-концевой участок конъюгирован с биотином. Оба антитела, МаЬ 6Н7 и МаЬ 8А5, также распознают β-синуклеин. МаЬ 8В1 распознает С-концевой участок синуклеина и связывает синуклеин в вестерн-блоттинге, но не распознает синуклеин в растворе (т.е. МаЬ 8В1 не обладает способностью иммунопреципитировать синуклеин).

На фиг. 12 представлены срезы контрлатеральной стороны (левая панель; круглые коричневые точки внутри среза - это агрегаты α-синуклеина) и ипсилатеральной стороны (правая панель) головного мозга мышей, получавших 8А5. Разница между животными, получившими 8А5 и ^01, является статистически значимой (р<0,05 в непараметрическом исследовании Крускалл-Валлиса [КгиккаИ-^аШк] и последующем тесте Данна [Оипп'к 1еь11). Полученные результаты говорят о том, что таргетирование С-концевых и Ν-концевых участков α-синуклеина (т.е. получение антител, направленных к эпитопам указанных участков) является благоприятным для лечения синуклеинопатий, таких как РФ и АО. Введение других тестируемых антител к α-синуклеину (табл. 5, фиг. 11) не приводит к исчезновению агрегатов.

Любому специалисту в данной области очевидно, что могут быть внесены различные изменения и модификации заявленных изобретений в пределах представленной ниже формулы изобретения. Кроме того, если в тексте не обозначено иное, любые воплощения настоящего изобретения могут использоваться в комбинации с любыми другими техническими решениями. Все публикации, заявки на патент и другие источники литературы приведены в настоящем описании в качестве ссылочного и иллюстративного материала.

Claims (47)

1. Способ профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, заключающийся во введении пациенту, имеющему риск развития данного заболевания или страдающему от данного заболевания, антитела в эффективном режиме, которое специфически связывается с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 1-20, причем остатки пронумерованы в соответствии с 5>Е0 ГО ΝΟ:1.

2. Способ по п.1, при котором антитело специфически связывается с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 1-10.

3. Способ по п.1 или 2, при котором антитело представляет собой моноклональное антитело.

4. Способ по п.3, при котором антитело представляет собой химерное антитело.

5. Способ по п.3, при котором антитело представляет собой человеческое антитело.

6. Способ по п.3, при котором антитело представляет собой гуманизированное антитело.

7. Способ по любому из пп.1-6, при котором антитело конкурирует с мышиным моноклональным антителом 6Н7 (АТСС номер доступа РТА 6910) за связывание с α-синуклеином человека.

8. Способ по п.7, при котором антитело представляет собой гуманизированный вариант мышиного моноклонального антитела 6Н7 (АТСС номер доступа РТА 6910).

9. Способ профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, заключающийся во введении пациенту, имеющему риск развития данного заболевания или страдающему от данного заболевания, антитела в эффективном режиме, которое специфически связывается с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 70-140, причем остатки пронумерованы в соответствии с 5>ЕО ГО ΝΟ:1.

10. Способ по п.9, при котором антитело специфически связывается с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 120-140.

11. Способ по п.9 или 10, при котором антитело представляет собой моноклональное антитело.

12. Способ по п.11, при котором антитело представляет собой химерное антитело.

- 51 013752

13. Способ по п.11, при котором антитело представляет собой человеческое антитело.

14. Способ по п.11, при котором антитело представляет собой гуманизированное антитело.

15. Способ по любому из пп.9-14, при котором антитело конкурирует с мышиным моноклональным антителом 8А5 (АТСС номер доступа РТА-6909) за связывание с α-синуклеином человека.

16. Способ по п.10, при котором антитело представляет собой гуманизированный вариант мышиного моноклонального антитела 8А5 (АТСС номер доступа РТА-6909).

17. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором антитело представляет собой антитело изотипа ЕС1 человека.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором антитело вводят совместно с фармацевтическим носителем в составе фармацевтической композиции.

19. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором антитело вводят в дозе 0,0001-100 мг/кг, предпочтительно в дозе, составляющей по крайней мере 1 мг/кг массы тела.

20. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором антитело вводят в множественных дозах в течение по крайней мере 6 месяцев.

21. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором антитело вводят интраперитонеально, перорально, подкожно, интракраниально, внутримышечно, местно, интраназально или внутривенно.

22. Способ профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, заключающийся во введении пациенту в эффективном режиме первого антитела, которое специфически связывается с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 1-20, и второго антитела, которое специфически связывается с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 70-140, причем остатки пронумерованы в соответствии с δΕΟ Ш ΝΟ:1.

23. Способ по п.22, при котором второе антитело специфически связывается с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 120-140.

24. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором заболевание представляет собой болезнь Паркинсона.

25. Фармацевтическая композиция, включающая химерное или гуманизированное антитело, которое специфически связывается с эпитопом α-синуклеина по остаткам 1-40, а также фармацевтический носитель.

26. Фармацевтическая композиция по п.25, в которой антитело специфически связывается с эпитопом α-синуклеина по остаткам 1-20.

27. Фармацевтическая композиция по п.26, в которой антитело специфически связывается с эпитопом α-синуклеина по остаткам 1-10.

28. Фармацевтическая композиция, включающая химерное или гуманизированное антитело, которое специфически связывается с эпитопом α-синуклеина по остаткам 70-140, а также фармацевтический носитель.

29. Фармацевтическая композиция по п.28, в которой антитело специфически связывается с эпитопом α-синуклеина по остаткам 120-140, а также фармацевтический носитель.

30. Моноклональное антитело, продуцируемое гибридомой Ш17.6Н7.1.54.28 (АТСС номер доступа РТА-6910) или 1Н4.8А5.25.7.36 (АТСС номер доступа РТА-6909).

31. Клетка гибридомы Ш17.6Н7.1.54.28 (АТСС номер доступа РТА-6910) или Ш4.8А5.25.7.36 (АТСС номер доступа РТА-6909).

32. Способ профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, заключающийся во введении пациенту, имеющему риск развития данного заболевания или страдающему от данного заболевания, полипептида, имеющего в своем составе иммуногенный фрагмент α-синуклеина, эффективный для индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с α-синуклеином человека по остаткам 70-140, причем остатки пронумерованы в соответствии с δΕΟ Ш ΝΟ:1.

33. Способ по п.32, при котором иммуногенный фрагмент включает δΝ130-136 и содержит в целом не более 40 последовательных остатков α-синуклеина, причем остатки пронумерованы в соответствии с δΕΕ) ГО ΝΟ:1.

34. Способ по п.33, при котором иммуногенный фрагмент выбран из группы, включающей δΝ124-140, δΝ132-140, δΝ126-139, δΝ129-139, δΝ137-139, δΝ131-138, δΝ126-137, δΝ134-137, δΝ125-140, δΝ133-140, δΝ127-139, δΝ130-139, δΝ124-138, δΝ132-138, δΝ127-137, δΝ135-137, δΝ126-140, δΝ134-140, δΝ128-139, δΝ131-139, δΝ125-138, δΝ133-138, δΝ128-137, δΝ124-136, δΝ127-140, δΝ135-140, δΝ124-139, δΝ132-139, δΝ126-138, δΝ134-138, δΝ129-137, δΝ125-136, δΝ128-140, δΝ136-140, δΝ125-139, δΝ133-139, δΝ127-138, δΝ135-138, δΝ130-137, δΝ126-136, δΝ129-140, δΝ137-140, δΝ126-139, δΝ134-139, δΝ128-138, δΝ136-138, δΝ131-137, δΝ127-136, δΝ130-140, δΝ124-139, δΝ127-139, δΝ135-139, δΝ129-138, δΝ124-137, δΝ132-137, δΝ128-136, δΝ131-140, δΝ125-139, δΝ128-139, δΝ136-139, δΝ130-138, δΝ125-137, δΝ133-137, δΝ129-136, δΝ130-136, δΝ131-136, δΝ132-136, δΝ133-136 и δΝ134-136, причем остатки пронумерованы в соответ- 52 013752 ствии с ЗЕО ΙΌ ΝΟ:1.

35. Способ профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина в головном мозге, заключающийся во введении пациенту, имеющему риск развития данного заболевания или страдающему от данного заболевания, полипептида, имеющего в своем составе иммуногенный фрагмент α-синуклеина, эффективный для индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с α-синуклеином человека по остаткам 1-40, причем остатки пронумерованы в соответствии с ЗЕО ΙΌ ΝΟ:1.

36. Способ по п.35, при котором иммуногенный фрагмент включает 8Ν1-5 и содержит в целом не более 40 последовательных остатков α-синуклеина, причем остатки пронумерованы в соответствии с ЗЕО ΙΌ ΝΟ:1.

37. Способ по п.35, при котором иммуногенный фрагмент выбран из группы, включающей 8Ν1-5, 8Ν1-6, 8Ν1-7, 8Ν1-8, 8Ν1-9, 8Ν1-10, 8Ν1-11, 8Ν1-12, 8Ν1-13 и 8Ν1-14, 8Ν1-15, 8Ν1-16, 8Ν1-17, 8Ν1-18, 8Ν1-19 и 8Ν1-20.

38. Способ профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина человека, заключающийся во введении пациенту, имеющему риск развития заболевания или страдающему от данного заболевания, полипептида, имеющего в своем составе иммуногенный фрагмент α-синуклеина, эффективный для индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 1-20, причем остатки пронумерованы в соответствии с ЗЕО ΙΌ ΝΟ:1, при этом иммуногенный фрагмент α-синуклеина не имеет в своем составе остатков 25-69, остатков 70-140, остатков 41-140, остатков 25-140 α-синуклеина.

39. Способ по любому из пп.32-38, при котором иммуногенный фрагмент связан с носителем с формированием конъюгата.

40. Способ профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина человека, заключающийся во введении пациенту, имеющему риск развития заболевания или страдающему от данного заболевания, полипептида или комбинации полипептидов, эффективной для индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 1-20, и антител, которые специфически связываются с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 70-140, причем указанный полипептид или комбинация полипептидов не индуцируют иммунный ответ с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом α-синуклеина по остаткам 25-69.

41. Способ профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией α-синуклеина человека, заключающийся во введении пациенту, имеющему риск развития заболевания или страдающему от данного заболевания, полипептида, имеющего в своем составе иммуногенный фрагмент α-синуклеина, эффективный для индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 1-20, а также полипептида, имеющего в своем составе второй иммуногенный фрагмент α-синуклеина, эффективный для индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 70-140.

42. Способ скрининга агента для того, чтобы определить, обладает ли указанный агент активностью, полезной для лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви, заключающийся в обеспечении контакта указанного агента и трансгенного животного (не человека), предрасположенного к развитию заболевания, характеризующегося образованием телец Леви; определении влияния агента на распространенность и уровень характерных симптомов по сравнению с контрольным трансгенным животным (не человеком), причем агент представляет собой (1) фрагмент α-синуклеина, который индуцирует образование антител, специфически связывающихся по крайней мере с одним эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 70-140; (ίί) фрагмент α-синуклеина, который индуцирует образование антител, которые специфически связываются по крайней мере с одним эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 1-20; (ίίί) антитело, которое специфически связывается с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 70-140; или (ίν) антитело, которое специфически связывается с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 1-20, причем остатки пронумерованы в соответствии с ЗЕО ЕЭ ΝΟ:1.

43. Способ по любому из предшествующих пунктов, при котором заболевание представляет собой болезнь Паркинсона.

44. Фармацевтическая композиция, включающая первый иммуногенный фрагмент α-синуклеина, причем указанный первый фрагмент эффективен для индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом α-синуклеина человека по остаткам 1-20, а также фармацевтический носитель.

45. Фармацевтическая композиция по п.44, дополнительно включающая второй иммуногенный фрагмент α-синуклеина, причем указанный второй фрагмент эффективен для индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом α-синуклеина человека по

- 53 013752 остаткам 70-140, при этом второй иммуногенный фрагмент отличается от первого иммуногенного фрагмента.

46. Способ гуманизации моноклонального антитела 8А5 или моноклонального антитела 6Н7, включающий определение аминокислотной последовательности СЭВ участков моноклонального антитела; выбор акцепторного антитела;

получение гуманизированного антитела, включающего СЭВк из моноклонального антитела и каркасные участки вариабельных доменов акцепторного антитела.

47. Способ получения химерного антитела из моноклонального антитела 8А5 или моноклонального антитела 6Н7, включающий определение аминокислотной последовательности вариабельных участков легких и тяжелых цепей моноклонального антитела;

выбор константных участков тяжелых и легких цепей;

получение химерного антитела, включающего легкую цепь, содержащую вариабельный участок легкой цепи, слитый с константным участком легкой цепи, и тяжелую цепь, содержащую вариабельный участок тяжелой цепи, слитый с константным участком тяжелой цепи.