ES2635317T3 - Anticuerpo anti-beta-amiloide y sus usos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a beta-amiloide, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: una región variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 39; y una región variable de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 41.

Description

Anticuerpo anti-beta-amiloide y sus usos

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas moléculas de unión específicas, particularmente anticuerpos humanos, así como fragmentos, derivados y variantes de los mismos que reconocen epítopos asociados con enfermedades, incluyendo neoepítopos, de proteínas que derivan de proteínas nativas endógenas, y que son predominantes en el

10 cuerpo de un paciente en una forma variante y/o fuera de su contexto fisiológico normal. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas de unión, anticuerpos y miméticos de los mismos en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, amiloidosis y patología beta-amiloide.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

15 El éxito de la generación de anticuerpos monoclonales se basa en la fusión eficiente y selectiva de células B estimuladas por antígeno con una línea celular de mieloma murina, seguida de la selección de híbridos que producen anticuerpos de forma estable como describieron originalmente Köhler y Milstein, Nature 256 (1975), 495

497. Sin embargo, la utilidad terapéutica de los anticuerpos de base murina en los seres humanos está dificultada

20 por la respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) debido a su origen no humano. Las estrategias para preparar anticuerpos monoclonales humanos o semejantes a humanos han sido posibles mediante la ingeniería genética. Sin embargo, los procedimientos disponibles hasta ahora presentan el inconveniente de que no son adecuados para producir anticuerpos con las características de los producidos en el curso de una respuesta inmunitaria fisiológica humana. Además, dichos anticuerpos pueden no ser lo suficientemente específicos debido a

25 la reactividad cruzada con otras proteínas y/o la proteína diana en contexto con la función fisiológica normal. En el caso de la enfermedad de Alzheimer o de Parkinson, por ejemplo, se considera que los anticuerpos que también reaccionan de manera cruzada con alta afinidad con derivados fisiológicos de la proteína precursora del amiloide (APP) o alfa sinucleína presentan efectos secundarios relacionados con las funciones normales de las estructuras diana fisiológicas. A este respecto, una enfermedad autoinmunitaria no deseada se induciría de forma completa -un

30 riesgo difícilmente calculable en el diseño conceptual de experimentos de inmunización activa que emplean estructuras proteicas que, en forma variante, también se producen fisiológicamente. Los efectos secundarios no relacionados con la estructura diana son, por ejemplo, reacciones anafilácticas, como se esperaría como efectos secundarios no deseados y temidos de la administración sistémica de proteínas exógenas. De acuerdo con descubrimientos recientes, éste también puede ser el caso en los anticuerpos denominados humanizados, que

35 surgen originariamente de organismos no humanos, habitualmente de ratones. Por otra parte, la inmunización activa con antígenos patológicos relevantes presenta el riesgo considerable de que los pacientes desarrollen anticuerpos y respuestas de células T que también reconocen variantes fisiológicas de dichas proteínas y, consecuentemente, dan lugar a una respuesta autoinmunitaria peligrosa e incontrolable. Los anticuerpos que reconocen un epítopo de betaamiloide presente en secciones cerebrales enfermas, pero no en secciones de controles sanos y que no reconocen

40 la proteína precursora de amiloide han sido descritos en la técnica (Geylis y col. Neurobiology of Aging, vol. 26, no. 5, mayo de 2005, páginas 597-606).

De este modo, existe una necesidad de proporcionar agentes que sean específicos para una diana implicada en un trastorno y que sean tolerados por el cuerpo humano.

45 RESUMEN DE LA INVENCIÓN

El problema técnico que subyace a la presente invención ha sido resuelto por las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

50 La presente invención hace uso del descubrimiento sorprendente de que los anticuerpos también pueden estar dirigidos contra variantes patofisiológicamente relevantes de proteínas endógenas, en particular contra neoepítopos, que se forman debido a la alteración patológica de la de transcripción, traducción o modificación posterior a la transcripción o posterior a la traducción o procesamiento proteolítico o agregación. Dichos anticuerpos están

55 dirigidos contra proteínas endógenas que, debido a su nueva estructura que se desvía de la fisiología normal, se vuelven patofisiológicamente relevantes mediante el desarrollo de efectos patológicos. Por razones de tolerancia inmunitaria, los anticuerpos conectados con la respuesta inmunitaria correspondiente a neoepítopos en dichas variantes patológicas no presentan normalmente, sin embargo, ninguna reacción cruzada contra las proteínas fisiológicamente funcionales, a diferencia del caso de las enfermedades autoinmunitarias. Esto se debe a que la

60 formación de anticuerpos con reactividad cruzada potencial se suprime específicamente por los mecanismos

conocidos de tolerancia, mientras que el desarrollo de una respuesta inmunitaria a neoepítopos patológicos puede escapar a la tolerancia.

La presente invención se refiere a anticuerpos humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que

5 comprenden una región variable de cadena pesada (VH) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera (VL) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 41. Como alternativa, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, xenogénico o quimérico humano-murino, siendo el último particularmente útil para los procedimientos de diagnóstico y estudios en animales. También están incluidas las composiciones terapéuticas que incluyen el anticuerpo o fragmentos activos del mismo, o agonistas y moléculas

10 cognadas, o como alternativa, antagonistas del mismo, y los procedimientos de uso de dichas composiciones en la prevención, diagnóstico o tratamiento de una enfermedad usando estas composiciones, en el que una cantidad efectiva de la composición se administra a un paciente que necesita dicho tratamiento.

El fragmento de unión a antígeno del anticuerpo puede ser un fragmento de cadena sencilla Fv, un fragmento F(ab'),

15 un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')2 o cualquier otro fragmento de unión a antígeno. En una realización específica, a continuación, el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo humano de isotipo IgG.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican al menos una región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo de la invención. Dicha región variable comprende las regiones

20 determinantes de la complementariedad (CDR) tal como se muestran en la tabla 4.

Por consiguiente, la presente invención también abarca vectores que comprenden dichos polinucleótidos y células huésped transformadas con estos, así como su uso para la producción de un anticuerpo y moléculas de unión equivalentes que son específicas para neoepítopos que son indicativos y/o causantes de la enfermedad de

25 Alzheimer.

El anticuerpo, la cadena o cadenas de inmunoglobulina, fragmentos de unión del mismo y la unión a antígeno a dicho anticuerpo pueden usarse en composiciones farmacéuticas y de diagnóstico para inmunoterapia y diagnóstico, respectivamente. Sin embargo, se prefiere el uso de las composiciones anteriores en la preparación de un

30 medicamento.

Por lo tanto, es un objetivo particular de la presente invención proporcionar composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento o prevención o ralentización del inicio de enfermedades asociadas con la acumulación y depósito del péptido beta amiloide en un sujeto, tal como enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, disfunción cognitiva

35 leve, angiopatía amiloide cerebral, demencia vascular, demencia multi-infarto. El tratamiento comprende administrar una concentración eficaz de un anticuerpo o derivado de anticuerpo al sujeto en el que el anticuerpo se une a la forma patológica de la proteína o el depósito de proteínas con una afinidad mayor que a la forma fisiológica normal de la proteína.

40 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Anticuerpo contra beta-amiloide. A: Anticuerpos humanos. B: Tinción de control con anticuerpo conocido contra beta-amiloide humano. Los pacientes excepcionalmente estables clínicamente con enfermedad de Alzheimer contienen anticuerpos contra las placas beta-amiloides. La tinción inmunohistoquímica con anticuerpos de pacientes

45 excepcionalmente estables clínicamente en secciones cerebrales obtenidas de pacientes con enfermedad de Alzheimer confirmada patológicamente revela anticuerpos que se unen a las placas beta-amiloides confirmados por un anticuerpo conocido contra beta-amiloide humano.

Figura 2: Anticuerpo contra ovillos neurofibrilares. A: Anticuerpos humanos. B: Tinción de control con anticuerpo

50 conocido contra tau humano. Los sujetos humanos sanos contienen anticuerpos contra los ovillos neurofibrilares. La tinción inmunohistoquímica con anticuerpos de sujetos sanos en secciones cerebrales obtenidas de pacientes con enfermedad de Alzheimer confirmada patológicamente revela anticuerpos que se unen a los ovillos neurofibrilares confirmados por un anticuerpo conocido contra tau humano.

55 Figura 3: Anticuerpo contra neuritas distróficas. A: Anticuerpos humanos. B: Tinción de control con anticuerpo conocido contra tau humano. Los sujetos humanos sanos contienen anticuerpos contra las neuritas distróficas. La tinción inmunohistoquímica con anticuerpos de sujetos sanos en secciones cerebrales obtenidas de pacientes con enfermedad de Alzheimer confirmada patológicamente revela anticuerpos que se unen a neuritas distróficas.

60 Figura 4: Anticuerpo contra beta-amiloide. La figura muestra la unión específica del anticuerpo humano

recombinante NI-101.11 que se aisló de un paciente excepcionalmente estable clínicamente con enfermedad de Alzheimer contra placas beta-amiloides cerebrales. Las secciones cerebrales obtenidas de un paciente con enfermedad de Alzheimer confirmada neuropatológicamente se tiñeron con anticuerpo humano recombinante a las concentraciones indicadas. La unión del anticuerpo a las placas beta-amiloides con concentraciones de 50 pM

5 sugiere una unión de alta afinidad.

Figura 5: La unión del anticuerpo humano recombinante NI-101.11 a placas beta-amiloides no se ve afectada por competencia por polipéptidos Abeta sintéticos lineales N-terminales. La unión del anticuerpo recombinante contra beta-amiloide cerebral (0,5 nM) no se ve afectada por competencia por el polipéptido derivado de Abeta N-terminal

10 que representa las posiciones 1 a 16 a concentraciones de hasta 1 µM.

Figura 6: El anticuerpo humano recombinante NI-101.11 reconoce un epítopo conformacional Abeta que no está presente en Abeta monomérico. La unión de NI-101.11 a las placas beta-amiloides en secciones cerebrales puede verse afectada por competencia por fibrillas AbetaI-42 pero no por monómeros AbetaI-42 sintéticos lineales.

15 Figura 7: El anticuerpo humano recombinante NI-101.11 no se une a Abeta sintético lineal, monomérico en Western blots. Las preparaciones de Abeta monomérico se separaron por PAGE no desnaturalizante. La proteína transferida se sondeó con anticuerpo humano recombinante contra beta-amiloide y anticuerpos de control contra secuencias Abeta lineales N-terminales (6E10). No se detectó unión de NI-101.11 a Abeta monomérico. Esta observación

20 sugiere que el anticuerpo reconoce un epítopo conformacional de Abeta.

Figura 8: El anticuerpo humano NI-101.11 se une a fibrillas amiloides artificiales preparadas a partir de péptidos AbetaI-42 sintéticos. Las fibrillas sintéticas Abeta o Abeta sintético monomérico que se utilizaron para recubrir placas ELISA a densidades de recubrimiento iguales se incubaron con anticuerpos humanos recombinantes contra beta

25 amiloide cerebral a las concentraciones indicadas. La actividad de unión del anticuerpo humano contra beta-amiloide cerebral a fibrillas amiloides artificiales (cuadrados abiertos) es más de 100 veces mayor comparado con Abeta monomérico (cuadrados llenos). El anticuerpo de control 22C4 se une preferentemente a Abeta monomérico (círculos llenos) y peor a fibrillas (círculos abiertos). Esto sugiere que NI-101.11 reconoce un epítopo conformacional que también está presente en las fibrillas amiloides artificiales preparadas a partir de péptidos Abeta sintéticos.

30 Figura 9: Ausencia de reactividad cruzada del anticuerpo humano recombinante NI-101.11 a APP celular de longitud completa o con cualquiera de sus derivados fisiológicos que aparecen en células cultivadas. A diferencia del anticuerpo de control (6E10) que se une a APP de la superficie celular, está ausente la unión de NI-101.11 a APP de longitud completa presente en la superficie celular. Estos datos demuestran la ausencia de reactividad cruzada de

35 NI-101.11 a APP celular, fisiológica de longitud completa.

Figura 10A-C: Ausencia de unión de NI-101.11 a Abeta monomérico mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Las figuras 10A y 10B muestran ausencia de unión de NI-101.11 o un anticuerpo de control no relacionado a Abetal-42 monomérico etiquetado con FITC, mientras que la figura 10C muestra una unión prominente del

40 anticuerpo 22C4 que reconoce un epítopo lineal presente en el extremo C de Abeta.

Figura 11: ELISA de competencia que muestra que la unión del anticuerpo 6E10, un anticuerpo dirigido contra un epítopo lineal en el extremo N de Abeta, podía bloquearse completamente después de pre-incubación con concentraciones en exceso de péptidos Abeta monoméricos, mientras que la pre-incubación con concentraciones en

45 exceso de estas preparaciones de péptido Abeta monomérico no suprimió la unión de NI-101.11.

Figura 15: El anticuerpo humano recombinante NI-101.11 contra beta-amiloide cerebral cruza la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón transgénico de enfermedad de Alzheimer y se une a las placas betaamiloides cerebrales in vivo.

50 Figura 16A-B: El anticuerpo humano recombinante NI-101.11 mejora el comportamiento cognitivo anormal en un modelo de ratón transgénico de enfermedad de Alzheimer. Se trataron ratones arcAbeta de 24 meses de edad semanalmente i.p. con 3 mg/kg de anticuerpo durante 2 meses. Se realizó un ensayo de comportamiento en laberinto en Y antes y después de la finalización del tratamiento.

55 Figura 17: Penetración de la barrera hematoencefálica y decoración de placas amiloides por NI-101.11 administrado periféricamente. El NI-101.11 puede cruzar la barrera hematoencefálica y unirse a depósitos beta-amiloides en ratones tratados con NI-101.11 (panel izquierdo) mientras que no es visible dicha tinción en animales tratados con el anticuerpo humano de control (panel derecho). El anticuerpo humano recombinante NI-101.11 reduce la carga de

60 placa beta-amiloide cerebral después del tratamiento sistémico durante dos meses.

Figura 18: La inmunización pasiva con NI-101.11 reduce la carga beta-amiloide en ratones arcAbeta. (A, B) Los análisis de la carga de placa con Tioflavina S y Rojo Congo revelan reducciones significativas de más del 50% en comparación con los animales tratados con el anticuerpo de control (Mann-Whitney U; p=0,02 para corteza, p=0,009 5 para hipocampo para TioS y p=0,009 para corteza y p=0,04 para hipocampo para análisis con Rojo Congo). Barra de escala: 200 µm. (C-E). El análisis con Tioflavina S revela una reducción significativa en la carga de beta-amiloide (C), número de placas beta-amiloides (D) y tamaño medio de las placas (E) en ratones arcAbeta tratados con NI

101.11 en comparación con los animales tratados de control. Estadística de Mann-Whitney U: p=0,02 para área de placa en corteza; p=0,009 para área de placa en hipocampo; p=0,047 para número de placas en la corteza; p=0,047

10 para número de placas en el hipocampo; p=0,009 para tamaño de placas en la corteza; p=0,009 para número de placas en el hipocampo.

Figura 19: La carga beta-amiloide reducida está acompañada de astrocitosis y microgliosis reducidas A) La cuantificación de tinción anti-GFAP reveló una reducción significativa en el número de astrocitos reactivos en la

15 corteza de ratones arcAbeta tratados con NI-101.11 en comparación con transgénicos tratados con control. B) La cuantificación de tinción Iba-1 mostró una tendencia hacia un número reducido de microglia activada en ratones tratados con NI-101.11 en la corteza y el hipocampo. Barra de escala: 200 µm.

Figura 20: Ausencia de incremento de microhemorragias cerebrales después de dos meses de tratamiento con

20 anticuerpo humano recombinante NI-101.11. Se trataron ratones arcAbeta de 24 meses de edad con angiopatía amiloide congofílica masiva probada semanalmente i.p. con 3 mg/kg de anticuerpo durante 2 meses. Foto representativa de una microhemorragia cerebral en ratones arcAbeta revelada por tinción con azul de Prusia de Perl (izquierda). El análisis cuantitativo demuestra una frecuencia significativamente elevada de microhemorragias en ratones transgénicos arcAbeta en comparación con los miembros de su camada de tipo silvestre. El tratamiento

25 crónico con NI-101.11 no dio como resultado una frecuencia incrementada de microhemorragias. Barra de escala: 20 µm.

Figura 21: El anticuerpo humano recombinante NI-101.11 inhibe la formación de fibrillas sintéticas de Abeta in vitro. El efecto del anticuerpo humano recombinante NI-101.11 en la formación de fibrillas de Abeta se ensayó midiendo 30 Tioflavina S unida a Abeta agregado por análisis de fluorescencia.

Figura 22: Se midió la fagocitosis dependiente de la dosis, mediada por anticuerpo, de fibrillas Abetal-42-FITC por células microgliales BV-2 después de inhibición del sistema de receptor de material trampa ("scavenger"). NI-101.11 desencadena una fagocitosis potente mediada por el receptor Fcgamma dependiente de la dosis de fibrillas Abeta.

35 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. Definiciones

40 Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el presente documento. Un anticuerpo o inmunoglobulina es una molécula de unión a antígeno que comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras básicas de inmunoglobulinas en los sistemas de vertebrados se entienden relativamente bien. Véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988).

45 Como se discutirá con más detalle más adelante, el término "inmunoglobulina" comprende diversas clases amplias de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Los expertos en la materia entenderán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (γ, µ, α, δ, ε) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, γ1-γ4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la “clase” del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgG

50 o IgE, respectivamente. Las subclases (isotipos) de inmunoglobulinas, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc., están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles por el experto en la materia a la vista de la presente descripción y, de acuerdo con esto, están dentro del alcance de la presente invención. Todas las clases de inmunoglobulinas están claramente dentro del alcance de la presente invención, la discusión siguiente estará dirigida

55 generalmente a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Respecto a IgG, una molécula de inmunoglobulina estándar comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos con un peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos con un peso molecular de 53.000-70.000. Las cuatro cadenas están unidas típicamente por puentes disulfuro en una configuración en “Y” en la que las cadenas ligeras reúnen a las cadenas pesadas empezando en la boca de la “Y” y continuando a través de la región variable.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (κ, λ). Cada clase de cadena pesada puede estar unida con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre sí y las partes de “cola” de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas bien por hibridomas, células B o células huésped

5 manipuladas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un extremo N en los extremos en horquilla de la configuración Y hasta el extremo C en el final de cada cadena.

Tanto las cadenas ligeras como pesadas están divididas en regiones de homología estructural y funcional. Los términos “constante” y “variable” se usan funcionalmente. A este respecto, se apreciará que los dominios variables 10 tanto de las partes de cadena ligera (VL) como pesada (VH) determinan el reconocimiento y especificidad del antígeno. A la inversa, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión a receptor Fc, unión a complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de región constante se incrementa al alejarse del sitio de unión a antígeno o extremo amino del anticuerpo. La parte N-terminal es una región variable y

15 en la parte C-terminal es una región constante; los dominios CH3 y CL comprenden realmente el extremo carboxi de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Como se ha indicado anteriormente, la región variable permite al anticuerpo reconocer selectivamente y unirse específicamente a epítopos en antígenos. Esto es, el dominio VL y el dominio VH, o subconjunto de las regiones 20 determinantes de la complementariedad (CDR), de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura cuaternaria de anticuerpo forma el sitio de unión a antígeno presente en el extremo de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión a antígeno está definido por tres CDR en cada una de las cadenas VH y VL. Cualquier fragmento de anticuerpo o inmunoglobulina que contiene estructura suficiente para unirse específicamente a un antígeno se indica en el presente documento

25 indistintamente como un "fragmento de unión a antígeno" o un "fragmento inmunoespecífico".

En los anticuerpos naturales, las seis “regiones determinantes de la complementariedad” o “CDR” presentes en cada dominio de unión a antígeno son secuencias de aminoácidos cortas, no contiguas que están situadas específicamente para formar el dominio de unión a antígeno al asumir el anticuerpo su configuración tridimensional 30 en un entorno acuoso. Los aminoácidos restantes en los dominios de unión a antígeno, denominados regiones “marco”, muestran menos variabilidad inter-molecular. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de lámina β y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina β. De este modo, las regiones marco actúan para formar un armazón que proporciona el posicionamiento de las CDR en una orientación correcta por interacciones inter-cadena, no covalentes. El dominio de unión a 35 antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria estimula la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo correspondiente. Los aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones marco, respectivamente, pueden ser identificados fácilmente para cualquier región variable de cadena pesada o ligera dada por un experto en la materia, ya que han sido definidos de manera precisa (véase, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Kabat, E., y

40 col., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987).

En el caso en el que existen dos o más definiciones de un término que se usa y/o acepta en la técnica, la definición del término tal y como se usa en el presente documento se pretende que incluya todos estos significados a no ser que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso de la expresión “región determinante de 45 la complementariedad” (“CDR”) para describir los sitios de combinación a antígeno no contiguos encontrados en la región variable de los polipéptidos tanto de cadena pesada como ligera. Esta región particular ha sido descrita por Kabat y col., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) y por Chothia y col., J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987), en las que las definiciones incluyen solapamiento o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se compara una con la otra. Sin embargo, la aplicación de 50 cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo se pretende que esté dentro del alcance del término como se define y usa en el presente documento. Los residuos de aminoácidos apropiados que engloban las CDR como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente se muestran más adelante en la tabla 1 como una comparación. Los números exactos de los residuos que engloban una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la materia pueden determinar

55 rutinariamente qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

Tabla 1: definiciones de CDR1

Kabat

Chothia

VH CDR1

31-35 26-32

VH CDR2

50-65 52-58

VH CDR3

95-102 95-102

VL CDR1

24-34 26-32

VL CDR2

50-56 50-52

VL CDR3

89-97 91-96

1La numeración de todas las definiciones de CDR en la tabla 1 es de acuerdo con las convenciones de numeración mostradas por Kabat y col. (véase más adelante)

Kabat y col., también definieron un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la materia puede asignar sin ambigüedad este sistema de “numeración de 5 Kabat” a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de cualquier dato experimental más allá de la secuencia en sí misma. Tal y como se usa en el presente documento, la “numeración de Kabat” se refiere al sistema de numeración mostrado por Kabat y col., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983). A no ser que se especifique otra cosa, las referencias a la numeración de posiciones específicas de residuos de aminoácidos en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del

10 mismo de la presente invención son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos inmunoespecíficos, variantes o derivados de los mismos de la invención incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de unión a epítopo, 15 por ejemplo, Fab, Fab’ y F(ab’)2, Fd, Fvs, Fvs de cadena sencilla (scFv) , anticuerpos de cadena sencilla, Fvs unidos por disulfuro (sdFv) , fragmentos que comprenden bien un dominio VL o VH, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos descritos en el presente documento). Las moléculas scFv son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 5.892.019. Las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpo de la

20 invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención no es IgM o un derivado de ésta con una estructura pentavalente. En particular, en aplicaciones específicas de la presente invención, especialmente uso terapéutico, las

25 IgM son menos útiles que las IgG y otros anticuerpos bivalentes o moléculas de unión correspondientes, ya que las IgM debido a su estructura pentavalente y ausencia de maduración por afinidad muestran frecuentemente reactividades cruzadas inespecíficas y afinidad muy baja.

Los fragmentos de anticuerpo, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender la o las regiones

30 variables solas o en combinación con todo o una parte de lo siguiente: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También están incluidos en la invención fragmentos de unión a antígeno que también comprenden cualquier combinación de región o regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos o fragmentos inmunoespecíficos de los mismos de la presente invención pueden tener cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos humanos, murinos, de burro,

35 conejo, cabra, cobaya, camello, llama, caballo o pollo. En otra realización, la región variable puede tener origen condrictoide (por ejemplo, de tiburones). Tal y como se usa en el presente documento, los anticuerpos “humanos” incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de pacientes humanos, bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe a

40 continuación y, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. 5.939.598 por Kucherlapati y col. Un anticuerpo humano todavía es "humano" incluso si se hacen sustituciones de aminoácidos en el anticuerpo, por ejemplo, para mejorar las características de unión.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión “parte de cadena pesada” incluye las secuencias de

45 aminoácidos derivadas de la cadena pesada de una inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una parte de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, un dominio bisagra (por ejemplo, región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, o una variante o fragmento de estos. Por ejemplo, un polipéptido de unión para uso en la invención puede comprender una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra

50 y un dominio CH2; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra y un dominio CH3 o una

cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otra realización, un polipéptido de la invención comprende una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH3. Además, un polipéptido de unión para uso en la invención puede carecer de al menos una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2). Como se ha mostrado anteriormente,

5 un experto en la materia entenderá que estos dominios (por ejemplo, las partes de cadena pesada) pueden modificarse de manera que varíen en la secuencia de aminoácidos respecto a la molécula de inmunoglobulina de origen natural.

En ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en el

10 presente documento, las partes de cadena pesada de una cadena polipeptídica de un multímero son idénticas a aquellas en una segunda cadena polipeptídica del multímero. Como alternativa, los monómeros que contienen la parte de cadena pesada de la invención no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de unión a diana diferente, formando, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico.

15 Las partes de cadena pesada de un polipéptido de unión para usarse en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento pueden derivar de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una parte de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molécula IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula IgG3. En otro ejemplo, una parte de cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula IgG1 y, en parte, de una molécula IgG3.

20 En otro ejemplo, una parte de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula IgG1 y, en parte, de una molécula IgG4.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión “parte de cadena ligera” incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. Preferentemente, la parte de cadena ligera

25 comprende al menos uno de un dominio VL o CL.

Se piensa que el tamaño mínimo de un epítopo de péptido o polipéptido para un anticuerpo es aproximadamente de cuatro a cinco aminoácidos. Los epítopos de péptido o polipéptido contienen preferentemente al menos siete, más preferentemente al menos nueve y de la forma más preferente entre al menos aproximadamente 15 y 30 aproximadamente 30 aminoácidos. Dado que una CDR puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en su forma terciaria, los aminoácidos que comprenden un epítopo no necesitan ser contiguos, y en algunos casos, incluso pueden no estar en la misma cadena peptídica. En la presente invención, el epítopo de péptido o polipéptido reconocido por los anticuerpos de la presente invención contiene una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, más preferentemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al

35 menos 25 o entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos contiguos o no contiguos de Aβ.

El término "neoepítopo", de acuerdo con la presente invención, indica un epítopo que es único para un patrón patológico y contenido en o formado por una proteína asociada con un trastorno que es una variante patológica de una proteína de lo contrario no patológica y/o que se desvía de la fisiología del estado sano. Dichas variantes 40 patofisiológicas pueden formarse mediante transcripción patológicamente alterada, traducción patológicamente alterada, modificación posterior a la traducción, procesamiento proteolítico patológicamente alterado, formación de complejo patológicamente alterada con parejas de interacción fisiológicas o patofisiológicas o estructuras celulares en el sentido de una co-localización alterada o conformación estructural patológicamente alterada -como por ejemplo agregación, oligomerización o fibrilación -cuya estructura tri o cuatridimensional se diferencia de la estructura de la 45 molécula fisiológicamente activa. Además, una variante patofisiológica también puede caracterizarse porque no está localizada en su entorno fisiológico o compartimento subcelular habitual. Como un ejemplo, los neoepítopos pueden estar localizados en las estructuras patológicamente conspicuas en las áreas de tejidos cerebrales que experimentan obviamente o han experimentado ya daño funcional. Si una estructura dada, por ejemplo, célula o tejido, o proteína presenta un neoepítopo puede verificarse revirtiendo el procedimiento descrito más adelante para

50 aislar y caracterizar una molécula de unión específica de una proteína asociada con un trastorno en el que una molécula de unión, por ejemplo, anticuerpo identificado por dicho procedimiento se usa para cribar una muestra para unión al anticuerpo, determinando de esta manera la presencia de un neoepítopo.

Las frases "específico/a de proteína asociada con enfermedad" y "específico/a de neoepítopo" se usan

55 indistintamente en el presente documento con el término "que reconoce específicamente un neoepítopo". Tal y como se usan en el presente documento, las expresiones tales como "ausencia de reactividad cruzada", "específico/a", "que reconoce específicamente", "que se une específicamente", "que se une preferentemente" y similares se refieren a la capacidad de la molécula de unión para discriminar entre el neoepítopo de una proteína asociada con un trastorno y la proteína nativa en su forma de tipo silvestre y contexto natural. De este modo, la molécula de unión de

60 la presente invención tiene una afinidad de unión preferente al neoepítopo sobre el antígeno de la proteína nativa

por un factor de al menos dos, preferentemente al menos 5, habitualmente más de por un factor de 10, particularmente preferido por un factor de 50 e incluso más preferido mayor de 100. Además, la KD relativa de la molécula de unión, por ejemplo, anticuerpo para el epítopo diana específico, por ejemplo, neoepítopo, es preferentemente al menos 10 veces menor, más preferentemente al menos 100 veces menor o más que la KD para

5 la unión de ese anticuerpo a otros ligandos o al equivalente nativo de la proteína asociada con la enfermedad.

Por “se une específicamente” o “reconoce específicamente”, usados indistintamente en el presente documento, se entiende generalmente que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo se une a un epítopo a través de su dominio de unión a antígeno y que la unión conlleva alguna complementariedad entre el dominio de unión a antígeno 10 y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo “se une específicamente” a un epítopo cuando se une a ese epítopo, a través de su dominio de unión a antígeno más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo al azar, no relacionado. El término “especificidad” se usa en el presente documento para calificar la afinidad relativa por la que un determinado anticuerpo se une a un determinado epítopo. Por ejemplo, el anticuerpo “A” puede considerarse que tiene una mayor especificidad para un epítopo dado que el anticuerpo “B” o puede decirse que el

15 anticuerpo “A” se une al epítopo “C” con una mayor especificidad de la que tiene para un epítopo relacionado “D”.

Por “se une preferentemente” se entiende que la molécula de unión, por ejemplo, anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo. De este modo, un anticuerpo que “se une preferentemente” a un epítopo dado se uniría más probablemente a ese epítopo

20 que a un epítopo relacionado, a pesar de que dicho anticuerpo puede reaccionar de manera cruzada con el epítopo relacionado.

Como ejemplo no limitante, puede considerarse que una molécula de unión, por ejemplo, anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une a dicho primer epítopo con una constante de disociación (KD) que es

25 menor que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer antígeno preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la KD del anticuerpo para el segundo epítopo.

30 En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una velocidad de disociación (k(off)) que es menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos

35 un orden de magnitud menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo.

Puede decirse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o

40 derivado descrito en el presente documento se une a un polipéptido diana descrito en el presente documento o un fragmento o variante del mismo con una velocidad de disociación (k(off)) de menos de o igual a 5 x 10-2 s-1, 10-2 s-1 , 5 X 10-3 s-1 ó 10-3 s-1. Más preferentemente, puede decirse que un anticuerpo de la invención se une a un polipéptido diana descrito en el presente documento o un fragmento o variante del mismo con una velocidad de disociación (k(off)) menor de o igual a 5 X 10-4 s-1, 10-4 s-1, 5 X 10-5 s-1 ó 10-5 s-1, 5 X 10-6 s-1, 10-6 s-1, 5 X 10-7 s-1 ó 10-7 s-1 .

45 Puede decirse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en el presente documento se une a un polipéptido diana descrito en el presente documento o un

-

fragmento o variante del mismo con una velocidad de asociación (k(on)) mayor de o igual a 103 M-1 s-1, 5 X 103 M-1 s 1, 104 M-1 s-1 ó 5 X 104 M-1 s-1. Más preferentemente, puede decirse que un anticuerpo de la invención se une a un

50 polipéptido diana descrito en el presente documento o un fragmento o variante del mismo con una velocidad de asociación (k(on)) mayor de o igual a 105 M-1 s-1, 5 X 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1 ó 5 X 106 M-1 s-1 ó 107 M-1 s-1 .

Se dice que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferentemente a ese epítopo hasta el punto en el que bloquea, en algún

55 grado, la unión del anticuerpo de referencia al epítopo. La inhibición competitiva puede determinarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos de ELISA de competencia. Puede decirse que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo dado al menos un 90%, al menos un 80%, al menos un 70%, al menos un 60% o al menos un 50%.

60 Tal y como se usa en el presente documento, el término “afinidad” se refiere a una medida de la fuerza de la unión

de un epítopo individual con la CDR de una molécula de unión, por ejemplo, una molécula de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988) en las páginas 27-28. Tal y como se usa en el presente documento, el término “avidez” se refiere a la estabilidad global del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, esto es, la fuerza de

5 combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulina con el antígeno. Véase, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez está relacionada tanto con la afinidad de las moléculas de inmunoglobulina individuales en la población con epítopos específicos como también con las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo altamente repetitiva, tal como un polímero, sería una de alta avidez.

10 Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Tal y como se usa en el presente documento, la expresión “reactividad cruzada” se refiere a la capacidad de un anticuerpo, específico para un antígeno, de reaccionar con un segundo antígeno; una medida de relación entre dos

15 sustancias antigénicas diferentes. De este modo, un anticuerpo reacciona de manera cruzada si se une a un epítopo distinto del que indujo su formación. El epítopo que reacciona de manera cruzada contiene generalmente muchas de las mismas características estructurales complementarias que el epítopo inductor y, en algunos casos, realmente puede ajustarse mejor que el original.

20 Por ejemplo, ciertos anticuerpos tienen algún grado de reactividad cruzada, ya que se unen a epítopos relacionados, pero no idénticos, por ejemplo, epítopos con al menos un 95%, al menos un 90%, al menos un 85%, al menos un 80%, al menos un 75%, al menos un 70%, al menos un 65%, al menos un 60%, al menos un 55% y al menos un 50% de identidad (según se calcula usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) con un epítopo de referencia. Puede decirse que un anticuerpo tiene poca o ninguna reactividad

25 cruzada si no se une a epítopos con menos de un 95%, menos de un 90%, menos de un 85%, menos de un 80%, menos de un 75%, menos de un 70%, menos de un 65%, menos de un 60%, menos de un 55% y menos de un 50% de identidad (según se calcula usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) con un epítopo de referencia. Un anticuerpo puede considerarse “altamente específico” para un determinado epítopo, si no se une a ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de ese epítopo.

30 Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a un polipéptido de la invención. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd de menos de 5 X 10-2 M, 10-2 M, 5 X 10-3 M, 10-3 M, 5 X 10-4 M, 10-4 M, 5 X 10-5 M, 10-5 M, 5 X10-6 M, 10-6 M, 5 X

35 10-7 M, 10-7 M, 5 X 10-8 M, 10-8 M, 5 X 10-9 M, 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10-11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X 10-15 M ó 10-15 M.

Como se ha indicado previamente, las estructuras de subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas. Tal y como se usa en el presente

40 documento, la expresión “dominio VH” incluye el dominio variable amino terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y la expresión “dominio CH1” incluye el primer (más amino terminal) dominio de región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 es adyacente al dominio VH y es amino terminal respecto a la región bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina.

45 Tal y como se usa en el presente documento, la expresión “dominio CH2” incluye la parte de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente el residuo 244 hasta el residuo 360 de un anticuerpo usando los esquemas de numeración convencionales (residuos 244 a 360, sistema de numeración Kabat; y residuos 231-340, sistema de numeración EU; véase Kabat EA y col. op. cit. El dominio CH2 es único porque no está emparejado de cerca con otro dominio. En lugar de esto, dos cadenas de carbohidrato ramificadas unidas por N

50 están interpuestas entre los dos dominios CH2 de una molécula IgG nativa intacta. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 al extremo C de la molécula IgG y comprende aproximadamente 108 residuos.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión “región bisagra” incluye la parte de una molécula de

55 cadena pesada que une el dominio CH1 con el dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo de esta manera que las dos regiones de unión a antígeno N terminales se muevan independientemente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior (Roux y col., J. Immunol. 161: 4083 (1998)).

60 Tal y como se usa en el presente documento, la expresión “enlace disulfuro” incluye el enlace covalente formado

entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un segundo grupo tiol. En la mayor parte de las moléculas IgG naturales, las regiones CH1 y CL están unidas por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas por dos enlaces disulfuro en posiciones correspondientes a 239 y 242 usando el sistema de numeración Kabat (posición 226 ó 229, sistema de numeración

5 EU).

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpo genotecnológico” se refiere a un anticuerpo en el que el dominio variable en cualquiera de la cadena pesada y ligera o ambas está alterado por al menos el reemplazo parcial de una o más CDR de un anticuerpo con especificidad conocida y, si es necesario, por reemplazo 10 parcial de la región marco y cambio de secuencia. Aunque las CDR pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del que se derivan las regiones marco, se prevé que las CDR se derivarán de un anticuerpo de una clase diferente y preferentemente de un anticuerpo de una especie diferente. Un anticuerpo genotecnológico en el que se injertan una o más CDR “donantes” de un anticuerpo no humano con especificidad conocida en una región marco de cadena pesada o ligera humana se denomina en el presente 15 documento un “anticuerpo humanizado”. Puede no ser necesario reemplazar todas las CDR con las CDR completas de la región variable del donante para transferir la capacidad de unión a antígeno de un dominio variable a otro. En lugar de esto, puede ser necesario sólo transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión diana. Dadas las explicaciones mostradas, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos No. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 y 6.180.370, estará dentro de la competencia de los expertos en la materia, bien

20 llevando a cabo experimentación rutinaria o por ensayo de prueba y error, obtener un anticuerpo genotecnológico o humanizado funcional.

Tal y como se usan en el presente documento, los términos “unido”, “fusionado” o “fusión” se usan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión entre sí de dos o más elementos o componentes, por cualquier medio 25 incluyendo conjugación química o medios recombinantes. Una “fusión en marco” se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos (ORF) de polinucleótidos para formar un ORF continuo, más largo, de una manera que mantiene el marco de lectura de traducción correcto de los ORF originales. De este modo, una proteína de fusión recombinante es una única proteína que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (segmentos que normalmente no están así unidos en la naturaleza). Aunque el 30 marco de lectura se hace, de este modo, continuo a lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar físicamente o espacialmente separados, por ejemplo, por secuencia enlazadora en marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las CDR de la región variable de una inmunoglobulina pueden estar fusionados, en marco, pero estar separados por un polinucleótido que codifica al menos una región marco de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, siempre que las CDR “fusionadas” se co-traduzcan como parte de un polipéptido

35 continuo.

Tal y como se usan en el presente documento, los términos “tratar” o “tratamiento” se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a la medidas profilácticas o preventivas, en las que el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como el desarrollo o diseminación del cáncer. Los resultados clínicos 40 beneficiosos o deseados incluyen, pero no están limitados a, alivio de los síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. “Tratamiento” también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya

45 presentan la afección o trastorno, así como aquellos con tendencia a tener la afección o trastorno o aquellos en los que se quiere prevenir la manifestación de la afección o trastorno.

Por “sujeto” o “individuo” o “animal” o “paciente” o “mamífero” se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, por ejemplo, un paciente humano, para el que se desea diagnóstico, pronóstico, prevención o terapia.

50 La presente invención se refiere a una molécula de unión como se caracteriza en las reivindicaciones, que es capaz de reconocer selectivamente un epítopo de una proteína asociada a enfermedad incluyendo un neoepítopo de una proteína asociada a enfermedad, que puede obtenerse o validarse preferentemente por el procedimiento de la presente invención descrito anteriormente en el presente documento e ilustrado en los ejemplos. Ventajosamente, la

55 molécula de unión de la presente invención no reconoce sustancialmente dicha proteína en su forma no asociada a enfermedad; véase también anteriormente.

Los medios y procedimientos para la producción recombinante de moléculas de unión, en particular anticuerpos y miméticos de los mismos, así como los procedimientos para cribar moléculas de unión competitivas, que pueden o 60 no ser anticuerpos, se conocen en la técnica y se resumen, por ejemplo, en la solicitud internacional

WO2006/103116 respecto a anticuerpos contra beta-amiloide y el tratamiento/diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.

Sin embargo, como se describe en el presente documento, en particular respecto a las aplicaciones terapéuticas en

5 los seres humanos, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo humano. En este contexto, la proteína patológica variante reconocida por el anticuerpo está asociada con un trastorno neurológico, es decir, un trastorno del cerebro.

Además, como se demuestra en los ejemplos 3 a 5, la molécula de unión de la presente invención, en particular un

10 anticuerpo tiene varias propiedades biológicas ventajosas, una o más de las cuales se han conseguido por la presente invención por primera vez, por ejemplo, es capaz de:

(i) cruzar la barrera hematoencefálica, por ejemplo, en el sitio del evento patológico;

15 (ii) unirse a placas beta-amiloides, amiloide cerebrovascular, depósitos Abeta difusos, ovillos neurofibrilares, tau hiperfosforilado, cuerpos de Lewy positivos para alfa-sinucleína o agregados proteicos asociados con neuritas distróficas;

(iii) eliminar placas beta-amiloides en el cerebro y/o prevenir la formación de placas amiloides en el cerebro; 20

(iv)

restaurar sustancialmente el comportamiento normal, y/o

(v)

no causar microhemorragias.

25 En una realización preferida particular, el anticuerpo o molécula de unión equivalente de la presente invención puede distinguirse de otros anticuerpos por una o más de las propiedades siguientes, por ejemplo, son capaces de:

1. pasar, al menos en cantidades pequeñas, la barrera hematoencefálica en el sitio de los eventos patológicos;

30 2. unirse a una o más estructuras extracelulares o celulares patofisiológicamente relevantes;

3. dar lugar a la reducción de la estructura patofisiológicamente relevante in vitro o in vivo;

4. dar lugar a la reducción de la estructura patofisiológicamente relevante y a la reducción de una toxicidad asociada 35 con ella;

5.

dar lugar al bloqueo o retraso del proceso de la enfermedad;

6.

dar lugar a la regeneración de funciones celulares y específicas de órgano y de organismo y posiblemente a una

40 prevención secundaria de la recurrencia de la patofisiología original después de la degradación de la toxicidad conectada con la estructura patofisiológicamente relevante; y/o

7. no está asociada con microhemorragias incrementadas.

45 Además, la ausencia de reactividad cruzada con precursores o derivados fisiológicos da lugar a la consecuencia de que, en primer lugar, las concentraciones son predecibles ya que se evitan los efectos sumidero en estructuras tisulares sanas y, en segundo lugar, las respuestas autoinmunitarias en el sentido de efectos secundarios no deseados se pierden sustancialmente. Además, los informes previos sugirieron una asociación de angiopatía amiloide cerebral (CAA) con reactividad vascular comprometida en un modelo de ratón transgénico con CAA

50 (Mueggler y col., J Neurosci 22 (2002), 7218-24). La CAA grave que ocurre en ratones arcAβ viejos (Knobloch y col., Neurobiol. Aging 28: 1297-1306 (2007) epub 31 de julio, 2006) podría constreñir de este modo la flexibilidad vasodilatadora de los vasos sanguíneos afectados. De acuerdo con la presente invención, es prudente esperar que el tratamiento con los anticuerpos de la presente invención pueda mejorar la vasorreactividad y el flujo sanguíneo cerebral en ratones transgénicos APP viejos. Esto puede validarse usando el modelo de ratones arcAβ descrito en

55 Knobloch y col. (2006), anteriormente, y descrito en la solicitud estadounidense "Transgenic animal model for Alzheimer's disease" de Grimm y col., número de serie 60/934.291 presentada el 11 de junio de 2007.

II. Anticuerpos

60 La presente invención se refiere, además, a las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión,

variantes y derivados de los mismos, mostrados en la tabla 2 y 3. La presente invención se refiere, más específicamente, a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del mismo, en el que el anticuerpo se une específicamente al mismo neoepítopo de una proteína asociada con un trastorno que el anticuerpo de referencia NI-101.12F6A.

5 La invención está dirigida además a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del mismo, en el que el anticuerpo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia NI-101.12F6A al neoepítopo de una proteína asociada con un trastorno.

10 La invención también está dirigida a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del 35 mismo, en el que el anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno idéntico al del anticuerpo NI-101.12F6A.

La presente invención ejemplifica, además, varias de dichas moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos, que pueden caracterizarse por comprender en su región variable, por ejemplo, 15 dominio de unión, la una región determinante de la complementariedad (CDR) de la región variable VH y VL que comprende las secuencias de aminoácidos representadas en la tabla 2 (VH) y tabla 3 (VL).

Tabla 2: Secuencias de aminoácidos de la región VH de anticuerpos específicos de beta-amiloide.

Anticuerpo

Secuencia de cadena pesada variable

NI-101.11

NI-101.12F 6A

Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de la región VL de anticuerpos específicos de beta-amiloide.

Anticuerpo

Secuencia de cadena ligera variable (kappa o lambda)

NI-101.11

NI-101.12F 6A

Las secuencias de nucleótidos correspondientes que codifican las regiones variables identificadas anteriormente se muestran en la lista de secuencias adjunta. El conjunto de CDR de las secuencias de aminoácidos anteriores de la región VH y VL según se representan en las tablas 2 y 3 se proporciona en la tabla 4. Sin embargo, tal como se 25 describe en lo sucesivo, el experto en la materia es muy consciente del hecho de que pueden usarse CDR, además

o como alternativa, que se diferencian en su secuencia de aminoácidos de las mostradas en la tabla 4 por uno, dos, tres o incluso más aminoácidos en el caso de CDR2 y CDR3.

Tabla 4: Denominación de secuencias de proteínas de CDR en nomenclatura Kabat de regiones VH y VL de anticuerpos específicos de beta-amiloide.

Anticuerpo

Cadena pesada variable Cadena ligera variable

NI-101.11

CDR1

SYGMH (SEQ ID NO: 20) RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 23)

CDR2

VIWFDGTKKYYTDSVKG (SEQ ID NO: 21) AASSLQS (SEQ ID NO: 24)

CDR3

DRGIGARRGPYYMDV (SEQ ID NO: 22) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 25)

NI-101.12F6A

CDR1

SYGMH (SEQ ID NO: 20) RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 23)

CDR2

VIWFDGTKKYYTDSVKG (SEQ ID NO: 21) AASSLQS (SEQ ID NO: 24)

CDR3

DRGIGARRGPYYMDV (SEQ ID NO: 22) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 25)

El anticuerpo de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos de la región VH y VL del anticuerpo NI-101.12F6A tal como se representa en las tablas 2 y 3. Un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo puede ser, por ejemplo, un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv), un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un 35 fragmento F(ab')2. Para algunas aplicaciones, sólo se requieren las regiones variables de los anticuerpos, que pueden obtenerse tratando el anticuerpo con reactivos adecuados de manera que se generan partes Fab', Fab o

F(ab')2. Dichos fragmentos son suficientes para uso, por ejemplo, en procedimientos de inmunodiagnóstico que implican el acoplamiento de las partes inmunoespecíficas de inmunoglobulinas a reactivos de detección tales como radioisótopos.

5 La presente invención se refiere, además, a polipéptidos aislados que componen los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención comprenden polipéptidos, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que codifican regiones de unión a antígeno específicas derivadas de moléculas de inmunoglobulina. Una secuencia polipeptídica o de aminoácidos "derivada de" una proteína designada se refiere al origen del polipéptido que tiene una determinada secuencia de aminoácidos. En ciertos casos, la secuencia polipeptídica o de

10 aminoácidos que se deriva de una secuencia polipeptídica o de aminoácidos de partida particular tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la de la secuencia de partida, o una parte de ésta, en el que la parte consiste en al menos 10-20 aminoácidos, al menos 20-30 aminoácidos, al menos 30-50 aminoácidos o que un experto en la materia puede identificar de otra manera que tiene su origen en la secuencia de partida.

15 Una inmunoglobulina o su ADNc codificantes puede modificarse adicionalmente. De este modo, en una realización adicional, el procedimiento de la presente invención comprende una cualquiera de la una o más etapa s de producción de un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de cadena sencilla, fragmento Fab, anticuerpo biespecífico, anticuerpo de fusión, anticuerpo etiquetado o un análogo de uno cualquiera de los mismos. Los procedimientos correspondientes son conocidos para el experto en la materia y se describen, por ejemplo, en

20 Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Cuando los derivados de dichos anticuerpos se obtienen por la técnica de presentación en fagos, puede usarse la resonancia de plasmón superficial como se emplea en el sistema BIAcore para incrementar la eficacia de los anticuerpos de fago que se unen al mismo epítopo que el de uno cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). La producción

25 de anticuerpos quiméricos se describe, por ejemplo, en la solicitud internacional WO89/09622. Los procedimientos para la producción de anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en la solicitud europea EP-A1 0 239 400 y en la solicitud internacional WO90/07861. Una fuente adicional de anticuerpos para utilizarse de acuerdo con la presente invención son los denominados anticuerpos xenogénicos. El principio general para la producción de anticuerpos xenogénicos, tales como anticuerpos humanos en ratones se describe, por ejemplo, en las solicitudes

30 internacionales WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 y WO 96/33735. Como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo de la invención puede existir en diversas formas además de anticuerpos completos; incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)2, así como en cadenas sencillas; véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO88/09344.

35 Los anticuerpos de la presente invención o su cadena o cadenas de inmunoglobulina correspondientes pueden modificarse adicionalmente usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, usando deleción o deleciones, inserción o inserciones, sustitución o sustituciones, adición o adiciones de aminoácidos y/o recombinación o recombinaciones y/o cualesquiera otra u otras modificaciones conocidas en la técnica bien solas o en combinación. Los procedimientos para introducir dichas modificaciones en la secuencia de ADN subyacente a la

40 secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina son muy conocidos para el experto en la materia; véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1994). Las modificaciones del anticuerpo de la invención incluyen derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de la cadena lateral, modificaciones de la cadena principal y

45 modificaciones N y C-terminales incluyendo acetilación, hidroxilación, metilación, amidación y la unión de restos de carbohidrato o lípido, cofactores y similares. Asimismo, la presente invención abarca la producción de proteínas quiméricas que comprenden el anticuerpo descrito o algún fragmento del mismo en el extremo amino fusionado a una molécula heteróloga, tal como un ligando inmunoestimulador en el extremo carboxilo; véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO00/30680 para los detalles técnicos correspondientes.

50 De acuerdo con lo anterior, la presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica una molécula de unión de la presente invención, en el caso del anticuerpo preferentemente al menos una región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo como se ha descrito anteriormente. Típicamente, dicha región variable codificada por el polinucleótido comprende al menos la VH y/o VL de la región variable de dicho anticuerpo. El

55 experto en la materia sabe que cada dominio variable (la cadena pesada VH y la cadena ligera VL) de un anticuerpo comprende tres regiones hipervariables, denominadas algunas veces regiones determinantes de la complementariedad o “CDR” flanqueadas por cuatro regiones marco relativamente conservadas o “FR” y se refieren a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. Las regiones hipervariables o CDR del subtipo IgG humano de anticuerpo comprenden residuos de aminoácidos desde los

60 residuos 24-34 (L1) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1) , 50-65 (H2) y

95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada como describen Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991) y/o aquellos residuos de un bucle hipervariable, por ejemplo, los residuos 26-32 (L1) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada 5 como describen Chothia y col., J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917. Los residuos marco o FR son aquellos residuos del dominio variable distintos de y que rodean a las regiones hipervariables. La expresión "unión específica" se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una constante de disociación (KD) de 10-7 o menos, y se une al antígeno predeterminado con una KD que es al menos dos veces menor que su KD para la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína o cualquier otro polipéptido 10 especificado) distinto del antígeno predeterminado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en el presente documento con la expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". Tal y como se usa en el presente documento, la unión "altamente específica" significa que la KD relativa del anticuerpo para el epítopo diana específico, por ejemplo, neoepítopo, es al menos 10 veces menor que la KD para la unión del anticuerpo a otros ligandos o al equivalente

15 nativo de la proteína asociada a enfermedad.

La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno puede determinarse experimentalmente usando cualquier

procedimiento adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky y col., "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental

Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press Nueva York, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and 20 Company Nueva York, NY (1992) y los procedimientos descritos en el presente documento. Las técnicas generales

para medir la afinidad de un anticuerpo por un antígeno incluyen ELISA, RIA y resonancia de plasmón superficial. La

afinidad medida de una interacción anticuerpo-antígeno particular puede variar si se mide en condiciones diferentes,

por ejemplo, concentración de sal, pH. De este modo, las medidas de la afinidad y otros parámetros de la unión del

antígeno, por ejemplo, KD, CI50, se hacen preferentemente con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno 25 y un tampón estandarizado.

El experto en la materia entenderá fácilmente que el dominio variable del anticuerpo que tiene el dominio variable

descrito anteriormente puede usarse para la construcción de otros polipéptidos o anticuerpos con la especificidad y

función biológica deseadas. De este modo, la presente invención también abarca polipéptidos y anticuerpos que 30 comprenden al menos una CDR del dominio variable descrito anteriormente y que tienen, ventajosamente,

sustancialmente las mismas propiedades de unión o similares que el anticuerpo descrito en los ejemplos adjuntos. El

experto en la materia entenderá fácilmente que, mediante el uso de los dominios variables o CDR descritos en el

presente documento, se pueden construir anticuerpos de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, por

ejemplo, como se describe en las solicitudes de patente europea EP 0 451 216 A1 y EP 0 549 581 A1. Además, el 35 experto en la materia sabe que la afinidad de unión puede potenciarse haciendo sustituciones de aminoácidos en las

CDR o en los bucles hipervariables (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) que se solapan parcialmente

con las CDR según se define por Kabat. De este modo, la presente invención también se refiere a anticuerpos en los

que una o más de las CDR mencionadas comprenden una o más, preferentemente no más de dos, sustituciones de

aminoácidos. Preferentemente, el anticuerpo de la invención comprende en una o ambas de sus cadenas de 40 inmunoglobulina dos de o las tres CDR regiones variables, como se muestra en la tabla 4.

Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los

mismos de la invención, como conocen los expertos en la materia, pueden comprender una región constante que

media una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a una región 45 constante de un anticuerpo puede activar el sistema del complemento. La activación del complemento es importante

en la opsonización y lisis de los patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta

inflamatoria y también puede estar implicada en la hipersensibilidad autoinmunitaria. Además, los anticuerpos se

unen a receptores en diversas células a través de la región Fc, con un sitio de unión al receptor Fc en la región Fc

del anticuerpo que se une a un receptor Fc (FcR) en una célula. Existen una serie de receptores Fc que son 50 específicos para diferentes clases de anticuerpos, incluyendo IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA

(receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a los receptores Fc en las superficies celulares

desencadena una serie de respuestas biológicas importantes y diversas incluyendo engullimiento y destrucción de

las partículas recubiertas por anticuerpo, aclaramiento de los complejos inmunitarios, lisis de las células diana

recubiertas por anticuerpo por las células asesinas (denominada citotoxicidad mediada por células dependiente de 55 anticuerpo o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de

inmunoglobulinas.

Por consiguiente, ciertas realizaciones de la invención incluyen un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno,

variante o derivado del mismo, en el que al menos una fracción de uno o más de los dominios de región constante 60 ha sido eliminada o alterada de otra manera de manera que se proporcionen características bioquímicas deseadas

tales como funciones efectoras reducidas, la capacidad de dimerización no covalente, capacidad incrementada de localizarse en el sitio de un tumor, semivida sérica reducida o semivida sérica incrementada cuando se compara con un anticuerpo completo, inalterado de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, determinados anticuerpos para usarse en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento son 5 anticuerpos con dominios eliminados que comprenden una cadena polipeptídica similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que carecen al menos de una parte de uno o más dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en ciertos anticuerpos, un dominio entero de la región constante del anticuerpo modificado estará eliminado, por ejemplo, todo o parte del dominio CH2 estará eliminado. En otras realizaciones, ciertos anticuerpos para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento tienen una región constante, por 10 ejemplo, una región constante de cadena pesada de IgG, que está alterada para eliminar la glicosilación, denominados en otro lugar del presente documento como anticuerpos aglicosilados o "agli". Dichos anticuerpos "agli" pueden prepararse enzimáticamente, así como por manipulación genética del sitio o sitios de glicosilación consenso en la región constante. Aunque no se pretende la vinculación a ninguna teoría, se cree que los anticuerpos "agli" pueden tener un perfil incrementado de seguridad y estabilidad in vivo. Los procedimientos para producir

15 anticuerpos aglicosilados, que tienen una función efectora deseada se encuentran, por ejemplo, en el documento WO 2005/018572.

En ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en el presente documento, la parte Fc puede estar mutada para disminuir la función efectora usando técnicas conocidas

20 en la técnica. Por ejemplo, la deleción o inactivación (mediante mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión al receptor Fc del anticuerpo modificado circulante incrementando de esta manera la localización tumoral. En otros casos, puede ser que las modificaciones en la región constante coherentes con la presente invención, moderen la unión al complemento y reduzcan así la semivida sérica y la asociación no específica de una citotoxina conjugada. Otras modificaciones más de la región constante pueden

25 usarse para modificar las uniones disulfuro o restos oligosacarídicos que permiten la localización aumentada debido a una especificidad de antígeno o flexibilidad del anticuerpo incrementadas. El perfil fisiológico, biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos resultantes de las modificaciones, tales como localización tumoral, biodistribución y vida media sérica, pueden medirse y cuantificarse fácilmente usando técnicas inmunológicas muy conocidas sin experimentación excesiva.

30 Las formas modificadas de los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden prepararse a partir de anticuerpos precursores o parentales completos usando técnicas conocidas en la técnica. Las técnicas ejemplares se describen con más detalle en el presente documento.

35 En ciertas realizaciones, tanto las regiones variables como constantes de los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención son totalmente humanas. Los anticuerpos totalmente humanos pueden prepararse usando técnicas que son conocidas en la técnica y como se describe en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos totalmente humanos contra un antígeno específico pueden prepararse administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en

40 respuesta a una provocación antigénica, pero cuyos loci endógenos se han inhabilitado. Las técnicas ejemplares que pueden usarse para preparar dichos anticuerpos se describen en las patentes de Estados Unidos: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140. Otras técnicas son conocidas en la técnica. Los anticuerpos totalmente humanos pueden producirse asimismo por varias tecnologías de presentación, por ejemplo, presentación en fagos u otros sistemas de presentación virales, como se describe con más detalle en otro lugar del presente documento.

45 Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden prepararse o fabricarse usando técnicas que son conocidas en la técnica. En ciertas realizaciones, las moléculas de anticuerpo o fragmentos de éstas se “producen recombinantemente”, es decir, se producen usando tecnología de ADN recombinante. Las técnicas ejemplares para preparar moléculas de anticuerpo o fragmentos de éstas se

50 describen con más detalle en otro lugar del presente documento.

Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también incluyen derivados que están modificados, por ejemplo, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo, de manera que la unión covalente no evita que el anticuerpo se una específicamente a su epítopo

55 cognado. Por ejemplo, pero no como limitación, los derivados del anticuerpo incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización con grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de varias modificaciones químicas puede llevarse a cabo por técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitado a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el

60 derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención no desencadenarán una respuesta inmunitaria perjudicial en el animal que se va a tratar, por ejemplo, en un ser humano. En ciertas realizaciones, las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, o fragmentos de unión

5 a antígeno de los mismos de la invención derivan de un paciente, por ejemplo, un paciente humano y se usan posteriormente en la misma especie de la que derivan, por ejemplo, ser humano, aliviando o minimizando la aparición de respuestas inmunitarias perjudiciales.

La des-inmunización también puede usarse para disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Tal y como se usa

10 en el presente documento, el término “des-inmunización” incluye la alteración de un anticuerpo para modificar los epítopos de las células T (véanse, por ejemplo, los documentos WO9852976A1, WO0034317A2). Por ejemplo, se analizan las secuencias de VH y VL del anticuerpo de partida y se “mapea” un epítopo de células T humano para cada región V que muestra la localización de los epítopos respecto a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Los epítopos de células T individuales

15 procedentes del mapa de epítopos de células T se analizan con el fin de identificar sustituciones de aminoácidos alternativas con un riesgo bajo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se diseña una gama de secuencias de VH y VL alternativas que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias se incorporan posteriormente en una gama de polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de neoepítopo o fragmentos inmunoespecíficos de los mismos para usarse en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento

20 descritos en el presente documento, que se ensayan entonces para función. Típicamente, se generan y ensayan entre 12 y 24 anticuerpos variantes. Los genes de cadena pesada y ligera completos que comprenden regiones modificadas V y C humanas se clonan en vectores de expresión y los plásmidos posteriores se introducen en líneas celulares para la producción de anticuerpos completos. Los anticuerpos se comparan a continuación en ensayos bioquímicos y biológicos apropiados y se identifica la variante óptima.

25 Pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de presentación en fagos o una combinación de las mismas. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridoma incluyendo aquellas conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold

30 Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. (1988); Hammerling y col., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981). La expresión “anticuerpo monoclonal” tal y como se usa en el presente documento no está limitado a anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridoma. La expresión “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que deriva de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no al procedimiento por el que se produce. De este modo, la expresión “anticuerpo monoclonal” no está

35 limitada a anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención se derivan de células B humanas que se han inmortalizado mediante transformación con el virus de Epstein-Barr, como se describe en el presente documento.

40 En el proceso muy conocido de hibridoma (Kohler y col., Nature 256: 495 (1975)) los linfocitos con una vida relativamente corta o mortales de un mamífero, por ejemplo, células B derivadas de un sujeto humano como se describe en el presente documento, se fusionan con una línea celular tumoral inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma), produciendo de este modo células híbridas o “hibridomas” que son tanto inmortales como capaces de producir el anticuerpo codificado genéticamente de la célula B. Los híbridos resultantes se segregan en

45 cepas genéticas únicas por selección, dilución y recrecimiento comprendiendo cada cepa individual genes específicos para la formación de un único anticuerpo. Producen anticuerpos que son homogéneos frente a un antígeno deseado y, respecto a su linaje genético puro, se denominan "monoclonales".

Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que

50 contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma no fusionadas, parentales. Los expertos en la materia entenderán que los reactivos, líneas celulares y medios para la formación, selección y crecimiento de los hibridomas están disponibles en el mercado a partir de varias fuentes y protocolos estandarizados muy establecidos. Generalmente, el medio de cultivo en el que se crecen las células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales contra el antígeno deseado. La

55 especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por ensayos in vitro tales como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoadsorbente ligado a enzima (ELISA) o ensayos de unión a neoepítopo como se describe en el presente documento. Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer por procedimientos

60 estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, págs. 59-103 (1986)). Se

apreciará, además, que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden separarse del medio de cultivo, fluido ascítico o suero por procedimientos de purificación convencionales tales como, por ejemplo, proteína-A, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

5 Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse de forma recombinante o por escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.

10 Los anticuerpos completamente humanos, tales como los descritos en el presente documento, son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden prepararse por diversos procedimientos conocidos en la técnica incluyendo procedimientos de presentación en fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Véase

15 también, las patentes de Estados Unidos No. 4.444.887 y 4.716.111; y publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741. Los anticuerpos humanos de la presente invención se aíslan, por ejemplo, de pacientes que no tienen síntomas, pero que presentan el riesgo de desarrollar un trastorno, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer o un paciente con el trastorno, pero con una evolución de la enfermedad excepcionalmente estable.

20 En otra realización, el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales deseados puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma aisladas y subclonadas sirven como una fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN

25 puede colocarse en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped procariotas o eucariotas tales como, pero no limitado a, células de E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) o células de mieloma que, de lo contrario, no producen las inmunoglobulinas. Más particularmente, el ADN aislado (que puede ser sintético como se describe en el presente documento) puede usarse para clonar secuencias de región constante y variable para la fabricación de anticuerpos como se describe en Newman y col.,

30 patente de Estados Unidos No, 5.658.570, presentada el 25 de enero de 1995. Esencialmente, esto conlleva la extracción de ARN de las células seleccionadas, conversión a ADNc y amplificación por PCR usando cebadores específicos de Ig. Los cebadores adecuados para este propósito también se describen en la patente de Estados Unidos No. 5.658.570. Como se describirá con más detalle más adelante, las células transformadas que expresan el anticuerpo deseado pueden hacerse crecer en cantidades relativamente grandes para proporcionar suministros

35 clínicos y comerciales de la inmunoglobulina.

En una realización específica, la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de la cadena pesada y/o ligera pueden inspeccionarse para identificar las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) por procedimientos que son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, por comparación con secuencias de 40 aminoácidos conocidas de otras regiones variables de la cadena pesada y ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad de secuencia. Usando técnicas de ADN recombinante rutinarias, una o más de las CDR pueden insertarse en regiones marco, por ejemplo, en regiones marco humanas. Las regiones marco pueden ser naturales o regiones marco consenso y preferentemente regiones marco humanas (véase, por ejemplo, Chothia y col., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) para una lista de regiones marco humanas). En ciertas realizaciones, el polinucleótido 45 generado por la combinación de las regiones marco y CDR codifica un anticuerpo que se une específicamente al menos a un epítopo de un polipéptido deseado. En ciertas realizaciones, pueden hacerse una o más sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones marco, por ejemplo, para mejorar la unión del anticuerpo a su antígeno. Adicionalmente, dichos procedimientos pueden usarse para realizar sustituciones o deleciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro intracadena para generar

50 moléculas de anticuerpo que carecen de uno o más enlaces disulfuro intracadena. Otras alteraciones en el polinucleótido están abarcadas por la presente invención y se encuentran dentro del alcance de la técnica.

Como alternativa, pueden adaptarse las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente de Estados Unidos No. 4.694.778; Bird, Science 242: 423-442 (1988); Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci.

55 EE. UU. 85: 5879-5883 (1988); y Ward y col., Nature 334: 544-554 (1989)) para producir anticuerpos de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman por la unión de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv mediante un puente de aminoácido, dando como resultado un anticuerpo de cadena sencilla. También pueden usarse las técnicas para el ensamblaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra y col., Science 242: 1038-1041 (1988)).

En otra realización, los linfocitos pueden seleccionarse por micromanipulación y aislarse los genes variables. Por ejemplo, pueden aislarse células mononucleares de sangre periférica de un mamífero inmunizado o naturalmente inmune, por ejemplo, un ser humano, y cultivarse durante aproximadamente 7 días in vitro. Los cultivos pueden cribarse para IgG específicas que cumplan los criterios del cribado. Las células de pocillos positivos pueden aislarse.

5 Las células B productoras de Ig individuales pueden aislarse por FACS o identificándolas en un ensayo en placa hemolítico mediado por complemento. Las células B productoras de Ig pueden micromanipularse en un tubo y los genes VH y VL pueden amplificarse usando, por ejemplo, RT-PCR. Los genes VH y VL pueden clonarse en un vector de expresión de anticuerpo y transferirse a células (por ejemplo, células eucariotas o procariotas) para expresión.

10 Como alternativa, las líneas celulares productoras de anticuerpos pueden seleccionarse y cultivarse usando técnicas muy conocidas para el experto en la materia. Dichas técnicas se describen en diversos manuales de laboratorio y publicaciones importantes. A este respecto, las técnicas adecuadas para uso en la invención como se describe más adelante se describen en Current Protocols in Immunology, Coligan y col., Eds., Green Publishing Associates and

15 Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, Nueva York (1991).

Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, por síntesis química o, preferentemente, por técnicas de expresión recombinante como se describe en el presente documento.

20 En una realización, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la invención comprende una región constante sintética en la que uno o más dominios están parcialmente o totalmente eliminados (“anticuerpos con dominio eliminado”). En ciertas realizaciones, los anticuerpos modificados compatibles comprenderán construcciones o variantes con dominio eliminado en los se ha eliminado el dominio CH2 entero

25 (construcciones ∆CH2). Para otras realizaciones, puede utilizarse un péptido conector corto para sustituir el dominio eliminado para proporcionar flexibilidad y libertad de movimiento a la región variable. Los expertos en la materia entenderán que dichas construcciones son particularmente preferidas debido a las propiedades reguladoras del dominio CH2 en la velocidad catabólica del anticuerpo. Las construcciones con dominio eliminado pueden derivarse usando un vector que codifica un dominio constante humano de IgG1 (véase, por ejemplo, los documentos WO

30 02/060955 A2 y WO02/096948A2). Este vector se genomanipula para eliminar el dominio CH2 y proporcionar un vector sintético que expresa una región constante de IgG1 con dominio eliminado.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la presente invención son minicuerpos. Los minicuerpos pueden prepararse usando procedimientos descritos en la

35 técnica (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.837.821 o WO 94/09817A1).

En una realización, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la invención comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene deleción o sustitución de unos pocos o incluso un único aminoácido, siempre que permita la asociación entre las subunidades monoméricas. Por ejemplo, la mutación 40 de un único aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión de Fc y de esta manera incrementar la localización tumoral. De manera similar, puede ser deseable eliminar simplemente la parte de uno o más dominios de región constante que controla la función efectora (por ejemplo, unión del complemento) que se va a modular. Dichas deleciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar características seleccionadas del anticuerpo (semivida sérica) mientras deja otras funciones deseables 45 asociadas con el dominio de región constante sujeto intactas. Además, como se ha aludido anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden ser sintéticas mediante la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que intensifica el perfil de la construcción resultante. A este respecto, puede ser posible alterar la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ejemplo, unión de Fc) mientras se mantiene sustancialmente la configuración y perfil inmunógeno del anticuerpo modificado. Otras realizaciones más

50 comprenden la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para aumentar características deseables tales como función efectora o proporcionar más unión de citotoxina o carbohidrato. En dichas realizaciones, puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas derivadas de dominios de región constante seleccionados.

La presente invención también proporciona anticuerpos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten

55 en variantes (incluyendo derivados) de moléculas de anticuerpo (por ejemplo, las regiones VH y/o regiones VL) descritas en el presente documento, uniéndose inmunoespecíficamente estos anticuerpos o fragmentos de los mismos a un polipéptido asociado con un trastorno o fragmento o variante del mismo. Las técnicas estándar conocidas para los expertos en la materia pueden usarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, incluyendo, pero no limitado a, mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR

60 que dan como resultado sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, las variantes (incluyendo derivados)

codifican menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos 5 o menos de 2 sustituciones de aminoácidos respecto a la región VH de referencia, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, región VL, VL-CDR1, VL-CDR2 o VL-CDR3. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, 10 histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Como alternativa, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente

15 a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden cribarse para actividad biológica para identificar los mutantes que conservan la actividad (por ejemplo, la capacidad de unirse a un polipéptido asociado con un trastorno).

Por ejemplo, es posible introducir mutaciones sólo en las regiones marco o sólo en regiones CDR de una molécula

20 de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser mutaciones silenciosas o sustitutivas neutras, es decir, no tienen ningún efecto o tienen poco efecto sobre la capacidad de un anticuerpo de unirse al antígeno, de hecho, algunas de dichas mutaciones no alteran la secuencia de aminoácidos de ninguna manera. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones o mejorar la producción de anticuerpos de un hibridoma. Las regiones codificantes con codones optimizados que codifican los anticuerpos de la presente

25 invención se describen en otro lugar del presente documento. Como alternativa, las mutaciones sustitutivas no neutras pueden alterar la capacidad de un anticuerpo de unirse al antígeno. La localización de la mayor parte de las mutaciones silenciosas y sustitutivas neutras probablemente sea en las regiones marco, mientras que la localización de la mayor parte de las mutaciones sustitutivas no neutras probablemente sea en CDR, aunque esto no es un requisito absoluto. Un experto en la materia será capaz de diseñar y ensayar moléculas mutantes con propiedades

30 deseadas tales como ausencia de alteración en la actividad de unión al antígeno o alteración en la actividad de unión (por ejemplo, mejoras en la actividad de unión al antígeno o cambio en la especificidad del anticuerpo). Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de forma rutinaria y la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada (por ejemplo, la capacidad de unirse inmunoespecíficamente al menos a un epítopo de un polipéptido asociado con un trastorno) puede determinarse usando técnicas descritas en el presente

35 documento o modificando rutinariamente técnicas conocidas en la técnica.

IV. Polinucleótidos que codifican anticuerpos

De acuerdo con lo anterior, la presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica una molécula de

40 unión de la presente invención, por ejemplo, un anticuerpo. En el caso del anticuerpo, el polinucleótido puede codificar al menos una región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo descrito anteriormente. El polinucleótido de la invención que codifica el anticuerpo descrito anteriormente, puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, ARN o ADN o ARN producido sintéticamente o una molécula de ácido nucleico quimérico producida de forma recombinante que comprende cualquiera de estos polinucleótidos bien solo o en combinación. Preferentemente,

45 dicho polinucleótido es parte de un vector. Dichos vectores pueden comprender genes adicionales tales como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula huésped adecuada y en condiciones adecuadas. Preferentemente, el polinucleótido de la invención está unido de manera operativa a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células procariotas o eucariotas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido en un ARNm que se puede traducir. Los elementos

50 reguladores que garantizan la expresión en células eucariotas, preferentemente células de mamífero, son muy conocidos para los expertos en la materia. Habitualmente comprenden secuencias reguladoras que garantizan el inicio de la transcripción y opcionalmente señales poli-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores de la transcripción, así como de la traducción y/o regiones promotoras asociadas de forma natural o heterólogas.

55 Un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado, o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por ADN mono y bicatenario, ADN que es

60 una mezcla de regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones mono

y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o una mezcla de regiones mono y bicatenarias. Además, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o

5 fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo también puede contener una o más bases modificadas o cadenas principales de ADN o ARN modificadas para estabilidad o por otras razones. Bases “modificadas” incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Pueden hacerse diversas modificaciones en el ADN y ARN; de este modo, "polinucleótido" engloba las formas modificadas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente.

10 Puede crearse un polinucleótido aislado que codifica una variante no natural de un polipéptido derivado de una inmunoglobulina (por ejemplo, una parte de cadena pesada o parte de cadena ligera de inmunoglobulina) introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la inmunoglobulina de manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en

15 la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse por técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Preferentemente, se hacen sustituciones de aminoácidos conservativas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales.

Como es bien conocido, el ARN puede aislarse de las células de hibridoma originales o de otras células

20 transformadas por técnicas estándar, tales como extracción con isotiocianato de guanidinio y precipitación seguida de centrifugación o cromatografía. Cuando es deseable, el ARNm puede aislarse del ARN total por técnicas estándar tales como cromatografía en oligo dT celulosa. Las técnicas adecuadas son familiares en la técnica.

En una realización, los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo pueden prepararse, bien

25 simultáneamente o por separado, usando transcriptasa inversa y ADN polimerasa según procedimientos muy conocidos. La PCR puede iniciarse con cebadores de región constante consenso o con cebadores más específicos basados en las secuencias publicadas de ADN y aminoácidos de la cadena pesada y ligera. Como se ha descrito anteriormente, también puede usarse PCR para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo. En este caso, las bibliotecas pueden cribarse con cebadores consenso o sondas homólogas mayores,

30 tales como sondas de región constante de ratón.

El ADN, típicamente ADN plasmídico, puede aislarse de las células usando técnicas conocidas en la técnica, mapearse por restricción y secuenciarse según técnicas estándar muy conocidas mostradas con detalle, por ejemplo, en las referencias anteriores referentes a técnicas de ADN recombinante. Por supuesto, el ADN puede ser

35 sintético de acuerdo con la presente invención en cualquier punto durante el proceso de aislamiento o análisis posterior.

La presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL), que tiene

40 secuencias polipeptídicas VL-CDR1, VL-CDR2 o VL-CDR3 mostradas en la tabla 4.

La presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH), en la que las regiones VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 tienen secuencias polipeptídicas que son idénticas a los grupos VH

45 CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 mostrados en la tabla 4.

Tabla 5: Secuencias polinucleotídicas de la región VH de anticuerpos específicos de Abeta.

Anticuerpo

Secuencia de cadena pesada variable

NI-101.11 (SEQ ID NO:56)

NI-101.11 (SEQ ID NO:5) (optimizada con codón)

NI-101.12F 6A (SEQ ID NO:38)

Tabla 6: Secuencias polinucleotídicas de la región VL de anticuerpos específicos de Abeta.

Anticuerpo

Secuencia de cadena ligera variable (kappa o lambda)

NI-101.11 (SEQ ID NO:7)

NI-101.12F 6A (SEQ ID NO:40)

A este respecto, el experto en la materia apreciará fácilmente que los polinucleótidos que codifican al menos el dominio variable de la cadena ligera y/o pesada pueden codificar los dominios variables de ambas cadenas de inmunoglobulina o sólo una. Asimismo, dichos polinucleótidos pueden estar bajo el control del mismo promotor o pueden estar controlados por separado para expresión. Los elementos reguladores posibles que permiten la 5 expresión en células huésped procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor PL, lac, trp o tac en E. coli y los ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1

o GAL1 en levadura o el promotor CMV, SV40, RSV, potenciador CMV, potenciador SV40 o un intrón de globina en células de mamíferos y otros animales. Además de los elementos que son responsables del inicio de la transcripción, dichos elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, 10 tales como el sitio poli-A de SV40 o el sitio poli-A de tk, cadena abajo del polinucleótido. Además, dependiendo del sistema de expresión usado, pueden añadirse a la secuencia codificante del polinucleótido de la invención secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido a un compartimento celular o secretarlo al medio y son muy conocidas en la técnica. La o las secuencias líderes se ensamblan en la fase apropiada con las secuencias de traducción, inicio y terminación y, preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína 15 traducida, o una parte de ésta, al espacio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación C o N-terminal que confiere características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. En este contexto, en la técnica se conocen vectores de expresión adecuados tales como vector de expresión de ADNc Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) o 20 pSPORT1 (GIBCO BRL). Preferentemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas de promotor eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas, pero también pueden usarse secuencias de control para huéspedes procariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para un alto nivel de expresión de las secuencias nucleotídicas y, si se desea, puede seguir la recogida y purificación de las cadenas ligeras, cadenas pesadas,

25 dímeros de cadena ligera/pesada de inmunoglobulina o anticuerpos intactos, fragmentos de unión u otras formas de inmunoglobulina; véase, Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979).

La presente invención también incluye fragmentos de los polinucleótidos de la invención, como se describe en otra parte. Adicionalmente, los polinucleótidos que codifican polinucleótidos de fusión, fragmentos Fab y otros derivados,

30 como se describe en el presente documento, también están contemplados por la invención.

Los polinucleótidos pueden producirse o fabricarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, si la secuencia nucleotídica del anticuerpo es conocida, puede ensamblarse un polinucleótido que codifica el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier y col.,

35 BioTechniques 17: 242 (1994)), que, en resumen, implica la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen partes de la secuencia que codifica el anticuerpo, hibridar y ligar estos oligonucleótidos y amplificar los oligonucleótidos ligados por PCR.

Como alternativa, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado

40 del mismo puede generarse a partir de un ácido nucleico de una fuente adecuada. Si no está disponible un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, un ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede sintetizarse químicamente u obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, preferentemente ARN poli A+, aislado a partir de cualquier tejido o células que expresan el

45 anticuerpo específico de neoantígeno, tal como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) por amplificación por PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridar con los extremos 3' y 5' de la secuencia o por clonación usando una sonda oligonucleotídica específica para la secuencia génica particular que se quiere identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse en vectores de clonación replicables usando cualquier

50 procedimiento bien conocido en la técnica.

Una vez que se ha determinado la secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos correspondiente del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, su secuencia de nucleótidos puede manipularse usando procedimientos muy conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de

55 nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) y Ausubel y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo, para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.

V. Expresión de polipéptidos de anticuerpo

La presente invención también implica un procedimiento para producir células capaces de expresar un anticuerpo de la invención o su o sus cadenas de inmunoglobulina correspondientes que comprende modificar células por

5 ingeniería genética con el polinucleótido o con el vector de la invención. Las células que se pueden obtener con el procedimiento de la invención pueden usarse, por ejemplo, para ensayar la interacción del anticuerpo de la invención con su antígeno.

Después de la manipulación del material genético aislado para proporcionar anticuerpos, o fragmentos de unión a

10 antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos se insertan típicamente en un vector de expresión para introducción en células huésped que pueden usarse para producir la cantidad deseada de anticuerpo.

En el presente documento, se describe la expresión recombinante de un anticuerpo, o fragmento, derivado o

15 análogo del mismo, por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que se une a una molécula diana. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o parte del mismo (que preferentemente contiene el dominio variable de cadena pesada o ligera) de la invención, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse por tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en a técnica. De este modo, los procedimientos para preparar una

20 proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo se describen en el presente documento. Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de anticuerpo y señales apropiadas de control de la transcripción y la traducción. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La invención

25 proporciona, por lo tanto, vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, o un dominio variable de cadena pesada o ligera, unida de manera operativa a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 86/05807; la publicación PCT WO 89/01036; y la patente de Estados Unidos No. 5.122.464) y el dominio

30 variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector para expresión de la cadena pesada o ligera completa.

La presente invención se refiere a vectores, particularmente plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos usados convencionalmente en ingeniería genética que comprenden un polinucleótido que codifica el antígeno o preferentemente un dominio variable de una cadena de inmunoglobulina de un anticuerpo de la invención; 35 opcionalmente en combinación con un polinucleótido de la invención que codifica el dominio variable de la otra cadena de inmunoglobulina del anticuerpo de la invención. Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión y/o un vector de transferencia de genes o de direccionamiento. Los vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adeno-asociados, virus del herpes o virus del papiloma bovino pueden usarse para la administración de los polinucleótidos o vector de la invención en la población celular diana. Pueden usarse 40 procedimientos que son muy conocidos para los expertos en la materia para construir vectores virales recombinantes; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). Como alternativa, los polinucleótidos y vectores de la invención pueden reconstituirse en liposomas para la administración a las células diana. Los vectores que contienen los 45 polinucleótidos de la invención (por ejemplo, los dominios variables de las cadenas pesadas y/o ligeras de las cadenas de inmunoglobulina que codifican secuencias y secuencias de control de la expresión) pueden transferirse a la célula huésped por procedimientos muy conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza habitualmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación pueden usarse para otros huéspedes celulares; véase

50 Sambrook, anteriormente.

El término "vector" o "vector de expresión" se usa en el presente documento para significar vectores usados de acuerdo con la presente invención como un vehículo para introducir en y expresar un gen deseado en una célula huésped. Como conocen los expertos en la materia, dichos vectores pueden seleccionarse fácilmente de entre el

55 grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente invención comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción apropiados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad de entrar y/o replicarse en células eucariotas o procariotas.

Para los fines de esta invención, pueden emplearse numerosos sistemas de vectores de expresión. Por ejemplo, 60 una clase de vector utiliza elementos de ADN que se derivan de virus animales tales como virus de papiloma bovino,

virus de polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios de unión a ribosomas internos. Además, las células que han integrado el ADN en sus cromosomas pueden seleccionarse introduciendo uno o más marcadores que permitan la selección de las células huésped transfectadas. El marcador puede proporcionar prototrofía a un huésped auxótrofo,

5 resistencia a biocidas (por ejemplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados tales como cobre. El gen del marcador seleccionable puede unirse directamente a las secuencias de ADN que se van a expresar o introducirse en la misma célula por cotransformación. También pueden necesitarse elementos adicionales para la síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias señal, señales de splicing, así como promotores, potenciadores y señales de terminación de la transcripción.

10 En realizaciones particularmente preferidas, los genes de región variable clonados se insertan en un vector de expresión junto con los genes de la región constante de la cadena pesada y ligera (preferentemente humanos) sintéticos como se ha descrito anteriormente. En una realización, esto se efectúa usando un vector de expresión patentado de Biogen IDEC, Inc., denominado NEOSPLA (descrito en la patente de Estados Unidos 6.159.730). Este

15 vector contiene el promotor/potenciador de citomegalovirus, el promotor principal de beta-globina de ratón, el origen de replicación de SV40, la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, el exón 1 y exón 2 de la neomicina fosfotransferasa, el gen de la dihidrofolato reductasa y secuencia líder. Se ha descubierto que este vector da como resultado un nivel de expresión muy alto de anticuerpos después de la incorporación de los genes de la región variable y constante, transfección en células CHO, seguida de selección en medio que contiene G418 y

20 amplificación con metotrexato. Por supuesto, puede usarse en la presente invención cualquier vector de expresión que sea capaz de desencadenar la expresión en células eucariotas. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen, pero no están limitados a, los plásmidos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 y pZeoSV2 (disponibles de Invitrogen, San Diego, CA) y el plásmido pCI (disponible de Promega, Madison, WI). En general, el cribado de grandes números de células

25 transformadas para aquellas que expresan niveles adecuadamente altos de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina es experimentación rutinaria que puede llevarse a cabo, por ejemplo, con sistemas robóticos. Los sistemas de vectores también se enseñan en las patentes de Estados Unidos No. 5.736.137 y 5.658.570, cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad en el presente documento. Este sistema proporciona altos niveles de expresión, por ejemplo, > 30 pg/célula/día. Otros sistemas de vectores ejemplares se describen, por

30 ejemplo, en la patente de Estados Unidos 6.413.777.

En otras realizaciones preferidas, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden expresarse usando construcciones policistrónicas tales como las descritas en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2003-0157641 A1, presentada el 18 de noviembre de 35 2002. En estos novedosos sistemas de expresión, pueden producirse múltiples productos génicos de interés tales como cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos a partir de una única construcción policistrónica. Estos sistemas usan ventajosamente un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para proporcionar niveles relativamente altos de anticuerpos. Las secuencias IRES compatibles se describen en la patente de Estados Unidos No. 6.193.980. Los expertos en la materia apreciarán que dichos sistemas de expresión pueden usarse para producir eficazmente la

40 gama completa de anticuerpos descrita en la presente solicitud.

Más generalmente, una vez que se ha preparado el vector o secuencia de ADN que codifica una subunidad monomérica del anticuerpo, el vector de expresión puede introducirse en una célula huésped apropiada. La introducción del plásmido en la célula huésped puede conseguirse por varias técnicas muy conocidas para los 45 expertos en la materia. Éstas incluyen, pero no están limitadas a, transfección (incluyendo electroforesis y electroporación), fusión de protoplastos, precipitación con fosfato de calcio, fusión celular con ADN envuelto, microinyección e infección con virus intactos. Véase, Ridgway, A.A.G. "Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds., Butterworths, Boston, Mass., Capítulo 24.2, p. 470-472 (1988). Típicamente, la introducción de plásmidos en el huésped es mediante electroporación. Las células huésped que albergan la

50 construcción de expresión se hacen crecer en condiciones apropiadas para la producción de las cadenas ligeras y cadenas pesadas y se ensayan para la síntesis de proteínas de cadena pesada y/o ligera. Las técnicas de ensayo ejemplares incluyen ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o análisis de separación celular activada por fluorescencia (FACS), inmunohistoquímica y similares.

55 El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo para uso en los procedimientos descritos en el presente documento. De este modo, la invención incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención o una cadena pesada o ligera del mismo, unido de manera operativa a un promotor heterólogo. En realizaciones preferidas para la expresión de anticuerpos

60 de cadena doble, los vectores que codifican tanto las cadenas pesada como ligera pueden co-expresarse en la

célula huésped para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla más adelante.

La presente invención se refiere, además, a células huésped transformadas con un polinucleótido o vector de la invención. Dicha célula huésped puede ser una célula procariota o eucariota. El polinucleótido o vector de la 5 invención, que está presente en la célula huésped, puede integrarse en el genoma de la célula huésped o puede mantenerse extracromosómicamente. La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota, tal como una célula bacteriana, de insecto, fúngica, vegetal, animal o humana. Las células fúngicas preferidas son, por ejemplo, aquellas del género Saccharomyces, en particular aquellas de la especie S. cerevisiae. El término “procariota” pretende incluir todas las bacterias que pueden transformarse o transfectarse con una molécula de ADN 10 o ARN para la expresión de un anticuerpo de la invención o las cadenas de inmunoglobulina correspondientes. Los huéspedes procariotas pueden incluir bacterias gram negativas, así como gram positivas tales como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. El término "eucariota" pretende incluir células de levadura, planta superior, de insecto y preferentemente de mamífero, de la manera más preferente células HEK 293, NSO y CHO. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los anticuerpos 15 o cadenas de inmunoglobulina, codificados por el polinucleótido de la presente invención pueden estar glicosilados o no glicosilados. Los anticuerpos de la invención o las cadenas de inmunoglobulina correspondientes también pueden incluir un residuo inicial del aminoácido metionina. Un polinucleótido de la invención puede usarse para transformar

o transfectar el huésped usando cualquiera de las técnicas conocidas habitualmente por los expertos en la materia. Además, los procedimientos para preparar genes fusionados, unidos de manera operativa y expresarlos, por 20 ejemplo, en células de mamífero y bacterias son muy conocidos en la técnica (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las construcciones genéticas y los procedimientos descritos en ella pueden utilizarse para la expresión del anticuerpo de la invención o las cadenas de inmunoglobulina correspondientes en huéspedes eucariotas o procariotas. En general, se usan los vectores de expresión que contienen secuencias promotoras que facilitan la transcripción eficaz del polinucleótido insertado en 25 relación con el huésped. El vector de expresión contiene típicamente un origen de replicación, un promotor y un terminador, así como genes específicos que son capaces de proporcionar la selección fenotípica de las células transformadas. Las células fuente adecuadas para las secuencias de ADN y las células huésped para la expresión y secreción de inmunoglobulinas pueden obtenerse de varias fuentes, tal como la American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", Quinta edición (1985) Rockville, Maryland, EEUU. Además, pueden

30 usarse animales transgénicos, preferentemente mamíferos, que comprenden células de la invención, para la producción a gran escala del anticuerpo de la invención.

De este modo, en una realización adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de una molécula de unión específica de una proteína asociada con un trastorno, por ejemplo, un anticuerpo o un

35 fragmento de unión o una o más cadenas de inmunoglobulina del mismo, comprendiendo dicho procedimiento

(a)

cultivar una célula tal como se ha descrito anteriormente; y

(b)

aislar dicho antígeno, molécula de unión, anticuerpo o fragmento de unión o una o más cadenas de inmunoglobulina del mismo a partir del cultivo.

40 Los huéspedes transformados pueden hacerse crecer en fermentadores y cultivarse según técnicas conocidas en la técnica para conseguir un crecimiento celular óptimo. Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligera y pesada individuales, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención, pueden purificarse según procedimientos estándar de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas

45 de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares; véase, Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982). El anticuerpo o sus una o más cadenas de inmunoglobulina correspondientes de la invención pueden aislarse del medio de crecimiento, lisados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y purificación, por ejemplo, de anticuerpos expresados recombinantemente o cadenas de inmunoglobulina de la invención puede ser por cualquier medio convencional, tal como, por ejemplo, separaciones

50 cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como aquellas que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra la región constante del anticuerpo de la invención. Será evidente para los expertos en la materia que los anticuerpos de la invención pueden acoplarse adicionalmente a otros restos, por ejemplo, para aplicaciones de direccionamiento de fármaco o formación de imágenes. Dicho acoplamiento puede realizarse químicamente después de la expresión del anticuerpo o antígeno en el sitio de la

55 unión o el producto de acoplamiento puede prepararse por ingeniería en el anticuerpo o antígeno de la invención a nivel de ADN. Los ADN se expresan en un sistema huésped adecuado y las proteínas expresadas se recogen y renaturalizan, si es necesario.

Se prefieren las inmunoglobulinas sustancialmente puras con al menos aproximadamente del 90 al 95% de 60 homogeneidad y de la forma más preferida del 98 al 99% o más de homogeneidad, para usos farmacéuticos. Una

vez purificados, parcialmente o hasta homogeneidad según se desee, los anticuerpos pueden usarse terapéuticamente (incluyendo extracorpóreamente) o en el desarrollo y realización de procedimientos de ensayo.

La célula huésped puede co-transfectarse con dos vectores de expresión de la invención, codificando el primer

5 vector un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la misma expresión de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Como alternativa, puede usarse un único vector que codifica los dos polipéptidos, de cadena pesada y ligera. En dichas situaciones, la cadena ligera se sitúa ventajosamente antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature

10 322: 52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 77: 2197 (1980)). Las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Tal y como se usa en el presente documento, “células huésped” se refiere a células que albergan vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un gen heterólogo. En las

15 descripciones de los procesos para el aislamiento de anticuerpos a partir de huéspedes recombinantes, los términos “célula” y “cultivo celular” se usan indistintamente para indicar la fuente del anticuerpo a no ser que se especifique claramente otra cosa. En otras palabras, la recuperación del polipéptido de las “células” puede significar bien a partir de la centrifugación de las células completas o del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

20 Puede utilizarse diversos sistemas de huésped-vector de expresión para expresar moléculas de anticuerpo para uso en los procedimientos descritos en el presente documento. Dichos sistemas huésped-expresión representan vehículos por los cuales las secuencias codificantes de interés pueden producirse y purificarse posteriormente, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de nucleótidos

25 codificantes apropiadas, expresar una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Éstas incluyen pero no están limitadas a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de células de

30 insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BLK,

35 293, 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7,5 K del virus vaccinia). Preferentemente, se usan células bacterianas tales como Escherichia coli, y más preferentemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de molécula de anticuerpo recombinante completa, para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por

40 ejemplo, las células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), conjuntamente con un vector tal como el elemento promotor principal del gen intermedio temprano de citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking y col., Gene 45: 101 (1986); Cockett y col., Bio/Technology

8: 2 (1990)).

45 La línea celular huésped usada para la expresión de proteínas tiene frecuentemente un origen animal; los expertos en la materia están acreditados con la capacidad de determinar preferentemente las líneas celulares huésped particulares que son las más adecuadas para que se exprese en ellas el producto génico deseado. Las líneas celulares huésped ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, CHO (Ovario de Hámster Chino), DG44 y DUXB11 (líneas de Ovario de Hámster Chino, DHFR menos), HELA (carcinoma de cuello uterino humano), CVI

50 (línea de riñón de mono), COS (un derivado de CVI con antígeno T de SV40), VERY, BHK (riñón de cría de hámster), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblasto de hámster chino), BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón), HAK (línea de riñón de hámster), SP2/O (mieloma de ratón), P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-1c1BPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocito humano) y 293 (riñón humano). Se prefieren particularmente las células CHO. Las líneas celulares huésped están típicamente disponibles en servicios comerciales, la American Tissue Culture Collection o

55 en la bibliografía publicada.

Además, puede elegirse una cepa de célula huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas o que modifica y procesa el producto génico de la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la 60 función de la proteína. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el

procesamiento y modificación posteriores a la traducción de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas de huésped apropiados para garantizar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Para este fin, pueden usarse células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, glicosilación y fosforilación del producto génico.

5 Para la producción con alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden prepararse por ingeniería líneas celulares que expresan de forma estable la molécula de anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células huésped pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por

10 ejemplo, secuencias promotoras, potenciadoras, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, las células manipuladas genéticamente se hacen crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar focos que a su vez pueden clonarse y

15 expandirse a líneas celulares. Este procedimiento puede usarse ventajosamente para manipular genéticamente líneas celulares que expresan de manera estable la molécula de anticuerpo.

Pueden usarse una serie de sistemas de selección, incluyendo, pero no limitado a los genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler y col., Cell 11: 223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y 20 Szybalski, Proc. Natl. Acad, Sci. EE. UU. 48: 202 (1992)), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22: 817 1980) pueden emplearse en células tk-, hgprt-o aprt-, respectivamente. También, puede usarse resistencia a antimetabolitos como la base de la selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler y col., Natl. Acad. Sci. EE. UU. 77: 357 (1980); O'Hare y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 78: 1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad, Sci. EE. UU. 78: 2072 25 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, Biotherapy

3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIB TECH 11 (5): 155-215 (mayo, 1993); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y col., Gene 30: 147 (1984). Los procedimientos conocidos habitualmente en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel y

30 col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli y col. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin y col., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981).

35 Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden incrementarse por amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, Nueva York, Vol. 3. (1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es amplificable, el incremento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped incrementará el número de copias del gen marcador. Dado que la región

40 amplificada está asociada con el gen de anticuerpo, también se incrementará la producción del anticuerpo (Crouse y col., Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983)).

La producción in vitro permite el aumento de escala para proporcionar grandes cantidades de los polipéptidos deseados. Las técnicas para el cultivo de células de mamífero en condiciones de cultivo tisular son conocidas en la 45 técnica e incluyen cultivo en suspensión homogéneo, por ejemplo, en un reactor aireado o en un reactor con agitación continua, o cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas o microperlas de agarosa o cartuchos cerámicos. Si es necesario y/o se desea, las soluciones de polipéptidos pueden purificarse por los procedimientos de cromatografía habituales, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en DEAE-celulosa o cromatografía por (inmuno-)afinidad, por ejemplo, después de

50 la biosíntesis preferente de un polipéptido sintético de la región bisagra o antes de o posteriormente a la etapa de cromatografía HIC descrita en el presente documento.

Los genes que codifican los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden expresarse en células no de mamífero tales como células de bacterias o insecto o 55 levaduras o vegetales. Las bacterias que captan fácilmente ácidos nucleicos incluyen miembros de las enterobacteriaceae, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus y Haemophilus influenzae. Además, se apreciará que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos heterólogos típicamente se vuelven parte de cuerpos de inclusión. Los polipéptidos heterólogos deben aislarse, purificarse y ensamblarse en moléculas funcionales. Cuando se desean formas 60 tetravalentes de anticuerpos, las subunidades se auto-ensamblarán en anticuerpos tetravalentes (WO02/096948A2).

En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse ventajosamente una serie de vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que se está expresando. Por ejemplo, cuando se quiere producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una 5 molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no están limitados a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther y col., EMBO J. 2: 1791 (1983)), en el que la secuencia codificante del anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en marco con la región codificante lacZ, de manera que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye e Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 (1985); Van 10 Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509 (1989)); y similares. Los vectores pGEX también pueden usarse para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de las células lisadas por adsorción y unión a una matriz de glutatión-perlas de agarosa seguida de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión de la trombina o factor Xa proteasa de manera que el producto génico diana

15 clonado pueda liberarse del resto GST.

Además de los procariotas, también pueden usarse microbios eucariotas. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es el usado más habitualmente entre los microorganismos eucariotas, aunque una serie de cepas adicionales están disponibles habitualmente, por ejemplo, Pichia pastoris.

20 Para la expresión en Saccharomyces, se usa habitualmente el plásmido YRp7, por ejemplo (Stinchcomb, y col., Nature 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene 7: 141 (1979); Tschemper y col., Gene 10: 157 (1980)). Este plásmido contiene ya el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12 (1977)). La

25 presencia de la lesión trp1 como una característica del genoma de la célula huésped de levadura proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación por el crecimiento en ausencia de triptófano.

En un sistema de insecto, se usa típicamente el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia 30 codificante del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y ponerse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina).

Una vez que una molécula de anticuerpo de la invención se ha expresado de forma recombinante, puede purificarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por

35 ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico por Proteína A y cromatografía de tamaño en columna), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Como alternativa, un procedimiento preferido para incrementar la afinidad de los anticuerpos de la descripción se describe en el documento US 2002 0123057 A1.

40 VI. Proteínas de fusión y conjugados

Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender un dominio adicional, estando unido dicho dominio por enlaces covalentes o no covalentes. La unión puede estar basada en una fusión genética de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica y descritos anteriormente o puede realizarse, por ejemplo, por 45 entrecruzamiento químico como se describe, por ejemplo, en la solicitud internacional WO94/04686. El dominio adicional presente en la proteína de fusión que comprende el anticuerpo de la invención puede estar unido preferentemente por un enlazador flexible, ventajosamente un enlazador polipeptídico, en el que dicho enlazador polipeptídico comprende aminoácidos plurales, hidrófilos, unidos por enlace peptídico con una longitud suficiente como para abarcar la distancia entre el extremo C-terminal de dicho dominio adicional y el extremo N-terminal del 50 anticuerpo de la invención o viceversa. El agente activo terapéuticamente o en diagnóstico puede acoplarse alanticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo por varios medios. Éstos incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión de cadena sencilla que comprenden las regiones variables del anticuerpo de la invención acopladas por procedimientos covalentes, tales como enlaces peptídicos, al agente activo terapéuticamente o en diagnóstico. Los ejemplos adicionales incluyen moléculas que comprenden al menos un 55 fragmento de unión a antígeno acoplado a moléculas adicionales covalentemente o no covalentemente que incluyen aquellas en la lista siguiente ilustrativa no limitante. Traunecker, Int. J. Cancer Surp. SuDP 7 (1992), 51-52, describen el reactivo biespecífico janusina en el que la región Fv dirigida a CD3 está acoplada a CD4 soluble o a otros ligandos tales como OVCA e IL-7. De manera similar, las regiones variables del anticuerpo de la invención pueden construirse en moléculas Fv y acoplarse a ligandos alternativos tales como los ilustrados en el artículo 60 citado. Higgins, J. Infect Disease 166 (1992), 198-202, describió un anticuerpo hetero-conjugado compuesto por

OKT3 entrecruzado con un anticuerpo dirigido a una secuencia específica en la región V3 de GP120. Dichos anticuerpos hetero-conjugados también pueden construirse usando al menos las regiones variables contenidas en el anticuerpo de los procedimientos de la invención. Los ejemplos adicionales de anticuerpos específicos incluyen aquellos descritos por Fanger, Cancer Treat. Res. 68 (1993), 181-194 y por Fanger, Crit. Rev. Immunol. 12 (1992),

5 101-124.

En una realización adicional de la presente invención, la molécula de unión, anticuerpo, cadena de inmunoglobulina

o un fragmento de unión del mismo o el antígeno se etiqueta de forma detectable. Los agentes de etiquetado

pueden acoplarse bien directamente o indirectamente a los anticuerpos o antígenos de la invención. Un ejemplo de 10 acoplamiento indirecto es por el uso de un resto espaciador.

Por lo tanto, la actividad biológica de las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos identificados aquí sugiere que tienen una afinidad suficiente como para hacerles candidatos potenciales para la localización de fármacos en células que expresan las estructuras superficiales apropiadas de la célula y tejido enfermo, respectivamente. Este 15 direccionamiento y unión a células podría ser útil para la administración de agentes activos terapéuticamente o en diagnóstico y terapia génica/administración de genes. Las moléculas/partículas con un anticuerpo de la invención se unirán específicamente a células/tejidos que expresan la forma variante de la proteína patológica y, por lo tanto, podrían tener un uso diagnóstico y terapéutico. De este modo, la molécula de unión, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención puede etiquetarse (por ejemplo, fluorescente, 20 radiactivo, enzima, magnético nuclear, metal pesado) y usarse para detectar dianas específicas in vivo o in vitro incluyendo ensayos del tipo "inmunoquímica" in vitro. In vivo podrían usarse de una manera similar a técnicas de formación de imágenes en medicina nuclear para detectar tejidos, células u otro material que expresa el neoepítopo. De este modo, en una realización adicional, la presente invención se refiere al uso de una molécula de unión o un anticuerpo de la presente invención o fragmento de unión del mismo para la preparación de una composición para la

25 detección in vivo de o direccionamiento de un agente terapéutico y/o de diagnóstico de una proteína asociada con un trastorno en el cerebro, detectar, suprimir la formación de o reducir los agregados o conformaciones de proteína patológica en un sujeto, para mejorar la cognición o retrasar o revertir el deterioro cognitivo asociado con enfermedades o para la extracción extracorpórea de compuestos patológicos o sus precursores a partir de fluidos corporales.

30 En ciertas realizaciones, un polipéptido de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos o uno o más restos que normalmente no están asociados con un anticuerpo. Las modificaciones ejemplares se describen con más detalle más adelante. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo fv de cadena sencilla de la invención puede comprender una secuencia enlazadora flexible, o puede estar modificado para añadir un resto funcional (por

35 ejemplo, PEG, un fármaco, una toxina o una etiqueta).

Un polipéptido de anticuerpo de la invención puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una proteína de fusión. Las proteínas de fusión son moléculas quiméricas que comprenden, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina con al menos un sitio de unión diana y al menos una parte heteróloga, es decir,

40 una parte con la que no está unida naturalmente en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que se ponen en contacto en el polipéptido de fusión o que pueden existir normalmente en la misma proteína, pero están situadas en una nueva reorganización en el polipéptido de fusión. Las proteínas de fusión pueden crearse, por ejemplo, por síntesis química o creando y traduciendo un polinucleótido en el que las regiones del péptido están codificadas en la relación deseada.

45 El término "heterólogo" tal como se aplica a un polinucleótido o un polipéptido, significa que el polinucleótido o polipéptido se deriva de una entidad distinta de la del resto de la entidad con la que se está comparando. Por ejemplo, tal y como se usa en el presente documento, un "polipéptido heterólogo" que se va a fusionar a un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o análogo del mismo se deriva de un polipéptido no de

50 inmunoglobulina de la misma especie o un polipéptido de inmunoglobulina o no de inmunoglobulina de una especie diferente.

Como se describe con más detalle en otro lugar del presente documento, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden fusionarse, además, de forma recombinante a 55 un polipéptido heterólogo en el extremo N o C-terminal o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos pueden fusionarse

o conjugarse de forma recombinante a moléculas útiles como etiquetas en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidos o toxinas. Véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; patente de Estados Unidos No. 5.314.995; y EP

60 396.387.

Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden estar compuestos por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos, y pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. 5 Los anticuerpos pueden modificarse por procesos naturales, tales como procesamiento posterior a la traducción, o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Dichas modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una bibliografía de investigación voluminosa. Las modificaciones pueden producirse en cualquier lugar en el anticuerpo, incluyendo el núcleo peptídico, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o carboxilo, o en restos tales como 10 carbohidratos. Se entenderá que puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o grados distintos en varios sitios en un anticuerpo dado. También, un anticuerpo dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los anticuerpos pueden ser ramificados, por ejemplo, como resultado de ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los anticuerpos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos naturales posteriores a la traducción o pueden prepararse por procedimientos sintéticos. Las 15 modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido

o derivado lipídico, unión covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación,

20 miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación. (Véase, por ejemplo, Proteins -Structure And Molecular Properties, T.E. Creighton,

W.H. Freeman and Company, Nueva York, 2ª Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B.C.

Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, págs. 1-12 (1983); Seifter y col., Meth Enzymol 182: 626-646 (1990); 25 Rattan y col., Ann NY Acad Sci 663: 48-62 (1992)).

La presente invención también proporciona proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo y un polipéptido heterólogo. En una realización, una proteína de fusión de la invención comprende, consiste esencialmente en o consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de 30 aminoácidos de una cualquiera o más de las regiones VH de un anticuerpo de la invención o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera o más de las regiones VL de un anticuerpo de la invención o fragmentos o variantes de los mismos, y una secuencia polipeptídica heteróloga. En otra realización, una proteína de fusión para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento comprende, consiste esencialmente en o consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera, dos, tres de las VH-CDR 35 de un anticuerpo, o fragmentos, variantes o derivados del mismo, o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera, dos, tres de las VL-CDR de un anticuerpo, o fragmentos, variantes o derivados del mismo, y una secuencia polipeptídica heteróloga. En una realización, la proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una VH-CDR3 de un anticuerpo de la presente invención, o fragmento, derivado o variante del mismo, y una secuencia polipeptídica heteróloga, en el que la proteína de fusión se une específicamente al menos a 40 un neoepítopo de una proteína asociada a un trastorno. En otra realización, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos una región VH de un anticuerpo de la invención y la secuencia de aminoácidos de al menos una región VL de un anticuerpo de la invención o fragmentos, derivados o variantes de los mismos y una secuencia polipeptídica heteróloga. Preferentemente, las regiones VH y VL de la proteína de fusión corresponden a una única fuente de anticuerpo (o fragmento scFv o Fab) que se une 45 específicamente al menos a un neoepítopo de una proteína asociada a un trastorno. En otra realización más, una proteína de fusión para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera, dos, tres o más de las CDR de VH de un anticuerpo y la secuencia de aminoácidos de una cualquiera, dos, tres o más de las CDR de VL de un anticuerpo, o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia polipeptídica heteróloga. Preferentemente, dos,

50 tres, cuatro, cinco, seis o más de las VH-CDR o VL-CDR corresponden a una única fuente de anticuerpo (o fragmento scFv o Fab) de la invención. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas de fusión también están abarcadas por la invención.

Las proteínas de fusión ejemplares notificadas en la bibliografía incluyen fusiones del receptor de células T

55 (Gascoigne y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 84: 2936-2940 (1987)); CD4 (Capon y col., Nature 337: 525-531 (1989); Traunecker y col., Nature 339: 68-70 (1989); Zettmeissl y col., DNA Cell Biol. EE. UU. 9: 347-353 (1990); y Byrn y col., Nature 344: 667-670 (1990)); L-selectina (receptor de direccionamiento) (Watson y col., J. Cell. Biol. 110: 2221-2229 (1990); y Watson y col., Nature 349: 164-167 (1991)); CD44 (Aruffo y col., Cell 61: 1303-1313 (1990)); CD28 y B7 (Linsley y col., J. Exp. Med 173: 721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley y col., J. Exp. Med. 174: 561-569

60 (1991)); CD22 (Stamenkovic y col., Cell 66: 1133-1144 (1991)); receptor de TNF (Ashkenazi y col., Proc. Natl. Acad.

Sci. EE. UU. 88: 10535-10539 (1991); Lesslauer y col., Eur. J. Immunol. 27: 2883-2886 (1991); y Peppel y col., J. Exp. Med. 174: 1483-1489 (1991)); y receptor de IgE (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Resumen No. 1448 (1991)).

5 Como se describe en otro lugar del presente documento, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden fusionarse a polipéptidos heterólogos para incrementar la semivida in vivo de los polipéptidos o para uso en inmunoensayos usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización, puede conjugarse PEG con los anticuerpos de la invención para incrementar su semivida in vivo. Leong, S.R., y col., Cytokine 16: 106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54: 531 (2002); o Weir y col.,

10 Biochem. Soc. Transactions 30: 512 (2002).

Además, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden fusionarse a secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar su purificación o detección. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido hexa-histidina, tal como la marca

15 proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre otras, muchas de las cuales están disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona la purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras marcas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no están limitadas a, la marca "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson y col., Cell 37: 767 (1984)) y la marca "flag".

20 Las proteínas de fusión pueden prepararse usando procedimientos que son muy conocidos en la técnica (véanse por ejemplo las patentes de Estados Unidos No. 5.116.964 y 5.225.538). El sitio preciso en el que se hace la fusión puede seleccionarse empíricamente para optimizar las características de secreción o unión de la proteína de fusión. El ADN que codifica la proteína de fusión se transfiere a una célula huésped para expresión.

25 Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en forma no conjugada o pueden conjugarse con al menos una de diversas moléculas, por ejemplo, para mejorar las propiedades terapéuticas de la molécula, para facilitar la detección de la diana, o para formación de imágenes o terapia del paciente. Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden etiquetarse o conjugarse bien antes o

30 después de la purificación, cuando se realiza purificación.

En particular, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden conjugarse con agentes terapéuticos, profármacos, péptidos, proteínas, enzimas, virus, lípidos, modificadores de la respuesta biológica, agentes farmacéuticos o PEG.

35 Los conjugados que son inmunotoxinas incluyendo anticuerpos convencionales se han descrito ampliamente en la técnica. Las toxinas pueden acoplarse a los anticuerpos por técnicas de acoplamiento convencionales o se pueden producir inmunotoxinas que contienen partes de toxina proteica como proteínas de fusión. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse de una manera correspondiente para obtener dichas inmunotoxinas. Son

40 ilustrativas de dichas inmunotoxinas las descritas por Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 y por Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.

La proteína de fusión descrita anteriormente puede comprender además un enlazador escindible o sitio de escisión para proteinasas. Estos restos espaciadores, a su vez, pueden ser insolubles o solubles (Diener y col., Science 231

45 (1986), 148) y pueden seleccionarse para permitir la liberación de fármacos a partir del antígeno en el sitio diana. Los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden acoplarse a los anticuerpos y antígenos de la presente invención para inmunoterapia son fármacos, radioisótopos, lectinas y toxinas. Los fármacos que pueden conjugarse con los anticuerpos y antígenos de la presente invención incluyen compuestos que se denominan convencionalmente fármacos tales como mitomicina C, daunorrubicina y vinblastina. En el uso de anticuerpos o antígenos conjugados

50 radioisotópicamente de la invención, por ejemplo, para inmunoterapia, determinados isótopos pueden ser más preferibles que otros dependiendo de factores tales como distribución en leucocitos, así como estabilidad y emisión. Dependiendo de la respuesta autoinmunitaria, algunos emisores pueden ser preferibles respecto a otros. En general, para inmunoterapia se prefieren los radioisótopos que emiten partículas α y β. Los preferidos son los emisores de corto alcance y alta energía tales como 212Bi. Los ejemplos de radioisótopos que pueden unirse a los anticuerpos o

55 antígenos de la invención para fines terapéuticos incluyen, pero no están limitados a, 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 64Cu, 212Bi, 212At, 211Pb, 47Sc, 109Pd y 188Re. Otros agentes terapéuticos que pueden acoplarse a la molécula de unión, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, así como protocolos terapéuticos ex vivo e in vivo son conocidos o pueden averiguarse fácilmente por los expertos en la materia. Cuando sea apropiado, el experto en la materia puede usar un polinucleótido de la invención que codifica uno cualquiera de los anticuerpos,

60 antígenos o los vectores correspondientes descritos anteriormente en lugar del material proteináceo en sí mismo.

Los expertos en la materia apreciarán que los conjugados también pueden ensamblarse usando diversas técnicas dependiendo del agente seleccionado que se va a conjugar. Por ejemplo, los conjugados con biotina se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar un polipéptido de unión con un éster activado de biotina tal como el éster de N

5 hidroxisuccinimida de biotina. De manera similar, los conjugados con un marcador fluorescente pueden prepararse en presencia de un agente de acoplamiento, por ejemplo, aquellos listados en el presente documento, o por reacción con un isotiocianato, preferentemente fluoresceína-isotiocianato. Los conjugados de los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención se preparan de una manera análoga.

10 La presente invención abarca además anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención conjugados con un agente de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse en diagnóstico, por ejemplo, para monitorizar el desarrollo o progresión de una enfermedad neurológica como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un tratamiento y/o régimen de prevención dado. La detección puede facilitarse acoplando el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante

15 o derivado del mismo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales que emiten positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para uso como diagnósticos de acuerdo con la presente

20 invención. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, βgalactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes

25 incluyen luciferasa, luciferina y acuorina; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo también puede etiquetarse de forma detectable acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado con

30 quimioluminiscencia se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge en el transcurso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de etiquetado quimioluminiscentes particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Una de las formas en las que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede

35 etiquetarse de forma detectable es uniendo el mismo a una enzima y usando el producto unido en un inmunoensayo enzimático (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quaterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2: 1-7 (1978)); Voller y col., J. Clin. Pathol. 31: 507-520 (1978); Butler, J.E., Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. y col., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokio (1981). La enzima, que

40 está unida al anticuerpo reaccionará con un sustrato apropiado, preferentemente un sustrato cromógeno, de tal manera que produce un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorimétricos o visuales. Las enzimas que pueden usarse para etiquetar de forma detectable el anticuerpo incluyen, pero no están limitadas a, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, isomerasa delta-5-esteroide, alcohol deshidrogenasa de levaduras, alfa-glicerofosfato, deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano

45 picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. Adicionalmente, la detección puede conseguirse por procedimientos colorimétricos que emplean un sustrato cromógeno para la enzima. La detección también puede conseguirse por comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados de manera similar.

50 La detección también puede conseguirse usando cualquiera de diversos otros inmunoensayos. Por ejemplo, etiquetando de forma radiactiva el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, es posible detectar el anticuerpo mediante el uso de un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine

55 Society, (marzo de 1986)). El isótopo radiactivo puede detectarse por medios que incluyen, pero no están limitados a, un contador gamma, un contador de centelleo o autorradiografía.

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo también puede etiquetarse de forma detectable usando metales que emiten fluorescencia tales como 152Eu, u otros de la serie lantánido. Estos metales 60 pueden unirse al anticuerpo usando grupos quelantes de metales tales como ácido dietilentriaminopentaacético

(DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

Las técnicas para conjugar diversos restos a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo son muy conocidas, véase, por ejemplo, Arnon y col., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs 5 In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y col. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom y col., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2ª Ed.), Robinson y col. (eds.), Marcel Dekker, Inc., págs. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y col. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In

10 Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y col. (eds.), Academic Press págs. 303-16 (1985), y Thorpe y col., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982).

En ciertas realizaciones, puede conjugarse un resto que potencie la estabilidad o eficacia de una molécula de unión,

15 por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunoespecífico del mismo. Por ejemplo, en una realización, puede conjugarse PEG a las moléculas de unión de la invención para incrementar su semivida in vivo. Leong, S.R., y col., Cytokine 16: 106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54: 531 (2002); o Weir y col., Biochem. Soc. Transactions 30: 512 (2002).

20 VII. Composiciones y procedimientos de uso

Además, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden la molécula de unión mencionada anteriormente, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención o derivados químicos del mismo, o el polinucleótido, vector o célula de la invención. La composición de la presente 25 invención puede comprender, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "derivado químico" describe una molécula que contiene restos químicos adicionales que normalmente no son una parte de la molécula base. Dichos restos pueden mejorar la solubilidad, semivida, absorción, etc., de la molécula base. Como alternativa, los restos pueden atenuar efectos secundarios no deseables de la molécula base o disminuir la toxicidad de la molécula base. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender agentes 30 adicionales tales como interleuquinas o interferones dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica. Por ejemplo, para uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, el agente adicional puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en moléculas orgánicas pequeñas, anticuerpos anti-Abeta y combinaciones de los mismos. Por lo tanto, en una realización preferida particular, la presente invención se refiere al uso de la molécula de unión, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente 35 invención o de una molécula de unión que tienen sustancialmente las mismas especificidades de unión de una cualquiera de éstas, el polinucleótido, el vector o la célula de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico para tratar o prevenir la progresión de la enfermedad de Alzheimer; para la mejoría de los síntomas asociados con la enfermedad de Alzheimer; para diagnosticar o cribar a un sujeto para la presencia de la enfermedad de Alzheimer o para determinar el riesgo de un sujeto de desarrollar la enfermedad de

40 Alzheimer. Dicha composición farmacéutica puede diseñarse para ser administrada por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intranasal, por vía parenteral o como un aerosol; véase también a continuación.

En una realización, la presente invención se refiere a los anticuerpos descritos anteriormente de la presente

45 invención para uso en el tratamiento de un trastorno neurológico caracterizado por acumulación y/o depósito anormal de beta-amiloide en el sistema nervioso central. La expresión "trastorno neurológico" incluye, pero no se limita a, enfermedad de Alzheimer y disfunción cognitiva leve.

Una ventaja particular de la estrategia terapéutica de la presente invención se basa en el hecho de que los

50 anticuerpos derivados de células B o células B de memoria de un organismo sano en fase preclínica o excepcionalmente estable clínicamente son, con cierta probabilidad, capaces de prevenir una enfermedad clínicamente manifiesta, o de disminuir el riesgo de aparición de una enfermedad clínicamente manifiesta o de retrasar el momento de la aparición de una enfermedad clínicamente manifiesta. Típicamente, dichos anticuerpos también han experimentado ya con éxito la maduración somática, es decir, la optimización respecto a la selectividad

55 y eficacia en la unión de alta afinidad a la molécula diana mediante la variación somática de las regiones variables del anticuerpo.

El conocimiento de que dichas células in vivo, por ejemplo, en un ser humano, no se han activado mediante proteínas fisiológicas relacionadas u otras o estructuras celulares en el sentido de una reacción autoinmunológica o 60 alérgica también tiene una gran importancia médica, ya que esto significa una probabilidad considerablemente

incrementada de viabilidad exitosa durante las fases del ensayo clínico. Por así decirlo, la eficiencia, aceptabilidad y tolerabilidad se han demostrado ya antes del desarrollo preclínico del anticuerpo profiláctico o terapéutico en al menos un sujeto humano. De este modo, puede esperarse que, con un procedimiento de acuerdo con la presente invención, tanto la eficiencia específica de la estructura de la diana de un anticuerpo como agente terapéutico como

5 su probabilidad disminuida de efectos secundarios incrementan significativamente su probabilidad de éxito en clínica.

En otra realización, la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende una cualquiera de las moléculas de unión, anticuerpos, fragmento de unión a antígeno, polinucleótidos, vectores o 10 células descritos anteriormente de la invención y opcionalmente medios adecuados para la detección tales como reactivos usados convencionalmente en procedimientos de diagnóstico basados en el sistema inmunitario o ácido nucleico. Los anticuerpos de la invención son adecuados, por ejemplo, para uso en inmunoensayos en los que pueden utilizarse en fase líquida o unidos a un vehículo de fase sólida. Los ejemplos de inmunoensayos que pueden utilizar el anticuerpo de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos bien en formato directo o 15 indirecto. Los ejemplos de dichos inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA), sándwich (ensayo inmunométrico), citometría de flujo y el ensayo de Western blot. Los antígenos y anticuerpos de la invención pueden unirse a muchos vehículos diferentes y usarse para aislar células específicamente unidas a ellos. Los ejemplos de vehículos muy conocidos incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza

20 del vehículo puede ser soluble o insoluble para los fines de la invención. Existen muchas etiquetas y procedimientos de etiquetado diferentes conocidos para los expertos en la materia. Los ejemplos de los tipos de etiquetas que pueden usarse en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes; véanse también las realizaciones descritas anteriormente en el presente documento.

25 Mediante una realización adicional, las moléculas de unión, en particular anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en un procedimiento para el diagnóstico de un trastorno en un individuo obteniendo una muestra de fluido corporal del individuo ensayado que puede ser una muestra de sangre, una muestra linfática o cualquier otra muestra de fluido corporal y poniendo en contacto la muestra de fluido corporal con un anticuerpo de

30 la presente invención en condiciones que permitan la formación de complejos anticuerpo-antígeno. El nivel de dichos complejos se determina a continuación por procedimientos conocidos en la técnica, indicando un nivel significativamente mayor que el formado en una muestra control la enfermedad en el individuo ensayado. De la misma manera, también puede usarse el antígeno específico unido por los anticuerpos de la invención. De este modo, la presente invención se refiere a un inmunoensayo in vitro que comprende la molécula de unión, por ejemplo,

35 anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención.

En este contexto, la presente invención también se refiere a medios diseñados específicamente para este fin. Por ejemplo, puede usarse una matriz basada en proteína o anticuerpos, que se carga por ejemplo con antígenos derivados de la proteína asociada a trastorno mencionada y que contiene el neoepítopo con el fin de detectar 40 autoanticuerpos que pueden estar presentes en pacientes que padecen, por ejemplo, un trastorno neurológico, en particular la enfermedad de Alzheimer, o con anticuerpos o moléculas de unión a antígeno equivalentes de la presente invención que reconocen específicamente una cualquiera de estas proteínas. Por ejemplo, la obtención de perfiles de antígenos en micromatriz de autoanticuerpos en artritis reumatoide ha sido notificada por Hueber y col., Arthritis Rheum. 52 (2005), 2645-2655. El diseño de inmunoensayos en micromatriz se resume en Kusnezow y col.,

45 Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a micromatrices cargadas con moléculas de unión o antígenos identificados de acuerdo con la presente invención.

La presente invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico y de diagnóstico, respectivamente, que comprende uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes descritos anteriormente, por ejemplo, 50 molécula de unión, anticuerpo o fragmento de unión del mismo, antígeno, polinucleótido, vector o célula de la presente invención. Asociado con dicho o dichos recipientes puede haber un folleto en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, folleto que refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta para la administración humana. Además, o como alternativa, el kit comprende reactivos y/o instrucciones para el uso en ensayos de diagnóstico apropiados. La

55 composición, por ejemplo, kit de la presente invención es por supuesto particularmente adecuada para el diagnóstico, prevención y tratamiento de un trastorno que está acompañado de la presencia de una proteína asociada con un trastorno como se ha definido anteriormente, especialmente amiloidosis, y en particular es aplicable para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (AD).

60 Los términos "tratamiento", "tratar" y similares se usan en el presente documento para indicar generalmente obtener

un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de ésta y/o puede ser terapéutico en términos de curar parcial o completamente una enfermedad y/o efecto adverso atribuido a la enfermedad. El término "tratamiento" tal y como se usa en el presente documento cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un

5 ser humano, e incluye: (a) prevenir la aparición de la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que todavía no se ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, por ejemplo, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, por ejemplo, causar la regresión de la enfermedad.

Además, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a un mamífero, preferentemente un ser humano, que necesita 10 tratamiento para una afección, trastorno o enfermedad.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse de acuerdo con procedimientos muy conocidos en la técnica; véase por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) por la University of Sciences en Philadelphia, ISBN 0-683-306472. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados 15 son muy conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos pueden formularse por procedimientos convencionales muy conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede realizarse por diferentes vías, por ejemplo, por

20 administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. Las formulaciones en aerosol tales como formulaciones por pulverización nasal incluyen soluciones acuosas purificadas u otras soluciones del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Dichas formulaciones se ajustan preferentemente a un pH y estado isotónico compatibles con las membranas mucosas nasales. Las formulaciones para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio con un vehículo adecuado.

25 Además, mientras la presente invención incluye el procedimiento ahora estándar (aunque afortunadamente infrecuente) de perforar un pequeño agujero en el cráneo para administrar un fármaco de la presente invención, en un aspecto preferido, la molécula de unión, especialmente anticuerpo o fármaco basado en anticuerpo de la presente invención puede cruzar la barrera hematoencefálica, lo que permite la administración intravenosa u oral.

30 El régimen de dosificación será determinado por el médico responsable y factores clínicos. Como es muy conocido en la técnica médica, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área corporal superficial, el compuesto particular que se va a administrar, sexo, tiempo y vía de administración, salud general, y otros fármacos que se administran simultáneamente. Una dosis típica puede

35 estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1.000 µg (o de ácido nucleico para la expresión o para la inhibición de la expresión en este intervalo); sin embargo, se consideran las dosis por debajo o por encima de este intervalo ejemplar, especialmente considerando los factores mencionados anteriormente. Generalmente, la dosificación puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente 0,01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.) del peso corporal del huésped. Por

40 ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o en el intervalo de 1-10 mg/kg, preferentemente al menos 1 mg/kg. También se pretende que las dosis intermedias en los intervalos anteriores estén en el alcance de la invención. Dichas dosis pueden administrarse a los sujetos diariamente, en días alternos, semanalmente o según cualquier otro esquema determinado por análisis empírico. Un tratamiento ejemplar conlleva la administración en dosificaciones múltiples durante un periodo prolongado, por ejemplo, de al menos seis

45 meses. Los regímenes de tratamiento ejemplares adicionales conllevan la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los esquemas de dosificación ejemplares incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos procedimientos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión se administran simultáneamente, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado está en los intervalos indicados. El

50 progreso puede monitorizarse por evaluación periódica. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución

55 de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender agentes adicionales tales como dopamina o fármacos

60 psicofarmacológicos, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica. Además, la composición

farmacéutica también puede formularse como una vacuna, por ejemplo, si la composición farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo anti-Aβ para inmunización pasiva.

Además, puede ser deseable la co-administración o administración secuencial de otros agentes. Una dosis o

5 cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad del ingrediente activo suficiente para mejorar los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y toxicidad de dichos compuestos pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y DL50 (la dosis letal para el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción

10 DL50/DE50. Preferentemente, el agente terapéutico en la composición está presente en una cantidad suficiente para restaurar el comportamiento y/o las propiedades cognitivas normales en el caso de la enfermedad de Alzheimer.

Éstas y otras realizaciones se describen y están abarcadas por la descripción y los ejemplos de la presente invención. La bibliografía adicional que se refiere a uno cualquiera de los materiales, procedimientos, usos y 15 compuestos que se van a emplear según la presente invención puede obtenerse de bibliotecas y bases de datos públicas, usando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, puede utilizarse la base de datos pública "Medline", que está organizada por el National Center for Biotechnology Information y/o la National Library of Medicine en el National Institutes of Health. Las bases de datos adicionales y direcciones de internet, tales como aquellas del European Bioinformatics Institute (EBI), que es parte del European Molecular Biology Laboratory

20 (EMBL) son conocidas para el experto en la materia y también pueden obtenerse usando motores de búsqueda de internet. Una visión global de la información de patentes en biotecnología y una visión general de fuentes relevantes de información de patentes útil para una búsqueda retrospectiva y para percatación actual se proporciona en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

25 La descripción anterior describe generalmente la presente invención. A no ser que se indique otra cosa, a un término según se usa en el presente documento se le proporciona la definición según se proporciona en el Diccionario de Oxford de Bioquímica y Biología Molecular, Oxford University Press, 1997, revisado en 2000 y reeditado en 2003, ISBN 0 19 850673 2. A lo largo del texto de esta especificación se citan varios documentos. Las citas bibliográficas completas pueden encontrarse al final de la especificación inmediatamente antes de las reivindicaciones.

30 Puede obtenerse una comprensión más completa por referencia a los ejemplos específicos siguientes que se proporcionan en el presente documento sólo para propósitos de ilustración y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

35 EJEMPLOS

Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la invención, pero no debe considerarse que limitan el alcance de la invención de ninguna manera. Las descripciones detalladas de los procedimientos convencionales, tales como los empleados en la presente memoria pueden encontrarse en la bibliografía citada; véase también "The Merck Manual

40 of Diagnosis and Therapy" Decimoséptima Ed. ed por Beers y Berkow (Merck & Co., Inc. 2003).

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro del alcance de la técnica. Para una elaboración adicional de técnicas generales útiles 45 en la práctica de esta invención, el médico puede consultar libros de texto estándar y revisiones en biología celular y cultivo tisular; véanse también las referencias citadas en los ejemplos. Los procedimientos generales en bioquímica molecular y celular pueden encontrarse en libros de texto estándar tales como Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3ª Ed. (Sambrook y col., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed. (Ausubel y col. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volúmenes I y II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide 50 Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames y Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames y Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney y Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller y Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3ª Edición (Ausubel y col., eds.); y Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller y Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In 55 Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu y col., eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (Weir y Blackwell, eds., 1986). Protein Methods (Bollag y col., John Wiley & Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner y col., eds., Academic Press 1999); 60 Viral Vectors (Kaplitt y Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic

Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle y Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Los reactivos, vectores de clonación y kits para la manipulación genética mencionados en esta descripción están disponibles de proveedores comerciales tales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech. Las técnicas generales en cultivo celular y la recogida de medios se plantean en Large Scale

5 Mammalian Cell Culture (Hu y col., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); y Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch y col., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251); Extracting information from cDNA Arrays, Herzel y col., CHAOS 11 (2001), 98-107.

10 Los experimentos siguientes se ilustran y describen respecto al anticuerpo NI-101.11. Sin embargo, el anticuerpo NI-101.12F6A es estructuralmente similar y puede esperarse, por lo tanto, que proporcione resultados comparables.

Procedimientos suplementarios

15 ELISA

Se recubrieron microplacas de 96 pocillos de mitad de área (Corning) con péptido Abeta sintético a una concentración estándar de 1 µg/ml en tampón de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,42) durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron y los sitios de unión no específica se bloquearon durante 1h a TA con PBS

20 que contenía BSA al 2% (Sigma, Buchs, Suiza). Se transfirió medio condicionado de células B de placas de cultivo de células B de memoria a las placas de ELISA y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. La unión de los anticuerpos humanos se determinó usando anticuerpos policlonales anti-IgG humana de burro conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Cambridgeshire, Reino Unido) seguido de la medida de la actividad HRP en un ensayo colorimétrico estándar.

25 Clonación molecular de anticuerpos que presentan la especificidad de interés

Se recogen células B vivas de cultivos de células B de memoria seleccionados usando un separador celular. Se prepara ARNm y se obtienen las secuencias de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina usando cebadores 30 específicos de marco de Ig para todas las familias marco 1 (FR1) de cadena pesada y ligera variables humanas como cebadores 5' en combinación con cebadores específicos para todos los segmentos J-H humanos como cebadores 3' (Marks y col., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597). Como alternativa, puede usarse RT-PCR de célula única de células separadas únicas del cultivo de células B de memoria como fuente de secuencias de cadena pesada y ligera de Ig (Babcook y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 93 (1996), 7843-7848; Brezinschek y col., J. Immunol.

35 155 (1995), 190-202; Coronella y col., Nucleic Acids Research 28 (2000); Owens y col., J. Immunol. 171 (2003), 2725-2733). La separación de células únicas conserva el emparejamiento correcto de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de los clones de anticuerpo producidos originalmente en el cultivo de células B.

La identificación del clon de anticuerpo con la especificidad deseada se realiza por re-cribado en micromatriz tisular

40 compatible con microtitulación y ELISA después de la expresión recombinante de los anticuerpos completos. La expresión recombinante de los anticuerpos IgG1 completos se consigue después de la inserción de las secuencias variables de cadena pesada y ligera "en el marco de lectura correcto" en los vectores de expresión que complementan la secuencia de región variable con una secuencia que codifica un péptido señal en el extremo 5prima y en el extremo 3' con una secuencia que codifica el o los dominios constantes apropiados. Para este fin, los

45 cebadores contenían sitios de restricción diseñados para facilitar la clonación de las secuencias variables de cadena pesada y ligera en vectores de expresión de anticuerpos. La inmunoglobulina de cadena pesada se expresa insertando el producto de RT-PCR de cadena pesada de inmunoglobulina en marco en un vector de expresión de cadena pesada que porta un péptido señal y los dominios constantes de inmunoglobulina humana. La inmunoglobulina de cadena ligera kappa se expresa insertando el producto de RT-PCR de cadena ligera kappa en

50 marco en un vector de expresión de cadena ligera que proporciona un péptido señal y el dominio constante 1 de la inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana. Como alternativa, la inmunoglobulina de cadena ligera lambda se expresa insertando el producto de RT-PCR de la cadena ligera lambda en marco en un vector de expresión de cadena ligera lambda que proporciona un péptido señal y el dominio constante 1 de la inmunoglobulina de cadena ligera lambda humana.

55 Los anticuerpos monoclonales recombinantes funcionales se obtienen después de la co-transfección en células HEK 293 (o cualquier otra línea celular receptora apropiada) de un vector de expresión de cadena pesada de Ig y un vector de expresión de cadena ligera kappa o lambda de Ig. El anticuerpo monoclonal humano recombinante se purifica posteriormente del medio acondicionado usando una purificación en columna con Proteína A estándar. El

60 anticuerpo monoclonal humano recombinante puede producirse en cantidades ilimitadas usando células

transfectadas temporalmente o de manera estable. Las líneas celulares que producen el anticuerpo monoclonal humano recombinante pueden establecerse usando los vectores de expresión de Ig directamente o re-clonando las regiones variables de Ig en vectores de expresión diferentes. Los derivados tales como F(ab), F(ab)2 y scFv también pueden generarse a partir de estas regiones variables de Ig.

Protocolo experimental:

RT-PCR de células B en masa

10 Las células vivas según se identificaron por sus propiedades de dispersión de la luz frontal y lateral de cultivos de células B de memoria seleccionados se separaron en alícuotas de 100-2.000 células directamente en tubos de PCR de 0,2 ml llenos con 20 µl de RNAlater (Ambion, Huntingdon, Reino Unido) usando un separador celular MoFlo. Se preparó ARNm usando el Micro Kit mRNA-Direct (Dynal, Invitrogen, Basilea, Suiza). Se preparó ADNc usando el Kit "RT para PCR" (Clontech BectonDickinson, Basilea, Suiza) y la PCR de las secuencias variables de cadena pesada

15 y ligera de inmunoglobulina (Ig) se realizó usando el Kit de PCR Advantage 2 (Clontech) usando cebadores específicos para todas las familias de marco 1 (FR1) de cadena variable pesada y ligera humana como cebadores 5' en combinación con cebadores específicos para los dominios constantes de cadenas pesadas de Ig humana o ligeras kappa de Ig o ligeras lambda de Ig como cebadores 3'. Los cebadores se adquirieron en Microsynth (Balgach, Suiza).

20 Un péptido señal que se usó en todos los vectores de expresión se obtuvo de la secuencia de la familia 1 L5 de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana (MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC; SEQ ID NO: 2) como se describe en la V-Base y diseñado para proporcionar el sitio de restricción Xba 1 con el fin de facilitar la clonación de las regiones variables amplificadas por PCR

25 ATGGACATGCGGGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTAGATGC; SEQ ID NO: 1). Xba1 se introdujo por mutagénesis silenciosa. Como un sitio de restricción 3' usado para la clonación de las regiones variables de cadena pesada, se introdujo el sitio de restricción Sal1 en C1 de IgG1 proporcionado por el vector. De manera similar, se introdujo el sitio de restricción BsiW1 en C1 de la cadena ligera kappa y se introdujo Xho1 en C1 de la cadena ligera lambda. La digestión por restricción de los productos de PCR y el ligamiento en

30 vectores receptores se realizó según procedimientos estándar. Se preparó ADN plasmídico usando kits estándar (Qiagen, Hombrechtikon, Suiza). Los vectores receptores contenían un promotor CMV para la expresión de los genes de anticuerpo en células de mamífero.

Expresión de anticuerpos monoclonales recombinantes funcionales

35 Los anticuerpos pueden producirse en cantidades suficientes por expresión recombinante usando tecnologías conocidas en la técnica (Trill y col., Curr. Opin. Biotechnol. 6 (1995), 553-601). El anticuerpo monoclonal humano recombinante de hasta 1 mg se produjo después de la transfección transitoria de células 293 HEK. El anticuerpo monoclonal humano recombinante de hasta 100 mg se produjo después de la transducción estable de células 293

40 HEK o las células NSO murinas usando vectores de lentivirus recombinantes.

Producción a pequeña escala de anticuerpo humano recombinante por transfección transitoria

El vector de cadena pesada de Ig y los vectores de cadena ligera de Ig se co-transfectaron en células HEK 293

45 usando el procedimiento estándar de co-precipitación con fosfato de calcio. Los anticuerpos recombinantes se purificaron del medio condicionado por células transfectadas HEK 293 usando purificación en columna con proteína A (GE-Healthcare, Otelfingen, Suiza).

Producción a gran escala de anticuerpo humano recombinante por transducción estable

50 En este contexto, se empleó un sistema de transfección basado en lentivirus para generar líneas celulares transducidas de manera estable que producen anticuerpo humano recombinante (Zufferey y col., J. Virol. 72 (1998), 9873-9880). Las células HEK 293 se co-transdujeron con dos lentivectores diferentes uno que porta un casete de expresión para la cadena pesada de Ig, el otro un casete para la cadena ligera de Ig de un anticuerpo recombinante.

55 Este procedimiento de transducción puede usarse en una amplia gama de líneas celulares de mamífero tales como células CHO y NSO.

Validación en modelos de ratón transgénico de enfermedad humana

60 Se generaron ratones transgénicos como se ha descrito previamente (Knobloch y col., Neurobiol. Aging 28 de julio

(2006)) en un fondo híbrido de C57B1/6 y DBA2. El grupo de ensayo se retrocruzó una vez a C57B1/6. Los ratones se mantuvieron en condiciones de estabulación estándar en un ciclo reverso de 12h:12h de luz/oscuridad y tuvieron acceso libre a alimento y agua. Los grupos de tratamiento se equilibraron para edad (24 meses en el primer ensayo, 26 meses en el 2º ensayo) y sexo. Los ratones se trataron con anticuerpos (3 mg/kg de peso corporal) por

5 inyecciones intraperitoneales una vez a la semana durante un periodo de tiempo de 2 meses dando como resultado 8 inyecciones por animal.

Ensayo de comportamiento en el laberinto en Y

10 La proporción de alternancia espontánea se evalúa usando un laberinto se plástico con forma de Y, con tamaños de brazo de 40 x 20 x 10 cm. Durante las sesiones de 5 min, se registran las secuencias de las entradas al brazo; la alternancia se definió como entradas sucesivas en los tres brazos, en conjuntos de tripletes superpuestos. El porcentaje de alternancia se calculó como la proporción de alternancias reales a posibles. Después de 2 meses de tratamiento con el anticuerpo, los ratones se reensayan en el laberinto en Y. Los experimentadores se mantienen

15 siempre ciegos para ambos tratamientos y genotipos durante todo el experimento.

Penetración de la barrera hematoencefálica y unión a estructuras anormales en el cerebro

Para evaluar si los anticuerpos seleccionados o fragmentos de los mismos pueden penetrar la barrera

20 hematoencefálica y unirse a sus dianas proteicas anormalmente agregadas o conformacionalmente alteradas en el cerebro, se administró una dosis eficaz del anticuerpo por vía sistémica, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía subcutánea o por vía intranasal a un animal transgénico que se caracteriza por la acumulación no fisiológica de la diana proteica agregada o conformacionalmente alterada en el cerebro. La unión del anticuerpo a las estructuras patológicas específicas en el cerebro se evalúa por inmunotinción con un anticuerpo

25 secundario anti-Ig humana etiquetado, seguido de detección inmunohistoquímica estándar.

Protocolo experimental:

Los ratones del modelo transgénico PS-1/APPswe para la enfermedad de Alzheimer recibieron dos inyecciones

30 periféricas de 150 µg de NI-101.11 el día 1 y el día 3. Los ratones se sacrificaron 24 h después de la segunda inyección y se perfundieron con PBS. Los cerebros se congelaron y se prepararon secciones de tejido del tejido congelado usando un criotomo. La presencia de anticuerpo humano en las secciones de criostato se ensayó tiñendo con anticuerpo anti-IgG humana marcado con Cy3 (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Reino Unido). La localización de las placas amiloides se realizó co-tiñendo las secciones de criostato con el anticuerpo de control

35 específico de Abeta murino 6E10 (disponible en Covance, Número de Catálogo SIG-39320) seguido de anticuerpo anti IgG de ratón marcado con FITC. Como alternativa, sólo se usó la tinción con anticuerpo anti IgG humana marcado con Cy3. El análisis de fluorescencia se realizó en un microscopio invertido de fluorescencia (Leica).

Reducción de la patología cerebral

40 Los efectos del tratamiento con anticuerpo sobre los niveles de dianas proteicas agregadas o conformacionalmente alteradas en el cerebro se evalúa por el tratamiento sistémico o administración cerebral dirigida del anticuerpo (intracraneal, intratecal o intraventricular) y un anticuerpo de control no relacionado a animales transgénicos con acumulación no fisiológica característica de la diana proteica agregada o conformacionalmente alterada en el

45 cerebro. Los efectos del tratamiento se evalúan por inmunotinción o tinción histoquímica de las dianas proteicas alteradas o agregadas y midiendo el área cubierta por dichos agregados, tamaño del agregado y número de agregados y cuantificación bioquímica de las concentraciones de las dianas proteicas en diferentes áreas cerebrales.

50 Ausencia de efectos secundarios relacionados con el tratamiento con anticuerpo

Los efectos adversos potenciales relacionados con la diana del tratamiento con anticuerpo se evaluarán por la administración sistémica o administración cerebral dirigida del anticuerpo (intracraneal, intratecal o intraventricular) y un anticuerpo de control no relacionado a animales transgénicos con acumulación no fisiológica característica de la

55 diana proteica agregada o conformacionalmente alterada en el cerebro. Los efectos secundarios potenciales se evaluarán por la inmunotinción o tinción histoquímica (por ejemplo, azul de Prusia para microhemorragias, hemotoxilina-eosina, leucocitos activados) y cuantificación bioquímica (por ejemplo, niveles de citoquinas por ELISA).

60 Tinción con inmunofluorescencia de células vivas

Las células HEK 293 se transfectaron de manera temporal con un vector que expresa APP humano de tipo silvestre fusionado en el extremo C terminal intracelular con la variante de proteína fluorescente amarilla Citrina. 24 horas después de la transfección, las células se incubaron con anticuerpos humanos recombinantes o anticuerpos de

5 control a 4ºC durante 30 minutos. Después de una etapa de lavado, las células se fijaron y se detectó el anticuerpo unido a la superficie usando anticuerpos secundarios etiquetados con Cy3 contra IgG humana o de ratón (Jackson ImmunoResearch). El análisis de la fluorescencia se realizó en un microscopio confocal (Leica).

Preparación de fibrillas de Abeta

10 El péptido Abeta se adquirió en Bachem (Bubendorf, Suiza). El péptido liofilizado se reconstituyó en TFA y se resuspendió en PBS inmediatamente antes de su uso como Abeta monomérico en los ensayos. Las fibrillas de Abeta se prepararon por incubación del péptido Abetal-42 monomérico a una concentración de 100 µg/ml en PBS a 37ºC durante 24 h. El péptido Abeta monomérico y las preparaciones de fibrillas también se usaron como sustrato

15 para recubrir placas de ELISA.

Western blot

El péptido Abeta monomérico se mezcló con colorante de carga, se desnaturalizó con calor y se cargaron 0,2 µg por

20 carril y se separó en una SDS-PAGE en gradiente. Las transferencias se incubaron con anticuerpo primario durante 2 h. La unión del anticuerpo monoclonal humano primario o anticuerpo control de ratón 6E10 se reveló usando anticuerpos secundarios anti-humano o anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano (HRP). Los blots se desarrollaron usando Sustrato de Máxima Sensibilidad SuperSignal West Femto (Pierce, Fisher Scientific, Wohlen, Suiza).

25 Competencia para la unión a placas amiloides tisulares

El anticuerpo humano recombinante NI-101.11 se incubó durante 2 h con preparaciones de péptido Abeta. Las preparaciones de anticuerpo/Abeta se usaron para la tinción inmunohistoquímica de sección de cerebro obtenida de

30 un paciente con enfermedad de Alzheimer confirmada neuropatológicamente. Se prepararon crio-secciones de 5 µm, se bloquearon con BSA al 4%, suero de cabra al 5% y suero de caballo al 5% en PBS durante 1 h a TA y se tiñeron con preparaciones NI-101.11/Abeta durante 1 h a temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado, se analizó la unión de los anticuerpos humanos a las secciones tisulares usando anticuerpos secundarios conjugados con Cy3 contra IgG humana (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd). El análisis de la fluorescencia se

35 realizó en un microscopio invertido de fluorescencia (Leica, Heerbrugg, Suiza).

Ejemplo 1

Detección de anticuerpos humanos contra estructuras anormales predominantes en enfermedades cerebrales 40 humanas

Se ensayaron anticuerpos de sujetos fenotípicamente sanos o pacientes excepcionalmente estables clínicamente con enfermedad de Alzheimer por inmunohistoquímica en secciones cerebrales obtenidas de pacientes con enfermedad de Alzheimer confirmada patológicamente. La figura 1A demuestra la presencia de anticuerpos en un

45 paciente excepcionalmente estable clínicamente que se unen a placas beta-amiloides según se confirmó por cotinción con un anticuerpo conocido contra beta-amiloide humana (anticuerpo 4G8; figura 1B). La presencia en un sujeto humano sano de anticuerpos contra ovillos neurofibrilares en una sección de tejido obtenida de un paciente con enfermedad de Alzheimer se muestra en la figura 2A. Este resultado se confirmó por co-tinción con un anticuerpo conocido contra tau humano (HT7). La figura 3A revela la presencia en un sujeto humano sano de

50 anticuerpos contra neuritas distróficas en una sección de tejido obtenida de un paciente con enfermedad de Alzheimer. La tinción de control con un anticuerpo conocido contra tau humano (HT7) se representa en la figura 3B. Estos resultados demuestran la presencia en pacientes fenotípicamente sanos o excepcionalmente estables clínicamente de anticuerpos contra estructuras patológicas identificables en muestras de tejido humano con diagnósticos confirmados histopatológicamente.

55 Ejemplo 2

Los anticuerpos humanos recombinantes mantienen la especificidad frente a una estructura anormal in vivo y reconocen el epítopo conformacional de proteína beta-amiloide asociada con enfermedad en placas amiloides

60 cerebrales pero no el precursor fisiológico o derivado no patógeno de ésta

El anticuerpo NI-101.11 se obtuvo de pacientes con enfermedad de Alzheimer excepcionalmente estables clínicamente con una proporción significativamente reducida de deterioro cognitivo. El aislamiento y la producción recombinante de anticuerpos se realizaron como se especifica en los procedimientos suplementarios.

5 NI-101.11

Se ensayó NI-101.11 recombinante para unión a placas beta-amiloides cerebrales (figura 4). Se tiñeron secciones cerebrales obtenidas de un paciente con enfermedad de Alzheimer confirmada neuropatológicamente a las

10 concentraciones indicadas. La unión del anticuerpo a placas beta-amiloides con concentraciones de 50 pM sugiere una unión de alta afinidad. La unión del anticuerpo NI-101.11 a placas beta-amiloides a una concentración de 0,5 nM no se ve afectada por competencia por la adición de cantidades en exceso de polipéptido derivado de Abeta Nterminal lineal sintético que representa las posiciones 1 a 16 a concentraciones de hasta 1 µM (figura 5). Además, la unión de NI-101.11 a placas beta-amiloides en secciones cerebrales a concentración 8 nM se ve afectada por

15 competencia por cantidades en exceso de fibrillas de Abetal-42 (4 µM) pero no de monómeros de Abetal-42 lineal sintético a concentración 4 µM, lo que sugiere que NI-101.11 reconoce un epítopo conformacional que no está presente en Abeta monomérico (figura 6).

Para evaluar adicionalmente la unión del anticuerpo humano recombinante NI-101.11 a Abeta monomérico lineal

20 sintético, se separaron preparaciones de Abeta monomérico por PAGE no desnaturalizante. La proteína transferida se ensayó con anticuerpo humano recombinante NI-101.11 y un anticuerpo de control contra secuencias Abeta Nterminal lineal (6E10). Mientras que 6E10 produjo una tinción prominente del péptido Abeta monomérico, no se detectó ninguna unión para NI-101.11 lo que sugiere que NI-101.11 no se une al péptido Abeta monomérico lineal, sino que reconoce un epítopo conformacional de Abeta (figura 7).

25 La unión de NI-101.11 recombinante a fibrillas amiloides artificiales preparadas a partir de péptidos Abetal-42 sintéticos y Abeta monomérico se determinó por ELISA (figura 8). Las fibrillas de Abeta sintético o Abeta monomérico sintético utilizadas para recubrir placas ELISA a densidades de recubrimiento iguales se incubaron con NI-101.11 a las concentraciones indicadas. La unión a fibrillas amiloides artificiales (cuadrados abiertos) es más de

30 100 veces mayor en comparación con Abeta monomérico (cuadrados llenos). El anticuerpo de control 22C4 contra el extremo C de Abeta se une preferentemente a Abeta monomérico (círculos llenos) y menos bien a las fibrillas (círculos abiertos). Esto sugiere que NI-101-10 reconoce un epítopo conformacional que también está presente en las fibrillas amiloides artificiales preparadas a partir de péptidos Abeta sintéticos.

35 La reactividad cruzada del anticuerpo humano recombinante NI-101.11 contra APP celular de longitud completa o con cualquiera de sus derivados fisiológicos se determinó por ensayos de unión celular (figura 9).

Se incubaron células HEK 293 vivas que expresan de manera estable APP humana fusionada con Citrina como un marcador durante 30 min a 4ºC, para evitar la internalización, con el anticuerpo humano recombinante NI-101.11 o el

40 anticuerpo control 6E10 contra la secuencia Abeta N-terminal lineal. Las señales positivas para citrina indican las células que expresan APP. A diferencia del anticuerpo de control (6E10) que se une a APP de la superficie celular en todas las células que expresan la construcción de fusión, no se detecta ninguna unión de anticuerpo humano recombinante NI-101.11 a APP de longitud completa. Estos datos demuestran la ausencia de reactividad cruzada de NI-101.11 con APP celular, fisiológica.

45 La ausencia de unión de NI-101.11 a Abeta monomérico se demostró adicionalmente por cromatografía de exclusión por tamaño: No se observó ninguna unión de NI-101.11 o un anticuerpo control no relacionado a AbetaI-42 monomérico etiquetado con FITC (figura 10A, 10B). Por el contrario, el anticuerpo 22C4 dirigido contra un epítopo lineal presente en el extremo C de Abeta co-eluyó con los monómeros AbetaI-42-FITC (figura 10C).

50 En un ELISA de competencia, la unión de 6E10, un anticuerpo dirigido contra un epítopo lineal en el extremo N de Abeta, podía bloquearse completamente después de una pre-incubación con concentraciones en exceso de péptidos monoméricos AbetaI-16, AbetaI-28 y AbetaI-40. Por el contrario, la pre-incubación con concentraciones en exceso de péptidos Abeta lineales no suprimió la unión de NI-101.11, lo que sugiere que NI-101.11 requiere un

55 epítopo conformacional (figura 11).

Ejemplo 3

El anticuerpo humano recombinante contra beta-amiloide cerebral cruza la barrera hematoencefálica en un modelo 60 de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer y se une a placas beta-amiloides cerebrales in vivo

Para determinar si el anticuerpo humano recombinante NI-101.11 cruza la barrera hematoencefálica y se une a placas beta-amiloides cerebrales in vivo, los ratones del modelo de la enfermedad de Alzheimer PS-1/APPswe recibieron dos inyecciones periféricas de 150 µg de NI-101.11 el día 1 y el día 3. Los ratones se sacrificaron 24 h 5 después de la segunda inyección y se perfundieron con PBS. Los cerebros se recogieron y se tiñeron secciones cerebrales con anticuerpos marcados con FITC contra IgG humana o con el anticuerpo Abeta monoclonal de ratón 6E10 seguido de un anticuerpo marcado con FITC contra IgG de ratón para confirmar la presencia de placas betaamiloides cerebrales. La tinción intensa de las placas amiloides con anti-IgG humana indicó que el anticuerpo humano recombinante NI-101.11 puede cruzar la barrera hematoencefálica de ratones transgénicos y unirse a las

10 placas beta-amiloides cerebrales en animales vivos (figura 15).

Ejemplo 4

El anticuerpo humano recombinante contra beta-amiloide mejora el comportamiento cognitivo anormal y confiere una 15 reducción de la carga de placas beta-amiloides, astrogliosis y microgliosis en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer sin incrementar la frecuencia de microhemorragias

Se trataron ratones arcAbeta de 24 meses de edad y miembros de su camada de tipo silvestre con edad equivalente semanalmente i.p. con 3 mg/kg de anticuerpo humano recombinante NI-101.11 o un anticuerpo de control humano 20 con isotipo equivalente durante 2 meses. Para evaluar el efecto del tratamiento sobre el comportamiento anormal en los ratones transgénicos, se realizó un ensayo comportamental de laberinto en Y antes y después de la finalización del tratamiento. La proporción espontánea de alternancia se evaluó usando un laberinto de plástico con forma de Y, con tamaños de brazo de 40 x 20 x 10 cm. Durante las sesiones de 5 min, se registraron las secuencias de entradas en los brazos; la alternancia se definió como entradas sucesivas en los tres brazos, en conjuntos de tripletes 25 superpuestos. El porcentaje de alternancia se calculó como la proporción de alternancias reales a posibles (definida como el número total de entradas a brazos -2) multiplicada por 100%. El rendimiento en el laberinto en Y de ratones arcAbeta no tratados y controles de miembros de su camada de tipo silvestre se comparó usando un ensayo de t para datos no emparejados. El ensayo no paramétrico de Kruskal-Wallis se usó para comparar la mejora después del tratamiento en los 4 grupos. El ensayo no paramétrico de Mann-Whitney U se eligió para la comparación por

30 pares de los diferentes grupos. Los participantes con cero (es decir, ratones que no dejaron el brazo en el que se pusieron) se excluyeron del análisis.

Como se observó en estudios previos, los ratones arcAbeta de 24 meses de edad no tratados estuvieron significativamente discapacitados en comparación con sus compañeros de camada de tipo silvestre (figura 16A, 35 antes del tratamiento; ensayo t para datos no emparejados, p= 0,0007).

Los ratones arcAbeta tratados con NI-101.11 mostraron niveles de alteración claramente potenciados, comparables con los ratones de control de tipo silvestre tratados con NI-101.11 después de 2 meses de tratamiento. El análisis de la mejoría (es decir, rendimiento después del tratamiento menos rendimiento antes del tratamiento) mostró una 40 diferencia significativa entre los cuatro grupos (figura 16B, ensayo de Kruskal-Wallis; p= 0,03). Un análisis post-hoc por pares entre todos los grupos mostró que los ratones arcAbeta tratados con NI-101.11 mejoraron su rendimiento cognitivo significativamente más que los ratones de tipo silvestre (Mann-Whitney U; p= 0,05 NI-101.11 tg frente a NI

101.11 wt; p= 0, 008 NI-101.11 tg frente a control wt). Este grupo de ratones también mostró una tendencia fuerte hacia un rendimiento mejorado en comparación con sus compañeros de camada transgénicos tratados con el

45 anticuerpo de control (Mann-Whitney-U; p= 0,08 NI-101.11 tg frente a control tg). Todos los ratones mostraron una mejoría de ∼10% en el rendimiento en el re-ensayo, lo que se debió probablemente al entorno familiar de la tarea.

Los efectos del tratamiento crónico de 2 meses con NI-101.11 sobre la carga amiloide, astrogliosis y microgliosis se analizaron por análisis histoquímico e inmunohistoquímico cuantitativos. Para este fin, los ratones se anestesiaron 50 después de la finalización del ensayo comportamental y se perfundieron por vía transcardial con PBS. Un hemisferio cerebral se fijó en paraformaldehído al 4% y se incluyó en parafina. Se cortaron secciones sagitales de 5 µm con un microtomo Leica RM 2135 (Bannockburn, Illinois). La carga de placas beta-amiloides en la corteza y el hipocampo se cuantificó en secciones de cerebro teñidas con Tioflavina S y Rojo Congo de acuerdo con el protocolo estándar. Para la inmunohistoquímica, los cortes se desparafinaron, se bloquearon con BSA al 4%, suero de cabra al 5% y 55 suero de caballo al 5% en PBS durante 1 h a TA. Los anticuerpos se incubaron durante una noche a 4ºC usando las diluciones siguientes: anti-GFAP (Advanced Immunochemicals) 1:500, anti-IBA1 (WAKO) 1:500. Los anticuerpos secundarios acoplados a fluoróforo se incubaron a TA durante 2 h. Se usaron 2-3 secciones por cerebro de ratón espaciadas 75 µm entre sí para cada tinción. Se tomaron 2 imágenes por sección a un aumento de 10x para el análisis de la corteza (región parietal y frontal). El área completa del hipocampo (aumento de 5x ajustado a la ROI)

60 se tomó para el análisis del hipocampo. El análisis de imágenes automático se realizó con el software ImageJ.

La tinción doble de las secciones cerebrales de ratones arcAbeta inmunizados con 6E10 y anti-IgG humana revelaron la unión de NI-101.11 a depósitos de Abeta (figura 17, panel izquierdo), lo que indica que NI-101.11 puede cruzar la barrera hematoencefálica y unirse a placas beta-amiloides cerebrales. No se observó esta unión del

5 anticuerpo humano a depósitos de Abeta en los ratones arcAbeta tratados con anticuerpo de control (figura 17, panel derecho).

[0317] El tratamiento crónico con 3 mg/kg de NI-101.11 dio como resultado una reducción significativa de la carga de placas amiloides como se reveló por la tinción con Tioflavina S y Rojo Congo. Esta reducción alcanzó niveles de más

10 del 50% en la corteza e hipocampo en comparación con los ratones arcAbeta tratados con anticuerpo de control (figura 18A, B). Además del área de la placa (figura 18C), también se observaron reducciones significativas para el número de placas (figura 18D) y el tamaño medio de las placas (figura 18E).

Para ensayar si el tratamiento crónico con NI-101.11 afecta a la respuesta neuroinflamatoria en los ratones

15 arcAbeta, se cuantificaron los astrocitos reactivos y microglia después de la tinción inmunohistológica. Se observó una reducción en el número de astrocitos reactivos (tinción anti-GFAP) en la corteza de los ratones arcAbeta tratados con NI-101.11 en comparación con los animales tratados con el anticuerpo de control (figura 19A; MannWhitney-U; p=0,047). No se detectó ningún cambio en el hipocampo. La tinción con un anticuerpo contra un marcador de microglia y macrófagos (anti-Iba1) también reveló una tendencia estadística hacia inflamación reducida

20 (figura 19B; Mann-Whitney-U; p=0,075 tanto para corteza como para hipocampo). La disminución en la astrocitosis y microgliosis está en línea con la carga beta-amiloide reducida observada después del tratamiento con NI-101.11.

La inmunoterapia pasiva con ciertos anticuerpos monoclonales dirigidos contra Abeta puede asociarse con una frecuencia incrementada de microhemorragias en el cerebro (Pfeifer y col., Science 298 (2002), 1379; Wilcock y col.,

25 J Neuroinflammation 1 (2004), 24). Para evaluar los efectos de la terapia crónica con NI-101.11, se realizó una tinción con azul de Prusia de Perl en secciones cerebrales de ratones arcAbeta y de tipo silvestre después de tratamiento crónico con NI-101.11. Esta tinción revela la presencia de hemosiderina, un producto de degradación de la hemoglobina, y marcador de microhemorragias previas (figura 20). En los ratones arcAbeta viejos tratados con un anticuerpo de control, la frecuencia de perfiles positivos para azul de Prusia estaba significativamente elevada en

30 comparación con sus compañeros de camada de tipo silvestre (Mann-Whitney-U; p=0,001). El tratamiento con NI

101.11 no dio lugar a un incremento en el número de microhemorragias cuando se compara con los ratones arcAbeta tratados con anticuerpo de control (MannWhitney-U; p=0,347) lo que indica que los efectos terapéuticos beneficiosos del tratamiento con NI-101.11 se produjeron en ausencia de este efecto secundario observado frecuentemente de inmunoterapia pasiva de Abeta.

35 Ejemplo 5

El anticuerpo humano recombinante contra beta-amiloide cerebral inhibe la formación de fibrillas de Abeta sintéticas

in vitro

40 Se ensayó el efecto del anticuerpo humano recombinante NI-101.11 sobre la formación de fibrillas Abeta midiendo la Tioflavina S unida a Abeta agregado por análisis de fluorescencia. Se incubaron soluciones de Abeta monomérico a 37ºC durante 24 h en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de NI-101.11. La formación de fibrillas de Abeta sintéticas in vitro se inhibió por NI-101.11 humano recombinante de una manera dependiente de la

45 concentración (figura 21).

Ejemplo 6

Efectos de NI-101.11 sobre la fagocitosis ex vivo de fibrillas de Abeta por células derivadas de microglia BV-2

50 Se estudiaron los efectos de NI-101.11 sobre la fagocitosis mediada por el receptor Fcgamma de fibrillas de Abeta en la línea celular derivada de microglia BV-2. Las células BV-2 se mantuvieron en DMEM suplementado con FBS al 5%, Pen/Estrep y glutamina. Las células se tripsinizaron y se sembraron 120.000 células BV-2/pocillo en placas de 24 pocillos con el fondo plano. Después de 12 h, el medio se reemplazó por 400 µl de DMEM/F12/pocillo

55 suplementado con HEPES 20 mM (pH 7,3), BSA al 1%, 10 µg/ml de Pen/Estrep. Se añadieron 100 µg/ml de Fucoidan, un inhibidor del receptor trampa ("scavenger") 30 min antes del experimento. Se pre-incubaron fibrillas de Abeta etiquetadas con FITC 50 µM con las concentraciones indicadas de anticuerpos durante 30 min a 37ºC, se lavó dos veces, seguido de centrifugación durante 5 min a 14.000 x g. Esta suspensión se añadió a las placas de cultivo tisular. Después de 30 min, las células BV2 se lavaron dos veces con HBSS para eliminar Abeta fibrilar no asociado.

Las células se trataron con 250 µg/ml de tripsina/EDTA durante 20 min a 4ºC y se lavaron dos veces por centrifugación a 500 x g durante 5 min a 4ºC. Las células se fijaron durante 20 min en FACS-Fix (PBS, FA al 2%, Glucosa al 2%, NaN 5 mM) y se lavaron dos veces con lavado FACS (PBS, EDTA 5 µM, BSA al 0,2%). La fluorescencia (FL-1) de 10.000 células se determinó por análisis FACS (basado en Webster SD y col., JI 2001).

5 La fagocitosis dependiente del receptor Fcgamma de fibrillas de Abeta1-42 etiquetadas con FITC se midió después de la inhibición del sistema de receptor trampa ("scavenger"). El análisis comparativo de NI-101.11 humano y un anticuerpo disponible en el mercado dirigido a un epítopo lineal en el extremo N del péptido Abeta (6E10) demostró una inducción dependiente de la dosis de la fagocitosis de fibrillas de Abeta. La captación de las fibrillas mediada por

10 NI-101.11 es hasta 3 veces mayor que la observada para el anticuerpo 6E10 (figura 22). Estos datos indican que NI

101.11 desencadena una fagocitosis mediada por el receptor Fcgamma potente dependiente de la dosis, de fibrillas de Abeta por las células microgliales.

Conclusión

15 Como se ha demostrado en los experimentos anteriores realizados de acuerdo con la presente invención, fue sorprendentemente posible detectar anticuerpos protectores y terapéuticamente activos y células B productoras de anticuerpos en sujetos humanos asintomáticos, fenotípicamente sanos, así como en pacientes con evoluciones de la enfermedad excepcionalmente estables clínicamente a pesar de un diagnóstico de discapacidad cognitiva o

20 enfermedad de Alzheimer. Más específicamente, pudo detectarse y aislarse una nueva clase de anticuerpos humanos, que discriminan la forma fisiológicamente funcional de un antígeno, minimizando de esta manera el riesgo de efectos secundarios autoinmunógenos que era hasta ahora un problema en la inmunoterapia. De este modo, se proporcionan anticuerpos y moléculas de unión equivalentes que reconocen específicamente una variante del antígeno en una estructura patofisiológicamente relevante, a la que se supone que el anticuerpo se une con el fin de

25 disminuir su toxicidad o para reducir su concentración o para estimular su degradación, por ejemplo, haciendo que el patógeno sea visible para los macrófagos que expresan FcR o células microgliales y, por lo tanto, volverlo inocuo. Como se ha demostrado adicionalmente en los ejemplos, dichos anticuerpos son terapéuticamente eficaces y son capaces tanto de suspender como de prevenir los efectos perjudiciales de proteínas patológicas anormales y agregados de éstas sin incrementar la frecuencia de microhemorragias cerebrales.

30 LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidad de Zúrich

35 <120> Procedimiento para proporcionar moléculas de unión y dianas específicas de enfermedad

<130> NE30A06/P-EPD2-WO

<150> US 60/878,831 40 <151>

<150> EP 07000211.8

<151>

45 <150> US 60/934,291

<151>

<150> EP 07020341.9

<151> 50

<160> 41

<170> PatentIn versión 3.5

55 <210> 1

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

60 <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(66)

<223> Péptido líder derivado de Vkappa I L5 humano, sitio de restricción Xba 1 introducido en 3’ de la secuencia

5 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (66)

<400> 1 10

<210> 2

<211>

22 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211>

372 25 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

región_V 30 <222> (1) .. (372)

<223> NI-101.10-secuencia de cadena pesada variable (Vh)

<220>

<221>

CDS 35 <222> (1) .. (372)

<400> 3

<210> 4

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

región_V 10 <222> (1) .. (372)

<223> NI-101.11-secuencia de cadena pesada variable (Vh)

<220>

<221>

CDS 15 <222> (1) .. (372)

<400> 5

<210> 6 5 <211> 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6 10

<210> 7

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

región_V 10 <222> (1) .. (327)

<223> NI-101.10 and NI-101-11-secuencia de cadena ligera kappa variable (Vkappa)

<220>

<221>

CDS 15 <222> (1) .. (327)

<400> 7

<210> 8

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

región_V 10 <222> (1) .. (381)

<223> NI-101.12-secuencia de cadena pesada variable (Vh)

<220>

<221>

CDS 15 <222> (1)..(381)

<400> 9

<210> 10 5 <211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10 10

<210> 11

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

región_V 10 <222> (1) .. (330)

<223> NI-101.12-secuencia de cadena ligera kappa variable (Vkappa)

<220>

<221>

CDS 15 <222> (1) .. (330)

<400> 11

<210> 12

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

región_V 10 <222> (1) .. (363)

<223> NI-101.13-secuencia de cadena pesada variable (Vh)

<220>

<221>

CDS 15 <222> (1) .. (363)

<400> 13

<210> 14

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

5 <400> 14

<210> 15 10 <211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

15 <221> región_V

<222> (1)..(330)

<223> NI-101.13-secuencia de cadena ligera lambda variable (Vlambda)

<220>

20 <221> CDS

<222> (1) .. (330)

<400> 15

<210> 16 5 <211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16 10

<210> 17

<211> 5 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223>

región determinante de la complementariedad (CDR) 10 <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (5)

<223>

Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.10 Vh, CDR1 15

<400> 17

20 <210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE 30 <222> (1) .. (17)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.10 Vh, CDR2

<400> 18

<210> 19

<211> 15

<212> PRT 10 <213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

15 <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (15)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.10 Vh, CDR3

20 <400> 19

<210> 20 25 <211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (5)

35 <223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.11 y NI-101.12F6A Vh, CDR1

<400> 20

<210> 21

<211> 17

<212> PRT 45 <213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

50 <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (17)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.11 y NI-101.12F6A Vh,

CDR2

<400> 21

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (15)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.11 y NI-101.12F6A Vh, CDR3

<400> 22

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (11)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.10, NI-101.11 y NI-101.12F6A Vkappa, CDR1

<400> 23

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (7)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.10, NI-101.11 y NI-101.12F6A Vkappa, CDR2

<400> 24

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (9)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.10, NI-101.11 y NI-101.12F6A Vkappa, CDR3

<400> 25

<210> 26

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (5)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.12 Vh, CDR1

<400> 26

<210> 27

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (19)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.12 Vh, CDR2

<400> 27

<210> 28

<211> 17

<212> PRT 10 <213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

15 <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (17)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.12 Vh, CDR3

20 <400> 28

<210> 29 25 <211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(11) 35 <223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.12 Vkappa, CDR1

<400> 29

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213>

Artificial 45

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (7)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.12 Vkappa, CDR2

<400> 30

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (9)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.12 Vkappa, CDR3

<400> 31

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (7)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.13 Vh, CDR1

<400> 32

<210> 33

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (16)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.13 Vh, CDR2

<400> 33

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (11)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.13 Vh, CDR3

<400> 34

<210> 35

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (13)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.13 Vlambda, CDR1

<400> 35

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (7)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.13 Vlambda, CDR2

<400> 36

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> región determinante de la complementariedad (CDR)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (11)

<223> Denominación de secuencias proteicas de CDR en la Nomenclatura Kabat de NI-101.13 Vlambda, CDR3

<400> 37

<210> 38

<211> 372

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> región_V

<222> (1) .. (372)

<223> NI-101.12F6A-secuencia de cadena pesada variable (Vh)

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (372)

<400> 38

<210> 39

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 324

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 10

<220>

<221> región_V

<222> (1) .. (324)

<223> NI-101.12F6A-secuencia de cadena ligera kappa variable (Vkappa) 15

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (324)

20 <400> 40 <210> 41

<213> Homo sapiens

<400> 41

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a betaamiloide, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: una región variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 39; y una región variable de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 41.

2. 2.

   El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que es un anticuerpo humano de isotipo IgG.

3. 3.

   El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que es un anticuerpo humano de isotipo IgG1.

4. 4.

   El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera kappa humana.

5. 5.

   El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que es un fragmento de unión a antígeno seleccionado de entre el grupo que consiste en un fragmento Fv de cadena sencilla, un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')2.

6. 6.

   Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. 7.

   Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6.

8. 8.

   Una célula huésped aislada que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7,

   o dos vectores de expresión, en la que el primer vector de expresión codifica la región variable de cadena pesada y el segundo vector de expresión codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
9. 9. Un procedimiento para preparar un anticuerpo anti-beta-amiloide o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho procedimiento

   (a)

   cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8 en un cultivo celular; y

   (b)

   aislar el anticuerpo anti-beta-amiloide o fragmento de unión a antígeno del mismo a partir del cultivo celular.

10. 10.

    Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo codificado por el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6 u obtenible mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9.

11. 11.

    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 10 para uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, disfunción cognitiva leve o acumulación o depósito anormal de beta-amiloide en el sistema nervioso central en un sujeto humano.

12. 12.

    El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intranasal, por vía parenteral o como un aerosol.

13. 13.

    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. 14.

    Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 10 unido a una etiqueta detectable.

15. 15.

    La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en la que la etiqueta detectable es una enzima, grupo prostético, material fluorescente, material luminiscente, material bioluminiscente, material radiactivo, metal que emite positrones, o ion metálico paramagnético no radiactivo.

16. 16.

    La composición de acuerdo con la reivindicación 14 o 15 para uso en la detección in vivo de depósito de beta-amiloide en el cerebro de un sujeto humano.

17. 17.

    La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 16, en la que el depósito de beta-amiloide

    se detecta mediante tomografía de emisión de positrones.

    [ug/ml]