ES2751160T3 - Anticuerpos humanos anti-SOD1 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-SOD1 monoclonal humano-murino humano o quimérico o un fragmento de unión a SOD1 del mismo, caracterizado porque el anticuerpo es capaz de unirse a SOD1 mal plegada o agregada; y en donde el anticuerpo reconoce preferentemente la SOD1 mal plegada o agregada sobre los dímeros fisiológicos de SOD1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo se une específicamente a un epítopo de SOD1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos GGPKDEERHVG (SEQ ID NO: 51) y comprende en su región variable las seis CDR en el orden que se representa en la Figura 1B (NI-204.12G7).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos humanos anti-SOD1

Campo de la invención

La presente invención generalmente se refiere a moléculas novedosas que se unen específicamente a la superóxido dismutasa [Cu-Zn] también conocida como superóxido dismutasa 1 o SOD1, particularmente a anticuerpos humanos, así como también a fragmentos, derivados y variantes de los mismos que reconocen la proteína SOD1, y formas mal plegadas/agregadas de SOD1. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas y de diagnóstico que comprenden tales moléculas de unión, anticuerpos y mimetizadores de los mismos, valiosos tanto como herramienta de diagnóstico para identificar SOD1 y especies de SOD1 mal plegadas/agregadas en plasma y CSF y también en estrategias de vacunación pasiva para tratar trastornos relacionados con SOD1 mal plegada/agregada, tal como la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), también conocida como enfermedad de Lou Gehrig o enfermedad de Charcot.

Antecedentes de la invención

La acumulación, las modificaciones y la agregación de proteínas son aspectos patológicos de numerosas enfermedades neurodegenerativas. Un subgrupo de enfermedades neurodegenerativas, conocidas como enfermedades de las neuronas motoras, se caracteriza por la degeneración gradual y la muerte de las neuronas motoras. La esclerosis lateral amiotrófica (ALS), uno de los miembros más comunes de este grupo de trastornos, es una enfermedad neurológica de rápido progreso e invariablemente mortal que ataca a las neuronas responsables del control de los músculos voluntarios, específicamente las neuronas motoras de la médula espinal, el tronco encefálico y la corteza motora Bruijn y otros, Annu. Rev. Neurosci.

27 (2004), 723-749) En 90 a 95 por ciento de todos los casos de ALS, se desconoce la etiología de la enfermedad, sin factores de riesgo claramente asociados (ALS esporádica, sALS). Solo del 5 al 10 por ciento de todos los casos de ALS son hereditarios (ALS familiar, fALS), y aproximadamente el 20 por ciento de ellos resulta de mutaciones en el gen que produce la enzima superóxido dismutasa [Cu-Zn] también conocida como superóxido dismutasa 1 o SOD1 (Bruijn y otros, Annu. Rev. Neurosci. 27 (2004), 723-749; Valentine y otros, Annu. Rev. Biochem. 74 (2005), 563-593; Andersen, Curr. Neurol Neurosci. Rep. 6 (2006), 37-46)

La SOD1 humana es una metaloenzima homodimérica de 32 kDa, con el locus genético en el cromosoma 21, localizada predominantemente en el citosol, el núcleo y los peroxisomas, pero también en el espacio intermembrana mitocondrial de las células eucariotas. Contiene un sitio activo que une un ion de cobre catalítico y un ion de zinc estructural. El papel funcional de SOD1 es actuar como una enzima antioxidante que cataliza la dismutación del radical superóxido en dioxígeno y peróxido de hidrógeno, lo que reduce de ese modo la concentración de superóxido en el estado estacionario y el estrés oxidativo en la célula (Fridovich, Science 201 (1978), 875-879)

Se conocen más de 100 mutaciones diferentes, diseminadas por toda la proteína SOD1 (http://alsod.iop.kcl.ac.uk/; Andersen, Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 1 Suppl. 1 (2000), S31-42; Andersen y otros, Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 2 (2001), 63-69; Gaudette y otros, Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 1 (2000), 83-89) y todas, excepto la mutación D90A, causan una enfermedad dominantemente hereditaria. No se aclara por completo cómo la SOD1 mutante conduce a la ALS. Mientras que algunas de las mutaciones afectan de manera diferente la estabilidad, la afinidad por los iones metálicos y la actividad enzimática de la proteína SOD1 mutante respectiva, otras no (Valentine y otros, Annu. Rev. Biochem. 74 (2005), 563-593; Valentine y Hart, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 100 (2003), 3617-3622; Lindberg y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 102, 9754-9759; Taylor y otros, Science 296 (2005), 1991-1995) Sin embargo, la herencia dominante de la enfermedad en combinación con el hecho de que los ratones nulos en SOD1 no desarrollan ALS (Reaume y otros, Nat. Genet. 13 (1996), 43-47) sugiere que la toxicidad mediada por SOD1 en ALS no es causada por una pérdida, sino por una ganancia de una o más funciones tóxicas debido a las mutaciones.

Tres (G37R, G85R y G93A) de las mutaciones humanas conocidas se han caracterizado ampliamente en modelos de ratones transgénicos (Bruijn y Cleveland, Neuropathol. Appl. Neurobiol. 22 (1996), 373-87; Gurney, N. Engl. J. Med.

331(1994), 1721-1722; Ripps y otros Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 689-93; Wong y otros, Neuron 14(1995), 1105­ 16). Las proteínas mutantes humanas se expresan de forma ubicua a niveles iguales o varias veces mayores que la SOD1 endógena de ratón. Contrariamente a la sobreexpresión de SOD1 humana de tipo salvaje, la sobreexpresión de las formas mutantes conduce al desarrollo de ALS en los animales con una patología similar a la enfermedad humana. Por ejemplo, comparable a los tejidos de pacientes con ALS, se han encontrado inclusiones proteicas ricas en agregados de SOD1 mutante en las neuronas y los astrocitos (Stieber y otros, Neurol. Sci. 173 (2000), 53-62) como depósitos pericariales y como complejos macromoleculares asociados con varios compartimentos mitocondriales (Manfredi y Xu, Mitochondrion 5 (2005), 77-87), y dentro del retículo endoplásmico (Kikuchi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (2006), 6025­ 6030).

Las inclusiones no contienen SOD1 únicamente. Uno de los compuestos adicionales, probablemente causantes de la ALS, es la proteína 43 de unión al ADN TAR (TDP-43). Recientemente se reportaron mutaciones patógenas en el gen que codifica TDP-43 (TARDBP) en pacientes con ALS familiar y esporádica y parecen ser responsables de al menos el 3,3 % de los casos de fALSNeumann y otros, Science 314 (2006), 130-133; Rutherford y otros, PLoS Genet. 4 (2008), e1000193)

Se ha reportado además que SOD1 es una diana principal del daño oxidativo en cerebros de pacientes con la Enfermedad de Alzheimer (AD) y la Enfermedad de Parkinson (PD). Se incrementó el nivel total de SOD1 y se encontraron agregados proteicos que se asocian con placas seniles amiloides y ovillos neurofibrilares en cerebros con AD (Choi y otros, J. Biol. Chem 280 (2005), 11648-11655)

Se desconoce el mecanismo exacto que conduce a la agregación de SOD1. Sin embargo, las hipótesis predominantes sugieren la agregación de SOD1 como una consecuencia del mal plegamiento de las proteínas debido a cambios conformacionales inducidos por la mutación (Bruijn y otros, Science 281 (1998), 1851-1854; Chattopadhyay y Valentine, Antioxid. Redox. Signal 11 (2009), 1603-1614; Furukawa y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006), 7148-7153; Prudencio y otros, Hum. Mol. Genet. 18 (2009), 3217-3226; Wang y otros, PLoS Biol. 6, e170 (2008)). El mutante mal plegado o wtSOD1 también se secreta por las células gliales al entorno extracelular, donde puede desencadenar la muerte selectiva de las neuronas motoras (Urushitani y otros, Nature Neuroscience 9 (2006). 108-118) Esto ofrece una posible explicación de la naturaleza no autónoma celular de la toxicidad de la SOD1 mutante y la rápida progresión de la enfermedad una vez que se desarrollan los primeros síntomas.

Como ya se mencionó, no está aclarada la etiología de las formas espontáneas de ALS que representan el 90-95 por ciento de todos los incidentes. Sin embargo, también se cree que, de forma similar a las observaciones relativas a las formas familiares de ALS, el mal plegamiento de SOD1 de tipo salvaje (wt) se asocia con la mayoría de los casos esporádicos de ALS (Bosco y otros, Nature Neuroscience 13 (2010), 1396-1403) SOD1 de tipo salvaje es objeto de modificaciones postraduccionales masivas, tales como la dimerización de la subunidad, la construcción del enlace disulfuro intrasubunidad entre los residuos Cys57 y Cys146, y la coordinación de cobre y zinc. Se ha demostrado que las interrupciones de estos procesos causan que la So D1 de tipo salvaje se agregue (Durazo y otros, J. Biol. Chem. 277 (2009), 15923-15931; Estévez y otros, Science 286 (1999), 2498-2500; Rakhit y otros, J. Biol. Chem. 279 (2004), 15499­ 15504; Lindberg y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004), 15893-15898) lo que proporciona, por lo tanto, un posible modelo patogénico para las formas espontáneas de ALS. Las inmunoterapias dirigidas a la SOD1 mutante o mal plegada han producido resultados alentadores en modelos animales para formas familiares de ALS. La inmunización activa retrasó el inicio de la enfermedad y la mortalidad, atenuó la pérdida de neuronas motoras y redujo los niveles de SOD1 en ratones transgénicos SOD1. La extensión de la vida se correlacionó con los títulos de anticuerpos (Urushitani y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (2007), 2495-2500; Cashman, NDI conference Uppsala 2009, Takeuchi y otros, J Neuropathol Exp Neurol. (2010), 1044-1056).

La inmunización pasiva retrasó la pérdida de peso corporal y el deterioro del reflejo de las extremidades posteriores y también extendió la vida (Urushitani y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (2007), 2495-2500; Cashman, n Di conference Uppsala 2009; Gros-Louis Fetal., J. Neurochem 2010).

Estos hallazgos destacan el beneficio potencial asociado con los enfoques de inmunoterapia activa dirigida a SOD1. Independientemente de este alto potencial, los enfoques para la inmunoterapia activa y pasiva pueden producir efectos variables con respecto a su eficacia hacia criterios de valoración terapéuticos específicos. Como se muestra para los enfoques dirigidos a Ap en modelos preclínicos de ratón de AD o en humanos, también pueden estar asociados con eventos adversos como enfermedad autoinmune, meningoencefalitis, aumento de la angiopatía amiloide cerebral y la inducción de hemorragias cerebrales (Pfeifer y otros, Science 298 (2002), 1379; Furlan y otros, Brain 126 (2003), 285­ 291; Wilcock y otros, J. Neuroinflammation 1:24 (2004); Lee at al., Fe Bs Lett. 579 (2005), 2564-8; Wilcock y otros, Neuroscience 144 (2007), 950-960; Schenk, Nat. Rev. Neurosci. 3 (2002), 824-828; Orgogozo y otros, Neurology 61 (2003), 46-54). Esto podría ser un problema menor en el contexto de la ALS sin la aparición de depósitos de proteínas extracelulares masivos, pero debe tenerse en cuenta, sin embargo.

El documento núm. US2008/206251 describe varios anticuerpos monoclonales de ratón anti SOD1 humana, que se unen a epítopos presentados o accesibles en formas no nativas de SOD1. Resumiendo lo anterior, se necesitan urgentemente nuevas estrategias terapéuticas para abordar las proteínas SOD1 mal plegadas/agregadas con una terapia eficaz y segura.

La inmunización pasiva con anticuerpos humanos que están optimizados evolutivamente y con afinidad madurada por el sistema inmune humano proporcionaría una nueva vía terapéutica prometedora con una alta probabilidad de excelente eficacia y seguridad.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a las modalidades como se caracterizan en las reivindicaciones y hace uso de la respuesta inmune específica a SOD1 de sujetos humanos sanos para el aislamiento de anticuerpos monoclonales humanos específicos anti-SOD1 naturales. En particular, los experimentos realizados de acuerdo con la presente invención tuvieron éxito en el aislamiento de anticuerpos monoclonales específicos contra SOD1 de un grupo de sujetos humanos sanos sin signos de ALS.

La presente invención se dirige por lo tanto a anticuerpos humanos, fragmentos de unión a antígeno y moléculas de unión a antígeno similares como se caracterizan en la reivindicación 1, que son capaces de reconocer específicamente SOD1. Por "reconocer específicamente SOD1", "anticuerpo específico contra/para SOD1" y "anticuerpo anti-SOD1" significa específicamente, general y colectivamente, anticuerpos contra la forma nativa de SOD1, o isoformas de SOD1 mal plegadas o agregadas. Se proporcionan en la presente descripción anticuerpos humanos selectivos para formas completas, mal plegadas y agregadas.

En particular, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo demuestra las características de unión inmunológica de un anticuerpo caracterizado por las regiones variables Vh y Vl como se establece en la Figura 1B (NI-204.12G7).

El fragmento de unión a antígeno del anticuerpo puede ser un fragmento Fv de cadena sencilla, un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')2, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno. En una modalidad específica, a continuación, el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo de isotipo IgG humano. Alternativamente, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico humano-murino o murinizado, siendo este último particularmente útil para los métodos de diagnóstico y estudios en animales.

Además, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo de la presente invención o fragmentos activos del mismo y a métodos inmunoterapéuticos e de inmunodiagnóstico que usan tales composiciones en la prevención, diagnóstico o tratamiento de trastornos relacionados con SOD1 mal plegada/agregada, tal como ALS, en donde una cantidad efectiva de la composición se administra a un paciente que la necesita.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican las regiones variables de las cadenas de inmunoglobulina del anticuerpo de la invención. Dicha región variable comprende al menos las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena Vh y Vl de la región variable como se establece en la Figura 1B.

En consecuencia, la presente invención también abarca los vectores que comprenden dichos polinucleótidos y las células huésped transformadas con los mismos, así como también su uso para la producción de un anticuerpo y moléculas de unión equivalentes que son específicas para SOD1. En la técnica se conocen los medios y métodos para la producción recombinante de anticuerpos y miméticos de los mismos, así como también los métodos de cribado de moléculas de unión competidoras, que pueden o no ser anticuerpos. Sin embargo, como se describe en la presente descripción, en particular con respecto a las aplicaciones terapéuticas en humanos, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo humano en el sentido de que la aplicación de dicho anticuerpo está sustancialmente libre de una respuesta inmune dirigida contra dicho anticuerpo observado de cualquier otra manera para anticuerpos quiméricos e incluso humanizados.

Además, en la presente descripción se describen composiciones y métodos que pueden usarse para identificar SOD1 en muestras. Los anticuerpos anti-SOD1 descritos pueden usarse para cribar en la sangre humana, CSF y orina la presencia de SOD1 en muestras, por ejemplo, mediante el uso de un ensayo basado en ELISA o adaptado a la superficie. Los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden ayudar en trastornos relacionados con la SOD1 mal plegada/agregada, tal como el diagnóstico de ALS, y pueden usarse para monitorear la progresión de la enfermedad y la eficacia terapéutica.

Por lo tanto, es un objeto particular de la presente invención proporcionar anticuerpos para usar en métodos para tratar, diagnosticar o prevenir una enfermedad relacionada con SOD1 mal plegada/agregada tal como la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). Los métodos comprenden administrar una concentración efectiva de un anticuerpo humano o derivado de anticuerpo al sujeto donde el anticuerpo se dirige a SOD1.

Otras modalidades de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción y los Ejemplos que siguen.

Breve descripción de las figuras

Figura 1:

Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región variable, es decir cadena pesada y cadena ligera kappa/lambda de los anticuerpos humanos NI-204.10D12 (A), NI-204.12G7 (B), NI-204.10A8 (C), NI-204.9F6 (D), NI-204.11F11 (E), NI-204.67E12 (F), NI-204.6H1 (G), NI-204.12G3 (H), NI-204.7G5 (I), NI-204.7B3 (J),NI-204.34A3 (K) y NI-204.25H3 (L). Las regiones marco (FR) y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se indican con las CDR subrayadas. También se indican la región de unión de cadena pesada (JH) y la región de unión de cadena ligera (JK). Debido a la estrategia de clonación, la secuencia de aminoácidos en el N-terminal de la cadena pesada y la cadena ligera puede contener alteraciones inducidas por el cebador en FR1, que sin embargo no afectan sustancialmente la actividad biológica del anticuerpo. Para proporcionar un anticuerpo humano consenso, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del clon original se alinearon y sintonizaron de acuerdo con las secuencias de la región variable de la línea germinal humana pertinente en la base de datos; ver, por ejemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) localizado por el Centro MRC para la Ingeniería de Proteínas (Cambridge, Reino Unido). Esos aminoácidos, que se consideran potencialmente desviados de la secuencia consenso de la línea germinal debido al cebador de la PCR y, por lo tanto, han sido reemplazados en la secuencia de aminoácidos, se indican en negrita.

Figura 2:

Especificidad de unión a la superóxido dismutasa 1 de anticuerpos humanos recombinantes. (A) Unión específica de NI-204.10D12 recombinante a s Od 1 humana en ELISA directo. (B) Unión específica de NI-204.12G7 recombinante a SOD1 humana en ELISA directo. (C) Unión específica de NI-204.10A8 recombinante a SOD1 humana en ELISA directo. (D) Unión específica de NI-204.9F6 recombinante a SOD1 humana en ELISA directo.

Figura 3:

Determinación de EC50 de los anticuerpos anti-SOD1 recombinantes derivados de humanos. (A) Las placas ELISA se recubrieron con SOD1 humana recombinante y se incubaron con las concentraciones indicadas de anticuerpos recombinantes derivados de humanos NI-204.10D12 (•), NI-204.10A8 (■), NI-204.9F6 (▲) o NI-204.12G7 (▼). Los anticuerpos NI-204.10D12, NI-204.10A8 y NI-204.12G7 se unen con alta afinidad a la SOD1 humana recombinante con una EC50 de 10,0 nM, 2,7 nM y 0,4 nM, respectivamente. NI-204.9F6 se une a SOD1 recombinante con una EC50 en el intervalo nanomolar de 104,8 nM.

Figura 4:

Análisis de EC50 a concentraciones de recubrimiento crecientes de SOD1 humana que favorece la formación de epítopos conformacionales. Determinación de EC50 de los anticuerpos humanos NI-204.10D12 (A), NI-204.10A8 (B), NI-204-9F6 (C) y NI-204.12G7 (D) y afinidad de unión del anticuerpo monoclonal murino SOD-1 72B1 (E) por s Od 1 humana recombinante a una concentración de recubrimiento creciente (▼ 30 pg/ml; ▲ 10 pg/ml; ■ 1 pg/ml; • 0,1 pg/ml; concentración de recubrimiento de SOD1 humana recombinante) mediante el uso de ELISA directo. Los valores de EC50 determinados se indican en la Tabla (F) a continuación. El anticuerpo NI-204.10D12 (A) y el anticuerpo NI-204.12G7 (D) se dirigen preferentemente a un epítopo de SOD1 humana que es probablemente el más expuesto o formado a altas concentraciones de recubrimiento y un mal plegamiento o agregación concomitante de SOD1 humana recombinante. Tanto el anticuerpo NI-204.10A8 (B) como NI-204.9F6 (C) reconocen un epítopo de SOD1 humana que está presente tanto en la conformación de la proteína fisiológica, así como también en la SOD1 mal plegada/agregada.

Figura 5:

Determinación de EC50 de NI-204.10D12, NI-204.10A8, NI-204.12G7 y NI-204.9F6 y afinidad de unión de SOD-1 72B1 para agregados (■) y dímeros fisiológicos (•) de la superóxido dismutasa 1 mediante el uso de ELISA directo. (A) Unión de alta afinidad de NI-204.10D12 recombinante a SOD1 humana mal plegada/agregada pero no a dímeros fisiológicos de SOD1 humana. (B) Unión de alta afinidad de NI-204.10A8 tanto a dímeros fisiológicos de SOD1 humana como a SOD1 humana mal plegada/agregada. (C) Unión de alta afinidad de NI-204.12G7 recombinante a SOD1 humana mal plegada/agregada pero no a dímeros fisiológicos de SOD1 humana. (D) Unión ligeramente preferencial de NI-204.9F6 recombinante a SOD1 humana mal plegada/agregada. (E) Ninguna unión preferencial a SOD1 humana mal plegada/agregada del anticuerpo SOD-1 72B1 disponible comercialmente.

Figura 6:

NI-204.10D12, NI-204.10A8, NI-204.12G7 y NI-209.9F6 reconocen los agregados patológicos de la superóxido dismutasa 1 en modelos transgénicos de ratones SOD1G93A. El análisis inmunohistoquímico muestra una detección de SOD1 patológica y/o SOD1 fisiológica en la médula espinal de animales transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J en la etapa terminal de la enfermedad con anticuerpos NI-204.10D12 quimérico (A); con NI-204-10A8 humano (b ), con NI-204.12G7 humano (C), con NI-204.9F6 humano (D) y con anti-SOD1 EPR1726 (E).

Figura 7:

NI.204.10D12 se une al dominio central de SOD1 humana según lo evaluado por análisis pepscan. La unión de anticuerpos se produce en los aminoácidos 85-107 que cubren los péptidos. El epítopo de unión de NI.204.10D12 comprende en consecuencia los aminoácidos 93-99 con la secuencia DGVADVS (SEQ ID NO: 2).

Figura 8:

El anticuerpo recombinante derivado de humanos NI-204.10D12 se une con igual afinidad a los péptidos sintéticos de SOD1 que tienen la secuencia de aminoácidos derivada de las proteínas SOD1 humana de tipo salvaje, la mutante humana G93A y la murina de tipo salvaje. Estos péptidos sintéticos abarcan el epítopo de unión de NI-204.10D12 identificado.

Figura 9:

Análisis inmunohistoquímico de médulas espinales transgénicas de B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J en la etapa terminal de la enfermedad. Detección de SOD1 patológica y/o SOD1 fisiológica en la médula espinal de animal transgénico B6.Cg-Tg(SOD1 *G93A)1Gur/J en la etapa terminal de la enfermedad con NI-204.10D12, 50 nM (A); NI-204-12G7, 5 nM (B); NI 204.11F11, 5 nM (C); NI-204.10A8, 50 nM (D); NI-204.67E12, 5 nM (E); NI.204.6H1, 5 nM (F); NI.204.12G3, 50 nM (G); NI.204.7G5, 50 nM (H); NI.204.25H3, 50 nM (I); NI.204.34A3, 50 nM (J); NI.204.7B3, 50 nM (K) y los anticuerpos de control C4F6 (L) y B8H10 (M).

Figura 10:

(A) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J inmunizados pasivamente con el anticuerpo NI-204.10D12. Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J tratados intraventricularmente con PbS (•) o el anticuerpo específico contra SOD1 NI-204.10D12 (■) (B) Atenuación de la pérdida de peso corporal en ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J tras la inmunización pasiva con el anticuerpo NI-204.10D12. Peso corporal de ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J tratados intraventricularmente con PBS (línea discontinua) o anticuerpo específico contra SOD1 NI-204.10D12 (línea continua) expresado como porcentaje del peso corporal inicial determinado después de la implantación quirúrgica de la bomba; * p< 0,05.

Figura 11

Mejora de la fuerza de agarre en ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J por inmunización pasiva con el anticuerpo NI-204.10D12. Fuerza de agarre de ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J tratados intraventricularmente con PBS (línea discontinua) o anticuerpo específico contra SOD1 NI-204.10D12 (línea continua) expresado como porcentaje de fuerza de agarre al inicio después de la implantación quirúrgica de la bomba; * p< 0,05.

Figura 12

Atenuación de la pérdida de neuronas motoras en la médula espinal de ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J tras el tratamiento crónico con el anticuerpo NI-204.10D12. El recuento de neuronas motoras en las astas ventrales de la médula espinal lumbar en ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J tratados intraventricularmente con PBS o anticuerpo específico contra SOD1 NI-204.10D12. (A) Recuento de neuronas motoras con la tinción de Nissl. Los datos representan el promedio ± SEM. (B) Recuento de neuronas motoras con la tinción de NeuN. Los datos representan el promedio ± SEM; ** p< 0,01.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

La acumulación, las modificaciones y la agregación de proteínas son aspectos patológicos de numerosas enfermedades neurodegenerativas como las enfermedades de Huntington, de Alzheimer (AD) y de Parkinson (PD) (Taylor y otros, Science 296 (2005), 1991-1995) El mal plegamiento, la agregación y la precipitación de proteínas parecen estar directamente relacionadas con la neurotoxicidad en estas enfermedades. La proteína superóxido dismutasa (SOD1) de cobre-zinc, homodimérica nativa (variantes de tipo salvaje y ALS1) tiene una tendencia a formar agregados fibrilares en ausencia del enlace disulfuro intramolecular o de iones de zinc unidos. Relacionado con la SOD1 mal plegada/agregada se encuentran trastornos como la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), también conocida como enfermedad de Lou Gehrig, o enfermedad de Charcot. Además, como se mencionó anteriormente, se han encontrado modificaciones oxidativas de SOD1 que también pueden inducir el mal plegamiento de la proteína en AD y PD, y los agregados de SOD1 se asocian con placas amiloides y ovillos neurofibrilares en pacientes con AD (Choi y otros, J. Biol. Chem 280 (2005), 11648-11655) lo que implica un posible papel de SOD1 en la patología de estas enfermedades.

Las características clínicas de la ALS son la degeneración gradual y la muerte de las neuronas motoras responsables del control de los músculos voluntarios, específicamente las neuronas motoras en la médula espinal, el tronco encefálico y la corteza motora. El curso de la enfermedad es rápidamente progresivo con debilitamiento muscular gradual como un signo distintivo, desgaste (atrofia) y espasmos (fasciculaciones), que ocurre en el 60 % de los pacientes e invariablemente mortal, principalmente por insuficiencia respiratoria, con un tiempo medio de supervivencia de tres a cinco años.

La mayoría de los casos de ALS (-90-95 %) son esporádicos (sALS), el resto son familiares hereditarios (fALS). Aproximadamente el 20 % de las fALS muestran una asociación genética con las mutaciones en el gen de SOD1. El mecanismo molecular de la ALS permanece sin elucidar en la mayoría de los casos, sin embargo, algunos estudios proporcionan datos que muestran que se pueden encontrar especies aberrantes de SOD1 en pacientes con sALS y fALS, lo que sugiere esto un posible origen común (Gruzman y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 104 (2007), 12524­ 12529)

En modelos de ratones ALS transgénicos, comparables a los tejidos de pacientes con ALS, se han encontrado inclusiones proteicas ricas en agregados de SOD1 mutante en las neuronas y los astrocitos (Stiebery otros, Neurol. Sci. 173 (2000), 53-62) como depósitos pericariales y como complejos macromoleculares asociados con varios compartimentos mitocondriales (Manfredi y Xu, Mitochondrion 5 (2005), 77-87), y dentro del retículo endoplásmico (Kikuchi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (2006), 6025-6030). Además, el mutante mal plegado o wtSOD1 también se secreta por las células gliales al entorno extracelular, donde puede desencadenar la muerte selectiva de las neuronas motoras (Urushitani y otros, Nature Neuroscience 9 (2006). 108-118) Esto ofrece una posible explicación de la naturaleza no autónoma celular observada de la toxicidad de la SOD1 mutante y la rápida progresión de la enfermedad una vez que se desarrollan los primeros síntomas.

El término "SOD1" se usa de forma indistinta para referirse específicamente a la forma monómera o dimérica nativa de SOD1. El término "SOD1" también se usa para identificar generalmente otros confórmeros de SOD1, por ejemplo, oligómeros o agregados de SOD1. El término "SOD1" también se usa para referirse colectivamente a todos los tipos y formas de SOD1.

La secuencia de proteínas para SOD1 humana es:

M ATK A V C VLKGDGP V QGIINFEQKESN GP VK V WGSIKGLTEGLHGFH VHEF GDNT A

GCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCII

GRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ (SEQ ID NO: 1).

La secuencia de aminoácidos de SOD1 de 154 aminoácidos se puede recuperar de la literatura y las bases de datos pertinentes; véase, por ejemplo, Sherman y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80 (1983), 5465-9; Kajihara y otros, J. Biochem. 104 (1988), 851-4; GenBank swissprot: locus SODC HUMANA, número de acceso P00441. La secuencia de aminoácidos de SOD1 humana "de tipo salvaje" o recombinante se representa por la secuencia mencionada anteriormente de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

Los anticuerpos humanos anti-SOD1 descritos en la presente descripción se unen específicamente a SOD1 y sus epítopos y a diversas conformaciones de SOD1 y sus epítopos. Por ejemplo, se describen en la presente descripción anticuerpos que se unen específicamente a SOD1, SOD1 de longitud completa y SOD1 patológicamente mal plegada/agregada. Como se usa en la presente descripción, la referencia a un anticuerpo que "se une específicamente", "se une selectivamente" o "se une preferentemente" a SOD1 se refiere a un anticuerpo que no se une a otras proteínas no relacionadas. En un ejemplo, un anticuerpo contra SOD1 descrito en la presente descripción puede unirse a SOD1 o un epítopo de la misma y no mostrar unión por encima de aproximadamente 2 veces el basal para otras proteínas. Un anticuerpo que "se une específicamente" o "se une selectivamente" a un confórmero de SOD1 se refiere a un anticuerpo que no se une a todas las conformaciones de SOD1, es decir, no se une a al menos otro confórmero de SOD1. Por ejemplo, en la presente descripción se describen anticuerpos que pueden unirse preferentemente a formas agregadas de SOD1 tanto in vitro como en tejidos con ALS. Dado que los anticuerpos humanos anti-SOD1 de la presente invención se han aislado de un grupo de sujetos humanos sanos que exhiben una respuesta inmune específica contra SOD1, los anticuerpos contra SOD1 de la presente invención también pueden denominarse "autoanticuerpos humanos" para enfatizar que de hecho, esos anticuerpos se expresaron por los sujetos y no se han aislado de, por ejemplo, una biblioteca de fagos que expresan inmunoglobulinas humanas, que hasta ahora representa un método común para tratar de proporcionar anticuerpos similares a los humanos.

El término "polinucleótido" pretende abarcar un ácido nucleico singular, así como también ácidos nucleicos plurales, y se refiere a una molécula o constructo de ácido nucleico aislado, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, como el que se encuentra en los ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). El término "ácido nucleico" se refiere a uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por polinucleótido o de ácido nucleico "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha retirado de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un anticuerpo contenido en un vector se considera aislado para los fines de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados, de acuerdo con la presente invención, incluyen además moléculas de este tipo producidas sintéticamente. Además, el polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, un sitio de unión a ribosoma o un terminador de la transcripción.

Como se usa en la presente descripción, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico la cual consiste en codones que se traducen a aminoácidos. Aunque un "codón de parada" (Ta G, TGA o TAA) no se traduce a un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosoma, terminadores de la transcripción, intrones, y similares, no son parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes de la presente invención pueden estar presentes en un solo constructo de polinucleótidos, por ejemplo, en un solo vector, o en constructos de polinucleótidos separados, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una sola región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un solo vector puede codificar por separado una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas a un ácido nucleico que codifica una molécula de unión, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal de secreción o un dominio funcional heterólogo.

En ciertas modalidades, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso del ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción asociados operablemente con una o más regiones codificantes. Una asociación operable es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal manera que coloca la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tal como una región codificante de polipéptidos y un promotor asociado a esta) están "asociados operablemente" o "unidos operablemente" si la inducción de la función del promotor resulta en la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión del producto génico o interfiere con la capacidad de transcribir el molde de ADN. Por lo tanto, una región promotora sería asociada operablemente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden asociarse operablemente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de la célula. Los promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción se describen en la presente descripción.

A menos que se indique lo contrario, los términos "trastorno" y "enfermedad" se usan indistintamente en la presente descripción.

Una "molécula de unión" como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a los anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a SOD1

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan son indistintamente en la presente descripción. Un anticuerpo o inmunoglobulina es una molécula de unión a SOD1 que comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada, y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras básicas de las inmunoglobulinas en los sistemas de vertebrados se conocen relativamente bien; ver, por ejemplo, Harlow y otros, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da edición 1988).

Como se discutirá con más detalle a continuación, el término "inmunoglobulina" comprende varias clases amplias de polipéptidos que se pueden distinguir bioquímicamente. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (y, m, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, y1-y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos) por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la técnica en vista de la presente descripción y, en consecuencia, están dentro del alcance de la presente invención. Todas las clases de inmunoglobulina están claramente dentro del alcance de la presente invención, la siguiente discusión generalmente se dirigirá a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a la IgG, una molécula de inmunoglobulina estándar comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos de peso molecular aproximadamente de 23 000 Daltons, y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos de peso molecular de 53000-70 000. Las cuatro cadenas se unen típicamente por enlaces disulfuro en una configuración de "Y" en donde las cadenas ligeras sujetan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede unirse con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas se unen covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas se unen entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan por hibridomas, células B o células huésped manipuladas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el C-terminal en la parte inferior de cada cadena.

Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se usan funcionalmente. Con respecto a esto, se apreciará que los dominios variables de las porciones de cadena ligera (V^l) y pesada (V^h) determinan el reconocimiento y la especificidad a antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CHI, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor Fc, unión al complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se vuelven más distales del sitio de unión al antígeno o del amino terminal del anticuerpo. La porción N-terminal es una región variable y la porción C-terminal es una región constante; los dominios CH3 y CL en realidad comprenden el carboxi terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Como se indicó anteriormente, la región variable permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a los epítopos en los antígenos. Es decir, el dominio V^l y el dominio V^h, o subconjunto de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura cuaternaria del anticuerpo forma el sitio de unión a antígeno presente en el extremo de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión a antígeno se define por tres CDR en cada una de las cadenas Vh y Vl. Cualquier anticuerpo o fragmento de inmunoglobulina que contiene la estructura suficiente para unirse específicamente a SOD1 se indica en la presente descripción indistintamente como un "fragmento de unión" o un "fragmento inmunoespecífico".

En los anticuerpos presentes de manera natural, un anticuerpo comprende seis regiones hipervariables, a veces llamadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" presentes en cada dominio de unión a antígeno, que son secuencias cortas y no contiguas de aminoácidos que están posicionadas específicamente para formar el dominio de unión a antígeno ya que el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. Las "CDR" están flanqueadas por cuatro regiones "marco" o "FR" relativamente conservadas que muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de hoja p y las CDR forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja p. Por lo tanto, las regiones marco actúan para formar un soporte que proporciona el posicionamiento de las CDR en la orientación correcta mediante interacciones intercadenas y no covalentes. El dominio de unión a antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo conocido. Un experto en la técnica puede identificar fácilmente los aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones marco, respectivamente, para cualquier región variable de cadena pesada o ligera dada, dado que se han definido con precisión; ver, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., y otros, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917.

En el caso donde haya dos o más definiciones de un término que se usa y/o acepta dentro la técnica, la definición del término como se usa en la presente descripción pretende incluir todos esos significados a menos que se establezca explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinante de la complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación de antígeno no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de ambos polipéptidos de cadena pesada y ligera. Esta región en particular ha sido descrita por Kabat y otros, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, donde las definiciones incluyen superposición o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o sus variantes está destinada a estar dentro del alcance del término como se define y usa en la presente descripción. Los residuos de aminoácidos apropiados que abarcan las CDR definidas por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la Tabla I como una comparación. Los números exactos de residuos que abarcan una CDR particular variarán en dependencia de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar rutinariamente cuáles residuos comprenden una región hipervariable particular o CDR del subtipo de anticuerpo IgG humano dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

Tabla I: Definiciones de CDR1

Kabat y otros también definieron un sistema de numeración para las secuencias del dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia del dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Como se usa en la presente descripción, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat y otros, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983) A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de las posiciones específicas de los residuos de aminoácidos en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la presente invención son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, el cual sin embargo es teórico y puede no aplicarse de la misma manera a cada anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, en dependencia de la posición de la primera CDR, las siguientes CDR podrían desplazarse en cualquier dirección.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos inmunoespecíficos, variantes o derivados de los mismos de la descripción incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, multiespecíficos, humanos, primatizados, murinizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de unión a epítopos, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fvs unidos por disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden un dominio Vl o Vh, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (que incluyen por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra anticuerpos descritos en la presente descripción). Las moléculas scFv se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU.

5,892,019. Las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpo de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, y IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

En una modalidad, el anticuerpo de la presente invención no es IgM o un derivado del mismo con una estructura pentavalente. Particularmente, en aplicaciones específicas de la presente invención, especialmente en el uso terapéutico, las IgM son menos útiles que las IgG y otros anticuerpos bivalentes o las moléculas de unión correspondientes, dado que las IgM debido a su estructura pentavalente y la falta de maduración de la afinidad a menudo muestran reactividades cruzadas inespecíficas y muy baja afinidad.

El anticuerpo de la presente invención no es un anticuerpo policlonal, es decir consiste sustancialmente en una especie de anticuerpo particular en lugar de ser una mezcla obtenida de una muestra de inmunoglobulina plasmática.

Los fragmentos de anticuerpos, incluidos los anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender la(s) región(ones) variable(s) sola(s) o en combinación con la totalidad o una porción de lo siguiente: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención fragmentos de unión a SOD1 que comprenden cualquier combinación de región(ones) variable(s) con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3.

En un aspecto, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano aislado de un humano. Opcionalmente, la región marco del anticuerpo humano se alinea y adopta de acuerdo con las secuencias de la región variable de la línea germinal humana pertinentes en la base de datos; ver, por ejemplo, Vbase (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) localizado por el Centro MRC para la Ingeniería de Proteínas (Cambridge, Reino Unido). Por ejemplo, los aminoácidos considerados potencialmente desviados de la secuencia verdadera de la línea germinal podrían deberse a las secuencias del cebador de la PCR incorporadas durante el proceso de clonación. En comparación con los anticuerpos de tipo humano generados artificialmente, tal como los fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla (scFv) de una biblioteca de anticuerpos presentados en fagos o ratones xenogénicos, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención se caracteriza por (i) obtenerse mediante el uso de la respuesta inmune humana en lugar de la de sustitutos animales, es decir el anticuerpo se ha generado en respuesta a SOD1 natural en su conformación relevante en el cuerpo humano, (ii) haber protegido al individuo o es al menos significativo para la presencia de SOD1, y (iii) dado que el anticuerpo es de origen humano, los riesgos de reactividad cruzada contra antígenos propios se minimiza. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, los términos "anticuerpo monoclonal humano", "autoanticuerpo monoclonal humano", "anticuerpo humano" y similares se usan para indicar una molécula de unión a SOD1 que es de origen humano, es decir que se ha aislado de una célula humana tal como una célula B o hibridoma de la misma o cuyo ADNc se ha clonado directamente del ARNm de una célula humana, por ejemplo, una célula B de memoria humana. Un anticuerpo humano sigue siendo "humano" incluso si se realizan sustituciones de aminoácidos en el anticuerpo, por ejemplo, para mejorar las características de unión.

Los anticuerpos derivados de las bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describió anteriormente y, por ejemplo, en la patente de EE.u U núm. 5,939,598 de Kucherlapati y otros, se denominan anticuerpos de tipo humano para distinguirlos de los anticuerpos verdaderamente humanos de la presente invención.

Por ejemplo, el apareamiento de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de tipo humano, tales como anticuerpos sintéticos y semisintéticos, típicamente aislados de la presentación en fagos, no reflejan necesariamente el apareamiento original como ocurrió en la célula B humana original. En consecuencia, los fragmentos Fab y scFv obtenidos de bibliotecas de expresión recombinante como se usan comúnmente en la técnica anterior pueden considerarse artificiales con todos los posibles efectos asociados sobre la inmunogenicidad y la estabilidad.

Por el contrario, la presente invención proporciona anticuerpos maduros por afinidad aislados de sujetos humanos seleccionados, que se caracterizan por su utilidad terapéutica y su tolerancia en el hombre.

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo murinizado" o "inmunoglobulina murinizada" se refiere a un anticuerpo que comprende las CDR de un anticuerpo humano de la presente invención; y una región marco humana que contiene sustituciones y/o deleciones y/o inserciones de aminoácidos que se basan en una secuencia de anticuerpo de ratón. La inmunoglobulina humana que proporciona las CDR se llama la "parental" o "aceptora" y el anticuerpo de ratón que proporciona los cambios en el marco se denomina "donor". Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si lo están, son sustancialmente idénticas a las regiones constantes del anticuerpo de ratón, es decir, al menos aproximadamente 85-90 %, preferentemente aproximadamente 95 % o más idénticas. Por lo tanto, en algunas modalidades, una inmunoglobulina humana de cadena pesada o ligera murinizada de longitud completa contiene una región constante de ratón, las CDR humanas y un marco sustancialmente humano que tiene varias sustituciones de aminoácidos "murinizantes". Típicamente, un "anticuerpo murinizado" es un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable murinizada y/o una cadena pesada variable murinizada. Por ejemplo, un anticuerpo murinizado podría no abarcar un anticuerpo quimérico típico, por ejemplo, debido a que toda la región variable de un anticuerpo quimérico no es de ratón. Un anticuerpo modificado que ha sido "murinizado" por el proceso de "murinización" se une al mismo antígeno que el anticuerpo parental que proporciona las CDR y usualmente es menos inmunogénico en ratones, en comparación con el anticuerpo parental.

Como se usa en la presente descripción, el término "porción de cadena pesada" incluye las secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, una bisagra (por ejemplo, región de la bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3 o una variante o fragmento de la misma. Por ejemplo, un polipéptido de unión para usar en la invención puede comprender una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, y un dominio CH2; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, y un dominio CH3, o una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, un dominio CH2, y un dominio c H3. En otra modalidad, un polipéptido de la invención comprende una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH3. Además, un polipéptido de unión para usar en la invención puede carecer de al menos una porción de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2). Como se estableció anteriormente, un experto en la técnica entenderá que estos dominios (por ejemplo, las porciones de la cadena pesada) pueden modificarse de manera que varíen en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina presente de manera natural.

En ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente descripción, las porciones de cadena pesada de una cadena polipeptídica de un multímero son idénticas a las de una segunda cadena polipeptídica del multímero. Alternativamente, los monómeros de la invención que contienen porciones de cadena pesada no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de unión a la diana diferente, lo que forma, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o diacuerpo.

En otra modalidad, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente descripción están compuestos por una cadena polipeptídica sencilla tal como scFv y deben expresarse intracelularmente (intracuerpos) para potenciales aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo.

Las porciones de cadena pesada de un polipéptido de unión para usar en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente descripción pueden derivarse de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4. Como se usa en la presente descripción, el término "porción de cadena ligera" incluye las secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. Preferentemente, la porción de cadena ligera comprende al menos uno de un dominio Vl o CL.

Se cree que el tamaño mínimo de un epítopo peptídico o polipeptídico para un anticuerpo es de aproximadamente cuatro a cinco aminoácidos. Los epítopos peptídicos o polipeptídicos contienen preferentemente al menos siete, con mayor preferencia al menos nueve y con la máxima preferencia entre al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos. Dado que una CDR puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en su forma terciaria, los aminoácidos que comprenden un epítopo no necesitan estar contiguos, y en algunos casos, incluso pueden no estar en la misma cadena peptídica. En la presente descripción, un epítopo peptídico o polipeptídico reconocido por los anticuerpos contiene una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, con mayor preferencia al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15 , al menos 20, al menos 25, o entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos contiguos o no contiguos de SOD1.

Por "unir específicamente" o "reconocer específicamente", usado indistintamente en la presente descripción, se entiende generalmente que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que se une a un epítopo a través de su dominio de unión a antígeno, y que la unión implica alguna complementariedad entre el dominio de unión a antígeno y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, a través de su dominio de unión a antígeno más fácilmente de lo que se podría unir a un epítopo aleatorio, no relacionado. El término "especificidad" se usa en la presente descripción para calificar la afinidad relativa por la que un cierto anticuerpo se une a un cierto epítopo. Por ejemplo, puede considerarse que el anticuerpo "A" tiene una especificidad superior por un epítopo dado que el anticuerpo "B," o se puede decir que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una especificidad superior que la que tiene para el epítopo "D" relacionado.

Cuando está presente, el término "características de unión inmunológica" u otras características de unión de un anticuerpo con un antígeno, en todas sus formas gramaticales, se refiere a la especificidad, afinidad, reactividad cruzada y otras características de unión de un anticuerpo.

Por "unir preferentemente," se denota la molécula de unión, por ejemplo, el anticuerpo que se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que se podría unir a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo. Así, un anticuerpo que "se une preferentemente" a un epítopo dado se podría unir más probablemente a ese epítopo que a un epítopo relacionado, aunque dicho anticuerpo pueda reaccionar de manera cruzada con el epítopo relacionado.

Por medio de un ejemplo no limitante, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo puede considerarse que se une a un primer epítopo preferentemente si se une a dicho primer epítopo con una constante de disociación (K^d) que es menor que la K^d del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une preferentemente a un primer antígeno si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la K^d del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une preferentemente a un primer epítopo si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la K^d del anticuerpo para el segundo epítopo.

En otro ejemplo no limitante, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo puede considerarse que se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una velocidad de disociación (k(off)) que es menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une preferentemente a un primer epítopo si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une preferentemente a un primer epítopo si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo.

Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en la presente descripción puede decirse que se une a SOD1 o un fragmento o variante de la misma con una velocidad de disociación (k(off)) menor o igual a 5 x 10-2 seg-1, 10-2 seg-1, 5x 10-3 seg-1 o 10-3 seg-1. Con mayor preferentemente, puede decirse que un anticuerpo de la invención se une a SOD1 o un fragmento o variante de la misma con una velocidad de disociación (k(off)) menor o igual a 5 x 10-4 seg-1, 10-4 seg-1, 5 x 10-5 seg-1, o 10-5 seg-15 x 10-6 seg-1, 10-6 seg-1, 5 x 10-7 seg-1 o 10-7 seg-1.

Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en la presente descripción puede decirse que se une a SOD1 o un fragmento o variante de la misma con una velocidad de asociación (k(on)) mayor o igual a 103 M-1 seg-1, 5 x 103 M-1 seg-1, 104 M-1 seg-1 o 5 x 104 M-1 seg-1. Con mayor preferencia, puede decirse que un anticuerpo de la invención se une a SOD1 o un fragmento o variante de la misma con una velocidad de asociación (k(on)) mayor o igual a 105 M-1 seg-1, 5 x 105 M-1 seg-1, 106 M-1 seg-1, o 5 x 106 M-1 seg-1 o 107 M-1 seg-1.

Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se dice que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferentemente a ese epítopo hasta el grado que se bloquea, en cierta medida, la unión del anticuerpo de referencia al epítopo. La inhibición competitiva puede ser determinada por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos ELISA de competencia. Se puede decir que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo dado en al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60% o al menos 50%.

Como se usa en la presente descripción, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de unión de un epítopo individual con la CDR de una molécula de unión, por ejemplo, una molécula de inmunoglobulina; véase, por ejemplo, Harlow y otros, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da edición. (1988) en las páginas 27-28. Como se usa en la presente descripción, el término "avidez" se refiere a la estabilidad general del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la fuerza de combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulina con el antígeno; ver, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez se relaciona tanto con la afinidad de las moléculas de inmunoglobulinas individuales en la población con epítopos específicos, como también con las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo altamente repetitiva, tal como un polímero, sería una de gran avidez. La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno puede determinarse experimentalmente mediante el uso de cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky y otros, "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press Nueva York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman y Company Nueva York, N Y (1992), y los métodos que se describen en la presente descripción. Las técnicas generales para medir la afinidad de un anticuerpo por un antígeno incluyen ELISA, RIA y resonancia de plasmones de superficie. La afinidad que se mide a una interacción particular antígeno anticuerpo puede variar si se mide bajo condiciones diferentes, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por lo tanto, las mediciones de la afinidad y otros parámetros de unión al antígeno, por ejemplo, KD, IC50, se llevan a cabo preferentemente, con las soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado.

Las moléculas de unión, por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Como se usa en la presente descripción, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, específico para un antígeno, de reaccionar con un segundo antígeno; una medida de la relación entre las dos sustancias antigénicas diferentes. Por lo tanto, un anticuerpo es reactivo cruzado si se une a un epítopo distinto del que indujo su formación. El epítopo de reacción cruzada generalmente contiene muchos de los mismos elementos estructurales complementarios que el epítopo inductor y, en algunos casos, puede encajar mejor que el original.

Por ejemplo, ciertos anticuerpos tienen algún grado de reactividad cruzada, ya que se unen a epítopos relacionados, pero no idénticos, por ejemplo, epítopos con al menos 95 %, al menos 90 %, al menos 85 %, al menos 80 %, al menos 75 %, al menos 70 %, al menos 65 %, al menos 60 %, al menos 55 % y al menos 50 % de identidad (como se calcula mediante el uso de métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente descripción) a un epítopo de referencia. Puede decirse que un anticuerpo tiene poca o ninguna reactividad cruzada si no se une a epítopos con menos del 95 %, menos del 90 %, menos del 85 %, menos del 80 %, menos del 75 %, menos del 70 %, menos del 65 %, menos del 60 %, menos del 55 % y menos del 50 % de identidad (como se calcula mediante el uso de métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente descripción) a un epítopo de referencia. Un anticuerpo puede considerarse "altamente específico" para un cierto epítopo, si no se une a ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de ese epítopo.

Las moléculas de unión, por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a SOD1. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M 5 x 10-8 M, 10-8 M 5 x 10-9 M, 10-9 M 5 x 10-10 M, 10-10M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14M, 10-14M, 5 x 10-15 M, o 10-15 M. Como se indicó anteriormente, las estructuras de las subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulinas se conocen bien. Como se usa en la presente descripción, el término "dominio V^h" incluye el dominio variable del amino terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y el término "dominio CH1" incluye el primer dominio de la región constante (la más amino terminal) de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio c H1 es adyacente al dominio V^h y es amino terminal a la región bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina.

Como se usa en la presente descripción, el término "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, de aproximadamente el residuo 244 al residuo 360 de un anticuerpo mediante el uso de esquemas de numeración convencionales (residuos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat; y residuos 231-340, sistema de numeración EU; ver Kabat EA y otros op. cit). El dominio CH2 es único en el sentido de que no se aparea estrechamente con otro dominio. Por el contrario, dos cadenas de carbohidratos ramificados N-enlazados se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 hasta el C-terminal de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 residuos.

Como se usa en la presente descripción, el término "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, lo que permite que las dos regiones de unión a antígeno N-terminales se muevan independientemente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior; ver Roux y otros, J. Immunol.

161 (1998), 4083-4090.

Como se usa en la presente descripción, el término "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace disulfuro o puente con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG presentes de manera natural, las regiones CH1 y CL se unen por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas se unen por dos enlaces disulfuro en las posiciones correspondientes a 239 y 242 mediante el uso del sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración EU).

Como se usa en la presente descripción, los términos "enlazado", "fusionado" o "fusión" se usan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes más, por cualquier medio que incluye la conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión en marco" se refiere a la unión de dos o más marcos abiertos de lectura de polinucleótidos (ORF) para formar un ORF continuo más largo, de manera que mantiene el marco de lectura de traducción correcto de los ORF originales. Por lo tanto, una proteína de fusión recombinante es una proteína única que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos normalmente no están unidos en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se hace así continuo a lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar separados física o espacialmente, por ejemplo, por una secuencia enlazadora en marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las CDR de una región variable de inmunoglobulina pueden fusionarse, en marco, pero estar separados por un polinucleótido que codifica al menos una región marco de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, siempre que las CDR "fusionadas" estén cotraducidas como parte de un polipéptido continuo.

Como se usa en la presente descripción, el término "muestra" se refiere a cualquier material biológico obtenido de un sujeto o paciente. En un aspecto, una muestra puede comprender sangre, líquido cefalorraquídeo ("CSF") u orina. En otros aspectos, una muestra puede comprender sangre completa, plasma, células B enriquecidas de muestras de sangre y células cultivadas (por ejemplo, células B de un sujeto). Una muestra también puede incluir una biopsia o muestra de tejido que incluye tejido neural. En aún otros aspectos, una muestra puede comprender células enteras y/o un lisado de células. Las muestras de sangre pueden colectarse por métodos conocidos en la técnica. En un aspecto, el sedimento puede resuspenderse agitando en vórtex a 4 °C en 200 pl de tampón (Tris 20 mM, pH 7,5, Nonidy otros 0,5 %, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, NaCl 0,1 M, Inhibidor de Proteasa Sigma IX e Inhibidores de Fosfatasa 1 y 2 Sigma IX). La suspensión puede mantenerse en hielo durante 20 minutos con vórtice intermitente. Después de girar a 15000 x g durante 5 minutos a aproximadamente 4 °C, pueden almacenarse alícuotas de sobrenadante a aproximadamente -70 °C.

Como se usa en la presente, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren al tratamiento terapéutico y profiláctico o medidas preventivas, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico indeseado, tal como el desarrollo de esclerosis lateral amiotrófica (ALS). Los resultados clínicos deseados o beneficiosos incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, diminución de la extensión de la enfermedad, estado de la enfermedad estable (es decir, no empeora), retraso o disminución del progreso de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (parcial o total), detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen los que tienen ya una afección o trastorno, así como también los que tienden a padecer la afección o trastorno o los que la manifestación de la afección o trastorno se debe prevenir.

Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, por ejemplo, un paciente humano, para quien se desea el diagnóstico, pronóstico, prevención o terapia.

II. Anticuerpos

La presente invención generalmente se refiere a anticuerpos humanos anti-SOD1 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se caracteriza en las reivindicaciones, que preferentemente demuestran las características de unión inmunológica y/o propiedades biológicas como se describe para los anticuerpos ilustrados en los Ejemplos, en particular el anticuerpo NI-204.12G7. De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos monoclonales humanos específicos para SOD1 se clonaron de un grupo de sujetos humanos sanos.

En el curso de los experimentos realizados de acuerdo con la presente invención, los anticuerpos en medios condicionados de cultivos de células B de memoria humanas se cribaron en paralelo para la unión a la proteína SOD1 recombinante o mal plegada/agregada, y a la albúmina de suero bovino (BSA). Solo los cultivos de células B que fueron positivos para SOD1 recombinante o mal plegado/agregada pero no para BSA se sometieron a la clonación de anticuerpos. En una segunda ronda de cribaje, también los cultivos de células B que fueron positivos para SOD1 agregado se sometieron a la clonación de anticuerpos.

Los intentos iniciales para aislar los anticuerpos específicos se enfocaron en grupos de sujetos humanos sanos con alta actividad de unión plasmática a SOD1, lo que sugiere niveles elevados de anticuerpos contra SOD1 circulantes en plasma. Inesperadamente, estos intentos no lograron producir células B de memoria humana específicas para SOD1 y los anticuerpos descritos en la presente invención se aislaron de grupos de sujetos humanos sanos que no fueron preseleccionados para una alta reactividad plasmática a SOD1 o tenían baja reactividad plasmática a SOD1.

Debido a esta medición, pudieron aislarse varios anticuerpos. Los anticuerpos seleccionados se analizaron adicionalmente para determinar la clase y la subclase de la cadena ligera. Los mensajes de anticuerpos relevantes seleccionados de cultivos de células B de memoria se transcriben después por RT-PCR, se clonan y combinan en vectores de expresión para la producción recombinante; ver los Ejemplos adjuntos. La expresión recombinante de los anticuerpos humanos en células HEK293 o CHO y la caracterización subsecuente de sus especificidades de unión hacia SOD1 humana recombinante (Figura 2 y Figura 3), y su unión distintiva a sus formas patológicamente mal plegadas/agregadas (Figura 4 a Figura 6) confirmó que por primera vez se han clonado anticuerpos humanos que son altamente específicos para SOD1 y que reconocen las formas distintivas patológicamente mal plegadas/agregadas de la proteína SOD1. Una segunda ronda de experimentos confirmó los hallazgos anteriores como se muestra en la Figura 9. Véase también la Tabla III que resume la información relativa a las afinidades de unión de los anticuerpos de la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención generalmente se refiere a un anticuerpo anti-SOD1 monoclonal humano presente de manera natural aislado y a sus fragmentos de unión como se caracteriza en las reivindicaciones. En una modalidad de la invención, el anticuerpo es capaz de unir específicamente SOD1 recombinante de longitud completa y/o las formas patológicamente mal plegadas/agregadas de SOD1 recombinante (ver Figura 4 y Ejemplo 2), agregados de dímeros fisiológicos de SOD1 (ver Figura 5 y Ejemplo 3) y agregados de SOD1 in vivo (ver Figura 6 y Ejemplo 4). El anticuerpo de la presente invención se une específicamente al dominio central de SOD1 (ver el Ejemplo 5 y la Tabla IV para un resumen).

La presente invención se dirige a un anticuerpo anti-SOD1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo se une específicamente al mismo epítopo de SOD1 que un anticuerpo de referencia NI-204.12G7. El mapeo de epítopos identificó una secuencia dentro del dominio de unión a microtúbulos de SOD1 humana que incluye los aminoácidos DGVADVS 93-99 (SEQ ID NO: 2) como el epítopo lineal único reconocido por el anticuerpo NI-204.10D12. El mapeo de epítopos identificó una secuencia dentro del dominio N-terminal de SOD1 que incluye los aminoácidos 10­ 60 en la que se localiza el epítopo reconocido por el anticuerpo NI-204.10A8. El mapeo adicional limitó el epítopo reconocido por el anticuerpo NI-204.10A8 a la secuencia que incluye los aminoácidos 9-55 LKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNT (SEQ ID NO: 52). Como se describe en detalle en el Ejemplo 5 y la Tabla IV aquí, los epítopos de los siguientes anticuerpos también se han mapeado y se localizan dentro de la secuencia SOD-1 que incluye: para el anticuerpo NI-204.12G7 de la presente invención los aminoácidos 73-83 GGPKDEERHVG ( SEQ ID NO: 51); para el anticuerpo NI-204.11F11 los aminoácidos 113-119 IIGRTLV (SEQ ID NO: 53); para el anticuerpo NI-204.6H1 los aminoácidos 85-95 LGNVTADKDGV (SEQ ID NO: 54); para el anticuerpo NI-204.12G3 los aminoácidos 121-135 HEKADDLGKGGNEES (SEQ ID NO: 55); para el anticuerpo NI-204.7G5 los aminoácidos 101-107 EDSVISL (SEQ ID NO: 56); para el anticuerpo NI-204.7B3 los aminoácidos 137-143 KTGNAGS (SEQ ID NO: 57); para el anticuerpo NI-204.34A3 los aminoácidos 85-95 LGNVTADKDGV (SEQ ID NO: 58); y para el anticuerpo NI-204.25H3 los aminoácidos 73-79 GGPKDEE (SEQ ID NO: 59).

Además, sin tener la intención de unirse a las observaciones experimentales iniciales como se demostró en el Ejemplo 4 y se muestra en la Figura 6, el anticuerpo monoclonal humano anti-SOD1 NI-204.12G7 de la presente invención se caracteriza por unir específicamente SOD1 patológicamente mal plegada/agregada y por no reconocer sustancialmente SOD1 en la forma fisiológica en el tejido de la médula espinal. Por lo tanto, la presente invención proporciona un conjunto de anticuerpos contra SOD1 humanos con especificidades de unión, que por lo tanto son particularmente útiles para fines de diagnóstico y terapéuticos. Para más detalles y una descripción resumida con respecto a las especificidades de unión de la presente invención, véase también la Figura 9 y la Tabla III.

El anticuerpo contra SOD1 de la presente invención reconoce preferentemente SOD1 patológicamente mal plegada/agregada en lugar de los dímeros fisiológicos de SOD1, en particular cuando se analiza de acuerdo con los Ejemplos 3 y 4. Además, o alternativamente, el anticuerpo anti-SOD1 de la presente invención se une a mutantes de SOD1 humana que causan enfermedades, en particular los descritos en el Ejemplo 4. En este contexto, las especificidades de unión pueden estar en el intervalo que se muestra para el anticuerpo ilustrativo NI-204.12G7 en la Figura 3, respectiva Figura 4, es decir que tiene concentraciones efectivas medias máximas (EC50) de aproximadamente 10 pM a 1 nM para SOD1 de tipo salvaje (recombinante) como se muestra para NI-204.12G7.

Algunos anticuerpos purificados se unen a una amplia serie de biomoléculas, por ejemplo, proteínas. Como apreciará el experto en la técnica, el término específico se usa en la presente descripción para indicar que otras biomoléculas distintas a las proteínas SOD-1 o fragmentos de las mismas no se unen significativamente a la molécula de unión a antígeno, por ejemplo, uno de los anticuerpos de la presente invención. Preferentemente, el nivel de unión a una biomolécula distinta de SOD-1 resulta en una afinidad de unión que es a lo máximo solo 20 % o menos, 10 % o menos, solo 5% o menos, solo 2% o menos o solo 1 % o menos (es decir, al menos 5, 10, 20, 50 o 100 veces menor) de la afinidad a SOD-1, respectivamente.

Por lo tanto, el anticuerpo anti-SOD1 de la presente invención se une preferentemente a las formas patológicas de SOD1, por ejemplo, SOD1 patológica mal plegada/agregada como se ejemplifica mediante ELISA directo en el Ejemplo 3 y en la médula espinal mediante la tinción inmunohistoquímica descrita en el Ejemplo 4. En otra modalidad, el anticuerpo anti-SOD1 de la presente invención se une preferentemente tanto a SOD1 recombinante como a las formas de SOD1 patológicamente mal plegadas/agregadas como se ejemplifica en el Ejemplo 2 y el Ejemplo 3 mediante ELISA directo.

Como se mencionó anteriormente, los agregados de SOD1 también pueden encontrarse asociados con placas seniles amiloides y ovillos neurofibrilares de pacientes con AD. Por lo tanto, en una modalidad, el anticuerpo de la presente invención puede ser útil en el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer.

La presente invención también se dirige a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno idéntico al del anticuerpo NI-204.12G7.

La presente invención ejemplifica además tales anticuerpos y sus fragmentos de unión, que se caracterizan por comprender en su región variable, por ejemplo, dominio de unión al menos las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la región variable de Vh y Vl que comprende las secuencias de aminoácidos representadas en la Figura 1B. Las secuencias de nucleótidos correspondientes que codifican la región variable identificada anteriormente se exponen en la Tabla II a continuación. El conjunto de CDR de las secuencias de aminoácidos anteriores de la región Vh y Vl se representan en la Figura 1B.

En una modalidad, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de la región Vh y Vl como se representa en la Figura 1B. Preferentemente, el anticuerpo de la presente invención se caracteriza por la preservación del apareamiento conocido de la cadena pesada y ligera como estaba presente en la célula B humana.

En una modalidad, el anticuerpo de la presente invención se proporciona mediante cultivos de células B simples u oligoclonales que se cultivan y el sobrenadante del cultivo, que contiene los anticuerpos producidos por dichas células B, se analiza para cribar la presencia y afinidad de anticuerpos anti-SOD1 en el mismo. El proceso de cribaje comprende las etapas de un ensayo de inmunorreactividad de la placa amiloide de tejido sensible (TAPIR) tal como se describe en la solicitud internacional WO2004/095031; la selección en secciones del cerebro y médula espinal para la unión a SOD1 agregada, tal como se describe en la solicitud internacional WO2008/081008; el cribaje para la unión de un péptido derivado de SOD1 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1; un cribaje para la unión de SOD1 humana recombinante de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1; un cribaje para la unión de agregados de dímeros fisiológicos de SOD1 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y aislar el anticuerpo para el que se detecta la unión o la célula que produce dicho anticuerpo.

Como se mencionó anteriormente, debido a su generación tras una respuesta inmune humana, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención reconocerá epítopos que son de particular relevancia patológica y que podrían no ser accesibles o menos inmunogénicos en el caso de procesos de inmunización para la generación de, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón y cribaje de bibliotecas de presentación en fagos in vitro, respectivamente. En consecuencia, es prudente estipular que el epítopo del anticuerpo humano anti-SOD1 de la presente invención es único y no existe ningún otro anticuerpo que sea capaz de unirse al epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención; ver también la Tabla IV que muestra entre otras cosas el epítopo único del anticuerpo NI-204.12G7.

Por lo tanto, la presente descripción también se extiende generalmente a los anticuerpos anti-SOD1 como se caracteriza en la reivindicación 1, que compiten con el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención por la unión específica a SOD1, donde el anticuerpo se une específicamente al mismo epítopo de SOD1 como el anticuerpo de referencia NI-204.12G7.

La competencia entre los anticuerpos se determina mediante un ensayo en el que la inmunoglobulina bajo ensayo inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tales como el SOD1. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto (RIA) en fase sólida, inmunoensayo enzimático directo o indirecto (EIA) en fase sólida, ensayo de competición en sándwich; ver Stahli y otros, Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; EIA biotina-avidina directo en fase sólida; ver Kirkland y otros, J. Immunol.

137 (1986), 3614-3619 y Cheung y otros, Virology 176 (1990), 546-552; ensayo marcado directo en fase sólida, ensayo en sándwich marcado directo en fase sólida; ver Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA marcado directo en fase sólida mediante el uso de la etiqueta I125; ver Morel y otros, Molec. Immunol.

25 (1988), 7-15 y Moldenhauery otros, Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Típicamente, tal ensayo implica el uso de SOD1 purificada o agregados de la misma unidos a una superficie sólida o células que portan cualquiera de éstos, una inmunoglobulina de prueba sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada, es decir el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de etiqueta unida a la superficie sólida o las células en presencia de la inmunoglobulina a prueba. Por lo general, la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Preferentemente, el ensayo de unión competitiva se realiza bajo las condiciones como se describe para el ensayo de ELISA en los Ejemplos adjuntos. Los anticuerpos identificados mediante el ensayo de competencia (anticuerpos competidores) incluyen los anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y los anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que ocurra un impedimento estérico. Generalmente, cuando un anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común al menos en un 50 % o 75 %. Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del mismo, donde el anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia NI-204.12G7 a SOD1.

Una inmunoglobulina o su ADNc codificante pueden modificarse adicionalmente. Por lo tanto, el método descrito en la presente solicitud comprende cualquiera de la(s) etapa(s) de producir un anticuerpo quimérico, anticuerpo murinizado, anticuerpo de cadena sencilla, fragmento Fab, anticuerpo biespecífico, anticuerpo de fusión, anticuerpo marcado o un análogo de cualquiera de estos. Los métodos correspondientes se conocen por el experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor (1988)). Cuando los derivados de dichos anticuerpos se obtienen mediante la técnica de presentación en fagos, resonancia de plasmones de superficie como se emplea en el sistema BIAcore puede usarse para aumentar la eficacia de los anticuerpos de fago que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). La producción de anticuerpos quiméricos se describe, por ejemplo, en la solicitud internacional WO89/09622. Los métodos para la producción de anticuerpos humanizados se describen en, por ejemplo, la solicitud europea EP-A1 0239400 y la solicitud internacional WO90/07861. Las fuentes de anticuerpos adicionales que se usan de acuerdo con la presente invención se denominan anticuerpos xenogénicos. El principio general para la producción de anticuerpos xenogénicos, tales como anticuerpos de tipo humano en ratones, se describe en, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 y WO 96/33735. Como se discutió anteriormente, el anticuerpo de la invención puede existir en una variedad de formas además de anticuerpos completos; que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)2, así como también en cadenas sencillas; ver por ejemplo la solicitud internacional WO88/09344.

Los anticuerpos de la presente invención o sus cadenas de inmunoglobulina correspondientes pueden modificarse adicionalmente mediante el uso de técnicas convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de deleción(ones), inserción(ones), sustitución(ones), adición(ones), y/o recombinación(ones) y/o cualquier otra modificación(ones) de aminoácidos conocida en la técnica, ya sea sola o en combinación. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para introducir tales modificaciones en la secuencia de ADN subyacente a la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina; ver, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) NY y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, NY (1994) Las modificaciones del anticuerpo de la invención incluyen derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, que incluyen modificaciones de la cadena lateral, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales, que incluyen acetilación, hidroxilación, metilación, amidación y la unión de restos de carbohidratos o lípidos, cofactores y similares. Igualmente, la presente invención abarca la producción de proteínas quiméricas que comprenden el anticuerpo descrito o algún fragmento del mismo en el extremo amino fusionado a una molécula heteróloga tal como un ligando inmunoestimulador en el extremo carboxilo; ver, por ejemplo, la solicitud internacional WO00/30680 para detalles técnicos correspondientes.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo como se caracteriza en las reivindicaciones, que está orientada hacia los anticuerpos humanos anti-SOD1 de la presente invención y muestran las propiedades mencionadas, es decir que reconocen específicamente SOD1. Tales anticuerpos y moléculas de unión pueden probarse para determinar su especificidad y afinidad de unión mediante ELISA e inmunohistoquímica como se describe en la presente descripción, véase, por ejemplo, los Ejemplos. Estas características de los anticuerpos y las moléculas de unión también pueden probarse mediante transferencia de Western. Los resultados preliminares de los experimentos subsecuentes realizados de acuerdo con la presente invención revelaron que el anticuerpo humano anti-SOD1 de la presente invención, en particular el anticuerpo NI-204.12G7, es capaz de unirse diferencialmente a SOD1 patológica en ratones transgénicos que sobreexpresan SOD1 humana G93A. El NI-204.12G7 muestra una fuerte preferencia de unión a SOD1 patológicamente mal plegada/agregada en esferoides ricos en neurofilamentos, similares a los observados en la esclerosis lateral amiotrófica humana, que se encuentran más frecuentemente en la asta anterior y en las columnas anterior y lateral de la sustancia blanca que en la asta posterior, y las inclusiones ricas en neurofilamentos que llenan las neuritas distróficas engrosadas. La unión preferencial de los anticuerpos también puede observarse dentro de las inclusiones dispersas intracelulares, las inclusiones de tipo cuerpo de Lewy y agregados extracelulares, que consisten principalmente en agregados anormales de la superóxido dismutasa 1; ver Ejemplo 4 y Figura 6. Una repetición de estos experimentos (ver Ejemplo 4 y Figura 9) respalda la evaluación anterior y extiende los resultados preliminares con respecto a las especificidades de unión de los anticuerpos adicionales de la presente invención. De acuerdo con las observaciones anteriores, los anticuerpos de la presente invención son capaces de revelar distintos patrones de SOD1 patológica en la médula espinal lumbar de ratones modelos con ALS. Particularmente, el anticuerpo NI-204-12G7 puede usarse de acuerdo con la presente invención para la visualización de SOD1 patológica que incluye inclusiones citoplasmáticas de SOD1, principalmente en neuronas motoras y agregados extracelulares de SOD1. Esta especificidad de unión hacia formas patológicas de SOD1 en tejido animal enfatiza además de los experimentos bioquímicos mostrados en la presente descripción (véase los Ejemplos 3 y 8) la facilidad de uso de los anticuerpos de la presente invención en el tratamiento y diagnóstico de enfermedades asociadas con la aparición de SOD1 mal plegada/agregada en el cerebro.

Con respecto a los resultados preliminares de tinción, todos los anticuerpos mostrados en la Figura 9 muestran tinción de las inclusiones dispersas intracelulares, las estructuras difusas citoplasmáticas y las estructuras vacuolares si se usa la concentración apropiada de anticuerpo. La tinción de los agregados más grandes comparables con el anticuerpo de referencia B8H10 (Figura 9M) divide la descripción de anticuerpos en dos grupos: anticuerpos NI204-12G7, NI204-11F11, NI204-6H1, NI204-12G3, NI204-7G5, NI204-25H3, NI204-34A3 y NI204-7B3 (Figura 9 B, C, F, G, H, I, J y K) tiñen estos agregados en la asta ventral de la médula espinal, mientras que NI204-10D12, NI204-10A8 y NI204-67E12 (Figura 9A, D y E) no tiñen estas estructuras, similar al anticuerpo de referencia C4F6 ((Figura 9L) que es específico para formas solubles y mal plegadas de SOD1 humana mutante (Bosco y otros, 2010, Nat Neuroscience 13(11); 1396-1403) Además, los anticuerpos NI204-10D12, NI204-6H1 y NI204-7G5 muestran tinción difusa en la sustancia gelatinosa en la asta dorsal de las secciones de la médula espinal.

Como una alternativa a la obtención de inmunoglobulinas directamente del cultivo de células B o células de memoria B, las células pueden usarse como una fuente de loci de cadena pesada y de cadena ligera reorganizados para su subsecuente expresión y/o manipulación genética. Los genes de anticuerpos reorganizados pueden transcribirse de manera reversa a partir de los ARNm apropiados para producir ADNc. Si se desea, la región constante de la cadena pesada puede cambiarse por la de un isotipo diferente o eliminarse por completo. Las regiones variables pueden unirse para codificar regiones Fv de cadena sencilla. Pueden unirse múltiples regiones Fv para conferir capacidad de unión a más de una diana o pueden emplearse combinaciones quiméricas de cadena pesada y ligera. Una vez que el material genético está disponible, el diseño de análogos como se describió anteriormente, que retienen su capacidad de unirse a la diana deseada es sencillo. Los métodos para la clonación de regiones variables de anticuerpos y la generación de anticuerpos recombinantes se conocen por el experto en la técnica y se describen, por ejemplo, Gilliland y otros, Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke y otros, Leukemia 11 (1997), 1787-1792. Una vez que se obtiene el material genético apropiado y, si se desea, se modifica para codificar un análogo, las secuencias codificantes, que incluyen las que codifican, como mínimo, las regiones variables de la cadena pesada y ligera, pueden insertarse en los sistemas de expresión contenido en los vectores que puede transfectarse a células huésped recombinantes estándar. Puede usarse una variedad de tales células huésped; para un procesamiento eficiente, sin embargo, se prefieren las células de mamífero. Las líneas celulares de mamífero típicas útiles para este propósito incluyen, pero sin limitación, células CHO, células HEK 293 o células NSO.

La producción del anticuerpo o análogo se lleva a cabo al cultivar el huésped recombinante modificado bajo condiciones de cultivo apropiadas para el crecimiento de las células huésped y la expresión de las secuencias codificantes. Los anticuerpos luego se recuperan aislándolos del cultivo. Los sistemas de expresión se diseñan preferentemente para incluir péptidos señal de manera que los anticuerpos resultantes se secretan en el medio; sin embargo, la producción intracelular también es posible.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica el anticuerpo de la presente invención, es decir las regiones variables de las cadenas de inmunoglobulina del anticuerpo descrito anteriormente. Típicamente, dicha región variable codificada por el polinucleótido comprende las tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena Vh y Vl, respectivamente, de la región variable de dicho anticuerpo.

El experto en la técnica apreciará fácilmente que el dominio variable del anticuerpo que tiene el dominio variable descrito anteriormente puede usarse para la construcción de otros polipéptidos o anticuerpos de especificidad y función biológica deseadas. El experto en la técnica conoce que la afinidad de unión puede mejorarse al hacer sustituciones de aminoácidos dentro de las CDR o dentro de los bucles hipervariables (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) que se superponen parcialmente con las CDR definidas por Kabat; ver, por ejemplo, Riechmann, y otros, Nature 332 (1988), 323­ 327. El anticuerpo de la invención comprende en sus dos cadenas de inmunoglobulina las tres CDR de las regiones variables como se expone en la Figura 1B.

Las moléculas de unión, por ejemplo, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención, como conocen los expertos en la técnica, pueden comprender una región constante que media una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a una región constante del anticuerpo puede activar el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y la lisis de los patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y se puede involucrartambién en la hipersensibilidad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a los receptores en varias células a través de la región Fc, con un sitio de unión al receptor Fc en la región Fc de anticuerpo que se une a un receptor Fc (FcR) en una célula. Existe un número de receptores Fc que son específicos para las diferentes clases de anticuerpos, que incluyen IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión de los anticuerpos a los receptores Fc en la superficie celular desencadena un número de importantes y diversas respuestas biológicas que incluyen el englobamiento y la destrucción de las partículas recubiertas con anticuerpos, la eliminación de los complejos inmunes, la lisis de las células objetivos recubiertas con anticuerpos por las células citolíticas (denominada citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, o ADCC), la liberación de mediadores inflamatorios, la transferencia a la placenta y el control de la producción de inmunoglobulinas.

En consecuencia, ciertas modalidades de la presente invención incluyen un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, en el que al menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante se han eliminado o alterado de cualquier otra manera para proporcionar las características bioquímicas deseadas tales como funciones efectoras reducidas, capacidad de dimerizarse de manera no covalente, capacidad aumentada de localización en el sitio de agregación y deposición de SOD1, vida media reducida en suero o vida media aumentada en suero en comparación con un anticuerpo completo inalterado de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, ciertos anticuerpos para usar en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente descripción son anticuerpos con dominios eliminados que comprenden una cadena polipeptídica similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que carecen al menos de una porción de uno o más dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en ciertos anticuerpos, se eliminará un dominio completo de la región constante del anticuerpo modificado, por ejemplo, se eliminará todo o parte del dominio CH2. En otras modalidades, ciertos anticuerpos para usar en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente descripción tienen una región constante, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada de IgG, que se altera para eliminar la glicosilación, denominados en otro lugar en la presente descripción como anticuerpos aglicosilados o "agli". Tales anticuerpos "agli" pueden prepararse enzimáticamente así como también mediante ingeniería del(de los) sitio(s) de glicosilación consenso(s) en la región constante. Aunque no está limitado por la teoría, se cree que los anticuerpos "agli" pueden tener un perfil mejorado de seguridad y estabilidad in vivo. Los métodos para producir anticuerpos aglicosilados, que tienen la función efectora deseada se encuentran, por ejemplo, en la solicitud internacional WO2005/018572.

En ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente descripción, la porción Fc puede mutarse para disminuir la función efectora mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la eliminación o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otro método) de un dominio de la región constante puede reducir la unión del receptor Fc de los anticuerpos modificados circulantes aumentando de este modo la localización de SOD1. En otros casos, podría ser que las modificaciones de la región constante, consistentes con la presente invención, moderen la unión del complemento y de este modo reduzcan la vida Sin embargo otras modificaciones de la región constante se pueden usar para modificar los enlaces disulfuro o las porciones de oligosacáridos que permiten se mejore la localización debido al aumento de la especificidad del antígeno o la flexibilidad del anticuerpo. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tal como la localización de SOD1, la biodistribución y la vida media en suero, pueden medirse y cuantificarse fácilmente mediante el uso de técnicas inmunológicas bien conocidas sin experimentación excesiva.

En ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente descripción, la porción Fc puede mutarse o intercambiarse por secuencias de proteínas alternativas para aumentar la captación celular de anticuerpos a manera de ejemplo al mejorar la endocitosis de los anticuerpos mediada por receptor a través de receptores Fcy, LRP o receptores Thy1 o mediante la 'Tecnología de SuperAnticuerpo', que se dice que permite que los anticuerpos se transporten a las células vivas sin dañarlos (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241). Por ejemplo, la generación de proteínas de fusión de la región de unión del anticuerpo y los ligandos conocidos de la proteína de los receptores de la superficie celular o los anticuerpos bi o multiespecíficos con secuencias específicas que se unen a SOD1, así como también a un receptor de la superficie celular, pueden modificarse mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica.

En ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente descripción, la porción Fc puede mutarse o intercambiarse por secuencias proteicas alternativas o el anticuerpo puede modificarse químicamente para aumentar su penetración en la barrera hematoencefálica. Las formas modificadas de los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden prepararse a partir de anticuerpos precursores o parentales completos mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica. Las técnicas ilustrativas se discuten con más detalle en la presente descripción. Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden hacerse o fabricarse mediante el uso de técnicas que se conocen en la técnica. En ciertas modalidades, las moléculas de anticuerpo o sus fragmentos se "producen recombinantemente" es decir, se producen mediante el uso de la tecnología de ADN recombinante. Las técnicas ilustrativas para hacer moléculas de anticuerpos o fragmentos de las mismas se discuten con más detalle en otra parte en la presente descripción.

Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la descripción también incluyen derivados que se modifican, por ejemplo, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de manera que la unión covalente no impida que el anticuerpo se una específicamente a su epítopo conocido. Por ejemplo, pero no por medio de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que se han modificados, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, que incluyen, sin limitación, la escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

En modalidades preferidas particulares, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la descripción no generarán una respuesta inmune nociva en el animal a tratar, por ejemplo, en un humano En ciertas modalidades, las moléculas de unión, por ejemplo, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención se derivan de un paciente, por ejemplo, un paciente humano, y subsecuentemente se usan en la misma especie de la que se derivan, por ejemplo, humano, aliviando o minimizando la aparición de respuestas inmunitarias nocivas.

La desinmunización también puede usarse para disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Como se usa en la presente descripción, el término "desinmunización" incluye la alteración de un anticuerpo para modificar los epítopos de las células T; véase, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO98/52976 y WO00/34317. Por ejemplo, se analizan las secuencias Vh y Vl del anticuerpo de partida y un "mapa" de epítopos de las células T humanas de cada región V que muestra la ubicación de los epítopos en relación con las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y otros residuos importantes dentro de la secuencia. Los epítopos de células T individuales del mapa de epítopos de las células T se analizan para identificar sustituciones de aminoácidos alternativas con un bajo riesgo de alterar la actividad del anticuerpo final. Un intervalo de secuencias alternativas de Vh y Vl se diseñan para comprender combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias se incorporan subsecuentemente en un intervalo de polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos contra SOD1 o fragmentos inmunoespecíficos de los mismos para usaren los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente descripción, que luego se prueban para determinar la función. Típicamente, se generan y prueban entre 12 y 24 anticuerpos variantes. Los genes completos de la cadena pesada y ligera que comprenden las regiones V y C humana modificadas se clonan después en vectores de expresión y los plásmidos subsecuentes se introducen en líneas celulares para la producción de anticuerpos completos. Los anticuerpos se comparan después en ensayos bioquímicos y biológicos apropiados, y se identifica la variante óptima.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante el uso de una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes, y de presentación en fagos, o una combinación de estas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante el uso de técnicas de hibridoma que incluyen las conocidas en la técnica y que se enseñan, por ejemplo, en Harlow y otros, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da edición. (1988); Hammerling y otros, en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981). El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en la presente descripción no se limita a los anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridomas. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un único clon, que incluye cualquier clon de eucariota, procariota o fago, y no el método por el cual se produce. Por lo tanto, el término “anticuerpo monoclonal” no se limita a los anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridomas. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención se derivan de células B humanas que se han inmortalizado mediante la transformación con el virus de Epstein-Barr, como se describe en la presente descripción.

En el bien conocido proceso de hibridoma (Kohler y otros, Nature 256 (1975), 495) los linfocitos relativamente de vida corta, o mortales de un mamífero, por ejemplo, las células B derivadas de un sujeto humano como se describe en la presente descripción, se fusionan con una línea celular de tumor inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma), lo que produce células híbridas o "hibridomas" que son inmortales y capaces de producir el anticuerpo genéticamente codificado de la célula B. Los híbridos resultantes se segregan en cepas genéticas únicas mediante selección, dilución y nuevo crecimiento con cada cepa individual que comprende genes específicos para la formación de un anticuerpo único. Producen anticuerpos, que son homogéneos contra un antígeno deseado y, en referencia a su origen genético puro, se denominan "monoclonales".

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma, parentales, no fusionadas. Los expertos en la técnica apreciarán que los reactivos, las líneas celulares y los medios para la formación, selección y crecimiento de hibridomas están disponibles comercialmente de varias fuentes y los protocolos estandarizados están bien establecidos. Generalmente, el medio de cultivo en el cual las células de hibridoma crecen se ensayó para la producción de anticuerpos monoclonales contra el antígeno deseado. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por ensayos in vitro, tal como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) como se describe en la presente descripción. Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y crecer mediante métodos estándar; véase, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, páginas 59-103 (1986). Se apreciará además que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden separarse del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero mediante procedimientos convencionales de purificación tales como, por ejemplo, proteína-A, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

En otra modalidad, los linfocitos pueden seleccionarse mediante micromanipulación y aislarse los genes variables. Por ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica pueden aislarse de un mamífero inmunizado o inmune naturalmente, por ejemplo, un humano, y cultivarse durante aproximadamente 7 días in vitro. Los cultivos pueden cribarse para IgG específicas que cumplan los criterios de selección. Las células de pocillos positivos pueden aislarse. Las células B productoras de Ig individuales pueden aislarse mediante FACS o identificándolas en un ensayo hemolítico de placa mediado por complemento. Las células B productoras de Ig pueden micromanipularse en un tubo y los genes de Vh y Vl pueden amplificarse mediante el uso de, por ejemplo, RT-PCR. Los genes de Vh y Vl pueden clonarse en un vector de expresión de anticuerpos y transfectarse a células (por ejemplo, células eucariotas o procariotas) para la expresión.

Alternativamente, las líneas celulares productoras de anticuerpos pueden seleccionarse y cultivarse mediante el uso de técnicas bien conocidas por el experto en la técnica. Tales técnicas se describen en una variedad de manuales de laboratorio y publicaciones primarias. A este respecto, las técnicas adecuadas para usar en la invención como se describe a continuación se describen en Current Protocols in Immunology, Coligan y otros, Eds., Green Publishing Associates y Wiley-Interscience, John Wiley y Sons, Nueva York (1991), incluidos los complementarias.

Los fragmentos de anticuerpo que reconocen los epítopos específicos pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse de manera recombinante o por escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, mediante el uso de enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. Tales fragmentos son suficientes para usar, por ejemplo, en procedimientos de inmunodiagnóstico que implican el acoplamiento de las porciones inmunoespecíficas de las inmunoglobulinas a los reactivos de detección tales como radioisótopos.

Los anticuerpos humanos, tal como se describió en la presente descripción, son particularmente convenientes para uso terapéutico en pacientes humanos. Los anticuerpos humanos de la presente invención se aíslan, por ejemplo, de sujetos humanos sanos que, debido a su edad, se puede sospechar que corren el riesgo de desarrollar un trastorno neurodegenerativo, por ejemplo, ALS, o un paciente con el trastorno, pero con un curso de la enfermedad inusualmente estable o forma inusualmente leve de la enfermedad. Sin embargo, aunque es prudente esperar que los sujetos ancianos sanos y sin síntomas, respectivamente, desarrollen más regularmente anticuerpos anti-SOD1 protectores que los sujetos más jóvenes, estos últimos pueden usarse también como fuente para obtener un anticuerpo humano de la presente invención. Esto es particularmente cierto para los pacientes más jóvenes que están predispuestos a desarrollar una forma familiar de ALS pero que permanecen sin síntomas dado que su sistema inmunológico funciona más eficientemente que el de los adultos mayores.

Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o preferentemente mediante técnicas de expresión recombinante como se describe en la presente descripción.

En una modalidad, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la invención comprende una región constante sintética en donde uno o más dominios están parcial o totalmente eliminados ("anticuerpos con dominio eliminado"). En ciertas modalidades, los anticuerpos modificados compatibles podrán comprender las construcciones de dominio eliminados o variantes donde el dominio CH2 completo se ha eliminado (construcciones ACH2). Para otras modalidades, un péptido de conexión corto puede sustituirse por el dominio eliminado para proporcionar flexibilidad y libertad de movimiento a la región variable. Los expertos en la técnica apreciarán que tales constructos son particularmente preferidos debido a las propiedades reguladoras del dominio CH2 en la velocidad catabólica del anticuerpo. Los constructos con dominio eliminado pueden derivarse mediante el uso de un vector que codifica un dominio constante humano de IgG-i, véase, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO02/060955 y WO02/096948A2. Este vector se modifica para eliminar el dominio CH2 y proporcionar un vector sintético que expresa una región constante de IgG1 con dominio eliminado.

En ciertas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la presente invención son minicuerpos. Los minicuerpos pueden hacerse mediante el uso de los métodos descritos en la técnica, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5,837,821 o la solicitud internacional WO 94/09817.

En una modalidad, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la invención comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la eliminación o sustitución de unos pocos o incluso un solo aminoácido siempre que permita la asociación entre las subunidades monoméricas. Por ejemplo, la mutación de un único aminoácido en áreas determinadas del dominio CH2 podría ser suficiente para reducir sustancialmente la unión de Fc y de este modo aumentar la localización de SOD1. De manera similar podría ser conveniente eliminar simplemente esa parte de uno o más dominios de la región constante que controlan la función efectora (por ejemplo, la unión al complemento) a ser modulada. Tales eliminaciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (vida media en el suero), mientras que dejan intactas otras funciones convenientes asociadas con el dominio de la región constante del individuo. Además, según se refirió anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden ser sintéticas a través de la mutación o la sustitución de uno o más aminoácidos que mejoran el perfil del constructo resultante. A este respecto, puede ser posible interrumpir la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ejemplola unión de Fc) mientras que se mantiene sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Aún otras modalidades determinadas comprenden la adición de uno o más aminoácidos de la región constante para mejorar las características convenientes, tales como una función efectora o proporcionar la unión para más citotoxina o carbohidrato. En tales modalidades puede ser conveniente insertar o reproducir secuencias específicas derivadas de los dominios seleccionados de la región constante.

La presente solicitud también describe anticuerpos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, variantes (que incluyen derivados) de moléculas de anticuerpos (por ejemplo, las regiones V^h y/o las regiones V^l) descritas en la presente descripción, cuyos anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen inmunoespecíficamente a SOD1. Las técnicas estándar conocidas por aquellos con experiencia en la técnica pueden usarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, que incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR, que resulta en sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, las variantes (que incluyen los derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos , menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con relación a la región V^h, V^h-CDR1, VH-CDR2, V^h-CDR3, región V^l, V^l-CDR1, V^l-CDR2 o V^l-CDR3 de referencia. Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es una en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Alternativamente, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden cribarse para la actividad biológica para identificar mutantes que retienen la actividad (por ejemplo, la capacidad de unir SOD1).

Por ejemplo, es posible introducir mutaciones solo en las regiones marco o solo en las regiones CDR de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser mutaciones de sentido erróneo o neutrales, por ejemplo, no tienen o tienen poco efecto sobre la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno, de hecho, algunas de estas mutaciones no alteran la secuencia de aminoácidos en absoluto. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones o mejorar la producción de anticuerpos de un hibridoma. Las regiones codificantes con codones optimizados que codifican anticuerpos de la presente invención se describen en otra parte de la presente descripción. Alternativamente, las mutaciones de sentido erróneo no neutrales pueden alterar la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno. Es probable que la ubicación de la mayoría de las mutaciones de sentido erróneo neutrales y silentes se encuentren en las regiones marco, mientras que la ubicación de la mayoría de las mutaciones de sentido erróneo no neutrales es probable que estén en las CDR, aunque esto no es un requisito absoluto. Un experto en la técnica sería capaz de diseñar y probar moléculas mutantes con propiedades deseadas, tales como no alterar la actividad de unión al antígeno o alterar la actividad de unión (por ejemplo, mejoras en la actividad de unión al antígeno o cambio en la especificidad del anticuerpo). Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse rutinariamente y la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada, (por ejemplo, la capacidad de unirse inmunoespecíficamente al menos a un epítopo de SOD1) puede determinarse mediante el uso de técnicas descritas en la presente descripción o al modificar rutinariamente técnicas conocidas en la técnica.

III. Polinucleótidos que Codifican Anticuerpos

Un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, variante o derivado, puede estar compuesto de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonudeótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, variante o derivado, puede estar compuesto de ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, variante o derivado, puede estar compuesto de regiones de triplecatenarias que comprenden ARN o ADN o ambos, ARN y ADN. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, variante o derivado también puede contener una o más bases modificadas o cadenas principales de ADN o ARN modificadas por estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tal como inosina. Pueden hacerse una variedad de modificaciones en el a Dn y el ARN; de esta manera, el "polinucleótido" abarca formas modificadas química, enzimática o metabólicamente.

Puede crearse un polinucleótido aislado que codifique una variante no natural de un polipéptido derivado de una inmunoglobulina (por ejemplo, una porción de la cadena pesada o porción de la cadena ligera de la inmunoglobulina) mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la inmunoglobulina de manera que una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos se introducen en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, tal como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Preferentemente, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se realizan en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales.

Como se conoce bien, el ARN puede aislarse de las células B originales, de las células de hibridoma o de otras células transformadas mediante técnicas estándar, tales como la extracción y precipitación con isotiocianato de guanidinio, seguido por centrifugación o cromatografía. Cuando sea conveniente, el ARNm puede aislarse del ARN total mediante técnicas estándar tales como cromatografía en oligo dT celulosa. Las técnicas adecuadas son familiares en la técnica. En una modalidad, los ADNc que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo pueden formarse, simultáneamente o por separado, mediante el uso de transcriptasa reversa y polimerasa de ADN de acuerdo con métodos bien conocidos. La PCR puede iniciarse por cebadores consensos de la región constante o por cebadores más específicos basados en las secuencias publicadas de ADN y aminoácidos de la cadena pesada y ligera. Como se discutió anteriormente, la PCR también puede usarse para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo. En este caso, las bibliotecas pueden cribarse mediante cebadores consensos o sondas homólogas más grandes, tales como sondas de la región constante humana.

El ADN, típicamente el ADN plasmídico, puede aislarse de las células mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica, mapearse y secuenciarse de acuerdo con técnicas estándar y bien conocidas establecidas en detalle, por ejemplo, en las referencias anteriores relacionadas con las técnicas de ADN recombinante. Por supuesto, el ADN puede ser sintético de acuerdo con la presente invención en cualquier momento durante el proceso de aislamiento o análisis posterior.

La presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V^h), donde al menos las CDR de la región variable de la cadena pesada son idénticas a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de referencia V^h-CDR1, V^h-CDR2 y V^h-CDR3 que se muestra en la Figura 1B.

La presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (V^l), donde al menos la región variable de la cadena ligera V^l-CDR son idénticos a la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de referencia V^l-CDR1, V^l-CDR2 y V^l-CDR3 que se muestra en la Figura 1B.

En la presente descripción, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótidos de la región V^h o V^l del anticuerpo anti-SOD1 como se representa en la Tabla II. A este respecto, el experto en la técnica apreciará fácilmente que los polinucleótidos que codifican al menos el dominio variable de la cadena ligera y/o pesada pueden codificar el dominio variable de ambas cadenas de inmunoglobulina o solo una.

Tabla II: Secuencias de nucleótidos de la región V^h y V^l del anticuerpo específico contra SOD1 NI-204.12G7.

La presente invención también incluye fragmentos de los polinucleótidos de la invención, como se describe en otra parte. Adicionalmente, la invención contempla también polinucleótidos que codifican polinucleótidos de fusión, fragmentos Fab y otros derivados, como se describe en la presente descripción.

Los polinucleótidos pueden producirse o fabricarse por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, puede ensamblarse un polinucleótido que codifica el anticuerpo a partir de los oligonucleótidos sintetizados químicamente por ejemplo, como se describió en Kutmeier y otros, BioTechniques 17 (1994), 242, lo que brevemente, implica la síntesis de los oligonucleótidos que se solapan y que contienen las porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, hibridación y unión de los oligonucleótidos, y después la amplificación de los oligonucleótidos unidos por RCP.

Alternativamente, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, variante o derivado puede generarse a partir de ácido nucleico de una fuente adecuada. Si no se dispone de un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, puede sintetizarse químicamente u obtenerse de una fuente adecuada un ácido nucleico que codifica el anticuerpo( por ejemplo , una biblioteca de ADNc de anticuerpos, o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, preferentemente ARN poliA+, aislado de cualquier tejido o células que expresan el anticuerpo específico contra SOD1, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) mediante amplificación por PCR mediante el uso de cebadores sintéticos hibridables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante la clonación mediante el uso de una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia génica particular a identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse después en vectores de clonación replicables mediante el uso de cualquier método bien conocido en la técnica.

Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente del anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, variante o derivado, su secuencia de nucleótidos puede manipularse mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1990) y Ausubel y otros, Ediciones, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, NY (1998), para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos.

IV. Expresión de Polipéptidos de Anticuerpos

Después de la manipulación del material genético aislado para proporcionar anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos se insertan típicamente en un vector de expresión para su introducción en células huésped que pueden usarse para producir la cantidad deseada del anticuerpo. La expresión recombinante de un anticuerpo, o fragmento, derivado o análogo del mismo, por ejemplo, se describe en la presente descripción una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que se une a una molécula diana. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o una porción del mismo (que contiene preferentemente el dominio variable de cadena pesada o ligera) de la invención, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede ser producido por tecnología de ADN recombinante mediante el uso de técnicas bien conocidas en la técnica. Por lo tanto, en la presente descripción se describen los métodos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen las secuencias de codificación del anticuerpo y señales adecuadas de control de la transcripción y la traducción. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de a Dn recombinante in vitro, técnicas de síntesis, y recombinación genética in vivo. La invención, por lo tanto, proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera de la misma, o un dominio variable de la cadena pesada o ligera, unido operablemente a un promotor. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo ( ver, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO 86/05807 y WO 89/01036 ; y la patente de EE.UU núm. 5,122,464 ) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en tal vector para la expresión de toda la cadena pesada o ligera.

El término "vector" o "vector de expresión" se usa en la presente descripción para significar vectores usados de acuerdo con la presente invención como un vehículo para introducir y expresar un gen deseado en una célula huésped. Como saben los expertos en la técnica, tales vectores pueden seleccionarse fácilmente del grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente invención comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción apropiados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad de entrar y/o replicarse en células eucariotas o procariotas. Para los fines de esta invención, pueden emplearse numerosos sistemas de vectores de expresión. Por ejemplo, una clase de vector usa elementos de ADN que se derivan de virus animales tales como virus del papiloma bovino, virus del polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios internos de unión a ribosomas. Adicionalmente, las células que han integrado el ADN en sus cromosomas pueden seleccionarse mediante la introducción de uno o más marcadores que permiten la selección de células huésped transfectadas. El marcador puede proporcionar prototrofia a un huésped auxotrófico, resistencia a biocidas (por ejemplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados como el cobre. El gen marcador de selección puede enlazarse directamente a las secuencias del ADN a expresar o introducirse en la misma célula mediante cotransformación. También pueden necesitarse elementos adicionales para una síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias de señal, señales de empalme, así como también promotores transcripcionales, potenciadores y señales determinación.

En modalidades particularmente preferidas, los genes de la región variable clonada se insertan en un vector de expresión junto con los genes de la región constante de la cadena pesada y ligera (preferentemente humanos) como se discutió anteriormente. En una modalidad, esto se efectúa mediante el uso de un vector de expresión patentado por Biogen IDEC, Inc., denominado como NEOSPLA, descrito en la patente de EE.UU núm. 6,159,730. Este vector contiene el promotor/potenciador de citomegalovirus, el promotor principal de la beta globina de ratón, el origen de replicación de SV40, la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, el exón 1 y el exón 2 de neomicina fosfotransferasa, el gen de dihidrofolato reductasa y la secuencia líder. Se ha encontrado que este vector da como resultado una expresión de anticuerpos de muy alto nivel tras la incorporación de los genes de la región variable y constante, transfección en células CHO, seguido por selección en medio que contiene G418 y amplificación con metotrexato. Por supuesto, cualquier vector de expresión que sea capaz de provocar la expresión en células eucariotas puede usarse en la presente invención. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen, pero sin limitarse a, plásmidos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, y pZeoSV2 (disponible en Invitrogen, San Diego, CA), y el plásmido pCI (disponible en Promega, Madison, WI). En general, el cribaje de un gran número de células transformadas para aquellas que expresan niveles adecuadamente altos de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina es una experimentación de rutina que puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante sistemas robóticos. Los sistemas de vectores también se enseñan en las patentes de EE.UU. núms.

5,736,137 y 5,658,570. Este sistema proporciona altos niveles de expresión, por ejemplo, > 30 pg/célula/día. Se describen otros sistemas de vectores ilustrativos, por ejemplo, en la patente de EE.UU núm. 6,413,777.

En otras modalidades preferidas, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden expresarse mediante el uso de constructos policistrónicos tales como los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU núm. 2003-0157641 A1. En estos sistemas de expresión, pueden producirse múltiples productos génicos de interés tales como cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos a partir de un solo constructo policistrónico. Estos sistemas usan ventajosamente un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para proporcionar niveles relativamente altos de anticuerpos. Las secuencias IRES compatibles se describen en la patente de EE.UU núm.

6,193,980. Los expertos en la técnica apreciarán que tales sistemas de expresión pueden usarse para producir efectivamente el intervalo completo de anticuerpos descritos en la presente solicitud.

Más generalmente, una vez que se ha preparado el vector o la secuencia de ADN que codifica una subunidad monomérica del anticuerpo, el vector de expresión puede introducirse en una célula huésped apropiada. La introducción del plásmido en la célula huésped puede lograrse mediante diversas técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, transfección, que incluye lipotransfección mediante el uso de, por ejemplo, Fugene® o lipofectamina, fusión de protoplastos, precipitación con fosfato de calcio, fusión de células con ADN envuelto, microinyección e infección con virus intacto. Típicamente, la introducción del plásmido en el huésped se realiza mediante el método estándar de coprecipitación con fosfato de calcio. Las células huésped que albergan el constructo de expresión se cultivan en condiciones apropiadas para la producción de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas, y se analizan para la síntesis de proteínas de cadena pesada y/o ligera. Las técnicas de ensayo ilustrativas incluyen ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), inmunohistoquímica y similares.

El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan luego mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo para su uso en los métodos descritos en la presente descripción. Por lo tanto, la invención incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, unido operablemente a un promotor heterólogo. En modalidades preferidas, para la expresión de anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican tanto las cadenas pesadas como las ligeras, pueden coexpresarse, en la célula huésped para la expresión de la molécula de inmunoglobulina entera, como se detalla más adelante.

La célula huésped puede cotransfectarse con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos, lo cual permite la expresión similar de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, un único vector puede utilizarse, que codifica los polipéptidos tanto de cadena pesada como ligera. En tales situaciones, la cadena ligera se sitúa ventajosamente antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre de tóxico ; véase Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 77 (1980), 2197. Las secuencias codificantes para las cadenas pesaday ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Como se usa en la presente descripción, "células huésped" se refiere a células que albergan los vectores construidos mediante el uso de técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un gen heterólogo. En las descripciones de los procesos para el aislamiento de anticuerpos de huéspedes recombinantes, los términos "célula" y "cultivo celular" se usan indistintamente para indicar la fuente del anticuerpo a menos que se especifique claramente lo contrario. En otras palabras, la recuperación del polipéptido de las "células" puede significar ya sea de la centrifugación de las células enteras o del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

Una variedad de sistemas de vectores de expresión en huéspedes puede utilizarse para expresar las moléculas de anticuerpo para usar en los métodos descritos en la presente descripción. Dichos sistemas de expresión de huésped representan vehículos mediante los cuales pueden producirse y purificarse posteriormente las secuencias codificantes de interés, pero además representan las células que pueden transformarse o transfectarse con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresando una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen pero sin limitarse a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con a Dn recombinante de bacteriófago, ADN plasmídico o vectores de expresión de ADN cosmídico que contienen secuencias que codifican anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión en levadura, recombinantes, que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión virales recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión virales recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; promotor del virus vaccinia de 7,5K). Preferentemente, las células bacterianas tales como Escherichia coli, y con mayor preferencia, las células eucariotas, especialmente para la expresión de una molécula completa de anticuerpo recombinante, se usan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, células de mamífero tales como las células de Ovario de Hámster Chino (CHO), junto con un vector tal como el principal elemento promotor de expresión génica temprana del citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos; véase, por ejemplo, Foecking y otros, Gene 45 (1986), 101; Cockett y otros, Bio/Technology 8 (1990), 2

La línea celular huésped usada para la expresión de proteínas es a menudo de origen mamífero; los expertos en la técnica se les atribuye la capacidad de determinar preferentemente líneas celulares huésped particulares que sean más adecuadas para el producto génico deseado que se expresará en ellas. Las líneas de células huésped ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, CHO (Ovario de Hámster Chino), DG44 y DUXB11 (líneas de Ovario de Hámster Chino, d Hf R menos), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (línea de riñón de mono), COS (un derivado de CVI con antígeno T de SV40), VERY, BHK (riñón de hámster bebé), MDCK, WI38, R1610 (fibroblastos de hámster Chino) BALBC/3T3 (fibroblastos de ratón), HAK (línea de riñón de hámster), SP2/O (mieloma de ratón), P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-1c1BPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocito humano) y 293 (riñón humano). Las células CHO y 293 son particularmente preferidas. Las líneas celulares huésped están típicamente disponibles en los servicios comerciales, la Colección Americana de Cultivos Tipo o en la literatura publicada.

Además, se puede elegir una cepa de la célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto génico de la manera específica deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Las diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y modificación de proteínas y productos génicos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas de huésped apropiados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína exógena expresada. Para esta finalidad, pueden usarse células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, glucosilación y fosforilación del producto génico.

Para la producción de proteínas recombinantes de alto rendimiento, a largo plazo, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden manipularse las líneas celulares que expresan de forma estable la molécula de anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación viral, las células huésped pueden transformarse con el ADN controlado mediante elementos de control de la expresión adecuados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción etc. sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. A continuación de la introducción del ADN exógeno, se pueden dejar crecer las células genéticamente manipuladas durante 1-2 días en un medio enriquecido y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable del plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar el plásmido de forma estable dentro de sus cromosomas y crecer para formar focos, que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para manipular genéticamente las líneas celulares que expresan de manera estable la molécula de anticuerpo.

Pueden usarse varios sistemas de selección, incluidos, pero sin limitarse a, la timidina cinasa del virus del herpes simple (Wiglery otros, Cell 11 (1977), 223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 48 (1992), 202), y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y otros, Cell 22 (1980), 817), pueden emplearse genes en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, la resistencia antimetabolito puede usarse como base de la selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y otros, Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 77 (1980), 357; O'Hare y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 78 (1981), 1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 78 (1981), 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 Goldspiel y otros, Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215; e higro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y otros, Gene 30 (1984), 147. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel y otros (ediciones), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).); y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli y otros (ediciones), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley y Sons, NY (1994); Colberre-Garapin y otros, J. Mol. Biol. 150:1 (1981).

Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden incrementarse mediante la amplificación del vector, para una revisión, ver Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, Nueva York, Volumen 3. (1987). Cuando es amplificable un marcador del sistema vector que expresa el anticuerpo, el incremento del nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped incrementará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo se incrementará también; véase {Crouse y otros, Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257. La producción in vitro permite la ampliación para proporcionar grandes cantidades de los polipéptidos deseados. Las técnicas para el cultivo de células de mamífero en condiciones de cultivo de tejidos son conocidas en la técnica e incluyen el cultivo en suspensión homogénea, por ejemplo, en un reactor aéreo o en un reactor agitador continuo, o en cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, microperlas de agarosa o cartuchos cerámicos. Si es necesario y/o deseado, las soluciones de polipéptidos pueden purificarse mediante los métodos habituales de cromatografía, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre DEAE-celulosa o cromatografía de (inmuno)afinidad, por ejemplo, después de la biosíntesis preferencial de un polipéptido de región bisagra sintética o antes o después de la etapa de cromatografía HIC descrita en la presente descripción.

Los genes que codifican anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden expresarse en células no mamíferas tales como bacterias o células de insectos o levaduras o plantas. Las bacterias que captan fácilmente los ácidos nucleicos incluyen miembros de las enterobacterias, tales como las cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tal como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, y Haemophilus influenzae. Se apreciará además que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos heterólogos típicamente se convierten en parte de los cuerpos de inclusión. Los polipéptidos heterólogos deben aislarse, purificarse y luego ensamblarse en moléculas funcionales. Cuando se desean formas tetravalentes de anticuerpos, las subunidades se autoensamblarán en anticuerpos tetravalentes; véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO02/096948.

En sistemas bacterianos, una serie de vectores de expresión puede seleccionarse ventajosamente según el uso previsto para la molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de una proteína de este tipo, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser convenientes los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan al vector de expresión de E. coli pUR278 ( Ruther y otros, EMBO J. 2 (1983), 1791 ), en el cual la secuencia codificante de anticuerpo puede ligarse individualmente al vector en marco con la región codificante de la lacZ de manera que se produce una proteína de fusión; vectores pIN ( Inouye e Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109 ; Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también pueden usarse para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con la glutatión S-transferasa (GST). Generalmente, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas por adsorción y unión a una matriz de perlas de agarosa y glutatión seguido por la elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión para trombina o proteasa factor Xa tal que el producto génico objetivo clonado puede liberarse de la porción GST.

Además de los procariotas, también pueden usarse microbios eucariotas. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de panadería común, es la más usada entre los microorganismos eucariotas, aunque hay otras cepas comúnmente disponibles, por ejemplo, Pichia pastoris. Para la expresión en Saccharomyces se usa comúnmente el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb y otros, Nature 282 (1979), 39; Kingsman y otros, Gene 7 (1979), 141; Tschempery otros, Gene 10 (1980), 157). Este plásmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Núm. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85 (1977), 12) La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de la célula huésped de levadura proporciona un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.

En un sistema de insecto, Autographa californica el virus de la poliedrosis nuclear (AcNPV) se usa típicamente como un vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante de anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina).

Una vez que una molécula de anticuerpo de la invención se ha expresado de manera recombinante, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligeras y pesadas individuales u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención, pueden purificarse de acuerdo con los procedimientos estándar de la técnica, que incluyen, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de la proteína A y cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas; véase, por ejemplo, Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982). Alternativamente, un método preferido para aumentar la afinidad de los anticuerpos de la invención se describe en la publicación de la patente de EE.UU 2002-0123057A1.

V. Proteínas de Fusión y Conjugados

En ciertas modalidades, el polipéptido del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos o uno o más restos que normalmente no se asocian con un anticuerpo. Las modificaciones ilustrativas se describen con más detalle a continuación. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo fv de cadena sencilla de la invención puede comprender una secuencia enlazadora flexible, o puede modificarse para añadir un resto funcional (por ejemplo, PEG, un fármaco, una toxina o una etiqueta tal como fluorescente, radioactiva, enzima, magnética nuclear, metal pesado y similares)

Un polipéptido del anticuerpo de la invención puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una proteína de fusión. Las proteínas de fusión son moléculas quiméricas que comprenden, por ejemplo, un dominio de unión a SOD1 de inmunoglobulina con al menos un sitio de unión a la diana, y al menos una porción heteróloga, es decir, una porción con la cual no está naturalmente unida en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos normalmente pueden existir en proteínas separadas que se unen en el polipéptido de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína, pero se colocan en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Las proteínas de fusión pueden crearse, por ejemplo, mediante síntesis química, o al crear y traducir un polinucleótido en el que las regiones peptídicas se codifican en la relación deseada.

El término "heterólogo", tal como se aplica a un polinucleótido o un polipéptido, significa que el polinucleótido o polipéptido se deriva de una entidad distinta de la del resto de la entidad con la que se compara. Por ejemplo, como se usa en la presente descripción, un "polipéptido heterólogo" para fusionarse a un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o análogo se deriva de un polipéptido no inmunoglobulínico de la misma especie, o un polipéptido de inmunoglobulina o no inmunoglobulínico de una especie diferente.

Como se discute con más detalle en otra parte en la presente descripción, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden fusionarse adicionalmente de manera recombinante a un polipéptido heterólogo en el N- o C-terminal o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) a polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos pueden fusionarse de manera recombinante o conjugarse con moléculas útiles como etiquetas en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidos o toxinas; véase, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO92/08495; WO91/14438; WO89/12624; la patente de EE.UU núm. 5,314,995; y la solicitud de patente europea PD 0 396 387.

Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden estar compuestos de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos, y pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos del código genético. Los anticuerpos pueden modificarse mediante procesos naturales, tales como el procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que se conocen bien en la técnica. Tales modificaciones se describen bien en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una literatura científica voluminosa. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier parte del anticuerpo, incluida la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o carboxilo, o en restos tal como los carbohidratos. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en un grado variable en varios sitios en un anticuerpo dado. Además, un anticuerpo dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los anticuerpos pueden ramificarse, por ejemplo, como un resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los anticuerpos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales postraduccionales o pueden hacerse mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen la acetilación, la acilación, la ADP-ribosilación, la amidación, la unión covalente a la flavina, la unión covalente de un resto hemo, la unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, la unión covalente de un lípido o derivado del lípido, la unión covalente de fosfatidilinositol, la reticulación, la ciclación, la formación de enlaces disulfuro, la desmetilación, la formación de reticulaciones covalentes, la formación de cistina, la formación de piroglutamato, la formilación, la carboxilación gamma, la glicosilación, la formación de anclajes GPI, la hidroxilación, la yodación, la metilación, la miristoilación, la oxidación, la pegilación, el procesamiento proteolítico, la fosforilación, la prenilación, la racemización, la selenoilación, la sulfatación, la adición de aminoácidos mediada por la transferencia por ARN a proteínas tales como la arginilación, y la ubiquitinación; véase, por ejemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York 2da Edición, (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, páginas 1-12 (1983); Seifter y otros, Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646; Rattan y otros, Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62).

La presente invención también proporciona proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un polipéptido heterólogo. En otra modalidad, una proteína de fusión para usar en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente descripción comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a SOD1 del mismo de la presente invención, y una secuencia de polipéptido heterólogo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas de fusión también están abarcadas por la invención.

Las proteínas de fusión ilustrativas reportadas en la literatura incluyen fusiones del receptor de células T (Gascoigne y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84 (1987), 2936-2940; CD4 (Capon y otros, Nature 337 (1989), 525-531; Trauneckery otros, Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl y otros, DNA Cell Biol. Estados Unidos 9 (1990), 347-353; y Byrn y otros, Nature 344 (1990), 667-670); L-selectina (receptor de localización) (Watson y otros, J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221­ 2229; y Watson y otros, Nature 349 (1991), 164-167); CD44 (Aruffo y otros, Cell 61 (1990), 1303-1313); CD28 y B7 (Linsley y otros, J. Exp. Med. 173(1991), 721-730); CTLA-4 (Lisley y otros, J. Exp. Med. 174(1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic y otros, Cell 66 (1991), 1133-1144); receptor de Tn F (Ashkenazi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 88 (1991), 10535-10539; Lesslauery otros, Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; y Peppel y otros, J. Exp. Med. 174 (1991), 1483­ 1489 (1991); y receptor de IgE a (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), Resumen Núm. 1448)

Como se discute en otra parte en la presente descripción, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden fusionarse a polipéptidos heterólogos para aumentar la vida media in vivo de los polipéptidos o para usar en inmunoensayos mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, el PEG puede conjugarse con los anticuerpos de la invención para aumentar su vida media in vivo; ver, por ejemplo, Leong y otros, Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. en Drug Deliv. Rev.54 (2002), 531; o Weir y otros, Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.

Además, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden fusionarse a secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar su purificación o detección. En modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido hexahistidina (HIS), tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc, 9259 Eton Avenue, Chatsworth, California, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86 (1989), 821-824por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero sin limitarse a, la etiqueta de "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson y otros, Cell 37 (1984), 767) y la etiqueta "flag".

Las proteínas de fusión se pueden preparar mediante el uso de métodos que son bien conocidos en la técnica; ver por ejemplo Patentes de EE.u U. 5,116,964 y 5,225,538. El sitio preciso en el que se realiza la fusión puede seleccionarse empíricamente para optimizar las características de secreción o unión de la proteína de fusión. El ADN que codifica la proteína de fusión se transfecta luego en una célula huésped para su expresión.

Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en forma no conjugada o pueden conjugarse con al menos una de una variedad de moléculas, por ejemplo, para mejorar las propiedades terapéuticas de la molécula, para facilitar la detección de objetivos, o para obtener imágenes o terapia del paciente. Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden marcarse o conjugarse antes o después de la purificación, cuando se realiza la purificación. En particular, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden conjugarse con agentes terapéuticos, profármacos, péptidos, proteínas, enzimas, virus, lípidos, modificadores de la respuesta biológica, agentes farmacéuticos o PEG.

Los conjugados que son inmunotoxinas que incluyen anticuerpos convencionales se han descrito ampliamente en la técnica. Las toxinas pueden acoplarse a los anticuerpos mediante técnicas de acoplamiento convencionales o pueden producirse inmunotoxinas que contienen porciones de toxina proteica como proteínas de fusión. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse de una manera correspondiente para obtener tales inmunotoxinas. Ilustrativos de tales inmunotoxinas son los descritos por Byers, Seminarios Celular. Biol. 2 (1991), 59-70 y por Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.

Los expertos en la materia apreciarán que los conjugados también pueden ensamblarse mediante el uso de una variedad de técnicas en dependencia del agente seleccionado a conjugar. Por ejemplo, se preparan conjugados con biotina, por ejemplo, haciendo reaccionar un polipéptido de unión a SOD1 con un éster de biotina activado tal como el éster de biotina N-hidroxisuccinimida. De manera similar, los conjugados con un marcador fluorescente pueden prepararse en presencia de un agente de acoplamiento, por ejemplo, los enumerados aquí, o por reacción con un isotiocianato, preferentemente fluoresceína-isotiocianato. Los conjugados de los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención se preparan de manera análoga.

La presente invención abarca además anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención conjugados con un agente de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos se pueden usar de forma diagnóstica para, por ejemplo, demostrar la presencia de una enfermedad neurodegenerativa, para indicar el riesgo de contraer una enfermedad neurodegenerativa, para controlar el desarrollo o la progresión de una enfermedad neurodegenerativa, es decir una enfermedad que muestra la aparición de SOD1 mal plegada/agregada o relacionada con ella como parte de un procedimiento de prueba clínica para, por ejemplo, Determinar la eficacia de un tratamiento y/o régimen de prevención. La detección se puede facilitar acoplando el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones mediante el uso de varias tomografías de emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos; véase, por ejemplo, la patente de EE.UU núm. 4,741,900 para iones metálicos que pueden conjugarse a anticuerpos para el uso como diagnóstico de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo también puede marcarse de manera detectable al acoplarlo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo etiquetado quimioluminiscente se determina después detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes particularmente útiles son el luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Una de las formas en que un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede marcarse de manera detectable es uniéndolo a una enzima y mediante el uso del producto vinculado en un inmunoensayo enzimático (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Publicación trimestral de Microbiological Associates, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller y otros, J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Mayordomo, metanfetamina. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Florida, (1980).); Ishikawa, E. y otros, (Eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981)) La enzima, que se une al anticuerpo, reaccionará con un sustrato apropiado, preferentemente un sustrato cromogénico, de tal modo como para producir una porción química que se pueda detectar, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorimétricos o visuales. Las enzimas que se pueden usar para etiquetar de forma detectable el anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, malato deshidrogenasa, nucleasa de estafilococos, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. Además, la detección se puede lograr mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también se puede lograr mediante la comparación visual del alcance de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados de manera similar.

La detección también se puede lograr mediante el uso de cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, al marcar radiactivamente el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, es posible detectar el anticuerpo mediante el uso de un radioinmunoensayo (RIA) (ver, por ejemplo, Weintraub, B., Principios de radioinmunoensayos, Séptimo curso de capacitación sobre técnicas de ensayo de radioligandos, The Endocrine Society, (marzo de 1986)). El isótopo radiactivo se puede detectar por medios que incluyen, entre otros, un contador gamma, un contador de centelleo o autorradiografía.

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo también puede marcarse de manera detectable mediante el uso de metales emisores de fluorescencia tales como 152Eu, u otros de la serie de los lantánidos.

Estos metales pueden unirse al anticuerpo mediante el uso de tales grupos quelantes de metales como ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

Las técnicas para conjugar tales restos terapéuticos aun anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo se conocen bien, véase, por ejemplo, Arnon y otros, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y otros (eds.), páginas. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom y otros, "Antibodies For Drug Delivery," en Controlled Drug Delivery (2da Ed.), Robinson y otros (eds.), Marcel Dekker, Inc., páginas 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y otros (eds.), páginas. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y otros (eds.), Academic Press páginas 303-16 (1985), y Thorpe y otros, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158.

Como se mencionó, en ciertas modalidades, un resto que mejora la estabilidad o eficacia de una molécula de unión, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, se puede conjugar un anticuerpo o fragmento inmunoespecífico del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, el PEG se puede conjugar con las moléculas de unión de la invención para aumentar su vida media en vivo. Leong y otros, Cytokine 16 (2001), 106; Adv. en Drug Deliv. Rev.54 (2002), 531; o Weir y otros, Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.

VI. Composiciones y Métodos de Uso

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo contra SOD1 mencionado anteriormente o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, o el polinucleótido, vector o célula de la invención. La composición de la presente invención puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender agentes adicionales tales como interleucinas o interferones en dependencia del uso pretendido de la composición farmacéutica. Para usar en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa que muestra la aparición de, o se relaciona con SOD1 mal plegada/agregada, por ejemplo, de esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer o de Parkinson, el agente adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en pequeñas moléculas orgánicas, anticuerpos anti-SOD1 y combinaciones de los mismos. Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso del anticuerpo contra SOD1 o al fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, el polinucleótido o el vector de la presente invención para usar en la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico para el tratamiento profiláctico y terapéutico de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto.

Por lo tanto, la presente solicitud describe un método para tratar un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la acumulación y/o depósito anormal de SOD1 en el cerebro y el sistema nervioso central, respectivamente, cuyo método comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de las moléculas de unión a SOD1, anticuerpos, polinucleótidos o vectores descritos anteriormente de la presente invención. El término "trastorno neurodegenerativo" incluye, pero sin limitarse a, enfermedades tales como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer (AD), complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia (ALS-PDC), síndrome de Down y enfermedad de Parkinson (PD). El término "trastorno neuromuscular" incluye, pero no se limita a, enfermedades tal como la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). A menos que se indique lo contrario, los términos neurodegenerativo, neurológico se usan indistintamente. Limitado a la descripción de la esclerosis lateral amiotrófica, los términos neurodegenerativo, neurológico y neuromuscular también se usan indistintamente.

Una ventaja particular del enfoque terapéutico de la presente invención radica en el hecho de que los anticuerpos de la presente invención se derivan de células B o células B de memoria de sujetos humanos sanos sin signos de una enfermedad que muestre la ocurrencia de, o relacionada con, SOD1 mal plegado/agregada tal como ALS y, por lo tanto, son, con cierta probabilidad, capaces de prevenir una enfermedad clínicamente manifiesta relacionada con SOD1 mal plegada/agregada, o de disminuir el riesgo de la aparición de la enfermedad clínicamente manifiesta, o de retrasar el inicio o la progresión de la enfermedad clínicamente manifiesta. Típicamente, los anticuerpos de la presente invención también han pasado con éxito por la maduración somática, es decir la optimización con respecto a la selectividad y efectividad en la unión de alta afinidad a la molécula SOD1 diana por medio de la variación somática de las regiones variables del anticuerpo.

El conocimiento de que tales células in vivo, por ejemplo, en un humano, no se han activado por medio de proteínas relacionadas u otras proteínas fisiológicas u otras estructuras celulares en el sentido de una reacción alérgica o autoinmunológica también es de gran importancia médica, ya que esto significa una posibilidad considerablemente mayor de superar con éxito las fases de las pruebas clínicas. Por así decirlo, la eficiencia la aceptabilidad y la tolerabilidad ya se han demostrado antes del desarrollo preclínico y clínico del anticuerpo profiláctico o terapéutico en al menos un sujeto humano. Por lo tanto, puede esperarse que los anticuerpos humanos anti-SOD1 de la presente invención, tanto su eficiencia específica a la estructura diana como agente terapéutico como su disminución de la probabilidad de efectos secundarios aumenten significativamente su probabilidad clínica de éxito.

La presente invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico y de diagnóstico, respectivamente, que comprende uno o más contenedores llenos con uno o más de los ingredientes descritos anteriormente, por ejemplo, anticuerpo anti-SOD1, fragmento de unión, derivado o variante del mismo, polinucleótido, vector o célula de la presente invención. Puede haber un aviso asociado con tal(es) contenedor(s) en la forma prescrita por una agencia gubernamental reguladora de la fabricación, uso o venta de los productos farmacéuticos o biológicos, donde el aviso refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta para la administración humana. Además, o alternativamente, el kit comprende reactivos y/o instrucciones para su uso en ensayos de diagnóstico apropiados. La composición, por ejemplo, el kit de la presente invención es, por supuesto, particularmente adecuada para la evaluación de riesgos, diagnóstico, prevención y tratamiento de un trastorno que se acompaña con la presencia de SOD1 mal plegada/agregada, y en particular aplicable para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer (AD), complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia (ALS-PDC), síndrome de Down o enfermedad de Parkinson, por ejemplo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica; ver por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) por la Universidad de Ciencias de Filadelfia, ISBN 0-683-306472. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden tales portadores pueden formularse mediante métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse de diferentes maneras, por ejemplo, por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intranasal, tópica o intradérmica o por suministro espinal o cerebral. Las formulaciones en aerosol tales como las formulaciones pulverizadas nasales incluyen soluciones acuosas u otras soluciones purificadas del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Tales formulaciones se ajustan preferentemente a un pH y un estado isotónico compatibles con las membranas mucosas nasales. Las formulaciones para la administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio con un portador adecuado.

Además, mientras que la presente invención incluye el procedimiento ahora estándar (aunque afortunadamente infrecuente) de perforar un pequeño agujero en el cráneo para administrar un fármaco de la presente invención, en un aspecto preferido, la molécula de unión, especialmente el anticuerpo o el fármaco basado en el anticuerpo de la presente invención puede atravesar la barrera hematoencefálica, lo que permite la administración intravenosa u oral.

El régimen de dosificación será determinado por el médico de cabecera y los factores clínicos. Como se conoce bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para cada paciente dependen de muchos factores, incluido el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto en particular que se administrará, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se administren simultáneamente. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1000 |jg (o de ácido nucleico para la expresión o para la inhibición de la expresión en este intervalo); sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de este intervalo ilustrativo, especialmente teniendo en cuenta los factores antes mencionados. Generalmente, la dosificación puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más usualmente de 0,01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.) del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o de 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg, preferentemente al menos 1 mg/kg. Las dosis intermedias en los intervalos anteriores también pretenden estar dentro del alcance de la invención. A los sujetos se les puede administrar tales dosis diariamente, en días alternos, semanalmente o de acuerdo con cualquier otro programa determinado por análisis empírico. Un tratamiento ilustrativo implica la administración en dosificaciones múltiples durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento ilustrativos adicionales implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los programas de dosificación ilustrativos incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg por semana. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El progreso puede monitorearse mediante evaluación periódica. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen emulsiones, suspensiones o soluciones estériles acuosas o no acuosas. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, que incluyen una solución salina y medios tamponados. Los portadores parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, lactato de Ringer y aceites fijos. Los portadores intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender agentes adicionales tales como dopamina o fármacos psicofarmacológicos, en dependencia del uso pretendido de la composición farmacéutica.

Además, en una modalidad preferida de la presente invención, la composición farmacéutica puede formularse como una vacuna, por ejemplo, si la composición farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo anti-SOD1 o un fragmento de unión del mismo para la inmunización pasiva. Como se mencionó en la sección de antecedentes, las especies de SOD1 agregadas se han reportado extracelularmente en plasma y CSF (Gruzman y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 104 (2007), 12524-12529) y los estudios en líneas de ratones transgénicos que usan la vacunación activa y pasiva con anticuerpos murinos humanizados revelaron niveles reducidos en el cerebro de agregados de SOD1 en el cerebro, progresión enlentecida de las alteraciones del comportamiento y retraso en la muerte Urushitani y otros, Proc. Natl. Acad.

Sci. Estados Unidos 104 (2007), 2495-2500) En consecuencia, es prudente esperar que la inmunización pasiva con anticuerpos humanos anti-SOD1 de la presente invención ayude a sortear varios efectos adversos de los conceptos de la terapia de inmunización activa como ya se discutió en la sección de antecedentes. Por lo tanto, los presentes anticuerpos anti-SOD1 de la presente invención serán particularmente útiles como una vacuna para la prevención o mejora de enfermedades que muestran la presencia de, o causadas por, SOD1 mal plegada/agregada tal como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer (AD), complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia (ALS-PDC), síndrome de Down o enfermedad de Parkinson, por ejemplo.

En una modalidad, puede ser beneficioso usar constructos biespecíficos o multiespecíficos recombinantes del anticuerpo de la presente invención. Para una referencia ver Fischer y Léger, Pathobiology 74 (2007), 3-14. Tal molécula biespecífica podría diseñarse para dirigirse a SOD1 con un brazo de unión y otra entidad patológica tal como Ap o alfa-sinucleína o una conformación patológica de SOD1 con un segundo brazo de unión. Alternativamente, el segundo brazo de unión puede diseñarse para dirigirse a una proteína presente en la barrera hematoencefálica para facilitar la penetración de los anticuerpos en el cerebro.

En una modalidad, puede ser beneficioso usar Fab recombinante (rFab) y fragmentos de cadena sencilla (scFv) del anticuerpo de la presente invención, que podrían penetrar más fácilmente una membrana celular. Por ejemplo, Robert y otros, Protein Eng. Des. Sel. (2008) 16 de octubre; S1741-0134, publicado en línea más adelante, describe el uso de Fab recombinante quimérico (rFab) y fragmentos de cadena sencilla (scFvs) del anticuerpo monoclonal WO-2 que reconoce un epítopo en la región N-terminal de Ap. Los fragmentos manipulados fueron capaces de (i) prevenir la fibrilación amiloide, (ii) desagregar las fibrillas Ap1-42 preformadas e (iii) inhibir la neurotoxicidad mediada por los oligómeros Ap1-42 in vitro tan eficientemente como la molécula completa de IgG. Las ventajas percibidas del uso de formatos pequeños de anticuerpos manipulados de Fab y scFv que carecen de la función efectora incluyen un paso más eficiente a través de la barrera hematoencefálica y minimizan el riesgo de desencadenar reacciones secundarias inflamatorias. También, además de que scFv y los anticuerpos de dominio único retienen la especificidad de unión de los anticuerpos de longitud completa, estos pueden expresarse como genes individuales e intracelularmente en células de mamífero como intracuerpos, con el potencial para la alteración del plegamiento, interacciones, modificaciones o localización subcelular de sus dianas; ver para la revisión, por ejemplo, Miller y Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401.

En un enfoque diferente Muller y otros, Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241, describen una plataforma tecnológica, también llamada 'Tecnología de SuperAnticuerpo', que se dice que permite que los anticuerpos se transporten a las células vivas sin dañarlas. Tales anticuerpos que penetran las células abren nuevas oportunidades diagnósticas y terapéuticas. El término 'TransMabs' se ha acuñado para estos anticuerpos.

En una modalidad adicional, puede ser conveniente la coadministración o la administración secuencial de otros anticuerpos útiles para tratar una enfermedad relacionada con la aparición de SOD1 mal plegada/agregada. En una modalidad, el anticuerpo adicional está comprendido en la composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos de anticuerpos que pueden usarse para tratar un sujeto incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos dirigidos a beta-amiloide, alfa-sinucleína, TDP-43ytau.

En una modalidad adicional, puede ser conveniente la coadministración o la administración secuencial de otros agentes neuroprotectores útiles para tratar una enfermedad relacionada con SOD1 mal plegada/agregada. En una modalidad, el agente adicional está comprendido en la composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos de agentes neuroprotectores que pueden usarse para tratar un sujeto incluyen, pero no se limitan a, un inhibidor de acetilcolinesterasa, un antagonista del receptor glutamatérgico, inhibidores de cinasa, inhibidores de HDAC, agentes antiinflamatorios, divalproex sódico o cualquier combinación de los mismos. En la técnica se describen ejemplos de otros agentes neuroprotectores que pueden usarse concomitante con la composición farmacéutica de la presente invención; ver, por ejemplo, la solicitud internacional WO2007/011907. En una modalidad, el agente adicional es dopamina o un agonista del receptor de dopamina.

Una dosis o cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad del ingrediente activo suficiente para mejorar los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y toxicidad de estos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales de experimentación, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50% de la población). La relación de la dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación, LD50/ED50. Preferentemente, el agente terapéutico en la composición está presente en una cantidad suficiente para restaurar o preservar el comportamiento normal y/o las propiedades cognitivas en caso de esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer (AD), complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia (ALS-PDC ), síndrome de Down o enfermedad de Parkinson, por ejemplo.

De lo anterior, es evidente que la presente invención abarca cualquier uso de un anticuerpo contra SOD1 de la presente invención, en particular para diagnosticar y/o usar en el tratamiento de una enfermedad relacionada con SOD1 mal plegada/agregada como se mencionó anteriormente, particularmente esclerosis lateral amiotrófica (ALS).

En otra modalidad, la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende cualquiera de los anticuerpos contra SOD1 descritos anteriormente, fragmentos de unión a antígeno, polinucleótidos, vectores o células de la invención y medios opcionalmente adecuados para la detección, tales como reactivos usados convencionalmente en métodos de diagnóstico basados en ácidos nucleicos o reacciones inmunológicas. Los anticuerpos de la invención son, por ejemplo, adecuados para usar en inmunoensayos en los que pueden utilizarse en fase líquida o unidos a un portador en fase sólida. Los ejemplos de inmunoensayos que pueden utilizar el anticuerpo de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos en formato directo o indirecto. Ejemplos de tales inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA), el sandwich (ensayo inmunométrico), la citometría de flujo y el ensayo de transferencia Western. Los antígenos y anticuerpos de la invención pueden unirse a muchos portadores diferentes y usarse para aislar células específicamente unidas a los mismos. Los ejemplos de portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del portador puede ser tanto soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Hay muchas etiquetas y métodos de etiquetado diferentes conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de los tipos de etiquetas que pueden usarse en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes; véase también las modalidades discutidas anteriormente.

En una modalidad adicional, los anticuerpos contra SOD1 de la presente invención también pueden usarse en un método para el diagnóstico de un trastorno en un individuo mediante la obtención de una muestra de fluido corporal del individuo analizado que puede ser una muestra de sangre, una muestra de linfa o cualquier otra muestra de fluido corporal y poner en contacto la muestra de fluido corporal con un anticuerpo de la presente invención en condiciones que permitan la formación de complejos anticuerpo-antígeno. El nivel de tales complejos se determina luego por métodos conocidos en la técnica, un nivel significativamente más alto que el formado en una muestra control indica la enfermedad en el individuo probado. De la misma manera, también puede usarse el antígeno específico unido por los anticuerpos de la invención. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un inmunoensayo in vitro que comprende la molécula de unión, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención.

En este contexto, la presente invención también se refiere a los medios diseñados específicamente para este propósito. Por ejemplo, puede usarse un arreglo basado en anticuerpos, que está cargado con anticuerpos o moléculas de unión a antígeno equivalentes de la presente invención que reconocen específicamente SOD1. El diseño de inmunoensayos de microarreglos se resume en Kusnezowy otros, Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. En consecuencia, la presente invención también se refiere a microarreglos cargados con moléculas de unión a SOD1 identificadas de acuerdo con la presente invención.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad relacionada con SOD1 mal plegada/agregada en un sujeto, el método comprende determinar la presencia de SOD1 y/o SOD1 mal plegada y/o agregada en una muestra del sujeto a diagnosticar con al menos un anticuerpo de la presente invención, o un fragmento de unión a SOD1 del mismo, en donde la presencia de SOD1 patológicamente mal plegada y/o agregada es indicativo de un trastorno neurodegenerativo y un aumento del nivel de SOD1 patológicamente mal plegada y/o agregada en comparación con el nivel de las formas diméricas fisiológicas de SOD1 es indicativo de la progresión de un trastorno neurodegenerativo en dicho sujeto.

El sujeto a diagnosticar puede ser asintomático o preclínico para la enfermedad. Preferentemente, el sujeto control tiene una enfermedad relacionada con SOD1 mal plegada/agregada, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer (AD), complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia (ALS-PDC), síndrome de Down o enfermedad de Parkinson, en donde una similitud entre el nivel de SOD1 patológicamente mal plegada y/o agregada y el estándar de referencia indica que el sujeto a diagnosticar tiene una enfermedad neurodegenerativa. Alternativamente, o además como un segundo control, el sujeto control no tiene una enfermedad neurodegenerativa, en donde una diferencia entre el nivel de dímeros fisiológicos de SOD1 y/o de SOD1 patológicamente mal plegado y/o agregada y el estándar de referencia indica que el sujeto debe diagnosticarse que tiene una enfermedad neurodegenerativa. Preferentemente, el sujeto a diagnosticar y el(los) sujeto(s) control coinciden en la edad. La muestra a analizar puede ser cualquier fluido corporal sospechoso de contener SOD1 patológicamente mal plegada y/o agregada, por ejemplo, una muestra de sangre, CSF u orina.

El nivel de dímeros fisiológicos de SOD1 y/o de SOD1 patológicamente mal plegada y/o agregada puede evaluarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica que comprende, por ejemplo, analizar SOD1 mediante una o más técnicas elegidas de transferencia Western, inmunoprecipitación, ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), clasificación de células activadas fluorescentes (FACS), electroforesis en gel bidimensional, espectroscopía de masas (MS), desorción láser asistida por matriz/tiempo de vuelo de ionización MS (MALDI-TOF), desorción láser incrementada por superficie tiempo de vuelo de ionización (SELDI-TOF), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC), cromatografía líquida multidimensional (LC) seguida de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) y densitometría láser. Preferentemente, dicha formación de imágenes in vivo de SOD1 comprende tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía por emisión de fotón único (SPECT), imagen óptica por infrarrojo cercano (NIR) o imagen por resonancia magnética (MRI).

Los métodos basados en anticuerpos para la detección de SOD1 y para diagnosticar o monitorear la progresión de una enfermedad relacionada con SOD1 mal plegada/agregada tal como ALS, y monitorear el tratamiento de dicha enfermedad mediante el uso de anticuerpos y medios relacionados que pueden adaptarse de acuerdo con la presente invención se describen también en las solicitudes internacionales WO2007/098607 y WO2007/025385. Esos métodos pueden aplicarse como se describió, pero con un anticuerpo específico contra SOD1, fragmento de unión, derivado o variante de la presente invención.

Estas y otras modalidades se describen y abarcan en la descripción y los ejemplos de la presente invención. Se puede recuperar literatura adicional sobre cualquiera de los materiales, métodos, usos y compuestos a emplear de acuerdo con la presente invención de las bibliotecas y bases de datos públicas, mediante el uso por ejemplo de dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede utilizar la base de datos pública "Medline", que está alojada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica y/o la Biblioteca Nacional de Medicina de los Institutos Nacionales de Salud. El experto en la técnica conoce otras bases de datos y direcciones web, como las del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI), que forma parte del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), y también se pueden obtener mediante motores de búsqueda en Internet. Una visión general de la información de patentes en biotecnología y una búsqueda de fuentes relevantes de información de patentes útiles para la investigación retrospectiva y para el conocimiento actual Berks, TIBTECH 12(1994), 352-364.

La descripción anterior generalmente describe la presente invención. A menos que se indique lo contrario, un término como se usa en la presente descripción recibe la definición que se proporciona en Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revisado en 2000 y reimpreso en 2003, ISBN 019850673 2. Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta descripción.

Se puede obtener una comprensión más completa haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en la presente descripción solo con fines ilustrativos.

EJEMPLOS

Los ejemplos que siguen ilustran más aun la invención. Los siguientes experimentos en los Ejemplos 1 a 7 se ilustran y describen con respecto a los anticuerpos NI-204.10D12, NI-204.12G7 (anticuerpo de la presente invención), NI-204.10A8, NI-204.9F6, NI-204.11F11, NI-204.67E12, NI-204.6H1, NI-204.12G3, NI-204.7G5, NI-204.7B3, NI-204.34A3 y NI-204.25H3 como clonados, es decir el marco 1 (FR1) regiones variables de Ig sin ajustarse a las secuencias de línea germinal (GL) de las cadenas pesadas y ligeras variables humanas; ver Figura 1.

Material y métodos

Se pueden encontrar descripciones detalladas de los métodos convencionales, tales como los empleados en la presente descripción, en la literatura citada; ver también "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Decimoséptima edición editada por Beers y Berkow (Merck & Co., Inc. 2003)

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia en la técnica. Para una mayor elaboración de técnicas generales útiles en la práctica de esta invención, el profesional puede consultar libros de texto estándar y revisiones en biología celular y cultivo de tejidos; véase también las referencias citadas en los ejemplos. Los métodos generales en bioquímica molecular y celular se pueden encontrar en libros de texto estándar como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3era Edición. (Sambrook y otros, Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4ta edición (Ausubel y otros ediciones, John Wiley y Sons 1999); DNA Cloning, Volúmenes I y II (Glover edición, 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait edición, 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames y Higgins ediciones 1984); Transcription And Translation (Hames y Higgins ediciones 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney y Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller y Calos, ediciones); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3ra Edición (Ausubel y otros, ediciones); y Recombinant DNA Methodology (Wu, edición, Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller y Calos, ediciones, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Volúmenes 154 and 155 (Wu y otros, ediciones); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, ediciones, Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (Weir y Blackwell, ediciones, 1986). Protein Methods (Bollag y otros, John Wiley y Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner y otros, ediciones, Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt y Loewy ediciones, Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits edición, Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle y Griffiths, John Wiley y Sons 1998). Los reactivos, los vectores de clonación y los kits para la manipulación genética a los que se hace referencia en esta descripción están disponibles en proveedores comerciales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech. Las técnicas generales en cultivo celular y recolección de medios se describen en Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu y otros, Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); y Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch y otros, Bioprocess Technol. 19 (1990), 251); Extracting information from cDNA arrays, Herzel y otros CHAOS 11 (2001), 98-107.

Métodos de identificación de células B específicas para SOD1 y clonación de los anticuerpos respectivos

A menos que se indique lo contrario a continuación, la identificación de células B específicas para SOD1 y la clonación molecular de anticuerpos anti-SOD1 que muestran especificidad de interés, así como también su expresión recombinante y caracterización funcional se ha realizado o se puede realizar generalmente como se describe en la sección de Ejemplos y Métodos Suplementarios de la solicitud internacional PCT/EP2008/000053 publicada como WO2008/081008. Dentro de esta solicitud se proporciona un nuevo método para la identificación de células B específicas para SOD1 y la clonación molecular de anticuerpos contra SOD1 que muestran especificidad de interés, así como también su expresión recombinante y caracterización funcional. Como se describió anteriormente en una modalidad de la presente invención, se cultivan cultivos de células B simples u oligoclonales y se analiza el sobrenadante del cultivo, que contiene anticuerpos producidos por dichas células B, para cribar la presencia y afinidad de los nuevos anticuerpos anti-SOD1 en el mismo. El proceso de cribaje comprende las etapas de un ensayo de inmunorreactividad de la placa amiloide de tejido sensible (TAPIR) como se describe en el documento núm.WO2004/095031; cribado en tejidos de la médula espinal de ratón transgénico que expresa formas de SOD1 humanas mutadas para agregados patológicos de SOD1 como se describe en el Ejemplo 4 y se muestra en la Figura 6; cribado para la unión de un péptido derivado de SOD1 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 como se describe análogamente en el Ejemplo 5 y se muestra en la Figura 7 con péptidos debido a los experimentos de confirmación de epítopo para el anticuerpo NI-204.10D12; un cribado para la unión de SOD1 de longitud completa de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y aislar el anticuerpo para el que se detecta la unión o la célula que produce dicho anticuerpo como se describe en la patente internacional WO2008/081008 y como se describe en el Ejemplo 1 y se muestra en las Figuras 2, 5 y 7.

Antígenos de SOD1

La SOD1 humana recombinante se adquirió de biomol (Hamburgo, Alemania). La SOD1 de tipo salvaje de eritrocitos humanos (dímeros fisiológicos) y todos los demás reactivos se compraron de Sigma-Aldrich (Buchs, Suiza) si no se menciona lo contrario.

Cribado de anticuerpos humanos contra SOD1

ELISA:

Las microplacas de 96 pocillos (Corning) se recubrieron con SOD1 humana recombinante (biomol, Hamburgo, Alemania) o con BSA (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) diluidos a una concentración de 3,3 pg/ml o 5 pg/ml entampón de recubrimiento (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,42, pH 9,6) durante toda la noche a 4 °C. Alternativamente, se usan microplacas de 96 pocillos (Corning) recubiertas con SOD1 humana oxidada in vitro a una concentración de 34 pg/ml en tampón de recubrimiento (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3pH 9,42). Las placas se lavaron en PBS-T pH 7,6 y los sitios de unión no específicos se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS/Tween-20 al 0,1 % que contenía BSA al 2 % (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza). El medio acondicionado de células B se transfirió desde las placas de cultivo de células B de memoria a placas ELISA y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Las placas ELISA se lavaron en PBS-T y la unión se determinó mediante el uso de anticuerpos policlonales antiinmunoglobulinas humanas conjugados a peroxidasa de rábano (HRP) (Jackson ImmunoResearch, Newmarket, Reino Unido) seguido por la medición de la actividad de HRP en un ensayo colorimétrico estándar. Solo los cultivos de células B que han mostrado la unión de los anticuerpos contenidos en el medio a SOD1 recombinante pero no a BSA se sometieron a la clonación de anticuerpos.

Cribado de microplacas MULTI-ARRAY®

Las placas estándar MULTI-SPOT de 10 puntos de 96 pocillos (Meso Scale Discovery, EE.UU.) se recubrieron con 30 ug/ml de SOD1 (biomol, Hamburgo, Alemania) en PBS. Los sitios de unión no específicos se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS-T que contenía BSA al 3 % seguido de incubación con medio acondicionado de células B durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron en PBS-T y luego se incubaron con anticuerpo policlonal antihumano conjugado a SULFO-Tag (Meso Scale Discovery, EE.UU.). Después de lavar con PBS-T, se detectó la unión del anticuerpo por medición de electroquimioluminiscencia mediante el uso de un SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery, EE.UU.).

Clonación molecular de anticuerpos contra SOD1

Se obtuvieron muestras que contenían células B de memoria de sujetos humanos sanos. Se recolectan células B vivas de cultivos seleccionados de células B de memoria y se prepara el ARNm. Las secuencias de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina se obtienen luego mediante el uso de un enfoque de PCR anidada.

Se usa una combinación de cebadores que representan todas las familias de secuencias del repertorio de la línea germinal de la inmunoglobulina humana para las amplificaciones de los péptidos líderes, segmentos V y segmentos J. La amplificación de la primera ronda se realiza mediante el uso de cebadores específicos de péptido líder en el extremo 5' y cebadores específicos de la región constante en el extremo 3' (Smith y otros, Nat Protoc. 4 (2009), 372-384). Para las cadenas pesadas y las cadenas ligeras kappa, la amplificación de la segunda ronda se realiza mediante el uso de cebadores específicos del segmento V en el extremo 5' y cebadores específicos del segmento J en el extremo 3'. Para las cadenas ligeras lambda, la amplificación de la segunda ronda se realiza mediante el uso de cebadores específicos del segmento V en el extremo 5' y un cebador específico de la región C en el extremo 3' (Marks y otros, Mol. Biol. 222 (1991), 581-597; de Haard y otros, J. Biol. Chem 26 (1999), 18218-18230)

La identificación del clon de anticuerpo con la especificidad deseada se realiza mediante un nuevo cribado en ELISA tras la expresión recombinante de los anticuerpos completos. La expresión recombinante de los anticuerpos IgG1 humanos completos o los anticuerpos IgG2a quiméricos se logra con la inserción de las secuencias de la cadena pesada y ligera variables "en el marco de lectura correcto" en vectores de expresión que complementan la secuencia de la región variable con una secuencia que codifica un péptido líder en el extremo 5' y en el extremo 3' con una secuencia que codifica el(los) dominio(s) constante(s) apropiado(s). Con ese fin, los cebadores contenían sitios de restricción diseñados para facilitar la clonación de las secuencias de la cadena pesada y ligera variables en los vectores de expresión de los anticuerpos. Las inmunoglobulinas de cadena pesada se expresan al insertar el producto de la RT-PCR de la cadena pesada de inmunoglobulina en marco en un vector de expresión de la cadena pesada que porta un péptido señal y los dominios constantes de la inmunoglobulina gamma 1 humana o la inmunoglobulina gamma 2a de ratón. Las inmunoglobulinas de la cadena ligera kappa se expresan al insertar el producto de la RT-PCR de la cadena ligera de kappa en marco en un vector de expresión de la cadena ligera que proporciona un péptido señal y el dominio constante de la inmunoglobulina de la cadena ligera de kappa humana. Las inmunoglobulinas de la cadena ligera de lambda se expresan al insertar el producto de la RT-PCR de la cadena ligera lambda en marco en un vector de expresión de la cadena ligera lambda que proporciona un péptido señal y el dominio constante de la inmunoglobulina de cadena ligera lambda humana o de ratón.

Los anticuerpos monoclonales recombinantes funcionales se obtienen tras la cotransfección en células HEK293 o CHO (o cualquier otra línea celular receptora apropiada de origen humano o de ratón) de un vector de expresión de la cadena pesada de Ig y un vector de expresión de la cadena ligera de Ig kappa o lambda. El anticuerpo monoclonal humano recombinante se purifica subsecuentemente del medio acondicionado mediante el uso de una purificación en columna estándar de Proteína A. El anticuerpo monoclonal humano recombinante puede producirse en cantidades ilimitadas mediante el uso de células transfectadas de manera transiente o estable. Las líneas celulares que producen anticuerpos monoclonales humanos recombinantes pueden establecerse mediante el uso de los vectores de expresión de Ig directamente o mediante la clonación de nuevo de las regiones variables de Ig en vectores de expresión diferentes. Derivados tales como F(ab), F(ab)2 y scFv también pueden generarse a partir de estas regiones variables de Ig.

Anticuerpos

El anticuerpo monoclonal anti-SOD1 de ratón 72B1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.) y el anticuerpo monoclonal anti-SOD1 de conejo EPR1726 (Epitomics, Burlingame, EE.UU.) se usaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. El anticuerpo contra SOD1 humano o quimérico recombinante NI-204.12G7 es un anticuerpo de la presente invención, mientras que NI-204.10D12, NI-204.10A8, NI-204.9F6, NI-204.11F11, NI-204.67E12, NI-204.6H1, NI-204.12G3, NI-204.7G5, NI-204.7B3, NI-204.34A3 y NI-204.25H3 son anticuerpos de referencia. Se expresaron en células HEK293 o CHO, se purificaron a partir de medios acondicionados y se usaron directamente en aplicaciones subsecuentes a menos que se indique lo contrario. En los Ejemplos 1 a 4 se usaron los anticuerpos recombinantes purificados descritos.

ELISA directo

Se recubrieron microplacas de 96 pocillos (Costar, Corning, EE.UU.) con proteína SOD1 recombinante (biomol, Hamburgo, Alemania) diluida a una concentración de 3,3 pg/ml en tampón de recubrimiento de carbonato para el ELISA (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9,42) a 4 °C durante toda la noche. Los sitios de unión no específicos se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente con PBS que contenía BSA al 2 % (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) y Tween20 al 0,5 %. La unión de los anticuerpos humanos de la presente descripción (NI-204.10D12, NI-204.9F6, NI-204.12G7 y NI-204.10A8) se determinó mediante el uso de un anticuerpo IgGy antihumano de burro conjugado con HRP (Jackson immunoResearch, Newmarket, Reino Unido), seguido de la medición de la actividad de HRP en un ensayo colorimétrico estándar. Los valores de EC50 se estimaron mediante una regresión no lineal mediante el uso del softWare GraphPad Prism (San Diego, EE.UU.).

Ratones transgénicos

La línea transgénica de ratón B6.Cg-Tg (SOD1*G93A) 1Gur/J se usa para validar los anticuerpos contra SOD1 (y las moléculas con sus especificidades de unión) de la presente descripción. Dicha línea transgénica de ratón es un modelo de ratón muy bien establecido y caracterizado para ALS. Las características neuropatológicas en la médula espinal de estos modelos de ratones con ALS son la presencia de esferoides ricos en neurofilamentos, similares a los observados en la esclerosis lateral amiotrófica humana, que se encuentran con mayor frecuencia en la asta anterior y en las columnas anterior y lateral de la sustancia blanca que en la asta posterior, la presencia de neuritas distróficas engrosadas llenas de inclusiones inmunorreactivas ricas en neurofilamentos, degeneración de la neurona motora caracterizada por la presencia de vacuolas pericárdicas, gliosis y astrocitosis. Las inclusiones dispersas intracelulares, las inclusiones tipo cuerpos de Lewy y los agregados extracelulares, que consisten principalmente en agregados anormales de la proteína superóxido dismutasa 1, son características distintivas neuropatológicas adicionales.

Ejemplo 1: Validación de la diana y especificidad de unión de los anticuerpos humanos contra SOD1

Para validar SOD1 como una diana reconocida de los anticuerpos aislados, se realizaron ensayos ELISA directos como se describió anteriormente. Para los anticuerpos humanos recombinantes ilustrativos NI-204.10D12, NI-204.12G7, NI-204.9F6 y NI-204.10A8, se recubrieron microplacas de 96 pocillos (Costar, Corning, EE.UU.)con SOD1 humana recombinante (biomol, Hamburgo, Alemania) o con BSA (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) diluidos a una concentración de 3,3 |jg/ml en tampón de recubrimiento de carbonato para el ELISA (Na2CO315 mM, NaHCO335 mM, pH 9,42) y se evaluó la eficiencia de unión del anticuerpo. Los anticuerpos ilustrativos NI-204.10D12, NI-204.12G7, NI-204.9F6 y NI-204.10A8 se unen específicamente a SOD1 humana por ELISA. No se observa unión a BSA; ver Figura 2.

Para determinar la concentración efectiva media máxima (EC50) de los anticuerpos ilustrativos NI-204.10D12, NI-204.12G7, NI-204.9F6 y NI-204.10A8 se realizaron experimentos ELISA directos adicionales con concentraciones de anticuerpos variables. Se recubrieron microplacas de 96 pocillos (Costar, Corning, EE.UU.) con SOD1 humana recombinante (biomol, Hamburgo, Alemania) diluida a una concentración de 3,3 jg/m l en tampón de recubrimiento de carbonato para el ELISA (Na2CO315 mM, NaHCO335 mM, pH 9,42) y se evaluó la eficiencia de unión del anticuerpo. La unión se determinó mediante el uso de un anticuerpo IgGy anti-humano de burro (Jackson immunoResearch, Newmarket, Reino Unido) conjugado con HRP, seguido de la medición de la actividad de HRP en un ensayo colorimétrico estándar.

Los valores de EC50 se estimaron mediante una regresión no lineal mediante el uso del software GraphPad Prism (San Diego, EE.UU.). Los anticuerpos recombinantes derivados de humanos NI-204.10D12, NI-204.10A8 y NI-204.12G7 se unen con una alta afinidad a la superóxido dismutasa 1 humana recombinante con una EC50 de 10,0 nM, de 2,7 nM y 0,4 nM, respectivamente. El anticuerpo NI-204.9F6 se une a la superóxido dismutasa 1 humana recombinante con una EC50 en el intervalo nanomolar(104,8 nM); ver Figura 3. Por lo tanto, los anticuerpos NI-204.10D12, NI-204.12G7, NI-204.10A8 y NI-204.9F6 son candidatos a fármacos derivados de humanos adecuados para la ALS familiar y pueden estudiarse en modelos de ratones transgénicos establecidos que sobreexpresan mutantes de la superóxido dismutasa 1.

Ejemplo 2: Análisis de EC50 para aumentar las concentraciones de recubrimiento de superóxido dismutasa humana 1 (SOD1), prefiriendo así la formación de epítopos conformacionales

Para determinar la capacidad de unión de NI-204.10D12, NI-204.10A8, NI-204.12G7 y NI-204.9F6 a epítopos conformacionales, se realizaron experimentos ELISA directos con SOD1 humana recombinante (biomol, Hamburgo, Alemania) a cuatro diferentes concentraciones de recubrimiento (0,1; 1; 10 o 30 jg/m l) en tampón de recubrimiento. Los anticuerpos primarios NI-204.10D12 humano, NI-204.10A8 humano, NI-204.9F6 humano y el anticuerpo monoclonal murino SOD-1 72B1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.) se diluyeron a las concentraciones indicadas (Figura 4) y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. La unión se determinó mediante el uso de un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra (Jackson immunoResearch, Newmarket, Reino Unido) o un anticuerpo IgGy anti-humano de burro (Jackson inmunoResearch, Newmarket, Reino Unido) conjugado con HRP, seguido de la medición de la actividad HRP en un ensayo colorimétrico estándar. Los valores de EC50 se estimaron mediante una regresión no lineal mediante el uso del software GraphPad Prism (San Diego, EE.UU.).

La concentración efectiva media máxima (EC50) que indica la potencia de un anticuerpo se determinó para las concentraciones de recubrimiento bajas y altas de SOD1 humana recombinante mediante el uso de un ELISA de SOD1 directo. La unión de alta afinidad de NI-204.10D12 recombinante con una EC50 de 24 nM se observó para altas densidades de recubrimiento de la proteína SOD1 humana (10 o 30 jg/m l) (Figura 4Ay F). A concentraciones de recubrimiento más bajas de SOD1 humana, se observó una caída sustancial en la afinidad, con un aumento correspondiente de la EC50 cerca de 25 veces para NI-204.10D12 (Figura 4A y F). La unión de muy alta afinidad de NI-204.12G7 recombinante con una EC50 de 0,4 nM se observó para altas densidades de recubrimiento de la proteína SOD1 humana (10 o 30 jg/m l) (Figura 4D y F). A concentraciones de recubrimiento más bajas de SOD1 humana, se observó una caída sustancial en la afinidad, con un aumento correspondiente de la EC50 cerca de 195 veces para NI-204.12G7 (Figura 4D y F). Por el contrario, el anticuerpo NI-204.10A8 se une con alta afinidad ya a bajas densidades de recubrimiento (0,1 y 1 jg/m l) de proteína SOD1 humana, con una EC50 de 96 nM y 19 nM, respectivamente (Figura 4B y F). A una densidad de recubrimiento de 10 jg/m l de proteína SOD1 humana, se observó un aumento adicional en la afinidad de unión de NI-204.10A8, disminuyendo la EC50 a 2 nM (Figura 4B y F). El anticuerpo NI-204.9F6 muestra propiedades de unión a la proteína SOD1 humana recombinante que son muy similares a las del anticuerpo NI-204.10A8 (Figura 4C). Sin embargo, las afinidades de unión de NI-204.9F6 son mucho menores que las determinadas para el anticuerpo NI-204.10A8 (Figura 4B, C y F).

El anticuerpo SOD-1 72B1 disponible comercialmente no mostró una fuerte disminución en la afinidad de unión a densidades de recubrimiento más bajas de SOD1 humana (Figura 4D).

El análisis de EC50 del anticuerpo NI-204.10D12 con concentraciones crecientes de recubrimiento de la superóxido dismutasa 1 humana reveló una fuerte ganancia en afinidad a altas concentraciones de recubrimiento de SOD1. Mientras que una EC50 de 24 nM se midió a 10 jg/m l de recubrimiento, este valor aumentó cerca de 25 veces para el recubrimiento de baja densidad (0,1 jg/m l) de S0 D1 lo que sugiere una caída considerable en la afinidad. De manera similar a NI-204.10D12, el análisis de EC50 del anticuerpo NI-204.12G7 reveló una ganancia muy fuerte en afinidad a altas concentraciones de recubrimiento de SOD1. Mientras que una EC50 de 0,4 nM se midió a 10 jg/m l de recubrimiento, este valor aumentó cerca de 195 veces para el recubrimiento de baja densidad (0,1 jg/m l) de SOD1 lo que sugiere una caída considerable en la afinidad. Es probable que estos hallazgos se expliquen por la posible agregación espontánea de SOD1 humana recombinante a altas concentraciones locales en la placa del ELISA y apuntan a epítopos de los anticuerpos NI-204.10D12 y NI-204.12G7 que se exponen en el mal plegamiento de SOD1 o la formación de agregados. Por el contrario, la unión de alta afinidad en el recubrimiento de baja densidad (0,1 pg/ml) con ganancia de afinidad a altas concentraciones de recubrimiento (10 pg/ml) de SOD1 del anticuerpo NI-204.10A8 indica que este anticuerpo puede reconocer un epítopo de SOD1 humano que está presente en la conformación fisiológica de la proteína. NI-204.9F6 muestra afinidades de unión más bajas en todas las concentraciones de SOD1 que NI-204.10A8 con una ligera ganancia de afinidad en altas concentraciones de recubrimiento, lo que sugiere que este anticuerpo también puede reconocer un epítopo de SOD1 humana presente en la conformación fisiológica.

Ejemplo 3: Análisis de unión a dímeros fisiológicos de SOD1 y a SOD1 mal plegada/agregada in vitro

Se usó una reacción de oxidación catalizada por metal para inducir in vitro la agregación de la superóxido dismutasa 1 (de acuerdo con Rakhit y otros, J Biol Chem. 279 (2004), 15499-504) SOD1 de tipo salvaje de eritrocitos humanos (dímeros) y todos los demás reactivos se compraron de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza). Para la agregación, se incubó SOD1 humana 10 pM en tampón de acetato Tris 10 mM, pH 7,0, que contiene ácido ascórbico 4 mM y CuCh 0,2 mM durante 48 horas a 37 °C. Como control, se incubó SOD1 humana 10 pM en tampón de acetato Tris 10 mM, pH 7,0, durante 48 horas a 37 °C.

Las microplacas de 96 pocillos (Corning) se recubrieron con dímeros fisiológicos de SOD1 humana o con dímeros de SOD1 humanos agregados in vitro a una concentración de 34 pg/ml en tampón de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO3 35 mM pH 9,42). Los sitios de unión no específicos se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS/Tween®-20 al 0,1 % que contiene BSA al 2 % (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza). Los anticuerpos primarios humanos NI-204.10D12, NI-204.12G7, NI-204.10A8, NI-204.9F6 y el anticuerpo monoclonal murino SOD-1 72B1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.) se diluyeron a las concentraciones indicadas y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La unión se determinó mediante el uso de un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra (Jackson immunoResearch, Newmarket, Reino Unido) o un anticuerpo IgGy anti-humano de burro (Jackson immunoResearch, Newmarket, Reino Unido) conjugado con HRP, seguido de la medición de la actividad HRP en un ensayo colorimétrico estándar. Los valores de EC50 se estimaron mediante una regresión no lineal mediante el uso del softWare GraphPad Prism (San Diego, EE.UU.).

El anticuerpo NI-204.10D12 humano (Figura 5A) y NI-204.12G7 (Figura 5C) se unen preferentemente a SOD1 humana mal plegada/agregada con una EC50 de 15 nM y 3,6 nM, respectivamente. El anticuerpo NI-204.9F6 humano (Figura 5D) se une de forma ligeramente preferencial a la superóxido dismutasa 1 humana mal plegada/agregada con una EC50 de 127 nM. Estos hallazgos sugieren que los anticuerpos NI-204.10D12, NI-204.12G7 y NI-204.9F6 se dirigen preferentemente a epítopos de SOD1 humana que se exponen en conformaciones patológicamente relevantes de formas mal plegadas/agregadas, pero no en formas fisiológicas de la superóxido dismutasa 1 humana.

Por el contrario, el anticuerpo NI-204.10A8 se une con igual afinidad a los dímeros fisiológicos de SOD1 humana y a la SOD1 humana mal plegada/agregada (Figura 5B) con una EC50 de 19,1 nM y 29,5 nM, respectivamente. Estos hallazgos sugieren que el anticuerpo NI-204.10A8 se dirige a un epítopo de SOD1 humana que se expone tanto en conformaciones patológicamente relevantes de formas mal plegadas/agregadas como fisiológicas de la superóxido dismutasa 1 humana.

El anticuerpo SOD-1 72B1 disponible comercialmente se une con casi igual afinidad a los dímeros fisiológicos de SOD1 humana y a la SOD1 humana mal plegada/agregada; ver Figura 5E.

Los agregados de SOD1 inducidos por oxidación catalizada por metal poseen propiedades idénticas con los agregados en vivo de la superóxido dismutasa 1 en ALS. NI-204.10D12 (Figura 5A) y NI-204.12G7 (Figura 5C) muestran una unión prominente a las formas patológicas terapéuticamente relevantes de SOD1 humana, tal como SOD1 mal plegada/agregada. La unión a los agregados de SOD1 parece preferirse sobre los dímeros fisiológicos. NI-204.9F6 (Figura 5D) muestra una unión ligeramente preferencial a las formas patológicas terapéuticamente relevantes de la superóxido dismutasa 1 humana. Sin embargo, la afinidad de unión del anticuerpo NI-204.9F6 por SOD1 mal plegada/agregada es menor que las afinidades determinadas para los anticuerpos NI-204.10D12 y NI-204.12G7.

Interesantemente, el anticuerpo NI-204.10A8 (Figura 5B), en contraste con los anticuerpos NI-204.10D12, NI-204.12G7 y NI-204.9F6, no muestra una unión preferencial a los agregados de SOD1 sobre los dímeros fisiológicos. Este anticuerpo se une a ambas especies de SOD1 con alta afinidad en el intervalo nanomolar bajo.

Estos hallazgos resaltan el perfil terapéuticamente atractivo de los anticuerpos NI-204.10D12 y NI-204.12G7 derivados de humanos que se dirigen contra conformaciones patológicamente relevantes de la proteína SOD1 y que el anticuerpo NI-204.10A8 posee propiedades bioquímicas que difieren de las de los anticuerpos NI-204.10D12 y NI-204.12G7. Por lo tanto, NI-204.10A8 derivado de humano representa un anticuerpo terapéutico potencial para la ALS con propiedades distintas de las de las moléculas NI-204.10D12 y NI-204.12G7.

Además, estos hallazgos concuerdan con el análisis de unión con concentraciones de recubrimiento crecientes de la superóxido dismutasa 1 humana.

Ejemplo 4: Evaluación de la unión de NI-204.10D12, NI-204.12G7, NI-204.10A8 y NI-204.9F6 a agregados patológicos de SOD1 en tejidos de ratón transgénico de la médula espinal

Las médulas espinales de ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J en la etapa terminal de la enfermedad se fijaron en solución de paraformaldehído al 4 % tamponada con fosfato, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 |jm. Después del pretratamiento con ácido fórmico, las secciones se incubaron con diferentes anticuerpos anti-superóxido dismutasa 1: NI-204.10D12 quimérico (50 nM), NI204-10A8 humano (50 nM), NI-204.12G7 humano (20 nM), NI-204.9F6 humano (50 nM) y EPR1726 anti-sOD1 (Epitomics, 1:10000) seguido de incubación con anticuerpo secundario anti-ratón de burro biotinilado o anti-humano de burro biotinilado o anti-conejo de burro biotinilado (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd; 1:250). La señal del anticuerpo se amplificó con el kit Vectastain ABC (Vector Laboratories) y se detectó con diaminobencidina (Dako).

La unión de NI-204.10D12, NI-204.12G7, NI-204.10D12 y NI-204.9F6 a la superóxido dismutasa 1 se caracterizó por análisis inmunohistoquímico de secciones de la médula espinal de ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J en la etapa terminal de la enfermedad.

NI-204.10D12 muestra principalmente una tinción difusa de la SOD1 patológica, así como también inclusiones dispersas intracelulares; ver Figura 6A.

NI-204.12G7 muestra una tinción prominente de la SOD1 patológica que incluye inclusiones citoplasmáticas de SOD1, principalmente en neuronas motoras y agregados extracelulares de SOD1 (Figura 6C).

NI-204.10A8 muestra una tinción prominente de la SOD1 patológica que incluye inclusiones citoplasmáticas de SOD1, principalmente en neuronas motoras y agregados extracelulares de SOD1 (Figura 6B). Además, este anticuerpo parece reconocer también la SOD1 fisiológica con alta sensibilidad, como lo muestra la intensa tinción difusa del tejido de la médula espinal (Figura 6B).

Estos hallazgos están de acuerdo con las propiedades de unión bioquímica de los tres anticuerpos: los anticuerpos NI-204.10D12 y NI-204.12G7 que muestran una fuerte preferencia de unión a SOD1 mal plegada/agregada y el anticuerpo NI-204.10A8 que muestra una afinidad de unión igual a los dímeros fisiológicos de SOD1 y a SOD1 mal plegada/agregada.

El anticuerpo NI-204-9F6, bajo las condiciones de tinción probadas, reacciona muy débilmente y detecta principalmente SOD1 intracelular e inclusiones dispersas intracelulares de SOD1; ver Figura 6D.

El anticuerpo EPR1726 anti SOD-1 comercialmente disponible, que detecta SOD1 específicamente humana pero no murina, se une a SOD1 fisiológica, así como a agregados patológicos de SOD1 con alta sensibilidad; ver Figura 6E.

Para probar todos los anticuerpos de la presente descripción, se ha repetido el experimento descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 9, los anticuerpos específicos de SOD1 derivados de humanos revelaron distintos patrones de SOD1 patológica, tales como inclusiones intracelulares, dispersas, inclusiones citoplasmáticas y agregados de SOD1 más grandes, en su mayoría extracelulares, en la médula espinal lumbar de ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J.

Todos los anticuerpos mostrados en la Figura 9 muestran la tinción de inclusiones dispersas intracelulares, estructuras citoplasmáticas difusas y estructuras vacuolares si se usa la concentración apropiada de anticuerpo. La tinción de los agregados más grandes comparables con el anticuerpo de referencia B8H10 (Figura 9M) divide los anticuerpos de la presente descripción en dos grupos: Anticuerpos NI-204.12G7 (Figura 9B), NI-204.11F11 (Figura 9C), NI-204.6H1 (Figura 9F), NI-204.12G3 (Figura 9G), NI-204.7G5 (Figura 9H), NI-204.25H3 (Figura 9I), NI-204.34A3 (Figura 9J) and NI-204.7B3 (Figura 9K) tiñen estos agregados en la asta ventral de la médula espinal, mientras que NI-204.10D12 (Figura 9A), NI-204.10A8 (Figura 9D), NI-204.67E12 (Figura 9E) no tiñen estas estructuras, de forma similar al anticuerpo de referencia C4F6 ((Figura 9L) que es específico para formas solubles y mal plegadas de SOD1 humana mutante (Bosco y otros, 2010, Nat Neuroscience 13(11); 1396-1403) Además, los anticuerpos NI-204.10D12, NI-204.6H1 yNI-204.7G5 muestran tinción difusa en la sustancia gelatinosa en la asta dorsal de las secciones de la médula espinal.

Además, algunos de los anticuerpos parecen reconocer también la SOD1 fisiológica con alta sensibilidad, como lo muestra la intensa tinción difusa de los tejidos de la médula espinal (NI-204.10D12 (Figura 9A), NI-204.10A8 (Figura 9D) y NI -204.67E12 (Figura 9E)).

Los anticuerpos C4F6 (MediMabs, Canadá; # MM-0070-2) y B8H10 (MediMabs, Canadá; # MM-0070) disponibles comercialmente se usaron como anticuerpos de control. La incubación con el anticuerpo C4F6 o el anticuerpo B8H10 fue seguida por la incubación con anticuerpo secundario anti-ratón de caballo biotinilado (Vector Laboratories; 1:250). La señal del anticuerpo se amplificó con el kit Vectastain ABC (Vector Laboratories) y se detectó con diaminobencidina (Dako). Esta tinción reveló dos patrones diferentes de tinción: el anticuerpo C46A mostró una tinción punteada/difusa (Figura 9L) mientras que el anticuerpo B8H10 tiñó principalmente inclusiones granulares de SOD1 y agregados de SOD1 (Figura 9M).

Conclusiones

Estos datos demuestran que los anticuerpos NI-204 reconocen estructuras patológicas de la superóxido dismutasa 1 en el modelo de ratón transgénico 1Gur/J B6.Cg-Tg(SOD1*G93A).

Ejemplo 5: Mapeo de epítopos de los anticuerpos NI-204

Se usaron exploraciones de péptidos superpuestos para el mapeo de epítopos. La secuencia completa de la superóxido dismutasa 1 humana se sintetizó como un total de 36 péptidos lineales 15-méricos con una superposición de 11 aminoácidos entre los péptidos individuales (JPT Peptide Technologies, Berlín, Alemania) y se detectó sobre membranas de nitrocelulosa. La membrana se activó durante 5 minutos en metanol y luego se lavó a temperatura ambiente en TBS durante 10 minutos. Los sitios de unión no específicos se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente con Roti®-Block (Carl Roth GmbH Co. KG, Karlsruhe, Alemania). Los anticuerpos humanos NI-204.10D12, NI-204.10A8, NI-204.12G7, NI-204.11F11, NI-204.6H1, NI-204.12G3, NI-204.7G5, NI-204.7B3, NI-204.34A3 respectivamente NI-204.25H3 (1 ^g/ml) se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente en Roti®-Block. La unión del anticuerpo primario se determinó mediante el uso del anticuerpo secundario IgGy de burro antihumano conjugado con HRP. Las transferencias se desarrollaron mediante el uso de ECL e la detección por ImageQuant 350 (GE Healthcare, Otelfingen, Suiza) Para mapear el epítopo dentro de la proteína superóxido dismutasa 1 que es reconocido por el anticuerpo NI-204.10D12, NI-204.10A8, NI-204.12G7, NI-204.11F11, NI-204.6H1, NI-204.12G3, NI-204.7G5, NI-204.7B3, NI-204.34A3 respectivamente por el anticuerpo NI-204.25H3, se usó una membrana de pepscan con 36 péptidos de 15 aminoácidos (superposición de 11 aminoácidos entre los péptidos) que cubre la secuencia completa de la proteína superóxido dismutasa 1. Como se muestra a modo ilustrativo en la Figura 7, se observa la unión prominente de NI-204.10D12 a los péptidos número 22, 23 y 24, lo que indica que el epítopo reconocido por este anticuerpo está localizado en el dominio central de SOD1. Por lo tanto, se predice que el epítopo de unión de NI-204.10D12 se localiza dentro de los aminoácidos 93-99 de SOD1. NI-204.10D12 se une al dominio central compuesto por los aminoácidos gruesos y subrayados 93-99 de la secuencia DGVADVS (SEQ ID NO: 2). Los epítopos de unión identificados análogamente para los anticuerpos específicos de SOD1 derivados de humanos NI-204.10D12, NI-204.10A8, NI-204.12G7, NI-204.11F11, NI-204.6H1, NI-204.12G3, NI-204.7G5, NI- 204.7B3, NI-204.34A3 y NI-204.25H3 de la presente descripción se resumen en la Tabla IV a continuación.

Tabla IV: Epítopos de unión identificados de los diferentes anticuerpos específicos de SOD1 derivados de humanos dentro de los aminoácidos indicados de la secuencia de la proteína SOD1 humana.

Ejemplo 6: Unión de NI-204.10D12 a péptidos derivados de SOD1 de tipo salvaje, mutante G93Ay murina

Las microplacas de 96 pocilios recubiertas con estreptavidina (Fischer Scientific) se recubrieron con péptidos biotinilados (JPT Peptide Technologies, Berlín, Alemania) que cubren el posible epítopo de unión de NI-204.10D12 en la proteína superóxido dismutasa 1 a una concentración de 50 |jg/ml en PBS a 4 °C durante toda la noche. Los sitios de unión no específicos se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS/Tween-20 al 0,1 % que contiene BSA al 2 % (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza). El anticuerpo primario quimérico NI-204.10D12 se diluyó a las concentraciones indicadas y se incubó 1 hora a temperatura ambiente. La unión se determinó mediante el uso de un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRp (Jackson immunoResearch, Newmarket, Reino Unido), seguido de la medición de la actividad de HRP en un ensayo colorimétrico estándar.

El anticuerpo NI-204.10D12 recombinante quimérico se une de una manera dependiente de la concentración a los péptidos sintéticos que tienen la secuencia de aminoácidos que cubre el epítopo de unión de NI-204.10D12 identificado derivados de las proteínas superóxido dismutasa 1 humana de tipo salvaje, G93A humana y murina (Figura 8). NI-204.10D12 se une a las tres especies diferentes de SOD1 con igual afinidad. El intercambio de aminoácido en la posición 93 ubicada dentro del epítopo de NI-204.10D12 en la superóxido dismutasa 1 humana se vincula a una forma familiar de ALS. Estos hallazgos indican que el anticuerpo NI-204.10D12 es un candidato a fármaco adecuado para el tratamiento de la ALS esporádica y familiar.

Ejemplo 7: Pruebas in vivo de los anticuerpos de la presente invención

Como ya se describió anteriormente, los estudios en líneas de ratones transgénicos que usan un enfoque de inmunización pasiva basado en la infusión intraventricular directa de anticuerpos anti-SOD1 humana han demostrado que tal tratamiento es capaz de aliviar la enfermedad en modelos de ratones de SOD1 fALS al prolongar la vida y atenuar la pérdida de neuronas motoras (Urushtani y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 104 (2007), 2495-2500; Gros-Louis y otros, J. Neurochem. (2010) 113, 1188-1199) Un enfoque de vacunación activa por el contrario no ha logrado conferir protección significativa (Urushtani y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 104 (2007), 2495-2500) Sin embargo, la vacunación activa puede no ser particularmente útil en humanos porque se espera que una fracción significativa de la población anciana no responda a la vacunación. Además, los posibles efectos secundarios asociados con una respuesta inmune dirigida a SOD1 pueden ser difíciles de controlar. Se puede esperar razonablemente que las moléculas de unión a SOD1 de la presente invención logren reducciones similares en los niveles cerebrales de agregados de SOD1 como se describió anteriormente para los anticuerpos de ratón, debido a sus especificidades de unión similares contra especies de SOD1 patológicamente mal plegadas/agregadas.

Sin embargo, debido a la optimización evolutiva y la maduración de la afinidad dentro del sistema inmune humano, los anticuerpos de la presente invención proporcionan una valiosa herramienta terapéutica debido al aislamiento a partir de sujetos humanos sanos, con alta probabilidad de excelente perfil de seguridad y carencia de inmunogenicidad. La confirmación de estos efectos terapéuticos esperados puede proporcionarse mediante métodos de prueba como se describió en las publicaciones mencionadas anteriormente con anticuerpos humanos en lugar de anticuerpos de ratones. En particular, los anticuerpos a cribar pueden aplicarse mediante diversas rutas posibles a los animales, tales como inyección intraperitoneal del anticuerpo, inyección intracraneal, infusión cerebral intraventricular y analizar los efectos del tratamiento.

La coexpresión de mutantes Ap y SOD1(G93A) conduce a una elevación de los agregados de SOD1 insolubles en tampón en ratones transgénicos dobles, lo que sugiere un papel potencial de Ap en el desarrollo de la ALS (Li y otros, Aging Cell.

5 (2006), 153-165) Cualquiera de las posibilidades de aplicación mencionadas anteriormente también puede usarse después de la inyección cerebral previa de las preparaciones de beta-amiloide en el cerebro de ratones transgénicos SOD1 para evaluar los efectos del tratamiento sobre la SOD1 patológica inducida por Ap.

La evaluación y la confirmación de los efectos terapéuticos de los anticuerpos de la presente invención pueden realizarse al monitorear los cambios de peso corporal debidos al inicio de la atrofia muscular y el tiempo de supervivencia general de los animales. Antes del inicio de la atrofia muscular, pueden evaluarse diversas deficiencias motoras, tanto en coordinación como en rendimiento, para detectar la aparición retrasada como un resultado del tratamiento. Esto puede realizarse mediante pruebas de comportamiento estándar, como rotarod, prueba de fuerza de agarre, prueba de reflejo de extensión, prueba de fuerza de agarre de la pata, laberinto en Y, prueba de reconocimiento de objetos nuevos o actividad de campo abierto, por ejemploCrawley, JN (2000) What's Wrong with My Mouse?: Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. Wiley-Liss, Nueva York).

Además, pueden usarse métodos histoquímicos que comprenden controlar la formación de inclusiones intracelulares tóxicas, tinción y recuento de neuronas motoras en secciones de la médula espinal, tinción total de SOD1 humana y/o una determinación bioquímica de los niveles de SOD1 soluble e insoluble en la médula espinal tras la extracción secuencial de la médula espinal (Urushtani y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 104 (2007), 2495-2500)

Ejemplo 8: Análisis de unión a dímeros nativos de SOD1, SOD1 desnaturalizada/oxidada y SOD1 recombinante

Métodos

Agregación in vitro de la superóxido dismutasa 1

Se usó una reacción de oxidación catalizada por metal para inducir in vitro la agregación de la superóxido dismutasa 1 (de acuerdo con Rakhit y otros, J. Biol. Chem 279 (2004), 15499-15504) La SOD1 nativa de eritrocitos humanos (dímeros) y todos los demás reactivos se compraron de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza). Para la agregación, se incubó SOD1 humana 10 pM en tampón de acetato Tris 10 mM, pH 7,0, que contiene ácido ascórbico 4 mM y CuCh 0,2 mM durante 48 horas a 37 °C. Como control, se incubó SOD1 humana 10 pM en tampón de acetato Tris 10 mM, pH 7,0, durante 48 horas a 37 °C.

Desnaturalización in vitro de la superóxido dismutasa 1

La reacción de desnaturalización de la superóxido dismutasa 1 se realizó de acuerdo con Zetterstrom y otros, J Neurochem. 117 (2011), 91-99. La SOD1 nativa de eritrocitos humanos (dímeros) y todos los demás reactivos se compraron de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza). Para la desnaturalización, se incubó SOD1 humana 23 pM en cloruro de guanidinio 3,5 M y EDTA 25 mM, pH 7,0, durante 4 horas a 22 °C. Las soluciones de desnaturalización se dializaron luego contra PBS que contiene EDTA 5 mM, pH 7,0, se centrifugaron a 20 000 g para eliminar los agregados de SOD1 y se colectaron los sobrenadantes que contienen SOD desnaturalizada.

ELISA directo

Se recubrieron microplacas de 96 pocillos (Corning) con dímeros de SOD1 humana nativa o con SOD1 humana desnaturalizada/oxidada in vitro o con SOD1 recombinante (Biomol, Alemania) a una concentración de 20 pg/ml en tampón de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO335 mM, pH 9,42). Los sitios de unión no específicos se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con PBS/Tween®-20 al 0,1 % que contiene BSA al 2 % (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza). Los anticuerpos primarios se diluyeron a las concentraciones indicadas y se incubaron 1 h a temperatura ambiente. La unión se determinó mediante el uso de un anticuerpo específico de IgG Fcy anti-humano de burro conjugado con HRP o un anticuerpo específico de IgG (H+L) anti-ratón de cabra conjugado con HRP, seguido de la medición de la actividad de HRP en un ensayo colorimétrico estándar.

DeterminacióndeEC50

Los valores de EC50 se estimaron mediante una regresión no lineal mediante el uso del software GraphPad Prism (San Diego, EE.UU.).

Resultados

La EC50 de los diferentes anticuerpos específicos de SOD1 derivados de humanos se determinó para dímeros de SOD1 humana nativa, SOD1 humana desnaturalizada/oxidada y SOD1 recombinante mediante ELISA directo con recubrimiento de las diferentes especies de SOD1 a una concentración de 20 pg/ml. Las afinidades de unión determinadas de los anticuerpos específicos de SOD1 derivados de humanos para las diferentes especies de SOD1 se resumen en la Tabla III a continuación.

Tabla III: Afinidad de unión de los diferentes anticuerpos específicos de SOD1 derivados de humanos para las diferentes especies de SOD1.

Los anticuerpos específicos de SOD1 humana se unen preferentemente a la superóxido dismutasa 1 humana recombinante y desnaturalizada/agregada con una EC50 que varía desde valores picomolares a valores nanomolares bajos. Estos hallazgos sugieren que la mayoría de los anticuerpos NI-204 se dirigen preferentemente a epítopos de SOD1 humana que se exponen en conformaciones mal plegadas patológicamente relevantes de formas desnaturalizadas/oxidadas, pero no nativas de la superóxido dismutasa 1 humana. Solo los anticuerpos NI-204.67E12, NI-204.10A8 y NI-204.9F6 no discriminan las diferentes especies de SOD1, con altas afinidades de unión general del anticuerpo NI-204.67E12 en el picomolar, y las afinidades de los anticuerpos NI-204.10A8 y NI-204.9F6 en el intervalo nanomolar.

Conclusiones

Los agregados de la superóxido dismutasa 1 inducidos por oxidación catalizada por metal y la SOD1 desplegada poseen propiedades similares o idénticas a las de los agregados in vivo de la superóxido dismutasa 1, asociados con la ALS. Varios anticuerpos específicos de SOD1 derivados de humanos muestran una unión prominente a formas mal plegadas terapéuticamente relevantes de la superóxido dismutasa 1 humana, tales como SOD1 desplegada/oxidada. La unión a la superóxido dismutasa 1 desplegada/oxidada parece preferirse sobre los dímeros nativos. Estos hallazgos resaltan el perfil terapéuticamente atractivo de los anticuerpos contra SOD-1 derivados de humanos de la presente invención que se dirigen contra conformaciones patológicamente relevantes de la proteína superóxido dismutasa 1.

Los ejemplos 3 y 8 se han realizado subsecuentemente con un retraso de varios meses en el medio. Durante este tiempo, los anticuerpos NI-204.10D12, NI-204.12G7, NI-204.10A8 y NI-204.9F6 se han almacenado a 4 °C, o preferentemente a -20 °C, o -80 °C en pequeñas alícuotas en solución salina tamponada con fosfato sin CaCh y MgCh, pH 7,4 (Invitrogen) para minimizar el daño debido a la congelación y descongelación durante varios meses.

En donde, en general, se obtuvieron datos similares sobre las afinidades de unión en ambos experimentos, el anticuerpo NI-204.10A8 mostró una pérdida significativa de afinidad de unión por SOD-1 fisiológica y agregada, así como de 20 nM, respectivamente 30 nM como se calculó en el Ejemplo 3 a más de 100 nM para ambas formas de SOD-1 como se indica en la Tabla III.

Se sabe que las proteínas sufren desnaturalización en la superficie del agua helada, la crioconcentración y la desnaturalización por frío durante la congelación, puede conducir a una pérdida de estabilidad, véase, por ejemplo, Kolhe y Badkar, Biotechnology Progress 27 (2011), 494-504; Hawe y otros, Eur J Pharm Sci. 38 (2009), 79-87; Lu y otros, J Pharm Sci. 97 (2008), 1801-1812; y Glick SM, J Clin Endocrinol Metab. 37 (1973), 461-462. A este respecto, los anticuerpos proporcionados por la presente descripción muestran diferentes perfiles de estabilidad, en donde algunos de los anticuerpos (por ejemplo, NI-204.10D12 y NI-204.12G7) pueden almacenarse durante un período de tiempo prolongado de al menos varios meses antes de su uso, en donde otros (por ejemplo, NI-204.10A8) deben usarse sin etapas de congelación después de su producción.

Ejemplo 9: Eficacia terapéutica de NI-204.10D12: prueba de concepto in vivo

Los estudios en líneas de ratones transgénicos que usan un enfoque de inmunización pasiva basado en la infusión intraventricular directa de anticuerpos anti-SOD1 humanos han demostrado que tal tratamiento es capaz de aliviar la enfermedad en los modelos de ratones de SOD1 fALS al prolongar la vida y atenuar la pérdida de neuronas motoras (Urushtani y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 104 (2007), 2495-2500; Gros-Louis y otros, J. Neurochem. (2010) 113, 1188-1199)

Se usó la línea de ratón transgénico B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J para la evaluación de la eficacia terapéutica de los anticuerpos contra SOD-1 derivados de humanos. Esta línea de ratones transgénicos es un modelo de ratón bien establecido y caracterizado para la ALS. La evaluación y confirmación de los efectos terapéuticos del anticuerpo NI-204.10D12 se realizó al monitorear los cambios de peso corporal debidos al inicio de la atrofia muscular y el tiempo de supervivencia general de los animales. Antes del inicio de la atrofia muscular, las deficiencias motoras en el rendimiento se probaron para detectar la aparición retrasada como un resultado del tratamiento mediante pruebas de fuerza de agarre de la pata. Además, se usaron métodos histoquímicos para teñir y contar neuronas motoras en secciones de la médula espinal para evaluar la atenuación mediada por NI-204.10D12 de la pérdida de neuronas motoras. Para evitar respuestas de anticuerpos anti-humanos de ratón durante el régimen de tratamiento crónico, se usó una versión quimérica del anticuerpo NI-204.10D12 en el estudio que consiste en los dominios variables humanos de NI-204.10D12 fusionados a los dominios constantes de Ig2a de ratón.

Métodos

Implantación quirúrgica de minibombas osmóticas Alzet® para la infusión cerebral

Los ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J de 60 días se anestesiaron profundamente (fentanilo/midazolam/medetomidina), se hizo una pequeña incisión en la línea media para exponer el cráneo y se preparó una bolsa subcutánea en el área mediocapular de la parte posterior de los ratones para que pudiera insertarse una minibomba estéril Alzet® (ALZET Osmotic Pumps; Cupertino, California, EE.UU., modelo 1004, 1,5 cm de longitud, 0,6 cm de diámetro y un peso de 0,4 g de peso vacío) rellenada con solución de anticuerpos o PBS. Luego, los ratones se fijaron en la cabeza dentro de un aparato estereotáxico y la unión de sutura ósea bregma se usó como punto de referencia para perforar un agujero en el cráneo y bajar una cánula del kit de infusión de cerebro Alzet® 3 en el ventrículo lateral izquierdo; coordenadas de acuerdo con el bregma; AP, -0,2 mm; ML, 0,9 mm; y DV, 2,5 mm. Después de la colocación de la cánula, se colocaron dos pequeños tornillos dentro del cráneo y se aplicó cemento dental para unirlo firmemente al cráneo. Naloxon (56952 (Swissmedic), OrPha Swiss GmbH, Küsnacht, Suiza), flumazenill (48280 (Swissmedic), Roche Pharma (Schweiz), Reinach, Suiza) /atipamezol (60562 (Swissmedic),Dr. E. Graub AG, Bern, Suiza) y metacam (Boehringer Ingelheim, Alemania) se proporcionó subcutáneamete como un antídoto y analgésico postoperatorio, con metacam y buprenorfina adicional (41931, 44100 (Swissmedic), Reckitt Benckiser Healthcare, UK)/fenilbutazona (42726 (Swissmedic), Streuli Pharma AG, Uznach, Suiza) / aminofenazona / bencilpenicilina (56271 (Swissmedic), Grünenthal Pharma AG, Glarus; Suiza)/ dihidroestreptomicina (42790 (Swissmedic), Streuli Pharma AG, Uznach, Suiza) proporcionados dentro del agua para tomar durante 1 semana como un analgésico /antibiótico. Después de la operación, los ratones se alojaron durante tres días en almohadillas térmicas y comida húmeda colocada en el piso de la jaula para promover la recuperación y reducir los abandonos.

El modelo 1004 de minibomba osmótica Alzet® bombea solución de anticuerpo o PBS al ventrículo lateral a una velocidad de infusión constante de 0,11 pl por hora = 2,64 pl por día durante una duración total de 28 días. La concentración de la solución de anticuerpo en la bomba se eligió para que fuera igual a 0,1 mg/kg de peso corporal por día.

Cambio de bomba

Cada 28 días se intercambiaron las minibombas osmóticas. Los ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J se anestesiaron profundamente mediante anestesia por inhalación (Sevofluran al 3,5 % (53211 (Swissmedic), Abbott AG, Baar, Suiza)) y se realizó una pequeña incisión sobre la bomba, la bomba se desconectó de la cánula de infusión cerebral y se retiró. Se insertó una bomba recién rellenada, conectada a la cánula de infusión y se usaron clips de heridas para cerrar el sitio de la incisión.

Análisis de la fuerza de agarre

Se usó un aparato medidor de fuerza de agarre (Ugo Basile, Comero, Italia; Cat. Núm.: 47106) para medir la fuerza de agarre de los ratones. El sistema se suministra con una red que se conecta a un sensor. Los animales se bajaron hasta que las cuatro patas agarraron la rejilla y luego se retiraron suavemente hasta que se soltó el agarre. La fuerza máxima alcanzada por el animal se registró electrónicamente en tres ensayos.

Punto final clínico

El punto final clínico de la enfermedad grave de la neurona motora incapacitante se definió por la incapacidad de los ratones de enderezarse dentro de los 15 segundos de estar acostados lateralmente. La probabilidad de supervivencia se probó mediante el análisis de supervivencia de ratones Kaplan-Meier que no habían alcanzado, en ningún momento dado del experimento, el punto final clínico definido de la enfermedad de la neurona motora.

Inmunohistoquímica y recuento de neuronas motoras

La médula espinal de ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J en la etapa terminal de la enfermedad se fijó en solución de paraformaldehído al 4 % tamponada con fosfato, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 pm. Para la tinción de Nissl (solución de cresilvioleta al 0,5 % (Sigma-Aldrich, C5042)), las secciones se tiñeron en solución de Nissl durante 3' a temperatura ambiente y luego se lavaron en agua destilada durante 3 minutos. Las secciones se procesaron adicionalmente según el protocolo estándar. Para la tinción de NeuN, después del pretratamiento de las secciones con ácido fórmico se incubaron con anticuerpo monoclonal NeuN, dilución 1:1000 (MAB377; Milipore). La señal de anticuerpos se amplificó con el sistema de detección DAB estándar. La tinción de NeuN se realizó con el sistema de tinción automático Leica BondMax™ (Leica, Wetzlar, Alemania).

Las neuronas positivas para Nissl o NeuN que tienen un diámetro > 30 pm se contaron en ambas astas ventrales de 8 secciones de la médula espinal lumbar por animal, cada sección separada 100 pm.

Resultados

Para evaluar los efectos del tratamiento farmacológico de anticuerpos derivados de humanos dirigidos a SOD1, el anticuerpo NI-204.10D12 se administró crónicamente durante tres meses mediante infusión cerebral intraventricular directa en ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J a partir de los 60 días de edad. El tratamiento crónico con anticuerpos 204.10D12 extendió significativamente la vida de los animales transgénicos SOD1 en 11 días con un tiempo de supervivencia promedio de 164 ± 3 días en los ratones que recibieron infusiones crónicas de NI-204.10D12 contra 153 ± 4 días en el grupo tratado con vehículo (p<0,05; Figura 10 (A)). Además, el tratamiento crónico con NI-204.10D12 de ratones transgénicos B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J condujo a un retraso significativo en la pérdida de peso corporal durante todo el curso de la enfermedad en comparación con el grupo de control tratado con PBS (Figura 10 (B)). Las deficiencias motoras progresivas graves observadas durante la progresión de la enfermedad en los ratones transgénicos SOD1 se mejoraron con el tratamiento con NI-204.10D12 como lo demuestra el rendimiento mejorado de la fuerza de agarre en el grupo tratado con anticuerpos en comparación con los controles del vehículo (Figura 11). El análisis cuantitativo del complemento de neuronas motoras en la asta ventral de la médula espinal lumbar reveló una atenuación significativa de la pérdida de neuronas motoras en animales tratados con NI-204.10D12 en comparación con los animales tratados con vehículo, lo que sugiere que el tratamiento con NI-204.10D12 puede proteger de la degeneración de las neuronas motoras mediadas por la sobreexpresión de SOD-1 mutante (Figura 12). Estos hallazgos resaltan los profundos efectos terapéuticos de los anticuerpos específicos de SOD1 derivados de humanos que, tras la administración crónica, pueden retrasar la aparición de la enfermedad, prolongar la supervivencia, mejorar el peso corporal y el rendimiento motor y mejorar la degeneración neuronal. Los anticuerpos específicos de SOD1 derivados de humanos son, por lo tanto, nuevos candidatos prometedores para el tratamiento de la ALS.

Ejemplo 10 Clasificación de la familia de la línea germinal de IgG de los anticuerpos contra SOD1

El análisis de secuencia de las regiones variables de los diferentes anticuerpos específicos de SOD1 humana permite la clasificación de los anticuerpos NI-204 en familias de IgG de la línea germinal (Tabla V).

Para proporcionar la clasificación de los anticuerpos humanos NI-204 en familias de segmentos V de la línea germinal, las secuencias de nucleótidos de la región variable original se alinearon con las secuencias de la línea germinal humana en la base de datos Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) alojada por el Centro MRC para la Ingeniería de Proteínas (Cambridge, Reino Unido). Las líneas germinales se han especificado por sus loci para las cadenas pesadas y por sus números de entrada en la Vbase para las cadenas ligeras (ver la Tabla V a continuación).

Tabla V: Clasificación de la familia de anticuerpos NI-204 de acuerdo con la comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal (el último carácter en los nombres de los anticuerpos indica su tipo: H-pesado, K-kappa, L-lambda)

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-SOD1 monoclonal humano-murino humano o quimérico o un fragmento de unión a SOD1 del mismo, caracterizado porque el anticuerpo es capaz de unirse a SOD1 mal plegada o agregada; y en donde el anticuerpo reconoce preferentemente la SOD1 mal plegada o agregada sobre los dímeros fisiológicos de SOD1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo se une específicamente a un epítopo de SOD1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos GGPKDEERHVG (SEQ ID NO: 51) y comprende en su región variable las seis CDR en el orden que se representa en la Figura 1B (NI-204.12G7).

2. El anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la región Vh y Vl como se representa en la Figura 1B.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo de la reivindicación 1 o 2, que se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fv de cadena única (scFv), un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')2.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene una concentración efectiva media máxima (EC50) para SOD1 de tipo salvaje recombinante de aproximadamente 10 pM a 100 nM en un ELISA directo.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el cual es un anticuerpo humano de isotipo IgG.

6. Uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Uno o más vectores que comprende(n) el(los) polinucleótido(s) de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que comprende el(los) polinucleótido(s) de la reivindicación 6 o el(los) vector(es) de la reivindicación 7.

9. El anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el cual se:

(i) etiqueta de manera detectable, preferentemente en donde la etiqueta detectable se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo y un metal pesado; y/o

(ii) une a un fármaco.

10. Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 9, el(los) polinucleótido(s) de la reivindicación 6, el(los) vector(es) de la reivindicación 7 o la célula de la reivindicación 8, que es preferentemente:

(i) una composición farmacéutica y además comprende un portador farmacéuticamente aceptable, que preferentemente comprende además un agente adicional útil para tratar la esclerosis lateral amiotrófica; o (ii) una composición de diagnóstico, y opcionalmente comprende reactivos usados convencionalmente en métodos de diagnóstico basados en ácidos nucleicos o reacciones inmunológicas.

11. Un anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 9, el(los) polinucleótido(s) de la reivindicación 6 o el(los) vector(es) de la reivindicación 7 para usar en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la esclerosis lateral amiotrófica en un sujeto.

12. Un método para diagnosticar o monitorear la progresión de la esclerosis lateral amiotrófica en un sujeto, el método que comprende determinar la presencia de SOD1 mal plegada o agregada en una muestra del sujeto a diagnosticar con al menos un anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 9, en donde la presencia de SOD1 mal plegada o agregada es indicativa de la esclerosis lateral amiotrófica y un aumento del nivel de SOD1 mal plegada o agregada en comparación con el nivel de los dímeros fisiológicos de SOD1 es indicativo de progresión de la esclerosis lateral amiotrófica en dicho sujeto.

13. El anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para usar en la detección in vivo de, o direccionamiento de un agente de diagnóstico a SOD1 en el cuerpo humano o animal, preferentemente en donde dicha formación de imágenes in vivo comprende tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía por emisión de fotón único (SPECT), imágenes ópticas por infrarrojo cercano (NIR) o imágenes por resonancia magnética (MRI).

14. Un kit útil en el diagnóstico o monitoreo de la progresión de una esclerosis lateral amiotrófica, dicho kit que comprende al menos un anticuerpo o fragmento de unión a SOD1 del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 9, el(los) polinucleótido(s) de la reivindicación 6, el(los) vector(s) de la reivindicación 7 o la célula de la reivindicación 8, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones para el uso.