ES2815527T3 - Terapia basada en anticuerpos de la amiloidosis por transtiretina (TTR) y anticuerpos de origen humano para ese propósito - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-transtiretina (TTR) de origen humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que es capaz de unirse a especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas y/o fragmentos de las mismas y no reconoce sustancialmente especies de TTR fisiológicas, (i) en el que el anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo de TTR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos EEEFVEGIY (SEQ ID NO: 49), y en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su región variable o dominio de unión las siguientes seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable VH y VL: (a) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 2 VH-CDR2: posiciones 50-65 de la SEQ ID NO: 2 VH-CDR3: posiciones 98-115 de la SEQ ID NO: 2 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 4 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 4, y VL-CDR3: posiciones 89-98 de SEQ ID NO: 4, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos; (ii) en el que el anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo de TTR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50), y en la que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su región variable o dominio de unión las siguientes seis CDR de la región variable VH y VL: (b) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 6 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 6 VH-CDR3: posiciones 99-109 de la SEQ ID NO: 6 VL-CDR1: posiciones 24-39 de la SEQ ID NO: 8 VL-CDR2: posiciones 55-61 de la SEQ ID NO: 8 VL-CDR3: posiciones 94-102 de la SEQ ID NO: 8, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos; (iii) en el que el anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo de TTR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos WEPFA (SEQ ID NO: 51), y donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su región variable o dominio de unión el seis CDR de la región variable VH y VL seleccionadas de: (c) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 10 VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 10 VH-CDR3: posiciones 100-109 de la SEQ ID NO: 10 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 12 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 12 VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 12, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos; (e) VH-CDR1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 18 VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 18 VH-CDR3: posiciones 100-116 de la SEQ ID NO: 18 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 20 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 20 VL-CDR3: posiciones 89-98 de la SEQ ID NO: 20, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos; (l) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 46 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 46 VH-CDR3: posiciones 99-108 de la SEQ ID NO: 46 VL-CDR1: posiciones 23-36 de la SEQ ID NO: 48 VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 48 VL-CDR3: posiciones 91-100 de la SEQ ID NO: 48, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos; (m) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 53 VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 53 VH-CDR3: posiciones 100-109 de la SEQ ID NO: 53 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 12 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 12 VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 12, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos; o (iv) en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su región variable o dominio de unión las seis CDR de la región variable VH y VL seleccionadas de: (d) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 14 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 14 VH-CDR3: posiciones 99-110 de la SEQ ID NO: 14 VL-CDR1: posiciones 23-36 de la SEQ ID NO: 16 VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 16 VL-CDR3: posiciones 91-102 de la SEQ ID NO: 16; (f) VH-CDR1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 22 VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 22 VH-CDR3: posiciones 100-117 de la SEQ ID NO: 22 VL-CDR1: posiciones 23-36 de la SEQ ID NO: 24 VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 24 VL-CDR3: posiciones 91-102 de la SEQ ID NO: 24; (g) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 26 VH-CDR2: posiciones 50-65 de la SEQ ID NO: 26 VH-CDR3: posiciones 98-110 de la SEQ ID NO: 26 VL-CDR1: posiciones 31-36 de la SEQ ID NO: 28 VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 28 VL-CDR3: posiciones 91-99 de la SEQ ID NO: 28; (h) VH-CDR1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 30 VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 30 VH-CDR3: posiciones 100-113 de la SEQ ID NO: 30 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 32 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 32 VL-CDR3: posiciones 90-99 de la SEQ ID NO: 32; (i) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 34 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 34 VH-CDR3: posiciones 99-108 de la SEQ ID NO: 34 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 36 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 36 VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 36; (j) VH-CDR1: posiciones 31-38 de la SEQ ID NO: 38 VH-CDR2: posiciones 53-69 de la SEQ ID NO: 38 VH-CDR3: posiciones 102-114 de la SEQ ID NO: 38 VL-CDR1: posiciones 23-36 de la SEQ ID NO: 40 VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 40 VL-CDR3: posiciones 91-99 de la SEQ ID NO: 40; (k) VH-CDR1: posiciones 31-36 de la SEQ ID NO: 42 VH-CDR2: posiciones 51-66 de la SEQ ID NO: 42 VH-CDR3: posiciones 99-113 de la SEQ ID NO: 42 VL-CDR1: posiciones 23-35 de la SEQ ID NO: 44 VL-CDR2: posiciones 51-57 de la SEQ ID NO: 44 VL-CDR3: posiciones 90-100 de la SEQ ID NO: 44; (n) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 55 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 55 VH-CDR3: posiciones 99-109 de la SEQ ID NO: 55 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 57 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 57 VL-CDR3: posiciones 89-99 de la SEQ ID NO: 57; (o) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 62 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 62 VH-CDR3: posiciones 99-114 de la SEQ ID NO: 62 VL-CDR1: posiciones 23-35 de la SEQ ID NO: 64 VL-CDR2: posiciones 51-57 de la SEQ ID NO: 64 VL-CDR3: posiciones 90-101 de la SEQ ID NO: 64; (p) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 66 VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 66 VH-CDR3: posiciones 100-107 de la SEQ ID NO: 66 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 68 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 68 VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 68; (q) VH-CDR1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 70 VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 70 VH-CDR3: posiciones 100-113 de la SEQ ID NO: 70 VL-CDR1: posiciones 23-33 de la SEQ ID NO: 72 VL-CDR2: posiciones 49-55 de la SEQ ID NO: 72 VL-CDR3: posiciones 88-96 de la SEQ ID NO: 72; (r) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 74 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 74 VH-CDR3: posiciones 99-113 de la SEQ ID NO: 74 VL-CDR1: posiciones 23-36 de la SEQ ID NO: 76 VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 76 VL-CDR3: posiciones 91-100 de la SEQ ID NO: 76; (s) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 78 VH-CDR2: posiciones 50-65 de la SEQ ID NO: 78 VH-CDR3: posiciones 98-105 de la SEQ ID NO: 78 VL-CDR1: posiciones 23-33 de la SEQ ID NO: 80 VL-CDR2: posiciones 49-55 de la SEQ ID NO: 80 VL-CDR3: posiciones 88-98 de la SEQ ID NO: 80; y (t) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 82 VH-CDR2: posiciones 50-65 de la SEQ ID NO: 82 VH-CDR3: posiciones 98-110 de la SEQ ID NO: 82 VL-CDR1: posiciones 23-33 de la SEQ ID NO: 84 VL-CDR2: posiciones 49-55 de la SEQ ID NO: 84 VL-CDR3: posiciones 88-98 de la SEQ ID NO: 84.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia basada en anticuerpos de la amiloidosis por transtiretina (TTR) y anticuerpos de origen humano para ese propósito

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la terapia basada en anticuerpos de amiloidosis por transtiretina (TTR). En particular, la presente invención se refiere a nuevas moléculas que se unen específicamente a la transtiretina humana (TTR) y a sus antígenos de acuerdo con se caracteriza en las reivindicaciones, en particular a anticuerpos recombinantes de origen humano, así como a fragmentos, derivados y variantes de los mismos que reconocen las formas mal plegadas, mal ensambladas o agregadas de TTR o fragmentos de la misma, y que son útiles en el tratamiento de enfermedades y afecciones inducidas por tales isoformas de TTR patógenas.

Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas y de diagnóstico que comprenden moléculas de unión, anticuerpos e imitadores de las mismas valiosas como herramientas de diagnóstico para identificar enfermedades asociadas con la amiloidosis por TTR y también como estrategia de vacunación pasiva para tratar trastornos relacionados con enfermedades asociadas con amiloidosis por TTR tales como polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC), amiloidosis sistémica senil (SSA), amiloidosis familiar sistémica, amiloidosis leptomeníngea/del sistema nervioso central (CNS), incluida la enfermedad de Alzheimer, amiloidosis ocular relacionada con TTR, amiloidosis renal relacionada con TTR, hipertiroxinemia relacionada con TTR, amiloidosis de ligamentos relacionada con TTR, incluido el síndrome del túnel carpiano, desgarros del manguito rotador y estenosis espinal lumbar, y preeclampsia.

Además, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad o afección inducida por isoformas de TTR patógenas, tales como TTR mal plegadas y/o agregadas presentes en depósitos de amiloide, en el que los niveles de isoformas de TTR patológicas se analizan en una muestra de un líquido corporal de un sujeto después de la administración de un anticuerpo anti-TTR, en el que cuando se compara con una muestra de control tomada antes de la administración, la presencia o alteración en el nivel de las isoformas de TTR patógenas, por ejemplo, de acuerdo con lo determinado por la presencia de un inmunocomplejo de TTR y el anticuerpo anti-TTR indican la enfermedad y/o afección.

Antecedentes de la invención

La transtiretina (TTR), anteriormente denominada prealbúmina, es una proteína soluble de 127 aminoácidos (secuencia de referencia del NCBI: NP_000362.1) que está implicada en el transporte de tiroxina y retinol en el organismo. La TTR es secretada en la sangre por el hígado y en el líquido cefalorraquídeo por el plexo coroideo, y también se expresa en tejidos específicos tales como las células alfa pancreáticas o el epitelio retiniano. La síntesis de TTR comienza en las edades embrionarias y continúa durante toda la vida. Está presente en alta concentración en el plasma (3.6-7.2 j M) y CSF (0.04-0.4 j M) y típicamente forma bajo condiciones fisiológicas un homotetrámero soluble de -55 kDa.

En condiciones específicas que se han aclarado poco y pueden incluir pH ácido, estrés oxidativo y factores locales, la proteína TTR adopta una conformación tridimensional alternativa y se vuelve tóxica.

La toxicidad de la proteína TTR mal plegada se ha descubierto investigando un trastorno neurodegenerativo autosómico dominante raro llamado polineuropatía amiloide familiar (FAP), que afecta a personas adultas en su edad media (Planté-Bordeneuve et al., Lancet Neurol. 10 (2011), 1086-1097). La FAP se caracteriza por deficiencias progresivas sensoriales, motoras y autonómicas que conducen a la muerte una década después del diagnóstico. Las lesiones nerviosas están asociadas con el depósito de agregados amorfos y fibrillas amiloides hechas de proteína TTR. La sustitución Val30Met es la mutación causante de FAP más frecuente, especialmente en áreas donde la enfermedad es endémica tal como en el norte de Portugal, pero ya se han identificado más de 100 mutaciones diferentes en el gen TTR; véase la Tabla IV más adelante. El mecanismo fisiopatológico en juego es idéntico para todas las mutaciones patogénicas, ya que las mutaciones alteran la estabilidad estructural del tetrámero de TTR, promoviendo el plegamiento incorrecto de TTR y conduciendo a la formación de especies tóxicas de TTR (Saraiva et al., Curr. Med. Chem. 19 (2012), 2304-2311).

También se observa toxicidad por TTR como consecuencia de la mutación Val122Ile, que se encuentra con alta frecuencia (3-5%) en las poblaciones afroamericanas y africanas occidentales. Esta mutación está asociada con la miocardiopatía amiloide familiar (FAC), una afección en la que la acumulación masiva de TTR en el miocardio produce debilidad cardíaca y, en última instancia, insuficiencia cardíaca (Ruberg et al., Circulation. 126 (2012), 1286-1300).

Las mutaciones en la secuencia de la proteína TTR no son un requisito estricto para la toxicidad de TTR, y la proteína TTR de tipo silvestre también es propensa al plegamiento incorrecto y la formación de agregados tóxicos. Por ejemplo, la amiloidosis sistémica senil (s Sa ) se caracteriza por debilidad cardíaca y la acumulación de agregados de TTR de tipo silvestre en el miocardio (Ikeda, Amyloid.18 Suppl 1 (2011), 155-156; Dungu et al., Heart. 98 (2012), 1546-1554).

Los depósitos de TTR de tipo silvestre también se observan en múltiples casos de inflamación de ligamentos y tendones, incluido el síndrome del túnel carpiano, desgarros del manguito rotador y estenosis espinal lumbar (Sueyoshi et al., Hum. Pathol. 42 (2011), 1259-1264; Gioeva et al., Amiloide 20 (2013), 1-6). Además, recientemente se ha informado de amiloidosis por TTR en la placenta de madres que padecen preeclampsia (Kalkunte et al., Am. J. Pathol.

183 (2013) 1425-1436).

Los tratamientos para enfermedades con amiloidosis por TTR son limitados y principalmente invasivos, en los que principalmente el tratamiento se debe a los síntomas. En el caso de FAP, los tratamientos se basan en analgésicos para el tratamiento del dolor neuropático, en el trasplante de hígado para eliminar la principal fuente de proteína TTR mutada y en el tratamiento con Tafamidis. Tafamidis es una pequeña molécula que se une al tetrámero de TTR y estabiliza su conformación. Actúa contra la disociación del tetrámero de TTR, la etapa limitante de la velocidad en la ruta del plegamiento incorrecto que conduce a la formación de especies de TTR tóxicas. Tafamidis ha sido aprobado para el tratamiento de FAP en Europa pero no ha sido aprobado en los EE. UU., y su eficacia terapéutica está limitada, en el mejor de los casos, a ralentizar la progresión de la enfermedad. Actualmente no hay ningún tratamiento disponible dirigido a la proteína TTR mal plegada.

En vista de lo anterior, se necesitan nuevas estrategias terapéuticas para una terapia eficaz y segura de enfermedades asociadas con la amiloidosis por TTR.

Este problema técnico se resuelve mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y descritas más adelante e ilustradas en los Ejemplos y Figuras.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y proporciona anticuerpos anti-transtiretina (TTR) y moléculas de unión a TTR equivalentes para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades y afecciones asociadas con la amiloidosis por TTR. Más específicamente, se proporcionan anticuerpos recombinantes de origen humano terapéuticamente útiles así como fragmentos y derivados de los mismos que reconocen formas mal plegadas, mal ensambladas o agregadas de TTR.

Los agregados de TTR mal plegados están asociados con marcadores de estrés celular, estrés oxidativo, respuesta inflamatoria y apoptosis muchos años antes del inicio de los síntomas (Macedo et al., Mol. Med. 13 (2007), 584-91). La capacidad natural del cuerpo para reconocer proteínas plegadas anormalmente y degradarlas es un factor protector, y las diferencias entre pacientes en su capacidad para eliminar proteínas TTR tóxicas ciertamente contribuyen a diferencias en la edad de inicio de la enfermedad y la velocidad de progresión de la enfermedad. En apoyo de esta hipótesis, se ha demostrado que los pacientes que reciben un trasplante de hígado de un donante de FAP desarrollan rápidamente anticuerpos contra la proteína patógena TTR (Ando et al., Transplantation. 73 (2002), 751-755), y que los pacientes con FAP con títulos altos de anticuerpos contra la proteína TTR mutada tienen un inicio de la enfermedad más tardío que los pacientes sin tales anticuerpos (Obayashi et al., Clin. Chim. Acta. 419 (2013), 127-131). Además, se ha demostrado que la inmunización activa contra la conformación patógena de TTR elimina casi completamente las deposiciones de TTR en ratones transgénicos con FAP (Terazaki et al., Lab. Invest. 86 (2006), 23-31).

Sin embargo, aunque podría haber parecido tentador investigar una estrategia inmunitaria para la intervención terapéutica, hasta ahora no se ha perseguido el uso de anticuerpos anti-TTR para el tratamiento de enfermedades relacionadas con TTR. Por ejemplo, en la solicitud internacional WO2010/030203 se ha descrito y propuesto un anticuerpo monoclonal aislado particular de ratón para TTR para su uso en el cribado de FAP y en la investigación y el tratamiento de enfermedades asociadas. Sin embargo, dado que los anticuerpos monoclonales de ratón inducen una respuesta de anticuerpo humano anti-ratón (HAMA), no son adecuados para la terapia en humanos. Por lo tanto, dado que la solicitud internacional caducó y aún no se ha publicado ningún desarrollo posterior, aparentemente no se ha seguido un enfoque terapéutico basado en anticuerpos. Más bien, hasta ahora, para los anticuerpos anti-TTR, sólo se ha investigado más a fondo su utilidad diagnóstica para pacientes con amiloidosis por TTR; véase, por ejemplo, Phay M. et al., Rejuvenation Res. 28 de octubre de 2013. [Publicación electrónica antes de la impresión].

Por el contrario, los experimentos realizados de acuerdo con la presente invención tuvieron éxito en el aislamiento de anticuerpos específicos de TTR monoclonales de origen humano que maduraron en el cuerpo humano y son específicos para especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas, mutadas y/o agregadas y/o fragmentos de los mismos. Los sujetos humanos y los pacientes, respectivamente, que son la fuente de las células B de las que se han aislado los anticuerpos anti-TTR monoclonales de origen humano y el ADNc que codifica su dominio variable, respectivamente, no mostraron una cantidad sustancial de TTR mal plegada y no presentaban síntomas de afecciones asociadas con isoformas patógenas. Sin embargo, en otra realización de la presente invención, la fuente de las células B de las que podrían aislarse los anticuerpos monoclonales anti-TTR de origen humano y el ADNc que codifica su dominio variable, respectivamente, son pacientes que muestran síntomas de una enfermedad y/o trastorno asociado con amiloidosis por TTR. Por tanto, es prudente esperar que los anticuerpos anti-TTR monoclonales humanos de la presente invención y sus derivados, además de no ser inmunogénicos en humanos, presenten un efecto terapéuticamente beneficioso.

Por lo tanto, la presente invención se dirige a anticuerpos recombinantes de origen humano, fragmentos de unión a antígeno y moléculas de unión a antígeno similares como se caracterizan en las reivindicaciones, que son capaces de reconocer específicamente TTR. Si no se indica lo contrario, por "reconocer específicamente TTR", "anticuerpo específico de/para TTR" y "anticuerpo anti-TTR" se entienden anticuerpos que se unen de manera específica, general y colectiva a la forma monomérica nativa de TTR; anticuerpos que se unen específicamente a cualquiera de las formas de TTR, por ejemplo, TTR mutada, TTR oligomérica, fibrilar y/o no fibrilar. En el presente documento se proporcionan anticuerpos de origen humano selectivos para la longitud completa y/o fragmentos y/o formas mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas de TTR.

Como se mencionó anteriormente, preferiblemente el anticuerpo anti-TTR de la presente invención es un anticuerpo recombinante, en el que tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena ligera y pesada variable, y/o sustancialmente la región variable completa están codificadas por un ADNc derivado de un ARNm obtenido de una célula B de memoria humana que produjo un anticuerpo anti-TTR. En una realización preferida, el anticuerpo anti-TTR de la presente invención muestra, en cualquier combinación, una más de las propiedades de unión y biológicas como se demuestra para los anticuerpos objeto ilustrados en los Ejemplos y Figuras adjuntos, preferiblemente una más de las propiedades de unión y biológicas como se demostró para los ejemplos de anticuerpos NI-301.59.F1, NI-301.35G11 y NI-301.37F1.

En una realización particularmente preferida de la presente invención, el anticuerpo anti-TTR o su fragmento de unión a TTR demuestra las características de unión inmunológica de un anticuerpo caracterizado por las regiones variables Vh y Vl como se establece en la Figura 1.

El fragmento de unión a antígeno del anticuerpo puede ser un fragmento Fv de cadena sencilla, un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')², o cualquier otro fragmento de unión a antígeno. En una realización específica, más adelante, el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo de isotipo IgG humano. Alternativamente, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico humano-roedor o rodentizado tal como un anticuerpo murino o murinizado, de rata o ratizado, siendo las versiones de roedor particularmente útiles para métodos de diagnóstico y estudios en animales.

Además, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo de la presente invención o fragmentos activos del mismo y a métodos inmunoterapéuticos e inmunodiagnósticos que usan tales composiciones en la prevención, diagnóstico o tratamiento de trastornos asociados con la amiloidosis por TTR, en los que una cantidad eficaz de la composición se administra a un paciente que la necesite.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican al menos una región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo de la invención. Dicha región variable comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Vh y Vl de la región variable como se expone en la Figura 1. En una realización preferida de la presente invención, el polinucleótido es un ADNc, preferiblemente derivado de ARNm obtenido de células B humanas de memoria que producen anticuerpos reactivos con especies de TTR mutantes, mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas.

Por consiguiente, la presente invención también abarca vectores que comprenden dichos polinucleótidos y células huésped transformadas con ellos, así como su uso para la producción de un anticuerpo y moléculas de unión equivalentes que son específicas para TTR. En una realización adicional de la presente invención, los anticuerpos o moléculas de unión son capaces de unirse a especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas o agregadas o fragmentos de las mismas. Se conocen en la técnica medios y métodos para la producción recombinante de anticuerpos y sus imitadores, así como métodos de cribado de moléculas de unión competidoras, que pueden ser anticuerpos o no. Sin embargo, como se describe en el presente documento, en particular con respecto a las aplicaciones terapéuticas en humanos, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo humano en el sentido de que la aplicación de dicho anticuerpo está sustancialmente libre de una respuesta inmune dirigida contra dicho anticuerpo que de otro modo se observaría para anticuerpos quiméricos e incluso humanizados.

Además, en el presente documento se describen composiciones y métodos que se pueden usar para identificar TTR, en particular especies o fragmentos de TTR mutados, mal plegados, mal ensamblados o agregados en muestras y/o in vivo. Los anticuerpos anti-TTR descritos y los fragmentos de unión de los mismos pueden usarse para cribar sangre humana, plasma, suero, saliva, líquido peritoneal, líquido cefalorraquídeo ("CSF") y orina para detectar la presencia de TTR y/o especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas, o agregadas o fragmentos de las mismas en muestras, por ejemplo, usando ensayos basados en ELISA o adaptados a la superficie. En una realización, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico o seguimiento de la progresión de un trastorno relacionado con especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas o agregadas o fragmentos de las mismas en un sujeto, comprendiendo el método determinar la presencia de especies o fragmentos de TTR mutados, mal plegados, mal ensamblados, o agregados en una muestra del sujeto que se va a diagnosticar con al menos un anticuerpo de la presente invención, en el que la presencia de especies o fragmentos de TTR mal plegados, mal ensamblados o agregados es indicativa del trastorno.

Además, en una realización de la presente invención, los anticuerpos anti-TTR se proporcionan para la preparación de una composición para detección in vivo (también denominada formación de imágenes in vivo) o el direccionamiento de un agente terapéutico y/o de diagnóstico a TTR, en especies o fragmentos de TTR particulares mutados, mal plegados, mal ensamblados o agregados en el cuerpo humano o animal. Los métodos y composiciones descritos en este documento pueden ayudar en los trastornos asociados con la amiloidosis por TTR y caracterizados, por ejemplo, por la aparición de formas de TTR y pueden usarse para controlar la progresión de la enfermedad y la eficacia terapéutica de la terapia proporcionada al sujeto, por ejemplo en métodos de diagnóstico relacionados con la obtención de imágenes in vivo. Por lo tanto, en una realización, se proporciona el anticuerpo anti-TTR y/o la molécula de unión a TTR de la presente invención, en la que dicha detección (formación de imágenes) in vivo comprende gammagrafía, tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía por emisión de fotón único (SPECT), formación de imágenes ópticas en el infrarrojo cercano (NIR) o imágenes de resonancia magnética (MRI).

Por tanto, la presente solicitud describe además métodos para tratar, diagnosticar o prevenir una enfermedad asociada con la amiloidosis por TTR. Los métodos comprenden administrar una concentración eficaz de un anticuerpo o derivado de anticuerpo preferiblemente humano al sujeto en el que el anticuerpo se dirige a TTR o fragmentos de la misma, preferiblemente especies de TTR o fragmentos de la misma mal plegados, mal ensamblados o agregados.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad asociada con amiloidosis por TTR, monitorizar el tratamiento de la enfermedad con un anticuerpo anti-TTR o determinar la utilidad diagnóstica o terapéutica de un anticuerpo anti-TTR que comprende analizar el nivel de TTR mal plegada y/o agregada en una muestra, por ejemplo, sangre obtenida de un sujeto después de la administración de un anticuerpo anti-TTR al sujeto, en el que la presencia o aumento del nivel de TTR mal plegada y/o agregada en la muestra del sujeto en comparación con el control, tal como una muestra obtenida del sujeto antes de la administración del anticuerpo anti-TTR indica una enfermedad asociada con amiloidosis por TTR, en la que el anticuerpo anti-TTR es un anticuerpo de la presente invención.

En una realización preferida de la presente invención, en particular cuando se usan animales no humanos para probar anticuerpos recombinantes de origen humano como se ilustra en el Ejemplo 13 y otros anticuerpos anti-TTR previstos para uso en humanos en general, el nivel de TTR mal plegada y/o agregada en la muestra se analiza determinando un complejo formado entre el anticuerpo anti-TTR y la TTR mal plegada y/o agregada, por ejemplo mediante inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-IgG humano o antiidiotípico.

Con respecto al aspecto de diagnóstico en particular para un sujeto humano y un paciente, la presencia y el nivel elevado de TTR mal plegada y/o agregada y complejo de la misma con el anticuerpo anti-TTR, respectivamente, indica la presencia de depósitos de amiloide de TTR en el cuerpo humano, por ejemplo en el corazón, el sistema nervioso periférico (PNS), los ojos, los músculos, el tracto gastrointestinal, los riñones, el sistema vascular y el sistema nervioso central (CNS) de un paciente o sujeto. Por lo tanto, el método de la presente invención permite la identificación y determinación de una enfermedad asociada con la amiloidosis por TTR en el cuerpo del sujeto por un lado y la eliminación de los depósitos de TTR del cuerpo del paciente por el otro, indicando así también el progreso terapéutico de un tratamiento dado y la eficacia de un fármaco para el tratamiento de la amiloidosis por TTR, tal como un anticuerpo anti-TTR. Por lo tanto, como se demuestra en el Ejemplo 13, el anticuerpo anti-TTR de la presente invención es capaz de unirse a TTR mal plegada y/o agregada con suficiente afinidad para alterar la estabilidad de los depósitos patológicos de TTR tal como para capturar y eliminar la TTR mal plegada y/o agregada de los depósitos en un fluido corporal, en particular sangre. El intervalo de tiempo especificado después de la administración, es decir, el marco de tiempo después del cual se mide el nivel de TTR patológico y el complejo con el anticuerpo anti-TTR, respectivamente, lo determina un médico en ejercicio. Normalmente, se utiliza un intervalo de tiempo inferior a una semana. En una realización preferida, el nivel de TTR patológico en una muestra de un paciente o sujeto después de la administración de un anticuerpo anti-TTR o fragmento de unión a antígeno del mismo al paciente o sujeto se determina después de menos de o igual a 48 horas; véase también el Ejemplo 13.

La presente invención también se refiere al uso de cualquier anticuerpo anti-TTR y molécula de unión a TTR en el método descrito anteriormente. Sin embargo, debido a las propiedades ventajosas y en particular porque es de origen humano, se prefiere el uso de un anticuerpo anti-TTR de la presente descripción en el presente documento. En una realización preferida, el anticuerpo muestra sustancialmente las mismas actividades biológicas y de unión que cualquier anticuerpo seleccionado entre NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.37F1-PIMC, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11 A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 y NI-301.14C3. El anticuerpo anti-TTR también se puede alterar para facilitar el manejo del método de diagnóstico, incluido el marcaje del anticuerpo como se describe en detalle a continuación.

Otras realizaciones de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción y los ejemplos que siguen.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de los anticuerpos humanos NI-301.59F1, NI301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI301 .9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.37F1PIMC, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI- 301.14D8, NI301.9X4 y NI-301.14C3. Las regiones marco (FR) y determinantes de complementariedad (CDR) se indican con las CDR subrayadas. Se utilizó el esquema de numeración de Kabat (consultar: http://www.bioinf.org.uk/abs/).

Figura 2: Unión a la TTR agregada, de tipo silvestre y mutante mediante ELISA directo. A, B, C: las placas de ELISA se recubrieron con TTR humana de tipo silvestre agregada (•), V30M-TTR recombinante agregada (▼) y albúmina de suero bovino (BSA) (■) a 10 pg/mL, y se incubaron con los siguiente anticuerpos monoclonales humanos en un intervalo de concentración de 4 pM a 400 nM: A) NI-301.59F1, B) NI-301.35G11 y C) NI-301.37F1. Los valores de EC⁵⁰ se estimaron ajustando puntos de datos con el método de mínimos cuadrados. NI-301.59F1: TTR de tipo silvestre agregada EC⁵⁰ = 3.0 nM, V30M-TTR agregada EC⁵⁰ = 15.5 nM. NI-301.35G11: TTR de tipo silvestre agregada EC⁵⁰ = 3.9 nM, V30M-TTR agregada EC⁵⁰ = 5.0 nM. NI-301.37F1: TTR de tipo silvestre agregada EC⁵⁰ = 0.35 nM, V30M-TTR agregada EC⁵⁰ = 0.15 nM.

Figura 3: Especificidad para TTR agregada en inmunotransferencia de mancha. La proteína TTR humana de tipo silvestre en conformaciones nativas (1) o agregadas (2) y la proteína V30M-TTR recombinante agregada (3) se depositaron en una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con los siguientes anticuerpos: A) anticuerpo policlonal de conejo comercial contra TTR (Dako-A0002; 150 ng/mL), B) NI-301.59F1, C) NI-301.35G11 y D) NI-301.37F1 (B, C y D: anticuerpos monoclonales humanos a 50 nM).

Figura 4: Especificidad para TTR agregada en transferencia Western. Proteína TTR humana de tipo silvestre (300 ng) en conformaciones nativas (1) o agregadas (2) y extracto de hígado de ratón de tipo silvestre (10 pg de proteína total) (3) se cargaron en un gel SDS-PAGE y se procesaron para transferencia Western con los siguientes anticuerpos: A) anticuerpo policlonal de conejo comercial contra TTR (Dako-A0002; 150 ng/mL), B) NI-301.59F1, C) NI301.35G11 y D) NI-301.37F1 (B, C y D : anticuerpos monoclonales humanos a 50 nM). Para evitar la disociación de los agregados de alto peso molecular, la muestra de TTR agregada se entrecruzó con glutaraldehído (1%, 5 min) antes de cargarla en el gel.

Figura 5: Ausencia de unión a TTR en plasma humano en transferencia Western. Se cargaron muestras de plasma (0,5 pL) de controles (n = 5), portadores de mutaciones asintomáticas (n = 5) y pacientes con FAP (n = 4) en un gel SDS-PAGE y se procesaron para transferencia Western con los siguientes anticuerpos: A) Anticuerpo policlonal de conejo comercial contra TTR (DakoA0002; 150 ng/mL), B) solo anticuerpo secundario (anti-IgG humana-HRP, dilución 1/10.000), C) NI-301.35G11 y D) NI-301.37F1 (C y D: anticuerpos monoclonales humanos a 50 nM).

Figura 6: Ausencia de unión a TTR en plasma humano en inmunotransferencia de mancha. La proteína TTR mutante y de tipo silvestre pura en conformaciones nativas y agregadas, y las muestras de plasma de controles, portadores de mutaciones asintomáticas y pacientes con FAP se depositaron en una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con los siguientes anticuerpos: A) anticuerpo policlonal de conejo comercial contra TTR (Dako-A0002; 150 ng/mL), B) solo anticuerpo secundario (anti-IgG2a de ratón-HRP, dilución 1/10.000), y C) anticuerpo quimérico de ratón NI-301.mur35G11 (10 nM). Muestras 1-6: 150 ng de 1) TTR agregada de tipo silvestre, 2) TTR nativa de tipo nativa, 3) BSA, 4) V30M-TTR nativa, 5) L55P-TTR nativa y 6) Y78F-TTR nativa. Muestras 7-18: 2 pL de plasma recogido de 7­ 10) controles (n = 4), 11-14) portadores de mutaciones asintomáticos (n = 4) y 15-18) pacientes con FAP (n = 4).

Figura 7: Unión específica a TTR agregada en solución. Para la inmunoprecipitación (IP) de TTR se utilizaron proteína TTR humana de tipo silvestre y recombinante en conformaciones nativas y agregadas, y una muestra de plasma humano en 3 diluciones diferentes utilizando los siguientes anticuerpos: A) anticuerpo policlonal de conejo comercial contra TTR (Dako-A0002), B) NI-301.35G11 y C) NI-301.37F1. Las proteínas inmunoprecipitadas se sometieron a SDS-PAGE y se detectaron mediante transferencia Western (WB) con el anticuerpo Dako-A0002 (150 ng/mL). Carriles 1-2: controles de carga de WB: 300 ng de 1) TTR humana de tipo silvestre, 2) TTR recombinante de tipo silvestre Carriles 3-6: IP sobre proteína TTR pura: 3) TTR humana nativa de tipo silvestre, 4) TTR humana agregada de tipo silvestre, 5) TTR recombinante nativa de tipo silvestre y 6) TTR recombinante agregada de tipo silvestre Carriles 7-10: IP en plasma humano diluido 7) 10 veces, 8) 100 veces, 9) 1000 veces con PBS y 10) PBS solamente.

Figura 8: Unión específica a TTR en tejido de ratón con FAP. Los ratones transgénicos que expresan el alelo V30M-TTR humano sobre un fondo inactivado (KO) para TTR reproducen las características histopatológicas de FAP, incluidos los depósitos de TTR amorfos y amiloides en varios tejidos. Se procesaron secciones de tejido recolectados de hígado e intestino de A) ratones con FAP y B) ratones TTR-KO para inmunohistoquímica utilizando los siguientes anticuerpos: 1) anticuerpo policlonal de conejo comercial contra TTR (DakoA0002; dilución 1/1000), 2) NI-301.35G11 y 3) NI-301.37F1 (2 y 3: anticuerpos monoclonales humanos a 50 nM).

Figura 9: Unión específica a depósitos de TTR mal plegada pero no a TTR nativa en tejido humano. Los anticuerpos se caracterizaron por su capacidad para unirse a TTR en secciones de biopsia de piel de pacientes con FAP y páncreas de control sano: las acumulaciones de TTR mal plegada que son características de FAP están presentes en la biopsia de piel del paciente, mientras que las células alfa pancreáticas muestran expresión endógena de TTR. Las secciones se procesaron para inmunohistoquímica usando los siguientes anticuerpos: 1A) anticuerpo policlonal de conejo comercial contra TTR (Dako-A0002; dilución 1/1000), 1B) anticuerpo anti-IgG de conejo acoplado a HRP (dilución 1/125), 2A) anticuerpo quimérico de ratón NI-301.mur35G11 (50 nM), 2B) Anticuerpo anti-IgG2a de ratón acoplado a HRP (dilución 1/125), 3A) NI-301.37F1 (50 nM), y 3B) IgG antihumano acoplado a HRP (dilución 1/125).

Figura 10: Epítopos de unión a TTR evaluados mediante análisis por Pepscan. Los epítopos de unión de anticuerpos en TTR se determinaron usando el método de exploración de péptidos. Además de los péptidos que cubren la secuencia completa de TTR humana de tipo silvestre (manchas 1 a 29), las mutaciones de TTR seleccionadas también se representaron en la membrana (manchas 30 a 44). La membrana de exploración de péptidos se incubó con los siguientes anticuerpos a 50 nM: A) NI301.59F1, B) NI-301.35G11 y C) NI-30137F1. Como se resume en la Tabla D): NI-301.59F1 se une a EEEFVEGIY (TTR 61-69); NI-301.35G11 se une a GELHGLTTEEE (TTR 53-63); la mutación L55P evita la unión del anticuerpo; y NI-301.37F1 se une a WEPFA (TTR 41-45); la mutación E42G evita la unión de anticuerpos. Con el fin de determinar los requisitos de secuencia de los epítopos mencionados, los epítopos de unión del anticuerpo en TTR se identificaron adicionalmente usando el método de exploración con alanina. La secuencia completa de la proteína TTR humana de tipo silvestre se representó en la membrana como un conjunto de 151 péptidos sucesivos de 15 aminoácidos de longitud, comenzando en cada aminoácido de la proteína TTR. Para cada péptido, el aminoácido en la posición 10 fue reemplazado por una alanina, o por glicina o prolina cuando el aminoácido inicial era una alanina. La membrana de exploración de péptidos se incubó con los siguientes anticuerpos a 20 nM: E) NI-301.59F1, F) NI301.35G11 y G) NI-301.37F1. Como se resume en la Tabla H):

NI-301.59F1 se une a EEFXEGIY (TTR 62-69).

NI-301.35G11 se une a ELXGLTXE (TTR 54-61).

NI-301.37F1 se une a WEPFA (TTR 41-45), en las que X indica aminoácido; el reemplazo de E42 por alanina no interrumpió la unión, pero el reemplazo por guanina evitó la unión de anticuerpos como se informa en C.

Figura 11: Cinética de unión del anticuerpo a la proteína TTR en solución evaluada por resonancia de plasmón de superficie.

La cinética de unión del anticuerpo NI-301.37F1 a la proteína TTR se midió mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR). El anticuerpo NI-301.37F1 se capturó en el sensor por medio de un anticuerpo anti-IgG humano, y la solución de proteína TTR se hizo pasar sobre la superficie del sensor, a concentraciones que oscilaban entre 3.2 y 316 nM. Se utilizó un modelo de unión simple 1:1 para ajustar los datos y derivar las constantes de asociación (ka) y disociación (kd) respectivas y la afinidad (KD). Se determinaron las propiedades de unión para A) proteína TTR humana de tipo silvestre en conformación nativa, B) proteína TTR humana de tipo silvestre desnaturalizada (conformación mal plegada) y C) proteína TTR-L55P mutante recombinante. TTR nativa de tipo silvestre: ka = no determinada, kd = no determinada, KD >316 nM. TTR de tipo silvestre desnaturalizada: ka = 2.1 x 104 M 'V , kd = 2.6 x 10-5 s-1, KD = 1.2 nM. TTR-L55P recombinante: ka = 3.3 x 104 M 'V 1, kd = 4.6 x 10'5 s'1, KD = 1.4 nM

Figura 12: El tratamiento crónico con anticuerpo anti-TTR reduce la deposición patológica de TTR en el modelo de ratón con FAP.

Los ratones con FAP (Tg(6.0hMet30) x muTTR-KO) recibieron la administración semanal de NI-301.37F1 quimérico de ratón o anticuerpo de control de isotipo a razón de 3 mg/kg ip durante 12 semanas. Al final del período de tratamiento, se recogieron tejidos y se cuantificó el grado de deposición de TTR mediante inmunofluorescencia. A) Efecto del tratamiento en ratones de 7 meses (n = 14-15 ratones por grupo); B) Efecto del tratamiento en ratones de 17 meses (n = 10 ratones por grupo). Comparaciones grupales con prueba t de dos colas no pareadas.

Figura 13: Unión del anticuerpo a depósitos patológicos de TTR in vivo.

La participación con el objetivo se caracterizó en ratones adultos con FAP (7 meses) 48 horas después de la administración de una dosis única de anticuerpo NI-301.37F1 a razón de 30 mg/kg ip, o PBS. Los depósitos patológicos de TTR y la localización del anticuerpo inyectado se detectaron simultáneamente mediante inmunofluorescencia. A, D) Depósitos patológicos de TTR en los riñones de (A) ratones inyectados con NI-301.37F1 o (D) con PBS. B, E) Detección de anticuerpo humano en (B) ratones inyectados con NI-301.37F1 o (E) con PBS. C, F) Imágenes superpuestas que muestran (C) la colocalización y (F) ausencia de tinción inespecífica de TTR y NI-301.37F1.

Figura 14: Detección sin tejido de TTR mal plegado in vivo.

Los ratones adultos con fA p recibieron una sola administración de NI-301.37F1 o anticuerpo de control de isotipo a razón de 3 mg/kg ip. Se recolectaron muestras de sangre antes de la inyección de anticuerpos (t = 0) y 48 horas después de la inyección de anticuerpos (t = 48 h). Las muestras de plasma se procesaron mediante inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-IgG humano y se analizaron mediante transferencia Western utilizando para la detección: A) un anticuerpo policlonal anti-TTR independiente de la conformación (Dako A0002, 150 ng/mL) y B) NI- 301,37F1 (20 nM). En paralelo, una muestra de plasma obtenida de un ratón con FAP no inyectado se incubó con el anticuerpo NI-301.37F1 in vitro, antes del procesamiento.

Figura 15: Especificidad de anticuerpo evaluada frente a proteínas de agregación mediante ELISA.

Se evaluó la especificidad de anticuerpo para la proteína TTR midiendo la unión a proteínas de agregación seleccionadas mediante ELISA directo. La unión del anticuerpo se evaluó a 4 y 20 nM y la intensidad de la señal se expresó en veces de cambio con respecto a los niveles de fondo, medidos para cada ensayo en ausencia de anticuerpo anti-TTR.

A-B) Unión de NI-301.37F1 ensayada a 20 (A) y 4 nM (B)

C-D) Unión de NI-301.44E4 ensayada a 20 (C) y 4 nM (D).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere en general a inmunoterapia y métodos no invasivos para la detección de enfermedades y afecciones asociadas con la presencia de isoformas patológicas, a menudo mutantes y/o mal plegadas de transtiretina (TTR). Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales recombinantes de origen humano y fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se caracteriza en las reivindicaciones, que se han generado con base en la información de secuencia obtenida de poblaciones de donantes humanos seleccionadas y son capaces de unirse a tales isoformas de TTR y antígenos de las mismas. El anticuerpo monoclonal recombinante de origen humano de la presente invención se caracteriza ventajosamente por unirse específicamente a especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas, mutadas y/o agregadas y/o fragmentos de las mismas, lo que permite un direccionamiento para el tratamiento y/o diagnóstico de especies de TTR alteradas patológicamente. Debido a su derivación humana, se puede esperar razonablemente que los anticuerpos recombinantes resultantes de la presente invención sean eficaces y seguros como agente terapéutico, y altamente específicos como reactivo de diagnóstico para la detección de TTR patológica sin producir falsos positivos.

Además, el anticuerpo de la presente invención, así como los derivados del mismo, se pueden usar para la terapia de combinación de pacientes después de trasplantes de órganos que, sin embargo, tienen el riesgo de desarrollar una amiloidosis por TTR debido a por ejemplo su deposición, por ejemplo mutaciones hereditarias en el TTR o un defecto en la producción de TTR en el hígado. Por lo tanto, como una realización ventajosa particular, la presente invención se refiere al anticuerpo monoclonal humano y cualquier derivado del mismo descrito en este documento para su uso en el tratamiento de pacientes, ya sea solo o en el tratamiento de pacientes que reciben, por ejemplo, fármacos inmunosupresores después del trasplante de órganos u otros agentes utilizados para los síntomas asociados con la amiloidosis por TTR, en los que el anticuerpo de la presente invención y cualquiera de sus derivados está diseñado para administrarse concomitantemente con el fármaco inmunosupresor y/o el agente que suprime los efectos secundarios adicionales o secuencialmente antes o después de la administración del mismo. En este contexto, el anticuerpo anti-TTR y el fragmento de unión a TTR de la presente invención son preferiblemente sustancialmente no inmunogénicos en humanos. En una realización de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden tanto un anticuerpo monoclonal humano de la presente invención o cualquier derivado del mismo y uno o más fármacos inmunosupresores y/o utilizados para los síntomas asociados con la amiloidosis por TTR.

I. Definiciones

A menos que se indique lo contrario, un término como se usa en este documento tiene la definición proporcionada en el Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revisado en 2000 y reimpreso en 2003, ISBN 0198506732.

Si no se indica específicamente lo contrario, el término "TTR" se usa indistintamente para referirse específicamente a las diferentes formas de transtiretina (TTR). El término "TTR" también se usa para identificar generalmente otros confórmeros de TTR, por ejemplo, oligómeros y/o formas mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas de TTR. El término "TTR" también se usa para referirse colectivamente a todos los tipos y formas de TTR, tales como TTR mutada. Las letras añadidas delante de los términos TTR se utilizan para indicar el organismo del que se origina el ortólogo particular, por ejemplo hTTR para TTR humana o mTTR para origen murino. Además, a menos que se indique lo contrario, el sistema de numeración para la secuencia de aminoácidos de TTR usado en el presente documento se refiere a la proteína TTR madura, es decir, la proteína TTR secretada por las células después de la escisión del péptido señal. Esta numeración es la que se utiliza para definir las mutaciones de TTR encontradas en pacientes, tales como TTR-V30M o TTR-L55P, pero difiere de la utilizada para la secuencia de la proteína precursora de transtiretina (secuencia de referencia del NCBI: NP_000362.1). En este contexto, la posición y el aminoácido sustituido en una TTR mutante pueden indicarse de formas diferentes pero equivalentes; véase, por ejemplo, "TTR-V30M" y "V30M-TTR".

Los anticuerpos anti-TTR descritos en el presente documento se unen específicamente a TTR y sus epítopos y a diversas conformaciones de TTR y sus epítopos. Por ejemplo, en el presente documento se describen anticuerpos que se unen específicamente a especies de TTR alteradas patológicamente o fragmentos de las mismas, tales como oligómeros/fibrillas y/o formas mutadas, mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas de TTR o fragmentos de las mismas. El término (patológicamente) mutada, mal plegada, mal ensamblada, agregada/agregados de TTR, se usa de manera intercambiable para referirse específicamente a las formas mencionadas anteriormente. El término "formas agregadas" o "agregados" (patológicas), como se usa en el presente documento, describe los productos de una acumulación o formación de grupos debido a la interacción errónea/patológica de TTR entre sí. Estos agregados, acumulaciones o formas de agrupamiento pueden ser, consistir sustancialmente o consistir tanto en TTR y/o fragmentos de TTR como en oligómeros no fibrilares y/o oligómeros fibrilares y fibrillas de los mismos. Como se usa en este documento, la referencia a un anticuerpo que "se une específicamente", "se une selectivamente" o "se une preferentemente" a TTR se refiere a un anticuerpo que no se une a otras proteínas no relacionadas. En un ejemplo, un anticuerpo de TTR descrito en el presente documento puede unirse a TTR o un epítopo del mismo y no mostrar unión por encima de aproximadamente 2 veces el fondo para otras proteínas. En una realización preferida, el anticuerpo de la presente invención no reconoce sustancialmente proteínas formadoras de amiloide no relacionadas seleccionadas del grupo que consiste en alfa-sinucleína (a-syn), Tau, proteína 43 de unión al ADN de respuesta transactiva (TDP-43), amiloide A en suero (SAA), proteína huntingtina (HTT); véase, por ejemplo la Figura 15. Un anticuerpo que "se une específicamente" o "se une selectivamente" a un confórmero de Tt R se refiere a un anticuerpo que no se une a todas las conformaciones de TTR, es decir, no se une al menos a otro confórmero de TTR.

Por ejemplo, en el presente documento se describen anticuerpos que se pueden unir preferentemente a formas mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas de TTR tanto in vitro como en tejidos obtenidos de pacientes con enfermedades asociadas con amiloidosis por TTR o con riesgo de desarrollar enfermedades asociadas con amiloidosis por TTR. Dado que las secuencias de los anticuerpos de TTR de la presente invención se han obtenido de sujetos humanos, los anticuerpos de TTR de la presente invención también pueden denominarse "autoanticuerpos humanos" o "anticuerpos de origen humano" para enfatizar que esos anticuerpos fueron de hecho expresados inicialmente por los sujetos y no son constructos sintéticos generadas, por ejemplo, por medio de inmunoglobulinas humanas que expresan bibliotecas de fagos, que hasta ahora representaban un método común para intentar proporcionar anticuerpos similares a los humanos.

Se entiende que el término "péptido" incluye los términos "polipéptido" y "proteína" (que, a veces, se pueden usar indistintamente en este documento) dentro de su significado. De manera similar, también se contemplan fragmentos de proteínas y polipéptidos y pueden denominarse en el presente documento como "péptidos". No obstante, el término "péptido" denota preferiblemente un polímero de aminoácidos que incluye al menos 5 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 10 aminoácidos contiguos, más preferiblemente al menos 15 aminoácidos contiguos, aún más preferiblemente al menos 20 aminoácidos contiguos, y particularmente preferido al menos 25 aminoácidos contiguos. Además, el péptido de acuerdo con la presente invención normalmente no tiene más de 100 aminoácidos contiguos, preferiblemente menos de 80 aminoácidos contiguos, más preferiblemente menos de 50 aminoácidos contiguos y aún más preferiblemente no más de 15 aminoácidos contiguos del polipéptido TTR.

Polinucleótidos:

El término "polinucleótido" pretende abarcar un ácido nucleico singular así como varios ácidos nucleicos, y se refiere a una molécula o constructo de ácido nucleico aislado, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADN)p. Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, como el que se encuentra en los ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). El término "ácido nucleico" se refiere a uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha eliminado de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un anticuerpo contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además tales moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador, tal como un promotor, un sitio de unión al ribosoma o un terminador de transcripción.

Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consta de codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de parada" (t Ag , TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que forma parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores transcripcionales, intrones y similares no forman parte de una región codificante. Pueden estar presentes dos o más regiones codificantes de la presente invención en un único constructo polinucleotídico, por ejemplo, en un solo vector, o en constructos polinucleotídicos separados, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un único vector puede codificar por separado una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas con un ácido nucleico que codifica una molécula de unión, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo.

En determinadas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso del ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción operables asociados con una o más regiones codificantes. Una asociación operable es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal manera que coloque la expresión del producto génico bajo la influencia o el control de la secuencia o secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado con el mismo) están "operativamente asociados" o "operativamente ligados" si la inducción de la función del promotor da como resultado la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfieren con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión del producto génico o interfieren con la capacidad de transcripción de la plantilla de ADN. Por lo tanto, una región promotora sería operable asociada con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de la célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden operarse asociados con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de la célula. En este documento se describen promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción.

Una "molécula de unión" como se usa en el contexto de la presente invención se refiere principalmente a anticuerpos y fragmentos de los mismos.

Anticuerpos:

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el presente documento. Un anticuerpo o inmunoglobulina es una molécula de unión que comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras básicas de inmunoglobulina en sistemas de vertebrados se conocen relativamente bien; véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988).

Como se discutirá con más detalle a continuación, el término "inmunoglobulina" comprende varias clases amplias de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (y, m, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, y1-Y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc., están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la materia a la vista de la presente divulgación y, por consiguiente, están dentro del alcance de la presente invención. Todas las clases de inmunoglobulinas están claramente dentro del alcance de la presente invención, la siguiente discusión se dirigirá generalmente a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a la IgG, una molécula de inmunoglobulina estándar comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos de peso molecular aproximadamente 23.000 Dalton y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos de peso molecular 53.000-70.000. Las cuatro cadenas están típicamente unidas por enlaces disulfuro en una configuración "Y" en la que las cadenas ligeras rodean las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede unirse con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas por hibridomas, células B o células huésped modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un extremo terminal N en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el extremo terminal C en la parte inferior de cada cadena.

Tanto las cadenas ligera como pesada se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se utilizan funcionalmente. A este respecto, se apreciará que los dominios variables de las porciones de la cadena ligera (Vl) y pesada (Vh) determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren importantes propiedades biológicas tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor Fc, unión al complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se vuelven más distales del sitio de unión a antígeno o del extremo amino del anticuerpo. La porción del terminal N es una región variable y en la porción del terminal C es una región constante; los dominios CH3 y CL comprenden realmente el extremo terminal carboxilo de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Como se indicó anteriormente, la región variable permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a epítopos en antígenos. Es decir, el dominio Vl y el dominio Vh, o subconjunto de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio tridimensional de unión a antígeno. Esta estructura de anticuerpo cuaternario forma el sitio de unión a antígeno presente al final de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión a antígeno está definido por tres CDR en cada una de las cadenas Vh y Vl. Cualquier anticuerpo o fragmento de inmunoglobulina que contenga una estructura suficiente para unirse específicamente a TTR se indica en el presente documento de manera intercambiable como un "fragmento de unión" o un "fragmento inmunoespecífico".

En los anticuerpos de origen natural, un anticuerpo comprende seis regiones hipervariables, a veces denominadas "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" presentes en cada dominio de unión a antígeno, que son secuencias cortas no contiguas de aminoácidos que están específicamente posicionadas para forman el dominio de unión a antígeno cuando el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. Las "CDR" están flanqueadas por cuatro regiones "marco" relativamente conservadas o "FR" que muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de lámina p y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de la lámina p. Por lo tanto, las regiones marco actúan para formar un andamio que proporciona el posicionamiento de las c Dr en la orientación correcta mediante interacciones no covalentes entre cadenas. El dominio de unión a antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo del antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo análogo. Los aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones marco, respectivamente, pueden identificarse fácilmente para cualquier región variable de cadena pesada o ligera dada por un experto en la técnica, ya que se han definido con precisión; véase "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917.

En el caso de que haya dos o más definiciones de un término que se use y/o acepte en la técnica, la definición del término como se usa en este documento pretende incluir todos esos significados a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinante de complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación de antígenos no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, en las que las definiciones incluyen superposiciones o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, la aplicación de cualquiera de las definiciones para hacer referencia a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo se pretende que esté dentro del alcance del término tal como se define y usa en el presente documento. Los residuos de aminoácidos apropiados que abarcan las CDR como se define en cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la Tabla I como comparación. Los números exactos de residuos que abarcan una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprenden una región hipervariable o CDR particular del subtipo de anticuerpo IgG humano dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

Kabat et al., también definen un sistema de numeración para secuencias de dominios variables que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la materia puede asignar sin ambigüedades este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones específicas de residuos de aminoácidos en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la presente invención están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, que sin embargo es teórico y puede no aplicarse igualmente a cada anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, dependiendo de la posición de la primera CDR, las siguientes CDR podrían desplazarse en cualquier dirección.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos inmunoespecíficos, variantes o derivados de los mismos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, murinizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de unión a epítopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')² , Fd, Fv, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv unidos por disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden ya sea un dominio Vl o Vh, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para los anticuerpos descritos en este documento). Las moléculas de ScFv son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5.892.019. Las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención no es IgM o un derivado del mismo con una estructura pentavalente. En particular, en aplicaciones específicas de la presente invención, especialmente en el uso terapéutico, las IgM son menos útiles que las IgG y otros anticuerpos bivalentes o las moléculas de unión correspondientes, ya que las IgM debido a su estructura pentavalente y la falta de maduración por afinidad a menudo muestran reactividades cruzadas inespecíficas y una muy baja afinidad.

El anticuerpo de la presente invención no es un anticuerpo policlonal, es decir, consiste sustancialmente en una especie de anticuerpo particular en lugar de ser una mezcla obtenida de una muestra de inmunoglobulina plasmática.

Los fragmentos de anticuerpos, incluidos los anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender la región o regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una parte de lo siguiente: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención fragmentos de unión a TTR que comprenden cualquier combinación de región o regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3.

En un aspecto, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano aislado de un ser humano. Opcionalmente, la región marco del anticuerpo humano se alinea y adopta de acuerdo con las secuencias de la región variable de la línea germinal humana pertinentes en la base de datos; véase, por ejemplo, Vbase (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) alojada por el MRC Center for Protein Engineering (Cambridge, Reino Unido). Por ejemplo, los aminoácidos que se considera que se desvían potencialmente de la secuencia de la línea germinal verdadera podrían deberse a las secuencias del cebador de PCR incorporadas durante el proceso de clonación. En comparación con los anticuerpos de tipo humano generados artificialmente, tales como los fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla (scFv) de una biblioteca de anticuerpos presentada en fagos o ratones xenogénicos, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención se caracteriza porque (i) se obtiene usando la respuesta inmune humana en lugar de aquella de sustitutos de animales, es decir, el anticuerpo se ha generado en respuesta a TTR natural en su conformación relevante en el cuerpo humano, (ii) habiendo protegido al individuo o es al menos significativo para la presencia de TTR, y (iii) dado que el anticuerpo es de origen humano se minimizan los riesgos de reactividad cruzada contra autoantígenos. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, los términos "anticuerpo monoclonal humano", "autoanticuerpo monoclonal humano", "anticuerpo humano" y similares se utilizan para indicar una molécula de unión a TTR que es de origen humano, es decir, que se ha aislado de un célula humana tal como una célula B o un hibridoma de la misma o cuyo ADNc se ha clonado directamente a partir de ARNm de una célula humana, por ejemplo, una célula B de memoria humana. Un anticuerpo humano sigue siendo "humano", es decir, de origen humano incluso si se realizan sustituciones de aminoácidos en el anticuerpo, por ejemplo, para mejorar las características de unión.

En una realización, los anticuerpos de origen humano de la presente invención comprenden regiones heterólogas en comparación con los anticuerpos de origen natural, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos en la región marco, región constante fusionada exógenamente a la región variable, diferentes aminoácidos en los extremos terminales C o N y similares.

Los anticuerpos derivados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe más adelante y, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos N° 5.939.598 de Kucherlapati et al., se denominan anticuerpos de tipo humano con el fin de distinguirlos de los anticuerpos verdaderamente humanos de la presente invención.

Por ejemplo, el apareamiento de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de tipo humano tales como anticuerpos sintéticos y semisintéticos típicamente aislados de la presentación en fagos no refleja necesariamente el apareamiento original tal como ocurrió en la célula B humana original. Por consiguiente, los fragmentos Fab y scFv obtenidos a partir de bibliotecas de expresión recombinante como se usan comúnmente en la técnica anterior pueden considerarse artificiales con todos los posibles efectos asociados sobre la inmunogenicidad y la estabilidad.

Por el contrario, la presente invención proporciona anticuerpos aislados madurados por afinidad de sujetos humanos seleccionados, que se caracterizan por su utilidad terapéutica y su tolerancia en el hombre.

Como se usa en este documento, el término "anticuerpo rodentizado" o "inmunoglobulina rodentizada" se refiere a un anticuerpo que comprende una o más CDR de un anticuerpo humano de la presente invención; y una región marco humana que contiene sustituciones y/o eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos que se basan en una secuencia de anticuerpo de roedor. Cuando se hace referencia a roedores, se utilizan preferiblemente secuencias que se originan en ratones y ratas, en las que los anticuerpos que comprenden tales secuencias se denominan "murinizados" o "ratinizados" respectivamente. La inmunoglobulina humana que proporciona las CDR se denomina "parental" o "aceptora" y el anticuerpo de roedor que proporciona los cambios del marco se denomina "donante". No es necesario que estén presentes regiones constantes, pero si lo están, normalmente son sustancialmente idénticas a las regiones constantes de anticuerpos de roedores, es decir, al menos aproximadamente del 85% al 90%, preferiblemente aproximadamente el 95% o más idénticas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una inmunoglobulina de cadena ligera o pesada humana murinizada de longitud completa contiene una región constante de ratón, CDR humanas y un marco sustancialmente humano que tiene varias sustituciones de aminoácidos "murinizadas". Normalmente, un "anticuerpo murinizado" es un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable murinizada y/o una cadena pesada variable murinizada. Por ejemplo, un anticuerpo murinizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico, por ejemplo, porque la región variable completa de un anticuerpo quimérico no es de ratón. Un anticuerpo modificado que ha sido "murinizado" mediante el proceso de "murinizadón" se une al mismo antígeno que el anticuerpo parental que proporciona las CDR y normalmente es menos inmunogénico en ratones, en comparación con el anticuerpo parental. Las explicaciones anteriores con respecto a los anticuerpos "murinizados" se aplican de manera análoga a los anticuerpos "rodentizados", tales como los "anticuerpos ratinizados", en los que se utilizan secuencias de rata en lugar de las murinas.

Como se usa en este documento, el término "porción de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, un dominio bisagra (por ejemplo, región de bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3 o una variante o fragmento del mismo. Por ejemplo, un polipéptido de unión para usar en la invención puede comprender una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra y un dominio CH2; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra y un dominio CH3, o una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una parte de un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otra realización, un polipéptido de la invención comprende una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH3. Además, un polipéptido de unión para su uso en la invención puede carecer de al menos una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2). Como se expuso anteriormente, un experto en la técnica entenderá que estos dominios (por ejemplo, las porciones de cadena pesada) pueden modificarse de manera que varíen en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina de origen natural.

En ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en este documento, las porciones de cadena pesada de una cadena polipeptídica de un multímero son idénticas a las de una segunda cadena polipeptídica del multímero. Alternativamente, los monómeros de la invención que contienen porciones de cadena pesada no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de unión objetivo diferente, formando, por ejemplo, un anticuerpo o diacuerpo biespecífico.

En otra realización, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en este documento están compuestos de una única cadena polipeptídica tal como scFv y deben expresarse intracelularmente (intracuerpos) para posibles aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo.

Las porciones de cadena pesada de un polipéptido de unión para uso en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en este documento pueden derivarse de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4.

Como se usa en este documento, el término "porción de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. Preferiblemente, la porción de cadena ligera comprende al menos uno de un dominio Vl o CL.

Se cree que el tamaño mínimo de un péptido o epítopo polipeptídico para un anticuerpo es de aproximadamente cuatro a cinco aminoácidos. Los epítopos de péptidos o polipéptidos contienen preferiblemente al menos siete, más preferiblemente al menos nueve y lo más preferiblemente entre al menos aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos. Dado que una CDR puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en su forma terciaria, los aminoácidos que comprenden un epítopo no necesitan ser contiguos y, en algunos casos, puede que ni siquiera estén en la misma cadena peptídica. En la presente invención, un epítopo peptídico o polipeptídico reconocido por los anticuerpos de la presente invención contiene una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, más preferiblemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contiguos o no contiguos de TTR.

Por "unión específica", o "reconocimiento específico", usados indistintamente en el presente documento, generalmente se quiere decir que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo se une a un epítopo a través de su dominio de unión a antígeno, y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión a antígeno y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, a través de su dominio de unión a antígeno, más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo aleatorio no relacionado. El término "especificidad" se usa en este documento para calificar la afinidad relativa por la que un determinado anticuerpo se une a un cierto epítopo. Por ejemplo, se puede considerar que el anticuerpo "A" tiene una mayor especificidad por un epítopo dado que el anticuerpo "B", o se puede decir que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una especificidad más alta que la que tiene por el epítopo "D" relacionado.

Cuando esté presente, el término "características de unión inmunológica" u otras características de unión de un anticuerpo con un antígeno, en todas sus formas gramaticales, se refiere a la especificidad, afinidad, reactividad cruzada y otras características de unión de un anticuerpo.

Por "unión preferencial" se entiende que la molécula de unión, por ejemplo, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo. Por lo tanto, un anticuerpo que "se une preferentemente" a un epítopo dado se unirá más probablemente a ese epítopo que a un epítopo relacionado, incluso aunque tal anticuerpo pueda reaccionar de forma cruzada con el epítopo relacionado.

A modo de ejemplo no limitativo, se puede considerar que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si une dicho primer epítopo con una constante de disociación (Kd) que es menor que la Kd del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer antígeno preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la Kd del anticuerpo por el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la Kd del anticuerpo por el segundo epítopo.

En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una constante de disociación (k (disociación)) que es menor que la k (disociación) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la k (disociación) del anticuerpo por el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la k (disociación) del anticuerpo por el segundo epítopo.

Se puede decir que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en el presente documento, se une a TTR o un fragmento, variante o conformación específica del mismo con una velocidad de disociación (k (disociación)) de menos que o igual a 5 x 10-2 s-1, 10-2 s-15 x 10-3 s-1 o 10­ 3 s-1. Más preferiblemente, se puede decir que un anticuerpo de la invención se une a TTR o un fragmento, variante o conformación específica del mismo con una velocidad de disociación (k (disociación)) menor o igual a 5 x 10-4 s-1, 10­ 4 s-1, 5 x 10-5 s-1, o 10-5s-1, 5 x 10-6s-1, 10-6s-1, 5 x 10-7 s-1 o 10-7 s-1.

Se puede decir que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en el presente documento, se une a TTR o un fragmento, variante o conformación específica del mismo con una velocidad de asociación (k (asociación)) de mayor que o igual a 103 M-1 s-1, 5 x 103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1 0 5 x 104 M-1 s-1. Más preferiblemente, se puede decir que un anticuerpo de la invención se une a TTR o un fragmento, variante o conformación específica del mismo con una velocidad de asociación (k (asociación)) mayor o igual a 105 M-1 s-1, 5 x 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, o 5 x 106 M-1 s-1 o 107 M-1 s-1.

Se dice que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferentemente a ese epítopo en la medida en que bloquea, hasta cierto grado, la unión del anticuerpo de referencia al epítopo. La inhibición competitiva se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos de ELISA de competición. Se puede decir que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo dado en al menos un 90%, al menos un 80%, al menos un 70%, al menos un 60% o al menos un 50%.

Como se usa en este documento, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de la unión de un epítopo individual con la CDR de una molécula de unión, por ejemplo, una molécula de inmunoglobulina; véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988) en las páginas 27­ 28. Como se usa en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la estabilidad general del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la fuerza de combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulinas con el antígeno; véase, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez está relacionada tanto con la afinidad de las moléculas de inmunoglobulina individuales en la población con epítopos específicos como con las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo muy repetida, como un polímero, sería de gran avidez. La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno se puede determinar experimentalmente usando cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, WE, Ed., Raven Press Nueva York, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, WH Freeman and Company Nueva York, NY (1992) y los métodos descritos en este documento. Las técnicas generales para medir la afinidad de un anticuerpo por un antígeno incluyen ELISA, RIA y resonancia de plasmón de superficie. La afinidad medida de una interacción anticuerpo-antígeno particular puede variar si se mide en diferentes condiciones, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión a antígeno, por ejemplo, Kd, IC⁵⁰, se realizan preferiblemente con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado.

Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de las mismas de la invención también se pueden describir o especificar en términos de su reactividad cruzada. Como se usa en el presente documento, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, específico para un antígeno, de reaccionar con un segundo antígeno; una medida de relación entre dos sustancias antigénicas diferentes. Por lo tanto, un anticuerpo tiene reactividad cruzada si se une a un epítopo distinto del que indujo su formación. El epítopo de reactividad cruzada generalmente contiene muchas de las mismas características estructurales complementarias que el epítopo inductor y, en algunos casos, puede encajar mejor que el original.

Por ejemplo, ciertos anticuerpos tienen cierto grado de reactividad cruzada, ya que se unen a epítopos relacionados pero no idénticos, por ejemplo, epítopos con al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80 %, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55% y al menos 50% de identidad (calculado usando métodos conocidos en la técnica y descritos en este documento) con un epítopo de referencia . Se puede decir que un anticuerpo tiene poca o ninguna reactividad cruzada si no se une a epítopos con menos del 95%, menos del 90%, menos del 85%, menos del 80%, menos del 75%, menos del 70%, menos del 65%, menos del 60%, menos del 55% y menos del 50% de identidad (calculado usando métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) a un epítopo de referencia. Un anticuerpo puede considerarse "altamente específico" para un cierto epítopo, si no se une a ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de ese epítopo.

Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de las mismas de la invención también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a TTR y/o especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas y/o fragmentos de las mismas. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9M, 10-9M, 5 x 10-10M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12M, 10-12M, 5 x 10-13M, 10-13M, 5 x 10-14M, 10-14M, 5 x 10-15M, o 10-15M.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención tiene una Kd para diferentes isoformas de TTR como se ilustra para los ejemplos de anticuerpos en la Tabla V a continuación, es decir, una Kd de > 300 nM para la TTR nativa de tipo silvestre y/o una Kd de < 15 nM, preferiblemente < 5 nM, y más preferiblemente < 2 nM para TTR desnaturalizada, y/o una Kd de < 35 nM, preferiblemente de < 20 nM para TTR-V30M nativa, y/o una Kd de < 150 nM, preferiblemente de < 5 nM, y lo más preferiblemente < 2 nM para TTR-L55P nativa.

Como se indicó anteriormente, las estructuras de subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Como se usa en este documento, el término "dominio Vh" incluye el dominio variable del terminal amino de una cadena pesada de inmunoglobulina y el término "dominio CH1" incluye el primer dominio de región constante (principalmente del terminal amino) de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 es adyacente al dominio Vh y es el terminal amino a la región bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina.

Como se usa en este documento, el término "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente el residuo 244 al residuo 360 de un anticuerpo usando esquemas de numeración convencionales (residuos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat; y residuos 231-340, sistema de numeración de la UE; véase Kabat EA et al., en la obra citada). El dominio CH2 es único en el sentido de que no está estrechamente emparejado con otro dominio. Más bien, se interponen dos cadenas de carbohidratos ramificadas unidas a N entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 hasta el extremo terminal C de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 residuos.

Como se usa en este documento, el término "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, lo que permite que las dos regiones de unión a antígeno del extremo terminal N se muevan de forma independiente. Las regiones bisagra se pueden subdividir en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior; véase Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083-4090.

Como se usa en este documento, el término "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace disulfuro o puente con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG de origen natural, las regiones CH1 y CL están unidas por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas por dos enlaces disulfuro en las posiciones correspondientes a 239 y 242 utilizando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración de la UE).

Como se usa en este documento, los términos "enlazado", "fusionado" o "fusión" se usan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes más, por cualquier medio que incluya conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión en el marco" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos (ORF) de polinucleótidos para formar un ORF continuo más largo, de una manera que mantiene el marco de lectura de traducción correcto de los ORF originales. Por lo tanto, una proteína de fusión recombinante es una única proteína que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (segmentos que normalmente no están unidos de esta manera en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se hace así continuo a lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar separados física o espacialmente, por ejemplo, por una secuencia enlazadora en el marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las CDR de una región variable de inmunoglobulina pueden fusionarse, en el marco, pero estar separados por un polinucleótido que codifica al menos una región marco de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, siempre que las CDR "fusionadas" estén traducidas conjuntamente como parte de un polipéptido continuo.

El término "expresión" como se usa en este documento se refiere a un proceso por el cual un gen produce un compuesto bioquímico, por ejemplo, un ARN o polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula, incluyendo, sin limitación, la inactivación del gen, así como la expresión transitoria y la expresión estable. Incluye, sin limitación, la transcripción del gen en ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN pequeño de horquilla (ARNph), ARN pequeño de interferencia (ARNpi) o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de ARNm en polipéptido o polipéptidos. Si el producto final deseado es un compuesto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese compuesto bioquímico y cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico". Como se usa en el presente documento, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen, o un polipéptido que se traduce a partir de una transcripción. Los productos génicos descritos en el presente documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glicosilación, adición de lípidos, asociación con otras subunidades proteicas, escisión proteolítica y similares.

Como se usa en este documento, el término "muestra" se refiere a cualquier material biológico obtenido de un sujeto o paciente. En un aspecto, una muestra puede comprender sangre, líquido peritoneal, CSF, saliva u orina. En otros aspectos, una muestra puede comprender sangre completa, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, células B enriquecidas a partir de muestras de sangre y células cultivadas (por ejemplo, células B de un sujeto). Una muestra también puede incluir una biopsia o una muestra de tejido que incluya tejido neural. En otros aspectos más, una muestra puede comprender células completas y/o un lisado de las células. Las muestras de sangre se pueden recolectar mediante métodos conocidos en la técnica. En un aspecto, el sedimento se puede resuspender mediante agitación tipo vórtice a 4 °C en 200 pL de tampón (Tris 20 mM, pH 7.5, Nonidet al 0.5%, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, NaCl 0.1 M, inhibidor de proteasa IX Sigma e inhibidores de la fosfatasa IX Sigma 1 y 2). La suspensión se puede mantener en hielo durante 20 min con agitación tipo vórtice intermitente. Después de centrifugar a 15.000 x g durante 5 min a aproximadamente 4 °C, se pueden almacenar alícuotas de sobrenadante a aproximadamente -70 °C.

Enfermedades:

A menos que se indique lo contrario, los términos "trastorno" y "enfermedad" se usan indistintamente en el presente documento y comprenden cualquier cambio fisiológico no deseado en un sujeto, un animal, un órgano aislado, tejido o célula/cultivo celular.

La amiloidosis por transtiretina (TTR) es un mecanismo fisiopatológico que interviene en muchas enfermedades diferentes que se caracterizan por el depósito anormal de la proteína TTR en varios tejidos como resultado de un cambio estructural (es decir, conformacional) de la proteína TTR. La proteína TTR mal plegada y mal ensamblada es tóxica y ocurre a menudo como consecuencia de mutaciones en el gen TTR. La toxicidad de TTR mal plegada conduce a daños en los tejidos locales, que al acumularse con el tiempo pueden provocar disfunción orgánica e incluso insuficiencia orgánica. Hay muchos tipos de tejidos y órganos que son susceptibles a la amiloidosis por TTR, como el sistema nervioso periférico y autónomo, el corazón, las leptomeninges, los ojos, los tendones, los ligamentos o los riñones. La amplia gama de tejidos que pueden verse afectados por la amiloidosis por TTR es una razón para la diversidad de síntomas que presentan los pacientes con amiloidosis por TTR. De hecho, los pacientes con amiloidosis por TTR se clasifican clínicamente como personas que padecen diferentes enfermedades, de acuerdo con el tejido u órgano más afectado por la amiloidosis por TTR y los síntomas correspondientes.

Sobre esta base, la amiloidosis por TTR se ha clasificado en una forma neuropática, en la que el sistema nervioso periférico y autónomo se ve afectado principalmente y los pacientes presentan principalmente dolor, parestesia, debilidad muscular y disfunción autónoma. También existe una forma cardíaca de amiloidosis por TTR, en la que el corazón se ve afectado principalmente y los pacientes presentan principalmente hipo o hipertensión ortostática, arritmia y cardiomegalia. Estas dos formas no son mutuamente excluyentes y muchos pacientes presentan una combinación de las dos. Cuando la amiloidosis por TTR afecta a otros tejidos, puede producir opacidad vítrea, sequedad ocular o glaucoma, proteinuria, hipertiroxinemia, síndrome del túnel carpiano o preeclampsia.

Por lo tanto, en una realización de la presente invención, los anticuerpos de la presente invención, los polinucleótidos, los vectores y/o las células de la presente invención se utilizan para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico para tratamiento profiláctico y/o terapéutico de las enfermedades por amiloidosis por TTR, para controlar la progresión de la enfermedad y/o la respuesta al tratamiento, y para el diagnóstico de enfermedades asociadas con la amiloidosis por TTR que comprenden polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC), amiloidosis sistémica senil (SSA), amiloidosis leptomeníngea/del sistema nervioso central (CNS) que incluye enfermedad de Alzheimer, amiloidosis ocular, amiloidosis renal, hipertiroxinemia, síndrome del túnel carpiano, desgarros del manguito rotador y estenosis espinal lumbar y preeclampsia.

Tratamiento:

Como se usa en este documento, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en las que el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como el desarrollo de deficiencia cardíaca. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, entre otros, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o enlentecimiento de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado patológico, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen la afección o trastorno, así como los que son propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que se debe prevenir la manifestación de la afección o trastorno.

Si no se indica lo contrario, el término "fármaco", "medicina" o "medicamento" se utilizan indistintamente en este documento e incluirán, entre otros, todos los (A) artículos, medicinas y preparaciones para uso interno o externo, y cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinada a ser utilizada para el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades del hombre o de otros animales; y (B) artículos, medicinas y preparaciones (distintos de los alimentos) destinados a afectar la estructura o cualquier función del cuerpo del hombre o de otros animales; y (C) artículos destinados a ser utilizados como un componente de cualquier artículo especificado en la cláusula (A) y (B). El término "fármaco", "medicina" o "medicamento" incluirá la fórmula completa de la preparación destinada a ser utilizada en el hombre u otros animales que contengan uno o más "agentes", "compuestos", "sustancias" o "composiciones (químicas)" como y en algún otro contexto también otros excipientes farmacéuticamente inactivos como rellenos, desintegrantes, lubricantes, deslizantes, aglutinantes o que garantizan un fácil transporte, desintegración, desagregación, disolución y disponibilidad biológica del "fármaco", "medicina" o "medicamento" en una ubicación objetivo prevista dentro del cuerpo del hombre u otros animales, por ejemplo, en la piel, en el estómago o en el intestino. Los términos "agente", "compuesto" o "sustancia" se usan indistintamente en este documento e incluirán, en un contexto más particular, pero no se limitan a todos los agentes farmacológicamente activos, es decir, agentes que inducen un efecto biológico o farmacológico deseado o son investigados o probados para determinar la capacidad de inducir tal posible efecto farmacológico mediante los métodos de la presente invención.

Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, por ejemplo, un paciente humano, para quien se desea el diagnóstico, pronóstico, prevención o terapia.

Vehículos farmacéuticos:

Los vehículos y rutas de administración farmacéuticamente aceptables se pueden tomar de la literatura correspondiente conocida por el experto en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) de la Universidad de Ciencias de Filadelfia, ISBN 0-683-306472, Vaccine Protocols 2nd Edition de Robinson et al., Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, EE. UU., 2003; Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems. 2a Edición de Taylor y Francis. (2006), ISBN: 0-8493­ 1630-8. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos pueden formularse por métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas se puede realizar de diferentes formas. Los ejemplos incluyen la administración de una composición que contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable por métodos oral, intranasal, rectal, tópico, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, subdérmico, transdérmico, intratecal e intracraneal. Las formulaciones en aerosol, tales como las formulaciones en aerosol nasal, incluyen soluciones acuosas purificadas u otras soluciones del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Preferiblemente, tales formulaciones se ajustan a un pH y un estado isotónico compatibles con las membranas mucosas nasales. También se prevén en la presente invención composiciones farmacéuticas para administración oral, tales como moléculas de anticuerpos de dominio único (por ejemplo, "nanocuerposMR"), etc. también están contempladas en la presente invención. Dichas formulaciones orales pueden estar en forma de tableta, cápsula, polvo, líquido o semisólido. Una tableta puede comprender un vehículo sólido, tal como gelatina o un adyuvante. Las formulaciones para administración rectal o vaginal se pueden presentar como un supositorio con un vehículo adecuado; véase también O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735. Puede encontrarse orientación adicional con respecto a formulaciones que son adecuadas para varios tipos de administración en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadelfia, PA, 17a ed. (1985) y actualizaciones correspondientes. Para una breve revisión de los métodos para la administración de fármacos, véase Langer, Science 249 (1990), 1527-1533.

II. Anticuerpos de la presente invención

La presente invención se refiere generalmente a anticuerpos anti-TTR de origen humano y fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se caracteriza en las reivindicaciones, que preferiblemente demuestran las características de unión inmunológica y/o propiedades biológicas como se describe para los anticuerpos ilustrados en los Ejemplos. De acuerdo con la presente invención, se clonaron anticuerpos monoclonales humanos específicos para TTR a partir de un grupo de sujetos humanos sanos. Sin embargo, en otra realización de la presente invención, los anticuerpos anti-TTR monoclonales humanos también podrían clonarse a partir de pacientes que muestran síntomas de una enfermedad y/o trastorno asociado con la amiloidosis por TTR.

En el curso de los experimentos realizados de acuerdo con la presente invención, se evaluó la capacidad de los anticuerpos presentes en los medios acondicionados de células B de memoria humana cultivadas para unirse a TTR y a más de otras 10 proteínas, incluida la albúmina de suero bovino (BSA). Solo los sobrenadantes de células B capaces de unirse a la proteína TTR pero no a ninguna de las otras proteínas en el cribado se seleccionaron para análisis adicionales, incluida la determinación de la clase de anticuerpos y la subclase de cadenas ligeras. Las células B seleccionadas se procesaron luego para la clonación de anticuerpos.

En resumen, esto consistió en la extracción de ARN mensajeros de las células B seleccionadas, retrotranscripción por RT-PCR, amplificación de las regiones codificantes de anticuerpos por PCR, clonación en vectores plasmídicos y secuenciación. A continuación, se produjeron anticuerpos humanos seleccionados mediante expresión recombinante en células HEK293 o CHO y purificación, y posteriormente se caracterizaron por su capacidad para unirse a proteína TTR humana. La combinación de varias pruebas, por ejemplo, la expresión recombinante de los anticuerpos en células HEK293 o CHO y la posterior caracterización de sus especificidades de unión hacia la proteína TTR humana, y su unión distintiva a formas patológicamente mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas de las mismas confirmó que por primera vez se han clonado anticuerpos humanos que son altamente específicos para TTR y reconocen de forma distintiva y se unen selectivamente a las formas patológicamente agregadas de la proteína TTR, tales como las fibrillas de TTR. En algunos casos, también se generaron anticuerpos quiméricos de ratón sobre la base de los dominios variables de los anticuerpos humanos de la presente invención. Estos anticuerpos quiméricos de ratón han mostrado igual afinidad, especificidad y selectividad de unión a TTR humana que los anticuerpos humanos como se muestra en las Figuras 6 y 9 y en los Ejemplos 4 y 8.

Por lo tanto, la presente invención se refiere en general a un anticuerpo anti-TTR monoclonal recombinante derivado de origen humanos y a fragmentos de unión, derivados y variantes del mismo como se caracteriza en las reivindicaciones. En una realización de la invención, el anticuerpo es capaz de unirse a TTR humana.

En una realización, la presente invención está dirigida a un anticuerpo anti-TTR, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del mismo, en el que el anticuerpo se une específicamente al mismo epítopo de TTR como anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 y NI-301.12D3. El mapeo de epítopos identificó una secuencia dentro de la TTR humana que incluye los aminoácidos 61-EEEFVEGIY-69 (SEQ ID NO: 49) como el epítopo lineal único reconocido por el anticuerpo NI-301.59F1 de esta invención, una secuencia dentro de la TTR humana que incluye los aminoácidos 53-GELHGLTTEEE-63 (SEQ ID NO: 50) como el epítopo lineal único reconocido por el anticuerpo NI-301.35G11 de esta invención, una secuencia dentro de la TTR humana que incluye los aminoácidos 41-WEPFA-45 (SEQ ID NO: 51) como el epítopo lineal único reconocido por el anticuerpo NI-301.37F1 (véase la Figura 10 y el Ejemplo 9). Por lo tanto, en una realización se proporciona el anticuerpo de la presente invención, en el que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo de TTR que comprende la secuencia de aminoácidos EEEFVEGIY (SEQ ID NO: 49), GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50), o WEPFA (SEQ ID NO: 51).

En este contexto, como se explica en el Ejemplo 9, los epítopos de unión de los ejemplos de anticuerpos NI-301.59F1, NI301.35G11 y NI-301.37F1 se han analizado utilizando un panel de 29 péptidos secuenciales de 15 aminoácidos de longitud y 11 superposiciones de aminoácidos (es decir, primer péptido TTRaa-Ms; segundo péptido TTRaa⁵-¹⁹; etc.), en los que el anticuerpo NI-301.59F1 y NI-301.35G11 reconocen dos péptidos superpuestos, (15 y 16) y (13 y 14), respectivamente, y el anticuerpo NI 301.37F1 reconoce tres péptidos superpuestos (9, 10 y 11); véase el Ejemplo 9 y la Figura 10.

Por lo tanto, con respecto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido TTR maduro y el correspondiente mapeo de péptidos, esto significa que el anticuerpo NI-301.59F1 que se une al epítopo EEEFVEGIY (SEQ ID NO: 49) es capaz de reconocer péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos GLTTEEEFVEGIYKV (SEQ ID NO: 85) y EEEFVEGIYKVEIDT (SEQ ID NO: 86).

Asimismo, el anticuerpo anti-TTR NI-301.35G11 que se une al epítopo GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50) es capaz de reconocer péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos TSESGELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 87) y GELHGLTTEEEFVEG (SEQ ID NO: 88).

De forma similar, el anticuerpo anti-TTR NI-301.37F1 que se une al epítopo WEPFA (SEQ ID NO: 51) es capaz de reconocer péptidos con las secuencias de aminoácidos FRKAADDTWEPFASG (SEQ iD NO: 89), ADDTWEPFASGKTSE (SEQ ID NO : 90) y WEPFASGKTSESGEL (SEQ ID NO: 91).

Por lo tanto, los anticuerpos objetivo de la presente invención ilustrados en los ejemplos son diferentes de los anticuerpos que reconocen cualquiera de los epítopos mencionados en el contexto únicamente de aminoácidos del terminal N y/o terminal C adicionales. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención, la unión específica de un anticuerpo anti-TTR a un epítopo de TTR que comprende la secuencia de aminoácidos EEEFVEGIY (SEQ ID NO: 49), GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50) o WEPFA (SEQ ID NO: 51) se determina con péptidos secuenciales de 15 aminoácidos de longitud y superposición de 11 aminoácidos de acuerdo con el Ejemplo 9 y las Figuras 10A a D.

En este contexto, el mapeo de epítopos extendido realizado de acuerdo con la presente invención y descrito en el Ejemplo 9 usando un panel de 151 péptidos secuenciales de 15 aminoácidos de longitud y 14 superposiciones de aminoácidos, en el que para cada péptido el aminoácido en la posición 10 fue reemplazado por una alanina por aminoácidos que no son alanina, mientras que las alaninas fueron reemplazadas por glicina o prolina reveló que el anticuerpo NI-301.59F1 se une al epítopo EEFXEGIY (TTRaa^62-69) y el anticuerpo NI-301.35G11 se une a ELXGLTXE (TTRaa^54-6-i) mientras que no se han determinado más requisitos de secuencia para el epítopo del anticuerpo NI-301.37F1. Por consiguiente, en otra realización, la determinación de si un anticuerpo dado se une al mismo epítopo que los anticuerpos NI-301.59F1, NI301.35G11 y NI-301.37F1 se realiza de acuerdo con el Ejemplo 9 y las Figuras 10E a H.

No hace falta decir que el mapeo de epítopos y la determinación de si un anticuerpo dado se une al mismo epítopo que un anticuerpo objetivo usado en el Ejemplo 9 y que se muestra en la Figura 10 también se puede aplicar a cualquier otro anticuerpo anti-TTR de la presente invención descrito en los Ejemplos con la región variable representada en la Figura 1A-1T.

Por consiguiente, la presente invención se refiere generalmente a cualquier anticuerpo anti-TTR y molécula similar a un anticuerpo como se caracteriza en las reivindicaciones, que se une al mismo epítopo que un anticuerpo ilustrado en los Ejemplos y que tiene al menos las CDR y/o región pesada y ligera variable como se muestra en cualquiera de las Figuras 1A-1T.

En una realización adicional, el anticuerpo se une específicamente a la secuencia de aminoácidos GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50) pero no a GELHGPTTEEE, correspondiente al epítopo mutante de TTR-L55P, o el anticuerpo se une específicamente a la secuencia de aminoácidos WEPFA (SEQ ID NO: 51) pero no W GPFA, correspondiente al epítopo mutante TTR-E42G.

Además, sin pretender quedar ligado a observaciones experimentales iniciales como se demuestra en los Ejemplos 3 a 8 y se muestra en las Figura 2, 3, 4, 7 y 9, los anticuerpos anti-TTR monoclonales humanos NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 de la presente invención se caracterizan preferiblemente por unirse específicamente a TTR patológica mal plegada, mal ensamblada o agregada y que no reconoce sustancialmente TTR en la forma fisiológica. Por lo tanto, la presente invención proporciona un conjunto de anticuerpos anti-TTR humanos con propiedades de unión particularmente útiles para fines diagnósticos y terapéuticos. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a formas patológicamente agregadas de TTR.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención exhibe las propiedades de unión de los ejemplos de anticuerpos NI-301.59F1, NI-301.35G11 y NI-301.37F1 como se describe en los Ejemplos. El anticuerpo anti-TTR de la presente invención reconoce preferentemente TTR alterada patológicamente, tal como especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas o agregadas y fragmentos de las mismas en lugar de TTR fisiológica. Por lo tanto, en una realización, el anticuerpo de la presente invención no reconoce sustancialmente especies de TTR fisiológicas.

El término "no reconoce sustancialmente" cuando se usa en la presente solicitud para describir la afinidad de unión de una molécula de un grupo que comprende un anticuerpo, un fragmento del mismo o una molécula de unión para una molécula objetivo específica, antígeno y/o conformación de la molécula objetivo y/o antígeno significa que la molécula del grupo mencionado anteriormente se une a dicha molécula, antígeno y/o conformación con una afinidad de unión que es al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces o 9 veces menor que la afinidad de unión de la molécula del grupo mencionado anteriormente para unirse a otra molécula, antígeno y/o conformación. Muy a menudo, la constante de disociación (KD) se utiliza como medida de la afinidad de unión. A veces, es la EC⁵⁰ en un ensayo específico como, por ejemplo, un ensayo ELISA que se usa como medida de la afinidad de unión. Preferiblemente, el término "no reconoce sustancialmente" cuando se usa en la presente solicitud significa que la molécula del grupo mencionado anteriormente se une a dicha molécula, antígeno y/o conformación con una afinidad de unión que es al menos o 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 1000 veces o 10000 veces menor que la afinidad de unión de dicha molécula del grupo mencionado anteriormente para unirse a otra molécula, antígeno y/o conformación.

Además, o alternativamente, el anticuerpo anti-TTR de la presente invención se une a formas mal plegadas, mal ensambladas o agregadas de TTR humana que causan enfermedades. En este contexto, las afinidades de unión pueden estar en el intervalo que se muestra para los ejemplos de anticuerpos NI-301.59F1, NI-301.35G11 y NI-301.37F1 en la Figura 2, Figura 10 respectiva, es decir, que tienen la mitad de concentraciones efectivas máximas ( EC⁵⁰) de aproximadamente 1 pM a 500 nM, preferiblemente una EC⁵⁰ de aproximadamente 50 pM a 100 nM, lo más preferiblemente una EC⁵⁰ de aproximadamente 1 nM a 20 nM para TTR agregada humana y TTR recombinante agregada como se muestra para NI-301.59F1 y NI- 301.35G11, o una EC⁵⁰ de aproximadamente 100 pM a 1 nM para TTR agregada humana y TTR recombinante agregada como se muestra para NI-301.37F1.

En particular, el anticuerpo anti-TTR, fragmento de unión o derivado del mismo tiene una afinidad de unión correspondiente a un valor de EC⁵⁰ de < 5 nM para la unión de V30M-TTR agregada de tipo silvestre y/o una EC⁵⁰ de < 20 nM, preferiblemente < 10 nM. y lo más preferiblemente < 1 nM para la unión de V30M-TTR agregada; véase el Ejemplo 3 y la Figura 2.

Algunos anticuerpos pueden unirse a una amplia gama de biomoléculas, por ejemplo, proteínas. Como apreciará el experto en la técnica, el término específico se usa en este documento para indicar que otras biomoléculas distintas de las proteínas TTR o fragmentos de las mismas no se unen significativamente a la molécula de unión a antígeno, por ejemplo, uno de los anticuerpos de la presente invención. Preferiblemente, el nivel de unión a una biomolécula distinta de TTR da como resultado una afinidad de unión que es como máximo solo 20% o menos, 10% o menos, solo 5% o menos, solo 2% o menos o solo 1% o menos (es decir, al menos 5, 10, 20, 50 o 100 veces menor, o algo más, de la afinidad por TTR, respectivamente; véase, por ejemplo, la Figura 2.

En una realización, el anticuerpo anti-TTR de la presente invención se une preferentemente a formas agregadas de TTR, TTR mal plegada, TTR mal ensamblada y/o fragmentos, derivados, fibrillas y/u oligómeros de los mismos. En otra realización, el anticuerpo anti-TTR de la presente invención se une preferentemente tanto a TTR nativa como a formas patológicamente mal plegadas, mal ensambladas o agregadas de TTR.

Como se mencionó anteriormente, los depósitos de TTR amorfos y amiloides pueden conducir a diferentes enfermedades dependiendo de en qué parte del cuerpo se produzcan las especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas o fragmentos de las mismas. Por ejemplo, los pacientes con polineuropatía amiloide familiar (FAP) presentan depósitos de TTR principalmente en las fibras nerviosas de pequeño diámetro y, por lo tanto, presentan principalmente síntomas tales como percepciones sensoriales alteradas y disfunciones autonómicas, incluidas disfunciones gastrointestinales o impotencia; los pacientes con miocardiopatía amiloide familiar (FAC) o amiloidosis sistémica senil (SSA) presentan depósitos de TTR principalmente en el corazón y, por lo tanto, presentan síntomas como insuficiencia cardíaca o arritmia cardíaca; los pacientes con depósitos de TTR en los riñones pueden presentar disfunciones renales y proteinuria.

Por lo tanto, en una realización, el anticuerpo de la presente invención es útil para el tratamiento de polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC), amiloidosis sistémica senil (SSA), amiloidosis familiar sistémica, amiloidosis leptomeníngea/del sistema nervioso central (CNS) que incluye enfermedad de Alzheimer, amiloidosis ocular, amiloidosis renal, hipertiroxinemia, amiloidosis de ligamentos que incluye síndrome del túnel carpiano, desgarros del manguito rotador y estenosis espinal lumbar y preeclampsia, y síntomas de los mismos.

La presente invención también se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del mismo, en el que el anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno idéntico al de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 y NI-301.14C3.

La presente invención ejemplifica además varias moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos, que se caracterizan por comprender en su región variable, por ejemplo, dominio de unión de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable Vh y Vl que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas en la Figura 1. Las secuencias de nucleótidos correspondientes que codifican las regiones variables identificadas anteriormente se exponen en la Tabla II a continuación. En la Figura 1 se representan ejemplos de conjuntos de CDR de las secuencias de aminoácidos anteriores de la región Vh y/o Vl. Sin embargo, como se discute a continuación, el experto en la técnica es muy consciente del hecho de que además o alternativamente pueden usarse CDR, que difieren en su secuencia de aminoácidos de las expuestas en la Figura 1 en uno, dos, tres o incluso más aminoácidos en el caso de CDR2 y CDR3. Por lo tanto, en una realización, se proporciona el anticuerpo de la presente invención o un fragmento de unión a TTR del mismo que comprende en su región variable las regiones determinantes de complementariedad (CDR) como se muestra en la Figura 1 y/o una o más CDR de las mismas que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención es cualquiera de los anticuerpos que comprenden una secuencia de aminoácidos de la región Vh y Vl como se muestra en la Figura 1 o una región Vh y Vl de la misma que comprende una o más sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, el anticuerpo de la presente invención se caracteriza por la conservación del emparejamiento análogo de la cadena pesada y ligera como estaba presente en la célula B humana.

En una realización adicional de la presente invención, el anticuerpo anti-TTR, el fragmento de unión a TTR, su variante sintética o biotecnológica se puede optimizar para que tenga una afinidad de unión apropiada con las propiedades objetivo y farmacocinéticas. Por lo tanto, al menos un aminoácido en la CDR o región variable, que es propenso a modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en glicosilación, oxidación, desaminación, escisión de enlaces peptídicos, formación de isoaspartato y/o cisteína no apareada, se sustituye por un aminoácido mutado que carece de dicha alteración o en el que al menos una fracción de carbohidrato se elimina o se añade química o enzimáticamente al anticuerpo. Se pueden encontrar ejemplos de optimización de aminoácidos en por ejemplo, las solicitudes internacionales WO 2010/121140 y w O 2012/049570. Se describen modificaciones adicionales que optimizan las propiedades del anticuerpo en Gavel et al., Protein Engineering 3 (1990), 433-442 y Helenius et al., Annu. Rev. Biochem. 73 (2004), 1019-1049.

Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, derivado o variante del mismo, que compite por unirse a TTR con al menos uno de los anticuerpos que tienen la región Vh y Vl como se muestra en cualquiera de la Figura 1 A a T.

Los resultados experimentales proporcionados en la Figura 2 y el Ejemplo 3 sugieren que algunos de los anticuerpos anti-TTR de la presente invención se unen preferentemente a formas mal plegadas, mal ensambladas o agregadas de anti-TTR humana sobre las formas fisiológicas de las proteínas. Por lo tanto, en una realización, el anticuerpo de la presente invención reconoce preferentemente TTR mal plegada, mal ensamblada y/o agregada y/o fragmento y/o derivados de la misma sobre la TTR fisiológica.

El anticuerpo de la presente invención puede ser humano, en particular para aplicaciones terapéuticas. Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de roedor, rodentizado o de roedor-humano quimérico, preferiblemente un anticuerpo murino, murinizado o murino-humano quimérico o un anticuerpo de rata ratinizado o de rata-humano quimérico que son particularmente útiles para métodos de diagnóstico y estudios en animales. En una realización, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de roedor-humano quimérico o rodentizado.

Además, en una realización, el anticuerpo quimérico de la presente invención, es decir, que comprende los dominios variables de un anticuerpo humano, por ejemplo, NI-301.35G11 y los dominios constantes genéricos ligero y pesado de murino exhiben las propiedades de unión de los ejemplos de anticuerpos quiméricos murinos NI-301.mur35G11 como se describe en los Ejemplos. Además, los anticuerpos quiméricos de ratón de la presente invención se unen con una alta afinidad a la TTR humana como se describe en los Ejemplos 4 y 8. Preferiblemente, la afinidad de unión de los anticuerpos quiméricos es similar a la de sus contrapartes humanas.

En una realización, el anticuerpo de la presente invención se proporciona mediante cultivos de células B simples u oligoclonales que se cultivan y el sobrenadante del cultivo, que contiene anticuerpos producidos por dichas células B, se criba para determinar la presencia y afinidad de anticuerpos anti-TTR en el mismo. El proceso de cribado comprende cribar la unión a agregados monomérico fibrilares o no fibrilares nativos como oligómeros de hTTR derivada de un péptido hTTR sintético de longitud completa o por ejemplo, purificada de plasma humano o expresión recombinante.

Además o alternativamente, el proceso de cribado para determinar la presencia y afinidad de anticuerpos anti-TTR puede comprender las etapas de un ensayo de inmunorreactividad de placa amiloide de tejido sensible (TAPIR) tal como se describe en la solicitud internacional WO 2004/095031. Además, o alternativamente, se pueden realizar cribados en secciones renales, de corazón para detectar la unión a anti-TTR, tal como se describe por analogía en la solicitud internacional WO 2008/081008 para secciones de cerebro y médula espinal.

Como se mencionó anteriormente, debido a su generación tras una respuesta inmune humana, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención reconocerá epítopos que son de particular relevancia patológica y que podrían no ser accesibles o menos inmunogénicos en el caso de procesos de inmunización para la generación de, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón y cribado in vitro de bibliotecas de presentación en fagos, respectivamente. Por consiguiente, es prudente estipular que el epítopo del anticuerpo anti-TTR humano de la presente invención es único y que no existe ningún otro anticuerpo que sea capaz de unirse al epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención; véase también la Figura 10. Una indicación adicional de la unicidad de los anticuerpos de la presente invención es el hecho de que, como se indica en el Ejemplo 8, los anticuerpos NI-301.59F1, NI-301.35G11 y NI-301.37F1 de la presente invención se unen a epítopos que son específicos para la conformación de TTR mal plegada, mal ensamblada y/o agregada, que como se indicó anteriormente, son de particular relevancia patológica y pueden no ser obtenibles mediante los procesos habituales para la generación de anticuerpos, tales como inmunización o cribados de bibliotecas in vitro.

Por lo tanto, en una realización, la presente invención también se extiende generalmente a anticuerpos anti-TTR y moléculas de unión a TTR que compiten con el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención por la unión específica a TTR. La presente invención se dirige más específicamente a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del mismo, en el que el anticuerpo se une específicamente al mismo epítopo de TTR como anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en NI-301.59F1, NI- 301.35G11, NI-301.37F1 y/o NI-301.12D3.

Además, en una realización, la presente invención también se extiende generalmente a anticuerpos anti-TTR y moléculas de unión a TTR que compiten con el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención por la unión específica a especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas o fragmentos de las mismas. Por lo tanto, la presente invención también se dirige más específicamente a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del mismo, en el que el anticuerpo se une específicamente al mismo epítopo de especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas o agregadas o fragmentos de las mismas como un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo formado por NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 y/o NI-301.12D3.

La competencia entre anticuerpos se determina mediante un ensayo en el que la inmunoglobulina bajo prueba inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como TTR. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto (RIA) en fase sólida, inmunoensayo enzimático directo o indirecto (EIA) en fase sólida, ensayo de competición en sándwich; véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; EIA con biotina-avidina directo en fase sólida; véase Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619 y Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552; ensayo marcado directo en fase sólida, ensayo en sándwich marcado directo en fase sólida; véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); RIA de marcaje directo en fase sólida utilizando la etiqueta I125; véase Morel et al., Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 y Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Típicamente, dicho ensayo implica el uso de TTR purificada o TTR mal plegada, mal ensamblada o agregada, tal como oligómeros y/o fibrillas de la misma unida a una superficie sólida o células que portan cualquiera de estas, una inmunoglobulina de prueba sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada, es decir el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o células en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Por lo general, la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Preferiblemente, el ensayo de unión competitiva se realiza en las condiciones descritas para el ensayo ELISA en los Ejemplos adjuntos. Los anticuerpos identificados por ensayo de competición (anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que se produzca un impedimento estérico. Normalmente, cuando un anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos un 50% o un 75%. Por lo tanto, la presente invención se dirige además a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del mismo, en el que el anticuerpo inhibe competitivamente un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-305.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI.301.44E4, NI-301.18C4 NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 y/o NI-301.14C3 de la unión a TTR.

Además, la presente invención se relaciona además con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados del mismo, en el que el anticuerpo inhibe competitivamente un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-305.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.44E4 NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 y/o NI-301.14C3 de la unión a especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas o agregadas o fragmentos de las mismas.

Una inmunoglobulina o su ADNc codificante se puede modificar adicionalmente. Por lo tanto, en una realización adicional, el método de la presente invención comprende una cualquiera de la etapa o etapas para producir un anticuerpo quimérico, anticuerpo murinizado, anticuerpo monocatenario, fragmento Fab, anticuerpo biespecífico, anticuerpo de fusión, anticuerpo marcado o un análogo de cualquiera de esos. Los métodos correspondientes son conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor (1988). Cuando se obtienen derivados de dichos anticuerpos mediante la técnica de presentación en fagos, se puede usar la resonancia de plasmón de superficie como se emplea en el sistema BIAcore para aumentar la eficiencia de los anticuerpos de fagos que se unen al mismo epítopo que el de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). La producción de anticuerpos quiméricos se describe, por ejemplo, en la solicitud internacional WO 89/09622. Los métodos para la producción de anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en la solicitud europea EP-A1 0 239 400 y la solicitud internacional WO 90/07861. Otras fuentes de anticuerpos a utilizar de acuerdo con la presente invención son los denominados anticuerpos xenogénicos. El principio general para la producción de anticuerpos xenogénicos tales como anticuerpos de tipo humano en ratones se describe, por ejemplo, en las solicitudes internacionales WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 y WO 96/33735. Como se discutió anteriormente, el anticuerpo de la invención puede existir en una variedad de formas además de los anticuerpos completos; incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)² , así como en cadenas sencillas; véase por ejemplo la solicitud internacional WO 88/09344. Por lo tanto, en una realización, se proporciona el anticuerpo de la presente invención, que se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv), un fragmento F (ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')².

Los anticuerpos de la presente invención o sus correspondientes cadena o cadenas de inmunoglobulina se pueden modificar adicionalmente usando técnicas convencionales conocidas en el arte, por ejemplo, usando eliminación o eliminaciones, inserción o inserciones, sustitución o sustituciones, adición o adiciones y/o recombinación o recombinaciones y/o cualquier otra modificación o modificaciones de aminoácidos conocidas en la técnica ya sea solas o en combinación. Los métodos para introducir tales modificaciones en la secuencia de ADN subyacente a la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina son bien conocidos por los expertos en la técnica; véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1994). Las modificaciones del anticuerpo de la invención incluyen derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluidas modificaciones de la cadena lateral, modificaciones de la estructura principal y modificaciones del extremo terminal N y C que incluyen acetilación, hidroxilación, metilación, amidación y unión de fracciones de carbohidratos o lípidos, cofactores y similares. Asimismo, la presente invención abarca la producción de proteínas quiméricas que comprenden el anticuerpo descrito o algún fragmento del mismo en el extremo terminal amino fusionado con una molécula heteróloga tal como un ligando inmunoestimulador en el extremo terminal carboxilo; véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO 00/30680 para los detalles técnicos correspondientes.

Dichos anticuerpos y moléculas de unión se pueden analizar para determinar su especificidad y afinidad de unión mediante ELISA e inmunohistoquímica como se describe en el presente documento, véanse, por ejemplo, los Ejemplos. Estas características de los anticuerpos y las moléculas de unión también pueden probarse mediante transferencia Western.

El ejemplo anticuerpo humano NI-301.37F1 mostró una tinción prominente de TTR mal plegada en secciones de la biopsia de piel del paciente con FAP pero no mostró tinción en el páncreas de control sano, en el que las células alfa pancreáticas muestran expresión endógena de TTR, es decir, TTR nativa (véase Ejemplo 8 y Figura 9). Los ejemplos de anticuerpos NI-301.35G11 y NI-301.37F1 de la presente invención también produjeron resultados positivos en tejido de ratón con FAP que mostraban depósitos de TTR anormales en varios tejidos, incluido el intestino; véase la Figura 8. Esta especificidad de unión hacia formas patológicas de TTR en tejido humano y animal enfatiza, además de los experimentos bioquímicos mostrados en este documento (véase la Figura 10), la posibilidad de utilizar los anticuerpos de la presente invención en el tratamiento y diagnóstico de enfermedades asociadas con la amiloidosis por TTR, que se produce preferiblemente debido a la aparición de especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas y/o fragmentos, derivados de las mismas.

Como alternativa a la obtención de inmunoglobulinas directamente a partir del cultivo de células B o células B de memoria, las células se pueden utilizar como fuente de loci de cadena pesada y cadena ligera reorganizados para expresión y/o manipulación genética posteriores. Los genes de anticuerpos reordenados se pueden transcribir de forma inversa a partir de ARNm apropiados para producir ADNc. Si se desea, la región constante de la cadena pesada puede cambiarse por la de un isotipo diferente o eliminarse por completo. Las regiones variables se pueden unir para codificar regiones Fv de cadena sencilla. Pueden unirse múltiples regiones Fv para conferir capacidad de unión a más de una combinación de cadena pesada y ligera objetivo o quimérica. Una vez que el material genético está disponible, el diseño de análogos como se describió anteriormente que conservan su capacidad para unirse al objetivo deseado es sencillo. Los expertos en la técnica conocen métodos para la clonación de regiones variables de anticuerpos y la generación de anticuerpos recombinantes son conocidos por el experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792.

Una vez que se obtiene el material genético apropiado y, si se desea, se modifica para codificar un análogo, las secuencias codificantes, incluidas las que codifican, como mínimo, las regiones variables de la cadena pesada y ligera, se pueden insertar en sistemas de expresión contenidos en vectores que pueden transfectarse en células huésped recombinantes estándar. Puede usarse una variedad de tales células huésped; para un procesamiento eficaz, sin embargo, se prefieren las células de mamífero. Las líneas celulares de mamífero típicas útiles para este propósito incluyen, pero no se limitan a, células CHO, células HEK 293 o células NSO.

La producción del anticuerpo o análogo se emprende luego cultivando el hospedador recombinante modificado en condiciones de cultivo apropiadas para el crecimiento de las células huésped y la expresión de las secuencias codificantes. Luego, los anticuerpos se recuperan aislándolos del cultivo. Los sistemas de expresión se diseñan preferiblemente para incluir péptidos señal de modo que los anticuerpos resultantes se secreten al medio; sin embargo, también es posible la producción intracelular.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica el anticuerpo de la presente invención, en el caso del anticuerpo, preferiblemente al menos una región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo descrito anteriormente. Normalmente, dicha región variable codificada por el polinucleótido comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la Vh y/o la Vl de la región variable de dicho anticuerpo. En una realización de la presente invención, el polinucleótido es un ADNc.

La persona experta en la técnica apreciará fácilmente que el dominio variable del anticuerpo que tiene el dominio variable descrito anteriormente puede usarse para la construcción de otros polipéptidos o anticuerpos de la especificidad y función biológica deseadas. La persona experta en la técnica sabe que la afinidad de unión se puede mejorar haciendo sustituciones de aminoácidos dentro de las CDR o dentro de los bucles hipervariables (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) que se solapan parcialmente con las CDR definidas por Kabat; véase, por ejemplo, Riechmann, et al., Nature 332 (1988), 323-327. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a anticuerpos en los que una o más de las CDR mencionadas comprenden una o más, preferiblemente no más de dos sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, el anticuerpo de la invención comprende en una o ambas de sus cadenas de inmunoglobulina dos o las tres CDR de las regiones variables como se establece en la Figura 1.

Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de las mismas de la invención, como lo conocen los expertos en la técnica, pueden comprender una región constante que media una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a una región constante del anticuerpo puede activar el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar involucrada en la hipersensibilidad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a receptores en varias células a través de la región Fc, con un sitio de unión al receptor Fc en la región Fc del anticuerpo que se une a un receptor Fc (FcR) en una célula. Hay una serie de receptores Fc que son específicos para diferentes clases de anticuerpos, incluidos IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a los receptores Fc en la superficies celulares desencadenan una serie de respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen la absorción y destrucción de partículas recubiertas de anticuerpos, la eliminación de complejos inmunes, la lisis de células objetivo recubiertas de anticuerpos por células asesinas (llamada citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulina.

En consecuencia, ciertas realizaciones de la presente invención incluyen un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, en el que al menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante se ha eliminado o alterado de otra manera para proporcionar las características bioquímicas deseadas, tales como funciones efectoras reducidas, la capacidad de dimerizar de forma no covalente, una mayor capacidad para localizar en el sitio de agregación y deposición de TTR, una semivida reducida en suero o una mayor semivida en suero en comparación con un anticuerpo completo no alterado de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, ciertos anticuerpos para usar en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en este documento son anticuerpos con dominio suprimido que comprenden una cadena polipeptídica similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que carecen de al menos una porción de uno o más dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en ciertos anticuerpos, se eliminará un dominio completo de la región constante del anticuerpo modificado, por ejemplo, se eliminará todo o parte del dominio CH2. En otras realizaciones, ciertos anticuerpos para usar en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en este documento tienen una región constante, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de IgG, que se altera para eliminar la glicosilación, denominada en otras partes del presente documento como anticuerpos aglicosilados o "ágli". Dichos anticuerpos "ágli" se pueden preparar enzimáticamente así como mediante modificación del sitio o sitios de glicosilación de consenso en la región constante. Aunque no está limitado por la teoría, se cree que los anticuerpos "ágli" pueden tener un perfil de seguridad y estabilidad mejorado in vivo. Los métodos para producir anticuerpos aglicosilados que tienen la función efectora deseada se encuentran, por ejemplo, en la solicitud internacional WO 2005/018572.

En ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en el presente documento, la porción Fc se puede mutar para disminuir la función efectora usando técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, la eliminación o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión al receptor Fc del anticuerpo modificado circulante aumentando de ese modo la localización de TTR. En otros casos, puede ser que las modificaciones de regiones constantes consistentes con la presente invención moderen la unión del complemento y reduzcan así la semivida en suero y la asociación inespecífica de una citotoxina conjugada. Aún se pueden usar otras modificaciones de la región constante para modificar enlaces disulfuro o fracciones de oligosacáridos que permitan una localización mejorada debido a una mayor especificidad antigénica o flexibilidad del anticuerpo. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tales como la localización de TTR, la biodistribución y la semivida en suero, pueden medirse y cuantificarse fácilmente utilizando técnicas inmunológicas bien conocidas sin experimentación excesiva.

En ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en el presente documento, la porción Fc puede mutarse o intercambiarse por secuencias de proteínas alternativas para aumentar la captación celular de anticuerpos a modo de ejemplo mejorando la endocitosis mediada por receptores de anticuerpos a través de receptores Fcy, LRP o receptores Thy1 o mediante la 'Tecnología de Super Anticuerpos', que se dice que permite que los anticuerpos se transporten a las células vivas sin dañarlas (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241). Por ejemplo, la generación de proteínas de fusión de la región de unión del anticuerpo y los ligandos de proteínas afines de los receptores de la superficie celular o anticuerpos bi o multiespecíficos con secuencias específicas que se unen a TTR, así como a un receptor de la superficie celular, se pueden modificar usando técnicas conocidas en el arte.

En ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en el presente documento, la porción Fc puede mutarse o intercambiarse por secuencias de proteínas alternativas o el anticuerpo puede modificarse químicamente para aumentar su penetración en la barrera hematoencefálica.

Las formas modificadas de anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención se pueden preparar a partir de anticuerpos precursores o parentales completos usando técnicas bien conocidas en el arte. Los ejemplos de técnicas se discuten con más detalle en este documento. Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención se pueden preparar o fabricar usando técnicas que son conocidas en el arte. En determinadas realizaciones, las moléculas de anticuerpo o sus fragmentos se "producen de forma recombinante", es decir, se producen utilizando tecnología de ADN recombinante.

Los ejemplos de técnicas para fabricar moléculas de anticuerpo o fragmentos de las mismas se describen con más detalle en otra parte del presente documento.

Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también incluyen derivados que se modifican, por ejemplo, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de manera que la unión covalente no evita que el anticuerpo se una específicamente a su epítopo afín. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

En realizaciones preferidas particulares, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención no provocarán una respuesta inmunitaria deletérea en el animal a tratar, por ejemplo, en un ser humano. En determinadas realizaciones, las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, o sus fragmentos de unión a antígenos de la invención se derivan de un paciente, por ejemplo, un paciente humano, y se utilizan posteriormente en la misma especie de la que se derivan, por ejemplo, un humano, aliviando o minimizando la aparición de respuestas inmunes deletéreas.

La desinmunización también se puede usar para disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Como se usa en el presente documento, el término "desinmunización" incluye la alteración de un anticuerpo para modificar los epítopos de las células T; véanse, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO 98/52976 y W o 00/34317. Por ejemplo, se analizan las secuencias de Vh y Vl del anticuerpo de partida y se "mapea" un epítopo de células T humanas de cada región V que muestra la ubicación de los epítopos en relación con las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Los epítopos de células T individuales del mapa de epítopos de células T se analizan para identificar sustituciones de aminoácidos alternativas con un riesgo bajo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se diseña una gama de secuencias de Vh y Vl alternativas que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias se incorporan posteriormente en una gama de polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de TTR o fragmentos inmunoespecíficos de los mismos para su uso en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en este documento que luego se prueban para su funcionamiento. Normalmente, se generan y prueban entre 12 y 24 variantes de anticuerpos. A continuación, se clonan genes completos de cadena pesada y ligera que comprenden regiones V y C humanas modificadas en vectores de expresión y los plásmidos posteriores se introducen en líneas celulares para la producción de anticuerpo completo. A continuación, los anticuerpos se comparan en ensayos bioquímicos y biológicos apropiados y se identifica la variante óptima.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando una amplia variedad de técnicas conocidas en el arte, incluido el uso de tecnologías de presentación en hibridomas, recombinantes y fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridomas, incluidas las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988); Hammerling et al., En: Monoclonal Antibodies and T-Cel1Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981). El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluido cualquier clon eucariota, procariota o fago, y no al método mediante el cual se produce. Por tanto, el término "anticuerpo monoclonal" no se limita a los anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridomas. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención se derivan de células B humanas que se han inmortalizado mediante transformación con el virus de Epstein-Barr, como se describe en el presente documento.

En el proceso de hibridoma bien conocido (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495) los linfocitos de vida relativamente corta, o mortales, de un mamífero, por ejemplo, células B derivadas de un sujeto humano como se describe en el presente documento, se fusionan con una línea celular tumoral inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma), produciendo así células híbridas o "hibridomas" que son tanto inmortales como capaces de producir el anticuerpo codificado genéticamente de la célula B. Los híbridos resultantes se segregan en cepas genéticas individuales mediante selección, dilución y rebrote con cada cepa individual que comprende genes específicos para la formación de un solo anticuerpo. Producen anticuerpos, que son homogéneos contra un antígeno deseado y, en referencia a su parentesco genético puro, se denominan "monoclonales".

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Los expertos en la técnica apreciarán que los reactivos, las líneas celulares y los medios para la formación, selección y crecimiento de hibridomas están disponibles comercialmente a partir de varias fuentes y los protocolos estandarizados están bien establecidos. Generalmente, el medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales contra el antígeno deseado. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante ensayos in vitro tales como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) como se describe en el presente documento. Una vez identificadas las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitativa y cultivarse mediante métodos estándar; véase, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), 59-103. Se apreciará además que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden separarse del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos de purificación convencionales tales como, por ejemplo, proteína A, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

En otra realización, los linfocitos pueden seleccionarse mediante micromanipulación y aislarse los genes variables. Por ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica pueden aislarse de un mamífero inmunizado o naturalmente inmune, por ejemplo, un ser humano, y cultivarse durante aproximadamente 7 días in vitro. Los cultivos se pueden cribar para detectar IgG específicas que cumplan con los criterios de cribado. Se pueden aislar células de pozos positivos. Las células B productoras de Ig individuales pueden aislarse mediante FACS o identificándolas en un ensayo de placa hemolítica mediado por complemento. Las células B productoras de Ig pueden micromanipularse en un tubo y los genes de Vh y Vl pueden amplificarse usando, por ejemplo, RT-PCR. Los genes de Vh y Vl pueden clonarse en un vector de expresión de anticuerpos y transfectarse en células (por ejemplo, células eucariotas o procariotas) para su expresión.

Alternativamente, las líneas celulares productoras de anticuerpos pueden seleccionarse y cultivarse usando técnicas bien conocidas por el experto en la materia. Estas técnicas se describen en una variedad de manuales de laboratorio y publicaciones primarias. A este respecto, las técnicas adecuadas para su uso en la invención, como se describe a continuación, se describen en Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates y Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, Nueva York (1991), incluidos los suplementos.

Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos pueden generarse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab^')2 pueden producirse de forma recombinante o mediante escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')²). Los fragmentos F(ab^')2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. Tales fragmentos son suficientes para su uso, por ejemplo, en procedimientos de inmunodiagnóstico que implican el acoplamiento de las porciones inmunoespecíficas de inmunoglobulinas para la detección de reactivos tales como radioisótopos.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o preferiblemente mediante técnicas de expresión recombinante como se describe en el presente documento.

En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la invención comprende una región constante sintética en la que uno o más dominios están parcial o totalmente eliminados ("anticuerpos con dominio eliminado"). En determinadas realizaciones, los anticuerpos modificados compatibles comprenderán constructos o variantes de dominio eliminado en los que se ha eliminado todo el dominio CH2 (constructos ACH2). Para otras realizaciones, un péptido de conexión corto puede sustituirse por el dominio eliminado para proporcionar flexibilidad y libertad de movimiento para la región variable. Los expertos en la técnica apreciarán que tales constructos son particularmente preferidos debido a las propiedades reguladoras del dominio CH2 sobre la tasa catabólica del anticuerpo. Los constructos de dominio eliminado pueden derivarse usando un vector que codifica un dominio constante humano de IgG-i, véanse, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO 02/060955 y WO 02/096948A2. Este vector está modificado para eliminar el dominio CH2 y proporcionar un vector sintético que expresa una región constante de IgG¹ con el dominio eliminado.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la presente invención son minicuerpos. Se pueden fabricar minicuerpos usando métodos descritos en la técnica, véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5.837.821 o la solicitud internacional WO 94/09817.

En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la invención comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene eliminación o sustitución de unos pocos o incluso de un solo aminoácido siempre que permita la asociación entre subunidades monoméricas. Por ejemplo, la mutación de un solo aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión de Fc y por tanto aumentar la localización de TTR. De manera similar, puede ser deseable eliminar simplemente la parte de uno o más dominios de región constante que controlan la función efectora (por ejemplo, la unión del complemento) a modular. Tales eliminaciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (semivida en suero) mientras dejan intactas otras funciones deseables asociadas con el dominio de la región constante objetivo. Además, como se mencionó anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden ser sintéticas mediante la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que mejoran el perfil del constructo resultante. A este respecto, puede ser posible interrumpir la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ejemplo, unión de Fc) mientras se mantiene sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Otras realizaciones más comprenden la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables tales como una función efectora o proporcionar más unión de citotoxina o carbohidrato. En tales realizaciones, puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas derivadas de dominios de región constante seleccionados.

La presente invención también proporciona anticuerpos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, variantes (incluyendo derivados) de moléculas de anticuerpos (por ejemplo, las regiones Vh y/o regiones Vl) descritas en el presente documento, cuyos anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen inmunoespecíficamente a TTR. Pueden usarse técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, que incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR que dan como resultado sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, las variantes (incluidos los derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos., menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con respecto a la región VH de referencia, Vh-CDR1, Vh-CDR2, Vh-CDR3, región Vl, Vl-CDR1, Vl-CDR2 o Vl-CDR3. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Alternativamente, las mutaciones se pueden introducir aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden cribar en busca de actividad biológica para identificar mutantes que retienen la actividad (por ejemplo, la capacidad de unirse a TTR y/o especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas o agregadas y/o fragmentos de las mismas).

Por ejemplo, es posible introducir mutaciones solo en regiones marco o solo en regiones CDR de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser mutaciones silenciosas o neutrales sin sentido, por ejemplo, que tengan poco o ningún efecto sobre la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno; de hecho, algunas de estas mutaciones no alteran la secuencia de aminoácidos en absoluto. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones o mejorar la producción de anticuerpos de un hibridoma. Las regiones codificantes de codón optimizado que codifican anticuerpos de la presente invención se describen en otra parte del presente documento. Alternativamente, las mutaciones de sentido erróneo no neutrales pueden alterar la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno. Es probable que la ubicación de la mayoría de las mutaciones de sentido erróneo silenciosas y neutrales esté en las regiones marco, mientras que la ubicación de la mayoría de las mutaciones de sentido erróneo no neutrales es probable que estén en CDR, aunque esto no es un requisito absoluto. Un experto en la técnica sería capaz de diseñar y probar moléculas mutantes con propiedades deseadas tales como ninguna alteración en la actividad de unión a antígeno o alteración en la actividad de unión (por ejemplo, mejoras en la actividad de unión a antígeno o cambio en la especificidad del anticuerpo). Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de forma rutinaria y la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada (por ejemplo, capacidad para unirse inmunoespecíficamente al menos a un epítopo de TTR y/o especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas o agregadas y/o fragmentos de las mismas) pueden determinarse usando técnicas descritas en el presente documento o modificando rutinariamente técnicas conocidas en el arte.

III. Polinucleótidos que codifican anticuerpos

Un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto de ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, a Rn monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede estar compuesto por regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo también puede contener una o más bases modificadas o cadenas principales de ADN o ARN modificadas para estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se pueden realizar diversas modificaciones en el ADN y el ARN; por lo tanto, "polinucleótido" abarca formas modificadas química, enzimática o metabólicamente.

Se puede crear un polinucleótido aislado que codifica una variante no natural de un polipéptido derivado de una inmunoglobulina (por ejemplo, una porción de cadena pesada o porción de cadena ligera de inmunoglobulina) introduciendo una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la inmunoglobulina de manera que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos conservadoras se realizan en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales.

Como es bien conocido, el ARN puede aislarse de las células B originales, células de hibridoma o de otras células transformadas mediante técnicas estándar, tales como extracción y precipitación con isotiocianato de guanidinio seguido de centrifugación o cromatografía. Cuando sea deseable, el ARNm puede aislarse del ARN total mediante técnicas estándar tales como cromatografía en oligo dT celulosa. Las técnicas adecuadas son familiares en el arte. En una realización, los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo pueden prepararse, simultáneamente o por separado, usando transcriptasa inversa y ADN polimerasa de acuerdo con métodos bien conocidos. La PCR puede iniciarse mediante cebadores de región constante de consenso o mediante cebadores más específicos basados en las secuencias de aminoácidos y ADN de cadena pesada y ligera publicadas. Como se discutió anteriormente, la PCR también se puede usar para aislar clones de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo. En este caso, las bibliotecas se pueden cribar mediante cebadores de consenso o sondas homólogas más grandes, tales como sondas de región constante humana.

El ADN, típicamente ADN plasmídico, puede aislarse de las células usando técnicas conocidas en el arte, mapearse por restricción y secuenciarse de acuerdo con técnicas estándar bien conocidas expuestas en detalle, por ejemplo, en las referencias anteriores relacionadas con técnicas de ADN recombinante. Por supuesto, el ADN puede ser sintético de acuerdo con la presente invención en cualquier momento durante el proceso de aislamiento o análisis posterior.

En este contexto, la presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica al menos el dominio de unión o la región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo de la presente invención. En una realización, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada (Vh) de inmunoglobulina.

En otra realización, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera (Vl) de inmunoglobulina.

En otra realización, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina en la que las regiones H-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 tienen secuencias polipeptídicas que son idénticas a los grupos Vh-CDR1, Vh-CDR2 y Vh-CDR3 mostrados en la Figura 1.

En una realización preferida de la presente invención, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótidos de la región Vh o Vl de un anticuerpo anti-TTR y/o un anticuerpo que reconoce especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas o agregadas y/o fragmentos de las mismas como se muestra en la Tabla II. A este respecto, el experto en la técnica apreciará fácilmente que los polinucleótidos que codifican al menos el dominio variable de la cadena ligera y/o pesada pueden codificar el dominio variable de ambas cadenas de inmunoglobulina o solo una. Por lo tanto, en una realización, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótidos de la región Vh y Vl de un anticuerpo anti-TTR que reconoce especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas o agregadas y/o fragmentos de las mismas como se representa en la Tabla II.

Tabla II: Secuencias de nucleótidos de la región Vh y Vl de anticuerpos que reconocen especies de TTR mutadas, m l l m l n m l r fr m n l mi m .

Debido a la estrategia de clonación, la secuencia de aminoácidos en los extremos N y C de la cadena pesada y las cadenas ligeras puede contener alteraciones inducidas por cebadores en FR1 y FR4, que sin embargo no afectan sustancialmente a la actividad biológica del anticuerpo. Para proporcionar un anticuerpo humano de consenso, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del clon original pueden alinearse y ajustarse de acuerdo con las secuencias de la región variable de la línea germinal humana pertinentes en la base de datos; véase, por ejemplo, Vbase2, como se describió anteriormente. La secuencia de aminoácidos de los anticuerpos humanos se indica en negrita cuando se considera que los aminoácidos del extremo terminal N y C se desvían potencialmente de la secuencia de la línea germinal de consenso debido al cebador de PCR y, por lo tanto, han sido reemplazados por la corrección de mutación inducida por cebador (PIMC), véase la Tabla III. En consecuencia, en una realización de la presente invención, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que tiene una secuencia polinucleotídica de la VH como se muestra en la Tabla III y la región VL correspondiente de un anticuerpo anti-TTR como se muestra en Tabla II.

Tabla III: Secuencias de nucleótidos de la región Vh y Vl de anticuerpos que reconocen especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas o agregadas y/o fragmentos de las mismas que muestran reemplazo por PIMC ne rita .

La presente invención también incluye fragmentos de los polinucleótidos de la invención, como se describe en otra parte. Además, la invención también contempla polinucleótidos que codifican polinucleótidos de fusión, fragmentos Fab y otros derivados, como se describe en el presente documento.

Los polinucleótidos se pueden producir o fabricar mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, se puede ensamblar un polinucleótido que codifica el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente, por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., BioTechniques 17 (1994), 242, que, brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, hibridación y ligado de esos oligonucleótidos, y luego amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.

Alternativamente, se puede generar un polinucleótido que codifica un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo a partir de ácido nucleico de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo en particular no está disponible, pero se conoce la secuencia de la molécula del anticuerpo, se puede sintetizar u obtener químicamente un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos, o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, preferiblemente ARN poliA+, aislado de cualquier tejido o células que expresen el anticuerpo específico de TTR, tal como las células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos hibridables con los extremos 31 y 51 de la secuencia o mediante clonación usando una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia genética particular para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden luego clonarse en vectores de clonación replicables usando cualquier método bien conocido en la técnica. Por consiguiente, en una realización de la presente invención, el ADNc que codifica un anticuerpo, cadena de inmunoglobulina o fragmento del mismo se usa para la producción de un anticuerpo anti-TTR.

Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente del anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, su secuencia de nucleótidos puede manipularse usando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1990) y Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998)), para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, eliminaciones y/o o inserciones de aminoácidos.

IV. Expresión de polipéptidos de anticuerpos

Después de la manipulación del material genético aislado para proporcionar anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos se insertan típicamente en un vector de expresión para su introducción en las células huésped que pueden usarse para producir la cantidad deseada de anticuerpo. En el presente documento se describe la expresión recombinante de un anticuerpo, o fragmento, derivado o análogo del mismo, por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que se une a una molécula objetivo. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o una porción del mismo (que contiene preferiblemente el dominio variable de la cadena pesada o ligera), de la invención, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede ser producido mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en el arte. Por lo tanto, en la presente memoria se describen métodos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo. Pueden usarse métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de anticuerpos y señales apropiadas de control transcripcional y traduccional. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La invención, por tanto, proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera de la misma, o un dominio variable de cadena pesada o ligera, operativamente unido a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO 86/05807 y WO 89/01036; y la patente de los Estados Unidos No. 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en tal vector para la expresión de toda la cadena pesada o ligera.

El término "vector" o "vector de expresión" se usa en el presente documento para referirse a vectores usados de acuerdo con la presente invención como vehículo para introducir y expresar un gen deseado en una célula huésped. Como saben los expertos en la técnica, tales vectores pueden seleccionarse fácilmente del grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente invención comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción apropiados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad de entrar y/o replicarse en células eucariotas o procariotas. Para los propósitos de esta invención, se pueden emplear numerosos sistemas de vectores de expresión. Por ejemplo, una clase de vector utiliza elementos de ADN que se derivan de virus animales tales como virus del papiloma bovino, virus de polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios internos de unión a ribosomas. Además, las células que han integrado el ADN en sus cromosomas pueden seleccionarse introduciendo uno o más marcadores que permitan la selección de células huésped transfectadas. El marcador puede proporcionar prototrofia a un huésped auxotrófico, resistencia a biocidas (por ejemplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados como el cobre. El gen marcador seleccionable puede unirse directamente a las secuencias de ADN a expresar o introducirse en la misma célula mediante cotransformación. También pueden ser necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias señal, señales de empalme, así como promotores, potenciadores y señales de terminación de la transcripción.

En realizaciones particularmente preferidas, los genes de la región variable clonados se insertan en un vector de expresión junto con los genes de la región constante de la cadena pesada y ligera (preferiblemente humanos) como se discutió anteriormente. Este vector contiene el promotor/potenciador del citomegalovirus, el promotor principal de la beta globina de ratón, el origen de replicación de SV40, la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, exón 1 y exón 2 de neomicina fosfotransferasa, el gen de la dihidrofolato reductasa y la secuencia líder. Se ha encontrado que este vector da como resultado un nivel muy alto de expresión de anticuerpos tras la incorporación de genes de región variable y constante, transfección en células CHO, seguida de selección en medio que contiene G418 y amplificación con metotrexato. Por supuesto, en la presente invención puede usarse cualquier vector de expresión que sea capaz de provocar expresión en células eucariotas. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, los plásmidos pcADN3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, y pZeoSV2 (disponibles a través de Invitrogen, San Diego, CA) y plásmido pCI (disponible a través de Promega, Madison, WI). En general, el cribado de un gran número de células transformadas en busca de aquellas que expresan niveles adecuadamente altos si las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, es una experimentación de rutina que se puede realizar, por ejemplo, mediante sistemas robóticos. Los sistemas de vectores también se enseñan en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.736.137 y 5.658.570. Este sistema proporciona altos niveles de expresión, por ejemplo, > 30 pg/célula/día. Otros ejemplos de sistemas de vectores se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 6.413.777.

En otras realizaciones preferidas, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden expresarse usando constructos policistrónicos tales como los descritos en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2003-0157641 A1. En estos sistemas de expresión, se pueden producir múltiples productos génicos de interés tales como cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos a partir de un único constructo policistrónico. Estos sistemas usan ventajosamente un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) para proporcionar niveles relativamente altos de anticuerpos. Las secuencias IRES compatibles se describen en la patente de los Estados Unidos No. 6.193.980. Los expertos en la técnica apreciarán que tales sistemas de expresión se pueden usar para producir eficazmente la gama completa de anticuerpos descritos en la presente solicitud. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona un vector que comprende el polinucleótido que codifica al menos el dominio de unión o la región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo, opcionalmente en combinación con un polinucleótido que codifica la región variable de la otra cadena de inmunoglobulina de dicha molécula de unión.

Más en general, una vez que se ha preparado el vector o la secuencia de ADN que codifica una subunidad monomérica del anticuerpo, el vector de expresión puede introducirse en una célula huésped apropiada. La introducción del plásmido en la célula huésped puede realizarse mediante diversas técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, transfección que incluye lipotransfección usando, por ejemplo, Fugene® o lipofectamina, fusión de protoplastos, precipitación con fosfato de calcio, fusión celular con ADN envuelto, microinyección e infección con virus intacto. Normalmente, la introducción del plásmido en el huésped se realiza mediante el método estándar de coprecipitación con fosfato de calcio. Las células huésped que albergan el constructo de expresión se cultivan en condiciones apropiadas para la producción de las cadenas ligeras y pesadas, y se analizan para la síntesis de proteínas de cadena pesada y/o ligera. Los ejemplos de técnicas de ensayo incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o análisis de clasificación de células activado por fluorescencia (FACS), inmunohistoquímica y similares.

El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan luego mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo para su uso en los métodos descritos en el presente documento. Por lo tanto, la invención incluye células huésped que comprenden un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, o al menos el dominio de unión o región variable de una inmunoglobulina del mismo, que preferiblemente son operables unidos a un promotor heterólogo. Además o alternativamente, la invención también incluye células huésped que comprenden un vector, como se definió anteriormente, que comprende un polinucleótido que codifica al menos el dominio de unión o la región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo, opcionalmente en combinación con un polinucleótido que codifica la región variable de la otra cadena de inmunoglobulina de dicha molécula de unión. En realizaciones preferidas para la expresión de anticuerpos de doble cadena, un único vector o vectores que codifican tanto la cadena pesada como la ligera pueden coexpresarse en la célula huésped para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla a continuación.

La célula huésped puede cotransfectarse con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten una expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede usarse un solo vector que codifique polipéptidos de cadena pesada y ligera. En tales situaciones, la cadena ligera se coloca ventajosamente antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica; véase Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 77 (1980), 2197. Las secuencias de codificación de las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Como se usa en este documento, "células huésped" se refiere a células que albergan vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un gen heterólogo. En las descripciones de los procesos para el aislamiento de anticuerpos de huéspedes recombinantes, los términos "célula" y "cultivo celular" se utilizan indistintamente para indicar la fuente del anticuerpo a menos que se especifique claramente lo contrario. En otras palabras, la recuperación del polipéptido de las "células" puede significar tanto a partir de células completas centrifugadas como a partir del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

Se puede utilizar una variedad de sistemas del vector de expresión del huésped para expresar moléculas de anticuerpo para su uso en los métodos descritos en el presente documento. Tales sistemas de expresión del huésped representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus ; el promotor 7.5Kdel virus vaccinia). Preferiblemente, se usan células bacterianas tales como E. coli, y más preferiblemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante completa, para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal del citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos; véase, por ejemplo, Foecking et al., Gene 45 (1986), 101; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2.

La línea de células huésped utilizada para la expresión de proteínas es a menudo de origen mamífero; a los expertos en la técnica se les atribuye la capacidad de determinar preferentemente líneas de células huésped particulares que son las más adecuadas para que el producto génico deseado se exprese en ellas. Los ejemplos de líneas de células huésped incluyen, pero no se limitan a, CHO (ovario de hámster chino), DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, DHFR menos), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (línea de riñón de mono), COS (un derivado de CVI con antígeno T de s V40), VERY, BHK (riñón de hámster bebé), MDCK, WI38, R1610 (fibroblasto de hámster chino), BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón), HAK (línea de riñón de hámster), SP2/O (mieloma de ratón), P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-1c1BPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocito humano) y 293 (riñón humano). Se prefieren particularmente las células CHO y 293. Las líneas de células huésped están disponibles típicamente en servicios comerciales, la American Tissue Culture Collection o en la literatura publicada.

Además, se puede elegir una cepa de célula huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico de la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Las diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación postraduccionales de proteínas y productos génicos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína foránea expresada. Con este fin, pueden usarse células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, glicosilación y fosforilación del producto génico.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden diseñarse líneas celulares que expresan de manera estable la molécula de anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células huésped se pueden transformar con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN foráneo, se puede permitir que las células modificadas crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para modificar líneas celulares que expresen de manera estable la molécula de anticuerpo.

Pueden usarse varios sistemas de selección, que incluyen pero no se limitan a la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223), genes de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202), y de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817) pueden emplearse en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, la resistencia a los antimetabolitos se puede utilizar como base para la selección de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573- 596; Mulligan, Science ^{2 6 0} (1993), 926-932; y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215; e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que se pueden usar se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols en Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981).

Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante amplificación del vector, para una revisión; véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, Nueva York, vol. 3. (1987). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es amplificable, el aumento del nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará; véase Crouse et al., Mol. Cell Biol. 3 (1983), 257.

La producción in vitro permite la ampliación para producir grandes cantidades de los polipéptidos deseados. Las técnicas para el cultivo de células de mamíferos en condiciones de cultivo de tejidos se conocen en la técnica e incluyen cultivo en suspensión homogéneo, por ejemplo, en un reactor de transporte aéreo o en un reactor de agitación continua, o cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, sobre microperlas de agarosa o cartuchos cerámicos. Si es necesario y/o deseado, las soluciones de polipéptidos se pueden purificar por los métodos habituales de cromatografía, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre DEAE-celulosa o cromatografía de (inmuno) afinidad, por ejemplo, después de la biosíntesis preferencial de un polipéptido sintético de la región bisagra o antes o después de la etapa de cromatografía HIC descrita en el presente documento.

Los genes que codifican anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden expresarse en células de no mamíferos tales como bacterias o insectos o células de levadura o de plantas. Las bacterias que absorben fácilmente ácidos nucleicos incluyen miembros de las Enterobacterias, tales como cepas de E. coli o Salmonella; bacilos, tales como B. subtilis; Pneumococcus; Streptococcus y Haemophilus influenzae. Se apreciará además que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos heterólogos típicamente pasan a formar parte de cuerpos de inclusión. Los polipéptidos heterólogos deben aislarse, purificarse y luego ensamblarse en moléculas funcionales. Cuando se deseen formas tetravalentes de anticuerpos, las subunidades se autoensamblarán en anticuerpos tetravalentes; véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO 02/096948.

En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar ventajosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifiquen fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan, al vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2 (1983), 1791), en el que la secuencia de codificación del anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en el marco con la región codificante lacZ para que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye e Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también se pueden usar para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a una matriz de perlas de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de proteasa de factor Xa o trombina, de modo que el producto del gen objetivo clonado pueda liberarse de la fracción GST.

Además de los procariotas, también se pueden usar microbios eucariotas. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de panadería común, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos eucariotas, aunque hay muchas otras cepas comúnmente disponibles, por ejemplo, Pichia pastoris. Para la expresión en Saccharomyces, el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsman et al., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al., Gene 10 (1980), 157) se usa comúnmente. Este plásmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85 (1977), 12). La presencia de la lesión de trpl como característica del genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.

En un sistema de insectos, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa típicamente como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina).

Una vez que una molécula de anticuerpo de la invención se ha expresado de manera recombinante, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligeras y pesadas individuales u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención, pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de la proteína A, y cromatografía en columna de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, por ejemplo precipitación con sulfato de amonio, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas; véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, N.Y. (1982). Alternativamente, un método preferido para aumentar la afinidad de los anticuerpos de la invención se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos No. 2002-0123057 A1. Por lo tanto, en una realización, la presente invención también proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-TTR o un anticuerpo que reconoce especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas o agregadas y/o fragmentos de las mismas o cadena o cadenas de inmunoglobulina de las mismas, comprendiendo dicho método:

(a) cultivar la célula huésped como se definió aquí anteriormente, célula que comprende un polinucleótido o un vector como se definió aquí anteriormente; y

(b) aislar dicho anticuerpo o cadena o cadenas de inmunoglobulina del mismo del cultivo.

Además, en una realización, la presente invención también se refiere a un anticuerpo o cadena o cadenas de inmunoglobulina del mismo codificado por un polinucleótido como se definió aquí anteriormente u obtenible mediante el método para preparar un anticuerpo anti-TTR.

V. Proteínas de fusión y conjugados

En determinadas formas de realización, el polipéptido del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos o una o más fracciones que normalmente no están asociadas con un anticuerpo. A continuación se describen ejemplos de modificaciones con más detalle. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo Fv de cadena sencilla de la invención puede comprender una secuencia enlazadora flexible o puede modificarse para añadir una fracción funcional (por ejemplo, PEG, un fármaco, una toxina o un marcador tal como un marcador fluorescente, radiactivo, enzima, magnético nuclear, metal pesado y similares).

Un polipéptido de anticuerpo de la invención puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una proteína de fusión. Las proteínas de fusión son moléculas quiméricas que comprenden, por ejemplo, un dominio de unión a TTR de inmunoglobulina con al menos un sitio de unión objetivo y al menos una porción heteróloga, es decir, una porción con la que no está unida naturalmente en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que se juntan en el polipéptido de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína pero se colocan en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Las proteínas de fusión se pueden crear, por ejemplo, mediante síntesis química, o creando y traduciendo un polinucleótido en el que las regiones peptídicas están codificadas en la relación deseada.

El término "heterólogo" tal como se aplica a un polinucleótido o polipéptido, significa que el polinucleótido o polipéptido se deriva de una entidad distinta de la del resto de la entidad con la que se está comparando. Por ejemplo, como se usa en este documento, un "polipéptido heterólogo" que se fusionará con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, variante o análogo del mismo se deriva de un polipéptido no de inmunoglobulina de la misma especie, o un polipéptido de inmunoglobulina o no de inmunoglobulina de una especie diferente. Como se discute con más detalle en otra parte de este documento, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden fusionarse de manera recombinante con un polipéptido heterólogo en el extremo terminal N o C o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden fusionar o conjugar de forma recombinante con moléculas útiles como marcadores en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidos o toxinas; véanse, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; la patente de los Estados Unidos No. 5.314.995; y la solicitud de patente europea EP 0 396387.

Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden estar compuestos de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos, y pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los anticuerpos pueden modificarse mediante procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Tales modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa literatura de investigación. Pueden producirse modificaciones en cualquier parte del anticuerpo, incluida la estructura del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo, o en fracciones tales como carbohidratos. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grados variables en varios sitios de un anticuerpo dado. Además, un anticuerpo dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los anticuerpos pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los anticuerpos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos naturales postraduccionales o pueden obtenerse mediante métodos de síntesis. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por transferencia de ARN a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación; véase, por ejemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York 2a Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, (1983) 1-12; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646; Rattan etal., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48- 62).

La presente invención también proporciona proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un polipéptido heterólogo. La proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos una región Vh de un anticuerpo de la invención y la secuencia de aminoácidos de al menos una región Vl de un anticuerpo de la invención o fragmentos, derivados o variantes del mismo, y un secuencia polipeptídica heteróloga. Preferiblemente, las regiones Vh y Vl de la proteína de fusión corresponden a un anticuerpo de fuente única (o fragmento scFv o Fab) que se une específicamente a TTR. En otra realización más, una proteína de fusión para uso en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en este documento comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de las CDR de Vh de un anticuerpo y la secuencia de aminoácidos de cualquier una, dos, tres o más de las CDR de Vl de un anticuerpo, o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia polipeptídica heteróloga. Preferiblemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de la o las CDR de Vh- o la o las CDR de Vl corresponden a un anticuerpo de fuente única (o fragmento scFv o Fab) de la invención. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas de fusión también están incluidas en la invención.

Los ejemplos de proteínas de fusión reportados en la literatura incluyen fusiones del receptor de células T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD4 (Capon et al., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et al., Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl et al., ADN Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; y Byrn et al., Nature 344 (1990) , 667-670); selectina L (receptor homing) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; y Watson et al., Nature 349 (1991), 164 -167); CD44 (Aruffo et al., Cell 61 (1990), 1303-1313); CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med.

173 (1991), 721-730); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66 (1991) , 1133-1144); receptor de TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; y Peppel et al., J. Exp. Med. 174 ( 1991), 1483-1489 (1991); y receptor a de IgE (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), Resumen No. 1448).

Como se discute en otra parte de este documento, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención se pueden fusionar con polipéptidos heterólogos para aumentar la semivida in vivo de los polipéptidos o para su uso en inmunoensayos usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización, PEG se puede conjugar con los anticuerpos de la invención para aumentar su semivida in vivo; véase, por ejemplo, Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; o Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.

Además, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención se pueden fusionar con secuencias marcadoras, tales como un péptido, para facilitar su purificación o detección. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina (HIS), tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824, por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson et al., Cell 37 (1984), 767), GST, c-myc y la etiqueta "flag"; véase, por ejemplo, Bill Brizzard, BioTechniques 44 (2008) 693-695 para una revisión de las técnicas de marcado de epítopos, y la Tabla 1 en la página 694 enumera las etiquetas de epítopo más comunes utilizables en la presente invención.

Las proteínas de fusión se pueden preparar usando métodos que son bien conocidos en la técnica; véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.116.964 y 5.225.538. El sitio preciso en el que se realiza la fusión puede seleccionarse empíricamente para optimizar las características de secreción o unión de la proteína de fusión. A continuación, el ADN que codifica la proteína de fusión se transfecta en una célula huésped para su expresión, que se realiza como se describió aquí anteriormente.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar en forma no conjugada o se pueden conjugar con al menos una de una variedad de moléculas, por ejemplo, para mejorar las propiedades terapéuticas de la molécula, para facilitar la detección del objetivo, o para obtener imágenes o terapia del paciente. Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden marcarse o conjugarse antes o después de la purificación, cuando se realiza la purificación. En particular, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden conjugarse con agentes terapéuticos, profármacos, péptidos, proteínas, enzimas, virus, lípidos, modificadores de la respuesta biológica, agentes farmacéuticos o PEG.

Los conjugados que son inmunotoxinas que incluyen anticuerpos convencionales se han descrito ampliamente en la técnica. Las toxinas pueden acoplarse a los anticuerpos mediante técnicas de acoplamiento convencionales o pueden producirse inmunotoxinas que contienen porciones de toxina proteica como proteínas de fusión. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse de manera correspondiente para obtener tales inmunotoxinas. Son ilustrativas de tales inmunotoxinas las descritas por Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 y por Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.

Los expertos en la técnica apreciarán que los conjugados también se pueden ensamblar usando una variedad de técnicas dependiendo del agente seleccionado a conjugar. Por ejemplo, se preparan conjugados con biotina, por ejemplo, haciendo reaccionar un polipéptido de unión a TTR con un éster activado de biotina tal como el éster de biotina N-hidroxisuccinimida. De manera similar, se pueden preparar conjugados con un marcador fluorescente en presencia de un agente de acoplamiento, por ejemplo, los enumerados en el presente documento, o mediante reacción con un isotiocianato, preferiblemente isotiocianato de fluoresceína. Los conjugados de los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos, variantes o derivados de los mismos de la invención se preparan de manera análoga.

La presente invención abarca además anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención conjugados con un agente de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos se pueden usar para diagnóstico para, por ejemplo, demostrar la presencia de una amiloidosis por TTR para indicar el riesgo de contraer una enfermedad o trastorno asociado con TTR mal plegada, mal ensamblada o agregada, para controlar el desarrollo o progresión de dicha enfermedad, es decir, una enfermedad que muestre la ocurrencia de, o relacionado con, TTR mal plegada-agregada plegada, mal ensamblada o como parte de un procedimiento de prueba clínica para, por ejemplo, determinar la eficacia de un tratamiento dado y/o régimen de prevención. Por lo tanto, en una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo, que está marcado de forma detectable. Además, en una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo que está unido a un fármaco. La detección puede facilitarse acoplando el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo a una sustancia detectable. Las sustancias o marcadores detectables pueden ser en general una enzima; un metal pesado, preferiblemente oro; un tinte, preferiblemente un tinte fluorescente o luminiscente; o una etiqueta radiactiva. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones que utilizan diversas tomografías por emisión de positrones y iones metálicos paramagnéticos no radiactivos; véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como diagnóstico de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo marcado de forma detectable, en el que el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo y un metal pesado.

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo también puede marcarse de forma detectable acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado con quimioluminiscencia se determina luego detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscentes particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio Theromatic, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Una de las formas en que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo puede marcarse de forma detectable es uniendo el mismo a una enzima y utilizando el producto enlazado en un inmunoensayo enzimático (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA)" Publicación trimestral de Microbiological Associates, Walkersville, Maryland, Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, et al., (Eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokio (1981). La enzima, que está unida al anticuerpo, reaccionará con un sustrato apropiado, preferiblemente un sustrato cromogénico, de tal manera que produzca una fracción químico que pueda detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorimétricos o visuales. Las enzimas que pueden usarse para marcar de manera detectable el anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol de levadura deshidrogenasa, alfa-glicerofosfato, deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina., asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. Además, la detección se puede realizar mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también se puede lograr mediante la comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados de manera similar.

La detección también se puede lograr usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, marcando radiactivamente el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo, es posible detectar el anticuerpo mediante el uso de un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (marzo de 1986)). El isótopo radiactivo se puede detectar mediante medios que incluyen, pero no se limitan a, un contador gamma, un contador de centelleo o autorradiografía.

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo también puede marcarse de forma detectable usando metales que emiten fluorescencia tales como 152Eu, u otros de la serie de lantánidos. Estos metales se pueden unir al anticuerpo utilizando grupos quelantes de metales como el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

Las técnicas para conjugar varias fracciones a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1987) 623-53; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), (1985) 475-506; "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), Academic Press (1985) 303-16, y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158.

Como se mencionó, en ciertas realizaciones, se puede conjugar una fracción que mejora la estabilidad o eficacia de una molécula de unión, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunoespecífico del mismo. Por ejemplo, en una realización, PEG se puede conjugar con las moléculas de unión de la invención para aumentar su semivida in vivo. Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; o Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.

VI. Composiciones y métodos de uso

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden la molécula de unión a TTR mencionada anteriormente, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención o derivado o variante del mismo, o el polinucleótido, vector, célula o péptido de la invención como se definió aquí anteriormente. En una realización, la composición de la presente invención es una composición farmacéutica y además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender agentes adicionales tales como interleucinas o interferones dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica. Para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno que muestra la aparición de, o relacionado con, TTR mutada, mal plegada, mal ensamblada o agregada, tal como amiloidosis por TTR, el agente adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en pequeñas moléculas orgánicas, anticuerpos anti-TTR y combinaciones de los mismos. Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de la molécula de unión a TTR, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, el polinucleótido, el vector o la célula de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico para el tratamiento profiláctico y terapéutico de una enfermedad o trastorno asociado con la amiloidosis por TTR, el seguimiento de la progresión de una enfermedad o trastorno asociado con la amiloidosis por TTR o una respuesta a un tratamiento de amiloidosis por TTR en un sujeto o para determinar el riesgo de un sujeto de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con amiloidosis por TTR.

La presente solicitud describe un método para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por acumulación y/o depósito anormal de TTR y/o TTR mal plegada, mal ensamblada, agregada, mutada en sistemas y órganos afectados tales como sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, sistema nervioso central, sistema gastrointestinal, sistema vascular especialmente leptomeninges, sistema linfoide especialmente los ganglios linfáticos, sistema musculoesquelético especialmente tendones y ligamentos, el corazón, ojos, riñones, pulmones, piel, lengua, glándula tiroides y vejiga cuyo método comprende la administración a una sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las moléculas, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o péptidos de unión a TTR descritos anteriormente de la presente invención.

Una ventaja particular del enfoque terapéutico de la presente invención radica en el hecho de que los anticuerpos recombinantes de la presente invención se derivan de células B o células B de memoria de sujetos humanos sanos sin signos o síntomas de una enfermedad, por ejemplo que portan una mutación asintomática y/o mutaciones, que muestran la aparición o están relacionadas con TTR agregada y, por lo tanto, son, con cierta probabilidad, capaces de prevenir una enfermedad clínicamente manifiesta relacionada con TTR mal plegada, mal ensamblada, mutada y/o agregada, o de disminuir el riesgo de aparición de la enfermedad o trastorno clínicamente manifiesto, o de retrasar la aparición o progresión de la enfermedad o trastorno clínicamente manifiesto. Típicamente, los anticuerpos de la presente invención también han pasado con éxito por la maduración somática, es decir, la optimización con respecto a la selectividad y la eficacia en la unión de alta afinidad a la molécula de TTR objetivo mediante la variación somática de las regiones variables del anticuerpo.

El conocimiento de que tales células in vivo, por ejemplo en un ser humano, no se han activado por medio de proteínas fisiológicas o estructuras celulares relacionadas o de otro tipo en el sentido de una reacción autoinmune o alérgica también es de gran importancia médica, ya que esto significa una probabilidad considerablemente mayor de vivir con éxito las fases de prueba clínica. Por así decirlo, la eficacia, aceptabilidad y tolerabilidad ya se han demostrado antes del desarrollo preclínico y clínico del anticuerpo profiláctico o terapéutico en al menos un sujeto humano. Por lo tanto, se puede esperar que los anticuerpos anti-TTR humanos de la presente invención, tanto su eficacia específica de la estructura objetivo como agente terapéutico como su menor probabilidad de efectos secundarios, aumenten significativamente su probabilidad clínica de éxito.

La presente invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico y de diagnóstico, respectivamente, que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes descritos anteriormente, por ejemplo, anticuerpo anti-TTR, fragmento de unión, derivado o variante del mismo, polinucleótido, vector, célula y/o péptido de la presente invención. Asociado con dicho contenedor o contenedores puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuyo aviso refleja la aprobación de la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana. Además, o alternativamente, el kit comprende reactivos y/o instrucciones para su uso en ensayos de diagnóstico apropiados. La composición, por ejemplo, el kit de la presente invención es, por supuesto, particularmente adecuado para la evaluación de riesgos, el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una enfermedad o trastorno que se acompaña de la presencia de TTR mutada, mal plegada, mal ensamblada y/o agregada, y en particular aplicable para el tratamiento de trastornos generalmente caracterizados por amiloidosis por TTR que comprenden enfermedades y/o trastornos como polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC), amiloidosis sistémica senil (SSA), amiloidosis familiar sistémica, amiloidosis leptomeníngea/del sistema nervioso central (CNS) incluida la enfermedad de Alzheimer, amiloidosis ocular relacionada con TTR, amiloidosis renal relacionada con TTR, hipertiroxinemia relacionada con TTR, amiloidosis de ligamentos relacionada con TTR, incluido el síndrome del túnel carpiano, desgarros del manguito rotador y estenosis espinal lumbar y preeclampsia.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) de la Universidad de Ciencias de Filadelfia, ISBN 0-683-306472. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos pueden formularse por métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede realizarse de diferentes formas, por ejemplo, mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intranasal, tópica o intradérmica o administración espinal o cerebral. Las formulaciones en aerosol, tales como las formulaciones en aerosol nasal, incluyen soluciones acuosas purificadas u otras soluciones del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Preferiblemente, tales formulaciones se ajustan a un pH y un estado isotónico compatibles con las membranas mucosas nasales. Las formulaciones para administración rectal o vaginal se pueden presentar como un supositorio con un vehículo adecuado.

El régimen de dosificación lo determinará el médico tratante y los factores clínicos. Como es bien conocido en la técnica médica, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluido el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se administrará, el sexo, la hora y la vía de administración, la salud general y otros medicamentos administrados al mismo tiempo. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0.001 a 1000 |jg (o de ácido nucleico para la expresión o para la inhibición de la expresión en este intervalo); sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de este ejemplo de intervalo, especialmente teniendo en cuenta los factores antes mencionados. Generalmente, la dosificación puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0.01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1 a 10 mg/kg, preferiblemente al menos 1 mg/kg. También se pretende que las dosis intermedias en los intervalos anteriores estén dentro del alcance de la invención. A los sujetos se les pueden administrar tales dosis diariamente, en días alternativos, semanalmente o de acuerdo con cualquier otro programa determinado por análisis empírico. Un ejemplo de tratamiento implica la administración en múltiples dosis durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los ejemplos regímenes de tratamiento adicionales implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los ejemplos de esquemas de dosificación incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El progreso se puede controlar mediante evaluaciones periódicas. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como el aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluida solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (como los basados en la dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender agentes adicionales tales como dopamina o fármacos psicofarmacológicos, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica.

Además, en una realización preferida de la presente invención, la composición farmacéutica puede formularse como una vacuna, por ejemplo, si la composición farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo de TTR o un fragmento de unión, derivado o variante del mismo para inmunización pasiva. Como se menciona en la sección de antecedentes, las especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas, mutadas y/o agregadas y/o fragmentos o derivados de las mismas son un desencadenante principal de la amiloidosis por TTR. En consecuencia, es prudente esperar que la inmunización pasiva con anticuerpos anti-TTR humanos y moléculas de unión a TTR equivalentes de la presente invención ayude a evitar varios efectos adversos de los conceptos de terapia de inmunización activa y conduzca a una agregación reducida de TTR. Por lo tanto, los presentes anticuerpos anti-TTR y sus equivalentes de la presente invención serán particularmente útiles como vacuna para la prevención o mejora de enfermedades o trastornos que muestren la presencia de, o sean causados por, TTR agregada, tal como polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC), amiloidosis sistémica senil (SSA), amiloidosis familiar sistémica, amiloidosis leptomeníngea/del sistema nervioso central (CNS), incluida la enfermedad de Alzheimer, amiloidosis ocular relacionada con TTR, amiloidosis renal relacionada con TTR, hipertiroxinemia relacionada con TTR, amiloidosis de ligamentos relacionada con TTR que incluye síndrome del túnel carpiano, desgarros del manguito rotador y estenosis espinal lumbar y preeclampsia, por ejemplo.

En una realización, puede ser beneficioso utilizar Fab recombinante (rFab) y fragmentos de cadena sencilla (scFv) del anticuerpo de la presente invención, que podrían penetrar más fácilmente una membrana celular. Por ejemplo, Robert et al., Protein Eng. Des. Sel. (2008); S1741-0134, publicado en línea más adelante, describe el uso de Fab recombinante quimérico (rFab) y fragmentos de cadena sencilla (scFv) del anticuerpo monoclonal WO-2 que reconoce un epítopo en la región del extremo terminal N de Abeta. Los fragmentos modificados fueron capaces de (i) prevenir la fibrilación amiloide, (ii) disgregar fibrillas de Abeta1-42 preformadas y (iii) inhibir la neurotoxicidad mediada por oligómeros Abeta1-42 in vitro tan eficazmente como la molécula de IgG completa. Las ventajas percibidas de utilizar pequeños formatos de anticuerpos modificados con Fab y scFv que carecen de la función efectora incluyen un paso más eficiente a través de la barrera hematoencefálica y minimizar el riesgo de desencadenar reacciones secundarias inflamatorias. Además, a pesar de que scFv y los anticuerpos de dominio único retienen la especificidad de unión de los anticuerpos de longitud completa, pueden expresarse como genes únicos e intracelularmente en células de mamíferos como intracuerpos, con el potencial de alteración del plegamiento, interacciones, modificaciones o localización subcelular de sus objetivos; véase para revisión, por ejemplo, Miller y Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401.

En un enfoque diferente, Muller et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241, describen una plataforma tecnológica, denominada 'Tecnología de Super Anticuerpo', que se dice que permite que los anticuerpos se transporten a las células vivas sin dañarlas. Estos anticuerpos que penetran en las células abren nuevas ventanas diagnósticas y terapéuticas. El término 'TransMab' se ha acuñado para estos anticuerpos.

En una realización adicional, puede ser deseable la administración conjunta o la administración secuencial de otros anticuerpos útiles para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con la aparición de TTR mutada, mal plegada, mal ensamblada y/o agregada. En una realización, el anticuerpo adicional está incluido en la composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos de anticuerpos que pueden usarse para tratar a un sujeto incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos dirigidos a CD33, SGLT2, IL-6 e IL-1.

En una realización adicional, puede ser deseable la administración conjunta o la administración secuencial de otros agentes útiles para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con t Tr mal plegada, mal ensamblada, mutada y/o agregada. En una realización, el agente adicional está incluido en la composición farmacéutica de la presente invención. Ejemplos de agentes que pueden usarse para tratar a un sujeto incluyen, pero no se limitan a: agentes que estabilizan el tetrámero de TTR, tales como Tafamidis Meglumin, diflusinal, doxiciclina con ácido ursodesoxicólico; agentes antiinflamatorios tales como diflusinal, corticosteroides, ácido 2-(2,6-dicloranilino)fenilacético (diclofenaco), ácido iso-butil-propanoico-fenólico (ibuprofeno); diuréticos, galato de epigalocatequina, clorhidrato de melfalán, dexametasona, bortezomib, bortezomib-melfalán, bortezomib-dexametasona, melfalán-dexametasona, bortezomibmelfalán-dexametasona; antidepresivos, fármacos antipsicóticos, neurolépticos, antidementiva (por ejemplo, la memantina antagonista del receptor de NMDA), inhibidores de la acetilcolinesterasa (por ejemplo, donepezilo, HCI, rivastigmina, galantamina), antagonistas del glutamato y otros medicamentos nootrópicos para la presión arterial (por ejemplo, dihidralazina, metildopa), citostáticos, glucocorticoides, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE); agentes antiinflamatorios o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos de agentes que pueden usarse para tratar o prevenir el rechazo de órganos después de un trasplante clínico de órganos incluyen, pero no se limitan a, los agentes del grupo que conducen a un debilitamiento del sistema inmunológico, es decir, que comprenden inmunosupresores tales como inhibidores de calcineurina tales como ciclosporina y Tacrolimus, inhibidores de la proliferación como los inhibidores de mTOR que comprenden Everolimus y Sirolimus (rapamicina), así como antimetabolitos tales como Azatioprina, Micofenolato de Mofetilo/MMF y ácido micofenólico, y corticosteroides tales como cortisona y cortisol, así como sustancias sintéticas tales como Prednisona o Prednisolona. Además, se pueden usar anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales anti-receptor de IL2 (por ejemplo, Basiliximab, Daclizumab) así como anticuerpos monoclonales anti-CD3 (por ejemplo, Muromonab-CD3) y composiciones policlonales tales como globulina anti-timocitos (ATG); y agonistas del receptor del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) (véase, por ejemplo, Noguchi et al., Acta Med. Okayama, 60 (2006), y la solicitud internacional WO 2012/088157). Además, agentes adicionales podrían comprender agentes para la profilaxis y/o tratamiento de infecciones y otros efectos secundarios después de un trasplante de órganos que comprenden valganciclovir, inmunoglobulina de citomegalia, ganciclovir, anfotericina B, pirimetamina, ranitidina, ramipril, furosemida, benzbromaron. Por lo tanto, en una realización se proporciona una composición que comprende además un agente adicional útil para tratar la amiloidosis por TTR y/o para tratar o prevenir el rechazo de órganos después, por ejemplo, trasplante clínico de hígado. En la técnica se describen ejemplos de otros agentes que pueden usarse concomitantemente con una composición farmacéutica de la presente invención; véase, por ejemplo las solicitudes internacionales WO 2009005672, WO 2010128092, WO 2012088157 o la solicitud europea EP 11 158212.8.

Una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del ingrediente activo suficiente para mejorar los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de tales compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, ED⁵⁰ (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y LD⁵⁰ (la dosis letal para el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD⁵⁰/ED⁵⁰.

De lo anterior, es evidente que la presente invención abarca cualquier uso de una molécula de unión a TTR y/o fragmentos de la misma que comprenden las CDR del anticuerpo descrito anteriormente, en particular para el diagnóstico y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionados con especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas o agregadas y/o fragmentos de las mismas como se mencionó anteriormente, tales como amiloidosis por TTR. Preferiblemente, dicha molécula de unión es un anticuerpo de la presente invención o una cadena de inmunoglobulina del mismo. Por lo tanto, la presente invención proporciona un anticuerpo como se define en el presente documento más arriba y más adelante, el polinucleótido, el vector o la célula como se define en el presente documento o una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende cualquiera de los mismos para uso en tratamiento profiláctico, tratamiento terapéutico y/o monitorización de la progresión o una respuesta al tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con TTR, preferiblemente en el que el trastorno se selecciona del grupo que comprende polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC), amiloidosis sistémica senil (SSA), amiloidosis familiar sistémica, amiloidosis leptomeníngea/del sistema nervioso central (CNS) que incluye enfermedad de Alzheimer, amiloidosis ocular relacionada con TTR, amiloidosis renal relacionada con TTR, hipertiroxinemia relacionada con TTR, amiloidosis de ligamentos relacionada con TTR, incluido el síndrome del túnel carpiano, desgarros del manguito rotador y estenosis espinal lumbar y preeclampsia. El grupo anterior de enfermedades o trastornos se denominará grupo de trastornos asociados con amiloidosis por TTR.

En otra realización, la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende cualquiera de las moléculas de unión a TTR descritas anteriormente, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, polinucleótidos, vectores, células y/o péptidos de la invención y medios opcionalmente adecuados para detección tales como reactivos usados convencionalmente en métodos de diagnóstico de base inmunológica o ácido nucleico. Los anticuerpos de la invención son, por ejemplo, adecuados para su uso en inmunoensayos en los que se pueden utilizar en fase líquida o unidos a un vehículo en fase sólida. Ejemplos de inmunoensayos que pueden utilizar el anticuerpo de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos en formato directo o indirecto. Ejemplos de tales inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo tipo sándwich (inmunométrico), citometría de flujo y el ensayo de transferencia Western. Los antígenos y anticuerpos de la invención pueden unirse a muchos vehículos diferentes y usarse para aislar células unidas específicamente a ellos. Los ejemplos de vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nailon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Hay muchas etiquetas y métodos de etiquetado diferentes conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de los tipos de etiquetas que pueden usarse en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes; véanse también las realizaciones discutidas anteriormente.

Mediante una realización adicional, las moléculas de unión a TTR, en particular los anticuerpos de la presente invención, también pueden usarse en un método para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno en un individuo obteniendo una muestra de fluido corporal del individuo analizado que puede ser una muestra de sangre, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de linfa o cualquier otra muestra de fluido corporal, tal como una muestra de saliva o de orina y poner en contacto la muestra de fluido corporal con un anticuerpo de la presente invención en condiciones que permitan la formación de complejos anticuerpo-antígeno. El nivel de tales complejos se determina luego mediante métodos conocidos en la técnica, un nivel significativamente más alto que el formado en una muestra de control que indica la enfermedad o trastorno en el individuo probado. De la misma manera, también se puede usar el antígeno específico unido por los anticuerpos de la invención. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un inmunoensayo in vitro que comprende la molécula de unión, por ejemplo, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno de la invención.

En una realización adicional de la presente invención, las moléculas de unión a TTR, en particular los anticuerpos de la presente invención, también pueden usarse en un método para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno en un individuo obteniendo una biopsia del individuo examinado que puede ser de piel, glándula salival, raíces de cabello, corazón, colon, nervios, biopsias de grasa subcutánea o una biopsia de cualquier órgano afectado.

En este contexto, la presente invención también se refiere a medios diseñados específicamente para este propósito. Por ejemplo, puede usarse una matriz basada en anticuerpos, que está cargada, por ejemplo, con anticuerpos o moléculas de unión a antígeno equivalentes de la presente invención que reconocen específicamente a TTR. El diseño de inmunoensayos de microarreglos se resume en Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a micromatrices cargadas con moléculas de unión a TTR identificadas de acuerdo con la presente invención.

En una realización, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas y/o fragmentos de las mismas en un sujeto, comprendiendo el método determinar la presencia de TTR y/o TTR mal plegada, mal ensamblada o agregada en una muestra del sujeto que se va a diagnosticar con al menos un anticuerpo de la presente invención o un fragmento de unión a TTR del mismo, en el que la presencia de TTR patológicamente mutada, mal plegada, mal ensamblada o agregada es indicativa de amiloidosis por TTR y un aumento del nivel de la TTR patológicamente mal plegada, mal ensamblada o agregada en comparación con el nivel de la TTR fisiológica es indicativa de la progresión de la amiloidosis por TTR en dicho sujeto.

El sujeto a diagnosticar puede ser asintomático o preclínico para la enfermedad. Preferiblemente, el sujeto de control tiene una enfermedad asociada con TTR mal plegada, mal ensamblada o agregada, por ejemplo, polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC) o amiloidosis sistémica senil (SSA), en la que una similitud entre el nivel de TTR patológicamente mal plegada, mal ensamblada o agregada y el estándar de referencia indica que el sujeto que se va a diagnosticar tiene una amiloidosis por TTR o está en riesgo de desarrollar amiloidosis por TTR. Alternativamente, o además como un segundo control, el sujeto de control no tiene una amiloidosis por TTR, en la que una diferencia entre el nivel de TTR fisiológica y/o de TTR mal plegada, mal ensamblada o agregada y el estándar de referencia indica que el sujeto a ser diagnosticado tiene una amiloidosis por TTR o tiene riesgo de desarrollar una amiloidosis por TTR. Preferiblemente, el sujeto a diagnosticar y el sujeto o sujetos de control tienen la misma edad. La muestra a analizar puede ser cualquier fluido corporal que se sospeche que contiene TTR patológicamente mal plegada, mal ensamblada o agregada, por ejemplo sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina, fluido peritoneal, saliva o fluido cefalorraquídeo (CSF).

El nivel de TTR fisiológica y/o de TTR patológicamente mal plegada, mal ensamblada o agregada puede evaluarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica que comprenda, por ejemplo, analizar TTR mediante una o más técnicas elegidas de transferencia Western, inmunoprecipitación, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), electroforesis en gel bidimensional, espectroscopia de masas (MS), desorción/ionización láser asistida por una matriz-tiempo de vuelo-MS (MALDI-TOF), desorción/ionización láser mejorada en la superficie-tiempo de vuelo (SELDI-TOF), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC), cromatografía líquida multidimensional (LC) seguida de espectrometría de masas en tándem (MS/MS), y densitometría láser. Preferiblemente, dicha formación de imágenes in vivo de TTR comprende gammagrafía, tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía por emisión de fotón único (SPECT), formación de imágenes ópticas en el infrarrojo cercano (NIR) o formación de imágenes por resonancia magnética (MRI).

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al diagnóstico de amiloidosis por TTR, controlando el tratamiento de esta enfermedad y determinando la utilidad diagnóstica o terapéutica de un fármaco anti-TTR en un tejido libre de biopsia, es decir, un método no invasivo.

Normalmente, la concentración de agregados de TTR y/o TTR mal plegada que pueden detectarse en un fluido corporal, por ejemplo, plasma sanguíneo, es muy baja y, por lo tanto, el diagnóstico de amiloidosis por TTR es oneroso y requiere mucho tiempo. En particular, el diagnóstico de las enfermedades por amiloidosis por TTR es un proceso difícil y prolongado, ya que diversas enfermedades presentan signos y síntomas muy similares, de modo que el diagnóstico formal de polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC) y amiloidosis sistémica senil (SSA) normalmente requiere la recogida de biopsias de tejido y la identificación de depósitos de amiloide de TTR mediante complejas técnicas de tinción histológica. Como las biopsias de tejido son muy pequeñas y los depósitos de amiloide de TTR están dispersos, la determinación histológica de la amiloidosis por TTR se asocia típicamente con una alta frecuencia de resultados falsos negativos y retrasos para los pacientes.

Sin embargo, de acuerdo con la presente invención se pudo demostrar sorprendentemente que después de una sola administración de un anticuerpo anti-TTR objetivo, fue posible una medición de TTR agregadas y/o mal plegadas unidas a anticuerpos anti-TTR en sangre; véase el Ejemplo 13 y la Figura 14. Por lo tanto, gracias a la propiedad probablemente única del anticuerpo anti-TTR de la presente invención para eliminar TTR de los depósitos de TTR amiloidogénico y el transporte sangre, se ha desarrollado un método novedoso para diagnosticar trastornos asociados con TTR mal plegada, mutada y/o agregada en un paciente o sujeto, cuyo método tiene el potencial de reemplazar la biopsia de tejido y el análisis histológico en el proceso de diagnóstico de las enfermedades amiloides por TTR. El método se basa en el uso de un anticuerpo específico para la conformación patológica de la proteína TTR, que se inyecta al paciente y se usa para sondear la presencia de proteína TTR mal plegada y/o agregada en cualquier parte del cuerpo del paciente. Después de un breve retraso, por ejemplo 2 días, después de la inyección del anticuerpo en un paciente, se extrae una muestra de sangre y se usa para detectar si el anticuerpo ha capturado y desprendido partículas de TTR mal plegadas y/o agregadas de los depósitos de TTR. La principal ventaja de este método en comparación con la histología tiene que ver con la inyección del anticuerpo anti-TTR directamente en los pacientes, en los que la circulación sanguínea permite su circulación a través de todos los tejidos y órganos, y la detección de depósitos de proteína TTR mal plegada y/o agregada independientemente de su localización.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad asociada con amiloidosis por TTR que comprende analizar el nivel de TTR mal plegada y/o agregada en una muestra de un sujeto después de la administración de un anticuerpo anti-TTR al sujeto, en el que la presencia o el nivel elevado de TTR mal plegada y/o agregada en la muestra del sujeto en comparación con el control, tal como una muestra obtenida del sujeto antes de la administración del anticuerpo anti-TTR, indica una enfermedad asociada con amiloidosis por TTR. Además, como se muestra en el Ejemplo 13, el método novedoso también es útil para caracterizar fármacos anti-TTR y el curso del tratamiento de la amiloidosis por TTR, respectivamente, el método novedoso de la presente invención también está destinado a controlar el tratamiento de la enfermedad con un anticuerpo anti-TTR o determinar la utilidad diagnóstica o terapéutica de un anticuerpo anti-TTR. En este contexto, la persona experta en la técnica reconocerá que el método de la presente invención no se limita a la investigación de la utilidad y eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-TTR, sino que también es aplicable a otros tipos de fármacos anti-TTR que son capaces de degradación de los depósitos de amiloide de TTR. Por ejemplo, un anticuerpo anti-TTR de la presente invención puede administrarse junto con otro fármaco anti-TTR y el nivel de TTR mal plegada y/o agregada en la muestra del sujeto que ha sido tratado se compara con un control obtenido del sujeto antes de la administración tanto del anticuerpo anti-TTR como del fármaco anti-TTR pero solo después del tratamiento con anticuerpo anti-TTR.

En una realización preferida de la presente invención, en particular cuando se usan animales no humanos para probar anticuerpos recombinantes de origen humano como se ilustra en el Ejemplo 13 y otros anticuerpos anti-TTR previstos para uso en humanos en general, el nivel de TTR mal plegada y/o agregada en la muestra se analiza determinando un complejo formado entre el anticuerpo anti-TTR y la TTR mal plegada y/o agregada, por ejemplo mediante inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-IgG humano o antiidiotípico. Alternativamente, se puede usar un segundo anticuerpo anti-TTR que reconozca TTR en un epítopo sustancialmente diferente del epítopo del anticuerpo anti-TTR candidato a fármaco para unirse al complejo formado por el anticuerpo anti-TTR candidato a fármaco y TTR y así detectar su presencia, por ejemplo, mediante ELISA o inmunoprecipitación.

Con respecto al aspecto de diagnóstico en particular para un sujeto y paciente humano, la presencia y el nivel elevado de TTR mal plegada y/o agregada y complejo de la misma con el anticuerpo anti-TTR, respectivamente, indica la presencia de depósitos amiloides de TTR en el cuerpo humano, por ejemplo en el corazón, el sistema nervioso periférico (PNS), los ojos, los músculos, el tracto gastrointestinal, los riñones, el sistema vascular y el sistema nervioso central (CNS) de un paciente o sujeto. Por lo tanto, el método de la presente invención permite la identificación y determinación de una enfermedad asociada con la amiloidosis por TTR en el cuerpo del sujeto por un lado y la eliminación de los depósitos de TTR del cuerpo del paciente por el otro, indicando así también el progreso terapéutico de un tratamiento dado y la eficacia de un fármaco específico para amiloidosis por TTR, tal como un anticuerpo anti-TTR.

Por lo tanto, como se demostró en el Ejemplo 13, el anticuerpo anti-TTR de la presente invención es capaz de unirse a TTR mal plegada y/o agregada con suficiente afinidad para alterar la estabilidad de los depósitos de TTR patológicos tales como capturar y eliminar la TTR mal plegada y/o agregada de los depósitos en un fluido corporal, en particular sangre.

El anticuerpo anti-TTR que se va a usar de acuerdo con el método de la presente invención puede ser cualquier anticuerpo TTR que sea específico para la conformación patológica de TTR, es decir, TTR mal plegada, mutada y/o agregado. Sin embargo, en una realización preferida, el anticuerpo anti-TTR utilizado en el método sin tejido es un anticuerpo anti-TTR o una molécula de unión a TTR de la presente invención descrita en el presente documento e ilustrada en los Ejemplos.

En este contexto, el anticuerpo anti-TTR puede modificarse y, por ejemplo, unirse a un marcador detectable como se describe para cualquiera de las otras realizaciones anteriormente en este documento. Además, los inmunoensayos tales como transferencia Western, inmunotransferencia de mancha, ELISA (sándwich) y similares conocidos en la técnica y descritos para otros métodos de diagnóstico y usos basados en el anticuerpo anti-TTR y el péptido de la presente invención pueden adaptarse al nuevo ensayo de amiloide de TTR de la presente invención.

Como se muestra en el Ejemplo 13 y la Figura 14 usando el ensayo de amiloide de TTR, podría demostrarse que los anticuerpos anti-TTR de la presente invención son capaces de capturar y separar TTR mal plegada y/o agregada de los depósitos de amiloide de TTR y el correspondiente inmunocomplejo puede medirse en una muestra de fluido corporal, en particular sangre del paciente o sujeto; véase el Ejemplo 13 y la Figura 14. Por consiguiente, en una realización de la presente invención, el anticuerpo anti-TTR puede unirse a TTR mal plegada y/o agregada con suficiente afinidad para alterar la salida neta de la TTR mal plegada y/o agregada de por ejemplo, el corazón, el sistema nervioso periférico (PNS), ojos, músculos, tracto gastrointestinal, riñones, sistema vascular y sistema nervioso central (CNS).

La muestra de fluido corporal, preferiblemente sangre o CSF del sujeto, en la que está presente TTR capturada y desprendida mal plegada y/o agregada unida al anticuerpo anti-TTR, se obtiene en un intervalo de tiempo especificado después de la administración. Este intervalo de tiempo especificado después de la administración suele ser inferior a una semana. En una realización preferida, este intervalo de tiempo después de la administración del anticuerpo anti-TTR es menor o igual a 48 horas.

Como se mencionó anteriormente, el método sin tejido descrito anteriormente también se puede utilizar para determinar el éxito del tratamiento, es decir, mediante la medición de capturas de especies de TTR mal plegadas y/o agregadas por anticuerpos anti-TTR antes y después del tratamiento. Por lo tanto, en una realización más o adicional, el método sin tejido de la presente invención puede comprender además la comparación entre el nivel de TTR mal plegada y/o agregada en la muestra de un fluido corporal con una muestra obtenida del sujeto antes de la administración de un anticuerpo anti-TTR. Por consiguiente, en una realización, el método de la presente invención se usa para determinar la eficacia de un tratamiento de amiloidosis por TTR o para controlar la progresión de una enfermedad o afección asociada con la TTR patológica en un paciente o sujeto.

Como se mencionó, las muestras de sujetos utilizadas en los métodos descritos anteriormente se pueden obtener antes o después de la administración de un anticuerpo anti-TTR. Sin embargo, también se pueden obtener muestras de instalaciones médicas o médicos en ejercicio, así como de otras instituciones de las que se pueden obtener muestras clínicas de un sujeto. Las instalaciones, médicos, etc., no solo pueden realizar la administración de un anticuerpo anti-TTR al sujeto y la recolección de muestras apropiadas para su uso en el método anterior, sino también controlar y/o el tratamiento del paciente, es decir, variando la cantidad, el tiempo, la frecuencia de administración del anticuerpo, interrumpir una terapia, reemplazar o combinar el anticuerpo anti-TTR por al menos otro anticuerpo anti-TTR o agente terapéutico. El nivel de t Tr puede evaluarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los métodos adecuados se describen a continuación y en la solicitud internacional WO 2013/066818.

En un aspecto de la presente invención, se proporciona para su uso un anticuerpo de la presente invención o un fragmento de unión a TTR del mismo, el polinucleótido, el vector o la célula como se definió anteriormente o una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende cualquiera de los mismos en un tratamiento profiláctico, tratamiento terapéutico y/o seguimiento de la progresión o respuesta al tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con TTR. Por lo tanto, en general, la presente invención también se refiere a un método para diagnosticar o controlar la progresión de una enfermedad o trastorno relacionado con TTR (tal como amiloidosis por TTR) en un sujeto, comprendiendo el método determinar la presencia de TTR en una muestra del sujeto a ser diagnosticado con al menos un anticuerpo de la presente invención o una molécula de unión a TTR que tiene sustancialmente las mismas especificidades de unión que cualquiera de los mismos, en el que la presencia de especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas o agregadas o fragmentos de las mismas es indicativa de la enfermedad o trastorno. En una realización, se proporciona dicho método de diagnóstico o seguimiento de la progresión de la amiloidosis por TTR en un sujeto, comprendiendo el método determinar la presencia de TTR mutada, mal plegada, mal ensamblada o agregada y/o fragmentos de la misma en una muestra del sujeto que se va a diagnosticar con al menos un anticuerpo de la presente invención o una molécula de unión a TTR que tiene sustancialmente las mismas especificidades de unión que cualquiera de las mismas, en el que la presencia de TTR mutada, mal plegada, mal ensamblada o agregada y/o fragmento de la misma es indicativa de amiloidosis por TTR presintomática, prodrómica o clínica, un aumento del nivel de oligómeros, agregados o fibrillas de TTR en comparación con el nivel de TTR fisiológica o en comparación con una muestra de referencia derivada de un sujeto de control sano o una muestra de control del mismo sujeto es indicativo de progresión de la amiloidosis por TTR presintomática, prodrómica o establecida. Cualquier persona experta en la técnica apreciará que, en una realización, dicho método se usa también para el diagnóstico o seguimiento de la progresión de cualquier otra enfermedad o trastorno del grupo de trastornos relacionados con la TTR como se definió anteriormente.

Como se indicó anteriormente, los anticuerpos de la presente invención, fragmentos de los mismos y moléculas de la misma especificidad de unión que los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden usarse no solo in vitro sino también in vivo, en los que además del diagnóstico, también pueden perseguirse aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, en una realización, la presente invención también se refiere a una molécula de unión a TTR que comprende al menos una CDR de un anticuerpo de la presente invención para la preparación de una composición para la detección/formación de imágenes in vivo o el direccionamiento de un agente terapéutico y/o diagnóstico a TTR en el cuerpo humano o animal. Los agentes terapéuticos y/o de diagnóstico potenciales pueden elegirse de las enumeraciones no exhaustivas de los agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de la amiloidosis por TTR y los marcadores potenciales como se indicó anteriormente. Con respecto a la formación de imágenes in vivo, en una realización preferida, la presente invención proporciona dicha molécula de unión a TTR que comprende al menos una CDR de un anticuerpo de la presente invención, en la que dicha formación de imágenes in vivo comprende gammagrafía, tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía de emisión de fotón único (SPECT), imágenes ópticas de infrarrojo cercano (NIR) o imágenes de resonancia magnética (MRI). En una realización adicional, la presente invención también proporciona dicha molécula de unión a TTR que comprende al menos una CDR de un anticuerpo de la presente invención, o dicha molécula para la preparación de una composición para los métodos de obtención de imágenes in vivo especificados anteriormente, para el uso en el método de diagnóstico o seguimiento de la progresión de una enfermedad o trastorno relacionado con TTR en un sujeto, como se define en el presente documento anteriormente.

VII. Péptidos con epítopos de TTR específicos de agregación

La presente solicitud también describe péptidos que tienen un epítopo de TTR específicamente reconocido por cualquier anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, dicho péptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 49, la SEQ ID NO: 50, o en la SEQ ID NO: 51 como el epítopo lineal único reconocido por el anticuerpo o una secuencia modificada del mismo en la que uno o más aminoácidos están sustituidos, eliminados y/o agregados, en la que el péptido es reconocido por cualquier anticuerpo de la presente invención, preferiblemente por el anticuerpo NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 o NI-301.12D3 .

Dicho péptido se puede utilizar para diagnosticar o controlar una enfermedad o trastorno relacionado con especies de TTR mal plegadas, mal ensambladas o agregadas y/o fragmentos de las mismas en un sujeto, tal como amiloidosis por TTR que comprende una etapa de determinación de la presencia de un anticuerpo que se une a un péptido en una muestra biológica de dicho sujeto, y se usa para el diagnóstico de dicha enfermedad en dicho sujeto midiendo los niveles de anticuerpos que reconocen el péptido de la presente invención descrito anteriormente y comparando las mediciones con los niveles que se encuentran en sujetos sanos de edad y sexo comparables. En una realización, se describe un método para diagnosticar la amiloidosis por TTR indicativa de FAP y/o FAC presintomática o clínica en un sujeto, que comprende una etapa de determinación de la presencia de un anticuerpo que se une a un péptido como se definió anteriormente en una muestra biológica de dicho sujeto. De acuerdo con este método, un nivel elevado de anticuerpos medidos específicos para dicho péptido de la presente invención es indicativo para diagnosticar en dicho sujeto FAP y/o FAC presintomático o clínico o para diagnosticar en dicho sujeto cualquier otra enfermedad o trastorno del grupo de trastornos relacionados con TTR como se definió aquí anteriormente. Además, dado que el péptido contiene un epítopo de un anticuerpo terapéuticamente eficaz derivado de un ser humano, dicho péptido puede, por supuesto, usarse como un antígeno, es decir, un inmunógeno para provocar una respuesta inmune en un sujeto y estimular la producción de un anticuerpo de la presente invención in vivo. El péptido puede formularse en una matriz, un kit y una composición tal como una vacuna, respectivamente, como se describió anteriormente. En este contexto, la presente invención también se refiere a un kit útil en el diagnóstico o seguimiento de la progresión de la amiloidosis por TTR, comprendiendo dicho kit al menos un anticuerpo de la presente invención o un fragmento de unión a TTR del mismo, el polinucleótido, el vector y/o la célula como se define respectivamente aquí anteriormente, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones de uso.

Estas y otras realizaciones se describen y engloban en la descripción y ejemplos de la presente invención. Puede obtenerse literatura adicional relativa a cualquiera de los materiales, métodos, usos y compuestos a emplear de acuerdo con la presente invención de bibliotecas públicas y bases de datos, usando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede utilizar la base de datos pública "Medline", alojada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y/o la Biblioteca Nacional de Medicina de los Institutos Nacionales de Salud (NLM.NIH). Otras bases de datos y direcciones web, como las del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI), que forma parte del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), son conocidas por el experto en la técnica y también pueden obtenerse utilizando motores de búsqueda en Internet. En Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364 se ofrece una descripción general de la información sobre patentes en biotecnología y un estudio de las fuentes relevantes de información sobre patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y para el conocimiento actual.

La descripción anterior describe en general la presente invención. A menos que se indique lo contrario, a un término como se usa en este documento se le da la definición proporcionada en el Diccionario Oxford de Bioquímica y Biología Molecular, Oxford University Press, 1997, revisado en 2000 y reimpreso en 2003, ISBN 0198506732. Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta especificación; sin embargo, no se admite que cualquier documento citado sea de hecho técnica anterior en cuanto a la presente invención. Puede obtenerse una comprensión más completa haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en el presente documento únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Aislamiento e identificación de anticuerpos anti-TTR

Se identificaron anticuerpos de origen humano dirigidos a TTR y/o especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas y/o fragmentos de las mismas utilizando el método descrito en la solicitud internacional WO 2008/081008, con modificaciones. En particular, la proteína TTR humana de tipo silvestre obtenida por purificación a partir de plasma humano y las proteínas TTR de tipo silvestre y mutantes obtenidas por expresión recombinante se usaron en conformaciones tanto nativas como mal plegadas-agregadas para la identificación de anticuerpos dirigidos a TTR. Las conformaciones mal plegadas-agregadas se produjeron in vitro en condiciones ácidas, usando un procedimiento similar al descrito en Colon W. et al., Biochemistry, 31 (1992), 8654-8660, con modificaciones menores.

Ejemplo 2: Determinación de la secuencia de anticuerpos

Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de los anticuerpos anti-TTR identificados anteriormente se determinaron sobre la base de sus secuencias de ARNm, véase la Figura 1. En resumen, se recolectaron células B vivas de cultivos de células B de memoria no inmortalizadas seleccionadas. Posteriormente, los ARNm de las células que producen anticuerpos anti-TTR seleccionados se extrajeron y convirtieron en ADNc, y las secuencias que codifican las regiones variables del anticuerpo se amplificaron mediante PCR, se clonaron en vectores plasmídicos y se secuenciaron. En resumen, se utilizó una combinación de cebadores que representan todas las familias de secuencias del repertorio de la línea germinal de inmunoglobulina humana para las amplificaciones de péptidos líderes, segmentos V y segmentos J. La primera ronda de amplificación se realizó usando cebadores específicos del péptido líder en el extremo 5' y cebadores específicos de la región constante en el extremo 3' (Smith et al., Nat Protoc. 4 (2009), 372­ 384). Para las cadenas pesadas y las cadenas ligeras kappa, la segunda ronda de amplificación se realizó utilizando cebadores específicos del segmento V en el extremo 5' y cebadores específicos del segmento J en el extremo 3'. Para las cadenas ligeras lambda, la segunda ronda de amplificación se realizó utilizando cebadores específicos del segmento V en el extremo 5' y un cebador específico de la región C en el extremo 3' (Marks et al., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597; de Haard et al., J. Biol. Chem. 26 (1999), 18218-18230).

La identificación del clon de anticuerpo con la especificidad deseada se realizó mediante un nuevo cribado en ELISA tras la expresión recombinante de anticuerpos completos. La expresión recombinante de anticuerpos IgG1 humanos completos se logró tras la inserción de las secuencias variables de cadena pesada y ligera "en el marco de lectura correcto" en vectores de expresión que complementan la secuencia de la región variable con una secuencia que codifica un péptido líder en el extremo 5' y en el extremo 3' con una secuencia que codifica el dominio o dominios constantes apropiados. Con ese fin, los cebadores contenían sitios de restricción diseñados para facilitar la clonación de las secuencias variables de cadena pesada y ligera en vectores de expresión de anticuerpos. Las inmunoglobulinas de cadena pesada se expresaron insertando el producto de RT-PCR de cadena pesada de inmunoglobulina en el marco en un vector de expresión de cadena pesada que porta un péptido señal y los dominios constantes de inmunoglobulina gamma 1 humana o de ratón. Las inmunoglobulinas de cadena ligera kappa se expresaron insertando producto de RT-PCR de cadena ligera kappa en el marco en un vector de expresión de cadena ligera que proporciona un péptido señal y el dominio constante de la inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana. Las inmunoglobulinas de cadena ligera lambda se expresaron insertando el producto de RT-PCR de cadena ligera lambda en el marco en un vector de expresión de cadena ligera lambda que proporciona un péptido señal y el dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera lambda humana o de ratón.

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales recombinantes funcionales tras la cotransfección en células HEK 293 o CHO (o cualquier otra línea celular receptora apropiada de origen humano o de ratón) de un vector de expresión de cadena pesada de Ig y un vector de expresión de cadena ligera de Ig kappa o lambda. El anticuerpo monoclonal humano recombinante se purificó posteriormente a partir del medio acondicionado usando una purificación en columna de proteína A estándar. El anticuerpo monoclonal humano recombinante se puede producir en cantidades ilimitadas utilizando células transfectadas de forma transitoria o estable. Las líneas celulares que producen anticuerpos monoclonales humanos recombinantes pueden establecerse utilizando los vectores de expresión de Ig directamente o clonando de nuevo las regiones variables de Ig en diferentes vectores de expresión. También se pueden generar derivados tales como F(ab), F(ab)² y scFv a partir de estas regiones variables de Ig.

Las regiones determinantes de complementariedad y del marco se determinaron por comparación con las secuencias de anticuerpos de referencia disponibles en bases de datos tales como Abysis (http://www.bioinf.org.uk/abysis/), y se anotaron utilizando el esquema de numeración de Kabat (http: //www.bioinf.org.uk/abs/). Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de los anticuerpos objetivo NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9 D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.37F1-PIMC, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI -301.14D8, NI-301.9X4 y NI-301.14C3 que incluyen la indicación del marco (FR) y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se muestran en la Figura 1A-1T.

A continuación, la alta afinidad de los anticuerpos objetivo para las conformaciones de TTR mal plegadas-agregadas y la falta sustancial de unión a las conformaciones de TTR de tipo silvestre nativas, que demuestran por lo tanto una fuerte selectividad para la TTR mutante, mal plegada, mal ensamblada y/o agregada se ilustra a modo de ejemplo para los anticuerpos NI-301.59.F1, NI-301.35G11 y NI-301.37F1. Sin embargo, los experimentos preliminares para otros anticuerpos en cuestión sugieren sustancialmente la misma unión preferencial a t Tr mutante, mal plegada, mal ensamblada y/o agregada sobre especies de TTR fisiológicas como los anticuerpos NI-301.59.F1, NI-301.35G11, y NI-301.37F1.

Ejemplo 3: Afinidad de unión de anticuerpos anti-TTR utilizando ELISA directo y determinación de EC⁵⁰

La capacidad del anticuerpo para unirse a TTR y/o formas mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas de TTR se evaluó por medio de ensayos de ELISA directo a concentraciones variables de anticuerpos. Esto permite determinar para cada anticuerpo su concentración media máxima efectiva (EC⁵⁰) en este ensayo, que es un proxy comúnmente utilizado para la afinidad de unión del anticuerpo, véase la Figura 2. En resumen, se recubrieron placas de ELISA (de alta unión, poliestireno transparente, área media, fondo plano) con TTR humana de tipo silvestre mal plegadaagregada, V30M-TTR recombinante mal plegada-agregada (ambas preparadas como se describe en el Ejemplo 1) y albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración de 10 pg/mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hora a 37 °C, y posteriormente se bloquearon con una solución de BSA al 2% y Tween-20 al 0,1% en PBS (PBS-T) durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Los anticuerpos contra TTR se diluyeron en PBS a 11 concentraciones diferentes que variaban de 4 a 400 nM y se incubaron en las placas de ELISA durante la noche a 4 °C. Después de 3 lavados con PBS-T, las placas de ELISA se incubaron con un anticuerpo secundario específico de IgG humano acoplado a HRP durante 1 hora a TA (dilución 1/4000). Después de 3 lavados con PBS-T, las reacciones de ELISA se desarrollaron con TMB durante exactamente 10 min a TA y se cuantificaron midiendo la densidad óptica a 450 nm (OD450nm).

Los ejemplos de anticuerpos NI-301.59F1, NI-301.35G11 y NI-301.37F1 exhibieron una fuerte unión a TTR de tipo silvestre y mutante mal plegada-agregada, pero no a la BSA de control, véase la Figura 2 A-C. Posteriormente, se determinaron las EC⁵⁰ del anticuerpo ajustando los datos con una regresión no lineal utilizando el método de mínimos cuadrados para estimar la afinidad de unión del anticuerpo en estas condiciones.

Los ejemplos de anticuerpos NI-301.59F1, NI.35G11 y NI-301.37F1 exhibieron una alta afinidad por la TTR humana de tipo silvestre mal plegada-agregada correspondiente a las EC⁵⁰ de 3.0 nM, 3.9 nM y 0.35 nM, respectivamente. Los ejemplos de anticuerpos también mostraron una alta afinidad por la V30M-TTR el mutante recombinante mal plegadaagregada, correspondiente a la EC⁵⁰ de 15.5 nM, 5.0 nM y 0.15 nM, respectivamente.

Ejemplo 4: Selectividad de unión de anticuerpos anti-TTR utilizando inmunotransferencia de manchas

Para evaluar la selectividad de unión de los anticuerpos de TTR y/o fragmentos de los mismos por conformaciones de TTR nativas o mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas, la proteína TTR humana de tipo silvestre en conformaciones nativa o mal plegada-agregada y proteína V30M-TTR recombinante en conformaciones mal plegadasagregadas se diluyeron en PBS a 4 concentraciones diferentes, y se depositaron mediante filtración al vacío sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana se secó brevemente (10 min) y se bloqueó con leche al 3% en PBS-T durante 1 hora a TA, y posteriormente se incubó con anticuerpos anti-TTR durante la noche a 4 °C. Después de 3 lavados con PBS-T durante 5 min a TA, la membrana se incubó con el anticuerpo secundario apropiado (acoplado a HRP; dilución 1/10000) durante 1 hora a TA. Después de 3 lavados con PBS-T, se reveló la membrana con luminol y se cuantificó la intensidad de la señal midiendo la luminiscencia.

El ejemplo de anticuerpo anti-TTR comercial unido a conformaciones de TTR nativas así como mal plegadasagregadas con afinidad similar, demostraron por lo tanto, su ausencia de selectividad de unión por conformaciones de TTR nativas o mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas, véase Figura 3A. Por el contrario, los ejemplos de anticuerpos NI-301.59.F1, NI-301.35G11 y NI-301.37F1 se unieron con alta afinidad a las conformaciones de TTR mal plegadas y agregadas solamente, y no mostraron unión a las conformaciones de TTR nativas, demostrando así una fuerte selectividad por TTR mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas (Figura 3 B2, C2, D2). Por consiguiente, los anticuerpos NI-301.35G11 y NI-301.37F1 también mostraron una fuerte unión a la proteína V30M-TTR recombinante mal plegada-agregada, como se muestra en la Figura 3 C3 y D3.

Para caracterizar aún más la selectividad de unión del anticuerpo, se procesaron de forma similar varias preparaciones de TTR que incluían conformaciones de tipo silvestre y mutante, nativas y mal plegadas-agregadas, y una colección de 12 muestras de plasma humano para el análisis mediante inmunotransferencia de manchas, usando anticuerpos anti-TTR quiméricos murinos y acoplados a HRP, anticuerpo secundario anti-IgG2a de ratón para detección (Figura 6).

El anticuerpo comercial exhibió una fuerte unión a todas las preparaciones de TTR, incluidas las preparaciones de TTR de tipo silvestre y mutante, nativa y mal plegada-agregada, y fue capaz de detectar TTR en todas las muestras de plasma humano. Esto demuestra además la ausencia de selectividad para conformaciones nativas o agregadas, véase Figura 6A. Por el contrario, el ejemplo de anticuerpo quimérico de ratón NI-301.mur35G11 exhibió una unión muy fuerte a la muestra de TTR de tipo silvestre mal plegada-agregada (Figura 6 C1), y también una fuerte unión a la proteína V30M-TTR mutante (Figura 6 C4) ya la proteína Y78F-TTR mutante (Figura 6 C6). Sin embargo, el anticuerpo NI-301.mur35G11 no se unió a TTR en las muestras de plasma humano. Esto demuestra además la fuerte selectividad de NI-301.mur35G11 para la proteína TTR mutada, mal plegada, mal ensamblada y/o agregada.

Ejemplo 5: Especificidad de unión y selectividad de anticuerpos anti-TTR utilizando transferencia Western

Se evaluó la especificidad de unión y la selectividad de los anticuerpos anti-TTR mediante transferencia Western, véase la Figura 4. En resumen, la proteína TTR humana de tipo silvestre (300 ng) en conformaciones nativas o mal plegadas-agregadas, y el extracto de hígado de ratón de tipo silvestre (10 |jg de proteína total) se cargaron en un gel SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando un sistema de transferencia semiseco. Posteriormente, la membrana se bloqueó con BSA al 2% en PBS-T durante 1 hora a TA, y se incubó durante la noche a 4 °C con anticuerpos anti-TTR diluidos en tampón de bloqueo. Después de 4 lavados con PBS-T durante 5 min a TA, la membrana se incubó con el anticuerpo secundario apropiado (acoplado a HRP; dilución 1/10000 en tampón de bloqueo) durante 1 hora a TA. Después de 3 lavados con PBS-T y uno final en PBS, se reveló la membrana con luminol y se cuantificó la intensidad de la señal midiendo la luminiscencia. Poco antes de su uso, la muestra de TTR mal plegada-agregada se sometió a entrecruzamiento con glutaraldehído (1%, 5 min, 37 °C) para evitar la disociación de los agregados de TTR durante el proceso de preparación para SDS-PAGE. Por el contrario, la muestra de TTR nativa no se entrecruzo antes de su uso, de modo que el homotetrámero de TTR (que es la conformación de TTR nativa en condiciones fisiológicas) se disoció casi por completo en monómeros y dímeros.

El anticuerpo anti-TTR comercial mostró una unión muy fuerte a los monómeros y dímeros de TTR de la muestra de TTR humana nativa (Figura 4 A1), y una unión igualmente fuerte a la muestra de TTR mal plegada-agregada entrecruzada (Figura 4 A2), lo que demuestra la ausencia de selectividad para conformaciones de TTR nativas o mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas. Por el contrario, los ejemplos de anticuerpos anti-TTR NI-301.59F1, NI-301.35G11 y NI-301.37F1 mostraron una unión muy fuerte a la muestra de TTR mal plegada-agregada entrecruzada (Figura 4 b2, C2, D2) pero no unión en absoluto a los monómeros y dímeros de TTR de la muestra de TTR humana nativa (Figura 4 B1, C1, D1), demostrando así una fuerte selectividad por las conformaciones de TTR mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas sobre las conformaciones de TTR nativas.

Además de eso, los anticuerpos anti-TTR comerciales y de ejemplo tenían niveles muy bajos de unión a las proteínas contenidas en el extracto de hígado de ratón (Figura 4 A3, B3, C3, D3). En vista de la gran cantidad de proteínas hepáticas utilizadas para el experimento y las altas concentraciones de anticuerpos con respecto a su afinidad de unión, esto indica que los ejemplos anticuerpos tienen una especificidad notable por TTR y no se unen significativamente a otras proteínas. Además, parece que los ejemplos de anticuerpos no se unen a la proteína TTR de ratón contenida en niveles elevados en el extracto de hígado de ratón, lo que indica que los ejemplos de anticuerpos muestran especificidad por la proteína TTR humana mal plegada. Sin embargo, el epítopo del anticuerpo NI-301.37F1 está presente en la proteína TTR de rata y ratón. Por consiguiente, la secuencia de aminoácidos primaria del epítopo puede no ser necesariamente decisiva para la detección de TTR mal plegada, sino la conformación.

Para caracterizar adicionalmente la capacidad de unión del anticuerpo, o su ausencia de la misma, a la proteína TTR nativa, se evaluó la capacidad de los ejemplos de anticuerpos para unirse a la proteína TTR contenida en muestras de plasma humano utilizando la misma técnica de transferencia Western que se describió aquí anteriormente., (Figura 5). La única diferencia técnica consistió en recortar la parte superior del gel a aproximadamente 25-30 kDa y usar solo la parte inferior del gel para transferir las proteínas a la membrana de nitrocelulosa. Esto es para eliminar las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos humanos presentes en alta concentración en las muestras de plasma, que potencialmente podrían interferir con el análisis.

Por el contrario, con el anticuerpo comercial usado como referencia, los ejemplos de anticuerpos NI-301.35G11 y NI-301.37F1 no detectaron en absoluto la proteína TTR humana contenida en muestras de plasma humano, lo que indica selectividad de unión por una conformación TTR que no está presente en las muestras analizadas bajo estas condiciones.

Ejemplo 6: Selectividad de unión de anticuerpos anti-TTR en solución utilizando inmunoprecipitación

Para verificar adicionalmente la selectividad de unión de los anticuerpos anti-TTR de la presente invención, se usaron proteína TTR recombinante y humana de tipo silvestre en conformaciones nativas y mal plegada-agregada, y una muestra de plasma humano a 3 diluciones diferentes en PBS para inmunoprecipitación (IP) de TTR. En resumen, se incubaron perlas magnéticas recubiertas de proteína A con anticuerpos anti-TTR diluidos en tampón de unión del fabricante durante 30 min a TA. El complejo anticuerpo/proteína A se recuperó y se incubó durante la noche a 4 °C con preparaciones de TTR y muestras de plasma humano. Después de los lavados, el complejo de anticuerpo/proteína A se resuspendió en tampón de carga SDS, se calentó durante 5 min a 90 °C y se procesó para el análisis de transferencia Western.

Como se muestra en la Figura 7, los ejemplos de anticuerpos de TTR NI-301.35G11 y NI-301.37F1, no mostraron por el contrario unión del anticuerpo TTR comercial Dako A0002, a las muestras de plasma (Figura 7 A7-9, B7-9, C7-9), así como tampoco unión a las muestras de TTR recombinante y nativa de tipo silvestre (Figura 7 B3, C3, B5, C5). Sin embargo, se evaluó una unión fuerte en la muestra, en la que estaban presentes formas mal plegadas-agregadas de TTR (Figura 7 B4, C4, B6, C6).

Estos resultados indican que los ejemplos de anticuerpos NI-301.35G11 y NI-301.37F1 son capaces de unir conformaciones de TTR mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas en solución, y muestran una notable selectividad para estas conformaciones.

Ejemplo 7: Unión a agregados patológicos de TTR en tejido de ratón con FAP

Se evaluaron ejemplos de anticuerpos anti-TTR por inmunohistoquímica (IHC) para determinar su capacidad para unirse a la proteína TTR patológica y no patológica tal como está presente en los tejidos de ratones transgénicos que expresan exclusivamente la proteína V30M-TTR humana y no la proteína TTR de ratón (en lo sucesivo denominados ratones FAP). Estos anticuerpos también se evaluaron para determinar la unión no específica en tejidos de ratones TTR inactivada (TTR-KO) que no expresan ninguna proteína TTR, y las líneas de ratón transgénicas e inactivadas correspondientes fueron inicialmente generadas y descritas por el profesor Suichiro Maeda (Kohno K. et al., American Journal of Pathology 140 (4) (1997), 1497-1508). En resumen, se realizó inmunohistoquímica en tejidos de ratón incluidos en parafina cortados en secciones de 3-5 pm de espesor. Las secciones se desparafinaron y rehidrataron inicialmente, y se trataron con H²O² al 3% en metanol durante 20 min a TA. Se aplicó tampón de bloqueo (PBS suero al 5% (caballo/cabra) BSA al 4%) durante 1 hora a TA y se reemplazó con anticuerpo anti-TTR diluido en PBS para incubación durante la noche a 4 °C. Después de 3 lavados en PBS, las secciones se incubaron sucesivamente con los anticuerpos secundarios biotinilados apropiados (anti IgG humana, dilución anti IgG de conejo 1/125 en PBS, incubación 1 hora a TA) y el sistema de detección de avidina-HRP (dilución 1/125 en PBS, incubación 1 hora a TA). La reacción se desarrolló con diaminobencidina durante exactamente 15 min a TA. Las secciones de tejido se tiñeron por contraste con hemalun durante 1 min a TA, se deshidrataron en series de etanol ascendente y se cubrieron con cubreobjetos.

Como se muestra en la Figura 8, un anticuerpo de TTR comercial Dako A0002 generó una fuerte tinción en secciones de hígado e intestino de ratones FAP y no produjo ninguna tinción en las correspondientes secciones de TTR KO (Figura 81A, 1B). El ejemplo de anticuerpo de TTR NI-301.35G11 generó una tinción de patrón e intensidad similares en secciones de hígado e intestino de ratones FAP (Figura 8 2A). Por el contrario, el ejemplo de anticuerpo NI-301.37F1 generó una fuerte tinción solo en la sección del intestino pero no en la sección del hígado del ratón FAP (Figura 83A). Esto indica que el anticuerpo NI-301.37F1 se une solo a los agregados de TTR patológicos (es decir, no fisiológicos) que se acumulan con el tiempo en el tracto gastrointestinal de los ratones FAP, y no a TTR en la conformación nativa sintetizada por el hígado.

Además de eso, ambos ejemplos de anticuerpos NI-301.35G11 y NI-301.37F1 no generaron ninguna tinción en secciones de tejido de hígado e intestino de ratones TTR-KO (Figura 82B, 3B). En vista de las altas concentraciones de anticuerpos utilizadas en este experimento con respecto a la afinidad de unión del anticuerpo, esta ausencia de tinción en las secciones de TTR-KO indica una alta especificidad de unión para la proteína TTR.

Ejemplo 8: Selectividad de unión para depósitos de TTR mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas en tejido humano

Los anticuerpos de la presente invención también se evaluaron por su capacidad para unirse a depósitos de TTR patológicos en tejido humano. Se procesaron secciones de una biopsia de piel de un paciente con FAP y secciones de tejido de páncreas de un individuo sano por inmunohistoquímica usando el mismo procedimiento que se describe en el Ejemplo 7, anterior. Se seleccionó la biopsia de piel para este experimento ya que contiene una cantidad importante de depósitos de amiloide de TTR patológicos. Por el contrario, en este experimento se utilizó tejido de páncreas porque las células alfa pancreáticas expresan TTR en un nivel elevado.

Como se muestra en la Figura 9, el anticuerpo comercial Dako A0002 reveló una tinción igualmente fuerte de depósitos de TTR patológicos en la piel y TTR nativa en células alfa pancreáticas (Figura 91A). De manera similar, el ejemplo de anticuerpo quimérico de ratón NI-301.mur35G11 produjo una tinción igualmente fuerte tanto en depósitos de TTR patológicos en la piel como de TTR nativa en células alfa pancreáticas (Figura 9 1B). Por el contrario, el anticuerpo NI-301.37F1 tiñó solamente el depósito de TTR patológico en la piel y no la TTR nativa en las células alfa pancreáticas (Figura 9 3A). Este resultado demuestra que NI-301.37F1 es altamente selectivo por IHC para depósitos de TTR patológicos, que incluyen conformaciones de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas.

La afección de control de "solo anticuerpo secundario" presentada en los paneles 1B, 2B y 3B de la Figura 9 revela la tinción del tejido que se produce en ausencia del anticuerpo primario. La ausencia (2B) o el nivel muy bajo (1B, 3B) de tinción indica que la tinción observada en los paneles 1A, 2A y 3A es de hecho específica para los correspondientes anticuerpos primarios.

Ejemplo 9: Evaluación del epítopo de unión de los anticuerpos de TTR

Para determinar el epítopo de unión de los ejemplos de anticuerpos NI-301.59F1, NI301.35G11 y NI-301.37F1, se analizó la secuencia completa de aminoácidos de TTR usando un panel de 29 péptidos secuenciales de 15 aminoácidos de longitud y 11 aminoácidos de superposición, unida covalentemente a una membrana. También se representaron en la membrana péptidos adicionales que incluían mutaciones seleccionadas. La membrana se bloqueó en tampón de bloqueo Roti durante la noche a 4 °C, se incubó primero con el anticuerpo anti-TTR diluido en tampón de bloqueo durante 2 horas a TA, luego con un anticuerpo anti IgG humano acoplado a HRP durante 45 min a TA (dilución 1/20000 en TBS). La reacción se desarrolló con luminol y se obtuvieron imágenes por luminiscencia.

El anticuerpo NI-301.59F1 reconoce las manchas 15, 16 y 44 que corresponden a la secuencia 61-EEEFVEGIY-69 (SEQ ID NO: 49) en TTR humana de tipo silvestre completa, véase la Figura 10A. El anticuerpo NI-301.35G11 reconoce las manchas 13, 14, 42 y 44 que corresponden a la secuencia 53-GELHGLTTEEE-63 (SEQ ID NO: 50) en TTR humana de tipo silvestre completa, véase Figura 10 B. Sin embargo, el anticuerpo NI-301.35G11 no reconoce la mancha 43, lo que indica que este anticuerpo no puede unirse a la secuencia 53-GELHGPTTEEE-63 correspondiente a la variante L55P-TTR. El anticuerpo NI-301.37F1 reconoce las manchas 9, 10, 11, 38 y 40 que corresponden a la secuencia 41-WEPFA-45 (SEQ ID NO: 51) en TTR humana de tipo silvestre completa, véase Figura 10C. Sin embargo, el anticuerpo NI-301.37F1 no reconoce la mancha 43, lo que indica que este anticuerpo no puede unirse a la secuencia 41-WGPFA-45 correspondiente a la variante E42G-TTR.

Para refinar la determinación del epítopo de unión de los ejemplos de anticuerpos NI-301.59F1, NI301.35G11 y NI-301.37F1, se analizó la secuencia completa de aminoácidos de TTR usando un panel de 151 péptidos secuenciales de 15 aminoácidos de longitud y 14 superposiciones de aminoácidos, unidos covalentemente a una membrana. Para cada péptido, el aminoácido en la posición 10 fue reemplazado por una alanina para los aminoácidos no alanina, mientras que las alaninas fueron reemplazadas por glicina o prolina. La membrana se bloqueó en tampón de bloqueo Roti durante la noche a 4 °C, se incubó primero con el anticuerpo anti-TTR diluido en tampón de bloqueo durante 2 horas a TA, luego con un anticuerpo anti IgG humano acoplado a HRP durante 45 min a TA (dilución 1/20000). La reacción se desarrolló con luminol y se obtuvieron imágenes por luminiscencia.

El anticuerpo NI-301.59F1 reconoce solo las manchas 77 y 83, lo que indica que E61 y V65 no son necesarios para la unión de 59F1 mientras que E62, E63, F64, E66, G67, 168 y Y69 son necesarios para la unión de anticuerpos. La contribución exacta de K70 es cuestión de interpretación: la fuerte unión del anticuerpo al péptido 44 que se muestra en la Figura 10A indica claramente que la ausencia de K70 en la posición del extremo terminal C no evita la unión del anticuerpo; en el experimento posterior mostrado en la Figura 10E, sin embargo, la sustitución de K70A en la posición 10 del péptido evitó la unión del anticuerpo. Estos resultados aparentemente opuestos sugieren que NI-301.59F1 se une a una conformación específica de la secuencia de aminoácidos 62-EEFXEGIY-69 (SEQ ID NO: 58), en la que X puede ser cualquier aminoácido.

El anticuerpo NI-301.35G11 reconoce las manchas 68, 71, 72, 73, 74 y 75, lo que indica que no se requiere G53 para la unión de 35G11 mientras que se requieren E54, L55, G57 y L58 para la unión de anticuerpos. El patrón de unión de 35G11 también indica que se requiere la presencia de E61 o e62 para la unión de anticuerpos. La contribución exacta de T59 y T60 no pudo determinarse en este experimento, pero se plantea la hipótesis de que se requiere la presencia de una de las dos tirosinas para la unión del anticuerpo. Tomados en conjunto, el perfil de unión de NI-301.35G11 en la exploración de alanina indica que este anticuerpo reconoce la secuencia 54 ELXGLTXE 61 (SEQ ID NO: 59), en la que X puede abarcar todos los aminoácidos conocidos, véase la Figura 10F.

El anticuerpo NI-301.37F1 se une a las manchas 50, 52, 55, 56 y 58-62 en la membrana de exploración de alanina, y no a las manchas 51, 53, 54 y 57. Esto indica que W41, P43, F44 y A45 se requieren para la unión del anticuerpo. Combinados con la observación anterior de que la mutación E42G interrumpe la unión del anticuerpo (Figura 10C), estos resultados indican que NI-301.37F1 se une a la secuencia 41-WEPFA-45 (SEQ ID NO: 60), véase la Figura 10G.

Ejemplo 10: Determinación de las características de unión del anticuerpo por resonancia de plasmón de superficie Las características de unión del anticuerpo a diversas preparaciones de TTR solubles se determinaron mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR), usando una máquina Biorad Proteon XPR36, véase la Tabla V.

El análisis de SPR se realizó en un BioRad ProteOn XPR36 equipado con un chip sensor GLM. Un anticuerpo antihumano dirigido contra el dominio Fc gamma se acopló covalentemente a la superficie de detección y se saturó con el anticuerpo bajo investigación. La proteína TTR de tipo silvestre y mutante en conformaciones nativas y mal plegadas se diluyó en tampón HBS-T a concentraciones que variaban de 3.2 a 316 nM. Se analizó la asociación anticuerpo-antígeno durante 180 s y la disociación durante 600 s. Se utilizó un modelo de unión de Langmuir (asociación simple 1:1) para ajustar los datos y derivar las constantes de asociación (ka) y disociación (kd), y la afinidad (KD).

Se revistió covalentemente un anticuerpo anti-IgG-Fcy humano sobre las superficies de detección y se usó para capturar los anticuerpos específicos de TTR humana. Los anticuerpos se probaron con 4 preparaciones de TTR diferentes, incluida la TTR de tipo silvestre nativa y mal plegada-agregada, y mutantes de TTR nativa V30M y L55P, todas preparadas a concentraciones de 3.2 a 316 nM en tampón HBS-T (Hepes 10 mM, 150 mM NaCl, EDt A 3 mM, Tween 20 al 0.05%, pH 7.4). Se preparó TTR de tipo silvestre mal plegada-agregada por desnaturalización ácida a 65 °C durante 80 min en tampón de acetato (acetato HCl 50 mM, KCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH 3,0), con posterior intercambio de tampón con HBS-T. 59F1, 35G11 y 37F1 exhibieron características de unión y disociación lineales que se ajustaron mejor con el modelo de Langmuir.

Los resultados muestran que estos tres anticuerpos se unen con alta afinidad a las variantes V30M-TTR y L55P-TTR en solución, así como a la preparación de TTR de tipo silvestre mal plegada-agregada. Por el contrario, estos ejemplos de anticuerpos no se unen a TTR de tipo silvestre nativa en solución.

Por consiguiente, los resultados muestran que NI-301.37F1 se une con alta afinidad a la proteína TTR humana de tipo silvestre mal plegada en solución, con una KD de 1.2 nM, pero no a la misma proteína en su conformación nativa. Se midió una afinidad de unión similar (KD = 1.4 nM) para la proteína TTR-L55P mutante.

T l V: D rmin i n l r rí i ni n l ni r r r n n i l m n rfi i .

Ejemplo 11: Inmunización pasiva de ratones transgénicos para TTR humano Val30Met, que presenta depósito de TTR tisular, con anticuerpo anti-TTR recombinante quimérico humano-ratón que da como resultado la eliminación del depósito.

La inmunización pasiva se realizó de manera similar a la descrita en la solicitud internacional WO 2010/030203, en particular el Ejemplo 3, así como de las referencias Kohno et al., Am. J. Pathol. (1997), 1497-1508 y Sousa et al., Am. J. Pathol. (2002), 1935-48, citados allí.

En resumen, el anticuerpo monoclonal se administró por vía intraperitoneal semanalmente durante 12 semanas a una dosis de 3 mg/kg a ratones FAP de 7 y 17 meses de edad, que eran transgénicos para el alelo Val30Met-TTR humano y desactivado para el gen TTR murino (Kohno et al., (1997), citado anteriormente). En los cinco días siguientes a la última dosis, se sacrificaron los animales y se recolectaron varios tejidos y se fijaron en una solución de paraformaldehído y se embebieron en parafina. Se cortaron secciones de 3-5 |jm y se procesaron para inmunohistoquímica usando el anticuerpo anti-TTR comercial descrito anteriormente. Se utilizó un procedimiento de inmunofluorescencia estándar, que era muy similar al indicado en el ejemplo 7 con la única diferencia de que se utilizó un anticuerpo secundario fluorescente para la detección. La superficie del tejido invadido con depósito de TTR se cuantificó y expresó como porcentaje del área total del tejido. El análisis estadístico del efecto del tratamiento se realizó con una prueba t de dos colas no pareada.

Esta línea de ratones transgénicos reproduce el mecanismo patológico clave común a las enfermedades amiloides de TTR que consiste en el desensamblaje del tetrámero de TTR y el plegamiento incorrecto de los monómeros de TTR en una conformación amiloidogénica tóxica e insoluble. Al igual que los pacientes con FAP, estos ratones transgénicos presentan típicamente deposición de TTR dependiente de la edad. La evaluación de la eficacia del tratamiento se investigó en dos grupos de ratones transgénicos que tenían 7 meses y 17 meses al inicio del tratamiento; edades en las que la deposición de TTR es importante e invade muchos tejidos gastrointestinales. Sorprendentemente, la inmunización pasiva con el ejemplo de anticuerpo NI-301.37F1 se asoció con una reducción estadísticamente significativa en la superficie del tejido invadido con la deposición de TTR cuando el tratamiento se inició a los 7 meses de edad, véase la Figura 12A. El tratamiento tuvo un efecto similar en ratones viejos, lo que condujo a una reducción casi significativa en la deposición de TTR, véase la Figura 12B.

Ejemplo 12: Los anticuerpos anti-TTR recombinantes de origen humano se unen a depósitos patológicos de TTR in vivo

Para determinar si los anticuerpos anti-TTR recombinantes de origen humano son capaces de unirse a depósitos patológicos de TTR in vivo, se inyectaron ratones FAP adultos de 7 meses de edad con el anticuerpo NI-301.37F1 a razón de 30 mg/kg ip o con PBS para comparación. Después de 48 horas, estos ratones se sometieron a perfusión transcardíaca y los tejidos se procesaron para análisis histológico. Los depósitos patológicos de TTR se detectaron usando un anticuerpo anti-TTR policlonal de conejo en combinación con un anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con fluorescencia, mientras que la localización del anticuerpo NI-301.37F1 inyectado se detectó con un anticuerpo anti-IgG humano marcado con fluorescencia. En particular, la inmunoprecipitación se realizó como sigue.

La inmunoprecipitación de NI-301.37F1 y anticuerpos de control de isotipo de muestras de plasma de ratón se realizó durante 2 horas a TA, usando perlas magnéticas acopladas a proteína A/G (Pierce # 88803) cargadas con anticuerpo anti-IgG humano (Jackson Immunoresearch # 709-005-098). Después de 3 lavados con PBS-T, las muestras se eluyeron de perlas magnéticas con un tampón de glicina 0.2 M (pH 2.5), se neutralizaron con Tris HCl 1 M (pH 8.0), se mezclaron con tampón de carga de LDS (Life Technologies # NP0007) y se calentaron 10 min a 90 °C. A continuación, las muestras se cargaron en un gel bis-tris al 4-12% (Life Technologies # WG1403A) y se corrieron durante 40 min a 200 V en tampón de ejecución MOPS. Después de la transferencia de la proteína a una membrana de nitrocelulosa, la proteína TTR se detectó usando el anticuerpo de TTR independiente de la conformación (Dako # A0002, 150 ng/mL) o el anticuerpo NI-301.37F1 (20 nM), en combinación con proteína A acoplada a h Rp (Life Technologies # 10-1023, dilución 1/10000) e imágenes luminiscentes.

El acoplamiento del objetivo in vivo como se describe en la Figura 13 se realizó en ratones FAP adultos (7 meses de edad) que recibieron una única inyección de anticuerpo NI-301.37F1 a razón de 30 mg/kg ip o PBS. Cuarenta y ocho horas después, los ratones fueron perfundidos con p Bs y los órganos fueron recolectados y procesados para análisis histológico. Los depósitos patológicos de TTR se detectaron mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-TTR policlonal de conejo comercial (Dako # A0002, 4.8 jg/mL) en combinación con un anticuerpo anticonejo conjugado con Cy5 (Jackson Immunoresearch # 711-175-152, dilución 1/200). La presencia (o ausencia) de NI-301.37F1 se detectó simultáneamente usando un anticuerpo antihumano conjugado con Cy3 (Jackson Immunoresearch N° 709-165-149, dilución 1/200). Se utilizaron los mismos parámetros de escaneo para obtener imágenes de tejidos inyectados con NI-301.37F1 y con PBS, y las imágenes recibieron los mismos ajustes de visualización.

Como se muestra en la Figura 13, la tinción dependiente de NI-301.37F1 estaba altamente colocalizada con tinción de TTR en ratones inyectados con NI-301.37F1, pero estaba completamente ausente en ratones inyectados con PBS, como se esperaba. Este resultado indica que el anticuerpo anti-TTR NI-301.37F1 se une a depósitos patológicos de TTR in vivo.

Ejemplo 13: La detección de depósitos de proteína TTR mal plegada in vivo no requiere biopsias de tejido

Este procedimiento de diagnóstico que reemplaza la biopsia de tejido y el análisis histológico en el proceso de diagnóstico de enfermedades amiloides por TTR asociadas con TTR agregada, mutada y/o mal plegada se ejemplifica a continuación y se ilustra en la Figura 14. En particular, el experimento se realizó con ratones FAP de 7 meses, como se describió anteriormente; véase el Ejemplo 11, anterior. Estos ratones reproducen el mecanismo fisiopatológico central de FAP y, al igual que los pacientes, presentan depósito de TTR dependiente de la edad en varios tejidos. Dos ratones FAP recibieron una única inyección intraperitoneal del anticuerpo monoclonal anti-TTR recombinante de origen humano NI-301.37F1 a una dosis de 3 mg/kg. Antes de la inyección de anticuerpos (t = 0) y dos días después de la inyección (t = 48 h), se recogieron pequeñas muestras de sangre y se preparó plasma para su análisis. Las muestras de plasma se sometieron a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-IgG humano (para recuperar el anticuerpo anti-TTR humano inyectado), con t = 0 se usaron muestras como controles negativos. A continuación, las muestras de inmunoprecipitación se procesaron mediante transferencia Western para detectar si el anticuerpo anti-TTR inyectado en ratones había capturado alguna proteína TTR mal plegada durante las 48 horas en las que circuló in vivo. Se realizaron transferencias Western usando tanto anticuerpos anti-TTR específicos de la conformación como independientes de la conformación. Se realizó un experimento de control con un anticuerpo de control de isotipo (que no puede unirse a la proteína TTR) como control negativo. Un control adicional consistió en incubar muestras de plasma de ratones FAP no tratados con el anticuerpo NI-301.37F1 in vitro, y procesarlas como se describió anteriormente.

Los resultados presentados en la Figura 14 indican que el anticuerpo NI-301.37F1 capturó alguna proteína TTR mal plegada durante el período de incubación de 48 horas in vivo. Esto se observó específicamente para el anticuerpo NI-301.37F1 y no para el anticuerpo de control de isotipo. Además, la proteína TTR mal plegada capturada por el anticuerpo NI-301.37F1 no estaba presente en las muestras de plasma recogidas de ratones no tratados. En conjunto, estos resultados indican que el anticuerpo NI-301.37F1 fue capaz de eliminar la proteína TTR mal plegada de los depósitos de TTR insolubles in vivo, cuya presencia podría detectarse sin necesidad de biopsias de tejido. Un ajuste técnico para utilizar esta prueba de diagnóstico en humanos consistiría en marcar el anticuerpo anti-TTR permitiendo su recuperación de la muestra de plasma humano, por ejemplo, con una etiqueta de biotina o histidina o estreptavidina. Alternativamente, el anticuerpo anti-TTR no modificado podría recuperarse de una muestra de plasma humano por medio de un anticuerpo anti-idiotípico.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-transtiretina (TTR) de origen humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que es capaz de unirse a especies de TTR mutadas, mal plegadas, mal ensambladas y/o agregadas y/o fragmentos de las mismas y no reconoce sustancialmente especies de TTR fisiológicas,

(i) en el que el anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo de TTR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos EEEFVEGIY (SEQ ID NO: 49), y en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su región variable o dominio de unión las siguientes seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable Vh y Vl:

(a)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 2

VH-CDR2: posiciones 50-65 de la SEQ ID NO: 2

VH-CDR3: posiciones 98-115 de la SEQ ID NO: 2

VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 4

VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 4, y

VL-CDR3: posiciones 89-98 de SEQ ID NO: 4, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos;

(ii) en el que el anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo de TTR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos GELHGLTTEEE (s Eq ID NO: 50), y en la que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su región variable o dominio de unión las siguientes seis CDR de la región variable Vh y Vl:

(b)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 6

VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 6

VH-CDR3: posiciones 99-109 de la SEQ ID NO: 6

VL-CDR1: posiciones 24-39 de la SEQ ID NO: 8

VL-CDR2: posiciones 55-61 de la SEQ ID NO: 8

VL-CDR3: posiciones 94-102 de la SEQ ID NO: 8, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos;

(iii) en el que el anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo de TTR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos WEPFA (SEQ ID NO: 51), y donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su región variable o dominio de unión el seis CDR de la región variable Vh y Vl seleccionadas de:

(c)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 10

VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 10

VH-CDR3: posiciones 100-109 de la SEQ ID NO: 10

VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 12

VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 12

VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 12, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos;

(e)

VH-CDR1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 18

VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 18

VH-CDR3: posiciones 100-116 de la SEQ ID NO: 18

VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 20

VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 20

VL-CDR3: posiciones 89-98 de la SEQ ID NO: 20, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos;

(l)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 46

VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 46

VH-CDR3: posiciones 99-108 de la SEQ ID NO: 46

VL-CDR1: posiciones 23-36 de la SEQ ID NO: 48

VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 48

VL-CDR3: posiciones 91-100 de la SEQ ID NO: 48, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos;

(m)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 53

VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 53

VH-CDR3: posiciones 100-109 de la SEQ ID NO: 53

VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 12

VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 12

VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 12, o en la que una o más de las CDR pueden comprender una o dos sustituciones de aminoácidos; o

(iv) en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende en su región variable o dominio de unión las seis CDR de la región variable Vh y Vl seleccionadas de:

(d)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 14

VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 14

VH-CDR3: posiciones 99-110 de la SEQ ID NO: 14

VL-CDR1: posiciones 23-36 de la SEQ ID NO: 16

VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 16

VL-CDR3: posiciones 91-102 de la SEQ ID NO: 16;

(f)

VH-CDR1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 22

VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 22

VH-CDR3: posiciones 100-117 de la SEQ ID NO: 22

VL-CDR1: posiciones 23-36 de la SEQ ID NO: 24

VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 24

VL-CDR3: posiciones 91-102 de la SEQ ID NO: 24;

(g)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 26

VH-CDR2: posiciones 50-65 de la SEQ ID NO: 26

VH-CDR3: posiciones 98-110 de la SEQ ID NO: 26

VL-CDR1: posiciones 31-36 de la SEQ ID NO: 28

VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 28

VL-CDR3: posiciones 91-99 de la SEQ ID NO: 28;

(h)

VH-CDR1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 30

VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 30

VH-CDR3: posiciones 100-113 de la SEQ ID NO: 30

VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 32

VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 32

VL-CDR3: posiciones 90-99 de la SEQ ID NO: 32;

(i)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 34

VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 34

VH-CDR3: posiciones 99-108 de la SEQ ID NO: 34

VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 36

VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 36

VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 36;

(j)

VH-CDR1: posiciones 31-38 de la SEQ ID NO: 38

VH-CDR2: posiciones 53-69 de la SEQ ID NO: 38

VH-CDR3: posiciones 102-114 de la SEQ ID NO: 38

VL-CDR1: posiciones 23-36 de la SEQ ID NO: 40 VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 40 VL-CDR3: posiciones 91-99 de la SEQ ID NO: 40;

(k)

VH-CDR1: posiciones 31-36 de la SEQ ID NO: 42 VH-CDR2: posiciones 51-66 de la SEQ ID NO: 42 VH-CDR3: posiciones 99-113 de la SEQ ID NO: 42 VL-CDR1: posiciones 23-35 de la SEQ ID NO: 44 VL-CDR2: posiciones 51-57 de la SEQ ID NO: 44 VL-CDR3: posiciones 90-100 de la SEQ ID NO: 44;

(n)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 55 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 55 VH-CDR3: posiciones 99-109 de la SEQ ID NO: 55 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 57 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 57 VL-CDR3: posiciones 89-99 de la SEQ ID NO: 57;

(o)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 62 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 62 VH-CDR3: posiciones 99-114 de la SEQ ID NO: 62 VL-CDR1: posiciones 23-35 de la SEQ ID NO: 64 VL-CDR2: posiciones 51-57 de la SEQ ID NO: 64 VL-CDR3: posiciones 90-101 de la SEQ ID NO: 64;

(p)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 66 VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 66 VH-CDR3: posiciones 100-107 de la SEQ ID NO: 66 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 68 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 68 VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 68;

(q)

VH-CDR1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 70 VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 70 VH-CDR3: posiciones 100-113 de la SEQ ID NO: 70 VL-CDR1: posiciones 23-33 de la SEQ ID NO: 72 VL-CDR2: posiciones 49-55 de la SEQ ID NO: 72 VL-CDR3: posiciones 88-96 de la SEQ ID NO: 72;

(r)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 74 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 74 VH-CDR3: posiciones 99-113 de la SEQ ID NO: 74 VL-CDR1: posiciones 23-36 de la SEQ ID NO: 76 VL-CDR2: posiciones 52-58 de la SEQ ID NO: 76 VL-CDR3: posiciones 91-100 de la SEQ ID NO: 76;

(s)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 78 VH-CDR2: posiciones 50-65 de la SEQ ID NO: 78 VH-CDR3: posiciones 98-105 de la SEQ ID NO: 78 VL-CDR1: posiciones 23-33 de la SEQ ID NO: 80 VL-CDR2: posiciones 49-55 de la SEQ ID NO: 80 VL-CDR3: posiciones 88-98 de la SEQ ID NO: 80; y

(t)

VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 82

VH-CDR2: posiciones 50-65 de la SEQ ID NO: 82

VH-CDR3: posiciones 98-110 de la SEQ ID NO: 82

VL-CDR1: posiciones 23-33 de la SEQ ID NO: 84

VL-CDR2: posiciones 49-55 de la SEQ ID NO: 84

VL-CDR3: posiciones 88-98 de la SEQ ID NO: 84.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende en su región variable o dominio de unión las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada variable (Vh) y ligera variable (Vl) seleccionada entre:

(a) SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4;

(b) SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8;

(c) SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12;

(d) SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16;

(e) SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20;

(f) SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24;

(g) SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 28;

(h) SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32;

(i) SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 36;

(j) SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40;

(k) SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 44;

(l) SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 48;

(m) SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 12;

(n) SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 57;

(o) SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 64;

(p) SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68;

(q) SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 72;

(r) SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 76;

(s) SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 80;

(t) SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 84; o

una cadena Vh y Vl que comprende las secuencias de aminoácidos resultantes de una alteración parcial de las secuencias de aminoácidos de cualquiera de (a) a (t) en la que la alteración se selecciona de la eliminación o eliminaciones, inserción o inserciones, sustitución o sustituciones y/o adición o adiciones de aminoácidos.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo se une al epítopo de TTR (i) GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50) pero no a un epítopo mutante L55P correspondiente o (ii) WEPFA (SEQ ID NO: 51) pero no a un mutante E42G correspondiente.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende además un dominio constante, preferiblemente en el que el dominio constante es un dominio constante humano, preferiblemente del tipo IgG.

5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el dominio constante es de la clase o isotipo IgG1.

6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es un anticuerpo quimérico murino-humano o murinizado.

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv), un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un Fragmento F(ab')².

8. Uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o vectores que comprenden el polinucleótido o polinucleótidos, preferiblemente en los que el polinucleótido o polinucleótidos son ADNc.

9. Una célula huésped que comprende el polinucleótido o polinucleótidos o vector o vectores de la reivindicación 8.

10. Un método para preparar un anticuerpo anti-TTR o un derivado biotecnológico del mismo, comprendiendo dicho método

(a) cultivar la célula de la reivindicación 9; y

(b) aislar el anticuerpo del cultivo.

11. Un anticuerpo codificado por el polinucleótido o polinucleótidos de la reivindicación 8 o que se puede obtener mediante el método de la reivindicación 10.

12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 u 11, que

(i) comprende una etiqueta detectable, preferiblemente en el que la etiqueta detectable se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo y un metal pesado; y/o

(ii) está unido a un fármaco.

13. Una composición que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 o 12, el polinucleótido o polinucleótidos o el vector o vectores de la reivindicación 8 o la célula de la reivindicación 9, preferiblemente en la que la composición

(i) es una composición farmacéutica y comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente en el que la composición es una vacuna y/o comprende un agente adicional útil para prevenir o tratar enfermedades asociadas con amiloidosis por TTR; o

(ii) una composición de diagnóstico, que preferiblemente comprende además reactivos usados convencionalmente en métodos de diagnóstico de base inmunológica o ácido nucleico.

14. Un anticuerpo anti-TTR o un fragmento de unión a TTR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 o 12, el polinucleótido o polinucleótidos o el vector o vectores de la reivindicación 8, la célula de la reivindicación 9 o la composición de la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad asociada con la amiloidosis por TTR, preferiblemente en la que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC), amiloidosis sistémica senil (SSA), amiloidosis familiar sistémica, amiloidosis leptomeníngea/del sistema nervioso central (CNS) incluida la enfermedad de Alzheimer, amiloidosis ocular relacionada con TTR, amiloidosis renal relacionada con TTR, hipertiroxinemia relacionada con TTR, amiloidosis del ligamento relacionada con TTR, incluido el síndrome del túnel carpiano, desgarros del manguito rotador y estenosis espinal lumbar, y preeclampsia o un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 o 12 para su uso en la detección o formación de imágenes in vivo de o que se dirige a un agente terapéutico y/o de diagnóstico para TTR en el cuerpo humano o animal, preferiblemente en el que dicha formación de imágenes in vivo comprende escintigrafía, tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía por emisión de fotón único (SPECT), infrarrojo cercano (NIR), formación de imágenes ópticas o formación de imágenes de resonancia magnética (MRI).

15. Un kit útil en el diagnóstico o seguimiento de un trastorno asociado con la amiloidosis por TTR, comprendiendo dicho kit al menos un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 o 12, el polinucleótido polinucleótidos o el vector o vectores de la reivindicación 8 y/o la célula de la reivindicación 9, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones de uso.

16. Un método para diagnosticar una enfermedad asociada con amiloidosis por TTR como se define en la reivindicación 14, control del tratamiento de la enfermedad con un anticuerpo anti-TTR o determinar la utilidad diagnóstica o terapéutica de un anticuerpo anti-TTR que comprende analizar el nivel de TTR mal plegada y/o agregada en una muestra de fluido corporal de un sujeto después de la administración de un anticuerpo anti-TTR al sujeto, en el que la presencia o nivel elevado de TTR mal plegada y/o agregada en la muestra del sujeto en comparación con un control indica una enfermedad asociada con amiloidosis por TTR, preferiblemente en el que el nivel de TTR mal plegada y/o agregada en la muestra se analiza determinando un complejo formado entre el anticuerpo anti-TTR y la TTR mal plegada y/o agregada, preferiblemente en el que el control es una muestra obtenida del sujeto antes de la administración del anticuerpo anti-TTR, preferiblemente en el que el fluido corporal es sangre y la muestra se deriva de la misma y/o el control es una muestra correspondiente de un fluido corporal tomado del sujeto antes de la administración del anticuerpo anti-TTR, en el que el anticuerpo anti-TTR es un anticuerpo anti-TTR o un fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 o 12.