BR112016014328B1

BR112016014328B1 - Terapia à base de anticorpos para amiloidose por transtirretina (ttr) e anticorpos derivados de humanos para a mesma

Info

Publication number: BR112016014328B1
Application number: BR112016014328-0A
Authority: BR
Inventors: Dr. Grimm Jan; Dr Michalon Aubin
Original assignee: Neurimmune Holding Ag
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2024-02-06
Also published as: EP3083681B1; AU2014369793A1; LT3083681T; EP3083681A1; AU2014369793B2; JP7258366B2; KR20160093726A; KR102496162B1; US10344080B2; JP2021087432A; NZ760022A; JP2020073464A; JP6841449B2; US11180545B2; PL3083681T3; CN106255702B; DK3083681T3; ES2815527T3; CN111471106A; CA2933008A1

Abstract

terapia de amiloidose de transtirretina (ttr) baseada em anticorpos e seus anticorpos humano-derivados. são fornecidos novos anticorpos derivados de humanos, específicos para transtirretina (ttr), de preferência, capazes de ligar-se a espécies de ttr agregadas, anormalmente configuradas e/ou anormalmente montadas, bem como métodos relacionados. além disso, são fornecidos métodos de diagnosticar e/ou monitorar doenças e seus tratamentos, que são associados à amiloidose de ttr. ensaios e conjuntos relacionados aos anticorpos específicos para ttr ou depósitos de ttr e agregados também são divulgados. os novos anticorpos anti-ttr podem ser utilizados em composições farmacêuticas e de diagnóstico para imunoterapia e diagnósticos direcionados a ttr.

Description

CAMPO DA INVEÇÃO

[001] A presente invenção geralmente refere-se à terapia à base de anticorpos para amiloidose por transtirretina (TTR). Em especial, a presente invenção refere-se a novas moléculas que se ligam especificamente à transtirretina (TTR) humana e a seus antígenos, em especial a anticorpos recombinantes derivados de humanos, bem como a fragmentos, derivados e variantes desses que reconheçam as formas anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada de TTR ou de seus fragmentos, e que são úteis no tratamento de doenças e transtornos induzidos por essas isoformas patogênicas de TTR.

[002] Além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas e de diagnóstico que compreendem esses anticorpos e moléculas de ligação e suas imitações, ambos valiosos como uma ferramenta de diagnóstico para a identificação de doenças associadas à amiloidose de TTR e também uma estratégia de vacinação passiva para o tratamento de transtornos relacionados a doenças associadas com a amiloidose de TTR, como por exemplo, Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF), Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF), Amiloidose Sistêmica Senil (ASS), amiloidose familiar sistêmica, amiloidose leptomeníngea / do Sistema Nervoso Central (SNC), incluindo Mal de Alzheimer, amiloidose ocular relativa à TTR, amiloidose renal relativa à TTR, hipertiroxinemia relativa à TTR, amiloidose de ligamentos relativa à TTR, incluindo a síndrome do túnel do carpo, lesões do manguito rotador e estenose espinhal lombar, e pré- eclâmpsia.

[003] Além disso, a presente invenção refere-se a um método de diagnóstico de uma doença ou transtorno induzido(a) por isoformas patogênicas de TTR, como por exemplo, TTR anormalmente configurada e/ou agregada presente em depósitos amiloides, em que níveis de isoformas patológicas de TTR são ensaiadas em uma amostra de fluido corporal de um indivíduo após a administração de um anticorpo anti-TTR, em que, quando em comparação com uma amostra de controle tomada antes da administração, a presença ou alteração do nível das isoformas patogênicas de TTR, por exemplo, tal como determinado pela presença de um imunocomplexo de TTR, e o anticorpo anti-TTR indique a doença e/ou transtorno.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] A transtirretina (TTR), anteriormente intitulada de pré-albumina, é uma proteína solúvel de 127 aminoácidos (sequência de referência no NCBI: NP_000362.1) envolvida com o transporte de tiroxina e retinol pelo corpo. A TTR é secretada no sangue pelo fígado e no líquido cefalorraquidiano pelo plexo coroide, e também é expressa em tecidos específicos como as células alfa pancreáticas ou o epitélio da retina. A síntese da TTR se inicia em idades embrionárias e continua durante toda a vida. Está presente em concentração elevada no plasma (3,6-7,2 μM) e no líquido cefalorraquidiano (0,04-0,4 μM) e forma, tipicamente e em condições fisiológicas, um homotetrâmero solúvel de ~55 kDa.

[005] Em condições específicas que foram mal esclarecidas e podem incluir pH ácido, desgaste oxidativo e fatores locais, a proteína TTR adota uma conformação tridimensional alternativa e se torna tóxica.

[006] A toxicidade da proteína TTR anormalmente configurada foi descoberta ao se investigar um transtorno neurodegenerativo raro e autossômico dominante intitulado Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF), que afeta adultos de meia-idade (Planté- Bordeneuve et al., Lancet Neurol. 10 (2011), 1086-1097). A PAF é caracterizada por deficiências sensoriais, motoras e autonômicas progressivas, e leva à morte uma década após o diagnóstico. As lesões nervosas são associadas à deposição de agregados amorfos e fibrilas amiloides feitas da proteína TTR. A substituição Val30Met é a mutação mais frequente causadora da PAF, sobretudo em áreas onde a doença é endêmica, como no norte de Portugal, mas mais de 100 mutações diferentes já foram identificadas no gene da TTR; vide Tabela IV abaixo. O mecanismo fisiopatológico abordado é idêntico para todas as mutações patogênicas, em que as mutações alteram a estabilidade estrutural do tetrâmero da TTR, promovendo a configuração anormal da TTR e levando à formação de espécies tóxicas de TTR (Saraiva et al., Curr. Med. Chem. 19 (2012), 2304-2311).

[007] A toxicidade da TTR também é observada como consequência da mutação Val122Ile, que é encontrada com frequência elevada (3-5%) nas populações afro- americanas e do oeste africano. Essa mutação está associada à Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF), um transtorno em que o enorme acúmulo de TTR no miocárdio leva a deficiências cardíacas e, por fim, à insuficiência cardíaca (Ruberg et al., Circulation. 126 (2012), 1286-1300).

[008] Mutações na sequência proteica da TTR não representam uma exigência rigorosa para toxicidade da TTR, e a proteína da TTR em estado natural também fica propensa à configuração anormal e à formação de agregados tóxicos. Por exemplo, a Amiloidose Sistêmica Senil (ASS) é caracterizada por deficiências cardíacas e pelo acúmulo de agregados da TTR em estado natural no miocárdio (Ikeda, Amyloid. 18 Suppl 1 (2011), 155-156; Dungu et al., Heart. 98 (2012), 1546-1554). Depósitos de TTR em estado natural também são observados em vários casos de inflamações em ligamentos e tendões, incluindo a síndrome do túnel do carpo, lesões do manguito rotador e estenose espinhal lombar (Sueyoshi et al., Hum. Pathol. 42 (2011), 1259-1264; Gioeva et al., Amyloid. 20 (2013), 1-6). Além disso, a amiloidose por TTR foi recentemente descoberta na placenta de mulheres que sofrem de pré-eclampsia (Kalkunte et al., Am. J. Pathol. 183 (2013) 14251436).

[009] Tratamentos para doenças com amiloidose por TTR são limitados e, principalmente, invasivos, em que o tratamento ocorre, principalmente, devido aos sintomas. No caso da PAF, os tratamentos se baseiam em analgésicos para o tratamento da dor neuropática, no transplante do fígado para remover a fonte principal da proteína da TTR que sofreu a mutação, e no tratamento com Tafamidis, que é uma pequena molécula que se liga ao tetrâmero da TTR e estabiliza sua conformação. Atua contra a dissociação do tetrâmero da TTR, a etapa limitante da proporção na via de configuração anormal que leva à formação de espécies tóxicas de TTR. O Tafamidis foi aprovado para o tratamento da PAF na Europa, mas não nos EUA, e sua eficácia terapêutica é limitada, no melhor dos casos, para abrandar a progressão da doença. Atualmente, não há tratamento disponível que almeje a proteína da TTR anormalmente configurada.

[0010] Em vista do relacionado acima, novas estratégias terapêuticas são necessárias para uma terapia eficaz e segura de doenças associadas à amiloidose por TTR.

[0011] Esse problema técnico é resolvido pelas formas de realização caracterizadas nas reivindicações e descritas mais abaixo e ilustradas nos Exemplos e Figuras.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0012] A presente invenção proporciona anticorpos antitranstirretina (TTR) e moléculas de ligação à TTR equivalentes para utilização no tratamento profilático ou terapêutico de doenças e transtornos associados à amiloidose por TTR. Mais especificamente, anticorpos recombinantes provenientes de humanos e terapeuticamente úteis, bem como fragmentos e seus derivados que reconheçam as formas anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada de TTR são fornecidos.

[0013] Agregados de TTR anormalmente configurados são associados a marcadores de desgaste celular, desgaste oxidativo, resposta inflamatória e apoptose muitos anos antes do aparecimento dos sintomas (Macedo et al., Mol. Med. 13 (2007), 584-91). A capacidade natural do corpo em reconhecer proteínas anormalmente dobradas e degradá-las é um fator de proteção, e as diferenças entre pacientes em sua capacidade de eliminar as proteínas tóxicas da TTR certamente contribuem para as diferenças na idade do aparecimento da doença e na velocidade de sua progressão. Em apoio a essa hipótese, já foi provado que pacientes que receberam transplante de fígado de um doador portadores de PAF desenvolvem rapidamente anticorpos contra a proteína patogênica da TTR (Ando et al., Transplantation. 73 (2002), 751-755), e que pacientes portadores de PAF com elevados títulos de anticorpos contra a proteína da TTR que sofreu a mutação apresentam um aparecimento da doença mais tardio que pacientes sem esses anticorpos (Obayashi et al., Clin. Chim. Acta. 419 (2013), 127-131). Além disso, já foi provado que a imunização ativa contra a conformação patogênica da TTR remove quase totalmente deposições de TTR em camundongos transgênicos portadores de PAF (Terazaki et al., Lab. Invest. 86 (2006), 2331).

[0014] No entanto, embora possa ter parecido tentador investigar uma estratégia de base imunológica para intervenção terapêutica, até aqui a utilização de anticorpos anti-TTR para tratamento de doenças relacionadas à TTR não foi buscada. Por exemplo, no pedido internacional WO2010/030203, um anticorpo monoclonal de camundongo isolado em especial para TTR foi descrito e proposto para ser utilizado na triagem de PAF e para pesquisa e tratamento de doenças associadas. No entanto, pelo fato dos anticorpos monoclonais de camundongo induzirem resposta dos anticorpos humanos anticamundongo (AHAC), não são apropriados para terapia em humanos. Portanto, como já expirou a validade da pedido internacional sem nenhum desenvolvimento posterior ter sido publicado, aparentemente, uma abordagem terapêutica com base em anticorpos não foi seguida. Em vez disso, até agora, para anticorpos anti-TTR, apenas sua utilidade para diagnóstico de pacientes com amiloidose por TTR foi investigada ainda mais a fundo; vide, ex.: Phay M. et al., Rejuvenation Res. 2013 Oct 28. [Publicação eletrônica antes da versão impressa].

[0015] Em contraste, experimentos realizados em conformidade com a presente invenção foram exitosos no isolamento de anticorpos específicos com TTR monoclonais de origem humana que atingiram a maturação no corpo humano e são específicos de espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas, que sofreram mutação e/ou agregadas e/ou seus fragmentos. Os indivíduos que foram testados e os pacientes, respectivamente, sendo a origem das células B de onde os anticorpos anti-TTR monoclonais de origem humana e o DNAc que codifica seus domínios variáveis, respectivamente, foram isolados, não mostraram uma quantidade substancial de TTR anormalmente configurada e estavam livres de sintomas das condições associadas a isoformas patogênicas. No entanto, em outra forma de realização da presente invenção, a origem das células B de onde os anticorpos anti-TTR monoclonais de origem humana e o DNAc que codifica seus domínios variáveis, respectivamente, pode ser isolada caso haja pacientes que apresentem sintomas de um(a) doença e/ou transtorno associado(a) à amiloidose por TTR. Portanto, é prudente esperar que os anticorpos anti-TTR monoclonais humanos da presente invenção e seus derivados, além de serem não imunogênicos em humanos, exibam um efeito terapeuticamente benéfico.

[0016] A presente invenção é, portanto, direcionado para anticorpos recombinantes de origem humana, fragmentos de ligação a antígenos e moléculas de ligação a antígenos semelhantes que sejam capazes de reconhecer especificamente a TTR. Se não estiver indicado de outra forma, por “reconhece especificamente a TTR”, “anticorpo específico de/para TTR” e “anticorpo anti-TTR”, os anticorpos referem-se ao que se liga especificamente, em geral e coletivamente à forma monomérica nativa da TTR; anticorpos que se ligam especificamente a qualquer uma das formas de TTR, ex.: TTR que sofreu mutação, oligomérica, fibrilar e/ou não fibrilar. Aqui fornecidos estão anticorpos de origem humana seletivos para as formas inteiriça e/ou fragmentada e/ou anormalmente configurada, anormalmente montada e/ou agregada de TTR.

[0017] Conforme anteriormente mencionado, de preferência o anticorpo anti-TTR da presente invenção é um anticorpo recombinante, em que pelo menos um, de preferência dois, ou de maior preferência, todas as três regiões determinantes de complementaridade (RDCs) da cadeia variável pesada e/ou leve, e/ou substancialmente, toda a região variável é codificada por um DNAc derivado de um RNAm obtido a partir de uma célula B de memória humana que produziu um anticorpo anti-TTR. Em uma forma de realização preferida, o anticorpo anti-TTR da presente invenção exibe, em qualquer combinação, mais uma das propriedades de ligação e biológicas conforme demonstradas para os anticorpos submetidos ilustrados nos Exemplos e Figuras em anexo, de preferência mais uma das propriedades de ligação e biológicas conforme demonstrado para os anticorpos exemplificativos NI-301.59.F1, NI-301.35G11 e NI-301.37F1.

[0018] Em uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção, o anticorpo anti-TTR ou seu fragmento de ligação à TTR demonstra as características de ligação imunológica de um anticorpo caracterizado pelas regiões variáveis VH e/ou VL, como mostra a Fig. 1.

[0019] O fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo pode ser um fragmento Fv de cadeia simples, um fragmento F(ab’), um fragmento F(ab), e um fragmento F(ab’)2, ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno. Em uma forma de realização específica, infra, o anticorpo ou seu fragmento é um anticorpo do isotipo de IgG humana. Como alternativa, o anticorpo é um anticorpo murino ou de humano-roedor quimérico, como por exemplo, anticorpo murino ou murinizado, de rato ou ratinizado, sendo as versões de roedores particularmente úteis para métodos de diagnóstico e estudos em animais.

[0020] Além disso, a presente invenção refere-se a composições que compreendem o anticorpo da presente invenção ou seus fragmentos ativos e a métodos imunoterapêuticos e de imunodiagnóstico que utilizem essas composições na prevenção, no diagnóstico ou no tratamento de transtornos associadas à amiloidose por TTR, em que uma quantidade eficaz da composição seja administrada a um paciente que dela necessite.

[0021] A presente invenção refere-se também a polinucleotídeos que codifiquem pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina do anticorpo da invenção. De preferência, essa região variável compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (RDC) do VH e/ou VL da região variável, como mostra a Fig. 1. Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o polinucleotídeo é um DNAc, de preferência derivado de um RNAm obtido a partir de células B de memória humana que produzem anticorpos reativos com espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas.

[0022] Por conseguinte, a presente invenção também engloba vetores que compreendem os referidos polinucleotídeos e células hospedeiras transformadas com eles, bem como sua utilização para a produção de um anticorpo e de moléculas de ligação equivalentes que são específicas para TTR. Em outra forma de realização da presente invenção, os anticorpos ou moléculas de ligação são capazes de ligar espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou seus fragmentos. Os meios e métodos para a produção recombinante de anticorpos e de imitadores dos mesmos, bem como os métodos de triagem de moléculas de ligação concorrentes, que podem ou não ser anticorpos, são conhecidos no ramo. No entanto, tal como aqui descrito, e em especial no que diz respeito a aplicações terapêuticas em humanos, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo humano no sentido de que a aplicação do referido anticorpo fica substancialmente livre de uma resposta imunológica direcionada contra esse anticorpo de outro modo observado para anticorpos quiméricos, e até mesmo para anticorpos humanizados.

[0023] Além disso, aqui descritos estão métodos e composições que podem ser utilizados para identificar a TTR, em especial as espécies de TTR que sofreram mutação, as anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou fragmentos em amostras e/ou in vivo. Os anticorpos anti-TTR revelados e seus fragmentos de ligação podem ser utilizados para triagem de sangue humano, plasma, soro, saliva, líquido peritoneal, líquido cefalorraquidiano, e de urina para a presença de TTR e/ou espécies de TTR que sofreram mutação, as anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou fragmentos em amostras, por exemplo, utilizando o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou o ensaio adaptado à superfície. Em uma forma de realização, a presente invenção refere-se a um método de diagnóstico ou monitoramento da progressão de um transtorno relativo a espécies de TTR que sofreram mutação, as anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou seus fragmentos em um indivíduo, com o método compreendendo a determinação da presença de espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou fragmentos em uma amostra proveniente do indivíduo a ser diagnosticado com pelo menos um anticorpo da presente invenção ou uma molécula de ligação à TTR e/ou moléculas de ligação a espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou fragmentos que tenham substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um destes, em que a presença de espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou fragmentos seja indicativa do transtorno.

[0024] Além disso, em uma forma de realização da presente invenção, os anticorpos anti- TTR e as moléculas de ligação à TTR que compreendam pelo menos uma RDC de um anticorpo da presente invenção são providenciados para a preparação de uma composição para detecção in vivo (também intitulada ‘imagiologia in vivo’) ou para almejar um agente terapêutico e/ou de diagnóstico para a TTR, em especial para espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou fragmentos no corpo humano ou animal. Os métodos e composições descritos no presente documento podem auxiliar em transtornos associados à amiloidose por TTR e caracterizados, ex.: pela ocorrência de formas de TTR e pode ser utilizado para monitorar a progressão da doença e a eficácia terapêutica da terapia aplicada ao indivíduo, por exemplo, em métodos de diagnóstico relativos à imagiologia in vivo. Portanto, em uma forma de realização, o anticorpo anti-TTR e/ou a molécula de ligação à TTR da presente invenção é fornecido(a), em que essa detecção in vivo (imagiologia) compreenda cintilografia, tomografia por emissão de pósitrons (TEP), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), imagiologia ótica do infravermelho próximo (NIR) ou imagem por ressonância magnética (IRM).

[0025] Por isso, é um objetivo específico da presente invenção fornecer métodos de tratamento, diagnóstico ou prevenção de doenças associadas à amiloidose por TTR. Os métodos compreendem a administração de uma concentração eficaz de um anticorpo que seja, de preferência, humano, ou de um anticorpo proveniente de um indivíduo em que o anticorpo almeje a TTR ou seus fragmentos, de preferência as espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou seus fragmentos.

[0026] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um peptídeo que apresenta um epítopo de TTR, de preferência de espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou seus fragmentos especificamente reconhecidos por um anticorpo da presente invenção. Esse peptídeo compreende ou é composto por uma sequência de aminoácidos tal como indicada abaixo na descrição detalhada e nos exemplos ou por uma sequência modificada deles, em que um ou mais aminoácidos são substituídos, eliminados e/ou adicionados, com a condição de que o peptídeo continua sendo reconhecido pelo anticorpo cognato. Conforme mencionado, esse peptídeo pode ser utilizado como um antígeno, isto é, como um imunógeno, e, portanto, ser útil para induzir uma resposta imunológica em um indivíduo e estimular a produção de um anticorpo da presente invenção in vivo. Assim, o peptídeo da presente invenção é especialmente útil como uma vacina.

[0027] Além disso, a presente invenção proporciona um método para o diagnóstico de doenças associadas à amiloidose por TTR em um indivíduo, compreendendo uma etapa de determinação da presença de um anticorpo que se liga a esse peptídeo em uma amostra biológica desse indivíduo.

[0028] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de diagnóstico de uma doença associada à amiloidose por TTR, monitorando o tratamento da doença com um anticorpo anti-TTR ou determinando a utilidade terapêutica ou de diagnóstico de um anticorpo anti-TTR, compreendendo ensaios do nível de TTR anormalmente configurada e/ou agregada em uma amostra, como por exemplo, sangue proveniente de um indivíduo após a administração de um anticorpo anti-TTR para o indivíduo, em que a presença ou o elevado nível de TTR anormalmente configurada e/ou agregada na amostra do indivíduo, em comparação com o grupo de controle, como uma amostra proveniente de um indivíduo antes da administração do anticorpo anti-TTR indica uma doença associada à amiloidose por TTR.

[0029] Em uma forma de realização de preferência da presente invenção, em especial ao utilizar animais não humanos para testar anticorpos recombinantes de origem humana conforme ilustrado no Exemplo 13 e outros anticorpos anti-TTR destinados para utilização em seres humanos, em geral, o nível de TTR anormalmente configurada e/ou agregada na amostra é alvo de ensaios pela determinação de um complexo formado entre o anticorpo anti-TTR e a TTR anormalmente configurada e/ou agregada, por exemplo, por imunoprecipitação com uma IgG anti-humana ou um anticorpo anti-idiotípico.

[0030] Referentemente ao aspecto de diagnóstico em especial para um indivíduo humano e um paciente, a presença e o nível elevado de TTR anormalmente configurada e/ou agregada e seu complexo com o anticorpo anti-TTR, respectivamente, indica a presença de depósitos de amiloide de TTR no corpo humano, como por exemplo, no coração, no sistema nervoso periférico (SNP), nos olhos, músculos, trato gastrointestinal, rins, sistema vascular e no sistema nervoso central (SNC) de um paciente ou indivíduo. Assim, o método da presente invenção permite a identificação e a determinação de uma doença associada à amiloidose por TTR no corpo do indivíduo, por um lado, e a remoção de depósitos de TTR do corpo do paciente, por outro, deste modo, também, indicando o progresso terapêutico de um dado tratamento e a eficácia de um medicamento para o tratamento da amiloidose por TTR, como por exemplo, um anticorpo anti-TTR.

[0031] Consequentemente, conforme demonstrado no Exemplo 13, o anticorpo anti-TTR da presente invenção é capaz de se ligar à TTR anormalmente configurada e/ou agregada com afinidade suficiente para alterar a estabilidade dos depósitos da TTR patológica como para capturar e remover TTRs anormalmente configuradas e/ou agregadas dos depósitos de um fluido corporal, em especial, do sangue. O intervalo de tempo especificado após a administração, isto é, o período de tempo após o qual o nível de TTR patológica e complexa com o anticorpo anti-TTR, respectivamente, é medido e determinado por um médico praticante. Normalmente, um intervalo de tempo inferior a uma semana é utilizado. Em uma forma de realização de preferência, o nível de TTR patológica de uma amostra de um paciente ou indivíduo após a administração de um anticorpo anti-TTR ou de seu fragmento de ligação com o antígeno no paciente ou indivíduo é determinado após um período de tempo menor ou igual a 48 horas; vide também o Exemplo 13.

[0032] A presente invenção também se refere à utilização de qualquer anticorpo anti-TTR e molécula de ligação a TTR no método descrito acima. No entanto, devido às vantajosas propriedades, e em especial, devido à sua origem humana, a utilização de um anticorpo anti-TTR do relatado no presente instrumento é a preferida. Em uma forma de realização de preferência, o anticorpo mostra substancialmente as mesmas atividades de ligação e biológicas de qualquer anticorpo selecionado de NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI- 301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI- 301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.37F1-PIMC, NI- 301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 e NI- 301.14C3. O anticorpo anti-TTR também pode ser alterado para facilitar o manuseio do método de diagnóstico, incluindo a identificação do anticorpo conforme descrito em detalhes abaixo.

[0033] Outras formas de realização da presente invenção ficarão aparentes a partir da descrição e dos Exemplos que se seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

[0034] Fig. 1: Sequências de aminoácidos das regiões variáveis de anticorpos humanos NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI- 301.37F1-PIMC, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 e NI-301.14C3.

[0035] Estruturas (FR) e regiões de determinação de complementaridade (RDCs) são indicadas com as RDCs sendo sublinhadas. Foi utilizado o esquema de numeração de Kabat (cf. http://www.bioinf.org.uk/abs/).

[0036] Fig. 2: Ligação à TTR agregada, em estado natural e que sofreu mutação por ensaio ELISA direto.

[0037] A, B, C: Placas para o ensaio ELISA foram revestidas com TTR humana agregada e em estado natural (•), V30M-TTR recombinante agregada (▼) e albumina de soro bovino (ASB) (■) a 10 μg/ml, e incubadas com os seguintes anticorpos monoclonais humanos em um intervalo de concentração de 4 pM a 400 nM: A) NI-301.59F1, B) NI- 301.35G11 e C) NI-301.37F1.

[0038] Os valores de EC50 foram estimados ajustando-se os pontos de dados com o método dos mínimos quadrados.

[0039] NI-301.59F1: wt-TTR agregada EC50= 3.0 nM, V30M-TTR agregada EC50= 15.5 nM

[0040] NI-301.35G11: wt-TTR agregada EC50= 3.9 nM, V30M-TTR agregada EC50= 5.0 nM

[0041] NI-301.37F1: wt-TTR agregada EC50= 0.35 nM, V30M-TTR agregada EC50= 0.15 nM

[0042] Fig. 3: Especificidade para TTR agregada com técnica de hibridização.

[0043] Proteína humana de TTR em estado natural nas conformações nativa (1) ou agregada (2), e proteína de V30M-TTR recombinante agregada (3) foram depositadas em uma membrana de nitrocelulose e incubadas com os seguintes anticorpos: A) anticorpo comercial policlonal de coelho contra TTR (Dako-A0002; 150 ng/ml), B) NI-301.59F1 C) NI-301.35G11 e D) NI-301.37F1 (B, C e D: anticorpos monoclonais humanos a 50 nM).

[0044] Fig. 4: Especificidade para TTR agregada com a técnica “western blot”.

[0045] Proteína humana de TTR em estado natural (300 ng) nas conformações nativa (1) ou agregada (2), e extrato de fígado murino em estado natural (10 μg de proteínas totais) (3) foram carregados em um gel de eletroforese (SDS-PAGE) e processados com a técnica “western blot” com os seguintes anticorpos: A) anticorpo comercial policlonal de coelho contra TTR (Dako-A0002; 150 ng/ml), B) NI-301.59F1 C) NI-301.35G11 e D) NI- 301.37F1 (B, C e D: anticorpos monoclonais humanos a 50 nM). Para evitar dissociação dos agregados de elevado peso molecular, a amostra de TTR agregada foi reticulada com glutaraldeído (1%, 5 min.) antes do carregamento no gel.

[0046] Fig. 5: Ausência de ligação à TTR de plasma humano com a técnica “western blot”.

[0047] Amostras de plasma (0,5 ul) provenientes de grupos de controle (n=5), portadores de mutação assintomáticos (n=5) e pacientes portadores de PAF (n=4) foram carregados em um gel de eletroforese (SDS-PAGE) e processados com a técnica “western blot” com os seguintes anticorpos: A) anticorpo comercial policlonal de coelho contra TTR (Dako- A0002; 150 ng/ml), B) somente anticorpo secundário (IgG-HRP anti-humano, com 1/10.000 de diluição), C) NI-301.35G11 e D) NI-301.37F1 (C e D: anticorpos monoclonais humanos a 50 nM).

[0048] Fig. 6: Ausência de ligação à TTR de plasma humano com a técnica de hibridização.

[0049] Proteína de TTR que sofreu mutação e pura em estado natural nas conformações nativa e agregada, e amostras de plasma provenientes de grupos de controle, portadores de mutação assintomáticos e pacientes portadores de PAF foram depositadas em uma membrana de nitrocelulose e incubadas com os seguintes anticorpos: A) anticorpo comercial policlonal de coelho contra TTR (Dako-A0002; 150 ng/ml), B) somente anticorpo secundário (IgG2a-HRP antimurino, com 1/10.000 de diluição), e C) anticorpo quimérico murino NI-301.mur35G11 (10 nM).

[0050] Amostras de 1 a 6: 150 ng de 1) wt-TTR agregada, 2) wt-TTR nativa, 3) ASB, 4) V30M-TTR nativa, 5) L55P-TTR nativa e 6) Y78F-TTR nativa.

[0051] Amostras de 7 a 18: 2 μl de plasma recolhidas de 7 a 10) grupos de controle (n=4), 11 a 14) portadores de mutação assintomáticos (n=4) e 15 a 18) pacientes portadores de PAF (n=4).

[0052] Fig. 7: Ligação específica à TTR agregada em solução.

[0053] Proteína de TTR recombinante e humana em estado natural nas conformações nativa e agregada, e uma amostras de plasma humano com 3 diluições diferentes foram utilizadas para imunoprecipitação (IP) de TTR utilizando os seguintes anticorpos: A) anticorpo comercial policlonal de coelho contra TTR (Dako-A0002), B) NI-301.35G11 e C) NI-301.37F1. As proteínas imunoprecipitadas foram submetidas a eletroforese (SDS- PAGE) e detectadas com a técnica “western blot” (WB) com o anticorpo Dako-A0002 (150 ng/ml).

[0054] Faixas de 1 a 2: grupos de controle de carregamento com a técnica “western blot”: 300 ng de 1) wt-TTR humano, 2) wt-TTR recombinante

[0055] Faixas de 3 a 6: IP com proteína pura de TTR: 3) wt-TTR humana nativa, 4) wt- TTR humana agregada, 5) wt-TTR recombinante nativa e 6) wt-TTR recombinante agregada

[0056] Faixas de 7 a 10: IP com plasma humano diluído 7) 10 vezes, 8) 100 vezes, 9) 1.000 vezes com PBS, e 10) somente PBS

[0057] Fig. 8: Ligação específica à TTR com tecido murino portadores de PAF.

[0058] Camundongos transgênicos com expressão do alelo da V30M-TTR humana em um panorama de “knockout” (KO) da TTR reproduzem as características histopatológicas da PAF, incluindo depósitos de TTR amorfos e amiloides em diversos tecidos. Cortes de tecidos do fígado e do intestino coletados de A) murinos portadores de PAF e B) murinos com KO-TTR foram processados para imuno-histoquímica utilizando os seguintes anticorpos: 1) anticorpo comercial policlonal de coelho contra TTR (Dako-A0002; com 1/1.000 de diluição), 2) NI-301.35G11 e 3) NI-301.37F1 (2 e 3: anticorpos monoclonais humanos a 50 nM).

[0059] Fig. 9: Ligação específica a depósitos de TTR anormalmente configurada, mas não de TTR nativa em tecido humano.

[0060] Os anticorpos foram caracterizados por sua capacidade de ligar TTRs em cortes de biópsias da pele de pacientes portadores de PAF e do pâncreas de pacientes saudáveis do grupo de controle: os acúmulos de TTR anormalmente configurada que são característicos de PAF estão presentes na biópsia da pele do paciente, enquanto que as células alfa do pâncreas mostram uma expressão endógena da TTR. Os cortes foram processados por imuno-histoquímica utilizando os seguintes anticorpos: 1A) anticorpo comercial policlonal de coelho contra TTR (Dako-A0002; com 1/1.000 de diluição), 1B) anticorpo de IgG anticoelho acoplado à HRP (com 1/125 de diluição), 2A) anticorpo quimérico de murino NI-301.mur35G11 (50 nM), 2B) anticorpo IgG2a antimurino acoplado à HRP (com 1/125 de diluição), 3A) NI-301.37F1 (50 nM), e 3B) IgG anti-humano acoplado à HRP (com 1/125 de diluição).

[0061] Fig. 10: Epítopos de ligação à TTR avaliados por análise pelo método “pepscan”.

[0062] Os epítopos de ligação a anticorpos na TTR foram determinadas por meio da utilização do método de verificação de peptídeos. Além dos peptídeos que abrangem toda a sequência da TTR humana em estado natural (pontos de 1 a 29), mutações de TTR selecionadas também foram representadas na membrana (pontos de 30 a 44). A membrana de verificação de peptídeos foi incubada com os seguintes anticorpos a 50 nM: A) NI- 301.59F1, B) NI-301.35G11 e C) NI-301.37F1. Conforme resumido na Tabela D): NI- 301.59F1 liga EEEFVEGIY (TTRs de 61 a 69); NI-301.35G11 liga GELHGLTTEEE (TTRs de 53 a 63); a mutação L55P impede a ligação a anticorpos; e NI-301.37F1 liga WEPFA (TTRs de 41 a 45); a mutação E42G impede a ligação a anticorpos. Para determinar as exigências de sequência dos epítopos mencionados, os epítopos de ligação a anticorpos na TTR foram posteriormente identificados utilizando o método de verificação de alanina. Toda a sequência de proteínas de TTR humana em estado natural foi representada na membrana na forma de um conjunto de 151 peptídeos sucessivos de 15 aminoácidos de comprimento, iniciando em todos os aminoácidos da proteína da TTR. Para cada peptídeo, o aminoácido na posição 10 foi substituída por uma alanina ou por glicina ou prolina quando o aminoácido inicial era uma alanina. A membrana verificação de peptídeos foi incubada com os seguintes anticorpos a 20 nM: E) NI-301.59F1, F) NI- 301.35G11 e G) NI-301.37F1. Conforme resumido na Tabela H):

[0063] NI-301.59F1 liga EEFXEGIY (TTRs de 61 a 68).

[0064] NI-301.35G11 liga ELXGLTXE (TTRs de 54 a 61).

[0065] NI-301.37F1 liga WEPFA (TTRs de 41 a 45), em que X representa aminoácidos; A troca de E42 por alanina não atrapalhou a ligação, mas a troca por guanina impediu a ligação do anticorpo, conforme relatado no C.

[0066] Fig. 11: Cinética de ligação do anticorpo à proteína da TTR em solução avaliada por ressonância plasmônica de superfície.

[0067] A cinética de ligação do anticorpo NI-301.37F1 à proteína da TTR foi medida por ressonância plasmônica de superfície (RPS). O anticorpo NI-301.37F1 foi capturado no sensor por meio de um anticorpo de IgG anti-humana, e a solução da proteína da TTR foi levada sobre a superfície do sensor, em concentrações que variaram de 3,2 a 316 nM. Um simples modelo de ligação 1:1 foi utilizado para ajustar os dados e obter as respectivas constantes de associação (ka) e dissociação (kd) e a afinidade (KD). As propriedades de ligação foram determinadas para A) proteína da TTR humana em estado natural em conformação nativa, B) proteína da TTR humana desnaturada em estado natural, (conformação anormalmente configurada), e C) proteína TTR-L55P mutante recombinante.

[0068] TTR nativa em estado natural: ka= indeterminada, kd= indeterminada, KD>316 nM

[0069] TTR desnaturada em estado natural: ka=2,1 104 M-1s-1, kd=2,6 10-5 s-1, KD=1,2 nM

[0070] TTR-L55P recombinante: ka=3,3 104 M-1s-1, kd=4,6 10-5 s-1, KD=1,4 nM

[0071] Fig. 12: O tratamento crônico com anticorpo anti-TTR reduz a deposição da TTR patológica em modelos murinos portadores de PAF.

[0072] Murinos portadores de PAF (Tg(6.0hMet30) x muTTR-KO) receberam administração semanal do anticorpo quimérico de murino NI-301.37F1 ou do grupo de controle de isotipo a 3 mg/kg i.p. durante 12 semanas. Ao final do período do tratamento, foram coletados tecidos e a medida de deposição da TTR foi quantificada por imunofluorescência. A) Efeito do tratamento em camundongos de 7 meses de idade (n=14- 15 camundongos por grupo); B) Efeito do tratamento em camundongos de 17 meses de idade (n=10 camundongos por grupo). Comparações entre os grupos com um teste-t de duas extremidades não pareadas.

[0073] Fig. 13: Ligação do anticorpo a depósitos da TTR patológica in vivo.

[0074] O envolvimento do alvo foi caracterizado em camundongos adultos (7 meses) portadores de PAF 48 horas após a administração de uma dose única do anticorpo NI- 301.37F1 a 30 mg/kg i.p, ou SBP. Depósitos de TTR patológica e a localização do anticorpo injetado foram detectados simultaneamente por imunofluorescência.

[0075] A, D) Depósitos de TTR patológica nos rins de (A) NI-301.37F1- ou (D) camundongos injetados com SBP. B, E) Detecção de anticorpos humanos em (B) NI- 301.37F1- ou (E) camundongos injetados com SBP. C, F) Imagens sobrepostas mostrando (C) colocalização de TTR e NI-301.37F1 e (F) ausência de coloração inespecífica.

[0076] Fig. 14: Detecção livre de tecidos da TTR anormalmente configurada in vivo.

[0077] Camundongos adultos portadores de PAF receberam uma única administração de NI-301.37F1 ou do anticorpo de controle de isotipo a 3 mg/kg i.p. As amostras de sangue foram colhidas antes da injeção de anticorpos (t=0) e 48 horas após a injeção de anticorpos (t=48h). As amostras de plasma foram processadas por imunoprecipitação com um anticorpo de IgG anti-humana, e analisadas por meio da técnica “western blot” utilizando para detecção: A) um anticorpo policlonal anti-TTR independente de conformação (Dako A0002, 150 ng/ml), e B) NI-301.37F1 (20 nM). Em paralelo, uma amostra de plasma obtida de um murino portadores de PAF não injetado foi incubada com o anticorpo NI- 301.37F1 in vitro, antes do processamento.

[0078] Fig. 15: Especificidade de anticorpos avaliada contra proteínas em agregação pelo teste ELISA

[0079] A especificidade de anticorpos para a proteína da TTR foi avaliada pela medição da ligação às proteínas em agregação selecionadas por ensaio ELISA direto. A ligação a anticorpos foi avaliada em 4 e 20 nM, e a intensidade do sinal foi expressa em fold change relativa aos níveis de segundo plano, medidos para cada ensaio na ausência de anticorpos anti-TTR.

[0080] A-B) Ligação ao NI-301.37F1 ensaiada a 20 (A) e 4 nM (B)

[0081] C-D) Ligação ao NI-301.44E4 ensaiada a 20 (C) e 4 nM (D).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0082] A presente invenção refere-se, em geral, a métodos não invasivos e de imunoterapia para a detecção de doenças e transtornos associados à presença de isoformas de transtirretina (TTR) patológica, muitas vezes que sofreram mutação, e/ou anormalmente configurada. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a anticorpos recombinantes monoclonais de origem humana e seus fragmentos de ligação ao antígeno, que foram gerados com base nas informações de sequência obtidas de populações de doadores humanos selecionados e são capazes de se ligar a essas isoformas de TTR e seus antígenos. O anticorpo recombinante monoclonal de origem humana da presente invenção é vantajosamente caracterizado por se ligar especificamente a espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas, que sofreram mutação e/ou agregadas e/ou seus fragmentos que permitam um direcionamento para o tratamento e/ou diagnóstico de espécies de TTR patologicamente alteradas. Devido à sua derivação humana, pode-se esperar razoavelmente que os anticorpos recombinantes resultantes da presente invenção sejam eficazes e seguros como agentes terapêuticos, e altamente específicos como reagentes de diagnóstico para a detecção de TTR patológica sem produzir falsos positivos.

[0083] Além disso, o anticorpo da presente invenção, bem como seus derivados, podem ser utilizados para terapia de combinação em pacientes após transplantes de órgãos que, não obstante, correm o risco de desenvolver uma amiloidose por TTR devido a, ex.: sua deposição ou mutações hereditárias na TTR ou um defeito na produção de TTR no fígado. Assim, como uma forma de realização vantajosa em especial, a presente invenção refere-se ao anticorpo monoclonal humano e quaisquer de seus derivados aqui descritos para utilização no tratamento de pacientes, tanto de forma independente quanto para o tratamento de pacientes que recebem, ex.: drogas imunossupressoras após transplantes de órgãos ou outros agentes utilizados para sintomas associados à amiloidose por TTR, em que o anticorpo da presente invenção e quaisquer de seus derivados destinem-se a ser administrados concomitantemente com o medicamento imunossupressor e/ou com o agente, suprimindo outros efeitos colaterais ou, de forma sequencial, antes ou após a administração do mesmo. Nesse contexto, o anticorpo anti-TTR e o fragmento de ligação à TTR da presente invenção são, de preferência, substancialmente não imunogênicos em seres humanos. Em uma forma de realização da presente invenção, composições farmacêuticas são fornecidas compreendendo tanto um anticorpo monoclonal humano da presente invenção quanto quaisquer de seus derivados e um ou mais medicamentos imunossupressores e/ou utilizados para sintomas associados à amiloidose por TTR.

I. Definições

[0084] Salvo disposição em contrário, a um termo utilizado no presente instrumento, é dada a definição prevista no Oxford Dictionary of Biochemistry e Molecular Biology (Dicionário Oxford de Bioquímica e Biologia Molecular), Oxford University Press, 1997, revisado no ano 2000 e reimpresso em 2003, ISBN 0 19 850673 2.

[0085] Deve-se notar que o termo “um” ou “uma” entidade refere-se a uma ou mais dessa entidade; por exemplo, entende-se que “um anticorpo” representa um ou mais anticorpos. Como tal, os termos “um” (ou “uma”), “um ou mais” e “pelo menos um” podem ser aqui utilizados indistintamente.

[0086] Salvo indicação específica em contrário, o termo “TTR” é utilizado alternadamente para se referir especificamente às diferentes formas da transtirretina (TTR). O termo “TTR” também é utilizado para identificar, de forma geral, outros confôrmeros de TTR, como por exemplo, oligômeros e/ou formas de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas. O termo “TTR” também é utilizado para se referir coletivamente a todos os tipos e formas de TTR, como por exemplo, a TTR que sofreu mutação. Letras acrescidas à frente dos termos TTR são utilizadas para indicar de que organismo aquele ortólogo em especial se origina, ex.: hTTR para TTR humana ou mTTR para origem murina. Além disso, salvo indicação em contrário, o sistema de numeração para as sequências de aminoácidos da TTR aqui utilizadas refere-se à proteína madura da TTR, isto é, à proteína de TTR como ela é secretada pelas células, após a clivagem do peptídeo de sinal. Essa numeração é a utilizada para definir as mutações da TTR encontradas em pacientes como a TTR-V30M ou a TTR-L55P, mas difere daquela utilizada para a sequência da proteína precursora da transtirretina (sequência de referência no NCBI: NP_000362.1). Nesse contexto, a posição e o aminoácido substituído em uma TTR que sofreu mutação podem ser indicados em diferentes, porém equivalentes formas; vide, ex.: “TTR-V30M” e “V30M-TTR”.

[0087] Os anticorpos anti-TTR aqui descritos ligam especificamente a TTR e seus epítopos a várias conformações de TTR e seus epítopos. Por exemplo, encontram-se aqui descritos anticorpos que ligam especificamente espécies de TTR patologicamente alteradas ou seus fragmentos, como oligômeros/fibrilas e/ou formas de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas ou seus fragmentos. O termo que sofreu mutação (patológica), anormalmente configurada, anormalmente montada e agregada(s)/agregado(s) de TTR é utilizado indistintamente para referir-se especificamente às formas supracitadas. O termo “formas agregadas” ou “agregados” (patológicos(as)), conforme aqui utilizado, descreve os produtos de um acúmulo ou formação de cluster devido à interação errônea/patológica da TTR uma com a outra. Esses agregados, acúmulos ou formas de cluster podem ser, consistem substancialmente de ou consistem tanto da TTR e/ou seus fragmentos quanto de oligômeros não fibrilares e/ou oligômeros fibrilares e suas fibrilas. Conforme aqui utilizada, a referência a um anticorpo que “liga especificamente”, “liga seletivamente” ou “liga preferencialmente” a TTR refere- se a um anticorpo que não liga outras proteínas não relacionadas. Em um exemplo, um anticorpo de TTR aqui descrito pode ligar a TTR ou um epítopo dela e não mostrar nenhuma ligação acima de cerca de 2 vezes o segundo plano de outras proteínas. Em uma forma de realização de preferência, o anticorpo da presente invenção não reconhece substancialmente proteínas formadoras de amiloides independentes selecionados do grupo composto por alfa-sinucleína (α-sin), Tau, a proteína de ligação ao DNA de resposta transacional 43 (TDP-43), o soro amiloide A (SAA), e a proteína huntingtina (HTT); vide, ex.: Fig. 15. Um anticorpo que “liga especificamente” ou “liga seletivamente” um confôrmero da TTR refere-se a um anticorpo que não liga todas as conformações da TTR, isto é, não liga pelo menos um outro confôrmero da TTR.

[0088] Por exemplo, no presente documento encontram-se descritos anticorpos capazes de se ligar, de preferência, a formas de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas tanto in vitro quanto em tecidos obtidos de pacientes com doenças associadas à amiloidose por TTR ou com risco de desenvolver doenças associadas à amiloidose por TTR. Como as sequências dos anticorpos da TTR da presente invenção foram obtidas de seres humanos, os anticorpos da TTR da presente invenção também podem ser chamados de “auto-anticorpos humanos” ou “anticorpos de origem humana” a fim de salientar que esses anticorpos eram, de fato, expressos inicialmente pelos indivíduos e não são construções sintéticas geradas, por exemplo, por meio de bibliotecas de fagos que expressam a imunoglobulina humana, que até aqui representaram um método comum para tentar fornecer anticorpos semelhantes aos humanos.

[0089] Entende-se que o termo “peptídeo” inclui os termos “polipeptídeo” e “proteína” (que, por vezes, podem ser utilizados no presente documento indistintamente) dentro de seu significado. Do mesmo modo, fragmentos de proteínas e polipeptídeos também são contemplados e podem ser chamados no presente documento de “peptídeos”. Não obstante, o termo “peptídeo” designa, de preferência, um polímero de aminoácidos que inclui pelo menos 5 aminoácidos contíguos, de preferência pelo menos 10 aminoácidos contíguos, mais preferencialmente pelo menos 15 aminoácidos contíguos, ainda mais preferencialmente pelo menos 20 aminoácidos contíguos, e de preferência particular, pelo menos 25 aminoácidos contíguos. Além disso, o peptídeo, de acordo com a presente invenção, não costuma ter mais de 100 aminoácidos contíguos, de preferência menos de 80 aminoácidos contíguos, mais preferencialmente menos de 50 aminoácidos contíguos e ainda mais preferencialmente não mais de 15 aminoácidos contíguos do polipeptídeo da TTR.

Polipeptídeos:

[0090] Conforme utilizado no presente documento, entende-se que o termo “polipeptídeo” abrange um único “polipeptídeo”, bem como a forma plural, “polipeptídeos”, e refere-se a uma molécula composta por monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações de amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo “polipeptídeo” refere-se a qualquer cadeia ou cadeias com dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, “peptídeos”, “dipeptídeos”, “tripeptídeos”, “oligopeptídeos”, “proteína”, “cadeia de aminoácidos”, ou qualquer outro termo utilizado para referir-se a uma cadeia ou cadeias com dois ou mais aminoácidos, estão inclusos dentro da definição de “polipeptídeo”, e o termo “polipeptídeo” pode ser utilizado ou no lugar de qualquer um desses termos ou alternadamente com qualquer um deles.

[0091] Entende-se, também, que o termo “polipeptídeo” refere-se aos produtos de modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, mas sem se limitar a glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação e derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode resultar de uma fonte biológica natural ou produzida por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido de uma sequência designada de ácido nucleico. Pode ser gerado de qualquer modo, incluindo por síntese química.

[0092] Um polipeptídeo da invenção pode ter o tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora não tenham necessariamente essa estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são chamados de configurados, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas em vez disso, são capazes de adotar um elevado número de conformações diferentes, e são chamados de não configurados. Conforme utilizado no presente documento, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma metade de carboidrato que é ligada à proteína por meio de uma cadeia secundária contenedora de oxigênio ou de hidrogênio de um resíduo de aminoácido, ex.: um resíduo de serina ou de asparagina.

[0093] Entende-se por um polipeptídeo “isolado” ou seu fragmento, variante ou derivado, um polipeptídeo que não está em seu meio natural. Nenhum nível de purificação em especial é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos produzidos de forma recombinante e proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados para os fins da invenção, como são os polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados, ou parcialmente ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.

[0094] “Peptídeos, polipeptídeos ou proteínas recombinantes” referem-se a peptídeos, polipeptídeos ou proteínas produzidas por técnicas de DNA recombinante, isto é, produzidos a partir de células de micróbios ou de mamíferos transformadas por uma construção exógena de expressão de DNA recombinante que codifica a proteína de fusão, incluindo o peptídeo desejado. Proteínas ou peptídeos expressos na maioria das culturas bacterianas costumam ser livres de glicano. Proteínas ou polipeptídeos expressos em levedura podem ter um padrão de glicosilação diferente daquele expresso em células de mamíferos.

[0095] Incluídos como polipeptídeos da presente invenção encontram-se fragmentos, derivados, análogos ou variantes dos polipeptídeos anteriores e também quaisquer combinações dos mesmos. Os termos “fragmento”, “variante”, “derivado” e “análogo” compreendem peptídeos e polipeptídeos que possuem uma sequência de aminoácidos suficientemente semelhante à sequência de aminoácidos do peptídeo natural. O termo “suficientemente semelhante” significa uma primeira sequência de aminoácidos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos idênticos ou equivalentes, relativo a uma segunda sequência de aminoácidos, de modo que a primeira e a segunda sequências de aminoácidos têm um domínio estrutural comum e/ou uma atividade funcional comum. Por exemplo, sequências de aminoácidos que compreendem um domínio estrutural comum que seja de pelo menos cerca de 45%, de pelo menos cerca de 50%, de pelo menos cerca de 55%, de pelo menos cerca de 60%, de pelo menos cerca de 65%, de pelo menos cerca de 70%, de pelo menos cerca de 75%, de pelo menos cerca de 80%, de pelo menos cerca de 85%, de pelo menos cerca de 90%, de pelo menos cerca de 91%, de pelo menos cerca de 92%, de pelo menos cerca de 93%, de pelo menos cerca de 94%, de pelo menos cerca de 95%, de pelo menos cerca de 96%, de pelo menos cerca de 97%, de pelo menos cerca de 98%, de pelo menos cerca de 99%, ou de pelo menos cerca de 100%, idênticas encontram-se definidas no presente documento como suficientemente semelhantes. De preferência, as variantes serão suficientemente semelhantes à sequência de aminoácidos dos peptídeos de preferência da presente invenção, em especial para TTR, variantes, derivados ou análogos de qualquer um deles. Essas variantes costumam reter a atividade funcional dos peptídeos da presente invenção. Entre as variantes, figuram peptídeos que diferem na sequência de aminoácidos com relação ao peptídeo nativo e wt, respectivamente, por meio de uma ou mais eliminação(ões), adição(ões) e/ou substituição(ões) de aminoácidos. Essas podem ser variantes de ocorrência natural, bem como variantes projetadas artificialmente.

[0096] Além disso, os termos “fragmento”, “variante”, “derivado” e “análogo”, quando referentes a anticorpos ou polipeptídeos de anticorpos da presente invenção compreendem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades de ligação ao antígeno da molécula, do anticorpo ou polipeptídeo de ligação nativa correspondente. Fragmentos de polipeptídeos da presente invenção compreendem fragmentos proteolíticos, bem como a eliminação de fragmentos, outrossim para fragmentos de anticorpos específicos discutidos em outro ponto do presente documento. Variantes de anticorpos e polipeptídeos de anticorpos da presente invenção compreendem fragmentos conforme os descritos acima, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, eliminações ou inserções de aminoácidos. Variantes podem ocorrer de forma natural ou não natural. Variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas utilizando-se técnicas de mutagênese conhecidas no ramo. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições, eliminações ou acréscimos conservadores ou não conservadores de aminoácidos. Derivados de moléculas de ligação específica à TTR, ex.: anticorpos e polipeptídeos de anticorpos da presente invenção são polipeptídeos que foram alterados de modo a exibir outras características não encontradas no polipeptídeo nativo. Proteínas de fusão estão entre os exemplos. Polipeptídeos variantes também podem ser aqui mencionados como “análogos polipeptídicos”. Conforme utilizado no presente documento, um “derivado” de uma molécula de ligação ou seu fragmento, um anticorpo, ou um polipeptídeo de anticorpo refere-se a um polipeptídeo de indivíduo com um ou mais resíduos quimicamente derivados por reação de um grupo secundário funcional. Também estão incluídos como “derivados” os peptídeos que contêm um ou mais derivados de aminoácidos de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo, 4- hidroxiprolina pode ser substituído por prolina; 5-hidroxi-lisina pode ser substituído por lisina; 3-metil-histidina pode ser substituído por histidina; homoserina pode ser substituída por serina; e ornitina pode ser substituída por lisina.

Determinação de semelhança e/ou identidade de moléculas:

[0097] A “semelhança” entre dois peptídeos é determinada pela comparação da sequência de aminoácidos de um peptídeo com a sequência de um segundo peptídeo. Um aminoácido de um peptídeo é semelhante ao aminoácido correspondente de um segundo peptídeo se for idêntico ou uma substituição conservadora de aminoácidos. Substituições conservadoras são as descritas em Dayhoff, M.O., ed., The Atlas of Protein Sequence e Structure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978), e em Argos, EMBO J. 8 (1989), 779-785. Por exemplo, aminoácidos pertencentes a um dos seguintes grupos representam alterações ou substituições conservadoras: -Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His; -Phe, Tyr, Trp, His; e - Asp, Glu.

[0098] A “semelhança” entre dois polinucleotídeos é determinada pela comparação da sequência do ácido nucleico de um polinucleotídeo com a sequência de um polinucleotídeo. Um ácido nucleico de um polinucleotídeo é semelhante ao ácido nucleico correspondente de um segundo polinucleotídeo se for idêntico ou, se o ácido nucleico integrar uma sequência de codificação, o respectivo tripleto que compreende o ácido nucleico codifica para o mesmo aminoácido ou para uma substituição conservadora de aminoácidos.

[0099] A determinação da percentagem de identidade ou semelhança entre duas sequências é de preferência realizada utilizando o algoritmo matemático de Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877. Esse algoritmo está incorporado aos programas BLASTn e BLASTp de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 disponível na internet no endereço do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge).

[00100] A determinação da percentagem de identidade ou semelhança é realizada com os parâmetros padrão dos programas BLASTn para buscas por polinucleotídeos BLAST e programas BLASTp para busca por proteínas BLAST, conforme recomendado na página da internet do NCBI e no “Guia de Seleção de Programas BLAST” referentemente às sequências de composição e comprimento específicos.

[00101] Buscas por polinucleotídeos BLAST são realizadas com o programa BLASTn.

[00102] Nos parâmetros gerais, a caixa correspondente a “Max Target Sequences” pode ser configurada em 100, a caixa correspondente a “Short queries” pode ser marcada, a caixa correspondente a “Expect threshold” pode ser configurada em 1.000 e a caixa correspondente a “Word Size” pode ser configurada em 7 conforme o recomendado para sequências curtas (inferiores a 20 bases) na página da internet do NCBI. Para sequências mais longas, a caixa correspondente a “Expect threshold” pode ser configurada em 10 e a caixa correspondente a “Word Size” pode ser configurada em 11. Nos parâmetros de pontuação, os “Match/mismatch Scores” podem ser configurados em 1, -2 e a caixa correspondente a “Gap costs” pode ser configurada como linear. Nos parâmetros de Filtros e Máscaras, a caixa correspondente a “Low complexity regions” não pode ser marcada, a caixa correspondente a “Species-specific repeats” não pode ser marcada, a caixa correspondente a “Mask for lookup table only” pode ser marcada, “DUST Filter Settings” pode ser marcada e a caixa correspondente a “Mask lower case letters” não pode ser marcada. Em geral, “Search for short nearly exact matches” pode ser utilizado neste aspecto, o que fornece a maioria das configurações indicadas acima. Outras informações sobre esse aspecto podem ser encontradas no “Guia de Seleção de Programas BLAST”, publicado na página do NCBI na internet.

[00103] Buscas por proteínas BLAST são realizadas com o programa BLASTp.

[00104] Nos parâmetros gerais, a caixa correspondente a “Max Target Sequências” pode ser configurada em 100, a caixa correspondente a “Short queries” pode ser marcada, a caixa correspondente a “Expect threshold” pode ser configurada em 10 e a caixa correspondente a “Word Size” pode ser configurada em “3”. Nos parâmetros de pontuação, a caixa correspondente a “Matrix” pode ser configurada em “BLOSUM62”, a Caixa correspondente a “Gap Costs” pode ser configurada em “Existence: 11 Extension: 1”, a caixa correspondente a “Compositional adjustments” pode ser configurada em “Conditional compositional score matrix adjustment”. Nos parâmetros de Filtros e Máscaras, a caixa correspondente a “Low complexity regions” não pode ser marcada, a caixa correspondente a “Mask for lookup table only” não pode ser marcada e a caixa correspondente a “Mask lower case letters” não pode ser marcada.

[00105] Modificações de ambos os programas, ex. em relação ao comprimento das sequências pesquisadas, são realizadas de acordo com as recomendações do “Guia de Seleção de Programas BLAST”, publicado em versões em HTML e em PDF na página do NCBI na internet.

Polinucleotídeos:

[00106] O termo “polinucleotídeo” destina-se a abranger um ácido nucleico singular, bem como ácidos nucleicos no plural, e refere-se a uma construção ou molécula de ácido nucleico isolada, ex.: RNA mensageiro (RNAm) ou DNA de plasmídeo (DNAp). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação de fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (ex.: uma ligação de amida, como por exemplo, a encontrada em ácidos nucleicos peptídicos (ANP)). O termo “ácido nucleico” refere-se a qualquer um ou mais segmento(s) de ácido nucleico, ex.: fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Entende-se por polinucleotídeo ou ácido nucleico “isolado” uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que tenha sido removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um anticorpo contido em um vetor é considerado isolado para os fins da presente invenção. Entre outros exemplos de um polinucleotídeo isolado, figuram os polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcial ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isoladas incluem trechos de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Ácidos nucleicos ou polinucleotídeos isolados de acordo com a presente invenção incluem ainda essas moléculas produzidas de forma sintética. Além disso, o polinucleotídeo ou o ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, como por exemplo, um promotor, um sítio de ligação ao ribossoma, ou um terminador de transcrição.

[00107] Conforme utilizado no presente documento, uma “região de codificação” é uma porção de ácido nucleico composta em códons traduzidas em aminoácidos. Embora um “códon de terminação” (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, pode ser considerado como se integrasse uma região de codificação, mas qualquer sequência flanqueadora, como por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossoma, terminadores de transcrição, íntrons e similares, não integram uma região de codificação. Duas ou mais regiões de codificação da presente invenção podem estar presentes em uma construção de polinucleotídeo simples, ex.: em um único vetor, ou em construções polinucleotídicas separadas, ex.: em vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma região de codificação simples, ou pode compreender duas ou mais regiões de codificação, ex.: um vetor simples pode codificar separadamente uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões de codificação heterólogas, tanto fundidas quanto não fundidas a um ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação, um anticorpo, ou seu fragmento, variante ou derivado. Regiões de codificação heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, como por exemplo, um peptídeo secretor de sinal ou um domínio funcional heterólogo.

[00108] Em certas formas de realização, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA, caso em que um polinucleotídeo que compreenda um ácido nucleico que codifique um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operáveis associados a uma ou mais regiões de codificação. Uma associação operável é quando uma região de codificação de um produto do gene, ex.: um polipeptídeo está associada a uma ou mais sequências reguladoras de modo a colocar a expressão do produto do gene sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (como por exemplo, uma região de codificação de polipeptídeo e um promotor a ela associado) são “operáveis associados” ou “operáveis vinculados” se a indução da função do promotor resultar na transcrição do RNAm que codifica o produto do gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferir na capacidade das sequências reguladoras da expressão de direcionar a expressão do produto do gene ou interferir na capacidade do molde do DNA ser transcrito. Assim, uma região promotora seria operável associada a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor for capaz de efetuar a transcrição desse ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor específico de célula que direciona a transcrição substancial do DNA apenas em células pré-determinadas. Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, potenciadores, operadores, repressores, e sinais de terminação de transcrição, podem ser operáveis associados ao polinucleotídeo para direcionar a transcrição específica da célula. Promotores apropriados e outras regiões de controle de transcrição encontram-se descritas no presente documento.

[00109] Diversas regiões de controle de transcrição são conhecidas dos peritos no ramo. Entre elas figuram, sem limitação, as regiões de controle de transcrição que funcionam em células de vertebrados, como por exemplo, mas sem se limitar aos segmentos do promotor e do potenciador provenientes de citomegalovírus (o promotor precoce imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (o promotor precoce), e retrovírus (como por exemplo, o vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, como por exemplo, a actina, a proteína de choque térmico, o hormônio do crescimento bovino e a β-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão de genes em células eucarióticas. Outras regiões de controle de transcrição apropriadas incluem promotores e potenciadores específicos de tecidos, bem como promotores indutíveis de linfoquina (ex.: promotores indutíveis por interferons ou interleucinas).

[00110] De modo semelhante, diversos elementos de controle de tradução são conhecidos daqueles com habilidades ordinárias no ramo. Entre eles figuram, mas sem se limitar a sítios de ligação ao ribossoma, códons de terminação e iniciação de tradução, e elementos derivados de picornavírus (particularmente um sítio de acesso interno para o ribossoma, ou SAIR, também chamada de sequência CITE).

[00111] Em outras formas de realização, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (RNAm).

[00112] As regiões de codificação de polinucleotídeo e ácido nucleico da presente invenção podem ser associadas a outras regiões de codificação que codificam peptídeos secretores ou de sinais, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Segundo a hipótese de sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm um peptídeo de sinal ou sequência secretora de comando, que é clivada a partir da proteína madura, após o início da exportação da cadeia de proteína crescente por todo o retículo endoplasmático rugoso. Aqueles com habilidades ordinárias no ramo têm ciência de que polipeptídeos secretados por células de vertebrados costumam ter um peptídeo de sinal fundido ao terminal N do polipeptídeo, que é clivado a partir do polipeptídeo completo ou integral para produzir uma forma secretada ou “madura” do polipeptídeo. Em certas formas de realização, o peptídeo de sinal nativo, ex.: um peptídeo com sinal da cadeia leve ou cadeia pesada de imunoglobulina é utilizado, ou um derivado funcional dessa sequência que retém a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo que é operável associado a ele. Como alternativa, um peptídeo heterólogo de sinal de mamífero, ou seu derivado funcional, podem ser utilizados. Por exemplo, a sequência de comando em estado natural pode ser substituída pela sequência de comando do ativador de plasminogênio de tecido humano (APT) ou β-glucuronidase de murino.

[00113] Uma “molécula de ligação” conforme utilizada no contexto da presente invenção refere-se principalmente a anticorpos e seus fragmentos, mas também pode referir-se a outras moléculas que não são anticorpos e que se ligam à TTR, incluindo, mas sem se limitar a hormônios, receptores, ligantes, moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (CPH), acompanhantes como proteínas do choque térmico (PCTs), bem como moléculas de adesão célula-célula, como por exemplo, integrantes das superfamílias de caderina, integrina, lectina de tipo C e imunoglobulina (Ig). Assim, exclusivamente para que fique claro, e sem limitar o escopo da presente invenção, a maioria das seguintes formas de realização são discutidas no que diz respeito a anticorpos e moléculas semelhantes a anticorpos que representam as moléculas de ligação de preferência para o desenvolvimento de agentes terapêuticos e de diagnóstico.

Anticorpos:

[00114] Os termos “anticorpo” e “imunoglobulina” são utilizados no presente documento indistintamente. Um anticorpo ou imunoglobulina é uma molécula de ligação que compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada, e normalmente compreende pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve. Estruturas básicas de imunoglobulina em sistemas de vertebrados são relativamente bem compreendidas; vide, ex.: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988).

[00115] Como será discutido em maiores detalhes abaixo, o termo “imunoglobulina” compreende diversas e amplas classes de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Os peritos no ramo irão notar que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsilon, (y, μ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre elas (ex.: y1-y4). É da natureza dessa cadeia, que determina a “classe” do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos) ex.: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. estão bem caracterizadas e são conhecidas por conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada uma dessas classes e isotipos estão prontamente discerníveis para o perito no ramo em vista da presente descrição e, por conseguinte, estão dentro do âmbito da presente invenção. Todas as classes de imunoglobulina estão claramente dentro do âmbito da presente invenção, e a discussão a seguir será geralmente direcionada para a classe de IgG de moléculas de imunoglobulina. Referentemente à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende dois polipeptídeos idênticos de cadeia leve de peso molecular de cerca de 23.000 Daltons, e dois polipeptídeos idênticos de cadeia pesada de peso molecular entre 53.000 e 70.000. As quatro cadeias são tipicamente unidas por ligações de dissulfeto em uma configuração “Y”, em que as cadeias leves suportam as cadeias pesadas iniciando pela abertura do “Y” e continuando pela região variável.

[00116] Cadeias leves são classificadas como kapa ou lambda (K, X). Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada ou com uma cadeia leve kapa ou lambda. Em geral, as cadeias leve e pesada são ligadas de forma covalente uma à outra, e as porções da “cauda” das duas cadeias pesadas são ligadas uma à outra por ligações de dissulfeto covalentes ou por ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas por hibridomas, células B ou células hospedeiras geneticamente manipuladas. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos vão de um terminal N nas extremidades bifurcadas da configuração Y até o terminal C na parte inferior de cada cadeia.

[00117] Tanto a cadeia leve quanto a pesada são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos “constante” e “variável” são utilizados funcionalmente. A esse respeito, deve-se notar que os domínios variáveis tanto das porções de cadeia leve (VL) quanto da pesada (VH) determinam o reconhecimento e a especificidade do antígeno. Por outro lado, os domínios constantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes como secreção, mobilidade transplacentária, ligação ao receptor Fc, ligação do complemento, e semelhantes. Por convenção, a numeração dos domínios de região constante aumenta à medida que se distanciam mais do sítio de ligação ao antígeno ou do amino-terminal do anticorpo. A porção do terminal N é uma região variável e a porção do terminal C é uma região constante; os domínios CH3 e CL compreendem, de fato, o carboxi-terminal das cadeias pesada e leve, respectivamente.

[00118] Conforme indicado anteriormente, a região variável permite que o anticorpo reconheça de forma seletiva e ligue especificamente epítopos a antígenos. Isto é, o domínio VL e o domínio VH, ou o subconjunto das regiões determinantes de complementaridade (RDC) de um anticorpo se combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação ao antígeno tridimensional. Essa estrutura de anticorpo quaternário forma o sítio de ligação ao antígeno presente à extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação ao antígeno é definido por três RDCs de cada uma das cadeias VH e VL. Qualquer fragmento de anticorpo ou imunoglobulina que contenha estrutura suficiente para se ligar especificamente à TTR é denotado indistintamente no presente documento como um “fragmento de ligação” ou um “fragmento imuno-específico”.

[00119] Em anticorpos que ocorrem naturalmente, um anticorpo compreende seis regiões hipervariáveis, às vezes chamadas de “regiões determinantes de complementaridade” ou “RDCs” presentes em todos os domínios de ligação ao antígeno, que são sequências curtas e não contíguas de aminoácidos que ficam especificamente posicionados de modo a formar o domínio de ligação ao antígeno enquanto o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. As “RDCs” são acompanhadas por quatro regiões de “estrutura” relativamente conservadas ou “FRs” que apresentam menor variabilidade intermolecular. As regiões estruturais adotam largamente uma conformação de folha-β e as RDCs formam circuitos que ligam, e em alguns casos, integram a estrutura da folha-β. Assim, regiões estruturais atuam para formar uma estrutura de suporte que proporciona o posicionamento das RDCs no sentido correto por meio de interações intercadeias e não covalentes. O domínio de ligação ao antígeno formado pelas RDCs posicionadas define uma superfície complementar ao epítopo no antígeno imunorreativo. Essa superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos que compreendem as RDCs e as regiões estruturais, respectivamente, podem ser prontamente identificados para qualquer região variável dada de cadeia pesada ou leve por alguém com habilidades ordinárias no ramo, uma vez que tenham sido definidas com precisão; vide, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health e Human Services, (1983); e Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917.

[00120] Quando houver duas ou mais definições de um termo que seja utilizado e/ou aceito no ramo, a definição do termo conforme utilizado no presente documento destina-se a incluir todos esses significados, a menos que esteja explicitamente indicado em contrário. Um exemplo específico é a utilização da expressão “região determinante de complementaridade” (“RDC”) para descrever os sítios não contíguos de combinação com o antígeno encontrados dentro da região variável tanto do polipeptídeo de cadeia pesada quanto do de cadeia leve. Essa região em particular foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health e Human Services, “Sequências of Proteins of Immunological Interest” (1983) e por Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, que encontram-se incorporadas no presente documento por referência, onde as definições incluem a sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos, quando comparados entre si. Não obstante, a aplicação de qualquer uma das duas definições para se referir a uma RDC de um anticorpo ou suas variantes destina-se a estar dentro do âmbito do termo conforme definido e utilizado no presente documento. Os resíduos de aminoácidos apropriados que compreendem as RDCs conforme definidas por cada uma das referências supracitadas são estabelecidos abaixo na Tabela I na forma de uma comparação. Os números exatos de resíduos que abrangem uma RDC em específico variam dependendo da sequência e do tamanho da RDC. Os peritos no ramo são capazes de determinar rotineiramente quais resíduos compreendem uma região hipervariável em particular ou RDC do subtipo de IgG humana de anticorpos dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo. I. 1A numeração de todas as definições das RDCs na Tabela I segue as convenções de numeração II. estabelecidas por Kabat et al. (vide abaixo).

[00121] Kabat et al. também definiu um sistema de numeração para sequências de domínio variável que se aplica a qualquer anticorpo. Alguém com habilidades ordinárias no ramo pode atribuir, inequivocamente, esse sistema de “numeração de Kabat” a qualquer sequência de domínio variável, sem a intervenção de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Conforme utilizada no presente documento, a “numeração de Kabat” refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., U.S. Dept. of Health e Human Services, “Sequência of Proteins of Immunological Interest” (1983). Salvo especificação em contrário, as referências à numeração das posições específicas de resíduos de aminoácidos em um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado da presente invenção seguem o sistema de numeração de Kabat, o que, no entanto, é teórico e não pode igualmente aplicar-se a todos os anticorpos da presente invenção. Por exemplo, dependendo da posição da primeira RDC, as seguintes podem ser deslocadas em qualquer direção.

[00122] Anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, fragmentos imunoespecíficos, variantes ou derivados da invenção incluem, mas sem se limitar a anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, murinizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos de ligação ao epítopo, ex.: Fab, Fab’ e F(ab’)2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs com vinculação de dissulfeto (sdFv), fragmentos que compreendem ou um domínio VL ou um domínio VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressões Fab, e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, ex.: anticorpos anti-Id para anticorpos descritos no presente documento). Moléculas ScFv são conhecidas no ramo e encontram-se descritas, ex.: na patente dos EUA 5.892.019. Moléculas de anticorpos ou imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer tipo (ex.: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (ex.: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[00123] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção não é IgM ou um de seus derivados com estrutura pentavalente. Em particular, em aplicações específicas da presente invenção, sobretudo na utilização terapêutica, IgMs são menos úteis que IgG e outros anticorpos bivalentes ou moléculas de ligação correspondentes, desde que a IgM, devido à sua estrutura pentavalente e à falta de maturação de afinidade, muitas vezes mostram reatividades cruzadas não específicas e uma afinidade muito baixa.

[00124] Em uma forma de realização de preferência particular, o anticorpo da presente invenção não é um anticorpo policlonal, isto é, é composto substancialmente por uma espécie particular de anticorpo, em vez de ser uma mistura obtida a partir de uma amostra de imunoglobulina de plasma.

[00125] Fragmentos de anticorpos, incluindo anticorpos de cadeia simples, podem compreender a(s) região(ões) variável(is) de forma independente ou em combinação com a totalidade ou com uma porção dos seguintes: região da dobra, domínios CH1, CH2 e CH3. Também estão incluídos no na invenção fragmentos de ligação à TTR que compreendem qualquer combinação de região(ões) variável(is) com uma região de dobra, domínios CH1, CH2 e CH3. Anticorpos ou seus fragmentos imunoespecíficos da presente invenção podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. De preferência, os anticorpos são humanos, murinos, de burro, coelho, cabra, porquinho-da-Índia, camelo, lhama, cavalo ou galinha. Em outra forma de realização, a região variável pode ser originária de peixes cartilaginosos (ex.: de tubarões).

[00126] Em um aspecto, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano isolado de um ser humano. Como opção, a região estrutural do anticorpo humano é alinhada e adotadas de acordo com as sequências pertinentes da região variável da linha germinal humana do banco de dados; vide, ex.: Vbase (http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/) hospedado no Centro do Conselho de Pesquisa Médica (MRC) para Engenharia de Proteínas (Cambridge, Reino Unido). Por exemplo, aminoácidos considerados propensos a se desviar da sequência da linha germinal genuína podem sê-lo devido às sequências do iniciador de reação em cadeia da polimerase (RCP) incorporadas durante o processo de clonagem. Em comparação com anticorpos semelhantes aos de seres humanos, porém gerados artificialmente, como por exemplo, fragmentos de anticorpos de cadeia simples (scFvs) de uma biblioteca de anticorpos miméticos ou camundongos xenogênicos, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção é caracterizado por (i) ser obtido por meio da resposta imunológica humana em vez da de substitutos de origem animal, ou seja, o anticorpo foi gerado em resposta à TTR natural em sua conformação correspondente no corpo humano, (ii) ter protegido o indivíduo ou ser, pelo menos, significativo para a presença de TTR, e (iii) como o anticorpo é de origem humana, os riscos de reatividade cruzada contra autoantígenos é minimizado. Assim, de acordo com a presente invenção, os termos “anticorpo monoclonal humano”, “autoanticorpo monoclonal humano”, “anticorpo humano” e semelhantes são utilizados para designar uma molécula de ligação à TTR que é de origem humana, ou seja, que tenha sido isolada de uma célula humana como uma célula B ou seu hibridoma ou o DNAc do qual tenha sido diretamente clonada a partir do RNAm de uma célula humana, por exemplo, uma célula B de memória humana. Um anticorpo humano ainda é “humano”, isto é, de origem humana, mesmo que substituições de aminoácidos sejam feitas no anticorpo, ex.: para aprimorar características de ligação.

[00127] Em uma forma de realização, os anticorpos de origem humana da presente invenção compreendem regiões heterólogas em comparação com os anticorpos de ocorrência natural, ex.: substituições de aminoácidos na região estrutural, região constante fundida de forma exógena à região variável, aminoácidos diferentes às extremidades dos terminais C ou N e semelhantes.

[00128] Anticorpos derivados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressem imunoglobulinas endógenas, conforme descrito abaixo e, por exemplo, na patente dos EUA n° 5.939.598 de Kucherlapati et al., são designados anticorpos semelhantes aos humanos para que se possa distingui-los dos anticorpos verdadeiramente humanos da presente invenção.

[00129] Por exemplo, o pareamento de cadeias pesadas e leves de anticorpos semelhantes aos humanos como anticorpos sintéticos e semissintéticos tipicamente isolados do mimetismo não refletem necessariamente o pareamento original, como ocorrido na célula B humana original. Consequentemente, os fragmentos Fab e scFv obtidos a partir de bibliotecas de expressão recombinante, tal como habitualmente utilizados na técnica anterior, podem ser considerados artificiais com todos os possíveis efeitos associados à imunogenicidade e à estabilidade.

[00130] Ao contrário, a presente invenção fornece anticorpos isolados e maturados por afinidade provenientes de seres humanos selecionados, que são caracterizados por sua utilidade terapêutica e sua tolerância no homem.

[00131] Conforme utilizado no presente documento, o termo “anticorpo de roedor” ou “imunoglobulina de roedor” refere-se a um anticorpo que compreende uma ou mais RDCs de um anticorpo humano da presente invenção; e uma região estrutural humana que contenha substituições e/ou eliminações e/ou inserções de aminoácidos que se baseiam em uma sequência de anticorpos de roedor. Referentemente a roedores, de preferência, sequências originárias de camundongos e ratos são utilizadas, em que os anticorpos que compreendem essas sequências são chamados de “murinizados” ou “ratinizados”, respectivamente. A imunoglobulina humana que proporciona as RDCs é chamada de “progenitor” ou “aceitante”, e o anticorpo de roedor que proporciona as alterações estruturais é chamado de “doador”. Não há necessidade da presença de regiões constantes, mas se estiverem presentes, costumam ser substancialmente idênticas às regiões constantes do anticorpo de roedor, isto é, de pelo menos cerca de 85% a 90%, de preferência cerca de 95% ou mais idênticas. Consequentemente, em algumas formas de realização, uma imunoglobulina humana murinizada de cadeia pesada ou leve integral contém uma região constante de camundongo, RDCs humanas, e uma estrutura substancialmente humana que possui uma série de substituições de aminoácidos “murinizantes”. Tipicamente, um “anticorpo murinizado” é um anticorpo que compreende uma cadeia leve variável murinizada e/ou uma cadeia pesada variável murinizada. Por exemplo, um anticorpo murinizado não abrangeria um anticorpo quimérico típico, ex.: porque toda a região variável de um anticorpo quimérico é diferentemente da de um camundongo. Um anticorpo modificado que tenha sido “murinizado” pelo processo de “murinização” liga-se ao mesmo antígeno que o anticorpo progenitor que fornece as RDCs e costuma ser menos imunogênico em camundongos em comparação com o anticorpo progenitor. As explicações acima referentes aos anticorpos “murinizados” se aplicam de forma análoga para outros anticorpos de roedores, como por exemplo, “anticorpos ratinizados”, em que sequências de rato são utilizadas em vez das murinas.

[00132] Conforme utilizado no presente documento, o termo “porção de cadeia pesada” compreende sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipeptídeo que compreende uma porção de cadeia pesada inclui pelo menos um entre os seguintes aspectos: um domínio CH1, um domínio de dobra (ex.: região de dobra superior, média e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma variante ou fragmento dos mesmos. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação para uso no na invenção pode compreender uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH1; uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobra, e um domínio CH2; uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH1 e um domínio CH3; uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobra e um domínio CH3, ou uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobra, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em outra forma de realização, um polipeptídeo da invenção compreende uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH3. Além disso, um polipeptídeo de ligação para utilização no na invenção pode apresentar a ausência de pelo menos uma porção de um domínio CH2 (ex.: a totalidade ou parte de um domínio CH2). Conforme estabelecido acima, será entendido por alguém com habilidades ordinárias no ramo que esses domínios (ex.: as porções de cadeia pesada) podem ser modificados de modo que variem na sequência de aminoácidos proveniente da molécula de imunoglobulina que ocorre naturalmente.

[00133] Em determinados anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados do mesmo descritos no presente documento, as porções de cadeia pesada de uma cadeia polipeptídica de um multímero são idênticas às de uma segunda cadeia polipeptídica do multimero. De forma alternativa, os monômeros que contém porções de cadeia pesada da invenção não são idênticos. Por exemplo, cada monômero pode compreender um sítio de ligação ao alvo diferente, formando, por exemplo, um anticorpo biespecífico ou diacorpo.

[00134] Em outra forma de realização, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados do mesmo descritos no presente documento são constituídos por uma única cadeia polipeptídica como scFvs e devem ser expressos de modo intracelular (intracorpos) para potenciais aplicações terapêuticas e de diagnóstico in vivo.

[00135] As porções de cadeia pesada de um polipeptídeo de ligação para utilização nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos no presente documento podem ser derivados de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma porção da cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH1 derivado de uma molécula de IgG1 e uma região de dobra derivada de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma região de dobra derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma dobra quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG4.

[00136] Conforme utilizado no presente documento, o termo “porção de cadeia leve” inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia leve de imunoglobulina. De preferência, a porção de cadeia leve compreende pelo menos um entre um domínio VL ou CL.

[00137] Imagina-se que o tamanho mínimo de um epítopo polipeptídico ou peptídico de um anticorpo seja de cerca de quatro a cinco aminoácidos. Epítopos polipeptídicos ou peptídicos contêm, de preferência pelo menos sete, mais preferencialmente pelo menos nove e mais preferencialmente ainda entre pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Uma vez que uma RDC é capaz de reconhecer um peptídeo ou polipeptídeo antigênico em sua forma terciária, os aminoácidos que compreendem um epítopo não precisam ser contíguos, e em alguns casos, podem nem mesmo estar na mesma cadeia peptídica. Na presente invenção, um epítopo polipeptídico ou peptídico reconhecido pelos anticorpos da presente invenção contém uma sequência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, mais preferencialmente pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, ou entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos de TTR contíguos ou não contíguos.

[00138] As expressões “ligam-se especificamente” ou “reconhecem especificamente” utilizadas indistintamente no presente documento costumam significar que uma molécula de ligação, ex.: um anticorpo, se liga a um epítopo por meio de seu domínio de ligação ao antígeno, e que essa ligação acarreta alguma complementaridade entre o domínio de ligação ao antígeno e o epítopo. De acordo com essa definição, diz-se que um anticorpo “liga-se especificamente” a um epítopo quando se liga àquele epítopo por meio de seu domínio de ligação ao antígeno mais prontamente do que se ligaria a um epítopo aleatório e desconexo. O termo “especificidade” é utilizado no presente documento para qualificar a afinidade relativa pela qual um determinado anticorpo se liga a um determinado epítopo. Por exemplo, o anticorpo “A” pode ser considerado como se tivesse uma especificidade mais elevada para um dado epítopo que o anticorpo “B”, ou pode-se dizer que o anticorpo “A” se liga ao epítopo “C” com uma especificidade mais elevada que já tenha se ligado ao epítopo “D” relacionado.

[00139] Onde estiver presente, o termo “características de ligação imunológica”, ou outras características de ligação de um anticorpo a um antígeno, em todas as suas formas gramaticais, refere-se à especificidade, afinidade, reatividade cruzada, e a outras características de ligação de um anticorpo.

[00140] Por “liga-se preferencialmente”, entende-se que a molécula de ligação, ex.: o anticorpo liga-se especificamente a um epítopo mais prontamente do que se ligaria a um epítopo afim, semelhante, homólogo ou análogo. Assim, um anticorpo que “liga-se preferencialmente” a um epítopo dado seria mais propenso a ligar-se a esse epítopo que ao epítopo afim, muito embora um anticorpo desses possa reagir de forma cruzada com o epítopo afim.

[00141] A título de exemplo não limitativo, uma molécula de ligação, ex.: um anticorpo pode ser considerado como se ligasse um primeiro epítopo, preferencialmente se ligar esse primeiro epítopo com uma constante de dissociação (KD), que seja inferior ao KD do anticorpo do segundo epítopo. Em outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado como se ligasse um primeiro antígeno, preferencialmente se ligar o primeiro epítopo com uma afinidade que seja pelo menos uma ordem de grandeza inferior ao KD do anticorpo do segundo epítopo. Em outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado como se ligasse um primeiro epítopo, preferencialmente se ligar o primeiro epítopo com uma afinidade que seja pelo menos duas ordens de grandeza inferior ao KD do anticorpo do segundo epítopo.

[00142] Em outro exemplo não limitativo, uma molécula de ligação, ex.: um anticorpo pode ser considerado como se ligasse um primeiro epítopo, preferencialmente se ligar o primeiro epítopo com uma constante de dissociação (k(off)) que seja inferior ao k(off) do anticorpo do segundo epítopo. Em outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado como se ligasse um primeiro epítopo, preferencialmente se ligar o primeiro epítopo com uma afinidade que seja pelo menos uma ordem de grandeza inferior ao k(off) do anticorpo do segundo epítopo. Em outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado como se ligasse um primeiro epítopo, preferencialmente se ligar o primeiro epítopo com uma afinidade que seja pelo menos duas ordens de grandeza inferior ao k(off) do anticorpo do segundo epítopo.

[00143] Pode-se dizer que uma molécula de ligação, ex.: um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado descrito no presente documento ligam a TTR ou um seu fragmento, variante ou conformação específica com uma constante de dissociação (k(off)) inferior ou igual a 5 x 10-2 seg-1, 10-2 seg-1, 5 x l0-3 seg-1 ou l0-3 seg-1. Mais preferencialmente, pode-se dizer que um anticorpo da invenção liga a TTR ou um seu fragmento, variante ou conformação específica com uma constante de dissociação (k(off)) inferior ou igual a 5 x 10-4 seg-1, 10-4 seg-1, 5 x 10-5 seg-1, ou 10-5 seg-1 5 x 10-6 seg-1, 10-6 seg-1, 5 x 10-7 seg-1 ou 10-7 seg-1.

[00144] Pode-se dizer que uma molécula de ligação, ex.: um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado descrito no presente documento ligam a TTR ou um seu fragmento, variante ou conformação específica com uma constante de associação (k(on)) superior ou igual a 103 M-1 seg-1, 5 x 103 M-1 seg-1, 104 M-1 seg-1 ou 5 x 104 M-1 seg-1. Mais preferencialmente, pode-se dizer que um anticorpo da invenção liga a TTR ou um seu fragmento, variante ou conformação específica com uma constante de associação (k(on)) superior ou igual a 105 M-1 seg-1, 5 x 105 M-1 seg-1, 106 M-1 seg-1, ou 5 x 106 M-1 seg-1 ou 107 M-1 seg-1.

[00145] Diz-se que uma molécula de ligação, ex.: um anticorpo, inibe de forma competitiva a ligação de um anticorpo de referência a um epítopo dado caso ligue preferencialmente a esse epítopo na medida em que bloqueia, até determinado nível, a ligação do anticorpo de referência ao epítopo. A inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido no ramo, por exemplo, por ensaios ELISA de competição. Pode-se dizer que um anticorpo inibe de forma competitiva a ligação do anticorpo de referência a um epítopo dado em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%.

[00146] Conforme utilizado no presente documento, o termo “afinidade” refere-se a uma medida da resistência da ligação de um epítopo individual à RDC de uma molécula de ligação, ex.: uma molécula de imunoglobulina; vide, ex.: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988) às páginas 2728. Conforme utilizado no presente documento, o termo “avidez” refere-se à estabilidade global do complexo entre uma população de imunoglobulinas e um antígeno, ou seja, a resistência da combinação funcional de uma mistura de imunoglobulina com o antígeno; vide, ex.: Harlow às paginas 29-34. A avidez está relacionada tanto à afinidade de moléculas individuais de imunoglobulina na população com epítopos específicos, quanto às valências das imunoglobulinas e do antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma estrutura de epítopo com elevado índice de repetição, como um polímero, por exemplo, seria de elevada avidez. A afinidade ou avidez de um anticorpo com relação a um antígeno pode ser determinada de forma experimental utilizando qualquer método apropriado; vide, por exemplo, Berzofsky et al., “Antibody-Antigen Interactions” In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman & Company New York, NY (1992), e os métodos descritos no presente documento. Entre as técnicas gerais de medição de afinidade de um anticorpo com relação a um antígeno figuram os testes ELISA, RIA, e de ressonância plasmônica de superfície. A afinidade medida de uma interação anticorpo-antígeno em especial pode variar se medida sob condições diferentes, ex.: concentração salina e pH. Assim, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação ao antígeno, ex.: KD, IC50, são feitos, de preferência, com soluções padronizadas de anticorpos e antígenos, e uma barreira padronizada.

[00147] Moléculas de ligação, ex.: anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção também podem ser descritos ou especificados nos termos de sua reatividade cruzada. Conforme utilizado no presente documento, o termo “reatividade cruzada” se refere à capacidade de um anticorpo, específico para um antígeno, reagir com um segundo antígeno; uma medida da relação entre duas substâncias antigênicas diferentes. Assim, um anticorpo apresenta reatividade cruzada se ele se liga a um epítopo diferente daquele que induziu sua formação. O epítopo que apresenta reatividade cruzada costuma conter muitas das mesmas características estruturais complementares do epítopo indutor, e em alguns casos, pode até servir melhor que o original.

[00148] Por exemplo, determinados anticorpos apresentam algum grau de reatividade cruzada, pois ligam epítopos relacionados, porém não idênticos, ex.: epítopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, e pelo menos 50% de identidade (conforme calculada utilizando métodos conhecidos no ramo e descritos no presente documento) para um epítopo de referência. Pode-se dizer que um anticorpo apresenta pouca ou nenhuma reatividade cruzada se não ligar epítopos com menos do que 95%, menos do que 90%, menos do que 85%, menos do que 80%, menos do que 75%, menos do que 70%, menos do que 65%, menos do que 60%, menos do que 55%, e menos do que 50% de identidade (conforme calculada utilizando métodos conhecidos no ramo e descritos no presente documento) para um epítopo de referência. Um anticorpo pode ser considerado “altamente específico” para um determinado epítopo se não ligar nenhum outro análogo, ortólogo ou homólogo desse epítopo.

[00149] Moléculas de ligação, ex.: anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção também podem ser descritos ou especificados nos termos de sua afinidade de ligação à TTR e/ou a espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas e/ou seus fragmentos. Entre as afinidades de ligação de preferência, figuram aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferior a 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15M, ou 10-15 M.

[00150] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção apresenta um Kd para isoformas diferentes da TTR, conforme ilustrado para os anticorpos exemplificativos na Tabela V abaixo, ou seja, um Kd de > 300 nM para a TTR nativa em estado natural, e/ou um Kd de < 15 nM, de preferência < 5 nM, e mais preferencialmente < 2 nM para TTR desnaturada, e/ou um Kd de < 35 nM, de preferência de < 20 nM para TTR-V30M nativa, e/ou um Kd de < 150 nM, de preferência de < 5 nM, e mais preferencialmente < 2 nM para TTR-L55P nativa.

[00151] Conforme indicado anteriormente, as estruturas subunitárias e a configuração tridimensional das regiões constantes das diversas classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Conforme utilizado no presente documento, o termo “Domínio VH” compreende o domínio variável do terminal amino de uma cadeia pesada de imunoglobulina e o termo “Domínio CH1” compreende o primeiro domínio de região constante (mais terminal amino) de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e é do terminal amino para a região de dobra de uma molécula da cadeia pesada de imunoglobulina.

[00152] Conforme utilizado no presente documento, o termo “Domínio CH2” compreende a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, ex.: desde cerca do resíduo 244 até o resíduo 360 de um anticorpo, utilizando esquemas de numeração convencionais (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat; e resíduos 231-340, sistema de numeração da UE; vide Kabat EA et al. op. cit). O domínio CH2 é singular na medida em que não está intimamente pareado com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidrato ramificadas com ligações N encontram-se interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Também está bem documentado que o domínio CH3 estende-se do domínio CH2 até o terminal C da molécula de IgG e compreende cerca de 108 resíduos.

[00153] Conforme utilizado no presente documento, o termo “região de dobra” compreende a porção de uma molécula de cadeia pesada que se junta ao domínio CH1 até o domínio CH2. Essa região de dobra compreende cerca de 25 resíduos e é flexível, permitindo, assim, que as duas regiões de ligação ao antígeno do terminal N se movimentem de forma independente. Regiões de dobra podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobra superior, médio e inferior; vide Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083-4090.

[00154] Conforme utilizado no presente documento, o termo “ligação dissulfídica” compreende a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. A cisteína do aminoácido compreende um grupo tiol que pode formar uma ponte ou ligação dissulfídica com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG que ocorrem naturalmente, as regiões CH1 e CL são ligadas por uma ligação dissulfídica e as duas cadeias pesadas estão ligadas por duas pontes dissulfídica nas posições correspondentes a 239 e 242, utilizando o sistema de numeração de Kabat (posição 226 ou 229 do sistema de numeração da UE).

[00155] Conforme utilizado no presente documento, os termos “ligado”, “fundido” ou “fusão” são utilizados indistintamente. Esses termos referem-se à união de mais dois elementos ou componentes, por qualquer meio que seja, incluindo meios recombinantes ou de conjugação química. Uma “fusão em fase” refere-se à união de duas ou mais fases de leitura aberta (ORFs) polinucleotídicas para formar uma ORF contínua e mais extensa, de uma maneira que mantém a correta fase de leitura traducional das ORFs originais. Assim, uma proteína de fusão recombinante é uma proteína simples que contém dois ou mais segmentos que correspondem a polipeptídeos codificados pelas ORFs originais (cujos segmentos não se unem normalmente dessa forma na natureza). Embora a fase de leitura seja, portanto, tornada contínua ao longo dos segmentos fundidos, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente separados, por exemplo, por uma sequência de ligação em fase. Por exemplo, polinucleotídeos que codificam as RDCs de uma região variável de imunoglobulina podem ser fundidos, em fase, mas separados por um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região estrutural de imunoglobulina ou outras regiões de RDCs, contanto que as RDCs “fundidas” sejam cotraduzidas como parte de um polipeptídeo contínuo.

[00156] O termo “expressão”, conforme utilizado no presente documento, refere-se a um processo no qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um RNA ou polipeptídeo. O processo compreende qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula, incluindo, sem limitação, o silenciamento de genes, bem como tanto a expressão transiente quanto a estável. Compreende, sem limitação, a transcrição do gene em RNA mensageiro (RNAm), RNA de transferência (RNAt), RNA pequeno do tipo “hairpin” (grampo de cabelo) (shRNA), RNA pequeno interferente (siRNA) ou qualquer outro produto do RNA, e a tradução do RNAm em polipeptídeo(s). Se o produto final desejado for um bioquímico, a expressão compreende a criação desse bioquímico e de quaisquer precursores. A expressão de um gene produz um “produto de gene”. Conforme utilizado no presente documento, um produto de gene pode ser tanto um ácido nucleico, ex.: um RNA mensageiro produzido por transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que é traduzido a partir de uma transcrição. Os produtos de gene descritos no presente documento compreendem, ainda, ácidos nucleicos com modificações pós-transcricionais, ex.: poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações pós-traducionais, ex.: metilação, glicosilação, a adição de lipídios, associação a outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica, e semelhantes.

[00157] Conforme utilizado no presente documento, o termo “amostra” refere-se a qualquer material biológico obtido de um indivíduo ou paciente. Em um aspecto, uma amostra pode compreender sangue, líquido peritoneal, líquido cefalorraquidiano, urina ou saliva. Em outros aspectos, uma amostra pode compreender o sangue integral, plasma sanguíneo, soro sanguíneo, células B enriquecidas a partir de amostras de sangue, e células em cultura (ex.: células B de um indivíduo). Uma amostra também é capaz de compreender uma amostra de biópsia ou de tecido, incluindo tecido neural. Em mais outros aspectos, uma amostra pode compreender células inteiras e/ou um lisado das células. Amostras de sangue podem ser colhidas por métodos conhecidos no ramo. Em um aspecto, o sedimento pode ser ressuspenso com agitação em vórtice a 4°C em uma barreira de 200 μl (20 mM Tris, pH. 7,5, 0,5 % Nonidet, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.1 M NaCl, Inibidor de Protease IX Sigma, e Inibidores de Fosfatase IX Sigma 1 e 2). A suspensão pode ser mantida em gelo durante 20 min. com agitação em vórtice intermitente. Após centrifugação a 15.000 x g durante 5 min. a cerca de 4°C, alíquotas de sobrenadante podem ser armazenadas a cerca de -70°C.

Doenças:

[00158] Salvo indicação em contrário, os termos “transtorno” e “doença” são utilizados indistintamente no presente documento e compreendem qualquer alteração fisiológica indesejada em um indivíduo, animal, órgão isolado, tecido ou célula/cultura celular.

[00159] Amiloidose por transtirretina (TTR) é um mecanismo fisiopatológico que exerce uma influência em muitas doenças diferentes, que são caracterizadas pela deposição anormal da proteína da TTR em vários tecidos, como resultado de uma alteração estrutural (isto é, conformacional) da proteína da TTR. A proteína da TTR anormalmente configurada e anormalmente montada é tóxica e ocorre frequentemente em consequência de mutações no gene da TTR. A toxicidade da TTR anormalmente configurada leva a danos nos teciduais locais, que, com o acúmulo ao longo do tempo, pode levar à disfunção de órgãos e até à sua falência. Existem muitos tipos de tecidos e órgãos que são susceptíveis à amiloidose por TTR, como os sistemas nervosos periférico e autônomo, coração, leptomeninges, olhos, tendões, ligamentos ou rins. A ampla gama de tecidos que podem ser afetados pela amiloidose por TTR é uma razão para a diversidade de sintomas relatados por pacientes com amiloidose por TTR. Na verdade, pacientes com amiloidose por TTR são clinicamente categorizados como se sofressem de doenças diferentes, dependendo do tecido ou órgão mais afetado pela amiloidose por TTR e dos sintomas correspondentes.

[00160] Nessa base, a amiloidose por TTR vem sendo classificada de forma neuropática, em que os sistemas nervosos periférico e autônomo são principalmente afetados e os pacientes exibem, em sua maioria, dor, parestesia, fraqueza muscular e disfunção autonômica. Existe, também, uma forma cardíaca de amiloidose por TTR, em que o coração é principalmente afetado e os pacientes exibem, em sua maioria, hipotensão ou hipertensão ortostática, arritmia e cardiomegalia. Essas duas formas não são mutuamente exclusivas, e muitos pacientes apresentam-se com uma combinação das duas. Quando a amiloidose por TTR afeta outros tecidos, pode provocar opacidade vítrea, olhos secos ou glaucoma, proteinúria, hipertiroxinemia, síndrome do túnel cárpico ou pré- eclampsia.

[00161] Portanto, em uma forma de realização da presente invenção, os anticorpos do mesmo, suas moléculas de ligação que possuem substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um desses, os polinucleotídeos, os vetores, as células e/ou peptídeos da presente invenção são utilizados para a preparação de uma composição farmacêutica ou de diagnóstico para o tratamento profilático e/ou terapêutico de doenças da amiloidose por TTR, para o monitoramento da progressão da doença e/ou da resposta ao tratamento, e para o diagnóstico de doenças associadas à amiloidose por TTR, compreendendo Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF), Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF), Amiloidose Sistêmica Senil (ASS), amiloidose leptomeníngea / do Sistema Nervoso Central (SNC), incluindo Mal de Alzheimer, amiloidose ocular, amiloidose renal, hipertiroxinemia, síndrome do túnel do carpo, lesões do manguito rotador e estenose espinhal lombar, e pré-eclâmpsia.

Tratamento:

[00162] Conforme utilizado no presente documento, os termos “tratar” ou “tratamento” referem-se a ambos os tratamentos terapêutico e profilático, ou a medidas preventivas, em que o objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) uma alteração ou transtorno fisiológico indesejado, como por exemplo, o desenvolvimento de deficiências cardíacas. Entre os resultados clínicos benéficos ou desejados figuram, mas sem se limitar ao alívio dos sintomas, à diminuição da extensão da doença, estabilização (ou seja, sem piorar) do estado da doença, atraso ou retardamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença, e remissão (seja parcial ou total), seja detectável ou indetectável. “Tratamento” também pode significar prolongar a sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada no caso do não recebimento do tratamento. Os que necessitam de tratamento são aqueles já com a doença ou transtorno, bem como aqueles propensos a ter a doença ou transtorno, ou aqueles em que a manifestação da doença ou transtorno se pretende prevenir.

[00163] Se não houver indicação em contrário, os termos “droga”, “remédio” ou “medicamento” são utilizados indistintamente no presente documento e compreenderão, mas sem se limitar a todos os (A) artigos, medicamentos e preparados para uso interno ou externo, e qualquer substância ou mistura de substâncias que se destinem a ser utilizadas para o diagnóstico, cura, mitigação, tratamento ou prevenção de doenças tanto em homens quanto em outros animais; e (B) artigos, medicamentos e preparados (exceto alimentos) que se destinem a afetar a estrutura ou qualquer função do corpo de um homem ou de outros animais; e (C) artigos destinados a serem utilizados como um componente de qualquer artigo especificado nas cláusulas (A) e (B). Os termos “droga”, “remédio” ou “medicamento” compreenderão a fórmula completa do preparado destinado à utilização no homem ou em outros animais, contendo um ou mais “agentes”, “compostos”, “substâncias” ou “composições (químicas)” como e em algum outro contexto, inclusive outros excipientes farmaceuticamente inativos como cargas, desintegrantes, lubrificantes, deslizantes, aglutinantes ou que assegurem facilidade de transporte, desintegração, desagregação, dissolução e disponibilidade biológica da “droga”, “remédio” ou “medicamento” no local de destino pretendido dentro do corpo do homem ou de outros animais, ex.: na pele, no estômago ou no intestino. Os termos “agente”, “composto” ou “substância” são utilizados indistintamente no presente documento e compreenderão, em um contexto mais particular, mas sem se limitar a todos os agentes farmacologicamente ativos, ou seja, agentes que induzem um efeito biológico ou farmacológico desejado ou que são investigados ou testados em busca da capacidade de induzir um possível efeito farmacológico desses pelos métodos da presente invenção.

[00164] Por “alvo” ou “indivíduo” ou “animal” ou “paciente” ou “mamífero”, entende-se qualquer alvo, particularmente um que seja mamífero, ex.: um paciente humano, para quem se deseje um diagnóstico, prognóstico, prevenção ou terapia.

Veículos farmacêuticos:

[00165] Vias de administração e veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser retirados da literatura correspondente conhecida do perito no ramo. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos bem conhecidos no ramo; vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) pela University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472, Vaccine Protocols 2nd Edition by Robinson et al., Humana Press, Totowa, New Jersey, USA, 2003; Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems. 2nd Edition by Taylor & Francis. (2006), ISBN: 0-8493-1630-8. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são bem conhecidos no ramo e compreendem soros fisiológicos tamponados com fosfato, água, emulsões, como de óleo/água, vários tipos de agentes molhantes, soluções estéreis, etc. Composições que compreendam esses veículos podem ser formuladas por métodos convencionais bem conhecidos. Essas composições farmacêuticas podem ser administradas ao indivíduo em uma dose adequada. A administração das composições adequadas pode ser efetuada por vias diversas. Exemplos: administração de uma composição que contém um veículo farmaceuticamente aceitável através de métodos orais, intranasais, retais, tópicos, intraperitoneais, intravenosos, intramusculares, subcutâneos, subdérmicos, transdérmicos, intratecais e intracranianos. Entre as formulações de aerossol, como por exemplo, formulações de pulverização nasal, figuram soluções aquosas purificadas ou outras soluções do agente ativo com agentes conservantes e agentes isotônicos. Essas formulações são preferencialmente ajustadas a um estado isotônico e de pH compatível com as membranas mucosas nasais. Composições farmacêuticas para administração oral, como por exemplo, moléculas de anticorpos de domínio simples (ex.: “nanocorpos™”), etc., também estão previstas na presente invenção. Essas formulações orais podem ser na forma de comprimido, cápsula, pó, líquido ou semissólido. Um comprimido pode compreender um veiculo sólido, como por exemplo, gelatina ou um adjuvante. Formulações para administração retal ou vaginal podem ser apresentadas como um supositório com um veículo adequado; vide, também, O’Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727- 735. Outras orientações referentes a formulações que são adequadas para vários tipos de administração podem ser encontradas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985) e atualizações correspondentes. Para uma breve revisão dos métodos de entrega de medicamentos, vide Langer, Science 249 (1990), 1527-1533.

II. Anticorpos da presente invenção

[00166] A presente invenção refere-se, em geral, a anticorpos anti-TTR de origem humana e seus fragmentos de ligação ao antígeno, que, de preferência demonstrem as características de ligação imunológica e/ou propriedades biológicas, conforme descrito para os anticorpos ilustrados nos Exemplos. De acordo com a presente invenção, anticorpos monoclonais humanos específicos para TTR foram clonados a partir de um conjunto de indivíduos humanos saudáveis. No entanto, em outra forma de realização da presente invenção, os anticorpos anti-TTR monoclonais humanos também podem ser clonados de pacientes que apresentem sintomas de uma doença e/ou transtorno associado à amiloidose por TTR.

[00167] No decurso dos experimentos realizados em conformidade com a presente invenção, anticorpos presentes no meio condicionado de células B de memória humana em cultura foram avaliados quanto à sua capacidade de se ligar à TTR e a mais de 10 outras proteínas, incluindo à albumina de soro bovino (ASB). Apenas os sobrenadantes de células B capazes de se ligar à proteína da TTR, mas não a qualquer uma das outras proteínas da triagem, foram selecionados para análise posterior, incluindo a determinação da classe de anticorpos e da subclasse de cadeia leve. As células B selecionadas foram, então, processadas para a clonagem do anticorpo.

[00168] Em resumo, isso consistiu na extração do RNA mensageiro das células B selecionadas, na retrotranscrição por RT-RCP, na amplificação das regiões de codificação de anticorpos por RCP, na clonagem em vetores plasmídicos e no sequenciamento. Anticorpos humanos selecionados foram, então, produzidos por expressão recombinante nas células HEK293 ou CHO e purificação, e posteriormente caracterizados pela sua capacidade de ligar a proteína da TTR humana. A combinação de vários testes, ex.: a expressão recombinante dos anticorpos nas células HEK293 ou CHO e a subsequente caracterização de suas especificidades de ligação para com a proteína da TTR humana, e sua ligação distinta a suas formas patologicamente anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas confirmaram que, pela primeira vez, anticorpos humanos foram clonados que são altamente específicos para a TTR e reconhecem distintamente e ligam de forma seletiva as formas patologicamente agregadas da proteína da TTR, como as fibrilas da TTR. Em alguns casos, anticorpos quiméricos murinos também foram gerados à base dos domínios variáveis dos anticorpos humanos da presente invenção. Esses anticorpos quiméricos murinos mostraram afinidade de ligação, especificidade e seletividade igual à da TTR humana como os anticorpos humanos, como ilustram as Figs. 6 e 9 e os Exemplos 4 e 8.

[00169] Assim, a presente invenção refere-se, em geral, a um anticorpo anti-TTR recombinante monoclonal de origem humana e seus fragmentos de ligação, derivados e variantes. Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo é capaz de ligar a TTR humana.

[00170] Em uma forma de realização, a presente invenção é direcionado a um anticorpo anti-TTR, ou a um seu fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivados, em que o anticorpo se liga especificamente ao mesmo epítopo de TTR como um anticorpo de referência selecionado do grupo que consiste de NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI- 301.37F1 e NI-301.12D3. O mapeamento de epítopos identificou uma sequência dentro da TTR humana, incluindo os aminoácidos 61-EEEFVEGIY-69 (ID DE SEQ. N°: 49) como o epítopo linear único reconhecido pelo anticorpo NI-301.59F1 da presente invenção, uma sequência dentro da TTR humana, incluindo os aminoácidos 53-GELHGLTTEEE-63 (ID DE SEQ. N°: 50) como o epítopo linear único reconhecido pelo anticorpo NI-301.35G11 da presente invenção, uma sequência dentro da TTR humana, incluindo os aminoácidos 41-WEPFA-45 (ID DE SEQ. N°: 51) como o epítopo linear único reconhecido pelo anticorpo NI-301.37F1 (vide Fig. 10 e Exemplo 9). Portanto, em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção é fornecido, em que o anticorpo liga especificamente um epítopo da TTR que compreende as sequências de aminoácidos EEEFVEGIY (ID DE SEQ. N°: 49), GELHGLTTEEE (ID DE SEQ. N°: 50), ou WEPFA (ID DE SEQ. N°: 51).

[00171] Nesse contexto, conforme explicado no Exemplo 9, os epítopos de ligação dos anticorpos exemplificativos NI-301.59F1, NI301.35G11, e NI-301.37F1 foram analisados por meio da utilização de um painel de 29 peptídeos sequenciais de 15 aminoácidos de comprimento e 11 aminoácidos de sobreposição (ou seja, primeiro peptídeo TTRaa1-15; segundo peptídeo TTRaa5-19; etc.), em que os anticorpos NI-301.59F1 e 301.35G11 reconhecem dois peptídeos sobrepostos, (15 e 16) e (13 e 14), respectivamente, e o anticorpo NI-301.37F1 reconhece três peptídeos sobrepostos (9, 10 e 11); vide Exemplo 9 e Fig. 10.

[00172] Assim, referentemente à sequência de aminoácidos do polipeptídeo maduro da TTR e ao mapeamento de peptídeos correspondente, isso significa que o anticorpo NI- 301.59F1 ligado ao epítopo EEEFVEGIY (ID DE SEQ. N°: 49) é capaz de reconhecer os peptídeos com as sequências de aminoácidos GLTTEEEFVEGIYKV (ID DE SEQ. N°: 85) e EEEFVEGIYKVEIDT (ID DE SEQ. N°: 86).

[00173] Da mesma forma, o anticorpo anti-TTR NI-301.35G11 ligado ao epítopo GELHGLTTEEE (ID DE SEQ. N°: 50) é capaz de reconhecer os peptídeos com as sequências de aminoácidos TSESGELHGLTTEEE (ID DE SEQ. N°: 87) e GELHGLTTEEEFVEG (ID DE SEQ. N°: 88).

[00174] De modo semelhante, o anticorpo anti-TTR NI-301.37F1 que se liga ao epítopo WEPFA (ID DE SEQ. N°: 51) é capaz de reconhecer os peptídeos com as sequências de aminoácidos FRKAADDTWEPFASG (ID DE SEQ. N°: 89), ADDTWEPFASGKTSE (ID DE SEQ. N°: 90), e WEPFASGKTSESGEL (ID DE SEQ. N°: 91).

[00175] Assim, os anticorpos objeto da presente invenção ilustrados nos Exemplos são diferentes dos anticorpos que reconhecem qualquer um dos epítopos mencionados somente no contexto dos aminoácidos adicionais dos terminais C e/ou N. Portanto, em uma forma de realização preferencial da presente invenção, a ligação específica de um anticorpo anti-TTR a um epítopo da TTR que compreende as sequências de aminoácidos EEEFVEGIY (ID DE SEQ. N°: 49), GELHGLTTEEE (ID DE SEQ. N°: 50), ou WEPFA (ID DE SEQ. N°: 51) é determinada com peptídeos sequenciais de 15 aminoácidos de comprimento e 11 aminoácidos de sobreposição de acordo com o Exemplo 9 e as Figuras 10A a D.

[00176] Nesse contexto, o mapeamento de epítopos estendido realizado em conformidade com a presente invenção e descrito no Exemplo 9, utilizando um painel de 151 peptídeos sequenciais de 15 aminoácidos de comprimento e 14 aminoácidos de sobreposição, em que, para cada peptídeo, o aminoácido na posição 10 foi substituído por uma alanina para aminoácidos sem alanina, em que as alaninas foram substituídas por glicina ou prolina e revelaram que o anticorpo NI-301.59F1 liga o epítopo EEFXEGIY (TTRaa61-68) e o anticorpo NI-301.35G11 liga o ELXGLTXE (TTRaa54-61) enquanto que nenhuma outra exigência de sequência foi determinada para o epítopo do anticorpo NI- 301.37F1. Consequentemente, em outra forma de realização, a determinação se um dado anticorpo se liga ao mesmo epítopo que os anticorpos NI-301.59F1, NI301.35G11, e NI- 301.37F1 é realizada de acordo com o Exemplo 9 e as Figuras 10E a H.

[00177] Não precisa dizer que o mapeamento de epítopos e a determinação se um dado anticorpo liga o mesmo epítopo que um anticorpo objeto utilizado no Exemplo 9 e mostrado na Fig. 10 também podem ser aplicados a qualquer outro anticorpo anti-TTR da presente invenção descrito nos Exemplos com a região variável representada na Figura 1A- 1T.

[00178] Consequentemente, a presente invenção refere-se, em geral, a qualquer anticorpo anti-TTR e molécula semelhante a anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo ilustrado nos Exemplos, tendo pelo menos as RDCs e/ou região variável pesada e leve conforme representadas em qualquer uma das Figuras 1A-1T.

[00179] Em outra forma de realização, o anticorpo liga especificamente a sequência de aminoácidos GELHGLTTEEE (ID DE SEQ. N°: 50), mas não a GELHGPTTEEE, correspondente ao epítopo que sofreu mutação TTR-L55P, ou o anticorpo liga especificamente a sequência de aminoácidos WEPFA (ID DE SEQ. N°: 51), mas não a WGPFA, correspondente ao epítopo que sofreu mutação TTR-E42G.

[00180] Além disso, sem pretender qualquer vinculação a observações experimentais iniciais conforme demonstrado nos Exemplos 3 a 8 e mostrado nas Figs. 2, 3, 4, 7 e 9, os anticorpos anti-TTR monoclonais humanos NI-301.59F1, NI-301.35G11, e NI-301.37F1 da presente invenção são preferencialmente caracterizados por se ligarem especificamente à TTR patológica, anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada e sem reconhecer substancialmente a TTR na forma fisiológica. Consequentemente, a presente invenção fornece um conjunto de anticorpos anti-TTR humanos com propriedades de ligação particularmente úteis para fins terapêuticos e de diagnóstico. Assim, em uma forma de realização, a presente invenção fornece anticorpos que são capazes de ligar especificamente formas patologicamente agregadas de TTR.

[00181] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção exibe as propriedades de ligação dos anticorpos exemplificativos NI-301.59F1, NI-301.35G11, e NI-301.37F1, conforme descrito nos Exemplos. O anticorpo anti-TTR da presente invenção reconhece preferencialmente a TTR patologicamente alterada, como por exemplo, espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e seus fragmentos, em vez da TTR fisiológica. Portanto, em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção não reconhece substancialmente espécies fisiológicas da TTR.

[00182] O termo “não reconhece substancialmente”, quando utilizado no presente pedido para descrever a afinidade de ligação de uma molécula de um grupo constituído por um anticorpo, um seu fragmento, ou uma molécula de ligação para uma molécula alvo específica, antígeno e/ou conformação da molécula alvo e/ou antígeno significa que a molécula do grupo supracitado liga a referida molécula, antígeno e/ou conformação com uma afinidade de ligação que é pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes ou 9 vezes inferior à afinidade de ligação da molécula do grupo supracitado para ligar outra molécula, antígeno e/ou conformação. Muitas vezes, a constante de dissociação (KD) é utilizada como uma medida da afinidade de ligação. Às vezes, é a EC50 em um ensaio específico, como por exemplo, um ensaio ELISA, que é utilizada como medida da afinidade de ligação. De preferência, o termo “não reconhece substancialmente”, quando utilizado no presente pedidoo, significa que a molécula do grupo supracitado liga essa molécula, antígeno e/ou conformação com uma afinidade de ligação que é, pelo menos, ou 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1.000 vezes ou 10.000 vezes inferior à afinidade de ligação dessa molécula do grupo supracitado para ligar-se a outra molécula, antígeno e/ou conformação.

[00183] Além disso, ou de forma alternativa, o anticorpo anti-TTR da presente invenção liga-se a formas causadoras de doença anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas da TTR humana. Nesse contexto, as afinidades de ligação podem estar no intervalo mostrado para os anticorpos exemplificativos NI- 301.59F1, NI-301.35G11, e NI-301.37F1 na Fig. 2, na respectiva Fig. 10, ou seja, tendo metade das concentrações eficazes máximas (EC50) de cerca de 1 pM a 500 nM, preferencialmente uma EC50 de cerca de 50 pM a 100 nM, mais preferencialmente uma EC50 de cerca de 1 nM a 20 nM para TTR humana agregada e TTR recombinante agregada conforme mostrado para NI-301.59F1 e NI-301.35G11, ou uma EC50 de cerca de 100 pM a 1 nM para TTR humana agregada e TTR recombinante agregada conforme mostrado para NI-301.37F1.

[00184] Em especial, o anticorpo anti-TTR, seu fragmento de ligação ou derivado apresenta uma afinidade de ligação correspondente a um valor de EC50 de < 5 nM para ligação agregada em estado natural e/ou uma EC50 de < 20 nM, preferencialmente < 10 nM e mais preferencialmente < 1 nM para ligar a V30M-TTR agregada; vide Exemplo 3 e Fig. 2.

[00185] Alguns anticorpos são capazes de se ligar a uma grande variedade de biomoléculas, ex.: proteínas. Como poderá ser notado por um perito do ramo, o termo específico é utilizado no presente documento para indicar que biomoléculas diferentes das proteínas da TTR ou de seus fragmentos não se ligam significativamente à molécula de ligação ao antígeno, ex.: um dos anticorpos da presente invenção. De preferência, o nível de ligação a uma biomolécula diferente da TTR resulta em uma afinidade de ligação que é, no máximo, apenas 20% ou menos, 10% ou menos, apenas 5% ou menos, apenas 2% ou menos ou apenas 1% ou menos (isto é, pelo menos, 5, 10, 20, 50 ou 100 vezes inferior, ou qualquer valor além desses) da afinidade à TTR, respectivamente; vide ex.: Fig. 2.

[00186] Em uma forma de realização, o anticorpo anti-TTR da presente invenção liga-se preferencialmente a formas agregadas de TTR, TTR anormalmente configurada, TTR anormalmente montada e/ou seus fragmentos, derivados, fibrilas e/ou oligômeros. Em outra forma de realização, o anticorpo anti-TTR da presente invenção se liga preferencialmente tanto à TTR nativa quanto às formas patologicamente anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas de TTR.

[00187] Conforme mencionado anteriormente, depósitos de TTR amiloides e amorfos podem provocar doenças diferentes, dependendo de onde ocorrerem no corpo das espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas, e/ou agregadas ou de seus fragmentos. Por exemplo, pacientes com Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF) apresentam depósitos de TTR principalmente nas fibras nervosas de pequeno diâmetro e, portanto, apresentam principalmente sintomas como percepções sensoriais alteradas e disfunções autonômicas, incluindo disfunções gastrointestinais ou impotência; Pacientes com Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF) ou Amiloidose Sistêmica Senil (ASS) apresentam depósitos de TTR principalmente no coração e, portanto, apresentam sintomas como insuficiência cardíaca ou arritmia cardíaca; Pacientes com depósitos de TTR nos rins podem apresentar disfunções renais e proteinúria.

[00188] Portanto, em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção é útil no tratamento da Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF), Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF), Amiloidose Sistêmica Senil (ASS), amiloidose familiar sistêmica, amiloidose leptomeníngea / do Sistema Nervoso Central (SNC), incluindo Mal de Alzheimer, amiloidose ocular, amiloidose renal, hipertiroxinemia, amiloidose de ligamentos, incluindo síndrome do túnel do carpo, lesões do manguito rotador e estenose espinhal lombar, e pré-eclâmpsia, e seus sintomas.

[00189] A presente invenção também é atraído por um anticorpo, ou fragmento de ligação do antígeno, uma sua variante ou seus derivados, em que o anticorpo compreende um domínio de ligação ao antígeno idêntico ao de um anticorpo selecionado a partir do grupo constituído por NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI- 301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI- 301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI- 301.14D8, NI-301.9X4, e NI-301.14C3.

[00190] A presente invenção ainda exemplifica várias moléculas de ligação, ex.: anticorpos e seus fragmentos de ligação, que podem ser caracterizadas pelo fato de compreenderem, em sua região variável, ex.: domínio de ligação de pelo menos uma região determinante de complementaridade (RDD) da região variável VH e/ou VL que compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos representadas na Fig. 1. As sequências de nucleotídeos correspondentes que codificam as regiões variáveis acima identificadas são apresentadas na Tabela II abaixo. Exemplos de conjuntos de RDCs das sequências de aminoácidos acima das regiões e VH e/ou VL estão representados na Fig. 1. No entanto, conforme discutido abaixo, um perito no ramo tem plena ciência do fato de que, adicionalmente ou alternativamente, podem ser utilizadas RDCs que diferem, em sua sequência de aminoácidos, daquelas mostradas na Fig. 1 em um, dois, três ou até mais aminoácidos no caso das RDC2 e RDC3. Portanto, em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção ou seu fragmento de ligação à TTR é fornecido, compreendendo em sua região variável pelo menos uma região determinante de complementaridade (RDC), conforme representado na Fig. 1 e/ou uma ou mais de suas RDCs, compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos.

[00191] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção representa qualquer um dos anticorpos que compreendem uma sequência de aminoácidos da região VH e/ou VL conforme representado na Fig. 1 ou uma sua região VH e/ou VL, compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos. De preferência, o anticorpo da presente invenção é caracterizado pela preservação do pareamento cognato da cadeia pesada e leve como estava presente na célula B humana.

[00192] Em outra forma de realização da presente invenção, o anticorpo anti-TTR, seu fragmento de ligação ao TTR, suas variantes sintética ou biotecnológica podem ser otimizados para que apresentem uma afinidade de ligação apropriada às propriedades farmacocinéticas e de destino. Portanto, pelo menos um aminoácido na RDC ou na região variável, que fica propenso a modificações selecionadas a partir do grupo constituído por glicosilação, oxidação, delaminação, clivagem da ligação peptídica, formação de isoaspartato e/ou cisteína despareada é substituído por um aminoácido que sofreu mutação e que não tem essa alteração ou em que pelo menos uma metade de carboidrato é eliminada ou adicionada quimicamente ou enzimaticamente ao anticorpo. Exemplos de otimização de aminoácidos podem ser encontradas em ex.: aplicações internacionais WO 2010/121140 e WO 2012/049570. Outras modificações responsáveis por otimizar as propriedades do anticorpo encontram-se descritas em Gavel et al., Protein Engineering 3 (1990), 433-442 e Helenius et al., Annu. Rev. Biochem. 73 (2004), 1019-1049.

[00193] Como alternativa, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, derivado ou variante que compete para ligar-se à TTR com pelo menos um dos anticorpos possuindo a região VH e/ou VL, conforme representado em qualquer uma das Fig. 1 A a T.

[00194] Resultados experimentais fornecidos na Fig. 2 e no Exemplo 3 sugerem que alguns dos anticorpos anti-TTR da presente invenção ligam-se preferencialmente a formas de anti-TTR humana causadoras de doença anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas nas formas fisiológicas das proteínas. Em uma forma de realização, portanto, o anticorpo da presente invenção reconhece preferencialmente a TTR anormalmente configurada, anormalmente montada e/ou agregada e/ou seus fragmento e/ou derivados na TTR fisiológica.

[00195] O anticorpo da presente invenção pode ser humano, em especial para aplicações terapêuticas. Como alternativa, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo de roedor, rodentizado ou quimérico de roedor-humano, preferencialmente um anticorpo murino, murinizado ou quimérico de murino-humano ou um anticorpo de rato, ratinizado ou quimérico de rato-humano que são particularmente úteis para métodos de diagnóstico e estudos em animais. Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo quimérico de roedor-humano ou rodentizado.

[00196] Além disso, em uma forma de realização, o anticorpo quimérico da presente invenção, ou seja, que compreende os domínios variáveis de um anticorpo humano, ex.: NI-301.35G11 e os domínios constantes genéricos leves e pesados de murino, exibe as propriedades de ligação dos anticorpos quiméricos murinos exemplificativos NI- 301.mur35G11 conforme descritos nos Exemplos. Além disso, os anticorpos quiméricos de camundongo da presente invenção ligam-se com elevada afinidade à TTR humana, conforme descrito nos Exemplos 4 e 8. De preferência, a afinidade de ligação de anticorpos quiméricos é semelhante à de seus homólogos humanos.

[00197] Em uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção é fornecido por culturas de células B individuais ou oligoclonais que são colocadas em cultura, e o sobrenadante da cultura, que contém anticorpos produzidos por essas células B, é alvo de uma triagem em busca de presença e afinidade de anticorpos anti-TTR no presente documento. O processo de triagem compreende a triagem em busca da ligação a agregados monoméricos, fibrilares ou não fibrilares nativos como oligômeros de hTTR derivados de um peptídeo de hTTR sintético e inteiriço ou ex.: purificado do plasma humano ou de expressão recombinante.

[00198] Além disso ou como alternativa, o processo de triagem em busca de presença e afinidade de anticorpos anti-TTR pode compreender as etapas de um ensaio de imunorreatividade da placa amiloide de tecido sensível (IRPATS) conforme descrito no pedido internacional WO 2004/095031, cujo conteúdo de divulgação é incorporado ao presente documento por referência. Além disso ou como alternativa, triagens para cortes renais e cardíacos para ligação a anti-TTR conforme descrito em analogia no pedido internacional WO 2008/081008 para que cortes de cérebro e medula espinal possam ser realizados.

[00199] Conforme mencionado anteriormente, devido à sua geração com base em uma resposta imunológica humana, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção reconhecerá epítopos que sejam de particular relevância patológica e que não possam ser acessíveis ou menos imunogênicos em caso de processos de imunização para a geração de, por exemplo, anticorpos monoclonais de camundongo e triagem in vitro de bibliotecas de exibição em fagos, respectivamente. Consequentemente, é prudente estipular que o epítopo do anticorpo anti-TTR humano da presente invenção é único e que não exista nenhum outro anticorpo que seja capaz de se ligar ao epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal humano da presente invenção; vide também a Fig. 10. Outra indicação da singularidade dos anticorpos da presente invenção é o fato de que, conforme indicado no Exemplo 8, os anticorpos NI-301.59F1, NI-301.35G11, e NI-301.37F1 da presente invenção ligam epítopos que são específicos para a conformação da TTR anormalmente configurada, anormalmente montada e/ou agregada, que, conforme indicado anteriormente, são de particular relevância patológica e não podem ser obtidos pelos processos habituais de geração de anticorpos, como a imunização ou triagens em bibliotecas in vitro.

[00200] Portanto, em uma forma de realização, a presente invenção também se estende de forma genérica a anticorpos anti-TTR e moléculas de ligação à TTR que competem com o anticorpo monoclonal humano da presente invenção para ligação específica à TTR. A presente invenção é mais especificamente direcionado a um anticorpo, ou a seu fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivados, em que o anticorpo se liga especificamente ao mesmo epítopo da TTR como um anticorpo de referência selecionado do grupo constituído por NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 e/ou NI- 301.12D3.

[00201] Além disso, em uma forma de realização, a presente invenção também se estende de forma genérica a anticorpos anti-TTR e moléculas de ligação à TTR que competem com o anticorpo monoclonal humano da presente invenção para ligação específica a espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas ou seus fragmentos. A presente invenção é, portanto, mais especificamente também direcionado a um anticorpo, ou a seu fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivados, em que o anticorpo se liga especificamente ao mesmo epítopo das espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou a seus fragmentos como um anticorpo de referência selecionado do grupo constituído por NI- 301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 e/ou NI-301.12D3.

[00202] A competição entre anticorpos é determinada por um ensaio em que a imunoglobulina em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, como a TTR. Tipos numerosos de ensaios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIE), imunoensaio enzimático direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição tipo “sanduíche”; vide Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; EIA de biotina- avidina direta de fase sólida; vide Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619 e Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552; ensaio de identificação direta de fase sólida, ensaio tipo “sanduíche” de identificação direta de fase sólida; vide Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); RIA de identificação direta de fase sólida utilizando etiqueta I125; vide Morel et al., Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 e Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Tipicamente, um ensaio dessa natureza envolve a utilização de TTR purificada ou TTR anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada, como seus oligômeros e/ou fibrilas ligados a uma superfície sólida ou células portadoras de qualquer um desses, uma imunoglobulina de teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada, isto é, o anticorpo monoclonal humano da presente invenção. A inibição competitiva é medida pela determinação da quantidade de marcadores ligados à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Geralmente, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Preferencialmente, o ensaio de ligação competitiva é realizado nas condições descritas para o ensaio ELISA nos Exemplos em anexo. Os anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos competidores) compreendem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente proximal ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que ocorra impedimento estereoquímico. Geralmente, quando há um anticorpo de competição presente em excesso, isso inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50% ou 75%. Consequentemente, a presente invenção é ainda mais atraído a um anticorpo, ou a seu fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivados, em que o anticorpo inibe competitivamente um anticorpo de referência selecionado do grupo constituído por NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI- 305.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI- 301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI.301.44E4, NI-301.18C4 NI-301.11A10, NI- 301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4, e/ou NI-301.14C3 da ligação à TTR.

[00203] Além disso, a presente invenção é ainda mais atraído a um anticorpo, ou a seu fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivados, em que o anticorpo inibe competitivamente um anticorpo de referência selecionado do grupo constituído por NI- 301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-305.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI- 301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI- 301.44E4 NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4, e/ou NI- 301.14C3 da ligação a espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou seus fragmentos.

[00204] Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado que compreende e é constituído essencialmente de, ou é constituído de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH), em que pelo menos uma das RDCs-VH da região variável de cadeia pesada ou pelo menos duas das RDCs-VH da região variável de cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos das RDC1-VH, RDC2-VH ou RDC3-VH da cadeia pesada de referência dos anticorpos descritos no presente documento. Como alternativa, as regiões RDC1-VH, RDC2-VH e RDC3-VH da VH são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos das RDC1-VH, RDC2-VH e RDC3-VH da cadeia pesada de referência dos anticorpos descritos no presente documento. Assim, de acordo com esta forma de realização, uma região variável de cadeia pesada da invenção tem as sequências polipeptídicas das RDC1-VH, RDC2-VH e RDC3-VH relacionadas aos grupos apresentados na Fig. 1, respectivamente. Enquanto a Fig. 1 mostra as RDCs-VH definidas pelo sistema de Kabat, outras definições da RDC, ex.: as RDCs-VH definidas pelo sistema de Chothia também estão inclusas na presente invenção, e podem ser facilmente identificadas por alguém com habilidades ordinárias no ramo, utilizando os dados apresentados na Fig. 1.

[00205] Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado que compreende e é constituído essencialmente de, ou é constituído de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH), em que as regiões RDC1-VH, RDC2- VH e RDC3-VH apresentam sequências polipeptídicas que são idênticas aos grupos RDC1- VH, RDC2-VH e RDC3-VH apresentados na Fig. 1, respectivamente.

[00206] Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado que compreende e é constituído essencialmente de, ou é constituído de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH), em que as regiões RDC1-VH, RDC2- VH e RDC3-VH apresentam sequências polipeptídicas que são idênticas aos grupos RDC1- VH, RDC2-VH e RDC3-VH apresentados na Fig. 1, respectivamente, exceto por uma, duas, três, quatro, cinco ou seis substituições de aminoácidos em qualquer uma RDC-VH. Em certas formas de realização, as substituições de aminoácidos são conservadoras.

[00207] Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado que compreende e é constituído essencialmente de, ou é constituído de uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), em que pelo menos uma das RDCs-VL da região variável de cadeia leve ou pelo menos duas das RDCs-VL da região variável de cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos das RDC1-VL, RDC2-VL ou RDC3-VL da cadeia leve de referência dos anticorpos descritos no presente documento. Como alternativa, as regiões RDC1-VL, RDC2-VL e RDC3-VL da VL são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos das RDC1-VL, RDC2-VL e RDC3-VL da cadeia leve de referência dos anticorpos descritos no presente documento. Assim, de acordo com esta forma de realização, uma região variável de cadeia leve da invenção tem as sequências polipeptídicas das RDC1-VL, RDC2-VL e RDC3-VL relacionadas aos polipeptídeos apresentados na Fig. 1, respectivamente. Enquanto a Fig. 1 mostra as RDCs-VL definidas pelo sistema de Kabat, outras definições da RDC, ex.: as RDCs-VL definidas pelo sistema de Chothia também estão inclusas na presente invenção.

[00208] Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado que compreende e é constituído essencialmente de, ou é constituído de uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), em que as regiões RDC1-VL, RDC2-VL e RDC3-VL apresentam sequências polipeptídicas que são idênticas aos grupos RDC1-VL, RDC2-VL e RDC3-VL apresentados na Fig. 1, respectivamente.

[00209] Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado que compreende e é constituído essencialmente de, ou é constituído de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VL), em que as regiões RDC1-VL, RDC2-VL e RDC3-VL apresentam sequências polipeptídicas que são idênticas aos grupos RDC1-VL, RDC2-VL e RDC3-VL apresentados na Fig. 1, respectivamente, exceto por uma, duas, três, quatro, cinco ou seis substituições de aminoácidos em qualquer uma RDC-VL. Em certas formas de realização, as substituições de aminoácidos são conservadoras.

[00210] Uma imunoglobulina ou seu DNAc codificador podem ser ainda mais modificados. Assim, em outra forma de realização, o método da presente invenção compreende qualquer uma das etapas de produção de um anticorpo quimérico, murinizado, de cadeia simples, fragmento Fab, anticorpo biespecífico, de fusão, marcado ou um análogo de qualquer um desses. Métodos correspondentes são conhecidos do perito no ramo e encontram-se descritos, ex.: em Harlow e Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor (1988). Quando derivados desses anticorpos são obtidos pela técnica de exibição em fagos, a ressonância plasmônica de superfície, conforme empregada no sistema BIAcore, pode ser utilizada para aumentar a eficiência de anticorpos de fagos que se ligam ao mesmo epítopo que o de qualquer um dos anticorpos descritos no presente documento (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). A produção de anticorpos quiméricos é descrita, por exemplo, no pedido internacional WO 89/09622. Métodos para a produção de anticorpos humanizados são descritos em, ex.: Aplicação europeia EP-A1 0 239 400 e aplicação internacional WO 90/07861. Outras fontes de anticorpos a serem utilizadas em conformidade com a presente invenção são os chamados anticorpos xenogênicos. O princípio geral para a produção de anticorpos xenogênicos, como por exemplo, anticorpos semelhantes aos humanos em camundongos, é descrito em, ex.: aplicações internacionais WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 e WO 96/33735. Conforme discutido anteriormente, o anticorpo da invenção pode existir em uma variedade de formas além de anticorpos integrais; incluindo, por exemplo, Fv, Fab e F(ab)2, assim como em cadeias simples; vide ex.: aplicação internacional WO 88/09344. Em uma forma de realização, portanto, o anticorpo da presente invenção é fornecido, o qual é selecionado a partir do grupo que é constituído por um fragmento Fv de cadeia simples (scFv), um fragmento F(ab’), um fragmento F(ab) e um fragmento F(ab’)2.

[00211] Os anticorpos da presente invenção ou sua(s) correspondente(s) cadeia(s) de imunoglobulina podem ser ainda mais modificados utilizando técnicas convencionais conhecidas no ramo, como por exemplo, por meio da utilização de eliminação(ões), inserção(ões), substituição(ões), adição(ões), e/ou recombinação(ões) de aminoácidos e/ou qualquer outra(s) modificação(ões) conhecidas no ramo, seja isoladamente ou em combinação. Métodos para a introdução dessas modificações na sequência de DNA subjacente à sequência de aminoácidos de uma cadeia de imunoglobulina são bem conhecidos dos peritos no ramo; vide, ex.: Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1994). Entre as modificações do anticorpo da invenção figuram as derivatizações químicas e/ou enzimáticas em um ou mais aminoácidos constituintes, incluindo modificações na cadeia auxiliar, modificações no esqueleto e modificações nos terminais N e C, incluindo acetilação, hidroxilação, metilação, amidação, e a anexação de metades de carboidratos ou lipídios, cofatores, e semelhantes. Do mesmo modo, a presente invenção abrange a produção de proteínas quiméricas que compreendem o anticorpo descrito ou algum seu fragmento no terminal amino fundido à molécula heteróloga, como por exemplo, um ligante imunoestimulante no terminal carboxila; vide, ex.: aplicação internacional WO 00/30680 para obter os detalhes técnicos correspondentes.

[00212] Além disso, a presente invenção abrange peptídeos que compreendem aqueles que contêm uma molécula de ligação, conforme descrito acima, por exemplo, contendo a região RDC3 da região variável de qualquer um dos anticorpos mencionados, em especial a RDC3 da cadeia pesada, já que tem sido observado frequentemente que a RDC3 de cadeia pesada (HRDC3) é a região que tem um maior grau de variabilidade e uma participação predominante na interação do antígeno com o anticorpo. Esses peptídeos podem ser facilmente sintetizados ou produzidos por meios recombinantes para produzir um agente de ligação útil de acordo com o na invenção. Esses métodos são bem conhecidos daqueles com habilidades ordinárias no ramo. Os peptídeos podem ser sintetizados, por exemplo, utilizando sintetizadores de peptídeos automatizados, que encontram-se disponíveis no comércio. Os peptídeos também podem ser produzidos por técnicas recombinantes pela incorporação do DNA, expressando o peptídeo em um vetor de expressão e transformando células com o vetor de expressão para produzir o peptídeo.

[00213] Consequentemente, a presente invenção refere-se a qualquer molécula de ligação, ex.: um anticorpo ou seu fragmento de ligação que é direcionado para os anticorpos anti-TTR e/ou anticorpos capazes de ligar espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e/ou seus fragmentos da presente invenção e mostra as propriedades mencionadas, ou seja, que reconhece especificamente a TTR e/ou espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e/ou seus fragmentos. Esses anticorpos e moléculas de ligação podem ser testados quanto às suas afinidade e especificidade de ligação por meio do teste de ELISA e imuno-histoquímica conforme descrito no presente documento, vide, ex.: os Exemplos. Essas características dos anticorpos e moléculas de ligação também podem ser testadas pelo método “western blot”.

[00214] O anticorpo humano exemplar NI-301.37F1 demonstrou uma coloração proeminente da TTR anormalmente configurada nos cortes de biópsias da pele de pacientes portadores de PAF, mas não demonstrou nenhuma coloração nos pâncreas de indivíduos saudáveis do grupo de controle, em que células alfa pancreáticas mostram uma expressão endógena da TTR, ou seja, TTR nativa (vide Exemplo 8 e Fig. 9). Os anticorpos exemplificativos NI-301.35G11 e NI-301.37F1 da presente invenção também deram resultados positivos em tecidos de camundongos portadores de PAF que mostraram depósitos anormais de TTR em vários tecidos, incluindo o intestino; vide Fig. 8. Essa especificidade de ligação a formas patológicas de TTR em tecidos humanos e animais salienta, além dos experimentos bioquímicos demonstrados no presente documento (vide Fig. 10), a capacidade de utilização dos anticorpos da presente invenção no tratamento e no diagnóstico de doenças associadas à amiloidose por TTR, que ocorre preferencialmente devido à ocorrência de espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas, e/ou agregadas e/ou seus fragmentos e derivados.

[00215] Como alternativa à obtenção de imunoglobulinas diretamente da cultura de células B ou células B de memória, as células podem ser utilizadas como uma fonte de locais reorganizados de cadeia leve e de cadeia pesada para expressão subsequente e/ou manipulação genética. Genes de anticorpos reorganizados podem ser transcritos de forma inversa a partir de RNAms apropriados para produzir DNAc. Se desejado, a região constante de cadeia pesada pode ser trocada pela de um isotipo diferente ou completamente eliminada. As regiões variáveis podem ser ligadas para codificar regiões Fv de cadeia simples. Várias regiões Fv podem ser ligadas para conferir capacidade de ligação a mais de um alvo ou combinações de cadeias leve e pesada quiméricas podem ser empregadas. Após o material genético ser disponibilizado, a criação de análogos conforme descrito acima, que retenham sua capacidade de ligar o alvo pretendido é simples. Métodos de clonagem de regiões variáveis de anticorpos e geração de anticorpos recombinantes são conhecidos dos peritos no ramo e encontram-se descritos, por exemplo, em Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792.

[00216] Após o material genético apropriado ser obtido e, se desejado, modificado para codificar um análogo, as sequências de codificação, incluindo as que codificam, no mínimo, as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, podem ser inseridas nos sistemas de expressão contidos nos vetores que podem ser transfectados em células hospedeiras recombinantes padrão. Várias dessas células hospedeiras podem ser utilizadas; para um processamento eficiente, no entanto, células de mamíferos são as preferidas. Linhas típicas de células de mamíferos úteis para este fim incluem, mas não estão limitadas a células CHO, células HEK 293 ou células NSO.

[00217] A produção do anticorpo ou análogo é, então, realizada fazendo a cultura do hospedeiro recombinante modificado em condições de cultura apropriadas ao crescimento das células hospedeiras e à expressão das sequências de codificação. Os anticorpos são, então, recuperados ao serem isolados da cultura. Os sistemas de expressão são, preferencialmente, concebidos para compreender peptídeos de sinal para que os anticorpos resultantes sejam secretados para o ambiente; no entanto, a produção intracelular também é possível.

[00218] De acordo com o exposto, a presente invenção refere-se também a um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou a molécula de ligação equivalente da presente invenção, no caso do anticorpo apresentar, preferencialmente, pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina do anticorpo descrito acima. Tipicamente, essa região variável codificada pelo polinucleotídeo compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (RDC) do VH e/ou VL da região variável do referido anticorpo. Em uma forma de realização da presente invenção, o polinucleotídeo é um DNAc.

[00219] O perito no ramo notará prontamente que o domínio variável do anticorpo que possui o domínio variável descrito acima pode ser utilizado para a construção de outros polipeptídeos ou anticorpos com a especificidade e a função biológica desejadas. Assim, a presente invenção também engloba polipeptídeos e anticorpos que compreendem pelo menos uma RDC do domínio variável descrito acima e que, vantajosamente, têm substancialmente as mesmas propriedades de ligação ou semelhantes que o anticorpo descrito nos exemplos em anexo. O perito no ramo sabe que a afinidade de ligação pode ser aprimorada fazendo substituições de aminoácidos dentro das RDCs ou dentro dos circuitos hipervariáveis (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) que se sobrepõem parcialmente às RDCs como definido por Kabat; vide, ex.: Riechmann, et al, Nature 332 (1988), 323-327. Assim, a presente invenção também se refere a anticorpos em que uma ou mais das RDCs mencionadas compreende(m) um ou mais, preferencialmente não mais que duas substituições de aminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo da invenção compreende, em uma ou ambas as suas cadeias de imunoglobulina, duas ou todas as três RDCs das regiões variáveis conforme exposto na Fig. 1.

[00220] Moléculas de ligação, ex.: anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção, como são conhecidos por aqueles com habilidades ordinárias no ramo, podem compreender uma região constante que medeia uma ou mais funções efetoras. Por exemplo, a ligação do componente C1 do complemento de uma região constante de anticorpo pode ativar o sistema do complemento. A ativação do complemento é importante para a opsonização e lise de células de agentes patogênicos. A ativação do complemento também estimula a resposta inflamatória e também pode estar envolvida na hipersensibilidade autoimune. Além disso, anticorpos ligam-se a receptores em várias células por meio da região Fc, com um sítio de ligação ao receptor Fc na região Fc do anticorpo que se liga a um receptor Fc (FcR) em uma célula. Há uma série de receptores Fc que são específicas de classes diferentes de anticorpos, incluindo IgG (receptores gama), IgE (receptores epsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). A ligação do anticorpo aos receptores Fc nas superfícies celulares desencadeia uma série de respostas biológicas importantes e diversas, incluindo imersão e destruição de partículas revestidas com anticorpos, remoção de complexos imunes, lise de células alvo revestidas com anticorpos por células exterminadoras (chamada de citotoxicidade celular dependente de anticorpos, ou CCDA), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle da produção de imunoglobulina.

[00221] Consequentemente, determinadas formas de realização da presente invenção incluem um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado, em que pelo menos uma fração de um ou mais dos domínios de região constante foi eliminada ou alterada de outra forma de modo a proporcionar características bioquímicas desejadas, como por exemplo, funções efetoras reduzidas, capacidade de dimerização não covalente, aumento da capacidade de localização no local de agregação e deposição de TTR, semivida sérica reduzida ou aumentada, em comparação com um anticorpo integral e inalterado com aproximadamente a mesma imunogenicidade. Por exemplo, determinados anticorpos para utilização nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos no presente documento são anticorpos de domínio eliminado que compreendem uma cadeia polipeptídica semelhante a uma cadeia pesada de imunoglobulina, mas a que falta pelo menos uma porção de um ou mais domínios de cadeia pesada. Por exemplo, em determinados anticorpos, um domínio integral da região constante do anticorpo modificado será eliminado, por exemplo, a totalidade ou parte do domínio CH2 será eliminada. Em outras formas de realização, determinados anticorpos for para utilização nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos no presente documento têm uma região constante, ex.: uma região constante de cadeia pesada de IgG, que é alterada para eliminar a glicosilação, citada em uma parte diferente do presente documento como anticorpos aglicosilados ou “agli”. Esses anticorpos “agli” podem ser preparados enzimaticamente, bem como por engenharia do(s) sítio(s) de glicosilação de consenso na região constante. Embora não estando limitado pela teoria, acredita-se que anticorpos “agli” podem ter um perfil de estabilidade e segurança aprimorado in vivo. Métodos de produção de anticorpos aglicosilados com a função efetora desejada são encontrados, por exemplo, no pedido internacional WO 2005/018572, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[00222] Em determinados anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados descritos no presente documento, a porção Fc pode sofrer mutação para reduzir a função efetora por meio da utilização de técnicas conhecidas no ramo. Por exemplo, a eliminação ou desativação (por meio de mutações pontuais ou por outros meios) de um domínio de região constante pode reduzir a ligação ao receptor Fc do anticorpo modificado circulante, aumentando, assim, a localização da TTR. Em outros casos, pode ser que as modificações da região constante consistentes com a presente invenção moderem a ligação ao complemento e, assim, reduzam a semivida sérica e a associação não específica de uma citotoxina conjugada. No entanto, outras modificações da região constante podem ser utilizadas para modificar ligações dissulfídicas ou frações de oligossacarídeos que possibilitem a localização aumentada devido à maior especificidade do antígeno ou flexibilidade do anticorpo. O perfil fisiológico resultante, a biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, como por exemplo, a localização da TTR, a biodistribuição e a semivida sérica podem ser facilmente medidos e quantificados utilizando técnicas imunológicas bem conhecidas sem experimentação indevida.

[00223] Em determinados anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados descritos no presente documento, a porção Fc pode sofrer mutação ou ser trocada por sequências de proteínas alternativas para aumentar a absorção celular de anticorpos por meio de exemplo, aumentando a endocitose mediada por receptor de anticorpos através de receptores FCY, LRP, ou Thyl ou da ‘Tecnologia do SuperAnticorpo’, que afirma-se possibilitar que anticorpos sejam transportados para o interior de células vivas sem que sejam prejudicados (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241). Por exemplo, a geração de proteínas de fusão da região de ligação ao anticorpo e os ligantes de proteínas cognatas de receptores da superfície celular ou anticorpos bi ou multiespecíficos, com sequências específicas que se ligam à TTR, bem como um receptor de superfície celular pode ser desenvolvido em sua engenharia por meio de técnicas conhecidas no ramo.

[00224] Em determinados anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados descritos no presente documento, a porção Fc pode sofrer mutação ou ser trocada por sequências de proteínas alternativas ou o anticorpo pode ser modificado quimicamente para aumentar sua penetração pela barreira hematoencefálica.

[00225] Formas modificadas de anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção, podem ser feitos a partir de anticorpos integrais precursores ou controladores, utilizando técnicas conhecidas no ramo. Exemplos de técnicas são discutidos em maiores detalhes no presente documento. Anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção podem ser feitos ou fabricados utilizando técnicas que são conhecidas no ramo. Em determinadas formas de realização, as moléculas de anticorpos ou seus fragmentos são “produzido de forma recombinante”, isto é, são produzidos utilizando tecnologia de DNA recombinante. Exemplos de técnicas para fazer moléculas de anticorpos ou seus fragmentos são discutidos em maiores detalhes em outra parte do presente documento.

[00226] Anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção também incluem derivados que são modificados, ex.: pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo de modo que a ligação covalente não impeça que o anticorpo se ligue especificamente ao seu epítopo cognato. Por exemplo, mas não a título de limitação, os derivados de anticorpos incluem anticorpos que foram modificados, ex.: por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma das numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas sem se limitar à clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

[00227] Em formas de realização de preferência particular, os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção não extraem uma resposta imunológica prejudicial no animal a ser tratado, ex.: em um ser humano. Em determinadas formas de realização, as moléculas de ligação, ex.: anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção, são derivadas de pacientes, ex.: um paciente humano, e são, subsequentemente, utilizadas na mesma espécie da qual tiveram origem, ex.: ser humano, aliviando ou minimizando a ocorrência de respostas imunológicas prejudiciais.

[00228] A desimunização também pode ser utilizada para diminuir a imunogenicidade de um anticorpo. Conforme utilizado no presente documento, o termo “desimunização” compreende a alteração de um anticorpo para modificar os epítopos de células T; vide, ex.: aplicações internacionais WO 98/52976 e WO 00/34317. Por exemplo, as sequências VH e VL do anticorpo de partida são analisadas e um epítopo de célula T humana “mapeia”, a partir de cada região V, mostrando a localização de epítopos em relação às regiões determinantes de complementaridade (RDC) e a outros resíduos importantes dentro da sequência. Epítopos de células T individuais provenientes do “mapa” de epítopos de células T são analisados a fim de identificar substituições de aminoácidos alternativos com baixo risco de alterar a atividade do anticorpo final. Uma série de sequências VH e VL alternativas são concebidas compreendendo combinações de substituições de aminoácidos e essas sequências são subsequentemente incorporadas a uma variedade de polipeptídeos de ligação, ex.: anticorpos específicos da TTR ou seus fragmentos imunoespecíficos para utilização nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos no presente documento, que são, então, testados para ver se funcionam. Normalmente, entre 12 e 24 anticorpos variantes são gerados e testados. Genes integrais das cadeias pesada e leve compreendendo as regiões V modificada e C humana são, então, clonados em vetores de expressão e os plasmídeos subsequentes são introduzidos nas linhas das células para a produção do anticorpo integral. Os anticorpos são, então, comparados em ensaios bioquímicos e biológicos adequados, e a variante ideal é identificada.

[00229] Anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando uma ampla variedade de técnicas conhecidas no ramo, incluindo a utilização de tecnologias de exibição de fagos, recombinante e de hibridoma, ou uma combinação delas. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando técnicas de hibridoma que incluem as conhecidas no ramo e ensinadas, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981), com tais referências incorporadas por referência na sua totalidade. O termo “anticorpo monoclonal” conforme utilizado no presente documento não se limita a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. O termo “anticorpo monoclonal” refere-se a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone de fago, eucariótico ou procariótico, e não o método pelo qual é produzido. Assim, o termo “anticorpo monoclonal” não se limita a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. Em determinadas formas de realização, os anticorpos da presente invenção derivam-se de células B humanas que foram imortalizadas por transformação com vírus de Epstein-Barr, conforme descrito no presente documento.

[00230] No bem conhecido processo de hibridoma (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495), os linfócitos mortais ou cuja vida é relativamente curta provenientes de um mamífero, ex.: células B provenientes de um ser humano, conforme descrito no presente documento, são fundidos com uma linha de células de tumor imortais (ex.:. uma linha de células de mieloma), assim, produzindo células híbridas ou “hibridomas”, que são tanto imortais quanto capazes de produzir o anticorpo codificado geneticamente da célula B. Os híbridos resultantes são segregados em estirpes genéticas individuais por seleção, diluição, e recrescimento com cada estirpe individual compreendendo genes específicos para a formação de um anticorpo simples. Eles produzem anticorpos, que são homogêneos contra um antígeno desejado e, em referência à sua origem genética pura, são denominados “monoclonais”.

[00231] As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Peritos no ramo notarão que reagentes, linhas de células e materiais para formação, seleção e crescimento de hibridomas encontram-se disponíveis comercialmente em uma série de fontes e protocolos padronizados estão bem estabelecidos. Em geral, o meio de cultura no qual as células de hibridoma crescem é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais contra o antígeno desejado. A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por ensaios in vitro, como imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIE) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), conforme descrito no presente documento. Depois de identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitantes e cultivados por métodos padrão; vide, ex.: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), 59-103. Ainda se poderá notar que os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser separados de meio de cultura, fluido de ascites ou soro por procedimentos convencionais de purificação, como por exemplo, proteína A, cromatografia de hidroxilapatite, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

[00232] Em outra forma de realização, os linfócitos podem ser selecionados por micromanipulação, e os genes variáveis, isolados. Por exemplo, células mononucleares periféricas de sangue podem ser isoladas de um mamífero imunizado ou naturalmente imune, ex.: um ser humano, e colocadas em cultura durante cerca de 7 dias in vitro. As culturas podem ser submetidas a uma triagem em busca de IgGs específicas que atendam aos critérios da triagem. Células provenientes de cavidades positivas podem ser isoladas. Células B individuais e produtoras de Ig podem ser isoladas por FACS ou por sua identificação em um ensaio de placa hemolítica mediado pelo complemento. Células B produtoras de Ig podem ser micromanipulados em um tubo, e os genes VH e VL podem ser amplificados utilizando, ex.: RT-RCP. Os genes VH e VL podem ser clonados em um vetor de expressão de anticorpo e transfectados em células (ex.: células eucarióticas ou procarióticas) para expressão.

[00233] Como alternativa, linhas de células produtoras de anticorpos podem ser selecionadas e cultivadas utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos no ramo. Essas técnicas estão descritas em uma série de manuais de laboratório e publicações primárias. A esse respeito, técnicas adequadas para utilização no na invenção, conforme descritas abaixo, encontram-se descritas em Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991) que está incorporado para referência em sua totalidade no presente documento, incluindo os suplementos.

[00234] Fragmentos de anticorpos que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, fragmentos Fab e F(ab’)2 podem ser produzidos por via recombinante ou por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, utilizando enzimas como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab’)2). Fragmentos F(ab’)2 contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada. Esses fragmentos são suficientes para utilização, por exemplo, em procedimentos de imunodiagnóstico que envolvem o acoplamento das porções imunoespecíficas de imunoglobulinas para detecção de reagentes como radioisótopos.

[00235] Em uma forma de realização, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma RDC com uma molécula de anticorpo. Em outra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende pelo menos duas RDCs com uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende pelo menos três RDCs com uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende pelo menos quatro RDCs com uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende pelo menos cinco RDCs com uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende pelo menos seis RDCs com uma ou mais moléculas de anticorpo. Exemplos de moléculas de anticorpo que compreendem pelo menos uma RDC que possam ser incluídas nos anticorpos objeto encontram-se descritos no presente documento.

[00236] Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido no ramo para a síntese de anticorpos, em particular, por síntese química ou preferencialmente por técnicas de expressão recombinante conforme descrito no presente documento.

[00237] Em uma forma de realização, um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado da invenção compreende uma região constante sintética em que um ou mais domínios são parcialmente ou completamente eliminados (“anticorpos com domínio eliminado”). Em determinadas formas de realização, anticorpos modificados compatíveis compreendem construções com domínio eliminado ou variantes em que todo o domínio CH2 foi removido (construções ΔCH2). Para outras formas de realização, um peptídeo curto de ligação pode ser substituído pelo domínio eliminado para proporcionar flexibilidade e liberdade de movimento para a região variável. Os peritos no ramo notarão que essas construções são particularmente preferidas devido às propriedades regulamentares do domínio CH2 da taxa catabólica do anticorpo. Construções com domínios eliminados podem ser derivadas utilizando um vetor que codifique um domínio constante de IgG1 humana, vide, ex.: aplicações internacionais WO 02/060955 e WO 02/096948A2. Esse vetor foi concebido para eliminar o domínio CH2 e proporcionar um vetor sintético que expresse uma região constante de IgG1 de domínio eliminado.

[00238] Em determinadas formas de realização, anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados da presente invenção são minicorpo, que podem ser feitos utilizando métodos descritos na especialidade, vide, ex.: patente dos EUA 5.837.821 ou aplicação internacional WO 94/09817.

[00239] Em uma forma de realização, um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado da invenção compreendem uma cadeia pesada de imunoglobulina apresentando eliminação ou substituição de alguns ou mesmo de um único aminoácido, contanto que permita associação entre as subunidades monoméricas. Por exemplo, a mutação de um único aminoácido em áreas selecionadas do domínio CH2 pode ser suficiente para reduzir substancialmente a ligação Fc e, assim, aumentar a localização da TTR. De modo semelhante, talvez seja desejável simplesmente eliminar essa parte de um ou mais domínios de região constante que controlam a função efetora (ex.: ligação ao complemento) a ser modulada. Essas eliminações parciais das regiões constantes pode melhorar características selecionadas do anticorpo (semivida sérica), enquanto deixa intactas outras funções desejáveis associadas ao domínio da região constante objeto. Além disso, conforme mencionado acima, as regiões constantes dos anticorpos descritos podem ser sintéticas por meio da mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos que aprimoram o perfil da construção resultante. A este respeito, talvez seja possível afetar a atividade fornecida por um sítio de ligação conservado (ex.: ligação ao Fc) mantendo substancialmente a configuração e o perfil imunogênico do anticorpo modificado. No entanto, outras formas de realização compreendem a adição de um ou mais aminoácidos à região constante para aprimorar características desejáveis como uma função efetora ou fornecer mais fixação de citotoxinas ou carboidratos. Nessas formas de realização, talvez seja desejável inserir ou replicar sequências específicas derivadas de domínios de região constante selecionados.

[00240] A presente invenção também proporciona anticorpos que compreendem e são constituídos essencialmente de, ou são constituídos de variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpos (ex.: as regiões VH e/ou VL) descritas no presente documento, cujos anticorpos ou seus fragmentos ligam-se imunoespecificamente à TTR. Técnicas convencionais conhecidas dos peritos no ramo podem ser utilizadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo, incluindo, mas sem se limitar à mutagênese direcionada ao sítio e à mutagênese mediada por RCP que resultam em substituições de aminoácidos. Preferencialmente, as variantes (incluindo derivados) codificam menos que 50 substituições de aminoácidos, menos que 40 substituições de aminoácidos, menos que 30 substituições de aminoácidos, menos que 25 substituições de aminoácidos, menos que 20 substituições de aminoácidos, menos que 15 substituições de aminoácidos, menos que 10 substituições de aminoácidos, menos que 5 substituições de aminoácidos, menos que 4 substituições de aminoácidos, menos que 3 substituições de aminoácidos, ou menos que 2 substituições de aminoácidos relativas à região VH de referência, VH-RDC1, VH-RDC2, VH-RDC3, região VL, VL-RDC1, VL-RDC2, ou VL- RDC3. Uma “substituição de aminoácidos conservadora” é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia auxiliar com carga semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias auxiliares com cargas semelhantes foram definidas no ramo. Entre essas famílias, figuram aminoácidos com cadeias auxiliares básicas (ex.: lisina, arginina, histidina), cadeias auxiliares ácidas (ex.: ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias auxiliares polares sem carga (ex.: glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias auxiliares não polares (ex.: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias auxiliares beta-ramificadas (ex.: treonina, valina, isoleucina) e cadeias auxiliares aromáticas (ex.: tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Como alternativa, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por exemplo, por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser submetidos a uma triagem em busca de atividade biológica para identificar mutantes que retêm atividade (ex.: a capacidade de ligar TTR e/ou espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e/ou seus fragmentos).

[00241] Por exemplo, é possível introduzir mutações somente em regiões estruturais ou somente em regiões RDC de uma molécula de anticorpo. As mutações introduzidas podem ser mutações missense silenciosas ou neutras, ex.: que têm nenhum ou pouco efeito sobre a capacidade de um anticorpo de ligar antígenos, de fato, algumas dessas mutações não alteram de absolutamente nenhuma forma a sequência de aminoácidos. Esses tipos de mutação podem ser úteis para otimizar a utilização de códons, ou aprimorar a produção de anticorpos de um hibridoma. Regiões de codificação otimizadas com códons que codificam anticorpos da presente invenção encontram-se descritas em outro local no presente documento. Como alternativa, mutações missense não neutras podem alterar a capacidade de um anticorpo de ligar antígenos. É provável que a localização da maior parte das mutações missense silenciosas e neutras seja nas regiões estruturais, enquanto que é provável que a localização da maior parte das mutações missense não neutras seja nas RDCs, embora isso não seja uma exigência em absoluto. Um perito no ramo seria capaz de conceber e testar moléculas mutantes com propriedades desejadas, como nenhuma alteração na atividade de ligação ao antígeno ou alteração na atividade de ligação (ex.: aprimoramentos na atividade de ligação ao antígeno ou alteração na especificidade do anticorpo). Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser rotineiramente expressa e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada (ex.: capacidade de ligar imunoespecificamente pelo menos um epítopo de TTR e/ou espécies de TTR que sofreram mutações, anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e/ou seus fragmentos) pode ser determinada utilizando as técnicas descritas no presente documento ou modificando de forma rotineira as técnicas conhecidas no ramo.

III. Polinucleotídeos que Codificam Anticorpos

[00242] Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado pode ser composto por qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado pode ser composto por DNA de cadeia simples e de cadeia dupla, DNA que é uma mistura de regiões de cadeia simples e de cadeia dupla, RNA de cadeia simples e de cadeia dupla e RNA que é uma mistura de regiões de cadeia simples e de cadeia dupla, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de cadeia simples ou, mais tipicamente, de cadeia dupla ou uma mistura de regiões de cadeia simples e de cadeia dupla. Além disso, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado pode ser composto por regiões de cadeia tripla que compreendem RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado também pode conter uma ou mais bases modificadas ou estruturas de DNA ou RNA modificadas para conferir estabilidade ou por outros motivos. Entre as bases “modificadas”, figuram, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns como a inosina. Uma série de modificações pode ser feita no DNA e no RNA; assim, “polinucleotídeo” compreende formas modificadas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente.

[00243] Um polinucleotídeo isolado que codifica uma variante não natural de um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (ex.: uma porção de cadeia pesada ou uma porção da cadeia leve de imunoglobulina) pode ser criado através da introdução de uma ou mais substituições, adições ou eliminações de nucleotídeos dentro da sequência de nucleotídeos da imunoglobulina de modo que um ou mais substituições, adições ou eliminações de aminoácidos sejam introduzidas na proteína codificada. Mutações podem ser introduzidas por meio de técnicas padrão, como a mutagênese direcionada ao local e a mutagênese mediada por RCP. De preferência, substituições de aminoácidos conservadoras são feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais.

[00244] Como bem se sabe, o RNA pode ser isolado de células B originais, células de hibridoma ou de outras células transformadas por técnicas padrão, como por exemplo, a extração e a precipitação do isotiocianato de guanidina seguidas por centrifugação ou cromatografia. Quando for desejável, o RNAm pode ser isolado do RNA total por meio de técnicas padrão como cromatografia em oligo (dT) celulose. Técnicas adequadas são conhecidas no ramo. Em uma forma de realização, os DNAcs que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo podem ser feitos, simultaneamente ou separadamente, utilizando transcriptase reversa e polimerase de DNA de acordo com métodos bem conhecidos. RCP pode ser iniciada por iniciadores de consenso da região constante ou por iniciadores mais específicos, com base nas sequências publicadas de aminoácidos e de DNA de cadeia pesada e leve. Conforme abordado acima, a RCP também pode ser utilizada para isolar clones de DNA que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo. Nesse caso, as bibliotecas podem ser submetidas a uma triagem por iniciadores de consenso ou por sondas homólogas maiores, como por exemplo, sondas da região constante humana.

[00245] O DNA, tipicamente o DNA de plasmídeos, pode ser isolado das células por meio de técnicas conhecidas no ramo, mapeado com restrições e sequenciado de acordo com técnicas padrão bem conhecidas estabelecidas em detalhes, ex.: nas referências anteriores relativas a técnicas de DNA recombinante. Obviamente, o DNA pode ser sintético de acordo com a presente invenção a qualquer momento durante o processo de isolamento ou análise posterior.

[00246] Nesse contexto, a presente invenção também se refere a um polinucleotídeo que codifica pelo menos o domínio de ligação ou região variável de uma cadeia de imunoglobulina do anticorpo da presente invenção. Em uma forma de realização, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado que compreende, é constituído essencialmente de, ou constituído de um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH), em que pelo menos uma das RDCs da região variável de cadeia pesada ou pelo menos duas das RDCs-VH da região variável de cadeia pesada sejam pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos das RDC1-VH, RDC2-VH ou RDC3-VH da cadeia pesada de referência dos anticorpos descritos no presente documento. Como alternativa, as regiões RDC1-VH, RDC2-VH ou RDC3-VH da VH são pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos das RDC1-VH, RDC2-VH e RDC3-VH da cadeia pesada de referência dos anticorpos descritos no presente documento. Assim, de acordo com essa forma de realização, uma região variável de cadeia pesada da invenção possui as sequências polipeptídicas RDC1-VH, RDC2-VH ou RDC3-VH relacionadas às sequências polipeptídicas mostradas na Fig. 1.

[00247] Em outra forma de realização, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado que compreende, é constituído essencialmente de, ou constituído de um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), em que pelo menos uma das RDCs-VL da região variável de cadeia leve ou pelo menos duas das RDCs-VL da região variável de cadeia leve sejam pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos das RDC1-VL, RDC2-VL ou RDC3- VL da cadeia leve de referência dos anticorpos descritos no presente documento. Como alternativa, as regiões RDC1-VL, RDC2-VL ou RDC3-VL da VL são pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos das RDC1-VL, RDC2-VL ou RDC3-VL da cadeia leve de referência dos anticorpos descritos no presente documento. Assim, de acordo com essa forma de realização, uma região variável de cadeia leve da invenção possui as sequências polipeptídicas RDC1-VL, RDC2-VL ou RDC3-VL relacionadas às sequências polipeptídicas mostradas na Fig. 1.

[00248] Em outra forma de realização, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado que compreende, é constituído essencialmente de, ou constituído de um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) em que as regiões RDC1-VH, RDC2-VH e RDC3-VH apresentam sequências polipeptídicas que são idênticas aos grupos RDC1-VH, RDC2-VH e RDC3-VH mostrados na Fig. 1.

[00249] Como é conhecido no ramo, “a identidade sequencial” entre dois polipeptídeos ou dois polinucleotídeos é determinada pela comparação da sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos de um polipeptídeo ou polinucleotídeo com a sequência de um segundo polipeptídeo ou polinucleotídeo. Quando abordado no presente documento, quando um eventual polipeptídeo for pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% idêntico a outro polipeptídeo, pode ser determinado utilizando métodos e programas de computador/software conhecidos no ramo como, por exemplo, mas sem se limitar ao programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). O BESTFIT utiliza o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482- 489 para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Ao utilizar o BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência em particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, os parâmetros são ajustados, naturalmente, de modo que a percentagem de identidade seja calculada sobre o comprimento total da sequência polipeptídica de referência e que lacunas na homologia de até 5% do número total de aminoácidos na sequência de referência sejam permitidas.

[00250] Em uma forma de realização de preferência da presente invenção, o polinucleotídeo compreende, é constituído essencialmente por, ou constituído por um ácido nucleico com uma sequência polinucleotídica da região VH ou VL de um anticorpo anti- TTR e/ou anticorpo que reconheça espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e/ou seus fragmentos, conforme representado na Tabela II. Quanto a esse respeito, um perito na técnica nota prontamente que os polinucleotídeos que codificam pelo menos o domínio variável da cadeia leve e/ou pesada podem codificar o domínio variável de ambas as cadeias de imunoglobulina ou de apenas uma. Em uma forma de realização, portanto, o polinucleotídeo compreende, é constituído essencialmente por, ou constituído por um ácido nucleico com uma sequência polinucleotídica da região VH ou VL de um anticorpo anti-TTR que reconheça espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e/ou seus fragmentos, conforme representado na Tabela II. Tabela II: Sequências nucleotídicas da região VH e VL de anticorpos que reconheçam espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e/ou seus fragmentos.

[00251] Devido à estratégia de clonagem, a sequência de aminoácidos dos terminais N e C das cadeias pesada e leve pode conter, potencialmente, alterações induzidas por iniciadores em FR1 e FR4, que, contudo, não afetariam substancialmente a atividade biológica do anticorpo. A fim de proporcionar um anticorpo humano de consenso, as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos do clone original podem ser alinhadas e ajustadas de acordo com as sequências pertinentes da região variável da linha germinal humana do banco de dados; vide, ex.: Vbase2, conforme descrito anteriormente. As sequências de aminoácidos de anticorpos humanos são indicadas em negrito quando os aminoácidos dos terminais N e C forem considerados como potencialmente se desviando da sequência de consenso da linha germinal devido ao iniciador de RCP e, assim, foram substituídos por correção de mutação induzida pelo iniciador (CMII), vide Tabela III. Consequentemente, em uma forma de realização da presente invenção, o polinucleotídeo compreende, é constituído essencialmente por, ou constituído por um ácido nucleico com uma sequência polinucleotídica da VH, conforme representado na Tabela III e da região VL correspondente de um anticorpo anti-TTR, conforme mostrado na Tabela II. Tabela III: Sequências nucleotídicas da região VH e VL de anticorpos que reconheçam espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e/ou seus fragmentos demonstrando substituição por CMII (em negrito).

[00252] A presente invenção também compreende fragmentos dos polinucleotídeos da invenção, conforme descrito em outro ponto. Além disso, polinucleotídeos que codificam polinucleotídeos de fusão, fragmentos Fab e outros derivados, conforme descrito no presente documento, também são contemplados pelo na invenção.

[00253] Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados por qualquer método conhecido no ramo. Por exemplo, se a sequência de nucleotídeos do anticorpo for conhecida, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente, ex.: conforme descrito em Kutmeier et al., BioTechniques 17 (1994), 242, que aborda resumidamente a síntese de oligonucleotídeos sobrepostos que contêm porções da sequência que codifica o anticorpo, a hibridação e a ligação desses oligonucleotídeos, e então, a amplificação dos oligonucleotídeos ligados por RCP.

[00254] Como alternativa, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado, pode ser gerado a partir do ácido nucleico proveniente de uma fonte adequada. Se um clone que contém um ácido nucleico que codifica um anticorpo em específico não estiver disponível, mas a sequência da molécula do anticorpo for conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser quimicamente sintetizado ou obtido a partir de uma fonte adequada (ex.: uma biblioteca de DNAcs de anticorpos, ou uma biblioteca de DNAcs gerada a partir de, ou ácido nucleico, preferencialmente poliA+ RNA, isolado de qualquer tecido ou células que expressem o anticorpo específico da TTR, como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo) por amplificação por RCP utilizando iniciadores sintéticos capazes de hibridar até as extremidades de 3’ e 5’ da sequência ou por clonagem utilizando uma sonda oligonucleotídica específica para a sequência de gene em particular para identificar, por exemplo, um clone de DNAc de uma biblioteca de DNAc que codifica o anticorpo. Ácidos nucleicos amplificados gerados por RCP podem, então, ser clonados em vetores de clonagem replicáveis utilizando qualquer método bem conhecido no ramo. Consequentemente, em uma forma de realização da presente invenção, o DNAc que codifica um anticorpo, cadeia de imunoglobulina, ou seu fragmento, é utilizado para a produção de um anticorpo anti-TTR.

[00255] Uma vez que a sequência nucleotídica e a sequência correspondente de aminoácidos do anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado seja determinada, sua sequência nucleotídica pode ser manipulada utilizando métodos bem conhecidos no ramo para a manipulação de sequências nucleotídicas, ex.: técnicas de DNA recombinante, mutagênese direcionada ao sítio, RCP, etc. (vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), que encontram-se ambos incorporados por referência no presente documento em sua totalidade), para gerar anticorpos que possuem uma sequência de aminoácidos diferente, por exemplo, para criar substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácidos.

IV. Expressão de Polipeptídeos de Anticorpos

[00256] Após a manipulação do material genético isolado para fornecer anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados da invenção, os polinucleotídeos que codificam os anticorpos são tipicamente inseridos em um vetor de expressão para introdução nas células hospedeiras que podem ser utilizadas para produzir a quantidade desejada de anticorpo. A expressão recombinante de um anticorpo, ou seu fragmento, derivado, ou análogo, ex.: uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que se liga a uma molécula de destino encontra-se descrita no presente documento. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou porção do mesmo (preferencialmente contendo o domínio variável de cadeia pesada ou leve), da invenção tenha sido obtido, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante utilizando técnicas bem conhecidas no ramo. Assim, métodos para a preparação de uma proteína por expressão de um polinucleotídeo que contenha uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo encontram-se descritos no presente documento. Métodos que são bem conhecidos dos peritos no ramo podem ser utilizados para construir vetores de expressão que contenham sequências de codificação de anticorpos e sinais apropriados de controle traducional e transcricional. Entre esses métodos figuram, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. O na invenção, portanto, proporciona vetores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, operacionalmente vinculada a um promotor. Esses vetores podem compreender a sequência de nucleotídeos que codifica a região constante da molécula de anticorpo (vide, ex.: aplicações internacionais WO 86/05807 e WO 89/01036; e patente dos EUA n° 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em um vetor desses para expressão de toda a cadeia pesada ou leve.

[00257] Os termos “vetor” ou “vetor de expressão” são utilizados no presente documento para aludir a vetores utilizados em conformidade com a presente invenção como um veículo para introdução e expressão de um gene desejado em uma célula hospedeira. Como é conhecido dos peritos no ramo, esses vetores podem ser facilmente selecionados do grupo constituído por plasmídeos, fagos, vírus e retrovírus. Em geral, vetores compatíveis com a presente invenção compreendem um marcador de seleção, sítios de restrição apropriados para facilitar a clonagem do gene desejado e a capacidade de entrar e/ou replicar-se em células eucarióticas ou procarióticas. Para os fins da presente invenção, podem ser empregados vários sistemas de vetores de expressão. Por exemplo, uma classe de vetor utiliza elementos de DNA derivados de vírus animais como vírus da papilomatose bovina, poliomavírus, adenovírus, vírus vaccinia, baculovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV), ou o vírus SV40. Outros envolvem a utilização de sistemas policistrônicos com sítios de ligação ao ribossoma interno. Além disso, as células que tenham integrado o DNA em seus cromossomas podem ser selecionadas através da introdução de um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode proporcionar prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência biocida (ex.: antibióticos), ou resistência a metais pesados como cobre. O gene marcador selecionável pode tanto ser diretamente vinculado às sequências de DNA a serem expressas quanto introduzido na mesma célula por cotransformação. Outros elementos também podem ser necessários para a síntese ideal do RNAm. Entre esses elementos, podem figurar sequências de sinal, sinais de splice, assim como promotores transcricionais, potenciadores e sinais de terminação.

[00258] Em formas de realização de preferência particular, os genes da região variável clonada são inseridos em um vetor de expressão, juntamente com os genes da região constante de cadeia pesada e leve (preferencialmente humanos) conforme abordado anteriormente. Esse vetor contém o promotor/potenciador de citomegalovírus, o promotor principal da beta-globina de camundongo, a origem de replicação do SV40, a sequência de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino, a fosfotransferase de neomicina exon 1 e exon 2, o gene de redutase de di-hidrofolato, e a sequência líder. Descobriu-se que esse vetor resulta na expressão de nível muito elevado de anticorpos mediante incorporação de genes das regiões constante e variável, transfecção em células CHO, seguida da seleção em G418 que contém amplificação média e de metotrexato. Obviamente, qualquer vetor de expressão que seja capaz de extrair expressão de células eucarióticas pode ser utilizado na presente invenção. Entre os exemplos de vetores apropriados figuram, mas sem se limitar aos plasmídeos pcDNA3, pHCMV/Zeo, RCP3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, e pZeoSV2 (disponível na Invitrogen, de San Diego, CA), e pCI de plasmídeos (disponível na Promega, Madison, WI). Em geral, a triagem de grandes números de células transformadas em busca das que expressam níveis adequadamente elevados das cadeias leve e pesada de imunoglobulina é uma experimentação de rotina que pode ser realizada, por exemplo, por sistemas robóticos. Sistemas de vetores também são orientados nas patentes dos EUA n° 5.736.137 e 5.658.570, cada uma das quais encontra-se incorporada por referência em sua totalidade no presente documento. Esse sistema prevê níveis de expressão elevados, ex.: > 30 pg/célula/dia. Outros exemplos de sistemas de vetores encontram-se descritos, ex.: na patente dos EUA n° 6.413.777.

[00259] Em outras formas de realização de preferência, os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados da invenção podem ser expressos utilizando construções policistrônicas como as descritas na publicação do pedido de patente dos EUA n° 2003-0157641 A1, e incorporadas no presente documento em sua totalidade. Nesses sistemas de expressão, vários produtos de gene de interesse, como cadeias leves e pesadas de anticorpos, podem ser produzidos a partir de uma única construção policistrônica. Esses sistemas utilizam vantajosamente um sítio de acesso interno para o ribossoma (SAIR) para fornecer níveis relativamente elevados de anticorpos. Sequências de SAIR compatíveis encontram-se descritas na patente dos EUA n° 6.193.980 que também está incorporada no presente documento. Os peritos no ramo notarão que esses sistemas de expressão podem ser utilizado para produzir efetivamente toda a gama de anticorpos descritos na presente aplicação. Portanto, em uma forma de realização, a presente invenção fornece um vetor que compreende o polinucleotídeo que codifica pelo menos o domínio de ligação ou a região variável de uma cadeia de imunoglobulina do anticorpo, opcionalmente em combinação com um polinucleotídeo que codifica a região variável da outra cadeia de imunoglobulina da referida molécula de ligação.

[00260] De um modo mais geral, após a sequência do DNA ou do vetor que codifica uma subunidade monomérica do anticorpo ter sido preparada, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. A introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser realizada utilizando várias técnicas bem conhecidas dos peritos no ramo, que compreendem, mas não se limitam à transfecção, incluindo lipotransfecção, utilizando, ex.: Fugene® ou lipofectamina, fusão de protoplastos, precipitação com fosfato de cálcio, fusão celular com DNA encapsulado, microinjeção e infecção com vírus intacto. Tipicamente, a introdução de plasmídeos no hospedeiro se dá por meio do método padrão de coprecipitação com fosfato de cálcio. As células hospedeiras que abrigam a construção de expressão são cultivadas em condições adequadas à produção das cadeias leves e pesadas, e ensaiadas para a síntese de proteína de cadeia pesada e/ou leve. Exemplos de técnicas de ensaio compreendem o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), o radioimunoensaio (RIE) ou a análise da separação de células ativada por fluorescência (SCAF), imuno-histoquímica e similares.

[00261] O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira por meio de técnicas convencionais e as células transfectadas são, então, colocadas em cultura através de técnicas convencionais para produzir um anticorpo para utilização nos métodos descritos no presente documento. Assim, o na invenção compreende células hospedeiras que compreendem um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo, ou pelo menos o domínio de ligação ou a região variável de uma imunoglobulina do mesmo, que de preferência seja operacionalmente vinculado a um promotor heterólogo. Além disso, ou como alternativa, o na invenção também compreende células hospedeiras que compreendem um vetor, conforme definido anteriormente, compreendendo um polinucleotídeo que codifica pelo menos o domínio de ligação ou a região variável de uma cadeia de imunoglobulina do anticorpo, opcionalmente em combinação com um polinucleotídeo que codifica a região variável da outra cadeia de imunoglobulina da referida molécula de ligação. Em formas de realização de preferência para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, um único vetor ou vetores que codifica(m) ambas as cadeias pesada e leve podem ser coexpressos na célula hospedeira para a expressão de toda a molécula de imunoglobulina, conforme detalhado abaixo.

[00262] A célula hospedeira pode ser cotransfectada com dois vetores de expressão da invenção, com o primeiro vetor codificando um polipeptídeo derivado de cadeia pesada e com o segundo vetor codificando um polipeptídeo derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que possibilitem a expressão igual dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Como alternativa, pode ser utilizado um único vetor que codifique ambos os polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Nesses casos, a cadeia leve é vantajosamente colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada livre de tóxicos; vide Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197. As sequências de codificação das cadeias pesada e leve podem compreender DNAc ou DNA genômico.

[00263] Conforme utilizado no presente documento, “células hospedeiras” são aquelas que abrigam vetores construídos utilizando técnicas de DNA recombinante e que codificam pelo menos um gene heterólogo. Nas descrições de processos para o isolamento de anticorpos de hospedeiros recombinantes, os termos “célula” e “cultura de células” são utilizados indistintamente para indicar a fonte do anticorpo, a menos que seja claramente especificado de outro modo. Em outras palavras, a recuperação do polipeptídeo das “células” pode significar de células inteiras centrifugadas, ou da cultura de células que contém tanto as células médias quanto as em suspensão.

[00264] Uma série de sistemas de vetores de expressão hospedeiros pode ser utilizada para expressar moléculas de anticorpo para utilização nos métodos descritos no presente documento. Esses sistemas hospedeiros de expressão representam veículos através dos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeos apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo da invenção in situ. Entre elas figuram, mas sem se limitar a microrganismos como bactérias (ex.: Escherichia coli, Bacillus subtilis) transformadas com DNA de bacteriófago recombinante, DNA plasmídico ou vetores de expressão de DNA cosmídico que contêm sequências de codificação de anticorpos; levedura (ex.: Saccharomyces, Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinantes que contêm sequências de codificação de anticorpos; sistemas de células de insetos infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (ex.: baculovírus) que contêm sequências de codificação de anticorpos; sistemas de células de plantas infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (ex.: vírus do mosaico da couve-flor, VMCf; vírus do mosaico do tabaco, VMT) ou transformados com vetores de expressão plasmídicos recombinantes (ex.: Ti plasmídico) que contêm sequências de codificação de anticorpos; ou sistemas de células de mamíferos (ex.: células COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3) que abrigam construções de expressão recombinantes que contêm promotores derivados do genoma de células de mamíferos (ex.: promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (ex.: o promotor tardio de adenovírus; o promotor do vírus vaccinia 7,5K). Preferencialmente, células bacterianas como a E. coli, e mais preferencialmente, células eucarióticas, especialmente para a expressão da molécula de anticorpo recombinante inteira, são utilizadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamífero como as células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), em conjunto com um vetor como o elemento principal do promotor do gene precoce intermediário do citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos; vide, ex.: Foecking et al., Gene 45 (1986), 101; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2.

[00265] A linhagem de células hospedeiras utilizada para expressão de proteínas é frequentemente de origem mamífera; os peritos no ramo são creditados com a capacidade de determinar preferencialmente linhagens particulares de células hospedeiras que são mais adequadas para o produto do gene desejado a ser expresso no presente documento. Entre os exemplos de linhagens de células hospedeiras figuram, mas sem se limitar a células CHO (Ovário de Hamster Chinês), DG44 e DUXB11 (linhagens de Ovário de Hamster Chinês, menos DHFR), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linhagem de rim de macaco), COS (derivada da CVI com antígeno SV40 T), VERY, BHK (rim de filhote de hamster), MDCK, WI38, R1610 (fibroblasto de hamster chinês) BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linhagem de rim de hamster), SP2/O (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA-1c1BPT (células endoteliais de bovino), RAJI (linfócitos humanos) e 293 (rim humano). As células CHO e 293 têm preferência particular. Normalmente estão disponíveis linhagens de células hospedeiras de serviços comerciais, da American Tissue Culture Collection ou da literatura publicada.

[00266] Além disso, pode ser escolhida uma cepa de células hospedeiras que modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processa o produto do gene na forma específica desejada. Essas modificações (ex.: glicosilação) e processamento (ex.: clivagem) de produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós- traducional e a modificação de proteínas e produtos de genes. Linhagens celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser escolhidos para assegurar a modificação e o processamento corretos da proteína estranha expressa. Para esse fim, podem ser utilizadas células hospedeiras eucarióticas que possuam a maquinaria celular para o processamento adequado do trecho principal, glicosilação, e fosforilação do produto do gene.

[00267] Para produção de longo prazo e de alto rendimento de proteínas recombinantes, é preferida a expressão estável. Por exemplo, linhagens celulares que expressam de forma estável a molécula de anticorpo podem ser manipuladas. Em vez de utilizar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (ex.: promotor, potenciador, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Após a introdução do DNA estranho, pode-se permitir que células manipuladas cresçam durante 1-2 dias em um meio enriquecido, e depois sejam realocadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo em seus cromossomos e cresçam para formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Esse método pode ser vantajosamente utilizado para manipular linhagens celulares que expressem estavelmente a molécula de anticorpo.

[00268] Pode ser utilizada uma série de sistemas de seleção, incluindo, mas sem se limitar à timidina quinase do vírus do Herpes simplex (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223), os genes hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202), e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817) podem ser empregados nas células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Além disso, a resistência antimetabolito pode ser utilizada como a base de seleção dos seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu & Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; e Morgan & Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215; e higro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147. Métodos de conhecimento comum no ramo da tecnologia de DNA recombinante que podem ser utilizados encontram-se descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer e Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), que são incorporados por referência no presente documento em suas totalidades.

[00269] Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados por amplificação de vetores, para uma análise; vide Bebbington & Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987). Quando um marcador no sistema de vetores que expressa um anticorpo é amplificável, o aumento no nível de inibidor presente na cultura da célula hospedeira aumenta o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada seja associada ao gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentar; vide Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257.

[00270] A produção in vitro possibilita o aumento de escala para se obter grandes quantidades dos polipeptídeos desejados. Técnicas para o cultivo de células de mamíferos em condições de cultura de tecidos são conhecidas no ramo e incluem cultura em suspensão homogênea, ex.: em um reator de leito fluidizado ou em um reator de agitação contínua, ou cultura celular imobilizada ou encapsulada, ex.: em fibras ocas, microcápsulas, em microesferas de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas pelos métodos de cromatografia habituais, por exemplo, filtragem em gel, cromatografia por troca iônica, cromatografia sobre DiEtilAminoEtil celulose ou cromatografia por (imuno-) afinidade, ex.: após a biossíntese preferencial de um polipeptídeo sintético de região de dobra ou antes ou subsequentemente à etapa de cromatografia de interação hidrofóbica descrita no presente documento.

[00271] Genes que codificam anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção também podem ser expressos em células de não mamíferos como bactérias, insetos ou levedura ou células de planta. Bactérias que ocupam prontamente os ácidos nucleicos incluem membros da família Enterobacteriaceae, como cepas de E. coli ou Salmonela; ou da família Bacillaceae, como por exemplo, Bacillus Subtilis; Pneumococo; Estreptococos, e Haemophilus influenzae. Será possível notar, ainda, que, quando expressos em bactérias, os polipeptídeos heterólogos costumam integrar corpos de inclusão. Os polipeptídeos heterólogos devem ser isolados, purificados, e então, montados na forma de moléculas funcionais. Onde forem desejadas formas tetravalentes de anticorpos, as subunidades, então, se montarão automaticamente na forma de anticorpos tetravalentes; vide, ex.: aplicação internacional WO 02/096948.

[00272] Em sistemas bacterianos, uma série de vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo da utilização pretendida da molécula de anticorpo a ser expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade de uma proteína dessas precisar ser produzida, para a produção de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, os vetores que direcionam a expressão de níveis elevados de produtos proteicos de fusão que sejam facilmente purificados pode ser desejável. Entre esses vetores figuram, mas não estão limitados, ao vetor de expressão da E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2 (1983), 1791), em que a sequência de codificação do anticorpo pode estar ligada individualmente no vetor em enquadramento com a região de codificação lacZ de forma que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509); e similares. Vetores pGEX também podem ser utilizados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, proteínas de fusão como essas são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorção e ligação a uma matriz de grânulos de glutationa-agarose seguida de eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são concebidos para incluir sítios de clivagem de protease de fator Xa ou trombina de modo que o produto do gene de destino clonado possa ser liberado a partir da metade com GST.

[00273] Além dos procarióticos, também podem ser utilizados micróbios eucarióticos. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é o de utilização mais comum entre os microrganismos eucarióticos, embora haja uma série de outras cepas comumente disponíveis, ex.: Pichia pastoris. Para expressão em Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, (Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsman et al., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al., Gene 10 (1980), 157) é de utilização comum. Esse plasmídeo já contém o gene TRP1 que fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC n° 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85 (1977), 12). A presença da lesão trpl como uma característica do genoma da célula hospedeira de levedura proporciona, então, um ambiente eficaz para a detecção da transformação através do crescimento na ausência de triptofano.

[00274] Em um sistema de inseto, o vírus da poliedrose nuclear Autographa californica (VPNAc) é tipicamente utilizado como um vetor para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação do anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene da poliedrina) do vírus e colocada sob o controle de um promotor do VPNAc (por exemplo, o promotor da poliedrina).

[00275] Uma vez que uma molécula de anticorpo da invenção tenha sido expressa de forma recombinante, os anticorpos inteiros, seus dímeros, cadeias pesadas e leves individuais, ou outras formas de imunoglobulina da presente invenção podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão no ramo, incluindo, por exemplo, por cromatografia (ex.: troca iônica, afinidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico após a Proteína A, e cromatografia de dimensionamento em coluna), centrifugação, solubilidade diferencial, ex.: precipitação de sulfato de amônia, ou por qualquer outra técnica padrão de purificação de proteínas; vide, ex.: Scopes, “Protein Purification”, Springer Verlag, N.Y. (1982). Como alternativa, um método de preferência para aumentar a afinidade de anticorpos da invenção encontra-se descrita na publicação de patente dos EUA 2002-0123057 A1. Em uma forma de realização, portanto, a presente invenção também proporciona um método para a preparação de um anticorpo anti-TTR ou de um anticorpo que reconheça espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e/ou seus fragmentos ou sua(s) cadeia(s) de imunoglobulina, com esse método compreendendo: (a) a colocação em cultura da célula hospedeira, conforme definido acima, cuja célula compreendia um polinucleotídeo ou vetor, conforme definido anteriormente; e (b) o isolamento desse anticorpo ou sua(s) cadeia(s) de imunoglobulina da cultura.

[00276] Além disso, em uma forma de realização, a presente invenção também se refere a um anticorpo ou a sua(s) cadeia(s) de imunoglobulina codificada(s) por um polinucleotídeo, conforme definido acima ou capaz de ser obtido pelo método de preparação de um anticorpo anti-TTR.

V. Proteínas de Fusão e Conjugados

[00277] Em determinadas formas de realização, o polipeptídeo do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos ou uma ou mais porções que não são normalmente associadas a um anticorpo. Exemplos de modificações encontram-se descritos em maiores detalhes abaixo. Por exemplo, um fragmento de anticorpo Fv de cadeia simples da invenção pode compreender uma sequência ligante flexível, ou pode ser modificado para adicionar uma metade funcional (ex.: PEG, uma droga, uma toxina, ou uma identificação, como por exemplo, de um metal pesado magnético nuclear com enzima fluorescente e radioativa e semelhantes)

[00278] Um polipeptídeo de anticorpo da invenção pode compreender, ser constituído essencialmente por, ou constituído por uma proteína de fusão. Proteínas de fusão são moléculas quiméricas que compreendem, por exemplo, um domínio de ligação à TTR da imunoglobulina com pelo menos um sítio de ligação de destino, e pelo menos uma porção heteróloga, isto é, uma porção com a qual não está naturalmente ligado na natureza. As sequências de aminoácidos podem existir normalmente em proteínas separadas que são reunidas no polipeptídeo de fusão ou podem existir normalmente na mesma proteína, mas serem colocadas em uma nova organização no polipeptídeo de fusão. Proteínas de fusão podem ser criadas, por exemplo, por síntese química, ou através da criação e tradução de um polinucleotídeo no qual as regiões peptídicas sejam codificadas na relação desejada.

[00279] O termo “heterólogo”, conforme aplicado a um polinucleotídeo ou polipeptídeo, significa que esse polinucleotídeo ou polipeptídeo é derivado de uma entidade distinta da do resto da entidade à qual estiver sendo comparado. Por exemplo, conforme utilizado no presente documento, um “polipeptídeo heterólogo” a ser fundido a um anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, variante ou análogo é derivado de um polipeptídeo de não imunoglobulina da mesma espécie, ou de um polipeptídeo de imunoglobulina ou não imunoglobulina de uma espécie diferente. Conforme é abordado com maiores detalhes em outro ponto do presente documento, anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados da invenção podem ainda ser fundidos de forma recombinante a um polipeptídeo heterólogo no terminal N ou C ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) com polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo, anticorpos podem ser fundidos de forma recombinante ou conjugados com moléculas úteis como marcadoras em ensaios de detecção e moléculas efetoras, como por exemplo, polipeptídeos heterólogos, drogas, radionuclídeos ou toxinas; vide, ex.: aplicações internacionais WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; patente dos EUA n° 5.314.995; e pedido de patente europeia EP 0 396 387.

[00280] Anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados da invenção podem ser compostos por aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isósteros peptídicos, e podem conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados pelos genes. Anticorpos podem ser modificados por processos naturais, como processamento pós- traducional, ou por técnicas de modificação química que sejam bem conhecidas no ramo. Essas modificações encontram-se muito bem descritas em textos básicos e em monografias mais pormenorizadas, bem como em uma volumosa literatura de pesquisa. Modificações podem ocorrer em qualquer parte do anticorpo, inclusive na estrutura peptídica, nas cadeias auxiliares de aminoácidos e nos terminais dos grupos amina ou carboxila, ou em porções como carboidratos. Poderá ser notado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente nos mesmos graus ou em graus variáveis em diversos sítios de um dado anticorpo. Além disso, um dado anticorpo pode conter muitos tipos de modificações. Anticorpos podem ser ramificados, por exemplo, como resultado de ubiquitinação, e podem ser cíclicos, com ou sem ramificações. Anticorpos cíclicos, ramificados e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais pós-traducionais ou podem ser preparados por métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ribosilação do ADP, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado nucleotídico, ligação covalente de um lipídio ou derivado lipídico, ligação covalente de fosfatidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfídica, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, carboxilação gama, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada por RNA de transferência de aminoácidos para proteínas como arginilação, e ubiquitinação; vide, ex.: Proteins - Structure e Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman & Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, (1983) 1-12; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646; Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62).

[00281] A presente invenção também prevê proteínas de fusão que compreendem um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado, e um polipeptídeo heterólogo. Em uma forma de realização, a proteína de fusão da invenção compreende, é constituído essencialmente por, ou constituído por um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de qualquer uma ou mais das regiões VH de um anticorpo da invenção ou a sequência de aminoácidos de qualquer uma ou mais das regiões VL de um anticorpo da invenção ou seus fragmentos ou variantes, e uma sequência polipeptídica heteróloga. Em outra forma de realização, uma proteína de fusão para utilização nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos no presente documento compreende, é constituído essencialmente por, ou constituído por um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três das RDCs-VH de um anticorpo, ou seus fragmentos, variantes ou derivados, ou a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três das RDCs-VL de um anticorpo, ou seus fragmentos, variantes, ou derivados, e uma sequência polipeptídica heteróloga. Em uma forma de realização, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de uma RDC3-VH de um anticorpo da presente invenção, ou seu fragmento, derivado ou variante, e uma sequência polipeptídica heteróloga, cuja proteína de fusão se liga especificamente à TTR. Em outra forma de realização, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de pelo menos uma região VH de um anticorpo da invenção e a sequência de aminoácidos de pelo menos uma região VL de um anticorpo da invenção ou seus fragmentos, derivados ou variantes, e uma sequência polipeptídica heteróloga. Preferencialmente, as regiões VH e VL da proteína de fusão correspondem a um anticorpo de fonte única (ou scFv ou fragmento Fab) que liga especificamente TTR. Em ainda outra forma de realização, uma proteína de fusão para utilização nos métodos de diagnóstico e tratamento descrita no presente documento compreende um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três ou mais das RDCs-VH de um anticorpo e a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três ou mais das RDCs-VL de um anticorpo, ou seus fragmentos ou variantes, e uma sequência polipeptídica heteróloga. Preferencialmente, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais das RDC(s)-VH ou RDC(s)-VL correspondem ao anticorpo de fonte única (ou scFv ou fragmento Fab) da invenção. Moléculas de ácido nucleico que codificam essas proteínas de fusão também encontram-se abrangidas pelo na invenção.

[00282] Exemplos de proteínas de fusão descritos na literatura incluem fusões do receptor de células T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD4 (Capon et al., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et al., Nature 339 (1989), 6870; Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; e Byrn et al., Nature 344 (1990), 667-670); L-selectin (homing receptor) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; e Watson et al., Nature 349 (1991), 164-167); CD44 (Aruffo et al., Cell 61 (1990), 1303-1313); CD28 e B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173 (1991),721-730); CTLA- 4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66 (1991), 1133-1144); TNF receptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; e Peppel et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991); e IgE receptor a (Ridgway e Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), Abstract No. 1448).

[00283] Conforme abordado em outro ponto do presente documento, anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados da invenção podem ser fundidos a polipeptídeos heterólogos para aumentar a semivida in vivo dos polipeptídeos ou para utilização em imunoensaios utilizando métodos conhecidos no ramo. Por exemplo, em uma forma de realização, a PEG pode ser conjugada aos anticorpos da invenção para aumentar sua semivida in vivo; vide, ex.: Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; ou Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.

[00284] Além disso, anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados da invenção podem ser fundidos a sequências de marcadores, como um peptídeo para facilitar sua purificação ou detecção. Em formas de realização de preferência, a sequência de marcador de aminoácidos é um peptídeo hexa-histidina (HIS), como a etiqueta fornecida em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Conforme descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824, por exemplo, a hexa-histidina prevê a purificação conveniente da proteína de fusão. Outros sinais peptídicos úteis para a purificação compreendem, mas sem se limitar à etiqueta “HA”, que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe (Wilson et al., Cell 37 (1984), 767), GST, c-mycand the “flag” tag; vide, ex.: Bill Brizzard, BioTechniques 44 (2008) 693-695 para obter uma análise das técnicas de marcação de epítopos, e com a Tabela 1 à sua página 694 listando os marcadores de epítopos mais comuns utilizáveis na presente invenção, cujo assunto principal esteja expressamente incorporado por referência no presente documento.

[00285] Proteínas de fusão podem ser preparadas utilizando métodos que são bem conhecidos no ramo; vide, por exemplo, as patentes dos EUA n° 5.116.964 e 5.225.538. O local preciso em que a fusão é feita pode ser selecionado empiricamente para otimizar a secreção ou as características de ligação da proteína de fusão. O DNA que codifica a proteína de fusão é, então, transfectado para uma célula hospedeira para expressão, que é realizada conforme descrito anteriormente.

[00286] Anticorpos da presente invenção podem ser utilizados na forma não conjugada ou podem ser conjugados com pelo menos uma de uma série de moléculas, ex.: para aprimorar as propriedades terapêuticas da molécula, facilitar a detecção do alvo, ou para a imagiologia ou terapia do paciente. Anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou derivados da invenção podem ser marcados ou conjugados, tanto antes quanto depois da purificação, quando a purificação é realizada. Em particular, os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção podem ser conjugados com agentes terapêuticos, profármacos, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lipídios, modificadores de resposta biológica, agentes farmacêuticos, ou PEG.

[00287] Conjugados que são imunotoxinas, incluindo anticorpos convencionais, foram amplamente descritos no ramo. As toxinas podem ser acopladas aos anticorpos por técnicas de acoplamento convencionais ou imunotoxinas que contenham porções de toxinas de proteínas podem ser produzidas como proteínas de fusão. Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados de uma forma correspondente para se obter essas imunotoxinas. Exemplos dessas imunotoxinas são as descritas por Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 e por Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.

[00288] Os peritos no ramo notarão que os conjugados também podem ser montados utilizando uma série de técnicas que dependem do agente selecionado a ser conjugado. Por exemplo, conjugados com biotina são preparados, ex.: por reação de um polipeptídeo de ligação à TTR com um éster ativado de biotina como o éster N-hidroxissuccinimida de biotina. Do mesmo modo, conjugados com um marcador fluorescente podem ser preparados na presença de um agente de acoplamento, ex.: aqueles listados no presente documento, ou por reação com um isotiocianato, preferencialmente o isotiocianato de fluoresceína. Conjugados dos anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção são preparados de uma maneira análoga.

[00289] A presente invenção abrange ainda anticorpos, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados da invenção conjugados com um agente terapêutico ou de diagnóstico. Os anticorpos podem ser utilizados diagnosticamente, por exemplo, para demonstrar a presença de amiloidose por TTR para indicar o risco de contrair uma doença ou transtorno associado à TTR anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada, para monitorar o desenvolvimento ou a progressão dessa doença, isto é, uma doença com ocorrência de, ou relacionada à TTR agregada, anormalmente configurada, anormalmente montada, ou, como parte de um procedimento de ensaio clínico para, ex.: determinar a eficácia de um dado tratamento e/ou regime de prevenção. Em uma forma de realização, portanto, a presente invenção refere-se a um anticorpo que é identificado de forma a ser detectável. Além disso, em uma forma de realização, a presente invenção refere-se a um anticorpo que está ligado a um medicamento. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento do anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado a uma substância detectável. As substâncias detectáveis ou identificação pode ser, em geral, uma enzima; um metal pesado, de preferência de ouro; um corante, de preferência um corante fluorescente ou luminescente; ou um marcador radioativo. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de pósitrons utilizando diversas tomografias de emissão de pósitrons, e íons metálicos paramagnéticos não radioativos; vide, ex.: a patente dos EUA n° 4.741.900 para obter informações sobre íons metálicos que possam ser conjugados com anticorpos para utilização como agentes de diagnóstico de acordo com a presente invenção. Entre os exemplos de enzimas adequadas figuram a peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; entre os exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados figuram estreptavidina/biotina e avidina/biotina; entre os exemplos de materiais fluorescentes adequados figuram umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente é o luminol; exemplos de materiais bioluminescentes são luciferase, luciferina e aequorina; e exemplos de materiais radioativos adequados são 125I, 131I, 111In ou 99Tc. Portanto, em uma forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo detectavelmente marcado, em que o marcador detectável é selecionado do grupo constituído por uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo e um metal pesado.

[00290] Um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado pode também ser marcado de forma detectável por meio do seu acoplamento a um composto quimioluminescente. A presença do anticorpo marcado como quimioluminescente é, então, determinada por meio da detecção da presença de luminescência que surge durante o decurso de uma reação química. Exemplos de compostos particularmente úteis de marcação quimioluminescente são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.

[00291] Uma das maneiras pelas quais um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado podem ser marcados de forma detectável é por meio de sua ligação a uma enzima e utilizando o produto vinculado em um imunoensaio enzimático (EIA) (Voller, A., “The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)” Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482523; Maggio, (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981). A enzima, que é ligada ao anticorpo, reage com um substrato apropriado, de preferência um substrato cromogênico, de maneira a produzir uma porção química capaz de ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou visuais. Entre as enzimas capazes de serem utilizadas para marcar de forma detectável o anticorpo figuram, mas sem se limitar a desidrogenase de malato, nuclease de estafilococos, isomerase delta-5- esteroide, desidrogenase de álcool de levedura, alfa-glicerofosfato, desidrogenase, isomerase de fosfato de triose, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, asparaginase, oxidase de glicose, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, desidrogenase de glicose-6-fosfato, glicoamilase e acetilcolinesterase. Além disso, a detecção pode ser conseguida por métodos colorimétricos que empregam um substrato cromogênico da enzima. A detecção também pode ser conseguida por comparação visual da extensão da reação enzimática de um substrato em comparação com padrões preparados de modo semelhante.

[00292] A detecção também pode ser conseguida utilizando qualquer um de uma série de outros imunoensaios. Por exemplo, marcando radioativamente o anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado, é possível detectar o anticorpo através da utilização de um radioimunoensaio (RIE) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)), que é incorporado por referência no presente documento). O isótopo radioativo pode ser detectado por meios que incluem, mas sem se limitar a um contador gama, um contador de cintilação, ou autorradiografia.

[00293] Um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado também pode ser marcado de forma detectável utilizando metais emissores de fluorescência, como 152Eu, ou outros da série dos lantanídeos. Esses metais podem ser ligados ao anticorpo utilizando esses grupos quelantes metálicos como o ácido dietilenotriamina penta-acético (DTPA) ou o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA).

[00294] As técnicas para a conjugação de diversas porções de um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado são bem conhecidas, vide, ex.: Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies & Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1987) 623-53; Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ’84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), (1985) 475506; “Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press (1985) 303-16, and Thorpe et al., “The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158.

[00295] Conforme mencionado, em determinada formas de realização, uma porção que aumenta a estabilidade ou a eficácia de uma molécula de ligação, ex.: um polipeptídeo de ligação, ex.: um anticorpo ou um seu fragmento imunoespecífico pode ser conjugado. Por exemplo, em uma forma de realização, PEG pode ser conjugado com as moléculas de ligação da invenção para aumentar sua semivida in vivo. Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; ou Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512.

VI. Composições e Métodos de Utilização

[00296] A presente invenção refere-se a composições que compreendem a molécula de ligação à TTR supracitada, ex.: anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção ou seu derivado ou seu variante, ou o polinucleotídeo, vetor, célula ou peptídeo da invenção conforme definido anteriormente no presente documento. Em uma forma de realização, a composição da presente invenção é uma composição farmacêutica e compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode compreender outros agentes como interleucinas ou interferons, dependendo da utilização pretendida da composição farmacêutica. Para utilização no tratamento de uma doença ou transtorno com a ocorrência de, ou relacionado à TTR que sofreu mutação, anormalmente configurada, anormalmente montada, ou agregada, como por exemplo, amiloidose por TTR, o agente adicional pode ser selecionado do grupo constituído por moléculas orgânicas pequenas, anticorpos anti-TTR, e suas combinações. Consequentemente, em uma forma de realização de preferência particular, a presente invenção refere-se à utilização da molécula de ligação à TTR, ex.: anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção ou de uma molécula de ligação que possui substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um desses, o polinucleotídeo, o vetor ou a célula da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica ou de diagnóstico para o tratamento profilático e terapêutico de uma doença ou transtorno associado à amiloidose por TTR, monitorando a progressão de uma doença ou transtorno associado à amiloidose por TTR ou uma resposta a um tratamento de amiloidose por TTR em um indivíduo ou para determinar o risco de um indivíduo desenvolver uma doença ou um transtorno associado à amiloidose por TTR.

[00297] Consequentemente, em uma forma de realização, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença ou transtorno caracterizado pela deposição e/ou pelo acúmulo anormal de TTR e/ou TTR anormalmente configurada, anormalmente montada, agregada, que sofreu mutação em órgãos e sistemas afetados como o sistema nervoso periférico, sistema nervoso autônomo, sistema nervoso central, sistema gastrointestinal, sistema vascular, especialmente leptomeninges, sistema linfoide, especialmente os gânglios linfáticos, sistema musculoesquelético, especialmente os tendões e os ligamentos, coração, olhos, rins, pulmões, pele, língua, glândula tireoide e bexiga, cujo método compreende a administração a um indivíduo com necessidade da mesma, uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das moléculas de ligação à TTR descritas anteriormente, anticorpos, polinucleotídeos, vetores, células ou peptídeos da presente invenção.

[00298] Uma vantagem particular da abordagem terapêutico da presente invenção reside no fato de que os anticorpos recombinantes da presente invenção são derivados de células B ou células B de memória de seres humanos saudáveis que não apresentam sinais ou sintomas de uma doença, ex.: portador de uma mutação e/ou mutações assintomática(s), indicando a ocorrência de, ou relacionada à TTR agregada e, assim, são, com certa probabilidade, capazes de prevenir uma doença clinicamente manifesta relacionada à TTR anormalmente configurada, anormalmente montada, que sofreu mutação e/ou agregada, ou de diminuição do risco de ocorrência da doença ou transtorno clinicamente manifestos, ou de atrasar os primeiros sintomas ou a progressão da doença ou transtorno clinicamente manifestos. Tipicamente, os anticorpos da presente invenção também já passaram com êxito pela maturação somática, ou seja, pela otimização referente à seletividade e eficácia na ligação de alta afinidade à molécula de TTR de destino por meio de variação somática das regiões variáveis do anticorpo.

[00299] O conhecimento de que essas células in vivo, ex.: em um ser humano, não foram ativadas por meio de proteínas relacionadas ou de outras proteínas fisiológicas ou estruturas celulares no sentido de uma reação alérgica ou autoimunológica também é de grande importância médica, pois significa um considerável aumento da possibilidade de sobreviver com sucesso às fases dos testes clínicos. Por assim dizer, a eficiência, a aceitabilidade e a tolerabilidade já foram demonstradas antes do desenvolvimento pré- clínico e clínico do anticorpo terapêutico ou profilático em pelo menos um indivíduo humano. Pode-se, portanto, esperar que os anticorpos anti-TTR humanos da presente invenção, tanto sua eficiência específica à estrutura de destino na qualidade de agente terapêutico quanto sua probabilidade reduzida de efeitos colaterais, aumentem significativamente sua probabilidade clínica de sucesso.

[00300] A presente invenção também proporciona um pacote ou kit farmacêutico e de diagnóstico, respectivamente, que compreende um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes descritos anteriormente, ex.: anticorpo anti-TTR, seu fragmento de ligação, derivado ou variante, polinucleotídeo, vetor, célula e/ou peptídeo da presente invenção. Associado a esse(s) recipiente(s), pode haver um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regule a fabricação, utilização ou comercialização de produtos farmacêuticos ou biológicos, aviso esse que reflita a aprovação, pela agência, da fabricação, utilização ou comercialização para administração em seres humanos. Além disso, ou como alternativa, o kit compreende reagentes e/ou instruções de utilização em ensaios de diagnóstico apropriados. A composição, ex.: kit com a presente invenção, é, evidentemente, particularmente apropriada para a avaliação de risco, o diagnóstico, a prevenção e o tratamento de uma doença ou transtorno que venha acompanhado da presença de TTR que sofreu mutação, anormalmente configurada, anormalmente montada, e/ou agregada, e em particular, aplicável para o tratamento de transtornos geralmente caracterizados por amiloidose por TTR que compreendam doenças e/ou transtornos como Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF), Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF), Amiloidose Sistêmica Senil (ASS), amiloidose familiar sistêmica, amiloidose leptomeníngea / do Sistema Nervoso Central (SNC), incluindo Mal de Alzheimer, amiloidose ocular relativa à TTR, amiloidose renal relativa à TTR, hipertiroxinemia relativa à TTR, amiloidose de ligamentos relativa à TTR, incluindo a síndrome do túnel do carpo, lesões do manguito rotador e estenose espinhal lombar, e pré-eclâmpsia.

[00301] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos bem conhecidos no ramo; vide, por exemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são bem conhecidos no ramo e compreendem soros fisiológicos tamponados com fosfato, água, emulsões, como por exemplo, de óleo/água, vários tipos de agentes molhantes, soluções estéreis, etc. Composições que compreendam esses veículos podem ser formuladas por métodos convencionais bem conhecidos. Essas composições farmacêuticas podem ser administradas ao indivíduo em uma dosagem adequada. A administração das composições apropriadas pode ser efetuada de diferentes maneiras, ex.: por via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intranasal, tópica ou por administração intradérmica ou por aplicação espinhal ou cerebral. Formulações de aerossol como formulações de pulverização nasal compreendem soluções aquosas purificadas ou outras soluções do agente ativo com agentes conservantes e agentes isotônicos. Essas formulações são preferencialmente ajustadas para um estado isotônico e de pH compatíveis com as membranas mucosas nasais. Formulações para administração rectal ou vaginal podem se apresentar como um supositório com um veículo apropriado.

[00302] O regime de dosagem será determinado pelo médico que estiver tratando o paciente e por fatores clínicos. Como bem se sabe nas técnicas médicas, dosagens para qualquer paciente individual dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, a área de superfície corporal, idade, o composto particular a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e outros medicamentos que estiverem sendo administrados concomitantemente. Uma dosagem típica pode estar, por exemplo, no intervalo entre 0,001 e 1.000 μg (ou de ácido nucleico para expressão ou para inibição da expressão nesse intervalo); contudo, dosagens abaixo ou acima desse intervalo exemplificativo estão previstos, especialmente considerando os fatores supracitados. Em geral, a dosagem pode variar, ex.: de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kg (ex.: 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.) do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg do peso corporal ou 10 mg/kg do peso corporal ou dentro do intervalo entre 1 e 10 mg/kg, preferencialmente pelo menos 1 mg/kg. Doses intermediárias dos intervalos acima também devem permanecer dentro do âmbito da invenção. Indivíduos podem receber essas dosagens diariamente, em dias alternados, semanalmente ou de acordo com qualquer outro cronograma determinado por análise empírica. Um exemplo de tratamento implica a administração em várias dosagens ao longo de um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Outros exemplos de regimes de tratamento implicam a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Exemplos de cronogramas de dosagens compreendem de 1 a 10 mg/kg ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kg semanalmente. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado se encaixa dentro dos intervalos indicados. O progresso pode ser monitorado por meio de uma avaliação periódica. Preparados para administração parentérica incluem soluções estéreis aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato, ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (como os baseados em dextrose de Ringer), e similares. Conservantes e outros aditivos também podem estar presentes, como por exemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, e gases inertes e similares. Além disso, a composição farmacêutica da invenção pode compreender outros agentes como a dopamina ou medicamentos psicofarmacológicos, dependendo da utilização pretendida da composição farmacêutica.

[00303] Além disso, em uma forma de realização de preferência da presente invenção, a composição farmacêutica pode ser formulada como uma vacina, por exemplo, se a composição farmacêutica da invenção compreender um anticorpo da TTR ou seu fragmento de ligação, derivado ou variante, para imunização passiva. Conforme mencionado na seção antecedentes, espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas, que sofreram mutação e/ou agregadas e/ou seus fragmentos ou derivados são um importante desencadeador de amiloidose por TTR. Consequentemente, é prudente esperar que a imunização passiva com anticorpos anti-TTR humanos e moléculas de ligação à TTR equivalentes da presente invenção ajude a quebrar vários efeitos adversos dos conceitos de terapia de imunização ativa e leve a uma agregação de TTR reduzida. Portanto, os anticorpos anti-TTR atuais e seus equivalentes da presente invenção serão particularmente úteis como uma vacina para a prevenção ou melhoria de doenças ou transtornos que mostrem a presença de, ou que sejam causados por TTR agregada, como Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF), Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF), Amiloidose Sistêmica Senil (ASS), amiloidose familiar sistêmica, amiloidose leptomeníngea / do Sistema Nervoso Central (SNC), incluindo Mal de Alzheimer, amiloidose ocular relativa à TTR, amiloidose renal relativa à TTR, hipertiroxinemia relativa à TTR, amiloidose de ligamentos relativa à TTR, incluindo a síndrome do túnel do carpo, lesões do manguito rotador e estenose espinhal lombar, e pré-eclâmpsia, por exemplo.

[00304] Em uma forma de realização, talvez seja benéfico utilizar os fragmentos recombinantes Fab (rFab) e de cadeia simples (scFvs) do anticorpo da presente invenção que podem penetrar mais facilmente uma membrana celular. Por exemplo, Robert et al., Protein Eng. Des. Sel. (2008); S1741-0134, publicado na internet com antecedência, descreve a utilização de fragmentos recombinantes quiméricos Fab (rFab) e de cadeia simples (scFvs) do anticorpo monoclonal WO-2, que reconhece um epítopo na região do terminal N de beta amiloide (Abeta). Os fragmentos manipulados foram capazes de (i) prevenir a fibrilização amiloide, (ii) desagregar fibrilas Abeta1-42 pré-formadas e (iii) inibir a neurotoxicidade mediada pelos oligômeros Abeta1-42 in vitro de forma tão eficiente quanto à molécula de IgG em sua integralidade. As vantagens percebidas da utilização de pequenos formatos de anticorpos Fab e scFv manipulados que não possuem a função efetora compreendem uma passagem mais eficiente pela barreira hematoencefálica e minimizam o risco de desencadear reações colaterais inflamatórias. Além disso, além dos anticorpos de scFv e de domínio simples reterem a especificidade de ligação de anticorpos de comprimento completo, podem ser expressos como genes simples e de maneira intracelular em células de mamíferos como intracorpos, com potencial de alteração das dobras, interações, modificações, ou localização subcelular de seus alvos; vide para análise, ex.: Miller & Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401.

[00305] Em uma abordagem diferente, Muller et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241, descrevem uma plataforma tecnológica intitulada ‘Tecnologia do SuperAnticorpo’, que afirma-se possibilitar que anticorpos sejam transportados para o interior de células vivas sem que sejam prejudicados. Esses anticorpos que penetram as células abrem novas janelas terapêuticas e de diagnóstico. O termo ‘TransMabs’ foi cunhado para esses anticorpos.

[00306] Em outra forma de realização, talvez seja desejável a coadministração ou administração sequencial de outros anticorpos úteis para o tratamento de uma doença ou transtorno relacionado à ocorrência de TTR que sofreu mutação, anormalmente configurada, anormalmente montada, e/ou agregada. Em uma forma de realização, o anticorpo adicional está compreendido na composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos de anticorpos que podem ser utilizados para tratar um indivíduo compreendem, mas não se limitam a anticorpos que almejem CD33, SGLT2, IL-6, e IL-1.

[00307] Em outra forma de realização, talvez seja desejável a coadministração ou administração sequencial de outros agentes úteis para o tratamento de uma doença ou transtorno relacionado à TTR que sofreu mutação, anormalmente configurada, anormalmente montada, e/ou agregada. Em uma forma de realização, o agente adicional está compreendido na composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos de agentes que podem ser utilizados para tratar um indivíduo compreendem, mas não se limitam a: Agentes que estabilizam o tetrâmero da TTR, como Tafamidis Meglumina, diflusinal, doxiciclina com ácido ursodesoxicólico; agentes anti-inflamatórios como diflusinal, corticoesteroides, ácido fenilacético 2-(2,6-dicloranilina) (diclofenaco), ácido iso-butil-fenil-propanóico (ibuprofeno); diuréticos, Epigalocatequina-galato, Cloridrato de melfalano, dexametasona, Bortezomibe, Bortezomibe-Melfalano, Bortezomibe- dexametasona, Melfalano-dexametasona, Bortezomibe-Melfalano-dexametasona; antidepressivos, drogas antipsicóticas, neurolépticos, drogas antidemência (ex.: a memantina antagonista do receptor NMDA), inibidores de acetilcolinesterase (ex.: Donepezil, HCI, Rivastigmina, Galantamina), antagonistas de glutamato e outros medicamentos nootrópicos de pressão arterial (ex.: Dihidralazina, Metildopa), citostáticos, glucocorticoides, inibidores de ACE (enzima conversora de angiotensina); agentes anti- inflamatórios ou qualquer combinação entre esses. Exemplos de agentes que podem ser utilizados para tratar ou prevenir a rejeição de órgãos após transplantes de órgãos clínicos compreendem, mas sem se limitar aos agentes do grupo que provoca um enfraquecimento do sistema imunológico, ou seja, imunossupressores que compreendam inibidores de calcineurina como ciclosporina e tacrolimo, inibidores de proliferação como inibidores de mTOR que compreendem everolimo e sirolimo (rapamicina), bem como antimetabolitos como azatioprina, Mofetil Micofenolato/MMF e ácido micofenólico, e corticosteroides como cortisona e cortisol, bem como substâncias sintéticas como Prednisona ou Prednisolona podem ser utilizadas. Além disso, podem ser utilizados anticorpos como os anticorpos monoclonais do receptor anti-IL-2 (ex.: Basiliximab, Daclizumab) bem como anticorpos monoclonais anti-CD3 (ex.: Muromonab-CD3), e composições policlonais como globulina antitimócito (ATG); e agonistas do receptor de peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) (vide, ex.: Noguchi et al., Acta Med. Okayama, 60 (2006), e a aplicação internacional WO 2012/088157). Além disso, outros agentes podem compreender agentes para a profilaxia e/ou tratamento de infecções e outros efeitos colaterais após transplantes de órgãos compreendendo valganciclovir, citomegalovírus imunoglobulina, ganciclovir, anfotericina B, pirimetamina, ranitidina, ramipril, furosemida, benzbromarona. Portanto, em uma forma de realização, uma composição é fornecida, compreendendo ainda um agente adicional útil para o tratamento da amiloidose por TTR e/ou no tratamento ou prevenção da rejeição de órgãos após, ex.: transplante clínico de fígado. Exemplos de outros agentes que podem ser utilizados concomitantemente com uma composição farmacêutica da presente invenção encontram-se descritos no ramo; vide, ex.: aplicações internacionais WO 2009005672, WO 2010128092, WO 2012088157 ou aplicação europeia EP 11 158 212.8.

[00308] Uma dosagem ou quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a essa quantidade do ingrediente ativo suficiente para aliviar os sintomas ou a condição. A eficácia terapêutica e a toxicidade desses compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, ex.: ED50 (a dosagem terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dosagem letal para 50% da população). A razão de dosagem entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, que pode ser expresso como a razão LD50/ED50.

[00309] Com base no exposto anteriormente, fica evidente que a presente invenção abrange qualquer utilização de uma molécula de ligação à TTR e/ou seus fragmentos, compreendendo pelo menos uma RDC do anticorpo descrito acima, particularmente para o diagnóstico e/ou tratamento de uma doença ou transtorno relacionado a espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e/ou seus fragmentos, conforme anteriormente mencionado, como amiloidose por TTR. Preferencialmente, essa molécula de ligação representa um anticorpo da presente invenção ou uma sua cadeia de imunoglobulina. Além disso, a presente invenção refere-se a anticorpos anti-idiotípicos de qualquer um dos anticorpos mencionados descritos anteriormente no presente documento. Esses são anticorpos ou outras moléculas de ligação que se ligam à singular sequência peptídica antigênica localizada na região variável de um anticorpo perto do sítio de ligação ao antígeno e que são úteis, ex.: para a detecção de anticorpos anti-TTR em uma amostra obtida de um indivíduo. Em uma forma de realização, portanto, a presente invenção fornece um anticorpo conforme definido acima e abaixo ou uma molécula de ligação à TTR que possui substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um desses, o polinucleotídeo, o vetor ou a célula conforme definido no presente documento ou uma composição farmacêutica ou de diagnóstico que compreende qualquer um desses para utilização no tratamento profilático, no tratamento terapêutico e/ou no monitoramento da progressão ou de uma resposta ao tratamento de uma doença ou transtorno relacionado à TTR, preferencialmente em que o transtorno seja selecionado do grupo que compreende Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF), Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF), Amiloidose Sistêmica Senil (ASS), amiloidose familiar sistêmica, amiloidose leptomeníngea / do Sistema Nervoso Central (SNC), incluindo Mal de Alzheimer, amiloidose ocular relativa à TTR, amiloidose renal relativa à TTR, hipertiroxinemia relativa à TTR, amiloidose de ligamentos relativa à TTR, incluindo a síndrome do túnel do carpo, lesões do manguito rotador e estenose espinhal lombar, e pré-eclâmpsia. O grupo supracitado de doenças ou transtornos é chamado de grupo de transtornos associados à amiloidose por TTR.

[00310] Em outra forma de realização, a presente invenção refere-se a uma composição de diagnóstico que compreende qualquer uma das moléculas de ligação à TTR, anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, polinucleotídeos, vetores, células e/ou peptídeos da invenção descritos acima, e opcionalmente, meios adequados para detecção desses reagentes convencionalmente utilizados em métodos de diagnóstico à base de ácidos nucleicos ou imunológicos. Os anticorpos da invenção são, por exemplo, apropriados para utilização em imunoensaios em que possam ser utilizados em fase líquida ou ligados a um veículo de fase sólida. Exemplos de imunoensaios que podem utilizar o anticorpo da invenção são imunoensaios competitivos e não competitivos, seja em formato direto ou indireto. Exemplos desses imunoensaios são o radioimunoensaio (RIE), o tipo “sanduíche” (ensaio imunométrico), citometria de fluxo, e o ensaio pelo método “western blot”. Os antígenos e anticorpos da invenção podem ser ligados a muitos veículos diferentes e utilizados para isolar células especificamente ligadas a eles. Entre os exemplos de veículos bem conhecidos figuram vidro, poliestireno, cloreto de polivinila, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amiloses, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel para os fins da invenção. Existem muitos marcadores e métodos de marcação diferentes conhecidos daqueles com habilidades ordinárias no ramo. Entre os exemplos dos tipos de marcadores que podem ser utilizados na presente invenção figuram enzimas, radioisótopos, metais coloidais, compostos fluorescentes, compostos quimioluminescentes e compostos bioluminescentes; vide também as formas de realização discutidas acima.

[00311] Por outra forma de realização, as moléculas de ligação à TTR, em especial os anticorpos da presente invenção, também podem ser utilizadas em um método de diagnosticar uma doença ou transtorno em um indivíduo através da obtenção de uma amostra de fluido corporal do indivíduo testado que pode ser um amostra de sangue, de plasma, de soro, de linfa ou de qualquer outro fluido corporal, como saliva ou urina, e o contato da amostra de fluido corporal com um anticorpo da presente invenção em condições que permitam a formação de complexos anticorpo-antígeno. O nível desses complexos é, então, determinado por métodos conhecidos no ramo, um nível significativamente mais elevado que o formado em uma amostra de controle que indique a doença ou transtorno no indivíduo testado. Do mesmo modo, o antígeno específico ligado pelos anticorpos da invenção também pode ser utilizado. Assim, a presente invenção refere-se a um imunoensaio in vitro que compreende a molécula de ligação, ex.: anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção.

[00312] Em outra forma de realização da presente invenção, as moléculas de ligação à TTR, em particular, os anticorpos da presente invenção também podem ser utilizados em um método para diagnosticar uma doença ou transtorno em um indivíduo através da obtenção de uma biópsia do indivíduo testado que pode ser de pele, glândulas salivares, raízes capilares, coração, cólon, nervo, biópsias de gordura subcutânea, ou uma biópsia de qualquer órgão afetado.

[00313] Nesse contexto, a presente invenção também se refere a meios especificamente projetados para essa finalidade. Por exemplo, uma matriz à base de anticorpos pode ser utilizada, que seja, por exemplo, cheia de anticorpos ou moléculas de ligação ao antígeno equivalentes da presente invenção, que reconheçam especificamente a TTR. A concepção de imunoensaios em micromatrizes encontra-se resumida em Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. Consequentemente, a presente invenção também se refere a micromatrizes cheias de moléculas de ligação à TTR identificadas em conformidade com a presente invenção.

[00314] Em uma forma de realização, a presente invenção se refere a um método de diagnosticar uma doença ou transtorno relacionado a espécies de TTR que sofreram mutação, anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas e/ou seus fragmentos em um indivíduo, com o método compreendendo a determinação da presença de TTR e/ou TTR anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada em uma amostra proveniente do indivíduo a ser diagnosticado com pelo menos um anticorpo da presente invenção, um seu fragmento de ligação à TTR ou uma molécula de ligação à TTR que possui substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um desses, em que a presença de TTR que sofreu mutações patológicas, anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada seja indicativa de amiloidose por TTR e um aumento no nível da TTR patologicamente anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada em comparação com o nível da TTR fisiológica seja indicativo de progressão de amiloidose por TTR no indivíduo em questão.

[00315] O sujeito a ser diagnosticado pode estar assintomático ou pré-clínico para a doença. Preferencialmente, o indivíduo do grupo de controle tem uma doença associada à TTR anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada, ex.: Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF), Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF) ou Amiloidose Sistêmica Senil (ASS), em que a semelhança entre o nível da TTR patologicamente anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada e o padrão de referência indique que o indivíduo a ser diagnosticado apresenta amiloidose por TTR ou está em risco de desenvolver amiloidose por TTR. Como alternativa, ou além disso, como um segundo grupo de controle, o indivíduo do grupo de controle não apresenta amiloidose por TTR, em que a diferença entre o nível de TTR fisiológica e/ou da TTR anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada e o padrão de referência indique que o indivíduo a ser diagnosticado apresenta amiloidose por TTR ou está em risco de desenvolver amiloidose por TTR. Preferencialmente, o indivíduo a ser diagnosticado e o(s) indivíduo(s) do grupo de controle têm idades correspondentes. A amostra a ser analisada pode ser de qualquer fluido corporal suspeito de conter TTR patologicamente anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada, por exemplo, de sangue, plasma sanguíneo, soro sanguíneo, urina, fluido peritoneal, saliva ou líquido cefalorraquidiano.

[00316] O nível de TTR fisiológica e/ou de TTR patologicamente anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada pode ser avaliado por qualquer método adequado conhecido no ramo, compreendendo, ex.: analisando a TTR por uma ou mais técnicas escolhidas entre “western blot”, imunoprecipitação, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (RIE), separação de células ativada por fluorescência (SCAF), eletroforese em gel bidimensional, espectroscopia de massa (EM), ionização e dessorção a laser assistida por matriz-tempo de voo (MALDI-TOF), ionização e dessorção a laser com superfície reforçada-tempo de voo (SELDI-TOF), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia líquida de proteína rápida (CLPR), cromatografia líquida multidimensional (CL) seguidas por espectrometria de massa em tandem (MS/MS), e densitometria a laser. Preferencialmente, a referida imagiologia in vivo da TTR compreende cintilografia, tomografia por emissão de pósitrons (TEP), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), imagiologia ótica do infravermelho próximo (NIR) ou imagem por ressonância magnética (MRI).

[00317] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao diagnóstico de amiloidose por TTR, monitorando o tratamento dessa doença e determinando a utilidade terapêutica ou de diagnóstico de uma droga anti-TTR em um método que não pede coleta de tecido ou uma biópsia, ou seja, um método não invasivo.

[00318] Normalmente, a concentração de agregados de TTR e/ou TTR anormalmente configurada capaz de ser detectada em um fluido corporal como plasma sanguíneo é muito baixa, e assim, o diagnóstico de amiloidose por TTR é penoso e demorado. Em particular, o diagnóstico das doenças da amiloidose por TTR é um processo difícil e demorado, já que várias doenças apresentam sinais e sintomas muito semelhantes, de modo que o diagnóstico formal de Polineuropatia Amiloidótica Familiar (PAF), Cardiomiopatia Amiloidótica Familiar (CAF) e Amiloidose Sistêmica Senil (ASS) costuma exigir coleta de tecido para biópsia e identificação de depósitos amiloides de TTR por meio de técnicas complexas de coloração histológica. Como as biópsias de tecidos são muito pequenas e os depósitos amiloides de TTR são dispersos, a determinação histológica de amiloidose por TTR é tipicamente associada à alta frequência de resultados falsos negativos e atrasos para os pacientes.

[00319] No entanto, de acordo com a presente invenção, pode ser surpreendentemente mostrado que, após uma única administração de um anticorpo anti- TTR objeto, uma medida de agregados e/ou de TTR anormalmente configurada ligada a anticorpos anti-TTR no sangue foi possível; vide Exemplo 13 e Fig. 14. Portanto, graças à propriedade provavelmente original do anticorpo anti-TTR da presente invenção remover a TTR dos depósitos de TTR amiloidogênicos e transportá-la no sangue, um novo método de diagnosticar transtornos associados à TTR anormalmente configurada, que sofreu mutações e/ou agregada em um paciente ou indivíduo foi desenvolvido, método esse que tem o potencial de substituir biópsias de tecido e a análise histológica no processo de diagnóstico de doenças amiloides de TTR. O método baseia-se na utilização de um anticorpo específico para a conformação patológica da proteína da TTR, que é injetada no paciente e utilizada para sondar quanto à presença da proteína da TTR anormalmente configurada e/ou agregada em qualquer ponto do corpo do paciente. Após uma curta espera, por exemplo, de 2 dias, após a injeção de anticorpos em um paciente, uma amostra de sangue é retirada e utilizada para detectar se o anticorpo capturou e destacou as partículas da TTR anormalmente configurada e/ou agregada dos depósitos de TTR. A principal vantagem desse método em comparação com a histologia tem a ver com a injeção do anticorpo anti-TTR diretamente em pacientes, em que a circulação sanguínea permitir sua circulação por todos os tecidos e órgãos, e a detecção de depósitos da proteína da TTR anormalmente configurada e/ou agregada, independentemente de sua localização.

[00320] Assim, em outros aspectos, a presente invenção refere-se a um método de diagnóstico de uma doença associada à amiloidose por TTR que compreende testes do nível de TTR anormalmente configurada e/ou agregada em uma amostra retirada de um indivíduo após a administração de um anticorpo anti-TTR no indivíduo, em que a presença ou o nível elevado de TTR anormalmente configurada e/ou agregada na amostra do indivíduo em comparação com o grupo de controle, assim como uma amostra obtida do indivíduo antes da administração do anticorpo anti-TTR indica uma doença associada à amiloidose por TTR. Além disso, uma vez que, conforme mostrado no Exemplo 13, o novo método também é útil para a caracterização de medicamentos anti-TTR e para o decurso do tratamento de amiloidose por TTR, respectivamente, o novo método da presente invenção também é planejado para monitorar o tratamento da doença com um anticorpo anti-TTR ou determinar a utilidade terapêutica ou de diagnóstico de um anticorpo anti-TTR. Nesse contexto, o perito no ramo saberá reconhecer que o método da presente invenção não se limita à investigação da utilidade terapêutica e da eficácia de anticorpos anti-TTR, como também se aplica a outros tipos de medicamentos anti-TTR que são capazes de degradar os depósitos amiloides de TTR. Por exemplo, um anticorpo anti-TTR da presente invenção pode ser administrado em conjunto com outro medicamento anti-TTR e o nível da TTR anormalmente configurada e/ou agregada na amostra do indivíduo que recebeu o tratamento é comparado com um grupo de controle obtido do indivíduo antes da administração tanto do anticorpo anti-TTR e do medicamento anti-TTR, mas somente após o tratamento com anticorpos anti-TTR.

[00321] Em uma forma de realização de preferência da presente invenção, em particular ao se utilizar animais não humanos para testar anticorpos recombinantes de origem humana, conforme ilustrado no Exemplo 13, e outros anticorpos anti-TTR destinados a serem utilizados em seres humanos, em geral, o nível de TTR anormalmente configurada e/ou agregada na amostra é submetido a testes pela determinação de um complexo formado entre o anticorpo anti-TTR e a TTR anormalmente configurada e/ou agregada, por exemplo, por imunoprecipitação com uma IgG anti-humana ou um anticorpo anti-idiotípico. Como alternativa, pode ser utilizado um segundo anticorpo anti-TTR que reconheça a TTR com um epítopo substancialmente diferente do epítopo do anticorpo anti- TTR candidato a medicamento, de modo a ligar o complexo formado pelo anticorpo anti- TTR candidato a medicamento e a TTR, e assim, detectou sua presença, por exemplo, por meio do ensaio ELISA ou por imunoprecipitação.

[00322] Referentemente ao aspecto de diagnóstico em particular para um ser humano e para um paciente, a presença e o nível elevado de TTR anormalmente configurada e/ou agregada e de seus complexos com o anticorpo anti-TTR, respectivamente, indica a presença de depósitos amiloides de TTR no corpo humano, por exemplo, no coração, no sistema nervoso periférico (SNP), nos olhos, músculos, trato gastrointestinal, rins, sistema vascular e no sistema nervoso central (SNC) de um paciente ou indivíduo. Assim, o método da presente invenção permite a identificação e a determinação de uma doença associada à amiloidose por TTR no corpo do indivíduo, por um lado, e a remoção de depósitos de TTR do corpo do paciente, por outro, deste modo, também, indicando o progresso terapêutico de um tratamento dado e a eficácia de um medicamento específico para amiloidose por TTR como um anticorpo anti-TTR.

[00323] Consequentemente, conforme demonstra o Exemplo 13, o anticorpo anti- TTR da presente invenção é capaz de ligar a TTR anormalmente configurada e/ou agregada com afinidade suficiente para alterar a estabilidade de depósitos patológicos de TTR como para capturar e remover a TTR anormalmente configurada e/ou agregada dos depósitos de dentro de um fluido corporal, em especial, do sangue.

[00324] O anticorpo anti-TTR a ser utilizado de acordo com o método da presente invenção pode ser qualquer anticorpo de TTR que seja específico para a conformação patológica da TTR, isto é, a TTR anormalmente configurada, que sofreu mutações, e/ou agregada. No entanto, em uma forma de realização de preferência, o anticorpo anti-TTR utilizado no método que dispensa tecidos é um anticorpo anti-TTR ou uma molécula de ligação à TTR da presente invenção descrito no presente documento e ilustrado nos Exemplos.

[00325] Nesse contexto, o anticorpo anti-TTR pode ser modificado e, por exemplo, ligado a um marcador detectável conforme descrito para qualquer uma das outras formas de realização anteriormente descritas. Além disso, imunoensaios como o com a técnica “western blot”, o com a técnica de hibridização, (sanduíche) ELISA e outros semelhantes conhecidos no ramo e descritos para outros métodos de diagnóstico e utilizações com base no anticorpo anti-TTR e no peptídeo da presente invenção podem ser adaptados para os novos ensaios de amiloides TTR da presente invenção.

[00326] Conforme mostra o Exemplo 13 e a Fig. 14 utilizando o ensaio de amiloide TTR, pode ser mostrado que os anticorpos anti-TTR da presente invenção são capazes de capturar e destacar a TTR anormalmente configurada e/ou agregada dos depósitos de amiloide TTR e o imunocomplexo correspondente pode ser medido em uma amostra de fluido corporal, em especial, do sangue do paciente ou indivíduo; vide Exemplo 13 e Fig. 14. Consequentemente, em uma forma de realização da presente invenção, o anticorpo anti-TTR é capaz de ligar a TTR anormalmente configurada e/ou agregada com afinidade suficiente para alterar o efluxo líquido da TTR anormalmente configurada e/ou agregada proveniente de, ex.: coração, sistema nervoso periférico (SNP), olhos, músculos, trato gastrointestinal, rins, sistema vascular e sistema nervoso central (SNC).

[00327] A amostra de fluido corporal, preferencialmente de sangue ou líquido cefalorraquidiano do indivíduo, em que a TTR anormalmente configurada e/ou agregada capturada e destacada ligada ao anticorpo anti-TTR está presente, é obtida em um intervalo de tempo especificado após a administração. Esse intervalo de tempo especificado após a administração costuma ser inferior a uma semana. Em uma forma de realização de preferência, esse intervalo de tempo após a administração do anticorpo anti-TTR é inferior ou igual a 48 horas.

[00328] Conforme mencionado acima, o método que dispensa a retirada de tecidos descrito acima também pode ser utilizado para determinar o sucesso do tratamento, isto é, medindo as espécies de TTR anormalmente configuradas e/ou agregadas capturada por anticorpos anti-TTR antes e após o tratamento. Assim, em uma forma de realização adicional ou suplementar, o método que dispensa a retirada de tecidos da presente invenção pode ainda compreender a comparação entre o nível da TTR anormalmente configurada e/ou agregada na amostra de um fluido corporal com uma amostra obtida do indivíduo antes da administração de um anticorpo anti-TTR. Consequentemente, em uma forma de realização, o método da presente invenção é utilizado para determinar a eficácia de um tratamento de amiloidose por TTR ou para monitorar a progressão de uma doença ou condição associada à TTR patológica em um paciente ou indivíduo.

[00329] Conforme mencionado, amostras de indivíduos utilizadas nos métodos descritos acima podem ser obtidas antes ou após a administração de um anticorpo anti- TTR. No entanto, amostras também podem ser obtidas de instalações médicas ou médicos praticantes, bem como de outras instituições a partir de qual amostras clínicas de um indivíduo podem ser obtidas. As instalações, médicos, etc., não podem somente realizar a administração de um anticorpo anti-TTR ao indivíduo e a coleta de amostras apropriadas para utilização no método acima, mas também, monitorar e/ou tratar o paciente, ou seja, variando a quantidade, o tempo, a frequência de administração do anticorpo, interrompendo uma terapia, substituir ou combinar o anticorpo anti-TTR com pelo menos outro anticorpo anti-TTR ou agente terapêutico. O nível de TTR pode ser avaliado por qualquer método adequado conhecido no ramo. Métodos adequados encontram-se descritos abaixo e no pedido internacional WO 2013/066818, cujo conteúdo de divulgação encontra-se incorporado ao presente documento por referência.

[00330] Em um aspecto da presente invenção, um anticorpo da presente invenção ou uma molécula de ligação à TTR que possui substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um desses, o polinucleotídeo, o vetor ou a célula conforme definidos acima, ou uma composição farmacêutica ou de diagnóstico que compreenda qualquer um desses é fornecida para utilização no tratamento profilático, no tratamento terapêutico, e/ou no monitoramento da progressão ou uma resposta ao tratamento de uma doença ou transtorno relacionado à TTR. Em geral, portanto, a presente invenção também se refere a um método de diagnóstico ou monitoramento da progressão de uma doença ou transtorno relacionado à TTR (como amiloidose por TTR) em um indivíduo, com o método compreendendo a determinação da presença de TTR em uma amostra do indivíduo a ser diagnosticado com pelo menos um anticorpo da presente invenção ou uma molécula de ligação à TTR que possui substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um desses, em que a presença de espécies de TTR que sofreram mutações, anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas ou seus fragmentos seja indicativa da doença ou transtorno. Em uma forma de realização, esse método de diagnóstico ou monitoramento da progressão de amiloidose por TTR em um indivíduo é fornecido, com o método compreendendo a determinação da presença de TTR que sofreu mutações, anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada e/ou seus fragmentos em uma amostra retirada do indivíduo a ser diagnosticado com pelo menos um anticorpo da presente invenção ou uma molécula de ligação à TTR que possui substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer um desses, em que a presença de TTR que sofreu mutações, anormalmente configurada, anormalmente montada ou agregada e/ou seus fragmentos seja indicativa de amiloidose por TTR pré-sintomática, prodromal ou clínica, um aumento do nível de oligômeros, agregados ou fibrilas de TTR em comparação com o nível da TTR fisiológica ou em comparação com uma amostra de referência retirada de um indivíduo do grupo de controle saudável ou uma amostra do grupo de controle retirada do mesmo indivíduo seja indicativa para a progressão de amiloidose por TTR pré-sintomática, prodromal ou estabelecida. Seria notado por qualquer perito no ramo que, em uma forma de realização, esse método também é utilizado para o diagnóstico ou monitoramento da progressão de qualquer outra doença ou transtorno do grupo de transtornos relacionados à TTR, conforme definido acima.

[00331] Conforme indicado anteriormente, os anticorpos da presente invenção, seus fragmentos e moléculas com a mesma especificidade de ligação dos anticorpos e de seus fragmentos podem ser utilizados não só in vitro, como também in vivo, em que além de aplicações terapêuticas e também de diagnóstico podem ser buscadas. Em uma forma de realização, portanto, a presente invenção também se refere a uma molécula de ligação à TTR que compreende pelo menos uma RDC de um anticorpo da presente invenção para a preparação de uma composição para detecção/imagiologia in vivo de ou destinada a um agente terapêutico e/ou de diagnóstico de TTR no corpo humano ou animal. Potenciais agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico podem ser escolhidos de entre enumerações não exaustivas dos agentes terapêuticos úteis no tratamento de amiloidose por TTR e potenciais marcadores, conforme indicado anteriormente no presente documento. Referentemente à imagiologia in vivo, em uma forma de realização de preferência, a presente invenção fornece essa molécula de ligação à TTR que compreende pelo menos uma RDC de um anticorpo da presente invenção, em que essa imagiologia in vivo compreende cintilografia, tomografia por emissão de pósitrons (TEP), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), imagiologia ótica do infravermelho próximo (NIR) ou imagem por ressonância magnética (MRI). Em outra forma de realização, a presente invenção também fornece essa molécula de ligação à TTR que compreende pelo menos uma RDC de um anticorpo da presente invenção, ou a referida molécula para a preparação de uma composição para os métodos de imagiologia in vivo especificados acima, para a utilização no método de diagnóstico ou monitoramento da progressão de uma doença ou transtorno relacionado à TTR em um indivíduo, conforme definido acima.

VII. Peptídeos com epítopos de TTR específicos para agregação

[00332] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a peptídeos que possuem um epítopo de TTR especificamente reconhecido por qualquer anticorpo da presente invenção. Preferencialmente, esse peptídeo compreende ou é constituído por uma sequência de aminoácidos conforme indicado na ID DE SEQ. N°: 49, ID DE SEQ. N°: 50, ou na ID DE SEQ. N°: 51 como o único epítopo linear reconhecido pelo anticorpo ou uma sequência modificada dele em que um ou mais aminoácidos são substituídos, eliminados e/ou adicionados, em que o peptídeo seja reconhecido por qualquer anticorpo da presente invenção, preferencialmente pelos anticorpos NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, ou NI-301.12D3.

[00333] Em uma forma de realização desse na invenção, um peptídeo desses pode ser utilizado para diagnosticar ou monitorar uma doença ou transtorno relacionado a espécies de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas ou agregadas e/ou seus fragmentos em um indivíduo, como amiloidose por TTR que compreende uma etapa de determinação da presença de um anticorpo que se liga a um peptídeo em uma amostra biológica desse indivíduo, e sendo utilizado para o diagnóstico de uma doença dessas no referido indivíduo através da medição dos níveis de anticorpos que reconhecem os peptídeos descritos acima da presente invenção e comparando as medições aos níveis que são encontrados em indivíduos saudáveis de idade e sexo comparáveis. Desse modo, em uma forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para diagnosticar amiloidose por TTR indicativo de PAF e/ou CAF pré-sintomática ou clínica em um indivíduo, compreendendo uma etapa de determinação da presença de um anticorpo que se liga a um peptídeo conforme definido acima em um amostra biológica desse indivíduo. Segundo esse método, um nível elevado de anticorpos medidos específicos para esse peptídeo da presente invenção é indicativo para diagnosticar, nesse indivíduo, PAF e/ou CAF pré-sintomática ou clínica ou para diagnosticar nesse indivíduo qualquer outra doença ou transtorno do grupo de transtornos relacionado à TTR conforme definido acima. Além disso, já que o peptídeo da presente invenção contém um epítopo de um anticorpo terapeuticamente eficaz de origem humana, esse peptídeo pode, evidentemente, ser utilizado como um antígeno, ou seja, um imunógeno para induzir uma resposta imunológica em um indivíduo e estimular a produção de um anticorpo da presente invenção in vivo. O peptídeo da presente invenção pode ser formulado em uma matriz, um kit e composição como uma vacina, respectivamente, conforme descrito anteriormente no presente documento. Nesse contexto, a presente invenção também se refere a um kit útil para diagnosticar ou monitorar a progressão da amiloidose por TTR, e esse kit compreende pelo menos um anticorpo da presente invenção ou uma molécula de ligação à TTR que possui substancialmente as mesmas especificidades de ligação de qualquer uma dessas, o polinucleotídeo, o vetor ou a célula e/ou o peptídeo conforme respectivamente definido anteriormente, opcionalmente com reagentes e/ou instruções de utilização.

[00334] Essas e outras formas de realização encontram-se descritas e abrangidas na descrição e nos exemplos da presente invenção. Outros materiais de leitura referentes a qualquer um dos materiais, métodos, utilizações e compostos a serem empregados de acordo com a presente invenção podem ser recuperados em bibliotecas e bancos de dados públicos, utilizando, por exemplo, dispositivos eletrônicos. Por exemplo, pode ser utilizado o banco de dados público “Medline”, que é hospedado pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI, o Centro Nacional de Informações de Biotecnologia) e/ou pela National Library of Medicine at the National Institutes of Health (NLM.NIH, a Biblioteca Nacional de Medicina dos Institutos Nacionais de Saúde). Outros bancos de dados e endereços na internet como os do European Bioinformatics Institute (EBI, o Instituto Europeu de Bioinformática), que integra o European Molecular Biology Laboratory (EMBL, o Laboratório Europeu de Biologia Molecular) são conhecidos dos peritos no ramo e também podem ser obtidos utilizando os motores de busca da internet. Uma visão geral das informações sobre patentes de biotecnologia e um levantamento de fontes relevantes de informações sobre patentes úteis para pesquisa retrospectiva e para a conscientização de momento é dada em Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

[00335] A descrição acima descreve de forma genérica a presente invenção. Salvo indicação em contrário, um termo conforme utilizado no presente documento é dada a definição como prevista no Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Dicionário Oxford de Bioquímica e Biologia Molecular), Oxford University Press, 1997, revisado no ano 2000 e reimpresso em 2003, ISBN 0 19 850673 2. Diversos documentos são citados ao longo do texto dessa especificação. Citações bibliográficas completas podem ser encontradas ao final da especificação imediatamente anterior às reivindicações. O teor de todas as referências citadas (incluindo referências bibliográficas, patentes emitidas, pedidos de patentes publicados, conforme citado ao longo desta aplicação, incluindo a seção antecedentes e especificações do fabricante, instruções, etc.) encontram- se expressamente incorporados por referência no presente documento; no entanto, não há nenhuma admissão de que qualquer documento citado seja de fato anterior ao da presente invenção. Uma compreensão mais completa pode ser obtida com uma consulta aos seguintes exemplos específicos que são fornecidos no presente documento para fins de ilustração somente e não são planejados para limitar o âmbito da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Isolamento e identificação de anticorpos anti-TTR

[00336] Anticorpos de origem humana de destino de TTR e/ou espécies de TTR que sofreram mutações, anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas e/ou seus fragmentos foram identificados utilizando o método descrito no pedido internacional WO 2008/081008, cujo conteúdo de divulgação é incorporado ao presente documento por referência, com modificações. Em particular, a proteína humana da TTR em estado natural obtida por purificação a partir do plasma humano, e proteínas de TTR mutante em estado natural obtidas por expressão recombinante foram utilizadas tanto nas conformações nativa e anormalmente configurada-agregada para a identificação de anticorpos de destino de TTR. As conformações anormalmente configuradas-agregadas foram produzidas in vitro em condições acídicas, utilizando um procedimento semelhante ao descrito em Colon W. et al, Biochemistry, 31 (1992), 8654-8660, com modificações menos importantes.

Exemplo 2: Determinação da sequência de anticorpos

[00337] As sequências de aminoácidos das regiões variáveis dos anticorpos anti- TTR acima identificados foram determinadas com base em suas sequências de RNAm, vide Fig. 1. Em resumo, as células B vivas de culturas de células B de memória não imortalizadas selecionadas foram colhidas. Subsequentemente, os RNAms das células produtoras de anticorpos anti-TTR selecionados foram extraídos e convertidos em DNAc, e as sequências codificadoras das regiões variáveis do anticorpo foram amplificadas por RCP, clonadas em vetores de plasmídeo e sequenciadas. Em resumo, uma combinação de iniciadores que representam todas as famílias de sequências do repertório da linha germinal de imunoglobulinas humanas foi utilizada para as amplificações de peptídeos líderes, segmentos V e segmentos J. A primeira rodada de amplificação foi realizada utilizando iniciadores específicos para o peptídeo líder na extremidade de 5’ e iniciadores específicos para a região constante na extremidade de 3’ (Smith et al., Nat Protoc. 4 (2009), 372-384). Para cadeias pesadas e cadeias leves kapa, a segunda rodada de amplificação foi realizada utilizando iniciadores específicos para o segmento V na extremidade de 5’ e iniciadores específicos para o segmento J na extremidade de 3’. Para cadeias leves lambda, a segunda rodada de amplificação foi realizada utilizando iniciadores específicos para o segmento V na extremidade de 5’ e um iniciador específico para a região C na extremidade de 3’ (Marks et al., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597; de Haard et al., J. Biol. Chem. 26 (1999), 18218-18230).

[00338] A identificação do clone do anticorpo com a especificidade desejada foi realizada por retriagem por meio do ensaio ELISA após expressão recombinante de anticorpos completos. A expressão recombinante de anticorpos da IgG1 humana completos foi obtida após a inserção das sequências variáveis de cadeia pesada e leve “na estrutura de leitura correta” nos vetores de expressão que complementam a sequência da região variável com uma sequência que codifica um peptídeo líder na extremidade de 5’ e na extremidade de 3’ com uma sequência que codifica o(s) domínio(s) constante(s) apropriado(s). Para essa extremidade, os iniciadores continham sítios de restrição concebidos para facilitar a clonagem das sequências variáveis de cadeia pesada e leve nos vetores de expressão dos anticorpos. Imunoglobulinas de cadeia pesada foram expressas pela inserção do produto de RT-RCP da cadeia pesada de imunoglobulina em estrutura em um vetor de expressão de cadeia pesada que suporta um peptídeo de sinal e os domínios constantes de imunoglobulina humana ou de camundongo gama 1. As imunoglobulinas de cadeia pesada kapa foram expressas pela inserção do produto de RT-RCP da cadeia leve kapa em estrutura em um vetor de expressão de cadeia leve que fornece um peptídeo de sinal e o domínio constante de imunoglobulina humana de cadeia leve kapa. As imunoglobulinas de cadeia leve lambda foram expressas pela inserção do produto de RT-RCP da cadeia leve lambda em estrutura em um vetor de expressão de cadeia leve lambda fornecendo um peptídeo de sinal e o domínio constante da imunoglobulina humana ou de camundongo de cadeia leve lambda.

[00339] Os anticorpos monoclonais recombinantes funcionais foram obtidos mediante cotransfecção em células HEK 293 ou CHO (ou qualquer outra linhagem celular receptora adequada de origem humana ou de camundongo) de um vetor de expressão de cadeia pesada de Ig e um vetor de expressão de cadeia leve de Ig kapa ou lambda. O anticorpo monoclonal recombinante humano foi subsequentemente purificado a partir do meio condicionado utilizando uma purificação de padrão em coluna de Proteína A. O anticorpo monoclonal recombinante humano pode ser produzido em quantidades ilimitadas, seja utilizando células transientemente transfectadas ou estavelmente transfectadas. Linhagens celulares produtoras de anticorpos monoclonais recombinantes humanos podem ser estabelecidas tanto por meio da utilização direta dos vetores de expressão da Ig quanto por reclonagem de regiões variáveis de Ig em diferentes vetores de expressão. Derivados como F(ab), F(ab)2 e scFv também podem ser gerados a partir dessas regiões variáveis de Ig.

[00340] A estrutura e as regiões determinantes de complementaridade foram determinadas por comparação com as sequências de anticorpos de referência disponíveis em bancos de dados como Abysis (http://www.bioinf.org.uk/abysis/), e registradas utilizando o esquema de numeração de Kabat (http://www.bioinf.org.uk/abs/). As sequências de aminoácidos das regiões variáveis dos anticorpos objeto NI-301.59F1, NI- 301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI- 301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.37F1-PIMC, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4, e NI- 301.14C3, incluindo que a indicação da estrutura (FR) e das regiões determinantes de complementaridade (RDCs) são mostradas na Figura 1A-1T.

[00341] No prosseguimento, a alta afinidade dos anticorpos objeto a conformações de TTR anormalmente configuradas-agregadas e a ausência substancial de ligação a conformações de TTR nativas em estado natural, demonstrando, assim, uma forte seletividade para a TTR que sofreu mutações, anormalmente configurada, anormalmente montada e/ou agregada é um exemplo ilustrado dos anticorpos NI-301.59.F1, NI- 301.35G11, e NI-301.37F1. No entanto, experimentos preliminares de outros anticorpos objeto sugerem substancialmente a mesma ligação preferencial à TTR que sofreu mutação, à anormalmente configurada, à anormalmente montada e/ou à agregada sobre espécies de TTR fisiológica como os anticorpos NI-301.59.F1, NI-301.35G11, e NI-301.37F1.

Exemplo 3: Afinidade de ligação de anticorpos anti-TTR utilizando o ensaio ELISA direto e a determinação EC50

[00342] A capacidade do anticorpo de ligar a TTR e/ou as formas de TTR anormalmente configurada, anormalmente montada e/ou agregada foi avaliada por meio de ensaios ELISA diretos com concentrações variáveis de anticorpos. Isso permite determinar, para cada anticorpo, sua meia máxima concentração eficaz (EC50) neste ensaio, que é um valor comumente utilizado para a afinidade de ligação do anticorpo, vide Fig. 2. Em resumo, as placas de ELISA (de alta ligação, de poliestireno transparente, semiárea, de fundo plano) foram revestidas com TTR humana anormalmente configurada-agregada e em estado natural, V30M-TTR recombinante anormalmente configurada-agregada (ambas preparadas conforme descrito no Exemplo 1) e albumina de soro bovino (ASB) com uma concentração de 10 μg/ml em soros fisiológicos tamponados com fosfato (SFTF) durante 1 h a 37°C, e subsequentemente, bloqueadas com uma solução de 2% de ASB e 0,1% Tween-20 de SFTF durante 1 h em temperatura ambiente (TA). Os anticorpos contra a TTR foram diluídos em SFTF em 11 concentrações diferentes que variaram entre 4 e 400 nM, e incubados nas placas de ELISA da noite para o dia a 4°C. Após 3 lavagens com SFTF, as placas de ELISA foram incubadas com um anticorpo humano secundário específico de IgG e acoplado a peroxidase de rábano durante 1 h em TA (1/4000 de diluição). Após 3 lavagens com SFTF, as reações ao ensaio de ELISA foram desenvolvidas com TMB durante exatamente 10 min. em TA e quantificadas por medição da densidade ótica a 450 nm (DE450nm).

[00343] Os anticorpos exemplificativos NI-301.59F1, NI-301.35G11, e NI- 301.37F1 exibiram uma forte ligação à TTR anormalmente configurada-agregada em estado natural e que sofreu mutações, mas não ao ASB do grupo de controle, vide Fig. 2 AC. Subsequentemente, as EC50s do anticorpo foram determinadas ajustando-se os dados com uma regressão não linear e utilizando o método dos mínimos quadrados para estimar a afinidade de ligação do anticorpo nessas condições.

[00344] Os anticorpos exemplificativos NI-301.59F1, NI.35G11, e NI-301.37F1 exibiram alta afinidade à TTR humana anormalmente configurada-agregada em estado natural correspondente às EC50s de 3,0 nM, 3,9 nM, e 0,35 nM, respectivamente. Os anticorpos exemplificativos também exibiram alta afinidade para a V30M-TTR recombinante anormalmente configurada-agregada e que sofreu mutação correspondente às EC50s de 15,5 nM, 5,0 nM, e 0,15 nM, respectivamente.

Exemplo 4: Seletividade de ligação de anticorpos anti-TTR utilizando a técnica de hibridização

[00345] Para avaliar a seletividade de ligação dos anticorpos da TTR e/ou de seus fragmentos a conformações da TTR nativas ou anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas, à proteína da TTR humana em estado natural em conformações nativas ou anormalmente configuradas-agregadas e proteína da V30M-TTR recombinante em conformações anormalmente configuradas-agregadas foram diluídas em SFTF com 4 concentrações diferentes, e depositadas por filtragem a vácuo em uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi brevemente seca (10 min.) e bloqueada com 3% de leite em SFTF durante 1 h em TA, e subsequentemente incubada com anticorpos anti-TTR da noite para o dia a 4°C. Após 3 lavagens com SFTF durante 5 min. Em TA, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário apropriado (acoplado à peroxidase de rábano; com 1/10.000 de diluição) durante 1 h em TA. Após 3 lavagens com SFTF, a membrana foi desenvolvida com luminol, e a intensidade do sinal, quantificada medindo-se a luminescência.

[00346] O anticorpo anti-TTR comercial exemplificativo ligado a conformações de TTR nativas, bem como anormalmente configuradas-agregadas com afinidade semelhante, demonstrando, assim, sua falta de seletividade de ligação a conformações de TTR nativas ou anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas, vide Fig. 3 A. Em contraste, os anticorpos exemplificativos NI-301.59.F1, NI-301.35G11, e NI-301.37F1 ligados com elevada afinidade a conformações de TTR anormalmente configuradas- agregadas somente, e não demonstraram nenhuma ligação com conformações de TTR nativas, demonstrando, assim, uma forte seletividade à TTR anormalmente configurada, anormalmente montada e/ou agregada (Fig. 3 B2, C2, D2). Consequentemente, os anticorpos NI-301.35G11 e NI-301.37F1 também demonstraram uma ligação forte com a proteína da V30M-TTR recombinante anormalmente configurada-agregada, conforme mostra a Fig. 3 C3 e D3.

[00347] Para caracterizar ainda mais a seletividade de ligação do anticorpo, várias preparações de TTR, incluindo conformações em estado natural e que sofreram mutações, nativas e anormalmente configuradas-agregadas, e um conjunto de 12 amostras de plasma humano foram processadas de forma semelhante para análise pela técnica de hibridização, utilizando anticorpos anti-TTR quiméricos murinos e acoplado à peroxidase de rábano, anticorpo secundário da IgG2a anticamundongo para detecção (Fig. 6).

[00348] O anticorpo comercial exibiu forte ligação com toda a preparação da TTR, incluindo preparações de TTR em estado natural e que sofreram mutações, nativas e anormalmente configuradas-agregadas, e foi capaz de detectar TTR em todas as amostras de plasma humano. Isso demonstra ainda mais a falta de seletividade para conformações nativas ou agregadas, vide Fig. 6 A. Em contraste, o anticorpo quimérico de camundongo exemplificativo NI-301.mur35G11 exibiu uma ligação muito forte com a amostra de TTR em estado natural anormalmente configurada-agregada (Fig. 6 C1), e também uma forte ligação com a proteína da V30M-TTR que sofreu mutações (Fig. 6 C4), e com a proteína da Y78F-TTR que sofreu mutações (Fig. 6 C6). Entretanto, o anticorpo NI-301.mur35G11 não se ligou à TTR nas amostras de plasma humano. Isso demonstra ainda mais a forte seletividade do NI-301.mur35G11 à proteína da TTR que sofreu mutação, anormalmente configurada, anormalmente montada e/ou agregada.

Exemplo 5: Especificidade de ligação e seletividade de anticorpos anti-TTR utilizando a técnica ‘western blot’

[00349] A especificidade de ligação e a seletividade de anticorpos anti-TTR foi avaliada por meio da técnica ‘western blot’, vide Fig. 4. Em resumo, a proteína da TTR humana em estado natural (300 ng) em conformações nativas ou anormalmente configuradas-agregadas, e extrato de fígado de camundongo em estado natural (10 μg de proteínas totais) foram carregados em um gel de eletroforese (SDS-PAGE) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose utilizando um sistema de transferência semisseca. A membrana foi subsequentemente bloqueada com ASB a 2% em SFTF durante 1 h em TA, e incubada da noite para o dia a 4°C com os anticorpos anti-TTR diluídos em tampão de bloqueio. Após 4 lavagens com SFTF durante 5 min. em TA, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário apropriado (acoplado à peroxidase de rábano; com 1/10.000 de diluição em tampão de bloqueio) durante 1 h em TA. Após 3 lavagens com SFTF e uma lavagem final em TFS, a membrana foi desenvolvida com luminol, e a intensidade do sinal, quantificada medindo-se a luminescência. Pouco antes da utilização, a amostra de TTR anormalmente configurada-agregada foi submetida a reticulação com glutaraldeído (1%, 5 min., 37°C) para evitar a dissociação dos agregados da TTR durante o processo de preparação para eletroforese (SDS-PAGE). Em contraste, a amostra de TTR nativa não foi reticulada antes da utilização, de modo que o homotetrâmero da TTR (que é a conformação da TTR nativa em condições fisiológicas) quase que se dissociou totalmente em monômeros e dímeros.

[00350] O anticorpo anti-TTR comercial demonstrou uma ligação muito forte aos monômeros e dímeros da TTR da amostra de TTR humana nativa (Fig. 4 A1), e uma ligação igualmente forte com a amostra da TTR anormalmente configurada-agregada e reticulada (Fig. 4 A2), demonstrando, assim, a falta de seletividade a conformações de TTR nativas ou anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas. Em contraste, os anticorpos anti-TTR exemplificativos NI-301.59F1, NI-301.35G11, e NI- 301.37F1 demonstraram uma ligação muito forte à amostra de TTR anormalmente configurada-agregada e reticulada (Fig. 4 B2, C2, D2), mas sem qualquer ligação aos monômeros e dímeros de TTR da amostra de TTR humana nativa (Fig. 4 B1, C1, D1), demonstrando, assim, uma forte seletividade a conformações de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas sobre conformações de TTR nativas.

[00351] Além disso, os anticorpos anti-TTR comerciais e os exemplificativos tinham níveis muito baixos de ligação às proteínas contidas no extrato de fígado de camundongo (Fig. 4 A3, B3, C3, D3). Em virtude da elevada quantidade de proteínas hepáticas utilizadas para a experiência e das altas concentrações de anticorpos referentemente à sua afinidade de ligação, isso indica que os anticorpos exemplificativos possuem uma especificidade notável para TTR e não se ligam significativamente a outras proteínas. Além disso, parece que os anticorpos exemplificativos não se ligam à proteína da TTR de camundongo contida em níveis elevados no extrato de fígado de camundongo, indicando que os anticorpos exemplificativos demonstram especificidade à proteína da TTR humana anormalmente configurada. Entretanto, o epítopo do anticorpo NI-301.37F1 está presente na proteína da TTR de rato e camundongo. Consequentemente, a principal sequência de aminoácidos do epítopo pode não ser necessariamente decisiva para a detecção da TTR anormalmente configurada, mas para a conformação.

[00352] Para caracterizar ainda mais a capacidade de ligação do anticorpo, ou sua ausência, a proteína da TTR nativa, os anticorpos exemplificativos foram avaliados quanto à sua capacidade de se ligar à proteína da TTR contida em amostras de plasma humano, utilizando a mesma técnica ‘western blot’, conforme descrito acima no presente documento (Fig. 5). A única diferença técnica consistiu no desbaste da parte superior do gel em cerca de 25 a 30 kDa, e utilizando apenas a parte inferior do gel para a transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose. Isso serve para eliminar as cadeias pesada e leve dos anticorpos humanos presentes em concentração elevada nas amostras de plasma, o que pode provocar interferência na análise.

[00353] Em contraste com o anticorpo comercial utilizado como referência, os anticorpos exemplificativos NI-301.35G11 e NI-301.37F1 sequer chegaram a detectar a proteína da TTR humana contida nas amostras de plasma humano, indicando, assim, a seletividade de ligação de uma conformação de TTR que não está presente nas amostras analisadas nessas condições.

Exemplo 6: Seletividade de ligação de anticorpos anti-TTR em solução utilizando imunoprecipitação

[00354] Para verificar ainda mais a seletividade de ligação dos anticorpos anti-TTR da presente invenção, a proteína da TTR humana e recombinante em estado natural nas conformações nativa e anormalmente configurada-agregada, e uma amostra de plasma humano em 3 diluições diferentes em TFS foram utilizadas para imunoprecipitação (IP) por TTR. Em resumo, grânulos magnéticos revestidos com proteína-A foram incubados com anticorpos anti-TTR diluídos no tampão de ligação do fabricante durante 30 min. em TA. O complexo anticorpo/proteína A foi recuperado e incubado da noite para o dia a 4°C com preparações de TTR e amostras de plasma humano. Depois de lavagens, o complexo anticorpo/proteína A foi ressuspenso em tampão de carga de SDS, aquecido durante 5 min. a 9° C e processado para análise pela técnica ‘western blot’.

[00355] Como mostra a Fig. 7, os anticorpos da TTR exemplificativos NI- 301.35G11 e NI-301.37F1 não demonstraram, em contraste com o anticorpo comercial da TTR Dako A0002 nenhuma ligação às amostras de plasma (Fig. 7 A7-9, B7-9, C7-9), assim como nenhuma ligação a amostras de TTR nativas e recombinantes em estado natural (Fig. 7 B3, C3, B5, C5). Entretanto, uma forte ligação foi avaliada na amostra, em que formas de TTR anormalmente configuradas-agregadas se demonstraram presentes (Fig. 7 B4, C4, B6, C6).

[00356] Estes resultados indicam que os anticorpos exemplificativos NI-301.35G11 e NI-301.37F1 são capazes de ligar conformações de TTR anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas em solução, e demonstram uma seletividade notável a essas conformações.

Exemplo 7: Ligação a agregados de TTR patológica em tecido de camundongo portadores de PAF

[00357] Anticorpos anti-TTR exemplificativos foram avaliados por imuno- histoquímica (IHC) quanto à sua capacidade de ligar a proteína da TTR patológica e não patológica como se encontram presentes nos tecidos de camundongos transgênicos que expressem exclusivamente a proteína humana V30M-TTR e não a proteína da TTR de camundongo (doravante denominados camundongos portadores de PAF). Esses anticorpos também foram avaliados quanto à sua ligação não específica em tecidos de camundongos com “knockout” de TTR (TTR-KO) que não expressem nenhuma proteína da TTR, e as linhagens correspondentes de camundongos transgênicos e com “knockout” foram inicialmente geradas e descritas pelo Prof. Suichiro Maeda (Kohno K. et al., American Journal of Pathology 140(4) (1997), 1497-1508). Resumidamente, a imuno-histoquímica foi realizada em tecidos de camundongo embebidos em parafina e cortados em cortes de 3 a 5 μm de espessura. Os cortes foram inicialmente desparafinados e reidratados, e tratados com 3% de H2O2 em metanol durante 20 min. em TA. O tampão de bloqueio (TFS + 5% de soro (cavalo/cabra) + 4% de ASB) foi aplicado durante 1 h em TA, e substituído por anticorpos anti-TTR diluídos em TFS para incubação da noite para o dia a 4°C. Após 3 lavagens em TFS, os cortes foram sucessivamente incubados com os anticorpos secundários biotinilados apropriados (anti-IgG humano, anti-IgG de coelho, diluição de 1/125 em TFS, 1 h de incubação em TA) e o sistema de detecção de peroxidase de rábano- avidina (diluição de 1/125 em TFS, incubação de 1 h em TA). A reação foi desenvolvida com diaminobenzidina durante exatamente 15 min. em TA. Os cortes de tecido foram contrastados com hemalum durante 1 min. em TA, desidratados em série ascendente de etanol e lamínulas.

[00358] Como mostra a Fig. 8, o anticorpo comercial da TTR Dako A0002 gerou uma forte coloração em cortes de fígado e intestino de camundongos portadores de PAF e não produziu nenhuma coloração nos cortes de TTR KO correspondentes (Fig. 8 1A, 1B). O anticorpo da TTR exemplificativo NI-301.35G11 gerou uma coloração de padrão e intensidade semelhantes tanto no corte do fígado quanto no do intestino de camundongos portadores de PAF (Fig. 8 2A). Em contraste, o anticorpo exemplificativo NI-301.37F1 gerou uma forte coloração apenas no corte do intestino, mas não no corte do fígado do camundongo portadores de PAF (Fig. 8 3A). Isso indica que o anticorpo NI-301.37F1 se liga apenas aos agregados da TTR patológica (isto é, não fisiológica) que se acumulam ao longo do tempo no trato gastrointestinal de camundongos portadores de PAF, e não à TTR em conformação nativa como sintetizada pelo fígado.

[00359] Além disso, ambos os anticorpos exemplificativos NI-301.35G11 e NI- 301.37F1 não geraram nenhuma coloração nos cortes de tecidos do fígado e do intestino de camundongos com “knockout” de TTR (TTR-KO) (Fig. 8, 2B, 3B). Tendo em vista as altas concentrações de anticorpos utilizados neste experimento referentemente à afinidade de ligação do anticorpo, essa ausência de coloração em cortes de TTR-KO é indicativa de alta especificidade de ligação à proteína da TTR.

Exemplo 8: Seletividade de ligação para depósitos de TTR anormalmente configurada, anormalmente montada e/ou agregada em tecido humano

[00360] Os anticorpos da presente invenção também foram avaliados quanto à sua capacidade de ligar depósitos de TTR patológica no tecido humano. Cortes de uma biópsia da pele de um paciente portadores de PAF e cortes de tecido pancreático de um indivíduo saudável foram processados por imuno-histoquímica utilizando o mesmo procedimento descrito no Exemplo 7 acima. A biópsia de pele foi selecionada para este experimento, pois contém uma quantidade importante de depósitos de amiloide de TTR patológica. Em contraste, o tecido pancreático foi utilizado neste experimento porque as células alfa pancreáticas expressam TTR em altos níveis.

[00361] Como mostra a Fig. 9, o anticorpo comercial Dako A0002 revelou uma coloração igualmente forte de depósitos de TTR patológica na pele e de TTR nativa nas células alfa pancreáticas (Fig. 9 1A). Do mesmo modo, o anticorpo exemplificativo quimérico de camundongo NI-301.mur35G11 produziu uma coloração igualmente forte em ambos os depósitos de TTR patológica na pele e de TTR nativa nas células alfa pancreáticas (Fig. 9 1B). Em contraste, o anticorpo NI-301.37F1 coloriu somente o depósito de TTR patológica na pele e não a TTR nativa nas células alfa pancreáticas (fig. 9 3A). Esse resultado demonstra que o NI-301.37F1 é altamente seletivo por IHC para depósitos de TTR patológica, que compreendem conformações de TTR que sofreram mutações, anormalmente configuradas, anormalmente montadas e/ou agregadas.

[00362] A condição de controle “somente anticorpo secundário” apresentada nos painéis 1B, 2B e 3B da Figura 9 revela a coloração de tecidos que ocorre na ausência do anticorpo principal. A ausência (2B) ou o nível muito baixo (1B, 3B) de coloração indica que a coloração observada nos painéis 1A, 2A e 3A é, de fato, específica dos anticorpos principais correspondentes.

Exemplo 9: Avaliação do epítopo de ligação dos anticorpos da TTR

[00363] Para determinar o epítopo de ligação dos anticorpos exemplificativos NI- 301.59F1, NI301.35G11, e NI-301.37F1, toda a sequência de aminoácidos da TTR foi analisada utilizando um painel de 29 peptídeos sequenciais de 15 aminoácidos de comprimento e 11 aminoácidos de sobreposição, covalentemente ligados a uma membrana. Outros peptídeos, incluindo mutações selecionadas, também estavam representados graficamente na membrana. A membrana foi bloqueada com tampão de bloqueio Roti da noite para o dia a 4°C, incubada primeiramente com o anticorpo anti-TTR diluído em tampão de bloqueio durante 2 h em TA, então, com um anticorpo de IgG anti-humano acoplado com peroxidase de rábano durante 45 min. em TA (diluição de 1/20.000 em TFS). A reação foi desenvolvida com luminol e imageada por luminescência.

[00364] O anticorpo NI-301.59F1 reconhece os pontos 15, 16 e 44 que correspondem à sequência 61-EEEFVEGIY-69 (ID DE SEQ. N°: 49) na TTR humana integral e em estado natural, vide Fig. 10 A. O anticorpo NI-301.35G11 reconhece os pontos 13, 14, 42, e 44 que correspondem à sequência 53-GELHGLTTEEE-63 (ID DE SEQ. N°: 50) na TTR humana integral e em estado natural, vide Fig. 10 B. No entanto, o anticorpo NI-301.35G11 não reconhece o ponto 43, indicando que esse anticorpo não pode ligar a sequência 53-GELHGPTTEEE-63 que corresponde à variante L55P-TTR. O anticorpo NI-301.37F1 reconhece os pontos 9, 10, 11, 38, e 40 que correspondem à sequência 41-WEPFA-45 (ID DE SEQ. N°: 51) na TTR humana integral e em estado natural, vide Fig. 10C. No entanto, o anticorpo NI-301.37F1 não reconhece o ponto 43, indicando que esse anticorpo não pode ligar a sequência 41-WGPFA-45 que corresponde à variante E42G-TTR.

[00365] Para refinar a determinação do epítopo de ligação dos anticorpos exemplificativos NI-301.59F1, NI301.35G11, e NI-301.37F1, toda a sequência de aminoácidos de TTR foi analisada utilizando um painel com 151 peptídeos sequenciais de 15 aminoácidos de comprimento e 14 aminoácidos de sobreposição, ligados de forma covalente a uma membrana. Para cada peptídeo, o aminoácido na posição 10 foi substituído por uma alanina em aminoácidos sem alanina, ao passo que alaninas foram substituídas por glicina ou prolina. A membrana foi bloqueada com tampão de bloqueio Roti da noite para o dia a 4°C, incubada primeiramente com o anticorpo anti-TTR diluído em tampão de bloqueio durante 2 h em TA, em seguida, com um anticorpo de IgG anti- humano acoplado a peroxidase de rábano durante 45 min. em TA (diluição de 1/20.000). A reação foi desenvolvida com luminol e imageada por luminescência.

[00366] O anticorpo NI-301.59F1 reconhece somente os pontos 77 e 83, indicando que E60 e V64 não são necessários para a ligação do 59F1, enquanto que E61, E62, F63, E65, G66, I67 e Y68 são necessários para a ligação do anticorpo. A contribuição exata do K69 é uma questão de interpretação: a forte ligação do anticorpo ao peptídeo 44 demonstrada na Fig. 10A indica claramente que a ausência do K69 na posição do terminal C não impede a ligação do anticorpo; no experimento subsequente mostrado na Fig. 10E, no entanto, a substituição do K69A na posição 10 no peptídeo impediu a ligação do anticorpo. Esses resultados aparentemente opostos sugerem que o NI-301.59F1 liga-se a uma conformação específica da sequência de aminoácidos 61-EEFXEGIY-68 (SEQ ID NO: 58), em que X pode ser qualquer aminoácido.

[00367] O anticorpo NI-301.35G11 reconhece os pontos 68, 71, 72, 73, 74 e 75, indicando que G53 não é necessário para a ligação do 35G11, enquanto que E54, L55, G57 e L58 são necessários para a ligação do anticorpo. O padrão de ligação do 35G11 também indica que a presença de E61 ou E62 é necessária para a ligação do anticorpo. A contribuição exata de T59 e T60 não pôde ser determinada neste experimento, mas se supõe que a presença de uma das duas tirosinas é necessária para a ligação do anticorpo. Tomados em conjunto, o perfil de ligação do NI-301.35G11 na busca por alanina indica que esse anticorpo reconhece a sequência 54 ELXGLTXE 61 (ID DE SEQ. N°: 59), em que X pode englobar todos os aminoácidos conhecidos, vide Fig. 10F.

[00368] O anticorpo NI-301.37F1 liga-se aos pontos 50, 52, 55, 56 e 58-62 na membrana da busca por alanina, e não aos pontos 51, 53, 54 e 57. Isso indica que W40, P42, F43 e A44 são necessários para a ligação do anticorpo. Em conjunto com a observação anterior, essa mutação E42G atrapalha a ligação do anticorpo (Fig. 10C), esses resultados indicam que NI-301.37F1 liga-se à sequência 41-WEPFA-45 (ID DE SEQ. N°: 60), vide Fig. 10G.

Exemplo 10: Determinação das características de ligação ao anticorpo por ressonância plasmônica de superfície

[00369] As características de ligação do anticorpo a vários preparados de TTR solúveis foram determinadas por meio de ressonância plasmônica de superfície (RPS), utilizando uma máquina Biorad Proteon XPR36, vide Tabela V.

[00370] A análise da RPS foi realizada com um BioRad Proteon XPR36 equipado com um chip sensor de GLM (Modelo Linear Generalizado). Um anticorpo anti-humano direcionada contra o domínio gama Fc foi acoplada de forma covalente à superfície de detecção e saturado com o anticorpo sob investigação. A proteína da TTR em estado natural e que sofreu mutação, nas conformações nativa e anormalmente configurada, foi diluída em uma solução tampão de SFTF em concentrações que variam de 3,2 a 316 nM. A associação anticorpo-antígeno foi analisada durante 180 s, e a dissociação, durante 600 s. Um modelo de ligação de Langmuir (associação 1:1 simples) foi utilizado para adaptar os dados e derivar as constantes de associação (ka) e dissociação (kd), e de afinidade (KD).

[00371] Um anticorpo IgG-FcY anti-humano foi revestido de forma covalente sobre as superfícies de detecção, e utilizado para capturar os anticorpos humanos específicos para TTR. Os anticorpos foram sondados com 4 preparados de TTR diferentes, incluindo a TTR em estado natural nativa e anormalmente configurada-agregada, e as mutações da TTR nativa V30M e L55P, todas preparadas em concentrações de 3,2 a 316 nM em uma solução tampão de SFTF (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH7.4). A TTR em estado natural anormalmente configurada-agregada foi preparada por desnaturação ácida a 65°C durante 80 min. em uma solução tampão de acetato (50 mM de HCl de acetato, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, pH 3.0), com a troca subsequente do tampão com SFTF. 59F1, 35G11 e 37F1 exibiram características lineares de ligação e dissociação que se adaptaram melhor com o modelo de Langmuir.

[00372] Os resultados demonstram que esses três anticorpos ligam com alta afinidade as variantes da TTR V30M-TTR e L55P-TTR em solução, bem como o preparado da TTR em estado natural anormalmente configurada-agregada. Em contraste, esses anticorpos exemplificativos não ligam a TTR nativa em estado natural em uma solução.

[00373] Consequentemente, os resultados demonstram que o NI-301.37F1 liga-se com elevada afinidade à proteína da TTR humana em estado natural anormalmente configurada em solução, com um KD de 1,2 nM, mas não à mesma proteína em sua conformação nativa. Uma afinidade de ligação semelhante (KD=1,4 nM) foi medida para a proteína TTR-L55P mutante. Tabela V: Determinação das características de ligação do anticorpo por ressonância plasmônica de superfície.

Exemplo 11: Imunização passiva de camundongos transgênicos para a TTR humana Val30Met, apresentando deposição de tecido da TTR, com resultados de anticorpo anti-TTR recombinante quimérico humano-murino na remoção da deposição

[00374] A imunização passiva foi realizada de forma semelhante à descrita no pedido internacional WO 2010/030203, em especial no Exemplo 3, cujo conteúdo de divulgação é incorporado ao presente documento por referência, bem como pelas referências Kohno et al., Am. J. Pathol. (1997), 1497-1508 e Sousa et al., Am. J. Pathol. (2002), 1935-48, citadas no presente documento.

[00375] Em resumo, o anticorpo monoclonal foi administrado semanalmente por via intraperitoneal durante 12 semanas com uma dosagem de 3 mg/kg em camundongos de 7 meses e de 17 meses de idade portadores de PAF, que eram transgênicos para o alelo humano Val30Met-TTR e “knockout” para o gene murino da TTR (Kohno et al., (1997), acima). Nos cinco dias após a última dose, os animais foram sacrificados, e vários tecidos foram coletados e fixados em solução de paraformaldeído, e embebidos em parafina. Cortes de 3 a 5 μm foram realizados e processados por imuno-histoquímica utilizando o anticorpo anti-TTR comercial descrito acima. Um procedimento de imunofluorescência padrão foi utilizado, que era muito semelhante ao indicado no exemplo 7 com a única diferença de que foi utilizado um anticorpo secundário fluorescente para a detecção. A superfície do tecido invadida pelo depósito de TTR foi quantificada e expressa na forma de percentagem da área total do tecido. Uma análise estatística do efeito do tratamento foi realizada com um teste-t de duas extremidades não pareadas.

[00376] Essa linhagem de camundongos transgênicos reproduz o mecanismo patológico chave comum a doenças amiloides de TTR que compreendem a desmontagem do tetrâmero da TTR e a configuração anormal dos monômeros de TTR em uma conformação amiloidogênica tóxica e insolúvel. Como com pacientes portadores de PAF, esses camundongos transgênicos costumam apresentar deposição de TTR dependente da idade. A avaliação da eficácia do tratamento foi investigada em dois grupos de camundongos transgênicos com 7 meses e 17 meses de idade no início do tratamento; idades em que a deposição de TTR é importante e invade muitos tecidos gastrointestinais. De forma notável, a imunização passiva com o anticorpo exemplificativo NI-301.37F1 foi associada a uma redução estatisticamente significativa da superfície do tecido invadido pela deposição de TTR quando o tratamento foi iniciado com 7 meses de idade, vide Fig. 12A. O tratamento teve efeito semelhante em camundongos velhos, conduzindo a uma redução quase significativa na deposição de TTR, vide Fig. 12B.

Exemplo 12: Anticorpos anti-TTR recombinantes de origem humana ligam-se a depósitos de TTR patológica in vivo

[00377] Para determinar se anticorpos anti-TTR recombinantes de origem humana são capazes de se ligar a depósitos de TTR patológica in vivo, camundongos adultos de 7 meses de idade portadores de PAF receberam uma injeção contendo o anticorpo NI- 301.37F1 a 30 mg/kg i.p. ou com SFTF para comparação. Após 48 horas, esses camundongos foram submetidos a perfusão transcardíaca e tecidos foram processados para análise histológica. Depósitos de TTR patológica foram detectados utilizando um anticorpo anti-TTR policlonal de coelho em combinação com um anticorpo de IgG anticoelho marcado por fluorescência, enquanto que a localização do anticorpo injetado NI-301.37F1 foi detectada com um anticorpo de IgG anti-humano marcado por fluorescência. Em particular, a imunoprecipitação foi realizada da seguinte forma.

[00378] A imunoprecipitação de NI-301.37F1 e anticorpos de controle de isotipo provenientes de amostras de plasma murino foi realizada durante 2 horas em TA, utilizando grânulos magnéticos acoplados à proteína A/G (Pierce n° 88803) carregados com um anticorpo de IgG anti-humano (Jackson Immunoresearch n° 709-005-098). Após 3 lavagens com SFTF, as amostras foram eluídas a partir de grânulos magnéticos de uma solução tampão de glicina a 0,2M (pH 2,5), neutralizada com 1M Tris HCl (pH8,0), misturada com uma solução tampão de carregamento de LDS (Life technologies n° NP0007) e aquecida durante 10 min. a 90°C. Amostras foram, então, carregadas em um gel de bis-tris a 4-12% (Life technologies n° WG1403A) colocadas para reagir durante 40 min. a 200 V em tampão de corrida. Após a transferência de proteína sobre uma membrana de nitrocelulose, a proteína da TTR foi detectada utilizando ou o anticorpo de TTR independente de conformação (Dako n° A0002, 150 ng/ml) ou o anticorpo NI-301.37F1 (20 nM), em combinação com a proteína A acoplada a peroxidase de rábano (Life technologies n° 10-1023, 1/10.000 de diluição) e imageamento por luminescência.

[00379] O compromisso com os objetivos in vivo conforme descritos na Fig. 13 foi realizada em camundongos adultos (de 7 meses de idade) portadores de PAF que receberam uma única injeção com o anticorpo NI-301.37F1 a 30 mg/kg i.p. ou SFTF. 48 horas depois, os camundongos foram perfundidos com SFTF e seus órgãos foram recolhidos e processados para análise histológica. Depósitos de TTR patológica foram detectados por imunofluorescência utilizando um anticorpo anti-TTR comercial policlonal de coelho (Dako n° A0002, 4,8 μg/ml) em combinação com um anticorpo anticoelho conjugado com Cy5 (Jackson Immunoresearch n° 711-175-152, 1/200 de diluição). A presença (ou ausência) de NI-301.37F1 foi detectada simultaneamente utilizando um anticorpo anti-humano conjugado com Cy3 (Jackson Immunoresearch n° 709-165-149, 1/200 de diluição). Os mesmos parâmetros de busca foram utilizados para imagiologia de tecidos injetados com NI-301.37F1 e com SFTF, e as imagens receberam os mesmos ajustes de exibição.

[00380] Como mostra a Fig. 13, a coloração dependente do NI-301.37F1 foi altamente colocalizada com a coloração da TTR em camundongos injetados com NI- 301.37F1, mas estava completamente ausente em camundongos injetados com SFTF, conforme era esperado. Esse resultado indica que o anticorpo anti-TTR NI-301.37F1 se liga a depósitos de TTR patológica in vivo.

Exemplo 13: A detecção de depósitos de proteína da TTR anormalmente configurada in vivo não necessita de biópsia dos tecidos

[00381] Este procedimento de diagnóstico que substitui a biópsia de tecido e a análise histológica no processo de diagnóstico de doenças da amiloide da TTR associada à TTR agregada, que sofreu mutações e/ou anormalmente configurada é exemplificado abaixo no presente documento e ilustrado na Fig. 14. Em particular, o experimento foi realizado com camundongos de 7 meses de idade portadores de PAF, conforme descrito acima; vide Exemplo 11, supra. Esses camundongos reproduzem o principal mecanismo fisiopatológico da PAF e, como os pacientes, apresentam deposição de TTR dependente da idade em vários tecidos. Dois camundongos portadores de PAF receberam uma única injeção intraperitoneal do anticorpo anti-TTR monoclonal e recombinante de origem humana NI-301.37F1 em uma dosagem de 3 mg/kg. Antes da injeção com o anticorpo (t=0), e dois dias após a injeção (t=48h), pequenas amostras de sangue foram colhidas e plasma foi preparado para análise. As amostras de plasma foram submetidas a imunoprecipitação com um anticorpo de IgG anti-humana (para recuperar o anticorpo anti- TTR humano injetado), com amostras t=0 utilizadas como grupos de controle negativo. As amostras com imunoprecipitação foram, então, processadas por meio da técnica “western blot” para detectar se o anticorpo anti-TTR injetado em camundongos havia capturado alguma proteína da TTR anormalmente configurada durante as 48 horas em que circulou in vivo. Técnicas “western blot” foram realizadas utilizando tanto os anticorpos anti-TTR específicos de conformação quanto os independentes de conformação. Um experimento de controle foi realizado com um anticorpo de controle de isotipo (incapaz de ligar a proteína da TTR) como grupo de controle negativo. Um grupo de controle complementar consistiu na incubação de amostras de plasma provenientes de camundongos portadores de PAF não tratados com o anticorpo NI-301.37F1 in vitro, e processamento conforme descrito acima. [00382] Os resultados apresentados na Fig. 14 indicam que o anticorpo NI-301.37F1 capturou alguma proteína da TTR anormalmente configurada durante o período de incubação de 48 horas in vivo. Observou-se isso especificamente para o anticorpo NI- 301.37F1 e não para o anticorpo de controlo do isotipo. Além disso, a proteína da TTR anormalmente configurada capturada pelo anticorpo NI-301.37F1 não estava presente nas amostras de plasma colhidas de camundongos não tratados. No conjunto, esses resultados indicam que o anticorpo NI-301.37F1 foi capaz de remover a proteína da TTR anormalmente configurada de depósitos de TTR insolúveis in vivo, cuja presença pode ser detectada sem a necessidade de se fazer biópsias de tecidos. Uma adaptação técnica para utilizar esse teste de diagnóstico em seres humanos consistiria na marcação do anticorpo anti-TTR que permita a sua recuperação a partir da amostra de plasma humano com, por exemplo, uma marca de biotina ou histidina ou estreptavidina. Como alternativa, o anticorpo anti-TTR não modificado pode ser recuperado a partir da amostra de plasma humano por meio de um anticorpo anti-idiotípico. T able IV: Mutaü ons in th e TTR. Gene

Claims

1. Anticorpo anti-transtiretina (TTR) de origem humana ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que é capaz de ligar espécies de TTR mutadas, incorretamente dobradas, incorretamente montadas e/ou agregadas e/ou fragmentos das mesmas e que não reconhece substancialmente espécies de TTR fisiológicas, (i) em que o anticorpo é capaz de ligar um epítopo de TTR que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos EEEFVEGIY (SEQ ID NO: 49), e em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende na sua região variável ou domínio de ligação as seguintes seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável VH e VL: (a) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 2 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-65 de SEQ ID NO: 2 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 98-115 de SEQ ID NO: 2 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 24-34 de SEQ ID NO: 4 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-56 de SEQ ID NO: 4 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 89-98 de SEQ ID NO: 4; (ii) em que o anticorpo é capaz de ligar um epítopo de TTR que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50), e em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende na sua região variável ou domínio de ligação as seguintes seis CDRs da região variável VH e VL: (b) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 6 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-66 de SEQ ID NO: 6 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 99-109 de SEQ ID NO: 6 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 24-39 de SEQ ID NO: 8 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 55-61 de SEQ ID NO: 8 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 94-102 de SEQ ID NO: 8; (iii) em que o anticorpo é capaz de ligar um epítopo de TTR que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos WEPFA (SEQ ID NO: 51), e em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende na sua região variável ou domínio de ligação as seis CDRs da região variável VH e VL selecionadas de: (c) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 10 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-67 de SEQ ID NO: 10 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 100-109 de SEQ ID NO: 10 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 24-34 de SEQ ID NO: 12 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-56 de SEQ ID NO: 12 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 89-97 de SEQ ID NO: 12; (e) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-37 de SEQ ID NO: 18 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-67 de SEQ ID NO: 18 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 100-116 de SEQ ID NO: 18 V L-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 24-34 de SEQ ID NO: 20 V L-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-56 de SEQ ID NO: 20 V L-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 89-98 de SEQ ID NO: 20; (l) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 46 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-66 de SEQ ID NO: 46 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 99-108 de SEQ ID NO: 46 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 23-36 de SEQ ID NO: 48 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-58 de SEQ ID NO: 48 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 91-100 de SEQ ID NO: 48; (m) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 53 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-67 de SEQ ID NO: 53 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 100-109 de SEQ ID NO: 53 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 24-34 de SEQ ID NO: 12 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-56 de SEQ ID NO: 12 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 89-97 de SEQ ID NO: 12; ou (iv) em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende na sua região variável ou domínio de ligação as seis CDRs da região variável VH e VL selecionadas de: (d) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 14 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-66 de SEQ ID NO: 14 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 99-110 de SEQ ID NO: 14 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 23-36 de SEQ ID NO: 16 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-58 de SEQ ID NO: 16 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 91-102 de SEQ ID NO: 16; (f) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-37 de SEQ ID NO: 22 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-67 de SEQ ID NO: 22 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 100-117 de SEQ ID NO: 22 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 23-36 de SEQ ID NO: 24 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-58 de SEQ ID NO: 24 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 91-102 de SEQ ID NO: 24; (g) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 26 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-65 de SEQ ID NO: 26 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 98-110 de SEQ ID NO: 26 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-36 de SEQ ID NO: 28 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-58 de SEQ ID NO: 28 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 91-99 de SEQ ID NO: 28; (h) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-37 de SEQ ID NO: 30 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-67 de SEQ ID NO: 30 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 100-113 de SEQ ID NO: 30 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 24-34 de SEQ ID NO: 32 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-56 de SEQ ID NO: 32 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 90-99 de SEQ ID NO: 32; (i) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 34 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-66 de SEQ ID NO: 34 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 99-108 de SEQ ID NO: 34 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 24-34 de SEQ ID NO: 36 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-56 de SEQ ID NO: 36 VL- CDR3: posições 89-97 de SEQ ID NO: 36; (j) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-38 de SEQ ID NO: 38 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 53-69 de SEQ ID NO: 38 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 102-114 de SEQ ID NO: 38 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 23-36 de SEQ ID NO: 40 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-58 de SEQ ID NO: 40 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 91-99 de SEQ ID NO: 40; (k) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-36 de SEQ ID NO: 42 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 51-66 de SEQ ID NO: 42 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 99-113 de SEQ ID NO: 42 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 23-35 de SEQ ID NO: 44 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 51-57 de SEQ ID NO: 44 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 90-100 de SEQ ID NO: 44; (l) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 55 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-66 de SEQ ID NO: 55 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 99-109 de SEQ ID NO: 55 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 24-34 de SEQ ID NO: 57 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-56 de SEQ ID NO: 57 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 89-99 de SEQ ID NO: 57; (o) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 62 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-66 de SEQ ID NO: 62 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 99-114 de SEQ ID NO: 62 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 23-35 de SEQ ID NO: 64 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 51-57 de SEQ ID NO: 64 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 90-101 de SEQ ID NO: 64; (p) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 66 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-67 de SEQ ID NO: 66 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 100-107 de SEQ ID NO: 66 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 24-34 de SEQ ID NO: 68 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-56 de SEQ ID NO: 68 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 89-97 de SEQ ID NO: 68; (q) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-37 de SEQ ID NO: 70 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-67 de SEQ ID NO: 70 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 100-113 de SEQ ID NO: 70 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 23-33 de SEQ ID NO: 72 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 49-55 de SEQ ID NO: 72 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 88-96 de SEQ ID NO: 72; (r) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 74 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-66 de SEQ ID NO: 74 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 99-113 de SEQ ID NO: 74 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 23-36 de SEQ ID NO: 76 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 52-58 de SEQ ID NO: 76 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 91-100 de SEQ ID NO: 76; (s) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 78 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-65 de SEQ ID NO: 78 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 98-105 de SEQ ID NO: 78 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 23-33 de SEQ ID NO: 80 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 49-55 de SEQ ID NO: 80 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 88-98 de SEQ ID NO: 80; e (t) VH-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 31-35 de SEQ ID NO: 82 VH-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 50-65 de SEQ ID NO: 82 VH-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 98-110 de SEQ ID NO: 82 VL-CDR1: consistindo em aminoácidos: posições 23-33 de SEQ ID NO: 84 VL-CDR2: consistindo em aminoácidos: posições 49-55 de SEQ ID NO: 84 VL-CDR3: consistindo em aminoácidos: posições 88-98 de SEQ ID NO: 84.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende, na sua região variável ou domínio de ligação, as sequências de aminoácidos da cadeia pesada variável (VH) e leve variável (VL) selecionadas de e consistindo em: (a) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4; (b) SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8; (c) SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12; (d) SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16; (e) SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20; (f) SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24; (g) SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 28; (h) SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 32; (i) SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36; (j) SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40; (k) SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 44; (l) SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48; (m) SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 12; (n) SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 57; (o) SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 64; (p) SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 68; (q) SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 72; (r) SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 76; (s) SEQ ID NO: 78 e SEQ ID NO: 80; (t) SEQ ID NO: 82 e SEQ ID NO: 84.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a epítopo de TTR (i) GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50) mas não a um epítopo mutante L55P correspondente ou (ii) WEPFA (SEQ ID NO: 51), mas não a um mutante E42G correspondente.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende ainda um domínio constante, preferencialmente em que o domínio constante é um domínio constante humano, preferencialmente do tipo IgG.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o domínio constante é da classe ou isotipo IgG1.

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo murídeo-humano quimérico ou um murinizado.

7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em um fragmento Fv de cadeia simples (scFv), um fragmento F(ab'), um fragmento F(ab) e um fragmento F(ab')2.

8. Um ou mais polinucleotídeos que codificam o anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizados pelo fato de que o(s) polinucleotídeo(s) compreende(m) uma sequência de nucleotídeos da cadeia (VH) e da cadeia (VL) selecionadas de e consistindo em: (a) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3; (b) SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7; (c) SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11; (d) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15; (e) SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 19; (f) SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 23; (g) SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 27; (h) SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 31; (i) SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 35; (j) SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 39; (k) SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 43; (l) SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 47; (m) SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 11; (n) SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 56; (o) SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 63; (p) SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 67; (q) SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 71; (r) SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 75; (s) SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 79; (t) SEQ ID NO: 81 e SEQ ID NO: 83, ou em que o(s) polinucleotídeo(s) compreende(m) uma sequência de ácido nucleico que é semelhante à sequência de ácido nucleico apresentada em qualquer um de (a) a (t), em que uma sequência de ácido nucleico é semelhante se o respectivo tripleto compreendendo o ácido nucleico codifica para o mesmo aminoácido, preferencialmente em que o(s) polinucleotídeo(s) são cDNA.

9. Um ou mais vetores caracterizados pelo fato de que compreendem o(s) polinucleotídeo(s) ou vetor(es) conforme definidos na reivindicação 8.

10. Microorganismo trangênico caracterizado pelo fato de que que compreende o(s) polinucleotídeo(s) conforme definidos na reivindicação 8 ou os vetor(es) conforme definidos na reivindicação 9.

11. Método de preparação de um anticorpo anti-TTR ou um derivado biotecnológico do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende (a) cultivar a célula conforme definida na reivindicação 10; e (b) isolar o anticorpo da cultura.

12. Anticorpo caracterizado pelo fato de ser codificado pelo(s) polinucleotídeo(s) conforme definidos na reivindicação 8 ou obtenível pelo método conforme definido na reivindicação 11.

13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 12, caracterizado pelo fato de que (i) compreende uma etiqueta detetável, preferencialmente em que a etiqueta detetável é selecionada do grupo que consiste em uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo e um metal pesado; e/ou (ii) está ligado a um fármaco.

14. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 12 ou 13, o(s) polinucleotídeo(s) conforme definidos na reivindicação 8 ou o(s) vetor(es) conforme definidos na reivindicação 9 ou a célula conforme definida na reivindicação 10, preferencialmente em que a composição (i) é uma composição farmacêutica e compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável, preferencialmente em que a composição é uma vacina e/ou compreende um agente adicional útil para prevenir ou tratar doenças associadas à amiloidose de TTR; ou (ii) uma composição de diagnóstico, preferencialmente compreendendo ainda reagentes convencionalmente utilizados em métodos de imunodiagnóstico ou métodos de diagnóstico baseados em ácido nucleico.

15. Kit útil no diagnóstico ou monitorização de um distúrbio associado a amiloidose de TTR caracterizado pelo fato de compreende pelo menos um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 12 ou 13, o(s) polinucleotídeo(s) conforme definidos na reivindicação 8 ou o(s) vetor(es) conforme definidos na reivindicação 9 e/ou a célula conforme definida na reivindicação 10, opcionalmente com reagentes e/ou instruções de utilização.

16. Método de diagnóstico de uma doença associada a amiloidose de TTR, , preferencialmente em que a doença é selecionada do grupo que consiste em Polineuropatia Amilóide Familiar (FAP), Cardiomiopatia Amilóide Familiar (FAC), Amiloidose Sistêmica Senil (SSA), amiloidose familiar sistêmica, amiloidose leptomeníngea/Sistema Nervoso Central (SNC), incluindo doença de Alzheimer, Amiloidose ocular relacionada à TTR, amiloidose renal relacionada à TTR, hipertiroxinemia relacionada à TTR, amiloidose ligamentar relacionada à TTR, incluindo síndrome do túnel do carpo, rupturas do manguito rotador e estenose espinhal lombar e pré-eclâmpsia, monitorização do tratamento da doença com um anticorpo anti-TTR ou determinação do diagnóstico ou utilidade terapêutica de um anticorpo anti-TTR caracterizado pelo fato de que compreende dosar o nível de TTR incorretamente dobrada e/ou agregada numa amostra de um fluido corporal de um indivíduo após administração de um anticorpo anti-TTR ao indivíduo, em que a presença ou um nível elevado de TTR incorretamente dobrada e/ou agregada na amostra do indivíduo em comparação com um controle indica uma doença associada a amiloidose de TTR, preferencialmente em que o nível de TTR incorretamente dobrada e/ou agregada na amostra é analisada determinando um complexo que se forma entre o anticorpo anti-TTR e a TTR incorretamente dobrada e/ou agregada, preferencialmente em que o controle é uma amostra obtida a partir do indivíduo antes da administração do anticorpo anti-TTR, preferencialmente em que o fluido corporal é sangue e a amostra é derivada do mesmo e/ou o controle é uma amostra correspondente de um fluido corporal colhido do indivíduo antes da administração do anticorpo anti-TTR, em que o anticorpo anti-TTR é um anticorpo anti-TTR ou fragmento de ligação a antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 12 ou 13.