KR20160093726A - 트랜스티레틴(ttr) 아밀로이드증의 항체-기반의 치료 및 이를 위한 인간-유래의 항체 - Google Patents

트랜스티레틴(ttr) 아밀로이드증의 항체-기반의 치료 및 이를 위한 인간-유래의 항체 Download PDF

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Abstract

트랜스티레틴(TTR)에 특이적이고, 바람직하게는 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 종에 결합할 수 있는 신규한 인간-유래의 항체뿐만 아니라 이와 관련된 방법이 제공된다. 또한, TTR 아밀로이드증과 연관된 질환의 진단 및/또는 모니터링 및 그의 치료 방법이 제공된다. TTR 또는 TTR 침적체 및 응집체에 특이적인 항체와 연관된 분석법 및 키트가 또한 개시된다. 상기 신규한 항-TTR 항체는 TTR 표적화 면역치료 및 진단용 약학적 및 진단적 조성물에 사용될 수 있다.

Description

트랜스티레틴(TTR) 아밀로이드증의 항체-기반의 치료 및 이를 위한 인간-유래의 항체{ANTIBODY-BASED THERAPY OF TRANSTHYRETIN(TTR) AMYLOIDOSIS AND HUMAN-DERIVED ANTIBODIES THEREFOR}
본 발명은 일반적으로 트랜스티레틴(transthyretin, TTR) 아밀로이드증의 항체-기반의 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 트랜스티레틴(TTR) 및 그의 항원에 특이적으로 결합하는 신규한 분자, 특히 TTR 또는 그의 절편의 접힘오류화(misfolded), 조립오류화(misassembled) 또는 응집된(aggregated) 형태의 TTR을 인식하는 인간-유래의 재조합 항체 및 그의 절편, 유도체 및 변이체에 관한 것으로서, 이들은 이러한 병원성 TTR 아형(isoform)에 의해 유도되는 질환 또는 증상의 치료에 유용하다.
또한, 본 발명은 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환의 진단뿐만 아니라 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(Familial Amyloid Polyneuropathy)(FAP), 가족성 아밀로이드 심근병증(Familial Amyloid Cardiomyopathy)(FAC), 노인 전신성 아밀로이드증(Senile Systemic Amyloidosis)(SSA), 전신 가족성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환을 포함하는 연수막(leptomeningeal)/중추 신경계(Central Nervous System)(CNS) 아밀로이드증, TTR-연관성 눈 아밀로이드증, TTR-연관성 신장 아밀로이드증, TTR-연관성 고티록신혈증(hyperthyroxinemia), 수근관 증후군(carpal tunnel syndrome), 회전 근개 파열(rotator cuff tear) 및 허리뼈 관 협착증(lumbar spinal stenosis)을 포함하는 TTR-연관성 인대 아밀로이드증 및 자간전증(preeclampsia)과 같은 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환과 관련된 장애를 치료하기 위한 수동적 백신화 전략 모두에 있어서 가치가 있는 이러한 결합 분자, 항체 또는 그의 모방체를 포함하는 약학적 및 진단적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 아밀로이드 침적체(deposit)에 존재하는 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR과 같은 병원성 TTR 아형에 의해 유도되는 질환 또는 증상의 진단 방법에 관한 것으로서, 병리학적 TTR 아형의 레벨이 항-TTR 항체의 투여 후 대상체 유래 체액의 샘플에서 분석되고, 예를 들면 TTR의 면역-복합체 및 항-TTR 항체의 존재에 의해 결정할 때, 투여 전에 취한 대조군 샘플과 비교할 때 병원성 TTR 아형의 레벨에서의 존재 또는 변경은 상기 질환 및/또는 증상을 시사한다.
종래에는 프리알부민으로 알려진 트랜스티레틴(TTR)은 127 개 아미노산의 가용성 단백질이며(NCBI 참조 서열: NP_000362.1), 체내에서 티록신 및 레티놀의 운반에 관여한다. TTR은 간에 의해 혈액으로, 그리고 맥락총에 의해 뇌척수액으로 분비되며, 또한 췌장 알파 세포 또는 신장 상피와 같은 특정 조직에서 발현된다. TTR 합성은 배아 시기에 시작되고, 일생 동안 지속된다. 이것은 혈장(3.6-7.2 μM) 및 CSF(0.04-0.4 μM)에서 고농도로 존재하고, 전형적으로 생리학적 조건 하에 ∼55 kDa의 가용성 호모테트라머를 형성한다.
빈약하게 설명되고 산성 pH, 산화성 스트레스 및 국소적인 요인들을 포함할 수 있는 특정 조건 하에, TTR 단백질은 대안적인 3 차원 입체형태(conformation)를 취하고, 독성이 된다.
접힘오류화 TTR 단백질의 독성은 중년의 성인들에 영향을 미치는 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP)으로 명명된 희귀한 상염색체 우성의 신경퇴행성 장애의 조사에 의해 발견되었다[Plante-Bordeneuve et al., Lancet Neurol. 10 (2011), 1086-1097]. FAP는 점진적인 감각, 운동 및 자율 손상에 의해 특정되며, 진단 10 년 후에 사망을 초래한다. 신경 병변은 TTR 단백질로 만들어진 무정형 응집체 및 아밀로이드 섬유(fibril)의 침적과 연관된다. Val30Met 치환은 특히 북부 포르투갈과 같이 상기 질환이 풍토성인 영역에서 FAP를 초래하는 가장 빈번한 돌연변이지만, 상기 TTR 유전자에서 100 개 이상의 상이한 돌연변이가 이미 확인되어 있다; 하기 표 4 참조. 상기 돌연변이는 TTR 테트라머의 구조적 안정성을 변경시켜서 TTR 접힘오류를 촉진하고, 독성 TTR 종의 형성을 유도한다는 점에서 병리생리학적 작용 메커니즘은 모든 병원성 돌연변이에서 동일하다[Saraiva et al., Curr. Med. Chem. 19 (2012), 2304-2311].
TTR 독성은 또한 아프리카계-미국인 및 서아프리카 인구에서 높은 빈도(3-5%)로 발견되는 Val122Ile 돌연변이의 결과로서 관찰된다. 상기 돌연변이는 심근에서의 과다한 TTR 축적이 심장 약화와 최종적으로 심부전을 유도하는 증상인 가족성 아밀로이드 심근병증(FAC)과 연관된다[Ruberg et al., Circulation. 126 (2012), 1286-1300].
TTR 단백질 서열에서의 돌연변이는 TTR 독성을 위한 엄격한 요구사항은 아니며, 야생형 TTR 단백질 또한 접힘오류 및 독성 응집체를 형성하기 쉽다. 예를 들면, 노인 전신성 아밀로이드증(SSA)은 심근에서 심장 약화 및 야생형 TTR 응집체의 축적에 의해 특정된다[Ikeda, Amyloid. 18 Suppl 1 (2011), 155-156; Dungu et al., Heart. 98 (2012), 1546-1554]. 야생형 TTR 침적체는 또한 수근관 증후군, 회전 근개 파열 및 허리뼈 관 협착증을 포함하는 인대 및 힘줄 염증의 다양한 증례에서 관찰된다[Sueyoshi et al., Hum. Pathol. 42 (2011), 1259-1264; Gioeva et al., Amyloid. 20 (2013), 1-6]. 또한, TTR 아밀로이드증은 최근 자간전증을 앓고 있는 어머니의 태반에서 보고되었다[Kalkunte et al., Am. J. Pathol. 183 (2013) 1425-1436].
TTR 아밀로이드증을 갖는 질환에 대한 치료는 제한적이고, 주로 침습성이며, 1 차적으로 상기 치료는 징후로 인한 것이다. FAP의 경우에 있어서, 치료는 신경성 통증을 관리하기 위한 진통제, 돌연변이된 TTR 단백질에 대한 주요 공급원을 제거하기 위한 간 이식, 및 타파미디스(Tafamidis)를 이용한 치료에 의존한다. 타파미디스는 TTR 테트라머에 결합하고 그 입체형태를 안정화시키는 소분자이다. 이것은 독성 TTR 종의 형성을 유도하는 접힘오류 경로에서의 속도 제한 단계인 TTR 테트라머의 해리(dissociation)에 반해 작용한다. 타파미디스는 유럽에서 FAP의 치료용으로 승인되었지만, 미국에서는 승인되지 않았고, 그 치료 효능은 제한적이며, 가장 좋은 경우에 있어서 질환의 진행을 늦추어준다. 현재 접힘오류화 TTR 단백질을 표적화하는 이용가능한 치료법은 없다.
이러한 측면에서, TTR 아밀로이드증과 연관된 질환의 효과적이고 안전한 치료를 위한 신규한 치료 전략이 요구된다.
상기 기술적 과제는 청구항에서 특정되고 아래에 추가로 개시되며 실시예 및 도면에서 도시된 구현예에 의해 해결된다.
본 발명은 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환 또는 증상의 예방적 또는 치료적 처치에 사용하기 위한 항-트랜스티레틴(TTR) 항체 및 등가의(equivalent) TTR-결합 분자를 제공한다. 보다 구체적으로, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 형태의 TTR을 인식하는 치료적으로 유용한 인간-유래의 재조합 항체뿐만 아니라 그의 절편 및 유도체가 제공된다.
접힘오류화 TTR 응집체는 징후가 개시되기 수년 전에 세포성 스트레스, 산화적 스트레스, 염증 반응 및 아폽토시스의 마커와 연관된다[Macedo et al., Mol. Med. 13 (2007), 584-91]. 비정상적으로 접혀진 단백질을 인식하고 이들을 분해시키는 신체의 자연적 능력은 보호성 인자이며, 환자들 사이의 독성 TTR 단백질을 제거하는 능력에서의 차이가 질환 개시 연령 및 질환 진행 속도에서의 차이에 분명히 기여한다. 상기 가설을 지지하는 것으로서, FAP 공여자로부터 간 이식을 받은 환자는 병원성 TTR 단백질에 대한 항체를 즉시 발생시키고[Ando et al., Transplantation. 73 (2002), 751-755], 돌연변이된 TTR 단백질에 대한 높은 항체 역가를 갖는 FAP 환자는 이러한 항체가 없는 환자보다 질환 개시가 늦는 것으로 나타났다[Obayashi et al., Clin. Chim. Acta. 419 (2013), 127-131]. 또한, 병원성 TTR 입체형태에 대한 능동적인 면역화는 FAP 유전자이식(transgenic) 마우스에서 TTR 침적체를 거의 완전히 제거하는 것으로 나타났다[Terazaki et al., Lab. Invest. 86 (2006), 23-31].
그러나, 치료적 개입을 위해 면역-기반의 전략을 조사하는 것은 솔깃한 것으로 보일 수 있지만, 지금까지 TTR 연관성 질환의 치료를 위해 항-TTR 항체를 사용하는 것은 추진되지 않았다. 예를 들면, 국제 출원 WO2010/030203에서 TTR에 대한 특정 단리된 마우스 모노클론 항체가 개시되었고, FAP에 대한 스크리닝 및 연관된 질환의 연구 및 치료에 사용하는 것이 제시되었다. 그러나, 마우스 모노클론 항체는 인간 항-마우스 항체(human anti-mouse antibody)(HAMA) 반응을 유도하기 때문에, 이것은 인간에서의 치료용으로 적합하지 않다. 따라서, 상기 국제 출원은 소멸되었고, 후속 개발은 아직 공개되지 않았기 때문에, 확실히 치료적 항체-기반의 접근법은 뒤따르지 않았다. 오히려, 지금까지 항-TTR 항체의 경우 TTR 아밀로이드증을 갖는 환자에 대한 진단적 유용성만이 추가로 조사되었다: 예컨대, Phay M. et al., Rejuvenation Res. 2013 Oct 28 참조. [인쇄전 전자공개].
이와 대조적으로, 본 발명에 따라 수행된 실험은 인체에서 성숙되고 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편에 특이적인 인간-유래의 모노클론 TTR-특이적 항체의 단리에 성공하였다. 인간-유래의 모노클론 항-TTR 항체 및 그 가변 도메인을 암호화하는 cDNA가 각각 단리되는 B 세포의 공급원이 되는 인간 대상체 및 환자는 각각 상당한 양의 접힘오류화 TTR을 보이지 않았고, 병원성 아형과 연관된 증상의 징후가 없었다. 그러나, 본 발명의 다른 구현예에서, 각각 인간-유래의 모노클론 항-TTR 항체 및 그 가변 도메인을 암호화하는 cDNA가 단리될 수 있는 B 세포의 공급원은 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환 및/또는 장애의 징후를 보여주는 환자이다. 따라서, 본 발명의 인간 모노클론 항-TTR 항체 및 그의 유도체는 인간에서 비-면역원성일 뿐만 아니라 치료학적으로 유익한 효과를 나타낸다는 것을 예상하는 것은 신중하다.
따라서, 본 발명은 TTR을 특이적으로 인식할 수 있는 인간-유래의 재조합 항체, 항원-결합 절편 및 유사한 항원-결합 분자에 관한 것이다. 달리 나타내지 않는 한, "TTR을 특이적으로 인식하는", "TTR에/대해 특이적인 항체" 및 "항-TTR 항체"는 TTR의 자연형 모노머성 형태에 특이적으로, 일반적으로 및 집합적으로 결합하는 항체; 임의의 형태의 TTR, 예컨대 돌연변이된 TTR, 올리고머성, 섬유상 및/또는 비-섬유상 TTR에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 명세서에는 전장 및/또는 절편 및/또는 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 형태의 TTR에 선택적인 인간-유래의 항체가 제공된다.
전술한 것과 같이, 본 발명의 항-TTR 항체는 가변 중쇄 및/또는 경쇄의 적어도 하나, 바람직하게는 2 개 이상, 바람직하게는 모든 3 개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 및/또는 실질적으로 전체 가변 영역이 항-TTR 항체를 생성하는 인간 메모리 B 세포로부터 수득된 mRNA로부터 유래되는 cDNA에 의해 암호화되는 재조합 항체인 것이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항-TTR 항체는 부속하는 실시예 및 도면에서 예시하는 대상체 항체에 대해 설명한 것과 같은 하나 이상의 결합 및 생물학적 특성, 바람직하게는 예시적인 항체 NI-301.59.F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1에 대해 설명된 것과 같은 하나 이상의 결합 및 생물학적 특성의 임의의 조합을 나타낸다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 항-TTR 항체 또는 그의 TTR-결합 절편은 도 1에 나타낸 것과 같은 가변 영역 VH 및/또는 VL에 의해 특정되는 항체의 면역학적 결합 특징을 나타낸다.
항체의 항원-결합 절편은 단일쇄 Fv 절편, F(ab') 절편, F(ab) 절편, 및 F(ab')2 절편, 또는 임의의 다른 항원-결합 절편일 수 있다. 아래의 특정 구현예에서, 항체 또는 그의 절편은 인간 IgG 이소형(isotype) 항체이다. 다른 한편으로, 항체는 키메라 인간-설치류(rodent) 또는 설치류화된 항체, 예컨대 쥐과(murine) 또는 쥐과화된 항체, 래트 또는 래트화된 항체이며, 설치류 버전이 동물에서의 진단 방법 및 연구를 위해 특히 유용하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 활성 절편을 포함하는 조성물 및 TTR 아밀로이드증과 연관된 장애의 예방, 진단 또는 치료에서 이러한 조성물을 이용하는 면역치료 및 면역진단 방법에 관한 것이며, 여기서 유효량의 조성물이 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 가변 영역은 도 1에 나타낸 것과 같은 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 종에 반응성인 항체를 생산하는 인간 메모리 B 세포로부터 수득된 mRNA로부터 유래되는 cDNA이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 이를 이용해 형질전환된 숙주 세포뿐만 아니라 TTR에 특이적인 항체 및 동등한 결합 분자의 생산을 위한 그의 용도를 포괄한다. 본 발명의 추가적인 구현예에서, 상기 항체 또는 결합 분자는 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 그의 절편에 결합할 수 있다. 항체 및 그의 모사체의 재조합 생산을 위한 수단 및 방법뿐만 아니라 항체일 수도 항체가 아닐 수도 있는 결합 분자와의 경쟁을 위한 스크리닝 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 그러나 본 명세서에 기재된 것과 같이, 특히 인간에서의 치료적 적용에 대해 본 발명의 항체는 상기 항체의 적용에서 다른 경우에는 키메라 및 심지어 인간화된 항체에 대해서도 관찰되는 상기 항체에 대한 면역 반응이 실질적으로 없다는 관점에서 인간 항체이다.
또한, 본 명세서는 TTR, 특히 샘플 및/또는 생체내(in vivo)에서 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 절편을 확인하기 위해 사용될 수 있는 조성물 및 방법이 개시된다. 상기 개시된 항-TTR 항체 및 그의 결합 절편은, 예를 들면, ELISA-기반 또는 표면 적응 분석을 이용함으로써 샘플에서 TTR 및/또는 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 그의 절편의 존재에 대해 인간 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 복막액, 뇌척수액("CSF") 및 소변을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 그의 절편과 연관된 장애의 진행을 진단 또는 모니터링하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 진단되는 대상체 유래의 샘플에서 적어도 하나의 본 발명의 항체 또는 그의 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 절편에 대한 TTR 결합 분자 및/또는 결합 분자를 이용하여 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 절편의 존재를 결정하는 단계를 포함하며, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 절편의 존재는 상기 장애를 시사한다.
또한, 본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 항-TTR 항체 및 TTR-결합 분자는 TTR, 특히 인간 또는 동물 체내에서 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 절편에 대한 치료제 및/또는 진단제를 생체내 검출(또한 생체내 이미징으로도 불림) 또는 표적화하기 위한 조성물의 제조를 위해 제공된다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 TTR 아밀로이드증과 연관되고 예컨대 TTR 형태의 출현에 의해 특정되는 장애를 도울 수 있고, 예를 들면 생체내 이미징과 연관된 진단 방법에서 질환의 진행 및 대상체에 제공된 치료법의 치료 효능을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 항-TTR 항체 및/또는 TTR 결합 분자가 제공되며, 상기 생체내 검출(이미징)은 신티그래피, 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomogrphy, PET), 단일 광자 방출 단층촬영(single photon emission tomography, SPECT), 근적외선(near infrared, NIR) 광학 이미징 또는 자기 공명 이미징(magnetic resonance imaging, MRI)을 포함한다.
따라서, 본 발명의 특별한 목적은 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환을 치료, 진단 또는 예방하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 바람직하게는 인간 항체 또는 항체 유도체를 대상체에 효과적인 농도로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항체는 TTR 또는 그의 절편, 바람직하게는 접힘오류화, 조립오류화, 또는 응집된 TTR 종 또는 그의 절편을 표적으로 한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체에 의해 특이적으로 인식되는 TTR, 바람직하게는 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 그의 절편의 에피토프(epitope)를 갖는 펩티드를 제공한다. 상기 펩티드는 하기 상세한 설명 및 실시예에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열, 또는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 그의 변형된 서열을 포함하거나 이루어지며, 단 상기 펩티드는 동족(cognate) 항체에 의해 여전히 인식된다. 언급한 것과 같이, 이러한 펩티드는 항원, 즉 면역원으로 사용될 수 있고, 따라서 대상체에서 면역 반응을 일으키고 생체내에서 본 발명의 항체의 생산을 자극하는데 유용하다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 백신으로서 특히 유용하다.
추가적으로, 본 발명은 대상체에서 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환을 진단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체의 생물학적 샘플에서 상기 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 결정하는 단계를 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환을 진단하거나, 항-TTR 항체를 이용한 상기 질환의 치료를 모니터링하거나, 또는 항-TTR 항체의 진단적 또는 치료적 유용성을 결정하는 방법에 관한 것으로서, 대상체에 항-TTR 항체를 투여한 후 샘플, 예를 들면 대상체로부터 수득된 혈액에서 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR 항체의 레벨을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 항-TTR 항체의 투여 전에 대상체로부터 수득된 샘플과 같은 대조군과 비교하여 대상체의 샘플에서 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR의 레벨이 존재하거나 향상된 것은 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환을 나타낸다.
본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 특히 실시예 13에 도시된 것과 같은 재조합 인간-유래의 항체 또는 인간에서 사용하기 위한 의도인 다른 항-TTR 항체를 테스트하기 위해 비-인간 동물을 이용할 때, 일반적으로 샘플에서의 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR의 레벨은, 예를 들면 항-인간 IgG 또는 항-이디오타입(idiotypic) 항체를 이용한 면역-침전에 의해 상기 항-TTR 항체 및 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR 사이에 형성된 복합체를 결정함으로써 분석된다.
특히 인간 대상체 및 환자에 대한 진단 측면과 관련하여, 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR 및 이것과 항-TTR 항체와의 복합체의 존재 및 향상된 레벨은 각각 인체, 예를 들면 환자 또는 대상체의 심장, 말초 신경계(PNS), 눈, 근육, 위장관, 신장, 혈관 시스템 및 중추 신경계(CNS)에서 TTR 아밀로이드 침적체의 존재를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법은 한편으로는 대상체 신체에서 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환을 확인 및 결정하고 다른 한편으로는 환자의 신체로부터 TTR 침적체를 제거하도록 하며, 이로 인해 또한 해당 치료의 치료적 진행 및 항-TTR 항체와 같은 TTR 아밀로이드증의 치료용 약물의 효능을 나타낸다.
따라서, 실시예 13에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 항-TTR 항체는 침적체로부터 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR을 체액, 특히 혈액 내로 포획 및 제거하기 위한 것과 같이 병리학적 TTR 침적체의 안정성을 변경시키기에 충분한 친화도로 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR에 결합할 수 있다. 투여 후 명시된 시간 간격, 즉 병리학적 TTR 및 항-TTR 항체와의 복합체의 레벨이 각각 측정되는 시간 프레임은 개업한 내과의사에 의해 결정된다. 보통, 1 주 이하의 시간 간격이 사용된다. 바람직한 구현예에서, 항-TTR 항체 또는 그의 항원-결합 절편을 환자 또는 대상체에 투여한 후 환자 또는 대상체 유래 샘플 내의 병리학적 TTR의 레벨은 48 시간 또는 그 이하 후에 결정된다; 또한 실시예 13 참조.
본 발명은 또한 임의의 항-TTR 항체 및 TTR-결합 분자를 전술한 방법에 사용하는 용도에 관한 것이다. 그러나, 특히 인간-유래인 유리한 특성으로 인하여, 본 명세서에 개시된 본 발명의 항-TTR 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 상기 항체는 NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.37F1-PIMC, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 및 NI-301.14C3로부터 선택되는 임의의 항체와 실질적으로 동일한 결합 및 생물학적 활성을 보여준다. 상기 항-TTR 항체는 또한 아래에 상세히 개시한 것과 같은 항체를 표지하는 단계를 포함하는 진단 방법의 취급을 촉진하기 위해 변경될 수 있다.
본 발명의 추가적인 구현예는 다음의 설명 및 실시예로부터 자명할 것이다.
도 1은 인간 항체 NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.37F1-PIMC, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 및 NI-301.14C3의 가변 영역의 아미노산 서열이다. 골격(framework, FR) 및 상보성 결정 영역이 나타나 있고, CDR에는 밑줄을 친다. Kabat 번호지정 방식(scheme)이 사용되었다(http://www.bioinf.org.uk/abs/ 참조).
도 2는 직접 ELISA에 의한 응집된 야생형 및 돌연변이체 TTR에 대한 결합을 나타낸다. A, B, C: ELISA 플레이트를 10 ㎍/㎖에서 응집된 인간 야생형 TTR(●), 응집된 재조합 V30M-TTR(▼) 및 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)(■)으로 코팅하였고, 4 pM 내지 400 nM 범위의 농도에서 다음의 인간 모노클론 항체로 인큐베이션하였다: A) NI-301.59F1, B) NI-301.35G11 및 C) NI-301.37F1. 데이터 포인트를 최소제곱법으로 맞춤으로써 EC50 값을 추정하였다. NI-301.59F1: 응집된 wt-TTR EC50 = 3.0 nM, 응집된 V30M-TTR EC50 = 15.5nM. NI-301.35G11: 응집된 wt-TTR EC50 = 3.9 nM, 응집된 V30M-TTR EC50 = 5.0nM. NI-301.37F1: 응집된 wt-TTR EC50 = 0.35 nM, 응집된 V30M-TTR EC50 = 0.15 nM.
도 3은 점 블롯(dot blot)에서 응집된 TTR에 대한 특이성을 나타낸다. 자연형(1) 또는 응집된(2) 입체형태의 인간 야생형 TTR 단백질, 및 응집된 재조합 V30M-TTR 단백질(3)을 니트로셀룰로오스 막에 침적시켰고, 다음의 항체로 인큐베이션하였다: A) TTR에 대한 시판되는 토끼 폴리클론 항체(Dako-A0002; 150 ng/㎖), B) NI-301.59F1, C) NI-301.35G11 및 D) NI-301.37F1(B, C 및 D: 50 nM에서 인간 모노클론 항체).
도 4는 웨스턴 블롯(western blot)에서 응집된 TTR에 대한 특이성을 나타낸다. 자연형(1) 또는 응집된(2) 입체형태의 인간 야생형 TTR 단백질(300 ng), 및 야생형 마우스 간 추출물(10 ㎍ 총 단백질)(3)을 SDS-PAGE 겔에 로딩하였고, 다음의 항체로 웨스턴 블롯을 진행하였다: A) TTR에 대한 시판되는 토끼 폴리클론 항체(Dako-A0002; 150 ng/㎖), B) NI-301.59F1, C) NI-301.35G11 및 D) NI-301.37F1(B, C 및 D: 50 nM에서 인간 모노클론 항체). 고분자량 응집체의 해리를 방지하기 위하여, 겔에 로딩(loading)하기 전에 응집된 TTR 샘플을 글루타르알데히드(1%, 5 분)로 가교결합시켰다.
도 5는 웨스턴 블롯에서 인간 혈장 TTR에 대한 결합이 없음을 나타낸다. 대조군(n=5), 징후없는(asymptomatic) 돌연변이 담체(n=5) 및 FAP 환자(n=4) 유래의 혈장 샘플(0.5 ㎕)을 SDS-POAGE 겔에 로딩하였고, 다음의 항체로 웨스턴 블롯을 진행하였다: A) TTR에 대한 시판되는 토끼 폴리클론 항체(Dako-A0002; 150 ng/㎖), B) 2 차 항체 단독(항-인간 IgG-HRP, 1/10,000 희석), C) NI-301.35G11 및 D) NI-301.37F1(C 및 D: 50 nM에서 인간 모노클론 항체).
도 6은 점 블롯에서 인간 혈장 TTR에 대한 결합이 없음을 나타낸다. 자연형 및 응집된 입체형태의 정제된 야생형 및 돌연변이 TTR 단백질 및 대조군, 징후없는 돌연변이 담체 및 FAP 환자 유래의 혈장 샘플을 니트로셀룰로오스 막에 침적시켰고, 다음의 항체로 인큐베이션하였다: A) TTR에 대한 시판되는 토끼 폴리클론 항체(Dako-A0002; 150 ng/㎖), B) 2 차 항체 단독(항-마우스 IgG2a-HRP, 1/10,000 희석), 및 C) 마우스 키메라 항체 NI-301.mur35G11(10 nM). 샘플 1-6: 150 ng의 1) 응집된 wt-TTR, 2) 자연형 wt-TTR, 3) BSA, 4) 자연형 V30M-TTR, 5) 자연형 L55P-TTR, 및 6) 자연형 Y78F-TTR. 샘플 7-18: 7-10) 대조군(n=4), 11-14) 징후없는 돌연변이 담체(n=4) 및 15-18) FAP 환자(n=4)로부터 수집된 2 ㎕의 혈장.
도 7은 용액에서 응집된 TTR에 대한 특이적인 결합을 나타낸다. 3 가지 상이한 희석액에서의 자연형 및 응집된 입체형태의 인간 야생형 및 재조합 TTR 단백질 및 인간 혈장 샘플을 사용하여 다음의 항체를 이용해 TTR 면역침전(immunoprecipation)(IP)시켰다: A) TTR에 대한 시판되는 토끼 폴리클론 항체(Dako-A0002), B) NI-301.35G11 및 C) NI-301.37F1. 상기 면역침전된 단백질을 SDS-PAGE에 적용하였고, 상기 Dako-A0002 항체(150 ng/㎖)를 이용한 웨스턴 블롯(WB)에 의해 검출하였다. 레인 1-2: WB 로딩 대조군: 300 ng의 1) 인간 wt-TTR, 2) 재조합 wt-TTR. 레인 3-6: 정제된 TTR 단백질에 대한 IP: 3) 인간 자연형 wt-TTR, 4) 인간 응집된 wt-TTR, 5) 재조합 자연형 wt-TTR 및 6) 재조합 응집된 wt-TTR. 레인 7-10: PBS로 7) 10 배, 8) 100 배, 9) 1,000 배 희석된 인간 혈장, 및 10) PBS 단독에 대한 IP.
도 8은 FAP 마우스 조직에서 TTR에 특이적인 결합을 나타낸다. TTR 낙-아웃(knock-out)(KO) 배경(background)에서 인간 V30M-TTR 대립형질(allele)을 발현하는 유전자이식 마우스는 다양한 조직에서 무정형 및 아밀로이드 TTR 침적체를 포함하는 FAP의 조직병리학적 홀마크(hallmark)를 재생산한다. A) FAP 마우스 및 B) TTR-KO 마우스로부터 수집된 간 및 내장 조직 섹션(section)을 다음의 항체를 이용하여 면역조직화학에 대해 처리하였다: 1) TTR에 대한 시판되는 토끼 폴리클론 항체(Dako-A0002; 1/1,000 희석), 2) NI-301.35G11 및 3) NI-301.37F1(2 및 3: 50 nM에서 인간 단일클론 항체).
도 9는 인간 조직에서 자연형 TTR이 아니라 접힘오류화 TTR 침적체에 대한 특이적인 결합을 나타낸다. 항체를 FAP 환자 피부 생검(biopsy) 및 건강한 대조군 췌장 유래의 섹션에서 TTR에 결합하는 능력에 대해 특성분석하였다: FAP에 특징적인 접힘오류화 TTR 축적물(accumulation)은 환자의 피부 생검에 존재하지만, 췌장 알파 세포는 TTR의 내인성 발현을 보여준다. 섹션을 다음의 항체를 이용한 면역조직화학에 대해 처리하였다. 1A) TTR에 대한 시판되는 토끼 폴리클론 항체(Dako-A0002; 1/1,000 희석), 1B) HRP-커플링된 항-토끼 IgG 항체(1/125 희석), 2A) 마우스 키메라 항체 NI-301.mur35G11(50 nM), 2B) HRP-커플링된 항-마우스 IgG2a 항체(1/125 희석), 3A) NI-301.37F1(50 nM) 및 3B) HRP-커플링된 항-인간 IgG(1/125 희석).
도 10은 펩스캔(pepscan) 분석에 의해 평가된 TTR 결합 에피토프를 나타낸다. TTR에 대한 항체 결합 에피토프는 펩티드 스캔 방법을 이용하여 결정하였다. 전체 인간 야생형 TTR 서열을 커버하는 펩티드(스팟 1 내지 29) 이외에, 선택된 TTR 돌연변이를 또한 막에 나타내었다(스팟 30 내지 44). 상기 펩티드 스캔 막을 50 nM에서 다음의 항체로 인큐베이션하였다: A) NI-301.59F1, B) NI-301.35G11 및 C) NI-301.37F1. 표 D)에 요약한 것과 같이, NI-301.59F1은 EEEFVEGIY(TTR 61-69)에 결합한다; NI-301.35G11은 GELHGLTTEEE(TTR 53-63)에 결합한다; L55P 돌연변이는 항체 결합을 방지한다; 및 NI-301.37F1은 WEPFA(TTR 41-45)에 결합한다; E42G 돌연변이는 항체 결합을 방지한다. 전술한 에피토프의 서열 요구사항을 결정하기 위하여, TTR에 대한 항체 결합 에피토프를 알라닌 스캔 방법을 이용하여 추가로 확인하였다. 인간 야생형 TTR 단백질의 전체 서열을 TTR 단백질의 모드 아미노산에서 시작하여 15 개 아미노산 길이의 151 개의 연속적인 펩티드의 세트로서 막에 나타내었다. 각각의 펩티드에 대하여, 위치 10에서의 아미노산을 알라닌 또는 글리신으로 교체하거나, 처음 아미노산이 알라닌일 때는 프롤린으로 교체하였다. 상기 펩티드 스캔 막을 20 nM에서 다음의 항체로 인큐베이션하였다: E) NI-301.59F1, F) NI-301.35G11 및 G) NI-301.37F1. 표 H)에 요약한 것과 같이, NI-301.59F1은 EEFXEGIY(TTR 61-68)에 결합한다. NI-301.35G11은 ELXGLTXE(TTR 54-61)에 결합한다. NI-301.37F1은 WEPFA(TTR 41-45)에 결합하며, X는 아미노산을 나타낸다; E42를 알라닌으로 교체하면 결합을 손상시키지 않았지만, 구아닌으로의 교체는 도 10의 C에 보고된 것과 같이 항체의 결합을 방지하였다.
도 11은 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 평가된 용액 내의 TTR 단백질에 대한 항체 결합 동역학(kinetics)을 나타낸다. TTR 단백질에 대한 항체 NI-301.37F1의 결합 동역학은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. 항체 NI-301.37F1을 항-인간 IgG 항체를 이용해 센서 상에서 포획하였고, TTR 단백질 용액을 3.2 내지 315 nM 범위의 농도에서 상기 센서 표면에 흘렸다. 단순한 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 일치시켰고, 결합(association)(ka) 및 해리(dissociation)(kd) 상수 및 친화도(KD)를 도출하였다. A) 자연형 입체형태의 인간 야생형 TTR 단백질, B) 변성된 인간 야생형 TTR 단백질(접힘오류화 입체형태), 및 C) 재조합 돌연변이 TTR-L55P 단백질에 대한 결합 특성을 결정하였다. 자연형의 야생형 TTR: ka = 결정되지 않음, kd = 결정되지 않음, KD > 316 nM. 변성된 야생형 TTR: ka = 2.1 104 M-1s-1, kd = 2.6 10- 5 s-1, KD = 1.2 nM. 재조합 TTR-L55P: ka = 3.3 104 M-1s-1, kd = 4.6 10-5 s-1, KD = 1.4 nM.
도 12는 항-TTR 항체를 이용한 만성 치료는 FAP 마우스 모델에서 병리학적 TTR 침적물을 감소시킴을 나타낸다. FAP 마우스(Tg(6.0hMet30) × muTTR-KO)를 마우스 키메라 NI-301.37F1 또는 이소형 대조군 항체로 3 ㎎/㎏에서 복강내로 12 주 동안 매주 투여하였다. 치료 기간 종료시, 조직을 수집하였고, TTR 침적의 정도를 면역형광에 의해 정량하였다. A) 7-월령 마우스에서의 치료 효과(n=14-15 마우스/군); B) 17-월령 마우스에서의 치료 효과(n=10 마우스/군). 양방(two tailed), 언페어드(unpaired) t-테스트를 이용하여 군들을 비교하였다.
도 13은 생체내에서 병리학적 TTR 침적물에 대한 항체 결합을 나타낸다. 표적의 관련성(engagement)을 30 ㎎/㎏에서 복강내로 단일 용량의 항체 NI-301.37F1 또는 PBS의 투여 48 시간 후에 성체 FAP 마우스(7 월령)에서 특성분석하였다. 병리학적 TTR 침적물 및 주사된 항체의 편재(localization)를 면역형광에 의해 동시에 검출하였다. A, D) (A) NI301.37F1- 또는 (D) PBS-주사된 마우스의 신장에서의 병리학적 TTR 침적물. B, E) (B) NI-301.37F1- 또는 (E) PBS-주사된 마우스에서의 인간 항체의 검출. C, F) TTR 및 NI-301.37F1 (C) 동시편재 및 (F) 비특이적 염색의 부재를 보여주는 중첩 이미지.
도 14는 생체내에서 접힘오류화 TTR의 조직-부재 검출을 보여준다. 성체 FAP 마우스에 3 ㎎/㎏에서 복강내로 NI-301.37F1 또는 이소형 대조군 항체를 단일 투여하였다. 항체 주사 전(t=0) 및 항체 주사 48 시간 후(t=48h)에 혈액 샘플을 수집하였다. 혈장 샘플을 항-인간 IgG 항체를 이용한 면역침전에 의해 처리하였고, 검출을 위하여 다음을 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다: A) 입체형태-독립적 항-TTR 폴리클론 항체(Dako-A0002, 150 ng/㎖), 및 B) NI-301.37F1. 이와 함께, 주사하지 않은 FAP 마우스로부터 수득된 혈장 샘플을 처리하기 전에 시험관내에서 항체 NI-301.37F1로 인큐베이션하였다.
도 15는 ELISA에 의해 응집 단백질에 대해 평가된 항체 특이성을 나타낸다. TTR 단백질에 대한 항체 특이성을 직접 ELISA에 의해 선택된 응집 단백질에 대한 결합을 측정함으로써 평가하였다. 항체 결합을 4 및 20 nM에서 평가하였고, 신호 강도를 각각의 분석에 대해 항-TTR 항체없이 측정된 배경 레벨에 대한 배수 변화로 표현하였다. A-B) 20 nM(A) 및 4 nM(B)에서 분석된 NI-301.37F1 결합. C-D) 20 nM(C) 및 4 nM(D)에서 분석된 NI-301.44E4 결합.
본 발명은 일반적으로 트랜스티레틴(TTR)의 병리학적, 종종 돌연변이 및/또는 접힘오류화 아형의 존재와 연관된 질환 및 증상을 검출하기 위한 면역치료 및 비-침습적 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 선택된 인간 공여자 군집으로부터 수득된 서열 정보에 기초하여 생성되고 이러한 TTR 아형 및 그의 항원에 결합할 수 있는 재조합 인간-유래의 모노클론 항체 및 그의 항원 결합 절편에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 인간-유래의 모노클론 항체는 접힘오류화, 조립오류화, 돌연변이화 및/또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편에 특이적으로 걸함하는 것에 의해 유리하게 특정되며, 병리학적으로 변경된 TTR 종의 치료 및/또는 진단을 위한 표적화를 허용한다. 이들은 인간 기원이기 때문에, 결과물인 본 발명의 재조합 항체는 치료제로서 효과적이고 안전하며, 위양성을 제공하는 일 없이 병리학적 TTR의 검출용 진단 시약으로서 매우 특이적일 것으로 합리적으로 기대된다.
또한, 본 발명의 항체뿐만 아니라 그의 유도체는 예컨대 TTR에서의 유전가능한 돌연변이 또는 간에서의 TTR 생산 결함과 같은 예컨대 그의 침적물로 인해 TTR 아밀로이드증이 발생할 위험성을 갖고 있는 기관 이식 후 환자의 조합 치료용으로 사용될 수 있다. 따라서, 특정 유리한 구현예로서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 인간 모노클론 항체 및 그의 임의의 유도체를 단독으로 환자의 치료에 사용하거나 예컨대 기관 이식 후 면역억제 약물 또는 TTR 아밀로이드증과 연관된 징후를 위해 사용되는 다른 제제를 받는 환자의 치료에 사용하는 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 항체 및 그의 임의의 유도체는 상기 면역억제 약물 및/또는 추가적인 부작용을 억제하는 제제와 동시에 또는 그의 투여 전후에 연속하여 투여되도록 디자인된다. 상기 문맥에서, 본 ㅂ라명의 항-TTR 항체 및 TTR-결합 절편은 인간에서 실질적으로-비-면역원성인 것이 바람직하다. 본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체 또는 그의 임의의 유도체 및 하나 이상의 면역억제 약물 및/또는 TTR 아밀로이드증과 연관된 징후용으로 이용되는 제제 모두를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
Ⅰ. 정의
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 용어는 2000 년 개정되고 2003 년 재인쇄된 [Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, ISBN 0 19 850673 2]에서 제공되는 것과 같은 정의로 주어진다.
용어 "하나" 또는 "한"의 대상이 하나 이상의 대상을 나타내는 것이 주지된다; 예를 들면 "항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나" (또는 "한"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"는 본 명세서에서 상호교환적으로 이용될 수 있다.
구체적으로 달리 나타내지 않는 한, 용어 "TTR"은 상이한 형태의 트랜스티레틴(TTR)을 구체적으로 나타내기 위해 상호교환적으로 이용된다. 용어 "TTR"은 또한 TTR의 다른 콘포머(conformer), 예를 들면 TTR의 올리고머 및/또는 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 형태를 일반적으로 나타내기 위해 이용된다. 용어 "TTR"은 또한 돌연변이 TTR과 같은 모든 유형 및 형태의 TTR을 종합적으로 나타내기 위해 이용된다. 용어 TTR의 앞에 첨가된 문자는 특정 오르소로그(ortholog)가 유래된 개체를 나타내기 위해 이용되며, 예컨대 인간 TTR에 대해서는 hTTR 또는 쥐과 기원에 대해서는 mTTR이다. 또한, 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 TTR 아미노산 서열에 대한 번호지정 시스템은 성숙한 TTR 단백질, 즉 신호 펩티드의 절단 후에 세포에 의해 분비되는 TTR 단백질에 관한 것이다. 상기 번호지정은 TTR-V30M 또는 TTR-L55P와 같은 환자에서 발견되는 TTR 돌연변이를 정의하기 위해 사용되는 것으로서, 트랜스티레틴 전구체 단백질 서열(NCBI 참조 서열: NP_000362.1)을 위해 사용되는 것과는 다르다. 상기 문맥에서, 돌연변이 TTR에서의 위치 및 치환된 아미노산은 다르지만 동등한 방식으로 표시될 수 있다; 예컨대, "TTR-V30M" 및 "V30M-TTR" 참조.
본 명세서에 개시된 항-TTR 항체는 TTR 및 그의 에피토프에 그리고 TTR 및 그의 에피토프의 다양한 입체형태에 특이적으로 결합한다. 예를 들면, 병리적으로 변경된 TTR 종 또는 그의 절편, 예컨대 올리고머/섬유 및/또는 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 형태의 TTR 또는 그의 절편에 특이적으로 결합하는 항체가 본 명세서에 개시된다. 용어 TTR의 (병리학적으로) 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 응집된/응집체는 전술한 형태를 구체적으로 나타내기 위해 상호교환적으로 이용된다. 본 명세서에서 이용되는 용어 (병리학적) "응집된 형태" 또는 "응집체"는 TTR의 서로간 오류적/병리학적 상호작용으로 인한 축적 또는 클러스터 형성 산물을 나타낸다. 이들 응집체, 축적 또는 클러스터 형태는 TTR 및/또는 TTR 절편 모두 및 그의 비섬유상 올리고머 및/또는 섬유상 올리고머 및 섬유이거나, 실질적으로 이로 구성되거나 또는 이로 구성될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 TTR에 "특이적으로 결합하는", "선택적으로 결합하는", 또는 "우선적으로 결합하는" 항체에 대한 언급은 다른 미관련 단백질에 결합하지 않는 항체를 나타낸다. 한 예에서, 본 명세서에 개시된 TTR 항체는 TTR 또는 그의 에피토프에 결합할 수 있고 다른 단백질에 대해 배경의 약 2 배 이상의 결합을 나타내지 않는다. 바람직하 구현예에서, 본 발명의 항체는 알파-시뉴클레인(α-syn), Tau, 교차활성 반응 DNA 결합 단백질 43(TDP-43), 혈청 아밀로이드 A(SAA), 헌팅틴 단백질(huntingtin protein, HTT)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연관되지 않은 아밀로이드-형성 단백질을 실질적으로 인식하지 않는다; 예컨대, 도 15 참조. TTR 콘포머에 "특이적으로 결합하는" 또는 "선택적으로 결합하는" 항체는 TTR의 모든 입체형태에 결합하지 않는, 즉 적어도 하나의 다른 TTR 콘포머에 결합하지 않는 항체를 나타낸다.
예를 들면, 시험관내 및 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환을 갖거나 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환이 발생할 위험성을 갖는 환자로부터 수득된 조직에서 모두 TTR의 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 형태에 우선적으로 결합할 수 있는 항체가 본 명세서에 개시된다. 본 발명의 TTR 항체의 서열은 인간 대상체로부터 수득되었으므로, 본 발명의 TTR 항체는 또한 이들 항체가 대상체에 의해 실제로 처음으로 발현되었고, 예를 들면, 여태까지 인간-유사 항체를 제공하기 위해 시도하는 하나의 일반적인 방법으로 제시된 인간 면역글로불린 발현 파지 라이브러리에 의해 생성된 합성 구조체가 아님을 강조하기 위하여 "인간 자가-항체" 또는 "인간-유래의 항체"로 불릴 수 있다.
용어 "펩티드"는 그 의미 내에 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" (때때로 본 명세서에서 상호교환적으로 이용될 수 있음)을 포함하는 것으로 이해된다. 유사하게, 단백질 및 폴리펩티드의 절편도 고려되며, 본 명세서에서 "펩티드"로 불릴 수 있다. 그럼에도 불구하고, 용어 "펩티드"는 바람직하게는 적어도 5 개의 인접 아미노산, 바람직하게는 적어도 10 개의 인접 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 15 개의 인접 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 20 개의 인접 아미노산, 특히 바람직하게는 적어도 25 개의 인접 아미노산을 포함하는 아미노산 중합체를 나타낸다. 또한, 본 발명에 따른 펩티드는 전형적으로 상기 TTR 폴리펩티드의 100 개 이하의 인접 아미노산, 바람직하게는 80 개 이하의 인접 아미노산, 보다 바람직하게는 50 개 이하의 인접 아미노산, 보다 더 바람직하게는 15 개 이하의 인접 아미노산을 갖는다.
폴리펩티드:
본 명세서에서 이용되는 용어 "폴리펩티드"는 단수의 "폴리펩티드"뿐만 아니라 복수의 "폴리펩티드"도 포괄하려는 것이며, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려져 있음)으로 선형으로 연결된 모노머(아미노산)로 이루어진 분자를 나타낸다. 용어 "폴리펩티드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 나타내며 특정 길이의 산물을 나타내지는 않는다. 따라서 "펩티드", "디펩티드", "트리펩티드", "올리고펩티드", "단백질", "아미노산 사슬" 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 나타내기 위해 이용되는 임의의 다른 용어가 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"가 임의의 이들 용어 대신에 또는 상호교환적으로 이용될 수 있다.
용어 "폴리펩티드"는 또한 비제한적으로 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화 및 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단 또는 비-천연 생성 아미노산에 의한 변형을 포함하는 폴리펩티드의 발현 후 변형 산물을 나타내기 위한 것이다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 원천에서 유래되거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 화학적 합성에 의한 것을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 약 3 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 20 개 이상, 25 개 이상, 50 개 이상, 75 개 이상, 100 개 이상, 200 개 이상, 500 개 이상, 1,000 개 이상, 또는 2,000 개 이상의 아미노산의 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3 차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 이러한 구조를 갖지는 않는다. 정의된 3 차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 접혀진 것으로 불리며, 정의된 3 차원 구조를 보유하지 않고 다수의 상이한 입체형태를 채용할 수 있는 폴리펩티드는 접혀지지 않은 것으로 불린다. 본 명세서에서 이용되는 용어 당단백질은 아미노산 잔기의 산소 함유 또는 질소 함유 측쇄, 예컨대 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기를 통해 단백질에 부착되는 적어도 하나의 탄수화물 모이어티(moiety)에 커플링된 단백질을 나타낸다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 그의 절편, 변이체, 또는 유도체는 그 천연 환경에 있지 않는 폴리펩티드에 대한 것이다. 특정한 레벨의 정제가 요구되지는 않는다. 예를 들면, 단리된 폴리펩티드는 그 천연 또는 자연 환경에서 제거될 수 있다. 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나 분획화되거나 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 같이, 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
"재조합 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질"은 재조합 DNA 기법에 의해 생산된, 즉 원하는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 외인성 재조합 DNA 발현 구축물(construct)에 의해 형질전환된 세포, 미생물 또는 포유류로부터 생산된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 대부분의 박테리아 배양에서 발현된 단백질 또는 펩티드에는 전형적으로 글리칸이 없을 것이다. 효모에서 발현된 단백질 또는 폴리펩티드는 포유류 세포에서 발현되는 것과 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드의 절편, 유도체, 유사체 또는 변이체 및 그의 임의의 조합이 또한 포함된다. 용어 "절편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"에는 천연 펩티드의 아미노산 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 및 폴리펩티드가 포함된다. 용어 "충분히 유사한"은 제1 및 제2 아미노산 서열이 공통 구조 도메인 및/또는 공통 기능적 활성을 갖도록 제2 아미노산 서열에 대해 충분한 또는 최소 수의 동일하거나 동등한 아미노산 잔기를 함유하는 제1 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들면, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한 공통 구조 도메인을 포함하는 아미노산 서열이 본 명세서에서 충분히 유사한 것으로 정의된다. 바람직하게는 변이체는 본 발명의 바람직한 펩티드, 특히 TTR, 변이체, 유도체 또는 유사체의 아미노산 서열과 충분히 유사할 것이다. 이러한 변이체는 일반적으로 본 발명의 펩티드의 기능적 활성을 보유한다. 변이체에는 하나 이상의 아미노산 결실(들), 부가(들), 및/또는 치환(들)에 의해 각각 천연 및 야생형 펩티드의 아미노산 서열과 상이한 펩티드가 포함된다. 이들은 천연 생성 변이체뿐만 아니라 인공적으로 설계된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 항체 폴리펩티드를 언급할 때의 용어 "절편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"에는 대응하는 천연 결합 분자, 항체, 또는 폴리펩티드의 적어도 일부 항원-결합 특성을 보유하는 임의의 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드 절편에는 본 명세서에서 다른 곳에 논의된 특정 항체 절편에 부가하여 단백질분해 절편뿐만 아니라 결실 절편이 포함된다. 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩티드의 변이체에는 상술된 것과 같은 절편, 및 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함된다. 변이체는 천연 생성되거나 천연 생성되지 않을 수 있다. 비-천연 생성 변이체는 본 기술분야에 공지된 돌연변이화 기법을 이용해서 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. TTR 특이적 결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩티드의 유도체는 천연 폴리펩티드에서 발견되지 않는 추가적 특징을 나타내기 위해 변형된 폴리펩티드이다. 예에는 융합 단백질이 포함된다. 변이체 폴리펩티드는 또한 본 명세서에서 "폴리펩티드 유사체"로 불릴 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 결합 분자 또는 그의 절편, 항체, 또는 항체 폴리펩티드의 "유도체"는 기능적 측쇄기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 대상체 폴리펩티드를 나타낸다. 또한 "유도체"로서 20 가지 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 생성 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드가 포함된다. 예를 들면, 4-히드록시프롤린이 프롤린에 대해 치환될 수 있고; 5-히드록시라이신이 라이신에 대해 치환될 수 있고; 3-메틸히스티딘이 히스티딘에 대해 치환될 수 있고; 호모세린이 세린에 대해 치환될 수 있고; 오르니틴이 라이신에 대해 치환될 수 있다.
분자의 유사성 및/또는 동일성의 결정:
두 펩티드 사이의 "유사성"은 한 펩티드의 아미노산 서열을 제2 펩티드의 서열과 비교하여 결정된다. 한 펩티드의 아미노산은 이것이 동일하거나 보존적 아미노산 치환인 경우, 제2 펩티드의 대응 아미노산과 유사하다. 보존적 치환에는 [Dayhoff, M.O., ed., The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978), 및 Argos, EMBO J. 8 (1989), 779-785]에 기재된 것들이 포함된다. 예를 들면, 하기 군 중 하나에 속하는 아미노산은 보존적 변화 또는 치환을 나타낸다: -Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His; -Phe, Tyr, Trp, His; 및 -Asp, Glu.
두 폴리뉴클레오티드 간의 "유사성"은 한 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열을 폴리뉴클레오티드의 서열과 비교하여 결정된다. 한 폴리뉴클레오티드의 핵산은 이것이 동일한 경우, 또는 핵산이 코딩 서열의 일부인 경우, 제2 폴리뉴클레오티드의 대응 핵산과 유사하며, 핵산을 포함하는 각각의 삼중자(triplet)가 동일한 아미노산 또는 보존적 아미노산 치환을 암호화한다.
두 서열 사이의 동일성 또는 유사성 백분율의 결정은 바람직하게는 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877]의 수학적 알고리즘을 이용하여 달성된다. 이러한 알고리즘은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)에서 이용 가능한 [Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol . 215: 403-410]의 BLASTn 및 BLASTp 프로그램에 도입된다.
동일성 또는 유사성 백분율 결정은 특정 길이 및 조성의 서열에 대해 NCBI 웹페이지 및 "BLAST 프로그램 선택 가이드"에서 권장되는 것과 같이 BLAST 폴리뉴클레오티드 검색을 위해서는 BLASTn 프로그램 및 BLAST 단백질 검색을 위해서는 BLASTp 프로그램의 표준 파라미터로 수행된다.
BLAST 폴리뉴클레오티드 검색은 BLASTn 프로그램으로 수행된다.
일반 파라미터에 있어서, "최대 표적 서열" 박스는 100으로 설정될 수 있고, "단축 쿼리" 박스가 확인될 수 있고, "예상 역치" 박스는 1,000으로 설정될 수 있고 "워드 크기" 박스는 NCBI 웹페이지에서 짧은 서열(20 개 염기 이하)에 대해 권장된 것과 같이 7로 설정될 수 있다. 더 긴 서열에 있어서, "예상 역치" 박스는 10으로 설정될 수 있고 "워드 크기" 박스는 11로 설정될 수 있다. 스코어링 파라미터에 있어서, "매치/미스매치 스코어"는 1, -2로 설정될 수 있고, "갭 코스트" 박스는 선형으로 설정될 수 있다. 필터 및 마스킹 파라미터에 있어서, "저복잡성 영역" 박스가 확인되지 않을 수 있고, "종-특이적 반복" 박스가 확인되지 않을 수 있고, "순람표만 마스크" 박스가 확인될 수 있고, "DUST 필터 설정"이 확인될 수 있고 "소문자 마스크" 박스가 확인되지 않을 수 있다. 일반적으로 "짧고 거의 정확한 매치에 대한 검색"을 이에 대해 이용할 수 있고, 이는 상기 나타낸 설정을 대부분 제공한다. 이에 대한 추가 정보는 NCBI 웹페이지에 공개된 "BLAST 프로그램 선택 가이드"에서 확인할 수 있다.
BLAST 단백질 검색은 BLASTp 프로그램으로 수행된다. 일반 파라미터에 있어서, "최대 표적 서열" 박스는 100으로 설정될 수 있고, "단축 쿼리" 박스가 확인될 수 있고, "예상 역치" 박스가 10으로 설정될 수 있고 "워드 크기" 박스가 "3"으로 설정될 수 있다. 스코어링 파라미터에 있어서, "매트릭스" 박스는 "BLOSUM62"로 설정될 수 있고, "갭 코스트" 박스는 "존재: 11 연장: 1"로 설정될 수 있고, "조성 조정" 박스는 "조건부 조성 스코어 매트릭스 조정"으로 설정될 수 있다. 필터 및 마스킹 파라미터에 있어서, "저복잡성 영역" 박스가 확인되지 않을 수 있고, "순람표만 마스크" 박스가 확인되지 않을 수 있고, "소문자 마스크" 박스가 확인되지 않을 수 있다.
예컨대, 검색된 서열 길이에 대한 두 프로그램의 변형은 NCBI 웹페이지에서 HTML 및 PDF 버전으로 공개된 "BLAST 프로그램 선택 가이드"에서의 권장사항에 따라 수행된다.
폴리뉴클레오티드:
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수 핵산뿐만 아니라 복수 핵산을 포괄하려는 것이며, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예컨대 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적인 결합(예컨대, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 임의의 하나 이상의 핵산 절편, 예컨대 폴리뉴클레오티드에 존재하는 DNA 또는 RNA 절편을 나타낸다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 그 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA에 대한 것이다. 예를 들면, 벡터에 함유된 항체를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예에는 이종성 숙주 세포에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 RNA 분자에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체가 포함된다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산에는 합성적으로 생산된 분자가 추가로 포함된다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종료자이거나 이를 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 이용되는 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 구성되는 핵산 부분이다. "정지 코돈" (TAG, TGA, 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만 코딩 영역의 일부로 간주될 수 있지만, 임의의 측면 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종료자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 본 발명의 둘 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예컨대 단일 벡터 상에, 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 구축물에, 예컨대 별도의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수도 있고, 또는 둘 이상의 코딩 영역을 함유할 수도 있으며, 예컨대 단일 벡터가 별도로 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 결합 분자, 항체, 또는 그의 절편, 변이체, 또는 유도체를 암호화하는 핵산에 융합되거나 융합되지 않은 이종성 코딩 영역을 암호화할 수 있다. 이종성 코딩 영역에는 비제한적으로 특화된 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종성 기능 도메인이 포함된다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드에는 보통 하나 이상의 코딩 영역에 작동가능하게 연관된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소가 포함될 수 있다. 작동가능한 연관은 유전자 산물, 예컨대 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현을 배치하기 위한 방식으로 하나 이상의 조절 서열에 연관되는 경우이다. 두 DNA 절편(예컨대 폴리펩티드 코딩 영역 및 이에 연관된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA 전사를 일으키는 경우 그리고 두 DNA 절편 사이의 연결의 성질은 발현 조절 서열이 유전자 산물의 발현을 지시하는 능력을 방해하거나 DNA 주형이 전사되는 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 연관된" 또는 "작동가능하게 연결된" 것이다. 따라서 프로모터 영역은 프로모터가 핵산의 전사를 일으킬 수 있는 경우, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연관될 것이다. 프로모터는 소정 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 외에 다른 전사 제어 요소, 예를 들면 인핸서, 작동유전자, 억제유전자 및 전사 종료 신호가 세포-특이적 전사를 지시하기 위해 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연관될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역이 본 명세서에 개시된다.
다양한 전사 제어 영역이 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 이들에는 비제한적으로 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 비제한적으로 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 더불어 최조기 발현 프로모터), 원숭이 바이러스 40(조기 발현 프로모터), 및 레트로바이러스(예컨대 라우스 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 절편이 포함된다. 다른 전사 제어 영역에는 척추동물 유전자, 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈에서 유래된 것들뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 추가적인 적합한 전사 제어 영역에는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 림포카인-유도성 프로모터(예컨대, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도 가능한 프로모터)가 포함된다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들에는 비제한적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종료 코돈, 및 피코나바이러스에서 유래된 요소(특히 CITE 서열로도 불리는 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES)가 포함된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들면 메신저 RNA(mRNA) 형태이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가적인 코딩 영역에 연관될 수 있으며, 이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 지시한다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비된 단백질은 조면 소포체를 통한 성장하는 단백질 사슬의 외수송이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 이것이 완전한 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙" 형태의 폴리펩티드를 생산하는 것을 알고 있다. 특정 구현예에서, 천연 신호 펩티드, 예컨대 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 이에 작동가능하게 연관된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 그 서열의 기능적 유도체가 이용된다. 다른 한편으로, 이종성 포유류 신호 펩티드, 또는 그의 기능적 유도체가 이용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 이용되는 "결합 분자"는 주로 항체, 및 그의 절편에 관련되지만, 또한 비제한적으로 호르몬, 수용체, 리간드, 주조직 적합 복합체(MHC) 분자, 샤페론, 예컨대 열 충격 단백질(HSP)뿐만 아니라 세포-세포 접착 분자, 예컨대 카드헤린, 인테그린, C-형 렉틴 및 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리 구성원을 포함하는 TTR에 결합하는 다른 비-항체 분자를 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명의 범위를 제한하지 않고 오직 명확성을 위해, 하기 구현예의 대부분은 치료제 및 진단제의 개발을 위해 바람직한 결합 분자를 나타내는 항체 및 항체-유사 분자에 대해 논의된다.
항체:
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본 명세서에서 상호교환적으로 이용된다. 항체 또는 면역글로불린은 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하며, 보통 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 결합 분자이다. 척추동물계에서 기본 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다; 예컨대, [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)] 참조.
아래에 보다 상세히 논의되는 것과 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양하고 넓은 범위의 폴리펩티드 클래스를 포함한다. 본 기술분야의 기술자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며 이들 중 일부 서브클래스가 있음(예컨대, γ1-γ4)을 이해할 것이다. 항체의 "클래스", 예컨대 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE를 결정하는 것은 이 사슬의 성질이다. 면역글로불린 서브클래스(이소형), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 잘 분석되어 있고, 기능적 특화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 클래스 및 이소형 각각의 변형된 버전은 본 개시의 관점에서 본 기술분야의 기술자가 쉽게 식별할 수 있고, 따라서 본 발명의 범위 내이다. 모든 면역글로불린 클래스가 명확히 본 발명의 범위 내이며, 하기 설명은 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 대해 주어질 것이다. IgG에 있어서, 표준 면역글로불린 분자는 분자량 약 23,000 달톤의 두 동일한 경쇄 폴리펩티드 및 분자량 53,000-70,000의 두 동일한 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 4 개 사슬은 전형적으로 경쇄가 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속 중쇄를 감싸 넣는 "Y" 배치로 이황화 결합에 의해 연결된다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄에 결합될 수 있다. 일반적으로 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되며, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 공유 이황화 연결에 의해 또는 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성되는 경우 비공유 연결에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배치의 포크형 말단의 N-말단부터 각 사슬 저부의 C-말단으로 진행된다.
경쇄 및 중쇄는 모두 구조 영역 및 기능적 상동성으로 구분된다. 용어 "불변(constant)" 및 "가변(variable)"은 기능적으로 이용된다. 이와 관련해서, 두 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부분 모두의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것이 이해될 것이다. 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특성, 예컨대 분비, 태반통과 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 관례 상, 불변 영역 도메인의 번호지정은 이들이 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더 멀어질수록 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고, C-말단 부분은 불변 영역이다; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
상기 나타낸 것과 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합할 수 있게 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 서브세트가 조합하여 3 차원 항원-결합 부위를 정의하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4 차 항체 구조는 Y의 각 팔의 말단에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원-결합 부위는 각각의 VH 및 VL 사슬 상에서 세 CDR에 의해 정의된다. TTR에 특이적으로 결합하기 충분한 구조를 함유하는 임의의 항체 또는 면역글로불린 절편은 본 명세서에서 "결합 절편" 또는 "면역특이적 절편"으로 상호교환적으로 표시된다.
천연 생성 항체에서, 항체는 때때로 각각의 항원-결합 도메인에 존재하는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 불리는 6 개의 고가변 영역을 포함하며, 이는 항체가 수성 환경에서 그 3 차원 배치를 취할 때 항원-결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 배치되는 아미노산의 짧은 비인접 서열이다. "CDR"에는 더 작은 분자간 변동성을 나타내는 4 개의 비교적 보존된 "골격" 영역 또는 "FR"이 측면에 있다. 골격 영역은 크게는 β-시트 입체형태를 채용하며, CDR은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서 골격 영역은 사슬 사이의 비공유 상호작용에 의해 정확한 배향으로 CDR의 배치를 제공하는 골격을 형성하는 작용을 한다. 배치된 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역반응성 항원 상에서 에피토프에 상보적인 표면을 정의한다. 상기 상보적 표면은 그 인지체 에피토프에 대한 항체의 비공유 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 골격 영역을 포함하는 아미노산이 정확히 정의되었으므로 본 기술분야의 통상의 기술자는 이를 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 쉽게 확인될 수 있다; ["Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E. et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917] 참조.
본 기술분야에서 이용되거나 및/또는 허용되는 용어의 둘 이상의 정의가 존재하는 경우, 본 명세서에서 이용되는 용어의 정의는 명시적으로 반대로 언급되지 않는 한 이러한 모든 의미를 포함하려는 것이다. 구체예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두의 가변 영역 내에서 확인되는 비인접 항원 조합 부위를 설명하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR")의 이용이다. 상기 특정 영역은 본 명세서에 참조로 포함된 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917]에 기재되었으며, 여기서 정의에는 서로에 대해 비교되는 경우 아미노산 잔기의 중복 또는 서브세트가 포함된다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 나타내기 위한 어느 정의의 적용도 본 명세서에서 정의되고 이용된 것과 같은 용어의 범위 내인 것으로 의도된다. 상기 언급된 각각의 참고문헌에 의해 정의된 것과 같은 CDR을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기를 비교로서 아래 표 1에 나타낸다. 특정 CDR을 포괄하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 본 기술분야의 기술자는 어느 잔기가 항체의 주어진 가변 영역 아미노산 서열에 대해 항체의 인간 IgG 서브타입의 특정한 고가변 영역 또는 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
CDR 정의1 Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1표 1에서 모든 CDR 정의의 번호지정은 Kabat et al. 에 나타낸 번호지정 관례에 따른다(아래 참조).
Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 번호지정 시스템을 정의하였다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 서열 자체를 넘는 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고 임의의 가변 도메인 서열에 대해 상기 "Kabat 번호지정" 시스템을 모호하지 않게 지정할 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 "Kabat 번호지정"은 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 나타낸 번호지정 시스템을 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에서 특정 아미노산 잔기 위치의 번호지정에 대한 언급은 Kabat 번호지정 시스템을 따르지만, 이는 이론적인 것이며 본 발명의 모든 항체에 동일하게 적용되지 않을 수 있다. 예를 들면, 제1 CDR의 위치에 따라 이후 CDR이 어느 방향으로든 이동될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 절편, 면역특이적 절편, 변이체, 또는 그의 유도체에는 비제한적으로 폴리클론, 모노클론, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 쥐과화된 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 에피토프-결합 절편, 예컨대 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, 이황화-연결된 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 절편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 절편 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예컨대, 본 명세서에 개시된 항체에 대한 항-Id 항체)가 포함된다. ScFv 분자는 본 기술분야에 공지되어 있고, 예컨대 US 특허 5,892,019에 기재된다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자일 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 5가 구조를 갖는 IgM 또는 그의 유도체가 아니다. 특히 본 발명의 특정 적용, 특히 치료적 이용에서, IgM의 5가 구조 및 친화도 성숙 부재로 인해 IgM은 종종 비특이적 교차 반응성 및 매우 낮은 친화도를 나타내므로, IgM은 IgG 및 다른 2가 항체 또는 대응하는 결합 분자에 비해 덜 유용하다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 폴리클론 항체가 아니며, 즉 혈장 면역글로불린 샘플으로부터 수득된 혼합물이기 보다는 실질적으로 하나의 특정 항체종으로 구성된다.
단일쇄 항체를 포함하는 항체 절편은 단독으로 또는 하기의 전부 또는 일부와의 조합으로 가변 영역(들)을 포함할 수 있다: 힌지(hinge) 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인. 또한 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 임의의 조합을 포함하는 TTR 결합 절편이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체 또는 그의 면역특이적 절편은 조류 및 포유류를 포함하는 임의의 동물 기원에서 유래될 수 있다. 바람직하게는 항체는 인간, 쥐과, 당나귀, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 라마, 말 또는 닭 항체이다. 다른 구현예에서, 가변 영역은 기원(예컨대, 상어)에서 콘드릭토이드(condricthoid)일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 인간으로부터 단리된 인간 모노클론 항체이다. 선택적으로, 인간 항체의 골격 영역은 데이터베이스에서 관련 인간 생식 계열 가변 영역 서열에 따라 정렬되고 채택된다; 예컨대, MRC Centre for Protein Engineering(Cambridge, UK)에서 호스팅되는 Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 참조. 예를 들면, 실제 생식 계열 서열에서 잠재적으로 일탈한 것으로 간주되는 아미노산은 클로닝 절차 동안 도입된 PCR 프라이머 서열에 기인할 수 있다. 인공적으로 생성된 인간-유사 항체, 예컨대 파지 디스플레이된 항체 라이브러리 또는 이종발생 마우스로부터의 단일쇄 항체 절편(scFv)에 비해, 본 발명의 인간 모노클론 항체는 (ⅰ) 동물 대리물에서에 비해 인간 면역 반응을 이용하여 수득됨, 즉 항체가 인체에서 그 관련 입체형태로 천연 TTR에 반응하여 생성되었음, (ⅱ) TTR의 존재 하에 개인을 보호했거나 적어도 유의미함, 및 (ⅲ) 항체가 인간 기원이므로, 자가 항원에 대한 교차 반응성 위험이 최소화됨을 특징으로 한다. 따라서 본 발명에 따르면, 용어 "인간 모노클론 항체", "인간 모노클론 자가항체", "인간 항체" 등은 인간 기원인, 즉 인간 세포, 예컨대 B 세포 또는 그의 하이브리도마로부터 단리되었거나 그 cDNA가 인간 세포, 예를 들면 인간 메모리 B 세포의 mRNA로부터 직접 클로닝된 TTR 결합 분자를 표시하기 위해 이용된다. 인간 항체는 항체에서 아미노산 치환이, 예컨대 결합 특징을 개선하기 위해 수행된 경우에도 여전히 "인간", 즉 인간-유래이다.
한 구현예에서, 본 발명의 인간-유래의 항체는 자연 발생 항체와 비교하여 예컨대 골격 영역에서의 아미노산 치환, 가변 영역에 외인성으로 융합된 불변 영역, C- 또는 N-말단에서의 상이한 아미노산 등과 같은 이종성 영역을 포함한다.
인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 유전자이식되고 아래 및 예를 들면 US 특허 제5,939,598호(Kucherlapati et al.)에 기재된 것과 같이 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 유래된 항체는 본 발명의 실제 인간 항체로부터 이들을 구별하기 위해 인간-유사 항체로 표시된다.
예를 들면, 인간-유사 항체, 예컨대 파지 디스플레이로부터 전형적으로 단리된 합성 및 반-합성 항체의 중쇄 및 경쇄의 페어링이 원래 인간 B 세포에서 일어난 것과 같은 원래 페어링을 반드시 반영하지는 않는다. 따라서 본 기술분야에서 일반적으로 이용된 것과 같은 재조합 발현 라이브러리로부터 수득된 Fab 및 scFv 절편은 면역원성 및 안정성에 대한 모든 가능한 연관 효과를 갖는 인공적인 것으로 간주될 수 있다.
대조적으로 본 발명은 선택된 인간 대상체로부터 단리된 친화도-성숙된 항체를 제공하며, 이는 인간에서 그의 치료적 유용성 및 그의 내성을 특징으로 한다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "설치류화된 항체" 또는 "설치류화된 면역글로불린"은 본 발명의 인간 항체로부터 하나 이상의 CDR; 및 설치류 항체 서열에 기반한 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 함유하는 인간 골격 영역을 포함하는 항체를 나타낸다. 설치류를 참조하면, 바람직하게는 마우스 및 래트에서 기원하는 서열이 이용되며, 여기서 상기 서열을 포함하는 항체는 각각 "쥐과화된" 또는 "래트화된" 것으로 불린다. CDR을 제공하는 인간 면역글로불린은 "부모" 또는 "수신체"로 불리며, 골격 변화를 제공하는 설치류 항체는 "공여체"로 불린다. 불변 영역이 존재할 필요는 없지만, 존재하는 경우 보통 설치류 항체 불변 영역과 실질적으로 동일하며, 즉 적어도 약 85% 내지 90%, 바람직하게는 약 95% 이상 동일하다. 따라서 일부 구현예에서, 전장 쥐과화된 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린은 마우스 불변 영역, 인간 CDR, 및 여러 "쥐과화" 아미노산 치환을 갖는 실질적으로 인간 골격을 함유한다. 전형적으로 "쥐과화된 항체"는 쥐과화된 가변 경쇄 및/또는 쥐과화된 가변 중쇄를 포함하는 항체이다. 예를 들면, 쥐과화된 항체는, 예컨대 키메라 항체의 전체 가변 영역이 비-마우스이므로 전형적인 키메라 항체를 포괄하지 않을 것이다. "쥐과화" 절차에 의해 "쥐과화된" 변형된 항체는 CDR을 제공하는 부모 항체와 동일한 항원에 결합하고, 보통 부모 항체에 비해 마우스에서 면역원성이 더 적다. "쥐과화된" 항체에 대한 상기 설명은 "설치류화된" 항체, 예컨대 "래트화된 항체"에 대해서도 유사하게 적용되며, 여기서 래트 서열이 쥐과 대신 이용된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "중쇄 부분"에는 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열이 포함된다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩티드는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: CH1 도메인, 힌지(예컨대, 상부, 중앙, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그의 변이체 또는 절편. 예를 들면, 본 발명에서 이용하기 위한 결합 폴리펩티드는 CH1 도메인; CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬, 또는 CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또한 본 발명에서 이용하기 위한 결합 폴리펩티드에는 적어도 일부 CH2 도메인(예컨대, CH2 도메인의 전부 또는 일부)이 없을 수 있다. 상기 나타낸 것과 같이, 본 기술분야의 통상의 기술자는 이들 도메인(예컨대, 중쇄 부분)이 천연 생성 면역글로불린 분자로부터의 아미노산 서열과 다르도록 변형될 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에 개시된 특정 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에서, 다량체의 하나의 폴리펩티드 사슬의 중쇄 부분은 다량체의 제2 폴리펩티드 사슬에서와 동일하다. 다른 한편으로, 본 발명의 중쇄 부분-함유 모노머는 동일하지 않다. 예를 들면, 각각의 모노머는, 예를 들면 이중특이적 항체 또는 디아바디를 형성하는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 단일 폴리펩티드 사슬, 예컨대 scFv로 이루어지며, 가능한 생체내 치료 및 진단 적용을 위해 세포내에서 발현된다(인트라바디).
본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 결합 폴리펩티드의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 중쇄 부분은 IgG1 분자에서 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자에서 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터 그리고 부분적으로 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터 그리고 부분적으로 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "경쇄 부분"에는 면역글로불린 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열이 포함된다. 바람직하게는, 경쇄 부분은 적어도 하나의 VL 또는 CL 도메인을 포함한다.
항체에 대한 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 최소 크기는 약 4 개 내지 5 개 아미노산으로 여겨진다. 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 바람직하게는 적어도 7 개, 보다 바람직하게는 적어도 9 개, 가장 바람직하게는 적어도 약 15 개 내지 약 30 개 아미노산을 함유한다. CDR이 그 3 차 형태로 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드를 인식할 수 있으므로, 에피토프를 포함하는 아미노산이 인접할 필요는 없고, 일부 경우에는 심지어 동일한 펩티드 사슬 상에 있지 않을 수도 있다. 본 발명에서, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 TTR의 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 6 개, 적어도 7 개, 보다 바람직하게는 적어도 8 개, 적어도 9 개, 적어도 10 개, 적어도 15 개, 적어도 20 개, 적어도 25 개, 또는 약 15 개 내지 약 30 개의 인접 또는 비-인접 아미노산 서열을 함유한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 이용되는 "특이적으로 결합하는", 또는 "특이적으로 인식하는"은 일반적으로 결합 분자, 예컨대 항체가 그 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하며, 결합이 항원-결합 도메인 및 에피토프 간의 일부 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 상기 정의에 따르면, 항체는 이것이 무작위 미관련 에피토프에 결합하는 것에 비해 더 쉽게 그 항원-결합 도메인을 통해 해당 에피토프에 쉽게 결합하는 경우, 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 것으로 불린다. 용어 "특이성"은 본 명세서에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적 친화도를 정량하기 위해 이용된다. 예를 들면, 항체 "A"가 항체 "B"에 비해 주어진 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수도 있고, 또는 항체 "A"가 관련된 에피토프 "D"에 대해 갖는 것에 비해 더 높은 특이성을 갖고 에피토프 "C"에 결합하는 것으로 불릴 수 있다.
존재하는 경우, 용어 "면역학적 결합 특징" 또는 항체의 항원과의 다른 결합 특징은 그 모든 문법 형태에서 항체의 특이성, 친화도, 교차 반응성 및 다른 결합 특징을 나타낸다.
"우선적으로 결합하는"이란 결합 분자, 예컨대 항체가 관련된, 유사한, 상동성 또는 유사한 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 따라서 주어진 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 이러한 항체가 관련된 에피토프와 교차 반응할 수 있는 경우라도, 관련된 에피토프에 비해 해당 에피토프에 더 잘 결합할 것이다.
비제한적 예로서, 결합 분자, 예컨대 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 작은 해리 상수(KD)로 상기 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 적어도 한 단위 크기가 작은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 적어도 2 단위가 작은 크기의 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
다른 비제한적 예에서, 결합 분자, 예컨대 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 작은 오프율(k(off))로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 한 단위가 작은 크기의 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 2 단위가 작은 크기의 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
본 명세서에 개시된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 5×10-2초-1, 10-2초-1, 5×10-3초-1 또는 10-3초-1 이하의 오프율(k(off))로 TTR 또는 그의 절편, 변이체 또는 특정 입체형태에 결합하는 것으로 불릴 수 있다. 보다 바람직하게는 본 발명의 항체는 5×10-4초-1, 10-4초-1, 5×10-5초-1, 또는 10-5초-1 5×10-6초-1, 10-6초-1, 5×10-7초-1 또는 10-7초-1 이하의 오프율(k(off))로 TTR 또는 그의 절편, 변이체 또는 특정 입체형태에 결합하는 것으로 불릴 수 있다.
본 명세서에 개시된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 항원-결합 절편, 변이체, 또는 유도체는 103M-1초-1, 5×103M-1초-1, 104M-1초-1 또는 5×104M-1초-1 이상의 속도(k(on))로 TTR 또는 그의 절편, 변이체 또는 특정 입체형태에 결합하는 것으로 불릴 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 105M-1초-1, 5×105M-1초-1, 106M-1초-1, 또는 5×106M-1초-1 또는 107M-1초-1 이상의 속도(k(on))로 TTR 또는 그의 절편, 변이체 또는 특정 입체형태에 결합하는 것으로 불릴 수 있다.
결합 분자, 예컨대 항체는 에피토프에 대한 기준 항체(reference antibody)의 결합을 어느 정도 차단하는 정도로 해당 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대해 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것으로 불린다. 경쟁적 저해는 본 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면 경쟁 ELISA 분석에 의해 결정될 수 있다. 항체는 주어진 에피토프에 대해 기준 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%만큼 경쟁적으로 저해하는 것으로 불릴 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "친화도"는 결합 분자, 예컨대 면역글로불린 분자의 CDR과 개별 에피토프의 결합 강도의 척도를 나타낸다; 예컨대, [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988), pages 27-28] 참조. 본 명세서에서 이용되는 용어 "결합력"은 면역글로불린 모집단 및 항원 사이의 복합체의 전체적 안정성, 즉 항원과 면역글로불린 혼합물의 기능적 조합 강도를 나타낸다; 예컨대, [Harlow, pages 29-34] 참조. 결합력은 특정 에피토프와 모집단 내 개별 면역글로불린 분자의 친화도 및 또한 항원과 면역글로불린의 가수에 모두 관련된다. 예를 들면, 2가 모노클론 항체 및 고도 반복 에피토프 구조, 예컨대 중합체를 갖는 항원 간의 상호작용이 높은 결합력 중 하나일 것이다. 항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다: 예를 들면 [Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992)], 및 본 명세서에 기재된 방법 참조. 항원에 대한 항체의 친화도 측정을 위한 일반 기법에는 ELISA, RIA, 및 표면 플라즈몬 공명이 포함된다. 특정한 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건, 예컨대 염 농도, pH 하에 측정되는 경우, 변할 수 있다. 따라서 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터, 예컨대 KD, IC50의 측정은 바람직하게는 표준화된 항체 및 항원 용액 및 표준화된 완충액으로 수행된다.
본 발명의 결합 분자, 예컨대 항체 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 또한 그의 교차 반응성의 관점에서 기재되거나 특정될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "교차 반응성"은 한 항원에 특이적인 항체가 제2 항원과 반응하는 능력; 두 상이한 항원 물질 간의 관련성 척도를 나타낸다. 따라서 항체는 이것이 그 형태를 유도한 것과 다른 에피토프에 결합하는 경우, 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도 에피토프와 동일한 여러 상보적 구조 특징을 함유하며, 일부 경우 실제로 원래보다 더 잘 맞을 수도 있다.
예를 들면, 특정 항체는 이들이 관련되었지만 동일하지 않은 에피토프, 예컨대 기준 에피토프에 대해 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50% 동일성(본 기술분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합한다는 점에서 어느 정도 교차 반응성을 갖는다. 항체는 이것이 기준 에피토프에 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 및 50% 이하 동일성(본 기술분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합하지 않는 경우 교차 반응성이 적거나 없는 것으로 불릴 수 있다. 항체는 이것이 임의의 다른 유사체, 오르소로그, 또는 해당 에피토프의 상동체에 결합하지 않는 경우, 특정 에피토프에 대해 "고도로 특이적"인 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 결합 분자, 예컨대 항체 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 또한 TTR 및/또는 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편에 대한 그의 결합 친화도의 관점에서 기재되거나 특정될 수 있다. 바람직한 결합 친화도에는 5×10-2 M, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M, 또는 10-15 M 이하의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것들이 포함된다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 하기 표 4에서 예시된 항체에 대해 도시된 것과 같은 상이한 TTR 아형에 대한 Kd, 즉 야생형 자연형 TTR에 대해서는 >300 nM의 Kd, 및/또는 변성된 TTR에 대해서는 ≤15 nM, 바람직하게는 ≤ 5 nM, 및 가장 바람직하게는 ≤ 2nM의 Kd, 및/또는 자연형 TTR-V30M에 대해서는 ≤ 35 nM, 바람직하게는 ≤ 20 nM의 Kd, 및/또는 TTR-L55P에 대해서는 ≤ 150 nM, 바람직하게는 ≤ 5 nM, 및 가장 바람직하게는 ≤ 2 nM의 Kd를 갖는다.
이전에 나타낸 것과 같이, 다양한 면역글로불린 클래스의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3 차원 배치는 널리 공지되어 있다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "VH 도메인"에는 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인이 포함되며, 용어 "CH1 도메인"에는 면역글로불린 중쇄의 제1(최아미노 말단) 불변 영역 도메인이 포함된다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하며 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단이다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "CH2 도메인"에는 통상적인 번호지정 방식을 이용해서 항체의 잔기 약 244 내지 잔기 360으로 연장되는 중쇄 분자 부분이 포함된다(잔기 244 내지 360, Kabat 번호지정 시스템; 및 잔기 231-340, EU 번호지정 시스템; Kabat EA et al., op. cit 참조). CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접히 페어링되지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려 두 N-연관된 분기쇄 탄수화물 사슬이 온전한 천연 IgG 분자의 두 CH2 도메인 사이에 배치된다. 또한 CH3 도메인은 CH2 도메인으로부터 IgG 분자의 C-말단으로 연장되며 약 108 개 잔기를 포함하는 것이 잘 보고되어 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "힌지 영역"에는 CH1 도메인을 CH2 도메인으로 연결하는 중쇄 분자 부분이 포함된다. 상기 힌지 영역은 약 25 개 잔기를 포함하며 가요성이므로, 두 N-말단 항원-결합 영역이 독립적으로 움직일 수 있게 한다. 힌지 영역은 3 개별 도메인: 상부, 중앙, 및 하부 힌지 도메인으로 하위 구분될 수 있다; [Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083-4090] 참조.
본 명세서에서 이용되는 용어 "이황화 결합"에는 두 황 원자 간에 형성된 공유 결합이 포함된다. 아미노산 시스테인은 제2 티올기와 이황화 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 대부분의 천연 생성 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 이황화 결합에 의해 연결되며, 두 중쇄는 Kabat 번호지정 시스템을 이용해서 239 내지 242(위치 226 또는 229, EU 번호지정 시스템)에 대응하는 위치에서 두 이황화 결합에 의해 연결된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호교환적으로 이용된다. 이들 용어는 화학적 콘주게이션(conjugation) 또는 재조합 수단을 포함하는 어떠한 수단에 의해서든 둘 이상의 요소 또는 성분을 함께 연결하는 것을 나타낸다. "틀내 융합(in-frame fusion)"은 원래 ORF(open reading frame)의 정확한 번역 해독틀을 유지하는 방식으로 연속적이고 더 긴 ORF를 형성하기 위한 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 개방 해독틀(ORF)의 연결을 나타낸다. 따라서 재조합 융합 단백질은 원래 ORF에 의해 암호화된 폴리펩티드에 대응하는 둘 이상의 절편(이 절편이 보통 자연적으로 이렇게 연결되지 않음)을 함유하는 단일 단백질이다. 따라서 해독틀은 융합된 절편을 통해 연속적으로 제조되지만, 절편은 예를 들면 틀내 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 가변 영역의 CDR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 틀내 융합될 수 있지만, "융합된" CDR이 연속적 폴리펩티드의 일부로 공-번역되는 한, 적어도 하나의 면역글로불린 골격 영역 또는 추가적인 CDR 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "발현"은 유전자가 생화학 물질, 예를 들면 RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 절차를 나타낸다. 이 절차에는 비제한적으로 유전자 낙다운(knockddown)뿐만 아니라 일시적 발현 및 안정한 발현 모두를 포함하는, 세포 내에서 유전자의 기능적 존재의 임의의 표시가 포함된다. 이는 비제한적으로 유전자의 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 작은 헤어핀(small hairpin) RNA(shRNA), 작은 간섭(small interfering) RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 전사 및 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 번역이 포함된다. 원하는 최종 산물이 생화학 물질인 경우, 발현에는 해당 생화학 물질 및 임의의 전구체의 생성이 포함된다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본 명세서에서 이용되는 유전자 산물은 핵산, 예컨대 유전자의 전사에 의해 생산되는 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 본 명세서에 기재된 유전자 산물에는 전사 후 변형, 예컨대 폴리아데닐화를 갖는 핵산 또는 번역 후 변형, 예컨대 메틸화, 글리코실화, 지질 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 연관, 단백질분해 절단 등을 갖는 폴리펩티드가 추가로 포함된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 "샘플"은 대상체 또는 환자로부터 수득된 임의의 생물학적 물질을 나타낸다. 한 측면에서, 샘플은 혈액, 복수, CSF, 침 또는 소변을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 혈액 샘플에서 농축된 B 세포 및 배양된 세포(예컨대, 대상체로부터의 B 세포)를 포함할 수 있다. 샘플에는 또한 생검 또는 신경 조직을 포함하는 조직 샘플이 포함될 수 있다. 다른 측면에서, 샘플은 전체 세포 및/또는 세포의 용해물을 포함할 수 있다. 혈액 샘플은 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 수집될 수 있다. 한 측면에서, 펠렛은 200㎕ 완충액(20 mM Tris, pH 7.5, 0.5% Nonidet, 1 mM EDTA, 1mM PMSF, 0.1 M NaCl, 1× Sigma 프로테아제 저해제, 및 1× Sigma 포스파타아제 저해제 1 및 2) 중 4℃에서 볼텍싱(vortexing)에 의해 재현탁될 수 있다. 현탁액은 간헐적 볼텍싱과 함께 20 분 동안 얼음 상에 유지될 수 있다. 약 4℃에서 5 분 동안 15,000×g로 회전시킨 뒤 상등액의 분취물을 약 -70℃에 보관할 수 있다.
질환:
달리 언급되지 않는 한, 용어 "장애(disorder)" 및 "질환(disease)"은 본 명세서에서 상호교환적으로 이용되며, 대상체, 동물, 단리된 기관, 조직 또는 세포/세포 배양에서 임의의 원하지 않는 생리학적 변화를 포함한다.
트랜스티레틴(TTR) 아밀로이드증은 TTR 단백질의 구조적(즉, 입체형태적) 변화의 결과로서 다양한 조직에서 TTR 단백질의 비정상적 침적에 의해 특정되는 많은 상이한 질환에서 작동하는 병리생리학적 메커니즘이다. 접힘오류화 및 조립오류화 TTR 단백질은 독성이고, 종종 TTR 유전자에서의 돌연변이의 결과로서 발생한다. 접힘오류화 TTR 독성은 국소 조직의 손상을 유도하고, 시간의 경과에 따라 축적되면 기관의 기능부전 및 심지어 기관의 부전을 유도할 수 있다. 말초 및 자율 신경계, 심장, 연수막, 눈, 힘줄, 인대 또는 신장과 같은 TTR 아밀로이드증에 민감한 많은 종류의 조직 및 기관이 있다. TTR 아밀로이드증에 의해 영향을 받을 수 있는 조직의 범위가 넓은 것은 TTR 아밀로이드증을 갖는 환자가 나타내는 징후가 다양한 이유이다. 사실, TTR 아밀로이드증을 갖는 환자는 TTR 아밀로이드증에 의해 가장 많이 영향받는 조직 또는 기관 및 대응하는 징후에 따라 임상적으로 상이한 질환을 앓는 것으로 카테고리화된다.
이를 근거로, TTR 아밀로이드증은 말초 및 자율 신경계가 1 차적으로 영향을 받고 환자들은 대체로 통증, 감각이상(paresthesia), 근육 약화 및 자율 기능부전을 나타내는 신경병의 형태로 분류되어 왔다. 또한, 심장이 1 차적으로 영향을 받고 환자들은 대체로 기립성(orthostatic) 저혈압 또는 고혈압, 부정맥 및 심장비대를 나타내는 심장 형태의 TTR 아밀로이드증이 있다. 상기 2 가지 형태는 상호 배타적이지 않으며, 많은 환자들은 상기 2 가지의 조합을 보여준다. TTR 아밀로리드증이 다른 조직에 영향을 미치면, 유리체 혼탁, 안구건조증 또는 녹내장, 단백뇨, 고티록신혈증, 수근관 증후군 또는 자간전증을 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 항체, 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 분자, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 및/또는 펩티드는 TTR 아밀로이드증의 예방적 및/또는 치료적 처치를 위한 약학적 또는 진단적 조성물의 제조, 질환 진행 및/또는 치료 반응의 모니터링, 및 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP), 가족성 아밀로이드 심근병증(FAC), 노인 전신성 아밀로이드증(SSA), 알츠하이머 질환을 포함하는 연수막/중추 신경계(CNS) 아밀로이드증, 눈 아밀로이드증, 신장 아밀로이드증, 고티록신혈증, 수근관 증후군, 회전 근개 파열 및 허리뼈 관 협착증, 및 자간전증을 포함하는 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환의 진단을 위해 사용된다.
치료:
본 명세서에서 이용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 나타내며, 여기서 목적은 원하지 않는 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 심장 결함의 발생을 예방하거나 완화(경감)시키는 것이다. 유익하거나 원하는 임상적 결과에는 비제한적으로 검출 가능하건 검출 불가능하건, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 안정화된(즉 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 완화 또는 경감, 및 진정(부분적이건 전체적이건)이 포함된다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존에 대비한 생존의 연장을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 자들에는 이미 상태 또는 장애를 갖는 자들뿐만 아니라 상태 또는 장애를 갖기 쉬운 자들 또는 상태 또는 장애의 발현이 예방되어야 하는 자들이 포함된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "약물", "의약" 또는 "약제"는 본 명세서에서 상호교환적으로 이용되며, 비제한적으로 모든 (A) 내용 또는 외용을 위한, 인간 또는 다른 동물의 질환의 진단, 치유, 완화, 치료, 또는 예방을 위해 이용되기 위한 물품, 의약 및 제조물 및 임의의 물질 또는 물질의 혼합물; 및 (B) 인간 또는 다른 동물의 신체 구조 또는 임의의 기능에 영향을 미치기 위한 물품, 의약 및 제조물(음식 이외); 및 (C) 조항 (A) 및 (B)에 명시된 임의의 물품의 성분으로 이용하기 위한 물품이 포함되어야 한다. 용어 "약물", "의약" 또는 "약제"에는 충전제, 붕해제, 윤활제, 활택제, 결합제로서 하나 이상의 "제제", "화합물", "물질" 또는 "(화학적) 조성물"을 또는 일부 다른 맥락에서는 다른 약학적 불활성 부형제를 함유하거나 인간 또는 다른 동물의 신체 내의 의도하는 표적 위치, 예컨대 피부, 위 또는 내장에서 "약물", "의약" 또는 "약제"의 용이한 수송, 붕해, 분해, 용해 및 생물학적 이용 가능성을 보장하는 인간 또는 다른 동물에서의 이용을 위한 제조물의 전체 제형물이 포함되어야 한다. 용어 "제제", "화합물", 또는 "물질"은 본 명세서에서 상호교환적으로 이용되며, 보다 구체적인 맥락에서는 비제한적으로 모든 약리 활성 제제, 즉 원하는 생물학적 또는 약리적 효과를 유도하거나 본 발명의 방법에 의해 이러한 가능한 약리적 효과를 유도할 가능성에 대해 연구되거나 평가되는 제제가 포함되어야 한다.
"대상체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 그에 대한 진단, 예진, 예방, 또는 치료법을 원하는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체, 예컨대 인간 환자를 의미한다.
약학적 담체 :
약학적으로 허용가능한 담체 및 투여 경로는 본 기술분야의 기술자에게 공지된 해당 문헌에서 취해질 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다; 예를 들면 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472, Vaccine Protocols. 2nd Edition by Robinson et al., Humana Press, Totowa, New Jersey, USA, 2003; Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems. 2nd Edition by Taylor and Francis (2006), ISBN: 0-8493-1630-8] 참조. 적합한 약학적 담체의 예는 본 기술분야에 널리 공지되어 있고 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 수화제, 멸균 용액 등이 포함된다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 적합한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식으로 시행될 수 있다. 예에는 경구, 비강내, 직장, 국소, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 경피, 수막내 및 두개내 방법을 통한 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 조성물의 투여가 포함된다. 에어로졸 제형, 예컨대 비강 스프레이 제형에는 활성 제제의 정제된 수성 또는 다른 용액이 보존제 및 등장화제와 함께 포함된다. 이러한 제형은 바람직하게는 비강 점막에 상용성인 pH 및 등장성 상태로 조정된다. 경구 투여를 위한 약학적 조성물, 예컨대 단일 도메인 항체 분자(예컨대, "nanobodies™") 등도 본 발명에서 고려된다. 이러한 경구 제형은 정제, 캡슐, 분말, 액체 또는 반고체 형태일 수 있다. 정제는 고형 담체, 예컨대 젤라틴 또는 보강제를 포함할 수 있다. 직장 또는 질 투여를 위한 제형은 적합한 담체와의 좌약으로 제공될 수 있다; 또한 [O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727-735] 참조. 다양한 투여 유형에 적합한 제형에 관한 추가 지침은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)] 및 해당 업데이트에서 찾아볼 수 있다. 약물 전달을 위한 방법의 간략한 리뷰에 대해서는 [Langer, Science 249 (1990), 1527-1533] 참조.
Ⅱ. 본 발명의 항체
본 발명은 일반적으로 인간-유래의 항-TTR 항체 및 그의 항원-결합 절편에 관한 것으로, 이는 바람직하게는 실시예에 예시된 항체에 대해 개요된 것과 같은 면역학적 결합 특징 및/또는 생물학적 특성을 나타낸다. 본 발명에 따르면, TTR에 특이적인 인간 모노클론 항체가 건강한 인간 대상체의 풀로부터 클로닝되었다. 그러나, 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 인간 모노클론 항-TTR 항체는 또한 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환 및/또는 장애의 징후를 보여주는 환자로부터 클로닝될 수 있다.
본 발명에 따라 수행된 실험 과정에서, 배양된 인간 메모리 B 세포의 컨디셔닝된 배지 내에 존재하는 항체는 TTR 및 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 10 가지 이상의 다른 단백질에 대해 결합하는 능력에 대해 평가되었다. 스크리닝에서 상기 TTR 단백질에는 결합하지만 어떠한 다른 단백질에도 결합하지 않는 B-세포 상등액만이 항체의 클래스 및 경쇄의 서브클래스의 결정을 포함하는 추가적인 분석을 위해 선택되었다. 이후, 선택된 B-세포를 항체 클로닝을 위해 처리하였다.
간략하게, 이것은 상기 선택된 B-세포로부터의 메신저 RNA의 추출, RT-PCR에 의한 역전사, PCR에 의한 항체-코딩 영역의 증폭, 플라스미드 벡터 내로의 클로닝 및 서열분석으로 이루어진다. 이후, 선택된 인간 항체는 HEK293 또는 CHO 세포에서의 재조합 발현에 의해 생산 및 정제되고, 이어서 인간 TTR 단백질에 결합하는 능력에 대해 특성분석된다. 다양한 테스트들의 조합, 예컨대 HEK293 또는 CHO 세포에서의 항체의 재조합 발현 및 후속하는 인간 TTR 단백질에 대한 결합 특이성의 특성분석, 및 그의 병리학적으로 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 형태에 대한 구별된 결합은 처음으로 TTR에 대해 매우 특이적이고, TTR 섬유와 같은 TTR 단백질의 병리학적으로 응집된 형태를 구별적으로 인식하고 선택적으로 결합하는 인간 항체가 클로닝되었음을 확인하였다. 어떤 경우에 있어서, 본 발명의 인간 항체의 가변 도메인에 기초하여 마우스 키메라 항체가 또한 생성되었다. 상기 마우스 키메라 항체는 도 6, 도 9 및 실시예 4 및 실시예 8에 나타낸 것과 같이 인간 TTR에 대해 인간 항체와 동일한 결합 친화도, 특이성 및 선택성을 나타내었다.
따라서, 본 발명은 일반적으로 재조합 인간-유래의 모노클론 항-TTR 항체 및 그의 결합 절편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 항체는 TTR에 결합할 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 항-TTR 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에 대한 것으로, 여기서 항체는 NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 및 NI-301.12D3로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 항체와 동일한 TTR의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 에피토프 맵핑은 본 발명의 항체 NI-301.59F1에 의해 인식되는 독특한 선형 에피토프로 아미노산 61-EEEFVEGIY-69(서열번호 49)를 포함하는 인간 TTR 내의 서열, 본 발명의 항체 NI-301.35G11에 의해 인식되는 독특한 선형 에피토프로 아미노산 53-GELHGLTTEEE-63(서열번호 50)을 포함하는 인간 TTR 내의 서열, 및 항체 NI-301.37F1에 의해 인식되는 독특한 선형 에피토프로 아미노산 41-WEPFA-45(서열번호 51)를 포함하는 인간 TTR 내의 서열을 확인하였다(도 10 및 실시예 9 참조). 따라서 한 구현예에서, 본 발명의 항체가 제공되며, 여기서 항체는 아미노산 서열 EEEFVEGIY(서열번호 49), GELHGLTTEEE(서열번호 50) 또는 WEPFA(서열번호 51)을 포함하는 TTR 에피토프에 특이적으로 결합한다.
상기 문맥에서, 실시예 9에 설명된 것과 같이, 예시적인 항체 NI-301.59F1, NI301.35G11 및 NI-301.37F1의 결합 에피토프는 15 개 아미노산 길이이고 11 개 아미노산이 중첩되는 29 개의 순차적인 펩티드의 패널을 이용해 분석되었고(즉, 제1 펩티드 TTRaa1 -15; 제2 펩티드 TTRaa5 -19; 등), 여기서 항체 NI-301.59F1 및 301.35G11은 각각 2 개의 중첩하는 펩티드(15 및 16) 및 (13 및 14)를 인식하고, 항체 NI-301.37F1은 3 개의 중첩하는 펩티드(9, 10 및 11)를 인식한다; 실시예 9 및 도 10 참조.
따라서, 성숙한 TTR 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 대응하는 펩티드 맵핑과 관련하여, 이것은 에피토프 EEEFVEGIY(서열번호 49)에 결합하는 항체 NI-301.59F1이 아미노산 서열 GLTT EEEFVEGIY KV(서열번호 85) 및 EEEFVEGIY KVEIDT(서열번호 86)을 갖는 펩티드를 인식할 수 있음을 의미한다.
마찬가지로, 에피토프 GELHGLTTEEE(서열번호 50)에 결합하는 항-TTR 항체 NI-301.35G11은 아미노산 서열 TSES GELHGLTTEEE(서열번호 87) 및 GELHGLTTEEE FVEG(서열번호 88)을 갖는 펩티드를 인식할 수 있다.
유사하게, 에피토프 WEPFA(서열번호 51)에 결합하는 항-TTR 항체 NI-301.37F1은 아미노산 서열 FRKAADDT WEPFA SG(서열번호 89), ADDT WEPFA SGKTSE(서열번호 90) 및 WEPFA SGKTSESGEL(서열번호 91)을 갖는 펩티드를 인식할 수 있다.
따라서, 실시예에서 나타낸 본 발명의 대상체 항체는 문맥에서 추가적인 N- 및/또는 C-말단 아미노산만을 갖는 전술한 임의의 에피토프를 인식하는 항체와 상이하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 아미노산 서열 EEEFVEGIY(서열번호 49), GELHGLTTEEE(서열번호 50) 또는 WEPFA(서열번호 51)을 포함하는 TTR 에피토프에 대한 항-TTR 항체의 특이적인 결합은 실시예 9 및 도 10a 내지 도 10d에 따라 15 개 아미노산 길이이고 11 개 아미노산의 중첩되는 순차적인 펩티드를 이용해 결정된다.
상기 문맥에서, 각각의 펩티드에 대하여 위치 10에서의 아미노산은 비-알라닌 아미노산의 경우에는 알라닌으로 교체되고, 알라닌은 글리신 또는 프롤린으로 교체된, 본 발명에 따라 수행되고 15 개 아미노산 길이이고 14 개 아미노산이 중첩되는 151 개의 순차적인 펩티드의 패널을 이용하여 실시예 9에 개시되어 있는 연장된 에피토프 맵핑은 항체 NI-301.59F1은 에피토프 EEFXEGIY(TTRaa61-68)에 결합하고, 항체 NI-301.35G11은 ELXGLTXE(TTRaa54-61)에 결합하지만, 항체 NI-301.37F1의 에피토프에 대해서는 추가적인 서열 요구사항이 결정되지 않았음을 밝혔다. 따라서, 다른 구현예에서, 해당 항체가 항체 NI-301.59F1, NI301.35G11 및 NI-301.37F1과 동일한 에피토프에 결합하는지 여부에 대한 결정이 실시예 9 및 도 10e 내지 도 10h에 따라 수행되었다.
에피토프 맵핑 및 해당 항체가 실시예 9 및 도 10에서 사용된 대상체 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부의 결정은 또한 도 1a 내지 도 1t에 묘사된 가변 영역을 갖는 실시예들에 개시된 본 발명의 임의의 다른 항-TTR 항체에 적용될 수 있음은 자명하다.
따라서, 본 발명은 일반적으로 적어도 도 1a 내지 도 1t의 임의의 하나에 나타낸 것과 같은 CDR 및/또는 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 갖는 임의의 항-TTR 항체 및 실시예에 나타낸 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체-유사 분자에 관한 것이다.
추가적인 구현예에서, 상기 항체는 아미노산 서열 GELHGLTTEEE(서열번호 50)에는 특이적으로 결합하지만, TTR-L55P 돌연변이 에피토프에 해당하는 GELHGPTTEEE에는 결합하지 않거나, 또는 상기 항체는 아미노산 서열 WEPFA(서열번호 51)에는 특이적으로 결합하지만, TTR-E42G 돌연변이 에피토프에 해당하는 WGPFA에는 결합하지 않는다.
또한, 실시예 3 내지 실시예 8에 나타내고 도 2, 도 3, 도 4, 도 7 및 도 9에 나타낸 것과 같은 초기 실험 관찰에 구애받지 않으면서, 본 발명의 인간 모노클론 NI-301.59F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1 항-TTR 항체는 바람직하게는 병리학적 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR에 특이적으로 결합하고 생리학적 형태의 TTR은 실질적으로 인식하지 않는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명은 특히 진단 및 치료 목적에 유용한 결합 특성을 갖는 인간 항-TTR 항체의 세트를 제공한다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 TTR의 병리학적으로 응집된 형태에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 실시예에 기재된 것과 같이 예시적인 NI-301.59F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1 항체의 결합 특성을 나타낸다. 본 발명의 항-TTR 항체는 생리학적 TTR 보다는 병리학적으로 변경된 TTR, 예컨대 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및 그의 절편을 우선적으로 인식한다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 생리학적 TTR 종을 실질적으로 인식하지 않는다.
용어 "실질적으로 인식하지 않는다"는 본 출원에서 항체, 그의 절편 또는 특정 표적 분자, 항원 및/또는 표적 분자 및/또는 항원의 입체형태에 특이적인 결합 분자를 포함하는 그룹의 분자의 결합 친화도를 설명하기 위해 이용되는 경우, 전술한 그룹의 분자가 다른 분자, 항원 및/또는 입체형태에 결합하기 위한 전술한 그룹의 분자의 결합 친화도에 비해 적어도 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배 또는 9 배 더 작은 결합 친화도로 상기 분자, 항원 및/또는 입체형태에 결합함을 의미한다. 매우 자주 해리 상수(KD)가 상기 결합 친화도의 측정으로서 사용된다. 때때로, 이것은 예를 들면 결합 친화도의 측정으로서 사용되는 ELISA 분석과 같은 특정 분석에서의 EC50이다. 바람직하게는 용어 "실질적으로 인식하지 않는다"는 본 출원에서 이용되는 경우, 전술한 그룹의 분자가 다른 분자, 항원 및/또는 입체형태에 결합하기 위한 전술한 그룹의 상기 분자의 결합 친화도에 비해 적어도 10 배, 20 배, 50 배, 100 배, 1,000 배 또는 10,000 배 이하인 결합 친화도로 상기 분자, 항원 및/또는 입체형태에 결합함을 의미한다.
부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항-TTR 항체는 질환을 유도하는 인간 TTR의 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 형태에 결합한다. 상기 맥락에서, 결합 친화도는 도 2, 각각의 도 10에서 예시적인 NI-301.59F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1 항체에 대해 나타낸 것과 같은 범위일 수 있으며, 즉 NI-301.59F1 및 NI-301.35G11에 대해 나타낸 것과 같이 인간 응집된 TTR 및 응집된 재조합 TTR에 대해 약 1 pM 내지 500 nM의 절반 최대 유효 농도(EC50), 바람직하게는 약 50 pM 내지 100 nM의 EC50, 가장 바람직하게는 약 1 nM 내지 20 nM의 EC50을, 또는 NI-301.37F1에 대해 나타낸 것과 같이 인간 응집된 TTR 및 응집된 재조합 TTR에 대해 약 100 pM 내지 1 nM의 EC50을 가질 수 있다.
특히, 상기 항-TTR 항체, 그의 결합 절편 또는 유도체는 응집된 야생형의 결합에 대해 ≤ 5 nM의 EC50 값 및/또는 응집된 V30M-TTR의 결합에 대해 ≤ 20 nM, 바람직하게는 ≤ 10 nM 및 가장 바람직하게는 ≤ 1 nM의 EC50에 해당하는 결합 친화도를 갖는다. 실시예 3 및 도 2 참조.
일부 항체는 광범위한 어레이의 생체분자, 예컨대 단백질에 결합한다. 본 기술분야의 기술자가 이해하는 것과 같이, 용어 특이적은 TTR 단백질 또는 그의 절편이 아닌 다른 생체분자가 항원-결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체 중 하나에 특이적으로 결합하지 않음을 나타내기 위해 본 명세서에서 이용된다. 바람직하게는 TTR 이외의 생체분자에 대한 결합 레벨은 각각 TTR에 대한 친화도의 단지 최대 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 2% 이하 또는 단지 1% 이하(즉 적어도 5, 10, 20, 50 또는 100 배 더 낮거나, 이를 상회하는 임의의 것)인 결합 친화도를 일으킨다; 예컨대, 도 2 참조.
한 구현예에서, 본 발명의 항-TTR 항체는 응집된 형태의 TTR, 접힘오류화 TTR, 조립오류화 TTR 및/또는 그의 절편, 유도체, 섬유 및/또는 올리고머에 우선적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항-TTR 항체는 자연형 TTR 및 병리학적으로 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 형태의 TTR에 우선적으로 결합한다.
전술한 것과 같이, 무정형 및 아밀로이드 TTR 침적물은 신체에서 상기 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 종 또는 그의 절편이 어디에서 발생하는지에 따라 상이한 질환을 유도할 수 있다. 예를 들면, 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP)을 갖는 환자는 주로 작은 직경의 신경 섬유에서 침적되고, 따라서 1 차적으로 위장관 기능부전 또는 발기부전을 포함하는 변경된 감각 인식 및 자율 기능부전과 같은 징후를 나타낸다; 가족성 아밀로이드 심근병증(FAC) 또는 노인 전신성 아밀로이드증(SSA)을 갖는 환자는 2 차적으로 심장에서 침적되며, 따라서 심부전 또는 심부정맥과 같은 징후를 나타낸다; 신장에서의 TTR 침적을 갖는 환자는 신장 기능부전 및 단백뇨를 나타낼 수 있다.
따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FFAP), 가족성 아밀로이드 심근병증(FAC), 노인 전신성 아밀로이드증(SSA), 전신 가족성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환을 포함하는 연수막/중추 신경계(CNS) 아밀로이드증, 눈 아밀로이드증, 신장 아밀로이드증, 고티록신혈증, 수근관 증후군, 회전 근개 파열 및 허리뼈 관 협착증을 포함하는 인대 아밀로이드증, 및 자간전증, 및 이들의 징후의 치료에 유용하다.
본 발명은 또한 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체로 이어지며, 여기서 항체는 NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 및 NI-301.14C3로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 동일한 항원-결합 도메인을 포함한다.
본 발명은 몇몇 결합 분자, 예컨대 항체 및 그의 결합 절편을 추가로 예시하며, 이는 그의 가변 영역, 예컨대 도 1에 도시된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 VH 및/또는 VL 가변 영역의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)의 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 확인된 가변 영역을 암호화하는 대응 뉴클레오티드 서열을 아래의 표 2에 나타낸다. VH 및/또는 VL 영역의 상기 아미노산 서열의 CDR의 예시적인 세트를 도 1에 도시한다. 그러나 아래에서 논의되는 것과 같이, 본 기술분야의 기술자는 부가적으로 또는 대안적으로 도 1에 나타낸 그의 아미노산 서열이 1, 2, 3 또는 CDR2 및 CDR3의 경우 더 많은 아미노산만큼 상이한 CDR이 이용될 수 있다는 사실을 잘 인지한다. 따라서 한 구현예에서, 도 1에 도시된 것과 같은 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 그의 하나 이상의 CDR을 그 가변 영역에 포함하는 본 발명의 항체 또는 그의 TTR-결합 절편이 제공된다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 도 1에 도시된 것과 같은 VH 및/또는 VL 영역 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 그의 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중 임의의 하나이다. 바람직하게는 본 발명의 항체는 인간 B-세포에 존재하는 것과 같은 중쇄 및 경쇄의 인지체 페어링의 보존을 특징으로 한다.
본 발명의 추가적인 구현에에서, 상기 항-TTR 항체, TTR-결합 절편, 그의 합성 또는 생명공학적 변이체는 표적에 대한 적절한 결합 친화도 및 약동학적 특성을 갖도록 최적화될 수 있다. 따라서, 글리코실화, 산화, 디아민화, 펩티드 결합 절단, 이소-아스파테이트 형성 및/또는 쌍이없는 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형이 되기 쉬운 CDR 또는 가변 영역 내의 적어도 하나의 아미노산은 이러한 변경이 없는 돌연변이된 아미노산에 의해 치환되거나, 적어도 하나의 탄수화물 모이어티(moiety)가 결실 또는 화학적 또는 효소적으로 항체에 부가된다. 아미노산 최적화에 대한 예는 예컨대 국제 출원 WO2010/121140 및 WO2012/049570에서 발견될 수 있다. 항체 특성을 최적화하기 위한 추가적인 변형은 [Gavel et al., Protein Engineering 3 (1990), 433-442] 및 [Helenius et al., Annu. Rev. Biochem. 73 (2004), 1019-1049]에 개시되어 있다.
다른 한편으로, 본 발명의 항체는 항체 또는 그의 항원-결합 절편, 유도체 또는 변이체이며, 이는 도 1a 내지 도 1t 중 어느 하나에 도시된 것과 같은 VH 및/또는 VL 영역을 갖는 항체의 적어도 하나와 TTR에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
도 2 및 실시예 3에 제공된 실험 결과는 본 발명의 항-TTR 항체 중 일부가 생리학적 형태의 단백질보다 질환을 유도하는 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 형태의 인간 항-TTR에 우선적으로 결합함을 제시한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 생리학적 TTR보다 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 및/또는 그의 절편 및/또는 유도체를 우선적으로 인식한다.
본 발명의 항체는 인간, 특히 치료적 적용을 위한 것일 수 있다. 다른 한편으로, 본 발명의 항체는 특히 동물에서 진단 방법 및 연구에 유용한 설치류, 설치류화된 또는 키메라 설치류-인간 항체, 바람직하게는 쥐과, 쥐과화된 또는 키메라 쥐과-인간 항체 또는 래트, 래트화된 또는 키메라 래트-인간 항체이다. 한 구현예에서, 본 발명의 항체는 키메라 설치류-인간 또는 설치류화된 항체이다.
또한 한 구현예에서, 인간 항체, 예컨대 NI-301.35G11의 가변 도메인 및 일반적인 쥐과 경쇄 및 중쇄 불변 도메인을 포함하는 본 발명의 키메라 항체는 실시예에 기재된 것과 같이 예시적인 NI-301.mur35G11 쥐과 키메라 항체의 결합 특성을 나타낸다. 또한 본 발명의 마우스 키메라 항체는 실시예 4 및 실시예 8에 기재된 것과 같이 인간 TTR에 높은 친화도로 결합한다. 바람직하게는 키메라 항체의 결합 친화도는 그의 인간 대응물과 유사하다.
한 구현예에서, 배양된 단일 또는 올리고클론 B-세포의 배양에 의해 본 발명의 항체가 제공되며, 상기 B-세포에 의해 생산된 항체를 함유하는 배양 상등액이 내부의 항-TTR 항체의 존재 및 친화도에 대해 스크리닝된다. 스크리닝 절차는 합성 전장 hTTR 펩티드에서 유래되거나, 예컨대 인간 혈장으로부터 정제되거나 재조합 발현된 hTTR의 천연 모노머, 섬유상 또는 비섬유상 응집체, 예컨대 올리고머에 대한 결합에 대한 스크리닝을 포함한다.
부가적으로 또는 대안적으로, 항-TTR 항체의 존재 및 친화도에 대한 스크리닝 절차는 감수성 조직 아밀로이드 플라크 면역반응성(TAPIR) 분석의 단계, 예컨대 그 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 출원 WO2004/095031에 개시된 단계를 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 항-TTR에 대한 결합에 대한 신장, 심장 섹션 상의 스크리닝, 예컨대 뇌 및 척추 섹션에 대한 국제 출원 WO2008/081008에 유사하게 기재된 스크리닝이 수행될 수 있다.
전술한 것과 같이, 인간 면역 반응시 그 생성으로 인해, 본 발명의 인간 모노클론 항체는 특정한 병리학적 관련성이 있고, 예를 들면 각각 마우스 모노클론 항체의 생성 및 파지 디스플레이 라이브러리의 시험관내 스크리닝을 위한 면역화 절차의 경우 접근 가능하지 않거나 덜 면역원성일 수 있는 에피토프를 인식할 것이다. 따라서 본 발명의 인간 항-TTR 항체의 에피토프가 독특하고 본 발명의 인간 모노클론 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합할 수 있는 다른 항체가 존재하지 않음을 명기하는 것이 신중하다; 또한 도 10 참조. 본 발명의 항체의 고유성에 대한 추가 시사는 실시예 8에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 항체 NI-301.59F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1이 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 입체형태에 특이적인 에피토프에 결합한다는 점이며, 이는 상기 나타낸 것과 같이 특정한 병리학적 관련성이 있고, 항체 생성을 위한 일반 절차, 예컨대 면역화 또는 시험관내 라이브러리 스크리닝에 의해 잘 수득가능하지 않을 수 있다.
따라서 한 구현예에서, 본 발명은 또한 일반적으로 TTR에 대한 특이적 결합에 대해 본 발명의 인간 모노클론 항체와 경쟁하는 항-TTR 항체 및 TTR-결합 분자로 연장된다. 본 발명은 보다 특이적으로 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에 대한 것이며, 여기서 항체는 NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 및/또는 NI-301.12D3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 항체와 동일한 TTR의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
또한 한 구현예에서, 본 발명은 또한 일반적으로 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 종 또는 그의 절편에 대한 특이적 결합에 대해 본 발명의 인간 모노클론 항체와 경쟁하는 항-TTR 항체 및 TTR-결합 분자로 연장된다. 따라서 본 발명은 보다 구체적으로 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에 대한 것이며, 여기서 항체는 NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 및/또는 NI-301.12D3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 항체와 동일한 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 그의 절편의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
항체 간의 경쟁은 시험 하의 면역글로불린이 공통 항원, 예컨대 TTR에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 저해하는 분석에 의해 결정된다. 여러 유형의 경쟁적 결합 분석, 예를 들면 하기가 공지되어 있다: 고상 직접적 또는 간접적 방사선면역분석(RIA), 고상 직접적 또는 간접적 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석; [Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253] 참조; 고상 직접적 바이오틴-애비딘 EIA; [Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619 및 Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552] 참조; 고상 직접적 표지 분석, 고상 직접적 표지 샌드위치 분석; [Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)] 참조; I125 표지를 이용하는 고상 직접적 표지 RIA; [Morel et al., Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 및 Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82] 참조. 전형적으로 이러한 분석에는 정제된 TTR 또는 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR, 예컨대 이들 미표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린, 즉 본 발명의 인간 모노클론 항체를 보유하는 고형 표면 또는 세포에 결합된 그의 올리고머 및/또는 섬유의 이용이 관여된다. 경쟁적 저해는 시험 면역글로불린의 존재 하에 고형 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양 결정에 의해 측정된다. 보통 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 바람직하게는 경쟁적 결합 분석은 첨부된 실시예에서 ELISA 분석에 대해 기재된 것과 같은 조건 하에 수행된다. 경쟁적 분석에 의해 확인된 항체(경쟁 항체)에는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 입체 장애가 일어나도록 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체가 포함된다. 보통 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 50% 또는 75% 저해할 것이다. 따라서 본 발명은 추가로 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에 대한 것으로, 여기서 항체는 TTR에 대한 결합으로부터 NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-305.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI.301.44E4, NI-301.18C4 NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 및/또는 NI-301.14C3으로 이루어진 군으로부터 선택된 기준 항체를 경쟁적으로 저해한다.
또한, 본 발명은 추가로 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에 대한 것으로, 여기서 항체는 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 그의 절편에 대한 결합으로부터 NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-305.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.44E4 NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 및/또는 NI-301.14C3으로 이루어진 군으로부터 선택된 기준 항체를 경쟁적으로 저해한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역의 VH-CDR의 적어도 하나 또는 중쇄 가변 영역의 VH-CDR의 적어도 둘은 본 명세서에 개시된 항체의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 다른 한편으로, VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 본 명세서에 개시된 항체의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 각각 도 1에 나타낸 군에 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다. 도 1은 Kabat 시스템에 의해 정의된 VH-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 정의, 예컨대 Chothia 시스템에 의해 정의된 VH-CDR도 본 발명에 포함되며, 도 1에 나타낸 데이터를 이용해서 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 각각 도 1에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 임의의 한 VH-CDR에서의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 아미노산 치환을 제외하고는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 각각 도 1에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 경쇄 가변 영역의 VL-CDR의 적어도 하나 또는 경쇄 가변 영역의 VL-CDR의 적어도 둘은 본 명세서에 개시된 항체의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 다른 한편으로, VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 본 명세서에 개시된 항체의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 각각 도 1에 나타낸 폴리펩티드에 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다. 도 1은 Kabat 시스템에 의해 정의된 VL-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 정의, 예컨대 Chothia 시스템에 의해 정의된 VL-CDR도 본 발명에 포함된다.
다른 구현예에서, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역이 각각 도 1에 나타낸 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 임의의 한 VL-CDR에서의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 아미노산 치환을 제외하고는 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역이 각각 도 1에 나타낸 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 군과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 구성된 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다.
면역글로불린 또는 그 암호화 cDNA는 추가 변형될 수 있다. 따라서 추가적인 구현예에서, 본 발명의 방법은 키메라 항체, 쥐과화된 항체, 단일쇄 항체, Fab-절편, 이중-특이적 항체, 융합 항체, 표지된 항체 또는 이들 중 임의의 하나의 유사체의 생산 단계(들) 중 임의의 하나를 포함한다. 해당 방법은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있고, 예컨대 [Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor (1988)]에 기재된다. 상기 항체의 유도체가 파지 디스플레이 기법에 의해 수득되는 경우, BIAcore 시스템에서 채용된 것과 같은 표면 플라즈몬 공명이 본 명세서에 기재된 항체의 임의의 하나에서와 동일한 에피토프에 결합하는 파지 항체의 효율을 증가시키기 위해 이용될 수 있다[Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13]. 키메라 항체의 생산은, 예를 들면 국제 출원 WO89/09622에 기재된다. 인간화된 항체의 생산 방법은, 예컨대 유럽 출원 EP-A1 0 239 400 및 국제 출원 WO90/07861에 기재된다. 본 발명에 따라 이용될 항체의 추가 원천은 소위 이종발생 항체이다. 이종발생 항체, 예컨대 마우스에서의 인간-유사 항체의 생산을 위한 일반 원칙은 예컨대 국제 출원 WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 및 WO96/33735에 기재된다. 상기 논의된 것과 같이, 본 발명의 항체는 완전 항체에 더하여, 예를 들면 Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 단일쇄를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다; 예컨대, 국제 출원 WO88/09344 참조. 따라서 한 구현예에서, 단일쇄 Fv 절편(scFv), F(ab') 절편, F(ab) 절편, 및 F(ab')2 절편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 본 발명의 항체가 제공된다.
본 발명의 항체 또는 그의 대응하는 면역글로불린 사슬(들)은 본 기술분야에 공지된 통상적 기법을 이용하여, 예를 들면 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 부가(들), 및/또는 재조합(들) 및/또는 본 기술분야에 공지된 임의의 다른 변형(들)을 단독으로 또는 조합으로 이용함으로써 추가 변형될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열의 근본이 되는 DNA 서열에 이러한 변형을 도입하기 위한 방법은 본 기술분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다; 예컨대, [Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)] 참조. 본 발명의 항체의 변형에는 아세틸화, 히드록실화, 메틸화, 아미드화 및 탄수화물 또는 지질 모이어티, 보조 인자의 부착 등을 포함하는 측쇄 변형, 골격 변형 및 N- 및 C-말단 변형을 포함하는 하나 이상의 구성 아미노산에서의 화학적 및/또는 효소적 유도체화가 포함된다. 마찬가지로, 본 발명은 이종성 분자, 예컨대 카르복실 말단에서의 면역자극 리간드에 융합된 아미노 말단에 기재된 항체 또는 그의 일부 절편을 포함하는 키메라 단백질의 생산을 포괄한다; 예컨대, 해당하는 기술적 세부사항에 대해서는 국제 출원 WO00/30680 참조.
추가적으로, 중쇄 CDR3(HCDR3)이 항원-항체 상호작용의 우선적 참여 및 더 큰 정도의 변동성을 갖는 영역임이 빈번하게 관찰되었으므로, 본 발명은 상술된 것과 같은 결합 분자를 함유하는, 예를 들면 전술한 항체 중 임의의 하나의 가변 영역의 CDR3 영역, 특히 중쇄의 CDR3을 함유하는 펩티드를 포괄한다. 이러한 펩티드는 쉽게 합성되거나 본 발명에 따라 유용한 결합 제제를 생산하기 위한 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. 이러한 방법은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 펩티드는, 예를 들면 시판되는 자동화된 펩티드 합성장치를 이용해서 합성될 수 있다. 펩티드는 또한 펩티드를 발현하는 DNA를 발현 벡터 내에 도입하고 세포를 펩티드를 생산하기 위한 발현 벡터로 형질전환함으로써 재조합 기법에 의해 생산될 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 항-TTR 항체 및/또는 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편에 대해 배향되고 전술한 특성을 나타내는, 즉 TTR 및/또는 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편을 특이적으로 인식하는 임의의 결합 분자, 예컨대 항체 또는 그의 결합 절편에 관한 것이다. 이러한 항체 및 결합 분자는 본 명세서에 기재된 것과 같은 ELISA 및 면역조직화학에 의해 그의 결합 특이성 및 친화도에 대해 시험될 수 있으며, 예컨대 실시예 참조. 항체 및 결합 분자의 이러한 특징은 웨스턴 블롯으로도 시험될 수 있다.
예시적인 인간 항체 NI-301.37F1은 FAP 환자의 피부 생검 유래의 섹션 상에서 뚜렷한 접힘오류화 TTR의 염색을 나타내었으나, 건강한 대조군 환자에 대해서는 어떠한 염색도 나타내지 않았고, 여기서 췌장 알파 세포는 TTR, 즉 자연형 TTR의 내인성 발현을 보여준다(실시예 8 및 도 9 참조). 본 발명의 예시적인 항체 NI-301.35G11 및 NI-301.37F1은 또한 내장을 포함하는 다양한 조직에서 비정상적 TTR 침적을 나타내는 FAP 마우스 조직에서 양성 결과를 제공하였다; 도 8 참조. 인간 및 동물 조직에서 TTR의 병리학적 형태에 대한 상기 결합 특이성은 본 명세서에서 나타낸 생화학적 실험에 더하여(실시예 도 10 참조), 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편, 유도체의 발생으로 인해 일어날 수 있는 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환의 치료 및 진단에서 본 발명의 항체의 이용 가능성을 강조한다.
B 세포 또는 메모리 B 세포의 배양에서 직접 면역글로불린을 수득하기 위한 대안으로, 세포가 후속 발현 및/또는 유전적 조작을 위해 재배열된 중쇄 및 경쇄 유전자위의 원천으로 이용될 수 있다. 재배열된 항체 유전자는 적절한 mRNA로부터 역전사되어 cDNA를 생산할 수 있다. 원하는 경우, 중쇄 불변 영역은 상이한 이소형에 대한 것으로 교환되거나 모두 제거될 수 있다. 가변 영역이 단일쇄 Fv 영역을 암호화하기 위해 연결될 수 있다. 다중 Fv 영역은 둘 이상의 표적에 대해 결합력을 부여하기 위해 연결될 수 있고, 또는 키메라 중쇄 및 경쇄 조합이 채용될 수 있다. 유전 물질을 이용 가능한 경우, 원하는 표적에 결합하는 그의 능력을 모두 보유하는 상술된 것과 같은 유사체의 설계가 수월하다. 항체 가변 영역의 클로닝 및 재조합 항체의 생성을 위한 방법은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들면 [Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792]에 기재되어 있다.
적절한 유전 물질이 수득되고 원하는 경우 유사체를 암호화하기 위해 변형되면, 최소한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 것을 포함하는 코딩 서열이 표준 재조합 숙주 세포 내로 전달감염될 수 있는 벡터 상에 함유된 발현 시스템 내로 삽입될 수 있다. 다양한 상기 숙주 세포가 이용될 수 있다: 그러나 효율적인 가공을 위해서는 포유류 세포가 바람직하다. 상기 목적을 위해 유용한 전형적인 포유류 세포주에는 비제한적으로 CHO 세포, HEK 293 세포, 또는 NSO 세포가 포함된다.
이어서 항체 또는 유사체의 생산은 숙주 세포의 성장 및 코딩 서열의 발현을 위해 적절한 배양 조건 하에 변형된 재조합 숙주를 배양함으로써 수행된다. 이어서 항체는 이들을 배양으로부터 단리함으로써 회수된다. 발현 시스템은 바람직하게는 생성 항체가 배지 내로 분비되도록 신호 펩티드를 포함하게 설계된다; 그러나 세포내 생산도 가능하다.
상기에 따라, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 동등한 결합 분자를, 항체의 경우에는 바람직하게는 적어도 상술된 항체의 면역글로불린 사슬의 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 상기 가변 영역은 상기 항체의 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 cDNA이다.
본 기술분야의 기술자는 상술된 가변 도메인을 갖는 항체의 가변 도메인이 원하는 특이성 및 생물학적 기능의 다른 폴리펩티드 또는 항체의 구축을 위해 이용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 따라서 본 발명은 또한 상술된 가변 도메인의 적어도 하나의 CDR을 포함하고 유리하게는 첨부된 실시예에 기재된 항체와 실질적으로 동일하거나 유사한 결합 특성을 갖는 폴리펩티드 및 항체를 포괄한다. 본 기술분야의 기술자는 결합 친화도가 Kabat에 의해 정의된 것과 같은 CDR과 부분적으로 중복되는 고가변 루프[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917] 내에서 또는 CDR 내에서 아미노산 치환을 수행하여 증강될 수 있음을 안다; 예컨대, [Riechmann, et al., Nature 332 (1988), 323-327] 참조. 따라서 본 발명은 또한 하나 이상의 전술한 CDR이 하나 이상의, 바람직하게는 둘 이하의 아미노산 치환을 포함하는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명의 항체는 도 1에 나타낸 것과 같은 가변 영역의 2 개 또는 전체 3 개의 CDR을 그 면역글로불린 사슬 중 하나 또는 둘 다에 포함한다.
본 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 것과 같이, 본 발명의 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 하나 이상의 효과인자 기능을 매개하는 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체 불변 영역에 대한 보체의 Cl 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화할 수 있다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에서 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하며, 자가면역 과민증에도 관여될 수 있다. 또한 항체는 Fc 영역을 통해 다양한 세포 상의 수용체에 결합하고, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 결합 부위가 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합한다. IgG(감마 수용체), IgE(엡실론 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)을 포함하는 상이한 항체 클래스에 특이적인 여러 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체 코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포에 의한 항체 코팅된 표적 세포의 용해(항체 의존적 세포 매개 세포독성 또는 ADCC로 불림), 염증 매개체의 방출, 태반 수송 및 면역글로불린 생산 제어를 포함하는 여러 중요하고 다양한 생물학적 반응을 유발한다.
따라서 본 발명의 특정 구현예에는 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체가 포함되며, 여기서 불변 영역 도메인의 하나 이상의 적어도 분획은 원하는 생화학적 특징, 예컨대 거의 동일한 면역원성의 전체 미변형된 항체에 비교되는 경우, 감소된 효과인자 기능, 비공유적으로 이량체화하는 능력, TTR 응집 및 침적 부위에서의 증가된 편재 능력, 감소된 혈청 반감기 또는 증가된 혈청 반감기를 제공하기 위해 결실되거나 달리 변형되었다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 특정 항체는 면역글로불린 중쇄와 유사한 폴리펩티드 사슬을 포함하지만 하나 이상의 중쇄 도메인의 적어도 일부가 없는 도메인 결실된 항체이다. 예를 들면 특정 항체에서, 변형된 항체의 불변 영역의 하나의 전체 도메인이 결실될 것이다, 예를 들면 CH2 도메인의 전부 또는 일부가 결실될 것이다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 특정 항체는 본 명세서에서 다른 곳에서 비글리코실화된 또는 "agly" 항체로 불리는 글리코실화를 제거하기 위해 변형된 불변 영역, 예컨대 IgG 중쇄 불변 영역을 갖는다. 이러한 "agly" 항체는 효소적으로 뿐만 아니라 불변 영역에서 공통 글리코실화 부위(들)의 조작에 의해 제조될 수 있다. 이론에 구애받지 않고, "agly" 항체는 생체내 개선된 안전성 및 안정성 프로필을 가질 수 있는 것으로 여겨진다. 원하는 효과인자 기능을 갖는 비글리코실화된 항체의 생산 방법은, 예를 들면 그 전문이 참조로 포함된 국제 출원 WO2005/018572에서 확인된다.
본 명세서에 기재된 특정 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 본 기술분야에 공지된 기법을 이용하여 효과인자 기능을 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 예를 들면, (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한) 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜서 TTR 편재를 증가시킬 수 있다. 다른 경우, 본 발명에 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화하고 이에 따라 혈청 반감기 및 콘주게이트된 세포독소의 비특이적 연관을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 다른 변형이 증가된 항원 특이성 또는 항체 유연성으로 인해 증강된 편재를 허용하는 이황화 연결 또는 올리고당 모이어티를 변형하기 위해 이용될 수 있다. 변형의 생성되는 생리학적 프로필, 생체이용률 및 다른 생화학적 효과, 예컨대 TTR 편재, 생체분포 및 혈청 반감기는 과도한 실험 없이 널리 공지된 면역학적 기법을 이용하여 쉽게 측정되고 정량될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 예로서 Fcγ 수용체, LRP, 또는 Thy1 수용체를 통한 항체의 수용체-매개된 세포내 섭취를 증강시킴으로써, 또는 항체가 살아있는 세포에 해를 끼치지 않고 내부로 들어갈 수 있도록 한다는 'SuperAntibody 기술[Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241]에 의해 항체의 세포 섭취를 증가시키기 위해 대안적인 단백질 서열로 돌연변이되거나 교환될 수 있다. 예를 들면, TTR에 결합하는 특이적 서열을 갖는 세포 표면 수용체 또는 이중- 또는 다중-특이적 항체뿐만 아니라 세포 표면 수용체의 인지체 단백질 리간드 및 항체 결합 영역의 융합 단백질의 생성은 본 기술분야에 공지된 기법을 이용하여 조작될 수 있다.
본 명세서에 기재된 특정 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 대안적인 단백질 서열로 돌연변이되거나 교환될 수 있고, 또는 항체가 그 혈액 뇌 장벽 침투를 증가시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체의 변형된 형태는 본 기술분야에 공지된 기법을 이용하여 전체 전구체 또는 부모 항체로부터 제조될 수 있다. 예시적인 기법은 본 명세서에서 보다 상세히 논의된다. 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 본 기술분야에 공지된 기법을 이용해서 제조되거나 제작될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 분자 또는 그의 절편은 "재조합적으로 생산되며", 즉 재조합 DNA 기술을 이용해서 생산된다. 항체 분자 또는 그의 절편을 제조하기 위한 예시적인 기법은 본 명세서에서 다른 곳에서 보다 상세히 논의된다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에는 또한, 예컨대 공유 부착이 항체의 그 인지체 에피토프에 대한 특이적 결합을 방지하지 않도록 항체에 대한 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 유도체가 포함된다. 비제한적으로 예를 들면, 항체 유도체에는, 예컨대 글리코실화, 아세틸화, peg화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해 변형된 항체가 포함된다. 임의의 여러 화학적 변형이 비제한적으로 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로 유도체는 하나 이상의 비전통적인 아미노산을 함유할 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 치료될 동물, 예컨대 인간에서 해로운 면역 반응을 일으키지 않을 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 그의 항원-결합 절편은 환자, 예컨대 인간 환자로부터 유래되며, 이후 이들이 유래된 동일한 종, 예컨대 인간에서 해로운 면역 반응의 발생을 완화하거나 최소화하는데 이용된다.
탈면역화가 또한 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "탈면역화"에는 T 세포 에피토프를 변형하기 위한 항체의 변형이 포함된다; 예컨대, 국제 출원 W098/52976 및 WO00/34317 참조. 예를 들면, 출발 항체의 VH 및 VL 서열이 분석되고, 서열 내에서 상보성 결정 영역(CDR) 및 다른 주요 잔기에 대해 에피토프의 위치를 나타내는 각각의 V 영역으로부터 인간 T 세포 에피토프가 "맵핑"된다. T 세포 에피토프 지도로부터의 개별 T 세포 에피토프는 최종 항체의 활성 변형 위험이 낮은 대안적 아미노산 치환을 확인하기 위해 분석된다. 아미노산 치환의 조합을 포함하는 다양한 대안적 VH 및 VL 서열이 설계되며, 이들 서열은 이후 다양한 결합 폴리펩티드, 예컨대 본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에 이용하기 위한 TTR-특이적 항체 또는 그의 면역특이적 절편 내로 도입되고, 이어서 기능에 대해 시험된다. 전형적으로, 12 내지 24 개의 변이체 항체가 생성되고 시험된다. 이어서 변형된 V 및 인간 C 영역을 포함하는 전체 중쇄 및 경쇄 유전자가 발현 벡터 내로 클로닝되고, 이후 플라스미드가 전체 항체의 생산을 위해 세포주 내로 도입된다. 이어서 항체가 적절한 생화학적 및 생물학적 분석에서 비교되고, 최적 변이체가 확인된다.
모노클론 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술 또는 그의 조합의 이용을 포함하는 본 기술분야에 공지된 매우 다양한 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 예를 들면, 모노클론 항체는, 예를 들면 그의 전문이 참조로 포함된 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981)]에 교시되고 본 기술분야에 공지된 것들을 포함하는 하이브리도마 기법을 이용해서 생산될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 용어 "모노클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않는다. 용어 "모노클론 항체"는 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 포함하여 단일 클론에서 유래된 항체를 나타내며, 이것이 생산된 방법을 나타내지 않는다. 따라서 용어 "모노클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 본 명세서에 기재된 것과 같이 엡스타인-바 바이러스로의 형질전환을 통해 불멸화된 인간 B 세포로부터 유래된다.
널리 공지된 하이브리도마 절차[Kohler et al., Nature 256 (1975), 495]에서, 상대적으로 짧게 생존하거나 유한한 포유류로부터의 림프구, 예컨대 본 명세서에 기재된 것과 같은 인간 대상체로부터 유래된 B 세포가 불멸 종양 세포주(예컨대, 골수종 세포주)와 융합되고, 이에 따라 불멸이고 B 세포의 유전적으로 코딩된 항체를 생산할 수 있는 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"를 생산한다. 생성되는 하이브리드는 선택, 희석 및 단일 항체의 형성을 위해 특정 유전자를 포함하는 각각의 개인 계통으로의 재성장에 의해 단일 유전 계통으로 분리된다. 이들은 항체를 생산하며, 이는 원하는 항원에 대해 동종성이고, 그의 순수한 유전적 혈통에 대해 "모노클론"로 불린다.
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지로 접종되고 성장된다. 본 기술분야의 기술자는 하이브리도마의 형성, 선택 및 성장을 위한 시약, 세포주 및 배지가 여러 공급원에서 시판되며, 표준화된 프로토콜이 잘 확립되어 있음을 이해할 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 원하는 항원에 대한 모노클론 항체의 생산에 대해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클론 항체의 결합 특이성은 시험관내 분석, 예컨대 본 명세서에 기재된 것과 같은 면역침전, 방사선면역분석(RIA) 또는 효소-연관된 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 결정된다. 하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 것이 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다; 예컨대, [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), 59-103 ] 참조. 서브클론에 의해 분비된 모노클론 항체가 통상적인 정제 절차, 예컨대 단백질-A, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 또는 혈청으로부터 분리될 수 있음이 추가로 이해될 것이다.
다른 구현예에서, 림프구가 마이크로조작에 의해 선택되고 가변 유전자가 단리될 수 있다. 예를 들면, 말초 혈액 단핵구는 면역화되거나 자연적으로 면역인 포유류, 예컨대 인간으로부터 단리되고, 시험관내에서 약 7 일 동안 배양될 수 있다. 배양은 스크리닝 요건에 부합하는 특이적 IgG에 대해 스크리닝될 수 있다. 양성 웰로부터 세포가 단리될 수 있다. 개별 Ig-생산 B 세포는 FACS에 의해 또는 이들을 보체 매개된 용혈 플라크 분석에서 확인함으로써 단리될 수 있다. Ig-생산 B 세포가 튜브 내로 마이크로조작될 수 있고, VH 및 VL 유전자는, 예컨대 RT-PCR을 이용해서 증폭될 수 있다. VH 및 VL 유전자는 항체 발현 벡터 내로 클로닝되고 발현을 위해 세포(예컨대, 진핵 또는 원핵 세포) 내로 전달감염될 수 있다.
다른 한편으로, 항체-생산 세포주는 본 기술분야의 기술자에게 널리 공지된 기법을 이용해서 선택되고 배양될 수 있다. 이러한 기법은 다양한 실험실 매뉴얼 및 주요 공보에 기재되어 있다. 이와 관련하여, 아래 기재된 것과 같이 본 발명에서 이용하기 적합한 기법은 그 전문이 보충물을 포함하여 본 명세서에 참조로 포함되는 [Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)]에 기재된다.
특정 에피토프를 인식하는 항체 절편이 공지된 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, Fab 및 F(ab')2 절편은 효소, 예컨대 (Fab 절편을 생산하기 위한) 파파인 또는 (F(ab')2 절편을 생산하기 위한) 펩신을 이용해서 면역글로불린 분자의 단백질분해 절단에 의해 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. F(ab')2 절편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 이러한 절편은, 예를 들면 시약, 예컨대 방사성동위원소를 검출하기 위해 면역글로불린의 면역특이적 부분의 커플링이 관여되는 면역진단 절차에서 이용하기에 충분하다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 분자의 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 2 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 3 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 4 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 5 개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 6 개의 CDR을 포함한다. 대상체 항체에 포함될 수 있는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 예시적인 항체 분자가 본 명세서에 기재된다.
본 발명의 항체는 항체의 합성을 위해 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 특히 화학적 합성에 의해 또는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 것과 같은 재조합 발현 기법에 의해 생산될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 결실된 합성 불변 영역을 포함한다("도메인-결실된 항체"). 특정 구현예에서, 상용성의 변형 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실된 구축물 또는 변이체를 포함할 것이다(ΔCH2 구축물). 다른 구현예에 있어서, 짧은 연결 펩티드가 가변 영역에 대해 가요성 및 이동의 자유를 제공하기 위해 결실된 도메인에 대해 치환될 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 이러한 구축물이 항체의 이화 속도에 대한 CH2 도메인의 조절 특성으로 인해 특히 바람직하다는 것을 이해할 것이다. 도메인 결실된 구축물은, IgG1 인간 불변 도메인을 암호화하는 벡터를 이용해서 유도될 수 있고, 예컨대 국제 출원 WO02/060955 및 WO02/096948A2 참조. 상기 벡터는 CH2 도메인을 결실시키고 도메인 결실된 IgG1 불변 영역을 발현하는 합성 벡터를 제공하기 위해 조작된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 미니바디이다. 미니바디는 본 기술분야에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 예컨대 US 특허 제5,837,821호 또는 국제 출원 WO94/09817 참조.
한 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 이것이 모노머성 서브유닛 사이의 연관을 허용하는 한 소수의 또는 심지어 하나의 아미노산의 결실 또는 치환을 갖는 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 예를 들면, CH2 도메인의 선택된 영역에서의 단일 아미노산 돌연변이가 실질적으로 Fc 결합을 감소시키고 이에 따라 TTR 편재를 증가시키기 충분할 수 있다. 유사하게, 조정될 효과인자 기능(예컨대, 보체 결합)을 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 단순 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분적 결실은 대상체 불변 영역 도메인에 연관된 다른 바람직한 기능은 온전히 놔두면서 항체의 선택된 특징(혈청 반감기)은 개선할 수 있다. 또한, 상기 암시된 것과 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 생성 구축물의 프로필을 증강시키는 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 돌연변이를 통해 합성될 수 있다. 상기 측면에서, 변형된 항체의 구조 및 면역원성 프로필을 실질적으로 유지하면서 보존된 결합 부위에 의해 제공되는 활성(예컨대, Fc 결합)을 손상시키는 것이 가능할 수 있다. 다른 구현예는 바람직한 특징, 예컨대 효과인자 기능을 증강시키거나 더 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 불변 영역에 하나 이상의 아미노산 부가를 포함한다. 이러한 구현예에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특이적 서열을 삽입하거나 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항체 분자(예컨대, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체 포함)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 구성된 항체를 제공하며, 이 항체 또는 그의 절편은 TTR에 면역특이적으로 결합한다. 비제한적으로 아미노산 치환을 일으키는 부위 지정된 돌연변이화 및 PCR-매개된 돌연변이화를 포함하는 본 기술분야의 기술자에게 공지된 표준 기법을 이용하여 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입할 수 있다. 바람직하게는, 변이체(유도체 포함)는 기준 VH 영역, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL 영역, VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3에 비해 50 개 이하의 아미노산 치환, 40 개 이하의 아미노산 치환, 30 개 이하의 아미노산 치환, 25 개 이하의 아미노산 치환, 20 개 이하의 아미노산 치환, 15 개 이하의 아미노산 치환, 10 개 이하의 아미노산 치환, 5 개 이하의 아미노산 치환, 4 개 이하의 아미노산 치환, 3 개 이하의 아미노산 치환, 또는 2 개 이하의 아미노산 치환을 암호화한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 본 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄(예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분기된 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다. 다른 한편으로, 돌연변이는 예컨대 포화 돌연변이화에 의해 코딩 서열의 전부 또는 일부에 따라 무작위 도입될 수 있고, 생성 돌연변이체는 활성(예컨대, TTRP 및/또는 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편에 결합하는 능력)을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
예를 들면, 항체 분자의 골격 영역에만 또는 CDR 영역에만 돌연변이를 도입할 수 있다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중성 미스센스 돌연변이일 수 있다, 예컨대, 항원에 결합하는 항체의 능력에 전혀 또는 거의 효과를 갖지 않을 수 있고, 실제로 이러한 돌연변이의 일부는 아미노산 서열을 어떻게든 변형하지 않는다. 이러한 유형의 돌연변이는 코돈 이용을 최적화하거나 하이브리도마의 항체 생산을 개선하기 위해 유용할 수 있다. 본 발명의 항체를 암호화하는 코돈 최적화된 코딩 영역은 본 명세서에서 다른 곳에 개시된다. 다른 한편으로, 비중성 미스센스 돌연변이는 항원에 결합하는 항체의 능력을 변형시킬 수 있다. 가장 침묵하며 중성인 미스센스 돌연변이의 위치는 골격 영역에 있을 가능성이 높은 반면 가장 비중성인 미스센스 돌연변이의 위치는 CDR에 있을 가능성이 높지만, 이것이 절대적인 조건인 것은 아니다. 본 기술분야의 기술자는 원하는 특성을 갖는, 예컨대 항원-결합 활성에 변형이 없는 또는 결합 활성에 변형이 있는(예컨대, 항원-결합 활성의 개선 또는 항체 특이성의 변화) 돌연변이체 분자를 설계하고 시험할 수 있을 것이다. 돌연변이화에 이어, 암호화된 단백질이 일상적으로 발현될 수 있고, 암호화된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성(예컨대, TTR 및/또는 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편 중 적어도 하나의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)이 본 기술분야에 공지된 기법을 일상적으로 변형하여 또는 본 명세서에 기재된 기법을 이용하여 결정될 수 있다.
Ⅲ. 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드
항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 이루어질 수 있으며, 이는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예를 들면, 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥, 또는 보다 전형적으로 이중-가닥, 또는 단일-가닥 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 이루어질 수 있다. 또한, 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역으로 이루어질 수 있다. 또한 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 안정성 또는 다른 이유를 위해 변형된 DNA 또는 RNA 골격 또는 하나 이상의 변형된 염기를 함유할 수 있다. "변형된" 염기에는, 예를 들면 트리틸화된 염기 및 비일반적인 염기, 예컨대 이노신이 포함된다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 수행될 수 있다; 따라서 "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포괄한다.
면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드(예컨대, 면역글로불린 중쇄 부분 또는 경쇄 부분)의 비천연 변이체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 암호화된 단백질 내로 도입되도록 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입함으로써 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기법, 예컨대 부위 지정된 돌연변이화 및 PCR-매개된 돌연변이화에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환이 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 수행된다.
널리 공지된 것과 같이, RNA는 표준 기법, 예컨대 구아니디늄 이소티오시아네이트 추출 및 침전 후 원심분리 또는 크로마토그래피에 의해 원래 B 세포, 하이브리도마 세포 또는 다른 형질전환된 세포로부터 단리될 수 있다. 원하는 경우, mRNA는 표준 기법, 예컨대 올리고 dT 셀롤로오스 상의 크로마토그래피에 의해 전체 RNA로부터 단리될 수 있다. 적합한 기법은 본 기술분야에서 친숙하다. 한 구현예에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA는 동시적으로 또는 별도로, 널리 공지된 방법에 따라 역전사효소 및 DNA 중합효소를 이용하여 제조될 수 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기반하여 보다 특이적인 프라이머에 의해 또는 공통 불변 영역 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기에서 논의된 것과 같이, PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 클론을 단리하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 경우, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더 큰 상동성 탐침, 예컨대 인간 불변 영역 탐침에 의해 스크리닝될 수 있다.
DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA는 본 기술분야에 공지된 기법을 이용해서 세포로부터 단리되고, 예컨대 재조합 DNA 기법에 관련된 상기 참고문헌에서 상세히 나타낸 표준의 널리 공지된 기법에 따라 제한효소 맵핑되고 서열분석될 수 있다. 물론, DNA는 단리 절차 또는 후속 분석 동안의 임의의 시점에 본 발명에 따라 합성될 수 있다.
상기 맥락에서, 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 결합 도메인 또는 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역의 적어도 하나의 CDR 또는 중쇄 가변 영역의 적어도 2 개의 VH-CDR은 본 명세서에 개시된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 다른 한편으로, VH의 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 영역은 본 명세서에 개시된 항체로부터의 기준 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 폴리펩티드 서열에 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 경쇄 가변 영역의 적어도 하나의 VL-CDR 또는 경쇄 가변 영역의 적어도 2 개의 VL-CDR은 본 명세서에 개시된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 다른 한편으로, VL의 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 영역은 본 명세서에 개시된 항체로부터의 기준 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서 상기 구현예에 따르면, 본 발명의 경쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 폴리펩티드 서열에 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 폴리펩티드 서열을 갖는다.
다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 영역은 도 1에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는다.
본 기술분야에 공지된 것과 같이, 두 폴리펩티드 또는 두 폴리뉴클레오티드 간의 "서열 동일성"은 한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 아미노산 또는 핵산 서열을 제2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 본 명세서에서 논의되는 경우, 임의의 특정 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한지 여부는 본 기술분야에 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어, 예컨대 비제한적으로 BESTFIT 프로그램(Wisconsin 서열 분석 패키지, 유닉스용 버전 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 이용해서 결정될 수 있다. BESTFIT은 두 서열 사이의 최적 상동성 절편을 찾기 위해 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘[Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489]을 이용한다. 특정 서열이, 예를 들면 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한지 여부를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 파라미터는 물론 동일성 백분율이 기준 폴리펩티드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고 기준 서열에서 총 아미노산 수의 최대 5%의 상동성 내 갭이 허용되도록 설정된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 표 2에 도시된 것과 같은 항-TTR 항체 및/또는 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편을 인식하는 항체의 VH 또는 VL 영역의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 상기 측면에서, 본 기술분야의 기술자는 경쇄 및/또는 중쇄의 적어도 가변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 두 면역글로불린 사슬 모두 또는 하나만의 가변 도메인을 암호화할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 따라서 한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 표 2에 도시된 것과 같은 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편을 인식하는 항-TTR 항체의 VH 및 VL 영역의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편을 인식하는 항체의 VH 및 VL 영역의 뉴클레오티드 서열.
항체 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 또는 가변 카파-경쇄(VK)의 뉴클레오티드 서열
NI-301.59F1-VH gaggtgcagctggtggagtctgggggagggttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgtagcctctggattcacttttagtaattattggatgagttgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccaatataaatcaagatagtgagaaatactatgtggactctgtgaagggccgattcgccatctccagagacaactccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagtcgaggacacgggcgtgtattactgtgcgagagatcgctattgcagtggtgggagatgctcccggggtaacaactggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg
서열번호 1
NI-301.59F1-VL gaaattgtgttgacgcagtctccagccactctgtctctgtctccaggggagagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagaagcaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactgatatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaggattttgcagtttattactgtcagcaatataataactggcctccgtacacttttggccaggggaccaaagtggatatcaaa
서열번호 3
NI-301.35G11-VH gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggggggtccctgagactctcctgtgtagcctctggattcacttttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggttccagggaaggggctggagtgggtctcatctattagtggtagtggtgatacaacaaaatacacagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacggtgtttctgcaaatgagcagcctgagagccgaggacacggccctatattactgtgtgaaagatggtagtggacggatcgatccttttgctttatggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcg
서열번호 5
NI-301.35G11-VL gaaattgtgatgacacagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcgtagtctcgtatacagtgatggaaacatttacttgaattggtttcagcagaggccaggccaatctccaaggcgcctaatttataaggtttctaaccgggactctggggtcccagacagattcagtggcagtgggtcagacactgacttcacactgagaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtctattactgcatgcagggtacacactggcctaggacgttcggccaagggaccaaggtggagatcaaa
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NI-301.37F1-VL gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcacaatcgcttgccgggccagtcagagcgttggcacctatttaaattggtatcagcagaaaagagggaaagcccctaaactcctcatctttgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagactttgcaacttactactgtcaacagagttacagttctcctccaacgttcggccaagggaccaaggtggagatcaaa
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서열번호 13
NI-301.2F5-VL cagtctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgacgttggtggttataactatgtctcctggtaccaacaatacccaggcaaagcccccaaagtcatgatttttgatgtttttaatcggccttcaggggtttctaatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgaccatctctggactccaggcagaggacgaggctgattattactgcagttcatatacaagcagcgtcactcctcactgggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtccta
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NI-301.119C12-VL cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgcactgggagcagctccaacatcggggcaggttatggtgtacactggtaccagcaactttcaggaacaccccccaaactcctcatctatggagacaacaatcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcactgggctccaggctgaggatgaggctcattattactgccagtcctatgacaccaccttgagtggttcgagggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtccta
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NI-301.5D8-VH caggtgcagctacagcagtggggcgcaggacggttgaagccttcggagaccctgtccctcacgtgcgctgtctatggtgggtctttcagtgcttactactggaattggatccgccaggccccagggaaggggctggagtggattggtgaagtcagtcatggtggcagcagcaactacagcccgtccctcaggggtcgagtcgccatttctttagacacgtccaagagccagttctccctgaggctgaattctgtgaccgccgcggacacggctgtttattactgtgcgagaggcagccctgtagtactaccaggtgccagattcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg
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NI-301.5D8-VL cagtctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgggtttcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgatgttgggagttataaccttgtctcctggtaccaacaacacccaggcaaagcccccaaactcttgatttatgaggtcaataagcggccctcaggagtttctactcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgacgatctctgggctccagactgaggacgaggctgattattactgctgctcatatgcaggtagtactaaggtcttcggaattgggaccaaggtcaccgtccta
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서열번호 45
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서열번호 69
NI-301.3C9 VL tcctatgagctgactcagccaccctcagtgtccgtgtccccaggacagacagccaccatcacctgctctggagataatttgggacataaatttacttgctggtatcagcagaagccaggccagtcccctgtcctggtcatctatcaagatcacaagcggccctcagggatccctgagcgattctccggctccaactctggggacacagccactctgaccatcagcgggacccaggctatggatgaggctgagtattactgtcaggcgtgggccttcccctatgtggtcttcggcggagggaccaagctgaccgtccta
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NI-301.14D8 VL cagtctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgggtttgctggacagtcggtcaccatctcctgcactggaaccagccttaacattgggacttacaaccttatctcctggtaccaacaacacccaggcagagcccccagactcatcatttttgagggcaataggcggccccccgggatttctaatcgcttctctgcctccaagtctggcaacacggcctccttgacagtctctgggctgctggctggcgacgaggctgattattactgttgctcatttgcaggaagagtctctttggtgtttggcggagggaccaagttgaccgtccta
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NI-301.9X4 VH caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaaaccttcggagaccctgtccctcacctgcagtgtctctgctggctccatcagtagtcactactggaactggatccggcagcccccagggaagggactggaatggattgggtctatctatcacagtgggagcaccaactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaagaaccacgtctccctgaggttgacgtctgtgaccgccgcagacacggccgtgtattactgtgcgagagactactactactacatggacgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctcg
서열번호 77
NI-301.9X4 VL tcctatgagctgactcagccaccctcggtgtcagtgtccccaggacagacggccaggatcacctgctctggagatgcgttgccagacaagtatgcttattggtaccagcagaagccaggccaggcccctatgttggttatatataaggacagtgagaggccctcagggatccctgagcgattctctggctccagtttggggacaacagtcatgctgaccatcagtggagtccaggcagaggacgaggctgactattactgtaaatcagcagacagcagtggtacttattgggtgttcggcggggggaccaagctgaccgtccta
서열번호 79
NI-301.14C3 VH gaggtgcagctggtggagactggaggaggcttgatccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctgggttcaccgtcagtagccactacatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaattatttatagcggtggtggcacatactacgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatcttcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaagatctacaggtcgggtaatactggttattcttacgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg
서열번호 81
NI-301.14C3 VL tcctatgagctgactcagccaccctcagtgtccgtgtccccagggcagacagccagcatcacctgctctggagataaattggggagtaaatatgcttgctggtatcagcagaagccaggccagtcccctgtactggtcatctatgaagataagaagcggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggctatggatgaggctgactatttctgtcaggcgtgggacagcagcacttctcatgtggtattcggcggagggaccaggctgaccgtccta
서열번호 83
클로닝 전략으로 인하여, 중쇄 및 경쇄의 N- 및 C-말단에서의 아미노산 서열은 잠재적으로 FR1 및 FR4에서 프라이머-유도성 변경을 함유할 수 있지만, 항체의 생물학적 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 공통 인간 항체를 제공하기 위하여, 원래 클론의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 데이터베이스에 있는 적절한 인간 생식선 가변 영역 서열과 배열 및 조율될 수 있다; 예컨대, 전술한 것과 같은 Vbase2 참조. N- 및 C-말단 아미노산이 상기 PCR 프라이머로 인해 공통 생식선 서열로부터 잠재적으로 벗어나는 것으로 간주되고, 따라서 프라이머-유도성 돌연변이 교정(primer-induced mutation correction, PIMC)에 의해 교체될 때에는 인간 항체의 아미노산 서열을 굵은 글자로 나타내었다. 표 3 참조. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 표 3에 도시된 것과 같은 VH 및 표 2에 나타낸 것과 같은 항-TTR 항체의 대응하는 VL 영역의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
PIMC에 의한 교체(굵은 글자)를 보여주는 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편을 인식하는 항체의 VH 및 VL 영역의 뉴클레오티드 서열
PBMC를 갖는 대안적인 항체-영역 가변 중쇄(VH)의 뉴클레오티드 서열
NI-301.37F1-PIMC-VH cagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcagtgtctctggtggctccatcatcagtaggagttcctactggggctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattgggggtatctatcatagtgggaacacttacgacaacccgtccctcaagagtcgactcaccatgtccgtagacacgtcgaagaaccagttctccctgaatctgaggtctgtgaccgccgcagacacggctgtgtattactgtgcgaggatagtgccggggggtgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcg
서열번호 52
본 발명은 또한 다른 곳에 기재된 것과 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 절편을 포함한다. 추가적으로 본 명세서에 기재된 것과 같은 융합 폴리뉴클레오티드, Fab 절편, 및 다른 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 의해 고려된다.
폴리뉴클레오티드는 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산되거나 제조될 수 있다. 예를 들면, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지된 경우, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 간략하게는 항체를 암호화하는 서열 부분을 함유하는 중복 올리고뉴클레오티드의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 이어서 결찰된 올리고뉴클레오티드의 PCR에 의한 증폭이 관여되는 [Kutmeier et al., BioTechnique 17 (1994), 242]에 기재된 것과 같은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있다.
다른 한편으로, 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 원천의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론을 이용할 수 없지만 항체 분자의 서열이 공지된 경우, 항체를 암호화하는 핵산은 화학적으로 합성되거나 적합한 원천(예컨대, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 바람직하게는 TTR-특이적 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 항체를 발현하기 위해 선택된 하이브리도마 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리 또는 이로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리A+ RNA)으로부터 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화할 수 있는 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 또는 예컨대 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 확인하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 클로닝에 의해 수득될 수 있다. 이어서 PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 본 기술분야에 널리 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제 가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 항체, 면역글로불린 사슬 또는 그의 절편을 암호화하는 cDNA는 항-TTR 항체의 제조를 위해 사용된다.
항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체의 뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열이 결정되면, 그 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 조작을 위해 본 기술분야에 널리 공지된 방법, 예컨대 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 생성하기 위해 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성하기 위한 재조합 DNA 기법, 부위 지정된 돌연변이화, PCR 등을 이용해서 조작될 수 있다(예를 들면, 둘 다 그의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) 및 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998)]에 기재된 기법을 참조).
Ⅳ. 항체 폴리펩티드의 발현
본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체를 제공하기 위한 단리된 유전 물질의 조작 후, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 원하는 양의 항체를 생산하기 위해 이용될 수 있는 숙주 세포 내로의 도입을 위해 발현 벡터에 삽입된다. 항체, 또는 그의 절편, 유도체 또는 유사체, 예컨대 표적 분자에 결합하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현이 본 명세서에 기재된다. 본 발명의 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 일부(바람직하게는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 함유)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체 분자의 생산을 위한 벡터가 본 기술분야에 널리 공지된 기법을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하기 위한 방법이 본 명세서에 기재된다. 본 기술분야의 기술자에게 널리 공지된 방법이 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축하기 위해 이용될 수 있다. 이들 방법에는, 예를 들면 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체내 유전적 재조합이 포함된다. 따라서 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 항체 분자, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터에는 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 포함될 수 있고(예컨대, 국제 출원 WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 US 특허 제5,122,464호 참조), 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위한 이러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본 명세서에서 숙주 세포 내로의 도입 및 원하는 유전자의 발현을 위한 운반체로 본 발명에 따라 이용되는 벡터를 의미하기 위해 이용된다. 본 기술분야의 기술자에게 공지된 것과 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군으로부터 쉽게 선택될 수 있다. 일반적으로 본 발명과 상용성인 벡터는 원하는 유전자의 클로닝 및 진핵 또는 원핵 세포로의 도입 및/또는 복제 능력을 촉진하기 위해 선택 마커, 적절한 제한효소 부위를 포함할 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 여러 발현 벡터 시스템이 채용될 수 있다. 예를 들면, 벡터의 한 클래스는 동물 바이러스, 예컨대 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 이용한다. 다른 것에는 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 다중시스트론 시스템의 이용이 관여된다. 또한 그의 염색체 내에 통합된 DNA를 갖는 세포는 전달감염된 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양요구 숙주에 대한 양성자성, 살생제 내성(예컨대, 항생제) 또는 중금속, 예컨대 구리에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결될 수도 있고, 또는 공-형질전환에 의해 동일한 세포 내에 도입될 수도 있다. 추가적인 요소가 또한 mRNA의 최적 합성을 위해 필요할 수 있다. 이들 요소에는 신호 서열, 스플라이스 신호뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서, 및 종료 신호가 포함될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기 논의된 것과 같이 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(바람직하게는 인간)에 따라 발현 벡터 내에 삽입된다. 상기 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주 프로모터, SV40 복제 기원, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 엑손 1 및 엑손 2, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 및 리더 서열을 함유한다. 상기 벡터는 가변 및 불변 영역 유전자의 도입, CHO 세포에서의 전달감염 후 G418 함유 배지 중에서의 선택 및 메토트렉세이트 증폭시 매우 높은 항체 발현 레벨을 일으키는 것으로 나타났다. 물론 진핵 세포에서 발현을 야기할 수 있는 임의의 발현 벡터가 본 발명에서 이용될 수 있다. 적합한 벡터의 예에는 비제한적으로 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, 및 pZeoSV2(Invitrogen, San Diego, CA에서 공급), 및 플라스미드 pCI(Promega, Madison, WI에서 공급)가 포함된다. 일반적으로 면역글로불린 중쇄 및 경쇄가, 예를 들면 로보틱 시스템에 의해 수행될 수 있는 일상적 실험인 경우, 적합하게 고레벨을 발현하는 것들에 대해 다수의 형질전환된 세포를 스크리닝한다. 벡터 시스템은 또한 각각 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 US 특허 제5,736,137호 및 제5,658,570호에 교시된다. 상기 시스템은 높은 발현 레벨, 예컨대 >30pg/세포/일을 제공한다. 다른 예시적 벡터 시스템은, 예컨대 US 특허 제6,413,777호에 개시된다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 다중 시스트론 구축물, 예컨대 US 특허 출원 공개 제2003-0157641 A1호에 개시되고 그 전문이 본 명세서에 도입된 것들을 이용해서 발현될 수 있다. 이들 발현 시스템에서, 여러 관심 유전자 산물, 예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄는 단일 다중 시스트론 구축물로부터 생산될 수 있다. 이들 시스템은 유리하게는 상대적으로 높은 레벨의 항체를 제공하기 위해 내부 리보솜 도입 부위(IRES)를 이용한다. 상용성 IRES 서열은 또한 본 명세서에 도입되는 US 특허 제6,193,980호에 개시된다. 본 기술분야의 기술자는 이러한 발현 시스템이 본 출원에 개시된 항체의 전체 범위를 효과적으로 생산하기 위해 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 선택적으로 결합 분자의 다른 면역글로불린 사슬의 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와의 조합으로, 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 결합 도메인 또는 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
보다 일반적으로, 항체의 모노머성 서브유닛을 암호화하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포 내로의 플라스미드 도입은 본 기술분야의 기술자에게 널리 공지된 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 여기에는 비제한적으로 예로 Fugene　 또는 리포펙타민을 이용한 지질전달감염을 포함하는 전달감염, 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트 침전, 외피 보유 DNA를 이용한 세포 융합, 마이크로주입 및 온전한 바이러스를 이용한 감염이 포함된다. 전형적으로, 숙주 내로의 플라스미드 도입은 표준 칼슘 포스페이트 공침전 방법을 통한다. 발현 구축물을 보유하는 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄 생산에 적절한 조건 하에 성장되며, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 분석된다. 예시적인 분석 기법에는 효소-연관된 면역흡착 분석(ELISA), 방사선 면역분석(RIA), 또는 형광 활성화된 세포 정렬기 분석(FACS), 면역조직화학 등이 포함된다.
발현 벡터는 통상적인 기법에 의해 숙주 세포로 전달되고, 이어서 전달감염된 세포가 통상적인 기법에 의해 배양되어 본 명세서에 기재된 방법에서 이용하기 위한 항체를 생산한다. 따라서 본 발명에는 바람직하게는 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체 또는 그의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 면역글로불린의 적어도 결합 도메인 또는 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 포함된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명에는 또한 항체의 면역글로불린 사슬의 적어도 결합 도메인 또는 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 선택적으로 상기 결합 분자의 다른 면역글로불린 사슬의 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와의 조합으로 포함하는 상기 본 명세서에서 정의된 것과 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포가 포함된다. 이중쇄 항체의 발현을 위한 바람직한 구현예에서, 중쇄 및 경쇄를 모두 암호화하는 단일 벡터 또는 벡터들은 아래에 상세히 나타낸 것과 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공-발현될 수 있다.
숙주 세포는 중쇄 유래된 폴리펩티드를 암호화하는 제1 벡터 및 경쇄 유래된 폴리펩티드를 암호화하는 제2 벡터인 본 발명의 두 발현 벡터로 공-전달감염될 수 있다. 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등 발현을 가능케 하는 동일한 선택 가능 마커를 함유할 수 있다. 다른 한편으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 모두 암호화하는 단일 벡터가 이용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 유리하게는 과량의 독소가 없는 중쇄를 배제하기 위해 중쇄 앞에 배치된다; [Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197] 참조. 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법을 이용해서 구축되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 암호화하는 벡터를 보유하는 세포를 나타낸다. 재조합 숙주로부터 항체의 단리를 위한 절차의 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양"은 이것에 명백히 달리 명시되지 않은 한, 항체 원천을 나타내기 위해 상호교환적으로 이용된다. 달리 말하면, "세포"로부터의 폴리펩티드의 회수는 배지 및 현탁된 세포를 둘 다 함유하는 세포 배양으로부터 또는 전체 세포의 침강으로부터를 의미할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 명세서에 기재된 방법에서 이용하기 위한 항체 분자를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생산되고 후속 정제될 수 있는 운반체를 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 전달감염되는 경우, 원 위치에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 여기에는 비제한적으로 미생물, 예컨대 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예컨대, 에스체리키아 콜라이 , 바실러스 서브틸리스); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예컨대, 사카로마이세스 , 피치아); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈에서 유래된 프로모터(예컨대, 메탈로티오나인 프로모터) 또는 포유류 바이러스에서 유래된 프로모터(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유류 세포 시스템(예컨대, COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3 세포)이 포함된다. 바람직하게는 박테리아 세포, 예컨대 E. 콜라이, 및 보다 바람직하게는 진핵 세포, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 것이 재조합 항체 분자의 발현을 위해 이용된다. 예를 들면, 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 벡터, 예컨대 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주 중기-조기 유전자 프로모터 요소와 함께 항체를 위해 효과적인 발현 시스템이다; 예컨대, [Foecking et al., Gene 45 (1986), 101; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2] 참조.
단백질 발현을 위해 이용되는 숙주 세포주는 종종 포유류 유래이다; 본 기술분야의 기술자는 내부에서 발현될 원하는 유전자 산물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 우선적으로 결정하는 능력이 있다고 믿어진다. 예시적인 숙주 세포주에는 비제한적으로 CHO(중국 햄스터 난소), DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 세포주, DHFR-), HELA(인간 경부암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 이용한 CVI의 유도체), VERY, BHK(아기 햄스터 신장), MDCK, WI38, R1610(중국 햄스터 섬유아세포), BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3x63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)이 포함된다. CHO 및 293 세포가 특히 바람직하다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 공급업체, 미국 조직 배양 은행(American Tissue Culture Collection) 또는 공개 문헌으로부터 이용 가능하다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형하고 가공하는 숙주 세포 계통이 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예컨대, 글리코실화) 및 가공(예컨대, 절단)은 단백질의 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 가공 및 변형을 위한 특징과 특정 기전을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 발현되는 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위해 선택될 수 있다. 상기 목적을 위해, 일차 전사체의 적절한 가공, 유전자 산물의 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 기전을 보유하는 진핵 숙주 세포가 이용될 수 있다.
재조합 단백질의 장기적인 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들면, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 가공될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 이용하기보다, 숙주 세포가 적절한 발현 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종료자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입에 이어, 가공된 세포는 농축 배지 중에 1-2 일 동안 성장하도록 둘 수 있고, 이어서 선택 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드 내의 선택 가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고 세포가 플라스미드를 그의 염색체 내로 안정하게 통합하고 다시 세포주 내로 클로닝되고 증식될 수 있는 초점을 형성하도록 클 수 있게 한다. 상기 방법은 유리하게는 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주를 가공하기 위해 이용될 수 있다.
비제한적으로 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나아제[Wigler et al., Cell 11 (1977), 223], 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제[Szybalska and Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202], 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제[Lowy et al., Cell 22 (1980), 817] 유전자를 포함하는 여러 선택 시스템이 이용될 수 있다. 또한, 항-대사물질 내성이 하기 유전자에 대한 선택의 기반으로 이용될 수 있다; dhfr, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함[Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527]; gpt, 미코페놀산에 대한 내성을 부여함[Mulligan and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072]; neo, 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여함[Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; 및 Morgan 및 Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215]; 및 hygro, 히그로마이신에 대한 내성을 부여함[Santerre et al., Gene 30 (1984), 147]. 이용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 본 기술분야에서 일반적으로 공지된 방법은 본 명세서에 그의 전문이 참조로 포함된 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)]에 기재된다.
항체 분자의 발현 레벨은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있으며, 리뷰를 위해서는 [Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)] 참조. 항체를 발현하는 벡터 시스템 중의 마커가 증폭 가능한 경우, 숙주 세포의 배양에 존재하는 저해제 레벨의 증가는 마커 유전자의 복제수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자에 연관되므로, 항체의 생산도 증가할 것이다; [Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 257] 참조. 시험관내 생산은 다량의 원하는 폴리펩티드를 제공하기 위해 스케일-업을 허용한다. 조직 배양 조건 하의 포유류 세포 배양을 위한 기법은 본 기술분야에 공지되어 있고, 예컨대 에어리프트 반응기 또는 연속 교반기 반응기에서의 동종성 현탁 배양, 또는 예컨대 중공사, 마이크로캡슐, 아가로오스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서의 고정화되거나 트랩핑된 세포 배양이 포함된다. 필요하고/하거나 원하는 경우, 폴리펩티드 용액은, 예를 들면 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스에 걸친 크로마토그래피 또는 (면역-)친화도 크로마토그래피에 의해, 예컨대 합성 힌지 영역 폴리펩티드의 우선적 생합성 이후 또는 본 명세서에 기재된 HIC 크로마토그래피 이전에 또는 이후에 정제될 수 있다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체를 암호화하는 유전자는 또한 비-포유류 세포, 예컨대 박테리아 또는 곤충 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 핵산을 쉽게 섭취하는 박테리아에는 엔테로박테리아세애의 구성원, 예컨대 E. 콜라이 또는 살모넬라 계통; 바실라세애, 예컨대 B. 서브틸리스 ; 뉴모코커스 ; 스트렙토코커스, 및 해모필러스 인플루엔재가 포함된다. 박테리아에서 발현되는 경우, 이종성 폴리펩티드가 전형적으로 봉입체의 일부가 됨이 추가로 이해될 것이다. 이종성 폴리펩티드는 단리되고, 정제되고, 이어서 기능적 분자로 조립되어야 한다. 항체의 4가 형태를 원하는 경우, 서브유닛이 4가 항체로 자가 조립할 것이다; 예컨대, 국제 출원 WO02/096948 참조.
박테리아 시스템에서, 여러 발현 벡터는 항체 분자가 발현되기 위한 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 항체 분자의 약학적 조성물의 생성을 위해 다량의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우, 쉽게 정제되는 고레벨의 융합 단백질 산물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터에는 비제한적으로 항체 코딩 서열은 융합 단백질이 생산되도록 lacZ 코딩 영역의 틀에 놓인 벡터 내로 개별적으로 결찰될 수 있는 E. 콜라이 발현 벡터 pUR278[Ruther et al., EMBO J. 2 (1983), 1791]; pIN 벡터[Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3101-3109; Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509] 등이 포함된다. pGEX 벡터가 또한 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GST)와의 융합 단백질로 외래 폴리펩티드를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며 글루타치온-아가로오스 비드의 매트릭스에 대한 흡착 및 결합에 의해, 이어서 자유 글루타치온의 존재 하 용출에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
원핵 미생물에 부가하여, 진핵 미생물도 이용될 수 있다. 사카로마이세스 세레비시애 또는 일반 빵 효모가 진핵 미생물 중 가장 일반적으로 이용되지만, 여러 다른 계통, 예컨대 피치아 파스토리스도 일반적으로 이용 가능하다. 사카로마이세 스에서의 발현을 위해, 예를 들면 플라스미드 YRp7[Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsman et al., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al., Gene 10 (1980), 157]이 일반적으로 이용된다. 상기 플라스미드는 이미 트립토판에서 성장하는 능력이 없는 효모의 돌연변이체 계통, 예를 들면 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 함유한다[Jones, Genetics 85 (1977), 12]. 이어서 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로 trp1 병소의 존재가 트립토판의 부재 하 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 캘리포니카 핵 다면체 형성 바이러스(AcNPV)가 전형적으로 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로 이용된다. 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다 세포에서 자란다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비필수 영역(예를 들면 폴리헤드린 유전자) 내로 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예를 들면 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 배치될 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 재조합적으로 발현된 경우, 본 발명의 전체 항체, 그의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태는, 예를 들면 크로마토그래피에 의해(예컨대, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 및 크기분별 칼럼 크로마토그래피 후 특이적 항원에 대한 친화도에 의해), 원심분리, 차별적 용해도, 예컨대 암모늄 설페이트 침전 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법을 포함하는 본 기술분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다; 예컨대, [Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)] 참조. 다른 한편으로, 본 발명의 항체의 친화도를 증가시키기 위해 바람직한 방법은 US 특허 공보 2002-0123057 A1에 개시된다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 또한 하기를 포함하는, 항-TTR 항체 또는 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편을 인식하는 항체 또는 그의 면역글로불린 사슬(들)의 제조 방법을 제공한다:
(a) 본 명세서에서 상기 정의된 것과 같은 숙주 세포를 배양하는 단계로, 세포는 이전에 본 명세서에 정의된 것과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 단계; 및
(b) 배양으로부터 상기 항체 또는 그의 면역글로불린 사슬(들)을 단리하는 단계.
또한 한 구현예에서, 본 발명은 또한 본 명세서에 상기 정의된 바와 같거나 항-TTR 항체를 제조하기 위한 상기 방법에 의해 수득 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 항체 또는 그의 면역글로불린 사슬(들)에 관한 것이다.
Ⅴ. 융합 단백질 및 콘주게이트
특정 구현예에서, 항체 폴리펩티드는 보통 항체에 연관되지 않는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시적인 변형이 아래에 보다 상세히 기재된다. 예를 들면, 본 발명의 단일쇄 Fv 항체 절편은 유연한 링커 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기능적 모이어티(예컨대, PEG, 약물, 독소, 또는 표지, 예컨대 형광, 방사활성, 효소, 핵 자기, 중금속 등)를 부가하기 위해 변형될 수 있다.
본 발명의 항체 폴리펩티드는 융합 단백질을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 구성될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들면 적어도 하나의 표적 결합 부위, 및 적어도 하나의 이종성 부분, 즉 자연에서 천연 연결되지 않는 부분을 갖는 면역글로불린 TTR-결합 도메인을 포함하는 키메라 분자이다. 아미노산 서열은 보통 융합 폴리펩티드에서 함께 오는 별도의 단백질로 존재할 수 있거나 이들은 보통 동일한 단백질에 존재할 수 있지만 융합 폴리펩티드에서 새로운 배열로 배치된다. 융합 단백질은, 예를 들면 화학적 합성에 의해 또는 펩티드 영역이 원하는 관계로 암호화되는 폴리뉴클레오티드를 생성하고 번역함으로써 생성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 적용되는 용어 "이종성"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 비교되는 대상의 나머지와 다른 대상으로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들면 본 명세서에서 이용되는 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체, 또는 유사체에 융합될 "이종성 폴리펩티드"는 동일한 종의 비-면역글로불린 폴리펩티드, 또는 상이한 종의 면역글로불린 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에서 유래된다.
본 명세서에서 다른 곳에서 보다 상세히 논의된 것과 같이, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 추가로 N- 또는 C-말단에서 이종성 폴리펩티드에 재조합적으로 융합되거나 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 콘주게이트될 수 있다(공유 및 비공유 콘주게이션 포함). 예를 들면, 항체는 검출 분석에서 표지 및 효과인자 분자, 예컨대 이종성 폴리펩티드, 약물, 방사선핵종 또는 독소로 유용한 분자에 재조합적으로 융합되거나 콘주게이트될 수 있다; 예컨대, 국제 출원 WO92/08495; W091/14438; W089/12624; US 특허 제5,314,995호; 및 유럽 특허 출원 EP 0 396 387 참조.
본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 서로 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산, 즉 펩티드 동배체로 이루어질 수 있고, 20 가지 유전자 암호화된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 항체는 천연 절차, 예컨대 번역 후 가공에 의해 또는 본 기술분야에 널리 공지된 화학적 변형 기법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 기본 교과서 및 보다 상세한 단행본뿐만 아니라 많은 연구 문헌에 잘 기재되어 있다. 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하는 항체 중 또는 모이어티, 예컨대 탄수화물 상 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형이 주어진 항체에서 몇몇 부위에 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 주어진 항체는 여러 유형의 변형을 함유할 수 있다. 항체는, 예를 들면 유비퀴틴화의 결과 분기화될 수 있고, 이들은 분기를 포함하거나 포함하지 않고 고리형일 수 있다. 고리형, 분기화 및 분기화 고리형 항체는 번역 후 천연 절차로부터 야기될 수도 있고 또는 합성 방법에 의해 제조될 수도 있다. 변형에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 부착 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, peg화, 단백질분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 전달 RNA 매개된 아미노산의 단백질에 대한 부가, 예컨대 아르기닐화 및 유비퀴틴화가 포함된다; 예컨대, [Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, (1983) 1-12; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646; Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48-62)] 참조.
본 발명은 또한 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체, 및 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 본 발명의 항체의 임의의 하나 이상의 VH 영역의 아미노산 서열 또는 본 발명의 항체의 임의의 하나 이상의 VL 영역 또는 그의 절편 또는 변이체의 아미노산 서열, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 융합 단백질은 항체, 또는 그의 절편, 변이체, 또는 유도체의 임의의 1, 2, 3 개의 VH-CDR의 아미노산 서열 또는 항체, 또는 그의 절편, 변이체, 또는 유도체의 임의의 1, 2, 3 개의 VL-CDR의 아미노산 서열, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 한 구현예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체, 또는 그의 절편, 유도체, 또는 변이체의 VH-CDR3의 아미노산 서열 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 융합 단백질은 TTR에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 VH 영역의 아미노산 서열 및 본 발명의 항체, 또는 그의 절편, 유도체 또는 변이체의 적어도 하나의 VL 영역의 아미노산 서열, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 융합 단백질의 VH 및 VL 영역은 TTR에 특이적으로 결합하는 단일 원천 항체(또는 scFv 또는 Fab 절편)에 대응한다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 융합 단백질은 항체의 임의의 1, 2, 3 개 이상의 VH CDR의 아미노산 서열 및 항체, 또는 그의 절편 또는 변이체의 임의의 1, 2, 3 개 이상의 VL CDR의 아미노산 서열, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6 개 이상의 VH-CDR(들) 또는 VL-CDR(들)은 본 발명의 단일 원천 항체(또는 scFv 또는 Fab 절편)에 대응한다. 이들 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 또한 본 발명에 포괄된다.
문헌에 보고된 예시적인 융합 단백질에는 T 세포 수용체[Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940]; CD4[Capon et al., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et al., Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; 및 Byrn et al., Nature 344 (1990), 667-670]; L-셀렉틴(귀소 수용체)[Watson et al., J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; 및 Watson et al., Nature 349 (1991), 164-167]; CD44[Aruffo et al., Cell 61 (1990), 1303-1313]; CD28 및 B7[Linsley et al., J. Exp. Med. 173 (1991), 721-730]; CTLA-4[Lisley et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569]; CD22[Stamenkovic et al., Cell 66 (1991), 1133-1144]; TNF 수용체[Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; 및 Peppel et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 1483-1489 (1991]; 및 IgE 수용체 a[Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. 115 (1991), Abstract No. 1448]의 융합이 포함된다.
본 명세서에서 다른 곳에 논의된 것과 같이, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 폴리펩티드의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 또는 본 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 면역분석에서 이용하기 위해 이종성 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 예를 들면 한 구현예에서, PEG는 그의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 항체에 콘주게이트될 수 있다; 예컨대, [Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; 또는 Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512] 참조.
또한, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 그의 정제 또는 검출을 촉진하게 위해 마커 서열, 예컨대 펩티드에 융합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 마커 아미노산 서열은 다수가 시판되는 것들 중에서 헥사-히스티딘 펩티드(HIS), 예컨대 pQE 벡터(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311)에서 제공되는 태그이다. 예를 들면, [Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824]에 기재된 것과 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그에는 비제한적으로 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에서 유래된 에피토프에 대응하는 "HA" 태그[Wilson et al., Cell 37 (1984), 767], GST, c-myc 및 "flag" 태그가 포함된다; 에피토프 태그화 기법의 리뷰에 대해서는, 예컨대 그 요지가 본 명세서에 명시적으로 참조로 포함되는 [Bill Brizzard, BioTechniques 44 (2008) 693-695] 및 여기서 페이지 694의 표 1에서 본 발명에서 이용 가능한 가장 일반적인 에피토프 태그의 목록 참조.
융합 단백질은 본 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용해서 제조될 수 있다; 예를 들면 US 특허 제5,116,964호 및 제5,225,538호 참조. 융합이 일어나는 정확한 부위는 융합 단백질의 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위해 실험적으로 선택될 수 있다. 이어서 융합 단백질을 암호화하는 DNA가 발현을 위해 숙주 세포 내로 전달감염되고, 이는 이전에 본 명세서에 기재된 것과 같이 수행된다.
본 발명의 항체는 콘주게이트되지 않은 형태로 이용될 수도 있고, 또는 예컨대 분자의 치료적 특성을 개선하기 위해, 표적 검출을 촉진하기 위해, 또는 환자의 이미징 또는 치료법을 위해 적어도 하나의 다양한 분자에 콘주게이트될 수도 있다. 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 정제가 수행되는 경우, 정제 이전 또는 이후에 표지되거나 콘주게이트될 수 있다. 특히, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 치료 제제, 전구약물, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약학적 제제 또는 PEG에 콘주게이트될 수 있다.
통상적인 항체를 포함하는 면역독소인 콘주게이트는 본 기술분야에서 널리 설명되었다. 독소는 통상적인 커플링 기법에 의해 항체에 커플링될 수도 있고 또는 단백질 독소 부분을 함유하는 면역독소가 융합 단백질로 생산될 수도 있다. 본 발명의 항체는 이러한 면역독소를 수득하기 위해 해당 방식에서 이용될 수 있다. 이러한 면역독소의 예는 [Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 및 Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54]에 기재된 것들이다.
본 기술분야의 기술자는 콘주게이트가 또한 콘주게이트될 선택된 제제에 따라 다양한 기법을 이용해서 조립될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 바이오틴과의 콘주게이트는, 예컨대 TTR-결합 폴리펩티드를 바이오틴의 활성화된 에스테르, 예컨대 바이오틴 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 반응시킴으로써 제조된다. 유사하게, 형광 마커와의 콘주게이트는 커플링 제제, 예컨대 본 명세서에 기재된 것들의 존재 하에 또는 이소티오시아네이트, 바람직하게는 플루오레신-이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체의 콘주게이트는 유사한 방식으로 제조된다.
본 발명은 진단제 또는 치료제에 콘주게이트된 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체를 추가로 포괄한다. 항체는, 예를 들면 TTR 아밀로이드증의 존재를 나타내어 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR과 연관된 질환 또는 질병을 얻을 위험을 시사하기 위해, 이러한 질환, 예컨대 주어진 치료 및/또는 예방 방식의 유효성을 결정하기 위한 임상적 평가 절차의 일환으로 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR의 발생을 나타내거나 이과 연관된 질환의 발생 또는 질환을 모니터링하기 위해 진단적으로 이용될 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 검출 가능하게 표지된 항체에 관한 것이다. 또한 한 구현예에서, 본 발명은 약물에 부착된 항체에 관한 것이다. 검출은 검출 가능한 물질에 대한 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체의 커플링에 의해 촉진될 수 있다. 검출 가능한 물질 또는 표지는 일반적으로 효소; 중금속, 바람직하게는 금; 염료, 바람직하게는 형광 또는 발광 염료; 또는 방사활성 표지일 수 있다. 검출 가능한 물질의 예에는 다양한 효소, 보철기, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사활성 물질, 다양한 양전자 방출 단층촬영을 이용한 양전자 방출 금속, 및 비방사활성 상자성 금속 이온이 포함된다; 예컨대, 본 발명에 따른 진단제로 이용하기 위해 항체에 콘주게이트될 수 있는 금속 이온에 대해서는 US 특허 제4,741,900호 참조. 적합한 효소의 예에는 홀스래디쉬 페록시다아제, 알칼린 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제 또는 아세틸콜린에스터라아제가 포함되며; 적합한 보철기 복합체의 예에는 스트렙타비딘/바이오틴 및 애비딘/바이오틴이 포함되고; 적합한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함되고; 생체발광 물질의 예에는 루시퍼라아제, 루시페린 및 애쿠오린이 포함되고; 적합한 방사활성 물질의 예에는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc가 포함된다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 검출 가능하게 표지된 항체를 제공하며, 여기서 검출 가능한 표지는 효소, 방사선동위원소, 형광단(fluorophore) 및 중금속으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 또한 이를 화학발광 화합물에 커플링하여 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이어서 화학발광 태그된 항체의 존재는 화학 반응 과정 동안 일어나는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 써로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.
항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체가 검출 가능하게 표지될 수 있는 방식의 하나는 이를 효소에 연결하고 연결된 산물을 효소 면역분석(EIA)에서 이용하는 것이다[Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7; Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523; Maggio, (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981)]. 항체에 결합된 효소는, 예를 들면 분광측정, 형광측정 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생산하는 방식으로 적절한 기질, 바람직하게는 발색 기질과 반응할 것이다. 항체를 검출 가능하게 표지하기 위해 이용될 수 있는 효소에는 비제한적으로 말레이트 탈수소효소, 스타필로코커스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라아제, 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트, 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 홀스래디쉬 페록시다아제, 알칼린 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코오스 옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 리보뉴클레아제, 유레아제, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스터라아제가 포함된다. 추가적으로, 검출은 효소에 대한 발색 기질을 채용하는 비색 방법에 의해 달성될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준물질과 비교하여 기질의 효소 반응 정도의 시각적 비교에 의해 달성될 수 있다.
검출은 또한 임의의 다양한 다른 면역분석을 이용해서 달성될 수 있다. 예를 들면, 항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체를 방사활성적으로 표지함으로써, 방사선 면역분석(RIA)의 이용을 통해 항체를 검출할 수 있다(예를 들면, 본 명세서에 참조로 포함되는 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)] 참조). 방사활성 동위원소는 비제한적으로 감마 계측기, 신틸레이션 계측기 또는 자가방사선촬영을 포함하는 수단에 의해 검출될 수 있다.
항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체는 또한 형광 방출 금속, 예컨대 152Eu, 또는 란탄족 계열의 다른 것들을 이용해서 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이들 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트기를 이용해서 항체에 부착될 수 있다.
항체, 또는 그의 항원-결합 절편, 변이체 또는 유도체에 대한 다양한 모이어티의 콘주게이트션을 위한 기법은 널리 공지되어 있으며, 예컨대 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1987) 623-53; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), (1985) 475-506; "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press (1985) 303-16, 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158] 참조.
전술한 것과 같이, 특정 구현예에서 결합 분자, 예컨대 결합 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 그의 면역특이적 절편의 안정성 또는 유효성을 증강시키는 모이어티가 콘주게이트될 수 있다. 예를 들면 한 구현예에서, PEG는 그의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 결합 분자에 콘주게이트될 수 있다[Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; 또는 Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30 (2002), 512].
Ⅵ. 조성물 및 이용 방법
본 발명은 전술한 TTR-결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 절편 또는 유도체 또는 변이체, 또는 이전에 본 명세서에 정의된 것과 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약학적 조성물이며, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 의도된 이용에 따라 추가 제제, 예컨대 인터류킨 또는 인터페론을 포함할 수 있다. 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR의 발생을 나타내거나 이과 연관된 질환 또는 장애, 예컨대 TTR 아밀로이드증의 치료에서의 이용을 위해, 추가적인 제제는 작은 유기 분자, 항-TTR 항체, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 TTR-결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 절편 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 결합 분자, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포의 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환 또는 장애의 예방적 및 치료적 처치, 대상체에서 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환 장애의 진행 또는 TTR 아밀로이드증 치료에 대한 반응을 모니터링, 또는 대상체의 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환 또는 장애 발생 위험을 결정하기 위한 약학적 또는 진단적 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
따라서 한 구현예에서, 본 발명은 말초 신경계, 자율 신경계, 중추 신경계, 위장관계, 혈관계, 특히 연수막, 림프계, 특히 림프절, 근골격계, 특히 힘줄 및 인대, 심장, 눈, 신장, 폐, 피부, 혀, 갑상선 및 방광과 같이 병이 난 시스템 또는 기관에서 TTR 및/또는 접힘오류화, 조립오류화, 응집된, 돌연변이화 TTR의 비정상적 축적 및/또는 침적에 의해 특정되는 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것으로, 이 방법은 본 발명의 상술된 TTR-결합 분자, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 펩티드 중 임의의 하나의 치료적 유효량을 이들을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 치료적 접근의 특정한 이점은 본 발명의 재조합 항체가 응집된 TTR의 발생을 나타내거나 이과 연관된 질환의 증세 또는 징후, 예컨대 징후없는 돌연변이 및/또는 돌연변이들을 갖지 않고 따라서 접힘오류화, 조립오류화, 돌연변이화 및/또는 응집된 TTR과 관련된 질환을 임상적으로 발현하는 것을 예방하거나 질환 또는 장애의 임상적 발현의 발생 위험을 감소시키거나, 또는 질환 또는 장애의 임상적 발현의 개시 또는 진행을 지연시킬 수 있는 특정한 개연성을 갖는 건강한 인간 대상체로부터의 B 세포 또는 B 메모리 세포로부터 유래된다는 점에 있다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 또한 이미 체세포 성숙, 즉 항체의 가변 영역의 체세포 변이에 의해 표적 TTR 분자에 대해 고친화도 결합에서 선택성 및 효과에 대해 최적화를 성공적으로 거쳤다.
생체내, 예컨대 인간에서 이러한 세포가 자가면역 또는 알러지 반응의 관점에서 관련되거나 다른 생리학적 단백질 또는 세포 구조에 의해 활성화되지 않았다는 지식은 이것이 임상 평가상을 통해 성공적으로 유지될 상당히 증가된 확률을 나타내므로, 또한 커다란 의학적 중요성을 갖는다. 말하자면, 효율성, 허용 가능성 및 내성이 이미 적어도 하나의 인간 대상체에서 예방적 또는 치료적 항체의 전임상 및 임상 개발 전에 이미 드러났다. 따라서 본 발명의 인간 항-TTR 항체는 치료 제제로서의 그 표적 구조-특이적 효율성 및 그 감소된 부작용의 개연성이 모두 그 임상적 성공 개연성을 크게 증가시키는 것으로 예상될 수 있다.
본 발명은 또한 상술된 성분의 하나 이상, 예컨대 본 발명의 항-TTR 항체, 그의 결합 절편, 유도체 또는 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 및/또는 펩티드가 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 각각의 약학적 및 진단적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)에는 인간 투여를 위한 제조, 이용 또는 판매 에이전시에 의한 승인을 반영하는 고지인 약학적 또는 생물학적 제품의 제조, 이용 또는 판매를 규제하는 정부 에이전시에 의해 처방되는 형태의 고지가 연관될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 키트는 적절한 진단 분석에 이용하기 위한 시약 및/또는 지침을 포함한다. 본 발명의 조성물, 예컨대 키트는 물론 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR의 존재에 수반되는 질환 또는 장애의 위험 평가, 진단, 예방 및 치료에 특히 적합하며, 특히 예를 들면, 일반적으로 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP), 가족성 아밀로이드 심근병증(FAC), 노인 전신성 아밀로이드증(SSA), 전신 가족성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환을 포함하는 연수막/중추 신경계(CNS) 아밀로이드증, TTR-연관성 눈 아밀로이드증, TTR-연관성 신장 아밀로이드증, TTR-연관성 고티록신혈증, 수근관 증후군, 회전 근개 파열 및 허리뼈 관 협착증을 포함하는 TTR-연관성 인대 아밀로이드증 및 자간전증과 같은 질환 및/또는 장애를 포함하는 TTR 아밀로이드증에 의해 특정되는 장애의 치료에 적용 가능하다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다; 예를 들면 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472] 참조. 적합한 약학적 담체의 예는 본 기술분야에 널리 공지되어 있고, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 수화제, 멸균 용액 등이 포함된다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다. 이들 약학적 조성물은 적합한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식, 예컨대 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내, 국소 또는 피내 투여 또는 척추 또는 뇌 전달에 의해 수행될 수 있다. 에어로졸 제형, 예컨대 비강 스프레이 제형에는 활성 제제의 정제된 수용액 또는 다른 용액과 보존제 및 등장화제가 포함된다. 이러한 제형은 바람직하게는 비강 점막에 상용성인 pH 및 등장 상태로 조정된다. 직장 또는 질 투여를 위한 제형은 적합한 담체와 함께 좌약으로 제공될 수 있다.
투여 요법은 주치의 및 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 널리 공지된 것과 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 체격, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시점 및 경로, 일반 건강 및 동시 투여되는 다른 약물을 포함하는 여러 요인에 의존한다. 전형적인 용량은, 예를 들면 0.001 내지 1,000 ㎍ 범위일 수 있다(또는 상기 범위의 핵산 발현을 위해 또는 발현 저해를 위해); 그러나 상기 예시적인 범위 이하 또는 이상의 용량이 특히 전술한 요인을 고려하여 계획된다. 일반적으로 투여량은, 예컨대 숙주 체중을 기준으로 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 보다 일반적으로 0.01 내지 5 ㎎/㎏(예컨대, 0.02 ㎎/㎏, 0.25 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 0.75 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏ 등)의 범위일 수 있다. 예를 들면 투여량은 체중을 기준으로 1 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ 또는 1-10 ㎎/㎏의 범위 내, 바람직하게는 적어도 1 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 범위의 중간 용량도 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다. 대상체에는 이러한 용량이 매일, 또는 수 일마다, 매주, 또는 실험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 일정에 따라 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 연장된 기간, 적어도 6 개월에 걸친 다중 투여량으로의 투여를 수반한다. 추가적인 예시적인 치료 요법은 2 주마다 또는 1 개월마다 또는 3 내지 6 개월마다 1 회 투여를 수반한다. 예시적인 투여 일정에는 연속일로 1-10 ㎎/㎏ 또는 15 ㎎/㎏, 수 일마다의 30 ㎎/㎏ 또는 매주 60 ㎎/㎏이 포함된다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 둘 이상의 모노클론 항체가 동시에 투여되며, 이 경우 투여되는 각 항체의 투여량은 나타낸 범위 내에 속한다. 진행은 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제조물에는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼이 포함된다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체에는 식염수 및 완충 배지를 포함하는 물, 알코올계/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 운반체에는 나트륨 클로라이드 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 나트륨 클로라이드, 락테이트화 링거, 또는 고정 오일이 포함된다. 정맥내 운반체에는 유체 및 영양분 보충제, 전해질 보충제(예컨대 링거 덱스트로오스에 기반한 것들) 등이 포함된다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 의도하는 용도에 따라 추가 제제, 예컨대 도파민 또는 정신약리적 약물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 예를 들면 본 발명의 약학적 조성물이 수동 면역화를 위해 TTR 항체 또는 그의 결합 절편, 유도체 또는 변이체를 포함하는 경우, 백신으로 제형화될 수 있다. 배경 섹션에 언급된 것과 같이, 접힘오류화, 조립오류화, 돌연변이화 및/또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편 또는 유도체는 TTR 아밀로이드증의 주요 유발자이다. 따라서, 본 발명의 인간 항-TTR 항체 및 동등한 TTR-결합 분자를 이용한 수동 면역화가 능동 면역화 치료법 개념의 몇몇 역효과 우회를 돕고 TTR의 감소된 응집을 유도할 것임을 예상하는 것이 신중하다. 따라서 본 발명의 항-TTR 항체 및 그의 균등물은, 예를 들면 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP), 가족성 아밀로이드 심근병증(FAC), 노인 전신성 아밀로이드증(SSA), 전신 가족성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환을 포함하는 연수막/중추 신경계(CNS) 아밀로이드증, TTR-연관성 눈 아밀로이드증, TTR-연관성 신장 아밀로이드증, TTR-연관성 고티록신혈증, 수근관 증후군, 회전 근개 파열 및 허리뼈 관 협착증을 포함하는 TTR-연관성 인대 아밀로이드증 및 자간전증과 같이 응집된 TTR을 존재를 보여주거나 이것에 의해 유발되는 질환 또는 장애를 예방 또는 개선하기 위한 백신으로 특히 유용할 것이다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체의 재조합 Fab(rFab) 및 단일쇄 절편(scFv)를 이용하는 것이 유익할 수 있으며, 이는 세포막을 보다 쉽게 침투할 수 있다. 예를 들면, 온라인에 먼저 공개된 [Robert et al., Protein Eng. Des. Sel. (2008); S1741-0134]는 Αbeta의 N-말단 영역에서 에피토프를 인식하는 모노클론 항체 WO-2의 키메라 재조합 Fab(rFab) 및 단일쇄 절편(scFv)의 이용을 기재한다. 가공된 절편은 효율적으로 (ⅰ) 아밀로이드 섬유화를 예방하고, (ⅱ) 사전 형성된 Αbeta1-42 섬유를 분해하고, (ⅲ) 전체 IgG 분자만큼 시험관내 Αbeta1-42 올리고머-매개된 신경독성을 저해할 수 있었다. 효과인자 기능이 없는 작은 Fab 및 scFv 가공된 항체 포맷을 이용하는 인지되는 장점에는 혈액-뇌 장벽에 걸친 보다 효율적인 통과 및 염증성 부작용의 유발 위험 최소화가 포함된다. 또한 scFv 및 단일-도메인 항체는 전장 항체의 결합 특이성을 보유하는데 더하여, 이들이 단일 유전자로 그리고 인트라바디로서 포유류 세포에서 세포내 발현될 수 있고, 그의 표적의 접힘, 상호작용, 변형 또는 세포하 편재의 변형 가능성을 갖는다; 리뷰에 대해서는, 예컨대 [Miller and Messer, Molecular Therapy 12 (2005), 394-401] 참조.
상이한 접근에서 [Muller et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241]는 소위 'SuperAntibody 기술'이라는 기술 플랫폼을 설명하며, 이는 항체가 살아있는 세포에 해를 끼치지 않고 내부로 들어갈 수 있도록 만든다고 한다. 이러한 세포-침투 항체는 새로운 진단 및 치료 관점을 열어준다. 용어 '트랜스맙(TransMab)'이 이들 항체에 대해 새로 만들어졌다.
추가적인 구현예에서, 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR의 발생과 연관된 질환 또는 장애의 치료에 유용한 다른 항체의 공-투여 또는 순차적 투여가 바람직할 수 있다. 한 구현예에서, 추가적인 항체가 본 발명의 약학적 조성물에 포함된다. 대상체를 치료하기 위해 이용될 수 있는 항체의 예에는 비제한적으로 CD33, SGLT2, IL-6 및 IL-1을 표적으로 하는 항체가 포함된다.
추가적인 구현예에서, 접힘오류화, 조립오류화, 돌연변이화 및/또는 응집된 TTR과 연관된 질환 또는 장애의 치료에 유용한 다른 제제의 공-투여 또는 순차적 투여가 바람직할 수 있다. 한 구현예에서, 추가적인 제제가 본 발명의 약학적 조성물에 포함된다. 대상체를 치료하기 위해 이용될 수 있는 제제의 예에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 타파미디스, 메글루민, 디플루시날, 우르소데옥시콜산을 갖는 독시사이클린과 같은 TTR-테트라머를 안정화시키는 제제; 디플루시날, 콜티코스테로이드, 2-(2,6-디클로라닐리노)페닐아세트산(디클로페낙), 이소-부틸-프로판노익-페놀산(이부프로펜)과 같은 항-염증제; 이뇨제, 에피갈로카테킨 갈레이트, 멜팔란 히드로클로라이드, 덱사메타손, 보르테조밉, 보르테조밉-멜팔라, 보르테조밉-덱사메타손, 멜팔란-덱사메타손, 보르테조밉-멜팔란-덱사메타손; 항우울제, 정신병약, 신경이완제, 항-치매제(예컨대, NMDA-레젭터 길항제 메난틴), 아세틸콜린에스테라아제 저해제(예컨대, 도네페질, HCI, 리바스티그민, 갈란타민), 글루타맷-길항제 및 다른 향정신성 혈압 약물(예컨대, 디히드랄라진, 메틸도파), 세포분열억제제, 글루코콜티코이드, 안지오텐신-전환-효소(angiotensin-converting-enzyme, ACE) 저해제; 항-염증제 또는 이들의 임의의 조합. 임상적 기관 이식 후 기관 거부를 치료하거나 예방하기 위해 이용될 수 있는 제제의 예에는 비제한적으로 시클로스포린 및 타크롤리무스와 같은 칼시네우린 저해제, 에베롤리무스 및 시롤리무스(라파마이신)를 포함하는 mTOR 저해제와 같은 증식 저해제 및 아자티오프린, 마이코페놀랫 모페틸/MMF 및 마이코페놀산과 같은 항대사물질을 포함하는 면역 시스템의 약화를 유도하는, 즉 면역억제제 군의 제제를 포함하고, 또한 콜티손 및 콜티솔과 같은 콜티코스테로이드 및 프레드니손 또는 프레드니솔론과 같은 합성 물질이 사용될 수 있다. 추가적으로, 항-IL2-수용체 모노클론 항체(예컨대, 바실릭시맙, 다실리주맙)뿐만 아니라 항-CD3 모노클론 항체(예컨대, 무로모납-CD3) 및 항-티모사이트 글로불린(anti-thymocyte globulin, ATG)과 같은 폴리클론 항체; 및 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1) 수용체 작용제(예컨대, [Noguchi et al., Acta Med. Okayama, 60 (2006)] 및 국제 출원 WO2012/088157 참조]와 같은 항체가 사용될 수 있다. 또한, 추가적인 제제는 발간시클로비어, 사이토메갈리-이뮤노글로불린, 강사이클로비어, 암포테리신 B, 피리메타민, 라니티딘, 라미프릴, 푸로세마이드, 벤즈브로마론을 포함하는 기관 이식 후 감염 및 다른 부작용의 예방 및 치료용 제제를 포함할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, TTR 아밀로이드증을 치료하거나 및/또는 임상적 간 이식 후 기관 거부를 치료하거나 예방하는데 유용한 추가적인 제제를 추가로 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 약학적 조성물과 동시에 이용될 수 있는 다른 제제의 예는 본 기술분야에 기재되어 있다; 예컨대, 국제 출원 WO2009005672, WO2010128092, WO2012088157 또는 유럽 출원 EP11158212.8 참조.
치료 유효 용량 또는 양은 증상 또는 상태를 완화하기 충분한 활성 성분의 양을 나타낸다. 이러한 화합물의 치료적 유효성 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 절차, 예컨대 ED50(모집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량) 및 LD50(모집단의 50%에 대한 치사 용량)에 의해 결정될 수 있다. 치료 및 독성 효과 간의 용량비는 치료 지수이며, 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다.
상기로부터, 본 발명이 특히 전술한 것과 같은 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편과 연관된 질환, 예컨대 TTR 아밀로이드증의 진단 및/또는 치료를 위한, 상술된 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 TTR-결합 분자 및/또는 그의 절편의 임의의 용도를 포괄함이 자명하다. 바람직하게는, 상기 결합 분자는 본 발명의 항체 또는 그의 면역글로불린 사슬이다. 또한, 본 발명은 이전에 본 명세서에 기재된 전술한 항체 중 임의의 하나의 항-이디오타입 항체에 관한 것이다. 이들은 항원-결합 부위 근처의 항체의 가변 영역 상에 위치하는 독특한 항원성 펩티드 서열에 결합하며, 예컨대 대상체로부터 수득되는 샘플 중 항-TTR 항체의 검출을 위해 유용한 항체 또는 다른 결합 분자이다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 TTR과 연관된 장애의 예방적 처치, 치료적 처치 및/또는 진행 또는 치료에 대한 반응 모니터링에서 이용하기 위한 상기에서 본 명세서에 그리고 아래에 정의된 것과 같은 항체 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 TTR-결합 분자, 본 명세서에 정의된 것과 같은 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 또는 이들 중 임의의 하나를 포함하는 약학적 또는 진단적 조성물을 제공하며, 바람직하게는 상기 장애는 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP), 가족성 아밀로이드 심근병증(FAC), 노인 전신성 아밀로이드증(SSA), 전신 가족성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환을 포함하는 연수막/중추 신경계(CNS) 아밀로이드증, TTR-연관성 눈 아밀로이드증, TTR-연관성 신장 아밀로이드증, TTR-연관성 고티록신혈증, 수근관 증후군, 회전 근개 파열 및 허리뼈 관 협착증을 포함하는 TTR-연관성 인대 아밀로이드증 및 자간전증을 포함하는 군으로부터 선택된다. 상기 질환 또는 장애군은 TTR 아밀로이드증과 연관된 장애군으로 불릴 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 상술된 TTR-결합 분자, 항체, 항원-결합 절편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 및/또는 펩티드 중 임의의 하나 및 선택적으로 검출에 적합한 수단, 예컨대 면역- 또는 핵산-기반 진단 방법에서 통상적으로 이용되는 시약을 포함하는 진단적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체는, 예를 들면 이들이 액상으로 이용되거나 고상 담체에 결합될 수 있는 면역분석에서 이용하기 적합하다. 본 발명의 항체를 이용할 수 있는 면역분석의 예는 직접적 또는 간접적 포맷의 경쟁적 및 비경쟁적 면역분석이다. 이러한 면역분석의 예는 방사선 면역분석(RIA), 샌드위치(면역계측 분석), 유세포 측정 및 웨스턴 블롯 분석이다. 본 발명의 항원 및 항체는 여러 상이한 담체에 결합되고 이에 특이적으로 결합된 세포를 단리하기 위해 이용될 수 있다. 널리 공지된 담체의 예에는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로오스, 천연 및 변형된 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로오스 및 마그네타이트가 포함된다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 가용성 또는 불용성일 수 있다. 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 여러 상이한 표지 및 표지 방법이 존재한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 표지 유형의 예에는 효소, 방사성동위원소, 콜로이드성 금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생체발광 화합물이 포함된다; 또한 상기 본 명세서에 논의된 구현예 참조.
추가적인 구현예에 의해, TTR-결합 분자, 특히 본 발명의 항체는 또한 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플, 림프 샘플 또는 임의의 다른 체액 샘플, 예컨대 침 또는 소변 샘플일 수 있는 시험된 개인으로부터의 체액 샘플을 수득하고 체액 샘플을 항체-항원 복합체 형성을 가능케 하는 조건 하에 본 발명의 항체와 접촉시킴으로써 개인에서 질환 또는 장애의 진단 방법에서 이용될 수 있다. 이어서 이러한 복합체의 레벨이 당 분야에 공지된 방법에 의해 결정되고, 결정되고, 대조군 샘플에서 형성된 것보다 유의미하게 더 높은 레벨은 시험된 개인에서 질환 또는 장애를 시사한다. 동일한 방식으로, 본 발명의 항체에 의해 결합된 특정 항원이 또한 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 절편을 포함하는 시험관내 면역분석에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 구현예에서, TTR-결합 분자, 특히 본 발명의 항체는 또한 피부, 침샘, 모근, 심장, 결장, 신경, 피하 지방 검체 또는 병이 난 임의의 기관일 수 있는 테스트된 개인으로부터의 검체를 수득함으로써 개인에서 질환 또는 장애의 진단 방법에 사용될 수 있다.
상기 맥락에서, 본 발명은 또한 상기 목적을 위해 특이적으로 설계된 수단에 관한 것이다. 예를 들면, 항체-기반 어레이가 이용될 수 있고, 여기에는 예를 들면 TTR을 특이적으로 인식하는 본 발명의 항체 또는 동등한 항원-결합 분자가 로딩된다. 마이크로어레이 면역분석의 설계는 [Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696]에 요약된다. 따라서 본 발명은 또한 본 발명에 따라 확인된 TTR-결합 분자가 로딩된 마이크로어레이에 관한 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편과 연관된 질환 또는 장애의 진단 방법에 관한 것으로, 이 방법은 진단받을 대상체로부터의 샘플에서 TTR 및/또는 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR의 존재를 본 발명의 적어도 하나의 항체, 그의 TTR-결합 절편 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 TTR-결합 분자로 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 병리학적으로 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR의 존재는 TTR 아밀로이드증을 시사하며, 생리학적 TTR의 레벨에 비해 병리학적으로 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR의 레벨 증가는 상기 대상체에서 TTR 아밀로이드증의 진행을 시사한다.
진단받을 대상체는 무증상이거나 질환에 대해 임상 전 단계일 수 있다. 바람직하게는, 대조군 대상체는 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR과 연관된 질환, 예컨대 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP), 가족성 아밀로이드 심근병증(FAC) 또는 노인 전신성 아밀로이드증(SSA)을 가지며, 여기서 병리학적으로 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR의 레벨 및 기준 표준 사이의 유사성은 진단받을 대상체가 TTR 아밀로이드증을 갖고 있거나 TTR이 발생할 위험이 있다는 것을 시사한다. 제2 대조군으로서 대안적으로, 또는 부가적으로, 대조군 대상체는 TTR 아밀로이드증을 갖지 않으며, 여기서 생리학적 TTR 및/또는 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR의 레벨 및 기준 표준 사이의 차이는 진단받을 대상체가 TTR 아밀로이드증을 갖거나 TTR 아밀로이드증이 발생할 위험이 있다는 것을 시사한다. 바람직하게는, 진단받을 대상체 및 대조군 대상체(들)는 연령 매치된다. 분석될 샘플은 병리학적으로 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR을 함유하는 것으로 추정되는 임의의 체액, 예를 들면 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 복수, 침 또는 뇌척수액(CSF)일 수 있다.
생리학적 TTR 및/또는 병리학적으로 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR의 레벨은, 예컨대 웨스턴 블롯, 면역침전, 효소-연관된 면역 흡착 분석(ELISA), 방사선 면역분석(RIA), 형광 활성화된 세포 정렬(FACS), 2 차원 겔 전기영동, 질량 분광측정(MS), 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화-비행시간-MS(MALDI-TOF), 표면 증강된 레이저 탈착 이온화-비행시간(SELDI-TOF), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 다차원 액체 크로마토그래피(LC)에 이은 직렬 질량 분광측정(MS/MS), 및 레이저 밀도측정에서 선택된 하나 이상의 기법에 의한 TTR의 분석을 포함하는 본 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 바람직하게는, TTR의 상기 생체내 이미징은 신티그래피, 양전자 방출 단층촬영(PET), 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT), 근적외선(NIR) 광학 이미징 또는 자기 공명 이미징(MRI)을 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 TTR 아밀로이드증의 진단, 상기 질환 치료의 모니터링 및 조직- 및 생검-부재, 즉 비-침습적 방법에서 항-TTR 약물의 진단적 또는 치료적 유용성을 결정하는 것에 관한 것이다.
보통, 체액, 예를 들면 혈액 혈장에서 검출될 수 있는 TTR 응집체 및/또는 접힘오류화 TTR의 농도는 매우 낮고, 따라서 TTR 아밀로이드증의 진단은 힘들고 시간-소모적이다. 특히, TTR 아밀로이드증 질환의 진단은 어렵고 긴 공정이며, 다양한 질환들이 매우 유사한 증세 및 징후를 나타내기 때문에, 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP), 가족성 아밀로이드 심근병증(FAC) 및 노인 전신성 아밀로이드증(SSA)의 공식적인 진단은 전형적으로 조직 생검의 수집 및 복잡한 조직학적 염색 기술에 의한 TTR 아밀로이드 침적체의 확인을 필요로 한다. 조직 생검은 매우 작고 TTR 아밀로이드 침적체는 분산되어 있기 때문에, TTR 아밀로이드증의 조직학적 결정은 전형적으로 위음성 결과의 빈도가 높고 환자들을 지체시킨다.
그러나, 본 발명에 따르면, 놀랍게도 대상체에 항-TTR 항체를 단일 투여한 후 응집체 및/또는 혈액 내의 항-TTR 항체에 결합된 접힘오류화 TTR의 측정이 가능하였다; 실시예 13 및 도 14 참조. 따라서, 아밀로이드성 TTR 침적체로부터 TTR을 제거하고 혈액 내로 운반하는 본 발명의 항-TTR 항체의 잠재적인 독특한 특성으로 인하여, 환자 또는 대상체에서 접힘오류화, 돌연변이화 및/또는 응집된 TTR과 연관된 질환의 신규한 진단 방법이 개발되었고, 상기 방법은 TTR 아밀로이드 질환의 진단 공정에서 조직 생검 및 조직학적 분석을 대체할 가능성이 있다. 상기 방법은 환자에 주사되고 환자 신체의 어느 곳에서 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR 단백질의 존재를 탐침하기 위해 사용되는 TTR 단백질의 병리학적 입체형태에 특이적인 항체의 사용에 의존한다. 환자에 항체를 주사한 후 짧은 지체, 예를 들면 2 일 후, 혈액 샘플을 취하고 상기 항체가 TTR 침적체로부터 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR 입자를 포획 및 분리하는지 여부를 검출하기 위해 사용된다. 조직학과 비교하여 상기 방법의 주요 이점은 환자에게 항-TTR 항체의 주사를 직접 해야 한다는 것이며, 혈액 순환이 모든 조직 및 기관을 통해 이를 순환하게 하고, 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR 단백질의 검출은 그 편재와 무관하게 침적된다.
따라서, 추가적인 측면에서, 본 발명은 대상체에 항-TTR 항체를 투여한 후 대상체 유래의 샘플에서 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR의 레벨을 분석하는 단계를 포함하는 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환의 진단 방법에 관한 것으로서, 여기서 항-TTR 항체의 투여 전에 대상체로부터 수득한 샘플과 같은 대조군과 비교하여 상기 대상체의 샘플 내의 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR의 존재 또는 상승된 레벨은 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환을 나타낸다. 또한, 실시예 13에 나타낸 것과 같이, 상기 신규한 방법은 또한 각각 항-TTR 약물 및 TTR 아밀로이드증의 치료 과정의 특성분석에 유용하기 때문에, 본 발명의 신규한 방법은 또한 항-TTR 항체를 이용한 질환의 치료를 모니터링하거나 항-TTR 항체의 진단적 또는 치료적 유용성을 결정하기 위한 의도이다. 상기 문맥에서, 본 기술분야의 기술자는 본 발명의 방법이 항-TTR 항체의 치료적 유용성 및 효능의 조사에 한정되지 않고 TTR 아밀로이드 침적체를 분해할 수 있는 다른 종류의 항-TTR 약물에도 적용가능함을 인식할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 항-TTR 항체는 다른 항-TTR 약물과의 조합으로 투여될 수 있고, 치료되는 대상체의 샘플에서 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR의 레벨은 상기 항-TTR 항체 및 항-TTR 약물 모두 투여 이전이지만 항-TTR 항체만 치료한 후에 상기 대상체로부터 수득된 대조군과 비교된다.
본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 특히 실시예 13에서 예시된 것과 같은 재조합 인간-유래의 항체 및 인간에서 사용하기 위한 의도인 다른 항-TTR 항체를 테스트하기 위해 비-인간 동물을 이용할 때, 일반적으로 샘플 내의 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR의 레벨은, 예를 들면 항-인간 IgG 또는 항-이디오타입 항체를 이용한 면역-침전에 의해 상기 항-TTR 항체와 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR 사이에 형성된 복합체를 결정함으로써 분석된다. 다른 한편으로, 약물 후보 항-TTR 항체의 에피토프와 실질적으로 상이한 다른 에피토프에서 TTR을 인식하는 제2 항-TTR 항체를 사용하여 약물 후보 항-TTR 항체와 TTR에 의해 형성된 복합체에 결합하고, 따라서 예를 들면 ELISA 또는 면역-침전에 의해 그 존재를 검출할 수 있다.
특히 인간 대상체 및 환자에 대한 진단 측면과 관련하여, 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR 및 항-TTR 항체와의 복합체의 상승된 레벨은 각각 인체, 예를 들면 환자 또는 대상체의 심장, 말초 신경계(PNS), 눈, 근육, 위장관, 신장, 혈관계 및 중추 신경계에서의 TTR 아밀로이드 침적체의 존재를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법은 한편으로는 대상체의 신체에서 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환을 확인 및 결정하고, 다른 한편으로는 대상체의 신체로부터 TTR 침적체를 제거하도록 하며, 이로 인해 또한 항-TTR 항체와 같은 TTR 아밀로이드증 특이적 약물의 해당 치료 및 효능의 치료적 진행을 나타낸다.
따라서, 실시예 13에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 항-TTR 항체는 병리학적 TTR 침적체의 안정성을 변경하기에 충분한 친화도로 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR에 결합하여서, 신체, 특히 혈액 내에서 상기 침적체로부터 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR을 포획 및 제거할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용되는 항-TTR 항체는 TTR의 병리학적 입체형태, 즉 접힘오류화, 돌연변이화 및/또는 응집된 TTR에 특이적인 임의의 TTR 항체일 수 있다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 조직-부재 방법에서 이용되는 항-TTR 항체는 본 명세서에 개시되고 실시예에서 예시된 본 발명의 항-TTR 항체 또는 TTR-결합 분자이다.
상기 문맥에서, 항-TTR 항체는, 예를 들면 전술한 임의의 다른 구현예에 대해 개시된 것과 같은 검출가능한 표지에 부착되어 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 항-TTR 항체 및 펩티드에 기반한 본 기술분야에 알려지고 다른 진단 방법에서 개시된 것과 같은 웨스턴 블롯, 점 블롯, (샌드위치) ELISA 등과 같은 면연분석이 본 발명의 신규한 TTR 아밀로이드 분석에 채용될 수 있다.
TTR 아밀로이드 분석을 이용하는 실시예 13 및 도 14에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 항-TTR 항체는 TTR 아밀로이드 침적체로부터 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR을 포획 및 분리할 수 있고 대응하는 면역-복합체는 체액, 특히 환자 또는 대상체 혈액의 샘플에서 측정될 수 있는 것으로 나타날 수 있다; 실시예 13 및 도 14 참조. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 상기 항-TTR 항체는, 예컨대 심장, 말초 신경계(PNS), 눈, 근육, 위장관, 신장, 혈관계 및 중추 신경계(CNS)로부터 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR의 순 유출을 변경하기에 충분한 친화도로 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR에 결합할 수 있다.
항-TTR 항체에 결합된 포획 및 분리된 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR이 존재하는 체액 샘플, 바람직하게는 대상체 유래의 혈액 또는 CSF는 투여 후 명시된 시간 간격에서 수득된다. 투여 후의 상기 명시된 시간 간격은 전형적으로 1 주 이하이다. 바람직한 구현예에서, 항-TTR 항체 투여 후의 상기 시간 간격은 48 시간 이하이다.
전술한 것과 같이, 상기 개시된 조직-부재 방법은 또한 예컨대 치료 전후에 항-TTR 항체에 의한 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR 종 포획을 측정함으로써 치료의 성공을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 추가적인 또는 부가적인 구현예에서, 본 발명의 본 발명의 조직-부재 방법은 체액 샘플에서의 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR의 레벨과 항-TTR 항체의 투여 전에 대상체로부터 수득된 샘플 사이를 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 방법은 TTR 아밀로이드증의 치료의 효과를 결정하거나 환자 때는 대상체에서 병리학적 TTR과 연관된 질환 또는 질병의 진행을 모니터링하기 위해 사용된다.
전술한 것과 같이, 전술한 방법에서 이용되는 대상체의 샘플은 항-TTR 항체의 투여 전후에 수득될 수 있다. 그러나, 샘플은 또한 의료 시설 또는 개업한 내과의사뿐만 아니라 대상체로부터의 임상적 샘플이 수득될 수 있는 다른 기관으로부터 수득될 수 있다. 상기 시설, 내과의사 등은 대상체에 항-TTR 항체의 투여하고 전술한 방법에서 사용하기 위한 적절한 샘플의 수집을 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 예컨대 항체 투여의 양, 시간, 빈도를 변화시키고, 치료를 중단하고, 적어도 다른 항-TTR 항체 또는 치료제에 의해 항-TTR 항체를 교체 또는 조합시킴으로써 환자를 모니터링 및/또는 치료할 수 있다. TTR의 레벨은 본 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 적합한 방법은 아래에 및 그 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 출원 WO2013/066818에 개시되어 있다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 TTR-결합 분자, 상기 본 명세서에서 정의된 것과 같은 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 또는 이들 중 임의의 하나를 포함하는 약학적 또는 진단적 조성물이 TTR과 연관된 질환 또는 장애의 예방적 처치, 치료적 처치 및/또는 진행 또는 치료에 대한 반응의 모니터링에서의 이용을 위해 제공된다. 따라서 일반적으로, 본 발명은 또한 대상체에서 TTR과 연관된 질환 또는 장애(예컨대 TTR 아밀로이드증)의 진단 또는 진행 모니터링 방법에 관한 것이며, 이 방법은 진단받을 대상체로부터의 샘플 중 TTR의 존재를 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 TTR-결합 분자로 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 또는 그의 절편의 존재는 질환 또는 장애를 시사한다. 한 구현예에서, 대상체에서 TTR 아밀로이드증의 진단 또는 진행 모니터링 방법이 제공되며, 이 방법은 진단받을 대상체로부터의 샘플 중 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 및/또는 그의 절편의 존재를 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 TTR-결합 분자로 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 및/또는 그의 절편의 존재는 전증상, 전구기 또는 임상적 TTR 아밀로이드증을 시사하고, 생리학적 TTR 레벨에 비해 또는 건강한 대조군 대상체 또는 동일한 대상체로부터의 대조군 샘플에서 유래된 기준 샘플에 비해 TTR 올리고머, 응집체 또는 섬유의 레벨 증가는 전증상, 전구기 또는 확립된 TTR 아밀로이드증을 시사한다. 본 기술분야의 기술자는 한 구현예에서 상기 방법이 상기 본 명세서에 정의된 것과 같은 TTR과 연관된 장애군으로부터의 임의의 다른 질환 또는 장애의 진단 또는 진행 모니터링에도 이용됨을 이해할 것이다.
상기 나타낸 것과 같이, 본 발명의 항체, 그의 절편 및 항체 및 그의 절편과 동일한 결합 특이성을 갖는 분자가 시험관내뿐만 아니라 생체내에서도 이용될 수 있으며, 진단에 더하여 치료적 적용도 추구될 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 또한 인간 또는 동물 신체에서 TTR에 대한 치료제 및/또는 진단제의 생체내 검출/이미징 또는 표적화를 위한 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 TTR 결합 분자에 관한 것이다. 잠재적인 치료제 및/또는 진단제는 TTR 아밀로이드증의 치료에 유용한 치료 제제 및 이전에 본 명세서에 나타낸 것과 같은 잠재적 표지의 비제한적 열거로부터 선택될 수 있다. 생체내 이미징에 대한 한 바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 상기 TTR 결합 분자를 제공하며, 여기서 상기 생체내 이미징은 신티그래피, 양전자 방출 단층촬영(PET), 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT), 근적외선(NIR) 광학 이미징 또는 자기 공명 이미징(MRI)을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 본 발명은 또한 상기 본 명세서에 정의된 것과 같은, 대상체에서 TTR과 연관된 질환 또는 장애의 진단 또는 진행 모니터링 방법에 이용하기 위해 상기 특정된 생체내 이미징 방법을 위한 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항체의 적어도 하나의 CDR, 또는 상기 분자를 포함하는 상기 TTR-결합 분자를 제공한다.
Ⅶ. 응집 특이적 TTR 에피토프를 갖는 펩티드
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 항체에 의해 특이적으로 인식되는 TTR의 에피토프를 갖는 펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 펩티드는 항체 또는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 그의 변형된 서열에 의해 인식되는 독특한 선형 에피토프로서 서열번호 49, 서열번호 50, 또는 서열번호 51에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 펩티드는 본 발명의 임의의 항체, 바람직하게는 NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 또는 NI-301.12D3에 의해 인식된다.
본 발명의 한 구현예에서, 이러한 펩티드는 상기 대상체의 생물학적 샘플 중 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 결정하는 단계, 및 상술된 본 발명의 펩티드를 인식하는 항체 레벨을 측정하고 필적하는 연령 및 성별의 건강한 대상체에서 확인되는 레벨과 측정을 비교함으로써 상기 대상체에서 이러한 질환의 진단을 위해 이용되는 단계를 포함하여, 대상체에서 접힘오류화, 조립오류화 또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편과 연관된 질환 또는 장애, 예컨대 TTR 아밀로이드증의 진단 또는 모니터링에 이용될 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 대상체의 생물학적 샘플 중 상기 정의된 것과 같은 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 전증상 또는 임상적 FAP 및/또는 FAC를 시사하는 TTR 아밀로이드증의 진단 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 따르면, 본 발명의 상기 펩티드에 특이적인 측정된 항체의 상승된 레벨은 상기 대상체에서 전증상 또는 임상적 FAP 및/또는 FAC의 진단 또는 상기 대상체에서 상기 본 명세서에 정의된 것과 같은 TTR과 연관된 장애군으로부터의 임의의 다른 질환 또는 장애의 진단을 시사한다. 또한, 본 발명의 펩티드는 인간 유래의 치료적으로 유효한 항체의 에피토프를 함유하고 있기 때문에, 이러한 펩티드는 물론 항원, 즉 대상체에서 면역 반응을 일으키고 생체내에서 본 발명의 항체의 생산을 자극하는 면역원으로 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 이전에 본 명세서에 기재된 것과 같이 각각 어레이, 키트 및 백신과 같은 조성물로 제형화될 수 있다. 상기 맥락에서, 본 발명은 또한 TTR 아밀로이드증의 진단 또는 진행 모니터링에 유용한 키트에 관한 것이며, 상기 키트는 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 이들 중 임의의 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 TTR-결합 분자, 각각 이전에 본 명세서에 정의된 것과 같은 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 및/또는 펩티드를 선택적으로 시약 및/또는 사용 지침과 함께 포함한다.
이들 및 다른 구현예가 본 발명의 설명 및 실시예에 개시되고 포괄된다. 본 발명에 따라 채용될 물질, 방법, 용도 및 화합물 중 임의의 하나에 관한 추가 문헌은, 예를 들면 전자 장치를 이용해서 공공 라이브러리 및 데이터베이스로부터 검색될 수 있다. 예를 들면 공공 데이터베이스 "Medline"이 이용될 수 있고, 이는 국립 위생 연구소의 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 및/또는 국립 의약 라이브러리(NLM.NIH)에 의해 호스팅된다. 추가 데이터베이스 및 웹 주소, 예컨대 유럽 분자 생물학 연구소(European Molecular Biology Laboratory, EMBL)의 일부인 유럽 바이오인포마틱스 연구소(European Bioinformatics Institute, EBI)의 것들은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있고, 인터넷 검색 엔진을 이용해서도 수득될 수 있다. 후행 검색 및 현재 인지를 위해 유용한 관련 특허 정보 출처의 조사 및 생명공학에서 특허 정보의 리뷰가 [Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364]에 제공된다.
상기 개시는 본 발명을 일반적으로 설명한다. 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 용어는 2000 년 개정되고 2003 년 재인쇄된 [Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, ISBN 0 19 850673 2]에 제공된 것과 같은 정의로 주어진다. 몇몇 문헌이 본 명세서의 텍스트에 걸쳐 인용된다. 전체 서지학적 인용은 특허청구범위 바로 앞에 있는 명세서 말단에서 확인될 수 있다. 모든 인용된 참고문헌의 내용(배경기술 항목을 포함하여 본 출원에 걸쳐 인용된 문헌 참조, 허여된 특허, 공개된 특허 출원 및 제조업체의 사양, 지침 등 포함)은 본 명세서에 명시적으로 참조로 포함된다; 그러나 인용된 임의의 문헌이 본 발명에 대해 실제로 선행 기술임을 승인하는 것은 아니다. 보다 완벽한 이해는 본 발명의 범위를 제한하려 하지 않고 단지 예시적인 목적으로 본 명세서에 제공되는 하기 특정 실시예를 참조하여 수득될 수 있다.
실시예
실시예 1: 항- TTR 항체의 단리 및 확인
TTR 및/또는 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편을 표적화하는 인간-유래의 항체는 그 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 출원 WO2008/081008에 개시되어 있는 방법을 변형해 이용하여 확인하였다. 특히, 인간 혈장으로부터 정제하여 수득된 인간 야생형 TTR 단백질 및 재조합 발현에 의해 수득된 야생형 및 돌연변이 TTR 단백질은 TTR-표적화 항체의 확인을 위해 자연형 및 접힘오류화-응집된 입체형태 모두를 사용하였다. 상기 접힘오류화-응집된 입체형태는 [Colon W. et al, Biochemistry, 31 (1992), 8654-8660]에 개시되어 있는 것과 유사한 절차를 약간 변형해 이용하여 산성 조건 하에 시험관내에서 생산하였다.
실시예 2: 항체 서열의 결정
상기 확인된 항-TTR 항체의 가변 영역의 아미노산 서열을 그 mRNA 서열에 기초하여 결정하였다: 도 1 참조. 간략하게, 선택된 비-불멸화된 메모리 B 세포 배양액으로부터 살아있는 B 세포를 수확하였다. 이어서, 선택된 항-TTR 항체를 생산하는 세포로부터 mRNA를 추출하였고, cDNA로 전환시켰으며, 항체의 가변 영역을 암호화하는 서열을 PCR에 의해 증폭하였고, 플라스미드 벡터 내로 클로닝하였으며, 서열분석하였다. 간략하게, 인간 면역글로불린 생식선 레퍼토리의 모든 서열 패밀리를 나타내는 프라이머들의 조합을 사용하여 리더(leader) 펩티드, V-세그먼트 및 J-세그먼트를 증폭하였다. 5'-말단에서 리더 펩티드-특이적 프라이머 및 3'-말단에서 불변 영역-특이적 프라이머를 이용하여 제1 라운드의 증폭을 수행하였다[Smith et al., Nat Protoc. 4 (2009), 372-384]. 중쇄 및 카파 경쇄의 경우, 5'-말단에서 V-세그먼트-특이적 프라이머 및 3'-말단에서 J-세그먼트-특이적 프라이머를 이용하여 제2 라운드의 증폭을 수행하였다. 람다 경쇄의 경우, 5'-말단에서 V-세그먼트-특이적 프라이머 및 3'-말단에서 C-영역-특이적 프라이머를 이용하여 제2 라운드의 증폭을 수행하였다[Marks et al., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597; de Haard et al., J. Biol. Chem. 26 (1999), 18218-18230].
원하는 특이성을 갖는 항체 클론의 확인은 완전한 항체의 재조합 발현에 대해 ELISA 상에서 재-스크리닝함으로써 수행하였다. 완전한 인간 IgG1 항체의 재조합 발현은 "올바른 판독 프레임(correct reading frame)" 내의 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 5'-말단에서 리더 펩티드를 암호화하는 서열로, 그리고 3'-말단에서 적절한 불변 도메인(들)을 암호화하는 서열로 가변 영역 서열을 보완하는 발현 벡터 내로 삽입함으로써 달성하였다. 이를 위하여, 프라이머들은 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 항체 발현 벡터 내로 클로닝하는 것을 촉진하도록 디자인된 제한 부위를 포함하였다. 중쇄 면역글로불린은 프레임 내의 면역글로불린 중쇄 RT-PCR 생성물을 인간 또는 마우스 면역글로불린 감마 1의 신호 펩티드 및 불변 도메인을 갖고 있는 중쇄 발현 벡터 내로 삽입함으로써 발현시켰다. 카파 경쇄 면역글로불린은 프레임 내의 카파 경쇄 RT-PCR 생성물을 인간 카파 경쇄 면역글로불린의 신호 펩티드 및 불변 도메인을 제공하는 경쇄 발현 벡터 내로 삽입함으로써 발현시켰다. 람다 경쇄 면역글로불린은 프레임 내의 람다 경쇄 RT-PCR 생성물을 인간 또는 마우스 람다 경쇄 면역글로불린의 신호 펩티드 및 불변 도메인을 제공하는 람다 경쇄 발현 벡터 내로 삽입함으로써 발현시켰다.
기능적 재조합 모노클론 항체를 Ig-중쇄 발현 벡터 및 카파 또는 람다 Ig-경쇄 발현 벡터의 HEK 293 또는 CHO 세포(또는 인간 또는 마우스 기원의 임의의 다른 적절한 수용 세포주) 내로 동시-전달감염(co-transfection)시킴으로써 수득하였다. 이어서, 재조합 인간 단일클론 항체를 표준 단백질 A 컬럼 정제를 이용하여 조건 배지로부터 정제하였다. 재조합 인간 모노클론 항체는 일시적으로 또는 안정하게 전달감염된 세포를 이용하여 무제한적인 양으로 생산할 수 있다. 재조합 인간 모노클론 항체를 생산하는 세포주는 Ig-발현 벡터를 직접 이용하거나 Ig-가변 영역을 상이한 발현 벡터 내로 재-클로닝함으로써 확립될 수 있다. F(ab), F(ab)2 및 scFv와 같은 유도체는 또한 상기 Ig-가변 영역으로부터 생성될 수 있다.
골격 및 상보성 결정 영역은 Abysis(http://www.bioinf.org.uk/abysis/)와 같은 데이터베이스에서 이용가능한 기준 항체 서열과 비교함으로써 결정하였고, Kabat 번호지정 방식(http://www.bioinf.org.uk/abs/)을 이용하여 할당하였다. 골격(FR) 및 상보성 결정 영역(CDR)의 표시를 포함하는 대상체 항체 NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.37F1-PIMC, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 및 NI-301.14C3은 도 1a 내지 도 1t에 나타나 있다.
다음에, 접힘오류화-응집된 TTR 입체형태에 대한 대상체 항체의 높은 친화도 및 자연형의 야생형 TTR 입체형태에 대한 결합의 실질적인 부재 및 이로 인해 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR에 대한 강한 선택성을 나타내는 것은 항체 NI-301.59.F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1에 예시적으로 나타나 있다. 그러나, 다른 대상체 항체에 대한 예비 실험은 항체 NI-301.59.F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1과 같은 생리학적 TTR 종 이상으로 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR에 대한 실질적으로 동일한 우선적인 결합을 제시한다.
실시예 3: 직접적인 ELISA을 이용한 항- TTR 항체의 결합 친화도 및 EC50 결정
TTR 및/또는 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 형태의 TTR에 결합하는 항체 능력을 다양한 항체 농도에서 직접적인 ELISA 분석에 의해 평가하였다. 이것은 본 분석에서 각각의 항체에 대해 항체 결합 친화도에 대해 보통 사용되는 프록시(proxy)인 절반 최대 유효 농도(half maximal effective concentration, EC50)를 결정하도록 한다: 도 2 참조. 간략하게, ELISA 플레이트(높은-결합, 투명한 폴리스티렌, 절반-면적, 평평한 바닥)를 접힘오류화-응집된 인간 야생형 TTR, 접힘오류화-응집된 재조합 V30M-TTR(상기 실시예 1에 개시된 것과 같이 제조됨) 및 소 혈청 알부민(BSA)을 이용해 포스페이트 버퍼 식염수(PBS) 내에서 10 ㎍/㎖의 농도로 37℃에서 1 시간 동안 코팅하였고, 이어서 PBS 내에서 2% BSA 및 0.1% 트윈-20(PBS-T)의 용액을 이용하여 실온(RT)에서 1 시간 동안 차단하였다. TTR에 대한 항체를 4 내지 400 nM 범위의 11 가지 상이한 농도로 PBS에서 희석하였고, 4℃에서 밤새 ELISA 플레이트에서 인큐베이션하였다. PBS-T로 3 회 세척한 후, ELISA 플레이트를 HRP-커플링된 인간 IgG-특이적 2 차 항체(1/4,000 희석)를 이용해 RT에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T로 3 회 세척한 후, TMB를 이용해 RT에서 정확하게 10 분 동안 ELISA 반응을 현상하였고, 450 ㎚(OD450㎚)에서 광학 밀도를 측정함으로써 정량하였다.
상기 예시적인 항체 NI-301.59F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1은 접힘오류화-응집된 야생형 및 돌연변이 TTR에 대한 강한 결합을 나타내었지만, 대조군 BSA에 대해서는 그렇지 않았다: 도 2의 A 내지 C 참조. 이어서, 상기 조건 하에서의 항체 결합 친화도를 추정하기 위하여 상기 데이터를 최소제곱법을 이용해 비-선형 회귀에 맞춤으로써 항체의 EC50을 결정하였다.
상기 예시적인 항체 NI-301.59F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1은 각각 3.0 nM, 3.9 nM 및 0.35 nM의 EC50에 해당하는 접힘오류화-응집된 인간 야생형 TTR에 대한 높은 친화도를 나타내었다. 상기 예시적인 항체는 또한 각각 15.5 nM, 5.0 nM 및 0.15 nM의 EC50에 해당하는 접힘오류화-응집된 재조합 돌연변이 V30M-TTR에 대한 높은 친화도를 나타내었다.
실시예 4: 점 블롯을 이용한 항- TTR 항체의 결합 선택성
자연형 또는 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 입체형태에 대한 TTR-항체 및/또는 그의 절편의 결합 선택성을 평가하기 위하여, 자연형 또는 접힘오류화-응집된 입체형태인 인간 야생형 TTR 단백질 및 조립오류화-응집된 입체형태인 재조합 V30M-TTR 단백질을 4 가지 상이한 농도로 PBS에서 희석하였고, 진공 여과에 의해 니트로셀룰로오스 막에 증착시켰다. 상기 막을 간략하게 건조시켰고(10 분), PBS-T에서 3% 우유로 RT에서 1 시간 동안 차단하였으며, 이어서 항-TTR 항체로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS-T로 RT에서 5 분 동안 3 회 세척한 후, 상기 막을 적절한 2 차 항체(HRP-커플링됨; 1/10,000 희석)로 RT에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T로 3 회 세척한 후, 상기 막을 루미놀을 이용해 현상하였고, 신호의 강도를 발광을 측정함으로써 정량하였다.
상기 예시적인 시판되는 항-TTR 항체는 자연형 뿐만 아니라 접힘오류화-응집된 TTR 입체형태에 유사한 친화도로 결합하였고, 이로 인해 자연형 또는 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 입체형태에 대한 결합 선택성이 없음을 나타내었다; 도 3의 A 참조. 이와 대조적으로, 상기 예시적인 항체 NI-301.59.F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1은 접힘오류화-응집된 TTR 입체형태에만 높은 친화도로 결합하였고, 자연형 TTR 입체형태에는 결합을 보이지 않았으며, 이로 인해 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR에 대한 강한 선택성을 나타내었다(도 3의 B2, C2, D2). 따라서, 상기 항체 NI-301.35G11 및 NI-301.37F1은 또한 도 3의 C3 및 D3에 나타낸 것과 같이 접힘오류화-응집된 재조합 V30M-TTR 단백질에 대한 강한 결합을 보여주었다.
항체 결합 선택성을 추가로 특성분석하기 위하여, 야생형 및 돌연변이화, 자연형 및 접힘오류화-응집된 입체형태를 포함하는 다양한 TTR 제조물 및 12 개의 인간 혈장 샘플 수집물을 쥐과 키메라 항-TTR 항체 및 검출을 위한 HRP-커플링된 항-마우스 IgG2a 2 차 항체를 이용하여 점 블롯에 의한 분석의 경우와 유사하게 처리하였다(도 6).
시판되는 항체는 야생형 및 돌연변이화, 자연형 및 접힘오류화-응집된 TTR 제조물을 포함하는 모든 TTR 입체형태에 대한 강한 결합을 나타내었고, 모든 인간 혈장 샘플에서 TTR을 검출할 수 있었다. 이것은 추가로 자연형 또는 응집된 입체형태에 대한 선택성이 없음을 나타낸다: 도 6의 A 참조. 이와 대조적으로, 상기 예시적인 마우스 키메라 항체 NI-301.mur35G11은 접힘오류화-응집된 야생형 TTR 샘플에 대한 매우 강한 결합을 나타내었고(도 6의 C1), 또한 돌연변이 V30M-TTR 단백질(도 6의 C4) 및 돌연변이 Y78F-TTR 단백질(도 6의 C6)에 대한 강한 결합을 나타내었다. 그러나, NI-301.mur35G11 항체는 인간 혈장 샘플 내의 TTR에 결합하지 않았다. 이것은 추가로 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 단백질에 대한 NI-301.mur35G11의 강한 선택성을 나타낸다.
실시예 5: 웨스턴 블롯을 이용한 항- TTR 항체의 결합 특이성 및 선택성
항-TTR 항체의 결합 특이성 및 선택성을 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다: 도 4 참조. 간략하게, 자연형 또는 접힘오류화-응집된 입체형태인 인간 야생형 TTR 단백질(300 ng) 및 야생형 마우스 간 추출물(10 ㎍ 총 단백질)을 SDS-PAGE 겔에 로딩하였고, 반건조 전달 시스템을 이용하여 니트로셀룰로오스 막으로 전달하였다. 이어서, 상기 막을 PBS-T 내의 2% BSA를 이용하여 RT에서 1 시간 동안 차단하였고, 차단 버퍼 내에서 희석된 항-TTR 항체로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS-T로 RT에서 5 분 동안 4 회 세척한 후, 상기 막을 적절한 2 차 항체(HRP-커플링됨; 차단 버퍼 내에서 1/10,000 희석)로 RT에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T로 3 회 세척하고, 마지막으로 PBS에서 1 회 세척한 후, 상기 막을 루미놀로 현상하였고, 신호 강도를 발광을 측정함으로써 정량하였다. 사용 직전에, 접힘오류화-응집된 TTR 샘플을 글루타르알데히드(1%, 5 분, 37℃)로 가교결합시켜 SDS-PAGE를 위한 준비 공정 동안에 TTR 응집체의 해리를 방지하였다. 이와 대조적으로, 자연형 TTR 샘플은 사용 전에 가교결합시키지 않아서, (생리학적 조건 하에 자연형 TTR 입체형태인) TTR 호모테트라머는 거의 완전히 모노머 및 다이머로 해리하였다.
시판되는 항-TTR 항체는 인간 자연형 TTR 샘플의 TTR 모노머 및 다이머에 대한 매우 강한 결합을 보였고(도 4의 A1), 가겨결합된 접힘오류화-응집된 TTR 샘플에 대해서도 유사한 강한 결합을 보였으며(도 4의 A2), 이로 인해 자연형 또는 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 입체형태에 대한 선택성이 없음을 나타내었다. 이와 대조적으로, 상기 예시적인 항-TTR 항체 NI-301.59F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1은 가교결합된 접힘오류화-응집된 TTR 샘플에 대한 매우 강한 결합을 보여주었지만(도 4의 B2, C2, D2), 인간 자연형 TTR 샘플의 TTR 모노머 및 다이머에 대해서는 모두 결합을 보이지 않았고(도 4의 B1, C1, D1), 이로 인해 자연형 TTR 입체형태 보다도 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 입체형태에 대한 강한 선택성을 나타내었다.
이에 더하여, 상기 시판되는 및 예시적인 항-TTR 항체는 마우스 간 추출물에 함유된 단백질에 대해서는 매우 낮은 레벨의 결합을 가졌다(도 4의 A3, B3, C3, D3). 실험에 사용된 높은 양의 간 단백질과 그 결합 친화도에 대한 높은 항체 농도를 고려하면, 이것은 상기 예시적인 항체가 TTR에 대한 현저한 특이성을 갖고 다른 단백질에는 유의미하게 결합하지 않음을 나타낸다. 또한, 상기 예시적인 항체는 마우스 간 추출물 내에 높은 레벨로 함유된 마우스 TTR 단백질에 결합하지 않는 것으로 보이며, 이는 상기 예시적인 항체가 인간 접힘오류화 TTR 단백질에 대한 특이성을 보임을 나타낸다. 그러나, 항체 NI-301.37F1의 에피토프는 래트 및 마우스의 TTR 단백질에 존재한다. 따라서, 상기 에피토프의 입체형태가 아닌 1 차 아미노산 서열은 접힘오류화 TTR의 검출을 위한 필수적인 결정사항이 아닐 수 있다.
자연형 TTR 단백질에 대한 상기 항체의 결합 능력 또는 그의 부재를 추가로 특성분석하기 위하여, 본 명세서에서 전술한 것과 동일한 웨스턴 블롯 기술을 이용하여 인간 혈장 샘플에 함유된 TTR 단백질에 결합하는 능력에 대해 상기 예시적인 항체를 평가하였다(도 5). 유일한 기술적 차이점은 약 25-30 kDa에서 겔의 윗부분을 다듬고, 니트로셀룰로오스 막에 대한 단백질의 전달을 위해 겔의 아랫부분만을 사용한 것으로 구성된다. 이것은 잠재적으로 분석을 방해할 수 있는 혈장 샘플에서 높은 농도로 존재하는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄를 제거하기 위한 것이다.
참조로서 사용된 시판되는 항체와 대조적으로, 상기 예시적인 항체 NI-301.35G11 및 NI-301.37F1은 인간 혈장 샘플에 함유된 모든 인간 TTR 단백질을 검출하지 않았으며, 이로 인해 상기 조건 하에 분석된 샘플 내에 존재하지 않는 TTR 입체형태에 대한 결합 선택성을 나타내었다.
실시예 6: 면역침전을 이용한 용액 내의 항- TTR 항체의 결합 선택성
본 발명의 항-TTR 항체의 결합 선택성을 추가로 확인하기 위하여, 자연형 및 접힘오류화-응집된 입체형태인 인간 야생형 및 재조합 TTR 단백질 및 PBS 내에서의 3 가지 상이한 희석인 인간 혈장 샘플을 TTR 면역침전(IP)을 위해 사용하였다. 간략하게, 단백질-A 코팅된 자성 비드를 제조사의 결합 버퍼 내에 희석된 항-TTR 항체로 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 항체/단백질 A 복합체를 회수하였고, TTR 제조물 및 인간 혈장 샘플로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세척 후, 상기 항체/단백질 A 복합체를 SDS 로딩 버퍼 내에 재부유시켰고, 90℃에서 5 분 동안 가열하였으며, 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리하였다.
도 7에 나타낸 것과 같이, 상기 예시적인 TTR 항체 NI-301.35G11 및 NI301.37F1은 시판되는 TTR 항체 Dako A0002와 대조적으로 혈장 샘플에 대한 결합을 나타내지 않았을 뿐만 아니라(도 7의 A7-9, B7-9, C7-9), 자연형의 야생형 및 재조합 TTR 샘플에 대한 결합을 나타내지 않아다(도 7의 B3, C3, B5, C5). 그러나, 접힘오류화-응집된 형태의 TTR이 존재하는 샘플에서는 강한 결합이 평가되었다(도 7의 B4, C4, B6, C6).
상기 결과는 상기 예시적인 항체 NI-301.35G11 및 NI-301.37F1이 용액에서 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 입체형태에 결합할 수 있고, 상기 입체형태에 대한 현저한 선택성을 보여줌을 나타낸다.
실시예 7: FAP 마우스 조직에서 병리학적 TTR 응집체에 대한 결합
예시적인 항-TTR 항체를 인간 V30M-TTR 단백질을 배타적으로 발현하고 마우스 TTR 단백질은 발현하지 않는 유전자이식 마우스(이하, "FAP 마우스"라 명명함)의 조직에 존재하는 것과 같은 병리학적 및 비-병리학적 TTR 단백질에 결합하는 능력에 대해 면역조직화학(IHC)에 의해 평가하였다. 상기 항체를 또한 임의의 TTR 단백질을 발현하지 않는 TTR 낙아웃(TTR-KO) 마우스 유래의 조직에 대한 비-특이적 결합에 대해 평가하였으며, 해당 유전자이식 및 낙아웃 마우스 라인은 처음에 스이치로 마에다 교수에 의해 생성 및 개시되었다[Kohno K. et al., American Journal of Pathology 140(4) (1997), 1497-1508]. 간략하게, 3-5 ㎛ 두께의 섹션으로 절단된 파라핀 포매된(embedded) 마우스 조직에 대해 면역조직화학을 수행하였다. 섹션들은 처음에 탈왁스 및 탈수시켰고, 메탄올 내의 3% H2O2로 RT에서 20 분 동안 처리하였다. 차단 버퍼(PBS + 5% 혈청(말/개) + 4% BSA)를 RT에서 1 시간 동안 적용하였고, PBS 내에 희석된 항-TTR 항체로 교체한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS에서 3 회 세척한 후, 섹션을 적절한 바이오틴화 2 차 항체(PBS 내의 항-인간 IgG, 항-토끼 IgG 희석액 1/125, RT에서 1 시간 인큐베이션) 및 아비딘-HRP 검출 시스템(PBS 내에서 희석 1/125, RT에서 1 시간 인큐베이션)로 연속적으로 인큐베이션하였다. 상기 반응물을 디아미노벤지딘으로 RT에서 정확하게 15 분 동안 현상하였다. 조직 섹션을 헤말룬(hemalun)으로 RT에서 1 분 동안 대비염색하였고, 증가하는 에탄올 시리즈에서 탈수하였으며, 커버슬립하였다.
도 8에 나타낸 것과 같이, 시판되는 TTR 항체 Dako A0002는 FAP 마우스의 간 및 내장 섹션에서 강한 염색을 생성하였고, 대응하는 TTR KO 섹션에서는 어떠한 염색도 나타내지 않았다(도 8의 1A, 1B). 상기 예시적인 TTR 항체 NI-301.35G11은 FAP 마우스의 간 및 내장 섹션 모두에서 유사한 염색 패턴 및 강도를 생성하였다(도 8의 2A). 이와 대조적으로, 상기 예시적인 항체 NI-301.37F1은 FAP 마우스의 내장 섹션에서만 강한 염색을 생성하였고, 간 섹션에서는 그렇지 않았다(도 8의 3A). 이것은 상기 NI-301.37F1 항체가 FAP 마우스의 위장관에서 시간에 따라 축적되어 병리학적(즉, 비-생리학적) TTR 응집체에만 결합하고, 간에서 합성된 것과 같은 자연형 입체형태인 TTR에는 결합하지 않음을 나타낸다.
이에 더하여, 예시적인 항체 NI-301.35G11 및 NI-01.37F1은 모두 TTR-KO 마우스 유래의 간 및 내장 조직 섹션에서 임의의 염색을 생성하지 않았다(도 8의 2B, 3B). 항체의 결합 친화도에 관한 본 실험에서 사용된 높은 항체 농도를 고려할 때, TTR-KO 섹션에 대한 염색의 부재는 TTR 단백질에 대한 높은 결합 특이성을 나타낸다.
실시예 8: 인간 조직에서 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR에 대한 결합 선택성
본 발명의 항체는 또한 인간 조직에서 병리학적 TTR 침적체에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. FAP 환자 유래의 피부 생검의 섹션 및 건강한 개인 유래의 췌장 조직 섹션을 상기 실시예 7에 개시된 것과 동일한 절차를 이용하여 면역조직화학에 대해 처리하였다. 피부가 중요한 양의 병리학적 TTR 아밀로이드 침적물을 함유하기 때문에 본 실험을 위해 피부 생검을 선택하였다. 이와 대조적으로, 췌장 조직은 췌장 알파 세포가 TTR을 높은 레벨로 발현하기 때문에 본 실험에서 사용하였다.
도 9에 나타낸 것과 같이, 시판되는 항체 Dako A0002는 피부 내의 병리학적 TTR 침적물 및 췌장 알파 세포 내의 자연형 TTR에서 동일하게 강한 염색을 나타내었다(도 9의 1A). 유사하게, 상기 예시적인 마우스 키메라 항체 NI-301.mur35G11은 피부 내의 병리학적 TTR 침적물 및 췌장 알파 세포 내의 자연형 TTR 모두에서 동일하게 강한 염색을 보여주었다(도 9의 1B). 이와 대조적으로, 상기 항체 NI-301.37F1은 피부 내의 병리학적 TTR 침적물만을 염색하였고, 췌장 알파 세포 내의 자연형 TTR은 염색하지 않았다(도 9의 3A). 상기 결과는 NI-301.37F1이 IHC에 의해 돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 입체형태를 포함하는 병리학적 TTR 침적물에 대해 매우 선택적임을 나타낸다.
도 9의 패널 1B, 2B 및 3B에 제공된 "2 차 항체 단독" 대조군 조건은 상기 조직 염색이 1 차 항체의 부재시 일어남을 나타낸다. 염색이 없거나(2B) 매우 낮은 레벨(1B, 3B)인 것은 패널 1A, 2A 및 3A에서 관찰된 염색이 실제로 대응하는 1 차 항체에 특이적임을 나타낸다.
실시예 9: TTR 항체의 결합 에피토프의 평가
상기 예시적인 항체 NI-301.59F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1의 결합 에피토프를 결정하기 위하여, 전체 TTR 아미노산 서열을 막에 공유적으로 결합되어 있는 15 개 아미노산 길이이고 11 개 아미노산이 중첩되는 29 개의 순차적인 펩티드의 패널을 이용해 분석하였다. 선택된 돌연변이를 포함하는 추가적인 펩티드를 또한 상기 막 위에 플로팅하였다. 상기 막을 Roti 차단 버퍼에서 4℃에서 밤새 차단하였고, 먼저 차단 버퍼에서 희석된 항-TTR 항체로 RT에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후, HRP-커플링된 항-인간 IgG 항체로 RT에서 45 분 동안 인큐베이션하였다(TBS 내에서 희석 1/20,000). 상기 반응물을 루미놀로 현상하였고, 발광에 의해 이미지화하였다.
상기 항체 NI-301.59F1은 전체 인간 야생형 TTR 상의 서열 61-EEEFVEGIY-69(서열번호 49)에 해당하는 스팟 15, 16 및 44를 인식한다: 도 10a 참조. 상기 항체 NI-301.35G11은 전체 인간 야생형 TTR 상의 서열 53-GELHGLTTEEE-63(서열번호 50)에 해당하는 스팟 13, 14, 42 및 44를 인식한다: 도 10b 참조. 그러나, 상기 항체 NI-301.35G11은 스팟 43을 인식하지 않는데, 이는 상기 항체가 L55P-TTR 변이체에 해당하는 서열 53-GELHGPTTEEE-63에 결합할 수 없음을 나타낸다. 상기 항체 NI-301.37F1은 전체 인간 야생형 TTR 상의 서열 41-WEPFA-45(서열번호 51)에 해당하는 스팟 9, 10, 11, 38 및 40을 인식한다: 도 10c 참조. 그러나, 상기 항체 NI-301.37F1은 스팟 43을 인식하지 않는데, 이는 상기 항체가 E42G-TTR 변이체에 해당하는 서열 41-WGPFA-45에 결합 수 없음을 나타낸다.
상기 예시적인 항체 NI-301.59F1, NI-301.35G11 및 NI-301.37F1의 결합 에피토프를 더욱 결정하기 위하여, 전체 TTR 아미노산 서열을 막에 공유적으로 결합된 15 개 아미노산 길이이고 14 개 아미노산이 중첩하는 151 개의 순차적인 펩티드의 패널을 이용하여 분석하였다. 각각의 펩티드에 대하여, 위치 10의 아미노산을 비-알라닌 아미노산의 경우에는 알라닌으로 교체하였고, 알라닌은 글리신 또는 프롤린으로 교체하였다. 상기 막을 Roti 차단 버퍼로 4℃에서 밤새 차단하였고, 먼저 차단 버퍼로 희석된 항-TTR 항체로 RT에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후, HRP-커플링된 항-인간 IgG 항체로 RT에서 45 분 동안 인큐베이션하였다(희석 1/20,000). 상기 반응물을 루미놀로 현상하였고, 발광에 의해 이미지화하였다.
상기 항체 NI-301.59F1은 스팟 77 및 83만을 인식하며, 이는 E60 및 V64는 59F1에 대한 결합에 필요하지 않지만, E61, E62, F63, G66, I67 및 Y68은 항체 결합을 위해 필요함을 나타낸다. K69의 정확한 기여는 해석의 문제이다: 도 10a에 나타낸 펩티드 44에 대한 강한 항체 결합은 C-말단 위치에서의 K69의 부재가 항체 결합을 방지하지 않음을 명확하게 나타낸다; 그러나, 도 10e에 나타낸 후속 실험에서, 상기 펩티드의 위치 10에서의 K69A 치환은 항체 결합을 방지하였다. 상기 반대로 보이는 결과는 NI-301.59F1이 아미노산 서열 61-EEFXEGIY-68(서열번호 58)의 특정 입체형태에 결합함을 제시하며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 항체 NI-301.35G11은 스팟 68, 71, 72, 73, 74 및 75를 인식하며, 이는 G53은 35G11에 대한 결합에 필요하지 않지만, E54, L55, G57 및 L58은 항체 결합을 위해 필요함을 나타낸다. 35G11 결합 패턴은 또한 E61 또는 E62의 존재가 항체 결합을 위해 필요함을 나타낸다. T59 및 T60의 정확한 기여는 본 실험에서 결정되지 않았지만, 상기 2 개의 티로신 중 하나의 존재가 항체 결합을 위해 필요하다는 가설이 세워진다. 종합해보면, 알라닌 스캔에 대한 NI-301.35G11 결합 프로필은 상기 항체가 서열 54 ELXGLTXE 61(서열번호 59)을 인식함을 나타내며, 여기서 X는 모든 알려진 아미노산을 포괄할 수 있다: 도 10f 참조.
상기 항체 NI-301.37F1은 상기 알라닌 스캔 막 상의 스팟 50, 52, 55, 56 및 58-62에 결합하며, 스팟 51, 53, 54 및 57에는 결합하지 않는다. 이는 W40, P42, F43 및 A44가 항체 결합을 위해 필요함을 나타낸다. 돌연변이 E42G가 항체 결합을 손상시킨다는 앞선 관찰과 조합하면(도 10c), 상기 결과는 NI-301.37F1이 서열 41-WEPFA-45(서열번호 60)에 결합함을 나타낸다: 도 10g 참조.
실시예 10: 표면 플라즈몬 공명에 의한 항체 결합 특징의 결정
다양한 가용성 TTR 제조물에 대한 항체 결합 특징을 Biorad Proteon XPR36 장치를 이용한 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정하였다: 표 4 참조.
GLM 센서 칩이 구비된 BioRad ProteOn XPR36 상에서 SPR 분석을 수행하였다. Fc 감마 도메인에 대한 항-인간 항체를 검출 표면에 공유적으로 커플링시켰고, 조사되는 항체로 포화시켰다. 자연형 및 접힘오류화 입체형태인 야생형 및 돌연변이 TTR 단백질을 3.2 내지 316 nM 범위의 농도로 HBS-T 버퍼에 희석하였다. 항체-항원의 결합을 180 초 동안, 해리를 600 초 동안 분석하였다. 랑그뮈어(Langmuir) 결합 모델(단순한 1:1 결합)을 사용하여 상기 데이터를 맞추었고, 결합(ka) 및 해리(kd) 상수 및 친화도(KD)를 유도하였다.
항-인간 IgG-Fcγ 항체를 검출 표면에 공유적으로 코팅시켰고, 인간 TTR-특이적 항체를 포획하기 위해 사용하였다. 상기 항체를 자연형 및 접힘오류화-응집된 야생형 TTR 및 자연형 V30M 및 L55P TTR 돌연변이체를 포함하는 4 가지 상이한 TTR 제조물로 탐침하였으며, 이들 모두는 HBS-T 버퍼(10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 7.4)에서 3.2 내지 316 nM의 농도로 제조하였다. 접힘오류화-응집된 야생형 TTR을 아세테이트 버퍼(50 mM 아세테이트 HCl, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, pH 3.0)에서 65℃에서 80 분 동안 산성 변성시키고, 이어서 HBST로 버퍼 교환함으로써 제조하였다. 59F1, 35G11 및 37F1은 랑그뮈어 모델과 가장 잘 맞는 선형 결합 및 해리 특징을 나타내었다.
상기 결과는 상기 3 가지 항체가 용액 내의 V30M- 및 L55P-TTR 변이체뿐만 아니라 접힘오류화-응집된 야생형 TTR 제조물에 높은 친화도로 결합함을 보여준다. 이와 대조적으로, 상기 예시적인 항체는 용액 내의 자연형의 야생형 TTR에 결합하지 않는다.
따라서, 상기 결과는 NI-301.37F1이 1.2 nM의 KD로 용액 내의 접힘오류화 인간 야생형 TTR 단백질에 높은 친화도로 결합하지만 자연형 입체형태인 동일한 단백질에는 결합하지 않음을 보여준다. 유사한 결합 친화도(KD = 1.4 nM)가 돌연변이 TTR-L55P 단백질에 대해 측정되었다.
표면 플라즈몬 공명에 의한 항체 결합 특징의 결정
항체
NI-301. 		항원 랑그뮈어 맞춤 (1:1 상호작용 모델)
ka (M -1 s -1 ) kd (s -1 ) KD
59F1 자연형 TTR n.a n.a > 316 nM
접힘오류화-응집된
TTR		 9.7 104 3.4 10-4 3.5 nM
자연형 TTR-V30M 1.3 104 2.2 10-4 16 nM
자연형 TTR-L55P 5.1 104 1.5 10-4 3.1 nM
35G11 자연형 TTR-WT n.a n.a > 316 nM
접힘오류화-응집된
TTR		 2.3 104 2.7 10-4 12 nM
자연형 TTR-V30M 7.4 103 2.4 10-4 33 nM
자연형 TTR-L55P n.a. n.a. > 100 nM
37F1 자연형 TTR-WT n.a n.a > 316 nM
접힘오류화-응집된
TTR		 2.1 104 2.6 10-5 1.2 nM
자연형 TTR-V30M 1.1 104 1.9 10-4 17 nM
자연형 TTR-L55P 3.3 104 4.6 10-5 1.4 nM
실시예 11: 키메라 인간-마우스 재조합 항- TTR 항체를 이용한 조직 TTR 증착을 제공하는 인간 Val30Met TTR에 대한 유전자이식 마우스의 수동 면역화는 증착물을 제거하게 된다.
그 개시 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 국제 출원 WO2010/030203(특히, 실시예 3) 뿐만 아니라 상기 문헌에서 인용된 참고문헌 [Kohno et al., Am. J. Pathol. (1997), 1497-1508] 및 [Sousa et al., Am. J. pathol. (2002), 1935-48]에 개시된 것과 유사하게 수동 면역화를 수행하였다.
간략하게, 모노클론 항체를 인간 Val30Met-TTR 대립형질로 유전자이식되고 쥐과 TTR 유전자가 낙아웃된 7-월령 및 17-월령의 FAP 마우스에 3 ㎎/㎏의 용량으로 12 주 동안 매주 복강내 투여하였다[Kohno et al., (1997), supra]. 마지막 용량 후 5 일에, 동물을 희생시켰고, 다양한 조직을 수집하였으며, 파라포름알데히드 용액에 고정하였고, 파라핀에 포매하였다. 3-5 ㎛ 섹션을 절단하였고, 전술한 시판되는 항-TTR 항체를 이용한 면역조직화학을 위해 처리하였다. 실시예 7에 나타낸 것과 매우 유사하고 검출을 위해 형광 2 차 항체가 사용된 점에서만 차이가 있는 표준 면역형광 절차를 사용하였다. TTR 침적물이 침범한 조직의 표면을 정량하였고, 총 조직 면적의 백분율로 나타내었다. 처리 효과의 통계적 분석을 양방, 언페어드 t-테스트를 이용해 수행하였다.
상기 유전자이식 마우스 라인은 TTR 테트라머의 탈조립(disassembly) 및 독성의 불용성 아밀로이드성 입체형태로의 TTR 모노머의 접힘오류로 이루어지는 TTR 아밀로이드 질환에 공통인 핵심 병리학적 메커니즘을 재생산한다. FAP 환자와 마찬가지로, 상기 유전자이식 마우스는 전형적으로 연령-의존적인 TTR 침적을 나타낸다. 치료 시작시 TTR 침적이 중요하고 많은 위장관 조직에 침범하는 연령인 7-월령 및 17-월령의 2 개 군의 유전자이식 마우스에서 치료 효능의 평가를 조사하였다. 놀랍게도, 치료가 7 월령에서 시작될 때, 상기 예시적인 항체 NI-301.37F1을 이용한 수동 면역화는 TTR 침적으로 침범된 조직 표면에서의 통계학적으로 유의미한 감소와 연관되었다: 도 12의 A 참조. 나이든 마우스에서 유사한 치료 효과를 가졌고, TTR 침적에서의 거의 유의미한 감소를 유도하였다: 도 12의 B 참조.
실시예 12: 인간-유래의 재조합 항- TTR 항체는 생체내에서 병리학적 TTR 침적체에 결합한다.
인간-유래의 재조합 항-TTR 항체가 생체내에서 병리학적 TTR 침적체에 결합할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 7 월령의 성체 FAP 마우스를 항체 NI-301.37F1과, 비교를 위해 PBS로 30 ㎎/㎏에서 복강내 주사하였다. 48 시간 후, 상기 마우스에 경심 관류(transcardiac perfusion)를 하였고, 조직학적 분석을 위해 조직을 처리하였다. 병리학적 TTR 침적체를 형광 표지된 항-토끼 IgG 항체와 조합된 토끼 폴리클론, 항-TTR 항체를 이용해 검출하였고, 주사된 항체 NI-301.37F1의 편재는 형광 표지된 항-인간 IgG 항체로 검출하였다. 특히, 면역침전을 다음과 같이 수행하였다.
NI-301.37F1 및 마우스 혈장 샘플 유래의 이소형 대조군 항체의 면역침전을 항-인간 IgG 항체(Jackson Immunoresearch #709-005-098)과 함께 로딩된 단백질 A/G-커플링된 자성 비드(Pierce #88803)를 이용해 RT에서 2 시간 동안 수행하였다. PBS-T로 3 회 세척한 후, 샘플을 자성 비드로부터 0.2 M 글리신 버퍼(pH 2.5)로 용출하였고, 1 M Tris HCl(pH 8.0)으로 중화시켰으며, LDS-로딩 버퍼(Life technologies #NP0007)로 혼합하였고, 90℃에서 10 분 동안 가열하였다. 이후, 샘플을 4-12% 비스-트리스 겔(Life technologies #WG1403A) 상에 로딩하였고, MOPS 구동 버퍼(running buffer)에서 200 V에서 40 분 동안 구동하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 전달한 후, 입체형태 비의존적 TTR 항체(Dako #A0002, 150 ng/㎖) 또는 항체 NI-301.37F1(20 nM)을 이용해 HRP-커플링된 단백질 A(Life technologies #10-1023, 1/10,000 희석) 및 발광 이미징과 조합하여 TTR 단백질을 검출하였다.
도 13에 나타낸 것과 같이 생체내 표적 관련성을 30 ㎎/㎏에서 복강내로 항체 NI-301.37F1 또는 PBS로 단일 주사된 성체 FAP 마우스(7-월령)에서 수행하였다. 48 시간 후, 마우스를 PBS로 관류하였고, 기관들을 수집하였으며, 조직학적 분석을 위해 처리하였다. 시판되는 토끼 폴리클론 항-TTR 항체(Dako #A0002, 4.8 ㎍/㎖)를 이용해 Cy5-콘주게이트된 항-토끼 항체(Jackson Immunoresearch #711-175-152, 1/200 희석)와 조합한 면역형광에 의해 병리학적 TTR 침적물을 검출하였다. NI-301.37F1의 존재(또는 부재)를 Cy3-콘주게이트된 항-인간 항체(Jackson Immunoresearch #709-165-149, 1/200 희석)을 이용해 동시에 검출하였다. NI-301.37F1-주사된 및 PBS-주사된 조직을 이미징하기 위해 동일한 스캐닝 파라미터를 사용하였고, 이미지들은 동일한 표시 조정(display adjustment)을 받았다.
도 13에 나타낸 것과 같이, NI-301.37F1-의존적 염색은 NI301.37F1-주사된 마우스에서 TTR 염색과 매우 동시편재되었지만, 예측한 것과 같이, PBS-주사된 마우스에서는 완전히 부재하였다. 상기 결과는 항-TTR 항체 NI-301.37F1이 생체내에서 병리학적 TTR 침적체에 결합함을 나타낸다.
실시예 13: 생체내에서 접힘오류화 TTR 단백질 침적체의 검출은 조직 생검을 필요로 하지 않는다.
응집된 돌연변이화 및/또는 접힘오류화 TTR과 연관된 TTR 아밀로이드 질환의 진단 공정에서 조직 생검 및 조직학적 분석을 대체하는 상기 진단 절차는 본 명세서에서 아래에 예시되며, 도 14에 도시된다. 특히, 상기 실험은 전술한 것과 같이 7-월령의 FAP 마우스를 이용해 수행하였다; 전술한 실시예 11 참조. 상기 마우스는 FAP의 중심 병리생리학적 메커니즘을 재생산하며, 환자와 마찬가지로, 다양한 조직에서 연령-의존적 TTR 침적을 나타낸다. 2 가지 FAP 마우스가 3 ㎎/㎏의 용량으로 인간-유래의 재조합 항-TTR 모노클론 항체 NI-301.37F1의 단일 복강내 주사를 받았다. 항체 주사 전(t=0), 및 주사 2 일 후(t=48h), 소량의 혈액 샘플을 수집하였고, 분석을 위해 혈장을 준비하였다. (주사된 인간 항-TTR 항체를 회수하기 위하여) 혈장 샘플을 항-인간 IgG 항체를 이용해 면역침전시켰고, t=0 샘플을 음성 대조군으로 사용하였다. 이후, 면역침전 샘플을 웨스턴-블롯에 의해 처리하여 마우스에 주사된 항-TTR 항체가 생체내에서 순화하는 48 시간 동안 일부 접힘오류화 TTR 단백질을 포획하는지 여부를 검출하였다. 입체형태-특이적 및 입체형태-비의존적 항-TTR 항체 모두를 이용해 웨스턴-블롯을 수행하였다. (TTR 단백질에 결합할 수 없는) 이소형 대조군 항체를 음성 대조군으로 이용해 대조군 실험을 수행하였다. 추가적인 대조군은 생체내에서 항체 NI-301.37F1으로 처리되지 않은 FAP 마우스 유래의 혈장 샘플을 인큐베이션하는 것으로 이루어졌으며, 전술한 것과 같이 처리하였다.
도 14에 제공된 결과는 항체 NI-301.37F1이 생체내에서 48 시간의 인큐베이션 기간 동안 일부 접힘오류화 TTR 단백질을 포획하였음을 나타낸다. 이것은 항체 NI-301.37F1의 경우에 특이적으로 관찰되었고, 이소형 대조군 항체의 경우에는 관찰되지 않았다. 또한, 항체 NI-301.37F1에 의해 포획된 접힘오류화 TTR 단백질은 처리되지 않은 마우스로부터 수집된 혈장 샘플에는 존재하지 않았다. 종합하면, 상기 결과들은 항체 NI-301.37F1이 생체내에서 불용성 TTR 침적물로부터 접힘오류화 TTR 단백질을 제거할 수 없었고, 이것의 존재는 조직 생검에 대한 필요 없이 검출될 수 있었음을 나타낸다. 인간에서 상기 진단 테스트를 사용하기 위한 한가지 기술적 조정은 항-TTR 항체를 표지하여, 예를 들면 바이오틴 또는 히스티딘 또는 스트렙트아비딘 태그를 갖는 인간 혈장 샘플로부터 이를 회수하도록 하는 것으로 구성될 것이다. 다른 한편으로, 상기 변형되지 않은 항-TTR 항체는 항-이디오타입 항체에 의해 인간 혈장 샘플로부터 회수될 수 있었다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
<110> Neurimmune Holding AG <120> Antibody-based therapy of transthyretin (TTR) amyloidosis and human-derived antibodies therefor <130> 2016-FPA-7604 <150> EP 13199251.3 <151> 2013-12-20 <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <223> NI-301.59F1 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(195) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (292)..(345) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 1 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggg ttg gtc cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttc act ttt agt aat tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 tgg atg agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gcc aat ata aat caa gat agt gag aaa tac tat gtg gac tct gtg aag 192 Ala Asn Ile Asn Gln Asp Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 ggc cga ttc gcc atc tcc aga gac aac tcc aag aac tca ctg tat ctg 240 Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 caa atg aac agc ctg aga gtc gag gac acg ggc gtg tat tac tgt gcg 288 Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga gat cgc tat tgc agt ggt ggg aga tgc tcc cgg ggt aac aac tgg 336 Arg Asp Arg Tyr Cys Ser Gly Gly Arg Cys Ser Arg Gly Asn Asn Trp 100 105 110 ttc gac ccc tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 378 Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> NI-301.59F1 variable K-light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 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Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro 85 90 95 tac act ttt ggc cag ggg acc aaa gtg gat atc aaa 324 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> NI-301.35G11 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(327) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 5 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtg cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttc act ttt agc agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gcc atg agc tgg gtc cgc cag gtt cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 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Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> NI-301.37F1 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(201) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (298)..(327) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 9 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc agt gtc tct ggt ggc tcc atc atc agt agg 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Ser Arg 20 25 30 agt tcc tac tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144 Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg ggt atc tat cat agt ggg aac act tac gac aac ccg tcc 192 Trp Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga ctc acc atg tcc gta gac acg tcg aag aac cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg aat ctg agg tct gtg acc gcc gca gac acg gct gtg tat tac 288 Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg agg ata gtg ccg ggg ggt gat gct ttt gat atc tgg ggc caa 336 Cys Ala Arg Ile Val Pro Gly Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 ggg aca atg gtc acc gtc tct tcg 360 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> NI-301.37F1 variable K-light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(291) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 11 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc aca atc gct tgc cgg gcc agt cag agc gtt ggc acc tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Tyr 20 25 30 tta aat tgg tat cag cag aaa aga ggg aaa gcc cct aaa ctc ctc atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Arg Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 ttt gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gac ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt tct cct cca 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Pro 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 13 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 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Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga att gag gac acg gct gta tat ttt tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ile Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gcg aga ggg agc ggt aga gca gct cgt cac tgg ttc gac ccc tgg ggc 336 Ala Arg Gly Ser Gly Arg Ala Ala Arg His Trp Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <223> NI-301.2F5 variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(108) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(174) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (271)..(306) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 15 cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg tct cct gga cag 48 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gac gtt ggt ggt tat 96 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 aac tat gtc tcc tgg tac caa caa tac cca ggc aaa gcc ccc aaa gtc 144 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val 35 40 45 atg att ttt gat gtt ttt aat cgg cct tca ggg gtt tct aat cgc ttc 192 Met Ile Phe Asp Val Phe Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc atc tct gga ctc 240 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 cag gca gag gac gag gct gat tat tac tgc agt tca tat aca agc agc 288 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 gtc act cct cac tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 336 Val Thr Pro His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 17 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(381) <223> NI-301.28B3 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(111) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(201) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (298)..(348) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 17 cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tcc ggt ggc tcc atc act agt agt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Ser 20 25 30 aat ttc tac tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144 Asn Phe Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg gct att tat tct agt gga aac acc tac tac aac ccg tcc 192 Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtc acc ata tcc gta gac acg tcc aag aaa aag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Lys Phe 65 70 75 80 tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gct gac acg gct gtc tat tac 288 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga cac tct tgt agt agt gcc agc tgc tat cct ccc ggt ttc 336 Cys Ala Arg His Ser Cys Ser Ser Ala Ser Cys Tyr Pro Pro Gly Phe 100 105 110 tgg ttc gac ccc tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 381 Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 19 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> NI-301.28B3 variable K-light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(294) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 19 gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct gcg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag act gtt agt tac aac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Tyr Asn 20 25 30 tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc cgg ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat ggc gcg tcc acc agg gcc act ggt atc cca ggc agg ttc agt ggc 192 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gag ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag tct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag caa tat aat aac tgg cct ccg 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <223> NI-301.119C12 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(111) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(201) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (298)..(351) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 21 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca aga ctg gtg aag cct tca cag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 gtt tac tac tgg agc tgg atc cgc cag cac cca ggg aag ggc ctg gag 144 Val Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att gga tat att tct aat act ggg aac acc tac tac aac ccg tcc 192 Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Asn Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tcg ata gac acc tcc aag aac cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctc aac ctg cgc tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gac tat ttc 288 Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Asp Tyr Phe 85 90 95 tgt gcg aga gag tat tgt agt ggt ggt aat tgc tac tct cgc ttc tac 336 Cys Ala Arg Glu Tyr Cys Ser Gly Gly Asn Cys Tyr Ser Arg Phe Tyr 100 105 110 tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 384 Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 23 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <223> NI-301.119C12 variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(108) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(174) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (271)..(306) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 23 cag tct gtg ctg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg gcc cca ggg cag 48 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 agg gtc acc atc tcc tgc act ggg agc agc tcc aac atc ggg gca ggt 96 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 tat ggt gta cac tgg tac cag caa ctt tca gga aca ccc ccc aaa ctc 144 Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Ser Gly Thr Pro Pro Lys Leu 35 40 45 ctc atc tat gga gac aac aat cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc 192 Leu Ile Tyr Gly Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc act ggg ctc 240 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 cag gct gag gat gag gct cat tat tac tgc cag tcc tat gac acc acc 288 Gln Ala Glu Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Thr 85 90 95 ttg agt ggt tcg agg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 336 Leu Ser Gly Ser Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 25 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <223> NI-301.5D8 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(195) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (292)..(330) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 25 cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga cgg ttg aag cct tcg gag 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Arg Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acg tgc gct gtc tat ggt ggg tct ttc agt gct tac 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr 20 25 30 tac tgg aat tgg atc cgc cag gcc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att 144 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 ggt gaa gtc agt cat ggt ggc agc agc aac tac agc ccg tcc ctc agg 192 Gly Glu Val Ser His Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Arg 50 55 60 ggt cga gtc gcc att tct tta gac acg tcc aag agc cag ttc tcc ctg 240 Gly Arg Val Ala Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 agg ctg aat tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtt tat tac tgt gcg 288 Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga ggc agc cct gta gta cta cca ggt gcc aga ttc gac ccc tgg ggc 336 Arg Gly Ser Pro Val Val Leu Pro Gly Ala Arg Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <223> NI-301.5D8 variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(108) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(174) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (271)..(297) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 27 cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg ttt cct gga cag 48 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Phe Pro Gly Gln 1 5 10 15 tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gat gtt ggg agt tat 96 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 aac ctt gtc tcc tgg tac caa caa cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc 144 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 ttg att tat gag gtc aat aag cgg ccc tca gga gtt tct act cgc ttc 192 Leu Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Thr Arg Phe 50 55 60 tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acg atc tct ggg ctc 240 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 cag act gag gac gag gct gat tat tac tgc tgc tca tat gca ggt agt 288 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 act aag gtc ttc gga att ggg acc aag gtc acc gtc cta 327 Thr Lys Val Phe Gly Ile Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 29 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <223> NI-301.9D5 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(111) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(201) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (298)..(339) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 29 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca ggc ctg gtg aag cct tca gag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc att gtc tct ggt gtc tcc atc aga agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Val Ser Ile Arg Ser Gly 20 25 30 ggt tac tac tgg agc tgg atc cgg cag cac cca ggg aag ggc ctg gag 144 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg gtt ggg ttc atc tat tac act ggg aac acc tac tac aac ccg tcc 192 Trp Val Gly Phe Ile Tyr Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gct acc ata tca gta gac acc tct aag aac cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg acc gct gtg act gcc gcg gac acg gcc gtg tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Thr Ala Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat tgt agt ggt ggc agc tgc ccc gag tcc tac ttt gac 336 Cys Ala Arg Asp Cys Ser Gly Gly Ser Cys Pro Glu Ser Tyr Phe Asp 100 105 110 tcc tgg ggt cgg ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372 Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <223> NI-301.9D5 variable K-light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (268)..(297) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 31 gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgt agg gcc agt cag agt gtt cgc agt ttc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Phe 20 25 30 tta gcc tgg tac caa cag aaa tct ggc cag gct ccc cga ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gca tcc aag agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt gac 192 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Asp 50 55 60 agt ggg tct gga aca gac ttc act ctc acc atc agc aga cta gag act 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Thr 65 70 75 80 gaa gac tct gcg gtt tat tac tgt cag cag cgt acc aac tgg cct cca 288 Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Pro 85 90 95 cac ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gaa atc aaa 327 His Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 33 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> NI-301.104F5 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(324) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 33 cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct gag agg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Glu Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc acc ttc agg agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtt ata tgg ttt gat gga agt aat aaa tac tat gca gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc gtc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtc tac tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gat ggt ata gca gcc act tat gcg gac tac tgg ggc cag gga 336 Ala Arg Asp Gly Ile Ala Ala Thr Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> NI-301.104F5 variable K-light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(291) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 35 gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt cgc agc tac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr 20 25 30 tta gcc tgg tac caa caa aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat ggt gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt ggc 192 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc ctg gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag caa cgt agc aac tgg ccg atc 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile 85 90 95 acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(375) <223> NI-301.21F10 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(114) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (157)..(207) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (304)..(342) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 37 cag gtg cag ctg gtg gag tcg ggg gga ggt ttg gtc cag cct ggg ggg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ttg aga ctg tcc tgt gcg gtc tct gga ttc acc ctt agt agt ctt 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Leu 20 25 30 agt tct tat tac atg agt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg 144 Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 gag tgg gtg gcc act ata aac cca ggt gga agt gag aag tcc tat gtg 192 Glu Trp Val Ala Thr Ile Asn Pro Gly Gly Ser Glu Lys Ser Tyr Val 50 55 60 gac tct gtg aag ggc cga ttc acc gtc tcc aga gac aac gcc agg agc 240 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ser 65 70 75 80 tca gta tat ttg caa atg gac agc ctg aca gtc gag gac acg gct att 288 Ser Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Ile 85 90 95 tat tac tgt gcg aga cca aga tat tgc act agt ggt ggt tgc tat ttt 336 Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Arg Tyr Cys Thr Ser Gly Gly Cys Tyr Phe 100 105 110 gac aac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 375 Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 39 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <223> NI-301.21F10 variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(108) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(174) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (271)..(297) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 39 cag tct gcc ctg act cag cct cgc tca gtg tcc ggg tct cct gga cag 48 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 tca gtc acc atc tcc tgc act gca acc aat agt gat gtt ggc gat tat 96 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Ala Thr Asn Ser Asp Val Gly Asp Tyr 20 25 30 aag tct gtc tcc tgg tac caa caa cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc 144 Lys Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 atg att tat gat gtc ggt agg cgg ccc tca ggg gtc cct gat cgc ttc 192 Met Ile Tyr Asp Val Gly Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 tct ggc tcc aaa tct gac aac acg gcc ttc ctg acc atc tct ggg ctc 240 Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Phe Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 cag act gag gat gaa gct gat tac ttt tgc tgt ata tat gta ggc agg 288 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Cys Ile Tyr Val Gly Arg 85 90 95 tct tcg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ttg acc gtc ctg 327 Ser Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 41 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <223> NI-301.9G12 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(108) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (151)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(339) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 41 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tct ggt ttc tcc atc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 tac tac tgg ggc tgg atc cgg cag ccc cca ggg acg ggg ctg gag tgg 144 Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp 35 40 45 att ggg agt atg tat cat agt ggg agg acc tac tac aac ccg tcc ctc 192 Ile Gly Ser Met Tyr His Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttg tcc 240 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser 65 70 75 80 ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg agg ggc ttc gat act agt ggt tcc cat cgg ccc ctc tcg act gac 336 Ala Arg Gly Phe Asp Thr Ser Gly Ser His Arg Pro Leu Ser Thr Asp 100 105 110 tac tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <223> NI-301.9G12 variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (151)..(171) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (268)..(300) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 43 cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tct gcg gcc cca gga cag 48 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 aag gtc acc atc tcc tgc tct gga agc agc tcc aac att ggg aat aat 96 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 tat gta tcc tgg tac cag cag ctc cca gga aca gcc ccc aaa ctc ctc 144 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 att tat gac aat aat aag cga ccc tca ggg att cct gac cga atc tct 192 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Ile Ser 50 55 60 ggc tcc aag tct ggc acg tca gcc acc ctg ggc atc acc gga ctc cag 240 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 act ggg gac gag gcc gat tat tac tgc gga acc tgg gat agc agc ctg 288 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 agt gct tat gtc ttc gga act ggg acc aag gtc acc gtc cta 330 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 45 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> NI-301.12D3 variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(324) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 45 gag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcg tct gga ttc acc ttc agg aac tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc cgc cgg gcc cca ggc agg ggg ctg gag tgg gta 144 Gly Met His Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtt ata tgg tct gat gga agt gat aaa tac tat gca gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 gag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg gtg ttt 240 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Phe 65 70 75 80 ctc caa atg aac agc ctg aga gcc gac gac acg gct gta tac ttc tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gcg aga gag ccg agc agc acc tgg gct ttt gac tac tgg ggc cag gga 336 Ala Arg Glu Pro Ser Ser Thr Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <223> NI-301.12D3 variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(108) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(174) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (271)..(300) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 47 cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg tct cct gga cag 48 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gat gtt ggg ggt tat 96 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 aac ctt gtc tcc tgg tac caa cag cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc 144 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 atg att tat gag gac att aag ggg ccc tca ggg gtt tct aat cgc ttc 192 Met Ile Tyr Glu Asp Ile Lys Gly Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg aca atc tct ggg ctc 240 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 cag gct gag gac gag gct gat tat ttc tgc tgc tca tat gca ggt act 288 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Thr 85 90 95 ggc act ctg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 330 Gly Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope recognized by NI-301.35G11 antibody <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Epitope of NI-301.35G11 antibody, aa 53 to aa 63 <400> 49 Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu 1 5 10 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope recognized by NI-301.37F1 antibody <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <223> Epitope of NI-301.37F1 antibody, aa 41 to aa 45 <400> 50 Trp Glu Pro Phe Ala 1 5 <210> 51 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> NI-301.37F1-PIMC variable heavy chain (VH) sequence after correction of primer induced mutations <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(201) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (298)..(327) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 51 cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc agt gtc tct ggt ggc tcc atc atc agt agg 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Ser Arg 20 25 30 agt tcc tac tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144 Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg ggt atc tat cat agt ggg aac act tac gac aac ccg tcc 192 Trp Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Asp Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga ctc acc atg tcc gta gac acg tcg aag aac cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg aat ctg agg tct gtg acc gcc gca gac acg gct gtg tat tac 288 Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg agg ata gtg ccg ggg ggt gat gct ttt gat atc tgg ggc caa 336 Cys Ala Arg Ile Val Pro Gly Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 ggg aca atg gtc acc gtc tct tcg 360 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 53 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> NI-301.44E4 VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(327) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 53 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag ccg ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agc agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gcc atg atc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144 Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca ggt att agt ggc agt ggc agt acg aca tac tac gca gac tcc gtg 192 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc gcc atc tcc aga gac aaa tcc aag aac acg ctg tcc 240 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 cta caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aaa ggg gca tgg gag ata ccc acc tac ttt gac aac tgg ggc cag 336 Ala Lys Gly Ala Trp Glu Ile Pro Thr Tyr Phe Asp Asn Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 55 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <223> NI-301.44E4 VK variable light-kappa chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(297) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 55 gaa att gtg ctg act cag tct cca gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt att agg aac aac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Asn 20 25 30 tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat ggt gca tcc acc agg gcc act ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc 192 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 act ggg tct ggg aca gag ttc act ctc atc gtc agc agc ctg cag tct 240 Thr Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag tat aat aac tgg cct ccc 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro 85 90 95 acg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 327 Thr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope of NI-301.35G11 antibody, aa 54 to aa 61 after alanine scan <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 57 Glu Leu Xaa Gly Leu Thr Xaa Glu 1 5 <210> 58 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope of NI-301.37F1 antibody, aa 41 to aa 45 after alanine scan <400> 58 Trp Glu Pro Phe Ala 1 5 <210> 59 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(375) <223> NI-301.18C4 VH variable heavy chain (VH) sequence <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(342) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 59 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga acc ttg gtc cag ccg ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Thr Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg agg ctc tcc tgc gca gcg tcg gga ttc aca ttc aac att tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr 20 25 30 gcc atg acc tgg gtc cgc ctg tct cca gtg agg gga ctg gag tgg gtc 144 Ala Met Thr Trp Val Arg Leu Ser Pro Val Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tct act att act agt ggt ggc gtc agc ata tat tac gca gac tcc ata 192 Ser Thr Ile Thr Ser Gly Gly Val Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Ile 50 55 60 aag ggc cgc ttc acc gtc tcc aga gac aat gcc aag aac atg gtg ttt 240 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Phe 65 70 75 80 cta caa ctg gac aac ctg aca gtc gat gac acg gcc ata tat tac tgt 288 Leu Gln Leu Asp Asn Leu Thr Val Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 ggg aag gac gga aac tgc gat gag aca agt tgt tac tta agg ggg atg 336 Gly Lys Asp Gly Asn Cys Asp Glu Thr Ser Cys Tyr Leu Arg Gly Met 100 105 110 gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tcg 375 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 61 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <223> NI-301.18C4 VL variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (151)..(171) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (268)..(303) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 61 cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tca gcg gcc cca gga cag 48 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 aag gtc acc atc tcc tgc tct ggt agc agg tcc gac att ggg tct aaa 96 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asp Ile Gly Ser Lys 20 25 30 ctt gtt tcc tgg tac cag gta atc cca gga aga gcc ccc cgg ctc gtc 144 Leu Val Ser Trp Tyr Gln Val Ile Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu Val 35 40 45 att ttt gac act tat aag cgg ccc tca ggg gta cct gcc cgc ttc tct 192 Ile Phe Asp Thr Tyr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 gcc tcc aag tct ggc acg tca gcc acc ctg gac atc gcc ggg ctc cag 240 Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Asp Ile Ala Gly Leu Gln 65 70 75 80 cct ggg gac gag gcc gaa tat ttc tgc gga tca tgg ggt aac agt gag 288 Pro Gly Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Gly Ser Trp Gly Asn Ser Glu 85 90 95 aat ttt tat tat gtc ttc gga tct ggg acc cgg gtc acc gtc ctg 333 Asn Phe Tyr Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 63 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <223> NI-301.11A10 variable heavy chain (VH) sequence (PIMC by default) <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(201) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (298)..(321) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 63 cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtg tct ggt ggc tcc atc agc agt aga 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Arg 20 25 30 agt tac tac tgg ggc tgg atg cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Met Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg agt att tat tat agt ggg agc acc ctc tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtc acc atg tca ata gtc acg tcg agg aac cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Ile Val Thr Ser Arg Asn Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg aag ctg agt tct gtg acc gcc gcg gac acg gcc gtg tat tat 288 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt acc cga atg ggg gag ggg ggg cgg gac tac tgg ggc cag gga acc 336 Cys Thr Arg Met Gly Glu Gly Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ctg gtc acc gtc tcc tcg 354 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> NI-301.11A10 variable K-light chain (VK) sequence <220> <221> V_region <222> (70)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(168) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR2 <220> <221> V_region <222> (265)..(291) <223> complementarity determining region (CDR) VK-CDR3 <400> 65 gac atc cag atg acc cag tct cct tcc acc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gcc agt cag agt att agt agt tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag gtc ctg atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 tat gat gcc tcc agt ttg gaa aga ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gaa ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gat gat tct gca act tat tac tgc caa cac tat aat ggt tat tca agg 288 Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Gly Tyr Ser Arg 85 90 95 acg ttc ggc cgc ggg acc aag gtg gaa atc aaa 321 Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 67 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <223> NI-301.3C9 variable heavy chain (VH) sequence (PIMC by default) <220> <221> V_region <222> (91)..(111) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(201) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (298)..(339) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 67 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag tct tcg cag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Gln 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt gcc tcc ttc acc agg ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Phe Thr Arg Gly 20 25 30 gat ttc tac tgg agt tgg atc cgc cag gtc cca ggg aag ggc ctg gaa 144 Asp Phe Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggt tac ata tat tcc act ggg gac gtc tac tac aat ccg tct 192 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Ser Thr Gly Asp Val Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gca aac atc tcg gtc gac acg ccc aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Ala Asn Ile Ser Val Asp Thr Pro Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 ttc ctg aaa ttg acc tct ttg act gcc gca gac acg gcc gtc tat ttt 288 Phe Leu Lys Leu Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 tgt gcc agg gaa gga caa tat tgt agc ggt ggt agt tgc tac cct gaa 336 Cys Ala Arg Glu Gly Gln Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Pro Glu 100 105 110 tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <223> NI-301.3C9 variable light chain (VL) sequence (PIMC by default) <220> <221> V_region <222> (67)..(99) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (145)..(165) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (262)..(288) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 69 tcc tat gag ctg act cag cca ccc tca gtg tcc gtg tcc cca gga cag 48 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 aca gcc acc atc acc tgc tct gga gat aat ttg gga cat aaa ttt act 96 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly His Lys Phe Thr 20 25 30 tgc tgg tat cag cag aag cca ggc cag tcc cct gtc ctg gtc atc tat 144 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 caa gat cac aag cgg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tcc ggc tcc 192 Gln Asp His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 aac tct ggg gac aca gcc act ctg acc atc agc ggg acc cag gct atg 240 Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 gat gag gct gag tat tac tgt cag gcg tgg gcc ttc ccc tat gtg gtc 288 Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Ala Phe Pro Tyr Val Val 85 90 95 ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 71 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <223> NI-301.14D8 variable heavy chain (VH) sequence (not PIMC) <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(339) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 71 gag gtg cag ctg gtg gag act ggg gga cgc ttg gtc cag ccg ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc gtg aga ctc tcc tgt ata gcc tct gga ttt ccc ttt agg aat tat 96 Ser Val Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 tgg atg agt tgg gtc cgc cag cct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gcc aac ata aag gaa gat ggc agt gac aga tac tat gtg gac tct gtg 192 Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Asp Arg Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgc ttc acc atc ttt aga gac aac gcc aag aat ttt ctg agt 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asn Phe Leu Ser 65 70 75 80 cta caa atg aat cgc ctg aga gcc gag gac acg gcg gta tac ttc tgt 288 Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gcg aga att gta ggg gta atc ccg tcc gct gac cca tac tac ctt gac 336 Ala Arg Ile Val Gly Val Ile Pro Ser Ala Asp Pro Tyr Tyr Leu Asp 100 105 110 tcc tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 372 Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 73 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <223> NI-301.14D8 variable light chain (VL) sequence (PIMC by default) <220> <221> V_region <222> (67)..(108) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (154)..(174) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (271)..(300) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 73 cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg ttt gct gga cag 48 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Phe Ala Gly Gln 1 5 10 15 tcg gtc acc atc tcc tgc act gga acc agc ctt aac att ggg act tac 96 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Leu Asn Ile Gly Thr Tyr 20 25 30 aac ctt atc tcc tgg tac caa caa cac cca ggc aga gcc ccc aga ctc 144 Asn Leu Ile Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu 35 40 45 atc att ttt gag ggc aat agg cgg ccc ccc ggg att tct aat cgc ttc 192 Ile Ile Phe Glu Gly Asn Arg Arg Pro Pro Gly Ile Ser Asn Arg Phe 50 55 60 tct gcc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ttg aca gtc tct ggg ctg 240 Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 ctg gct ggc gac gag gct gat tat tac tgt tgc tca ttt gca gga aga 288 Leu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Phe Ala Gly Arg 85 90 95 gtc tct ttg gtg ttt ggc gga ggg acc aag ttg acc gtc cta 330 Val Ser Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 75 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <223> NI-301.9X4 variable heavy chain (VH) sequence (PIMC by default) <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(195) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (292)..(315) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 75 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aaa cct tcg gag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc agt gtc tct gct ggc tcc atc agt agt cac 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Ala Gly Ser Ile Ser Ser His 20 25 30 tac tgg aac tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg gaa tgg att 144 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 ggg tct atc tat cac agt ggg agc acc aac tac aac ccc tcc ctc aag 192 Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cac gtc tcc ctg 240 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Val Ser Leu 65 70 75 80 agg ttg acg tct gtg acc gcc gca gac acg gcc gtg tat tac tgt gcg 288 Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga gac tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc 336 Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val 100 105 110 acc gtc tcc tcg 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 77 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> NI-301.9X4 variable light chain (VL) sequence (PIMC by default) <220> <221> V_region <222> (67)..(99) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (145)..(165) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (262)..(294) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 77 tcc tat gag ctg act cag cca ccc tcg gtg tca gtg tcc cca gga cag 48 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat gcg ttg cca gac aag tat gct 96 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 tat tgg tac cag cag aag cca ggc cag gcc cct atg ttg gtt ata tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Met Leu Val Ile Tyr 35 40 45 aag gac agt gag agg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggc tcc 192 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 agt ttg ggg aca aca gtc atg ctg acc atc agt gga gtc cag gca gag 240 Ser Leu Gly Thr Thr Val Met Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 gac gag gct gac tat tac tgt aaa tca gca gac agc agt ggt act tat 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Ala Asp Ser Ser Gly Thr Tyr 85 90 95 tgg gtg ttc ggc ggg ggg acc aag ctg acc gtc cta 324 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 79 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <223> NI-301.14C3 variable heavy chain (VH) sequence (PIMC by default) <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(195) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (292)..(330) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 79 gag gtg cag ctg gtg gag act gga gga ggc ttg atc cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct ggg ttc acc gtc agt agc cac 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser His 20 25 30 tac atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca att att tat agc ggt ggt ggc aca tac tac gca gac tcc gtg aag 192 Ser Ile Ile Tyr Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat ctt 240 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat tac tgt gcg 288 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aag atc tac agg tcg ggt aat act ggt tat tct tac gac tac tgg ggc 336 Lys Ile Tyr Arg Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 81 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <223> NI-301.14C3 variable light chain (VL) sequence <220> <221> V_region <222> (67)..(99) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (145)..(165) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (262)..(294) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <400> 81 tcc tat gag ctg act cag cca ccc tca gtg tcc gtg tcc cca ggg cag 48 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 aca gcc agc atc acc tgc tct gga gat aaa ttg ggg agt aaa tat gct 96 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Lys Tyr Ala 20 25 30 tgc tgg tat cag cag aag cca ggc cag tcc cct gta ctg gtc atc tat 144 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 gaa gat aag aag cgg ccc tca ggg atc cct gag cga ttc tct ggc tcc 192 Glu Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 aac tct ggg aac aca gcc act ctg acc atc agc ggg acc cag gct atg 240 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 gat gag gct gac tat ttc tgt cag gcg tgg gac agc agc act tct cat 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ser His 85 90 95 gtg gta ttc ggc gga ggg acc agg ctg acc gtc cta 324 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence recognized by NI-301.59F1 in the epitope mapping - Spot 16 <400> 83 Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr 1 5 10 15 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence recognized by NI-301.35G11 in the epitope mapping - Spot 13 <400> 84 Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu 1 5 10 15 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence recognized by NI-301.35G11 in the epitope mapping - Spot 14 <400> 85 Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly 1 5 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence recognized by NI-301.37F1 in the epitope mapping - Spot 9 <400> 86 Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly 1 5 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence recognized by NI-301.37F1 in the epitope mapping - Spot 10 <400> 87 Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu 1 5 10 15 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence recognized by NI-301.37F1 in the epitope mapping - Spot 11 <400> 88 Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu 1 5 10 15

Claims (33)

  1. 인간-유래의 항-트랜스티레틴(transthyretin)(TTR) 항체 또는 그의 항원-결합 절편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    적어도 상보성 결정 영역(complementarity determining region)(CDR) 및/또는 가변 영역이 항-TTR 항체를 생산하는 인간 메모리 B 세포로부터 수득된 mRNA로부터 유래된 cDNA에 의해 암호화되는 항체.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    돌연변이화, 접힘오류화, 조립오류화 및/또는 응집된 TTR 종 및/또는 그의 절편에 결합할 수 있고, 생리학적 TTR 종을 실질적으로 인식하지 않는 항체.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는
    (ⅰ) 아미노산 서열 EEEFVEGIY(서열번호 49), GELHGLTTEEE(서열번호 50) 또는 WEPFA(서열번호 51), 및/또는
    (ⅱ) 비선형의 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있는 항체.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 항체는 TTR 에피토프 (ⅰ) GELHGLTTEEE(서열번호 50)에는 결합하지만 대응하는 L55P 돌연변이체 에피토프에는 결합하지 않거나, (ⅱ) WEPFA(서열번호 51)에는 결합하지만 대응하는 E42G 돌연변이체에는 결합하지 않는 항체.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 항체 또는 그 가변 영역 또는 결합 도메인 내에 다음을 포함하는 TTR 결합 분자:
    (a) 도 1a 내지 도 1t 중 어느 하나에 도시된 VH 및/또는 VL 가변 영역 아미노산 서열의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR);
    (b) 도 1a 내지 도 1t 중 어느 하나에 도시된 것과 같은 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열;
    (c) (a)의 아미노산 서열 중 어느 하나의 부분적인 변경의 결과인 아미노산 서열로 이루어지는 적어도 하나의 CDR; 또는
    (d) (b)의 아미노산 서열의 부분적인 변경의 결과인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원 결합 절편은 상기 VH 및/또는 VL 영역 또는 적어도 하나의 CDR에 이종성인 폴리펩티드 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게는 폴리펩티드 서열은 불변 도메인을 포함하는 항체.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 불변 도메인은 바람직하게는 IgG 타입, 가장 바람직하게는 IgG1 클래스 또는 이소형(isotype)의 인간 불변 도메인인 항체.
  9. 청구항 6의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-TTR 항체 또는 TTR-결합 분자.
  10. 청구항 5 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 쥐과(murine)-인간 또는 쥐과화된 항체인 항체.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    단일쇄 Fv 절편(scFv), F(ab') 절편, F(ab) 절편 및 F(ab')2 절편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 절편인 항체.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드는 cDNA인 폴리뉴클레오티드.
  13. 청구항 12의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  14. 청구항 12의 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 13의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  15. 항-TTR 항체를 생산하기 위한 청구항 12의 폴리뉴클레오티드, 청구항 13의 벡터 또는 청구항 14의 숙주 세포의 용도.
  16. (a) 청구항 14의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양물로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 항-TTR 항체 또는 그의 생명공학적 유도체의 제조 방법.
  17. 청구항 12의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되거나 청구항 16의 방법에 의해 수득될 수 있는 항체.
  18. (ⅰ) 검출가능한 표지를 포함하고, 바람직하게는 상기 검출가능한 표지는 효소, 방사성동위원소, 형광단 및 중금속으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 및/또는
    (ⅱ) 약물에 부착되는, 청구항 1 내지 청구항 11 또는 청구항 17 중 어느 한 항의 항체.
  19. 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 17 및 청구항 18 중 어느 한 항의 항체에 의해 특이적으로 인식되는 TTR의 에피토프를 갖는 펩티드로서, 바람직하게는 상기 펩티드는 청구항 4에 정의된 것과 같은 아미노산 서열 또는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 그의 변형된 서열을 포함하고, 상기 펩티드는 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 항체에 의해 인식되며, 바람직하게는 상기 펩티드는 항원인 펩티드.
  20. 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 17 및 청구항 18 중 어느 한 항의 항체, 청구항 12의 폴리뉴클레오티드, 청구항 13의 벡터, 청구항 14의 세포 또는 청구항 19의 펩티드를 포함하는 조성물로서, 바람직하게는 상기 조성물은
    (ⅰ) 약학적 조성물이고, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하며, 바람직하게는 상기 조성물은 백신이고, 및/또는 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환의 예방 또는 치료에 유용한 추가적인 제제를 포함하며; 또는
    (ⅱ) 진단적 조성물이고, 바람직하게는 면역 또는 핵산 기반의 진단 방법에서 종래 사용되는 시약을 추가로 포함하는 조성물.
  21. TTR 아밀로이드증과 연관된 질환의 예방적 또는 치료적 처치에 사용하기 위한 것으로서, 바람직하게는 상기 질환은 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(Familial Amyloid Polyneuropathy)(FAP), 가족성 아밀로이드 심근병증(Familial Amyloid Cardiomyopathy)(FAC), 노인 전신성 아밀로이드증(Senile Systemic Amyloidosis)(SSA), 전신 가족성 아밀로이드증, 알츠하이머 질환을 포함하는 연수막/중추 신경계(Central Nervous System)(CNS) 아밀로이드증, TTR-연관성 눈 아밀로이드증, TTR-연관성 신장 아밀로이드증, TTR-연관성 고티록신혈증, 수근관 증후군, 회전 근개 파열 및 허리뼈 관 협착증을 포함하는 TTR-연관성 인대 아밀로이드증 및 자간전증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 17 및 청구항 18 중 어느 한 항의 항-TTR 항체 또는 이들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 TTR-결합 절편, 청구항 12의 폴리뉴클레오티드, 청구항 13의 벡터, 청구항 14의 세포, 청구항 19의 펩티드 또는 청구항 20의 조성물.
  22. 인간 또는 동물 신체에서 TTR에 대한 치료제 및/또는 진단제의 생체내 검출 또는 이미징 또는 표적화에 사용하기 위한 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 17 및 청구항 18 중 어느 한 항의 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 TTR-결합 분자로서, 바람직하게는 상기 생체내 이미징은 신티그래피, 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomogrphy)(PET), 단일 광자 방출 단층촬영(single photon emission tomography, SPECT), 근적외선(near infrared)(NIR) 광학 이미징 또는 자기 공명 이미징(magnetic resonance imaging)(MRI)을 포함하는 TTR-결합 분자.
  23. 대상체의 생물학적 샘플 내에서 청구항 19의 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 결정하는 단계를 포함하는, TTR 아밀로이드증과 연관된 장애를 진단하기 위한 시험관내 방법.
  24. 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 17 및 청구항 18 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항체 또는 이들 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 TTR 결합 분자, 청구항 12의 폴리뉴클레오티드, 청구항 13의 벡터 또는 청구항 14의 세포 및/또는 청구항 19의 벡터와, 선택적으로 사용을 위한 시약 및/또는 설명서를 포함하는, TTR 아밀로이드증과 연관된 장애의 진단 또는 모니터링에 유용한 키트.
  25. 대상체에 항-TTR 항체를 투여한 후 상기 대상체 유래의 체액의 샘플 내에서 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR의 레벨을 분석하는 단계를 포함하는, 청구항 21에 정의된 것과 같은 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환의 진단, 항-TTR 항체를 이용한 상기 질환 치료의 모니터링 또는 항-TTR 항체의 진단적 또는 치료적 유용성의 결정 방법으로서, 대조군과 비교하여 상기 대상체의 샘플 내에서 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR의 존재 또는 레벨의 향상은 TTR 아밀로이드증과 연관된 질환을 지시하는 방법.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 샘플 내에서 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR의 레벨은 상기 항-TTR 항체와 접힘오류화 및/또는 응집된 TTR 사이에 형성된 복합체를 결정함으로써 분석되는 방법.
  27. 청구항 25 또는 청구항 26에 있어서,
    상기 대조군은 상기 항-TTR 항체의 투여 전에 상기 대상체로부터 수득된 샘플인 방법.
  28. 청구항 25 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 체액은 혈액이고, 상기 샘플은 이로부터 유래되며, 및/또는 상기 대조군은 상기 항-TTR 항체의 투여 전에 상기 대상체로부터 취해진 체액의 대응하는 샘플인 방법.
  29. 청구항 25 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 비-인간 동물 또는 인간인 방법.
  30. 청구항 25 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체 유래의 샘플은 투여 후 명시된 시간 간격에 수득되는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 시간 간격은 1 주 이하, 바람직하게는 48 시간 이하인 방법.
  32. 청구항 25 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-TTR 항체는 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 17 및 청구항 18 중 어느 한 항의 항-TTR 항체 또는 항원-결합 절편인 방법.
  33. 청구항 25 내지 청구항 32 중 어느 한 한의 방법에서의 항-TTR 항체의 용도로서, 바람직하게는 상기 항체는 청구항 1 내지 청구항 11, 청구항 17 및 청구항 18 중 어느 한 항의 항-TTR 항체 또는 항원-결합 절편인 용도.
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