KR101603076B1 - 아밀로이드증의 치료 및 예방 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 AA의 C 말단 영역 기원의 AA 단편과 같은 네오에피토프를 포함하는 펩타이드, 및 응집된 아밀로이드 단백질의 네오에피토프에 특이적인 항체, 예를 들어, AA 섬유의 C-말단 영역에 특이적인 항체를 투여함에 의해 AA 아밀로이드증 및 AL 아밀로이드증을 포함하는, 아밀로이드증의 예방 또는 치료를 수행하는데 유용한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 환자에서 아밀로이드 침적물의 형성을 억제하고/하거나 이의 제거를 증가시켜 아밀로이드 질환을 예방하거나 치료하기 위한 항체에 관한 것이다.

Description

아밀로이드증의 치료 및 예방{Treatment and prophylaxis of amyloidosis}
관련 출원에 대한 상호 참조
2008년 9월 10일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/095,932호 및 2007년 12월 28일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/007,544호를 우선권으로 주장하고 이들 우선권은 이의 전반적인 내용이 참조로서 본원에 인용된다.
기술분야
본 발명은 면역학 및 의학 기술 분야에 관한 것이다.
아밀로이드증은 병리학적 형태의 아밀로이드 단백질의 존재를 특징으로 하는 다수의 질환을 기술하는 일반적인 용어이고 흔히 국소 부위 또는 전신적으로 발생할 수 있는 다수의 "아밀로이드 침적물" 또는 "아밀로이드 플라크"를 형성하는 단백질 섬유의 세포외 침적물을 수반한다. 이들 침적 또는 플라크는 주로 광범위한 조직 부위에서 직경이 10-100 μm인 광범위 불용성 침적물로 어셈블리되는 천연의 가용성 단백질 또는 펩타이드로 구성된다. 당해 침적물은 일반적으로 대략 직경이 10-15nm인 섬유의 측면 응집체로 구성된다. 아밀로이드 섬유는 콩고 레드 염료(Congo Red dye)로 염색되는 경우 편광에서 특징적인 사과 녹색 복굴절을 생성한다. 일반적으로 이들 침적물의 섬유 조성은 다양한 형태의 아밀로이드 질환에 대해 특징적으로 동정된다.
플라크 침적물을 형성하는 펩타이드 또는 단백질은 흔히 대형 전구체 단백질로부터 생성된다. 보다 구체적으로, 섬유 침적물과 같은 아밀로이드 응집체의 병인은 "비정상적" 전구체 단백질이 역-평행 β 평판 쉬트로 응집하는 단편으로 단백질 용해 절단됨을 포함한다.
이들 침적물의 섬유 조성은 다양한 형태의 아밀로이드 질환에 대해 특징적으로 동정된다. 예를 들어, 주로 베타 아밀로이드 펩타이드 (β-AP)의 섬유로 구성된 뇌내 및 뇌혈관 침적물은 알츠하이머 질환(가족형 및 산발형 둘다)을 특징으로 하고, 섬 아밀로이드 단백질 펩타이드(IAPP; 아밀린)는 II형 당뇨병과 관련된 췌장 섬 세포 아밀로이드 침적물내 섬유를 특징으로 하고 β2-마이크로글로불린은 장기 혈액투석 치료의 결과로서 형성되는 아밀로이드 침적물의 주요 성분이다. 보다 최근에 프리온 연합 질환, 예를 들어, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jacob) 질환은 또한 아밀로이드 질환으로서 인지되었다.
일반적으로, 질환의 주요 아밀로이드증은 소위 면역글로불린 경쇄(카파 또는 람다)의 가변 단편에 대한 AL-섬유의 N-말단 영역의 상동성때문에 명명된 "아밀로이드 경쇄형" (AL-형) 단백질 섬유의 존재를 특징으로 한다.
다양한 형태의 질환은 대부분 아밀로이드증이 기본 전신성 질환과 관련이 있는지의 여부를 기초로 하여 여러 부류로 나누어진다. 따라서, 특정 장애는 주요 아밀로이드증인 것으로 고려되고 여기서 기존의 또는 공존하는 질환의 증거는 없다. 아밀로이드 단백질 A(AA) 섬유 침적물의 존재를 특징으로 하는 2차 또는 반응성(AA형) 아밀로이드증에서는 기본적으로 또는 관련된 만성 염증 또는 감염성 질환 상태가 있다.
가족유전성 아밀로이드증은 ATTR 트랜스티레틴형의 관련 신경병증, 신장 또는 심혈관 침적물을 가질 수 있다. 다른 가족유전성 아밀로이드증은 다른 증후군을 포함하고 상이한 아밀로이드 성분(예를 들어, AA 섬유를 특징으로 하는 가족성 지중해열)을 가질 수 있다. 다른 형태의 아밀로이드증은 분리된 기관에 존재하는 초점형, 흔히 종양형 침적물을 특징으로 하는 국소 형태를 포함한다. 다른 아밀로이드증은 노화와 관련되고 통상적으로 심장 또는 뇌에서 플라크 형성을 특징으로 한다. 또한, 아밀로이드 침적물은 통상적으로 장기 혈액투석과 관련된다. 이들 및 다른 형태의 아밀로이드 질환은 표 1에 요약되어 있고(문헌참조: Tan, S. Y. and Pepys, Histopathology 25:403-414, 1994; Harrison's Handbook of Internal Medicine, 13th Ed., Isselbacher, K.J., et al, eds, McGraw-Hill, San Francisco, 1995) 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제6,875,434호, 제6,890,535호, 제6,913,745호, 제6,923,964호, 및 제6,936,246호에 기재되어 있다.
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Figure 112010048814606-pct00002
Figure 112010048814606-pct00003
흔히 대부분의 아밀로이드 침적물을 형성하는 섬유는 하나 이상의 1차 전구체 단백질 또는 펩타이드로부터 유래하고 통상적으로 황화된 글리코사미노글리칸과 연합된다. 추가로, 아밀로이드 침적물은 소수 단백질 및 다양한 유형의 펩타이드와 프로테오글리칸, 갱글리오사이드 및 하기 섹션에서 보다 상세하게 기재된 바와 같은 기타 당을 포함할 수 있다.
AA 섬유는 HDL 입자에 존재하고 인터루킨 (IL)-I 및 IL-6과 같은 사이토카인 및 종양 괴사 인자 뿐만 아니라 종양 괴사 인자 α에 반응하여 합성되는 순환하는 아포지질단백질(SSA)의 단백질용해 절단에 의해 형성되는 크기가 다양하지만 일반적으로 약 8000 달톤인 펩타이드 단편(AA 펩타이드 또는 단백질)로 구성된다[문헌참조: Husby, G. et al. Amyloid 1, 119-137 (1994)]. 단백질용해 절단은 SAA 단백질의 3분의 2인 약 76-잔기 N-말단의 병리학적 침적을 유발한다. 사람에서, SAA의 혈장 농도는 약 0.1 mg/ml이지만 염증 자극에 반응하여 1,000배 이상 증가할 수 있다. 당해 프로세스의 일부로서, SAA 분자는 단백질 용해를 진행하고 N-말단 절단 생성물은 간, 비장, 신장 및 부신을 포함하는 중추 기관에서 AA 섬유로서 전신적으로 침적된다. 침적은 또한 심장 및 위장관에서 통상적인 것이다.
일반적으로, AA 아밀로이드증은 지속적인 급성 상 반응을 유발하는 질환의 증후이다. 당해 질환은 만성 염증 장애, 만소 국소 또는 진신성 미생물 감염 및 악성 신생물을 포함한다. AA 아밀로이드 질환은 염증 질환, 예를 들어, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선 관절병증, 라이터 증후군, 성인 스틸(Still) 질환, 베체트 증후군 및 크론 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. AA 침적물은 또한 만성 미생물 감염, 예를 들어, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창 궤양, 만성 신우신염, 골수염 및 휘플(Whipple) 질환의 결과로서 생성된다. 특정 악성 신생물은 또한 AA 섬유 아밀로이드 침적물을 생성시킬 수 있다. 이들은 호지킨 림프종, 신장 암종, 위, 폐 및 비뇨생식기의 암종, 기저세포 암종 및 모발 세포 백혈병과 같은 병태를 포함한다. AA 아밀로이드 질환은 또한 유전된 염증 질환, 예를 들어, 가족성 지중해열로부터 비롯될 수 있다. 추가로, AA 아밀로이드 질환은 캐슬맨(Castleman) 질환과 같은 림프증식성 장애로부터 비롯될 수 있다.
AA 아밀로이드증은 서서히 퍼지는 진행성이다. 증상은 일반적으로 질환의 후기 단계에서 나타난다. 흔히, 환자는 상당한 기관 손상이 발생할 때까지 진단되지 않는다. AA 섬유는 필수 기관에서 침적되고 기관 기능부전을 유발하여 결국 사망에 이르게 한다. 5년 생존율은 45-50%이다. 진단 후 평균 생존은 4-8년이다. 말단 단계의 신장 질환은 사례의 40 내지 60%에서 사망의 원인이다[문헌참조: Gillmore J.D. et al, Lancet 358:24-9 (2001)].
현재, AA 아밀로이드증을 포함한 임의의 아밀로이드 질환에 대해 어떠한 승인된 특이적인 아밀로이드 지향의 치료법이 없다[문헌참조: Gillmore J.D. et al., Lancet 358:24-9 (2001)]. 근본적이거나 연합된 질환 상태가 있는 경우, 치료법은 근본적인 질환을 치료함에 의해 아밀로이드성 단백질의 생성을 감소시키는 방향으로 지향된다. 예를 들어, AA 아밀로이드증에 대한 현재 치료 전략은 ApoSSA 수준을 10mg/l 미만으로 감소시켜 근본적인 염을 표적화하는 것이다. 현재 사용되는 치료법은 화학요법(콜로람부실 및 MTX), 면역-억제제(아자티오프린), 소염 약물(콜히친) 및 TNF 억제제를 포함한다. 따라서 본 발명은 AA 아밀로이드증을 예방하거나 이의 효과를 경감시키기 위한 치료 계획에 대한 오랜 숙원의 필요성을 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 사람 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번내의 에피토프, 예를 들어, 서열번호 2의 잔기 70번 내지 76번내의 에피토프 또는 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11에 제시된 잔기를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 사람, 사람화되거나 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성된 항체 2A4 또는 ATCC 수탁번호 PTA-9468에 의해 생성된 항체 7D8과 사람 아밀로이드 A 펩타이드에 결합하는 것에 대해 경쟁하는 것들을 포함한다. 본 발명의 추가의 항체는 서열번호 152의 잔기 20번 내지 131번 또는 서열번호 153의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 경쇄 가변 영역 및 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로 제시된 중쇄 가변 영역을 갖는 항체와 사람 아밀로이드 A 펩타이드에 결합하는 것에 대해 경쟁한다.
당해 기재된 항체는 ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성된 사람화되고 키메라 버전의 항체 2A4 또는 ATCC 수탁번호 PTA-9468에 의해 생성된 사람화된 버전 또는 키메라 버전의 항체 7D8을 포함한다.
예를 들어, 대표적인 항체 및 항원 결합 단편은 서열번호 152의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 2A4 경쇄 가변 영역의 하나 이상의 상보성 영역 또는 서열번호 153의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 7D8 경쇄 가변 영역의 하나 이상의 상보성 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 예로서, 대표적인 항체 및 항원 결합 단편은 서열번호 152의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 2A4 경쇄 가변 영역의 2개의 상보성 영역 또는 서열번호 153의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 7D8 경쇄 가변 영역의 2개의 상보성 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 대표적인 항체 및 항원 결합 단편은 대표적인 항체 및 항원 결합 단편은 서열번호 152의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 2A4 경쇄 가변 영역의 3개의 상보성 영역 또는 서열번호 153의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 7D8 경쇄 가변 영역의 3개의 상보성 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 2A4 또는 7D8 항체의 대표적인 사람화된 버전은 각각 Y 및 F에 의해 점유되는 L87 및 L90(캐뱃(Kabat) 넘버링 규정)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 골격 잔기를 포함하고 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 (acceptor) 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유된다. 대표적인 항체 및 항원 결합 단편은 각각 T, S, L, D, Q, K, Y, L, F, 및 L에 의해 점유되는 +7, +14, +15, +17, +18, +50, +75, +88, + 92, 및 +109 (선형 넘버링)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 골격 잔기를 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유된다. 예를 들어, 대표적인 항체 및 항원 결합 단편은 각각 Y 및 F에 의해 점유되는 +75 및 +92 (선형 넘버링)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 골격 잔기를 포함하고, 이때, 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역내 상응하는 잔기에 의해 점유된다. 본 발명의 다른 대표적인 항체 및 항원 결합 단편에서, 경쇄 가변 영역은 Q에 의해 점유되는 +105(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 T에 의해 점유되는 +7(선형 넘버링)에서 골격 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 항체 및 항원 결합 단편은 S에 의해 점유되는 +14(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 항체 및 항원 결합 단편은 L에 의해 점유되는 +15(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 항체 및 항원 결합 단편은 D에 의해 점유되는 +17(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 항체 및 항원 결합 단편은 Q에 의해 점유되는 +18(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 항체 및 항원 결합 단편은 K에 의해 점유되는 +50(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 항체 및 항원 결합 단편은 Y에 의해 점유되는 +75(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 항체 및 항원 결합 단편은 L에 의해 점유되는 +88(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 항체 및 항원 결합 단편은 F에 의해 점유되는 +92(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 항체 및 항원 결합 단편은 L에 의해 점유되는 +109(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 항체 및 항원 결합 단편은 Q에 의해 점유되는 +105(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 경쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유된다.
본 발명에 사용되는 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 사람 카파 서브그룹 2 경쇄 가변 영역(캐뱃 규정), 예를 들어, 서열번호 166 또는 167로 제시된 서열을 포함하는 사람 Vk 경쇄 가변 영역과 같은 사람 배선 VKIIA19/A3로부터의 사람 서브그룹 2 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 특정 측면에서, 항체 및 항원 결합 단편은 서열번호 152의 잔기 20번 내지 131번, 서열번호 153의 잔기 20번 내지 131번으로서 제시되거나 서열번호 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175, 또는 176으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 대표적인 항체 및 항원 결합 단편은 또한 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로 제시된 2A4 중쇄 가변 영역의 하나 이상의 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역, 예를 들어, 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로 제시된 2A4 중쇄 가변 영역의 2개의 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로 제시된 2A4 중쇄 가변 영역의 3개의 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함한다. 대표적인 사람화된 2A4 및 7D8 항체 및 항원 결합 단편은 각각 I, A, F, 또는 V에 의해 점유된 H37, H49, H70, 및 H93(캐뱃 넘버링 규정)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 골격 잔기를 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유된다. 대표적인 사람화된 항체 및 항원 결합 단편은 각각 R, K, K, I, A, F, Q, S, M, N, M, V, 또는 A에 의해 점유되는 +10, +15, +19, +37, +49, +73, +78, +79, +80, +87, +95, +99 및 +119(선형 넘버링)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 골격 잔기를 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유된다. 예를 들어, 대표적인 사람화된 항체 및 항원 결합 단편은 각각 I, A, F, 또는 V에 의해 점유되는 +37, +49, +73, 및 +99 (선형 넘버링)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 골격 잔기를 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유된다.
예를 들어, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 R에 의해 점유된 +10(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 K에 의해 점유된 +15(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 K에 의해 점유된 +19(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 I에 의해 점유된 +37(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 A에 의해 점유된 +49(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 F에 의해 점유된 +73(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 Q에 의해 점유된 +78(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 S에 의해 점유된 +79(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 M에 의해 점유된 +80(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 N에 의해 점유된 +87(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 M에 의해 점유된 +95(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 V에 의해 점유된 +99(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유되고; 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 A에 의해 점유된 +109(선형 넘버링)에서 골격 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것들을 포함하고, 이때 중쇄 가변 영역의 나머지는 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역에서 상응하는 잔기에 의해 점유된다.
사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 사람 감마 서브그룹 3 중쇄 가변 영역(캐뱃 규정), 예를 들어, 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로서 제시되거나 서열번호 161, 162 또는 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 같은 서열번호 165로 제시된 서열을 포함하는 사람 감마 서브그룹 3 중쇄 가변 영역을 포함한다.
추가의 대표적인 항체 및 항원 결합 단편은 서열번호 152의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 2A4 경쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역 또는 서열번호 153의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 7D8 경쇄 가변 영역의 3개의 상보성 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로 제시된 2A4 중쇄 가변 영역의 3개의 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 당해 항체 및 항원 결합 단편은 서열번호 168, 169 및 170번으로 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 171, 172 및 173으로 제시된 3개의 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 것들을 포함한다. 또 다른 예로서, 당해 항체 및 항원 결합 단편은 서열번호 177, 169 및 170번으로 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 171, 172 및 173으로 제시된 3개의 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 것들을 포함한다. 또 다른 예로서 당해 항체 및 항원 결합 단편은 서열번호 152의 잔기 20번 내지 131번 또는 서열번호 153의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 것들을 포함한다. 또 다른 예로서, 당해 항체 및 항원 결합 단편은 서열번호 155, 156, 157, 158, 159, 160, 174, 175, 또는 176으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 161, 162, 또는 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 것들을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 155로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 161로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 155로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 162로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 155로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 156으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 161로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 156으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 162로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 156으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 157로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 161로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 157로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 162로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 157로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 158로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 161로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 158로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 162로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 158로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 159로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 161로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 159로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 162로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 159로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 160으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 161로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 160으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 162로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 160으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 174로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 161로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 174로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 162로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 174로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 175로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 161로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 175로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 162로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 175로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 176으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 161로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 176으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 162으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 서열번호 176으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또한 본원 상기에서 기재되고 청구항에 제시된 바와 같은 모든 항체 및 항원 결합 단편을 포함하여, 사람 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번내 에피토프에 특이적으로 결합하는 사람, 사람화된, 또는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 추가로 당해 핵산을 발현하는 세포가 제공된다.
다른 측면에서, 본 발명은 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고 이때 X1 및 X2는 임의의 아미노산이다. 당해 항체 및 항원 결합 단편은 사람, 사람화된 또는 키메라 항체 및 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 사람 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것들을 포함한다.
추가의 대표적인 항체 및 항원 결합 단편은 X1이 H, T, F, S, P, A, L, C, Q, R, E, K, D, G, V, Y, I, 또는 W이고 X2가 T, S, E, R, I, V, F, D, A, G, M, L, N, P, C, K, Y, 또는 Q이거나; X1이 H, T, F, S, P, 또는 A이고 X2가 T, S, E, R, I, V, F, D, 또는 A이거나; X1이 H, T, F, 또는 A이거나; X2가 T, S, E, D, 또는 A이거나; X1이 H, T, F, 또는 A이고 X2가 T, S, E, D, 또는 A이거나; X1이 H, T, 또는 A이고 X2가 T, S, E, 또는 A이거나; X1이 H 또는 A이고 X2가 T, S, 또는 A이거나; X1이 H이고 X2가 T 또는 A이거나; X1이 A이고 X2가 S, T, E 또는 V이거나; X1이 A이고 X2가 S, T 또는 E이거나; X1이 T이고 X2가 E이거나; X1이 F이고 X2가 D이거나; X1이 S이고 X2가 E, F 또는 A이거나; X1이 P이고 X2가 E, I 또는 F인 것들을 포함한다. 예를 들어, 당해 항체 및 항원 결합 단편은
Figure 112010048814606-pct00004
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 에피토프; 또는
Figure 112010048814606-pct00005
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 에피토프; 또는
Figure 112010048814606-pct00006
으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 결합한다. 기재된 에피토프는 응집된 아밀로이드 단백질에서 발견될 수 있고, 예를 들어,
Figure 112010048814606-pct00007
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 에피토프; 또는 아미노산 서열 GHGAEDS (서열번호 4)을 포함하는 에피토프; 또는 아미노산 HEDT (서열번호 12)를 포함하는 에피토프; 또는 아미노산 HEDA (서열번호 15)를 포함하는 에피토프; 또는 아미노산 AEDS (서열번호 13)를 포함하는 에피토프 또는 아미노산 AEDT (서열번호 14)을 포함하는 에피토프; 또는 아미노산 TEDE (서열번호 16)를 포함하는 에피토프; 또는 아미노산 서열 AEDV (서열번호 23)를 포함하는 에피토프; 또는 아미노산 서열 SEDF (서열번호 24) 또는 PEDF (서열번호 22)를 포함하는 에피토프; 또는 PEDS (서열번호 26), PEDL (서열번호 27), TEDV (서열번호 28), AEDE (서열번호 19), SEDI (서열번호 29) 및 TEDT (서열번호 30)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프; 또는
Figure 112010048814606-pct00008
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다.
본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단편은 약 107 M-1 미만의 친화성을 갖는 단량체 형태의 아밀로이드 단백질에 결합하는 것들을 포함한다. 대표적인 아밀로이드 단백질은 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 면역글로불린 경쇄 단백질(예를 들어, Vλ6 Wil 및 Vκ), 사람 섬 아밀로이드 전구체 폴리펩타이드(IAPP), 베타 아밀로이드 펩타이드, 트랜스티레틴(TTR), 및 ApoA1을 포함한다.
또한 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하고, 본원에 기재된 바와 같고 청구항에 제시된 바와 같은 모든 항체 및 항원 결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산이 제공되고, 이때 X1 및 X2는 임의의 아미노산이다. 추가로 당해 핵산을 발현하는 세포가 제공된다.
본 발명은 추가로 사람 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번내 에피토프, 예를 들어, 서열번호 2의 잔기 70번 내지 76번내 에피토프에 특이적으로 결합하는 사람, 사람화된 또는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여, AA 아밀로이드증을 갖는 대상체를 치료학적으로 치료하거나 예방학적으로 치료하는 방법을 제공한다. AA 아밀로이드증을 치료하는 기재된 치료 방법으로부터 수혜받을 수 있는 대상체는 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선 관절병증, 라이터 증후군, 성인 스틸 질환, 베체트 증후군, 크론 질환, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창 궤양, 만성 신우신염, 골수염, 휘플 질환, 호지킨 림프종, 신장 암종, 장(gut), 폐 및 비뇨생식기의 암종, 기저 세포 암종, 모발 세포 백혈병, 가족성 지중해열 및 캐슬맨 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아밀로이드 질환을 앓고 있는 대상체들을 포함한다. 기재된 예방학적 방법으로부터 수혜받을 수 있는 대상체는 이전의 장애 중 어느 하나가 발병할 위험에 처해있거나 이에 민감할 수 있는 대상체들을 포함한다.
또한, 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 사용하여 아미노산 서열 ED를 포함하는 응집된 아밀로이드 단백질과 연관된 아밀로이드증을 갖는 대상체를 치료학적으로 치료하거나 예방학적으로 치료하는 방법이 제공되고 이때 X1 및 X2는 임의의 아미노산이다. 응집된 아밀로이드 단백질과 연관된 아밀로이드증을 치료하는 기재된 치료학적 방법으로부터 수혜받을 수 있는 대상체는 AA 아밀로이드증, AL 아밀로이드증, 알츠하이머 질환, 경증 인식 손상, 아밀로이드 다발신경병증, 지중해열, 머클-웰스 증후군, 전신 염증 질환과 관련된 반응성 전신 아밀로이드증, 골수종 또는 마크로글로불린혈증 관련된 아밀로이드증, 면역세포 악액질과 관련된 아밀로이드증, 모노클로날 감마병증, 불가사의한 악액질, 및 만성 염증 질환과 관련된 국소 결절 아밀로이드증을 앓는 대상체들을 포함한다. 기재된 예방학적 방법으로부터 수혜받을 수 있는 대상체는 상기 장애의 위험에 처하거나 이에 민감할 수 있는 대상체들을 포함한다. 본 발명의 하나의 측면에서, 아밀로이드 단백질은 서열 AEDV (서열번호 23)를 포함하고 기재된 방법을 치료학적으로 또는 예방학적으로 사용하여 치료된 아밀로이드성 질환은 AA 아밀로이드증, AL 아밀로이드증, 아밀로이드 다발신경병증, 지중해열, 머클-웰스 증후군, 전신 염증 질환과 관련된 반응성 전신 아밀로이드증, 골수종 또는 마크로글로불린혈증 관련된 아밀로이드증, 면역세포 악액질과 관련된 아밀로이드증, 모노클로날 감마병증, 불가사의 악액질 및 만성 염증 질환과 관련된 국소 결절 아밀로이드증이다.
기재된 치료학적 및 예방학적 방법은 사람 대상체를 치료하기 위해 유용하다.
효과적인 치료학적 치료의 대표적인 지표는 아밀로이드증의 진행을 보여주고/주거나, 아밀로이드 섬유 응집체의 침적을 억제하고/하거나 아밀로이드 섬유 응집체를 제거하는 것을 포함한다. 효과적인 예방학적 치료의 대표적인 지표는 아밀로이드증의 개시를 지연시키고/시키거나 아밀로이드증의 위험을 감소시키는 것을 포함한다.
추가로, 사람 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번내의 에피토프에 특이적으로 결합하고 검출가능한 표지에 결합되어 있는 사람, 사람화된 또는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 환자에서 검출가능한 표지를 검출함으로써 대상체에서 AA 아밀로이드증과 관련된 아밀로이드 침적물을 검출하는 방법이 제공된다. 추가의 방법은 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항원 결합 단편을 사용하여 아미노산 서열 ED를 포함하는 응집된 아밀로이드 단백질을 검출함을 포함하고 이때 X1 및 X2는 임의의 아미노산이다. 상기 검출 방법은 예를 들어, 상기된 질환 및 장애중 임의의 하나에서 질환 또는 치료의 개시 또는 진행을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 치료 방법에 대하여, 당해 모니터링은 비사람 대상체 뿐만 아니라 사람에서 수행될 수 있다. 유용한 검출가능한 표지는 방사선표지, 예를 들어, 125I를 포함한다. 당해 검출 방법을 수행하는데 있어서, 검출가능한 표지를 검출하는 단계는 SPECT/CT 영상화 및 NMR 분광법과 같은 비-침습성 기술에 의해 성취될 수 있다.
추가로 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번에 대한 항체를 포함하는, 면역 반응을 유도하기에 효과적인 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번에 대해 면역 반응을 유도하는 제제를 사용하여 AA 아밀로이드증을 갖는 대상체의 능동적 면역 치료법이 제공된다. 면역 반응을 유도하는 대표적인 제제는 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번 또는 AA 펩타이드 기원의 20개 미만의 연속 아미노산을 갖는 3개 이상의 연속 잔기의 서브단편을 포함한다. 이들 방법은 수동적 면역치료와 관련하여, 즉 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 투여함에 의해 상기 본원에 기재된 대상체를 치료하기 위해 치료학적으로 및/또는 예방학적으로 둘다에 유용하다. 치료학적 및 예방학적 효능의 지표는 또한 수동적 면역치료와 관련하여 상기된 바와 같다.
상기에서는 발명의 특정 측면을 요약하였고 여기서는 발명의 추가의 측면이 기재된다.
도 1 : 사람 SAA1, 사람 SAA2, 사람 SAA3 및 사람 SAA4의 서열 정렬.
도 2: 사람 SAA1 및 사람 AA1의 서열 정렬.
도 3: 사람 SAA2 및 사람 AA2의 서열 정렬.
도 4: 사람 SAA3 및 사람 AA3의 서열 정렬.
도 5: 사람 SAA4 및 h사람 AA4의 서열 정렬.
도 6: 사람 AA1, 사람 AA2, 사람 AA3 및 사람 AA4의 서열 정렬.
도 7: 사람 AA1, h사람 AA2, 사람 AA3 및 사람 AA4의 서열 정렬.
도 8: 마우스 SAA1, 마우스 SAA2, 마우스 SAA3 및 마우스 SAA4의 서열 정렬.
도 9: 마우스 SAA1 및 마우스 AA1의 서열 정렬.
도 10: 마우스 SAA2 및 마우스 AA2의 서열 정렬.
도 11 : 마우스 SAA3 및 마우스 AA3의 서열 정렬.
도 12: 마우스 SAA4 및 마우스 AA4의 서열 정렬.
도 13: 마우스 AA1, 마우스 AA2, 마우스 AA3 및 마우스 AA4의 서열 정렬.
도 14: 마우스 AA1, 마우스 AA2, 마우스 AA3 및 마우스 AA4의 마지막 7개 잔기의 서열 정렬.
도 15: 사람 SAA1 및 마우스 SAA1의 서열 정렬.
도 16: 사람 AA1 및 마우스 AA1의 서열 정렬.
도 17: 사람 SAA1 및 마우스 SAA1 단편의 서열 정렬.
도 18: 사람 SAA1 알파, 사람 SAA1 베타 및 사람 SAA1 감마의 서열 정렬.
도 19: 사람 SAA2 알파 및 사람 SAA2 베타의 서열 정렬.
도 20: SAA 단백질의 서열 비교. 2A4, 8G9 및 7D8을 생성하기 위해 사용되는 펩타이드 영역은 점선으로 나타낸다. 샤르 페이(Shar Pei) 서열에서 67번과 68번 사이의 8개 아미노산 삽입체는 밀줄 및 화살표로 나타낸다. 정렬은 CLUSTALW를 사용하여 수행한다.
도 21 : Vκ 경쇄의 배선 서열.
도 22: Vλ 경쇄의 배선 서열.
도 23: Vλ6 Wil의 아미노산 서열.
도 24: Glu50-Asp51의 위치를 보여주는 Vλ6 Wil의 X-선 결정.
도 25: Glu81-Asp82의 위치를 보여주는 Vλ6 Wil의 X-선 결정.
도 26: 합성 Vλ6 Wil 섬유에 대한 엘란 mAb의 결합 역학. 고정화된 Vλ6 Wil 섬유에 대한 6.6nM에서의 mAb 2A4, 7D8 및 8G9의 상호작용의 BIAcore 측정. 각각의 상호작용에 대해 계산된 KD는 약 1 nM이었다.
도 27: 합성 Vλ6 Wil 섬유에 대한 mAb 7D8의 농도 의존성 결합 역학. 고정화된 Vλ6 Wil 섬유에 대한 6.6 - 33.3 nM의 농도에서의 항체 상호작용은 BIAcore로 측정하였다.
도 28: p39 및 p41 펩타이드의 존재하에 합성 Vλ6 Wil 섬유에 대한 mAb 7D8의 결합 역학. 고정화된 Vλ6 Wil 섬유와 6.6nM에서의 mAb 7D8의 상호작용은 1 또는 20㎍/mL에서 펩타이드 p39 및 p41의 존재하에 BIAcore로 측정하였다.
도 29: ALλ 조직 아밀로이드 침적물과 모노클로날 항체의 반응성.
도 30: 사람 ALλ 아밀로이드종(amyloidoma)을 함유하는 마우스에서 125I-표지된 mAb 7D8의 생분포.
도 31 : 쥐 유래 AA 섬유와 배양 상청액의 항-AA의 상호작용. 쥐 AA AEF에 결합하는 mAb 배양 상청액의 결과. 상부 및 하부 패널은 각각 제1 및 제2 배양 유체에 대한 데이터이다.
도 32: 단백질 A-정제된 2A4, 8G9 및 7D8 mAb의 SDS-PAGE 분석.
도 33: 정제된 mAb의 면역화 (p#39) 및 대조군(p#41) 펩타이드로의 결합 .
도 34: 쥐 AA 아밀로이드 추출물(AEF)로의 결합.
도 35: 정제된 mAb의 사람 신장 AA 아밀로이드 추출물로의 결합.
도 36A-36E: 쥐 2A4, 7D8, 및 8G9 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 서열(도 36A); 사람화된 2A4/8G9 및 7D8 경쇄 가변 영역의 서열(도 36B-36C); 어셉터 골격으로서 사용된 사람 경쇄 가변 영역의 서열(도 36D); 어셉터 골격으로서 사용되는 사람화된 2A4/7D8/8G9 중쇄 가변 영역 및 사람 중쇄 가변 영역의 서열(도 36E). 밑줄은 CDR; 이중 밑줄은 리더 서열; 소문자는 복귀 돌연변이.
본 발명은 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고 이때, X1 및 X2는 임의의 아미노산이다.
본 발명의 대표적인 항체는 또한 (a) 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체와, X1EDX2를 포함하는 에피토프에 결합하는 것에 대해 경쟁하거나; (b) 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체로서 X1EDX2를 포함하는 동일한 에피토프에 결합하거나; (c) 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체의 항원 결합 도메인을 포함하거나; (d) 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체의 6개 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체로부터 유래된 항체의 경쇄 가변 영역 또는 (b) 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체로부터 유래된 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항체 가변 영역을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 7D8, 2A4, 또는 8G9 항체의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는, 7D8, 2A4, 또는 8G9 항체의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열; (c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 엄중 하이브리드화 조건하에서 (a) 또는 (b)의 뉴클레오타이드 서열의 상보체인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산과 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 포함하는, 항체 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 항체 및 항원 결합 단편을 발현하는 세포가 또한 제공된다. 본 발명은 추가로 본 발명의 핵산을 발현하는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편을 사용하여 아밀로이드 질환을 치료하는 방법 및 아밀로이드 질환을 예방하는 방법을 포함한다. 현재, AA 아밀로이드증 및 AL 아밀로이드증을 포함하는, 아밀로이드 질환중 어느 질환에 대해서도 어떠한 승인된 특이적 아밀로이드 표적의 치료법은 없다[문헌참조: Gillmore J.D. et al., Lancet 358:24-9 (2001)]. 기본 또는 관련 질환 상태가 있는 경우 치료 요법은 기본 질환을 치료함에 의해 아밀로이드성 단백질의 생산을 감소시키는 쪽으로 지향된다. 예를 들어, AA 아밀로이드증에 대한 현재 치료 전략은 ApoSSA 수준을 10mg/l 미만으로 감소시켜 기본 염증을 표적으로 하는 것이다. 현재 사용되는 치료요법은 화학치료요법(클로로람부실 및 MTX), 면역-억제제(아자티오프린), 소염 약물(콜히친) 및 TNF 억제제를 포함한다. 본 발명은 아밀로이드증, 예를 들어, AA 아밀로이드증 및 AL 아밀로이드증을 포함하는 다수의 아밀로이드 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 방법을 제공한다. 하나의 측면에 따라, 본 발명은 활성 성분으로서, 아밀로이드 성분에 대해 환자에서 면역 반응을 유도하기에 효과적인 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 당해 제제는 아밀로이드 단백질로부터 유래된 아미노산 서열 X1EDX2로 이루어진 단편을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 당해 제제는 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 다른 양태에서, 당해 제제는 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 당해 조성물은 일반적으로 또한 부형제를 포함하고 바람직한 양태에서 애주번트를 포함할 수 있다. 추가의 바람직한 양태에서, 애주번트는 예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, MPL™, QS-21 (STIMULON™) 또는 불완전 프로인트 애주번트를 포함한다. 관련 양태에 따라, 당해 약제학적 조성물은 환자내 하나 이상의 아밀로이드 성분에 대해 면역 반응을 유도하기에 효과적인 다수의 제제를 포함할 수 있다.
관련 양태에서, 당해 제제는 섬유 펩타이드 또는 단백질 아밀로이드 성분과 같은 응집된 아밀로이드 단백질에 대해 지시된 면역 반응을 생성하기에 효과적이다. 바람직하게, 당해 섬유 펩타이드 또는 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 특정 형태의 아밀로이드 질환과 관련된 것으로 공지된 섬유 전구체 단백질로부터 유래한다. 당해 전구체 단백질은 혈청 아밀로이드 A 단백질(ApoSSA), 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, ApoAI, 트랜스티레틴, 라이소자임, 피브로겐 α 쇄, 겔솔린, 시스타틴 C, 아밀로이드 β 단백질 전구체(β-APP), 베타2 마이크로글로불린, 프리온 전구체 단백질 (PrP), 심방 나트륨 이뇨성 인자, 케라틴, 섬 아밀로이드 폴리펩타이드, 펩타이드 호르몬, 및 시누클레인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당해 전구체는 또한 당해 전구체의 돌연변이 단백질, 단백질 단편 및 단백질용해 펩타이드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 당해 제제는 섬유 전구체 단백질과 관련하여 섬유 단백질 또는 펩타이드에 의해 형성된 네오에피토프에 대해 지시된 면역 반응을 유도하기에 효과적이다. 즉, 본원에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 많은 섬유 형성 펩타이드 또는 단백질은 상기 열거된 것들과 같은 당해 전구체 단백잴의 단편이다. 예를 들어, 단백질용해 절단에 의해 당해 단편이 형성되는 경우, 에피토프는 전구체상에 존재하지 않고 따라서 단편이 전구체 단백질의 일부인 경우 면역계에 면역학적으로 유용하지 않은 것으로 밝혀질 수 있다. 당해 에피토프에 지시된 제제는 이들이 환자에서 자가면역 반응을 유도할 가능성이 적을 수 있기 때문에 바람직한 치료할적 제제일 수 있다. 바람직하게, 당해 제제는 비병리학적 형태의 아밀로이드 단백질에 비해 우선적으로 병리학적 형태의 아밀로이드 단백질에 대해 지시된 면역 반응을 생성한다.
관련 양태에 따라, 본 발명의 약제학적 조성물은 하기의 응집된(예를 들어, 섬유) 펩타이드 또는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택된 것들과 같은 아밀로이드 응집체에 대해 지시된 제제를 포함한다: AA, AL, ATTR, AApoA1, Alys, Agel, Acys, Aβ, AB2M, AScr, Acal, AIAPP 및 시누클레인-NAC 단편. 이들 펩타이드의 완전한 명칭 및 조성은 본원에 기재된다. 당해 펩타이드는 본원에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
당해 방법은 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 유효 용량의 항체를 환자에게 투여함을 포함하고 여기서, X1은 H, T, F, S, P, A 또는 당해 아밀로이드 단백질에서 ED에 바로 선행하는 임의의 다른 아미노산 잔기이고 X2는 T, S, E, R, I, V, F, A 또는 당해 아밀로이드 단백질에서 ED 바로 이어서 있는 임의의 다른 아미노산 잔기이다. 몇몇 방법에서, 당해 환자는 아미노산 서열 ED를 포함하는 응집된 아밀로이드 단백질과 관련된 아밀로이드증을 앓고 있다. 몇몇 항체는 당해 X1EDX2로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체에서, X1은 H, T, F, S, P, 또는 A이고 X2는 T, S, E, D, R, I, V, F 또는 A이다. 몇몇 당해 항체에서, X1이 H인 경우, X2는 T 또는 A이고; X1이 A인 경우, X2 는 S, T, E 또는 V이고; X1이 T인 경우, X2는 E이고; X1이 F인 경우, X2는 D이고; X1이 S인 경우, X2는 E, F 또는 A이고; X1이 P인 경우, X2는 E, I 또는 F이다. 몇몇 양태에서, X1은 H, T, F, S, P, 또는 A이고 X2는 T, S, E, D, R, I, V, F 또는 A이고, 단, X1이 A인 경우 X2는 V가 아니다. 몇몇 양태에서, X1이 A인 경우, X2는 S, T 또는 E이다.
몇몇 항체는 아미노산 서열
Figure 112010048814606-pct00009
를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
몇몇 항체는
Figure 112010048814606-pct00010
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는
Figure 112010048814606-pct00011
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다.
몇몇 항체는 AA의 잔기 70번 내지 76번 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 AA의 71번 내지 75번내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 GHEDT, (서열번호 3)를 포함하는 펩타이드에 대해 생성된다.
몇몇 항체는 아미노산 서열
Figure 112010048814606-pct00012
을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 아미노산 서열
Figure 112010048814606-pct00013
을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다.
몇몇 항체는 아미노산 서열 AEDV, (서열번호 23)을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 아미노산 서열 SEDF, (서열번호 24) 또는 PEDF, (서열번호 22)를 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 아미노산 서열 AEDS, (서열번호 13)를 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 아미노산 서열
Figure 112010048814606-pct00014
을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 아미노산 서열 TEDE, (서열번호 16)를 포함하는 펩타이드에 결합한다.
몇몇 항체는 아미노산 서열 AEDV, (서열번호 23)를 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 아미노산 서열 SEDF, (서열번호 24) 또는 PEDF, (서열번호 22)을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 아미노산 서열 AEDS, (서열번호 13)을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 아미노산 서열
Figure 112010048814606-pct00015
를 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 아미노산 서열 TEDE, (서열번호 16)를 포함하는 펩타이드에 결합한다.
상기된 임의의 항체는 상기된 방법에서 아밀로이드 단백질, 예를 들어, 아미노산 서열 ED를 포함하는 아밀로이드 단백질의 침적을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방을 위해 투여될 수 있다. 몇몇 방법에서, 아밀로이드 단백질이 아미노산 서열 AEDV, (서열번호 23)를 포함하는 경우 당해 항체는 알츠하이머 질환 또는 약간의 인식 손상의 치료 또는 예방을 위해 투여되지 않는다. 아밀로이드 단백질은 혈청 아밀로이드 A 단백질, 면역글로불린 경쇄 단백질, 예를 들어, Vλ6 Wil 또는 Vκ, 사람 섬 아밀로이드 전구체 폴리펩타이드(IAPP), 베타 아밀로이드 펩타이드, 트랜스티레틴(TTR) 또는 ApoA1 중 임의의 하나일 수 있다.
임의로 환자는 사람이다. 임의로, 당해 항체는 잔기가 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 임의로 당해 항체는 서열번호 2의 잔기 70번 내지 76번내 에피토프에 특이적으로 결합한다. 임의로 당해 항체는 사람 항체, 사람화된 항체 또는 키메라 항체이다. 임의로 사람 항체는 사람 이소형 IgG1, IgG4, IgG2 또는 IgG3이다. 임의로, 사람화된 항체는 사람 이소형 IgG1, IgG4, IgG2 또는 IgG3이다. 임의로, 키메라 항체는 사람 이소형 IgG1, IgG4, IgG2 또는 IgG3이다. 임의로, 당해 항체는 마우스 항체이다. 임의로, 당해 항체는 폴리클로날 항체이다. 임의로 당해 항체는 모노클로날 항체이다.
몇몇 치료 방법에서 당해 항체는 2개 카피의 동일쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 다른 방법에서, 당해 항체는 Aβ의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 경쇄 및 중쇄 쌍 및 소교 세포상의 Fc 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하는 이특이적 항체이다. 다른 방법에서, 항체 쇄는 이종성 폴리펩타이드와 융합한다.
몇몇 치료 방법에서, 항체의 용량은 환자의 체중 kg당 1 mg 이상이다. 다른 방법에서, 항체의 용량은 환자의 체중 kg당 10 mg 이상이다.
몇몇 치료 방법에서, 당해 항체는 약제학적 조성물로서 담체와 함께 투여된다. 다른 방법에서, 당해 항체는 AA 펩타이드로 면역화된 사람 기원의 B 세포로부터 제조된 AA에 대한 사람 항체이다. 임의로, AA 펩타이드로 면역화된 사람은 환자이다. 몇몇 방법에서, 항체는 복강내, 경구, 비강내, 피하내, 근육내, 국소적으로 또는 정맥내로 투여된다.
몇몇 치료 방법에서, 당해 항체는 하나 이상의 항체 쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 환자에게 투여함에 의해 투여되고 당해 폴리뉴클레오타이드는 환자에서 발현되어 항체 쇄를 생성한다. 임의로, 당해 폴리뉴클레오타이드는 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하고 당해 폴리뉴클레오타이드는 환자에서 발현되어 중쇄 및 경쇄를 생성한다.
상기 몇몇 치료 방법은 추가로 상이한 AA 에피토프에 결합하는 하나 이상의 다른 항체의 유효 용량을 투여함을 포함한다. 상기 몇몇 치료 방법은 추가로 환자의 혈중 투여된 항체의 수준에 대해 환자를 모니터링함을 포함한다. 다른 방법에서, 당해 항체는 6개월 이상의 기간동안 다중 용량으로 투여된다. 다른 방법에서, 당해 항체는 서방성 조성물로서 투여된다.
본 발명은 추가로 AA 아밀로이드증에 민감한 환자에서 AA 아밀로이드증을 예방하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 환자에게 AA의 잔기 70번 내지 76번내 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 유효 용량을 투여함을 포함한다. 임의로, 당해 환자는 사람이다. 임의로, 당해 항체는 잔기가 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11로 이루어진 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 임의로, 당해 항체는 서열번호 2의 잔기 70번 내지 76번내 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 방법에서, 당해 환자는 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선 관절병증, 라이터 증후군, 성인 스틸 질환, 베체트 증후군, 크론 질환, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창 궤양, 만성 신우신염, 골수염, 휘플 질환, 호지킨 림프종, 신장 암종, 장, 폐 및 비뇨생식기의 암종, 기저 세포 암종, 모발 세포 백혈병, 가족성 지중해열 및 캐슬맨 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기본 아밀로이드 질환을 앓는다.
본 발명은 추가로 AA의 잔기 70번 내지 76번내 에피토프에 특이적으로 결합하는 사람, 사람화된 또는 키메라 항체를 제공한다. 임의로, 당해 사람화된 항체는 AA의 잔기 70번 내지 76번내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 임의로, 사람화된 항체는 사람화된 버전 7D8 항체(ATCC 수탁번호 PTA-9468)이다. 임의로, 사람화된 항체는 사람화된 버전 7D29 항체이다. 임의로, 사람화된 항체는 사람화된 버전 7D19 항체이다. 임의로, 사람화된 항체는 사람화된 버전 7D47 항체이다. 임의로 사람화된 항체는 사람화된 버전 7D39 항체이다. 임의로 사람화된 항체는 사람화된 버전 7D66 항체이다. 임의로 사람화된 항체는 사람화된 버전 8G9 항체이다. 임의로, 사람화된 항체는 사람화된 버전 8G3 항체이다. 임의로, 사람화된 항체는 사람화된 버전 8G4 항체이다. 임의로, 사람화된 항체는 사람화된 버전 8G51 항체이다. 임의로, 사람화된 항체는 사람화된 버전 8G22 항체이다. 임의로 사람화된 항체는 사람화된 버전 8G30 항체이다. 임의로 사람화된 항체는 사람화된 버전 8G46 항체이다. 임의로 사람화된 항체는 사람화된 버전 2A4 항체(ATCC 수탁번호 PTA-9662)이다. 임의로 사람화된 항체는 사람화된 버전 2A20 항체이다. 임의로 사람화된 항체는 사람화된 버전 2A44 항체이다. 임의로 사람화된 항체는 사람화된 버전 2A77 항체이다. 임의로 사람화된 항체는 사람화된 버전 2A13 항체이다. 임의로 사람화된 항체는 사람화된 버전 2A14 항체이다.
본 발명은 추가로 약제학적 조성물을 제공한다. 당해 약제학적 조성물은 AA의 잔기 70번 내지 76번내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 및 약제학적으로 허용되는 담첼르 포함한다. 몇몇 약제학적 조성물은 AA의 잔기 70번 내지 76번 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 사람, 사람화된 또는 키메라 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다른 약제학적 조성물은 AA의 잔기 70번 내지 76번내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 여기서, 항체의 이소형은 사람 IgG1이다. 몇몇 약제학적 조성물에서 항체의 이소형은 사람 IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 몇몇 약제학적 조성물에서 항체는 사람 항체이다. 몇몇 약제학적 조성물에서 항체는 사람화된다. 몇몇 약제학적 조성물에서 항체는 키메라 항체이다. 몇몇 약제학적 조성물에서 항체는 폴리클로날 항체이다. 몇몇 약제학적 조성물에서 항체는 모노클로날 항체이다.
몇몇 약제학적 조성물에서 항체는 2개 카피의 동일쌍의 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 몇몇 약제학적 조성물에서 항체는 AA의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 경쇄 및 중쇄 쌍 및 소교 세포상의 Fc 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하는 이특이적 항체이다. 몇몇 약제학적 조성물에서 항체 쇄는 이종성 폴리펩타이드에 융합된다. 몇몇 약제학적 조성물에서 담체는 비경구 투여용 생리학적으로 허용되는 희석제이다. 몇몇 약제학적 조성물은 복강내, 경구, 비강내, 피하, 근육내, 국소적으로 또는 정맥내로 투여되도록 구성된다. 몇몇 약제학적 조성물은 적어도 6개월 이상동안 다중 용량으로 투여되도록 구성된다. 몇몇 약제학적 조성물은 서방성 조성물로서 투여되도록 구성된다. 몇몇 약제학적 조성물은 추가로 AA의 상이한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 다른 항체를 포함한다.
본 발명은 환자에서 AA 아밀로이드증을 치료하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 AA70-76에 대한 항체를 포함하는 면역 반응을 유도하기에 유효한 요법에서 AA70-76에 대한 항체를 포함하는 면역 반응을 유도하기에 유효한 요법에서 AA70-76에 대한 면역 반응을 유도하는 제제를 투여함을 포함한다. 몇몇 방법에서 환자는 사람이다. 임의로, 당해 제제는 AA70-76 또는 이의 3개 연속의 잔기의 서브단편을 포함하고 AA 펩타이드 기원의 20개 미만의 연속 아미노산을 갖는다. 임의로, 당해 제제는 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 및 이의 3개 이상의 연속 잔기의 서브단편을 갖는 펩타이드이고 AA 펩타이드 기원의 20개 미만의 아미노산을 갖는다. 임의로 당해 제제는 제1 및 제2 이종성 폴리펩타이드로 N 및 C 말단에서 연결된다. 임의로, 당해 제제는 이의 N-말단에서 이종성 폴리펩타이드에 연결되고 이의 C 말단에서 N-말단 분절의 하나 이상의 추가 카피물로 연결된다. 몇몇 방법에서 이종성 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드에 대해 T-세포 반응을 유도하고 이로써 AA에 대한 B-세포 반응을 유도한다. 몇몇 방법에서 폴리펩타이드는 추가로 하나 이상의 추가 카피의 AA를 포함한다. 임의로, 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단으로 AA, 다수의 추가 카피의 AA 및 이종성 아미노산 분절을 포함한다.
몇몇 치료 방법에서 폴리펩타이드는 N-말단 분절에 대한 면역 반응을 증진시키는 애주번트와 함께 투여된다. 임의로, 애주번트 및 폴리펩타이드는 함께 조성물로서 투여된다. 임의로, 애주번트는 폴리펩타이드 전에 투여된다. 임의로, 애주번트는 폴리펩타이드 이후에 투여된다. 몇몇 방법에서 애주번트는 명반이다. 몇몇 방법에서 애주번트는 MPL이다. 몇몇 방법에서 애주번트는 QS-21이다. 몇몇 방법에서, 애주번트는 불완전 프로인트 애주번트이다. 몇몇 방법에서 면역 반응은 MHC I 또는 MHC II 복합체의 성분으로서 AA 펩타이드에 결합하는 T 세포를 포함한다.
본 발명은 환자에서 AA 아밀로이드증을 예방하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 AA70-76에 대한 항체를 포함하는 면역 반응을 유도하기에 유효한 요법에서 AA70-76에 대한 면역 반응 유도하는 제제를 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 방법에서 환자는 사람이다. 몇몇 방법에서 환자는 무증상이다. 몇몇 방법에서 환자는 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선 관절병증, 라이터 증후군, 성인 스틸 질환, 베체트 증후군, 크론 질환, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창 궤양, 만성 신우신염, 골수염, 휘플 질환, 호지킨 림프종, 신장 암종, 장, 폐 및 비뇨생식기의 암종, 기저 세포 암종, 모발 세포 백혈병, 가족성 지중해열 및 캐슬맨 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기본 아밀로이드 질환을 앓는다.
예방을 수행하는 몇몇 방법에서, 당해 제제는 AA70-76 또는 이의 3개 이상의 연속 잔기의 서브 단편을 포함하고 AA 펩타이드 기원의 20개 미만의 연속 아미노산을 갖는다. 임의로, 당해 제제는 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 및 이의 3개 이상의 연속 잔기의 서브단편을 갖는 펩타이드이고 AA 펩타이드 기원의 20개 미만의 아미노산을 갖는다. 임의로 당해 제제는 이의 N 및 C 말단에서 제1 및 제2 이종성 폴리펩타이드로 연결된다. 임의로, 당해 제제는 이의 N 말단에서 이종성 폴리펩타이드로 및 이의 C 말단에서 하나 이상의 추가 카피의 N-말단 분절로 연결된다. 몇몇 방법에서 이종성 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드에 대해 T-세포 반응을 유도하고 이로써 AA에 대한 B-세포 반응을 유도한다. 몇몇 방법에서 당해 폴리펩타이드는 하나 이상의 추가 카피의 AA를 포함한다. 임의로, 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단으로 AA, 다수의 추가 카피의 AA 및 이종성 아미노산 분절을 포함한다.
본 발명은 추가로 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 AA의 잔기 70번에서 개시하여 AA의 잔기 76번에서 종결되는 잔기로 이루어진 AA 단편을 포함한다. 임의로, AA 단편은 이의 C 말단에서 이종성 폴리펩타이드로 연결된다. 임의로, AA 단편은 N-말단에서 이종성 폴리펩타이드로 연결된다. 임의로, AA 단편은 이의 N 및 C 말단에서 제1 및 제2 이종성 폴리펩타이드로 연결된다. 임의로, AA 단편은 이의 N 말단에서 이종성 폴리펩타이드로 및 이의 C 말단에서 하나 이상의 추가 카피의 N 말단 분절로 연결된다. 임의로, 폴리펩타이드는 추가로 하나 이상의 추가 카피의 N-말단 분절을 포함한다. 임의로, 폴리펩타이드는 N 말단에서 C 말단으로 AA, 다수의 추가 카피의 N-말단 분절 및 이종성 아미노산 분절을 포함한다. 몇몇 약제학적 조성물에서 이종성 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드에 대한 T 세포 반응을 유도하고 이로써 N-말단 분절에 대해 B-세포 반응을 유도한다.
몇몇 약제학적 조성물은 추가로 AA에 대한 면역 반응을 증진시키는 애주번트를 포함한다. 임의로 애주번트는 명반이다. 임의로, 애주번트는 MPL이다. 임의로 애주번트는 QS-21이다. 임의로, 애주번트는 불완전 프로인트 애주번트이다. 임의로 애주번트는 추가로 GM-CSF을 포함한다. 임의로, 애주번트는 M-CSF이다. 임의로, 조성물은 10마이크로그램 초과의 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명은 환자에서 AA 아밀로이드증을 치료하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 환자에서 아밀로이드 침적물의 펩타이드 성분에 대한 면역 반응을 유도하기에 효과적인 제제 및 기본 질환을 치료하는 상이한 제제를 투여하는 환자에서 AA 아밀로이드증을 치료함을 포함한다. 몇몇 방법에서 기본 질환은 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선 관절병증, 라이터 증후군, 성인 스틸 질환, 베체트 증후군, 크론 질환, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창 궤양, 만성 신우신염, 골수염, 휘플 질환, 호지킨 림프종, 신장 암종, 장, 폐 및 비뇨생식기의 암종, 기저 세포 암종, 모발 세포 백혈병, 가족성 지중해열 및 캐슬맨 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 환자에서 AA 아밀로이드증을 예방하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 환자에서 아밀로이드 침적물의 펩타이드 성분에 대해 면역 반응을 유도하기에 효과적인 제제 및 기본 질환을 치료하는 상이한 제제를 투여하여 환자내 AA 아밀로이드증을 치료함을 포함한다. 몇몇 방법에서 기본 질환은 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선 관절병증, 라이터 증후군, 성인 스틸 질환, 베체트 증후군, 크론 질환, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창 궤양, 만성 신우신염, 골수염, 휘플 질환, 호지킨 림프종, 신장 암종, 장, 폐 및 비뇨생식기의 암종, 기저 세포 암종, 모발 세포 백혈병, 가족성 지중해열 및 캐슬맨 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 AA 아밀로이드증을 갖는 환자를 치료하는 활성에 대해 항체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 항체와 AA 펩타이드를 접촉시키고 항체가 AA에 특이적으로 결합하여 항체가 AA 아밀로이드증을 치료하는 활성을 갖는 징후를 제공하는지의 여부를 측정함을 포함한다.
본 발명은 항원과 물리적으로 연합된 생물학적 실체를 제거하는 활성에 대해 항체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 배지에서 항원 연합 생물학적 실체, 항체 및 Fc 수용체 함유 식세포를 조합하고; 배지에 잔류하는 항원 연합 생물학적 실체의 양을 모니터링함을 포함하고 이때 항원 연합 생물학적 실체의 양의 감소가 항원에 대한 제거 활성을 가짐을 시사한다. 몇몇 방법에서, 모니터링 단계는 배지내 잔류하는 항원의 양을 모니터링한다. 몇몇 방법에서 당해 조합은 항원 연합 생물학적 실체를 배지에 부가하고 배지를 Fc 수용체 함유 식세포와 접촉시킴을 포함한다. 몇몇 방법에서 항원 연합 생물학적 실체는 조직 샘플로서 제공된다. 몇몇 방법에서 항원은 생물학적 실체이다. 몇몇 방법에서 조직 샘플은 아밀로이드 침적물을 포함한다. 임의로 조직 샘플은 환자 또는 AA 아밀로이드증 병리를 갖는 포유동물로부터 기원한 것이다. 몇몇 방법에서, 항원은 AA이다. 몇몇 방법에서 식세포는 소교 세포이다. 몇몇 방법에서 조직 샘플은 암 조직 샘플, 바이러스 감염된 조직 샘플, 염증 세포, 비악성 비정상 세포 성장을 포함하는 조직 샘플, 및 비정상 세포외 매트릭스를 포함하는 조직 샘플로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 환자에서 아밀로이드 침적물을 검출하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 환자에게 AA의 아미노산 70번 내지 76번내 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하고 환자에서 항체의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 임의로, 당해 항체는 표지된다. 임의로, 당해 항체는 상자성 표지로 표지된다. 임의로, 표지된 항체는 핵 자기 공명에 의해 검출된다. 임의로, 표지된 항체는 SPECT/CT 영상화로 검출된다. 몇몇 방법에서, 당해 항체는 환자에서 아밀로이드 침적물에 결합하는 것에 대한 제거 반응을 유도하는 능력이 없다.
본 발명은 진단 키트를 제공한다. 당해 키트는 AA의 잔기 70번 내지 76번을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 몇몇 키트는 추가로 환자에서 AA의 아밀로이드 침적물과 연합된 질환의 생체내 진단 또는 모니터링에 대한 항체의 용도를 기재하는 표지를 포함한다. 몇몇 양태에서, 당해 키트는 AA를 검출하는데 있어서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도에 대한 지침서를 포함한다.
본 발명은 추가로 (a) 대상체에 검출가능한 표지에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계(여기서, 항체 또는 이의 단편은 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 X1 및 X2는 임의의 아미노산이다) 및 (b) 결합된 항체 또는 이의 단편의 존재 또는 부재를 검출하는 단계(여기서, 결합된 항체 또는 단편의 존재가 AA 아밀로이드증의 진단을 지시한다)를 포함하는, 대상체에서 아밀로이드증을 진단하는 방법을 제공한다.
본원에서 추가로 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2(여기서, X1 및 X2는 임의의 아미노산이다)를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 사용하여 아밀로이드증을 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다.
본 발명은 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2(여기서, X1 및 X2는 임의의 아미노산이다)를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, X1은 H, T, F, S, P, A, L, C, Q, R, E, K, D, G, V, Y, I 또는 W, 예를 들어, H, T, F, S, P, 또는 A, 또는 예를 들어 H, T, F, 또는 A를 포함한다. X2는 T, S, E, R, I, V, F, D, A, G, M, L, N, P, C, K, Y, 또는 Q, 예를 들어, T, S, E, R, I, V, F, D, 또는 A, 또는 예를 들어 T, S, E, D, 또는 A를 포함한다. 다른 예에서, X1은 H, T, 또는 A이고 X2는 T, S, E, 또는 A이고, 예를 들어 X1은 H 또는 A이고 X2는 T, S, 또는 A이다. 추가의 예에서, X1은 H이고 H2는 T 또는 A이거나; X1은 A이고 X2는 S, T, E, 또는 V이거나, 예를 들어, X1은 A이고 X2는 S, T, 또는 E이거나, X1은 T이고 X2는 E이거나, X1은 F이고 X2는 D이거나, X1은 S이고 X2는 E, F, 또는 A이거나; X1은 P이고 X2는 E, I, 또는 F이다.
특히, 당해 에피토프는 서열번호 3, 12, 13, 14, 15, 및 16와 같은 서열번호 3 내지 서열번호 25에서 제시된 것들과 같은 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 예는 서열번호 4와 같은 서열번호 4, 5, 7, 8, 및 9를 포함한다. 에피토프, 예를 들어, 서열번호 3에 결합하는 본 발명의 항체는 2A4, 7D8, 및 8G9 항체를 포함한다.
본 발명의 항체가 결합하는 응집된 아밀로이드 단백질은 비단량체성 단백질이다. 당해 응집된 아밀로이드 단백질은 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA), 면역글로불린 경쇄 단백질, 사람 섬 아밀로이드 전구체 폴리펩타이드(IAPP), 베타 아밀로이드 펩타이드, 트랜스티레틴(TTR), 및 ApoA1, 예를 들어 SAA를 포함한다.
본 발명은 추가로 (a) 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체와 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 결합하는 것에 대해 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체와 경쟁하거나; (b) 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체로서 X1EDX2를 포함하는 동일한 에피토프에 결합하거나; (c) 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체의 항원 결합 도메인을 갖거나; (d) 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체의 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 키메라 또는 사람화된 버전의 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체를 제공한다.
X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 대표적인 항체는 또한 2A4, 7D8 또는 8G9 항체의 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR)중 하나 이상, 2개 또는 3개를 갖는 항체를 포함한다. X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 또한 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체의 중쇄의 CDR 중 하나 이상, 2개 또는 3개를 갖는 항체를 포함한다.
CDR은 당업계에 공지된 방법에 따라 동정될 수 있다. 예를 들어, CDR을 동정하기 위한 넘버링 시스템은 통상적으로 사용된다. 캐뱃 정의는 서열 가변성을 기초로 하고 초티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기초로 한다. AbM 정의는 캐뱃과 초티아 방법간의 절충이다. 경쇄 가변 영역의 CDR은 캐뱃, 초티아 또는 AbM 알고리듬에 따르면 위치 24 및 34 (CDR1-L), 50 및 56 (CDR2-L), 및 89 및 97 (CDR3-L)에서 잔기에 의해 결합되어 있다. 캐뱃 정의에 따르면, 중쇄 가변 영역의 CDR은 위치 31 및 35B (CDR1-H), 50 및 65 (CDR2-H), 및 95 및 102 (CDR3-H) (캐뱃에 따른 넘버링)에서 잔기에 의해 결합되어 있다. 초티아 정의에 따르면, 중쇄 가변 영역의 CDR은 위치 26 및 32 (CDR1-H), 52 및 56 (CDR2-H), 및 95 및 102 (CDR3-H) (초티아에 따른 넘버링)에서 잔기에 의해 결합되어 있다. AbM 정의에 따르면 중쇄 가변 영역의 CDR은 위치 26 및 35B (CDR1-H), 50 및 58 (CDR2-H), 및 95 및 102 (CDR3-H)(캐뱃에 따른 넘버링)에서 잔기에 의해 결합되어 있다[문헌참조: See Martin et al. (1989) Proc. Natl. Acad. ScL USA 86: 9268-9272; Martin et al. (1991) Methods Enzymol. 203: 121-153; Pedersen et al. (1992) Immunomethods 1 : 126; 및 Rees et al. (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, pp. 141-172].
본 발명의 항체는 또한 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체의 가변 영역으로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하고, 이때 X1 및 X2는 임의의 아미노산이다. 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체의 가변 영역을 갖는 항체가 또한 포함된다.
본 발명의 항체는 또한 키메라 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 단일쇄 항체, 4량체 항체, 4가 항체, 다중특이적 항체, 도메인 특이적 항체, 도메인 결실된 항체 또는 융합 단백질을 포함한다.
본 발명의 항체 단편이 또한 제공된다. 본 발명의 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 또는 ScFv 단편일 수 있다. 당해 항체 또는 이의 단편은 세포 독성제, 방사선치료학적 제제 또는 검출가능한 표지와 커플링될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 7D8, 2A4, 또는 8G9 항체 경쇄 가변 영역으로부터 유래된 항체 경쇄 가변 영역, 또는 (b) 7D8, 2A4, 또는 8G9 항체 경쇄 가변 영역으로부터 유래된 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항체 가변 영역을 제공한다. 7D8, 2A4, 또는 8G9 항체의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 갖는 분리된 가변 영역이 제공된다. 분리된 항체 가변 영역은 항체 제조에 유용하다.
본 발명은 또한 (a) 7D8, 2A4, 또는 8G9 항체의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 7D8, 2A4, 또는 8G9 항체의 뉴클레오타이드 서열과 동일하고 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 뉴클레오타이드 서열 (a) 또는 (b)와 실질적으로 동일한, 즉 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 엄중 하이브리드화 조건, 예를 들어, 최종 세척 조건 65℃에서 0.1 x SSC하에 (a) 또는 (b)의 뉴클레오타이드 서열의 상보체인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산과 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 갖는 항체 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 항체 또는 핵산을 발현하는 세포 및 세포주를 제공한다. 대표적인 숙주 세포는 포유동물 및 사람 세포, 예를 들어 CHO 세포, HEK-293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포, 및 COS 세포를 포함한다. 이종성 작제물의 숙주 세포로의 형질전환 후 안정한 세포주를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 대표적인 비-포유동물 숙주 세포는 곤충 세포를 포함한다(문헌참조: Potter et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3): 103-112). 항체는 또한 유전자도입 동물(문헌참조: Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13(6):625-629) 및 유전자도입 식물(문헌참조: Schillberg et al. (2003) Cell MoL Life. Sci. 60(3):433-45)에서 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 X1EDX2를 포함하는 아밀로이드 단백질의 면역원성 단편을 사용하여 복합 아밀로이드증을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 이때 X1은 당해 아밀로이드 단백질에서 ED 바로 전방에 H, T, F, S, P, A 또는 임의의 다른 아미노산 잔기이고 X2는 당해 아밀로이드 단백질에서 ED 바로 이후에 T, S, E, R, I, V, F, A 또는 임의의 다른 아미노산 잔기이다. 특정 이론에 국한되지 않으면서, 아밀로이드 단백질이 대형 전구체 단백질로부터 절단되거나 형태적으로 변화하는거에 상관없이 응집하거나 섬유분해되거나 섬유성 구조에 혼입되는 경우 X1EDX2를 포함하는 에피토프는 노출될 수 있는 것으로 사료된다. 예를 들어, AA 아밀로이드증을 치료하거나 예방하는 대표적인 방법은 AA 70-76 단편 또는 이의 면역원성 단편의 투여를 포함한다. 본 발명은 또한 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2과 반응성인 항체를 사용하여 아밀로이드 단백질의 침적과 연관된 아밀로이드증을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 이때 X1은 당해 응집된 아밀로이드 단백질에서 ED 바로 전방에 H, T, F, S, P, A 또는 임의의 다른 아미노산 잔기이고 X2는 당해 응집된 아밀로이드 단백질에서 ED 바로 이후에 T, S, E, R, I, V, F, A 또는 임의의 다른 아미노산 잔기이다. 바람직하게, 당해 항체는 비-병리학적 아밀로이드 단백질에 비해 응집된 아밀로이드 단백질과 우선적으로 반응한다. 예를 들어, AA 섬유와 연관된 AA 아밀로이드증의 치료 또는 예방 방법은 AA 섬유의 C-말단 영역(AA의 잔기 대략 70-76)에 특이적인 항체의 투여를 포함할 수 있다. 항체는 AA 응집체(예를 들어 섬유)의 형성을 억제할 수 있거나 이들의 제거 및 분해를 유도하여 AA 아밀로이드증을 치료하거나 예방할 수 있다.
I. 정의
용어 "실질적인 동일성"은 2개 펩타이드 서열이 최적으로 정렬되는 경우(예를 들어, 디폴트 갭 가중치를 사용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해) 65% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 80 또는 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 99% 이상의 서열 동일성)을 공유함을 의미한다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환에 의해 상이하다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 표준 서열로서 작용하고 이것과 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리듬을 사용하는 경우 시험 및 표준 서열은 컴퓨터에 입력하고 경우에 따라 서브서열 배위를 지정하고 서열 알고리듬 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서 서열 비교 알고리듬은 지정된 프로그램 파라미터를 기초로 표준 서열과 대비하여 시험 서열(들)에 대한 % 서열 동일성을 계산한다.
비교용 서열의 최적 정렬은 예를 들어, 문헌[참조: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리듬, 문헌[참조: Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알로리듬, 문헌[참조: Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 검색, 이들 알고리듬 [GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)]의 컴퓨터화된 수행 또는 육안적 검사(문헌참조: Ausubel et al, supra)에 의해 수행될 수 있다. % 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적합한 알고리듬의 한가지 예는 문헌[참조: Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기재된 BLAST 알고리듬이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 기관[National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)]을 통해 공개적으로 입수할 수 있다. 전형적으로 디폴트 프로그램 파라미터를 사용하여 서열 비교를 수행할 수 있지만 설정된 파라미터가 또한 사용될 수 있다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 워드길이(W) 3, 예상값(E) 10 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스와 같이 디폴트로서 사용한다(문헌참조: Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989))
보존성 또는 비보존성으로서 아미노산 치환을 분류하기 위해 아미노산을 다음과 같은 분류한다: 그룹 I (소수성 측쇄): 노르류신, met, ala, val, leu, ile; 그룹 II (중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III (산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV (염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; Group V (쇄 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI (방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존성 치환은 동일 부류의 아미노산간의 치환을 포함한다. 비보존성 치환은 이들 부류중 하나의 구성원을 또 다른 구성원으로 교환하는 것이다.
당해 용어 "모두-D"는 ≥ 75%, ≥ 80%, ≥ 85%, ≥ 90%, ≥ 95%, 및 100% D-배위 아미노산을 갖는 펩타이드를 언급한다.
용어 "제제"를 사용하여 약리학적 활성을 갖거나 가질 수 있는 화합물을 기재한다. 제제들은 공지된 약물인 화합물, 약리학적 활성이 동정되었지만 추가로 치료학적 평가가 진행중인 화합물 및 약리학적 활성에 대해 스크리닝되어야만 하는 수거물 및 라이브러리의 구성원인 화합물을 포함한다.
"아밀로이드 질환" 또는 "아밀로이드증"은 증상으로서 또는 이의 병리의 일부로서 아밀로이드 플라크의 축적 또는 형성을 갖는 임의의 다수의 장애를 언급한다. "아밀로이드 플라크"는 주로 단백질성 섬유로 구성된 세포외 침적물이다. 일반적으로, 섬유는 주로 단백질 또는 펩타이드로 구성되지만 플라크는 또한 본원에 기재된 바와 같은 펩타이드 또는 비펩타이드 분자인 추가의 성분을 포함할 수 있다.
"아밀로이드 단백질" 또는 "아밀로이드 펩타이드"는 절단, 형태적 변화, 응집 또는 섬유형성을 진행하여 병리학적 올리고머, 아밀로이드 섬유, 아밀로이드 플라크 및/또는 아밀로이드 성분을 형성할 수 있는 단백질 또는 펩타이드이다.
"아밀로이드 성분"은 당해 분자의 항원성 부분을 포함하는 아밀로이드 플라크에 존재하는 임의의 분자 실체이다. 아밀로이드 성분은 단백질, 펩타이드, 프로테오글리칸 및 탄수화물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"항-아밀로이드 제제"는 척추동물 대상체에서 능동 또는 수동 면역화 기술에 의해 투여되는 경우 아밀로이드 플라크 성분에 대해 면역 반응을 유발할 수 있다.
"AA 단백질" 또는 "AA 펩타이드"는 단량체성 또는 응집된, 가용성 또는 불용성이든 상관없이 혈청 아밀로이드 A 단백질(SAA)의 단백질용해 절단에 의해 형성된 아밀로이드 단백질 A 단백질 또는 펩타이드의 형태를 언급한다.
"응집된 아밀로이드 단백질" 또는 "응집된 아밀로이드 펩타이드" 또는 "아밀로이드 응집체"는 아밀로이드 단백질 또는 아밀로이드 펩타이드의 병리학적, 비단량체성 응집된 형태를 언급한다. 응집된 아밀로이드 단백질 및 아밀로이드 펩타이드는 가용성 또는 불용성일 수 있다. 몇몇 응집된 아밀로이드 단백질 및 응집된 아밀로이드 펩타이드는 올리고머를 형성할 수 있다. 몇몇 응집된 아밀로이드 단백질 및 응집된 아밀로이드 펩타이드는 올리고머, 섬유 및/또는 아밀로이드 플라크를 형성할 수 있다. 섬유 펩타이드 및 단백질을 포함하는당해 응집된 아밀로이드 단백질 및 아밀로이드 펩타이드의 예는 본원에 제공된다.
"AA 응집체"는 응집된 형태의 AA를 언급한다.
본 발명의 치료학적 제제는 전형적으로 목적하지 않은 오염물로터 실질적으로 순수하다. 이것은 제제가 전형적으로 적어도 약 50% w/w (중량/중량) 순도를 갖고 실질적으로 삽입 단백질 및 오염물이 없음을 의미한다. 때때로, 당해 제제는 적어도 약 80% w/w 및 보다 바람직하게 적어도 약 90% 또는 약 95% w/w 순도이다. 그러나, 통상적인 단백질 정제 기술을 사용하여, 적어도 99% w/w의 균일한 펩타이드가 수득될 수 있다. 본 발명의 치료학적 제제는 아밀로이드 침적물과 연관된 질환을 차단, 예방 또는 치료할 수 있다.
2개 실체간의 특이적 결합은 당해 실체가 서로에 대해 상호 친화성을 가짐을 의미하고 당해 친화성은 비관련 항원 또는 상이한 항원에 대한 항체와 같은 대조군에 대해 실체의 친화성 보다 적어도 10배, 100배 또는 100배 초과한다. 서로에 대해 2개의 실체의 상호 친화성은 적어도 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 또는 1010 M-1이다. 108 M-1보다 큰 친화성이 바람직하다.
용어 "면역글로불린" 또는 "항체" (본원에서 상호교환적으로 사용됨)는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖고 예를 들어, 쇄 상호간 디설파이드 결합에 의해 안정화되어 있는 2개의 중쇄 및 경쇄로 이루어진 기본 4개의 폴리펩타이드 쇄 구조를 갖는 항원 결합 단백질을 언급한다. 중쇄 및 경쇄 둘다는 도메인으로 폴딩된다. 용어 "도메인"은 예를 들어, β-평판 쉬트 및/또는 쇄내 디설파이드 결합에 의해 안정화된 펩타이드 루프를 포함하는(예를 들어, 3 내지 4개의 펩타이드 루프를 포함하는) 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드의 구형 영역을 언급한다. 도메인은 추가로 본원에서 "불변" 도메인의 경우에 다양한 부류의 구성원의 도메인내 서열 가변성의 상대적 결핍 또는 "가변" 도메인의 경우에 다양한 부류 구성원의 도메인내 상당한 가변성을 기초로 "불변" 또는 "가변"으로 언급된다. 경쇄상의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인으로 언급된다. 중쇄상의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인으로서 언급된다. 경쇄상의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인으로 언급된다. 중쇄상의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인으로서 언급된다.
용어 "영역"은 항체 쇄의 일부 또는 부분을 언급하고 본원에 정의된 바와 같은 불변 또는 가변 도메인 및 당해 도메인의 별개의 일부 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 경쇄 가변 도메인 또는 영역은 본원에 정의된 바와 같이 "골격 영역" 또는 "FR"중에 분산되어 있는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"을 포함한다.
면역글로불린 또는 항체는 단량체 또는 중합체 형태로 존재할 수 있다. 용어 "항원 결합 단편"은 면역글로불린의 폴리펩타이드 단편을 언급하고 항체는 항원에 결합하고 항원 결합(즉, 특이적 결합)에 대해 온전한 항체(즉, 이들이 유래된 온전한 항체)와 경쟁한다. 용어 "형태"는 단백질 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체, 항체 쇄, 이의 도메인 또는 영역)의 3차원 구조를 언급한다. 예를 들어, 용어 "경쇄(또는 중쇄) 형태"는 경쇄(또는 중쇄) 가변 영역의 3차원 구조를 언급하고 용어 "항체 형태" 또는 "항체 단편 형태"는 항체 또는 이의 단편의 3차원 구조를 언급한다.
항체의 "특이적 결합"은 항체가 항원 또는 바람직한 에피토프에 대해 감지할만한 친화성을 나타내고 바람직하게 상당한 교차반응성을 나타내지 않음을 의미한다. "감지가능한" 또는 바람직한 결합은 106, 107, 108, 109 M-1, 또는 1010 M-1 이상의 친화성 결합을 포함한다. 107 M-1 초과의 친화성, 바람직하게는 108 M-1 초과의 친화성이 보다 바람직하다. 본원에 제시된 것들의 중간값은 또한 본 발명의 범위내에 있는 것으로 의도되고 바람직한 결합 친화성은 친화성 범위, 예를 들어, 106 내지 1010 M-1, 바람직하게 107 내지 1010 M-1, 보다 바람직하게 108 내지 1010 M-1로 나타낼 수 있다. "상당한 교차반응성을 나타내지 않는" 항체는 목적하지 않는 실체(예를 들어, 목적하지 않는 단백질성 실체)에 감지할만하게 결합하지 않는 항체이다. 예를 들어, AA에 특이적으로 결합하는 항체는 감지할만하게 AA에 결합하지만 비-AA 단백질 또는 펩타이드(예를 들어, 플라크에 포함된 비-AA 단백질 또는 펩타이드)와 상당히 반응하지 않는다. 바람직한 에피토프에 대해 특이적인 항체는 예를 들어, 동일한 단백질 또는 펩타이드상에 원거리 에피토프와 상당히 교차반응하지 않는다. 특이적 결합은 당해 결합을 결정하기 위한 임의의 당업계 인지된 수단에 따라 결정될 수 있다. 바람직하게, 특이적 결합은 스캐챠드 분석 및/또는 경쟁 결합 분석에 따라 결정된다.
항원 결합 항체 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조된다. 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, 단일쇄, 및 단일쇄 항체를 포함한다. 추가의 항체 단편 및 작동기 기능 변이체는 "항체"란 제목의 섹션에서 논의된다. "이특이적" 또는 "이작용성" 면역글로불린 또는 항체이외에 면역글로불린 또는 항체는 이의 결합 부위 각각이 동일한 것으로 이해된다. "이특이적" 또는 "이작용성 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다[문헌참조: Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)].
용어 "사람화된 면역글로불린" 또는 "사람화된 항체"는 하나 이상의 사람화된 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 하나 이상의 사람화된 경쇄 또는 중쇄)를 포함하는 면역글로불린 또는 항체를 언급한다. 용어 "사람화된 면역글로불린 쇄" 또는 "사람화된 항체 쇄" (즉, "사람화된 면역글로불린 경쇄" 또는 "사람화된 면역글로불린 중쇄")는 사람 면역글로불린 또는 항체로부터의 실질적인 가변 골격 영역 및 비-사람 면역글로불린 또는 항체로부터의 실질적인 상보성 결정 영역(CDR)(예를 들어, 하나 이상의 CDR, 바람직하게 2개 CDR, 보다 바람직하게 3개의 CDR)을 포함하고 추가로 불변 영역(예를 들어, 경쇄의 경우에 하나 이상의 불변 영역 또는 이의 부분 및 중쇄의 경우에 바람직하게 3개의 불변 영역)을 포함하는 가변 영역을 갖는 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 각각 경쇄 또는 중쇄)를 언급한다. 용어 "사람화된 불변 영역" (예를 들어, "사람화된 경쇄 가변 영역" 또는 "사람화된 중쇄 가변 영역")은 사람 면역글로불린 또는 항체로부터의 실질적인 가변 골격 영역 및 비-사람 면역글로불린 또는 항체로부터의 실질적인 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역을 언급한다.
용어 "사람 면역글로불린 또는 항체로부터의 실질적인" 또는 "실질적으로 사람"은 비교 목적을 위해 사람 면역글로불린 또는 항체 아미노산 서열에 정렬되는 경우 당해 영역이 80 내지 90% 이상, 바람직하게는 90 내지 95% 이상, 보다 바람직하게 95 내지 99% 이상의 동일성(즉, 국소 서열 동일성)을 공유하여 예를 들어, 보존성 치환, 컨센서스 서열 치환, 배선 치환, 복귀돌연변이 등을 허용하는 것을 의미한다. 보존성 치환, 컨센서스 서열 치환, 배선 치환, 복귀돌연변이 등의 도입은 흔히 사람화된 항체 또는 쇄의 "최적화"로서 언급된다. 용어 "비-사람 면역글로불린 또는 항체로부터의 실질적인" 또는 "실질적인 비-사람"은 비-사람 기관, 예를 들어, 비 사람 포유동물과 80 내지 95% 이상, 바람직하게 90 내지 95% 이상, 보다 바람직하게 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 면역글로불린 또는 항체 서열을 갖는 것을 의미한다.
따라서, 능히 CDR을 제외하고는, 사람화된 면역글로불린 또는 항체 또는 사람화된 면역글로불린 또는 항체 쇄의 모든 영역 또는 잔기는 실질적으로 하나 이상의 본래 사람 면역글로불린 서열의 상응하는 영역 또는 잔기와 실질적으로 동일하다. 용어 "상응하는 영역" 또는 "상응하는 잔기"는 제1 및 제2 서열이 비교 목적을 위해 최적으로 정렬되는 경우 제1 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열상의 영역 또는 잔기와 동일한(즉, 동등한) 위치를 점유하는 제2 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열상의 영역 또는 잔기를 언급한다.
용어 "사람화된 면역글로불린" 또는 "사람화된 항체"는 상기된 바와 같이 키메라 면역글로불린 또는 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 사람화된 면역글로불린 또는 항체가 이들의 구성에서 키메라이지만 (즉, 한 종 이상의 단백질로부터의 영역을 포함하는) 이들은 본원에 정의된 바와 같은 키메라 면역글로불린 또는 항체에서 발견되지 않는 추가의 특징부(즉, 공여체 CDR 잔기 및 어셉터 골격 잔기를 포함하는 가변 영역)를 포함한다.
용어 "키메라 면역글로불린" 또는 항체는 면역글로불린 또는 항체를 언급하고 이의 가변 영역은 제1 종으로부터 유래하고 불변 영역은 제2 종으로부터 유래한다. 키메라 면역글로불린 또는 항체는 예를 들어, 유전학적 기술에 의해 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 절편으로부터 작제될 수 있다.
"항원"은 항체가 특이적으로 결합하는 실체(예를 들어, 단백질성 실체 또는 펩타이드)이다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정체"는 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)이 특이적으로 결합하는 항원상의 부위를 언급한다. 에피토프는 연속 아미노산 또는 단백질 3차원 폴딩에 의해 인접한 비연속 아미노산 둘다로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출상에서 유지되는 반면 3차원 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 형태로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 이상의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 형태를 결정하는 방법은 예를 들어, X-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다[문헌참조: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)].
본 발명의 대표적인 항체는 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 예를 들어, 또한 2A4, 7D8 또는 8G9 항체에 의해 결합된 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 동일한 에피토프를 인지하는 항체는 단순한 면역분석으로 동정될 수 있고 이는 하나의 항체가 또 다른 항체의 표적 항원으로의 결합을 차단하는 능력(즉, 경쟁 결합 분석)을 보여준다. 경쟁 결합은 시험중에 있는 면역글로불린이 표준 항체의 통상의 항원, 예를 들어, Aβ로의 특이적 결합을 억제하는 분석으로 결정된다. 수많은 유형의 경쟁 결합 분석은 공지되어 있고 예를 들어, 고형상 직접 또는 간접 방사선면역분석(RIA), 고형상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(문헌참조: Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); 고형상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌참조: Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); 고형상 직접 표지된 분석, 고형상 직접 표지된 샌드위치 분석(문헌참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); I-125 표지를 사용한 고형상 직접 표지 (문헌참조 Morel et al, Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); 고형상 직접 비오틴-아비딘 EIA(문헌참조: Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); 및 직접 표지된 RIA(문헌참조: Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))가 있다. 전형적으로, 당해 분석은 이들 비표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 표준 면역글로불린중 하나를 함유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁 억제는 시험 면역글로불린의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함에 의해 측정한다. 통상적으로 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이것은 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 또는 70-75% 이상에 의해 통상의 항원에 대한 표준 항체의 특이적 결합을 억제한다.
에피토프는 또한 면역 세포, 예를 들어, B 세포 및/또는 T 세포에 의해 인지된다. 에피토프의 세포 인지는 3H-티미딘 혼입, 사이토카인 분비, 항체 분비 또는 항원 의존성 사멸(세포 독성 T 림프구 분석)에 의해 측정된 바와 같이 항원 의존성 증식을 측정하는 시험관내 분석에 의해 결정될 수 있다.
당해 용어 "네오에피토프"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원상의 신규 및/또는 특유의 부위를 언급한다.
용어 "네오에피토프 항체"는 분자의 단백질용해 절단에 의해 노출된 새로운 N- 또는 C-말단 아미노산 서열을 특이적으로 인지하지만 본래의(비절단된) 분자상의 에피토프에 결합하지 않는 항체를 언급한다. 당해 용어 "네오에피토프 항체"는 SAA의 단백질 용해 절단에 의해 노출된 신규 N- 또는 C-말단 아미노산을 특이적으로 인지하지만 본래의 (비절단된) SAA 분자상의 에피토프에 결합하지 않는 항체를 언급한다. 몇몇 네오에피토프 항체는 가용성 또는 불용성 AA에 결합하지만 AA 섬유를 포함하는 AA 응집체를 분해한다. "네오에피토프 항체"는 또한 단백질이 형태적 변화를 진행한 후(예를 들어, 단지 경쇄가 발현되고 아밀로이드를 형성하는 경우 AL 아밀로이드증 및 경쇄의 경우에서와 같이) 항체에 결합하는데 가용한 신규 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체일 수 있다.
용어 "면역학적" 또는 "면역" 반응은 수용 환자에서 아밀로이드 펩타이드에 대해 지시된 이로운 체액성(항체 매개) 및/또는 세포성(항원 특이적 T 세포 또는 이의 분비 생성물에 의해 매개됨) 반응이 나타나는 것이다. 당해 반응은 면역원의 투여에 의해 유도된 능동 반응 또는 항체 또는 프라이밍된 T-세포의 투여에 의해 유도된 수동 면역일 수 있다. 세포성 면역 반응은 항원 특이적 CD4+ T 헬퍼 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포를 활성화시키기 위해 I형 또는 II형 MHC 분자와 연합된 폴리펩타이드 에피토프를 제공함으로써 유발된다. 당해 반응은 또한 단핵구, 대식세포, NK 세포, 호중구, 수지상 세포, 성상세포, 소교 세포, 호산구 또는 선천성 면역의 기타 성분들의 활성화를 포함할 수 있다. 세포 매개 면역학적 반응의 존재는 증식 분석(CD4+ T 세포) 또는 CTL (세포독성 T 림프구) 분석에 의해 결정될 수 있다(문헌참조: Burke, supra; Tigges, supra). 면역원의 보호성 또는 치료학적 효과에 대한 체액성 및 세포성 반응의 상대적 기여는 항체 및 T 세포를 면역화된 동계 동물로부터 별도로 분리하고 제2 대상체에서 보호 또는 치료학적 효과를 측정함에 의해 밝혀질 수 있다.
"면역원성 제제" 또는 "면역원"은 임의로 애주번트와 함께 포유동물에 투여시 자체에 대한 면역학적 반응을 유도할 수 있다.
용어 "네이키드형(naked) 폴리뉴클레오타이드"는 콜로이드성 물질과 복합체화되지 않은 폴리뉴클레오타이드를 언급한다. 네이키드형 폴리뉴클레오타이드는 흔히 플라스미드 벡터에 클로닝된다.
용어 "애주번트"는 항원과 함께 투여되는 경우 항원에 대한 면역 반응을 증강시키지만 단독으로 투여되는 경우 항원에 대한 면역 반응을 생성하지 않는 화합물을 언급한다. 애주번트는 림프구 활용, B 및/또는 T 세포의 자극 및 대식세포의 자극을 포함하는 여러 기작에 의해 면역 반응을 증강시킬 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "유효 용량"은 목적하는 효과를 성취하거나 적어도 부분적으로 성취하는데 충분한 양으로서 정의된다. 용어 "치료학적 유효량"은 이미 질환을 앓고 있는 환자에서 질환 및 이의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 억제하는데 충분한 양으로서 정의된다. 당해 사용을 위한 유효량은 감염 중증도 및 환자 자신의 면역계의 일반적인 상태에 의존한다.
용어 "환자"는 예방학적 또는 치료학적 치료를 받은 사람 및 기타 포유동물 대상체를 포함한다.
본 발명은 응집된 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하고 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 결합하는 것에 대해 예를 들어, 2A4, 7D8, 또는 8G9 항체와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 항체간의 경쟁은 시험중에 있는 면역글로불린이 통상의 항원, 예를 들어, AA로의 표준 항체의 특이적 결합을 억제한다는 분석에 의해 결정된다. 수많은 유형의 경쟁 결합 분석은 공지되어 있고 예를 들어, 고형상 직접 또는 간접 방사선면역분석(RIA), 고형상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(문헌참조: Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); 고형상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌참조: Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); 고형상 직접 표지된 분석, 고형상 직접 표지된 샌드위치 분석(문헌참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); I-125 표지를 사용한 고형상 직접 표지 (문헌참조 Morel et al, Mol. Immunol. 25(1):7-15 (1988)); 고형상 직접 비오틴-아비딘 EIA(문헌참조: Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); 및 직접 표지된 RIA(문헌참조: Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990))가 있다. 전형적으로, 당해 분석은 이들 비표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 표준 면역글로불린중 하나를 함유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁 억제는 시험 면역글로불린의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함에 의해 측정한다. 통상적으로 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 동정된 항체(경쟁 항체)는 표준 항체 및 표준 항체에 의해 결합되는 에피토프에 충분히 인접한 에피토프에 결합하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하여 입체 장애를 발생시키는 항체를 포함한다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이것은 적어도 50 내지 75% 이상에 의해 통상의 항원에 대한 표준 항체의 특이적 결합을 억제한다.
아밀로이드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 107 M-1의 친화도로 아밀로이드 단백질에 결합하는 항체를 의미한다. 몇몇 항체는 108 M-1과 1011 M-1 사이의 친화도로 아밀로이드 단백질에 결합한다.
단량체성 아밀로이드 단백질에 특이적으로 결합하지 않고 응집된 AA와 같은 응집된 아밀로이드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 예를 들어, 상기된 바와 같은 섬유(예를 들어, 이전의 AA 아밀로이드증 환자의 부검 또는 유전자도입 동물 모델로부터 기원하는 것과 같은 응집된 β 평판 쉬트 형태의 AA)와 같은 응집된 아밀로이드 단백질에 결합하는 항체를 의미하고 아밀로이드 단백질의 단량체 형태에 대해 적어도 10배 및 통상적으로 100배 미만의 특이적 결합 친화성을 갖는다. 예를 들어, 당해 항체는 109 M-1의 결합 친화도로 가용성 AA에 결합할 수 있고 107 M-1 미만의 치환성으로 플라크에 결합할 수 있다. 플라크에 대한 당해 항체의 친화성은 통상적으로 107 또는 106 M-1 미만이다. 당해 항체는 추가로 또는 대안적으로 항체가 섬유와 접촉되는 경우 비관련 대조군 항체(예를 들어, 반전체 AA 펩타이드에 대한 폴리클로날 항체의 항체 또는 혼합물)에 상대적인 형광 강도에 의해 정의되고 당해 결합은 형광 표지에 의해 평가된다. 플라크에 결합하는 것 없이 가용성 AA 펩타이드에 결합하는 항체의 형광 강도는 인자 5 이내에 있거나, 흔히 인자 2이내에 있고 흔히 대조군 항체의 것과 오차 범위내에서 구별할 수 없다.
하나 이상의 언급된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 특이적으로 언급되지 않은 다른 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들어, AA 펩타이드를 포함하는 조성물은 분리된 AA 펩타이드 및 대형 폴리펩타이드 서열의 성분으로서 AA 펩타이드를 포함한다.
II. 아밀로이드 질환
1. 개요 및 병리학
아밀로이드 질환 또는 아밀로이드증은 다양한 외향 증상을 갖는 다수의 질환 상태를 포함한다. 이들 장애는 공통적으로, 통상적으로 직경이 약 10 내지 100μm이고 특이적 기관 또는 조직 영역에 위치하는 "아밀로이드 침적물" 또는 "아밀로이드 플라크"로서 공지된 단백질 섬유의 비정상적인 세포외 침적물이 존재한다. 당해 플라크는 천연에 존재하는 가용성 단백질 또는 펩타이드로 주로 구성된다. 이들 불용성 침적물은 일반적으로 직경이 약 10 내지 15nm인 섬유의 측면 응집체로 구성된다. 아밀로이드 섬유는 콩고 레드 염료로 염색되는 경우 편광으로 사과 녹색 복굴절을 나타낸다. 당해 장애는 하기 논의된 바와 같이 플라크 침적물을 형성하는 주요 섬유 성분을 기초로 분류된다.
플라크 침적물을 형성하는 펩타이드 또는 단백질은 흔히 대형 전구체 단백ㅈ질로부터 제조된다. 보다 구체적으로, 아밀로이드 섬유 침적물의 병리학은 일반적으로 "비정상적" 전구체 단백질의 단편으로의 단백질 용해 절단을 포함한다. 이들 단편은 일반적으로 역-평행 β 평판 쉬트로 응집하지만 분해되지 않은 특정 형태의 전구체 단백질이 가족성 아밀로이드 다중신경병증 및 투석 관련 아밀로이드증(β2 마이크로글로불린 섬유)에서 응집하여 섬유(변이체 트랜스티레틴 섬유)를 형성하는 것으로 보고되었다(문헌참조: Tan, et al, 1994, supra).
2. 임상적 증후군
본 섹션은 특징적인 플라크 섬유 조성을 포함하는, 주요 유형의 아밀로이드증을 기재한다. 본 발명에서 아밀로이드 질환이 다양한 질환 특이적 아밀로이드 침적물의 성분 또는 성분들에 대한 면역 반응을 자극하는 제제를 투여함에 의해 치료될 수 있다는 것을 밝혔다. 하기 섹션 C에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 당해 성분은 바람직하게 플라크를 형성하는 섬유의 구성 성분이다. 하기 섹션은 주요 형태의 아밀로이드증을 예시하지만 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
a. AL 아밀로이드증
AL 아밀로이드 침적은 일반적으로 형질세포의 악성(다발성 골수종)에서 양성 모노클로날 감마병증에 이르는 B 림프구 계열의 거의 모든 질환과 연관되어 있다. 일단, 아밀로이드 침적물의 존재는 기본 세포 질환의 주요 지시기일 수 있다.
AL 아밀로이드 침적물의 섬유는 모노클로날 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편으로 구성된다. 보다 구체적으로, 단편은 경쇄(카파 또는 람다)의 N-말단 영역으로부터 유래하고 이의 가변(VL) 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 침적물은 일반적으로 간엽 조직에 존재하여 말초 및 자율 신경병증, 손목굴증후군, 대설증, 제한적 심근병증, 대형 관절의 관절병증, 면역 질환, 골수종 및 잠재 질환을 유발할 수 있다. 그러나, 이것은 거의 모든 조직, 특히 심장과 같은 내장 기관이 포함될 수 있음을 주지해야 한다.
b. 유전성 전신 아밀로이드증
많은 형태의 유전성 전신 아밀로이드증이 있다. 이들은 비교적 희귀 병태이긴 하지만 증상 및 이들의 유전 패턴(통상적으로 상염색체 우성)의 성인 발병은 일반 집단에서 당해 질병을 영속시킨다. 일반적으로 당해 증후군은 전구체 단백질에서 점 돌연변이 때문일 수 있고 이는 변이 아밀로이드성 펩타이드 또는 단백질의 생성을 유발한다. 표 2는 예시된 형태의 당해 장애의 섬유성 조성을 요약한다.
Figure 112010048814606-pct00016
Figure 112010048814606-pct00017
표 2에 제공된 데이터는 예시적인 것이고 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 예를 들어, 트랜스티레틴 유전자에서 40개 이상의 별도의 점 돌연변이가 보고되었고 이 모두는 임상적으로 유사한 형태의 가족성 아밀로이드 다중신경병증을 유발한다.
트랜스티레틴(TTR)은 또한 흔히 프리알부민으로서 언급되는 14킬로달톤의 단백질이다. 이것은 간 및 맥락막총에 의해 생성되고 이것은 갑상선 호르몬 및 비타민 A를 수송하는 기능을 한다. 50개 이상의 변이 형태의 단백질은 각각 단일 아미노산 변화를 특징으로 하고 다양한 형태의 가족성 아밀로이드 다중신경병증에 관여한다. 예를 들어, 위치 55에서 류신의 프롤린으로의 치환은 특히 진행성 형태의 신경병증을 유발한다; 위치 111에서 류신의 메티오닌으로의 치환은 덴마크 환자에서 중증 심병증을 유발하였다. 전신 아밀로이드증을 갖는 환자의 심장 조직으로부터 분리된 아밀로이드 침적물은 침적물이 총체적으로 ATTR(이의 전체 서열의 특징이 분석되었다)로서 언급되고 TTR 및 이의 단편의 이종성 혼합물로 구성되어 있는 것으로 밝혀졌다. ATTR 섬유 성분은 당해 플라크로부터 추출될 수 있고 이들의 구조 및 서열은 당업계에 공지된 방법에 따라 결정된다(문헌참조: Gustavsson, A., et ah, Laboratory Invest. 73: 703-708, 1995; Kametani, F., et ah, Biochem. Biophys. Res. Commun. 125: 622-628, 1984; Pras, M., et al, PNAS 80: 539-42, 1983).
아포지질단백질 AI의 분자에 점 돌연변이(예를 들어, Gly->Arg26; Trp -> Arg50; Leu -> Arg60)을 갖는 사람은 단백질 아포지질단백질 AI 또는 이의 단편(AApoAI)의 침적물을 특징으로 하는 형태의 아밀로이드증을 나타낸다(오스터태그(Ostertag)형). 이들 환자는 저수준의 고밀도 지질단백질(HDL)을 갖고 말초 신경병증 또는 신부전증을 나타낸다.
효소 라이소자임의 알파 쇄의 돌연변이(예를 들어, Ile->Thr56 또는 Asp->His57)는 영국 가족에서 보고된 또 다른 형태의 오스터태그형 비-신경병증 유전성 아밀로이드의 기반이 된다. 여기서, 돌연변이 라이조자임 단백질(Alys)의 섬유는 침적되고 환자는 일반적으로 손상된 신장 기능을 나타낸다. 당해 단백질 본원에 기재된 대부분의 섬유 형성 단백질과 같지 않게 일반적으로 온전한 (비단편화된) 형태로 존재한다(문헌참조: Benson, M.D., et al. CIBA Fdn. Symp. 199: 104-131, 1996).
β-아밀로이드 펩타이드(Aβ)는 베타 아밀로이드 전구체 단백질 (βAPP)로서 공지된 대형 단백질로부터 단백질 용해에 의해 유래된 39개 내지 43개 아미노산 펩타이드이다. βAPP에서의 돌연변이는 가족성 형태의 알츠하이머 질환, 다운 증후군 및/또는 노인성 치매를 유발하고 이들은 Aβ 섬유 및 하기에 추가로 상세하게 기재된 기타 성분으로 구성된 플라크의 뇌 침적을 특징으로 한다. 알츠하이머 질환과 연관된 APP에서 공지된 돌연변이는 β 또는 γ 세크레타제의 절단 부위에 인접하게 또는 Aβ내에서 발생한다. 예를 들어, 위치 717은 Aβ로의 이의 프로세싱에서 APP의 γ-세크레타제 절단 부위에 인접해 있고 위치 670/671은 β-세크레타제 절단 부위에 인접해 있다. 이들 잔기중 임의의 하나의 돌연변이는 추측컨대 APP로부터 생성된 42/43 아미노산 형태의 Aβ의 양 증가를 유발함에 의해 알츠하이머 질환을 유발할 수 있다. 다양한 길이의 Aβ 펩타이드의 구조 및 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 당해 펩타이드는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(문헌참조: Glenner and Wong, Biochem Biophys. Res. Comm. 129: 885-890, 1984; Glenner and Wong, Biochem Biophys. Res. Comm. 122: 1131-1135, 1984). 또한, 다양한 형태의 펩타이드가 시판되고 있다.
시누클레인은 아포지질단백질과 유사하고 신경원 시토졸 및 시냅스전 터미날에 풍부한 시냅스 관련 단백질이다. NAC로 명명되는 α-시누클레인으로부터 유래된 펩타이드 단편은 또한 알츠하이머 질환의 아밀로이드 플라크의 성분이다(문헌참조: Clayton, et al., 1998). 당해 성분은 또한 하기에 상세히 기재된 바와 같이 본 발명의 면역학적 기반 치료를 위한 표적으로서 작용한다.
겔솔린은 액틴 필라멘트에 결합하고 이를 단편화시키는 칼슘 결합 단백질이다. 단백질의 위치 187 (예를 들어, Asp->Asn; Asp->Tyr)에서 돌연변이는 독일 또는 일본계의 사람 및 핀란드 환자에서 통상적으로 발견되는 유전성 전신 아밀로이드증 형태를 유발한다. 관련 개체에서, 겔솔린 단편(Agel)으로부터 형성된 섬유는 통상적으로 아미노산 173번 내지 243번(68kDa의 카복시말단 단편)으로 이루어지고 혈관 및 기저막에 침적되어 말초 신경병증, 영양실조 피부 변화 및 다른 기관에서의 침적으로 진행하는 각막 영양실조 및 두개골 신경병증을 유발한다(문헌참조: Kangas, H., et al. Human Mol. Genet. 5(9): 1237-1243, 1996).
다른 돌연변이된 단백질, 예를 들어, 피브리노겐(AfibA)의 돌연변이 알파 쇄 및 돌연변이 시스타틴 C(Acys)는 또한 섬유를 형성하고 특징적인 유전성 장애를 발병시킨다. AfibA 섬유는 시장 질환과 함께 비신경병증 유전성 아밀로이드를 특징으로 하는 침적물을 형성하고; Acys 침적물은 아이슬란드에서 보고된 유전성 뇌 아밀로이드 혈관병증을 특징으로 한다(문헌참조: Isselbacher, et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, San Francisco, 1995; Benson, et al., supra ). 적어도 몇몇 경우에, 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)를 갖는 환자는 베타 단백질과 연계하여 비-돌연변이 형태의 시스타틴 C를 함유하는 아밀로이드 섬유를 갖는 것으로 나타났다(문헌참조: Nagai, A., et al. Molec. Chem. Neuropathol. 33: 63-78, 1998).
특정 형태의 프리온 질환은 현재 유전성인 것으로 고려되고 있고 이전에 주로 본래 감염성인 것으로 생각되었던 사례의 15% 이하를 점유한다(문헌참조: Baldwin, et al., Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995). 당해 프리온 장애에서, 환자는 정상적인 프리온 단백질(PrPC)로 구성된 플라크를 형성한다. 우세한 돌연변이 이소형인 PrPSc는 또한 AScr로서 언급되고 프로테아제 분해에 대한 이의 내성, 세제 추출 후 불용성, 2차 리소좀에서의 침적, 해독후 합성 및 고 β-평판 쉬트 함량에 있어서 정상적인 세포 단백질과 상이하다. 유전학적 계보는 크로이츠펠트-야콥 질환(Creutzfeldt-Jacob disease)(CJD), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 증후군(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome)(GSS) 및 태아 가족성 불면증(fatal familial insomnia)(FFI)을 유발하는 5개 이상의 돌연변이에 대해 설정되었다. (Baldwin) 서열을 결정하고 당해 펩타이드를 제조하면서 스크라파이(scrapie) 섬유로부터 섬유 펩타이드를 추출하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다(문헌참조: Beekes, M., et al. J. Gen. Virol. 76: 2567-76, 1995).
예를 들어, 하나의 형태의 GSS는 코돈 102에서 PrP 돌연변이에 연계되었고 단뇌 GSS는 코돈 117에서의 돌연변이와 함께 분리되었다. 코돈 198 및 217에서 돌연변이는 알츠하이머 질환에 특징적인 신경염 플라크가 Aβ 펩타이드 대신 PrP를 함유하는 GSS 형태를 유도한다. 특정 형태의 가족성 CJD는 코돈 200 및 210에서의 돌연변이와 관련되었고; 코돈 129 및 178에서의 돌연변이는 가족성 CJD 및 FFI 둘다에서 발견되었다(문헌참조: Baldwin, supra).
c. 노인성 전신 아밀로이드증
전신성 또는 국소적 아밀로이드 침적은 연령과 함께 증가한다. 예를 들어, 야생형 트랜스티레틴(TTR)의 섬유는 통상적으로 노인의 심장 조직에서 발견된다. 이들은 무증상, 임상적으로 사일런트일 수 있거나 심부전증을 유발할 수 있다. 무증상 섬유 국소 침적물은 또한 뇌(Aβ), 전립선의 신체 전분질(Aβ2 마이크로글로불린), 관절 및 정액 소낭에 존재할 수 있다
d. 뇌 아밀로이드증
아밀로이드의 국소 침적은 뇌에서, 특히 노인에게서 통상적인 것이다. 뇌에서 가장 흔한 형태의 아밀로이드는 주로 Aβ 펩타이드 섬유로 이루어지고 치매 또는 산발성(비유전성) 알츠하이머 질환을 유도한다. 사실, 산발성 알츠하이머 질환의 발생 빈도는 유전성인 것으로 보여지는 형태를 크게 초과한다. 이들 플라크를 형성하는 섬유 펩타이드는 유전 형태의 알츠하이머 질환(AD)과 관련하여 상기된 것들과 매우 유사하다.
e. 투석 관련 아밀로이드증
β2 마이크로글로불린(Aβ2M) 섬유로 구성된 플라크는 통상적으로 장기 혈액투석 또는 복막 투석을 받은 환자에서 나타난다. β2 마이크로글로불린은 11.8 킬로달톤의 폴리펩타이드이고 모든 핵화된 세포상에 존재하는 I형 MHC 항원의 경쇄이다. 정상적인 환경하에, 이것은 연속적으로 세포막으로부터 누출되고 정상적으로 신장에 의해 여과된다. 손상된 신장 기능의 경우에서와 같이 제거 실패는 신장에서 및 다른 부위(주로 관절의 콜라겐 풍부 조직에서)에서 침적을 유도한다. 다른 섬유 단백질과 같지 않게, Aβ2M 분자는 일반적으로 섬유에 비단편화된 형태로 존재한다(문헌참조: Benson, supra).
f. 호르몬 유래된 아밀로이드증
내분비 기관은 특히 노인에게서 아밀로이드 침적물을 함유할 수 있다. 호르몬 분비 종양은 또한 호르몬 유래 아밀로이드 플라크를 함유할 수 있고, 당해 플라크의 섬유는 칼시토닌(갑상선 골수 암종), 섬 아밀로이드 폴리펩타이드(아밀린; II형 당뇨병을 갖는 대부분의 환자에 존재함) 및 심방 이뇨 펩타이드(분리된 심방 아밀로이드증)과 같은 폴리펩타이드 호르몬으로 이루어져 있고, 이들 단백질의 서열 및 구조는 당업계에 널리 공지되어 있다.
g. 이종 아밀로이드증
아밀로이드의 국소 침적물로서 주로 나타나는 다양한 다른 형태의 아밀로이드 질환이 있다. 일반적으로, 이들 질환은 아마도 특정 섬유 전구체의 국소화된 생성 결과 및/또는 이화작용의 결핍 또는 섬유 침적을 위한 특정 조직(예를 들어, 관절)의 성향에 의한 결과이다. 당해 특발성 침적의 예는 구상의 AL 아밀로이드, 피부성 아밀로이드, 내분비 아밀로이드 및 종양 관련 아밀로이드를 포함한다.
III. AA 아밀로이드 질환
AA 아밀로이드증은 기존 또는 공존의 질환에 대해 부차적으로 발병하기 때문에 이전에 2차 또는 반응성 아밀로이드증으로 명명되었다. 당해 질환은 염증 질환, 예를 들어, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선 관절병증, 라이터 증후군, 성인 스틸 질환, 베체트 증후군 및 크론 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. AA 침적물은 또한 만성 미생물 감염, 예를 들어, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창 궤양, 만성 신우신염, 골수염 및 휘플(Whipple) 질환의 결과로서 생성된다. 특정 악성 신생물은 또한 AA 섬유 아밀로이드 침적물을 생성시킬 수 있다. 이들은 호지킨 림프종, 신장 암종, 장, 폐 및 비뇨생식기의 암종, 기저세포 암종 및 모발 세포 백혈병과 같은 병태를 포함한다. AA 아밀로이드 질환은 또한 가족성 지중해열과 같은 유전된 염증 질환으로부터 비롯될 수 있다. 추가로, AA 아밀로이드 질환은 림프증식성 장애, 예를 들어, 캐슬맨 질환으로부터 비롯될 수 있다.
1. AA 아밀로이드증과 연관된 염증 질환
류마티스 관절염은 주로 관절의 만성 전신 질환이다. 류마티스성 관절염의 증상은 활액막 및 관절 구조(관절)에서 염증 변화에 의해 및 골의 위축 및 희박해짐(골 밀도 감소)을 특징으로 한다. 류마티스 관절염의 후기 단계에서, 기형 및 강직(관절의 고정)이 나타난다. 류마티스 관절염의 모델은 완전 프로인트 애주번트중의 II형 콜리겐을 투여함으로써 마우스 또는 래트에 유도될 수 있다.
소아 만성 관절염은 많은 형태로 있다: 가장 흔한 것은 소아성 류마티스 관절염이다. 임의의 연령의 어린이에서 발생할 수 있지만 먼저 2세 내지 6세에서 보다 흔하게 나타난다. 3개 주요 유형의 소아 류마티스 관절염, 즉 소수-관절 관절염, 다중관절 관절염 및 전신성 관절염(또한 스틸스 질환으로서 공지됨)이 있다. 소수 관절 관절염은 전형적으로 4개 이하의 관절, 통상적으로 무릎과 같은 대형 관절에 영향을 준다. 이는 경직을 수반하여 어린이에게 절름발이를 유발할 수 있다. 다중관절 관절염은 5개 이상의 관절에 영향을 줌을 특징으로 하고 가장 흔하게는 손 및 발의 소형 관절이다. 다중관절 관절염을 갖는 어린이는 흔히 보다 심각한 형태의 질환을 갖는다. 전신성 관절염은 열 및 핑크 발진과 복합되어 부어오른 관절을 특징으로 한다. 당해 관절은 열이 개시한 후 수개월 또는 수년이 지날때까지 부어오르지 않을 수 있다. 이것은 또한 간, 심장, 비장 및 림프절과 같은 내부 기관에 영향을 줄 수 있고 빈혈이 일반적으로 나타난다. 전신성 관절염은 자체가 누그러지는 경향이 있고 소수 %의 어린이가 심각한 관절증을 가질 수 있고 이는 성년까지 계속된다.
강직성 척추염은 척추 및 천장 관절의 관절염을 유발하는 류마티스 질환이고 눈, 폐 및 심장 판막의 염증을 유발할 수 있다. 일생에 걸쳐 산발적인 등통의 에피소드에서 척추, 말초 관절 및 기타 신체 기관을 공격하여 세월이 흐름에 따라 심각한 관절 및 등 경직, 활동력 상실 및 기형을 유발한다.
건선은 악화 및 경감을 특징으로 하고 다인성 유전 패턴을 갖는 통상적인 만성 편평피부병이다. 건선의 증상은 다양한 크기의 둥근 건조 스케일링 패치의 존재를 특징으로 하고 이는 신근 표면, 손톱, 머릿가죽, 생식기 및 요천추 영역에 대해 편입을 갖는 갈백색 또는 은백색 스케일에 의해 덮여져 있다.
건선 관절병증은 건선이 관절염의 발병과 관련된 장애이다. 당해 장애는 다양한 방식으로 나타날 수 있다. 관절염은 일반적으로 약하고 단지 수개의 관절이 포함된다. 몇몇 환자에서, 당해 질환은 심각하고 통상적으로 손 및 척추에 영향을 준다. 척추가 영향받는 경우, 당해 증상은 강직성 척추염과 매우 유사하다.
라이터 증후군은 관절염, 요도염(뇨생식기의 염증), 결막염(안구의 염증) 및 피부 및 점막 병변으로 이루어진 일련의 증상이다. 라이터 증후군은 또한 반응성 관절염으로서 언급되고 이는 관절염이 신체에 다른 곳에서 개시된 감염에 대한 반응으로서 일어남을 의미한다. 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)는 종종 성 접촉을 통해 획득된 라이터 증후군과 가장 흔하게 관련된 세균이다. 수개의 상이한 세균이 살모넬라, 쉬겔라, 여르시니아 및 캄필로박터를 포함하는, 소화관을 통해 획득된 라이터 증후군과 관련된다.
성인 스틸스 질환은 성인 개시 스틸스 질환으로 명명되고 신체의 내부 기관, 관절 및 다른 부분을 공격하는 희귀한 염증 병태이다. 이것은 갑작스럽게 나타났다가 사라질 수 있다. 매우 심각한 경우에, 성인 스틸스 질환은 만성이되고 극히 악화되어 심각한 통증 및 경직성을 유발한다. 수년 후 당해 질환은 심장 및 폐와 같은 중추 기관을 무력화시킨다.
베체트 증후군은 재발성 경구 및/또는 생식 궤양화, 눈을 멀게하고 신경학적 손상을 유발할 수 있는 만성 재발성 포도막염을 제공하는 다중계 장애이다. 이것은 4개의 주요 증상을 특징으로 한다: 경구 아프타성 궤양, 피부 병변, 안과 증상, 및 생식 궤양화, 및 흔히 위장관, 중추신경계, 혈관계, 폐 및 신장을 포함하는 신체 조직 및 기관에서 염증에 의해 나타난다. 베체트 증후군의 관절염은 통상적으로 산발적으로 자가 제한적이고 기형을 나타내지 않고 무릎 및 발목에 국한되어 있다.
크론 질환은 구강에서 항문까지에 이르는 위장관의 임의의 부분을 포함하는 만성 육아성(소형 낟알형 신체 또는 성장) 염증 질환이지만 통상적으로 장 벽의 허물어짐 및 두터워짐을 갖는 회장(소장의 5분의 3의 하한부)이 포함된다. 크론 질환의 증상은 능히 체중 감소 및 먹기 반감에 의해 입증되는 만성 설사, 증가된 장 소리 및 크램핑의 존재를 포함한다.
2. AA 아밀로이드증과 연관된 만성 미생물 감염 질환
나병은 피부를 짓무르게 하여 손상시키고 말초 신경을 손상시키고 점점 악화시킴을 특징으로 하는 감염성 질환이다. 나병은 크게 만연되지 않는 장기간 잠복기를 갖는 유기체 마이코박테리움 레프라(Mycobacterium leprae)에 의해 유발된다. 나병은 2개의 공통된 형태, 결핵형 및 나병형이 있다. 2개 형태는 피부상에 진물림을 나타내지만 나병형은 가장 심삭하여 대형의기형 결절(종기 및 융기)를 나타낸다. 나병은 결국 신경학적 손상을 유발한다. 장기 나병을 갖는 환자는 감각 상실로부터 비롯된 반복된 손상으로 인해 이들의 손발을 사용하지 못할 수 있다.
결핵은 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 유발되는 전염성 세균 감염이다. 당해 질환은 감염된 조직에서 육아종(육아 종양)의 발육을 특징으로 한다. 폐가 주로 포함되지만 당해 감염은 다른 기관으로 퍼질수있다.
기관지확장증은 대형 기도의 비정상적 파괴 및 팽창이다. 기관지확장증은 흔히 기도의 재발성 염증 또는 감염에 의해 유발된다. 기관지확장증을 갖는 환자에서 보여지는 통상적인 세균은 박멸시키기가 어려운 것으로 악명높은 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)이다. 당해 세균에 의한 기도의 반복되는 감염은 당해 유기체를 기관지에 군집시킬 수있고 이는 당해 사람들이 슈도모나스성 폐렴에 걸리게 하고 이는 특별한 항생제의 처리를 요한다.
압박 궤양 또는 욕창으로서도 공지된 욕창성 궤양은 환부에 대한 장기 압박에 의해 유발되는 피부 및 기본 조직의 궤양화이다. 이들은 붉어진 피부로 개시하여 점진적으로 악화되어 수포를 형성함에 이어서 속빈 상처를 유발하고 결국 곰보가 되게 한다. 이들 궤양화는 통상적으로 뒤꿈치, 궁둥이의 미저골 및 뒤통수와 같은 골질의 돌출부상에 나타난다.
만성 신우신염은 신장 및 뇨관(뇨를 신장으로부터 배출하는 관)의 감염이다. 신우신염은 가장 흔히 특히, 방광으로부터 뇨관 또는 신장 골반으로의 뇨의 일시적 또는 지속적인 역류의 존재하에 뇨관 감염의 결과로서 나타난다.
골수염은 통상적으로 세균에 의해 유발되는 급성 또는 만성 골 감염이다. 흔히 당해 감염은 신체의 다른 부위에서 개시하여 혈액을 통해 골로 전달된다. 골이 감염되는 경우, 고름이 골내에 생성되고 이것은 농양을 유발할 수 있다. 농양은 이어서 골로의 혈액 공급을 고갈시킨다. 만성 골수염은 골 조직이 상실된 혈액 공급의 결과로서 죽는 경우에 유발된다. 만성 감염은 수년동안 간헐적으로 지속할 수 있다.
휘플 질환은 장의 감염으로 인해 장관으로부터 영양물의 부적절한 흡수를 유발하는 희귀 병태이다. 이것은 세균 트로페리마 휘펠리(Tropheryma whippelii)에 의해 유발된다. 증상은 설사, 장 출혈, 복통, 식욕 상실, 체중 감소, 피로 및 무기력증을 포함한다. 관절염 및 열은 흔히 장 증상이 나타나기 수년전에 나타난다. 환자는 또한 신경학적 증상을 경험할 수 있다. 진단은 증상 및 소장 또는 영향 받은 다른 기관 기원의 조직 생검의 결과를 기초로 한다. 인지되고 치료되는 경우, 휘플 질환은 통상적으로 치유될 수 있다. 치료 되지 않으면 당해 병태는 통상적으로 치명적이다.
3. AA 아밀로이드증과 연관된 악성 신생물
호지킨 림프종은 림프절, 비장, 간 및 골수에서 발견되는 림프성 조직의 암이다. 이러한 암의 제1 징후는 흔히 비대해진 림프절이다. 당해 질환은 인접 림프절로 번질 수 있고 이후에 폐, 간 또는 골수로 번질 수 있다.
신장 암종은 신장의 암이다. 암 세포는 신장에서 일련의 세관에서 발견된다. 제1 증상은 통상적으로 뇨에서의 출혈이다. 때로는 신장 둘다가 관여된다. 암은 쉽게 번지고 가장 흔하게 폐 및 기타 기관으로 번진다. 신장 세포 암종은 가장 통상적인 유형의 신장 암이고 이어서 유두 신장 세포 암종, 혐색소성 신장 암종 및 수거관 신장 암종이다. 신장 암종의 약 5%는 이들의 외형이 다른 카테고리 중 어느 것과 맞지 않기 때문에 분류되지 못한다.
관의 암종은 위장관 암, 예를 들어, 결장직장암, 췌장암, 위암 및 식도암을 포함한다. 결장직장암은 대장 또는 직장에서 개시하는 암이다. 거의 모든 결장직장암은 수년간에 걸쳐서 암으로 진행되는 양성 폴립으로서 개시한다. 결장직장암의 대부분의 경우는 증상을 갖지 않는다. 췌장암은 췌장의 악성이다. 증상은 복통, 식욕 상실, 상당한 체중 감소 및 무통증 황달을 포함한다. 위암은 또한 위장암으로 명명되고 위의 임의의 붇위에서 발병할 수 있고 위를 통해 다른 기관, 특히 식도 및 소장으로 번질 수 있다. 이것은 또한 위벽을 통해 인접한 림프절 및 간, 췌장 및 폐와 같은 기관으로 또는 쇄골 위의 림프절, 결장 및 난소와 같은 원거리 기관으로 번질 수 있다. 위암은 흔히 무증상이다. 식도암은 식도의 악성이다. 증상은 연하곤란(삼키기 어려움), 통증 및 상당한 체중 감소를 포함한다.
폐의 암종은 악성 종양이 존재함을 특징으로 하는 폐의 암이다. 2개 주요 유형의 폐암이 있다: 비소세포 폐암 및 소세포 폐암. 증상은 특정 유형의 암에 따라 상이하지만 만성 기침, 기침 출혈, 숨가쁨, 숨을 헐떡거림, 흉통, 식욕 상실, 체중 감소 및 피로를 포함할 수 있다.
비뇨생식관의 암종은 전립선암, 방광암, 자궁내막암, 경부암 및 난소암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전립선암은 전립선내 악성 종양 성장을 포함한다. 증상은 빈번한 뇨 배출, 일정한 줄기의 뇨를 개시하고 유지하기가 어려움, 뇨중 출혈, 방뇨 통증, 발기 어려움 또는 통증스러운 사정을 포함할 수 있다. 방광암은 뇨 방광의 악성 성장의 여러 유형중 어느 하나를 언급한다. 증상은 뇨중 출혈, 빈번한 방뇨, 방뇨 통증 및 급한 뇨 마려움을 포함한다. 자궁내막암은 자궁내막(일련의 자궁)의 암 성장을 포함한다. 이것은 주로 폐경 후 나타나고 질 출혈이 나타난다. 경부암은 경부의 악성이다. 경부암의 조기 단계는 완전히 무증상일 수 있다. 질 출혈은 악성의 존재를 지시할 수 있다. 진전된 단계에서, 전이가 복부, 폐 또는 기타 위치에 존재할 수 있다. 난소암은 난소의 악성 신생물이다. 난소암은 흔히 모호하고 비특이적이고 모호한 하부 복부 불쾌감, 둔부의 무거움 느낌, 비정상적인 월경 주기, 질 출혈, 체중 증가 또는 감소, 비특이적 위장관 증상을 포함한다. 난소암은 흔히 자궁, 방광, 장 및 일련의 장 벽상에 이식되는 암 세포를 방출한다. 이들 암 세포는 암이 의심되기도 전에 새로운 종양 성장을 형성하기 시작할 수 있다.
기본 세포 암종은 기저피부 세포에서 암성 변화를 포함하는 서서히 성장하는 피부 종양이다. 증상은 얼굴, 귀, 목, 가슴, 등 또는 머릿가죽; 병변 또는 인접한 피부에서 가시적인 혈관; 지속적인 치유되지 않는 상처상에 위치하는 피부 병변을 포함한다. 당해 암은 일반적으로 국소적으로 유지되어 있고 거의 신체의 원거리 부분으로 번지지 않지만 성장을 계속하여 신경, 골 및 뇌를 포함하는 인접한 조직 및 구조물에 침입할 수 있다.
모발 세포 백혈병은 낮은 혈구수를 유도하는 림프구(B 세포)의 암이다. 당해 질환은 모발형의 돌출을 갖는 비정상적 형태의 B 세포에 의해 유발된다. 증상은 흔히 모호하다. 모발 세포 백혈병에 의해 유발되는 낮은 혈구수는 감염, 피로 및 과도한 출혈을 유발할 수 있다.
4. AA와 연관된 유전된 염증 질환
가족성 지중해열은 흔히 복부 또는 폐를 포함하는 재발성 열 및 염증을 특징으로 하는 유전된 장애이다. 증상은 일련의 복부강, 흉강, 피부 또는 관절에서 염증이 통상적으로 12 내지 24시간 피크로 고열과 함께 나타남을 포함한다. 공격은 증상의 중증도에서 다양할 수 있고 사람들은 통상적으로 공견간에 증상이 없다. 이러한 질환은 매우 희귀성이다. 위험 인자는 가족성 지중해열 또는 지중해 조상을 갖는 가족력을 포함한다.
5. AA 아밀로이드증과 연관된 림프증식성 장애
캐슬맨의 질환은 병리학적으로 형질세포 침윤과 함께 거대 림프절 비대증의 존재를 특징으로 하는 림프증식성 형태의 장애이다. 캐슬맨 질환의 환자는 통상적으로 열, 빈혈, 고감마글로불린혈증 및 급성 상 반응 단백질의 혈청 농도 증가를 갖고 이 모두는 대량의 IL-6이 림프절에서 생성되기 때문이다.
IV. 혈청 아밀로이드 A
1. 사람 혈청 아밀로이드 A
혈청 아밀로이드 A (SAA)는 아밀로이드 A 단백질의 순환하는 전구체인 아밀로이드 침적물의 섬유 성분이다. 구조적 연구는 사람 SAA가 이종성이고 다형태 SAA 유전자 및 단백질 생성물 군을 나타냄을 보여주었다. SAA 유전자 슈퍼패밀리는 11p15.1에 위치하는 밀접하게 연관된 유전자 클러스터를 포함한다[문헌참조: Sellar, GC et al. Genomics 19: 221-227 (1994)]. 4개의 SAA 유전자는 사람에서 보고되었다. 4개의 SAA 유전자에 의해 암호화된 단백질의 대표적인 아미노산 서열은 도 1에 도시되어 있다. 2개 유전자(SAA1 및 SAA2)는 급성상 혈청 아밀로이드 A(A-SAA)를 암호화하고 염증에 반응하여 협력적으로 유도된다. SAA1 및 SAA2는 암호화 및 비암호화 영역 둘다에서 95% 서열 동일성을 공유한다. 도 18 및 도 19에 도시된 바와 같이 알파, 베타 및 감마 이소형의 사람 SAA1 및 알파 및 베타 이소형의 사람 SAA2가 있다. SAA3은 슈도유전자이다. SAA4는 항상성 SAA를 암호화하고 최소로 유도될 수 있다[문헌참조: Cunnane G. Bailliere 's Clin. Rheumatol. 13(4): 615-628]. 모든 사람 SAA/AA 분자는 능히 중요하게 자체 응집을 위해 이론적 칼슘 결합 테트라펩타이드 서열 Gly-Pro-Gly-Gly을 함유하고 섬유형성에서 아밀로이드의 섬유외 잔기를 갖는다[문헌참조: Fykse, E.M. et al. Biochem. J. 256:973-980 (1988) 및 Turnell et al. Mol. Biol. Med. 3:387-407 (1986)]. SAA/AA의 N 말단 부분은 아마도 자가 응집을 위해 중요한 소수성이 강하고 아밀로이드 침적물에 다른 성분이다[문헌참조: Husby et al. Clin. Immunol. Immunopathol. 70(1):2-9 (1994)]. 각각 이소형의 AA의 서열 및 이의 상응하는 SAA 이소형과의 관계는 도 2 내지 5에 도시되어 있다. 예를 들어, 사람 SAA1 알파 이소형은 하기의 서열을 갖는다:
Figure 112010048814606-pct00018
SAA의 단백질용해 단편인 AA는 또한 이종성이다. 주요 사람 AA 펩타이드는 76개 아미노산으로 이루어진다. AA의 예는 하기의 서열을 갖는다:
Figure 112010048814606-pct00019
AA70-76은 잔기 70번에서 개시하여 서열번호 2의 잔기 76번에서 종료되고 서열 GHGAEDS, (서열번호 4), 또는 당해 단백질의 서열이 최대로 서열번호 2와 정렬되는 경우 사람 또는 기타 종 유래의 또 다른 천연 AA 단백질 기원의 상응하는 분절로 이루어진다.
2. 쥐 혈청 아밀로이드 A
마우스에서, 4개의 SAA 유전자자는 보고되었다. 4개의 쥐 SAA 유전자에 의해 암호화된 단백질의 대표적인 아미노산 서열은 도 8에 도시되어 있다. 마우스 SAA 유전자 패밀리는 염색체 7에 밀접하게 연결된 4개의 구성원을 포함한다. 이들 유전자중 2개는 주요 마우스 SAA 이소형(SAA1 및 SAA2)을 암호화하고 엑손에서 뿐만 아니라 인트론 및 플랭킹 영역에서 높은 서열 동일성을 공유하고 대략 동일한 양으로 아밀로이드 유도 모델에 반응하여 유도된다. 이들 2개 이소형은 103개 아미노산 잔기 중 9개만이 상이하지만 단지 SAA2가 아밀로이드 섬유상에 선택적으로 침적된다[문헌참조 de Beer M.C. Biochem J. 1991 280(Pt 1): 45-49 (1991); Hoffman J.S. et al. J Exp Med. 159:641-646 (1984); Shiroo M et al. Scand J. Immunol. 26:709-716 (1987)]. SAA3은 소수 HDL 아포지질단백질이고 말초적으로 급성상에서 제조된다. SAA4는 항상성동안에 90% 이상의 SAA를 포함하는 소수 정상의 HDL 아포지질단백질인 항상성 서브패밀리이다[문헌참조: Stearman R.S. et al. Nucleic Acids Research, 14(2)797-809 (1986) 및 de Beer M.C. Genomics, 34(1): 139-42 (1996)]
SAA의 단백질 용해 단편인 쥐 AA는 또한 이종성이다. 각각의 쥐 이소형의 AA의 서열 및 이의 상응하는 SAA 이소형과의 관계는 도 9 내지 12에 도시되어 있다. 쥐 AA1, AA2, AA3 및 AA4의 서열 정렬은 도 13에 도시되어 있다.
쥐 AA1은 사람 AA1의 쥐 등가물이다(도 6 참조). 특히, 쥐 AA1의 잔기 69번 내지 75번 (GRGHEDT, 서열번호 9)는 사람 AA1의 잔기 70번 내지 76번 (GHGAEDS, 서열번호 4)과 최대로 정렬된다[도 17 참조].
3. Shar Pei 혈청 아밀로이드 A
Shar Pei 서열은 도 20에 나타낸다. 흥미롭게도, 사람 SAA 단백질에서 상동성 영역 -AEDS(서열번호 13)은 위치 76번에서 보존성 Thr이 Ser로 치환되어 있고 위치 73번(His가 Ala로 치환됨: 도 1)에서 잔기의 상당히 상이한 측쇄를 갖는다. -AEDS(서열번호 13)의 서열은 특히 AA 아밀로이드증에 민감하고 AA 아밀로이드 특이적 항체 및 기타 화합물의 신규 진단학적 및 치료학적 적용을 평가하기 위해 전신성 AA의 천연 모델을 제공할 수 있는 품종인 개의 Shar Pei 종에서 관찰된다.
4. AA 단백질의 N-말단 분절은 이의 섬유형성 성질을 결정한다
아밀로이드 섬유 단백질 AA는 전구체 단백질 혈청 AA의 다양한 긴 N-말단부로 이루어진다. 증거는 분자의 아밀로이드성 부분이 N-말단 10 내지 15개 아미노산의 긴 분절이다. 분자의 당해 부분에서의 아미노산 치환은 2개의 마우스 SAA 이소형 중 하나가 아밀로이드성인지의 이유를 설명할 수 있다[문헌참조: Westermark G.T. Biochem Biophys Res Commun. 182(1):27-33 (1992).]
V. 기타 사람 아밀로이드성 단백질
진뱅크 등록번호 및 X1EDX2 서열은 상기 표 2에 열거된 것 중 일부를 포함하는, 여러 사람 아밀로이드성 단백질에 대해 하기 표 3에 제공되어 있다.
Figure 112010048814606-pct00020
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Figure 112010048814606-pct00027
Figure 112010048814606-pct00028

VI. 능동 면역화를 위한 아밀로이드 펩타이드
본 발명의 방법에 사용하기 위한 치료제는 환자에 투여시 X1EDX2, 예를 들어, AA("AA 제제")의 잔기 70-76 사이에서의 에피토프를 포함하는 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 면역원성 펩타이드, 예를 들어, AA 펩타이드 및 AL 펩타이드이다. 제제의 추가 예로는 기타 아밀로이드 단백질("X1EDX2 단편")로부터 유래한 X1EDX2로 이루어진 단편, 예를 들어, 아미노산 서열 PEDI(서열번호 21), PEDF(서열번호 22), AEDV(서열번호 23), SEDF(서열번호 24) 또는 SEDA(서열번호 25)로 이루어진 AL Vκ 단편, 및 아미노산 서열 SEDE(서열번호 18), AEDE(서열번호 19), TEDE(서열번호 16) 또는 PEDE(서열번호 20)로 이루어진 AL Vκ 단편을 포함하는 면역원성 펩타이드가 포함된다. 일부 적합한 아밀로이드 단백질로는 혈청 아밀로이드 A 단백질, 면역글로불린 경쇄 단백질, 사람 췌도 아밀로이드 전구체 폴리펩타이드(IAPP), 베타 아밀로이드 펩타이드, 트랜스티레틴(TTR), ApoA1, 및 표 1에 열거되고 서열 X1EDX2를 포함하는 기타 아밀로이드 단백질이 포함된다. 일부 제제에서, X1은 H, T, F, S, P, A 또는 아밀로이드 단백질에서 ED에 바로 선행하는 임의의 기타 아미노산 잔기이고; X2는 T, S, E, R, I, V, F, D, A 또는 이러한 아밀로이드 단백질에서 ED에 바로 후행하는 임의의 기타 아미노산 잔기이다. 일부 제제에서, X1은 H, T, F, S, P 또는 A이고 X2는 T, S, E, D, R, I, V, F 또는 A이다. 일부 이들 제제에서, X1이 H이고, X2가 T 또는 A인 경우; X1이 A이고, X2가 S, T, E 또는 V인 경우; X1이 T이고, X2가 E인 경우; X1이 F이고, X2가 D인 경우; X1이 S이고, X2가 E, F 또는 A인 경우; X1이 P이고, X2가 E, I 또는 F이다. 일부 제제에서, X1이 H, T, F, S, P 또는 A이고 X2가 T, S, E, D, R, I, V, F 또는 A이며, 단 X1이 A인 경우, X2는 V가 아니다. 일부 제제에서, X1이 A인 경우, X2는 S, T 또는 E이다.
일부 제제는 아미노산 서열
Figure 112010048814606-pct00029
를 포함한다. 일부 제제는 캐리어에 결합하여 접합체를 형성하는
Figure 112010048814606-pct00030
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 제제는 아미노산 서열
Figure 112010048814606-pct00031
를 포함한다. 일부 제제는 캐리어에 결합하여 접합체를 형성하는
Figure 112010048814606-pct00032
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된다. 일부 제제는
Figure 112010048814606-pct00033
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산을 포함한다.
바람직한 AA 단편은 사람 AA1 (HAA1) 알파 이소형태 잔기 70-76 (GHGAEDS, 서열번호 4), HAA1 베타 이소형태 잔기 70-76 (GHDAEDS, 서열번호 5), HAA1 감마 이소형태 잔기 70-76 (GHDAEDS, 서열번호 5), HAA2 알파 및 베타 이소형태 잔기 70-76 (GHGAEDS, 서열번호 4), HAA3 잔기 70-76 (GDHAEDS, 서열번호 7), HAA4 잔기 78-84 (STVIEDS, 서열번호 8), 마우스 AA1 (MAA1) 잔기 69-75 (GRGHEDT, 서열번호 9), MAA2 잔기 69-75 (GRGHEDT, 서열번호 9), MAA3 잔기 62-68 (GHGAEDS, 서열번호 10) 및 MAA4 잔기 76-82 (NHGLETL, 서열번호 11) 또는 이들의 임의의 3개 이상의 인접 아미노산의 하위 단편이다. 일부 AA 단편들은 상기 지정된 분절 이외의 AA 아밀로이드증 펩타이드의 잔기를 함유하지 않는다. 기타 AA 단편들은 AA 아밀로이드증 펩타이드로부터 유래된 추가의 인접 잔기를 함유하지만 AA 아밀로이드증 펩타이드로부터 유래된 총 20개 이하, 바람직하게는 총 10개 이하의 인접 잔기를 함유한다. 추가의 바람직한 X1EDX2 및 AL 단편으로는
Figure 112010048814606-pct00034
가 포함된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 치료제로는 또한 환자에 투여시 AA의 N 말단 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 면역원성 AA 펩타이드가 포함된다. 바람직한 제제는 사람 AA의 잔기 1-15 내의 에피토프와 관련된 면역원성 반응을 유도한다.
바람직하게는, 투여되는 AA, AL 또는 기타 제제의 단편, 예를 들어, X1EDX2 단편은 이들 단편과의 T 세포 반응을 생성하는 에피토프가 부족하다. 일반적으로, T 세포 에피토프들은 10개 초과의 인접 아미노산이다. 따라서, 아밀로이드 단백질의 바람직한 단편, 예를 들어, AA 또는 X1EDX2 단편은 크기 4 내지 10, 바람직하게는 7 내지 10의 인접 아미노산이다; 즉, T 세포 반응을 생성하지 않고 항체 반응을 생성하기에 충분한 길이. T 세포 에피토프들이 단편들의 면역원 활성을 요하지 않고 환자의 아집단에서 바람직하지 못한 염증 반응을 유발할 수도 있기 때문에[문헌 참조: Anderson et al., (2002) J. Immunol. 168, 3697-3701; Senior (2002) Lancet Neurol. 1, 3], T 세포 에피토프들의 부재가 바람직하다.
바람직힌 AA 단편은 사람 AA1 (HAA1) 알파 이소형태 잔기 70-76 (GHGAEDS) (서열번호 4), HAA1 베타 이소형태 잔기 70-76 (GHDAEDS) (서열번호 5), HAA1 감마 이소형태 잔기 70-76 (GHDAEDS, 서열번호 5), HAA2 알파 및 베타 이소형태 잔기 70-76 (GHGAEDS, 서열번호 4), HAA3 잔기 70-76 (GDHAEDS) (서열번호 7), HAA4 잔기 78-84 (STVIEDS) (서열번호 8), 마우스 AA1 (MAA1) 잔기 69-75 (GRGHEDT) (서열번호 9), MAA2 잔기 69-75 (GRGHEDT, 서열번호 9), MAA3 잔기 62-68 (GHGAEDS) (서열번호 10) 및 MAA4 잔기 76-82 (NHGLETL) (서열번호 11) 또는 이들의 임의의 3개 이상의 인접 아미노산의 하위 단편이다. 일부 AA 단편들은 상기 지정된 분절 이외의 AA 아밀로이드증 펩타이드의 잔기를 함유하지 않는다. 기타 AA 단편들은 AA 아밀로이드증 펩타이드로부터 유래된 추가의 인접 잔기를 함유하지만 AA 아밀로이드증 펩타이드로부터 유래된 총 20개 이하, 바람직하게는 총 10개 이하의 인접 잔기를 함유한다. 추가의 바람직한 X1EDX2 및 AL 단편으로는
Figure 112010048814606-pct00035
가 포함된다.
천연 아밀로이드증, AL 아밀로이드증 및 기타 아밀로이드증 펩타이드의 유사체도 또한 본 발명의 방법 및 조성물에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 유사체는 대립 종 및 대립 변이체를 포함한다. AA의 유사체는 천연 AA 70 내지 76 펩타이드와 특이적으로 결합하는 항체를 유도한다. 일부 이들 유사체는 AA 70 내지 76 이외의 동위원소들과 특이적으로 결합하는 항체를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이하의 위치 변화에 의해 30% 이하의 아미노산 위치에서 유도한다. 천연 아미노산 잔기의 각각의 결손 또는 치환은 치환이 없는 잔기의 삽입인 위치 변화로서 간주된다. 아미노산 치환은 종종 보존적 치환이다.
AA 또는 AA 단편, AL 또는 AL 단편 또는 기타 아밀로이드 단백질 단편, 예를 들어, X1EDX2 단편은 또한 비천연 아미노산 또는 N 또는 C 말단 아미노산을 1, 2, 5, 10 또는 심지어 모든 위치에서 포함한다. 예를 들어, 천연 아스파르트산 잔기는 이소아스파르트산으로 대체될 수 있다. 비천연 아미노산의 예로는 D, 알파, 알파 이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 4-하이드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트, 엡실론-N,N,N-트리메틸리신, 엡실론-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, 오메가-N-메틸아르기닌, β-알라닌, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록스프롤린, 티록신, 감마-아미노 부티르산, 호모세린, 시트룰린 및 이소아스파르트산이 있다. 본 발명의 일부 치료제는 모든 D 펩타이드들, 예를 들어, 모든 D AA 또는 모든 D AA 단편 및 모든 D 펩타이드 유사체이다. 본 발명의 일부 치료제는 90%의 모든 D 펩타이드, 예를 들어, 90%의 모든 D AA 또는 90%의 모든 D AA 단편 및 90%의 모든 D 펩타이드 유사체이다. 본 발명의 일부 치료제는 80%의 모든 D 펩타이드, 예를 들어, 80%의 모든 D AA 또는 80%의 모든 D AA 단편 및 80%의 모든 D 펩타이드 유사체이다. 단편 및 유사체는 하기 기재되는 미처리 또는 위약 대조군과 비교하여 유전자도입 동물 모델에서 예방 또는 치료 효능에 대해 스크리닝한다.
AA, AL, 이들의 단편 및 유사체 및 X1EDX2 단편 및 이의 유사체는 고상 펩타이드 합성 또는 재조합 발현에 의해 합성될 수 있거나 천연 공급원으로부터 수득될 수 있다. 자동 펩타이드 합성장치는 다수의 공급업체, 예를 들어, Applied Biosystems(미국 캘리포니아 포스터시 소재)로부터 구입가능하다. 재조합 발현은 세균, 예를 들어, 대장균(E. coli), 효모, 곤충 세포 또는 포유동물 세포에서 수행할 수 있다. 재조합 발현 절차는 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989)]에 기재되어 있다.
치료제는 또한 한면 또는 양면에서 AA 펩타이드, AL 펩타이드 또는 X1EDX2 단편과 인접하는 하나 이상의 기타 아미노산과 함께, 예를 들어, AA 펩타이드, AL 펩타이드 또는 X1EDX2 단편의 면역원 단편을 포함하는 긴 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 제제는 이종 아미노산 서열에 대하여 보조 T 세포 반응을 유하여 AA 분절, AL 분절 또는 X1EDX2 단편에 대하여 B 세포 반응을 유도하는 이종 아미노산 서열에 융합된 AA, AL 또는 X1EDX2 단편의 분절을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 하나 이상의 인접 이종 아미노산은 또한 제조, 저장 또는 사용에서 분해로부터 보호하기 위해 AA 또는 AL 펩타이드 또는 X1EDX2 단편을 캡핑하는데 사용될 수도 있다. 이러한 폴리펩타이드들은 하기 기재되는 미처리 또는 위약 대조군과 비교하여 동물 모델에서 예방 또는 치료 효능에 대해 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 치료제는 폴리리신 서열에 의해 인접된 AA 또는 AL의 면역원성 단편 또는 X1EDX2 단편을 포함한다. 폴리리신 서열은 AA 또는 AL의 면역원성 단편 또는 X1EDX2 단편의 N 말단, C 말단 또는 N 말단과 C 말단의 모두에 융합될 수 있다. AA 또는 AL 펩타이드, X1EDX2 단편, 유사체, AA의 활성 단편 또는 기타 폴리펩타이드는 결합 또는 다량체 형태 또는 해리 형태로 투여될 수 있다. 치료제는 또한 단량체 면역원성 제제의 다량체를 포함한다.
추가의 변형예에서, AA 또는 AL의 면역원성 단편 또는 X1EDX2 단편은 면역원성 조성물의 일부로서 바이러스 또는 세균에 의해 제공될 수 있다. 면역원성 펩타이드를 암호화하는 핵산은 바이러스 또는 세균의 게놈 또는 에피솜에 혼입된다. 임의로, 핵산은 면역원성 단백질이 분비 단백질로서 발현되거나, 바이러스의 외부 표면 단백질 또는 세균의 막 관통 단백질과의 융합 단백질로서 발현되어 펩타이드가 나타나는 방식으로 혼입된다. 이러한 방법에 사용되는 바이러스 또는 세균은 비병원성이거나 약독화되어야 한다. 적합한 바이러스로는 아데노바이러스, HSV, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 및 기타 알파 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 및 기타 라브도 바이러스, 우두 및 수두가 포함된다. 적합한 세균으로는 살모넬라 및 쉬겔라가 포함된다. HBV의 HBsAg에 대한 면역원성 펩타이드의 융합은 특히 적합하다.
치료제는 또한 AA, AL 또는 X1EDX2 단편과 현저한 아미노산 서열 유사성을 반드시 갖지 않지만 AA, AL 또는 X1EDX2 단편의 모방체로서 작용하여 유사한 면역 반응을 유도하는 펩타이드 및 기타 화합물을 포함한다. 예를 들어, β 병풍 구조를 형성하는 임의의 펩타이드 및 단백질은 적합성에 대해 스크리닝될 수 있다. AA 또는 AL 또는 기타 아밀로이드 형성 펩타이드, 예를 들어, X1EDX2 단편에 대한 모노클로날 항체에 대항하는 항이디오타입 항체도 또한 사용될 수 있다. 이러한 항이디오타입 항체는 항원을 모방하여 이에 대한 면역 반응을 생성한다[문헌 참조: Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6th ed.), p. 181]. AA 펩타이드 이외의 제제는 상기 열거된 AA의 바람직한 분절(예를 들어, AA 70 내지 76 또는 GHEDT(서열번호 3)) 또는 상기 열거된 AL 또는 X1EDX2 단편, 예를 들어,
Figure 112010048814606-pct00036
의 하나 이상에 대하여 면역원성 반응을 유도한다.
바람직하게는 이러한 제제는 AA 또는 AL의 기타 분절, 또는 X1EDX2 단편이 유래된 아밀로이드 단백질과 관련되지 않고 이들 분절의 하나와 특이적으로 관련되는 면역원성 반응을 유도한다.
펩타이드 또는 기타 화합물의 랜덤 라이브러리도 또한 적합성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 조합 라이브러리는 단계적 방식으로 합성될 수 있는 다수 유형의 화합물을 위해 생성될 수 있다. 이러한 화합물로는 폴리펩타이드 폴리펩타이드, 베타 회전 모방체, 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀, 올리고머성 N 치환된 글리신 및 올리고카바메이트가 포함된다. 화합물의 다수의 조합 라이브러리는 국제 공개공보 제WO 95/12608호(Affymax), 제WO 93/06121호(Affymax), 제WO 94/08051호(Columbia University), 제WO 95/35503호(Pharmacopeia) 및 제WO 95/30642호(Scripps)(이들 각각은 모든 목적을 위해 참조로 인용된다)에 기재되어 있는 암호화 합성 라이브러리(ESL) 방법에 의해 제작될 수 있다. 펩타이드 라이브러리는 또한 파지 디스플레이 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 국제 공개공보 제W0 91/18980호(Devlin) 참조).
조합 라이브러리 및 기타 화합물은 AA 또는 기타 아밀로이드 형성 펩타이드에 특이적인 것으로 공지된 항체 또는 림프구(B 또는 T)와 특이적으로 결합하는 능력을 측정함으로써 적합성에 대하여 초기 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 초기 스크리닝은 AA, AL 또는 이들의 단편 또는 X1EDX2 단편에 대한 임의의 폴리클로날 혈청 또는 모노클로날 항체로 수행될 수 있다. 이어서, 화합물은
AA(예를 들어, AA 70 내지 76 또는 GHEDT(서열번호 3)) 또는 AL 내의 특이적 에피토프와 특이적으로 결합하거나 상기 열거된 X1EDX2 단편, 예를 들어,
Figure 112010048814606-pct00037
와 특이적으로 결합하는 것에 대하여 스크리닝될 수 있다.
화합물은 항체 에피토프 특이성을 지도화하기 위해 기재된 동일한 절차에 의해 시험될 수 있다. 이어서, 이러한 스크리닝에 의해 확인된 화합물은 AA, AL 또는 이들의 단편 또는 X1EDX2 단편에 대한 항체 또는 반응성 림프구를 유도하는 능력에 대하여 추가로 분석될 수 있다. 예를 들어, 혈청의 다중 희석액은 AA, AL 또는 이들의 단편 또는 X1EDX2 단편으로 예비피복된 미세역가 플레이트 상에서 시험될 수 있으며, 표준 ELISA는 AA, AL 또는 이들의 단편 또는 X1EDX2 단편에 대한 반응성 항체에 대하여 시험하도록 수행될 수 있다. 이어서, 화합물은 아밀로이드증, 예를 들어, AA 아밀로이드증 또는 AL 아밀로이드증에 잘 걸리게 한 유전자도입 동물에서 예방 및 치료 효능에 대하여 시험될 수 있다. 동일한 스크리닝 접근법은 상기 기재된 AA 또는 AL의 단편 및 X1EDX2 단편을 포함한 기타 잠재적 제제, AA 유사체, AL 유사체 및 긴 펩타이드에 대하여 사용될 수 있다.
VII. 접합체
면연 반응을 유도하기 위한 일부 제제는 AA에 대하여 면역 반응을 유도하기 위한 적절한 에피토프를 함유하지만 너무 작아 면역원성이 아니다. 이러한 경우, 펩타이드 면역원은 적합한 캐리어 분자에 결합하여 면역 반응을 유도하는데 도움이 되는 접합체를 형성할 수 있다. 단일 제제는 단일 캐리어에 결합할 수 있거나, 복수 카피의 제제는 복수 카피의 캐리어에 결합할 수 있거나, 이들은 차례로 서로 결합할 수 있거나, 복수 카피의 제제는 단일 카피의 캐리어에 결합할 수 있거나, 단일 카피의 제제는 복수 카피의 캐리어 또는 상이한 캐리어에 결합할 수 있다. 적합한 캐리어로는 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 오발부민, 파상풍 독소 또는 기타 병원성 세균, 예를 들어, 디프테리아, 대장균, 콜레라 또는 헬리코박터 파일로리(H. pylori)로부터 유래된 독소, 또는 기타 약독화 독소 유도체가 포함된다. T 세포 에피토프도 또한 적합한 캐리어 분자이다. 일부 접합체는 본 발명의 제제를 면역 자극성 중합체 분자(예를 들어, 트리팔미토일-S-글리세린 시스테인(Pam3Cys), 만난(만노오스 중합체), 또는 글루칸(베타 1→2 중합체)), 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-1 알파 및 베타 펩타이드, IL-2, 감마-INF, IL-10, GM-CSF) 및 케모카인(예를 들어, MIP1 알파 및 베타, 및 RANTES)과 결합시킴으로써 형성될 수 있다. 면역원성 제제는 또한 국제 공개공보 제WO 97/17613호(O'Mahony) 및 제WO 97/17614호(O'Mahony)에 기재된 바와 같이, 조직을 통과하는 수송을 촉진하는 펩타이드에 결합할 수도 있다. 면역원은 스페이서 아미노산(예를 들어, gly-gly)을 갖거나 갖지 않은 캐리어에 결합할 수 있다.
일부 접합체는 본 발명의 제제를 하나 이상의 T 세포 에피토프에 결합시킴으로써 형성될 수 있다. 일부 T 세포 에피토프는 뒤섞인 것인 반면에, 다른 T 세포 에피토프는 일반적인 것이다. 뒤섞인 T 세포 에피토프는 다양한 유형의 HLA를 나타내는 광범위한 개체에서 T 세포 면역성 유도를 강화할 수 있다. 뒤섞인 T 세포 에피토프와는 대조적으로, 일반적인 T 세포 에피토프는 상이한 HLA-DR 대립유전자에 의해 암호화되는 다양한 HLA 분자를 나타내는 개체의 T 세포 면역성 유도를 고비율로, 예를 들어, 75% 이상 강화할 수 있다.
다수의 천연 발생 T 세포 에피토프는, 예를 들어, 파상풍 독소(예를 들어, P2 및 P30 에피토프), B형 간염 바이러스 표면 항원, 백일해 독소, 홍역 바이러스 F 단백질, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomitis)의 주요 외부 막 단백질, 디프테리아 독소(예를 들어, CRM197), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 포자소체(circumsporozite; CS) T, 플라스모듐 팔시파룸 CS 항원, 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni) 트리오스 포스페이트 이성체, 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) TraT 및 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)에 존재한다. 본 발명의 면역원성 펩타이드는 또한 문헌[참조: Sinigaglia F. et al., Nature, 336:778-780 (1988); Chicz R.M. et al., J. Exp. Med., 178:27-47 (1993); Hammer J. et al., Cell 74:197-203 (1993); Falk K. et al., Immunogenetics, 39:230-242 (1994); WO 98/23635; Southwood S. et al. J. Immunology; 160:3363-3373 (1998); 및 Giannini,G. et al. Nucleic Acids Res. 12: 4063-4069 (1984); 이들 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된다]에 기재된 T 세포 에피토프에 접합될 수도 있다. 추가의 예로는 다음과 같은 것이 포함된다:
인플루엔자 헤마글루티닌: HA307 -319
말라리아 CS: T3 에피토프
Figure 112010048814606-pct00038
B형 간염 표면 항원:
Figure 112010048814606-pct00039
열 충격 단백질 65:
Figure 112010048814606-pct00040
칼메트-게랭 균(bacille Calmette-Guerin):
Figure 112010048814606-pct00041
파상풍 독소:
Figure 112010048814606-pct00042
파상풍 독소:
Figure 112010048814606-pct00043
HIV gp120 T1:
Figure 112010048814606-pct00044
파상풍 독소:
Figure 112010048814606-pct00045
HIV gp120 T1:
Figure 112010048814606-pct00046
또는, 상기 접합체는 본 발명의 제제를 MHC 클래스 II 분자의 큰 부분에 결합할 수 있는 하나 이상의 인공 T 세포 에피토프, 예를 들어, pan DR 에피토프("PADRE")에 결합시킴으로써 형성될 수 있다. PDRE는 미국 특허 제5,736,141호, 국제 공개공보 제WO 95/07707호 및 문헌[참조: Alexander J et al., Immunity, 1:751-761 (1994)](이들 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된다)에 기재되어 있다. 바람직한 PADRE 펩타이드는 AKXVAAWTLKAAA(서열번호 74)(공통 잔기는 굵은 글씨로 표시함)[여기서, X는 바람직하게는 사이클로헥실알라닌, 티로신 또는 페닐알라닌, 가장 바람직하게는 사이클로헥실알라닌이다]이다.
면역원성 제제는 화학적 가교결합에 의하여 캐리어에 결합할 수 있다. 면역원을 캐리어에 결합시키는 기술은 N-석신이미딜-3-(2-피리딜-티오)프로피오네이트(SPDP) 및 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC)를 사용하여 이황화 결합을 형성하는 것(펩타이드에서 설프하이드릴기가 부족한 경우, 이황화 결합은 시스테인 잔기를 첨가함으로써 제공될 수 있다)을 포함한다. 이러한 시약은 자신들과 하나의 단백질에 존재하는 펩타이드 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 형성하거나, 리신 상의 엡실론-아미노, 또는 기타 아미노산에 존재하는 다른 유리 아미노 그룹을 통해 아미드 결합을 형성한다. 다양한 이들 이황화/아미드 형성제는 문헌[Immun. Rev. 62, 185 (1982)]에 기재되어 있다. 기타 이관능성 커플링제는 이황화 결합 보다는 티오에테르 결합을 형성한다. 다수의 이들 티오에테르 형성제는 시판중에 있으며, 그 예로서는 6-말레이미도카프론산, 2-브로모아세트산 및 2-요오도아세트산, 4-(N-말레이미도-메틸)사이클로헥산-1-카복실산의 반응성 에스테르가 포함된다. 상기 카복실 그룹은 상기 제제와 석신이미드 또는 1-하이드록실-2-니트로-4-설폰산 나트륨 염과 배합함으로써 활성화될 수 있다.
본 발명의 Th 에피토프 및 펩타이드 면역원 사이에 스페이서 잔기(예를 들어, Gly-Gly)를 부가함으로써 면역원성을 개선시킬 수 있다. B 세포 에피토프(즉, 펩타이드 면역원)로부터 유래된 Th 에피토프를 물리적으로 분리시키는 이외에, 글리신 잔기는 Th 에피토프와 펩타이드 면역원을 결합시킴으로써 생성되는 임의의 인공 2차 구조를 파괴할 수 있으며, 이로써 T 세포 및/또는 B 세포 반응 사이의 충돌을 방지할 수 있다. 그러므로, 보조 에피토프와 항체 유도 영역 사이를 형태적으로 분리시키면, 제시된 면역원과 적당한 Th 세포 및 B 세포 사이에 더욱 효율적인 상호 작용이 일어날 수 있다.
본 발명의 제제에 대하여 다양한 유형의 HLA를 나타내는 개체의 대부분에서 T 세포 면역성 유도를 강화하기 위하여, 상이한 Th 세포 에피토프와 접합체의 혼합물을 제조할 수 있다. 이러한 혼합물은 상이한 Th 세포 에피토프와 2개 이상의 접합체의 혼합물, 상이한 Th 세포 에피토프와 3개 이상의 접합체의 혼합물, 또는 상이한 Th 세포 에피토프와 4개 이상의 접합체의 혼합물을 함유할 수 있다. 이러한 혼합물은 애주번트와 함께 투여될 수 있다.
면역원성 펩타이드는 또한 캐리어(즉, 이종 펩타이드)를 갖는 융합 단백질로서 발현될 수도 있다. 면역원성 펩타이드는 아미노 말단, 카복실 말단 또는 이들 모두에서 캐리어와 결합할 수 있다. 임의로, 면역원성 펩타이드의 다수의 반복 단위는 융합 단백질에 존재할 수 있다. 임의로, 면역원성 펩타이드는, 예를 들어, 펩타이드의 N 말단과 C 말단 둘 다에서 다수 카피의 이종 펩타이드에 결합할 수 있다. 임의로, 다수 카피의 면역원성 펩타이드는 다수 카피의 이종 펩타이드에 결합할 수 있다. 이들은 서로에 결합한다. 일부 캐리어 펩타이드는 캐리어 펩타이드에 대하여 보조 T 세포 반응을 유도하는 작용을 한다. 이에 따라서, 상기 유도된 보조 T 세포는 캐리어 펩타이드에 결합된 면역원성 펩타이드에 대하여 B 세포 반응을 유도한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 융합 단백질의 일부 예는 하기에 나타낸다. 이러한 융합 단백질 중의 일부는, 예를 들어, 미국 특허 제5,196,512호, 유럽 특허 제378,881호 및 유럽 특허 제427,347호에 기재된 파상풍 독소 에피토프에 결합되어 있는 AA의 분절을 포함한다. 일부 융합 단백질은 미국 특허 제5,736,142호에 기재된 하나 이상의 PADRE에 결합되어 있는 AA의 분절을 포함한다. 일부 이종 펩타이드는 뒤섞인 T 세포 에피토프인 반면에, 기타 이종 펩타이드는 일반적인 T 세포 에피토프이다. 일부 방법에서, 투여 제제는 AA 분절이 이종 분절에 선형 배열로 결합되어 있는 간단한 단일 융합 단백질이다. 본 발명의 치료제는 공식을 사용하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 방법에서, 상기 제제는 식 2x(여기서, x는 1 내지 5의 정수이다)로 표시되는 융합 단백질의 다량체이다. x는 바람직하게는 1, 2 또는 3이고, 가장 바람직하게는 2이다. x가 2인 경우, 이러한 다량체는 MAP4로 언급되는 바람직한 배열로 결합된 4개의 융합 단백질을 갖는다(미국 특허 제5,229,490호 참조).
MAP4의 배열을 이하에 나타내었는데, 여기서 분지형 구조는 리신의 N 말단과 측쇄 아민 둘 다에서 펩타이드 합성을 개시함으로써 생성된다. 배수에 따라, 리신은 서열에 통합되어, 분지화될 수 있으며, 생성된 구조는 다수의 N 말단을 제공할 것이다. 이러한 예에서, 4개의 동일한 N 말단은 분지형 리신 함유 코어 상에 생성되었다. 이와 같이 반복함으로써 같은 계통의 B 세포의 반응성을 강화한다. 하기 예에서, Z는 AA 또는 AL의 면역원성 단편 또는 X1EDX2 단편을 의미하며, Z1 내지 Z4는 AA 또는 AL의 면역원성 단편(들) 또는 X1EDX2 단편을 의미한다. 이들 단편은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
Figure 112010048814606-pct00047
융합 단백질의 다른 예로는 다음과 같은 것이 포함된다:
MAP4 배열 중에서 Z-파상풍 독소 830-844:
Figure 112010048814606-pct00048
MAP4 배열 중에서 Z-파상풍 독소 947-967:
Figure 112010048814606-pct00049
MAP4 배열 중에서 Z-파상풍 독소 830-844:
Figure 112010048814606-pct00050
선형 배열 중에서 Z-파상풍 독소 830-844 + 947-967:
Figure 112010048814606-pct00051
X가 바람직하게는 사이클로헥실알라닌, 티로신 또는 페닐알라닌이고, 가장 바람직하게는 사이클로헥실알라닌인 PADRE 펩타이드(선형 배열 중의 모두)-Z:
Figure 112010048814606-pct00052
Z x 3-PADRE 펩타이드:
Figure 112010048814606-pct00053
선형 배열 중에서 Z-오발부민 323-339:
Figure 112010048814606-pct00054
융합 단백질의 추가 예로는 다음과 같은 것이 포함된다:
Figure 112010048814606-pct00055
Z-QYIKANSKFIGITEL(서열번호 71)(2분지형 수지 상에 존재): 단편들은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
Figure 112010048814606-pct00056
동일하거나 유사한 캐리어 단백질 및 결합 방법은 AA 또는 AA 또는 AL의 면역원성 단편 또는 X1EDX2 단편에 대한 항체의 생산에 사용될 수 있다. 예를 들어, 캐리어에 결합된 AA 또는 AA 또는 AL의 면역원성 단편 또는 X1EDX2 단편은 AA 또는 AA 또는 AL의 면역원성 단편 또는 X1EDX2 단편에 대한 모노클로날 항체의 생산에서 실험실 동물에 투여될 수 있다.
VIII. 치료제를 암호화하는 핵산
본 발명의 치료제는 또한 핵산을 포함한다. 아밀로이드 침착물에 대한 면역 반응은 또한 수동 면역화에 사용되는 AA 펩타이드를 암호화하는 핵산과 이의 단편, 기타 펩타이드 면역원, 또는 항체 및 이의 구성성분 쇄를 투여함으로써 유도될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 이러한 제제는 환자에 투여시 X1EDX2 단편을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 AA, AL 또는 핵산의 잔기 70-76 사이에 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 AA 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 이러한 제제는 또한 AA의 C 말단 네오에피토프 또는 X1EDX2 단편과 특이적으로 결합하는 항체를 암호화하는 핵산을 포함한다. 특히, 이러한 핵산은 잔기 70-76 (GHGAEDS(서열번호 4)) 내의 HAA1 알파 이소형태 , 잔기 70-76 (GHDAEDS(서열번호 5)) 내의 HAA1 베타 이소형태, 잔기 70-76 (GHDAEDS(서열번호 5)) 내의 HAA1 감마 이소형태, 잔기 70-76 (GHGAEDS(서열번호 4)) 내의 HAA2 알파 및 베타 이소형태, 잔기 70-76 (GDHAEDS(서열번호 7)) 내의 HAA3, 잔기 78-84 (STVIEDS(서열번호 8)) 내의 HAA4, 잔기 69-75 (GRGHEDT(서열번호 9)) 내의 마우스 AA1 (MAA1), 잔기 69-75 (GRGHEDT(서열번호 9)) 내의 MAA2, 잔기 62-68 (GHGAEDS(서열번호 4)) 내의 MAA3 및 잔기 76-82 (NHGLETL(서열번호 11)) 내의 MAA4와 특이적으로 결합하는 항체를 암호화한다. 이러한 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 추가의 바람직한 핵산은 HEDT(서열번호 12), AEDS(서열번호 13), AEDT(서열번호 14), HEDA(서열번호 15) 또는 TEDE(서열번호 16) 또는 위에서 열거된 기타 X1EDX2 펩타이드와 특이적으로 결합하는 항체를 암호화한다. 면역원을 암호화하는 핵산 분절은 통상적으로 조절 요소, 예를 들어, 환자의 의도된 표적 세포에서 DNA 분절을 발현시킬 수 있는 프로모터 및 인핸서에 결합되어 있다. 면역 반응을 유도하는데 바람직한 혈액 세포에서 발현시키는 경우, 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 유전자 또는 CMV 주요 중개성 초기 프로모터(CMV major intermediate early promoter) 및 인핸서로부터 유래된 프로모터 및 인핸서 요소는 발현을 유도하는데에 적합하다. 결합된 조절 요소 및 암호화 서열은 종종 벡터 내에 클로닝된다. 이중쇄 항체 투여의 경우, 2개의 쇄는 동일한 벡터 또는 별도의 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 본 발명의 치료제를 암호화하는 핵산은 또한 하나 이상의 T 세포 에피토프를 암호화할 수도 있다. 애주번트의 사용 및 캐리어의 사용과 관련된 본원의 개시내용은 본 발명의 치료제를 암호화하는 핵산과의 사용에 뮤타티스 뮤탄디스(mutatis mutandis)를 적용한다.
레트로바이러스 시스템[예를 들어, 문헌 참조: Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)]; 아데노바이러스 벡터[예를 들어, 문헌 참조: Bett et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)]; 아데노 관련 바이러스 벡터[예를 들어, 문헌 참조: Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)], 우두 바이러스 및 조류 수두 바이러스를 포함하는 수두 바이러스(pox virus) 과로부터 유래된 바이러스 벡터, 알파 바이러스 속, 예를 들어, 신드비스 및 셈리키 포레스트 바이러스(Sindbis and Semliki Forest Viruses)[예를 들어, 문헌 참조: Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)], 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(미국 특허 제5,643,576호 참조) 및 라브도 바이러스, 예를 들어, 수포성 구내염 바이러스(국제 공개공보 제WO 96/34625호 참조) 및 파필로마 바이러스[문헌 참조: Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); 국제 공개공보 제WO 94/12629호(Woo et al.); 및 Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)]로부터 유래된 바이러스 벡터를 포함하는 다수의 바이러스 벡터 시스템을 사용할 수 있다.
면역원을 암호화하는 DNA, 또는 이를 함유하는 벡터는 리포좀에 패키징될 수 있다. 적합한 지질 및 관련 유사체는 미국 특허 제5,208,036호, 제5,264,618호, 제5,279,833호 및 제5,283,185호에 개시되어 있다. 면역원을 암호화하는 DNA 및 벡터는 또한 미립자 캐리어(예를 들어, 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체 및 폴리락타이드 및 폴리(락타이드-코-글리콜라이드))에 흡착되거나 또는 결합될 수도 있다[예를 들어, 문헌 참조: McGee et al., J. Micro Encap. (1996)].
유전자 요법용 벡터 또는 네이키드형 DNA는 전신 투여(예를 들어, 정맥 내, 복강 내, 비강 내, 위 내, 피 내, 근육 내, 피하 또는 두개 내 주입) 또는 국소 투여(예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호 참조)에 의해 각각의 환자에게 투여함으로써 생체 내에 전달될 수 있다. 이러한 벡터는 추가로 촉진제, 예를 들어, 부피바신(예를 들어, 미국 특허 제5,593,970호 참조)을 포함할 수 있다. DNA는 또한 유전자 총을 사용하여 투여될 수도 있다[문헌 참조: 상기 Xiao & Brandsma]. 면역원을 암호화하는 DNA는 현미경적 금속 비드의 표면에 침전된다. 미세발사체를 충격파 또는 팽창성 헬륨 가스로 가속화시켜, 수개의 세포층의 깊이까지 조직을 관통한다. 예를 들어, Agacetus, Inc.(미국 위스콘신주 미들톤 소재)에 의해 제조된 액셀 유전자 전달 장치(Accel™ Gene Delivery Device)가 적합하다. 또는, 네이키드형 DNA는 화학적 또는 기계적 자극에 의해 DNA를 피부에 간단히 찔러 넣음으로써 상기 DNA가 피부를 관통하여 혈류로 들어갈 수 있다[국제 공개공보 제WO 95/05853호 참조].
추가의 변형예에서, 면역원을 암호화하는 벡터는 생체외 세포[예를 들어, 각각의 환자로부터 외부 이식한 세포(예를 들어, 림프구, 골수 흡인물, 및 조직 생검편) 또는 보편적 공여 조혈 줄기 세포]에 전달된 다음, 일반적으로 벡터를 혼입한 세포를 선택한 후 상기 세포를 환자에 다시 이식함으로써 전달될 수 있다.
IX. 애주번트
본 발명의 면역원성 제제, 예를 들어, 펩타이드는 때때로 애주번트와 함께 투여된다. 애주번트는 유도된 항체 및/또는 펩타이드가 단독으로 사용되는 경우 이러한 상황에 대한 유도된 항체의 결합 친화도를 증가시킨다. 다양한 애주번트는 AA의 면역원성 단편과 배합하여 사용되어 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 바람직한 애주번트는 반응의 정성적인 형태에 영향을 미치는 면역원의 형태적 변화를 유발하지 않고 면역원에 대한 내인적 반응을 증가시킬 수 있다. 바람직한 애주번트로는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 3-De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(MPL™)[GB 2220211 (현재 Corixa의 일부로서 미국 몬타나주 해밀톤 소재의 RIBI ImmunoChem Research Inc.) 참조]를 포함한다. 스티뮬론(Stimulon™) QS-21은 남아프리카에서 발견되는 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina) 나무의 수피에서 분리된 사포닌 또는 트리테르펜 글리코사이드이다[문헌 참조: Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); 미국 특허 제5,057,540호(미국 매사추세츠주 프라밍험 소재의 Aquila BioPharmaceuticals)]. 기타 애주번트로는 수중유 유액(예를 들어, 스쿠알렌 또는 피넛 오일)이 있으며, 임의로 면역 자극제, 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A[문헌 참조: Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)], 플루론산 중합체(pluronic polymers) 및 사멸된 마이코박테리아(mycobacteria)와 배합된다. 다른 애주번트로는 CpG(국제 공개공보 제WO 98/40100호 참조)가 있다. 애주번트는 활성제를 함유한 치료 조성물의 성분으로서 투여될 수 있거나, 또는 치료제 투여 이전, 투여와 동시에 또는 이후에 별도로 투여될 수 있다.
애주번트의 바람직한 부류로는 알루미늄 염, 예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄이 있다. 이러한 애주번트는 기타 특이적 면역 자극제, 예를 들어, MPL 또는 3-DMP, QS-21, 중합체성 또는 단량체성 아미노산, 예를 들어, 폴리글루탐산 또는 폴리리신과 함께 사용될 수 있거나 또는 이들 없이 사용될 수 있다. 애주번트의 다른 부류로는 수중유 유화액 제형이 있다. 이러한 애주번트는 기타 특이적 면역 자극제, 예를 들어, 뮤라밀 펩타이드(예를 들어, N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(nor-MDP), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1',2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Al-D-이소글루-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드(DTP-DPP)테라미드(THERAMIDE™)), 또는 기타 세균 세포벽 성분과 함께 사용될 수 있거나 또는 이들 없이 사용될 수 있다. 수중유 유화액으로는 (a) 미세유동화기, 예를 들어, 모델 110Y 미세유동화기(미국 매사추세츠주 뉴톤 소재의 Microfluidics)를 사용하여 마이크론 이하의 입자로 제형화된, 5% 스쿠알렌, 0.5% Tween 80 및 0.5% Span 85(임의로, 다양한 양의 MTP-PE 함유)를 함유한 MF59(국제 공개공보 제WO 90/14837호 참조), (b) 마이크론 이하의 유화액으로 미세유동화되거나 와류되어 입자 크기가 보다 큰 유화액을 생성하는, 10% 스쿠알렌, 0.4% Tween 80, 5% 플루론산 차단 중합체 L121 및 thr-MDP를 함유하는 SAF 및 (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80 및, 모노포스포릴지질 A(MPL), 트레할로오스 디미콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS), 바람직하게는 MPL + CWS (Detox™)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세균 세포벽 성분을 함유하는 리비(Ribi™) 애주번트 시스템(RAS)(미국 매사추세츠주 해밀톤 소재의 Ribi ImmunoChem)을 포함한다.
바람직한 애주번트의 또 다른 부류로는 사포닌 애주번트, 예를 들어, 스티뮬론(미국 매사추세츠주 프라밍험 소재의 QS-21, Aquila, Framingham) 또는 이로부터 생성된 입자, 예를 들어, ISCOMs(면역 촉진 복합체) 및 ISCOMATRIX가 있다. 기타 애주번트로는 RC-529, GM-CSF 및 완전 프로인트 애주번트(CFA) 및 불완전 프로인트 애주번트(IFA)가 포함된다. 기타 애주번트로는 사이토카인, 예를 들어, 인터루킨(예를 들어, IL-1α 및 β 펩타이드, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL13 및 IL-15), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 케모카인, 예를 들어, MIP1α 및 β 및 RANTES가 포함된다. 애주번트의 또 다른 부류로는 N-글리코실아미드, N-글리코실우레아 및 N-글리코실카바메이트를 포함하는 당지질 유사체가 있으며, 이들의 각각은 당 잔기 내에서 면역 조절제 또는 애주번트로서 아미노산으로 치환된다(미국 특허 제4,855,283호 참조). 열 충격 단백질, 예를 들어, HSP70 및 HSP90도 애주번트로서 사용될 수 있다.
애주번트는 면역원과 함께 단일 조성물로서 투여될 수 있거나, 또는 면역원 투여 이전에, 투여와 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다. 면역원과 애주번트는 포장되어 동일한 바이알로 공급될 수 있거나, 또는 별도의 바이알로 포장되어 사용전에 혼합될 수 있다. 면역원 및 애주번트는 통상적으로 의도된 치료 용도를 나타내는 라벨과 함께 포장된다. 면역원과 애주번트가 별도로 포장되는 경우, 포장은 통상적으로 사용 전 혼합을 위한 설명서도 포함한다. 애주번트 및/또는 캐리어의 선택은 애주번트를 함유하는 면역원성 제형의 안정성, 투여 경로, 투여 계획, 백신 접종되는 종에 대한 애주번트의 효능에 의존하며, 사람에서 약제학적으로 허용 가능한 애주번트는 관련 규제 당국에 의해 사람 투여가 승인되었거나 승인 가능한 것이어야 한다. 예를 들어, 완전 프로인트 애주번트는 사람 투여에 적합하지 않다. 알루미늄 염, MPL 및 QS-21이 바람직하다. 임의로, 2개 이상의 상이한 애주번트가 동시에 사용될 수도 있다. 바람직한 배합물은 MPL을 함유하는 알루미늄 염, QS-21을 함유하는 알루미늄 염, QS-21을 함유하는 MPL, GM-CSF를 함유하는 MPL 또는 RC-529, 및 알루미늄 염, QS-21 및 MPL을 함께 포함한다. 또한, 불완전 프로인트 애주번트도 임의로 알루미늄 염, QS-21 및 MPL 중의 하나, 및 이들의 모든 배합물과 배합하여 사용될 수 있다[문헌 참조: Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)].
X. 항체의 수동 투여
본 발명의 치료제는 AA와 같은 아밀로이드 펩타이드 내에 에피토프를 포함하는 응집된 아밀로이드 단백질에 X1EDX2(여기서, X1은 H, T, F, S, P, A, 또는 이러한 응집된 아밀로이드 단백질에서 ED에 바로 선행하는 임의의 다른 아미노산 잔기이고; X2는 T, S, E, R, I, V, F, A, 또는 이러한 응집된 아밀로이드 단백질에서 ED에 바로 선행하는 임의의 다른 아미노산 잔기이다)를 포함하는 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 수동 투여에 사용되는 항체는 AA의 C 말단 또는 N 말단 에피토프와 결합하는 항체일 수 있다. 혈청 아밀로이드 A 단백질 이외의 기타 아밀로이드 단백질로는 혈청 아밀로이드 A 단백질, 면역글로불린 경쇄 단백질, 예를 들어, Vλ6 Wil 또는 Vκ, 사람 췌도 아밀로이드 전구체 폴리펩타이드(IAPP), 베타 아밀로이드 펩타이드, 트랜스티레틴(TTR) 및 ApoA1 뿐만 아니라, 상기 표 1에 열거된 것들이 포함된다.
AA는 SAA의 단백질 가수분해에 의한 분해에 의해 형성된다. 바람직한 항체는 SAA의 단백질 가수분해에 의한 분해에 의해 형성되는 AA의 네오에피토프와 특이적으로 결합한다. 바람직한 항체는 AA의 C 말단 네오에피토프와 특이적으로 결합하며, 특히 이러한 항체는 잔기 70-76 내의 HAA1 알파 이소형태(GHGAEDS, 서열번호 4), 잔기 70-76 내의 HAA1 베타 이소형태(GHDAEDS, 서열번호 5), 잔기 70-76 내의 HAA1 감마 이소형태(GHDAEDS, 서열번호 5), 잔기 70-76 내의 HAA2 알파 및 베타 이소형태(GHGAEDS, 서열번호 10), 잔기 70-76 내의 HAA3(GDHAEDS, 서열번호 7), 잔기 78-84 내의 HAA4HAA4, 잔기 69-75 내의 마우스 AA1(MAA1)(GRGHEDT, 서열번호 9), 잔기 69-75 내의 MAA2(GRGHEDT, 서열번호 9), 잔기 62-68 내의 MAA3(GHGAEDS, 서열번호 10) 및 잔기 76-82 내의 MAA4(NHGLETL, 서열번호 11)와 특이적으로 결합한다. 일부 항체는 단지 이들 펩타이드 중의 1개 내의 에피토프와 결합한다. 기타 항체는 이들 펩타이드 중의 1개 이상 내의 에피토프와 결합한다. 예를 들어, 일부 항체는 GHGAEDS(서열번호 4) 펩타이드 및 GHDAEDS(서열번호 5) 펩타이드와 특이적으로 결합한다. 일부 항체는 GHGAEDS(서열번호 4) 펩타이드와 특이적으로 결합하지만 GHDAEDS(서열번호 5) 펩타이드와 특이적으로 결합하지 않는다. 1개 이상의 사람 AA 펩타이드와 결합하는 것이 바람직하다. 동일 항체가 마우스 모델에서 시험되고, 후속적으로 사람에서 사용될 수 있다는 점에서 1개 이상의 사람 AA 펩타이드와 상응하는 마우스 펩타이드와 결합하는 것이 유용하다. 일부 바람직한 항체는 HAA1 알파 이소형태 잔기 71-76, 72-76, 73-76, 74-76, 70-75, 70-74, 70-73, 70-72, 71-75, 72-75, 73-75, 71-74, 71-73, 72-74 또는 MAA1 잔기 70-75, 71-75, 72-75, 73-75, 69-74, 69-73, 69-72, 69-71, 70-74, 71-74, 72-74, 70-73, 70-72 내의 에피토프와 특이적으로 결합한다. 이러한 항체는 통상적으로 아밀로이드 침착물과 특이적으로 결합하지만 가용성 AA와 결합할 수 없다. 예를 들어, 항체가 특정 잔기, 예를 들어, HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76 내의 에피토프와 특이적으로 결합한다고 할 때, 이는 항체가 특정 잔기(즉, 이러한 예에서 HAA1 알파 이소형태의 잔기 70-76)를 함유하는 폴리펩타이드와 특이적으로 결합함을 의미한다. 이러한 항체는 HAA1 알파 이소형태의 잔기 70-76 내의 모든 잔기와 반드시 접촉하지는 않는다. HAA1 알파 이소형태의 잔기 70-76에 의한 모든 단일 아미노산 치환 및 결손은 반드시 현저하게 결합 친화도에 영향을 미치는 것은 아니다. 이러한 네오에피토프 항체는 AA와 결합하지만 SAA와 결합하지 않는다. 항체의 에피토프 특이성은, 예를 들어, 국제 공개공보 제WO 00/72880호에 기재된 바에 따라 측정할 수 있다.
수동 투여에 사용되는 항체는 AA의 N 말단 에피토프에 대한 항체이다. 바람직한 항체는 AA의 N 말단 에피토프와 특이적으로 결합하며, 특히 이러한 항체는
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와 특이적으로 결합한다. 일부 항체는 단지 이들 펩타이드 중의 1개 내의 에피토프와 결합한다. 기타 항체는 이들 펩타이드 중의 1개 이상 내의 에피토프와 결합한다. 예를 들어, 일부 항체는 RSFFSFLGEAFDGAR(서열번호 80) 펩타이드 및 QGWLTFLKAAGQGAK(서열번호 81) 펩타이드와 특이적으로 결합한다. 일부 항체는 RSFFSFLGEAFDGAR(서열번호 80) 펩타이드와 결합하지만, QGWLTFLKAAGQGAK(서열번호 81) 펩타이드와 특이적으로 결합하지 않는다. 1개 이상의 사람 AA 펩타이드와 결합하는 것이 바람직하다. 동일 항체가 마우스 모델에서 시험되고, 후속적으로 사람에서 사용될 수 있다는 점에서 1개 이상의 사람 AA 펩타이드와 상응하는 마우스 펩타이드와 결합하는 것이 유용하다.
일부 항체는 이러한 X1EDX2로 이루어진 에피토프와 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 이러한 항체는 응집된 아밀로이드 단백질의 이러한 에피토프와 특이적으로 결합한다. 이러한 항체의 일부는 이러한 단량체 형태의 아밀로이드 단백질에 비하여 응집된 아밀로이드 단백질과 우선적으로 특이적으로 결합한다. 일부 항체에서, X1은 H, T, F, S, P 또는 A이고 X2는 T, S, E, D, R, I, V, F 또는 A이다. 일부 이들 항체에서, X1이 H인 경우, X2는 T 또는 A이고; X1이 A인 경우, X2는 S, T, E 또는 V이고; X1이 T인 경우, X2는 E이고; X1이 F인 경우, X2는 D이고; X1이 S인 경우, X2는 E, F 또는 A이고; X1이 P인 경우, X2는 E, I 또는 F이다. 일부 항체에서, X1은 H, T, F, S, P 또는 A이고 X2는 T, S, E, D, R, I, V, F 또는 A이며, 단 X1은 A이고, X2는 V가 아니다. 일부 항체에서, X1이 A인 경우, X2는 S, T 또는 E이다.
일부 항체는 아미노산 서열
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를 포함하는 에피토프와 특이적으로 결합한다.
일부 항체는
Figure 112010048814606-pct00059
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 특이적으로 결합한다. 일부 항체는
Figure 112010048814606-pct00060
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 특이적으로 결합한다.
일부 항체는 GHEDT(서열번호 3), 예를 들어, 2A4, 7D8 및 8G9를 포함하는 펩타이드에 대하여 형성되거나, 이의 사람화 또는 키메라 버전이다.
항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 폴리클로날 혈청은 통상적으로 AA의 길이를 따라 수개의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체의 혼합 집단을 함유한다. 그러나, 폴리클로날 혈청은 AA의 특정 분절, 예를 들어, HAA1 알파 이소형태의 잔기 70-76에 특이적일 수 있다. 바람직한 항체는 키메라 또는 사람화 항체[문헌 참조: Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 및 국제 공개공보 제WO 90/07861호, 미국 특허 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,585,089호, 제5,530,101호 및 제5,225,539호(Winter)] 또는 사람[문헌 참조: 국제 공개공보 제WO93/12227호(1993); 미국 특허 제5,877,397호, 제5,874,299호, 제5,814,318호, 제5,789,650호, 제5,770,429호, 제5,661,016호, 제5,633,425호, 제5,625,126호, 제5,569,825호, 제5,545,806호; Nature 148, 1547-1553 (1994); Nature Biotechnology 14, 826 (1996); 국제 공개공보 제WO 91/10741호(1991)]이다. 항체를 사람화하기 위한 대체 접근법(베니어링(veneering)으로서도 또한 공지됨)은 미국 특허 제6,797,492호에 기재되어 있다. 상이한 결합 특이성을 갖는 수개의 마우스 항체는 사람화 항체를 제조하기 위한 출발물질로서 이용가능하다.
대표적인 사람화 항체는 사람화 버전 7D8 항체(ATCC 수탁번호 PTA-9468), 사람화 버전 7D29 항체, 사람화 버전 7D19 항체, 사람화 버전 7D47 항체, 사람화 버전 7D39 항체, 사람화 버전 7D66 항체, 사람화 버전 8G9 항체, 사람화 버전 8G3 항체, 사람화 버전 8G4 항체, 사람화 버전 8G51 항체, 사람화 버전 8G22 항체, 사람화 버전 8G30 항체, 사람화 버전 8G46 항체, 사람화 버전 2A4 항체(ATCC 수탁번호 PTA-9662), 사람화 버전 2A20 항체, 사람화 버전 2A44 항체, 사람화 버전 2A77 항체, 사람화 버전 2A13 항체 및 사람화 버전 2A14 항체이다. 7D8 항체(JH80 7D8.29.19.47) 및 2A4 항체(JH80 2A4.20.44077)를 생산하는 하이브리도마는 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약("부다페스트 조약")의 규정 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; 현재 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801에 소재)에 각각 2008년 9월 4일자 및 2008년 12월 17일자로 기탁되었다. ATCC는 7D8을 생산하는 하이브리도마에 ATCC 수탁번호 PTA-9468을 부여하고 2A4를 생산하는 하이브리도마에 ATCC 수탁번호 PTA-9662를 부여하였다.
사람 이소타입 IgG1은 식세포 상의 FcRI 수용체에 대한 사람 이소타입의 친화도가 최대이기 때문에 AA의 C 말단 영역에 대한 항체에 바람직하다. 일부 항체는 결합 친화도가 약 107, 108, 109 또는 1010M-1 이상인 AA와 특이적으로 결합한다.
AA의 단편에 의한 능동 면역화는 항체의 수동 투여와 병용할 수 있다. 특정 조합의 예로는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 71-76 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 72-76 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 73-76 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 74-76 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 70-75 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 70-74 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 70-73 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 70-72 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 71-75 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; AA 단편 HAA1 알파 이소형태 잔기 72-75 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 73-75 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 73-75 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 71-74 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 71-73 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편; HAA1 알파 이소형태 잔기 72-74 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체를 갖는 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76을 포함하는 AA 단편이 포함된다. 추가로, HAA1 알파 이소형태 잔기 71-76, 72-76, 73-76, 74-76, 70-75, 70-74, 70-73, 70-72, 71-75, 72-75, 73-75, 71-74, 71-73, 72-74를 포함하는 AA 단편은 HAA1 알파 이소형태 잔기 71-76, 72-76, 73-76, 74-76, 70-75, 70-74, 70-73, 70-72, 71-75, 72-75, 73-75, 71-74, 71-73, 72-74 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체와 배합될 수 있다. HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76, HAA1 베타 이소형태 잔기 70-76, HAA1 감마 이소형태 잔기 70-76, HAA2 알파 및 베타 이소형태 잔기 70-76, MAA1 잔기 69-75, MAA2 잔기 69-75 또는 MAA3 잔기 62-68을 포함하는 AA 단편은 HAA1 알파 이소형태 잔기 70-76, HAA1 베타 이소형태 잔기 70-76, HAA1 감마 이소형태 잔기 70-76, HAA2 알파 및 베타 이소형태 잔기 70-76, MAA1 잔기 69-75, MAA2 잔기 69-75 또는 MAA3 잔기 62-68 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체와 배합될 수 있다.
상기 기재된 항체의 일부는 단량체 또는 전구체 형태의 아밀로이드 단백질과 특이적으로 결합하지 않는다. 이러한 항체의 일부는 아밀로이드 단백질을 야기하는 전구체 단백질의 분해에 의해 생성된 네오에피토프와 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 일부 항체는 마우스 AA 원섬유 HEDT(서열번호 12)의 C 말단 잔기와 특이적으로 결합하지만, SAA(GHEDTMADQE, 서열번호 61)의 비아밀로이드 부분으로 연장되는 펩타이드와 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 항체는 형태적 에피토프와 특이적으로 결합한다. 이러한 형태적 에피토프의 일부는 선형이다. 이러한 형태적 에피토프의 일부는 아밀로이드 단백질이 응집(원섬유) 구조에 도입되거나 부분 변성되는 경우에 노출된다. 이러한 항체의 예로는 쥐 모노클로날 항체 2A4 (ATCC 수탁번호 PTA-9662), 8G9 (ATCC 수탁번호 ) 및 7D8 (ATCC 수탁번호 PTA-9468), 이들의 사람, 사람화 및 키메라 형태, 2A4, 8G9 또는 7D8과 동일한 에피토프와 특이적으로 결합하는 기타 항체, 및 임의의 이들 항체의 항원 결합 단편이 포함된다. 일부 항체는 아미노산 서열 ED를 포하하는 아밀로이드 단백질과 특이적으로 결합한다. 일부 항체는 면역글로불린 결쇄 단백질, 사람 췌도 아밀로이드 전구체 폴리펩타이드(IAPP), 베타 아밀로이드 펩타이드, 트랜스티레틴(TTR) 및 ApoA1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아밀로이드 단백질과 특이적으로 결합한다.
염기성 항체 구조 단위는 아단위의 사량체를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 사량체는 동일한 2쌍의 폴리펩타이드 쇄로 이루어지고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카복시 말단 부분은 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 영역으로 정의한다.
1. 항체
본 발명은 완전한 항체 및 항원 결합 항체 단편, 페길화 항체 및 항체 단편, 효과기 기능이 변경된(예를 들어, 감소 또는 제거됨) 항체, 예를 들어, Fc 영역에서 돌연변이 또는 치환된 잔기를 포함하는 항체를 포함한다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 예로는 F(ab) 및 F(ab')2 트리-Fab', Fab', Fv, scFv, 디-Fab' 단편이 포함되며, 이들은 항체를 펩신과 같은 효소로 처리하여 생성되거나 당업계에 공지된 재조합 조작 기술에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 항체에 대한 추가의 항원 결합 단편은 페길화 항체 단편, 예를 들어, 페길화(PEGylated) Fab' 및 페길화 디-Fab'를 포함하는 치료 항체 단편을 포함한다. 효과기 기능 돌연변이의 예로는 미국 특허 제5,624,821호에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본원에 참조로 인용된다. 일부 항체는 Fc 감마 RI 수용체에 대한 결합 친화도를 감소시킨다. 효과기 기능 돌연변이 항체는 경첩 영역에서 돌연변이를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 돌연변이체 IgG 항체는 중쇄 불변 영역에서의 돌연변이를 위치 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322 중의 하나 이상에서 포함한다. 일부 항체에서, 하나 이상의 잔기 234, 236 및 237은 알라닌으로 치환된다. 일부 항체에서, 잔기 235는 글루타민으로 치환된다. 일부 항체에서, 잔기 297은 알라닌으로 치환된다. 일부 항체에서, 잔기 318, 320 및 322는 알라닌으로 치환된다. 일부 항체에서, 잔기 318은 발린으로 치환된다. 일부 항체에서, 잔기 322는 글루타민으로 치환된다. 효과기 기능을 강화시킨 항체는 항체 단일 S239D 및 I332E 및 이중 및 삼중 돌연변이체 S239D/I332E 및 S239D/I332E/A330L(캐뱃 넘버링)을 포함한다.
2. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 적합한 개체를 면역원으로 면역화시킴으로써 상기 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 면역화 피험자의 항체 역가는 표준 기술, 예를 들어, 효소결합 면역흡착 측정법(ELISA)에 의해 시간에 따라 모니터링할 수 있다. 경우에 따라, 표적 항원에 대하여 유도된 항체 분자는 포유동물(예를 들어, 혈액)로부터 분리될 수 있으며, 추가로 널리 공지된 기술, 예를 들어, 단백질 A 세파로스 크로마토그래피로 정제하여 항체, 예를 들어, IgG 분획을 수득할 수 있다. 면역화 후 적절한 시간, 예를 들어, 항 항원 항체 역가가 최대일 때, 항체 생산 세포를 개체로부터 수득하여 표준 기술, 예를 들어, 문헌[참조: Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497; Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem .255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; 및 Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75)]에 최초로 기재되어 있는 하이브리도마 기술에 의해 모노클로날 항체를 제조하는 데 사용할 수 있다. 키메라 폴리클로날 항체의 제조는 미국 특허 제6,420,113호(Buechler et al)에 기재되어 있다.
3. 모노클로날 항체
림프구와 무한증식 세포주를 융합하는데 사용되는 널리 공지된 다수의 프로토콜 중의 임의의 프로토콜[예를 들어, 문헌 참조: G. Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Gefter et al. Somatic Cell Genet., 상기 인용됨; Lerner, Yale J. Biol. Med., 상기 인용됨; Kenneth, Monoclonal Antibodies, 상기 인용됨]이 모노클로날 항체를 생산하기 위해 적용될 수 있다. 더욱이, 당업자는 유용할 수도 있는 이러한 방법의 다수의 변형이 존재함을 인식할 것이다. 통상적으로, 무한증식 세포주(예를 들어, 골수종 세포주)는 림프구와 동일한 포유동물 종으로부터 유도된다. 예를 들어, 쥐 하이브리도마는 본 발명의 면역원성 제조 방법에 의해 면역화된 마우스로부터 유래된 림프구를 무한증식 마우스 세포주와 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 바람직한 무한증식 세포주는 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")을 함유하는 배지에 민감한 마우스 골수종 세포주이다. 다수의 골수종 세포주 중의 임의의 세포주가 표준 기술, 예를 들어, P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주에 따라 융합 파트너로서 사용될 수 있다. 이러한 골수종 세포주는 ATCC로부터 입수가능하다. 통상적으로, HAT 민감성 마우스 골수종 세포는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")을 사용하여 마우스 비장 세포에 융합될 수 있다. 이어서, 융합으로부터 생성된 하이브리도마 세포는 HAT 배지를 사용하여 선택되며, 이러한 배지는 융합되지 않은 골수종 세포 및 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 사멸시킨다(융합되지 않은 비장 세포는 형질전환되지 않기 때문에 수일 후 사멸한다). 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 표준 ELISA 검정법을 사용하여 표적 항원과 결합하는 항체에 대한 하이브리도마 배양물 상청액, 예를 들어, Aβ를 스크리닝함으로써 검지된다.
4. 재조합 항체
모노클로날 항체 분비성 하이브리도마를 다른 방법으로 제조하기 위해, 재조합 복합 면역글로불린 라이브러리(예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 표적 항원에 의해 스크리닝하여 표적 항원과 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 분리함으로써 모노클로날 항체를 확인하고 분리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 키트는 시판중이다[예를 들어, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP™ Phage Display Kit, Catalog No. 240612]. 추가로, 항체 디스플레이를 생성하고 스크리닝하는데 사용하기 위해 특히 적합한 방법 및 시약의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호(Ladner et al.), 국제 공개공보 제WO 92/18619호(Kang et al.), 제WO 91/17271호(Dower et al.), 제WO 92/20791호(Winter et al.), 제WO 92/15679호(Markland et al.), 제WO 93/01288호(Breitling et al.), 제WO 92/01047호(McCafferty et al.), 제WO 92/09690호(Garrard et al.), 제WO 90/02809호(Ladner et al.) 및 문헌[참조: Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; 및 McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554]에서 발견될 수 있다.
5. 키메라 및 사람화 항체
추가로, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있는 사람과 비-사람 부분을 모두 포함하는 재조합 항체, 예를 들어, 키메라 및 사람화 모노클로날 항체는 본 발명의 범위 내에 있다.
용어 "사람화 면역글로불린" 또는 "사람화 항체"란 하나 이상의 사람화 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 하나 이상의 사람화 경쇄 또는 중쇄)를 포함하는 면역글로불린 또는 항체를 의미한다. 용어 "사람화 면역글로불린 쇄" 또는 "사람화 항체 쇄"(즉, "사람화 면역글로불린 경쇄" 또는 "사람화 면역글로불린 중쇄")란 사람 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 가변 골격 영역과, 비-사람 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 상보성 결정 영역(CDR)(예를 들어, 하나 이상의 CDR, 바람직하게는 2개 이상의 CDR, 더욱 바람직하게는 3개 이상의 CDR)을 포함하고, 불변 영역(예를 들어, 경쇄의 경우 하나 이상의 불변 영역 또는 이의 부분, 및 중쇄의 경우 3개 이상의 불변 영역)을 추가로 포함하는 가변 영역을 갖는 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 각각 경쇄 또는 중쇄)를 의미한다. 용어 "사람화 가변 영역"(예를 들어, "사람화 경쇄 가변 영역" 또는 "사람화 중쇄 가변 영역")이란 사람 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 가변 골격 영역과, 비-사람 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역을 의미한다.
표현 "사람 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로" 또는 "실질적으로 사람"이란, 영역이, 비교 목적으로 사람 면역글로불린 또는 항체 아미노 서열에 대하여 정렬되는 경우, 사람 골격 또는 불변 영역 서열과 적어도 80 내지 90%, 90 내지 95% 또는 95 내지 99%의 동일성(즉, 국소 서열 동일성)을 공유하고, 예를 들어, 보존적 치환, 공통 서열 치환, 배선 치환, 역돌연변이 등을 허용함을 의미한다. 보존적 치환, 공통 서열 치환, 배선 치환, 역 돌연변이 등의 도입은 종종 사람화 항체 또는 쇄의 "최적화"를 의미한다. 표현 "비-사람 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로" 또는 "실질적으로 비-사람"이란 비-사람 생물체, 예를 들어, 비-사람 포유동물의 서열과 적어도 80 내지 95%, 바람직하게는 적어도 90 내지 95%, 더욱 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 면역글로불린 또는 항체 서열을 가짐을 의미한다.
따라서, CDR을 제외하고, 사람화 면역글로불린 또는 항체, 또는 사람화 면역글로불린 또는 항체 쇄의 모든 영역 또는 잔기는 하나 이상의 원래 사람 면역글로불린 서열의 상응하는 영역 또는 잔기와 실질적으로 동일하다. 용어 "상응하는 영역" 또는 "상응하는 잔기"란 제1 서열 및 제2 서열이 비교 목적으로 최적으로 정렬되는 경우 제1 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 상의 영역 또는 잔기와 동일한(즉, 등가) 위치를 점유하는 제2 아미노산 또는 뉴클레로타이드 서열 상의 영역 또는 잔기를 의미한다.
용어 "현저한 동일성"이란 2개의 폴리펩타이드 서열이, 예를 들어, GAP 또는 BESTFIT 프로그램(디폴트 갭 가중치 이용)에 의해 최적으로 정렬되는 경우, 적어도 50 내지 60%, 바람직하게는 적어도 60 내지 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 70 내지 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 80 내지 90%, 더더욱 바람직하게는 적어도 90 내지 95%, 더더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상(예를 들어, 99% 이상)의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 용어 "실질적 동일성"이란 용어는 2개의 폴리펩타이드 서열이, 예를 들어, GAP 또는 BESTFIT 프로그램(디폴트 갭 가중치 이용)에 의해 최적으로 정렬되는 경우, 적어도 80 내지 90%, 바람직하게는 적어도 90 내지 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상(예를 들어, 99% 이상)의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 서열 비교의 경우, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열과 비교하는 참조 서열(reference sequence)로서 작용을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하면, 하위서열 좌표가 지정되고, 필요에 따라, 서열 알고리즘 프로그램 매개 변수가 지정된다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 참조 서열에 대한 시험 서열(들)의 % 서열 동일성을 지정된 프로그램 매개 변수를 기준으로 하여 계산한다.
비교용 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, 문헌[참조: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[참조: Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[참조: Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 탐색법, 상기 알고리즘의 컴퓨터 실행(Wisconsin Genetics Software Package 중의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 미국 위스콘신주 매디슨 575 사이언스 드라이브 소재의 Genetics Computer Group), 또는 육안 관찰[문헌 참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology]에 의하여 수행될 수 있다. % 서열 동일성 및 서열 유사성을 측정하는데 적합한 알고리즘의 일례로는 문헌[참조: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)]에 기재되어 있는 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석법을 실행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터(NCBI)를 통해 공중이 이용가능하다(미국 국립 보건원(NIH) NCBI 인터넷 서버를 통해 공중이 이용가능하다). 통상적으로, 디폴트 프로그램 매개 변수는 서열 비교를 수행하기 위하여 사용될 수 있으나, 조정된 매개 변수도 사용될 수 있다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트값으로서, 단어 길이(W) = 3, 기대치(E) = 10 및 BLOSUM62 점수화 행렬(scoring matrix)[문헌 참조: Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)]을 사용한다.
바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. 아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적으로 분류할 목적으로, 아미노산은 다음과 같은 그룹으로 분류된다: 그룹 I(소수성 측쇄): leu, met, ala, val, leu, ile; 그룹 II(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III(산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V(쇄 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 부류의 아미노산 사이에서 일어나는 치환과 관련된다. 비보존적 치환은 상기 부류 중 하나에 속하는 구성원을 다른 부류에 속하는 구성원으로 교환하는 것으로 구성된다.
바람직하게는, 사람화 면역글로불린 또는 항체는 상응하는 비-사람화 항체의 친화도의 3, 4 또는 5의 인자 내에 존재하는 친화도를 갖는 항원과 결합한다. 예를 들어, 비-사람화 항체가 결합 친화도가 10-9M인 경우, 사람화 항체는 결합 친화도가 3 x 10-8M, 4 x 10-8M, 5 x 10-8M 또는 10-9M 이상이다. 면역글로불린 또는 항체 쇄의 결합 특성을 기술하는 경우, 쇄는 "직접 항원(예를 들어, Aβ) 결합"에 대한 능력에 기초하여 기재될 수 있다. 쇄는, 완전한 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)에 대하여 특이적 결합 특성 또는 결합 친화도를 부여하는 경우, "직접 항원 결합"이라고 한다. 돌연변이(예를 들어, 역돌연변이)는, 돌연변이가 결여된 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친화도와 비교하여 적어도 크기의 순서로 상기 쇄를 포함하는 완전한 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친화도에 영향을 미치는(예를 들어, 감소시키는) 경우, 중쇄 또는 경쇄의 항원 결합 유도 능력에 실질적으로 영향을 미친다고 한다. 돌연변이는, 돌연변이가 결여된 쇄를 포함하는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친화도의 2, 3 또는 4의 인자로 상기 쇄를 포함하는 완전한 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친화도에 영향을 미치는(예를 들어, 감소시키는) 경우, "쇄의 항원 결합 유도 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는다".
용어 "키메라 면역글로불린" 또는 항체란 가변 영역이 제1 종으로부터 유래하고 불변 영역이 제2 종으로부터 유래하는 면역글로불린 또는 항체를 의미한다. 키메라 면역글로불린 또는 항체는 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 분절로부터, 예를 들어, 유전자 조작에 의해 제작될 수 있다. 용어 "사람화 면역글로불린" 또는 "사람화 항체"는 하기에 정의된 바와 같이 키메라 면역글로불린 또는 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 사람화 면역글로불린 또는 항체가 구성에서 키메라이지만(즉, 하나 이상의 종의 단백질로부터 유래한 영역을 포함함), 이들은 본원에 정의된 바와 같이 키메라 면역글로불린 또는 항체에서 발견되지 않는 추가의 특징(즉, 공여체 CDR 잔기 및 어셉터 골격 잔기를 포함하는 가변 영역)을 포함한다.
이러한 키메라 및 사람화 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술, 예를 들어, 국제 출원 제PCT/US86/02269호(Robinson et al.); 유럽 특허원 제184,187호(Akira, et al.), 제171,496호(Taniguchi, M.), 제173,494호(Morrison et al.); 국제 공개공보 제WO 86/01533호(Neuberger et al.); 미국 특허 제4,816,567호(Cabilly et al.); 유럽 특허원 제125,023(Cabilly et al.); 미국 특허 제5,225,539호(Winter); 및 문헌[참조: Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 및 Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060]에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 치료제는 또한 항체 모방물, 예를 들어, 상보성 측정 영역(CDR) 모방물을 포함한다.
6. 유전자도입 동물로부터 유래한 사람 항체 및 파지 디스플레이
또는, 면역화에 의해 외생성 면역글로불린을 생산하지 않는 사람 항원의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자도입 동물(예를 들어, 마우스)을 생산할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동형접합 결손은 내생성 항체 생산을 완전히 억제하는 것으로 기술되었다. 이러한 배선 돌연변이 마우스에서 사람 배선 면역글로불린 유전자 배열의 이동은 항원 도입에 의한 사람 항체의 생산을 야기한다(미국 특허 제6,150,584호, 제6,114,598호 및 제5,770,429호 참조).
완전한 사람 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유도될 수도 있다[문헌 참조: Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]. 키메라 폴리클로날 항체도 또한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유도될 수 있다(미국 특허 제6,420,113호(Buechler et al.)).
7. 이중특이적 항체, 항체 융합 폴리펩타이드 및 단일 쇄 항체
이중특이적 항체(BsAb)는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이러한 항체는 전체 길이의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab)'2 이중특이적 항체))로부터 유래한다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전체 길이의 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다[문헌 참조: Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 조합 때문에, 이러한 하이브리도마(콰드로마)는 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산한다[문헌 참조: 국제 공개공보 제WO 93/08829호 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)].
이중특이성 항체는 또한 가교결합 항체 또는 "헤테로접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로접합체에서 항체의 하나는 아비딘과 커플링될 수 있고, 다른 하나는 비오틴 또는 기타 페이로드(payload)와 커플링될 수 있다. 헤테로접합체 항체는 통상적인 임의의 가교결합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있으며, 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
또 다른 양태에서, 항체는 반응성의 검출성 또는 기능성 잔기, 예를 들어, 면역독소와 같은 페이로드에 화학적으로 또는 유전학적으로 융합되어 항체 융합 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 이러한 페이로드로는, 예를 들어, 면역독소, 화학요법제 및 방사성 동위원소가 포함되며, 이들 모두는 당업계에 널리 공지되어 있다.
단일 쇄 항체는 또한 본 발명에 따른 안정화에 적합하다. 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, 상기 링커는 각각의 가변 영역을 서로 접속하게 하여 VL 및 VH 영역이 유래되는 모 항체의 항원 결합 포켓(pocket)을 재현한다[문헌 참조: Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)].
전술한 임의의 폴리펩타이드 분자 단독 또는 배합물은 본 발명에 따른 안정화 제형으로서 제조하기에 적합한 것으로 이해된다.
XI. 치료가능한 개체
치료 가능한 개체 또는 환자는 질병의 위험이 있지만 증상이 나타나지 않은 개체 및 현재 증상이 나타난 환자를 포함한다. 그러므로, 본 발명의 방법은 대상 환자의 위험도에 대한 임의의 평가를 필요로 하지 않는 일반적인 집단에 예방적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 공지된 유전적 위험 자가면역 장애를 갖고 있는 개체에 특히 유용하다. 이러한 개체는 상기 질병을 겪고 있는 친척이 있는 개체 및 유전학적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 위험도가 측정되는 개체를 포함한다.
AA 아밀로이드증을 앓고 있는 환자는 연장된 시간 동안 증상이 없을 수 있다. 따라서, AA 아밀로이드증의 임상적 진단은 아밀로이드 침착물이 광범위해질 때까지 종종 지연되거나 누락될 수 있다. 증상이 있는 환자의 경우, 환자의 53% 만이 진단되는 것으로 추정된다[문헌 참조: L.E.K. Consulting, Independent Market Research (2003)].
본 발명은 아밀로이드 단백질의 침착을 특징으로 하는 질병, 예를 들어, 표 1에 열거된 질병을 포함하는 상기 기재된 질병을 치료하거나 예방하는데 유용한 방법을 제공한다. 일부 방법은 아미노산 서열 ED를 포함하는 아밀로이드 단백질의 침착을 특징으로 하는 질병을 치료하거나 예방하는데 유용하다. 일부 방법에서, 아밀로이드 단백질이 아미노산 서열 AEDV를 포함하는 경우, 항체는 알츠하이머병 또는 경도 인지 장애를 치료하거나 예방하기 위해 투여되지 않는다. 아밀로이드 단백질은 표 1에 열거된 것, 예를 들어, Vλ6 Wil 또는 Vκ, 사람 췌도 아밀로이드 전구체 폴리펩타이드(IAPP), 베타 아밀로이드 단백질, 트랜스티레틴(TTR) 또는 ApoA1을 포함하는 상기 기재된 임의의 아밀로이드 단백질일 수 있다.
본 발명의 방법은 AA 아밀로이드증 또는 AL 아밀로이드증의 공지된 위험도를 갖거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 이로 진단된 개체에 특히 유용하다. 이러한 개체는 만성 염증성 질환, 유전성 염증성 질환 및 만성 미생물 감염, 예를 들어, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선성 관절병증, 라이터 증후군, 성인 스틸병, 베체트 증후군, 크론병, 가족성 지중해 열, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창, 만성 신우신염, 골수염, 휘플병, 골수종, 고분자글로불린혈증, 면역세포 질환, 모노클로날 감마병증 및 잠재 질환을 갖는 개체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 만성 염증성 및 감염성 질환은 AA 아밀로이드증의 진행에 대한 전제조건이고, 국소 결절성 아밀로이드증에 의해 발생된 AL 아밀로이드증은 만성 염증성 질환과 관련될 수 있다. AA 아밀로이드증의 공지된 위험도를 갖는 개체는 또한 호지킨 림프종, 신장 암종, 장, 폐 및 비뇨생식기관 암종, 기저 세포 암종 및 모상 세포 백혈병을 갖는 개체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 추가로, AA 아밀로이드증의 공지된 위험도를 갖는 개체는 또한 림프구 증식성 장애, 예를 들어, 캐슬만병을 갖는 개체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
무증상 및 증상 환자 모두에서, 치료는 근본적인 AA 또는 AL 아밀로이드 질환의 진단 전 또는 후 어느 때라도 시작할 수 있다. 치료는 통상적으로 기간에 따른 다중 복용량을 수반한다. 치료는 치료제에 대한 항체, 활성화 T 세포(부작용) 또는 B 세포 반응(예를 들어, AA 펩타이드)을 분석하거나 시간에 따른 방사성 표지된 SAP 섬광조영술을 적용함으로써 모니터링할 수 있다. 반응이 감소하는 경우, 추가 복용량이 필요하다.
XII. 치료 요법
일반적으로, 치료 요법은 아밀로이드 단백질, 바람직하게는 응집된 형태의 아밀로이드 단백질, 예를 들어, AA 또는 AL에 대한 면역원성 반응을 유도하는데 효과적인 제제를 투여함을 포함한다. 바람직하게는, AA 또는 AL의 면역원성 단편 또는 X1EDX2 단편은 환자에 투여된다. 예방 용도에서, 약제학적 조성물 또는 약제는 아밀로이드증, 예를 들어, AA 아밀로이드증 또는 AL 아밀로이드증에 걸리기 쉽거나 이의 위험에 있는 환자에게 이러한 위험을 제거 또는 감소시키거나, 중증도를 완화시키거나, 질병의 생리학적, 생화학적, 조직학적 및/또는 행동 증상, 질병의 진행 동안 나타나는 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하는 질병의 발생을 지연시키는데 충분한 양으로 투여된다. 치료 용도에서, 제제는 질병의 진행 동안 나타나는 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하는 질병의 증상(생리학적, 생화학적, 조직학적 및/또는 행동)을 치료하거나, 적어도 부분적으로 저지하거나, 이의 악화를 억제하기에 충분한 제제의 투여 용량 및 투여 빈도를 포함하는 요법에서 이러한 질환을 앓고 있는 것으로 의심되거나 이미 앓고 있는 환자에 투여된다. 일부 방법에서, 제제의 투여는 특징적인 AA 또는 AL 아밀로이드증 병리학이 발생하지 않은 환자에서 조기에 증상을 감소 또는 제거한다. 치료 또는 예방을 달성하는데 적절한 양은 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 정의한다. 치료 또는 예방을 달성하는데 적절한 양과 투여량 빈도의 조합은 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인 요법으로 정의한다. 예방 및 치료 요법 모두에서, 제제는 일반적으로 충분한 면역 반응이 달성될 때까지 수개의 투여량으로 투여된다. 치료 또는 예방을 달성하는데 적절한 투여 용량 및 빈도는 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적인 요법으로 정의한다. 통상적으로, 환자의 면역 반응을 모니터링하고, 면역 반응이 감소하기 시작하는 경우에는 반복 투여량을 제공한다. 면역 반응은 환자의 혈액 중에서, 예를 들어, AA 또는 AL에 대한 항체를 검출하거나, 예를 들어, AA 또는 AL의 수준을 검출함으로써 모니터링할 수 있다.
상기 기재된 질환의 치료를 위한 본 발명의 제제 및 조성물의 유효량은 누여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 사람인지 또는 동물인지 여부, 투여되는 다른 약제, 및 치료인지 예방인지 여부를 포함하는 다수의 다양한 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 환자는 사람이지만, 유전자도입 포유동물을 포함하는 비-사람 동물도 또한 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 필요가 있다. 면역원의 양은 애주번트가 투여되는지 여부에 좌우되며, 애주번트가 부재한 경우에는 높은 투여량이 요구된다. 면역원의 투여량은 통상적으로 환자당 1 내지 500μg, 더욱 일반적으로 사람 투여용 주사당 5 내지 500μg로 다양하다. 종종, 주사당 1 내지 2mg의 고용량을 사용한다. 통상적으로, 각각의 사람 주사를 위해 적어도 10, 20, 50 또는 100μg을 사용한다. 면역원의 질량은 또한 대체적으로 면역원의 질량에 대한 면역원 내의 면역원성 에피토프의 질량비에 좌우된다. 통상적으로, 10-3 내지 10-5μmol의 면역원성 에피토프를 면역원성의 μg을 위해 사용된다. 주사 시기는 1일 1회 내지 1년 1회 또는 10년 1회로 상당히 다양할 수 있다. 면역원의 투여량이 주어지는 임의의 날에, 투여량은 애주번트도 또한 투여되는 경우에는 1μg/환자 이상, 통상적으로 10μg/환자 이상이며, 애주번트가 부재한 경우에는 10μg/환자 이상, 통상적으로 100μg/환자 이상이다. 통상적인 요법은 면역화 후 시간 간격, 예를 들어, 6주 간격에서 추가 주사로 이루어진다. 또 다른 요법은 면역화 후 1, 2 및 12개월 뒤 추가 주사로 이루어진다. 또 다른 요법은 생존 동안 2개월 마다 주사를 수반한다. 또는, 추가 주사는 면역 반응을 모니터링함으로써 권고되는 불규칙적인 근거에 있을 수 있다.
면역원을 암호화하는 핵산에 대한 용량은 환자당 약 10ng 내지 1g, 100ng 내지 100mg, 1μg 내지 10mg, 또는 30 내지 300μg DNA이다. 감염성 바이러스 벡터에 대한 용량은 용량당 10 내지 100비리온 이상으로 다양하다.
항체에 의한 수동 면역화의 경우(병용 요법에서), 투여량은 숙주 체중 1kg당 0.0001 내지 100mg/kg, 0.5 내지 5mg/kg 미만, 더욱 일반적으로 0.01 내지 5mg/kg, 0.5 내지 3mg/kg이다. 예를 들어, 투여량은 체중 1kg당 1㎎ 또는 10㎎, 또는 1 내지 10mg, 환원하자면, 70kg 환자의 경우, 각각 70mg 또는 700mg, 또는 70 내지 700mg일 수 있다. 추가의 예로서, 투여량은 체중 1kg당 5mg 미만, 또는 1.5mg, 또는 0.5 내지 1.5mg, 바람직하게는 1.5mg 이상일 수 있다. 치료 요법의 예로는 2주에 1회 또는 매월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2 이상의 모노클로날 항체를 동시에 투여하며, 이 경우 투여되는 각각의 항체의 투여량은 지정된 범위 내에 속한다. 항체는 일반적으로 수회 투여한다. 단일 투여량 사이의 간격은 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자의 AA에 대한 항체의 혈중 수준을 측정하여 제시된 대로 불규칙할 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 1 내지 1000μg/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조절되며, 일부 방법에서는 25 내지 300μg/ml이다. 또는, 지속 방출형 제형으로서 항체를 투여할 수 있으며, 이 경우 투여 빈도를 줄인다. 용량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 사람 항체가 최장 반감기를 나타내고, 그 다음은 사람화 항체, 키메라 항체 및 비-사람 항체의 순이다. 투여 용량 및 빈도는 치료가 예방용인지 치료용인지 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방 용도에서, 장기간에 걸쳐 비교적 간격을 크게 하여 비교적 낮은 용량을 투여한다. 일부 환자는 남은 일생 동안 계속 치료받는다. 치료 용도에서, 질병의 진행이 감소되거나 또는 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질병 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 나타낼 때까지, 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 용량을 필요로 한다. 이후, 환자는 예방 요법을 투여받을 수 있다.
면역 반응을 유도하는 제제는 예방 및/또는 치료를 위해 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 복강내, 비강내 또는 근육내 수단으로 투여할 수 있다. 면역원성 제제의 가장 통상적인 투여 경로는 피하이지만, 다른 경로도 동등하게 효과적이다. 다음으로 가장 흔한 경로는 근육내 주사이다. 이러한 유형의 주사는 팔 또는 다리 근육에 실시하는 것이 가장 일반적이다. 일부 방법에서, 침착물이 축적되는 특정 조직에 제제를 직접 주사, 예를 들어, 두개내 주사한다. 근육내 주사 또는 정맥내 주입은 항체 투여용으로 바람직하다(병용 요법에서). 일부 방법에서, 특정 치료 항체를 두개 내로 직접 주사한다. 일부 방법에서, 항체는 서방형 조성물 또는 장치, 예를 들어, MEDIPAD™ 장치로서 투여한다.
본 발명의 제제는 활성 치료제 및 다양한 기타 약제학적으로 허용되는 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서 종종 투여된다[문헌 참조: Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980)]. 바람직한 형태는 투여의 의도된 방식 및 치료 용도에 좌우된다. 조성물은 또한 목적하는 제형에 따라 약제학적으로 허용되는 무독성 담체 또는 희석제를 포함하며, 이들은 동물 또는 사람 투여용 약제학적 조성물을 제형화하는데 일반적으로 사용되는 비히클로서 정의된다. 희석제는 배합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예로는 증류수, 생리학적 포스페이트 완충 염수, 링거 용액, 덱스트로오스 용액 및 행크 용액이 있다. 추가로, 약제학적 조성물 또는 제형은 기타 담체, 보조제 또는 무독성, 비치료용, 비면역원성 안정화제 등을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 크고 서서히 대사되는 거대 분자, 예를 들어, 단백질, 다당류, 예를 들어, 키토산, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(예를 들어, 라텍스 관능화된 세파로스(SEPHAROSETM), 아가로스, 셀룰로오스 등), 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 지질 응집물(예를 들어, 오일 점적제 또는 리포솜)을 포함할 수 있다. 추가로, 이들 담체는 면역자극제(즉, 애주번트)로서 작용할 수 있다.
비경구 투여의 경우, 본 발명의 제제는 물, 오일, 염수, 글리세롤 또는 에탄올 등의 멸균액일 수 있는 약제학적 담체와 함께 생리학적으로 허용되는 희석제 중의 물질의 용액 또는 현탁액의 주사용 투여량으로 투여될 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등이 조성물에 존재할 수 있다. 약제학적 조성물의 기타 성분은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유 및 미네랄유이다. 일반적으로, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 특히 주사용 용액으로 바람직한 액체 담체이다. 활성 성분의 지속 방출을 허용하는 방식으로 제형화할 수 있는 데포 주사 또는 이식 제제의 형태로 항체를 투여할 수 있다. 조성물의 예로는 50mM L-히스티딘, 150mM NaCl로 구성되고 HCl로 pH 6.0으로 조정한 수성 완충액 중에서 제형화된 모노클로날 항체 5㎎/㎖를 포함한다. 비경구 투여용 조성물은 통상적으로 실질적으로 멸균성 등장성이며 FDA 또는 유사 기관의 GMP 조건 하에 제조된다.
통상적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 주사가능하게 제조하며, 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로 제조할 수 있다. 제제는 상기 논의된 바와 같이 유화되거나, 또는 리포솜 또는 마이크로 입자, 예를 들어, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드 또는 애주번트 효과 강화용 공중합체에 캡슐화될 수 있다[문헌 참조: Langer, Science 249, 1527(1990); 및 Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119(1997)]. 본 발명의 제제는 활성 성분의 지속 방출 또는 맥박 방출(pulsatile release)을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사 또는 이식 제제의 형태로 투여할 수 있다.
기타 투여 방식에 적합한 추가의 제제는 경구, 비강내, 폐용 제형, 좌제 및 경피용 용도가 포함된다.
좌제의 경우, 결합제 및 담체는, 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하며, 이러한 좌제는 0.5 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2% 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구용 제형은 부형제, 예를 들어, 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로오스 및 탄산마그네슘을 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 지속 방출형 제형 또는 분말의 형태를 취할 수 있으며, 활성 성분을 10 내지 95%, 바람직하게는 25 내지 70%를 포함한다.
국소 용도는 경피 또는 피내 전달을 야기할 수 있다. 콜레라 독소 또는 해독 유도체 또는 이의 아단위 또는 기타 유사한 세균 독소와 상기 제제를 동시투여하여 용이하게 국소 투여할 수 있다[문헌 참조: Glenn et al., Nature 391, 851(1998)]. 화학적 가교결합 또는 융합 단백질로서의 발현에 의해 수득된 혼합물 또는 결합 분자로서 성분을 사용하여 동시 투여할 수 있다.
또는, 경피 전달은 피부 패치 또는 트랜스퍼로솜(transferosome)을 사용하여 달성할 수 있다[문헌 참조: Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24(1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15(1998)].
XIII. 복합 약물 요법 치료법
본 발명에 따른 병용 용법은 AA 아밀로이드증을 치료하거나 예방하기 위해 단독으로 수행되거나 또 다른 요법과 함께 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 병용 요법은 전술한 아밀로이드 질병, 예를 들어, 염증성 질환, 만성 미생물 감염, 악성 신생물, 유전성 염증성 질병 및 림프구 증식성 장애를 치료하거나 예방하는 또 다른 요법과 함께 수행될 수도 있다. 임상 평가에서 및 임상전 개발에서 상업용으로 이용가능한 다수의 치료가 있으며, 이는 약물 치료와 병행하여 AA 아밀로이드증을 예방하고 치료하기 위해 본원에 개시된 발명을 사용하기 위해 선택된다. 이러한 치료는 몇 개의 주요 카테고리, 즉 (i) 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID; 예를 들어, 데토프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메클로페나메이트, 메페남산, 멜록시캄, 나부메온, 나프록센 나트륨, 옥사프로진, 피록시캄, 설린닥, 톨메틴, 셀레콕십, 로페콕십, 아스피린, 콜린 살리실레이트, 살살테, 및 나트륨 및 마그네슘 살리실레이트); (ii) 스테로이드(예를 들어, 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론); (iii) DMARD, 즉 질병 개질 항류마티스 약물(예를 들어, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 사이클로포스파미드, 하이드록시클로로퀸, 설파살라진, D-페니실아민, 미노실린 및 금); 또는 (iv) 재조합 단백질(예를 들어, ENBREL®(이타너셉트, 가용성 TNF 수용체) 및 REMICADE®(인플릭시맵) 키메라 모노클로날 항 TNF 항체)(이에 한정되지 않음)로부터 선택된 하나 이상의 화합물일 수 있다.
병용 요법의 기간은 전술된 치료 대상 질환의 유형, 연령, 환자의 조건, 환자 질병의 단계 및 유형, 및 환자가 치료에 반응하는 방법에 좌우된다. 의사는 요법의 효과를 긴밀하게 관찰할 수 있고 필요한 임의의 판단을 내릴 수 있다. 추가로, AA 아밀로이드증(예를 들어, 염증성 장애 또는 기타 전술한 질병에 유전적으로 걸리기 쉽거나 이미 걸린 사람) 또는 AL 아밀로이드증을 진행시킬 위험이 큰 사람은 AA AL 응집물, 예를 들어, 원섬유의 진행을 억제하거나 지연시키기 위해 예방 처치를 받을 수 있다.
배합물의 각각의 성분 투여 용량, 투여 빈도 및 투여 방식은 독립적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 하나의 화합물은 1일 3회 경구로 투여될 수 있는 동안, 제2 화합물은 1일 1회 근육내로 투여될 수 있다. 병용 요법은 휴식 기간을 포함하는 온 및 오프 사이클로 주어질 수 있다. 화합물은 또한 함께 제형화되어 1회 투여에 의해 2개의 화합물을 전달할 수 있다. 본 발명의 배합물은 또한 약제학적 팩의 성분으로서 제공될 수도 있다. 약물은 함께 또는 별도로 각각의 투여량으로 제형화될 수 있다. 각각의 화합물은 적합한 담체 물질과 혼합되어 일반적으로 조성물의 총량을 기준으로 1 내지 95중량%의 양으로 존재할 수 있다.
조성물은 경구, 비경구(예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하), 직장, 경피, 비강, 질, 흡입제 또는 안구 투여에 적합한 투여 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 조성물은, 예를 들어, 정제, 캡슐, 환제, 분말, 과립, 현탁액, 유화액, 용액, 하이드로겔을 포함한 겔, 페이스트, 연고, 크림, 플라스터, 드렌치, 전달 장치, 좌제, 관장제, 주사제, 임플란트, 스프레이 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 약제학적 조성물은 통상적인 약제학적 실무에 따라 제형화될 수 있다[예를 들어, 문헌 참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (19th ed.) ed. A. R. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa. and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, N.Y.].
XIV. AA 또는 AL 아밀로이드증의 모니터링 또는 진단 방법
AA 또는 AL 아밀로이드증의 모니터링 또는 진단 방법은 SAA 및 C 반응성 단백질의 혈장 농도를 측정하고 조직 생검(신장, 직장, 위, 잇몸, 지방, 타액, 구순선) 및 콩고 레드 염색에 의한 조직학을 수행하고/하거나 AA 또는 AL 응집물, 예를 들어, 원섬유에 대하여 유도된 특정 항체로 면역 염색함을 포함한다. 본 발명은 AA 아밀로이드증을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 환자에서 AA 펩타이드에 대하여 항체 반응을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 환자에게 투여하는 치료 과정을 모니터링하는데 특히 유용하다. 이러한 방법을 사용하여 증상이 있는 환자에 대한 치료와 증상이 없는 환자에 대한 예방 치료를 모두 모니터링할 수 있다. 일부 방법은 면역원성 제제의 투여량을 투여하기 전에 환자에서 항체 반응의 기준선 값을 측정하고 이를 치료 후에 면역 반응에 대한 값과 비교함을 수반한다. 항체 반응에서 현저한 증가(즉, 동일 샘플의 반복 측정에서 실험적 오차의 통상적인 한계보다 큼, 이러한 측정의 평균으로부터 하나의 표준 편차로서 표현됨)는 양성 치료 결과(즉, 제제의 투여가 면역 반응을 달성 또는 증대시킴)를 나타낸다. 항체 반응에 대한 값이 현저하게 변화하지 않거나 감소한 경우, 음성 치료 결과가 나타난다. 일반적으로, 면역원성 제제로 초기 치료 과정을 진행한 환자는 연속적인 투여에 따라 항체 반응의 증가를 나타낼 것으로 예상되며, 이는 결국 고조기에 도달한다. 제제의 투여는 일반적으로 항체 반응이 증가하는 동안 계속된다. 고조기 도달은 투여된 치료가 투여량 및 빈도에서 중단되거나 감소될 수 있음을 나타내는 지표이다.
다른 방법에서, 항체 반응의 대조값(즉, 평균 및 표준 편차)을 대조군에 대해 측정한다. 통상적으로 대조군에서의 개체는 치료전에 수용되지 않았다. 치료제를 투여한 후에 환자의 항체 반응의 측정값을 대조값과 비교한다. 대조값에 비하여 상당한 증가(예를 들어, 평균으로부터 1 표준 편차 이상)는 양성 치료 결과를 나타낸다. 상당한 증가 또는 감소의 결여는 음성 치료 결과를 나타낸다. 제제의 투여는 일반적으로 항체 반응이 대조값에 비하여 증가하는 동안 계속된다. 전술한 바와 같이, 대조값에 대한 고조기 도달은 치료의 투여가 투여량 및 빈도에서 중단되거나 감소될 수 있음을 나타내는 지표이다.
다른 방법에서, 항체 반응의 대조값(예를 들어, 평균 및 표준 편차)은 치료제로 치료하고 항체 반응이 치료에 반응하여 고조기에 도달한 개체의 대조군으로부터 측정된다. 환자에서 항체 반응의 측정값을 대조값과 비교한다. 환자의 측정 수준이 대조값과 상당히 다르지 않으면(예를 들어, 1 표준 편차 이상), 치료를 중단한다. 환자의 수준이 대조값 이하로 상당히 낮으면, 제제의 연속 투여를 보장한다. 환자의 수준이 대조값 이하로 지속되면, 치료 요법에서의 변화, 예를 들어, 상이한 애주반트, 단편 또는 수동 투여로의 전환의 사용이 권고될 수 있다.
다른 방법에서, 현재 치료를 받지 않지만 이전에 치료 과정을 수행한 환자를, 치료 재개가 필요한지 여부를 결정하기 위해 항체 반응에 대해 모니터링한다. 환자에서 항체 반응의 측정값은 이전의 치료 과정 후에 환자에서 이전에 달성된 항체 반응의 값과 비교할 수 있다. 이전의 측정과 비교하여 상당한 감소(즉, 동일한 샘플의 반복 측정에서 오차의 통상적인 한계보다 큼)는 치료를 재개할 수 있다는 지표이다. 또는, 환자에서의 측정값은 치료 과정을 경험한 후에 환자의 군에서 측정된 대조값(평균 + 표준편차)과 비교할 수 있다. 또는, 환자에서의 측정값은, 질병의 증상이 남아있지 않은 예방학적으로 치료된 환자의 군에서의 대조값과 비교하거나 질병 특성의 개선을 나타내는 치료학적으로 치료된 환자의 군에서의 대조값과 비교할 수 있다. 이들 모든 경우에, 대조 수준과 비교하여 상당한 감소(즉, 표준 편차 이상)는 환자의 치료를 재개해야 함을 나타내는 지표이다.
일부 방법은 요오드 123 표지되거나 요오드 125 표지된 혈청 아밀로이드 P 성분(123I-SAP 또는 125I-SAP) 섬광조영술을 적용한다. 123I-SAP 또는 125I-SAP은 환자에 정맥내 주사되고 감마 카메라로 관찰된다. 방사성 표지된 SAP 섬광조영술은 환자에서 아밀로이드증의 진행을 모니터링하고 치료를 평가하는 유용한 방법이다. 이는 아밀로이드에 특이적이고 환자에서 아밀로이드 침착물의 위치 및 양을 정량적으로 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 123I-SAP 및 125I-SAP는 건강한 개체 또는 비아밀로이드 환자에서 축적되지 않는다. 방사성 표지된 SAP 조영술은 아밀로이드의 역동적 턴오버를 모니터링하는데 사용될 수 있고, 퇴행성 아밀로이드 침착물을 목표로 하는 치료의 효능을 평가할 수 있다. 또한, 방사성 표지된 SAP 섬광조영술은 비침습적이고 전신 스캔을 제공한다. 본 발명의 방법은 제제의 투여량을 투여하기 전에 환자에서 항체 반응의 기준선 값을 측정하고, 이를 환자에서 치료 후에 항체 반응에 대한 값과 비교함을 수반한다. 항체 반응에서 현저한 증가(즉, 동일 샘플의 반복 측정에서 실험적 오차의 통상적인 한계보다 큼, 이러한 측정의 평균으로부터 1 표준 편차로서 표현됨)는 양성 치료 결과(즉, 제제의 투여가 면역 반응을 달성 또는 증대시킴)를 나타낸다. 항체 반응에 대한 값이 현저하게 변화하지 않거나 감소한 경우, 음성 치료 결과가 나타난다. 일반적으로, 면역원성 제제로 초기 치료 과정을 수행한 환자는 연속적인 투여에 따라 항체 반응의 증가를 나타낼 것으로 예상되며, 이는 결국 고조기에 도달한다. 제제의 투여는 일반적으로 항체 반응이 증가하는 동안 계속된다. 고조기 도달은 투여된 치료가 투여량 및 빈도에서 중단되거나 감소될 수 있음을 나타내는 지표이다.
분석용 조직 샘플은 통상적으로 환자에게서 얻은 혈액, 혈장, 혈청, 점막 또는 뇌척수액이다. 이들 샘플은 임의의 형태의 AA 또는 AL 펩타이드에 대한 면역 반응의 지표에 대해 분석한다. 면역 반응은 AA 또는 AL 펩타이드와 특이적으로 결합하는 항체의 존재로부터 측정할 수 있다. 항체는 항체와 특이적으로 결합하는 리간드에 대한 결합 분석에서 측정될 수 있다. 통상적으로, 리간드는 고정된다. 결합은 표지된 항이디오타입 항체를 사용하여 측정될 수 있다.
능동 및 수동 투여 모두를 사용하는 병용 요법에서, 유사한 접근법이 수동 투여로부터 생성된 항체의 수준을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
아밀로이드증의 진단 방법은 또한, 예를 들어, 검출가능한 표지와 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개체에 투여하고, 결합된 항체 또는 이의 단편의 존재 또는 부재를 측정함으로써 적용될 수 있으며, 상기 항체 또는 이의 단편은 응집 아밀로이드 단백질에서 X1EDX2(여기서, X1 및 X2는 임의의 아미노산이다)를 포함하는 에피토프와 특이적으로 결합한다. 결합된 항체 또는 단편의 결손은 아밀로이드증의 진단을 지지한다. 아밀로이드증의 진단에 유용한 항체 및 단편은 본 발명의 개시된 항체를 포함한다.
본 발명의 진단 항체 또는 단편은, 예를 들어, 환자의 체내에 정맥 주사에 의해 투여하거나, 두개내 주사에 의해 뇌에 직접 투여할 수 있다. 항체 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 통상적으로, 항체를 표지하지만, 일부 방법에서 항체를 표지하지 않고 제2 표지화 제제를 항체와 결합하는데 사용한다. 표지의 선택은 검출 수단에 좌우된다. 예를 들어, 형광 표지는 광학적 검출에 적당하다. 상자성 표지는 수술이 개입되지 않는 단층 촬영 검출에 사용하기에 적당하다. 211At, 212Bi, 67Cu, 125I, 131I, 111In, 32P, 212Pb, 186Re, 188Re, 153Sm, 99 mTc 또는 90Y를 포함하는 방사성 표지를 사용할 수 있다. 이러한 방사성 표지도 또한 PET, SPECT 또는 기타 적합한 기술을 사용하여 검출될 수 있다.
진단은 또한 표지된 위치의 수, 크기 및/또는 강도를 상응하는 기준선 값과 비교함으로써 수행된다. 기준선 값은 발병되지 않은 개체군의 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기준선 값은 또한 동일 환자에 대해 미리 측정된 수준을 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 기준선 값은 환자에서 측정될 수 있으며, 이후 측정값은 기준선 값과 비교된다. 기준선 신호에 비하여 값의 증가는 AA 아밀로이드증의 진단을 지지한다.
본 발명의 진단 방법은 AA 아밀로이드증, AL 아밀로이드증, 알츠하이머병, 경도 인지 장애, 아밀로이드 다발신경병증, 지중해 열, 머클 웰즈 증후군, 전신성 염증 질환과 관련된 반응성 전신성 아밀로이드증, 골수종 또는 아밀로이드증과 관련된 고분자글로불린혈증, 면역세포 질환과 관련된 아밀로이드증, 모노클로날 감마글로불린병증, 잠재 질환, 또는 만성 염증 질환과 관련된 국소 결절 아밀로이드증을 포함한 아밀로이드증 질환을 진단하는데 사용될 수 있다.
XV. AA 아밀로이드증의 동물 모델
AA 아밀로이드증은 SSA 농도가 질산은, 카제인 또는 지질다당류의 주사에 의해 현저하게 증가되는 마우스에서 실험적으로 유도될 수 있다. 이러한 제제는 사이토카인의 생산을 자극한다[문헌 참조: Skinner et al. Lab Invest. 36:420-427 (1997); 및 Kisilevsky et al. Bailliere's Clin. Immunol. Immunopathol. 8(3) 613-626 (1994)]. 염증 자극 후 2주 또는 3주 내에, 동물은 AA 아밀로이드증을 앓고 있는 환자에서 발견되는 바와 같이 전신성 AA 침착물을 축적한다. 이러한 지체기는 AA 아밀로이드 축적된 마우스 비장 또는 간으로부터 추출된 단백질을 마우스에 동시 제공하는 경우 극적으로 짧다[문헌 참조: Axelrad et al., Lab Invest. 47(2):139-46 (1982)]. 이러한 제제의 아밀로이드 형성 가속 활성은 "아밀로이드 강하 인자"(AEF)라고 칭한다. 런드마크 등(Lundmark et al.)은 AEF의 활성 성분이 명백히 AA 섬유 자체인 것으로 보고한다. 추가로, 이들은 이러한 물질이 1ng 미만의 용량에서도 매우 강력하다는 것과 상당한 길이의 시간에 걸쳐 생물학적 활성을 보유한다는 것을 입증하였다. 특히, AEF는 또한 경구 투여되는 경우 효과적이었다. 이들은 AA 및 기타 형태의 아밀로이드증이 프리온 관련 장애와 유사한 전염성 질병인 것으로 결론지었다[문헌 참조: Lundmark et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 6979-6984 (2002)].
AA 아밀로이드는 또한 메탈로티오네인 I 프로모터의 제어 하에 사람 인터루킨 6 유전자를 갖는 마우스의 유전자도입 균주에서 유도되어 SAA의 농도를 증가시키고 3개월 연령의 비장, 간 및 신장에서 아밀로이드를 발생시킬 수도 있다. 약 8 내지 9개월에서의 사망 시점에, 이러한 유전자도입 마우스로부터 유래한 기관은 광범위한 아밀로이드 침착물을 갖는다[문헌 참조: Solomon et al., Am. J. Pathol. 154(4):1267-1272 (1999)].
유전자도입 급속 유도 아밀로이드 질병(Transgenic Rapidly Induced Amyloid Disease; TRIAD) 유전자도입 마우스 모델은 상기 기재된 유전자도입 마우스 모델에 대한 개량이다. TRIAD 마우스는 H-2LD 조직적합성 프로모터의 제어 하에 사람 인터루킨 6 유전자를 갖는다. AEF를 8주 연령의 TRIAD 마우스에 투여하는 경우, 현저한 비장 및 간 AA 아밀로이드 침착물이 3 내지 4주 내에 생성된다. 후속적으로, 이러한 과정은 기타 기관으로 진행되어 4 내지 6주 후에 사망에 이르게 한다. 전신성 아밀로이드증의 진행은 상기 기재된 유전자도입 마우스 모델과 비교하여 가속화된다[문헌 참조: 국제 공개공보 제WO 01/77167호(University of Tennessee Research Corporation), 제WO 95/35503호(Pharmacopeia) 및 제WO 95/30642호(Scripps); Wall et al. Amyloid 12(3): 149-156 (2005); 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 참조로 인용된다].
일반적인 마모셋(marmoset)(Callithrix jacchus)은 생의학 연구에서 광범위하게 사용되는 브라질 원산지의 소규모 신세계 영장류(New World primate)이다. 루드라게 등(Ludlage et al.)은 일반적인 마모셋이 간, 부신, 신장 및 장을 포함하는 하나 이상의 기관에서 아밀로이드 침착물을 갖는 것으로 밝혀졌다고 보고한다. 발명자들은 유전적 요인이 이러한 영장류에서 AA 아밀로이드증의 발병의 원인일 것으로 인정하였다. 이와 관련하여, 일반적인 마모셋은 AA 및 기타 전신성 아밀로이드 장애의 발병기전 및 치료법의 연구를 위한 유일한 실험적 모델로서 작용할 수 있다[문헌 참조: Ludlage et al. Vet Pathol 42:117-124 (2005)].
AA 아밀로이드증에 특히 걸리기 쉬운 -AEDS 모티프를 함유하는 AA 서열을 갖는 품종인 개의 샤 페이(Shar Pei) 종은 AA 아밀로이드 특이적 항체 및 기타 화합물의 신규한 진단 및 치료 용도를 평가하기 위한 전신성 AA의 자연 발생 모델을 제공한다.
실시예
실시예 I. AA 단편
문헌[참조: Yamamoto and Migita Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2915-2919]에 기재된 바와 같은 아미노산 71-75 - GHEDT에 상응하는 펩타이드는 AnaSpec(미국 캘리포니아주 새너제이 소재)에 의해 합성되었다. 문헌[참조: Bard, F. et al., (2000) Nat. Med. 6, 916-919]에 의해 앞서 기재된 바와 같이, 폴리클로날 항체(Pab) AA를 생성하고, 면역글로불린 분획을 분리하였다.
실시예 II. 쥐 항체의 제조를 위한 면역원
사용된 에피토프는 N 말단에 CG 링커를 갖는 GHEDT(서열번호 3)이었다. 에피토프를 함유하는 펩타이드 EPRB-39를 양 항마우스 항체와 커플링시킨다. EPRB-39는 Anasec(미국 캘리포니아주 새너제이 소재)으로부터 수득하였다. 생산된 항체는 영역 GHEDTIADQE(서열번호 89)를 포함하는 펩타이드와 특이적으로 결합하지 않기 때문에 네오에피토프인 것으로 보인다.
실시예 III. 면역화 절차
완전 프로인트 애주번트(CFA), 이어서 불완전 프로인트 애주번트(IFA)를 함유하는 50ug EPRB-39/양 항마우스 IgG를 6주 연령의 A/J 마우스에 복강내 총 3회 주사하기 위해 한 주 걸러 주사하였다. 융합 3일 전, 꼬리 정맥에 90ul PBS 중의 50ug EPRB-39 SAM IgG를 주사하였다. 높은 배경을 갖는 ELISA로부터 1/10000에서 역가를 평가하였다.
JH80은 EPRB-39에 대한 융합 번호이다. 다음은 활성인 클론 및 제한 희석액 클론의 목록이다:
Figure 112010048814606-pct00061
7D47, 8G9 및 2A77는 바람직한 서브클론을 나타낸다. 생산된 항체는 SAA의 C 말단 분해 부위를 포함하는 펩타이드와 반응하지 않기 때문에 네오에피토프 특이적인 것으로 보인다.
실시예 IV. 응집 및 가용성 AA에 대한 항체 결합
문헌[참조: Schenk D. et al., (1999) Nature 400, 173-177]에 의해 앞서 기재된 바와 같이, ELISA에 의해 혈청 역가(순차 희석으로 측정) 및 응집 AA에 대한 모노클로날 항체 결합을 수행하였다. 가용성 AA란 디메틸 설폭사이드에서 초음파 처리된 AA 원섬유를 의미한다. 항체의 순차 희석액을 실온에서 밤새 50,000cpm의 125I-AA와 함께 항온처리하였다. 단백질 A 세파로스(Amersham Biosciences, 스웨덴 웁살라 소재) 75mg/ml/토끼 항마우스 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch, 미국 펜실베이니아주 웨스트 그로브 소재) 200μg을 함유하는 슬러리 50μl를 희석 항체와 실온에서 1시간 동안 항온처리하고, 2회 세척하고, Wallac 감마 계수기 (PerkinElmer Life Science, 미국 일리노이주 그로브 소재)로 계수하였다. 모든 단계를 10mM Tris, 0.5M NaCl, 1mg/ml 젤라틴 및 0.5% Nonidet P-40으로 이루어진 방사선 면역 측정 완충액(pH 8.0) 중에서 수행하였다.
실시예 V. Vλ6 Wil 구조의 분석
발현된 사람 Vκ 및 Vλ 면역글로불린 경쇄 배선 유전자의 서열은 도 21 및 22에 도시된 바와 같다. κ1a, λ1a, λ3a 및 λ3c 하위 그룹을 제외하고, 모든 Vκ 및 Vλ 배선 유전자 서열에서 위치 81 및 82에서 Glu-Asp 잔기 짝짓기가 존재한다. 추가로, 위치 50 및 51에서의 제2 배선 암호화된 Glu-Asp 짝짓기는 Vλ6 배선 유전자에게만 유일하다. 따라서, Vλ6 Wil은 50-51 및 81-82 Glu-Asp 쌍 둘 다를 함유한다. 잔기 50 및 51의 측쇄 둘 다는 X선 결정학에 의해 나타낸 바와 같이 Vλ6 Wil의 표면에 접근가능하다(도 24 참조). 대조적으로, Glu81 측쇄만 표면 노출되고 Asp82 측쇄는 부분 매몰되고 Lys79 및 Arg61의 측쇄와 (정전기적 상호작용 또는 H 결합에 의해) 상호작용하는 것으로 보인다(도 25 참조).
Glu-Asp 측쇄의 X선 결정 구조와 상대적 이용가능성에 대한 상기 분석에 기초하여, 본 발명자들은 도메인이 응집(예를 들어, 원섬유) 구조에 도입되어(또는 부분 변성됨), 숨은 잠재 에피토프를 노출시키기 때문에 매몰된 Glu81이 접근가능한 것으로 결론지었다.
실시예 VI. Vλ6에 대한 항AA 모노클로날 항체 항체 결합의 분석
A. 표면 플라스몬 공명
표면 플라스몬 공명은 수개의 모노클로날 항체와 Vλ6 Wil 원섬유 및 단량체의 결합 동력학을 확립하는데 사용되었다. 6.6nM의 농도에서, 3개의 항체 모두는 약 1nM(쥐 AA 원섬유와의 반응성에 대하여 밝혀진 것과 비교가능한 값)의 KD를 갖는 고정된 합성 Vλ6 Wil 원섬유와 결합하였다(도 26 참조). 결합 단계 동안 편향(RU로서 표현됨)은 mAb 7D8 및 2A4에 대하여 유사하였지만 8G9에 대하여 50% 낮았다. 이는 친화도 계산치가 3개의 항체 모두에 대하여 유사하였기 때문에 원섬유 상의 이러한 항체의 밀도가 다른 2개의 시약보다 낮았음을 제시한다. IgG1 mAb는 대조군으로서 작용하였고 Vλ6 Wil 원섬유와 결합을 나타내지 않았다.
6.6nM 내지 33.3nM의 범위에 대한 mAb 7D8의 적정은 kon과 관련된 최대 편향에서 예상된 감소를 나타냈다(도 27 참조). 일반적으로, 결합 동력학은 각각의 농도에서 유사하였지만, 이러한 예비 실험에서 26.6nM의 7D8에 대한 KD 값은 다른 농도에서 수득된 값과 상이하였다.
반응의 특이성을 평가하고 mAb와 원섬유의 결합이 (Fc 매개된 결합 또는 비특이적 흡착과는 대조적으로) 고전적 F(ab)-항원 상호작용을 통해 발생하였음을 보장하기 위해, 결합 데이터를 면역원 펩타이드(p39) 20 및 1μg/ml의 존재하에 획득하였다(도 8 참조). 저농도에서 mAb 7D8과 결합하지 않는 펩타이드 p41은 대조군으로 작용하였다. p41 펩타이드 20μg/ml의 존재하에, Vλ6 Wil 원섬유를 갖는 mAb 7D8에 대한 결합 동력학은 7D8 단독과 동일하였다. 대조적으로, 1μg/ml의 면역원 펩타이드 p39는 측정된 신호의 편향으로 판단하였을 때 결합 정도에서 2배 초과하여 감소하였다(도 28). 7D8에 의한 원섬유 결합의 억제는 20μg/ml의 p39 펩타이드가 사용된 경우 거의 완전히 억제되었다. 이러한 데이터는 이러한 상호작용이 면역원 펩타이드에 의해 완전히 억제될 수 있으므로 mAb 7D8이 분자의 F(ab) 영역을 통해 원섬유와 결합함을 나타낸다.
mAb 7D8과 칩 상에 고정된 Vλ6 단량체의 반응성은 BIAcore를 사용하여 검사하였다. 항체는 단량체성 단백질과 반응하지 않았다. 이러한 데이터는 mAb 7D8에 의해 인식된 결합 부위가 원섬유 상에 존재하지만 가용성 전구체 단백질 상에 존재하지 않음을 나타내며, 항원이 성질상 형태적이거나 잠재적임을 시사한다.
B. 면역조직화학
면역조직화학을 다음과 같이 수행하였다: 포르말린 고정되고 파라핀 매봉된 블록으로부터 절단된 두께 6μm의 절편을 CitraPlus(BioGenex, 미국 캘리포니아주 샌 라몬 소재)로 90℃에서 30분 동안 항온처리하여 항원을 회수하였다. 조직을 mAb 2A4, 7D8 또는 8G9의 3μg/ml 용액으로 면역 염색하였다. IgG2a mAb TY11은 대조군으로서 작용하였다. HRPO 접합된 말 항마우스 Ig 항체(ImmPRESS Universal Reagent, Vector Labs, 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)를 제2 시약으로서 사용하였다. 3,3'-디아미노베지덴(Vector Labs)을 사용하여 슬라이드를 현상하고 Leica DM500 현미경을 사용하여 검사하였다. 모노클로날 항체와 ALκ 및 ALλ 아밀로이드 조직 침착물의 상호작용도 또한 면역조직화학을 사용하여 연구하였다. 도 29에 도시된 바와 같이, λ2 단편으로 이루어진 환자의 갑상선에서의 아밀로이드 침착물을 7D8, 2A4 및 8G9로 면역 염색하였다. 반응성의 영역은 콩고 레드 염색된 조직 절편에서 나타난 녹색 금 복굴절로 표시된 아밀로이드 침착물과 연관성이 있었다. 가장 인상적인 반응성은 mAb 7D8 및 2A4 mAb로 달성되었지만, 8G9는 비록 양성이지만 상당히 약해졌다. 이러한 정성적 데이터는 8G9가 다른 2개의 시약보다 Vλ6 Wil 원섬유와 잘 결합하지 않는 BIAcore 분석과 잘 일치한다(도 26 참조). 대조군으로서 작용하는 이소타입 매칭된 mAb TY11은 아밀로이드 면역반응성을 나타내지 않았다.
이러한 λ2 단백질의 아미노산 서열(서열번호 86)(하기 도시됨)은 배선 암호화된 Glu 및 Asp 잔기를 위치 81 및 82에서 각각 함유한다.
Figure 112010048814606-pct00062
ALκ 아밀로이드 조직 침착물의 검사는 7D8 및 8G9보다 낮은 정도로 양성 반응성을 갖는 2A4로 드러났다. 또한, 면역염색성 영역과 복굴절의 콩고 레드 친화성 아밀로이드 영역 사이의 일치가 있었다. TY11 mAb는 미반응성이었다.
C. 125I 표지된 7D8을 사용한 AL 아밀로이드종의 방사선 영상
AL 아밀로이드종의 실험적 생체내 모델은 방사선 표지된 mAb 7D8이 사람 AL 아밀로이드를 영상화하는지를 연구하는데 사용하였다. SDS-PAGE에 의해 측정된 7D8의 방사선 표지된 효율은 IgH 쇄와 IgL 쇄 둘 다가 I-125 표지를 혼입하였고 단편화 또는 응집화와 관련된 밴드의 증거가 관찰되지 않았음을 나타낸다. 유도된 AL 아밀로이드종을 갖는 마우스의 SPECT/CT 영상화는 125I 표지된 항체가 아밀로이드 없는 조직(예를 들어, 간, 심장, 비장 및 신장)에 비하여, 아밀로이드에서 방사선 표지된 항체의 축적에 의해 입증된 등에 위치한 유도된 아밀로이드 덩어리로 국소화되었음을 나타낸다. 방사선 표지된 무관한 IgG mAb는 덩어리로 축적되지 않았지만, IgG 항체의 이화작용과 탈할로겐화를 나타내는 유리 방사선 요오드화물이 갑상선에서 관찰되었다. 아밀로이드종을 갖는 마우스에서 125I-7D8 mAb의 분포는 간, 비장, 신장, 위, 심장 및 폐의 것과 비교하여 아밀로이드 덩어리와 관련된 활성을 측정함으로써 정량화되었다. 이러한 데이터는 SPETC/CT 영상 연구를 확인해 주었다. 주사 후 72시간(영상을 획득하고 조직을 수확하는 시간)에서, 아밀로이드종은 간(mAb 이화작용의 부위) 및 심장(잔류 혈액 풀 활성이 높을 것으로 예상되는 부위)에서 발견된 것보다 4배 더 높은 약 8%의 ID를 함유하였다. 폐에서 나타난 활성은 안락사의 방식에 기인하였다(데이터는 도시하지 않음).
생체분포 데이터를 확인하기 위해, 아밀로이드종 및 간, 비장, 심장 및 신장을 수확하고 조직 절편을 자가조직방사선 분석용으로 제조하였다. 방사선 표지는 다음과 같이 수행하였다: 제한량의 클로라민 T를 사용하여 7D8 항체를 2 mCi의 환원제 무함유 125I(Perkin Elmer)로 표지하고, 5mg/ml의 소혈청 알부민을 함유하는 PBS(BSA/PBS) 중에 현탁시켰다. Ultrogel AcA34 컬럼(Amersham Pharmacia)을 통한 크기 배제 액체 크로마토그래피에 의해 결합하지 않은 동위원소 및 단백질 응집물을 제거하였다. IgG 단량체 함유 분획을 영상 실험을 위해 수집하였다. 방사선화학 수율은 약 25μCi/μg의 특이적 활성을 제공하는 약 50%이었다. 125I 표지된 mAb를 환원제의 존재 또는 부재하에 SDS/PAGE(10% 겔)에 처리하고 사이클론 인 영상기로 분석하였다. SPECT 영상법 및 생체분포 측정법에 따라, 자가조직 방사선 분석은 간에 비하여 아밀로이드종에서 125I-7D8의 현저한 축적을 확인해 주었다. 임의의 다른 기관(예상된 간 이외의 활성은 항체의 이화작용과 관련됨)에서 방사선 표지된 항체 125I-7D8 흡수의 증거는 없었다. mAb 7D8이 아밀로이드 덩어리의 벌크 전체에 비교적 균일하게 분포하지만, 약간 높은 밀도가 복부 아밀로이드 경계의 말초 영역에서 관찰되었다. 임의의 기관에서 방사선 표지된 대조군 IgG의 흡수는 없었다.
D. 요약 및 결론
표면 플라스몬 공명, 면역조직화학 및 생체내 방사선 영상법은 AA 반응성 항체 2A4, 7D8 및 8G9가 면역글로불린 경쇄로부터 유래한 AL 아밀로이드 및 원섬유(Kd 약 InM)와 결합하는 것을 확립한다. 이러한 상호작용은 마찬가지로 각각 위치 81 및 82에서 고도로 보존된 Glu 및 Asp 아미노산에서 발생하며, 이는 아밀로이드 형성 경쇄가 원섬유에 혼입되는 경우에만 노출되는 잠재 선형 에피토프를 형성한다.
실시예 VII. ELISA 분석은 X1EDX2 펩타이드에 대한 항체 결합을 입증한다
다양한 서열의 펩타이드에 대한 항체 2A4, 7D8 및 8G4의 결합을 평가하기 위해 BIAcore 분석을 수행하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 항체는 서열 X1EDX2를 갖는 펩타이드와 반응하는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 항체는 추가의 C 말단 잔기를 갖는 펩타이드와 반응하지 않았다. 이는 항체가 SAA의 분해로 생성된 네오에피토프와 특이적으로 반응하여 유리 C 말단을 생성하는 것을 제시한다. 그러나, 실시예 V에서 입증된 바와 같이, 유리 말단은 Vλ6 Wil에 대한 이들 항체의 결합에 대하여 필수적이지 않지만, X1EDX2 도메인은 응집(예를 들어, 원섬유) 구조(또는 부분적으로 변성됨)에 도입되어 숨은 잠재 에피토프를 노출시키기기 때문에 항체에 대한 결합에 유리한 형태를 채용한다.
Figure 112010048814606-pct00063
Figure 112010048814606-pct00064
실시예 VIII. 마우스 AA의 면역조직화학적 분석
항체 2A4, 8G9 및 7D8을 발현하는 하이브리도마로부터 유래된 상청액의 쥐 AA 비장 및 간 아밀로이드 침착물(아밀로이드 침착물이 주요 부위)에 대한 반응성은 면역조직화학적으로 기록된다. 이러한 연구의 경우, 간 및 비장에서 광범위한 AA 아밀로이드를 갖는 TRIAD 마우스로부터 수확된 세포의 절편(녹색 복굴절의 콩고 레드 친화성 침착물에 의해 입증됨)을 mAb 함유 상청액으로 염색하였다. 3개 모두는 간 및 비장 아밀로이드와 결합하였다. 대조적으로, 무관한 하이브리도마로부터 유래한 배양물 상청액과 반응성이 없었다. 2A4, 8G9 및 7D8을 사용하여 새로운(고정되지 않음) OCT 매봉된 쥐 간 및 비장에서 아밀로이드를 면역 염색하는 아밀로이드의 능력을 시험하였다. mAb가 간 부비동에서 AA 아밀로이드와 결합하는 능력을 보유한다는 증거가 존재하였다. 또한, 비장 조직과의 항체 반응성은 용이하게 예방되었고, 모낭 주위 아밀로이드는 강하게 면역 염색되었다. mAb가 AA 아밀로이드와 특이적으로 결합함을 입증하기 위해, 1:25 희석액의 mAb 상청액을 50μg/ml의 펩타이드 #39(p#39) 또는 #41(p#41)과 실온에서 1시간 동안 예비항온처리하였다. 포르말린 고정된 조직을 기질로서 사용하는 경우, p#39 펩타이드 (50μg/ml)는 2A4와 7D8 mAb 둘 다의 아밀로이드 반응성을 현저하게 억제하였다(8G9를 함유하는 결과는 계류중이다). 대조적으로, p#41 펩타이드는 효과가 없었다. 비교 결과를 새로운 조직에 의해 수득하였다.
실시예 IX. 사람 AA의 면역조직화학적 분석
위치 73-76으로부터 마우스와 사람 SAA의 아미노산 서열의 비교는 2개의 동일한 잔기, 보존적 Ser와 Thr간의 치환 및 비보존적 A1a와 His간의 교환을 나타낸다. 2A4, 8G9 및 7D8 mAb가 사람 AA 아밀로이드 침착물과 교차 반응하는지를 시험하기 위해, 사람 AA 함유 신장, 부신, 난소 및 간에 대한 반응성을 시험하였다. 모든 경우에서, mAb 상청액은 아밀로이드 침착물을 면역 염색하였다. 난소 조직에서, p#39 펩타이드는 혈관주위 AA 아밀로이드에 대한 mAb의 결합을 효과적으로 차단하였지만, p#41 펩타이드는 이러한 반응을 억제하지 못하였다.
실시예 X. 쥐 유도된 AA 원섬유와 배지 상청액의 항 AA의 상호작용
2A4, 8G9 및 7D8 mAb와 AA 아밀로이드의 상호작용을 ELISA로 초기에 시험하였고, SigmaPlot(SPSS Inc.)을 사용하여 도 31에 도시된 데이터를 분석하였다. 각각의 점은 평균±SE (n = 3)을 나타낸다. 무관한 하이브리도마로부터 유래한 배지 상청액을 대조군(Ctrl Culture Sup)으로 사용하였다. 매우 낮은 신호 대 잡음 비가 존재하였고 그 결과는 대조군 상청액에 비하여 더 큰 흡수 신호에 의해 명백해진 바와 같이 제1 수확물은 제2 수확물에 비하여 더 많은 mAb를 함유하였음을 나타냈다. (추가로, 1일째 물질의 면역조직화학적 반응은 2일째 샘플보다 더 컸다.) SE 값이 컸지만, 2A4, 8G9 및 7D8의 결합 친화도가 약 1:64 희석 후 부재한 반응성으로 대략 동등하였음이 이러한 자료로부터 나타났다. 결합 데이터는 또한 능력, 즉 결합된 mAb의 양이 7D8>8G9>2A4로 다르지만, 이러한 데이터가 mAb 농도에 대해 교정되지 않았고 후속적 연구에서 이러한 경향이 관찰되지 않았음을 제시한다. 배지 상청액에 의해 발견된 낮은 신호와 높은 가변성 때문에, 쥐와 사람 AA 아밀로이드 원섬유에 대한 mAb의 상대적 결합 친화도를 더욱 정확히 측정하기 위해(뿐만 아니라 생체내 생체분포 연구에 물질을 제공하기 위해), 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 mAb를 분리하는 것이 필요하였다. 분리된 mAb의 순도는 환원성 및 비환원성 조건 하에 10% 아크릴아미드 겔을 사용하여 SDS-PAGE로 규명하였다(도 32 참조). 레인 1 내지 4의 샘플을 머캅토에탄올로 처리하였고, 레인 5 내지 9는 처리하지 않았다. 겔을 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하였다: mAb 8G9, 레인 1 및 6; mAb 2A4, 레인 2 및 7; mAb 7D8, 레인 3 및 8; SP2/0 대조군 상청액, 레인 4 및 9; 블랭크, 레인 5. 단백질 Mr 마커(Std)는 상부에서 저부까지이다: 176, 119, 75, 49, 39, 25 및 19kDa. 정제된 mAb와 면역성 펩타이드 p#39, 대조군 펩타이드(p#41), 쥐 및 사람 AA 추출물의 상호작용을 상기 기재된 바와 같이 ELISA로 측정하였다. SigmaPlot 소프트웨어를 사용하여 S자 곡선을 피팅(fitting)함으로써 이들 데이터를 분석하였고 50% 포화에서 mAb 농도(EC50)를 측정하였다(표 5 참조).
Figure 112010048814606-pct00065
3개의 mAb와 펩타이드 p#39의 상호작용은 포화성 결합을 낮은 nM 범위에서 EC50 값으로 나타냈다(상기 표 5 참조). 대조적으로, 사용된 mAb의 최고 농도(100nM)에서도, p#41 펩타이드에 대한 검출가능한 결합이 거의 없었다(도 33 - 각각의 점은 평균±SE (각각의 농도에서 n = 3)를 나타낸다). 이러한 데이터는 상기 기재된 면역조직화학적 결과, 즉 펩타이드 p#39는 AA 아밀로이드 축적 조직에 대한 mAb의 결합을 완전히 차단할 수 있음을 확인해 주었다. 각각의 mAb와 p#39 펩타이드의 결합에 대한 EC50 계산치는 쥐 AA 아밀로이드 추출물이 기질로서 사용된 경우에서와 본질적으로 동일하였다(도 34 - 각각의 점은 평균±SE (각각의 농도에서 n = 3)를 나타낸다). 마우스 AA 추출물에 대한 mAb 결합에 대한 EC50 계산치는 p#39 펩타이드가 기질로서 사용된 경우에 수득된 것과 본질적으로 동일하였다(도 34 및 표 5 참조). 대조적으로, 사람 AA 아밀로이드 추출물이 마이크로플레이트의 웰 상에서 건조된 경우, EC50 값은 마우스 AA 및 펩타이드 p#39에 대하여 관찰된 것보다 5 내지 7배 낮았다(도 35 - 각각의 점은 평균±SE (각각의 농도에서 n = 3)를 나타낸다; 표 5 참조). 7D8 mAb 결합에 대한 EC50 값이 시험된 3개의 항체 중에서 가장 낮기 때문에, 발명자들은 생체내 공동 국소화 및 영상 연구에 대하여 이러한 시약을 선택하였다. 쥐 단백질에 대하여 사람 SAA 서열에서 2개의 아미노산 치환은 EC50 값에 영향을 미쳤다. 특정 이론에 의해 제한하려는 것은 아니지만, 발명자들은 사람 AA에 대한 높은 EC50을 항원 결합 부위에서 아미노산 측쇄의 더욱 불량한 "피트(fit)"의 결과라고 주장했다. 그러나, 이러한 효과는 단지 ELISA에서와 같이 아밀로이드 추출물이 표면 흡착되는 경우의 상대적 친화도에서 5배 감소와 일치한다. 더욱이, 이러한 데이터는 모든 3개의 mAb가 쥐와 사람 조직 AA 아밀로이드 침착물 둘 다와 결합하였다는 관찰을 지지한다.
실시예 XI. 마우스 및 사람 AA 아밀로이드에 대한 Mab의 경쟁적 결합
미세역가 웰의 표면에 흡착되는 경우 잠재적 변성의 효과(존재하는 경우)를 측정하기 위해, 쥐 또는 사람 AA 아밀로이드 추출물이 mAb와 표면 결합된 AA 추출물의 상호작용에 대한 가용성 경쟁자로서 사용되는 경쟁 ELISA를 사용하여 2A4, 8G9 및 7D4의 반응성을 평가하였다.
모든 경우에서, 사람과 마우스 기원 둘 다의 가용성(비흡착된) AA 아밀로이드 원섬유는 3개의 mAb에 대하여 경쟁적일 수 있었으며, 시약에 의해 인식되는 에피토프가 표면 흡착으로부터 생성된 부분 변성에 의존하지 않음을 나타낸다. 일반적으로, 마우스 AA(AEF) 추출물은 사람 AA보다 우수한 경쟁자이었다(표 6 참조).
Figure 112010048814606-pct00066
용액 중의 마우스 AEF에 대한 IC50 값(50%까지 mAb 결합을 감소시킨 AA의 농도(중량))은 약 20μg/ml인 반면, 사람 AA에 대한 IC50 값은 6 내지 44배 컸다(대조적으로, 사람 AA에 대한 EC50 값은 마우스 AA에 대한 EC50 값보다 단지 7배 낮았다). 이는 용액 중에 존재하는 경우 아밀로이드 원섬유에 대한 에피토프가 쥐 AA와 비교하여 사람 AA 제제에서 덜 접근가능하다는 사실을 반영할 수 있다.
예상된 바와 같이, 표면 흡착되는 경우 사람 및 쥐 AA 원섬유에 대한 최대의 상대적 친화도를 나타낸 7D8 mAb는 경쟁을 달성하기 위해 최대 농도의 AA 아밀로이드를 필요로 한다.
실시예 XII. 방사선 표지된 MAb 7D8
7D8의 방사선 표지 효율을 SDS-PAGE로 측정하였다. 환원된 원래 mAb를 분석하고 영상기를 사용하여 단백질을 가시화하였다. IgH 쇄와 IgL 쇄 둘 다는 I-125 표지를 혼입하였고, 단편화 또는 응집화와 관련된 밴드의 증거는 관찰되지 않았다.
실시예 XIII. 125I 표지된 7D8을 사용한 AA 아밀로이드의 영상화
방사선 표지된 mAb 7D8의 생체내 국소화를 연구하기 위해, 3개의 그룹의 마우스를 사용하였다: 유전자도입 IL-6; 유도된 AgNO3/AEF; 및 아밀로이드 결핍 대조군(WT). SPECT/CT 영상은 간에서 단지 낮은 혈액 풀 활성 및 갑상선에서 유리 요오드화물을 나타낸 대조군 마우스와 비교하여 이들 조직에서 방사선 표지된 mAb의 축적에 의해 명백하기 때문에 125I-7D8 mAb가 비장 및 간에서 마우스 AA 아밀로이드 침착물로 국소화되었음을 나타냈다.
이들 마우스와 대조적으로, AgNO3 주사된 마우스는 유리 요오드화물의 갑상선 흡수 및 일부 간 활성을 나타냈지만, 125I-7D8 결합의 주요 부위는 AgNO3 피하 주사의 부위에서 나타났다(우측 등 하부 영역). 이 영역에서의 활성은 CT에 의해 나타난 바와 같이 X선 약독화 간 용액에 의해 명백히 제한된다. 7D8 mAb는 SPECT 영상에서 명백한 바와 같이 TRIAD 마우스에서 순환성 sAA의 존재하에 간과 비장 둘 다에서 AA 아밀로이드 침착물과 결합하는 것으로 나타났다.
A. 마우스에서 125I-7D8의 생체분포
125I-7D8의 주입 48시간 후, 혈액 풀에서 방사성이 존재하였고, 이는 (마우스가 희생되었을 때 혈액으로 채워진) 폐에서의 비교적 높은 흡수를 설명하였다. 특히, IL-6 마우스에서 mAb의 간비장 축적은 아밀로이드의 존재를 나타낸다. SPECT/CT 영상은 이들 기관에서 mAb의 분포를 확인해 주었다. 주사 72시간 후, 혈액 풀 값은 이러한 mAb에 대하여 비교적 긴 T1 /2 bio (약 60시간)로 인해 48시간에서 희생된 마우스에 비하여 심장 및 폐에서 불변 활성에 의해 명백한 바와 같이 거의 변하지 않았다. IL-6 마우스에서 방사선 표지된 mAb의 현저한 축적이 존재하였는데, 이는 인상적인 비장 및 더 낮은 정도로 간 흡수를 나타내는 것으로 획득된 SPECT 영상과 일치하였다. 다른 기관 중에서도, 가장 중요한 것은 간(이는 급성 단계 반응 동안 IgG의 이화작용과 sAA의 공급원의 부위이다)이었다. WT 마우스에서, 염증성 감염 또는 아밀로이드가 없었고 간은 6% 미만의 ID/g를 함유했으며, 이는 혈액 풀이 신호에 거의 독점적으로 공헌하는 신장 및 심장과 비교가능하다.
B. 자가조직방사선 분석 및 조직화학적 분석
IL-6 및 AgNO3 마우스에서의 125I-7D8의 간 축적 증가가 아밀로이드 흡수, 이화작용 제거 또는 새롭게 합성된 sAA에 대한 결합으로부터 유발된 것인지를 측정하기 위해, 간 및 기타 조직을 자가조직방사선 분석하였다.
SPECT 영상법 및 생체분포 측정법에 기초하여, 유전자도입 IL-6 마우스에서 아밀로이드의 최대량이 간 및 비장인 것으로 추정하였다. 이러한 추정은 상당한 아밀로이드가 적색 속질 뿐만 아니라 혈관주위 영역 및 간의 부비동 전체에서 관찰된 콩고 레드 염색 절편에서 확인되었다. 추가로, 더욱 조심스러운 복굴절성 침착물이 신장 및 심장에 존재하였다. 이들 조직 내의 125I-7D8 분포는 콩고 레드 및 AA 반응성 물질과 매우 연관성이 있었다. 아밀로이드가 전혀 없는 간세포에서 축적은 없었다.
생체분포 데이터에 기초하여, AgNO3 처리된 마우스는 비장보다 간에서 125I-7D8의 흡수가 많았는데, 이는 이러한 동물에서 AA의 축적의 정상적인 패턴이 아니기 때문에 예상되지 않았다. 콩고 레드 염색은 비장의 단일 모낭주위 영역(우측 상부 코너)에서 소량의 아밀로이드 및 광범위한 간 혈관주위 침착물을 나타냈으며, 이들 둘 다는 자가조직방사선 분석에서 명백하였다. 추가로, AgNO3 주사의 피하 부위는 SPECT 영상법에서 상당한 농도의 125I-7D8를 갖는 것으로 나타났다(발명자들도 또한 방사선 요오드화 SAP가 영상화 제제로서 사용되는 경우 이를 관찰하였다). 이 부위는 아밀로이드를 함유하지 않지만(즉, 콩고 레드 복굴절성 물질), 항AA mAb로 면역 염색되었다. 특정 이론으로 제한하려는 것은 아니지만, mAb 7D8은 염증 또는 "예비 아밀로이드"(뿐만 아니라, 성숙 아밀로이드 침착물)의 부위로 국소화할 수 있다. IL-6 마우스의 기관에서 7D8의 인상적인 축적과 대조적으로, 대조군 마우스의 조직은 혈액 풀 이외의 어떤 기관에서도 거의 없거나 추적자가 없는 것으로 밝혀졌다. 아밀로이드는 이들 대조군의 임의의 기관의 콩고 레드 염색된 절편에서 발견되지 않았다.
C. 125I-7D8의 약동학
방사선 표지된 7D8 항체의 주사 후, 분자의 소멸 속도를 측정하고 표 7에 반감기 측정을 요약하였다. 이러한 결과는 7D8의 T1 /2 bio가 IgG2b 쥐 mAb의 값과 일치하는 약 60시간임을 나타냈다(유의, 7D8은 IgG2b 하위 부류이다). IL-6(TRIAD) 마우스에서 125I-7D8의 약간 더욱 빠른 소멸은 현저한 것으로 간주되지 않았다. 이러한 데이터에 기초하여, 72시간에 걸친 SPECT 데이터에서 명백한 바와 같이, 조직 아밀로이드에 의해 mAb의 보유는 분비 속도에 영향을 미치지 않는다.
Figure 112010048814606-pct00067
1. 유전자도입 또는 TRIAD 마우스를 사용하여 아밀로이드증을 예방하거나 치료하는 제제를 확인하는 방법
제제의 제조 절차는 문헌[참조: Schenk et al. Nature 400:173-177]에 기재되어 있다. 제제를 유전자도입 마우스의 제1 면역화를 위해 완전 프로인트 애주번트와 1:1(v/v) 유화시킨 후, 2주 및 이후 매달 완전 프로인트 애주번트로 추가하였다. PBS 주사도 동일한 계획을 따랐고, 대조군의 경우 마우스에 PBS/애주번트의 1:1 혼합물을 주사하였다. 제제가 동물의 생명을 증가시킴으로서 AA 아밀로이드증을 예방하는데 효과적인지를 측정하기 위해 유전자도입 마우스의 수명을 비교하였다.
2. 조직병리학
광 및 편광 현미경의 경우, 두께 4 내지 6μm의 조직 절편을 절단하고 헤마톡실린, 에오신(HE) 및 새로이 제조된 알칼리 콩고 레드 용액으로 각각 염색하였다. 전자 현미경의 경우, 절편을 에폰(Ted Pella, 미국 캘리포니아주 레딩 소재)에 매봉하고, 절단하고 JEOL 100S 투과 전자 현미경으로 검사하였다[문헌 참조: Ludlage et al. Vet Pathol 42:117-124 (2005)].
3. 면역조직화학
파라핀 매봉된 조직 절편(두께 6μm)을 마이크로톰 상에서 절단하고 폴리-L-리신 피복된 슬라이드에 쌓고, 실온에서 밤새 건조시키고, 탈파라핀시켰다. 앞서 기재된 아비딘비오틴 복합체(ABC-elite) 기술을 사용하여 면역 염색을 수행하였다. 일차 항체는 마우스 항사람 아밀로이드 A(Accurate Chemical and Scientific Corporation, 미국 뉴욕 웨스트베리 소재) 및 항마우스 SAA 폴리클로날 항혈청이었다. 친화도 정제된 말 항마우스 면역글로불린 G(IgG) 양고추냉이 퍼옥시다제 접합체(Vector Laboratories, 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재) 또는 염소 항토끼, 항마우스 또는 항래트 IgG 양고추냉이 퍼옥시다제 접합체(BioRad Laboratories, 미국 캘리포닝주 리치몬드 소재)를 이차 항체로서 사용하였다.
4. ELISA에 의한 SAA 정량화
제조업자에 의해 공급된 지침서에 따라 Multispecies SAA ELISA 키트(Biosource, 미국 캘리포니아 카마릴로 소재)를 사용하여 SAA 농도를 효소결합 면역흡착 측정법(ELISA)으로 측정하였다. 공지된 양의 사람 SAA 단백질을 사용하여 표준 곡선을 작성하고 흡광도를 모델 4450 BioRad 플레이트 판독기(미국 캘리포니아주 플러턴 소재)로 405nm에서 측정하였다.
5. 마우스에서 방사선 표지된 SAP 섬광조영술 턴오버 연구
N-브로모석신이미드를 사용하여 SAP를 125I(2 내지 5 MBq/mg)로 산화적으로 요오드화하였다. 6 내지 12주 연령의 마우스에 200μl 중의 125I-SAP 2 내지 10μg을 정맥 주사하였다. 정확히 측정된 꼬리 채혈(0.01 내지 0.04g)을 특정한 시간 간격으로 취하고 트리클로로아세트산 침전성 방사선을 주사된 추적자의 표준 동량(aliquot)과 함께 각각의 실험 말기에 동일한 방식으로 측정하였다[문헌 참조: Pepys et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:5602-5606 (1994)].
6. 사람에서 방사선 표지된 SAP 섬광조영술 턴오버 및 영상 연구
사람에서 사용하기 위한 SAP를 단일 정상 승인된 공여자의 혈장으로부터 분리하고 N-브로모석신이미드를 사용하여 125I(2 내지 5 MBq/mg) 또는 123I(110 MBq/50μg 단백질)로 산화적으로 요오드화하였다. 123I SAP 주사 후, 데이터를 획득하고 IGE Starcam 감마 카메라(IGE Medical Systems, 영국 슬러프 소재) 상에서 처리하고 125I 표지된 SAP의 소멸을 건강한 개체 및 AA 아밀로이드증을 앓고 있는 환자에서 연구하였다[문헌 참조: Pepys et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:5602-5606 (1994)].
7. 아밀로이드 추출 및 정제
조직으로부터 아밀로이드를 추출하는데 사용된 방법은 문헌[참조: Pras et al. J. Clin. Invest. 47:924-933 (1968)]에 기재된 바와 같다. 간단히 말해서, 부검으로 수득되어 -80℃에서 유지된 간 또는 기타 기관으로부터의 조직의 부분을, Omni-Mixer (Omni International, 미국 코네티컷주 워터베리 소재)를 사용하여 빙욕에서 냉 염수로 균질화하였다. 추출물을 10,000rpm에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하고 펠릿을 냉 염수로 2회, 0.1M 나트륨 시트레이트 Tris 완충 염수(pH 8.0)로 1회, 이어서 상청액의 A280이 0.10 미만이 될 때까지 염수로 다시 재추출하였다. 생성된 펠릿을 냉 증류수로 균질화하고 혼합물을 35,000rpm에서 3시간 동안 4℃에서 원심분리하였다. 이어서, 수추출물로부터 수득된 펠릿을 동결건조하였다.
8. 표면 플라스몬 공명
BIAcore X 기구 상에서 결합 동력학을 측정하였다. Vλ6 Wil로부터 제조된 원섬유를 간단히 프로브 초음파 처리기로 초음파 처리하고, 이어서 BIAcore 프로토콜에 따라 아민 화학을 사용하여 CM-5 칩에 커플링시켰다. 이러한 과정은 EDC 및 NHS를 이용하여 원섬유 상의 유리 아미노산 잔기와 커플링하기 위해 칩 상의 카복실 그룹을 활성화시킨다. 커플링을 NaOAc 완충액(pH 4.0)에서 100μg/ml의 농도에서 수행하였다. 대조군 채널은 "가커플링(mockcoupled)"이었고 두 채널을 에탄올아민과 반응시켜 미반응 부위를 포화시켰다. Vλ6 Wil 원섬유 약 16,000 RU를 커플링시켰다.
Fc1(Vλ6 Wil 원섬유) - Fc-2(대조군) 방식으로 BIAcore으로부터의 HBS-EP 완충액에서 센소그램(sensogram)을 20μl/분으로 작동시켰다. mAb 또는 mAb + 펩타이드 억제제를 함유하는 샘플을 주입하고(70μl), 지연 세척 기능을 200초 동안 사용하여 센소그램을 수거하였다. 질량 작용 보정을 갖는 1:1 Langmuir 모델을 사용하여 데이터를 BIAevalutation 소프트웨어로 분석하였다.
9. MicroSPECT/CT
3마리의 마우스 중 2개의 코호트에 각각 50mg의 사람 AL 아밀로이드 추출물을 견갑골 사이에서 피하 주사하였다. 7일 후, 마우스의 한 그룹에 약 300μCi의 125I 표지된 mAb 7D8을 꼬리 정맥 주사하였다. 제2 그룹에 대조군으로서 동량의 마우스 mAb MOPC 31C를 투여하였다. 72시간 후, 마우스를 과량의 이소플루란으로 희생시키고 SPECT/CT 영상을 획득하였다. CT 영상에서 혈관 조영 강화를 제공하기 위해, 스캐닝하기 5분 전에 마우스에 200μl 용량의 Fenestra VC™(Advanced Research Technologies, 캐나다 몬트리올 소재)를 정맥 주사하였다.
SPECT 데이터를 0.5mm 기공 직경 핀홀 조준기가 장착되는 경우 밀리미터 이하의 해상도를 갖는 microCAT II + SPECT 듀얼 방식 영상 플랫폼(Siemens Preclinical Solutions, 미국 테네시주 녹스빌 소재)으로 수집하였다. 영상화되는 경우, 2개의 검출기(1.2mm2 격자무늬 상에 배열된 1×1×8mm CsI(T1) 결정 어레이에 커플링된 50mm 직경의 Hamamatsu R2486-02 멀티 애노드 포토 멀티플라이어 튜브)를 회전 중앙으로부터 약 45mm에 위치시켰다. 45개의 프로젝션으로 이루어진 각각의 SPECT 데이터 세트를 50분의 과정 동안 360°에 걸쳐 수집하였다. 예상 최대화 최대 공산(EM-ML) 알고리즘의 실행을 사용하여 영상을 재구성하였다.
SPECT 데이터를 수집한 후, 고해상도 CT 영상을 수득하였다. microCAT II 스캐너는 20 내지 80 kVp 마이크로포커스 X선 공급원이 장착된 원형 궤도 원뿔 빔 구조를 가지며, 임의로 섬유 옵틱 번들(fiber-optic bundle)을 통해 minR 인 스크린에 커플링된 2048 x 3072 CCD 어레이 검출기를 사용하여 90mm × 60mm 필드의 사진을 캡쳐한다. 1°방위각에서 360개의 프로젝션으로 이루어진 각각의 CT 데이터 세트를 8분 내에 획득하였다. Feldkamp 백프로젝션 알고리즘의 실행을 사용하여 등방성 77μm 3D 화소 상에서 실시간으로 영상을 재구성하였다.
재구성된 SPECT 및 CT 영상의 공동 등록을 용이하게 하기 위해, Co-57 밀봉 공급원을 영상 베드 상에 위치시켰다. microSPECT 및 CT 데이타 세트를 시각화하고 3D 영상 분석 소프트웨어 패키지(Amira, 버전 3.1: Mercury Computer Systems)로 수동으로 공동 등록하였다.
10. 생체분포
간, 비장, 신장, 심장, 폐 및 임플란트된 아밀로이드 종양(즉, 아밀로이드종)의 샘플을 마우스로부터 수확하고, 바이알에 넣고, 계량하고, 방사성을 측정하였다. 일차 인덱스 값을 % 주사량/g 조직(% ID/g)으로 표현하였다.
11. 자가조직방사선 분석
125I-7D8의 주사 72시간 후 희생된 마우스로부터 수득되어 포르말린 고정된 파라핀 매봉된 조직 블록으로부터 두께 6μm의 절편을 암실에 저장된 NTB-2 유화액(Eastman Kodak)에 침지된 Probond 현미경 슬라이드(Fisher Scientific) 상에 놓고 노출 24시간 후 현상하였다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 대조 염색하고, Permount(Fisher Scientific)를 사용하여 커버글라스를 덮고, 광학 현미경으로 검사하였다. 추가로, 연속 슬라이드를 알칼리 콩고 레드로 염색하고 교차 편광 조명 하에 관찰하였다. 마지막으로, AA 반응성 mAb를 일차 시약으로서 사용하여 3번째 슬라이드를 면역 염색하였다. 디지털 카메라 현미경 영상을 촬영하고 영상 분석 소프트웨어 패키지(Image Pro Plus, Media, Cybernetics)를 사용하여 평가하였다.
실시예 XIV. 사람화 2A4 및 7D8 항체의 제조
당업계에 공지된 기술에 따라 쥐 2A4, 7D8 및 8G9 CDR을 사람 어셉터 골격에 이식하여 사람화 2A4, 7D8 및 8G9 항체를 제조하였다. 항원성을 감소시키면서 결합 친화도를 보존하도록 역 돌연변이를 제조하였다. 마우스 2A4의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 서열번호 152의 잔기 20-131 및 서열번호 154의 잔기 20-138으로서 각각 나타낸다. 7D8의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 서열번호 153의 잔기 20-131 및 서열번호 154의 잔기 20-138로서 각각 나타낸다. 쥐 2A4 및 8G9의 경쇄 가변 영역은 서로 동일하고, CDR1의 단일 잔기에서 7D8의 경쇄 가변 영역과 상이하다. 2A4, 7D8 및 8G9의 중쇄 가변 영역은 동일하다.
2A4 및 7D8의 가변 카파(Vk)는 마우스 하위 그룹 2에 속하며, 이는 사람 하위 그룹 2에 상응하며, 가변 중쇄(Vh)는 마우스 하위 그룹 3c에 속하며, 이는 사람 하위 그룹 3에 상응한다[문헌 참조: Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242]. CDR-L1은 16개의 잔기를 포함하고 Vk의 표준 부류에 속한다. CDR-L2는 7개의 잔기를 포함하고 Vk의 부류 1에 속한다. CDR-L3은 9개의 잔기를 포함하고 Vk의 부류 1에 속한다[문헌 참조: Martin AC, Thornton JM. (1996) J Mol Biol. 263, 800-15]. 7D8의 위치 27에서의 류신은 다소 특이하며, 2A4의 글루타민은 보다 일반적이다. 모델은 측쇄가 결합 부위의 표면 상에 존재하고, 따라서 항원 결합에 중요해야 한다. CDR-H1은 5개의 잔기를 포함하고 부류 1에 속하고, CDR-H2는 19개의 잔기를 포함하고 부류 4에 속한다[문헌 참조: Martin & Thornton, 1996]. CDR-H3은 표준 부류를 갖지 않으나, 8개의 잔기 루프는 문헌[참조: Shirai et al. (1999) FEBS Lett. 455, 188-97]의 규칙에 따라 구부러진(kinked) 염기를 갖는다. 이는 모델에서 보존되지만, CDR-H3의 말단의 형태는 상이할 수 있다. Vk외 Vh 도메인 사이의 계면에서의 잔기는 2A4 Vk, 7D8 Vk 및 2A4 Vh에 대하여 일반적으로 공지된 것이다.
역 돌연변이의 선택을 안내하는 구조를 찾는 조사는 PDB 데이터베이스[문헌 참조: Deshpande et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33: D233-7]로 이루어진다. NCBI로부터의 비환원성 단백질 서열 데이터베이스의 조사는 마우스 CDR에 이식하는 적합한 사람 골격을 선택하게 하였다. Vk의 경우, NCBI 등록번호 제BAC01562호(gi:21669075)(서열번호 166)를 갖는 사람 카파 경쇄가 선택되었다. 이는 동일한 길이의 CDR-L3이고 사람 배선 VKIIA19/A3 및 사람 카파 하위 그룹 2에 속한다. J 영역에서만 상이한 유사한 골격은 NCBI 등록번호 제BAC01733호(gi:21669417)(서열번호 167)로 발견되었다. BAC01562는 2A4 Vk에 대한 골격으로서 사용되었고, BAC01733은 7D8 Vk에 대한 골격으로서 사용되었다. Vh의 경우, 사람 Ig 중쇄 AAC51024(gi:1791061)(서열번호 165)가 사용되었다[문헌 참조: Glas et al. (1997) Clin. Exp. Immunol. 107: 372-380]. 이는 사람 배선 VH3-72 및 사람 중쇄 하위 그룹 3에 속한다.
대표적인 사람화 2A4 경쇄 가변 영역을 서열번호 155, 156 및 157로서 나타낸다. 대표적인 사람화 7D8 경쇄 가변 영역을 서열번호 158, 159, 160, 174, 175 및 176으로 나타낸다. 대표적인 사람화 2A4/7D8 경쇄 가변 영역을 서열번호 161, 162 및 163으로 나타낸다[36a 내지 36e 참조].
본 발명의 대표적인 사람화 항체는 서열번호 152의 잔기 20-131, 서열번호 153의 잔기 20-131 및 서열번호 155, 156, 157, 157, 159, 160, 174, 175 및 176 중의 하나로부터 선택된 경쇄 가변 영역; 및 서열번호 154의 잔기 20-138 및 서열번호 161, 162 및 163 중의 하나로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다.
실시예 XV. 중증 전신성 AA 아밀로이드증을 갖는 마우스에서 MAb 2A4의 치료 효과
mAb 2A4의 치료 효능은 중증 전신성 AA 아밀로이드증을 갖는 H2/huIL-6 마우스에서 평가하였다. 사람 IL-6 이식 유전자를 구성적으로 발현하는 유전자도입 H2/huIL-6 마우스는 신속적 및 비가역적 전신성 AA 아밀로이드증인 것으로 입증되었다. 제1 및 제2 연구에서, 마우스에서 활성이 보고되지 않은 이소타입 매칭된 mAb TY-11으로 처리된 마우스는 대조군으로서 사용하였다. 아밀로이드 강화 인자를 투여하여 AA를 유도하기 전에, H2/huIL-6 마우스를 샘플링하고, 안구뒤 부비동을 통해 출혈되고, 혈청을 제조하고 및 시판중인 ELISA 키트를 사용하여 sAA 농도를 측정하였다. 대표적인 수치는 다음과 같다: 2196.7μg/ml, 823.91μg/ml, 1415.00μg/ml, 1673.01μg/ml, 814.53μg/ml, 1088.18μg/ml, 736.34μg/ml, 1546.35μg/ml, 953.70μg/ml, 886.46μg/ml, 평균 = 1213.4±478μg/ml.
제2 연구의 초기(0주)에, H2/huIL-6 마우스에 100μg의 아밀로이드 강화 인자(AEF)를 정맥내 주사하였다. AEF를 주사하여 AA 병변을 유도한 후, 마우스를 mAb 2A4 (13종 동물) 또는 TY11 (11종 동물)의 대체 팔다리에서 100μg의 주사를 5회 피하 투여하였다. AEF 주사 약 1주일 후 치료를 개시하였다. 각 처리 그룹에서 동물의 생존을 플롯팅하고 분석하였다. 결과를 표 7에 나타낸다. mAb TY11 처리된 마우스의 45%만이 연구 종료까지 생존하였다. 대조적으로, 2A4 처리된 마우스는 연구 과정에서 전혀 사망하지 않았다. 표준 방법을 사용한 생존 데이터의 분석은 두 그룹에서 생존 곡선(P<0.0025)에서 현저한 차이를 나타냈다. TY11 처리된 마우스의 평균 생존은 41일로 계산되었고, 이전 연구(38.5일)에서 관찰된 것과 비교할 수 있다.
[표 7]
Figure 112010048814606-pct00068
AEF 투여 후 6주째에, 마우스를 출혈시켜 희생시키고, 추가의 분석을 위해 기관을 수확하였다. 간 및 비장에서 아밀로이드의 정량화를 위해, 콩고 레드 복굴절을 교차 편광 조명 하에 현미경적으로 시각화하고 디지털 방식으로 기록하였다. 아밀로이드 관련 화소를 (분광 분할 방법을 사용하여) 선택하고 정량화함으로써 복굴절성 물질의 면적을 측정하였다. 아밀로이드 함량의 척도인 아밀로이드 부하 지수(ABI)는 각각의 기관에서 아밀로이드에 의해 점유된 면적률로 표현하였다. 2A4 및 TY11 처리된 마우스의 간 및 비장에서 아밀로이드의 정량화는 2개의 처리 사이에서 현저한 차이를 보이지 않았다. 그러나, 2A4 처리된 마우스와 비교하여 42일까지 생존한 TY11 처리된 마우스는 병의 정도 또는 AA 아밀로이드의 분포를 진행시켜 사망에 이르지 않았다. 또한, 생존 연구 과정 동안 간비장 아밀로이드 부하를 모니터링하여 사망과 관련된 아밀로이드 부하에서의 증가를 평가하였다.
제3 연구에서, mAb 2A4를, 마우스에서 반응성이 보고되지 않은 이소타입 매칭된 mAb JH70과 비교하였다. 또한, 혈액 화학 및 기타 매개변수를 처리 기간 동안 모니터링하였다. 8/1/2008과 9/7/2008 사이에 태어난 수컷 및 암컷 H2/huIL-6 마우스를 본 연구에 사용하였다. 23마리의 암컷 마우스와 16마리의 수컷 마우스를 안구뒤 부비동을 통해 출혈시켰다. 전혈을 혈중요소질소(BUN) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 화학 특성화에 사용하여 VetScan VS2(Abaxis, Union City, CA)를 이용하여 신장 및 간 기능을 측정하였다. 12가지의 기타 단백질의 혈청 농도 및 분석물을 동시에 측정하였다. VetScan HM5 플랫폼을 사용하여 전혈구 계산(CBC)을 수행하였다. 추가로, 5mg/ml의 소혈청 알부민 중의 저용량(약 50 내지 60μCi)의 방사선 요오드화 사람 혈청 아밀로이드 P 성분(125I-SAP)을 각각의 마우스에 투여하여 질병 진행의 개시 전에 마우스의 아밀로이드 부하를 평가하였다. 각각의 마우스를 용량 보정기에 배치함으로써 주사 후(pi) 24시간째에 유지된 125I-SAP의 함량을 측정하였다. 유전자도입되지 않은 마우스(대조군)에서 관찰된 것보다 큰 125I-SAP 보유는 아밀로이드 질병을 나타낸다. 마지막으로, 혈청을 사용하여 혈청 아밀로이드 단백질 A(sAA)의 농도를 시판용 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 각각의 마우스에 대한 이러한 전처리 데이터, 선택된 혈액 화학 수치 및 처리의 요약을 표 8 및 9에 나타낸다.
Figure 112010048814606-pct00069
Figure 112010048814606-pct00070
제3 연구 초기(0주)에, H2/huIL-6 마우스 모두에 100μg의 아밀로이드 강화 인자(1mg/ml)를 정맥내 투여하였다. 1주일 후, 치료를 시작하였고, 표 8에 요약된 바와 같이 각각의 마우스에 2A4 또는 JH70 sc를 100μg 투여하였다. 7주 동안 매주마다 mAb를 계속 주사하였다.
AEF 주사 후 2주째에, 안구뒤 부비동을 통해 수집된 혈액을 사용하여 CBC, 혈액 화학 및 혈청 sAA를 측정하였다. 이때도 또한, 상기한 바와 같이 그룹 1의 마우스에 BSA 중의 약 60μCi의 125I-SAP를 투여하여 방사선 표지된 SAP의 보유에 의해 입증되는 아밀로이드의 축적을 평가하였다. 몇 마리의 동물은 극한 고통의 부작용을 나타냈고, 따라서 125I-SAP를 사용하는 아밀로이드의 평가를 중단시켰다. AEF 주사 후 2주째에 수득된 소정의 혈액 화학 매개변수의 결과를 표 10에 나타낸다.
Figure 112010048814606-pct00071
AEF 주사 후 8주째에, 마우스를 출혈시킨 직후, 캐리어로서 5% 정상 마우스 혈청을 사용하여 약 200μCi의 125I-SAP를 투여하였다. 이러한 처리와 반응하여, 몇 마리의 동물은 30분 이내에 감소되는 약간 특이한 거동을 나타냈다. 24시간 후, 마우스에 X선 CT 조영제(약 200μl, 꼬리 정맥에서 정맥내)를 주사하고, 이어서 과량의 이소플루란으로 희생시켰다. 각각의 동물의 단일광자방출(SPECT) 및 X선(CT) 단층촬영 영상을 수득하였다. 기관을 수확하고, 각각의 샘플에서 방사성의 양을 계산하고, % 주사량/g 조직으로 표현하였다. 추가로, 절편 및 현미경 분석 준비를 위해 각각의 조직의 일부를 완충된 포르말린으로 밤새 고정시켰다.
7주 치료 연구 동안, 2마리의 마우스는 사망한 채로 발견되었고, 3마리는 밤새 생존할 것 같지 않아 보이고 불량한 신체 조건 점수(< 2; 체중 감소 15% 이상 관련)를 갖기 때문에 희생시켰다. 125I-SAP 주사에 대하여 부정적인 반응을 보인 마우스 및 안구뒤 출혈로부터 발생한 합병증에 기인하여 희생된 1마리 마우스는 생존 분석의 일부로서 평가하지 않았다. 각각의 mAb 치료그룹에서 마우스의 생존을 표 11에 나타낸다.
Figure 112010048814606-pct00072
평가할 수 있었던 mAb JH70 처리된 마우스의 약 65%는 연구 종료까지 생존하였다. 대조적으로, 평가할 수 있었던 2A4 마우스는 57일 동안 전혀 사망하지 않았다. 표준 방법을 사용하는 생존 데이터의 분석은 생존 곡선(Mantel-Cox 시험을 사용하는 P=0.015 및 Grehan-Breslow-Wilcoxon 시험을 사용하는 P=0.016)에서 현저한 차이를 입증하였다.
각각의 마우스에 제공된 치료에 따라 최종 혈액 화학 데이터를 분석하였다. 수컷 및 암컷 H2/huIL-6 마우스와 관련된 평균 매개변수 값에서의 차이 때문에(희생 시점에, 암컷 마우스에서의 BUN 수준은 2A4 처리된 마우스와 JH70 처리된 마우스 모두에 대하여 높았다), 생존한 암컷 마우스만이 하기 표 12에 포함된다.
Figure 112010048814606-pct00073
2A4로 처리된 마우스는 혈청 혈중요소질소(BUN) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 수준이 JH70 처리된 마우스와 비교하여 감소한 것으로 나타났다. BUN 및 ALT는 각각 신장 및 간 기능의 지표이고, 이의 수준 감소는 기관 기능이 2A4 치료에 의해 더욱 보존될 수 있음을 나타낸다.
ATCC PTA-9468 20080905 ATCC PTA-9662 20081217
<110> Elan Pharmaceuticals, Inc. <120> Treatment and prophylaxis of amyloidosis <130> 021452-0376734 <150> US 61/007,544 <151> 2007-12-28 <150> US 61/095,932 <151> 2008-09-10 <160> 177 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys Ser Leu Val Leu Gly Val 1 5 10 15 Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala 20 25 30 Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile 35 40 45 Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys 50 55 60 Arg Gly Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Glu Val Ile Ser Asp Ala Arg 65 70 75 80 Glu Asn Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala 85 90 95 Asp Gln Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His 100 105 110 Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120 <210> 2 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human amyloid protein A peptide <400> 2 Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp 1 5 10 15 Met Tyr Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser 20 25 30 Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly 35 40 45 Pro Gly Gly Ala Tyr Ala Ala Glu Val Ile Ser Asp Ala Arg Glu Asn 50 55 60 Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser 65 70 75 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from amyloidosis peptide <400> 3 Gly His Glu Asp Thr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from amyloid A protein <400> 4 Gly His Gly Ala Glu Asp Ser 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from amyloid A protein <400> 5 Gly His Asp Ala Glu Asp Ser 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from amyloid protein <400> 6 Gly His Gly Ala Glu Asp Ser 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from amyloid A protein <400> 7 Gly Asp His Ala Glu Asp Ser 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from amyloid A protein <400> 8 Ser Thr Val Ile Glu Asp Ser 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from amyloid A protein <400> 9 Gly Arg Gly His Glu Asp Thr 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from amyloid A protein <400> 10 Gly His Gly Ala Glu Asp Ser 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from amyloid A protein <400> 11 Asn His Gly Leu Glu Thr Leu 1 5 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from amyloidosis peptide <400> 12 His Glu Asp Thr 1 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 13 Ala Glu Asp Ser 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 14 Ala Glu Asp Thr 1 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 15 His Glu Asp Ala 1 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AL V lambda fragment from amyloid protein <400> 16 Thr Glu Asp Glu 1 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AL V lambda fragment from amyloid protein <400> 17 Phe Glu Asp Asp 1 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AL V lambda fragment from amyloid protein <220> <221> MISC_FEATURE <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 18 Ser Glu Asp Glu 1 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AL V lambda fragment from amyloid protein <220> <221> MISC_FEATURE <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 19 Ala Glu Asp Glu 1 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AL V lambda fragment from amyloid protein <400> 20 Pro Glu Asp Glu 1 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AL V kappa fragment from amyloid protein <220> <221> MISC_FEATURE <223> Consensue sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 21 Pro Glu Asp Ile 1 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AL V kappa fragment from amyloid protein <220> <221> MISC_FEATURE <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 22 Pro Glu Asp Phe 1 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AL V kappa fragment from amyloid protein <220> <221> MISC_FEATURE <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 23 Ala Glu Asp Val 1 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AL V kappa fragment from amyloid protein <220> <221> MISC_FEATURE <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 24 Ser Glu Asp Phe 1 <210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> AL V kappa fragment from amyloid protein <400> 25 Ser Glu Asp Ala 1 <210> 26 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 26 Pro Glu Asp Ser 1 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 27 Pro Glu Asp Leu 1 <210> 28 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 28 Thr Glu Asp Val 1 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 29 Ser Glu Asp Ile 1 <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 30 Thr Glu Asp Thr 1 <210> 31 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 31 Leu Glu Asp Gly 1 <210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 32 Ala Glu Asp Met 1 <210> 33 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 33 His Glu Asp Ser 1 <210> 34 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 34 Cys Glu Asp Asp 1 <210> 35 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 35 Gln Glu Asp Ser 1 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 36 Arg Glu Asp Ser 1 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 37 Thr Glu Asp Gly 1 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 38 Gln Glu Asp Arg 1 <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 39 Thr Glu Asp Leu 1 <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 40 Pro Glu Asp Asn 1 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 41 Glu Glu Asp Pro 1 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 42 Leu Glu Asp Leu 1 <210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 43 Lys Glu Asp Ala 1 <210> 44 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 44 Ser Glu Asp Cys 1 <210> 45 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 45 Glu Glu Asp Asp 1 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 46 Ser Glu Asp Lys 1 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 47 Asp Glu Asp Asp 1 <210> 48 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 48 Asp Glu Asp Gly 1 <210> 49 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 49 Leu Glu Asp Glu 1 <210> 50 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 50 Gly Glu Asp Ala 1 <210> 51 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 51 Val Glu Asp Phe 1 <210> 52 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 52 Tyr Glu Asp Glu 1 <210> 53 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 53 Ile Glu Asp Leu 1 <210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 54 Trp Glu Asp Tyr 1 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 55 Asp Glu Asp Trp 1 <210> 56 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 56 Ser Glu Asp Leu 1 <210> 57 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 57 Tyr Glu Asp Gln 1 <210> 58 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 58 Leu Glu Asp Trp 1 <210> 59 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 59 Tyr Glu Asp Arg 1 <210> 60 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 60 Pro Glu Asp Lys 1 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Non-amyloid portion of serum amyloid A protein <400> 61 Gly His Glu Asp Thr Met Ala Asp Gln Glu 1 5 10 <210> 62 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 62 Ala Glu Asp Ala 1 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 63 Gln Glu Asp Leu 1 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 64 Val Glu Asp Leu 1 <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 65 Leu Glu Asp Ala 1 <210> 66 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus sequence derived from human amyloidogenic proteins <400> 66 Ser Glu Asp Gly 1 <210> 67 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from Malaria CS <220> <221> MISC_FEATURE <223> T3 epitope <400> 67 Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val 1 5 10 15 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from Hepititis B surface antigen residues 19-28 <400> 68 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 1 5 10 <210> 69 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from mycobacterium heat shock protein 65 residues 153-171 <400> 69 Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly 1 5 10 15 Asn Glu Gly <210> 70 <211> 14 <212> PRT <213> Bicille calmette-guerin <400> 70 Gln Val His Phe Gln Pro Leu Pro Pro Ala Val Val Lys Leu 1 5 10 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from Tetanus toxoid residues 830-844 <400> 71 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 72 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from Tetanus toxoid residues 947-967 <400> 72 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> HIV <220> <221> MISC_FEATURE <223> HIV gb120 T1 <400> 73 Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 10 15 <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Pan DR epitope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 74 Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 75 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein derived from Tetanus toxoid residues 830-844 and 947-967 <400> 75 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe 1 5 10 15 Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala 20 25 30 Ser His Leu Glu 35 <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from ovalbumin residues 323-389 <400> 76 Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg <210> 77 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from hemagglutinin influenza A virus <400> 77 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 78 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein derived from hemagglutinin influenza A residues 307-319, Malaria CD: T3 epitope, tetanus toxoid residues 830-844 and 947-967 <400> 78 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Glu Lys Lys 1 5 10 15 Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val Gln Tyr Ile 20 25 30 Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe 35 40 45 Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu 50 55 60 Glu 65 <210> 79 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion protein <400> 79 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys 1 5 10 15 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 20 25 30 Ala Ser His Leu Glu 35 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from human amyloid A protein <400> 80 Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from human amyloid A protein <400> 81 Gln Gly Trp Leu Thr Phe Leu Lys Ala Ala Gly Gln Gly Ala Lys 1 5 10 15 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from mouse amyloid A protein <400> 82 Glu Ser Trp Arg Ser Phe Phe Lys Glu Ala 1 5 10 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from mouse amyloid A protein <400> 83 Gly Phe Phe Ser Phe Val His Glu Ala Phe Gln Gly Ala Gly Asp 1 5 10 15 <210> 84 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from mouse amyloid A protein <400> 84 Glu Ala Gly Gln Gly Ser Arg Asp 1 5 <210> 85 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from mouse amyloid A protein <400> 85 Trp Tyr Ser Phe Phe Arg Glu Ala Val Gln Gly Thr Trp Asp 1 5 10 <210> 86 <211> 99 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Lambda 2 fragments from human amyloid deposits <400> 86 Gly Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Arg Gln 1 5 10 15 Thr Val Ala Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ala Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Arg Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Leu <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from serum amyloid A protein <400> 87 Cys Gly Gly His Glu Asp Thr 1 5 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from serum amyloid A protein <400> 88 Cys Gly Gly Ala Glu Asp Ser 1 5 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from serum amyloid A protein <400> 89 Gly His Glu Asp Thr Ile Ala Asp Gln Glu 1 5 10 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from serum amyloid A protein <400> 90 Cys Gly Gly Ala Glu Asp Thr 1 5 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from serum amyloid A protein <400> 91 Cys Gly Gly His Ala Asp Thr 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from serum amyloid A protein <400> 92 Cys Gly Gly His Glu Ala Thr 1 5 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from serum amyloid A protein <400> 93 Cys Gly Gly His Glu Asp Ala 1 5 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from serum amyloid A protein <400> 94 Cys Gly Gly His Glu Asp Thr Met 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from serum amyloid A protein <400> 95 Cys Gly Gly His Glu Asp Thr Met Ala 1 5 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from serum amyloid A protein <400> 96 Cys Gly Gly His Glu Asp Thr Met Ala Asp 1 5 10 <210> 97 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Derived from serum amyloid A protein <400> 97 Cys Gly Gly His Glu Asp 1 5 <210> 98 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> HSAA1 <400> 98 Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys Ser Leu Val Leu Gly Val 1 5 10 15 Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala 20 25 30 Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile 35 40 45 Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys 50 55 60 Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Ala Ile Ser Asp Ala Arg 65 70 75 80 Glu Asn Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala 85 90 95 Asp Gln Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His 100 105 110 Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120 <210> 99 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> HSAA2 <400> 99 Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys Ser Leu Val Leu Ser Val 1 5 10 15 Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala 20 25 30 Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile 35 40 45 Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys 50 55 60 Arg Gly Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Glu Val Ile Ser Asn Ala Arg 65 70 75 80 Glu Asn Ile Gln Arg Leu Thr Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala 85 90 95 Asp Gln Ala Ala Asn Lys Trp Gly Arg Ser Gly Arg Asp Pro Asn His 100 105 110 Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120 <210> 100 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> HSAA3 <400> 100 Met Lys Leu Ser Thr Gly Ile Ile Phe Cys Ser Leu Val Leu Gly Val 1 5 10 15 Ser Ser Gln Gly Trp Leu Thr Phe Leu Lys Ala Ala Gly Gln Gly Ala 20 25 30 Lys Asp Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Lys Glu Ala Asn Tyr Lys 35 40 45 Lys Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Val Gln 50 55 60 Arg Gly Pro Gly Gly Val Trp Ala Thr Glu Val Ile Ser Asp Ala Arg 65 70 75 80 Glu Asn Val Gln Arg Leu Thr Gly Asp His Ala Glu Asp Ser Leu Ala 85 90 95 Gly Gln Ala Thr Asn Lys Trp Gly Gln Ser Gly Lys Asp Pro Asn His 100 105 110 Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 115 120 <210> 101 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> HSAA4 <400> 101 Met Arg Leu Phe Thr Gly Ile Val Phe Cys Ser Leu Val Met Gly Val 1 5 10 15 Thr Ser Glu Ser Trp Arg Ser Phe Phe Lys Glu Ala Leu Gln Gly Val 20 25 30 Gly Asp Met Gly Arg Ala Tyr Trp Asp Ile Met Ile Ser Asn His Gln 35 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120 <210> 119 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> HAA1 beta isoform <400> 119 Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp 1 5 10 15 Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser 20 25 30 Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly 35 40 45 Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Ala Ile Ser Asp Ala Arg Glu Asn 50 55 60 Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln 65 70 75 80 Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His Phe Arg 85 90 95 Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr 100 <210> 120 <211> 102 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Serum amyloid A protein <400> 120 Gly Phe Phe Ser Phe Ile Gly Glu Ala Phe Gln Gly Ala Gly Asp Met 1 5 10 15 Trp Arg Ala Tyr Thr Asp Met Lys Glu Ala Gly Trp Lys Asp Gly Asp 20 25 30 Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Gln Arg Gly Pro 35 40 45 Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Lys Ile Ser Asp Ala Arg Glu Ser Gln 50 55 60 Glu 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kappa light chain <400> 123 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser 85 90 95 <210> 124 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> kplb <220> <221> MISC_FEATURE <223> Germline sequences of V kappa light chain <400> 124 Ser Gln Asp Asn Tyr Asn Asp Asn Thr Asp Phe Glu Ile Asp Asn Leu 1 5 10 15 Pro <210> 125 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> kplc <220> <221> MISC_FEATURE <223> Germline sequences of V kappa light chain <400> 125 Ser Tyr Asn Ala Gln Asp Glu Ser Tyr Thr Pro 1 5 10 <210> 126 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> kpld <220> <221> MISC_FEATURE <223> Germline sequences of V kappa light chain <400> 126 Ser Gly Arg Asn Asp Gly Arg Ala Gln Glu Leu His Pro 1 5 10 <210> 127 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> kple <220> <221> MISC_FEATURE <223> Germline sequences of V kappa light chain <400> 127 Ser Gly Asn Tyr Phe Ser Ala Gln Asp Glu Pro 1 5 10 <210> 128 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> kplf <220> <221> MISC_FEATURE <223> Germline sequences of V kappa light chain <400> 128 Ala Leu Ser Gly Ala Asp Asp Glu Phe Asn Pro 1 5 10 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> kplg <220> <221> MISC_FEATURE <223> Germline sequences of V kappa light chain <400> 129 Ser Val Gly Ala Gln Asp Glu Ala Phe Pro 1 5 10 <210> 130 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> kp2a <220> <221> MISC_FEATURE <223> Germline sequences of V kappa light chain <400> 130 Val Thr Leu Ser 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MISC_FEATURE <223> Germline sequences of V lambda light chain <400> 136 Val Asp Ser Ala Val Leu Glu Ala Asn Lys Ser Val Leu Tyr Ser Ser 1 5 10 15 Asn Asn Lys Asn Tyr Gln Pro Trp Thr Arg Asp Asp Ala Glu Val Val 20 25 30 Tyr Thr Pro 35 <210> 137 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> kp5 <220> <221> MISC_FEATURE <223> V lambda light chain <400> 137 Glu Thr Thr Leu Ala Phe Met Thr Pro Lys Asn Ser Lys Asp Asp Asp 1 5 10 15 Asp Met Asn Glu Ala Ile Phe Ile Gln Glu Thr Thr Val Pro Ile Pro 20 25 30 Tyr Asp Asn Asn Ile Glu Ser Glu Ala Tyr Phe Leu His Asp Asn Phe 35 40 45 Pro <210> 138 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> lmla <220> <221> MISC_FEATURE <223> V lambda light chain <400> 138 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser 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MISC_FEATURE <223> lm2b <220> <221> MISC_FEATURE <223> V lambda light chain <400> 142 Ala Arg Gly Ser Val Ile Thr Thr Asp Val Gly Tyr His Lys Met Asp 1 5 10 15 Val Ser Val Asn Thr Ser Thr Ser Ala Glu Cys Ser Tyr Ala Gly Tyr 20 25 30 Thr Phe <210> 143 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> lm3a <220> <221> MISC_FEATURE <223> V lambda light chain <400> 143 Ser Tyr Val Lys Thr Ala Arg Thr Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser 1 5 10 15 His Lys Gln Val Val Val Asp Asp Ser Asp Glu Asn Asn Thr Thr Ser 20 25 30 Arg Val Glu Ala Gln Val Ser Asp His 35 40 <210> 144 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> lm3b <220> <221> MISC_FEATURE <223> V lambda light chain <400> 144 Ser Tyr Glu Val Ser Thr Ala Arg Thr Asp Ala Leu Pro Lys Gln Ala 1 5 10 15 Tyr Lys Gln Val Val Lys Asp Ser Glu Glu Ser Thr Val Thr Ser Val 20 25 30 Ala Glu Gln Ser Ala Gly 35 <210> 145 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> lm3c <220> <221> MISC_FEATURE <223> V lambda light chain <400> 145 Ser Tyr Glu Val Ser Thr Ala Ser Thr Asp Lys Leu Gly Asp Lys Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Ser Val Val Gln Asp Ser Glu Asn Asn Thr Thr Ser Thr 20 25 30 Ala Met Gln Ala Thr Ala His 35 <210> 146 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> lm4 <220> <221> MISC_FEATURE <223> V lambda light chain <400> 146 Ser Glu Asp Ala Val Leu Thr Arg Thr Gln Asp Leu Arg Ser Tyr Ala 1 5 10 15 Lys Gln Val Val Gly Lys Asn 20 <210> 147 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> lm6 <220> <221> MISC_FEATURE <223> V lambda light chain <400> 147 Asn Phe Met His Glu Ser Lys Thr Thr Arg Gly Ser Ala Ser Gln Arg 1 5 10 15 Ser Ser Thr Thr Val Asp Gln Val Ile Asp Ser Ser Asn Ser Thr Ser 20 25 30 Lys Glu Gln Ser Tyr Asn 35 <210> 148 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> lm7 <220> <221> MISC_FEATURE <223> V lambda light chain <400> 148 Thr Val Glu Leu Thr Val Ser Gly Thr Leu Thr Ala Ser Thr 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kappa light chain version 2 <400> 159 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 160 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized 7D8 v kappa light chain version 3 <400> 160 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 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Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 167 <211> 276 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human v kappa light chain framework <400> 167 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser 20 25 30 Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu 50 55 60 Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 85 90 95 Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 130 135 140 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 145 150 155 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Claims (103)

  1. 서열번호 2로 제시된 사람 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 서열번호 2로 제시된 사람 아밀로이드 A 펩타이드에 결합하는 것에 대해 ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성되는 항체 2A4와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성되는 항체 2A4의 사람화된 또는 키메라 형인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 168, 169 및 170으로 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 171, 172 및 173으로 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 서열번호 157로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 사람 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번 내의 에피토프에 특이적으로 결합하고, ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성되는 항체 2A4의 사람화된 또는 키메라 형인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 사람 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번 내의 에피토프에 특이적으로 결합하고, ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성되는 항체 2A4의 사람화된 또는 키메라 형인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 서열번호 157로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 사람 아밀로이드 A 펩타이드의 잔기 70번 내지 76번 내의 에피토프에 특이적으로 결합하고, ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성되는 항체 2A4의 사람화된 또는 키메라 형인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제8항에 있어서, ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성되는 쥐 모노클로날 항체 2A4의 사람화된 형인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 서열번호 168, 169 및 170으로 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 171, 172 및 173으로 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성되는 쥐 모노클로날 항체 2A4인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제11항에 있어서, ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성되는 쥐 모노클로날 항체 2A4의 사람화된 형인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성되는 쥐 모노클로날 항체 2A4 또는 이의 사람화된 또는 키메라 형인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 서열번호 152의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 경쇄 가변 영역 및 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로 제시된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제14항에 있어서, 서열번호 152의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 2A4 경쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 캐뱃 (Kabat) 넘버링 규정에 따라 각각 Y 및 F에 의해 점유되는 L87 및 L90으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 골격 잔기를 포함하고, 경쇄 가변 영역의 나머지가 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역내 상응하는 잔기에 의해 점유되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제16항에 있어서, 선형 넘버링에 따라 각각 T, S, L, D, Q, K, Y, L, F 및 L에 의해 점유되는 +7, +14, +15, +17, +18, +50, +75, +88, + 92 및 +109로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 골격 잔기를 포함하고, 경쇄 가변 영역의 나머지가 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역내 상응하는 잔기에 의해 점유되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제18항에 있어서, 선형 넘버링에 따라 각각 Y 및 F에 의해 점유되는 +75 및 +92로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 골격 잔기를 포함하고, 경쇄 가변 영역의 나머지가 사람 어셉터 면역글로불린 경쇄 가변 영역내 상응하는 잔기에 의해 점유되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제14항에 있어서, 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로 제시된 2A4 중쇄 가변 영역의 3개의 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 제20항에 있어서, 캐뱃 넘버링 규정에 따라 각각 I, A, F 또는 V에 의해 점유되는 H37, H49, H70 및 H93으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 골격 잔기를 포함하고, 중쇄 가변 영역의 나머지가 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역내 상응하는 잔기에 의해 점유되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 제20항에 있어서, 선형 넘버링에 따라 각각 R, K, K, I, A, F, Q, S, M, N, M, V 또는 A에 의해 점유되는 +10, +15, +19, + 37, +49, +73, +78, +79, +80, +87, +95, +99, +119로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 골격 잔기를 포함하고, 중쇄 가변 영역의 나머지가 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역내 상응하는 잔기에 의해 점유되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  23. 제22항에 있어서, 선형 넘버링에 따라 각각 I, A, F 또는 V에 의해 점유되는 +37, +49, +73 및 +99로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 골격 잔기를 포함하고, 중쇄 가변 영역의 나머지가 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역내 상응하는 잔기에 의해 점유되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  24. 제14항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로서 제시되거나 서열번호 161, 162 또는 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 제14항에 있어서, 서열번호 152의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 2A4 경쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로 제시된 2A4 중쇄 가변 영역의 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. 제14항에 있어서, 서열번호 168, 169 및 170번으로 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 171, 172 및 173으로 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  27. 제25항에 있어서, 서열번호 152의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  28. 제25항에 있어서, 서열번호 155, 156 또는 157로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 161, 162 또는 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  29. 제28항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열번호 157로 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  30. 제17항에 있어서, 캐뱃 넘버링 규정에 따라 각각 I, A, F 또는 V에 의해 점유되는 H37, H49, H70 및 H93으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 골격 잔기를 포함하고, 중쇄 가변 영역의 나머지가 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역내 상응하는 잔기에 의해 점유되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  31. 제18항에 있어서, 선형 넘버링에 따라 각각 R, K, K, I, A, F, Q, S, M, N, M, V 또는 A에 의해 점유되는 +10, +15, +19, + 37, +49, +73, +78, +79, +80, +87, +95, +99, +119로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 골격 잔기를 포함하고, 중쇄 가변 영역의 나머지가 사람 어셉터 면역글로불린 중쇄 가변 영역내 상응하는 잔기에 의해 점유되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  32. 혈청 아밀로이드 A (SAA) 단백질의 단백질용해 절단에 의해 형성되는 아밀로이드 A (AA) 단백질 내의 노출된 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 이의 항원-결합 단편.
  33. 제32항에 있어서, AA 단백질이 서열번호 13으로 제시된 서열 AEDS를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  34. 제32항에 있어서, 절단 부위에 결쳐있는 (spanning) 펩타이드에는 특이적으로 결합하지 않는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  35. 응집된 경쇄 면역글로불린 단백질 내의 노출된 에피토프에 특이적으로 결합하고, 상기 경쇄 면역글로불린 단백질은 서열 X1EDX2를 포함하며, 상기 서열에서 X1은 F, Y, S, A, T 또는 P이고 X2는 N, D, F, I, V, A 또는 E인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  36. 제35항에 있어서, 서열 X1EDX2가 FEDD, SEDE, AEDE, TEDE 및 PEDE로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  37. 제35항에 있어서, 서열 X1EDX2가 PEDI, PEDF, AEDV, SEDF 및 SEDA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  38. 사람 AL 아밀로이드 단백질에 결합하는 것에 대해 ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성되는 항체 2A4와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  39. 제38항에 있어서, 107 M-1 미만의 친화도로 면역글로불린 경쇄 단백질의 응집된 형태에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  40. 서열번호 86의 위치 81 및 82에 각각 상응하는 위치에 Glu 및 Asp를 포함하는 면역글로불린 경쇄 단백질의 응집된 형태 내의 노출된 잠재 (cryptic) 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  41. 제40항에 있어서, 107 M-1 미만의 친화도로 면역글로불린 경쇄 단백질의 응집된 형태에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  42. 제1항 내지 제34항 중의 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 포함하는, 아밀로이드 A 아밀로이드증을 가진 대상체를 치료학적 또는 예방학적으로 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 아밀로이드 A 아밀로이드증이 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선 관절병증, 라이터 증후군, 성인 스틸 (Still) 질환, 베체트 증후군, 크론 질환, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창 궤양, 만성 신우신염, 골수염, 휘플 (Whipple) 질환, 호지킨 림프종, 신장 암종, 장, 폐 및 비뇨생식기의 암종, 기저세포 암종, 모발 세포 백혈병, 가족성 지중해열 또는 캐슬맨 (Castleman) 질환과 관련이 있는, 약제학적 조성물.
  44. 제1항 내지 제31항 및 제35항 내지 제41항 중의 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편의 유효량을 포함하는, AL 아밀로이드증을 가진 대상체를 치료학적 또는 예방학적으로 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  45. 제44항에 있어서, AL 아밀로이드증이 말초 또는 자율 신경병증, 손목굴 증후군, 대설증, 제한적 심근병증, 대형 관절의 관절병증, 면역 질환, 골수종, 모노클로날 감마글로불린병증, 잠재 질환 또는 만성 염증성 질환과 관련이 있는 약제학적 조성물.
  46. 제45항에 있어서, AL 아밀로이드증이 B 림프구 계열의 질환과 관련이 있는, 약제학적 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 질환이 암인, 약제학적 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 암이 다발성 골수종인, 약제학적 조성물.
  49. 응집된 AL 단백질 내의 서열 X1EDX2를 포함하는 에피토프에 특이적 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 포함하여 AL 아밀로이증을 치료하고, 상기 서열에서 X1은 H, L, C, Q, R 또는 E 이고 X2는 T, S, E, R, G, M, L 또는 P인, 아밀로이드 경쇄형 단백질 원섬유 (fibril)의 존재를 특징으로 하는 AL 아밀로이드증을 가진 사람 환자를 치료학적 또는 예방학적으로 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, AL 아밀로이드증이 말초 또는 자율 신경병증, 손목굴 증후군, 대설증, 제한적 심근병증, 대형 관절의 관절병증, 면역 질환, 골수종, 모노클로날 감마글로불린병증, 잠재 질환 또는 만성 염증성 질환과 관련이 있는, 약제학적 조성물.
  51. 제50항에 있어서, AL 아밀로이드증이 B 림프구 계열의 질환과 관련이 있는, 약제학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 질환이 암인, 약제학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 암이 다발성 골수종인, 약제학적 조성물.
  54. 제49항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편이 응집된 AL 단백질 내의 서열번호 13으로 제시된 아미노산 서열 AEDS를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는, 약제학적 조성물.
  55. 서열번호 3으로 제시된 GHEDT를 포함하는 펩타이드에 대해 생성된 항체 또는 이의 단편을 포함하여 AL 아밀로이증을 치료하도록 하는, 아밀로이드 경쇄형 단백질 원섬유의 존재를 특징으로 하는 AL 아밀로이드증을 가진 사람 환자를 치료학적 또는 예방학적으로 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  56. 제49항 또는 제55항에 있어서, 항체 또는 이의 단편이 키메라 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 단일쇄 항체, 4량체 항체, 4가 항체, 다중특이적 항체, 도메인-특이적 항체, 도메인-결실된 항체, 융합 단백질, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 또는 ScFv 단편인, 약제학적 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 항체 또는 이의 단편이 키메라 또는 사람화된 항체 또는 이의 단편인, 약제학적 조성물.
  58. 제49항 또는 제55항에 있어서, 항체 또는 이의 단편이 107 M-1 미만의 친화도로 단량체성 AL 단백질에 결합하는, 약제학적 조성물.
  59. 검출가능한 표지에 결합된 제1항 내지 제34항 중의 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는, 대상체에서 AA 아밀로이드증과 관련된 아밀로이드 축적물을 검출하기 위한 약제학적 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 아밀로이드 A 아밀로이드증이 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선 관절병증, 라이터 증후군, 성인 스틸 질환, 베체트 증후군, 크론 질환, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창 궤양, 만성 신우신염, 골수염, 휘플 (Whipple) 질환, 호지킨 림프종, 신장 암종, 장, 폐 및 비뇨생식기의 암종, 기저세포 암종, 모발 세포 백혈병, 가족성 지중해열 또는 캐슬맨 (Castleman) 질환과 관련이 있는, 약제학적 조성물.
  61. 제59항에 있어서, 검출가능한 표지가 방사선표지인, 약제학적 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 방사선표지가 125I인, 약제학적 조성물.
  63. 제59항에 있어서, 검출을 SPECT/CT 영상화에 의해 수행하는, 약제학적 조성물.
  64. 제59항에 있어서, 검출을 NMR 분광법에 의해 수행하는, 약제학적 조성물.
  65. 검출가능한 표지에 결합된 제1항 내지 제31항 및 제35항 내지 제41항 중의 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는, 대상체에게서 AL 아밀로이드증과 관련된 아밀로이드 축적물을 검출하기 위한 약제학적 조성물.
  66. 제65항에 있어서, AL 아밀로이드증이 말초 또는 자율 신경병증, 손목굴 증후군, 대설증, 제한적 심근병증, 대형 관절의 관절병증, 면역 질환, 골수종, 모노클로날 감마글로불린병증, 잠재 질환 또는 만성 염증성 질환과 관련이 있는, 약제학적 조성물.
  67. 제66항에 있어서, AL 아밀로이드증이 B 림프구 계열의 질환과 관련이 있는, 약제학적 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 질환이 암인, 약제학적 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 암이 다발성 골수종인, 약제학적 조성물.
  70. 제65항에 있어서, 검출가능한 표지가 방사선표지인, 약제학적 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 방사선표지가 125I인, 약제학적 조성물.
  72. 제65항에 있어서, 검출을 SPECT/CT 영상화에 의해 수행하는, 약제학적 조성물.
  73. 제65항에 있어서, 검출을 NMR 분광법에 의해 수행하는, 약제학적 조성물.
  74. 서열번호 177, 169 및 170으로 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 171, 172 및 173으로 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 검출가능한 표지에 결합되는, 대상체에서 아밀로이드 축적물을 검출하기 위한 약제학적 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 아밀로이드 축적물이 아밀로이드 A 단백질 원섬유의 존재를 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  76. 제74항에 있어서, 대상체가 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 건선 관절병증, 라이터 증후군, 성인 스틸 질환, 베체트 증후군, 크론 질환, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창 궤양, 만성 신우신염, 골수염, 휘플 (Whipple) 질환, 호지킨 림프종, 신장 암종, 장, 폐 및 비뇨생식기의 암종, 기저세포 암종, 모발 세포 백혈병, 가족성 지중해열 또는 캐슬맨 (Castleman) 질환과 관련이 있는 아밀로이드 A 아밀로이드증을 앓고 있거나 앓기 쉬운 대상체인, 약제학적 조성물.
  77. 제74항에 있어서, 아밀로이드 축적물이 아밀로이드 경쇄형 단백질 원섬유의 존재를 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  78. 제77항에 있어서, 대상체가 말초 또는 자율 신경병증, 손목굴 증후군, 대설증, 제한적 심근병증, 대형 관절의 관절병증, 면역 질환, 골수종, 모노클로날 감마글로불린병증, 잠재 질환 또는 만성 염증성 질환과 관련이 있는 아밀로이드 AL 아밀로이드증을 앓고 있거나 앓기 쉬운 대상체인, 약제학적 조성물.
  79. 제78항에 있어서, AL 아밀로이드증이 B 림프구 계열의 질환과 관련이 있는, 약제학적 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 질환이 암인, 약제학적 조성물.
  81. 제79항에 있어서, 암이 다발성 골수종인, 약제학적 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 대상체가 사람인, 약제학적 조성물.
  83. 제74항에 있어서, 항체 또는 이의 단편이 키메라 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 단일쇄 항체, 4량체 항체, 4가 항체, 다중특이적 항체, 도메인-특이적 항체, 도메인-결실된 항체, 융합 단백질, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 또는 ScFv 단편인, 약제학적 조성물.
  84. 제83항에 있어서, 항체 또는 이의 단편이 키메라 또는 사람화된 항체 또는 이의 단편인, 약제학적 조성물.
  85. 제84항에 있어서, 키메라 또는 사람화된 항체의 이소타입이 사람 IgG1인, 약제학적 조성물.
  86. 제84항에 있어서, 항체가 ATCC 수탁번호 PTA-9468에 의해 생성되는 쥐 모노클로날 항체 7D8의 키메라 또는 사람화된 형인, 약제학적 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 항체가 서열번호 158, 159, 160, 174, 175 및 176 중의 어느 하나로 제시된 경쇄 가변 영역 및 서열번호 161, 162 및 163 중의 어느 하나로 제시된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
  88. 제74항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 서열번호 153의 잔기 20번 내지 131번으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 154의 잔기 20번 내지 138번으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
  89. 제74항에 있어서, 항체가 ATCC 수탁번호 PTA-9468에 의해 생성되는 쥐 모노클로날 항체 7D8인, 약제학적 조성물.
  90. 제74항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 107 M-1 미만의 친화도로 단량체성 아밀로이드 단백질에 결합하는, 약제학적 조성물.
  91. 제74항에 있어서, 검출가능한 표지가 방사선표지인 약제학적 조성물.
  92. 제91항에 있어서, 방사선표지가 125I인 약제학적 조성물.
  93. 제74항에 있어서, 검출을 SPECT/CT 영상화에 의해 수행하는, 약제학적 조성물.
  94. 제74항에 있어서, 검출을 NMR 분광법에 의해 수행하는, 약제학적 조성물.
  95. 서열번호 157로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  96. 제95항에 있어서, CHO 세포, HEK-293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포 및 COS 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 포유동물 세포인, 숙주 세포.
  97. 제95항에 있어서, 서열번호 157로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 발현하는, 숙주 세포.
  98. 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
  99. 제98항에 있어서, CHO 세포, HEK-293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포 및 COS 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 포유동물 세포인, 숙주 세포.
  100. 제98항에 있어서, 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역을 발현하는, 숙주 세포.
  101. 서열번호 157로 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는, CHO 세포.
  102. 제101항에 있어서, 서열번호 157로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 163으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 발현하는, CHO 세포.
  103. ATCC 수탁번호 PTA-9662에 의해 생성되는 쥐 모노클로날 항체 2A4를 발현하는 하이브리도마.
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