CN101374555B - 神经衍生的生物分子体内代谢的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在临床疾病进程的早期或在脑损伤和临床症状发生前诊断、监测和评估神经学和神经变性疾病和病症，例如阿尔茨海默病的疗效的方法。提供了检测对象的CNS中产生的生物分子体内代谢的方法。

Description

神经衍生的生物分子体内代谢的检测方法
发明领域
本发明涉及诊断和治疗神经学和神经变性疾病、病症和相关过程的方法。本发明也涉及体内检测对象的中枢神经系统衍生的生物分子代谢的方法。 
联邦研究支持的确认
本发明(至少部分)是在国家健康研究院的基金(NIH基金P50-AG05681、M01RR00036、NIH RR000954和NIH DK056341)支持下作出的。因此，美国政府对本发明可享有一定权利。 
发明背景 
阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD)是痴呆的最常见病因和日益严重的公共健康问题。目前，估计该病在美国影响5百万人，估计到2050年将增至1千3百万(Herbert等，2001，Alzheimer Dis.Assoc.Disord.15(4)：169-173)。与其它神经中枢系统(CNS)变性疾病相似，AD的特征在于蛋白质产生、累积和清除中的紊乱。在AD中，蛋白，淀粉样蛋白-β(Aβ)在该病患者的大脑中大量累积，表明该蛋白的代谢失调。AD导致记忆力、认知功能和最终的独立性丧失。这对于患者和患者家庭是沉重的个人和经济负担。由于该疾病的严重性及其在人群中的日益流行，急需开发更好的治疗方法。 
目前有一些改善症状的药物，然而还没有改善疾病的治疗方法。在永久性大脑损伤发生前给予改善疾病的治疗可能是最有效的。然而，在作出临床诊断之时，早已发生了广泛的神经元丧失(Price等，2001，Archiv.Neurol.58(9)：1395-1402)。因此，鉴定处于产生AD风险中的那些患者的方法对于防止或延迟AD发作应该是最有帮助的。目前没有方法能在临床症状发生前鉴定AD中产生的病理生理学改变或能有效地检测可能防止该疾病发作或减缓该疾病进展的治疗方法的作用。 
因此，需要灵敏、精确与可再现的方法来检测CNS中生物分子的体内代谢。具体地说，需要检测神经变性疾病相关蛋白的体内分数合成速率(fractionalsynthesis rate)和清除速率，例如AD中Aβ代谢的方法。 
发明概述 
本发明一方面提供了在脑损伤和临床症状发生前诊断和监测神经学和神经变性疾病，例如AD出现和进展的方法。本发明另一方面提供监测神经学和神经变性疾病，例如AD的治疗作用的方法。 
本发明还有一方面提供检测神经衍生生物分子体内代谢(例如，合成速率，清除速率)的方法。 
本发明另一方面包括检测对象中神经衍生蛋白质体内代谢的试剂盒，从而可将蛋白质的代谢用作神经学或神经变性疾病的预测器、疾病进展的监视器或疾病治疗效力的指示器。 
附图简述 
图1是描述细胞中淀粉样蛋白前体(APP)加工成淀粉样蛋白-β(Aβ)的示意图。黑色表示亮氨酸(L)，可能的标记位点之一。底部显示了Aβ的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)，显示的胰蛋白酶消化位点说明了质谱法分析的片段。 
图2描述了显示淀粉样蛋白-β肽的分离情况的质谱图。用中心结构域(centraldomain)抗-Aβ抗体，m266，从人CSF中免疫沉淀Aβ肽，洗脱的Aβ经质谱法分析。质谱峰标注了它们相应的肽变体；Aβ38、Aβ39、Aβ40和Aβ42。 
图3是说明13C-标记的Aβ17-28片段分子量漂移(shift)的质谱图。在A图中，收集体外产生Aβ的人神经胶质瘤细胞系的未标记培养液并免疫沉淀。然后用胰蛋白酶在位点5、16和28(见图1)切割淀粉样蛋白-β肽，产生显示质量为1325和1336的两个片段包络(envelope)。应注意Aβ片段Aβ17-28(1325)和Aβ6-16(1336)的两个质量包络显示了未标记Aβ中天然同位素的统计学分布。也应注意在应有标记信号的质量1331处没有信号。在B图中，收集在有13C6-亮氨酸存在下培养24小时的人神经胶质瘤细胞的培养液，免疫沉淀Aβ，用胰蛋白酶切割产生显示质量为1325、1331和1336的片段包络。注意，Aβ17-28的质量从1325向1331漂移(箭头)证明有13C6-亮氨酸标记(Aβ* 17-28)。Aβ6-16不含有亮氨酸，因此它未标记或 质量未漂移。少量Aβ17-28维持未标记。 
图4描述的图显示体外标记Aβ的标准曲线。连续稀释标记培养液的样品制作标准曲线来检验检测技术的线性和变异性。从培养液中沉淀Aβ，胰蛋白酶消化，用液相色谱电喷雾注射(LC-ESI)质谱仪分析片段，使用定制软件(custom writtensoftware)定量测定串联质谱离子。软件合计标记的和未标记的串联离子，计算标记的与总Aβ之比。标记的Aβ百分比与预计值显示为线性回归线。注意，除了有低的偏差，线性拟合良好。 
图5是描述体内标记方案的示意图。该图显示参与者的任一肘前静脉中插有静脉内导管，L3-4鞘内间隔中插有腰椎导管。在一侧的静脉中，首先进行2mg/kg的推注，再以1.8-2.5mg/kg/小时的速率输注13C6-标记的亮氨酸9或12小时。如图中所示在最初16个小时中每小时以及16小时后每2小时，通过另一侧的静脉获得12ml血浆。每小时通过腰椎导管获得6ml CSF。然后通过Aβ免疫沉淀、胰蛋白酶消化和LC-ESI-MS分析处理各样品来测定各时间点标记Aβ的百分比。 
图6描述了说明标记和未标记的淀粉样蛋白-β的MS/MS离子的质谱图。静脉内输注13C6-亮氨酸后收集人CSF。显示了未标记(a)和标记(b)的Aβ17-28(LVFFAEDVGSNK(SEQ ID NO：2))的代表性图谱。利用m/z 663.3处的未标记母离子Aβ17-28或m/z 666.3处的标记母离子Aβ17-28的MS/MS分析获得图谱。注意含有13C-亮氨酸的MS/MS离子(Aβ17)的质量漂移了6个道尔顿，说明有标记的亮氨酸。在17位没有亮氨酸的Aβ未标记，质量未漂移6个道尔顿。 
图7描述了在体内标记Aβ的标准曲线。对于人CSF中体内标记的Aβ，用未标记的人CSF连续稀释标记的人CSF样品以制作标准曲线来定量测定检测技术的精确性和精密度。从CSF中沉淀Aβ，胰蛋白酶消化，用LC-ESI质谱仪分析Aβ片段，使用定制软件定量测定串联质谱离子。软件合计标记的和未标记的串联离子，计算标记的Aβ与总Aβ之比。预计的标记的Aβ百分比与检测值显示为线性回归线。注意，线性拟合良好。 
图8描述了三位参与者的Aβ代谢曲线。各参与者在第0时开始输注标记的亮氨酸，继续输注9小时(正方形)或12小时(三角形和圆圈)。通过腰椎导管每小时获得CSF的样品。免疫沉淀Aβ，胰蛋白酶消化。如上所述利用LC-ESI质谱仪检测标记的和未标记的串联质谱离子以测定标记Aβ的百分比。 
图9描述了36-小时研究期间参与者的CSF和血液中标记亮氨酸的比值。在最初2mg/kg推注的1小时内，CSF和血浆中标记亮氨酸的水平达到几乎稳定的状态。在第9小时停止将标记亮氨酸输入血流后，标记亮氨酸的水平呈指数衰减。输注期间，标记亮氨酸的血浆水平约比CSF中标记亮氨酸的水平高约4％。 
图10描述了36小时期间，6位参与者的CSF中标记与未标记Aβ的平均比值。求出标记与未标记Aβ代谢曲线的平均值，各时间点的平均值显示为+/-SEM。标记各参与者9或12小时，而在第0-12、24或36小时每小时取样。在前4个小时中未检测到有标记掺入，然后标记Aβ的百分比升高，停滞在几乎稳定的状态(标记亮氨酸水平约为10％)，然后在该项研究的最后12小时降低。 
图11描述了9-小时标记输注和36小时取样的3位参与者的Aβ代谢曲线。A-C图描述了通过标记Aβ增加的斜率除以预计稳定状态值来计算分数合成速率(FSR)。预计稳定状态值评估为标记期间检测到的CSF标记亮氨酸的平均值。斜率定义为从标记Aβ未增加的4小时滞后期后开始，9小时后结束(实心菱形)。D-F图描述了通过24-36小时标记Aβ百分比的天然对数的斜率计算分数清除速率(FCR)(实心菱形)。 
图12描述了FSR和FCR的平均值。显示了6位参与者的平均Aβ FSR和3位参与者的平均AβFCR及标准偏差。 
优选实施方式详述 
本发明涉及早期诊断和评估对象的神经学和神经变性疾病、病症和过程的方法。具体地说，本发明提供通过测定CNS衍生生物分子的合成速率和清除速率，从而能在神经损伤相关临床症状发生前进行诊断的方法。本领域技术人员可明白本发明的用处在于早期诊断能提供早期治疗的机会并可能防止患者的明显神经损伤。本发明提供的方法能监测改善疾病的治疗的开发或筛选可能在人中具有显著疗效的疗法。例如，人们能确定一种治疗是否改变了源自CNS的生物分子的合成或清除速率。最后，本方法可提供神经学和神经变性疾病出现的预测性检验和监测这种疾病进展的方法。 
I.监测神经衍生生物分子的体内代谢的方法 
本发明提供检测神经衍生生物分子的体内代谢的方法。采用该方法，本领域技术人员能研究参与特定疾病状态的相关神经衍生生物分子的代谢(合成和清除)中可能的改变。此外，本发明能检测改善疾病的治疗在对象中的药效学作用。 
具体地说，本发明提供体内标记在中枢神经系统中合成的生物分子的方法；收集含标记和未标记生物分子的生物学样品的方法；和检测生物分子随时间标记的方法。可采用这些检测方法计算代谢参数，例如合成和清除速率以及其它参数。 
(a)变性性疾病 
阿尔茨海默病(AD)是一种以中枢神经系统(CNS)中的淀粉样蛋白噬斑为特征的衰老性疾病，其是因淀粉样β(Aβ)蛋白产量增加、清除降低或该两种情况所致。本发明人开发了通过检测脑脊液(CSF)或血浆中Aβ的体内合成和清除速率来检测人中Aβ体内代谢的方法。然后可用Aβ的体内合成和清除速率来评估与对照组相比，对象的Aβ合成或清除是否改变。这种比较使得AD可在病程的早期即在临床症状和明显的神经损伤发生前得到诊断。此外，本发明提供测定载脂蛋白E(ApoE)是否导致Aβ代谢改变的方法。该测定可能为为何特定ApoE基因型是AD的风险因素之一提供新的解释。 
本领域技术人员应知道，虽然AD是可由本发明诊断或监测的示范性疾病，但本发明不限于AD。可以设想，可采用本发明方法诊断和治疗几种神经学和神经变性疾病、病症或过程，包括但不限于：帕金森病、中风、额骨颞痴呆(frontaltemporal dementias)(FTD)、亨延顿舞蹈病、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底变性(corticobasal degeneration)(CBD)、衰老相关病症和痴呆、多发性硬化症、朊病毒疾病(例如，克-雅病、牛海绵样脑病或疯牛病和搔痒症)、路易小体病(Lewy Body Disease)和肌萎缩性侧索硬化(ALS或Lou Gehrigi’s病)。也可设想，可采用本发明方法研究CNS的正常生理学、代谢和功能。 
神经学和神经变性疾病是老年对象中最常见的。例如，65岁以上的人中有10％患有AD，而85岁以上的人中有约45％患有AD。由于神经学和神经变性疾病在老年人群中的普遍性以及这些疾病相关的卫生保健花费，可以设想可检测人对象，特别是老年人对象的生物分子体内代谢。或者，可以检测其它哺乳动物对象的生物分子体内代谢。在另一实施方式中，所述对象是陪伴动物，例如狗或猫。在另一实施 方式中，所述对象是家畜，例如牛、猪、马、绵羊或山羊。在还有另一实施方式中，所述对象是动物园动物。在另一实施方式中，所述对象是研究动物，例如非人灵长类或啮齿类动物。 
(b)生物分子 
本发明提供体内检测神经衍生生物分子代谢的方法。所述生物分子可以是蛋白质、脂质、核酸或碳水化合物。可能的生物分子只受限于是否能在体内合成期间标记它们并收集可用于检测它们的代谢的样品。在一优选的实施方式中，生物分子是CNS中合成的蛋白质。例如，待检测的蛋白质可以是但不限于：淀粉样蛋白-β(Aβ)及其变体、可溶性淀粉样蛋白前体(APP)、载脂蛋白E(同种型2、3或4)、载脂蛋白J、τ(Tau)蛋白(另一种AD相关蛋白)、胶质纤维酸性蛋白、α-2巨球蛋白、共核蛋白(synuclein)、S100B、髓磷脂碱蛋白(涉及多发性硬化症)、朊病毒、白介素和肿瘤坏死因子(TNF)。其它可靶向的生物分子包括γ-氨基丁酸能神经元、去甲肾上腺素能神经元、组胺能神经元、5-羟色胺能神经元(seratonergicneuron)、多巴胺能神经元、胆碱能神经元和谷氨酰胺能神经元(glutaminergicneuron)的产物或与其相互作用的蛋白质或肽。 
在一示范性实施方式中，检测其体内代谢的蛋白质可以是淀粉样-β(Aβ)蛋白。另一实施方式可检测Aβ的其它变体(例如，40、42、38或其它)。还有另一实施方式检测Aβ的消化产物(例如，Aβ6-16、Aβ17-28)。 
(c)标记的部分 
可利用几种不同部分(moiety)来标记感兴趣的生物分子。一般而言，本发明方法通常所用的两类标记是放射性同位素或非放射性(稳定的)同位素。一优选实施方式可利用非放射性同位素，通过质谱法检测。优选的稳定同位素包括氘2H、13C、 15N、17或18O、33、34或36S，但应该知道将占优势的天然形式中所见的原子质量改变多几个或少几个中子的许多其它稳定同位素也有效。合适的标记通常能改变所研究的生物分子质量，从而能用质谱仪检测。在一个实施方式中，待检测的生物分子是蛋白质，标记的部分是含有非放射性同位素(例如，13C)的氨基酸。在另一实施方式中，待检测的生物分子是核酸，标记的部分是含有非放射性同 位素(例如，15N)的核苷酸三磷酸。或者，可利用放射性同位素，用闪烁计数器而不是质谱仪检测标记的生物分子。可同时或依次使用一种或多种标记部分。 
在一优选实施方式中，当用该方法检测蛋白质的代谢时，标记的部分通常是氨基酸。本领域技术人员应该知道可利用几种氨基酸提供生物分子的标记。通常可根据各种因素选择氨基酸，例如：(1)该氨基酸通常存在于感兴趣蛋白质或肽的至少一个残基中。(2)该氨基酸通常能快速到达蛋白质合成位点并能穿过血-脑屏障而快速平衡。如实施例1和2所示，亮氨酸是标记CNS中合成的蛋白质的优选氨基酸。(3)该氨基酸优选必需氨基酸(不是由身体产生的)，从而能获得较高的标记百分比。然而，也可用非必需氨基酸；检测的精确度可能会降低。(4)氨基酸标记通常不影响感兴趣蛋白质的代谢(例如，极大剂量的亮氨酸可影响肌肉代谢)。和(5)所需氨基酸的可获性(即，一些氨基酸比其它氨基酸更昂贵或难于制备)。一个实施方式用含有6个13C原子的13C6-苯丙氨酸标记神经衍生的蛋白质。一优选的实施方式用13C6-亮氨酸标记神经衍生的蛋白质。一示范性实施方式利用13C6-亮氨酸标记淀粉样蛋白-β。 
标记的氨基酸(非放射性同位素和放射性同位素)有许多商品化来源。通常可经生物学方法或合成方法制备标记的氨基酸。可用能随生物体产生蛋白质而掺入氨基酸的13C、15N或另一种同位素的浓缩混合物培养生物体(例如，海草/海藻)从而获得生物学制备的氨基酸。然后分离和纯化氨基酸。或者，可用已知的合成化学方法制备氨基酸。 
(d)给予标记的部分 
可通过几种方法将标记的部分给予对象。给予的合适方法包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌肉内或口服。在一优选实施方式中，标记的部分是标记的氨基酸，通过静脉内输液给予标记的氨基酸。在另一实施方式中，可以口服摄取标记的氨基酸。 
依据所选的分析类型(例如，稳定状态或推注/追踪(bolus/chase))，可在一定时期内缓慢给予标记的部分或作为单次大剂量给予。为达到标记生物分子的稳定状态水平，标记通常应持续足够时间，从而能可靠地定量测定标记的生物分子。在一个实施方式中，标记的部分是标记的亮氨酸，静脉内给予标记的亮氨酸9小时。在 另一实施方式中，静脉内给予标记的亮氨酸12小时。 
本领域技术人员应知道，标记部分的用量(或剂量)可以不同。该用量通常取决于以下因素(并按以下因素估计)。(1)所需分析的类型。例如，为实现血浆中约15％标记亮氨酸的稳定状态，需要先推注2mg/kg 10分钟，再(输注)约2mg/kg/hr 9小时。相反，如果不需要稳定状态，则可一开始就推注大剂量的标记亮氨酸(例如，1或5克的标记亮氨酸)。(2)所分析的蛋白质。例如，如果是快速产生的蛋白质，则需要较短的标记时间和较少的标记，可能少至1小时内0.5mg/kg。然而，大多数蛋白质的半衰期从数小时到数日不等，因此更可能采用0.5mg/kg-4mg/kg连续输注4、9或12小时。和(3)检测标记的灵敏度。例如，随着检测标记的灵敏度升高，所需标记的用量降低。 
本领域技术人员应知道，一位对象可使用多种标记。这样能多重标记同一生物分子，提供该生物分子在不同时间的产生或清除信息。例如，可在初始时期给予对象第一标记，随后给予药理学试剂(药物)，然后给予第二标记。分析该对象的样品通常可以检测给予药物之前和之后的代谢，直接检测药物在该对象中的药效学作用。 
或者，可在同一时间使用多种标记来提高对生物分子的标记以及标记更广泛的生物分子。 
(e)生物学样品 
本发明方法能获得对象的生物学样品，从而可检测标记生物分子的体内代谢。合适的生物学样品包括但不限于：脑脊液(CSF)、血浆、血清、尿、唾液、汗液和眼泪。在本发明的另一实施方式中，生物学样品取自脑脊液。在另一实施方式中，生物学样品收集自尿液。在一优选的实施方式中，生物学样品收集自血液。 
可用或不用导管(如果要进行多次收集优选导管)通过腰椎穿刺获得脑脊液。可用或不用导管通过静脉穿刺收集血液。可简单收集尿液或用导管更精确地收集尿液。可采用标准药品生产质量管理规范(GMP)方法直接收集唾液和眼泪。 
通常，当所研究的生物分子是蛋白质时，本发明能从给予标记前的对象取得第一生物学样品以提供对象的基线。给予标记的氨基酸或蛋白质后，通常从该对象取得一份或多份样品。本领域技术人员应知道，样品的数量以及何时取得样品一般 取决于例如以下多种因素：分析的类型、给药的类型、感兴趣的蛋白质、代谢速率、检测的类型等。 
在一个实施方式中，生物分子是蛋白质，每小时采集血液和CSF样品，共36小时。或者，可以每2小时或甚至以更低的频率收集样品。一般，可用取样的最初12小时中(即，标记开始后的12小时)获得的生物学样品测定蛋白质的合成速率，可用取样的最后12小时中(即，标记开始后的24-36小时)获得的生物学样品测定蛋白质的清除速率。或者，可在标记一段时间例如12小时后取样来估计合成速率，但这样做的精确性低于多次取样。或者，可依据蛋白质的合成和清除速率以一小时或数天或甚至数周的间隔取样。 
(f)检测 
本发明通过检测生物学样品中标记生物分子的含量与未标记生物分子的含量来测定标记生物分子与未标记生物分子的比值。标记与未标记生物分子的比值通常直接与该生物分子的代谢成比例。检测标记和未标记生物分子的合适方法依据所研究的生物分子和用于标记它的标记部分的类型可有所不同。如果感兴趣的生物分子是蛋白质，标记部分是非放射性标记的氨基酸，则检测方法通常应对检测标记蛋白质相当于未标记蛋白质的质量变化足够灵敏。一优选实施方式采用质谱法检测标记和未标记蛋白质之间的质量变化。一实施方式采用气相色谱质谱。另一实施方式采用MALDI-TOF质谱。一优选实施方式采用高分辨率串联质谱。 
可采用其它技术分离生物学样品中感兴趣蛋白质与其它蛋白质和生物分子。例如，可先用免疫沉淀分离和纯化感兴趣蛋白质，再用质谱法分析。或者，可用装有色谱装置的质谱仪来分离蛋白质而无需免疫沉淀，然后可直接检测感兴趣的蛋白质。在一示范性实施方式中，免疫沉淀感兴趣的蛋白质，然后利用与装有电喷雾离子化源的串联MS单元(LC-ESI-串联MS)相连的液相层析系统分析。 
本发明也能同时检测同一生物学样品中的多种蛋白质或肽。即，对于多种蛋白质，可以分别或同时检测未标记和标记蛋白质(和/或肽)的含量。因此，本发明提供大规模筛选蛋白质合成和清除中发生的变化的有用方法(即，蛋白组学/代谢学(metabolomics))，也提供检测和测定参与潜在病理生理学的蛋白质的灵敏方法。或者，本发明也提供检测多种类型生物分子的方法。在这方面，例如，可同时或依次 检测蛋白质和碳水化合物。 
(g)代谢分析 
一旦检测了生物学样品中标记和未标记生物分子的含量，便可以确定标记生物分子的比值或百分比。如果感兴趣的生物分子是蛋白质并且已测定了生物学样品中标记和未标记蛋白质的含量，则可以计算标记与未标记蛋白质的比值。可从标记与未标记蛋白质随时间的比值计算蛋白质代谢(合成速率、清除速率、滞后期、半衰期等)。可用许多合适的方法计算这些参数。本发明能同时检测标记和未标记的蛋白质(或肽)，因此可以计算标记与未标记蛋白质的比值及进行其它计算。本领域技术人员熟悉可与本发明方法一起使用的关于标记的一级动力学模型(first orderkinetic model)。例如，可计算分数合成速率(FSR)。FSR等于标记与未标记蛋白质增加的最初速率除以前体富集。类似地，可以计算分数清除速率(FCR)。此外，可测定其它参数，例如滞后时间和同位素示踪物稳定状态，并用作蛋白质代谢和生理学的量度。也可对数据建模以拟合多个隔室模型(compartment model)来估计隔室之间的传递。当然应根据各蛋白质合成和清除参数(例如，一个库(one-pool)、多个库(multiple pools)、稳定状态、非稳定状态、隔室建模等)选择数学建模的类型。 
根据本发明，蛋白质的合成通常基于标记/未标记蛋白质的比值随时间增加的速率(即，斜率，指数拟合曲线或隔室模型拟合限定了蛋白质合成的速率)。对于这些计算，一般最少需要一份样品(用于估计基线标记)，优选两份，更优选多份来计算标记摄入蛋白质的精确曲线(即，合成速率)。 
相反，停止给予标记的氨基酸后，标记与未标记蛋白质比值降低的速率通常反映了该蛋白质的清除速率。对于这些计算，一般最少需要一份样品(用于估计基线标记)，优选两份，更优选多份来计算标记蛋白质的标记随时间减少的精确曲线(即，清除速率)。在给定的时间，生物学样品中标记蛋白质的含量反映了对象中蛋白质的合成速率(即，产生)或清除速率(即，除去或破坏)，通常表示为每小时的百分比或质量/时间(例如，mg/hr)。 
如实施例所示，在一示范性实施方式中，通过在9个小时期间给予对象标记的亮氨酸并在36小时期间以规则间隔收集生物学样品来检测淀粉样蛋白-β(Aβ)的体内代谢。可以收集血浆或CSF的生物学样品。一般依次通过免疫沉淀和LC-ESI- 串联MS来测定生物学样品中标记与未标记Aβ的含量。可以从这些测量值测定标记与未标记Aβ的比值，该比值能测定代谢参数，例如Aβ的合成速率和清除速率。 
II.诊断或监测神经学和神经变性疾病的进展或治疗的试剂盒 
本发明提供通过检测对象中中枢神经系统衍生蛋白质的体内代谢来诊断或监测神经学或神经变性疾病进展或治疗的试剂盒。试剂盒通常装有标记的氨基酸、给予标记氨基酸的装置、随时间收集生物学样品的装置、和检测及测定标记与未标记蛋白质比值从而计算代谢指数的使用说明书。然后可将代谢指数与正常健康个体的代谢指数作比较，或与同一对象早先得到的代谢指数作比较。这些比较使得实施者能预测神经学或神经变性疾病的出现，诊断神经学或神经变性疾病的发作，监测神经学或神经变性疾病的进展或验证神经学或神经变性疾病治疗方案的效力。在一优选实施方式中，所述试剂盒装有13C6-亮氨酸或13C6-苯丙氨酸，代标记的蛋白质是Aβ，待评估的疾病是AD。 
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员常规理解的意义。以下参考文献为技术人员提供了许多本发明所用术语的通用定义：Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(《微生物学和分子生物学字典》)，(第二版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science andTechnology(《剑桥科技字典》)，(Walker编，1988)；The Glossary of Genetics(《》遗传学词典)，第五版，R.Rieger等编，Springer Verlag，(1991)；Hale和Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology(《哈珀柯林斯生物学字典》)，(1991)。除非另有表述，本文所用的以下术语具有所述的意义。 
“清除率”指感兴趣生物分子的除去速率。 
“分数清除速率”或FCR计算成特定时期中标记生物分子的比率的天然对数。 
“分数合成速率”或FSR计算成特定时期中标记生物分子比率增加的斜率除以预计的标记前体的稳定状态值。 
“同位素”指其核具有相同原子数，但因含有不同数目的中子而具有不同质量数的给定元素的所有形式。非限制性的例子有12C和13C均是碳的稳定同位素。 
“滞后期”通常指首次标记生物分子到检测到该标记生物分子的迟滞时间。 
“代谢”指生物分子的合成、转运、破坏、修饰或清除速率的任何组合。 
“代谢指数”指包含感兴趣生物分子的分数合成速率(FSR)和分数清除速率(FCR)的量度。比较正常和患病个体的代谢指数有助于诊断或监测神经学或神经变性疾病。 
“神经衍生细胞”包括血脑屏障内的所有细胞，包括神经元、星形细胞、小胶质细胞、脉络丛细胞、室管膜细胞、其它神经胶质细胞等。 
“稳定状态”指在特定时期中所检测参数的变化不明显的阶段。 
“合成速率”指感兴趣生物分子的合成速率。 
在代谢示踪物研究中，“稳定同位素”是丰度不及最丰富的天然存在同位素的非放射性同位素。 
本文所用的“对象”表示具有中枢神经系统的活生物体。具体地说，所述对象是哺乳动物。合适的对象包括研究动物、陪伴动物、家畜和动物园动物。优选的对象是人。 
实施例
纳入以下实施例来说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应知道，实施例公开的技术代表了本发明人发现的在实施本发明中能发挥良好作用的技术，因此，可认为构成了实施本发明的优选方式。然而，本领域技术人员借鉴本文应知道，可在公开的具体实施方式中作出许多改变却仍能获得类似或相似的结果而不脱离本发明的构思和范围。 
实施例1.体外检测淀粉样蛋白-β的代谢 
原理
生物化学、遗传学和动物模型证据暗示Aβ(图1)是AD中的病原性肽。为开发检测Aβ体内标记的方法，采用以下四个基本步骤设计体外系统：1)体外在培养液中标记Aβ，2)分离Aβ与其它标记的蛋白质。3)将Aβ特异性切割成可用于分析标记的片段，和4)定量测定标记和未标记的片段。 
淀粉样蛋白-β的免疫沉淀和切割
首先开发了分离和检测生物学液体中未标记Aβ的方法。采用能识别该分子的中心结构域(残基13-28)的高特异性单克隆抗体(m266)免疫沉淀CSF或细胞培养液样品中的Aβ。按照生产商的方法将m266抗体(EIi Lilly惠赠)以10mg/ml m266抗体的浓度与CNBr琼脂糖珠共价结合以制备抗体珠。4℃，将抗体珠保存在50％PBS和0.02％叠氮化物的浆状液体(slurry)中。一个微量离心管中装有的免疫沉淀混合物是250μl 5×RIPA、12.5μl 100×蛋白酶抑制剂和30μl抗体珠浆液。向该混合物中加入1ml生物学样品，4℃将试管旋转过夜。用1×RIPA清洗珠一次，用25mM碳酸氢铵清洗两次。最终清洗后抽干珠，用30μl纯的甲酸将Aβ从抗体-珠复合物上洗脱。采用质谱法直接表征Aβ(分子量和氨基酸序列)。如图2所示，结果与以前公布的结果相似(Wang等，1996，J Biol.Chem.271(50)：31894-31902)。 
可利用胰蛋白酶通过酶消化将淀粉样蛋白-β切割成较小的片段。如图1所示，利用胰蛋白酶切割Aβ产生Aβ1-5、Aβ6-16、Aβ17-28和Aβ29-40/42片段。 
标记淀粉样蛋白-β
第二，开发了标记新合成的Aβ的方法。13C6-亮氨酸用作代谢标记，因为其通过主动转运能穿过血脑屏障而快速平衡(Smith等，1987，J Neurochem 49(5)：1651-1658)，其是必需氨基酸、不会改变Aβ的特性并且安全而无放射性。13C稳定同位素不改变氨基酸或蛋白质的化学或生物学特性；只是将各13C标记的质量增加了1道尔顿。事实上，用纯13C培养整个生物体不会有任何有害影响。标记的亮氨酸掺入Aβ氨基酸序列的17和34位(见图1)。 
天然存在的同位素13C(所有碳的1.1％)和15N导致大分子(包括蛋白质)质量的天然分布(natural distribution)。由于Aβ的大小和存在这些天然产生的同位素，可将肽分裂成较小肽来直接检测标记。或者，可利用完整的未消化Aβ进行分离。 
液相层析/质谱
第三，开发精确定量测定标记与未标记Aβ的方法。为此，将装有自动进样器的Waters(Milford，MA)毛细管液相层析系统与装有电喷雾离子化源(LC-ESI-串联MS)的Thermo-Finnigan(San Jose，加利福尼亚州)LCQ-DECA相连。将各样品的5μl等份试样注射到Vydac C-18毛细管柱(0.3×150mm MS 5μm柱)上。Aβ17-28片段含有一个亮氨酸残基，掺入13C6-亮氨酸使得该片段的分子量漂 移6道尔顿。以正离子扫描方式，用LC-ESI-MS分析胰蛋白酶消化的合成并免疫沉淀的Aβ，得到预期的母离子：Aβ17-28质量为1325.2和13C6-亮氨酸标记的Aβ17-28质量为1331.2(图3A和3B)。标记Aβ(Aβ*)的百分比计算为标记Aβ17-28 的所有标记MS/MS离子除以未标记Aβ17-28的所有未标记MS/MS离子的比值。按照下式，利用含有宏的定制微软Excel电子表格将比值计算为Aβ17-28的示踪物与被示踪物比值(TTR)： 
TTRAβ＝(∑MS/MS离子Aβ* 17-28)/(∑MS/MS离子Aβ17-28) 
结论如下：本方法提供了标记和未标记形式的Aβ的高度特异性“指纹”，因为它定量测定了各形式的含量并同时测定了氨基酸序列。以此方式实现了标记的Aβ相对于未标记Aβ的良好分离和特异性。通过制作标记和未标记培养液的连续稀释液的标准曲线检验了精确度和精密度(图4)。线性拟合0％-80％的标记Aβ连续稀释液标准曲线得到R2为0.98，斜率为0.92。评估的其它检测技术包括只采用选择离子方式直接检测母离子，也包括利用MALDI-TOF质谱仪。然而，这些方法不能提供采用定量串联质谱法分析通过LC-ESI实现的灵敏度和特异性。 
体外标记淀粉样蛋白-β
在存在13C6-标记的亮氨酸(Cambridge Isotope Laboratories，剑桥，马萨诸塞州)或未标记的亮氨酸时培养产生Aβ的人神经胶质瘤细胞(Murphy等，2000，J Biol.Chem.275(34)：26277-26284)。用m266抗体通过免疫沉淀分离Aβ与培养液(见上文)。洗脱的Aβ用胰蛋白酶37℃消化4小时，LC-EIS MS分析诸片段。与预期的一样，从存在未标记亮氨酸时培育的细胞分离的Aβ的Aβ17-28片段分子量为1325.2，从13C6-标记亮氨酸培育的细胞分离的Aβ的Aβ17-28片段分子量为1331.2(图3B)。这些结果表明这些细胞将13C6-亮氨酸掺入Aβ，证实存在13C6-亮氨酸时合成的Aβ掺入了标记氨基酸以及采用质谱法能区分含亮氨酸的肽中6道尔顿分子量的漂移。 
分析13C6-亮氨酸标记的4小时和24小时细胞培养液来测定作为时间函数的标记相对量。4-小时标记实验揭示有约70％标记，而24-小时标记实验揭示有95％以上标记。这些结果表明与标记接触后的数小时内，淀粉样蛋白前体(APP)掺入标记的氨基酸，标记的Aβ从标记的APP上切下并释放入胞外空间。 
实施例2.体内检测淀粉样蛋白-β代谢 
原理
蛋白质的产生和清除是受紧密调节并反映正常生理学以及疾病状态的重要参数。人中蛋白质代谢的早先研究致力于全身或外周身体蛋白，但不集中在中枢神经系统(CNS)产生的蛋白质上。以前没有方法可用于定量测定人的CNS中蛋白质合成和清除速率。这种方法不只对于评估人中Aβ的合成或清除速率，还对于评估CNS疾病相关的各种其它蛋白质代谢有价值。为解决潜在的AD发病机制和Aβ代谢的关键问题，开发了定量测定人的CNS中体内Aβ分数合成速率(FSR)和分数清除速率(FCV)的方法。 
参与者和取样
所有人类研究得到Washington University Human Studies Committee(华盛顿大学人类研究委员会)和General Clinical Research Center(GCRC)AdvisoryCommittee(普通临床研究中心(GCRC)顾问委员会)的批准。获得了所有参与者的知情同意。所有参与者经筛选均为总体健康良好，无神经学疾病。7位男性和3位女性(23-45岁)参与其中。各研究参与者从前一天晚上8点开始禁食，过夜后于早上7点进入GCRC。GCRC研究厨房在早上9点、下午1点和6点提供食物(60％碳水化合物、20％脂肪、20％蛋白质，标记亮氨酸输注期间为低亮氨酸饮食)，参与者可随意饮水。护理人员和GCRC厨房记录参与期间消耗的所有食物和水。将一根静脉内导管置于肘前静脉，用其给予稳定的同位素标记的亮氨酸溶液。将第二根静脉内导管置于对侧肘前静脉以获得血液样品。用Touhy针头将蛛网膜下导管插入L3-L4间隙，因而可取样CSF而无需进行多次腰椎穿刺(Williams，2002，Neurology 58：1859-1860)。由受过训练的注册护士放置静脉内导管，由受过训练的、腰椎穿刺经验丰富的临床医师放置腰椎导管。除非研究是36小时，否则每小时采集血样，在36小时研究中，前16小时每小时采集血液，此后每2小时采集血液。整个研究期间，每小时取得CSF样品。参见图5所示的体内实验方案的示意图。除了使用洗手间之外，鼓励参与者卧床。 
将13C6-亮氨酸(Cambridge Isotope Laboratories)溶解于医学级生理盐水，然后在每次研究的前一天用0.22微米滤膜过滤。利用医用静脉内泵以1.8-2.5mg/kg/hr的速率静脉内输注标记的亮氨酸。 
在一位参与者中Aβ的体内标记和定量测定
为确定是否能人体内产生并检测标记的Aβ，给一位参与者输注24-小时标记的亮氨酸，然后进行腰椎穿刺以获得CSF。在一侧静脉内以1.8mg/kg/小时的速率给予13C6-标记的亮氨酸。每小时通过另一侧静脉内操作获得10ml血浆。连续输注24小时后，进行一次腰椎穿刺获得30ml CSF。免疫沉淀CSF样品的Aβ，用胰蛋白酶消化，将各样品的5μl等份试样注射到Vydac C-18毛细管柱(0.3×150mm MS 5μm)上。以正离子扫描方式，用LC-ESI-MS分析胰蛋白酶消化的合成并免疫沉淀的Aβ，得到预期的母离子：Aβ17-28质量为1325.2和13C6-亮氨酸标记的Aβ17-28质量为1331.2。为获得氨基酸序列和丰度数据，这些母离子经碰撞诱导解离(CID28％)，以选择反应监测方式(SRM)扫描它们的双荷电种类的串联MS分析([M+2H]+2；m/z 663.6和666.6)，从而能将产生的y-和b-系列离子用于定量测定同位素比值(图6)。此外，检测了血浆和CSF13C6-亮氨酸来确定预期的13C6-亮氨酸的最大含量。这些结果证明在人CSF中可以检测未标记的Aβ17-28和13C-标记的Aβ17-28。 
第一位人参与者的这些结果证明了3个重要的发现：1)1.8mg/kg/小时的静脉内输注速率得到的平均血浆13C6-亮氨酸是总血浆亮氨酸的12％；2)在24小时时，在CSF中检测到的CSF13C6-亮氨酸显示与血浆相似的水平(11.9％)；和3)24小时时，人CSF中被13C6-亮氨酸标记的Aβ约为总Aβ水平的8％。 
为定量测定在人CSF中体内标记Aβ的检测技术的精确度和准确性，制作标记和未标记的人CSF连续稀释液的标准曲线(图7)。检测技术与体外标准曲线的相同(图4)。以选择离子监测方式采用LC-ESI MS定量测定标记和未标记的Aβ17-28 的含量，用串联质谱仪记录MS-2离子。线性拟合0％-8％的标记Aβ连续稀释液标准曲线得到R2为0.98，斜率为0.81。从这些数据可以预计，人参与者的体内样品的标记范围可能是1-10％。注意，未标记CSF在Y轴有1％的检测值，而预计是0％。由于检测系统的基线噪声，用此系统不能检测1％以下的标记情况。结论是：可以在人体内标记Aβ，采用LC-ESI质谱法检测的精确度和准确性良好。 
体内标记的药代动力学
为确保能用13C6-亮氨酸可检测地标记Aβ并维持足够的时间从而可用稳定状态方程来计算Aβ合成和清除速率，测定了最佳标记和取样时间。检验了一系列 13C6-亮氨酸静脉内输注剂量(1.8-2.5mg/kg/小时)、持续时间(6、9或12小时)和CSF/血液取样时间(12-36小时的持续时间)(见表1)。 
表1：参与者标记和取样参数 
参与者编号   输注剂量(mg/kg/小时)   输注持续时间，  以小时计   CSF/血液取样，  以小时计
    1     1.8     24小时     24小时
    2     1.9     12小时     13小时
    3     2.5     12小时     24小时
    4     2.5     9小时     6小时
    5     2.4     6小时     36小时
    6     2     6小时     36小时
    7     2     6小时     36小时
    8     2     9小时     36小时
    9     2     9小时     36小时
    10     2     9小时     36小时
图8显示了三位参与者的Aβ代谢标记曲线。通过一侧静脉内输注以1.9(圆圈)、2.5(三角形)或2.5(正方形)mg/kg/小时的速率给予13C6-标记的亮氨酸12(圆圈，三角形)或9(正方形)小时。每小时分别通过另一侧静脉和腰椎导管获得10ml血浆和6ml CSF。在检测到标记的Aβ显著上升之前有5小时的滞后时间。然后标记的Aβ上升9(正方形)或12(三角形或圆圈)小时，再稳定5小时。标记9小时(正方形)使标记的Aβ在最后3小时的水平降低，而标记12小时(三角形或圆圈)未显示标记的Aβ降低。 
其它研究揭示在输注标记9或12小时后能可靠地定量测定标记的Aβ，但输注标记6小时后不能。在取样的前12小时中，可以测定标记曲线的合成部分；然而只能在取样的36小时内测定标记曲线的清除部分。根据这些结果，Aβ的最佳标记参数确定为静脉内输注标记9小时和样品收集36小时。这些参数能评估标记曲线的分数合成速率(FSR)和分数清除速率(FCR)部分。 
体内标记方案
在最后三位参与者中，最初以2mg/kg推注10分钟达到标记亮氨酸的稳定状态，然后以2mg/kg/小时的速率连续静脉输注9小时来给予13C6-标记的亮氨酸。在最后三位参与者中，血液和CSF取样36小时。以1或2小时的时间间隔取得12ml血液和6ml CSF的连续样品。正常体积的成年人中CSF的产生速率是约20ml/小时(Fishman RA，1992，Cerebrospinal fluid in diseases of the nervous system(神经系统疾病中的脑脊液)，Saunders，Philadelphia)并在整个过程中补充自身。在36小时研究中，收集的血液总量是312ml，收集的CSF总量是216ml。 
本项研究总共登记了10位参与者，其中8位完成了预定的方案，2位因发生与本项研究有关的腰椎穿刺后头痛而在完成前终止(见表1)。8位研究完成者中有2位输注了6小时的标记亮氨酸，该2位参与者中标记Aβ的水平太低因而不能精确检测，未用于分析。因此，下文报道了其余6位研究对象。 
定量测定标记的亮氨酸
分析血浆和CSF样品来测定各液体中标记亮氨酸的含量(图9)。采用毛细管气相色谱-质谱法(GC-MS)定量测定血浆和CSF13C6-亮氨酸的标记与未标记亮氨酸比值(Yarasheski等，2005，Am J Physiol.Endocrinol.Metab.288：E278-284；Yarasheski等，1998，Am J Physiol.275：E577-583)，对于低质量的氨基酸分析，GC-MS比LC-ESI-MS更合适。1小时内，血浆和CSF中13C6-亮氨酸达到的稳定状态水平分别是14％和10％。这证实亮氨酸通过已知的中性氨基酸转运系统快速转运通过血脑屏障(Smith等，1987，J Neurochem.49(5)：1651-1658)。 
标记的Aβ动力学
如上所述，对于每小时收集的各份CSF样品，通过免疫沉淀-MS/MS测定标记与未标记Aβ的比值。将13C-标记的Aβ17-28的MS/MS离子除以未标记Aβ17-28的MS/MS离子得到标记Aβ与未标记Aβ的比值(见上文TTR公式)。图10显示了各时间点的平均标记Aβ比值和标准误差(n＝6)。在最初4小时中，未检测到标记的Aβ，然后其在5-13小时上升。13-24小时中没有明显变化。24-36小时标记的Aβ减少。 
计算FSR和FCR：
利用下式的标准公式计算分数合成速率(FSR)： 
其中(Et2-Et1)Aβ/(t2-t1)定义为标记期间标记Aβ的斜率，前体E是标记亮氨酸的比率。以每小时百分比计的FSR操作性地定义为6-15小时线性回归的斜率除以输注期间CSF13C6-标记亮氨酸水平的平均值(参见图11A-C)。例如，每 小时7.6％的FSR表示每小时产生总Aβ的7.6％。 
按照下式，通过拟合标记Aβ曲线的清除部分的天然对数的斜率计算分数清除速率(FCR)： 
FCR＝In(ΔTTRAβ/Δ时间(小时)24-36) 
FCR操作性地定义为24-36小时标记Aβ的天然对数(图11D-F)。例如，每小时8.3％的FCR表示每小时清除总Aβ的8.3％。6位健康参与者的Aβ的平均FSR是7.6％/小时，平均FCR是8.3％/小时(图12)。这些数值彼此没有统计学差异。 
实施例3.检测血浆中标记Aβ百分比的技术 
原理
与CSF相比，血浆Aβ代谢可能发生在单独隔室中，代谢速率不同。在AD的小鼠模型中，血浆中抗体捕捉的Aβ量昭示了病理学(特征)。因此，血浆中Aβ的代谢速率可以是AD病理学的限定特征。此外，与CSF相比，(检测)血浆Aβ代谢可能是检测人中Aβ代谢的同样有效的方法。如果证明其可以诊断或预测痴呆，则本方法作为临床前或临床AD的诊断性检验也许更可行。 
实验设计
与以前实施例中对CSF的操作一样，可开发检测血浆中标记和未标记Aβ的方法。与CSF相比，获得血浆的Aβ有两种主要的差异：1)血浆中Aβ约低100倍和2)非Aβ蛋白质浓度约高200倍。可能需要采用本领域技术人员已知的方法优化免疫沉淀的效率和特异性。可通过线性阱四极(Linear TrapQuadrapole)(LTQ)质谱仪分析来检验免疫沉淀以鉴定污染性蛋白质的数量和相对含量。LTQ的灵敏度比LC-ESI最多提高200倍。初步结果表明将1ml人CSF的Aβ片段稀释50倍具有良好的信噪比。 
可用5-10ml血浆检验优化的方法。可以免疫沉淀标记的和未标记的Aβ，用胰蛋白酶消化，质谱法分析。可利用对象的标记血浆样品检测和制作血浆标记标准曲线。通过连续稀释用标记最多的样品制备5份样品。可通过LTQ定量测定标记Aβ的母离子和串联质谱离子，这些结果可制作成标准曲线。通过线性拟合模型可测定该曲线的直线性和可变性。将该标准曲线与为人CSF Aβ标 记制作的标准曲线比较。可将标记的血浆Aβ曲线与对照和AD个体的标记CSF曲线比较来确定Aβ的血浆水平是否能检测或预测AD。 
结果
与CSF的数据一样(见实施例1和2)，预计开发的技术能可重现和定量地检测人血浆的标记和未标记Aβ。预计标准曲线接近线性，可变性低。预计人体内研究的血浆标记Aβ曲线将密切反映CNS/CSF标记的Aβ曲线。也可获得参与者血浆Aβ的FSR和FCR。如Aβ输注入血浆后的动物模型所示，预计血浆中Aβ的清除率比CSF中快得多。 
其它方法
如果不能如以上详述的精确检测标记和未标记的血浆Aβ，则可采用减少时间点并增加每个时间点的样品(每隔1小时20ml，而不是每小时10ml)。这样会降低检测的时间分辨率，但可能仍足以获得FSR和FCR。如果蛋白质污染仍是血浆的问题，则可能需要通过本领域技术人员熟悉的HPLC、蛋白质2D凝胶或甚至更严格的清洗步骤来纯化。 
LTQ是可商品化获得的最灵敏的质谱仪，其能根据阿托摩尔(attomole)含量提供获得检测值的最佳机会。目前没有比该质谱仪更好的方法；然而，质谱法的灵敏度经常随着技术改进而提高。本领域技术人员应知道采用质谱法的这种改进属于本发明的范围和构思。 
实施例4.测定ApoE基因型对CSF Aβ代谢的影响 
原理
ApoE基因型是经充分验证的AD遗传学风险因素。免疫组织学揭示AD中ApoE与胞外淀粉样蛋白沉积物协同定位。此外，发现ApoEε4基因型是人群中AD的风险因素之一。ApoEε2等位基因显示在AD风险中具有保护作用。ApoE基因型在几种AD小鼠模型中也显示导致AD病理学发生极大变化(Games等，1995 Nature 373(6514)：523-527)。 
ApoEε4剂量依赖性地增加了AD和大脑淀粉样血管病(CAA)中Aβ沉积物的密度。在CSF、血浆和正常以及AD大脑中，ApoE与可溶性Aβ相关。ApoE4可能通过Aβ代谢的共同机制而与AD和CAA相关，虽然ApoE4已显示涉及 多种其它途径。 
在AD小鼠模型中，ApoE同种型已显示导致Aβ沉积发生时间和Aβ沉积分布发生剂量和等位基因依赖性变化(Holtzman等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.97：2892-2897；DeMattos等，2004，Neuron 41(2)：193-202)。人ApoE3显示导致Aβ沉积发生剂量依赖性降低。此外，对清除的研究已显示从CNS转运至血浆的Aβ的t1/2＜30分钟，其在无ApoE时降低。综上所述，这提示ApoE对CNSAβ具有Aβ结合和清除作用。 
实验设计和分析
可测定各参与者的ApoE基因型。收集经离心血浆的血沉棕黄层(白细胞层)，采用本领域技术人员已知的标准技术立即冷冻于-80℃。通过PCR分析测定样品的ApoE基因型(Talbot等，1994，Lancet 343(8910)：1432-1433)。用Aβ代谢的CSF或血浆FSR或FCR的连续变量分析ApoE2(0、1或2份拷贝)和ApoE4(0、1或2份拷贝)的基因剂量的作用。 
采用本领域技术人员已知的标准技术可作出统计学分析方法。例如，对于Aβ的FSR和FCR，可用人ApoE同种型和年龄作为对照组以及AD组的因素来进行双向(two-way)或三向(three-way)ANOVA。如果数据不是正态分布，可采用转化以符合关于高斯分布的必需的统计学假设。 
结果
与ApoE3相比，预计ApoE4能降低Aβ清除。相反，与ApoE3相比，预计ApoE2能提高Aβ清除。预计Aβ的合成速率不会按照ApoE基因型而改变。如果检测到Aβ代谢有变化，这将是ApoE状态对人体内Aβ代谢有作用的证据。 
实施例5.比较ApoE基因型对人血浆AβFSR和FCR代谢(的作用) 
原理
如AD小鼠模型所证明的，ApoE基因型可能影响Aβ从CNS向血浆转运。检测人中的这种作用可揭示通过ApoE转运的变化。 
体内动物数据显示血浆、CSF与脑中Aβ的清除速率不同。这些差异的原因和它们之间的关系尚不十分清楚。ApoE基因型表达可能在Aβ从CNS向CSF和血浆的转运和清除中起到重要作用。与血浆Aβ相比，CNS中的ApoE大多 数由星形细胞产生，唾液酸化且在结构上不同。为更好地理解作为ApoE基因型功能的这些隔室之间的关系，可采用实施例3的技术检测血浆中Aβ的代谢。 
实验设计和分析
可测定各参与者的ApoE基因型。收集经离心血浆的血沉棕黄层(白细胞层)，采用本领域技术人员已知的标准技术立即冷冻于-80℃。采用实施例4所用的技术分析样品。用血浆Aβ代谢的FSR或FCR的连续变量分析ApoE2(0、1或2份拷贝)和ApoE4(0、1或2份拷贝)的基因剂量的作用。采用本领域技术人员已知和以上实施例4所述的标准技术可作出统计学分析方法。 
结果
与ApoE3相比，预计ApoE4能降低血浆Aβ清除；与ApoE3相比，预计ApoE2能提高血浆Aβ清除。预计不会观察到Aβ的合成速率按照ApoE基因型而改变。然而，如果检测到血浆Aβ代谢有变化，这将是首次评估ApoE状态对人中Aβ代谢的作用。 
其它方法
对于Aβ代谢，血浆、CSF和CNS隔室之间的关系不十分清楚。取决于AD的存在，各隔室中的Aβ比值有变化。这表明诸隔室之间Aβ代谢的紊乱有差别作用。与CSF Aβ代谢相比，外周血浆Aβ代谢的关系可能比仅是ApoE基因型依赖性更复杂。可能不只AD状态，还有其它因素可相互作用而影响该关系。因此，Aβ代谢变化的清晰模式(clear pattern)可能不依赖于ApoE基因型。 
借鉴本文可作出并实施本文公开和要求权益的所有组合物和方法，而无需过多实验。虽然已根据优选实施方式描述了本发明组合物和方法，但本领域技术人员应明白，可在这些组合物和方法以及本文所述方法的步骤或次序中作出改变而不脱离本发明的概念、构思和范围。更具体地说，应该明白可用化学和生理学上相关的某些物质取代本文所述的物质，却仍能获得相同或相似的结果。本领域技术人员明白的所有这种相似的取代和改进应视作属于权利要求书所限定的本发明构思、范围和概念。 

Claims (20)

1.一种检测在对象中枢神经系统中合成的蛋白质的体内代谢的方法，其中所述方法不用于诊断疾病，所述方法包括：
(a)给予该对象标记的部分，所述标记的部分能穿过血脑屏障并随着该蛋白质在该对象的中枢神经系统中合成而掺入该蛋白质；
(b)获得该对象的脑脊液样品，该脑脊液样品包含在中枢神经系统中合成并用所述标记的部分可检测地标记的蛋白质组分和未用所述标记的部分标记的蛋白质组分，其中用质谱仪检测所述脑脊液样品中标记的蛋白质组分；
(c)检测标记的蛋白质的含量和未标记的蛋白质的含量，其中标记的蛋白质与未标记的蛋白质的比值与对象中该蛋白质的中枢神经系统代谢成正比；
(d)从自首次标记蛋白质到可检测标记的蛋白质的时间迟滞之后但在停止给予标记的氨基酸之前收集的一个或多个样品计算所述标记蛋白质的分数合成速率，其中所述分数合成速率是标记/未标记蛋白质的比值随时间增加的速率，和/或
(e)从在停止给予标记的氨基酸之后12小时期间收集的一个或多个样品计算所述标记蛋白质的分数清除速率，其中所述分数清除速率是标记/未标记蛋白质的比值随时间降低的速率。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记的部分是原子或具有标记的原子的分子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述原子是非放射性同位素。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述非放射性同位素选自2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S和36S。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括分离所述脑脊液样品的标记的蛋白质组分和未标记的蛋白质组分。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过选自质谱法、串联质谱法及其组合的方法检测标记的蛋白质含量和未标记的蛋白质含量。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自淀粉样蛋白-β、载脂蛋白E、载脂蛋白J、共核蛋白、可溶性淀粉样蛋白前体、Tau、α-2巨球蛋白、S100B、髓磷脂碱蛋白、白介素和TNF。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过免疫沉淀分离所述蛋白质。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脑脊液样品通过腰椎穿刺、腰椎导管或其组合获得。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，获得该对象的脑脊液样品是0-12小时、0-24小时或0-36小时，每小时一次。
11.标记的部分、给予对象标记的部分的装置、获得该对象的脑脊液样品的装置、检测标记的蛋白质的含量和未标记的蛋白质的含量的装置、计算所述标记蛋白质的分数合成速率的说明书和计算所述标记蛋白质的分数清除速率的说明书在制备用于检测在对象中枢神经系统中合成的蛋白质的体内代谢的试剂盒中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述标记的部分是原子或具有标记的原子的分子。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述原子是非放射性同位素。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述非放射性同位素选自2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S和36S。
15.如权利要求11所述的用途，其特征在于，还包括分离所述脑脊液样品的标记的蛋白质组分和未标记的蛋白质组分的装置。
16.如权利要求11所述的用途，其特征在于，通过选自质谱法、串联质谱法及其组合的方法检测标记的蛋白质含量和未标记的蛋白质含量。
17.权利要求11所述的用途，其特征在于，所述蛋白质选自淀粉样蛋白-β、载脂蛋白E、载脂蛋白J、共核蛋白、可溶性淀粉样蛋白前体、Tau、α-2巨球蛋白、S100B、髓磷脂碱蛋白、白介素和TNF。
18.如权利要求15所述的用途，其特征在于，通过免疫沉淀分离所述蛋白质。
19.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述脑脊液样品通过腰椎穿刺、腰椎导管或其组合获得。
20.如权利要求11所述的用途，其特征在于，获得该对象的脑脊液样品是0-12小时、0-24小时或0-36小时，每小时一次。
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