CN107765015A - 一种定量检测脑组织中Aβ40蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种定量检测脑组织中Aβ₄₀蛋白的方法。该方法通过联用免疫沉淀与基质辅助激光解吸电离‑飞行时间质谱，实现脑组织中Aβ40蛋白的定量检测。本发明建立的IP‑MALDI‑TOF方法在一定浓度范围内可以用来测量小鼠脑组织匀浆上清中的Aβ₄₀蛋白含量，该方法操作简单，稳定性和精密度良好，为Aβ蛋白的测量提供了新的思路。

Description

一种定量检测脑组织中Aβ40蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种定量检测脑组织中Aβ₄₀蛋白的方法。

背景技术

Aβ淀粉样蛋白(Aβ)由第21号染色体编码，是淀粉样蛋白前体(APP)经蛋白水解酶作用后的底物，是阿尔茨海默病脑内主要病理标志性蛋白之一，它的形成、沉积和降解启动和贯穿了AD的整个病理过程。Aβ₄₂是由42个氨基酸组成的蛋白质片断(其氨基酸序列为DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA，如SEQ ID NO：1所示)，若在其缬氨酸711和异亮氨酸712之间酶切割则形成Aβ₄₀(其序列为DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV，如SEQ ID NO：2所示)。Aβ₄₀是由40个氨基酸组成的蛋白片断，正常老年人和AD患者脑内均存在，并且AD患者脑中含量多于正常患者。

Aβ蛋白在脑中含量很少、容易聚集并且脑中基体复杂，这些都为Aβ在脑中的绝对定量造成了困难。现在常用的定量方法是ELISA酶联免疫试剂盒法，酶免疫试验还是有其局限性的，不但所检测的生物学体液样本如组织匀浆液中有可能存在各种干扰实验的因素，而且在实验过程中，影响结果的因素也很多，尤其是进行手工ELISA测定时。

因此，亟待一种能准确绝对定量脑组织中的Aβ₄₀蛋白的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能准确绝对定量脑组织中Aβ₄₀蛋白的方法。

免疫沉淀法(Immunoprecipitation，IP)是一种研究蛋白质间交互作用的生物技术，这种技术是将蛋白质视为抗原，并利用磁珠上的抗体与之进行特异性结合的特性，来进行研究。这项技术可用来将含有上千种不同蛋白质的样品中，分离和浓缩出特定蛋白质。目前常用的IP后目标蛋白鉴定的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western Blot、质谱鉴定等。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都十分简单和高效。

本发明建立了一种联用免疫沉淀与基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的方法，命名为IP-MALDI-TOF技术，检测脑组织中Aβ₄₀蛋白，并在进MALDI-TOF之前就加入一种内标物，以此来准确绝对定量脑组织中的Aβ₄₀蛋白。

具体地，本发明提供一种定量检测脑组织中Aβ₄₀蛋白的方法，该方法通过联用免疫沉淀与基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱，实现脑组织中Aβ₄₀蛋白的定量检测。

更具体地，该方法包括以下步骤：

(1)将含有Aβ₄₀蛋白的待测样品与偶联有Aβ₄₀蛋白抗体的磁珠混合，通过免疫沉淀把目标Aβ₄₀蛋白富集到磁珠上，形成磁珠-抗体-蛋白复合物；

(2)用洗脱液洗脱，将Aβ₄₀蛋白从磁珠-抗体-蛋白的复合物中分离出来，进行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱检测。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从蛋白样品前处理、抗体-磁珠的孵育、抗体-磁珠复合物洗脱到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到实验目的。

根据本发明，优选地，所述Aβ₄₀蛋白抗体包括Biolegend公司的三种抗Aβ₄₀蛋白抗体：M2.3、4G8、11A50-B10。利用这三种抗体同时连接到磁珠上按上述方法富集Aβ₄₀标准蛋白，通过MALDI-TOF检测，回收率达到48.7％。

根据本发明，所述洗脱液为酸性洗脱液，包括但不限于盐酸。所述洗脱液的pH值优选为1.0-3.0。

优选地，基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测定中，以α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质。

本发明利用基于内标法的MALDI-TOF MS的定量分析方法。由于任何影响目标物和内标物离子化效率及信号强度的因素均影响定量分析结果。因此，在实际样品的定量分析过程中，内标的选择很重要。本发明的基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱检测为内标检测法，使用与Aβ₄₀相差2个氨基酸的Aβ₄₂蛋白作为内标，后者不会影响前者的离子化过程，且两者有类似的离子化效率，适合作为内标。

经实验验证，Aβ₄₀与内标Aβ₄₂具有线性关系，线性范围为120ng/ml-600ng/ml。可以通过添加一定浓度的内标与待检测样品混合进样，得出两种物质信号强度的比值，根据已经绘制好的标准曲线就可以实现对待检测物质的定量。本发明方法的检出限为2.94μg/L，定量限为9.80μg/L。

本发明建立的IP-MALDI-TOF方法在一定浓度范围内可以用来测量小鼠脑组织匀浆上清中的Aβ₄₀蛋白含量，该方法操作简单，稳定性和精密度良好，为Aβ蛋白的测量提供了新的思路。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。

图1示出了加入内标后Aβ40蛋白的MALDI-TOF线性标准曲线。

图2示出了不同抗体对IP作用的影响。

图3示出了Biolegend三种抗体识别位点。

图4示出了不同洗脱方式的比较结果。

图5示出了IP-MALDI MS的线性标准曲线。

图6示出了Bradford法测总蛋白标准曲线。

图7示出了ELISA测Aβ40标准蛋白的标准曲线。

图8示出了IP-MALDI-TOF MS与ELISA定量鼠脑基体中Aβ40蛋白浓度的比较结果。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

以下涉及Aβ₄₀标准蛋白的实验中，为了防止Aβ₄₀标准蛋白的聚集，需要用六氟异丙醇(HFIP)进行前处理，具体操作如下：

(1)将Aβ₄₀以1mg/ml浓度溶于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP，Sigma)中，并分装于EP管(100μg/管)中。

(2)放入通风柜中，HFIP蒸发，将得到的透明肽膜在真空下干燥过夜，然后放在-20℃直至使用。

(3)若为得到Aβ₄₀的低聚物，将干燥的多肽重新悬浮于DMEM或PBS中至终浓度为100μM，然后在4℃下孵育24小时。使用前可通过Western blot检测Aβ₄₀的寡聚体形式。

实施例1、建立IP-MALID-TOF绝对定量Aβ₄₀蛋白的方法

1.1、基于MALDI-TOF MS的定量分析方法

(1)基质准备：根据所测多肽分子量大小范围确定最终选择α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)作为基质，用的30％乙腈的超纯水溶液(含0.1％的TFA)配制成饱和的基质溶液，基质溶液现配现用。

(2)仪器的校正：质谱分析前仪器的质量数釆用BRUKER公司的蛋白标准品利用外标法进行校正。

(3)质谱仪参数设定：加速电压：20kV；激光频率：2000HZ；质量扫描范围：3000-10000Da；离子延时提取时间：250ns；激光强度：60％；线性模式。

点样：分别取2μl样品点样于靶盘中，等自然挥干后，分别点上1μl基质，完全挥干后放入MALDI-TOF MS中，进行测定。

(4)选择合适的运行方法，激光随机选择样品10个不同部位，共打激光1500次，得到的质谱图是平均后的信号强度。打开flexAnalyse软件分析处理得到的质谱图。

1.2、MALDI-TOF的线性以及检测限

要建立MALDI-TOF的线性关系，需要Aβ₄₀标准蛋白和内标物Aβ₄₂以不同的比例混合，通过寻找相应的信号浓度比之间的关系来确定两种多肽是否具有线性相关性。

分别配制Aβ₄₀浓度为120、150、200、300、400、600ng/ml，内标为600ng/ml，实验中釆用20％乙腈超纯水溶液(含0.1％TFA)对样品进行溶解稀释混匀，每个样品上样五次，按上述操作方法进行MALDI-TOF检测，得到不同比例下的MALDI-TOF MS图。两种蛋白的MALDI-TOF图谱信号稳定，峰形明显，两者信号强度比与浓度比有一定的相关性，以Aβ₄₀与内标的浓度比为横坐标，以Aβ₄₀与内标的信号强度比为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程和R²。如图1所示。

由图1可以看出Aβ₄₀与内标有线性关系，线性范围为120ng/ml-600ng/ml。可以通过添加一定浓度的内标与待检测样品混合进样，得出两种物质信号强度的比值，根据已经绘制好的标准曲线就可以实现对待检测物质的定量。

以2μl的20％乙腈超纯水溶剂(含0.1％的TFA)和1μl的CHCA基质平行进样测试10次，测定Aβ₄₀的信号响应值，分别以其信号响应值的标准偏差(S)的3倍和10倍所对应的质量浓度为检出限及定量限，得出检出限为2.94μg/L，定量限为9.80μg/L。

1.3免疫沉淀法富集Aβ₄₀蛋白

磁珠上的对甲苯磺酰基能与多肽或抗体上的氨基反应，使其偶联在磁珠上，属于共价连接。

免疫沉淀法富集提取Aβ₄₀蛋白操作如下：

(一)洗涤磁珠

涡旋瓶内磁珠30秒，取165μl(5mg)磁珠置于EP管中，加入1ml的Buffer A，混匀，放置磁力架中1min，磁珠被吸附，弃上清，再将EP管移出磁力架，加入165μl的Buffer A，重悬。

(二)配体偶联磁珠

将165μl洗过的磁珠，放置磁力架中1min，移去上清，加入一定量抗体(不同抗体不同加入比例)，再加入Buffer A，共150μl，涡旋充分混合，再加入100μl的Buffer C，混合充分，摇床37℃孵育12-18小时。孵育过后，放入磁力架中吸附2min，弃上清，再加入1ml的Buffer D，摇床孵育1小时，而后放置磁力架中2min，弃上清。加入1ml Buffer E洗涤磁珠，涡旋5～10秒，放置磁力架中弃上清，重复洗涤两次。最后加入250μl含有叠氮化钠的BufferE，作为贮存Buffer，重悬，磁珠浓度为20mg/ml。

(三)偶联后的磁珠富集目标蛋白

取1mg上述偶联后的磁珠(相当于上述磁珠50μl)，置于1ml小鼠脑组织匀浆上清中或者1ml的Aβ₄₀标准蛋白溶液中，摇床18℃孵育3小时，使磁珠上的抗体充分与溶液中的目标蛋白反应。孵育过后放置磁力架中2min，可保留上清检测目标蛋白剩余量。加入Buffer E涡旋5-10秒洗涤两次。

(四)洗脱目标蛋白

将磁珠-抗体-目标蛋白复合溶液置于磁力架中，弃上清，加入100μl的ElutionBuffer，涡旋2min，再70℃加热10min，最后置于磁力架中，收集上清，得到目标蛋白溶液。

1.4、IP富集Aβ₄₀蛋白条件的优化

1.4.1抗体的优化

因为免疫沉淀对抗体的纯度、抗原识别位点等质量要求很高，所以抗体的选择在IP-MALDI-TOF过程中至关重要，分别使用以下五种抗体或多肽，筛选出了最优抗体。

(一)KLVFF多肽

将Aβ蛋白中的一小段多肽作为配体，偶联到磁珠上，利用KLVFF这一段序列与Aβ中的KLVFF发生缠绕、聚集，从而把Aβ蛋白富集到磁珠上。

具体过程为：1mg偶联20μgKLVFF多肽的磁珠，按上述免疫沉淀法富集1ml 1μg/ml的Aβ₄₀蛋白标准溶液，以200μl HCl加热洗脱，并加入2.5μg/ml的内标混匀，通过MALDI-TOFMS检测，得出Aβ₄₀标准蛋白回收率为5.25％，如图2所示。

(二)金斯瑞、Abacam两种抗Aβ₄₀抗体

使用金斯瑞以及Abacam公司抗Aβ₄₀单克隆抗体偶联磁珠，按上述免疫沉淀法，通过MALDI-TOF检测，如图2所示，回收率分别为12.3％、23％。

(三)Biolegend三种抗体

使用Biolegend公司的三种抗Aβ₄₀蛋白抗体：M2.3、4G8、11A50-B10，偶联磁珠，它们分别识别Aβ₄₀蛋白的4-9、18-22以及C端序列(如图3所示)。利用这三种抗体同时连接到磁珠上按上述方法富集Aβ₄₀标准蛋白，通过MALDI-TOF检测，如图2所示，回收率达到48.7％，而只偶联11A50-B10抗体的回收率只有32％，说明三种抗体的联合免疫沉淀作用强于单个抗体的作用，适用于本发明的IP反应。

1.4.2洗脱条件的优化

为了达到最优的洗脱效果，使更多的目标蛋白从磁珠上洗脱下来，发明人筛选了酸性、碱性、有机溶剂、尿素这四种洗脱液，且每种洗脱方式分为不加热和加热两种形式，进MALDI-TOF检测，比较不同的洗脱效果。如图4所示酸性洗脱优于其他三种洗脱方式，加热比不加热效果要好，说明酸性溶液更能破坏蛋白和其抗体的结合。

具体操作为：按照上述免疫沉淀法，每毫克磁珠偶联Biolegend的4μg M2.3、5μg4G8、5μg 11A50-B10三种抗体，加到1ml 0.6μg/ml的Aβ40标准蛋白溶液中，最后分别用100μl 10mM的HCl(pH 2.0)、10mM的NaOH(pH 12.0)、100％甲醇、8M尿素洗脱，且每种溶液分未加热与70℃加热10min两种方式，最后加入0.6μg/ml的内标混匀，进MALDI-TOF检测，比较不同的洗脱效果。

实施例2、IP-MALDI-TOF的线性验证

准确配制一系列Aβ₄₀标准品浓度，通过IP-MALDI-TOF MS检测，得到标准曲线如图5所示，加入的Aβ₄₀标准蛋白浓度越高，Aβ₄₀与内标的信号强度比越大，并且呈线性关系，线性范围为30ng/ml-600ng/ml，Aβ₄₀蛋白在使用浓度范围内线性关系良好。

具体操作为：按照上述免疫沉淀法，每毫克磁珠偶联Biolegend的4μg M2.3、5μg4G8、5μg 11A50-B10三种抗体，加到1ml 3ppb、30ppb、150ppb、300ppb、600ppb的不同浓度Aβ₄₀标准蛋白溶液中，最后分别用100μl 20mM的HCl 70℃加热10min洗脱，最后加入300ppb的内标混匀，进MALDI-TOF检测Aβ₄₀与内标的信号强度比。如图5所示，两者信号强度比与加入的Aβ₄₀标准蛋白的浓度有一定的相关性，以加入的Aβ₄₀标准蛋白浓度为横坐标，以Aβ₄₀与内标的信号强度比为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程和R²。

实施例3、IP-MALDI-TOF定量Aβ₄₀的重复性验证

方法重复性是对同一样品的标准蛋白溶液平行测量八次的RSD值。以IP-MALDI-TOF MS平行做8个样品，每个样品进MALDI-TOF测样5次，得到八个样品Aβ40与内标的信号强度比，去掉一个结果明显偏小的值，算出RSD为6.0％，说明该方法精密度良好，结果见表1。

具体操作为：按照上述免疫沉淀法，每毫克磁珠偶联Biolegend的4μg M2.3、5μg4G8、5μg 11A50-B10三种抗体，加到1ml浓度为300ppb的Aβ₄₀标准蛋白溶液中，最后用100μl20mM的HCl 70℃加热10min洗脱，最后加入300ppb的内标混匀，进MALDI-TOF检测Aβ₄₀与内标的信号强度比。

表1 IP-MALDI-TOF定量Aβ40的重复性实验(n＝8)

实施例4、IP-MALDI-TOF与ELISA两种方法定量Aβ₄₀蛋白的比较

测定AD鼠脑、正常鼠脑中Aβ₄₀标准蛋白的含量，建立AD鼠脑基体，加入Aβ₄₀标准蛋白，人造小鼠脑组织中含有300μg/L Aβ₄₀的重症AD患者，然后用建立的IP-MALDI-TOF方法和常用的ELISA方法分别测量。

4.1、匀浆法提取小鼠脑组织中的总蛋白

7月龄的APP转基因模型鼠和正常鼠经复合麻醉剂麻醉后，用低温生理盐水快速灌流2min，断头取脑，用冰生理盐水冲洗干净，放入-80℃保存。

匀浆法脑蛋白的提取：称取鼠脑重量，把组织剪切成细小的碎片。融解细胞裂解液，混匀，取适当的裂解液在使用数分钟内加入蛋白酶抑制剂PMSF，使PMSF最终浓度为1mM。按照每20毫克组织加入200μl细胞裂解液的比例加入裂解液(含1mM的PMSF)，用玻璃匀浆器在冰上充分匀浆，冰上静置30min。充分裂解后，4℃10000g离心1小时，取上清。上清液蛋白浓度用Bradford法定量，置于-80℃保存。

4.2、Bradford法测小鼠脑组织总蛋白的含量

使用去垢剂兼容性Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定AD鼠脑、正常鼠脑组织匀浆上清中的总蛋白浓度：蛋白标准品(20mg/ml，BSA)用上述细胞裂解液稀释成0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5mg/ml的一系列浓度，每次稀释要注意充分混匀。取10μl不同浓度的蛋白标准溶液加到96孔板的蛋白标准孔中，取10μl样品到96孔板的样品孔中。各孔加入300μlG250染色液(去垢剂兼容性)，用酶标仪测定A595波长下的吸光度。根据图6标准曲线和使用样品体积计算出样品中的蛋白浓度，AD鼠脑中总蛋白含量为(92+8)mg/g；正常鼠脑中总蛋白含量为(103+12)mg/g，两者没有显著性差异(p＝0.1265)。

4.3、ELISA测定小鼠脑组织基体中的Aβ₄₀蛋白含量

使用ELISA试剂盒，酶联免疫法测定小鼠脑组织基体中的Aβ₄₀蛋白含量，样品应先用样本稀释剂稀释。具体操作如下：

(1)标准曲线：设标准孔，每孔中加入标准品，浓度分别为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40pg/ml。为保证检测结果准确性，标准品设双孔测定。(2)加样：样品孔中每孔加入待测组织裂解液，样品平行加入6孔测定。(3)轻轻混匀30s，封住板孔，37℃温育2小时。(4)弃去液体，甩干，不用洗涤。(5)每孔加生物素标记抗体工作液100μl，覆上新的板贴，37℃温育1小时。(6)弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2分钟，200μl/孔，甩干。(7)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，覆上新的板贴，37℃温育1小时。(8)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，200μl/孔，甩干。(9)依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色15～30分钟。(10)依序每孔加终止溶液50μl，终止反应。(11)在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度值(OD值)。最后由图7标准曲线算出AD鼠脑和正常鼠脑组织基体中Aβ₄₀蛋白含量分别为(177.43+13.77)ng/ml；(58.54+9.05)pg/ml。

4.4、IP-MALDI-TOF与ELISA两种方法定量Aβ₄₀蛋白的比较

用IP-MALDI-TOF测量相同的的AD鼠脑中的Aβ₄₀蛋白浓度，与上述ELISA方法作比较，看两个方法测量有无显著性差异。IP-MALDI测得的AD鼠脑中Aβ₄₀蛋白浓度为(170.59+16.45)ng/ml。IP-MALDI-TOF测得的AD鼠脑中的Aβ₄₀蛋白浓度与ELISA相比，没有显著性差异，结果见图8。

具体操作为：按照上述免疫沉淀法，每毫克磁珠偶联Biolegend的4μg M2.3、5μg4G8、5μg 11A50-B10三种抗体，加到1ml Aβ₄₀浓度为300ppb的小鼠脑组织匀浆液中，最后用100μl 10mM的HCl 70℃加热10min洗脱，最后加入300ppb的内标混匀，进MALDI-TOF检测Aβ₄₀与内标的信号强度比。该方法平行做6次，每次进MALDI-TOF重复测定5次。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。

序列表

<110> 中国计量科学研究院

北京化工大学

<120> 一种定量检测脑组织中Aβ40蛋白的方法

<130> 1700568

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210> 2

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

35 40

Claims (7)

1.一种定量检测脑组织中Aβ₄₀蛋白的方法，其特征在于，该方法通过联用免疫沉淀与基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱，实现脑组织中Aβ₄₀蛋白的定量检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括以下步骤：

(1)将含有Aβ₄₀蛋白的待测样品与偶联有Aβ₄₀蛋白抗体的磁珠混合，通过免疫沉淀把目标Aβ₄₀蛋白富集到磁珠上，形成磁珠-抗体-蛋白复合物；

(2)用洗脱液洗脱，将Aβ₄₀蛋白从磁珠-抗体-蛋白的复合物中分离出来，进行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱检测。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述Aβ₄₀蛋白抗体包括Biolegend公司的三种抗Aβ₄₀蛋白抗体：M2.3、4G8、11A50-B10。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述洗脱液为酸性洗脱液。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述洗脱液的pH值为1.0-3.0。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱检测为内标检测法，所述内标为Aβ₄₂蛋白。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测定中，以α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质。