CN114324557A - 一种基于MALDI-TOF MS的ζ-珠蛋白的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于MALDI‑TOF MS的ζ‑珠蛋白的检测方法，所述方法，包括以下步骤：制备抗体偶联磁珠；富集检测样本；清洗‑洗脱；点样检测。ζ‑珠蛋白属于低丰度蛋白，并且分子量较大(>15，000Da)，所以质谱仪在检测ζ‑珠蛋白时，会面临灵敏度、分辨率不足等瓶颈。本发明首次提出一种基于MALDI‑TOF MS的ζ‑珠蛋白检测方法，该方法通过对ζ‑珠蛋白的富集提取以及排除相关干扰因素等操作，使之可适用于MALDI‑TOF MS进行检测，且检测率高达100％。
Description
技术领域
本发明涉及ζ-珠蛋白检测技术领域。更具体地，涉及一种基于MALDI-TOF MS的ζ-珠蛋白的检测方法。
背景技术
ζ-珠蛋白是人类胚胎期血液中特有的血红蛋白成分，正常人在出生3个月后不再被检出。但SEA缺失型α地中海贫血的基因携带者的血红蛋白中仍可检出微量的ζ-珠蛋白，所以检测成年人的ζ-珠蛋白，对筛查发现SEA型α地中海贫血基因携带者有积极的意义。对ζ-珠蛋白的检测，现有较为通用的方法主要为ELISA法和基于基因分析的方法等。其中，ELISA法要求在目前地中海贫血筛查的一般环境中增加新的仪器设备，并且存在检测时间较长，效率较低，成本较高以及敏感度和特异性难以达到要求等缺点；而基于基因分析的方法，则因效率低、成本高而难以普及使用。
MALDI-TOF MS是用于检测生物大分子的质谱仪，其作为质谱检测技术，有着更高的抗干扰能力、分辨能力和更好的灵敏度等优势。现有生物标志物的研究发现，MALDI-TOFMS对多种地中海贫血分型均可进行良好的区分，但是，基于MALDI-TOF MS的技术检测的生物分子质核比超过10000Da时，其灵敏度和分辨能力会大幅下降。而ζ-珠蛋白分子量>15000Da，并且在成人血液中含量十分稀少，所以用MALDI-TOF MS检测的难度极高。因此，提供一种成本较低、操作简单、精确度较高的基于MALDI-TOF MS的ζ-珠蛋白的检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种基于MALDI-TOF MS的ζ-珠蛋白的检测方法。
本发明的第二个目的在于提供一种用于上述的检测方法的试剂盒。
为达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种基于MALDI-TOF MS的ζ-珠蛋白的检测方法，包括如下步骤：
制备抗体偶联磁珠：ζ-珠蛋白抗体与磁珠分别用碱性缓冲液进行一次清洗，清洗后的ζ-珠蛋白抗体和磁珠偶联，然后用牛血清白蛋白溶液进行二次清洗，获得抗体偶联磁珠；
富集检测样本：将含有ζ-珠蛋白的全血样本进行前处理，然后与所述抗体偶联磁珠混匀，孵育1h，得到富集到ζ-珠蛋白的抗体偶联磁珠；
清洗-洗脱：将所述富集到ζ-珠蛋白的抗体偶联磁珠依次用包含0.1％(v/v)的吐温-20的碱性缓冲液和水进行清洗，然后用醋酸洗脱液进行洗脱，得到包含ζ-珠蛋白的洗脱液；
点样检测：将所述包含ζ-珠蛋白的洗脱液与SA基质混合后点在疏水靶板上，干燥结晶，在MALDI-TOF MS上进行检测。
其中，ζ-珠蛋白分子量>15000Da，并且在成人血液中含量十分稀少，所以用MALDI-TOF MS检测的难度极高，而本发明发现，利用通过对ζ-珠蛋白的富集提取及排除相关干扰因素等操作，可以使其适用于MALDI-TOF MS进行检测，且检测率高达100％。具体排除相关干扰因素的操作，主要包括：制备抗体偶联磁珠前，将ζ-珠蛋白抗体与磁珠分别进行一次清洗，洗去表面的干扰因子；其次，ζ-珠蛋白抗体与ζ-珠蛋白的特异性识别；最后，及时在抗体与磁珠偶联后，进行的二次清洗，洗去副产物等杂质，以提升后期对ζ-珠蛋白的富集程度。
进一步，在上述方法中，所述磁珠为亲和素磁珠或羧基磁珠。其中，本发明发现，这两种磁珠可以更优的富集ζ-珠蛋白。
所述牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白的质量浓度为0.1％。
所述碱性缓冲液是pH为6.5～8.0的PBS缓冲液。
所述全血样本的前处理，包括以下步骤：每5μL的全血样本用32.5μL的水稀释，再加入12.5μL的包含0.1％的吐温-20的碱性缓冲液混合，即可；所述碱性缓冲液是pH为6.5～8.0的PBS缓冲液。
所述醋酸洗脱液中醋酸的体积浓度为5％。
所述包含ζ-珠蛋白的洗脱液与SA基质的体积比为1:1。
所述SA基质是体积比为6:4的三氟乙酸溶液和乙腈混合而成的；所述三氟乙酸溶液中三氟乙酸的体积浓度为0.1％。
第二方面，本发明提供了用于上述的检测方法的试剂盒。所述试剂盒包含：ζ-珠蛋白抗体、磁珠、碱性缓冲液、包含0.1％的吐温-20的碱性缓冲液、醋酸洗脱液和SA基质。
进一步，所述磁珠为亲和素磁珠或羧基磁珠。
进一步，所述碱性缓冲液是pH为6.5～8.0的PBS缓冲液。
进一步，所述醋酸洗脱液中醋酸的体积浓度为5％。
进一步，所述SA基质是体积比为6:4的三氟乙酸溶液和乙腈混合而成的；所述三氟乙酸溶液中三氟乙酸的体积浓度为0.1％。
另外，如无特殊说明，本发明中所用原料均可通过市售商购获得，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。所述百分比如无特殊说明均为质量百分比，所述溶液若无特殊说明均为水溶液。
本发明的有益效果如下：
ζ-珠蛋白属于低丰度蛋白，并且ζ-珠蛋白的分子量较大(>15000Da)，所以质谱仪在检测ζ-珠蛋白时，会面临灵敏度、分辨率不足等瓶颈。本发明首次提出一种基于MALDI-TOF MS的ζ-珠蛋白检测方法，该方法通过对ζ-珠蛋白的富集提取以及排除相关干扰因素等操作，使之可适用于MALDI-TOF MS进行检测。
本发明提供的基于MALDI-TOF MS的ζ-珠蛋白检测方法，检测率高达100％，可以对ζ-珠蛋白进行定性、定量分析。此外，该方法检测一个样本只需要几秒钟，且其靶板可实现48、96、384等通量，因此，该方法非常适用于在现实应用中进行ζ-珠蛋白的鉴定，以作为该生物标志物相关疾病，如SEA型在中海贫血等的分析指标。
本发明提供的ζ-珠蛋白检测试剂盒原料廉价易得，工艺简单，适合大规模生产应用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出实施例1的检测方法检测的阳性全血样本的质谱图。
图2示出实施例1的检测方法检测的阴性全血样本的质谱图。
图3示出对比例1的检测方法检测的阳性全血样本与对照阴性全血样本的质谱对比图。
图4示出对比例2的检测方法检测的阳性全血样本的质谱图。
图5示出试验例1的不同抗体用量与相对峰强度的关系的质谱对比图。
图6示出试验例2的检测方法检测多种全血样本的检测结果数据对比图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
其中，以下实施例中，ζ-珠蛋白抗体购自GeneTex公司。
亲和素M-270环氧树脂磁珠购自Thermofisher和爱博泰克有限公司。
实施例1：
(一)提供一种检测ζ-珠蛋白的试剂盒，包括ζ-珠蛋白抗体、亲和素-M-270环氧树脂磁珠、0.1mM，PH＝7.4的PBS缓冲液、包含0.1％(v/v)吐温-20的1mM，PH＝7.4的PBS缓冲液、体积浓度为5％的醋酸溶液和SA基质(所述SA基质是体积比为6:4的三氟乙酸溶液和乙腈混合而成的；所述三氟乙酸溶液的体积浓度为0.1％)。
(二)用上述试剂盒进行ζ-珠蛋白的检测，包括以下步骤：
(1)制备抗体偶联磁珠：
a.取20μgζ-珠蛋白抗体至50Kda浓缩管中，加100μL PBS缓冲液超滤3次，收集管中剩余液体，再使用20μL PBS缓冲液清洗管壁一次；
b.取亲和素M-270环氧树脂磁珠1mg(提前制备为溶液状态/25μL)，200μL PBS缓冲液清洗一次。加入15μL PBS缓冲液，混匀，再加入清洗后的抗体，混匀，加入22.5μL硫酸铵溶液，混匀。
c.置于翻转混合仪，孵育过夜，将产物加入200μL 0.1％牛血清白蛋白(BSA)溶液清洗4次，获得抗体偶联磁珠置于4℃保存。
(2)富集检测样本：
a.取全血样本5μL，加至32.5μL纯净水中，混匀，再加入12.5μL所述包含体积0.1％的吐温-20的PBS缓冲液，混匀；
b.取抗体偶联磁珠(1.25～2.5μg)于磁力架上，弃掉上清液，加入处理后的全血样本，混匀；
c.置于翻转混合仪，孵育1小时，得到富集到ζ-珠蛋白的抗体偶联磁珠；
(3)清洗-洗脱：
a.取上述富集到ζ-珠蛋白的抗体偶联磁珠于磁力架上，弃掉上清液，加入200μL包含0.1％吐温-20的PBS缓冲液清洗，重复操作4次；使用200μL纯净水洗一次，低速离心将磁珠离至管底；
b.磁珠于磁力架上，弃掉上清液。加入10μL醋酸溶液洗脱，混匀后静置1分钟；得到包含ζ-珠蛋白的洗脱液；
(4)点样检测：
a.取得到包含ζ-珠蛋白的洗脱液2.5μL，加入2.5μL SA基质，混匀后，全部点在疏水靶板上；
b.靶板置于加热板上(40℃)干燥结晶后，上机检测；
(三)检测结果分析：
图1为利用本例方法测得的已经基因测序确定的SEA型地中海贫血的阳性全血样本的质谱结果，在质谱图m/z＝15545-15551处出现较强的质谱峰(ζ-珠蛋白的分子量为15548Da，考虑到MALDI-TOF MS对高质荷比离子的分辨能力较弱，设定偏差为±3Da)，即为检测到的ζ-珠蛋白。
图2为利用本例方法测得的阴性全血样本的质谱结果，在质谱图m/z＝15545-15551处出现没有出现明显的质谱峰，即没有检测到ζ-珠蛋白。
对比例1
检测方法：针对ζ-珠蛋白检测，首先选取已经基因测序确定的SEA型地中海贫血的阳性全血样本与对照阴性全血样本分别直接进行点样检测。此检测操作共重复两次。
检测结果分析：发现二者质谱图无明显区别，基本重合，在质谱图m/z＝15545-15551处均出现没有出现明显的质谱峰，未能检测到ζ-珠蛋白(如图3所示)。该结果表明因ζ-珠蛋白含量过低，且其分子量较大，MALDI-TOF MS无法对其样本直接检测。
对比例2
同实施例1，检测已经基因测序确定的SEA型地中海贫血的阳性全血样本，区别仅在于，将抗体与磁珠直接偶联包被，富集所采用的磁珠为普通顺磁磁珠。
检测结果分析：在质谱图m/z＝15545-15551处出现没有出现明显的质谱峰，未能检测到ζ-珠蛋白(如图4所示)，该结果表明，使用普通顺磁磁珠时，抗体与磁珠的结合率较低，因此，ζ-珠蛋白富集程度不高，影响最终的质谱结果。
对比例3
同实施例1，检测已经基因测序确定的SEA型地中海贫血的阳性全血样本，区别仅在于，制备抗体偶联磁珠时，不进行步骤a。
检测结果分析：在质谱图m/z＝15545-15551处没有出现明显的质谱峰，未能检测到ζ-珠蛋白，该结果表明，抗体试剂中含有甘氨酸、Tris、甘油等保护剂，干扰了抗体与磁珠的结合。因此，在制备抗体偶联磁珠时必须进行清洗步骤，否则影响最终的质谱结果。
试验例1：探究抗体用量与相对峰强度的关系
同实施例1，区别仅在于，利用不同浓度的抗体分别偶联磁珠，1mg磁珠对应抗体用量为5、2.5、1.25μg。
检测结果分析：如图5所示。抗体用量梯度降低时,ζ-珠蛋白的相对峰强度也随之降低。
试验例2：探究多中全血样本对照检测结果
本实验共测样本59例，其中阴性对照15例，β型地中海贫血5例，静止型α地贫5例，SEA型α地贫34例。检测试剂盒与检测方法同实施例1，区别仅在于，抗体用量及全血用量不同，具体条件如图6所示。。
检测结果分析：SEA型α地贫的ζ链珠蛋白检出率100％，阴性对照样本的ζ链珠蛋白检出率0％，β地贫ζ链珠蛋白检出率0％，静止型α地贫0％，具体数据如图6所示。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种基于MALDI-TOF MS的ζ-珠蛋白的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备抗体偶联磁珠：ζ-珠蛋白抗体与磁珠分别用碱性缓冲液进行一次清洗，清洗后的ζ-珠蛋白抗体和磁珠偶联，然后用牛血清白蛋白溶液进行二次清洗，获得抗体偶联磁珠；
富集检测样本：将含有ζ-珠蛋白的全血样本进行前处理，然后与所述抗体偶联磁珠混匀，孵育1h，得到富集到ζ-珠蛋白的抗体偶联磁珠；
清洗-洗脱：将所述富集到ζ-珠蛋白的抗体偶联磁珠依次用包含0.1％的吐温-20的碱性缓冲液和水进行清洗，然后用醋酸洗脱液进行洗脱，得到包含ζ-珠蛋白的洗脱液；
点样检测：将所述包含ζ-珠蛋白的洗脱液与SA基质混合后点在疏水靶板上，干燥结晶，在MALDI-TOF MS上进行检测。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磁珠为亲和素磁珠或羧基磁珠。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白的质量浓度为0.1％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱性缓冲液是pH为6.5～8.0的PBS缓冲液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述全血样本的前处理，包括以下步骤：每5μL的全血样本用32.5μL的水稀释，再加入12.5μL的包含0.1％的吐温-20的碱性缓冲液混合，即可；所述碱性缓冲液是pH为6.5～8.0的PBS缓冲液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述醋酸洗脱液中醋酸的体积浓度为5％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述包含ζ-珠蛋白的洗脱液与SA基质的体积比为1:1。
优选地，所述SA基质是体积比为6:4的三氟乙酸溶液和乙腈混合而成的；所述三氟乙酸溶液中三氟乙酸的体积浓度为0.1％。
8.一种用于权利要求1～7任一所述的检测方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：ζ-珠蛋白抗体、磁珠、碱性缓冲液、包含0.1％的吐温-20的碱性缓冲液、醋酸洗脱液和SA基质。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠为亲和素磁珠或羧基磁珠。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性缓冲液是pH为6.5～8.0的PBS缓冲液；
优选地，所述醋酸洗脱液中醋酸的体积浓度为5％；
优选地，所述SA基质是体积比为6:4的三氟乙酸溶液和乙腈混合而成的；所述三氟乙酸溶液中三氟乙酸的体积浓度为0.1％。
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