CN116908469A - 一种用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，包括以下步骤：1)设置至少两组外源肽段参考品，每组外源肽段参考品至少包含一条有泛素化修饰位点的肽段，并且对于每一组中每种肽段，在其他各组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应肽段；2)在样品处理过程中，在不同的时间点加入上述不同的外源肽段参考品，且任意两组外源肽段参考品加入的时间点之间，均包括泛素化肽段富集的步骤；3)进样检测，提取处理数据，定量外源肽段参考品，计算不同泛素化修饰肽段的得率比值，以此评价两个外源肽段参考品加入时间点之间的泛素化富集过程是否合格。该方法能有效评价泛素化肽段富集效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法。
背景技术
泛素化蛋白组学是一种新兴的蛋白质组学技术，它通过检测蛋白质上的泛素化修饰来研究蛋白质的功能和调控机制。泛素化是一种重要的蛋白质修饰方式，它可以调节蛋白质的稳定性、活性、亚细胞定位和相互作用等多种生物学过程。泛素化蛋白质组学是主要的研究手段，质谱法是鉴别蛋白泛素化位点和定量泛素化变化的关键工具。泛素化肽段的富集对于成功的泛素化肽质谱分析至关重要。目前泛素化蛋白组学技术主要包括泛素化蛋白质的富集、鉴定和定量三个步骤。泛素化蛋白质的富集可以通过免疫共沉淀、亲和层析和泛素结构域捕获等方法实现。鉴定泛素化蛋白质可以通过质谱分析技术，如液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)和磷酸化肽质谱(Phospho-MS)等方法实现。定量泛素化蛋白质可以通过同位素标记技术，如蛋白质同位素标记绝对定量(PSAQ)和蛋白质同位素标记相对定量(iTRAQ)等方法实现。
目前，蛋白质泛素化富集的蛋白初始用量要求为蛋白浓度不少于5mg/mL，蛋白总量不少于4mg，富集后可得到约5μg肽段。由于大多数泛素化肽段富集过程中并不做质控，只在质谱上机后通过鉴定数与富集效率判断此次实验是否成功，因此无法确定是样本本身泛素化修饰蛋白量少还是富集过程导致的富集效率或鉴定数低。质控泛素化肽段富集过程变得极为必要。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于监测泛素化蛋白质组学中，泛素化肽段富集过程的方法。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，包括以下步骤：
1)设置至少两组外源肽段参考品，每组外源肽段参考品至少包含一条有泛素化修饰位点的肽段，并且对于每一组中每种肽段，在其他各组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应肽段；
2)在样品处理过程中，在不同的时间点加入上述不同的外源肽段参考品，且任意两组外源肽段参考品加入的时间点之间，均包括泛素化肽段富集的步骤；
3)进样检测，提取处理数据，定量外源肽段参考品，将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同泛素化修饰肽段的得率比值，以此评价两个外源肽段参考品加入时间点之间的泛素化富集过程是否合格。
该方法用以评估泛素化肽段富集过程中，泛素化富集效率及实验流程是否合格。
优选的，步骤1)中，所述泛素化修饰位点选自分布在赖氨酸残基上的N-泛素化修饰位点；每组中有泛素化修饰位点的肽段，与其他组中有泛素化修饰位点的肽段相比，序列一致的，泛素化修饰位点也相同。
优选的，步骤1)中，所述每组外源肽段参考品至少包含一条有泛素化修饰位点的肽段，其中每组中的肽段数量大于等于2条时，各肽段序列相同或者不同。
优选的，步骤1)中，所述同位素标记不同包括：一组中肽段没有同位素标记，其他各组中肽段有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同；或者各组中肽段都有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同。
优选的，步骤1)中，所述同位素标记中的同位素包括：12C、13C、14C、14N、15N、16O、18O、1H、2H。
优选的，步骤2)中，所述外源肽段参考品加入前进行准确定量，优选加入量一致，或者按比例进行加入。
优选的，步骤2)中，所述样品选自细胞、组织、血浆、血清、全血、尿液、脑脊液、唾液、淋巴液、胸腔积水、乳汁、组织液、微生物或植物。
优选的，步骤2)中，所述外源肽段参考品加入前进行准确定量，优选加入量一致，或者按比例进行加入。
作为具体实施方案，所述泛素化肽段富集的步骤，包括泛素化肽段富集的所有步骤或者部分步骤。即两组外源肽段参考品加入的时间点之间，有的可以包括泛素化肽段富集的所有步骤，有的可以包括泛素化肽段富集的部分步骤。
优选的，步骤3)中，所述检测的方法为质谱检测，如LC-MS/MS，MALDI-TOF。
进一步的，步骤3)中，若在前加入的外源肽段参考品是在泛素化肽段富集前或者富集开始时加入，在后加入的外源肽段参考品是在泛素化肽段富集完成时或者富集完成后加入，则将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同泛素化修饰肽段的得率比值，以此评价整个泛素化肽段富集过程是否合格。
进一步的，步骤3)中，所述在前加入的外源肽段参考品和在后加入的外源肽段参考品，若两者加入时间点之间仅包括泛素化肽段富集过程的部分步骤，则将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同泛素化修饰肽段的得率比值，以此评价上述泛素化肽段富集过程的部分步骤是否合格。
优选的，步骤3)中，所述提取处理数据，可以使用软件对肽段参考品的肽段进行定性定量数据提取，可使用部分先进质谱检测软件自带的实时鉴定方法，或在获得全数据后进行定性定量数据提取。
优选的，步骤3)中，所述提取处理数据，使用蛋白质组分析软件如：ProteomeDiscoverer、PEAKs、DIA-NN、Spectronaut、Maxquant、Skyline，将所有定性定量肽段数据进行导出，对导出数据进行手动或编程软件搜索并确定相应肽段丰度。
作为优选方案，当外源肽段参考品设置两组时，具体的方法如下：
1)准备两组外源肽段参考品A和B，A组和B组外源肽段参考品均包含一条泛素化修饰位点的肽段，A组作为检测标品，B组中的肽段与A组中肽段序列对应相同，但同位素标记不同，作为标定标品，同位素标记为精氨酸(R)非重标(12C)与13C标记，其泛素化修饰位点均为：赖氨酸残基上的N-泛素化修饰位点；
2)将两组参考品分开使用，在进行泛素化肽段富集前或富集中检测标品肽段组A混合加入样本中，富集完成后将标定标品肽段组B混合加入样本中，进样检测；
3)使用蛋白质组分析软件Proteome Discoverer，将所有定性定量肽段数据进行导出，对导出数据进行手动或编程软件搜索并确定相应肽段丰度，根据检测标品肽段组A与标定标品肽段组B比例计算得率，以评价泛素化肽段富集过程是否合格，计算公式为：回收率＝检测标品肽段组A的肽段强度/标定标品肽段组B的肽段强度。
有益效果：与现有技术相比，本发明可以有效评估泛素化肽段富集流程是否合格，本方法可以直观、定量评估泛素化肽段富集流程对样本造成的影响，从而评估样本操作过程中泛素化肽段的损失情况，进一步可以指导泛素化肽段富集流程的改良，也可以用于评估不同泛素化肽段富集方法对样本中泛素化肽段富集效果。
附图说明
图1：为本发明评估方法的流程示意图。
图2：为实施例1的实验流程示意图。
具体实施方式
以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
实施例
1.设置一组肽段：DGLDAK(GlyGly)SYYAPVR对应赖氨酸的泛素化修饰，精氨酸(R)
非重标(12C)，命名为检测标品肽段组A；
2.相应的同位素标记肽段(R用13C标记)：DGLDAK(GlyGly)SYYAPVR(13C6)，命名为标定标品肽段组B；(标品肽段组A和标品肽段组B均通过生物公司定制合成)。
3.将检测标品肽段组A及标定标品肽段组B，各组中肽段均按照浓度1:1进行配比，检测标品肽段组A和标定标品肽段组B均稀释到浓度为20ng/μL；
4.在蛋白质组样品提取完成后，取4mg蛋白质组样品两组，分别加入100μg胰蛋白酶，用50mMNH4HCO3溶液补齐至800μL体系，37℃酶解过夜；
5.取SPE C18 1mL除盐柱，按如下顺序加入：甲醇1mL，0.1％甲酸1mL*2次，上样*2遍，0.1％甲酸1mL*3次，使用70％乙腈1mL洗脱样品；
6.将洗脱样品进行离心真空冷冻干燥；
7.向样品管中分别加入5μL 20ng/μL检测标品肽段组A，加入1.4mL IAP缓冲液1
(100mM MOPS/NaOH pH 7.2，20mM Na2HPO4，100mM NaCl)混匀；
8.4℃10,000g离心5min后收集上清；
9.将抗体珠2,000g离心30s，去除珠子中的缓冲液，用1mL 1XPBS洗涤抗体珠4
次，每次洗涤后以2,000g离心30s，去除上清；
10.将步骤8的上清加入到抗体珠上，在4℃的旋转器上孵育2h；
11.2,000g离心30s，去除上清；
12.在抗体珠中加入1mL IAP缓冲液，倒置管混合5次，2,000g离心30s，去除上清；13.重复步骤13，总共IAP缓冲液洗两次；
14.向抗体珠中加入1mL 4℃预冷的质谱水，倒置管混合5次，2,000g离心30s，去除上清；
15.重复步骤15两次，总共水洗三次；
16.一组向抗体珠中加入55μL 0.05％ TFA，另一组向抗体珠中加入55μL 0.15％TFA，敲击管底几次，室温静置10min，每2-3min轻轻用移液器搅拌一次，分别作为样品1和样品2；
17.2,000g离心30s，收集上清；
18.分别向抗体珠中加入50μL 0.05％ TFA和0.15％ TFA，重复步骤16的离心/洗脱步骤，将上清液与步骤18收集的上清合并；
19.将合并后的上清使用SPE C18 1mL除盐柱，按如下顺序加入：甲醇1mL，0.1％甲
酸1mL*2次，上样*2遍，0.1％甲酸1mL*3次，使用70％乙腈1mL洗脱样品；20.将洗脱样品进行离心真空冷冻干燥；
21.向样品中分别加入5μL 20ng/μL标定标品肽段组B，加入15μL 0.1％甲酸水混匀；22.分别进样15μL至液相质谱进行150min DDA数据采集，液相质谱为ThermoU3000+HF进行检测；流动相A为2％乙腈、0.1％甲酸水溶液，流动相B为80％乙腈和0.1％甲酸水溶液；设置梯度为0-5min，3％ B，5-140min，3％-90％ B，140-150min，90％-3％ B；
23.本实例使用Proteome Discoverer软件对数据进行抽提，固定化修饰为半胱氨酸的烷基化修饰，可变修饰为赖氨酸的泛素化修饰，导出peptide定性定量数据表，快速从
表中提取得到两组肽段在2个样本中丰度如下表：
表1.3个肽段标品的定量信息
表2.样品1、2中抽提部分样品肽段定量信息
通过表1的肽段定量数据，发现样品1中赖氨酸的泛素化肽段定量回收率偏小；且通过表2，对比样品1与样品2中相同肽段定量值可知，样品1中的泛素化肽段回收比例仅为样品2的85％左右，说明在使用抗体珠进行泛素化肽段富集流程中，使用不同酸浓度溶液洗脱抗体珠上结合的泛素化肽段对泛素化肽段的洗脱效果有影响，需要降低洗脱液pH以增加富集效果。
Claims (10)
1.一种用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)设置至少两组外源肽段参考品，每组外源肽段参考品至少包含一条有泛素化修饰位点的肽段，并且对于每一组中每种肽段，在其他各组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应肽段；
2)在样品处理过程中，在不同的时间点加入上述不同的外源肽段参考品，且任意两组外源肽段参考品加入的时间点之间，均包括泛素化肽段富集的步骤；
3)进样检测，提取处理数据，定量外源肽段参考品，将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同泛素化修饰肽段的得率比值，以此评价两个外源肽段参考品加入时间点之间的泛素化富集过程是否合格。
2.根据权利要求1所述的用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤1)中，所述泛素化修饰位点选自分布在赖氨酸残基上的泛素化修饰位点；每组中有泛素化修饰位点的肽段，与其他组中有泛素化修饰位点的肽段相比，序列一致的，泛素化修饰位点也相同。
3.根据权利要求1所述的用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤1)中，所述每组外源肽段参考品至少包含一条有泛素化修饰位点的肽段，其中每组中的肽段数量大于等于2条时，各肽段序列相同或者不同。
4.根据权利要求1所述的用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤1)中，所述同位素标记不同包括：一组中肽段没有同位素标记，其他各组中肽段有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同；或者各组中肽段都有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同。
5.根据权利要求1所述的用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤1)中，所述同位素标记中的同位素包括：12C、13C、14C、14N、15N、16O、18O、1H、2H。
6.根据权利要求1所述的用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤2)中，所述样品选自细胞、组织、血浆、血清、全血、尿液、脑脊液、唾液、淋巴液、胸腔积水、乳汁、组织液、微生物或植物。
7.根据权利要求1所述的用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤2)中，所述外源肽段参考品加入前进行准确定量，优选加入量一致，或者按比例进行加入；所述泛素化肽段富集的步骤，包括泛素化肽段富集的所有步骤或者部分步骤。
8.根据权利要求1所述的用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤3)中，所述检测的方法为质谱检测。
9.根据权利要求1所述的用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤3)中，若在前加入的外源肽段参考品是在泛素化肽段富集前或者富集开始时加入，在后加入的外源肽段参考品是在泛素化肽段富集完成时或者富集完成后加入，则将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同泛素化修饰肽段的得率比值，以此评价整个泛素化肽段富集过程是否合格。
10.根据权利要求1所述的用于监测泛素化蛋白质组学中泛素化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤3)中，所述在前加入的外源肽段参考品和在后加入的外源肽段参考品，若两者加入时间点之间仅包括泛素化肽段富集过程的部分步骤，则将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同泛素化修饰肽段的得率比值，以此评价上述泛素化肽段富集过程的部分步骤是否合格。
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