CN113429474B - 一种基于特征性肽段标签鉴别植物蛋白肉样品掺假情况的方法 - Google Patents

一种基于特征性肽段标签鉴别植物蛋白肉样品掺假情况的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于特征性肽段标签鉴别植物蛋白肉样品掺假情况的方法。所述特征性肽段标签包括植物蛋白肉的特征性肽段和动物源性标准肉样的特征性肽段；所述植物蛋白肉的特征性肽段包括SEQ ID NO.1和/或SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。所述方法采用两步酶解法，结合高效液相色谱‑串联质谱方法和特征性肽段标签，能够定性和定量地检测出植物蛋白肉制品中其他动物肉类的掺杂情况，同时，所述方法的样品需求量小，检测过程试剂耗材等耗损较少，适合用于大样本量的检测工作，因此本发明提供的方法为植物蛋白肉制品这一新型食品的质量安全监管提供了检测技术支持。

Description

一种基于特征性肽段标签鉴别植物蛋白肉样品掺假情况的 方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种基于特征性肽段标签鉴别植物蛋白肉样品掺假情况的定量检测方法，尤其涉及一种基于高效液相色谱质谱联用的测定植物蛋白肉样品中不同物种来源及含量的方法。
背景技术
近年来全球肉类产能大幅度减少，传统畜牧业将无法满足产能需求，由大豆分离蛋白作为主要原料加入其它植物性成分制作而成的新型食品——植物蛋白肉恰好为此提供了一个绿色环保的解决办法，形成了一股新的饮食变革热潮。但随着对这一新型食品关注度不断提高，其中是否有动物肉掺假的情况已成为素食主义者最关心的安全性问题之一。
当下，对于动物源成分检测方法的研究热点集中在对于肉类基质中掺入其他肉类进行仪器快速识别种类和简单定量，鲜有对于植物基产品中肉类掺入检测方法建立的描述，更未有针对植物蛋白肉这类产品进行动物肉掺假方面的研究报道。现有报道中针对传统素食中动物源成分检测的主要方法为检测DNA的PCR法和检测蛋白质的ELISA法，但是二者的实施效果均存在不足。
对于PCR法来说，模板的质量与引物的特异性很大程度决定了实验的准确度。不论植物蛋白肉产品还是传统的素食产品都经过一系列食品加工过程，在此期间DNA结构遭到较大的破坏，这无疑会影响后续提取DNA模板的质量，甚至造成结果呈现假阴性。同时，引物的设计选择也很重要，对于掺假定量的可靠性很难控制。
对于ELISA法来说，抗体的特异性及食品基质中其他蛋白的干扰作用也可能会较大程度的影响定量效果，造成结果的偏差。
随着检测技术的不断发展进步，液相色谱-质谱法逐渐成为物种鉴定的新方式，可通过特异性的肽段识别，进行重现度好、灵敏度高的定量检测，尤其是对于食品深加工产品也可以表现出良好的检测效果，展现了PCR法和ELISA法所不具备的优势。虽然已有报道利用液相色谱串联质谱法进行肉类产品掺假检测，但由于植物基食物与动物基食物自身蛋白性质的结构差异和豆科食品中对于胰蛋白酶的抑制因子，使常规检测流程并不适用于植物基食品中产品掺假检测。
因此，提供一种结果准确、可靠性高的检测植物蛋白肉制品是否掺假的方法对于本领域而言具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于特征性肽段标签鉴别植物蛋白肉样品掺假情况的方法。该方法结合液相色谱-串联质谱方法和特征性肽段标签，适用于植物蛋白肉原料、半成品、成品和熟制品中动物肉掺假的定性和定量检测，为该类植物蛋白肉产品的质量保证提供分析技术手段。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测植物蛋白肉样品的特征性肽段标签，所述特征性肽段标签包括植物蛋白肉的特征性肽段和动物源性标准肉样的特征性肽段；
所述植物蛋白肉的特征性肽段包括SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明中，分别将标准肉样(如鸡肉、牛肉、猪肉等)和植物蛋白肉样品所得肽段进行同类中的并集分析，再从同类动物肉标准样品共有的肽段中找到区别于植物蛋白肉样品的肽段和其他种类动物样品肽段，最终分别得到植物蛋白肉独有肽段5条，鸡肉独有肽段5条，猪肉独有肽段107条，牛肉独有肽段122条。
随后，利用Blast比对根据肽段定位种属的特异性及所定位的蛋白，筛选得到了植物蛋白肉特征性肽段标签2条(即SEQ ID NO.1和2所示的肽段)，鸡肉特征性肽段标签2条，牛肉特征性肽段标签3条，猪肉特征性肽段标签4条。
利用植物蛋白肉特征性肽段标签，能够鉴定所述样品是否包含植物蛋白肉。若同时能够检测出含有其他动物源特征性肽段，则表示检测的样品为掺杂了其他肉类的植物蛋白肉产品。
作为本发明优选的技术方案，所述动物源性标准肉样的来源包括鸡、牛或猪中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述动物源性标准肉样的特征性肽段包括SEQ ID NO.3～11中任意一项或至少两项所示的氨基酸序列。
表1
Figure BDA0003151468150000031
Figure BDA0003151468150000041
第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的特征性肽段标签鉴别植物蛋白肉样品掺假情况的方法，包括：
前处理：使用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解所述植物蛋白肉样品，而后，去除所述酶解后产物中的大于10kDa的大分子物质，除盐；
上机检测：采用高效液相色谱-质谱联用方法对所述前处理后得到的样品进行检测，对检测结果进行注释，再将所得多肽的序列信息与第一方面所述的特征性肽段标签进行比对，得到所述植物蛋白肉样品的掺假情况。
本发明提供常见食用肉种类和植物蛋白肉多肽生物标记物(即各标准肉样和植物蛋白肉产品特征性多肽)，结合高效液相色谱串联质谱技术，定量测定植物蛋白肉中掺入动物肉的手段，包括样品前处理，各种标准肉样和植物蛋白肉特征多肽的筛选，以及高效液相色谱串联质谱检测植物蛋白肉中的特征多肽等步骤。
作为本发明优选的技术方案，所述前处理的具体步骤包括：
将所述植物蛋白肉样品与第一溶液混合、匀浆，使样品均匀分散在溶液中，而后离心取上清，加入胃蛋白酶，调节pH后，进行第一次酶解；
所述第一次酶解结束后，所得第一次酶解产物与第二溶液混合、匀浆，再与胰蛋白酶混合，调节pH后，进行第二次酶解。
优选地，所述胃蛋白酶的工作浓度为1500～3000U/mL，例如可以是1500U/mL、1600U/mL、1800U/mL、2000U/mL、2200U/mL、2400U/mL、2500U/mL、2800U/mL或3000U/mL等。
优选地，所述胰蛋白酶的工作浓度为0.5～0.8mg/mL，例如可以是0.5mg/mL、0.55mg/mL、0.6mg/mL、0.65mg/mL、0.7mg/mL、0.75mg/mL或0.8mg/mL等。
优选地，所述前处理的步骤中还包括使用BCA试剂盒测定胃蛋白酶或胰蛋白酶消化后蛋白浓度的操作。
作为本发明优选的技术方案，所述第一溶液包括：5～8mM KCl、0.8～1.0mMKH2PO4、20～30mM NaHCO3、40～50mM NaCl、0.05～0.1mM MgCl2·6H2O和0.5～1mM(NH4)2CO3。
本发明中，所述第一溶液中KCl的摩尔浓度为5～8mM，例如可以是5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM或8mM等；KH2PO4的摩尔浓度为0.8～1.0mM，例如可以是0.8mM、0.82mM、0.85mM、0.9mM、0.95mM、0.98mM或1mM等；NaHCO3的摩尔浓度为20～30mM，例如可以是20mM、22mM、24mM、25mM、26mM、28mM或30mM等；NaCl的摩尔浓度为40～50mM，例如可以是40mM、42mM、44mM、45mM、46mM、48mM或50mM等；MgCl2·6H2O的摩尔浓度为0.05～0.1mM，例如可以是0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM或0.1mM等；(NH4)2CO3的摩尔浓度为0.5～1mM，例如可以是0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或1mM等。
优选地，所述第二溶液包括5～8mM KCl、0.8～1.0mM KH2PO4、70～100mM NaHCO3、30～50mM NaCl和0.2～0.4mM MgCl2·6H2O。
本发明中，所述第二溶液中KCl的摩尔浓度为5～8mM，例如可以是5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM或8mM等；KH2PO4的摩尔浓度为0.8～1.0mM，例如可以是0.8mM、0.82mM、0.85mM、0.9mM、0.95mM、0.98mM或1mM等；NaHCO3的摩尔浓度为70～100mM，例如可以是70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM等；NaCl的摩尔浓度为30～50mM，例如可以是30mM、32mM、34mM、35mM、36mM、40mM、42mM、44mM、45mM、46mM、48mM或50mM等；MgCl2·6H2O的摩尔浓度为0.2～0.4mM，例如可以是0.2mM、0.22mM、0.25mM、0.28mM、0.3mM、0.32mM、0.35mM、0.38mM或0.4mM等。
优选地，所述上清与胃蛋白酶混合后，将pH调节至2.0～3.5，例如可以是2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2或3.5等。
优选地，所述第一次酶解产物与胰蛋白酶混合后，将pH调节至6.5～7.5，例如可以是6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5等。
作为本发明优选的技术方案，所述大分子物质的去除方法包括采用超滤管进行超滤。
优选地，所述除盐的方法包括将去除大分子物质后所得溶液加入除盐柱中，再加入洗脱液进行洗脱。
优选地，所述洗脱液包括质量分数为0.1～0.5％(例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％等)的TFA(三氟乙酸)和质量分数为70～85％(例如可以是70％、72％、74％、75％、76％、78％、80％、82％或85％等)的乙腈。
作为本发明优选的技术方案，所述上机检测的步骤中高效液相色谱使用的色谱柱为C18色谱柱。
优选地，所述高效液相色谱中使用的A液为质量分数为0.05～0.1％的甲酸水溶液，即所述A液中甲酸的质量分数可以是0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％。
优选地，所述高效液相色谱中使用的B液为质量分数为0.05～0.1％的甲酸-乙腈溶液，即所述B液中甲酸的质量分数可以是0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％。
优选地，所述质谱采用数据依赖模式在MS和MS/MS间切换采集。
优选地，所述质谱的一级扫描范围为m/z 350～1600。
优选地，所述质谱过程中母离子质荷比最低扫描范围固定为m/z 110，最高扫描范围固定为m/z 2000。
优选地，所述MS/MS的最低离子强度值设定为50000，离子最大引入时间为100ms，自动增益控制设定为1.0×105，母离子选择窗口设定为1.8道尔顿。
作为本发明优选的技术方案，所述注释的方法包括：将所述质谱后得到的原始文件用MaxQuant进行数据库检索，与Uniprot数据库中进行对比注释。
优选地，所述注释过程完成后，将所得样品的多肽信息与SEQ ID NO.1～11所示的特征性肽段标签进行比对，定性判断所述植物蛋白肉样品的掺假情况。
作为本发明优选的技术方案，所述方法还包括对植物蛋白肉样品中动物源肉的含量进行定量的步骤：
检测含有已知量动物源肉的植物蛋白肉样品，绘制标准曲线；
根据待测植物蛋白肉样品中特征性肽段标签色谱峰的响应情况，结合所述标准曲线换算出动物源肉的百分含量。
本发明中，所述检测方法的前处理步骤可以采用如下方式进行：
(1)胃蛋白酶酶解
称取样品，溶于第一溶液中，高速匀浆后，4℃离心，取出少量上清液采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，并进行蛋白电泳；
所述第一溶液成分如表2所示：
表2
组分 摩尔浓度
KCL 5～8mM
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.8～1.0mM
NaHCO<sub>3</sub> 20～30mM
NaCl 40～50mM
MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 0.05～0.1mM
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 0.5～1mM
其余上清液，加胃蛋白酶溶液和0.3M CaCl2，用第一溶液补至一定体积后，用1MHCL调节pH至3.0，随后37℃摇床酶解1～2h，随后用1M NaOH将调节至pH7.0，置于冰上停止反应；
再取出少量上清液采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，并进行蛋白电泳。
通过酶解前和酶解后的蛋白电泳图和蛋白浓度测定情况判定胃蛋白酶酶解效果。
(2)胰蛋白酶酶解
取上一步骤中终止消化后的胃蛋白酶酶解产物，加入第二溶液、0.3M CaCl2和胰蛋白酶溶液，再使用1M NaOH将调节至pH 7.0，在37℃摇床中酶解1～2h，随后90℃加热5min终止反应，取出少量上清液采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，并进行蛋白电泳；
其中，所述第二溶液成分如表3所示：
表3
Figure BDA0003151468150000081
Figure BDA0003151468150000091
剩余产物加入无水乙醇，产物与无水乙醇的体积比为4:3，于4℃下醇沉12h，10000rpm，4℃离心20min后，上清液用于后续上机前处理和蛋白电泳。
通过蛋白电泳和蛋白浓度测定情况判定是否酶解完全。
(3)除去大分子
将样品进一步4℃，1000g离心30min，取上清后冷冻干燥去除其中的乙醇有机成分；样品干粉使用1mL 0.1％TFA水溶液重溶，4℃，10000g离心10min，取上清；
吸取400μL上清溶液使用10kDa超滤管在10,000g下超滤至20μL；重复吸取400μL样品溶液，继续超滤至20μL；
收集滤过液体，舍弃超滤管中分子量大于10kDa的蛋白等大分子物质。
(4)除盐
使用活化溶液(质量分数为80％的乙腈溶液，包含质量分数为0.1％的TFA)活化除盐柱；再使用平衡液(质量分数为0.1％的乙腈溶液，包含质量分数为0.1％的TFA)平衡除盐柱；
超滤收集的滤过液体加入除盐柱内，使样品缓慢流过除盐柱，多肽被除盐柱捕集，盐等其它非疏水性小分子流出；
再添加清洗液(质量分数为0.5％的乙腈溶液，包含质量分数为0.1％的TFA)清洗除盐柱，洗去残留盐类；
添加洗脱液(质量分数为80％的乙腈溶液，包含质量分数为0.1％的TFA)，使液体缓慢流过除盐柱，将多肽洗脱下来，收集洗脱溶液，洗脱液冷冻干燥。
本发明中，所述检测方法的上机检测步骤可以采用如下方式进行：
(1)高效液相色谱分离
采用超高压纳升级液相色谱系统进行分离，分析色谱柱为C18，规格75μm×250mm，液相A液为0.1％甲酸-水溶液(即其中甲酸的质量分数为0.1％)，B液为0.1％甲酸-乙腈溶液(即其中甲酸的质量分数为0.1％)；
样品以10μL A相溶解，由自动进样器吸取2μL样品后，以500nL/min流速上样到分析柱上；
样品在分析柱上进行色谱分离，流速为300nL/min。
相关液相梯度如下：0min-45min，B液线性梯度从5％到30％；45min-52min，B液线性梯度从30％到90％；52min-53min，B液维持在90％；53min-55min，B液线性梯度从90％到5％；B液保持5％，5min。
(2)串联质谱测定
离子源喷雾电压为2.2kV，质谱仪加热毛细管设定为320℃，采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集；
全扫描MS使用Orbitrap进行一级扫描，扫描范围为m/z 350-1600，分辨率设定为60,000(m/z 200处)；离子最大引入时间为50ms，自动增益控制设定为1×106，随后使用高能碰撞解离对符合串级碎裂条件的、强度排名前十的母离子进行碎裂并用Orbitrap进行扫描，扫描分辨率设定为15000。
母离子质荷比最低扫描范围固定为m/z＝110处，最高到2000。
进行MS/MS的最低离子强度值设定为50000，MS/MS时离子最大引入时间为100ms，自动增益控制设定为1.0×105，母离子选择窗口设定为1.8道尔顿。
(3)定性及定量分析
质谱原始文件用MaxQuant进行数据库检索，与Uniprot数据库中进行对比注释；
再将待测样品中的多肽信息与SEQ ID NO.1～11所示特征性肽段标签进行逐一比对，从而定性判定植物蛋白肉样品中是否含有其他动物肉成分和含有动物肉种类；
对植物蛋白肉中混有不同百分含量的相应种类标准肉样按照上述特征性多肽的检测方法进行标准曲线的绘制，根据待测样品中特征性肽段标签色谱峰的响应情况，结合标准曲线即可换算出动物肉成分掺假百分含量。
第三方面，本发明还提供一种如第一方面所述的特征性肽段标签或如第二方面所述的方法在定性和/或定量植物蛋白肉样品掺假情况中的应用。
优选地，所述植物蛋白肉样品包括植物蛋白肉原料、植物蛋白肉半成品、植物蛋白肉成品或植物蛋白肉熟制品中的任意一种。
本发明中，所述方法检测的对象可以是植物蛋白肉原料、植物蛋白肉半成品、植物蛋白肉成品或植物蛋白肉熟制品；同时，所述方法检测的对象包括未掺假的植物蛋白肉，也可以是掺杂鸡肉、猪肉或牛肉中的任意一种或至少两种的植物蛋白肉，其中，掺杂的肉可以是原料、半成品、成品或熟制品。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一套特征性肽段标签，如SEQ ID NO.1～11所示，其中EQ IDNO.1和SEQ ID NO.2用于鉴定所述样品是否为植物蛋白肉，SEQ ID NO.3～11用于鉴定所述样品是否掺杂动物肉并且判断动物种类；所述特征性肽段标签用于植物蛋白肉中动物肉成分掺假的判定，为该类新型食品的质量安全监管提供了检测技术支持；
(2)本发明提供的检测方法在样品前处理过程中采取两步酶解法，即先使用胃蛋白酶酶解、再使用胰蛋白酶酶解，使样品酶解更完全，有助于特征性肽段标签的筛选鉴定；同时，所述检测方法的样品需求量小，检测过程试剂耗材等耗损较少，适合用于大样本量的检测工作；
(3)本发明提供的检测方法通过选择合适的LC-MS/MS检测条件，具有较低的检测限，检测结果准确，对于样品中低含量的混合样本也能够较好的检出；因此，本发明提供的检测方法具有较好的应用前景，为今后的质量部门监管提供了方法参考。
附图说明
图1为实施例1中植物蛋白肉样品酶解后进行LC-MS/MS检测后获得的总离子流图。
图2为实施例2中鸡肉标准样品酶解后进行LC-MS/MS检测后获得的总离子流图。
图3为实施例2中牛肉标准样品酶解后进行LC-MS/MS检测后获得的总离子流图。
图4为实施例2中猪肉标准样品酶解后进行LC-MS/MS检测后获得的总离子流图。
图5为植物蛋白肉中人工添加鸡肉混合样品标准曲线；其中，横坐标按照数字1-5分别对应鸡肉:植物蛋白肉的混合比例为0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、100:0，纵坐标为响应值。
图6为植物蛋白肉中人工添加牛肉混合样品标准曲线；其中，横坐标按照数字1-5分别对应牛肉:植物蛋白肉的混合比例为0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、100:0，纵坐标为响应值。
图7为植物蛋白肉中人工添加猪肉混合样品标准曲线；其中，横坐标按照数字1-5分别对应猪肉:植物蛋白肉的混合比例为0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、100:0，纵坐标为响应值。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1 市售植物蛋白肉实际样检测
(1)样品采集
购买市售植物蛋白肉馅作为待测样品，-20℃冷冻保存。
(2)样品前处理
a、胃蛋白酶酶解：
称取3g样品，溶于15mL第一溶液中，高速匀浆3s，重复3次，4℃离心3000rpm，10min，取出1mL上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，并进行蛋白电泳；
其中，所述第一溶液的成分为：6.9mM KCL(6.9mL)、0.9mM KH2PO4(0.9mL)、25mMNaHCO3(12.5mL)、47.2mM NaCl(11.8mL)、0.1mM MgCl2·6H2O(1/3mL)和0.5mM(NH4)2CO3(0.5mL)；
另取9mL上清液，加1.5mL胃蛋白酶溶液(25000U/mL)和4.7μL 0.3MCaCl2，用第一溶液补齐至18mL；
用1M HCL调节pH至3.0，随后37℃摇床酶解2h；
用1M NaOH将调节至pH7.0，置于冰上停止反应，取出1mL上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，并进行蛋白电泳；
b、胰蛋白酶酶解
取10mL终止消化后的胃蛋白酶酶解产物，加入3.184mL第二溶液、20μL0.3M CaCl2和2mL胰蛋白酶溶液(5mg/mL)；
其中，所述第二溶液成分为：6.8mM KCL(6.8mL)、0.8mM KH2PO4(0.8mL)、85mMNaHCO3(42.5mL)、39.4mM NaCl(9.6mL)和0.33mM MgCl2·6H2O(1.1mL)。
采用1M NaOH将调节至pH 7.0，在37℃摇床中酶解2h；
随后90℃加热5min终止反应，取出1mL上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。
其余产物按照4:3体积比，加入无水乙醇于4℃，醇沉12h，10000rpm，4℃离心20min后，上清液用于后续上机前处理和蛋白电泳。
通过蛋白电泳和蛋白浓度测定情况判定是否酶解完全。
(3)去除大分子物质和除盐
将上清液进一步4℃，1000g离心30min，取上清后冷冻干燥去除其中的乙醇有机成分，样品干粉使用1mL质量分数为0.1％TFA水溶液重溶，4℃，10000g离心10min，取上清；
吸取400μL上一步骤的上清溶液使用10kDa超滤管10,000g下超滤至20μL，舍弃超滤管中分子量大于10kDa的蛋白等大分子；
使用200μL活化溶液(质量分数为80％的乙腈溶液，包含质量分数为0.1％的TFA)活化除盐柱；
使用600μL平衡液(质量分数为0.1％的乙腈溶液，包含质量分数为0.1％的TFA)平衡除盐柱；超滤收集的滤过液体加入除盐柱内，使样品缓慢流过除盐柱，多肽被除盐柱捕集，盐等其它非疏水性小分子流出；
再添加200μL清洗液(质量分数为0.5％的乙腈溶液，包含质量分数为0.1％的TFA)清洗除盐柱，洗去残留盐类；
添加300μL洗脱液(质量分数为80％的乙腈溶液，包含质量分数为0.1％的TFA)，使液体缓慢流过除盐柱，将多肽洗脱下来，洗脱液冷冻干燥。
(4)待测样品上机测试
采用EASY-nLC 1000超高压纳升级液相色谱系统进行分离，分析色谱柱为C18，规格75μm×250mm；液相A液为0.1％甲酸-水溶液(即其中甲酸的质量分数为0.1％)，B液为0.1％甲酸-乙腈溶液(即其中甲酸的质量分数为0.1％)；
样品以10μL A相溶解，由自动进样器吸取2μL样品后，以500nL/min流速上样到分析柱上；
样品在分析柱上进行色谱分离，流速为300nL/min；
相关液相梯度如下：0min-45min，B液线性梯度从5％到30％；45min-52min，B液线性梯度从30％到90％；52min-53min，B液维持在90％；53min-55min，B液线性梯度从90％到5％；B液保持5％，5min。
离子源喷雾电压为2.2kV，质谱仪加热毛细管设定为320℃，采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集；
全扫描MS使用Orbitrap进行一级扫描，扫描范围为m/z 350-1600，分辨率设定为60,000(m/z 200处)；离子最大引入时间为50ms，自动增益控制设定为1×106，随后使用高能碰撞解离对符合串级碎裂条件的、强度排名前十的母离子进行碎裂并用Orbitrap进行扫描，扫描分辨率设定为15000。
母离子质荷比最低扫描范围固定为m/z＝110处，最高到2000；进行MS/MS的最低离子强度值设定为50000，MS/MS时离子最大引入时间为100ms，自动增益控制设定为1.0×105，母离子选择窗口设定为1.8道尔顿。
对于2、3、4、5电荷数的离子进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子在10秒内进行1次MS/MS，之后排除21秒，30％的碰撞能量。
本实施例中样品检测所得的LC-MS/MS总离子流图如图1所示；
(5)特征性肽段标签筛选识别
质谱原始文件用MaxQuant进行数据库检索，与Uniprot数据库中进行对比注释。
将测得的多肽序列集合与SEQ ID NO.1～11所示特征性肽段标签，进行逐一比对；
实验结果发现，本实施例中检测的样品仅存在植物蛋白肉特征性肽段标签SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11。
因此，判定该待测样品中不含动物肉掺假成分。
实施例2 植物蛋白肉人工添加单一品种标准肉样检测
(1)样品采集制备
购置鸡肉、猪肉、牛肉标准肉样，配制一系列植物蛋白肉与真肉混合标准样；其中，真肉与植物蛋白肉的质量比分别为：0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、100:0。
(2)样品前处理与测定
样品前处理流程与上机测定过程，与实施例1保持一致；
同时，本实施例中使用相同的方法检测了鸡肉、猪肉、牛肉标准肉样，所得LC-MS/MS总离子流图如图2、图3和图4所示。
(3)特征性肽段标签筛选识别
质谱原始文件用MaxQuant进行数据库检索，与Uniprot数据库中进行对比注释。
将测得的多肽序列集合与SEQ ID NO.1～11所示特征性肽段标签，进行逐一比对，所有样品均发现存在植物蛋白肉特征性肽段标签SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
对于混合有鸡肉的植物蛋白肉鸡块样品中识别出鸡肉特征性肽段标签SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4，可以判定含有鸡肉成分。
对于混合有牛肉的植物蛋白肉牛肉饼样品中识别出牛肉特征性肽段标签SEQ IDNO.5～7，可以判定含有牛肉成分。
对于混合有猪肉的植物蛋白肉肉馅样品中识别出猪肉特征性肽段标签SEQ IDNO.9～11，可以判定含有猪肉成分。
(4)标准曲线绘制
通过一系列添加比例不同肉样人工模拟掺假样品中特征性肽段标签的响应值，绘制三种不同类型人工模拟混入动物肉成分的植物蛋白肉样品的标准曲线，如图5、图6和图7所示；
其中，标准曲线(植物蛋白肉中人工添加鸡肉混合样品)为y＝14.31x-1.208，R2＝0.997，标准曲线(植物蛋白肉中人工添加牛肉混合样品)为y＝13.35x-0.060，R2＝0.998，标准曲线(植物蛋白肉中人工添加猪肉混合样品)为y＝10.91x+0.714，R2＝0.997；
三种混合模型线性良好，R2值在0.997～0.998之间，可用于定量检测。
实施例3 植物蛋白肉人工添加0.01～5％标准肉样检测
本实施例中，为了判断该方法的检出限，采用植物蛋白肉人工添加质量百分比为0.1～10％标准肉样进行测试。
(1)样品采集制备
购买市售植物蛋白肉肉馅作为待测样品，-20℃冷冻保存。购置猪肉标准肉样，按照质量百分比为0.1～10％添加量，包括0.1％、0.5％、1％、2％、5％、8％、10％，与植物蛋白肉混合制成待测样品。
(2)样品前处理与测定
样品前处理流程与上机测定过程，与实施例1保持一致。
(3)特征性肽段标签筛选识别
质谱原始文件用MaxQuant进行数据库检索，与Uniprot数据库中进行对比注释。
将测得的多肽序列集合与SEQ ID NO.1～11所示特征性肽段标签，进行逐一比对，结果发现，本发明提供的检测方法能够检测出植物蛋白肉中存在植物蛋白肉特征性肽段标签SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；同时，所述方法在添加量为1～10％时，均识别出猪肉特征性肽段标签SEQ ID NO.6～9，可以判定该样品中含有猪肉成分，因此，该方法检出限可达1％。
实施例4 植物蛋白肉人工添加多品种标准肉样检测
为了判断该方法是否能够区别多种动物肉添加，采用植物蛋白肉人工添加质量百分比为1％鸡肉和质量百分比为1％猪肉样进行测试。
(1)样品采集制备
购买市售猪肉标准肉样、鸡肉标准肉样和植物蛋白肉肉馅作为待测样品，-20℃冷冻保存；
按照质量分数1％的猪肉和质量分数1％的鸡肉添加量与植物蛋白肉混合制成待测样品(即待测样品中包含植物蛋白肉:猪肉:鸡肉＝98:1:1)。
(2)样品前处理与测定
样品前处理流程与上机测定过程，与实施例1保持一致。
(3)特征性肽段标签筛选识别
质谱原始文件用MaxQuant进行数据库检索，与Uniprot数据库中进行对比注释；
将测得的多肽序列集合与SEQ ID NO.1～11所示特征性肽段标签，进行逐一比对；
结果发现，本发明提供的检测方法能够检测出样品中存在植物蛋白肉特征性肽段标签SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，并识别出鸡肉特征性肽段标签SEQ ID NO.3～4和猪肉特征性肽段标签SEQ ID NO.8～11，可以判定该样品中既含有猪肉成分又含有鸡肉成分。
综上所述，本发明提供的检测方法能够用于植物蛋白肉中动物肉成分掺假的判定，且样品需求量小，检测过程试剂耗材等耗损较少，适合用于大样本量的检测工作，检测限可低至1％，对于混合样本也能够有效鉴定。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津中医药大学
<120> 一种基于特征性肽段标签鉴别植物蛋白肉样品掺假情况的方法
<130> 20210702
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Ile Pro Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Lys Thr Asn Asp Arg Pro Ser Ile Gly Asn
1 5 10
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Glu Leu Ile Asn Ser Trp Val Glu Ser Gln Thr Asn Gly Ile Ile Arg
1 5 10 15
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Asp Ile Leu Asn Gln Ile Thr Lys Pro Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Val Asp Ile Glu Ala Pro Asp Val Ser Leu Glu Gly Pro Glu Gly Lys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Arg Pro Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ser Gln Asp Gly Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ala Val Leu Asp Lys Leu His Asn Leu Asn Thr Asn Trp Phe Pro Ala
1 5 10 15
Gly Ser Arg Pro
20
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ser Met Ile Ala Asp Tyr Leu Asn Lys Leu
1 5 10
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Ser Met Ile Ala Asp Tyr Leu Asn Lys Leu Ile Asp Ile Gly Val Ala
1 5 10 15
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Ser Met Ile Ala Asp Tyr Leu Asn Lys Leu Ile
1 5 10

Claims (11)

1.用于检测植物蛋白肉样品的特征性肽段标签，其特征在于，所述特征性肽段标签包括植物蛋白肉的特征性肽段和动物源性标准肉样的特征性肽段；
所述植物蛋白肉的特征性肽段为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的肽。
2.根据权利要求1所述的特征性肽段标签，其特征在于，所述动物源性标准肉样的来源包括鸡、牛或猪中的任意一种或至少两种的组合；
所述动物源性标准肉样的特征性肽段为SEQ ID NO.3~11中任意一项或至少两项所示的肽。
3.一种利用如权利要求1或2所述的特征性肽段标签鉴别植物蛋白肉样品掺假情况的方法，其特征在于，所述方法包括：
前处理：使用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解所述植物蛋白肉样品，而后，去除所述酶解后产物中的大于10 kDa的大分子物质，除盐；
上机检测：采用高效液相色谱-质谱联用方法对所述前处理后得到的样品进行检测，对检测结果进行注释，再将所得多肽的序列信息与权利要求1或2所述的特征性肽段标签进行比对，得到所述植物蛋白肉样品的掺假情况。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述前处理的具体步骤包括：
将所述植物蛋白肉样品与第一溶液混合，而后离心取上清，再将所述上清与胃蛋白酶混合，调节pH后，进行第一次酶解；
所述第一次酶解结束后，所得第一次酶解产物与第二溶液以及胰蛋白酶混合，调节pH后，进行第二次酶解，得到第二次酶解产物；
所述胃蛋白酶的工作浓度为1500~3000 U/mL；
所述胰蛋白酶的工作浓度为0.5~0.8 mg/mL；
所述前处理的步骤中还包括使用BCA试剂盒测定胃蛋白酶或胰蛋白酶消化后蛋白浓度的操作。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一溶液包括：5~8 mM KCl、0.8~1.0mM KH2PO4、20~30 mM NaHCO3、40~50 mM NaCl、0.05~0.1 mM MgCl2·6H2O和0.5~1 mM(NH4)2CO3；
所述第二溶液包括5~8 mM KCl、0.8~1.0 mM KH2PO4、70~100 mM NaHCO3、30~50 mMNaCl和0.2~0.4 mM MgCl2·6H2O；
所述上清与胃蛋白酶混合后将混合溶液的pH调节至2.0~3.5；
所述第一次酶解产物与胰蛋白酶混合后将混合溶液的pH调节至6.5~7.5。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大分子物质的去除方法包括采用超滤管进行超滤；
所述除盐的方法包括将去除大分子物质后所得溶液加入除盐柱中，再加入洗脱液进行洗脱；
所述洗脱液包括质量分数为0.1~0.5%的TFA和质量分数为70~85%的乙腈。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述上机检测的步骤中高效液相色谱使用的色谱柱为C18色谱柱；
所述高效液相色谱中使用的A液为质量分数为0.05~0.1%的甲酸水溶液，B液为质量分数为0.05~0.1%的甲酸-乙腈溶液；
所述质谱采用数据依赖模式在MS和MS/MS间切换采集；
所述质谱的一级扫描范围为m/z 350~1600；
所述质谱过程中母离子质荷比最低扫描范围固定为m/z 110，最高扫描范围固定为m/z2000；
所述MS/MS的最低离子强度值设定为50000，离子最大引入时间为100 ms，自动增益控制设定为1.0×105，母离子选择窗口设定为1.8道尔顿。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述注释的方法包括：将所述质谱后得到的原始文件用MaxQuant进行数据库检索，与Uniprot数据库中进行对比注释；
所述注释过程完成后，将所得样品的多肽信息与SEQ ID NO.1~11所示的特征性肽段标签进行比对，定性判断所述植物蛋白肉样品的掺假情况。
9.根据权利要求3~8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对植物蛋白肉样品中动物源肉的含量进行定量的步骤：
检测含有已知量动物源肉的植物蛋白肉样品，绘制标准曲线；
根据待测植物蛋白肉样品中特征性肽段标签色谱峰的响应情况，结合所述标准曲线换算出动物源肉的百分含量。
10.如权利要求1或2所述的特征性肽段标签或如权利要求3~9任一项所述的方法在定性和/或定量植物蛋白肉样品掺假情况中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述植物蛋白肉样品包括植物蛋白肉原料、植物蛋白肉半成品或植物蛋白肉成品中的任意一种。
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