CN111855858A - 基于液质联用技术快速鉴定肉样的动物源性成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种基于液质联用技术快速鉴定肉样的动物源性成分的方法，包括以下步骤：S1、建立不同动物源性肉类中高丰度蛋白质的靶标特征多肽数据库；S2、对待测肉样进行前处理，得到待测肉样的多肽样品；S3、采用液相色谱串联质谱检测S2得到的待测肉样的多肽样品，并与S1所述数据库中的靶标特征多肽进行比较，从而鉴定所述待测肉样的动物源性成分。本发明解决了现有前处理中样品提取时间长、操作复杂等问题，在实现高效前处理同时，保证对复杂肉制品中动物源性成分的准确鉴别，为肉类市场中的掺假鉴定提供有效技术手段。

Description

基于液质联用技术快速鉴定肉样的动物源性成分的方法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种基于液质联用技术快速鉴定肉样的动物源性成分的方法。
背景技术
食品掺假是全球所关注的热点问题，肉类尤其价格较高，掺假获得利润空间很大，因此经常被作为掺假的对象。当前常见的肉与肉制品产品掺假鉴别主要有基于蛋白质组学的酶联免疫附吸(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)技术和质谱(MassSpectrometry，MS)技术，基于DNA的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)鉴别及光谱等无损检测技术。但ELISA技术不能同时检测多种成分且不能用于加工食品的掺假鉴别，易出现交叉反应，导致假阳性；PCR技术对样品DNA纯度要求高，各鉴别物种易相互干扰；光谱技术仍存在检测限高等问题。随着质谱技术的成熟和发展，以特异性肽生物标志物为基础的液相色谱串联质谱技术逐渐用于肉制品的真实性鉴定，该技术灵敏，准确度高，尤其对于复杂基质干扰和假阳性判别等问题具有显著优势。
但当前报道的基于液质联用判定动物源性的方法，参照了蛋白质组学全蛋白的提取过程，提取过程繁琐，酶解基本以过夜为主，导致整个前处理环节持续时间过长、操作复杂等问题，影响了该技术的广泛应用。
发明内容
液质联用判定动物源性的关键是找到各物种的特异性多肽，肉类食品蛋白含量丰富，因此不需要参照全蛋白提取进行处理，选择动物组织中丰度高的蛋白作为研究对象即可，基于此，本发明针对当前液质联用技术进行肉类产品掺假判别提取过程繁琐、批量实验效率低等问题，提供一种基于液质联用技术快速鉴定肉样的动物源性成分的方法，与已报道的方法比较，其采用特定的以动物组织中高丰度蛋白为研究对象的高效前处理方法，过程简单，不需要过夜酶解，整个前处理过程至少缩短了10倍的时间，2个小时左右即可完成全部的前处理过程，适合批量操作，为食品真实性技术鉴别应用提供技术参考。
具体来说，本发明提供了如下技术方案：
一种基于液质联用技术快速鉴定肉样的动物源性成分的方法，包括以下步骤：
S1、建立不同动物源性肉类中高丰度蛋白质的靶标特征多肽数据库；
S2、对待测肉样进行前处理，得到待测肉样的多肽样品；
S3、采用液相色谱串联质谱检测S2得到的待测肉样的多肽样品，并与S1所述数据库中的靶标特征多肽进行比较，从而鉴定所述待测肉样的动物源性成分；
其中，S2中，所述前处理包括以下步骤：
(1)提取样品高丰度蛋白：向待测肉样中加入提取液和磁珠，用均质仪以1000～2600rad/min的转速均质2～5min，然后离心取上清液；
(2)向步骤(1)取得的上清液中加入NH4HCO3和胰蛋白酶进行酶解，加入甲酸终止反应，摇匀过膜上机分析。
优选的，上述方法中，步骤(1)中，所述提取液为0.04～0.06mol/L Tris-HCl、5～6mol/L尿素、1～3mol/L硫脲。
优选的，上述方法中，以2g肉样计，所述提取液的添加量为15～25mL。
优选的，上述方法中，步骤(1)中，按照每个肉样4～6个磁珠的比例，加入适量的磁珠。
优选的，上述方法中，步骤(1)中，所述离心的转速为10000～14000r/min，离心时间为10～30min。
优选的，上述方法中，步骤(2)具体为：取20～100μL上清液，加入1～3mL质量分数为0.5～2％的NH4HCO3溶液，加入20～60μL质量浓度100μg/mL胰蛋白酶，30～45℃下酶解0.5～2h后，加入200μL质量分数为5～15％的甲酸溶液终止反应，静止10～30min摇匀过滤膜上机分析。
优选的，上述方法中，所述S1具体包括以下步骤：
1)对不同动物源性肉类的标准肉样分别进行前处理，以便得到不同动物源性肉类的多肽样品；
2)采用液相色谱串联高分辨质谱分别检测步骤1)得到的不同动物源性肉类的多肽样品，筛选出不同动物源性肉类中高丰度蛋白质的特征多肽数据库；
3)采用液相色谱串联普通质谱分别检测步骤1)得到的不同动物源性肉类的多肽样品，得到多肽样品中不同多肽的质谱响应值；
4)根据步骤3)得到的不同多肽的质谱响应值，从步骤2)的不同动物源性肉类中高丰度蛋白质的特征多肽数据库中筛选出普通质谱信噪比不低于1500的特征多肽，即为不同动物源性肉类中高丰度蛋白质的靶标特征多肽数据库。
优选的，上述方法中，步骤1)中，所述前处理包括以下步骤：
A1、提取样品高丰度蛋白：向标准肉样中加入提取液和磁珠，用均质仪以1000～2600rad/min的转速均质2～5min，然后离心取上清液；
A2、向步骤A2取得的上清液中加入NH4HCO3和胰蛋白酶进行酶解，加入甲酸终止反应，摇匀过膜上机分析；
进一步优选的，
步骤A1中，所述提取液为0.04～0.06mol/L Tris-HCl、5～6mol/L尿素、1～3mol/L硫脲；以2g肉样计，所述提取液的添加量为15～25mL；
和/或，步骤A1中，按照每个肉样4～6个磁珠的比例，加入适量的磁珠；
和/或，步骤A1中，所述离心的转速为10000～14000r/min，离心时间为10～30min；
和/或，步骤A2具体为：取20～100μL上清液，加入1～3mL质量分数为0.5～2％的NH4HCO3溶液，加入20～60μL质量浓度100μg/mL胰蛋白酶，30～45℃下酶解0.5～2h后，加入200μL质量分数为5～15％的甲酸溶液终止反应，静止10～30min，摇匀过滤膜上机分析。
优选的，上述方法中，步骤1)中，采用与所述S2中相同的方法进行前处理。
优选的，上述方法中，S1中，羊肉的靶标特征多肽数据库如下：
Figure BDA0002610500610000041
和/或，猪肉的靶标特征多肽数据库如下：
Figure BDA0002610500610000042
Figure BDA0002610500610000051
和/或，鸡肉的靶标特征多肽数据库如下：
Figure BDA0002610500610000052
和/或，火鸡肉的靶标特征多肽数据库如下：
Figure BDA0002610500610000053
Figure BDA0002610500610000061
和/或，牛肉的靶标特征多肽数据库如下：
Figure BDA0002610500610000062
本发明还提供了上述方法在识别肉类掺假中的应用。
本发明建立了一种肉蛋白特征性多肽的高效前处理方法，结合液相色谱质谱联用技术，从而实现对肉制品中多种动物源性成分的掺伪鉴别，优点在于：
(一)该方法前处理操作简单且分离效果好，检测时间短，结果准确可靠，方法可行性高，检出限可以到0.1％。
(二)建立了同时检测肉类食品中多种动物源性成分的特征多肽的鉴别方法。
(三)该方法对实际肉类样品进行了验证，证明可直接用于分析基质复杂的熟肉与肉制品中的其他动物源性肉类的准确鉴别。
附图说明
图1为本发明实施例1中羊肉的的靶标特征多肽sheep_1的提取离子流图。
图2为本发明实施例1中猪肉的靶标特征多肽pig_4的提取离子流图。
图3为本发明实施例1中鸡肉的靶标特征多肽chicken_1的提取离子流图。
图4为本发明实施例1中火鸡肉的靶标特征多肽turkey_3的提取离子流图。
图5为本发明实施例1中牛肉的靶标特征多肽bovine_1的提取离子流图。
图6为对比例1中猪肉的靶标特征多肽pig_3的提取离子流图。
图7为对比例1中猪肉的靶标特征多肽pig_2的提取离子流图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的实验原料和相关设备等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
实施例1提供了一种基于液质联用技术快速鉴定肉样的动物源性成分的方法，包括以下步骤：
S1、称取羊肉2g、猪肉2g、鸡肉2g、火鸡肉2g、牛肉2g作为标准肉样分别进行前处理，具体前处理过程如下：每个标准肉样中分别加入20mL提取液(0.05mol/L Tris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲)，放入5个磁珠，采用高速均质仪依次以1000rad/min的转速均质9s，1200rad/min的转速均质9s，2600rad/min的转速均质120s，并重复上述均质过程一次；然后12000r/min转速下离心20分钟；取100μL上清液，加入NH4HCO3(1％)2mL，加入50μL100μg/mL胰蛋白酶于37℃恒温箱反应1h，加入10％甲酸200μL，混匀过0.22μm滤膜，即得羊肉、猪肉、鸡肉、火鸡肉和牛肉各自的多肽样品，上机待用。
S2、采用液相色谱串联高分辨质谱Vanquish UPLC-Q Exactive HF-X液相色谱-高分辨质谱(美国Thermo Fisher公司)分别检测S1得到的羊肉、猪肉、鸡肉、火鸡肉、牛肉的多肽样品。
液相色谱条件：色谱柱C18(2.1mm×100mm,1.8μm)；流速0.25mL/min；柱温40℃，进样量5μL；流动相：A相0.1％FA/H2O，B相0.1％FA/ACN；采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，
在第0～0.5min，所述流动相A的体积由97％递减为90％，所述流动相B的体积由3％递增为10％；
在第0.5～14min，所述流动相A的体积由90％递减为60％，所述流动相B的体积由10％递增为40％；
在第14～15min，所述流动相A的体积由60％递减为20％，所述流动相B的体积由40％递增为80％；
在第15～17.5min，所述流动相A和B的体积保持不变；
在第17.5～18.6min，所述流动相A的体积由20％递增为97％，所述流动相B的体积由80％递减为3％；
在第18.6～22min，所述流动相A的体积为97％，所述流动相B的体积为3％。
高分辨质谱条件：喷雾电压3.5kV；毛细管温度320℃；离子源雾化温度350℃；鞘气40Arb；辅气15Arb；离子化模式：正模式；扫描模式：Full MS-dd-MS2；全扫描分辨率120000FWHM；扫描质量扫描范围为m/z 350～1 500；自动增益值为3×10e6，最大离子注入时间(IT)20ms，二级质谱扫描分辨率为15 000FWHM，topN为20(前20强)，自动增益值为1×10e5，最大离子注入时间IT时间为100ms，碰撞能量为30V。
高分辨质谱数据分析：用Proteome Discoverer(PD 2.8)软件分别对羊肉、猪肉、鸡肉、火鸡肉、牛肉的多肽样品高分辨数据进行分析，检索Uniprot中对应物种的数据库，其中processing流程采用precolator_FDR方法和Consensus流程采用compare_peptide方法，检索Uniprot中对应物种的数据库，其他参数为默认值，分析后生成样品的蛋白列表、多肽列表。对获得蛋白列表进行参数设置如下：Score Sequest HT降序排列，Coverage[％]不低于60，选择排名前35的蛋白作为高丰度目标蛋白，对其酶解多肽片段进行物种之间对比和筛选，获得各个物种高丰度蛋白的相对特异性多肽列表。将列表再次搜索Uniprot库，去掉和其他物种共有多肽，获得特征多肽列表。
S3、采用液相色谱串联普通质谱TSQ ultra EMR液相色谱-质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司)分别检测S1得到的羊肉、猪肉、鸡肉、火鸡肉、牛肉的多肽样品。
液相色谱条件：色谱柱C18(2.1mm×100mm,1.8μm)；流速0.25mL/min；柱温40℃，进样量5μL；流动相：A相0.1％FA/H2O，B相0.1％FA/ACN；采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，
在第0～0.5min，所述流动相A的体积由97％递减为90％，所述流动相B的体积由3％递增为10％；
在第0.5～14min，所述流动相A的体积由90％递减为60％，所述流动相B的体积由10％递增为40％；
在第14～15min，所述流动相A的体积由60％递减为20％，所述流动相B的体积由40％递增为80％；
在第15～17.5min，所述流动相A和B的体积保持不变；
在第17.5～18.6min，所述流动相A的体积由20％递增为97％，所述流动相B的体积由80％递减为3％；
在第18.6～22min，所述流动相A的体积为97％，所述流动相B的体积为3％；
质谱条件：喷雾电压3500V；鞘气35Arb；辅气15Arb；离子传输管温度275℃；离子源雾化温度380℃；碰撞气为1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均为0.7。
普通质谱数据分析：将S2获得的特征多肽列表输入到skyline软件，转化成各条多肽的子离子信息，导入到液相色谱串联普通质谱的检测结果中，去掉普通质谱响应值偏低的多肽(信噪比低于1500)，最终获得靶标特征多肽列表，见表1。
表1为筛选出的羊肉、猪肉、鸡肉、火鸡肉、牛肉的靶标特征多肽的离子对信息。图1为羊肉的靶标特征多肽sheep_1的提取离子流图，图2为猪肉的靶标特征多肽pig_4的提取离子流图，图3为鸡肉的靶标特征多肽chicken_1的提取离子流图，图4为火鸡肉的靶标特征多肽turkey_3的提取离子流图，图5为牛肉的靶标特征多肽bovine_1的提取离子流图。
表1不同动物源性肉类的靶标特征多肽的信息
Figure BDA0002610500610000101
Figure BDA0002610500610000111
Figure BDA0002610500610000121
S4、称取从FAPS购买的掺假用的质控样(鸡肉样本，混有猪肉、牛肉、火鸡肉)作为待测肉样，按照与S1相同的方法对其进行前处理，得到待测质控样的多肽样品溶液。
S5、采用液相色谱串联普通质谱检测S4得到的质控样的多肽样品溶液(液相色谱和质谱的检测条件同S3)，并将谱图与S3得到的不同动物源性肉类的靶标特征多肽列表的保留时间、离子丰度进行比较，结果见表2。
表2质控样品的检测结果
Figure BDA0002610500610000122
Figure BDA0002610500610000131
由表2的鉴定结果可知，采用本发明方法鉴定肉制品的动物源性成分结果准确可靠，准确率高，同时，本发明前处理操作高效快速，具有广阔的应用价值。
对比例1
与实施例1相比，区别在于：样品前处理中，称取2g样品，加10mL提取液(0.05mol/LTris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲)，放入3个磁珠，采用高速均质仪以1000rad/min的转速均质2min，然后在12000r/min转速下离心10分钟；取50μL上清液，加入NH4HCO3(1％)2mL，加入50μL100μg/mL胰蛋白酶于37℃恒温箱反应1h，加入10％甲酸200μL，混匀过0.22μm滤膜，即得羊肉、猪肉、鸡肉、火鸡肉和牛肉各自的多肽样品，上机待用；
为了提高检测方法的效率，对比例1对液质联用条件进行了优化，采集方法缩短为13分钟，具体如下：
液相色谱条件：色谱柱C18(2.1mm×100mm,1.8μm)；流速0.25mL/min；柱温40℃，进样量5μL；流动相：A相0.1％FA/H2O，B相0.1％FA/ACN；采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，
在第0～0.5min，废液通道；
在第0.5～8min，所述流动相A的体积由95％递减为20％，所述流动相B的体积由5％递增为80％；
在第8～9.5min，所述流动相A和B的体积保持不变；
在第9.5～10min，所述流动相A的体积由20％递增为95％，所述流动相B的体积由80％递减为5％；
在第10～13min，所述流动相A和B的体积保持不变；
因此目标多肽的保留时间和实施例1相比有所变化。
图6和图7分别为对比例1中猪肉的靶标特征多肽pig_3和pig_2的提取离子流图对比，由图6和图7可知，对比例1的方法得到的靶标特征多肽的响应值明显偏低，峰面积较小，不能满足方法的要求。
对比例2
与实施例1相比，区别在于：样品前处理中，称取2g样品，加20mL提取液(0.05mol/LTris-HCl)，而后操作相同。
但部分多肽chicken_2,chicken_3,turkey_2,bovine_2不出峰或出峰较小，不能满足方法的要求。
对比例3
与实施例1相比，区别在于：样品前处理中，称取2g样品，加20mL提取液(25％甲酸/乙腈)，高速均质振荡后，离心，但样品溶液不分层，浑浊，无法进行后续实验，不能满足方法的要求。
对比例4
与实施例1相比，区别在于：样品前处理中，称取2g样品，加20mL提取液(50％甲酸/乙腈)，高速均质振荡后，离心，但样品溶液不分层，浑浊，无法进行后续实验，不能满足方法的要求。
对比例5
与实施例1相比，区别在于：样品前处理中，称取2g样品，加20mL提取液(70％甲酸/乙腈)，高速均质振荡后，离心，但样品溶液不分层，浑浊，无法进行后续实验，不能满足方法的要求。
试验例1对市售肉制品样品的鉴定
采用实施例1的方法对30个市售肉制品样品进行检测，检测结果见表3。由表3可知，共检测出8个产品掺假，涉及鸡肉替代猪肉、猪肉替代羊肉及牛肉、鸭肉替代羊肉及牛肉等，2个产品不符合标签，产品标签中有猪肉成分，但检测结果无猪肉成分。
采用PCR技术对上述30个市售肉制品样品进行检测，产品掺假结果与采用实施例1方法得到的结果一致，进一步验证了采用本发明方法鉴定肉制品掺假结果准确可靠，准确率高。
表3市售肉制品样品检测的结果
Figure BDA0002610500610000151
Figure BDA0002610500610000161
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.基于液质联用技术快速鉴定肉样的动物源性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、建立不同动物源性肉类中高丰度蛋白质的靶标特征多肽数据库；
S2、对待测肉样进行前处理，得到待测肉样的多肽样品；
S3、采用液相色谱串联质谱检测S2得到的待测肉样的多肽样品，并与S1所述数据库中的靶标特征多肽进行比较，从而鉴定所述待测肉样的动物源性成分；
其中，S2中，所述前处理包括以下步骤：
(1)提取样品高丰度蛋白：向待测肉样中加入提取液和磁珠，用均质仪以1000～2600rad/min的转速均质2～5min，然后离心取上清液；
(2)向步骤(1)取得的上清液中加入NH4HCO3和胰蛋白酶进行酶解，加入甲酸终止反应，摇匀过膜上机分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取液为0.04～0.06mol/L Tris-HCl、5～6mol/L尿素、1～3mol/L硫脲。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以2g肉样计，所述提取液的添加量为15～25mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，按照每个肉样4～6个磁珠的比例，加入适量的磁珠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心的转速为10000～14000r/min，离心时间为10～30min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体为：取20～100μL上清液，加入1～3mL质量分数为0.5～2％的NH4HCO3溶液，加入20～60μL质量浓度100μg/mL胰蛋白酶，30～45℃下酶解0.5～2h后，加入200μL质量分数为5～15％的甲酸溶液终止反应，静止10～30min，摇匀过滤膜上机分析。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：
1)对不同动物源性肉类的标准肉样分别进行前处理，以便得到不同动物源性肉类的多肽样品；
2)采用液相色谱串联高分辨质谱分别检测步骤1)得到的不同动物源性肉类的多肽样品，筛选出不同动物源性肉类中高丰度蛋白质的特征多肽数据库；
3)采用液相色谱串联普通质谱分别检测步骤1)得到的不同动物源性肉类的多肽样品，得到多肽样品中不同多肽的质谱响应值；
4)根据步骤3)得到的不同多肽的质谱响应值，从步骤2)的不同动物源性肉类中高丰度蛋白质的特征多肽数据库中筛选出普通质谱信噪比不低于1500的特征多肽，即为不同动物源性肉类中高丰度蛋白质的靶标特征多肽数据库。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述前处理包括以下步骤：
A1、提取样品高丰度蛋白：向标准肉样中加入提取液和磁珠，用均质仪以1000～2600rad/min的转速均质2～5min，然后离心取上清液；
A2、向步骤A2取得的上清液中加入NH4HCO3和胰蛋白酶进行酶解，加入甲酸终止反应，摇匀过膜上机分析；
优选的，
步骤A1中，所述提取液为0.04～0.06mol/L Tris-HCl、5～6mol/L尿素、1～3mol/L硫脲；以2g肉样计，所述提取液的添加量为15～25mL；
和/或，步骤A1中，按照每个肉样4～6个磁珠的比例，加入适量的磁珠；
和/或，步骤A1中，所述离心的转速为10000～14000r/min，离心时间为10～30min；
和/或，步骤A2具体为：取20～100μL上清液，加入1～3mL质量分数为0.5～2％的NH4HCO3溶液，加入20～60μL质量浓度100μg/mL胰蛋白酶，30～45℃下酶解0.5～2h后，加入200μL质量分数为5～15％的甲酸溶液终止反应，静止10～30min，摇匀过滤膜上机分析。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)中，采用与所述S2中相同的方法进行前处理。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，羊肉的靶标特征多肽数据库如下：
Figure FDA0002610500600000031
和/或，猪肉的靶标特征多肽数据库如下：
Figure FDA0002610500600000032
Figure FDA0002610500600000041
和/或，鸡肉的靶标特征多肽数据库如下：
Figure FDA0002610500600000042
和/或，火鸡肉的靶标特征多肽数据库如下：
Figure FDA0002610500600000043
和/或，牛肉的靶标特征多肽数据库如下：
Figure FDA0002610500600000051
。
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