CN106483221A - 羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法 - Google Patents

羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法 Download PDF

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CN106483221A CN201610925831.9A CN201610925831A CN106483221A CN 106483221 A CN106483221 A CN 106483221A CN 201610925831 A CN201610925831 A CN 201610925831A CN 106483221 A CN106483221 A CN 106483221A
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Abstract

本发明涉及羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法，可有效解决羊肉及其制品中是否掺有鼠肉，确保羊肉质量的问题，方法是，熟羊肉及其制品用分别用乙醇、乙醚洗涤2次；分别称取鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品各加入蛋白提取液混悬，冰浴，离心，蛋白加入二硫代苏糖醇溶液反应，然后加入碘乙酰胺溶液反应；再加入冰丙酮，放置，离心，沉淀碳酸氢铵溶液复溶，加入胰蛋白酶混匀酶切，加入甲酸终止反应，再分别净化、除盐，用HPLC‑Q/Exactive测定肉中的多肽化合物；Sieve 2.0和Maxquant 1.5.3.8软件分析，选取每个物种中的多肽信息，去掉含有Miss Cleavage的多肽，获得相对特异性多肽，本发明方法独特，科学、先进，易操作，方法稳定可靠，准确率高，应用面广，实用性强。

Description

羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法
技术领域
本发明涉及食品，特别是一种羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法。
背景技术
受宗教信仰、营养需求、经济利益等多种因素的影响，动物源性食品中掺假成份的鉴定已成为食品安全面临的焦点问题。在经济利益的驱使下，在食品生产中经常有掺假与商标不符的廉价肉，面对政府部门的监管，掺假技术手段在不断地更新，甚至出现规模化肉制品掺假的现象，肉制品掺杂主要表现为畜禽肉冒充牛肉、羊肉制品；不可食用的鼠肉被作为正常肉制品食用，这种欺诈性质的商业活动已挫伤消费者对于食品的信心，损害了消费者利益。鉴于我国目前肉制品掺伪的现状，如何建立相关的快速筛查的方法，规范食品市场，打击食品中原料肉掺杂掺假、以次充好的商业欺诈行为，为消费者提供良好的食品安全保障手段，已成为当前我国食品安全迫切解决的问题。为保护消费者的利益，美国、欧盟等发达国家食品法规要求商品标签明确地标出动物源成分及其含量，禁止一切掺假作伪。
目前，我国对食品中动物性食品掺假的相关法规、技术标准滞后，检测手段主要依靠感官、ELISA和PCR等方法，感官法受主观因素影响结果可靠性差，ELISA法不能用于加工食品的掺伪鉴别，PCR-DNA法只能用于定性，同时加工肉制品中DNA降解严重，无法定量测定掺假肉含量。国外对肉类掺假检验方法的研究起步较早，基本确立了以特征性的脂肪、蛋白质、核酸作为靶标物进行肉类掺假检验的基本思路。目前，掺杂肉鉴别方法主要有质谱法、PCR法、酶联免疫法、红外光谱分析法、色谱法等。
随着近年来包括高分辨质谱技术在蛋白组学中应用的快速发展，使用液相色谱串联质谱技术分析鉴别各物种的蛋白特征性多肽，进而鉴定物种已经成为现实。拟建立的液相色谱串联质谱检测方法，简单，快捷，可应用于质检部门的标准方法和仲裁方法，为国家质检总局、农业部、工商部门针对我国动物源性食品生产情况，制定相关政策，建立食品标签管理体系提供技术保障已成可能。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法，可有效解决羊肉及其制品中是否掺有鼠肉，确保羊肉质量的问题。
本发明解决的技术方案是，包括以下步骤：
(1)、肉样品的预处理：
鲜生羊肉及鲜生鼠肉直接进行肉蛋白的提取和酶切；
熟羊肉及其制品用分别用乙醇、乙醚洗涤2次，室温下蒸发干溶剂，得处理后的熟羊肉及其制品，进行肉蛋白的提取和酶切；
(2)、肉蛋白的提取和酶切：
分别称取鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品各加入蛋白提取液混悬，冰浴，离心，取上清液测蛋白浓度，分别取蛋白加入二硫代苏糖醇溶液反应，然后各加入碘乙酰胺溶液(IAA)，避光反应；再各加入冰丙酮，放置，离心，弃上清液，再每次用冰丙酮洗两遍，用碳酸氢铵溶液复溶，加入胰蛋白酶(Trypsin)混匀，酶切过夜，酶切后的样品各加入甲酸终止反应，得鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品的含多肽化合物溶液；
(3)、鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品的含多肽化合物溶液的分别净化、除盐：
将鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品用的萃取HLB柱先依次用甲醇、水活化，再将含多肽化合物溶液分别装入HLB柱中，全部流出后用水冲洗HLB柱，抽干，甲醇洗脱，收集各自的洗脱液，于氮气流下浓缩至干，加入乙腈和甲酸的溶液溶解残渣，分别得到净化后的多肽化合物溶液，滤膜过滤，用HPLC-Q/Exactive测定肉中的多肽化合物；
(4)、HPLC-Q/Exactive测定肉中的多肽化合物：
先找到纯的生鲜羊肉和鼠肉找到各自的特征多肽，然后通过测定不同比例的鼠肉掺到羊肉中，对掺假羊肉进行测定；
(5)、数据分析：
对上述用HPLC-Q/Exactive获得的数据，同时采用Sieve 2.0和Maxquant 1.5.3.8软件进行分析，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有Miss Cleavage的多肽，获得相对特异性多肽，从而实现对羊肉掺假鼠肉的鉴定。
本发明方法独特，科学、先进，易操作，方法稳定可靠，准确率高，可有效用于对羊肉掺假鼠肉的鉴定，保证羊肉的纯真性，而且该方法还可用于对其它肉类的掺假鉴定，应用面广，实用性强，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为本发明鼠肉中掺不同比例羊肉的线性关系图。
图2为羊肉中掺不同比例鼠肉的线性关系图。
图3为羊特征多肽测定低限选择离子流图。
图4为鼠特征多肽测定低限选择离子流图。
图5、图6、图7为采用Sieve2.0软件分析区分两物种羊和鼠的标筛PCA图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
(1)、肉样品的预处理：
鲜生羊肉及鲜生鼠肉直接进行肉蛋白的提取和酶切；
熟羊肉及其制品用质量浓度95％乙醇洗2次，再用乙醚洗2次，室温下蒸发干溶剂，得处理后的熟羊肉及其制品，进行肉蛋白的提取和酶切；每2g熟羊肉及其制品每次质量浓度95％乙醇用量为20mL，每次乙醚用量为10mL；
(2)、肉蛋白的提取和酶切：
分别称取鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品各100mg，各加入1000μL蛋白提取液混悬，冰浴10min，在4℃、13000r/min离心10min，取上清液测蛋白浓度，分别取0.5mg蛋白加入1M的二硫代苏糖醇溶液(DTT)使浓度保持在10mM，在56℃下反应40min，然后各加入0.5M的碘乙酰胺溶液(IAA)使浓度保持在50mM，避光反应40min；再各加入4倍体积的-20℃冰箱预冷过夜的丙酮，-20℃放置5h，离心，弃上清液，再每次用1mL冰丙酮洗两遍，最后各用200μL碳酸氢铵溶液复溶，按重量体积比20︰1加入胰蛋白酶(Trypsin)混匀，重量体积是指固体以g计，液体以mL计，酶切过夜，酶切后的样品各加入2μL甲酸终止反应，得鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品的含多肽化合物溶液；
所述的蛋白提取液的制备方法是，取50mL 1M TrisHCl，37.5mL 4M NaCl，4mL0.5MEDTA，10mL NP-40，10mL质量浓度10％SDS，用水定容至1000mL，于0-4℃保存；
所述的碳酸氢铵溶液是由碳酸氢铵0.395g加入100mL水混匀制成；
(3)、鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品的含多肽化合物溶液的分别净化、除盐：
将鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品用的萃取HLB柱先依次用3mL甲醇、3mL水活化，再将鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品的含多肽化合物溶液分别装入HLB柱中，待含多肽化合物溶液全部流出后用3mL水淋洗，使柱体保持抽干5min，5mL甲醇洗脱，收集各自的洗脱液，于氮气流下浓缩至干，加入乙腈和质量浓度0.1％甲酸溶液溶解残渣，分别得到净化后的多肽化合物溶液，经0.2μm滤膜过滤，HPLC-Q/Exactive测定肉中的多肽化合物；
所述的乙腈和质量浓度0.1％甲酸溶液是按体积比1︰9制成；
(4)、HPLC-Q/Exactive测定肉中的多肽化合物：
色谱条件：Hypersil GOLD C18色谱柱，2.1mm×100mm，1.9μm；柱温30℃；流动相A为质量浓度0.1％甲酸水溶液；流动相B为质量浓度0.1％的甲酸乙腈；A相和B相的体积百分比色谱梯度为：0min，5％B相和95％A相；3min，5％B相和95％A相；20min，30％B相和70％A相；23min，90％B相和10％A相；26min，90％B相和10％A相；26.1min，5％B相和95％A相；30min，5％B相和95％A相；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL；
质谱条件：喷雾电压：3500V；毛细管温度：270℃；离子源加热温度：270℃；质谱扫描模式：Target-SIM-ddMS2；全扫描分辨率：70000FWHM；一级全扫描化合物，自动增益值1×106；进样时间100ms；二级扫描：topN10；分辨率：17500FWHM；自动增益值2×105；进样时间110ms；碰撞能量：27eV；
在上述色谱、质谱条件下，先找到纯的生鲜羊肉和鼠肉找到各自的特征多肽，由于经过加热加工的肉中不稳定的特征多肽会降解，因此通过测定寻找经过加工处理的熟羊肉及羊肉制品和熟鼠肉中稳定存在的特征多肽各4条，见下表：
作为最终定性的依据，然后通过测定不同比例的鼠肉掺到羊肉中，对掺假羊肉进行测定；
(5)、数据分析：
对上述用HPLC-Q/Exactive获得的数据，同时采用Sieve 2.0和Maxquant 1.5.3.8软件进行分析，方法是：
Sieve2.0数据分析：将羊肉设为参比组，鼠肉设为对照组，设定目标为蛋白组学差异性分析，质量准确度阈值设为10ppm，进行Align和Frame分析；
Maxquant 1.5.3.8分析：肉类样品进行非标记定量(LFQ)分析，检索数据库为羊、鼠物种的Uniprot全库，最多漏切位点设为2，可变修饰为氧化蛋氨酸、乙酰化N-端，固定修饰为脲甲基修饰半胱氨酸，勾选异亮氨酸等于亮氨酸设置(I＝L)，为获得尽可能多的多肽定量信息，选择所有定量肽段信息选项，其他参数为Maxquant默认值；利用非标记定量的结果，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有Miss Cleavage的多肽，获得相对特异性多肽，从而实现对羊肉掺假鼠肉的鉴定。
本发明经试验和实地应用，取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
1.实验部分
1.1仪器和耗材
液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱(HPLC-Q Exactive，美国Thermo Fisher公司)配Ultimate 3000液相色谱系统、Xcalibur 2.0、Mass Frontier 7.0、sieve 2.0软件；Eppendorf 5427R台式高速冷冻离心机；高温干燥箱；CF15RXII离心机(日本Hitachi公司)；JJ-2组织捣碎匀浆机HR 1861/30(金坛江南仪器公司)；0.22μm水相一次性微孔滤膜(美国Agilent公司)。10000K蛋白过滤膜(美国CNW公司)，OASIS HLB柱(3mL/60mg，美国Waters公司)；5210型超声波清洗器(美国Bransonic公司)；SA-31振荡器(日本大和公司)；24位固相萃取装置(德国CNW公司)；XS205天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；-80℃冰箱(海尔DW-86L388)；移液枪(德国Eppendorf公司)。
1.2主要试剂与材料
鲜羊肉购于大型超市、生鲜市场，鼠肉自捕获取后腿肉。
甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸(美国Tedia公司)；胰蛋白酶(测序级)；二硫代苏糖醇(DTT，生化级，美国Promega公司)；碘乙酰胺(IAA，生化级，美国Sigma公司)；测序级胰蛋白酶(美国Promega公司)，尿素、硫脲、盐酸、NP-40、三(羟甲基)氨甲基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、氯化钠、丙酮、乙醚、乙醇均为国产分析纯；水为Millipore纯水系统制得的高纯水(电阻率≥18MΩ·cm)。
1.3溶液的配制
蛋白提取溶液：取50mL1M TrisHCl，37.5mL 4M NaCl，4mL 0.5M EDTA，10mLNP-40，10mL 10％SDS，用水定容至1000mL，于0℃-4℃保存可使用一周。二硫代苏糖醇溶液(DTT)：准确称取0.154g二硫代苏糖醇，加入1mL水溶解，配制成1mol/L二硫代苏糖醇水溶液，该溶液使用前配制。碘乙酰胺溶液(IAA)：准确称取0.185g碘乙酰胺，加入1mL水溶解，配制成1mol/L的碘乙酰胺母液，该溶液使用前配制。50mmol/L碳酸氢铵溶液：准确称取碳酸氢铵0.395g加入100mL水配制。1μg/μL的胰蛋白酶(Trypsin)溶液：将100μL1mmol/L盐酸加入到含有100μg胰蛋白酶(Trypsin)冻干粉的离心管中即得到。
1.4羊肉及鼠肉生肉和熟肉制品的制备
羊肉及鼠肉熟肉制作：分别将适量的生鲜肉在190℃加热1h后制得羊肉和鼠肉的熟肉，真空至干后备用。
羊肉制品(以羊肉串为例)：取适量的生鲜羊肉加入20％氯化钠腌制4h，加入适量的烧烤料(四川友嘉食品有限公司)，置碳炉中烧烤10min，并加入适量的植物油，取出后撒入适量的孜然粉，真空至干后备用。
羊肉中掺假鼠肉的制作：取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、40、60、80、90、95、100g鼠肉，与羊肉混合，使其中鼠肉掺假比例分别为0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10％、20％、40％、60％、80％、90％、95％、100％(质量比)。
1.5样品分析
1.5.1肉样品的预处理
羊肉及鼠肉生鲜肉：不做预处理
熟肉及羊肉制品：分别称取2.0g熟肉及羊肉制品，加入20mL 95％乙醇的洗2次，加入10mL乙醚洗2次，待溶剂完全蒸发干备用。
1.5.2肉中蛋白的提取和酶切
分别称取100mg 1.5.1处理过的样品，加入1000μL蛋白提取溶液，混悬后冰浴10min，离心10min(13000r/min，4℃)，取上清液测蛋白浓度，分别取0.5mg蛋白加入1M的二硫代苏糖醇溶液(DTT)使浓度保持在10mM，在56℃下反应40min，然后加入0.5M的碘乙酰胺溶液(IAA)使浓度保持在50mM，避光反应40min。加入4倍体积的-20℃冰箱预冷过夜的丙酮，-20℃放置5h，离心，弃上清液，再用冰丙酮洗两遍每次1mL。最后加入200μL碳酸氢铵溶液复溶，按1:20的比例加入胰蛋白酶(Trypsin)酶切过夜，酶切后的样品加入2μL甲酸终止反应，得到含多肽化合物溶液。
1.5.3肉中多肽化合物的净化、除盐
HLB柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，将1.5.2得到的溶液上载至固相萃取柱中，待样液全部流出后用3mL水淋洗，使柱体保持抽干5min，5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于氮气流下浓缩至干，加入1mL乙腈：0.1％甲酸(体积比1:9)溶解残渣得净化后的多肽化合物溶液，经0.2μm滤膜过滤后HPLC-Q/Exactive测定。
1.6肉中多肽化合物的测定
在以下色谱、质谱条件下，先找到纯的生鲜羊肉和鼠肉找到各自的特征多肽，因经过加热加工的肉中不稳定的特征多肽会降解，因此实验又通过测定寻找经过加工处理的熟羊肉及羊肉制品和熟鼠肉中稳定存在的特征多肽，作为最终定性的依据，然后通过测定不同比例的鼠肉掺到羊肉中，来验证方法的准确性与稳定性，最后用于实际样品的测定。
1.6.1液相色谱条件
色谱条件：Hypersil GOLD C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.9μm)；柱温：30℃；流动相A为0.1％甲酸水溶液；流动相B为0.1％的甲酸乙腈。色谱梯度为：0min，5％B相和95％A相；3min，5％B相和95％A相；20min，30％B相和70％A相；23min，90％B相和10％A相；26min，90％B相和10％A相；26.1min，5％B相和95％A相；30min，5％B相和95％A相。流速：0.3mL/min；进样体积：10μL。
1.6.2质谱条件
喷雾电压：3500V；毛细管温度：270℃；离子源加热温度：270℃；质谱扫描模式：Target-SIM-ddMS2；全扫描分辨率：70 000FWHM；一级全扫描化合物：见表1，自动增益值1×106；进样时间100ms；二级扫描：topN 10；分辨率：17 500FWHM；自动增益值2×105；进样时间110ms；碰撞能量：27eV。
表1鼠肉和羊肉选取的特征多肽
1.7数据分析
HPLC-Q/Exactive获得的数据，同时采用Sieve 2.0和用Maxquant 1.5.3.8软件进行分析。
Sieve2.0数据分析条件：将羊肉设为参比组，鼠肉设为对照组，设定目标为蛋白组学差异性分析，质量准确度阈值设为10ppm，进行Align和Frame分析。
Maxquant 1.5.3.8条件：肉类样品进行了非标记定量(LFQ)分析，检索数据库为羊、鼠物种的Uniprot全库，最多漏切位点设为2，可变修饰为氧化(蛋氨酸)、乙酰化(N-端)，固定修饰为脲甲基修饰(半胱氨酸)。勾选异亮氨酸等于亮氨酸设置(I＝L)，为了获得尽可能多的多肽定量信息，选择所有定量肽段信息选项。其他参数为Maxquant默认值。利用非标记定量的结果，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有Miss Cleavage的多肽，获得相对特异性多肽。
2结果与讨论
2.1蛋白特征多肽的选择
动物肌肉中存在两种丰度最高的蛋白：肌红蛋白(myoglobin，Mb)和肌球蛋白。肌红蛋白是哺乳动物细胞中主要是肌细胞贮存和分配氧的蛋白质，肌肉中肌红蛋白含量十分丰富，控制着肌肉的颜色，是由一条多肽链和一个辅基血红素构成，含153个氨基酸残基，水溶性强，在肌肉中易于提取。肌球蛋白(myosin)属肌浆蛋白Sarcoplasmic proteins，是一种重要的骨骼肌相关的蛋白质，该类蛋白是由多条多肽链组成，水溶性差，在熟肉加工制品中，蛋白热变性过程中蛋白序列发生改变的主要蛋白是肌浆蛋白，相对于生肉，熟肉可识别的蛋白数量更少。
2.2鼠肉和羊肉的myoglobin比对
利用http://www.uniprot.org/工具进行比对，羊肉和鼠肉myoglobin蛋白align结果：鉴别出该蛋白的80％氨基酸序列一致(123/154)，NCBI align得分249，Evalue＝3e-91。
鼠myoglobin序列：
>sp|P04247|MYG_MOUSE Myoglobin OS＝Mus musculus GN＝Mb PE＝1SV＝3
MGLSDGEWQLVLNVWGKVEADLAGHGQEVLIGLFKTHPETLDKFDKFKNLKSEEDMKGSEDLKKHGCTVLTALGTILKKKGQHAAEIQPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEIIIEVLKKRHSGDFGADAQGAMSKALELFRNDIAAKYKELGFQG
羊myoglobin序列：
>sp|P02190|MYG_SHEEP Myoglobin OS＝Ovis aries GN＝MB PE＝1SV＝2
MGLSDGEWQLVLNAWGKVEADVAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASEDLKKHGNTVLTALGGILKKKGHHEAEVKHLAESHANKHKIPVKYLEFISDAIIHVLHAKHPSDFGADAQGAMSKALELFRNDMAAQYKVLGFQG
除肌红蛋白外，肌球蛋白特异序列有较高的一致性。在Uniprot库中可搜到59条鼠myosin不同构型的蛋白，1条Myosin light chain羊物种蛋白(由438个氨基酸组成)。
2.3高分辨质谱特征肽的识别
动物蛋白被胰蛋白酶酶解后，由小分子质量的多肽组成，将肉经细胞裂解液裂解及胰蛋白酶酶解处理后，用高分辨质谱对小分子多肽进行非标记定量分析，并利用Uniport全库进行数据的检索。利用非标记定量的结果选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有Miss Cleavage的多肽，鉴定物种相对于其他物种专属性的多肽条数。
本发明方法采用Maxquant鉴定了222条羊肉、544条鼠肉特异性蛋白序列，两物种数据经Sieve差异性分析，共鉴定出175条高响应强度的差异数据，见表4a、4b。对鉴定的差异数据或序列，方法遵循以下原则：1、质谱分析时可以离子化效率高，具有充足的子离子碎片；2、目标蛋白的唯一专属性；3、没有残存易于化学修饰的氨基酸，如Cys活性疏基、可氧化的Met、脱酰胺的Asn和Gln、N-末端Gln(焦谷胺酸)；4、缺少翻译后修饰，易于产生胰蛋白酶漏切位点序列。
对于Maxquant鉴定的特征多肽，选取峰形佳、灵敏度高的序列作为目标分析物。结果表明羊肉的肌红蛋白、鼠肉的肌球蛋白加工过程中不降解，不变性，羊肉的HLAESHANK和GHHEAEVK两个序列，因色谱保留性差，未被选作目标物进行分析。经blast比对，发现鼠和羊Myoglobin蛋白对应位置有5条差异多肽，见表2，测试后证明鼠肉Myoglobin蛋白离子化效率低，不利于质谱分析。因此本方法选取4条特征性多肽用于两种物种鉴定，见表1。
表2 Myoglobin蛋白对应位置鼠和羊特征多肽
2.4方法准确度和方法精密度
为了验证方法的准确性和稳定性，分别考察了羊肉掺假三个比例的鼠肉(1％、5％、20％)的回收率实验，每个掺假比例平行测6次结果如表3。
表3羊肉掺假鼠肉的特征多肽添加回收率及精密度(n＝6)
2.5方法线性范围和方法测定低限
将羊肉+鼠肉双变量制作：取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、40、60、80、90、95、100g鼠肉，与羊肉混合，使其中鼠肉掺假比例分别为0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10％、20％、40％、60％、80％、90％、95％、100％。同时取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、40、60、80、90、95、100g羊肉，与鼠肉混合，使其中羊肉掺假比例分别为0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10％、20％、40％、60％、80％、90％、95％、100％。样品按照本文进行操作，测定结果的峰面积与添加肉百分比呈良好的线性关系。见图1和2。
经测定本方法测定低限0.1％，见图3和图4。
除采用Blast蛋白数据库比对区分物种外同时采用Sieve2.0软件分析区分两物种，如图5、6、7。
表4a sheep and mouse sieve DATA
表4b sheep and mouse sieve DATA
3结论
由上述可以看出，本发明是建立了一种采用高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱方法(Q-Exactive Target-SIM-ddMS2)快速测定羊肉及其熟肉制品中掺假鼠肉的鉴定方法。不仅可用于近缘性动物性食品的鉴定，也可用于加工食品的肉源性成份的鉴定且可以准确定量。在找到的特征性多肽的基础上，将鼠肉按照0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10％、20％、40％、60％、80％、90％、95％、100％比例掺加到羊肉中，选择羊肉定量多肽4条，鼠肉定量多肽4条，进行定量分析，线性相关系数大于0.99，检出限可达到0.1％。运用该方法分别测定市售56种羊肉及羊肉制品，未检出掺有鼠肉。结果表明高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱方法鉴定羊肉及其熟肉制品中掺假鼠肉结果准确，准确率高达99.9％，且方法稳定可靠，不但应用于羊肉掺假的鉴定，而且还可以广泛用于其它肉类掺假的签定，如在实验中，申请人还牛肉定量多肽5条，猪肉定量多肽5条，对掺假其他肉类的按本发明方法进行了鉴定，线性相关系数大于0.99，也就是说，准确率也都达到了99％以上，表明用途广(这里不再一一对其他肉类的实验进行表述)，具有很强的实用性，是肉类防掺假上的一大创新，经济和社会效益巨大。

Claims (4)

1.一种羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、肉样品的预处理：
鲜生羊肉及鲜生鼠肉直接进行肉蛋白的提取和酶切；
熟羊肉及其制品用质量浓度95％乙醇洗2次，再用乙醚洗2次，室温下蒸发干溶剂，得处理后的熟羊肉及其制品，进行肉蛋白的提取和酶切；每2g熟羊肉及其制品每次质量浓度95％乙醇用量为20mL，每次乙醚用量为10mL；
(2)、肉蛋白的提取和酶切：
分别称取鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品各100mg，各加入1000μL蛋白提取液混悬，冰浴10min，在4℃、13000r/min离心10min，取上清液测蛋白浓度，分别取0.5mg蛋白加入1M的二硫代苏糖醇溶液使浓度保持在10mM，在56℃下反应40min，然后各加入0.5M的碘乙酰胺溶液使浓度保持在50mM，避光反应40min；再各加入4倍体积的-20℃冰箱预冷过夜的丙酮，-20℃放置5h，离心，弃上清液，再每次用1mL冰丙酮洗两遍，最后各用200μL碳酸氢铵溶液复溶，按重量体积比20︰1加入胰蛋白酶混匀，重量体积是指固体以g计，液体以mL计，酶切过夜，酶切后的样品各加入2μL甲酸终止反应，得鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品的含多肽化合物溶液；
(3)、鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品的含多肽化合物溶液的分别净化、除盐：
将鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品用的萃取HLB柱先依次用3mL甲醇、3mL水活化，再将鲜生羊肉、鲜生鼠肉、预处理后的熟羊肉及其制品的含多肽化合物溶液分别装入HLB柱中，待含多肽化合物溶液全部流出后用3mL水淋洗，使柱体保持抽干5min，5mL甲醇洗脱，收集各自的洗脱液，于氮气流下浓缩至干，加入乙腈和质量浓度0.1％甲酸溶液溶解残渣，分别得到净化后的多肽化合物溶液，经0.2μm滤膜过滤，HPLC-Q/Exactive测定肉中的多肽化合物；
(4)、用HPLC-Q/Exactive仪测定肉中的多肽化合物：
用HPLC-Q/Exactive仪，在色谱、质谱条件下，先找到纯的生鲜羊肉和鼠肉找到各自的特征多肽，由于经过加热加工的肉中不稳定的特征多肽会降解，因此通过测定寻找经过加工处理的熟羊肉及羊肉制品和熟鼠肉中稳定存在的特征多肽各4条，见下表：
作为定性的依据，然后通过测定不同比例的鼠肉掺到羊肉中，对掺假羊肉进行测定；
(5)、数据分析：
对上述用HPLC-Q/Exactive获得的数据，同时采用Sieve 2.0和Maxquant 1.5.3.8软件进行分析，方法是：
Sieve2.0数据分析：将羊肉设为参比组，鼠肉设为对照组，设定目标为蛋白组学差异性分析，质量准确度阈值设为10ppm，进行Align和Frame分析；
Maxquant 1.5.3.8分析：肉类样品进行非标记定量(LFQ)分析，检索数据库为羊、鼠物种的Uniprot全库，最多漏切位点设为2，可变修饰为氧化蛋氨酸、乙酰化N-端，固定修饰为脲甲基修饰半胱氨酸，勾选异亮氨酸等于亮氨酸设置(I＝L)，为获得尽可能多的多肽定量信息，选择所有定量肽段信息选项，其他参数为Maxquant默认值；利用非标记定量的结果，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有Miss Cleavage的多肽，获得相对特异性多肽，从而实现对羊肉掺假鼠肉的鉴定。
2.根据权利要求1所述的羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法，其特征在于，所述的色谱条件为：Hypersil GOLD C18色谱柱，2.1mm×100mm，1.9μm；柱温30℃；流动相A为质量浓度0.1％甲酸水溶液；流动相B为质量浓度0.1％的甲酸乙腈；A相和B相的体积百分比色谱梯度为：0min，5％B相和95％A相；3min，5％B相和95％A相；20min，30％B相和70％A相；23min，90％B相和10％A相；26min，90％B相和10％A相；26.1min，5％B相和95％A相；30min，5％B相和95％A相；流速：0.3mL/min；进样体积：10μL；
所述的质谱条件：喷雾电压：3500V；毛细管温度：270℃；离子源加热温度：270℃；质谱扫描模式：Target-SIM-ddMS2；全扫描分辨率：70000FWHM；一级全扫描化合物，自动增益值1×106；进样时间100ms；二级扫描：topN10；分辨率：17500FWHM；自动增益值2×105；进样时间110ms；碰撞能量：27eV。
3.根据权利要求1所述的羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(2)蛋白提取液的制备方法是，取50mL 1M TrisHCl，37.5mL 4M NaCl，4mL 0.5M EDTA，10mLNP-40，10mL质量浓度10％SDS，用水定容至1000mL，于0-4℃保存；
所述的碳酸氢铵溶液是由碳酸氢铵0.395g加入100mL水混匀制成。
4.根据权利要求1所述的羊肉及其制品掺假鼠肉的鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(3)所述的乙腈和质量浓度0.1％甲酸溶液是按体积比1︰9制成。
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