CN108181399B - 一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳制品中A2‑β‑酪蛋白含量的检测方法，包括准备样品和标准品：如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳离心脱脂；加入缓冲液，涡旋混匀，静置10‑120min，离心5‑20min；取下清液，加入缓冲液定容，涡旋混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测；HPLC检测分析，采用梯度洗脱程序进行洗脱，流动相A：0.1%三氟乙酸、流动相B：0.1%乙腈。本发明检测分析方法可以实现对于普通牛奶中A1‑β‑酪蛋白和A2‑β‑酪蛋白亚型状态检测分析研究，通过预处理以及色谱条件的协同调整，实现对于两种亚型的充分分离，进而结合标准品进行快速判断牛乳原料是否属于纯品A2‑β‑酪蛋白亚型牛乳替代现有基因检测分析方法，简化检测分析研究的难度，降低检测分析成本。

Description

一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种酪蛋白含量检测方法，特别涉及一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，特别是牛乳中酪蛋白检测分析，属于乳制品领域。

背景技术

牛奶中含有丰富的营养成分，每一杯250mL的牛奶中固含量为30-38克，包括10-20克乳糖、5-7克脂肪、2-2.5克矿物质以及7-10克蛋白质。因此，牛奶被广泛的推荐作为青少年健康饮品，补充青少年生长发育阶段对于各种营养成分的需求。

牛奶蛋白含量丰富，同时其中蛋白质又被分为酪蛋白和乳清蛋白，乳清蛋白是指溶解分散在乳清中的蛋白，酪蛋白则主要是含磷钙的结合蛋白。因此，酪蛋白既可以为人体提供氨基酸来源，又可以作为磷、钙元素的来源，对于幼儿生长发育具有重要意义。

在牛奶酪蛋白中30-35％是β-酪蛋白，β-酪蛋白有多种变体，最常见是A1和A2亚型。他们的区别是组成这种蛋白质的209个氨基酸中的一个氨基酸不同，氨基酸链的第67位是脯氨酸(proline)的酪蛋白是A2-β-酪蛋白，第67位是组氨酸(histidine)的则是A1-β-酪蛋白。两种β-酪蛋白在结构上的细微差别意味着它们被吸收的情况也有所不同。A2-β-酪蛋白相比于A1-β-酪蛋白，在消化酶作用下产生β-酪啡肽-7更少，可以有效的减少BCM-7类鸦片活性肽对于肠道活性影响，更有利于人体吸收利用、健康。

随着现代社会消费升级，对于更加健康安全的乳制品提出更高要求，A2牛奶近年来在中国市场取得非常好的市场效应。目前能够参照的技术手段主要是牛只基因鉴定法，基因鉴定法主要针对牛只的基因鉴定，但是对于某一未知牛乳样品基因型鉴定不适用。针对市售牛乳产品中β-酪蛋白的构型确认及具体含量如何，需要开发一种通用的检测方法。

发明人在大量的研究工作总结以后，提出了通过HPLC色谱法快速检测分析牛乳中酪蛋白类型的方法，但是市场上对于A1、A2亚型β-酪蛋白标准品的提供较少，难以满足检测分析的需求。

现有技术中也提供一些关于酪蛋白检测分离的方法，但大多仅限于αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白三大类型的检测和分离，并没有关于β-酪蛋白A1和A2类型的拆分研究。

市场销售或者一般途径得到的牛乳样品(或者干酪素)均为A1和A2的混合样，采购的标准品β-酪蛋白也是两种构型的混合物。缺少标准品的情况下，在技术检测上不能明确色谱图上两个峰所代表的具体成分，无法进行定性及定量分析，也就无法确定不同的酪蛋白的类型，也就无法准确的检测分析不同的酪蛋白含量。

现有资料上看，利用液相色谱检测技术得到的色谱图上，β-酪蛋白出现两个色谱峰，但是在文献资料中并未明确指出两个峰所代表的β-酪蛋白基因构型。导致该现象的原因主要是，市场销售或者一般途径得到的牛乳样品(或者干酪素)均为A1和A2的混合样，采购的标准品β-酪蛋白也是两种构型的混合物。所以，在技术检测上不能明确色谱图上两个峰所代表的具体成分。

A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白标准物质的缺乏，无法在市场上购买到商品化的标准品物，进而导致A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白定量检测无法实现。现有文献中对于β-酪蛋白定量的测定主要集中在两种混合物的定量检测上，作为A2的研究存在缺陷。

现有文献中β-酪蛋白的提取方法存在两个问题，第一，采用膜过滤或者色谱分离所需要的膜技术和制备型色谱仪较贵，并不适用于通用；第二，利用酪蛋白的特性提纯方法耗时较长或者步骤繁琐。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中所存在的缺少针对性的区分β-酪蛋白的A1、A2亚型检测方法的不足，提供一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法。

与现有的奶牛基因检测方法不同，本发明利用常规检测仪器(高效液相色谱仪)，通过液相色谱柱对牛乳中两种β-酪蛋白的色谱分离，通过保留时间进行定性鉴定，另外通过从牛乳中提取的A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白作为标准品，利用色谱峰面积进行定量检测未知奶样中的β-酪蛋白的含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，包括以下步骤：

S1、准备样品和标准品：

101样品准备：如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳离心脱脂。加入缓冲液，涡旋混匀，静置10-120min，离心5-20min。取下清液，加入缓冲液定容，混匀，用0.45μmPTFE滤膜过滤过滤，待上机检测。

102标准品准备：称取αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品各1mg至三个1.5mL离心管中，加入缓冲液，溶解均匀，加入缓冲液定容，过滤，得到已知酪蛋白浓度的待上机检测的标准品。

S2、色谱检测：

采用高效液相色谱依次检测标准品和样品，根据标准品中各个酪蛋白的保留时间，确定样品中相应酪蛋白成分的保留时间以及峰面积，计算各种酪蛋白的含量。

色谱参数如下：

色谱柱：ZORBAX 300A Stalle Bond 300SB-C8 4.6*250 5μm。

采用梯度洗脱程序进行洗脱，流动相A：0.1％三氟乙酸、流动相B：0.1％乙腈，洗脱程序：

时间/min	流动相A/％	流动相B/％	流速/mL/min
				0	75.7	24.3	1
2	71.2	28.8	1
				17	64.8	35.2	1
30	61.8	38.2	1
				45	55.0	45.0	1
48	46.0	54.0	1
				53	46.0	54.0	1
55	75.7	24.3	1
				65	75.7	24.3	1

进样量：50μL；

柱温：40℃；

检测波长：241nm。

本发明乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，结合发明人的长期研究经验总结，提出适宜的样品准备方法和相应的标准品配制方法，实现样品准备和标准品能够充分溶解制备成优秀的HPLC分析上机样品。本发明配制的样品中HPLC上机检测过程中，配合相应的流动相A和流动相B组分相互之间的配合应用，按照梯度洗脱程序进行处理样品，最终样品的洗脱分离效果好，可以通过HPLC实现高效率的检测分析。对于乳制品中多种不同的酪蛋白成分的检测分析精确度高，结果准确可靠。

其中S1包括的101和102不区分先后顺序。优选地，配制的标准品冷藏保存有效期7天。

本发明方法中应用的缓冲液进行筛分处理，改变牛乳中各种成分的溶解分散特性，结合离心处理筛分出牛乳中蛋白质等，利用β-巯基乙醇保护蛋白质避免氧化，通过缓冲液优化处理，实现对于目标β-酪蛋白的提取。本发明样品准备过程中对于乳制品预处理有效的提取得到牛乳中的酪蛋白，萃取酪蛋白比例高，检测分析结果准确可靠。

经过上述提取预处理方法处理得到的待测溶液中β-酪蛋白稳定溶解，在HPLC仪器上通过色谱柱和流动相配合作用，其中流动相为双组份流动相，流动相A：0.1％三氟乙酸和流动相B：0.1％乙腈协调，进行梯度洗脱处理，实现乳制品样品中多种成分相互分离检测的效果，使得各种酪蛋白可以充分的分离开来，实现高效率检测分析不同的酪蛋白的效果，在一次检测分析中实现多种不同的酪蛋白成分的检测。

进一步，所述缓冲液是含有6-8mol/L尿素、0.3-0.8％β-巯基乙醇、17-18mmol/LBis-Tris的混合液。优选地，所述缓冲液是7mol/L尿素、0.5％β-巯基乙醇、17.5mmol/LBis-Tris。缓冲液是本发明人结合检测分析酪蛋白的分子结构特点设计的缓冲液，能够很好的溶解酪蛋白，对待检测成分实现精确筛分萃取。

优选地，加入缓冲液以后，调节pH＝7.0-7.5。调节pH更有利于筛选酪蛋白成分，通过调节pH可以加快提取速度。

进一步，S1准备样品和标准品过程如下：

101样品前处理

移取150-250μL经过脱脂的牛乳至1.5-2mL离心管中，加入600-800μL缓冲液，涡旋混匀1-5min，室温静置放置0.5-2h。4000-9000r/min离心5-20min。取下清液400-500μL至另一干净1.5-2mL离心管中，加入缓冲液定容，混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测。

所述缓冲液是含有6-8mol/L尿素、0.3-0.8％β-巯基乙醇、17-18mmol/L Bis-Tris的混合液。

进一步，102标准品前处理

称取αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品各1mg至三个1.5-2mL离心管中，加入400-500μL缓冲液，混匀；加入缓冲液定容至1mL，混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测。

进一步，S1准备样品和标准品过程如下：

101样品前处理

准备缓冲液：含有7mol/L尿素、0.5％β-巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris的混合溶液。

移取200μL经过脱脂的牛乳至1.5mL离心管中，加入600μL缓冲液，涡旋混匀1min，室温静置放置1h，6000r/min离心10min。取下清液，加入缓冲液定容，混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测。

102标准品前处理

称取αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品各1mg至三个1.5mL离心管中，加入500μL缓冲液，溶解充分；加入缓冲液定容至1mL，混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测。

本发明样品前处理以及标准品前处理是发明人根据长期工作总结，结合酪蛋白固有特性采取的针对性分离预处理方法，该方法能够很好的针对牛奶中多种营养成分的溶解分散特性进行筛选，排除乳糖、矿物质、脂肪等成分的干扰影响，精确筛选酪蛋白，进而为准确的酪蛋白含量测试提供可靠保障。

通过本发明提供的以上技术方案可以方便的进行乳制品中酪蛋白检测分析，本领域技术人员可以采用本发明方法快速检测牛乳中酪蛋白含量，并据酪蛋白含量类型、比例判断不同牛乳的品质等级。为消费者提供品质更加优秀的乳制品，实现分子层面的牛乳研发管理，使得乳制品生产企业能够更好的精确控制乳制品产品质量。

进一步，检测过程中使用的β-酪蛋白标准品分为A1-β-酪蛋白、A2-β-酪蛋白两种。A1、A2-β-酪蛋白纯净品为自行提取纯化得到的标准品。优选地，A1-β-酪蛋白、A2-β-酪蛋白标准品纯度≥83％。

进一步，102标准品准备：

称取αs-酪蛋白、A1-β-酪蛋白、A2-β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品各1mg至四个1.5mL离心管中，加入缓冲液，溶解均匀，加入缓冲液定容，过滤，得到已知酪蛋白浓度的待上机检测的标准品。

本发明为了实现上述检测分析的发明目的，还提供以下准备A1-β-酪蛋白、A2-β-酪蛋白标准品的方法。通过从已知A1、A2亚型的牛乳中提取分离A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白，纯化分离后得到纯净单一亚型β-酪蛋白作为标准品，实现标准品的准备以用于色谱检测分析未知奶样中β-酪蛋白是否为A1或A2亚型及其含量。

进一步，β-酪蛋白通过以下分离纯化方法制备得到，具体制备过程包括以下步骤：

(B1)将已知A1-β-酪蛋白牛奶、已知A2-β-酪蛋白牛奶或者普通牛奶，1-6℃冷冻离心，取下层脱脂奶升温至30-35℃，调节pH＝11-11.5，搅拌，加入钙盐溶液使奶样中钙离子浓度为0.05-0.07mol/L。

(B2)调节pH＝7.0-7.5，离心，倾倒上层清液，加入20-60mL水搅拌至固体蛋白呈乳浊液，离心，倾倒上清液，再次加入20-60mL水搅拌至固体蛋白呈乳浊液，离心，倾倒上清液。

(B3)将固体蛋白加入80-150mL pH＝11-12的碱性水溶液，搅拌溶解，降温至1-6℃，保温1-5h，优选2h。

(B4)调节pH＝4.55-4.65，1-6℃冷冻离心，收集上清液，升温至28-34℃，保持10-50min。

(B5)离心，收集沉淀，用水洗涤，丙酮洗涤，30-50℃烘干或者冷冻干燥，得到A1-β-酪蛋白或A2-β-酪蛋白，冷冻保存。

优选地，分别采用已知A1-β-酪蛋白牛奶、已知A2-β-酪蛋白牛奶提取纯化得到A1-β-酪蛋白、A2-β-酪蛋白标准品。

β-酪蛋白分离纯化过程中，通过基因型鉴定为A2和A1的牛所产的奶作为原料，利用酪蛋白的等电点沉淀、Ca²⁺离子敏感、β-酪蛋白低温地酸游离三种特性组合，经过脱脂、水洗、离心，调节pH重新溶解分散等处理方法，实现精确筛选提取纯化β-酪蛋白。首先，将牛奶脱脂，调节pH＝11左右，使得牛奶蛋白充分溶解。然后加入钙盐溶液，选用0.05-0.07mol/L钙盐溶液，相应使得钙离子浓度控制在此范围内，既可以完全让αs-酪蛋白和β-酪蛋白容易与钙离子结合沉淀，又不会沉淀κ-酪蛋白，实现精确筛选沉淀的作用。然后，通过两次水洗使得未沉淀的乳清蛋白和乳糖等水溶性成分和钙离子沉淀下来的酪蛋白分离开。然后，再次调节pH＝11-12，搅拌重新溶解，降温1-6℃并保温一段时间，离心处理，水洗、丙酮洗涤处理，使得αs-酪蛋白和β-酪蛋白相互分离，最终得到高品质β-酪蛋白纯净品。选择已知A1、A2亚型的牛奶作为原料，通过上述分离方法快速分理得到高纯度A1、A2亚型纯净品的β-酪蛋白，可用于添加应用或分析研究。

经鉴定A1、A2亚型β-酪蛋白纯净度均达到83％以上，满足A1、A2亚型β-酪蛋白定性或定量检测分析要求，并且可以对所得β-酪蛋白产物进一步提纯得到更高纯度的标准品，更好的应用于精密定量分析。

进一步，步骤B1、使用氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液调节pH＝11。氢氧化钠或氢氧化钾溶液具有良好的稳定性，仅实现调节pH的功能，不影响酪蛋白本身的结构稳定性，分离所得产物用于检测分析更加有利。优选地，氢氧化钠或氢氧化钾溶液浓度为0.1-2mol/L。pH值适宜，浓度适宜，调节pH过程中添加用量适中。

进一步，步骤B1、所述钙盐溶液是氯化钙溶液。氯化钙溶液稳定，钙离子游离性好，容易与酪蛋白结合沉淀，且阴离子不发生副反应。

优选地，步骤B1、加入氯化钙使奶样中氯化钙浓度为0.065mol/L。氯化钙浓度调节在此范围内最有利于钙离子和β-酪蛋白络合沉淀，实现初步筛分提取。

进一步，步骤B1、A1-β-酪蛋白牛奶200mL、A2-β-酪蛋白牛奶或普通牛奶200mL，2℃冷冻离心，取下层脱脂奶升温至30摄氏度，用1mol/L氢氧化钠溶液调节奶样pH＝11，搅拌条件下加入适量0.5mol/L氯化钙溶液使最终奶样中氯化钙浓度为0.065mol/L。

优选地，牛奶样品原料选用新鲜A1-β-酪蛋白牛奶200mL或新鲜A2-β-酪蛋白牛奶。

进一步，步骤B2、添加盐酸溶液调节pH＝7.0-7.4。用盐酸溶液中和S1调节pH时加入强碱溶液，中和效率高，更有利于待提取分离组分的稳定。

优选地，步骤B2、每次加入30-40mL纯净水搅拌至固体蛋白呈乳浊液。每次用少量纯净水充分搅拌洗涤至乳浊液形态，通过强烈搅拌将夹杂在沉淀的酪蛋白中的乳糖、乳清蛋白等杂质成分有效的去除。重复纯净水搅拌洗涤两次，实现最佳的洗涤效果。

进一步，步骤B2、1mol/L盐酸调节pH＝7，4000r/min离心10min，倾倒上层清液，加入30mL纯水强力搅拌至固体蛋白呈乳浊液，4000r/min离心10min，倾倒上清液，再次加入30mL纯水强力搅拌至固体蛋白呈乳浊液，4000r/min离心10min，倾倒上清液。通过纯水洗涤除去残余的水溶性乳清蛋白、乳糖等。

进一步，步骤B3、pH＝11-12的碱性水溶液是氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。同步骤1一样采用稳定性好的碱液调节pH，对于分离酪蛋白的效果更好。

优选地，步骤B3、添加的80-150mL pH＝11的碱性水溶液，该水溶液是氢氧化钠或氢氧化钾溶液。

进一步，步骤B3、将固体蛋白转移至200mL烧杯中，加入100mL pH＝11的碱性水溶液，搅拌至蛋白溶液完全，保持搅拌的条件下将蛋白溶液降至2℃，保温2h。

进一步，步骤B4、用盐酸溶液调节pH＝4.58-4.62，优选使用1mol/L或0.5mol/L盐酸调节。同步骤B2用盐酸调节pH，调节效果好，稳定性优。

优选地，步骤B4、收集上清液升温至30-32℃，保持20-40min。

进一步，步骤B4、用0.5-1mol/L盐酸调节pH＝4.58-4.62，冷冻离心(2℃、6000r/min)8-12min收集上清液至另一干净烧杯中，水浴条件下将上清液升温至30℃，保持30min。

进一步，步骤B5、常温条件下(温度不得低于15℃)6000r/min离心10min，收集沉淀，用适量纯水洗涤固体两次，丙酮洗涤两次，45℃条件下烘干或者冷冻干燥，得到β-酪蛋白(纯度83％左右)-20℃冷冻保存。产物β-酪蛋白是A1-β-酪蛋白、A2-β-酪蛋白或混合酪蛋白，根据原料选用已知的A1、A2牛奶可以得到相应的纯净品A1-β-酪蛋白、A2-β-酪蛋白。

进一步，步骤B5、分离得到的A1-β-酪蛋白或A2-β-酪蛋白的纯度80-95％，优选80-88％之间。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1.本发明检测分析方法可以实现对于普通牛奶中A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白亚型状态检测分析研究，通过预处理以及色谱条件多因素调整协同，实现对于两种A1、A2亚型充分分离、快速检测的目的，进而结合标准品进行快速判断牛乳原料是否属于纯品A2-β-酪蛋白亚型牛乳。

2.本发明检测分析方法可以替代现有基因检测分析方法，简化检测分析研究的难度，利用现有设备仪器实现高品质牛乳分析诊断研究，弥补奶牛基因检测过程复杂，成本高昂的不足。

3.本发明方法还可以直接用于市售乳制品检测判定，用于评价市售乳制品中β-酪蛋白类型及含量是否符合标识宣传。

4.本发明检测方法中还提供提取A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白方法，利用酪蛋白几种不同的特性按照一定顺序进行配合促进，实现其中β-酪蛋白的筛分提纯，筛分酪蛋白的效率较高，且筛分所得产品纯净度高，满足HPLC色谱检测分析应用的要求。

5.本发明检测方法中还提供提取β-酪蛋白的方法，对于天然牛乳中多种成分重要特性充分利用，仅通过简单的pH值调节、离心、冷冻等处理实现了分离目的。分离过程中采用的试剂均为实验室常见试剂原料，实施全新的分离纯化技术难度小，分离效率高，方便普通实验室应用实施，实现对于牛乳中A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白分离纯化。

附图说明：

图1：sigmaβ-酪蛋白的HPLC图谱。

图2：提纯A2-β-酪蛋白的HPLC图谱。

图3：sigmaαs-酪蛋白的HPLC图谱。

图4：sigmaκ-酪蛋白的HPLC图谱。

图5：A2牛奶样品的HPLC图谱。

图6：A2牛奶样品的HPLC图谱。

图7：普通牛奶样品的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

<实施例1>

A1-β-酪蛋白提纯

新鲜A1-β-酪蛋白牛奶200mL，2℃冷冻离心，取下层脱脂奶升温至30摄氏度，用1mol/L氢氧化钠溶液调节奶样pH＝11.0，搅拌条件下加入适量0.5mol/L氯化钙溶液使最终奶样中氯化钙浓度为0.065mol/L，1mol/L盐酸调节pH＝7.0，6000r/min离心10min，倾倒上层清液，加入30mL纯水强力搅拌至固体蛋白呈乳浊液，6000r/min离心10min，倾倒上清液，再次加入30mL纯水强力搅拌至固体蛋白呈乳浊液，3000r/min离心15min，倾倒上清液。将固体蛋白转移至200mL烧杯中，加入100mL pH＝11.0氢氧化钠溶液，搅拌至蛋白溶液完全，保持搅拌的条件下将蛋白溶液降至2℃，保温2h。用0.5mol/L盐酸调节pH＝4.6，冷冻离心(2℃、8000r/min)10min收集上清液至另一干净烧杯中，水浴条件下将上清液升温至30℃，保持30min。常温条件下(温度不得低于15℃)6000r/mi离心10min，收集沉淀，用适量纯水洗涤固体两次，丙酮洗涤两次，45℃条件下烘干或者冷冻干燥，得到A1-β-酪蛋白-20℃冷冻保存。经过检测，所得到A1-β-酪蛋白纯度83％。

<实施例2>

A2-β-酪蛋白提纯

新鲜A2-β-酪蛋白牛奶200mL，3℃冷冻离心，取下层脱脂奶升温至30℃，用1mol/L氢氧化钾溶液调节奶样pH＝11.5，搅拌条件下加入适量0.5mol/L氯化钙溶液使最终奶样中氯化钙浓度为0.066mol/L，1mol/L盐酸调节pH＝7.0，6000r/min离心12min，倾倒上层清液，加入30mL纯水强力搅拌至固体蛋白呈乳浊液，6000r/min离心8min，倾倒上清液，再次加入30mL纯水强力搅拌至固体蛋白呈乳浊液，6000r/min离心8min，倾倒上清液。将固体蛋白转移至200mL烧杯中，加入100mL pH＝11.0氢氧化钾溶液，搅拌至蛋白溶液完全，保持搅拌的条件下将蛋白溶液降至2℃，保温2h。用1mol/L盐酸调节pH＝4.6，冷冻离心(2℃、6000r/min)10min收集上清液至另一干净烧杯中，水浴条件下将上清液升温至30℃，保持30min。常温条件下6000r/mi离心10min，收集沉淀，用适量纯水洗涤固体两次，丙酮洗涤两次，45℃条件下烘干或者冷冻干燥，得到A2-β-酪蛋白-20℃冷冻保存。经过检测，所得到A2-β-酪蛋白纯度86％。

<实施例3>

A1-β-酪蛋白提纯

新鲜A1-β-酪蛋白牛奶200mL，1℃冷冻离心，取下层脱脂奶升温至32℃，用1mol/L氢氧化钠溶液调节奶样pH值至11.2，搅拌条件下加入适量0.8mol/L氯化钙溶液使最终奶样中氯化钙浓度为0.068mol/L，1mol/L盐酸调节pH＝7.0，4000r/min离心10min，倾倒上层清液，加入30mL纯水强力搅拌至固体蛋白呈乳浊液，4000r/min离心10min，倾倒上清液，再次加入30mL纯水强力搅拌至固体蛋白呈乳浊液，4000r/min离心10min，倾倒上清液。将固体蛋白转移至200mL烧杯中，加入100mL pH＝11.0氢氧化钠溶液，搅拌至蛋白溶液完全，保持搅拌的条件下将蛋白溶液降至1℃，保温4h。用1mol/L盐酸调节pH＝4.6，冷冻离心(2℃、6000r/min)10min收集上清液至另一干净烧杯中，水浴条件下将上清液升温至30℃，保持30min。常温条件下(温度不得低于15℃)6000r/mi离心10min，收集沉淀，用适量纯水洗涤固体两次，丙酮洗涤两次，42℃条件下烘干或者冷冻干燥，得到A2-β-酪蛋白-20℃冷冻保存。经过检测，所得到A1-β-酪蛋白纯度84％。

<实施例4>

A2-β-酪蛋白提纯

(1)新鲜A2-β-酪蛋白牛奶200mL，2℃冷冻离心，取下层脱脂奶升温至30℃，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH＝11.0，搅拌条件下加入适量0.5mol/L氯化钙溶液使最终奶样中氯化钙浓度为0.063mol/L，搅拌混合均匀。

(2)用1mol/L盐酸调节pH＝7.0，4000r/min离心10min，倾倒上层清液，加入30mL纯水强力搅拌至固体蛋白呈乳浊液，4000r/min离心10min，倾倒上清液，再次加入30mL纯水强力搅拌至固体蛋白呈乳浊液，4000r/min离心10min，倾倒上清液。

(3)将固体蛋白转移至200mL烧杯中，加入100mL pH＝11.0氢氧化钠溶液，搅拌至蛋白溶液完全，保持搅拌的条件下将蛋白溶液降至2℃，保温2h。用1mol/L(或0.5mol/L)盐酸调节pH＝4.6，冷冻离心(2℃、6000r/min)10min收集上清液至另一干净烧杯中，水浴条件下将上清液升温至30℃，保持30min。

(4)常温条件下(温度不得低于15℃)6000r/mi离心10min，收集沉淀，用适量纯水洗涤固体两次，丙酮洗涤两次，45℃条件下烘干或者冷冻干燥，得到A2-β-酪蛋白，-20℃冷冻保存。经过检测，所得到A2-β-酪蛋白纯度86％左右。

<检测分析例>

准备：sigmaβ-酪蛋白标准品、实施例4提纯A2-β-酪蛋白。

称取上述酪蛋白标准品1mg至三个1.5mL离心管中，加入500μL缓冲液，涡旋混匀，6000r/min离心15s，室温下静置1H。6000r/min离心10min。加入490μL缓冲液(4.5mol/L盐酸胍)，加入10μLβ-巯基乙醇，涡旋混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测。

色谱检测：

色谱参数如下，色谱柱：ZORBAX 300A Stalle Bond 300SB-C8 4.6*250 5μm，采用梯度洗脱程序进行洗脱，流动相A：0.1％三氟乙酸、流动相B：0.1％乙腈，洗脱程序：

时间/min	流动相A/％	流动相B/％	流速/mL/min
				0	75.7	24.3	1
2	71.2	28.8	1
				17	64.8	35.2	1
30	61.8	38.2	1
				45	55.0	45.0	1
48	46.0	54.0	1
				53	46.0	54.0	1
55	75.7	24.3	1
				65	75.7	24.3	1

进样量：50μL；

柱温：40℃；

检测波长：241nm。

检测结果如图1、2所示，图1显示sigmaβ-酪蛋白标准品HPLC图谱中出现两个β-酪蛋白峰，表明其含有A1、A2亚型β-酪蛋白。图2是实施例4提取纯化的A2-β-酪蛋白标准品HPLC图谱，HPLC图谱中仅出现单一峰，峰形对称性好，无前延或拖尾，适合作为标准品使用。

<对比例1>

A2-β-酪蛋白提纯

取实施例4相同的A2牛奶原料，进行同样提纯处理，只是步骤1脱脂奶加入氢氧化钠调节pH＝9、12，其余工序不变，提取纯化得到A2-β-酪蛋白，-20℃冷冻保存。考察不同的pH值对于提取纯化A2-β-酪蛋白的影响。

经检测前述调节pH＝9的情况下，A2-β-酪蛋白纯度86％，收率相比实施例4降低36％。

经检测前述调节pH＝12的情况下，A2-β-酪蛋白纯度83％，收率相比实施例4降低8％。

由此可知脱脂奶加入氢氧化钠调节pH的时候，调节至11左右更有利于提取纯化得到更多的A2-β-酪蛋白。

<对比例2>

A2-β-酪蛋白提纯

取实施例4相同的A2牛奶原料，进行同样的提纯处理，只是步骤1加入氯化钙溶液以后控制奶样中氯化钙浓度0.03mol/L、0.1mol/L，其余工序不变。

检测发现，制备得到的A2-β-酪蛋白纯度和氯化钙添加用量存在一定关系，氯化钙添加量控制为浓度0.03mol/L的情况下，产物纯度89％，收率相比于实施例4降低47％，难以有效的提取牛奶中的A2酪蛋白。氯化钙浓度0.1mol/L氯化钙添加量的情况下，产物纯度74％，收率为实施例4的105％，过量的氯化钙使得κ-酪蛋白混合沉淀，影响了后续的分离处理。

<对比例3>

A2-β-酪蛋白提纯

取实施例4相同的A2牛奶原料，进行同样的提纯处理，只是步骤2两次用纯水洗改为乙醇洗涤，用量为30mL。经检测，A2-β-酪蛋白纯度72％，且收率相比实施例4降低26％。

本发明提纯处理A2牛奶样品过程中，对于两次使用纯水洗涤并充分搅拌呈乳浊液，使得乳糖、乳清蛋白等易溶于水的成分快速洗去，改用乙醇洗涤以后，对于杂质成分洗脱效率大幅度降低，且收率也降低了，提取得到的A2-β-酪蛋白难以满足HPLC色谱检测标准品要求。

通过上述对比例1-3分析可以确定本发明A2-β-酪蛋白提纯方法具有高效率、高精度优势，能够方便的提取制备得到最佳纯净度的A2-β-酪蛋白标准品。相比于其他调整变化参数后的提取方式而言，具有更高的提取回收率以及更优的纯度，更适合用作HPLC检测分析中的A1-β-酪蛋白、A2-β-酪蛋白标准品使用。

<实施例5>

乳制品中酪蛋白含量的检测

1.准备样品和标准品：

1.1样品前处理

配制缓冲液：7mol/L尿素、0.5％β-巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris。

移取200μL经过脱脂的A2牛乳至1.5mL离心管中，加入600μL缓冲液，涡旋混匀1min，室温静置放置1h，6000r/min离心10min。取下清液，加入缓冲液定容至1mL，混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测。

1.2标准品前处理

外购sigma公司的αs-酪蛋白、β-酪蛋白(A1、A2混合)、κ-酪蛋白标准品。实施例4制备的A2-β-酪蛋白标准品(纯度86％)。

精密称取αs-酪蛋白、β-酪蛋白(混合)、A2-β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品各1mg至三个1.5mL离心管中，加入500μL缓冲液，溶解充分，混合均匀；加入缓冲液定容至1mL，混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测。

S2、色谱检测：

采用高效液相色谱依次检测标准品和样品，根据标准品中各个酪蛋白的保留时间，确定样品中相应酪蛋白成分的保留时间以及峰面积，计算各种酪蛋白的含量。

色谱参数如下：

色谱柱：ZORBAX 300A Stalle Bond 300SB-C8 4.6*250 5μm

采用梯度洗脱程序进行洗脱，流动相A：0.1％三氟乙酸、流动相B：0.1％乙腈，洗脱程序：

进样量：50μL；柱温：40℃；检测波长：241nm。

检测结果：

标准品HPLC图谱结果如图1-4所示，其中标准品sigmaβ-酪蛋白和实施例4制备的A2-β-酪蛋白标准品图谱为上述检测分析中图1-2结果(相同色谱条件，采用上述测试例数据)，图3是sigmaαs-酪蛋白，图4是sigmaκ-酪蛋白，采用和上述实验相同的色谱条件测试得到图谱。

由图谱可以看出sigma公司的β-酪蛋白、αs-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品，以及A2-β-酪蛋白标准品，在上述HPLC参数条件下，峰形对称性、无前伸峰、拖尾峰、双肩峰等，峰形良好，有着较大的分离系数，各种酪蛋白保留时间相互间隔时间较为适宜，可以用于定性/定量检测分析研究。

样品测试结果如图5所示，A2牛奶样品仅出现A2-β-酪蛋白单峰，测试结果与实际情况一致。牛奶样品经过预处理以后，各种酪蛋白成分提取充分，且在上机检测过程中多种酪蛋白相互分离效果好，各个响应峰相互之间无干扰。

<实施例6>

乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测

采用与实施例5相同的HPLC仪器及参数进行检测分析，只是样品准备过程中参数控制和实施例1略有不同，具体如下：

1.1样品前处理：

配制缓冲液：6mol/L尿素、0.6％β-巯基乙醇、18mmol/L Bis-Tris。

移取150μL经过脱脂的牛乳至1.5mL离心管中，加入800μL缓冲液，涡旋混匀5min，室温静置放置2h。9000r/min离心5min。取下清液500μL至另一干净1.5mL离心管中，加入缓冲液定容，混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测。

1.2标准品前处理

标准品同实施例5。

检测结果显示牛乳中含有β-酪蛋白1.13g/100mL。测试结果准确，在一定范围内调整缓冲液的配合比例不影响最终测试结果的准确性。

<对比例4>

乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测

采用与实施例5相同的HPLC仪器及参数进行检测分析，测试相同的牛乳样品，只是样品的准备过程和实施例5不同：样品前处理过程中采用6mol/L尿素、20mmol/L Bis-Tris的混合溶液代替缓冲液进行样品前处理。

测试结果显示采用不含β-巯基乙醇的溶液代替缓冲液的情况下，检测分析结果远远小于实施例5测试结果，表明酪蛋白提取不充分，测试结果不准确。

<对比例5>

乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测

采用与实施例5相同的HPLC仪器及参数进行检测分析，测试与实施例5相同的牛乳样品，只是配制缓冲液配方不同于实施例5。分别尝试以下三种情况的缓冲液配方，分析不同的缓冲液配方对于检测分析结果的影响：

方案A：3mol/L尿素、0.6％β-巯基乙醇、18mmol/L Bis-Tris。

方案B：12mol/L尿素、0.6％β-巯基乙醇、18mmol/L Bis-Tris。

方案C：6mol/L尿素、0.6％β-巯基乙醇、30mmol/L Bis-Tris。

测试结果：

尿素含量为3mol/L的方案A测试结果的酪蛋白整体含量较低，仅实施例5测试结果的2/3左右，表明尿素含量过少的情况下，检测值明显降低，测试结果不准确性。

尿素含量为12mol/L的方案B测试结果的酪蛋白含量和实施例5测试结果基本相当，增加的尿素并没有提高提取效率，表明6mol/L尿素在混合溶液起到了充分提取酪蛋白的作用，更高的尿素不能提高测试结果数据，属于无意义的增加。同时，测试结果还显示过多的尿素影响HPLC分析峰形，对于定量测试不利。

方案C中Bis-Tris含量较高，理论上对于酪蛋白的溶解稳定性更加有利，但测试结果得到的牛乳中蛋白质含量比实施例5测试结果低10％左右，与实际知己结果有明显差距，所以Bis-Tris添加用量并非越高越好。

<实施例6>

乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测

采用与实施例5相同的HPLC仪器及参数进行检测分析，标准品配制过程中将β-酪蛋白标准品采用实施例3-4提取纯化的A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白，新增两项单独的A1、A2-β-酪蛋白纯净品标准品。

牛奶样品选用市售已知A2牛奶(只含有单纯的A2-β-酪蛋白)，经过实施例1相同的样品前处理以及检测分析流程，结果如图6所示，A2牛奶样品仅出现A2-β-酪蛋白单峰，测试结果与实际情况一致。

<试验例1>

牛奶鉴定分析

取液体牛奶样品，2℃6000r/min离心10min，取中间清液200μL，加入600μL缓冲液(同

实施例1，下同)，涡旋混匀10min，常温下静置1H。6000r/min离心10min，取下层清液500μL加入到1.5mL离心管中，加入缓冲液定容，涡旋混匀后，经过0.45μm PTFE过滤至进样小瓶中上机检测，标准品准备同实施例5，检测结果比对A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白标准品出峰时间和峰面积，确定奶样β-酪蛋白基因型及其含量。普通牛奶中β-酪蛋白为A2和A1混合型，结果如图7所示，普通牛奶样品中包含了A1和A2两种β-酪蛋白色谱峰，检测结果与实际一致。

<试验例2>

牛奶鉴定分析

取普通全脂奶粉1g加入10mL温度为50-60℃的水，充分溶解后，2℃6000r/min离心10min，取中间清液200μL，加入600μL缓冲液，涡旋混匀后常温下静置1H。6000r/min离心10min，取下层清液500μL加入到1.5mL离心管中，加入缓冲液定容，涡旋混匀后，经过0.45μmPTFE过滤至进样小瓶中上机检测，标准品准备同实施例5，检测结果比对A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白标准品出峰时间和峰面积，确定奶样β-酪蛋白基因型及其含量。普通奶粉中β-酪蛋白为A2和A1混合型，检测结果与实际一致。

<试验例3>

牛奶鉴定分析

取A2牛奶200μL，加入600μL缓冲液，涡旋混匀后常温静置1H。16000g/min离心10min，取下层清液500μL加入到1.5mL离心管中，加入缓冲液定容，涡旋混匀后，经过0.45μmPTFE过滤至进样小瓶中上机检测，标准品准备同实施例5，检测结果比对A2-β-酪蛋白标准品出峰时间和峰面积，确定奶样β-酪蛋白基因型及其含量，其中β-酪蛋白出峰时间和实施例提取制备的A2-β-酪蛋白出峰时间一致，检测结果与理论一致。

<试验例4>

牛奶鉴定分析

取市售A2奶样200μL，加入600μL缓冲液，涡旋混匀后常温静置1H。16000g/min离心10min，取下层清液500μL加入到1.5mL离心管中，加入缓冲液定容，涡旋混匀后，经过0.45μmPTFE过滤至进样小瓶中上机检测，标准品准备同实施例5，和A2-β-酪蛋白标准品出峰时间和峰面积比对，确定奶样β-酪蛋白基因型为A2，并计算得出A-β-酪蛋白含量为0.86g/100mL，检测结果与理论一致。

Claims (11)

1.一种乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，包括以下步骤：

S1、准备样品和标准品：

101样品准备：如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳离心脱脂；加入缓冲液，涡旋混匀，静置10-120min，离心5-20min；取下清液，加入缓冲液定容，混匀，用0.45μmPTFE滤膜过滤过滤，待上机检测；

102标准品准备：称取αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品各1mg至三个1.5mL离心管中，加入缓冲液，溶解均匀，加入缓冲液定容，过滤，得到已知酪蛋白浓度的待上机检测的标准品；

S2、色谱检测：

采用高效液相色谱依次检测标准品和样品，根据标准品中各个酪蛋白的保留时间，确定样品中相应酪蛋白成分的保留时间以及峰面积，计算各种酪蛋白的含量；

色谱参数如下：

色谱柱：ZORBAX 300A Stalle Bond 300SB-C8 4.6*250 5μm；

采用梯度洗脱程序进行洗脱，流动相A：0.1％三氟乙酸、流动相B：0.1％乙腈，洗脱程序：

时间/min 流动相A/％ 流动相B/％ 流速/mL/min 0 75.7 24.3 1 2 71.2 28.8 1 17 64.8 35.2 1 30 61.8 38.2 1 45 55.0 45.0 1 48 46.0 54.0 1 53 46.0 54.0 1 55 75.7 24.3 1 65 75.7 24.3 1

进样量：50μL；

柱温：40℃；

检测波长：241nm；

所述β-酪蛋白通过以下分离纯化方法制备得到，具体制备过程包括以下步骤：

(B1)将已知A1-β-酪蛋白牛奶或已知A2-β-酪蛋白牛奶，1-6℃冷冻离心，取下层脱脂奶升温至30-35℃，调节pH＝11-11.5，搅拌，加入钙盐溶液使奶样中钙离子浓度为0.05-0.07mol/L；

(B2)调节pH＝7.0-7.5，离心，倾倒上层清液，加入20-60mL水搅拌至固体蛋白呈乳浊液，离心，倾倒上清液，再次加入20-60mL水搅拌至固体蛋白呈乳浊液，离心，倾倒上清液；

(B3)将固体蛋白加入80-150mL pH＝11-12的碱性水溶液，搅拌溶解，降温至1-6℃，保温1-5h；

(B4)调节pH＝4.55-4.65，1-6℃冷冻离心，收集上清液，升温至28-34℃，保持10-50min；

(B5)离心，收集沉淀，用水洗涤，丙酮洗涤，30-50℃烘干或者冷冻干燥，得到A1-β-酪蛋白或A2-β-酪蛋白，冷冻保存。

2.如权利要求1所述乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述缓冲液是含有6-8mol/L尿素、0.3-0.8％β-巯基乙醇、17-18mmol/L Bis-Tris的混合液。

3.如权利要求1所述乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，其特征在于，S1准备样品和标准品过程如下：

101样品前处理

移取150-250μL经过脱脂的牛乳至1.5-2mL离心管中，加入600-800μL缓冲液，涡旋混匀1-5min，室温静置放置0.5-2h；4000-9000r/min离心5-20min；取下清液400-500μL至另一干净1.5-2mL离心管中，加入缓冲液定容，混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测；

所述缓冲液是含有6-8mol/L尿素、0.3-0.8％β-巯基乙醇、17-18mmol/L Bis-Tris的混合液。

4.如权利要求1所述乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，其特征在于，102标准品前处理：

称取αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品各1mg至三个1.5mL离心管中，加入400-500μL缓冲液，混匀；加入缓冲液定容至1mL，混匀，用0.45μm PTFE滤膜过滤过滤，待上机检测。

5.如权利要求1所述乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，其特征在于，步骤B3，保温2h。

6.如权利要求1所述乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，其特征在于，步骤B1、使用氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液调节pH＝11。

7.如权利要求1所述乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，其特征在于，步骤B1、所述钙盐溶液是氯化钙溶液。

8.如权利要求1所述乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，其特征在于，步骤B3、添加的80-150mL pH＝11的碱性水溶液，该水溶液是氢氧化钠或氢氧化钾溶液。

9.如权利要求1所述乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，其特征在于，步骤B1、A1-β-酪蛋白牛奶200mL、A2-β-酪蛋白牛奶或普通牛奶200mL，2℃冷冻离心，取下层脱脂奶升温至30摄氏度，用1mol/L氢氧化钠溶液调节奶样pH＝11，搅拌条件下加入适量0.5mol/L氯化钙溶液使最终奶样中氯化钙浓度为0.065mol/L。

10.如权利要求1所述乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，其特征在于，步骤B5、分离得到的A1-β-酪蛋白或A2-β-酪蛋白的纯度80-95％。

11.如权利要求10所述乳制品中A2-β-酪蛋白含量的检测方法，其特征在于，步骤B5、分离得到的A1-β-酪蛋白或A2-β-酪蛋白的纯度80-88％之间。