CN108414628A - 一种牛奶中A2-β-酪蛋白的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛乳中A2‑β‑酪蛋白的检测方法，首先分别检测了已经通过基因型鉴定为A1型和A2型的牛奶的高效液相色谱图，并与αs‑酪蛋白、β‑酪蛋白和κ‑酪蛋白标准品的高效液相色谱图进行比对，确定出了A1‑β‑酪蛋白和A2‑β‑酪蛋白的色谱峰型及出峰时间，进而能够定性检测出未知牛奶中β‑酪蛋白是否为A2‑β‑酪蛋白；然后成功地从A2型牛奶中分离出了A2‑β‑酪蛋白，并测得A2‑β‑酪蛋白在高效液相中峰面积与浓度的对应关系，进而能够定量检测出未知牛奶中A2‑β‑酪蛋白的含量；本发明所涉及的检测方法简单、便捷，适宜于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种牛奶中A2-β-酪蛋白的检测方法。
背景技术
酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白质，占牛乳蛋白含量的80％左右。根据氨基酸组成和电泳行为的不同，酪蛋白可分为αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占牛乳酪蛋白总量的30-35％。β-酪蛋白又存在多种变体，最常见的是A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白，两者的区别在于氨基酸链的第67位存在变异，前者为组氨酸，后者为脯氨酸。研究发现，A1-β-酪蛋白在生物体内会水解产生β-酪啡肽(BCM-7)，该活性肽能够导致缺血性心脏病、动脉粥样硬化、I型糖尿病、新生儿猝死症及一些精神方面的疾病，因此含有A2-β-酪蛋白的乳制品更加健康安全，在国内外市场上也更受欢迎。
由于奶牛的基因决定了所产牛乳中β-酪蛋白是A1型或者A2型，所以目前主要通过牛只基因鉴定法来判断牛乳中β-酪蛋白的种类，该法不能判断未知奶牛基因型的牛乳样品，尤其是市售牛乳产品中β-酪蛋白的种类。现有的酪蛋白分析检测方法，利用高效液相色谱仪、凝胶电泳仪或者毛细管电泳仪等，仅能检测出αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，无法判断出β-酪蛋白的A1或A2型，而且在前处理中分离纯化酪蛋白的步骤繁琐、耗时长、花费高昂。因此，迫切需要一种对未知奶样中β-酪蛋白的高效、便捷提纯分离方法，以及利用常规检测仪器就能准确、快速检定出其中β-酪蛋白种类的方法。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的就是提供便捷廉价的A2-β-酪蛋白的检测检定方法。
本发明提供了一种牛奶中A2-β-酪蛋白的检测方法，包括：
对A1型牛奶和A2型牛奶进行高效液相测试，其中A1型牛奶和A2型牛奶是经过多次常规基因检测法所确定，众所周知，A1型牛奶中的β-酪蛋白只有A1-β-酪蛋白，A2型牛奶中的β-酪蛋白只有A2-β-酪蛋白，这是由奶牛的基因型所决定，将所得高效液相色谱图分别与αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白标准品的高效液相谱图做对比，识别A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白的特征峰和出峰时间，其中β-酪蛋白标准品并不能确定为A1型或者A2型，目前也没有市售的A2-β-酪蛋白；结合待测牛奶的高效液相谱图定性检测其中β-酪蛋白的类型，即通过其中β-酪蛋白的峰形、出峰时间等判断其为A1-β-酪蛋白或者A2-β-酪蛋白或者两者的混合物。
优选的是，所述检测方法还包括：
分离出A2型牛奶中的A2-β-酪蛋白并进行高效液相检测，获得A2-β-酪蛋白在高效液相中峰面积与浓度的对应关系，结合待测牛奶的高效液相谱图定量检测其中A2-β-酪蛋白的含量。
优选的是，所述A1型牛奶、A2型牛奶、αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、A2-β-酪蛋白以及待测牛奶在相同的条件下进行高效液相色谱测试，色谱条件如下：
色谱柱Vydac Everest C18 Column，250×4.6mm，5μm,
进样量50μL；
柱温40℃；
检测波长241nm，辅助280nm；
洗脱时间65min，流速1mL/min；
流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A是质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B是质量分数为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液；洗脱程序：
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ | 流速/mL·min-1 |
| 0 | 75.7 | 24.3 | 1 |
| 2 | 71.2 | 28.8 | 1 |
| 17 | 64.8 | 35.2 | 1 |
| 30 | 61.8 | 38.2 | 1 |
| 45 | 55.0 | 45.0 | 1 |
| 48 | 46.0 | 54.0 | 1 |
| 53 | 46.0 | 54.0 | 1 |
| 55 | 75.7 | 24.3 | 1 |
| 65 | 75.7 | 24.3 | 1 |
优选的是，所述A1型牛奶、A2型牛奶、αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和待测牛奶在进行高效液相测试之前经过前处理；
其中，所述αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的前处理包括如下步骤：
1)向1.5mL离心管中加入1mg待测样品，以及500μL由6mol/L盐酸胍、0.1mol/LBis-Tris、5.37mmol/L二水柠檬酸钠组成的缓冲溶液，涡旋均匀后，在6000r/min下离心15s，室温静置1h；
2)将离心管在6000r/min下离心10min，加入490μL的4.5mol/L盐酸胍和10μL的β-巯基乙醇，涡旋均匀后用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于上机测试；
所述A1型牛奶、A2型牛奶和待测牛奶的前处理包括如下步骤：
1)向1.5mL离心管中加入200μL待测样品，以及600μL由6mol/L盐酸胍、0.1mol/LBis-Tris、5.37mmol/L二水柠檬酸钠组成的缓冲溶液，涡旋均匀后室温静置1h；
2)将离心管在6000r/min下离心10min，留取下清液500μL并转移至另一1.5mL离心管；向下清液中加入490μL的4.5mol/L盐酸胍和10μL的β-巯基乙醇，涡旋均匀后用0.45μmPTFE滤膜过滤，滤液即可用于上机测试。
优选的是，所述A1型牛奶、A2型牛奶、αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、A2-β-酪蛋白以及待测牛奶在相同的条件下进行高效液相色谱测试，色谱条件如下：
色谱柱ZORBAX 300A StableBond 300SB-C8，250×4.6mm，5μm,
进样量50μL；
柱温40℃；
检测波长214nm；
洗脱时间65min，流速1mL/min；
流动相由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成。
优选的是，所述A1型牛奶、A2型牛奶、αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和待测牛奶在进行高效液相测试之前经过前处理，包括下述步骤：
1)向1.5mL离心管中加入1mg或200μL待测样品，以及600μL缓冲液，在6000r/min下离心10min；
2)取下清液500μL并转移至另一1.5mL离心管，并向其中加入500μL缓冲液，涡旋混匀后用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于上机测试；
其中，所述待测样品中的牛奶为脱脂牛奶或者正常牛奶；
所述缓冲溶液由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成。
优选的是，所述A1型牛奶、A2型牛奶、αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和待测牛奶在进行高效液相测试之前经过前处理，即向1.5mL离心管中加入1mg或200μL待测样品，以及800μL缓冲液，在6000r/min下离心10min，取下清液，用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于上机测试；
其中，所述待测样品中的牛奶为脱脂牛奶或者正常牛奶；
所述缓冲溶液由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成。
优选的是，所述分离出A2型牛奶中的A2-β-酪蛋白的步骤如下：
1)将A2型牛奶脱脂，边搅拌边用盐酸调节pH值到4-5，并将该脱脂奶置于50℃水浴锅中保温10min，然后常温离心分层，保留沉淀；用pH值为4-5的酸溶液冲洗离心管两次，弃去上清液，保留沉淀；
2)向沉淀中加入pH值为4-5的酸溶液，并不断搅拌至呈乳浊液；将该乳浊液降温至2-4℃并继续搅拌12-16h，离心分层，留取上清液；
3)将上清液用200目滤布过滤，收集滤液；将该滤液水浴升温至30℃，涡旋混匀后冷冻干燥，即得到目标蛋白，在-20℃冷冻保存目标蛋白。
优选的是，所述步骤1)中盐酸浓度为0.8-1mol/L；所述步骤1)和步骤2)中离心时间5min，转速4000r/min。
对本发明及其有益效果的阐述：本发明分别检测了已经通过基因型鉴定为A1型和A2型的牛奶的高效液相色谱图，并与Sigma品牌αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白标准品的高效液相色谱图进行比对，确定出了A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白的色谱峰型及出峰时间，进而能够定性检测出未知牛奶中β-酪蛋白是A1-β-酪蛋白还是A2-β-酪蛋白还是两者的混合；然后成功地从A2型牛奶中分离出了A2-β-酪蛋白，并测得A2-β-酪蛋白在高效液相中峰面积与浓度的对应关系，进而能够定量检测出未知牛奶中A2-β-酪蛋白的含量。
为了定量检测乳制品中β-酪蛋白的类型及A2-β-酪蛋白的含量，必须要获得高纯度的A2-β-酪蛋白用作标样，然而由于工艺或者成本等因素，市场上并没有售卖A2-β-酪蛋白的标准化商品，致使在A2-β-酪蛋白定量检测方面存在一定的技术空白；因此本发明中还提供了A2-β-酪蛋白的分离方法，分离纯度能达到85％，提纯工艺简单、成本低，克服了现有技术中β-酪蛋白分离时间长、步骤繁琐以及耗费高昂的问题，为检测乳制品中β-酪蛋白种类提供了条件，也使本发明所涉及的检测方法更加适宜于大规模推广应用。
附图说明
图1-图3依次为购买的Sigma品牌αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白标准样品的高效液相色谱图；
图4为A1型牛奶的高效液相色谱图；
图5为A2型牛奶的高效液相色谱图；
图6为样品牛奶的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图详细阐述检测牛乳中A2-β-酪蛋白的方法，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本案中测试所用高效液相色谱仪为安捷伦1260。
实施例1
1)标准品前处理及检测：称取购买的Sigma品牌αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品各1mg至三个1.5mL离心管中，加入500μL缓冲液(由6mol/L盐酸胍、0.1mol/L Bis-Tris、5.37mmol/L二水柠檬酸钠组成)，涡旋混匀，以6000r/min离心15s，室温下静置1h；然后再以6000r/min离心10min，离心后加入490μL的4.5mol/L盐酸胍和10μL的β-巯基乙醇，涡旋混匀；最后用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于高效液相色谱仪检测；
αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品的色谱出峰图依次为附图中的图1、图2和图3，从图中可以清晰地看出，αs-酪蛋白的出峰时间在38-39min、κ-酪蛋白的出峰时间在20-21min、β-酪蛋白的出峰时间在41-42min，但无法判断该β-酪蛋白是A1型还是A2型或者两者混合物；
2)A1型或A2型牛奶前处理及检测：移取200μL经脱脂的牛奶至1.5mL离心管中，加入600μL缓冲液(由6mol/L盐酸胍、0.1mol/L Bis-Tris、5.37mmol/L二水柠檬酸钠组成)，涡旋混匀1min，室温下静置1h；然后再以6000r/min离心10min，取下清液500μL至另一干净的1.5mL离心管中，加入490μL的4.5mol/L盐酸胍和10μL的β-巯基乙醇，涡旋混匀，用0.45μmPTFE滤膜过滤，滤液即可用于高效液相色谱仪检测；
A1型和A2型牛奶的色谱出峰图分别为图4和图5，对照图1-3，能够清楚的识别出各自αs-酪蛋白、β-酪蛋白以及κ-酪蛋白的色谱峰；图4和图5中β-酪蛋白的色谱峰出峰时间不一致，A1型牛奶中的A1-β-酪蛋白的出峰时间在42min，A2型牛奶中的A2-β-酪蛋白的出峰时间在43min，说明本测试的色谱条件下A1-β-酪蛋白较A2-β-酪蛋白先出峰；再次对照图2中的β-酪蛋白标准品标准色谱图，能够判断其不含或者含极少量A2-β-酪蛋白；
3)A2-β-酪蛋白的分离纯化：将200mL新鲜A2型牛奶在2℃冷冻离心，取下层脱脂奶；在磁力搅拌条件下用1mol/L盐酸调节脱脂奶pH值至4.6(±0.02)，并将该脱脂奶置于50℃水浴锅中保温10min；然后在常温条件下以4000r/min离心5min，弃去上清液，保留沉淀；用pH为4.6的弱酸溶液冲洗离心管两次，弃去上清液，保留沉淀；向沉淀中加入pH值为4.6的酸溶液，并不断搅拌至呈乳浊液；将该乳浊液降温至4℃，且在4℃下搅拌12-16h、以4000r/min离心5min，取上清液；将上清液用200目的滤布过滤，收集滤液；将该滤液水浴升温至30℃，涡旋混匀后冷冻干燥，即得到目标蛋白并在-20℃冷冻保存，目标蛋白的纯度在75-85％之间。
将提纯得到的A2-β-酪蛋白在与步骤1)和步骤2)相同的条件下进行高效液相色谱测试，得到峰面积与浓度关系，进而用于定量检测样品奶中A2-β-酪蛋白的含量；
4)待测牛奶样品及其中β-酪蛋白的检测：首先对待测牛奶样品进行前处理，处理方法与步骤2)中相同，然后进行高效液相色谱检测，色谱出峰图如图6，对照图1-图3能够清楚的识别出αs-酪蛋白、β-酪蛋白以及κ-酪蛋白的色谱峰，其中，该牛乳样品在42-43min先后出现了两个β-酪蛋白峰，根据上文的分析，对照图4、图5可识别出先出的峰为A1-β-酪蛋白色谱峰、后出的峰为A2-β-酪蛋白色谱峰，从而初步判断出本牛乳样品中β-酪蛋白为A1型和A2型的混合；同时，根据步骤3)所得的A2-β-酪蛋白在高效液相中峰面积与浓度关系，能够计算出牛奶样品中A2-β-酪蛋白的含量。
其中，实施例1的色谱条件如下：
色谱柱Vydac Everest C18 Column，250×4.6mm，5μm,
进样量50μL；
柱温40℃；
检测波长241nm，辅助280nm；
洗脱时间65min，流速1mL/min；
流动相A：0.1wt％三氟乙酸水溶液；流动相B：0.1wt％三氟乙酸乙腈溶液；
洗脱程序：
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ | 流速/mL·min-1 |
| 0 | 75.7 | 24.3 | 1 |
| 2 | 71.2 | 28.8 | 1 |
| 17 | 64.8 | 35.2 | 1 |
| 30 | 61.8 | 38.2 | 1 |
| 45 | 55.0 | 45.0 | 1 |
| 48 | 46.0 | 54.0 | 1 |
| 53 | 46.0 | 54.0 | 1 |
| 55 | 75.7 | 24.3 | 1 |
| 65 | 75.7 | 24.3 | 1 |
实施例2
1)标准品前处理及检测：称取购买的Sigma品牌αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品各1mg至三个1.5mL离心管中，加入600μL缓冲液(由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成)，在6000r/min离心10min；取下清液500μL并转移至另一1.5mL离心管，并向其中加入500μL前述缓冲液，涡旋混匀后用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于高效液相色谱仪检测，得到αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品的色谱出峰图；
2)A1型或A2型牛奶前处理及检测：移取200μL经脱脂或者不脱脂的牛奶至1.5mL离心管中，加入600μL缓冲液(由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成)在6000r/min离心10min；取下清液500μL并转移至另一1.5mL离心管，并向其中加入500μL前述缓冲液，涡旋混匀后用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于高效液相色谱仪检测，得到A1型和A2型牛奶的色谱出峰图；
3)与实施例1中步骤3)相同；
4)与实施例1中步骤4)相同；
其中，实施例2的色谱条件如下：
色谱柱ZORBAX 300A StableBond 300SB-C8，250×4.6mm，5μm,
进样量50μL；
柱温40℃；
检测波长214nm；
洗脱时间65min，流速1mL/min；
流动相由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成。
实施例3
1)标准品前处理及检测：称取购买的Sigma品牌αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品各1mg至三个1.5mL离心管中，加入800μL缓冲液(由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成)，在6000r/min离心10min，取下清液，用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于高效液相色谱仪检测，得到αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白标准品的色谱出峰图；
2)A1型或A2型牛奶前处理及检测：移取200μL经脱脂或者不脱脂的牛奶至1.5mL离心管中，加入800μL缓冲液(由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成)，在6000r/min离心10min，取下清液，用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于高效液相色谱仪检测，得到A1型和A2型牛奶的色谱出峰图；
3)与实施例1中步骤3)相同；
4)与实施例1中步骤4)相同；
其中，实施例2的色谱条件如下：
色谱柱ZORBAX 300A StableBond 300SB-C8，250×4.6mm，5μm,
进样量50μL；
柱温40℃；
检测波长214nm；
洗脱时间65min，流速1mL/min；
流动相由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。
Claims (9)
1.一种牛奶中A2-β-酪蛋白的检测方法，其特征在于，包括：
对A1型牛奶和A2型牛奶进行高效液相测试，将所得高效液相色谱图分别与αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白标准品的高效液相谱图做对比，识别A1-β-酪蛋白和A2-β-酪蛋白的特征峰和出峰时间；结合待测牛奶的高效液相谱图定性检测其中β-酪蛋白的类型。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括：
分离出A2型牛奶中的A2-β-酪蛋白并进行高效液相检测，获得A2-β-酪蛋白在高效液相中峰面积与浓度的对应关系，结合待测牛奶的高效液相谱图定量检测其中A2-β-酪蛋白的含量。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述A1型牛奶、A2型牛奶、αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、A2-β-酪蛋白以及待测牛奶在相同的条件下进行高效液相色谱测试，色谱条件如下：
色谱柱Vydac Everest C18Column，250×4.6mm，5μm,
进样量50μL；
柱温40℃；
检测波长241nm，辅助280nm；
洗脱时间65min，流速1mL/min；
流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A是质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B是质量分数为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液；洗脱程序：
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述A1型牛奶、A2型牛奶、αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和待测牛奶在进行高效液相测试之前经过前处理；
其中，所述αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的前处理包括如下步骤：
1)向1.5mL离心管中加入1mg待测样品，以及500μL由6mol/L盐酸胍、0.1mol/L Bis-Tris、5.37mmol/L二水柠檬酸钠组成的缓冲溶液，涡旋均匀后，在6000r/min下离心15s，室温静置1h；
2)将离心管在6000r/min下离心10min，加入490μL的4.5mol/L盐酸胍和10μL的β-巯基乙醇，涡旋均匀后用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于上机测试；
所述A1型牛奶、A2型牛奶和待测牛奶的前处理包括如下步骤：
1)向1.5mL离心管中加入200μL待测样品，以及600μL由6mol/L盐酸胍、0.1mol/L Bis-Tris、5.37mmol/L二水柠檬酸钠组成的缓冲溶液，涡旋均匀后室温静置1h；
2)将离心管在6000r/min下离心10min，留取下清液500μL并转移至另一1.5mL离心管；向下清液中加入490μL的4.5mol/L盐酸胍和10μL的β-巯基乙醇，涡旋均匀后用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于上机测试。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述A1型牛奶、A2型牛奶、αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、A2-β-酪蛋白以及待测牛奶在相同的条件下进行高效液相色谱测试，色谱条件如下：
色谱柱ZORBAX 300A StableBond 300SB-C8，250×4.6mm，5μm,
进样量50μL；
柱温40℃；
检测波长214nm；
洗脱时间65min，流速1mL/min；
流动相由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述A1型牛奶、A2型牛奶、αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和待测牛奶在进行高效液相测试之前经过前处理，包括下述步骤：
1)向1.5mL离心管中加入1mg或200μL待测样品，以及600μL缓冲液，在6000r/min下离心10min；
2)取下清液500μL并转移至另一1.5mL离心管，并向其中加入500μL缓冲液，涡旋混匀后用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于上机测试；
其中，所述待测样品中的牛奶为脱脂牛奶或者正常牛奶；
所述缓冲溶液由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述A1型牛奶、A2型牛奶、αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和待测牛奶在进行高效液相测试之前经过前处理，即向1.5mL离心管中加入1mg或200μL待测样品，以及800μL缓冲液，在6000r/min下离心10min，取下清液，用0.45μm PTFE滤膜过滤，滤液即可用于上机测试；
其中，所述待测样品中的牛奶为脱脂牛奶或者正常牛奶；
所述缓冲溶液由7mol/L尿素、0.5％β巯基乙醇、17.5mmol/L Bis-Tris组成。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述分离出A2型牛奶中的A2-β-酪蛋白的步骤如下：
1)将A2型牛奶脱脂，边搅拌边用盐酸调节pH值到4-5，并将该脱脂奶置于50℃水浴锅中保温10min，然后常温离心分层，保留沉淀；用pH值为4-5的酸溶液冲洗离心管两次，弃去上清液，保留沉淀；
2)向沉淀中加入pH值为4-5的酸溶液，并不断搅拌至呈乳浊液；将该乳浊液降温至2-4℃并继续搅拌12-16h，离心分层，留取上清液；
3)将上清液用200目滤布过滤，收集滤液；将该滤液水浴升温至30℃，涡旋混匀后冷冻干燥，即得到目标蛋白，在-20℃冷冻保存目标蛋白。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中盐酸浓度为0.8-1mol/L；所述步骤1)和步骤2)中离心时间5min，转速4000r/min。
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