JPH05133938A - アガロースゲル電気泳動によるグリコシル化ヘモグロビンＨｂ Ａｌｃの分離法 - Google Patents
アガロースゲル電気泳動によるグリコシル化ヘモグロビンＨｂ Ａｌｃの分離法Info
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- JPH05133938A JPH05133938A JP4024679A JP2467992A JPH05133938A JP H05133938 A JPH05133938 A JP H05133938A JP 4024679 A JP4024679 A JP 4024679A JP 2467992 A JP2467992 A JP 2467992A JP H05133938 A JPH05133938 A JP H05133938A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】非グリコシル化ならびに他の種類のグリコシル
化のヘモグロビンからグルコシル化ヘモグロビンＨｂＡ
ｌｃをうまく分離でき、異常ヘモグロビンとの干渉を示
さず、かつ、分離後に濃度測定で構成成分を分析可能に
する電気泳動法を提供する。 【構成】１０ｇのアガロースを強く攪拌しながら蒸溜水
８３０ｍｌ中に投入する。混合物を９５度Ｃまで徐々に
加熱し、５５度Ｃ付近に冷却する。攪拌しながら１種ま
たは幾つかの酸と、１種または数種の塩基ならびに保存
料薬物を含む濃縮溶液１７０ｍｌを加え、硫酸コンドロ
イチンと、所望のゲル特性を与える添加剤を添加する。
均質化後、適当な支持体上にアガロースゲルをキャスト
する。得られたゲルから余剰の緩衝液を除去し、全血液
または赤血球の溶血物を電気泳動の一般法に従って加え
サンプル中のヘモグロビンの百分率を定量する。
化のヘモグロビンからグルコシル化ヘモグロビンＨｂＡ
ｌｃをうまく分離でき、異常ヘモグロビンとの干渉を示
さず、かつ、分離後に濃度測定で構成成分を分析可能に
する電気泳動法を提供する。 【構成】１０ｇのアガロースを強く攪拌しながら蒸溜水
８３０ｍｌ中に投入する。混合物を９５度Ｃまで徐々に
加熱し、５５度Ｃ付近に冷却する。攪拌しながら１種ま
たは幾つかの酸と、１種または数種の塩基ならびに保存
料薬物を含む濃縮溶液１７０ｍｌを加え、硫酸コンドロ
イチンと、所望のゲル特性を与える添加剤を添加する。
均質化後、適当な支持体上にアガロースゲルをキャスト
する。得られたゲルから余剰の緩衝液を除去し、全血液
または赤血球の溶血物を電気泳動の一般法に従って加え
サンプル中のヘモグロビンの百分率を定量する。
Description
【０００１】本発明はグリコシル化されていないヘモグ
ロビンのみならず、例えばＨｂ ＡｌａやＨｂ Ａｌｂ
のようなグリコシル化した他の類型のヘモグロビンや胎
児期のヘモグロビンや、場合によっては異常ヘモグロビ
ンから、グルコースＨｂ Ａｌｃによって、血液サンプ
ル中に存在するグリコシル化したヘモグロビンの分離を
可能ならしめるアガロースゲル上で実施される電気泳動
法に関するものである。
ロビンのみならず、例えばＨｂ ＡｌａやＨｂ Ａｌｂ
のようなグリコシル化した他の類型のヘモグロビンや胎
児期のヘモグロビンや、場合によっては異常ヘモグロビ
ンから、グルコースＨｂ Ａｌｃによって、血液サンプ
ル中に存在するグリコシル化したヘモグロビンの分離を
可能ならしめるアガロースゲル上で実施される電気泳動
法に関するものである。
【０００２】本発明の方法によって分離した後、従来の
濃度測定（densitometric ）分析によって、サンプル中
に存在する各類型のヘモグロビンの百分率を定量するこ
とができる。
濃度測定（densitometric ）分析によって、サンプル中
に存在する各類型のヘモグロビンの百分率を定量するこ
とができる。
【０００３】患者の糖尿病の動向の監視は血液中のグル
コースの量の検査によって実施することができる。しか
し、この量の変動は特に迅速であることが知られてい
る。グルコースの定量が与えてくれるのは患者の血糖値
についての一時的な情報に限られ、したがって、分析前
の数週間の血統値の変動は反映しない。
コースの量の検査によって実施することができる。しか
し、この量の変動は特に迅速であることが知られてい
る。グルコースの定量が与えてくれるのは患者の血糖値
についての一時的な情報に限られ、したがって、分析前
の数週間の血統値の変動は反映しない。
【０００４】更に、周知の如く、グリコシル化ヘモグロ
ビンＨｂ Ａｌの定量が反映するのは血液サンプルの採
血前２ケ月間に亘る患者の平均血液グルコース濃度であ
る。
ビンＨｂ Ａｌの定量が反映するのは血液サンプルの採
血前２ケ月間に亘る患者の平均血液グルコース濃度であ
る。
【０００５】この理由により、グリコシル化〔グリコ化
（glycated）ともいう〕ヘモグロビンの定量はしばしば
医療分析実験室において使用される。
（glycated）ともいう〕ヘモグロビンの定量はしばしば
医療分析実験室において使用される。
【０００６】ヘモグロビンはヘム基を有する４個のペプ
チド鎖からなる。正常な成人被験者の主要なヘモグロビ
ンはヘモグロビンＡであり、これは２個のα鎖と２個の
β鎖から構成されている。
チド鎖からなる。正常な成人被験者の主要なヘモグロビ
ンはヘモグロビンＡであり、これは２個のα鎖と２個の
β鎖から構成されている。
【０００７】ヘモグロビンＡｌｃは各β鎖のＮ末端バリ
ンの遊離ＮＨ2 末端にグルコースを結合することにより
ヘモグロビンＡのβ鎖の非酵素グリコシル化によって形
成される。
ンの遊離ＮＨ2 末端にグルコースを結合することにより
ヘモグロビンＡのβ鎖の非酵素グリコシル化によって形
成される。
【０００８】生化学分析の示すところによると、このＨ
ｂ Ａｌｃ画分には１モルのグルコースが１モルのヘモ
グロビン当り含まれている。
ｂ Ａｌｃ画分には１モルのグルコースが１モルのヘモ
グロビン当り含まれている。
【０００９】全グリコシル化ヘモグロビンＡｌはまたＡ
ｌａ、Ａｌｂ、Ａｌｄ、Ａｌｅ画分も含んでいる。Ａｌ
ａ画分にはリン酸化されていないグルコースの代りにグ
ルコース−６−リン酸塩が含まれており、他の３画分に
ついては現在まだ良く知られていないが、これらの画分
と血糖平衡との間には相関関係があるとは思われない。
ｌａ、Ａｌｂ、Ａｌｄ、Ａｌｅ画分も含んでいる。Ａｌ
ａ画分にはリン酸化されていないグルコースの代りにグ
ルコース−６−リン酸塩が含まれており、他の３画分に
ついては現在まだ良く知られていないが、これらの画分
と血糖平衡との間には相関関係があるとは思われない。
【００１０】様々な方法がグリコシル化ヘモグロビンを
分離するため使用される。
分離するため使用される。
【００１１】幾つかのクロマトグラフ法が、得られる結
果の見地からは満足な結果を与えるが、一般に遅くて経
費が高くつく。
果の見地からは満足な結果を与えるが、一般に遅くて経
費が高くつく。
【００１２】例えば、適当な２種類の緩衝液を用いて溶
離して、アガロースゲルに結合したｍ−アミノフエニル
ホウ酸に結合するグリコシル化ヘモグロビンの特性を利
用してアフイニテイクロマトグラフ法を実施することは
公知である。
離して、アガロースゲルに結合したｍ−アミノフエニル
ホウ酸に結合するグリコシル化ヘモグロビンの特性を利
用してアフイニテイクロマトグラフ法を実施することは
公知である。
【００１３】弱酸性のカチオン交換樹脂上でのクロマト
グラフ法によれば、種々異なるイオン強度及びｐＨの緩
衝液を用いて溶離により異なるヘモグロビン画分を分離
することができる。このような技法は例えば特許ＵＳ−
Ａ−４３９４９１及びＵＳ−Ａ−４４０７９６１に記述
されている。これらのクロマトグラフ法は温度変化に敏
感であり、かつ、各分析はしばしば胎児期のヘモグロビ
ン（ＨｂＦ）または異常ヘモグロビン（ＨｂＳ，Ｈｂ
Ｃ）を含むサンプルの場合エラーがある。
グラフ法によれば、種々異なるイオン強度及びｐＨの緩
衝液を用いて溶離により異なるヘモグロビン画分を分離
することができる。このような技法は例えば特許ＵＳ−
Ａ−４３９４９１及びＵＳ−Ａ−４４０７９６１に記述
されている。これらのクロマトグラフ法は温度変化に敏
感であり、かつ、各分析はしばしば胎児期のヘモグロビ
ン（ＨｂＦ）または異常ヘモグロビン（ＨｂＳ，Ｈｂ
Ｃ）を含むサンプルの場合エラーがある。
【００１４】高性能液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）
の与える結果は良好であり、大量分析を可能ならしめる
自動化した高価な分析装置がある。
の与える結果は良好であり、大量分析を可能ならしめる
自動化した高価な分析装置がある。
【００１５】電気泳動技法の中には、ｐＨの勾配におけ
るポリアクリルアミドゲル上のそれらの等電点に応じ
て、ヘモグロビンの各成分を電気的に分離することは公
知である（等電点電気泳動による分離）。この方法によ
れば異常ヘモグロビンを検出することができるが、Ｈｂ
ＦはＨｂ Ａｌｃに干渉し、同じ点に移動する。更に濃
度測定分析をこの方法に適用するのは難しい。注目すべ
きことはＨｂＡｌｃ／ＨｂＦの干渉によって特に起るの
は妊婦の糖尿病の監視の場合の問題である。
るポリアクリルアミドゲル上のそれらの等電点に応じ
て、ヘモグロビンの各成分を電気的に分離することは公
知である（等電点電気泳動による分離）。この方法によ
れば異常ヘモグロビンを検出することができるが、Ｈｂ
ＦはＨｂ Ａｌｃに干渉し、同じ点に移動する。更に濃
度測定分析をこの方法に適用するのは難しい。注目すべ
きことはＨｂＡｌｃ／ＨｂＦの干渉によって特に起るの
は妊婦の糖尿病の監視の場合の問題である。
【００１６】特許ＵＳ−Ａ−４２２２８３６に述べてあ
るのはクエン酸緩衝液を含む寒天ゲル上のグリコシル化
ヘモグロビンの分離法である。この技法によれば、一方
では非グリコシル化ヘモグロビンＡｏと、他方全部同一
点に移動する集団グリコシル化ヘモグロビンＨｂ Ａｌ
ａ，ｂ，及びｃの分離をすることができる。この方法は
使用寒天の硫酸塩分のきびしい制御が必要である。
るのはクエン酸緩衝液を含む寒天ゲル上のグリコシル化
ヘモグロビンの分離法である。この技法によれば、一方
では非グリコシル化ヘモグロビンＡｏと、他方全部同一
点に移動する集団グリコシル化ヘモグロビンＨｂ Ａｌ
ａ，ｂ，及びｃの分離をすることができる。この方法は
使用寒天の硫酸塩分のきびしい制御が必要である。
【００１７】寒天ゲル上の電気泳動で得られた同様な結
果が次の報文に述べてある。すなわち、Menard L 等
の、Clin. Chem. ２６巻、１０７５頁（１９７９年）に
出ている寒天ゲル電気泳動によるグリコシル化ヘモグロ
ビンＡｌの定量分析と、Clin.Chem. ２７巻３号、４７
２〜４７５頁（１９８１年）に出ている Aleyassine H
等の、グリコシル化ヘモグロビンの寒天ゲル電気泳動測
定；各種ヘモグロビン、高脂血症及び温度の影響があ
る。
果が次の報文に述べてある。すなわち、Menard L 等
の、Clin. Chem. ２６巻、１０７５頁（１９７９年）に
出ている寒天ゲル電気泳動によるグリコシル化ヘモグロ
ビンＡｌの定量分析と、Clin.Chem. ２７巻３号、４７
２〜４７５頁（１９８１年）に出ている Aleyassine H
等の、グリコシル化ヘモグロビンの寒天ゲル電気泳動測
定；各種ヘモグロビン、高脂血症及び温度の影響があ
る。
【００１８】特許ＵＳ−Ａ−４３５１７１１（ J. Ambl
er）が述べている電気泳動法によれば、他のヘモグロビ
ン画分からグリコシル化ヘモグロビンを分離することが
できる。この明細書によれば、硫酸デキストランを血液
サンプルまたは電気泳動緩衝液中に含まれる。使用支持
体は従来の寒天ゲルでもよいしあるいは酢酸セルロース
ゲルでもよい。
er）が述べている電気泳動法によれば、他のヘモグロビ
ン画分からグリコシル化ヘモグロビンを分離することが
できる。この明細書によれば、硫酸デキストランを血液
サンプルまたは電気泳動緩衝液中に含まれる。使用支持
体は従来の寒天ゲルでもよいしあるいは酢酸セルロース
ゲルでもよい。
【００１９】本方法の制限事項は、Clin. Chem. １９８
３年；２９巻、３４０〜３４３頁に出ている“可動アフ
イニテイ電気泳動による酢酸セルロース膜上のグリコシ
ル化ヘモグロビンの測定”においてその著者自身（ J.
Ambler）が指摘している。すなわち、胎児期ヘモグロビ
ン（ＨｂＦ）の干渉、Ｈｂ Ａｌａ及びＨｂ Ａｌｂの
非分離、ゲル着色の必要性及びしたがって、全血液につ
いての操作の不可能性である。必要なのは、洗浄した赤
血球の溶血物（ hemolysates）を用いることで、これに
は幾つかの工程の追加と莫大な工数が必要となる。
３年；２９巻、３４０〜３４３頁に出ている“可動アフ
イニテイ電気泳動による酢酸セルロース膜上のグリコシ
ル化ヘモグロビンの測定”においてその著者自身（ J.
Ambler）が指摘している。すなわち、胎児期ヘモグロビ
ン（ＨｂＦ）の干渉、Ｈｂ Ａｌａ及びＨｂ Ａｌｂの
非分離、ゲル着色の必要性及びしたがって、全血液につ
いての操作の不可能性である。必要なのは、洗浄した赤
血球の溶血物（ hemolysates）を用いることで、これに
は幾つかの工程の追加と莫大な工数が必要となる。
【００２０】Clinica. Chemica. Acta. １４２巻、１
２３〜１３０頁（１９８４年）に出ている“アガロース
ゲル上でのアフイニテイ電気泳動によるグリコシル化ヘ
モグロビンの測定”という Aleyassine H の報文に述
べられている同様な技法によれば、同様にして、非グリ
コシル化ヘモグロビンからの集団グリコシル化ヘモグロ
ビンの分離が可能である。これに記載の方法によれば、
アガロースゲルに硫酸デキストランを添加する。電気泳
動後、胎児期のヘモグロビンはグリコシル化ヘモグロビ
ンと同じ点まで移動し、従って干渉が起る。Ｈｂ Ａｌ
ａとＨｂ Ａｌｂは分離されない。
２３〜１３０頁（１９８４年）に出ている“アガロース
ゲル上でのアフイニテイ電気泳動によるグリコシル化ヘ
モグロビンの測定”という Aleyassine H の報文に述
べられている同様な技法によれば、同様にして、非グリ
コシル化ヘモグロビンからの集団グリコシル化ヘモグロ
ビンの分離が可能である。これに記載の方法によれば、
アガロースゲルに硫酸デキストランを添加する。電気泳
動後、胎児期のヘモグロビンはグリコシル化ヘモグロビ
ンと同じ点まで移動し、従って干渉が起る。Ｈｂ Ａｌ
ａとＨｂ Ａｌｂは分離されない。
【００２１】更に、発表者は本報文において、得られる
結果を著しく左右するものは使用する硫酸デキストラン
の発生源であることを指摘している。出願人は、更に、
同じ提供者の同量の硫酸デキストランでもロットが異な
ればこれらの結果は得られなかったし、従って、この技
法の使用には難があることを確認することができた。
結果を著しく左右するものは使用する硫酸デキストラン
の発生源であることを指摘している。出願人は、更に、
同じ提供者の同量の硫酸デキストランでもロットが異な
ればこれらの結果は得られなかったし、従って、この技
法の使用には難があることを確認することができた。
【００２２】したがって、現在のところ出願人の承知す
る限りでは、非グリコシル化ヘモグロビンならびに他の
種類のグリコシル化ヘモグロビンからグリコシル化ヘモ
グロビンＨｂ Ａｌｃをうまく分離することができ、し
かも、胎児期ヘモグロビンＨｂＦのような異常ヘモグロ
ビンとの干渉を示さず、かつ、電気泳動分離後に、濃度
測定で構成成分を分析可能にするような電気泳動法は存
在しない。
る限りでは、非グリコシル化ヘモグロビンならびに他の
種類のグリコシル化ヘモグロビンからグリコシル化ヘモ
グロビンＨｂ Ａｌｃをうまく分離することができ、し
かも、胎児期ヘモグロビンＨｂＦのような異常ヘモグロ
ビンとの干渉を示さず、かつ、電気泳動分離後に、濃度
測定で構成成分を分析可能にするような電気泳動法は存
在しない。
【００２３】本発明の目的は、このような結果を得るこ
とができて、しかも、安価で、実用的で、使い易い電気
泳動法を提供することである。
とができて、しかも、安価で、実用的で、使い易い電気
泳動法を提供することである。
【００２４】本発明のもう一つの目的は、また各種異常
ヘモグロビンの識別もできるような方法を提供すること
でもある。
ヘモグロビンの識別もできるような方法を提供すること
でもある。
【００２５】本発明の更にもう一つの目的は、本発明の
電気泳動法の実施を可能ならしめるアガロースゲルを含
むキットを提供することである。
電気泳動法の実施を可能ならしめるアガロースゲルを含
むキットを提供することである。
【００２６】本発明の目的は、硫酸化多糖類、特に硫酸
コンドロイチンを添加するアガロースゲルを製造する方
法、及びこの方法により得ることができるアガロースゲ
ルにある。
コンドロイチンを添加するアガロースゲルを製造する方
法、及びこの方法により得ることができるアガロースゲ
ルにある。
【００２７】硫酸コンドロイチンは硫酸コンドロイチン
Ａ、硫酸コンドロイチンＢ、硫酸コンドロイチンＣ及び
これらの化合物の２種以上の混合物からなる群から選ぶ
ことができる。
Ａ、硫酸コンドロイチンＢ、硫酸コンドロイチンＣ及び
これらの化合物の２種以上の混合物からなる群から選ぶ
ことができる。
【００２８】使用する硫酸コンドロイチンは各種の動物
種から抽出可能である。その数種類は市場で入手でき
る、例えば、豚の肋骨または皮から、牛の気管または角
膜から、またはサメまたは鯨の軟骨から得ることができ
る。
種から抽出可能である。その数種類は市場で入手でき
る、例えば、豚の肋骨または皮から、牛の気管または角
膜から、またはサメまたは鯨の軟骨から得ることができ
る。
【００２９】単独にあるいは混ぜて使用するこれら各種
の硫酸コンドロイチンを含むゲルによる電気泳動試験の
与えた結果は良好で、それらの発生源には無関係で、そ
れらの分子量にも無関係である。ゲルを観察することに
よりグリコシル化ヘモグロビンＨｂ Ａｌｃを識別する
ことができた。
の硫酸コンドロイチンを含むゲルによる電気泳動試験の
与えた結果は良好で、それらの発生源には無関係で、そ
れらの分子量にも無関係である。ゲルを観察することに
よりグリコシル化ヘモグロビンＨｂ Ａｌｃを識別する
ことができた。
【００３０】硫酸コンドロイチンは平衡化緩衝液に含有
することができるが、その濃度は当該緩衝液の０．１な
いし３％が有利であり、当該緩衝液の０．５ないし１％
が好ましい。緩衝液のｐＨは一般に、５と６の範囲、好
ましくは５．２と５．８の間にある。
することができるが、その濃度は当該緩衝液の０．１な
いし３％が有利であり、当該緩衝液の０．５ないし１％
が好ましい。緩衝液のｐＨは一般に、５と６の範囲、好
ましくは５．２と５．８の間にある。
【００３１】緩衝液にはマレイン酸、フタル酸、２，３
−ピリジンジカルボン酸、コハク酸、二臭化コハク酸、
粘液酸、ジグリコール酸、リンゴ酸及びアジピン酸の中
から選んだ酸、及び下記すなわち、トリス、ＮａＯＨ、
ＫＯＨ、ＤＬ−メチルグルカミン、イミダゾール、及び
ピペラジンから選んだ塩基を含有することができる。
−ピリジンジカルボン酸、コハク酸、二臭化コハク酸、
粘液酸、ジグリコール酸、リンゴ酸及びアジピン酸の中
から選んだ酸、及び下記すなわち、トリス、ＮａＯＨ、
ＫＯＨ、ＤＬ−メチルグルカミン、イミダゾール、及び
ピペラジンから選んだ塩基を含有することができる。
【００３２】勿論、他の許容しうる酸や塩基も使用でき
ることは自明のことである。
ることは自明のことである。
【００３３】好ましくは、硫酸コンドロイチンはゲルが
凝固する以前にアガロースゲルに添加する。ゲルはま
た、硫酸コンドロイチンを含む平衡緩衝液中で平衡させ
ることもできる。
凝固する以前にアガロースゲルに添加する。ゲルはま
た、硫酸コンドロイチンを含む平衡緩衝液中で平衡させ
ることもできる。
【００３４】したがって、たとえば、Beckmann Parago
n （登録商標）ＳＰＥゲルのような硫酸コンドロイチン
を含まないゲルをこの方法で使用して、グリコシル化ヘ
モグロビンＨｂ Ａｌｃを識別することができる、これ
は本発明を逸脱するものではない。平衡化は普通３０分
かかる。
n （登録商標）ＳＰＥゲルのような硫酸コンドロイチン
を含まないゲルをこの方法で使用して、グリコシル化ヘ
モグロビンＨｂ Ａｌｃを識別することができる、これ
は本発明を逸脱するものではない。平衡化は普通３０分
かかる。
【００３５】本発明のもう一つの目的は本発明の方法に
よって得られたアガロースゲルと場合によっては硫酸コ
ンドロイチンを含む平衡化緩衝液と、電気泳動緩衝液か
らなるヘモグロビンの電気泳動用キットにある。好まし
くは、電気泳動緩衝液は、平衡化緩衝液と同じものであ
る（しかし場合によっては硫酸コンドロイチンは含まれ
ていない）。
よって得られたアガロースゲルと場合によっては硫酸コ
ンドロイチンを含む平衡化緩衝液と、電気泳動緩衝液か
らなるヘモグロビンの電気泳動用キットにある。好まし
くは、電気泳動緩衝液は、平衡化緩衝液と同じものであ
る（しかし場合によっては硫酸コンドロイチンは含まれ
ていない）。
【００３６】本発明を下記電気泳動ゲルの実施例（実施
例１ないし７）と使用実施例（実施例８）によって例示
する。
例１ないし７）と使用実施例（実施例８）によって例示
する。
【００３７】実施例 １ないし７（製造） アガロースの標準溶液は次のようにして製造する：１０
ｇのアガロースを強く撹拌しながら蒸留水８３０ｍｌ中
に投入する。混合物は９５℃まで徐々に加熱し、次に、
５５℃付近に冷却する。撹拌しながら１種または幾つか
の酸または酸として挙動する物質と、１種または数種の
塩基ならびに場合によっては、例えばナトリウムアジド
のような保存料薬物を含む濃縮溶液１７０ｍｌを加え
る。
ｇのアガロースを強く撹拌しながら蒸留水８３０ｍｌ中
に投入する。混合物は９５℃まで徐々に加熱し、次に、
５５℃付近に冷却する。撹拌しながら１種または幾つか
の酸または酸として挙動する物質と、１種または数種の
塩基ならびに場合によっては、例えばナトリウムアジド
のような保存料薬物を含む濃縮溶液１７０ｍｌを加え
る。
【００３８】硫酸コンドロイチンと、所望のゲルの特性
（組織と保水性）を与えることのできる公知の添加剤を
この標準溶液に添加する。均質化した後、適当な支持体
上にアガロースゲル（１０×７．５ｃｍのゲル２００な
いし２５０個）キャストする。
（組織と保水性）を与えることのできる公知の添加剤を
この標準溶液に添加する。均質化した後、適当な支持体
上にアガロースゲル（１０×７．５ｃｍのゲル２００な
いし２５０個）キャストする。
【００３９】 実施例 酸 塩 基 アジド 他の成分 硫酸コンド ロイチン ─────────────────────────────────── １ マレイン酸 8.2g トリス11.9g 0.59g ─ 7.84g ２ マレイン酸 9.2g トリス14.5g 1 g ─ 6.51g ３ マレイン酸 8.7g トリス11.8g 0.21g フタル酸水素 10 g カリウム1.3g ４ フタル酸 8.02g トリス10.8g 1 g HOPSO 10.1g 10 g ５ 2,3 ピリジンジ トリス10.9g 1 g MES 5.04g 8.61g カルボン酸 8 g ６ マレイン酸 10 g イミダゾル 0.4 g NaSCN 2 g 5.3 g 5.2g ７ マレイン酸5.47g トリス7.79g ─ フタル酸水素 6.47g カリウム0.82g NaSCN 1.5 g
【００４０】実施例 ８（使用） 実施例１，２及び３に記載の製造法の一つによって得ら
れたゲルをテーブル上に置き、吸い取って余剰の緩衝液
を除去する。全血液または赤血球の溶血物を電気泳動の
一般法に従って加える。次に、ゲルには５０Ｖで２０な
いし４０分、または１００Ｖで１０ないし２０分間、好
ましくは、電気泳動緩衝液に、ゲル製造用のアガロース
標準溶液の製造に用いた酸と塩基を用いて電気泳動を受
けさせる。電気泳動が終ると、ゲルは、蒸留水で洗浄
し、ゲルの支持体は完全にふき取り、そして４１５ｎｍ
で濃度計の読み取りを行い、これによって異常ヘモグロ
ビンの存在を検知することができ、かつサンプル中に存
在する１種以上のヘモグロビンに対するグリコシル化ヘ
モグロビンＨｂ Ａｌｃの百分率を計算することができ
る。
れたゲルをテーブル上に置き、吸い取って余剰の緩衝液
を除去する。全血液または赤血球の溶血物を電気泳動の
一般法に従って加える。次に、ゲルには５０Ｖで２０な
いし４０分、または１００Ｖで１０ないし２０分間、好
ましくは、電気泳動緩衝液に、ゲル製造用のアガロース
標準溶液の製造に用いた酸と塩基を用いて電気泳動を受
けさせる。電気泳動が終ると、ゲルは、蒸留水で洗浄
し、ゲルの支持体は完全にふき取り、そして４１５ｎｍ
で濃度計の読み取りを行い、これによって異常ヘモグロ
ビンの存在を検知することができ、かつサンプル中に存
在する１種以上のヘモグロビンに対するグリコシル化ヘ
モグロビンＨｂ Ａｌｃの百分率を計算することができ
る。
【００４１】別法として、ゲルは乾燥し、次に、乾いた
ら濃度計で読み取ってよい。一変形法としてはゲルを着
色して、低感度の濃度計でこれを読み取り可能にするか
またはこれを保存できるようにしてもよい。この着色を
可能ならしめるのには、蛋白質を着色する試薬を用いる
か（ヘモグロビン以外の蛋白が反応することを考慮し
て）または抗原−抗体特性の使用法を含めてヘモグロビ
ン特異性着色剤を使用する。
ら濃度計で読み取ってよい。一変形法としてはゲルを着
色して、低感度の濃度計でこれを読み取り可能にするか
またはこれを保存できるようにしてもよい。この着色を
可能ならしめるのには、蛋白質を着色する試薬を用いる
か（ヘモグロビン以外の蛋白が反応することを考慮し
て）または抗原−抗体特性の使用法を含めてヘモグロビ
ン特異性着色剤を使用する。
【００４２】実験結果から、特に明かになったことだ
が、本発明によるゲルを使用すれば下記のヘモグロビン
すなわちＨｂ Ａｏ、メトヘモグロビン、Ｈｂ Ａｌ
ｃ、ＨｂＦ、Ｈｂ Ａｌｂ及びＨｂ Ａｌａに相当する
明瞭なバンドを明かにすることができ混同するおそれは
全くない。
が、本発明によるゲルを使用すれば下記のヘモグロビン
すなわちＨｂ Ａｏ、メトヘモグロビン、Ｈｂ Ａｌ
ｃ、ＨｂＦ、Ｈｂ Ａｌｂ及びＨｂ Ａｌａに相当する
明瞭なバンドを明かにすることができ混同するおそれは
全くない。
【００４３】上記の各実施例は本発明の有利な実施態様
を例示してはいるが、発明の範囲を制限するものではな
い。
を例示してはいるが、発明の範囲を制限するものではな
い。
【００４４】硫酸コンドロイチンを含まない電気泳動用
ゲルが例えば Beckman Paragon （登録商標）ＳＰＥゲ
ルである場合、上記の各実施例に述べたような酸や塩基
と硫酸コンドロイチンを含む平衡化緩衝液中でかような
ゲルを例えば３０分間平衡化させても本発明の枠を逸脱
するものではない。本方法の時間が更に長くかかって
も、得られる結果は全く同様である。
ゲルが例えば Beckman Paragon （登録商標）ＳＰＥゲ
ルである場合、上記の各実施例に述べたような酸や塩基
と硫酸コンドロイチンを含む平衡化緩衝液中でかような
ゲルを例えば３０分間平衡化させても本発明の枠を逸脱
するものではない。本方法の時間が更に長くかかって
も、得られる結果は全く同様である。
【００４５】他の硫酸化多糖類を含むアガロースゲルに
硫酸コンドロイチンを添加してもやはり本発明の枠を逸
脱するものではない。
硫酸コンドロイチンを添加してもやはり本発明の枠を逸
脱するものではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０８Ｂ 37/12 Ａ 8615−4Ｃ
Claims (17)
- 【請求項１】 アガロースに硫酸コンドロイチンを添加
することを特徴とするアガロースに硫酸化多糖類を添加
するアガロースゲルの製造法。 - 【請求項２】 硫酸コンドロイチンを硫酸コンドロイチ
ンＡと、硫酸コンドロイチンＢと、硫酸コンドロイチン
Ｃと、これらの化合物の２種または幾つかの混合物を含
む群から選定することを特徴とする請求項１の方法。 - 【請求項３】 硫酸コンドロイチンが、いわゆる平衡化
緩衝液に含まれていることを特徴とする請求項１と２の
何れか１項の方法。 - 【請求項４】 硫酸コンドロイチンが当該緩衝液中０．
１ないし３％の濃度で緩衝液中に存在することを特徴と
する請求項３の方法。 - 【請求項５】 硫酸コンドロイチンが緩衝液中０．５な
いし１％の濃度で当該緩衝液中に存在していることを特
徴とする請求項４の方法。 - 【請求項６】 緩衝液のｐＨが５ないし６であることを
特徴とする請求項３ないし５の何れか１項の方法。 - 【請求項７】 緩衝液のｐＨが５．２ないし５．８であ
ることを特徴とする請求項６の方法。 - 【請求項８】 緩衝液にマレイン酸、フタール酸、２，
３−ピリジンジカルボン酸、コハク酸、ジブロモコハク
酸、粘液酸、ジグリコール酸、リンゴ酸、及びアジピン
酸から選定した酸が含まれていることを特徴とする請求
項３ないし７の何れか１項の方法。 - 【請求項９】 緩衝液に下記のもの、すなわち、トリ
ス、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＤＬ−メチルグルカミン、イミ
ダゾル及びピペラジンから選定した塩基が含まれている
ことを特徴とする請求項３ないし８の何れか１項の方
法。 - 【請求項１０】 硫酸コンドロイチンをゲルが凝固する
前にアガロースに添加することを特徴とする前記請求項
１〜９の何れか１項の方法。 - 【請求項１１】 ゲルを硫酸コンドロイチンを含む平衡
化緩衝液で平衡化させることを特徴とする請求項３ない
し９の何れか１項の方法。 - 【請求項１２】 平衡化したゲルに硫酸コンドロイチン
が含まれていないことを特徴とする請求項１１の方法。 - 【請求項１３】 ゲルを３０分間平衡化させることを特
徴とする請求項１１又は１２の方法。 - 【請求項１４】 請求項１ないし１３の何れか１項の方
法により得ることのできるアガロースゲル。 - 【請求項１５】 請求項１４のアガロースゲルと、場合
によっては硫酸コンドロイチンを含む平衡化緩衝液と、
電気泳動緩衝液とを含むことを特徴とするヘモグロビン
の電気泳動用キット。 - 【請求項１６】 電気泳動用支持媒質として、請求項１
４のアガロースゲルを用いることを特徴とする完全血液
または赤血球のサンプル中に存在する他のヘモグロビン
からグリコシル化ヘモグロビンＨｂ Ａｌｃを分離する
ための電気泳動法。 - 【請求項１７】 電気泳動の支持媒質として使用するこ
とを特徴とするアガロースゲルへの硫酸コンドロイチン
の利用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE9100027A BE1004336A3 (fr) | 1991-01-15 | 1991-01-15 | Procede de separation et de quantification de l'hemoglobine glycosylee hb a1c. |
| BE09100027 | 1991-01-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05133938A true JPH05133938A (ja) | 1993-05-28 |
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Family Applications (1)
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| JP (1) | JPH05133938A (ja) |
| BE (1) | BE1004336A3 (ja) |
| DE (1) | DE69113608T2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008047703A1 (en) * | 2006-10-16 | 2008-04-24 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Hemoglobin determination method |
| EP2352020A2 (en) | 2010-01-19 | 2011-08-03 | Arkray, Inc. | Method for analyzing sample by electrophoresis and use of the same |
| JP2016028234A (ja) * | 2014-07-09 | 2016-02-25 | アークレイ株式会社 | 緩衝剤組成物 |
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| US6582574B1 (en) * | 1999-03-31 | 2003-06-24 | City Of Hope | pK-matched running buffers for gel electrophoresis |
| JP4218261B2 (ja) * | 2002-06-11 | 2009-02-04 | ダイキン工業株式会社 | ポンプユニット |
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| GB0403592D0 (en) | 2004-02-18 | 2004-03-24 | Lucite Int Uk Ltd | A catalyst system |
| GB0411951D0 (en) | 2004-05-28 | 2004-06-30 | Lucite Int Uk Ltd | Carbonylation of ester |
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| WO2007057640A1 (en) | 2005-11-17 | 2007-05-24 | Lucite International Uk Limited | Carbonylation of ethylenically unsaturated compounds |
| GB0607494D0 (en) | 2006-04-13 | 2006-05-24 | Lucite Int Uk Ltd | Metal complexes |
| ES2729615T3 (es) | 2006-12-02 | 2019-11-05 | Lucite Int Uk Ltd | Nuevos ligandos de carbonilación y su uso en la carbonilación de compuestos etilénicamente insaturados |
| GB0625518D0 (en) * | 2006-12-21 | 2007-01-31 | Lucite Int Uk Ltd | Carbonylation of conjugated dienes |
| US20100032297A1 (en) * | 2007-04-27 | 2010-02-11 | Arkray, Inc. | Electrophoresis Chip and Electrophoresis Apparatus |
| GB0812297D0 (en) | 2008-07-04 | 2008-08-13 | Lucite Int Uk Ltd | Novel carbonylation ligand sand thier use of in the carbonylation of ethylenically unsaturated compounds |
| FR2947632B1 (fr) | 2009-07-01 | 2011-11-11 | Sebia Sa | Analyse et dosage d'hemoglobines glyquees par electrophorese capillaire, compositions tampon et kits pour electrophorese capillaire |
| GB201000078D0 (en) | 2010-01-05 | 2010-02-17 | Lucite Int Uk Ltd | Process for the carbonylation of ethylenically unsaturated compounds, novel carbonylation ligands and catalyst systems incorporatng such ligands |
| TWI603772B (zh) * | 2016-05-25 | 2017-11-01 | 中華醫事科技大學 | 血紅素之純化方法及其設備 |
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|---|---|---|---|---|
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| US4351711A (en) * | 1981-04-21 | 1982-09-28 | Gelman Sciences, Inc. | Electrophoresis method for detecting glycosylated hemoglobin in blood |
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| GB8403473D0 (en) * | 1984-02-09 | 1984-03-14 | Special Trustees For St Thomas | Purification of factor viii |
| DE3724726A1 (de) * | 1987-07-25 | 1989-02-02 | Behringwerke Ag | Verfahren zur reinigung des plazentaren gewebeproteins pp4 |
-
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- 1991-01-15 BE BE9100027A patent/BE1004336A3/fr not_active IP Right Cessation
- 1991-12-23 EP EP91870219A patent/EP0495347B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-23 DE DE69113608T patent/DE69113608T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-01-14 JP JP4024679A patent/JPH05133938A/ja active Pending
- 1992-01-15 US US07/821,429 patent/US5246558A/en not_active Expired - Lifetime
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| US8257567B2 (en) | 2006-10-16 | 2012-09-04 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Hemoglobin determination method |
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| JP2016028234A (ja) * | 2014-07-09 | 2016-02-25 | アークレイ株式会社 | 緩衝剤組成物 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| US5246558A (en) | 1993-09-21 |
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