TWI603772B - 血紅素之純化方法及其設備 - Google Patents

Description

血紅素之純化方法及其設備

本發明係有關於一種純化方法及設備，特別是一種血紅素之純化方法及其設備。

血紅素(hemoglobin，又稱血紅蛋白)具有四個球蛋白次單元(globular protein subunit)，每一球蛋白次單元包含有一個血基質(heme)分子，且每一血基質分子具有一個二價鐵離子(Fe ²⁺)。

血紅素在大部分脊椎動物之血管系統與組織之間的氣體交換中起重要作用。其負責將氧經由血液循環自呼吸系統攜帶至身體細胞中且亦攜帶代謝廢物及二氧化碳離開身體細胞至呼吸系統中。由於血紅素具有此氧輸送特性，所以若可在活體外穩定且能使用於活體內，則血紅素可使用為有力的供氧器。

市面上已有包含有血紅素的保健食品。然而，現有純化分離血紅素的製程繁雜、成本高昂且純度不高。因此，本發明所屬技術領域中具有通常知識者持續致力研究如何以較簡便且快速的方式來分離並純化血紅素，或從組織萃取液或樣本中去除血紅素。

有鑑於上述習知技藝的問題，本發明的目的就是在提供一種血紅素之純化方法及其設備，以簡便且快速地從血液中分離並純化血紅素，或從組織萃取液或樣本中去除血紅素。

本發明的血紅素之純化方法，至少包含：提供包含有血紅素的血液樣品；提供填充有螯合瓊脂糖凝膠(Chelating Sepharose Fast Flow)之第一管柱；進行一鍵結步驟，以將血液樣品流過第一管柱，使得血液樣品中的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起；再以PBS緩衝液洗出非特異性鍵結於螯合瓊脂糖凝膠的雜質，待收集液體OD280吸收光值近0時，接著鹼性溶液進行一沖提步驟，藉由沖提鹼性溶液，降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠螯合能力，而使血紅素從第一管柱中分離出來。

前述的螯合瓊脂糖凝膠包含有交聯瓊脂糖珠(cross-linked agarose beads)及亞胺基二乙酸(iminodiacetic acid)。

前述的交聯瓊脂糖珠之濃度係為6%。

其中從第一管柱中分離出來之血紅素係溶解於鹼性溶液中，且於沖提步驟後更進行一中和步驟，藉由酸性溶液來調節溶解有血紅素的鹼性溶液之酸鹼度，而得包含有血紅素之中性溶液。

前述的鹼性溶液為氫氧化鈉，酸性溶液為檸檬酸(citric acid)。

前述的氫氧化鈉之濃度為50mM，檸檬酸之濃度為50mM。

本發明之血紅素之純化方法更包含對中性溶液進行一濃縮步驟，以提高中性溶液中血紅素的濃度。

此外，本發明更揭露一種應用於血紅素之純化方法，或從組織萃取液或樣本中去除血紅素的純化血紅素之設備，至少包含：幫浦；填充有螯合瓊脂糖凝膠之第一管柱；複數個容置槽，這些容置槽內分別設有血液樣品、鹼性溶液及緩衝溶液；以及複數個管線，各管線之兩端係分別連接各容置槽及第一管柱之入口，其中這些容置槽中的液體係藉由幫浦的驅動而經由這些管線依一順序分別流至第一管柱中。

本發明之純化血紅素之設備更包含一第二管柱，其中第二管柱之入口係連通第一管柱之出口。

本發明之純化血紅素之設備更包含一第三管柱，其中第三管柱之入口係連通第二管柱之出口。

承上所述，本發明的血紅素之純化方法及其設備可具有一或多個下述優點：

(1)本發明的血紅素之純化方法，藉由填充於管柱中的螯合瓊脂糖凝膠來與血紅素(配位)鍵結在一起，可分離血液中的血紅素與其他物質，再藉由鹼性溶液來降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的鍵結力，使血紅素從第一管柱中分離出來，可達到純化血紅素之目的。

(2)本發明的血紅素之純化方法，藉由酸性溶液來調節溶解有血紅素的鹼性溶液之酸鹼度，以得到包含有血紅素的中性溶液，再進行濃縮步驟，而能夠獲得高濃度之血紅素。

(3)本發明的血紅素之純化方法，藉由使用螯合瓊脂糖凝膠、鹼性溶液及酸性溶液，而能夠簡便且快速的達到純化血紅素之目的。再者，本發明的血紅素之純化方法亦可運用於將組織萃取液或樣本中的血紅素去除，提升其應用價值。

(4)本發明的純化血紅素之設備，藉由幫浦來驅使容置槽中的液體依一特定順序流至管柱中，以分離血液中的血紅素。

(5)本發明的純化血紅素之設備，藉由使用彼此串聯設置的多個管柱，可較高效率的達到純化血紅素之目的。

茲為使鈞審對本發明的技術特徵及所能達到的技術功效有更進一步的瞭解與認識，謹佐以較佳的實施例及配合詳細的說明如後。

以下將參照附圖，說明本發明的血紅素之純化方法及其設備的實施例，為使便於理解，下述實施例中的相同元件係以相同的符號標示來說明。

請參閱圖1，圖1為本發明的血紅素之純化方法的第一實施例之流程示意圖。如圖1所示，本發明的血紅素之純化方法至少包含下列步驟S10、S20、S30、S40及S50。在步驟S10中，提供包含有血紅素的血液樣品，其中血液樣品可例如為人類血液、鴕鳥血液、豬血液或組織萃取液，但不限定於此，任何含有血紅素之血液樣品或組織萃取液皆可藉由本發明之方法來進行純化。在步驟S20中，提供填充有螯合瓊脂糖凝膠(Chelating Sepharose Fast Flow)之第一管柱。在步驟S30中，進行鍵結步驟，以將血液樣品流過第一管柱，使得血液樣品中的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起。在步驟S40中，進行清洗步驟，藉由將緩衝溶液流過第一管柱，以將血液樣品中非特異性鍵結於螯合瓊脂糖凝膠的雜質從第一管柱中沖洗出來。在步驟S50中，進行沖提步驟，藉由沖提鹼性溶液以降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的鍵結力而使血紅素從第一管柱中分離出來。

在本發明之純化方法中，所選用的螯合瓊脂糖凝膠係購自GE Healthcare Life Sciences。螯合瓊脂糖凝膠為一種生物處理程序(BioProcess)固定化金屬親和性層析法(Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC)介質(medium)，用於純化對金屬離子具有親和力的蛋白質。因此，當蛋白質樣品中包含有金屬離子時(例如血液樣品中包含有二價鐵離子)，在蛋白質樣品流過填充有螯合瓊脂糖凝膠的管柱時，螯合瓊脂糖凝膠會抓住蛋白質，藉以將蛋白質從樣品中分離出來。較佳地，螯合瓊脂糖凝膠不帶有電荷(即電中性)且不包含有金屬離子，因此可以抓取更多的蛋白質，提高蛋白質的純化效率。

在本發明中，螯合瓊脂糖凝膠可例如包含有交聯瓊脂糖珠(cross-linked agarose beads)及亞胺基二乙酸(iminodiacetic acid)。其中，交聯瓊脂糖珠的濃度可例如為6% 交聯瓊脂糖(cross-linked agarose)。而第一管柱之長度可例如為20公分、內徑為1.6公分。螯合瓊脂糖凝膠的成分組合及第一管柱的尺寸並不限定於前述的物質及數值，任何可用以抓取血紅素的物質成分及管柱皆為本發明所請求保護之螯合瓊脂糖凝膠及管柱。

在本發明中，血紅素可以特異性鍵結於螯合瓊脂糖凝膠，而其餘的雜質則非與螯合瓊脂糖凝膠特異性鍵結。詳細來說，第一管柱中的螯合瓊脂糖凝膠僅能與血紅素鍵結在一起(即，螯合瓊脂糖凝膠與血紅素特異性鍵結在一起)，而血液樣品中的其他雜質(在此指血液樣品中非為血紅素的其他物質)則不能與螯合瓊脂糖凝膠特異性鍵結在一起。並且，在使用緩衝溶液進行清洗步驟S40時，不能與螯合瓊脂糖凝膠特異性鍵結在一起的雜質則會被緩衝溶液沖洗出來。前述的緩衝溶液可例如為磷酸緩衝鹽(phosphate buffer saline，PBS)溶液。於進行清洗步驟S40之後或過程中更進行一檢測步驟(圖中未繪示)，以檢測從第一管柱中沖洗出來的雜質(非特異性鍵結於螯合瓊脂糖凝膠的物質)的OD280吸光值是否近0(較佳為0)，若是則進行沖提步驟S50。當所測得之OD280吸光值近於0時，表示從第一管柱中沖洗出來的雜質不含有蛋白質成分，即可使用鹼性溶液進行沖提步驟S50。

請參閱圖2，圖2為本發明的血紅素之純化方法的第二實施例之流程示意圖。如圖2所示，本發明的血紅素之純化方法至少包含下列步驟S10、S20、S30、S40、S50、S60及S70。本發明的第二實施例及第一實施例之差異處僅在於，第二實施例之方法中更包含進行中和步驟S60，藉由酸性溶液來調節溶解有血紅素的鹼性溶液之酸鹼度，而得包含有血紅素之中性溶液。並且，如圖2所示，在本發明之第二實施例中，在進行中和步驟S60之後，更可以對中性溶液進行濃縮步驟S70，以提高中性溶液中血紅素的濃度。

前述的鹼性溶液可例如為氫氧化鈉，而酸性溶液可例如為檸檬酸(citric acid)。鹼性溶液並不限定於氫氧化鈉，任何可用以降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠螯合能力來沖提出管柱中的血紅素的鹼性溶液皆為本發明所請求保護之鹼性溶液。在進行沖提步驟S50中，使用鹼性溶液來沖提第一管柱而使第一管柱中的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的螯合能力降低而令血紅素從第一管柱中分離出來，舉例來說，可以是血紅素溶解於鹼性溶液中而使得血紅素能夠隨著鹼性溶液的沖提過程而從第一管柱中分離出來。而酸性溶液也不限定於檸檬酸，任何可用以調節鹼性溶液之酸鹼度之酸性溶液皆為本發明所請求保護之酸性溶液。

前述的鹼性溶液的使用量可例如為1個管柱體積(column volume)，使用者可經由第一管柱20的尺寸而得知第一管柱20的管柱體積，藉以獲知鹼性溶液的使用量。較佳地，前述氫氧化鈉之濃度可例如為50mM，而檸檬酸之濃度可例如為50mM，但不限定於此。

在步驟S70中，可選用例如冷凍乾燥、超濾(Ultrafiltration)或透析膜等方式來進行濃縮步驟。在進行濃縮步驟S70時，並不限定於前述的方式，任何可用以提高血紅素濃度的方法皆為本發明所請求保護之濃縮步驟。

請接續參閱圖3，圖3為本發明的純化血紅素之設備之示意圖。本發明的純化血紅素之設備可應用於前述的血紅素之純化方法。如圖3所示，本發明的純化血紅素之設備至少包含：幫浦10、第一管柱20、容置槽30, 32, 34以及管線40, 42, 44。第一管柱20中填充有螯合瓊脂糖凝膠。容置槽30內設有血液樣品，容置槽32內設有PBS(phosphate buffered saline)緩衝液，而容置槽34內設有鹼性溶液。各個管線40, 42, 44的兩端分別連接容置槽30, 32, 34及第一管柱20之入口。容置槽30, 32, 34中的液體係藉由幫浦10的驅動而經由管線40, 42, 44依一順序分別流至第一管柱20中。容置槽30, 32, 34中的液體流至第一管柱20的順序可例如依序為血液樣品、PBS緩衝液及鹼性溶液，但不限定於此。使用者也可依照實際需求將PBS緩衝液、血液樣品、PBS緩衝液及鹼性溶液依序流至第一管柱20中。

由於本發明是先將血液樣品流至第一管柱20中以使第一管柱20中的螯合瓊脂糖凝膠與血液樣品中的血紅素鍵結在一起，再使用鹼性溶液來沖提第一管柱20以使第一管柱20中的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的螯合能力降低(例如使血紅素溶解於鹼性溶液中)，來達到分離純化血紅素之目的。因此，須留意的是，容置槽30, 32, 34中的液體流至第一管柱20的順序必須先將血液樣品流至第一管柱20中，再使用鹼性溶液來沖提第一管柱20，而在進行鍵結步驟S30及進行沖提步驟S50之間，使用者可視實際需求選擇使用PBS緩衝液或其他適當的溶劑或者是水來沖提第一管柱20(即進行清洗步驟S40)。

在本發明中，使用者也可選用多個管柱來分離純化血紅素。請參閱圖4，圖4為本發明的純化血紅素之設備之第二實施例之示意圖。如圖4所示，本發明之純化血紅素之設備更可包含有第二管柱22，且第二管柱22之入口係連通第一管柱20之出口。此外，本發明之純化血紅素之設備也可以包含有第三管柱24，且第三管柱24之入口係連通第二管柱22之出口。在本發明之純化血紅素之設備中，第二實施例與第一實施例之差異處僅在於，第二實施例中的管柱之數量為兩個以上。藉此，若是在血液樣品流過第一管柱20時，第一管柱20中的螯合瓊脂糖凝膠抓取血液樣品中的血紅素的鍵結力已達飽和，則從第一管柱20之出口流出的血液樣品可經由管線而接續流至第二管柱22，以使第二管柱22中的螯合瓊脂糖凝膠抓取從第二管柱22之入口流入之血液樣品中的血紅素。同樣的，若是在血液樣品流過第二管柱22時，第二管柱22中的螯合瓊脂糖凝膠抓取血液樣品中的血紅素的鍵結力已達飽和，則從第二管柱22之出口流出的血液樣品可經由管線而接續流至第三管柱24，以使第三管柱24中的螯合瓊脂糖凝膠抓取從第三管柱24之入口流入之血液樣品中的血紅素。在本發明中，螯合瓊脂糖凝膠的鍵結飽和度(binding capacity)為30-37 μmol Cu ²⁺/ml (即，每毫升的螯合瓊脂糖凝膠最多可鍵結30-37微莫耳的二價銅離子)。

此外，如圖3及圖4所示，本發明之純化血紅素之設備更可以包含設有酸性溶液的酸性液槽36，且酸性液槽36經管線46而連通至收集槽38，並藉由幫浦10的驅動而經由管線46將酸性溶液流至收集槽38(為使圖面簡潔，圖中雖未繪示酸性液槽36經由管線連通至收集槽38’及38’’，但本發明所屬技術領域中具有通常知識者應能藉由參閱管線46連接酸性液槽36及收集槽38的方式而理解管線如何連通酸性液槽36及收集槽38’及38’’)。在鹼性溶液流過第一管柱20及/或第二管柱22及/或第三管柱24後，使用者可再藉由酸性溶液來調節溶解有血紅素的鹼性溶液之酸鹼度，以得到包含有血紅素之中性溶液。接著，如前述方法所提及，再藉由冷凍乾燥、超濾(Ultrafiltration)或透析膜等濃縮裝置94來進行濃縮步驟，以提高血紅素於中性溶液中的濃度。最後，得到具高濃度之血紅素溶液或沉澱物。

請參閱圖5，圖5為本發明的純化血紅素之自動化設備之第一實施例之示意圖。如圖5所示，本發明的純化血紅素之自動化設備至少包含：幫浦10、第一管柱20、容置槽30, 32, 34、管線40, 42, 44以及自動化控制裝置50。第一管柱20中填充有螯合瓊脂糖凝膠。容置槽30內設有血液樣品，容置槽32內設有PBS緩衝液，而容置槽34內設有鹼性溶液。各個管線40, 42, 44的兩端分別連接容置槽30, 32, 34及第一管柱20之入口。自動化控制裝置50電性連接幫浦10，以自動地驅動幫浦10運作。容置槽30, 32, 34中的液體係藉由幫浦10的驅動而經由管線40, 42, 44依一順序分別流至第一管柱20中。容置槽30, 32, 34中的液體流至第一管柱20的順序可例如依序為血液樣品、PBS緩衝液及鹼性溶液，但不限定於此。使用者也可依照實際需求將PBS緩衝液、血液樣品、PBS緩衝液及鹼性溶液依序流至第一管柱20中。

同樣的，如前述純化血紅素之設備所提及的，由於容置槽30, 32, 34中的液體流至第一管柱20的順序必須先將血液樣品流至第一管柱20中，再使用鹼性溶液來沖提第一管柱20，而在進行鍵結步驟S30及進行沖提步驟S50之間，使用者可視實際需求選擇使用PBS緩衝液或其他適當的溶劑或者是水來沖提第一管柱20(即進行清洗步驟S40)。

在本發明的純化血紅素之自動化設備中，使用者也可選用多個管柱來分離純化血紅素。請參閱圖6，圖6為本發明的純化血紅素之自動化設備之第二實施例之示意圖。如圖6所示，本發明之純化血紅素之自動化設備更可包含有第二管柱22，且第二管柱22之入口係連通第一管柱20之出口。此外，本發明之純化血紅素之自動化設備也可以包含有第三管柱24，且第三管柱24之入口係連通第二管柱22之出口。在本發明之純化血紅素之自動化設備中，第二實施例與第一實施例之差異處僅在於，第二實施例中的管柱之數量為兩個以上。藉此，若是在血液樣品流過第一管柱20時，第一管柱20中的螯合瓊脂糖凝膠抓取血液樣品中的血紅素的鍵結力已達飽和，則從第一管柱20之出口流出的血液樣品可經由管線而接續流至第二管柱22，以使第二管柱22中的螯合瓊脂糖凝膠抓取從第二管柱22之入口流入之血液樣品中的血紅素。同樣的，若是在血液樣品流過第二管柱22時，第二管柱22中的螯合瓊脂糖凝膠抓取血液樣品中的血紅素的鍵結力已達飽和，則從第二管柱22之出口流出的血液樣品可經由管線而接續流至第三管柱24，以使第三管柱24中的螯合瓊脂糖凝膠抓取從第三管柱24之入口流入之血液樣品中的血紅素。如同純化血紅素之設備所述，在本發明的純化血紅素之自動化設備中，螯合瓊脂糖凝膠的鍵結飽和度(binding capacity)為30-37 μmol Cu ²⁺/ml (即，每毫升的螯合瓊脂糖凝膠最多可鍵結30-37微莫耳的二價銅離子)。

此外，如圖4及圖6所示，本發明之純化血紅素之設備及純化血紅素之自動化設備更可包含有至少一分析切換裝置60，第一管柱20及/或第二管柱22之出口係經由分析切換裝置60而連通第二管柱22及/或第三管柱24之入口。請參閱圖7，圖7為本發明中分析切換裝置之第一態樣之示意圖。如圖7所示，分析切換裝置60可例如包含有光偵測器62及流向切換器64，光偵測器62係於鹼性溶液流至第一管柱20之前依據從第一管柱20之出口流出之液體是否含有血紅素而啟動流向切換器64，以令第二管柱22之入口連通第一管柱20之出口，及/或依據從第二管柱22之出口流出之液體是否含有血紅素而啟動流向切換器64，以令第三管柱24之入口連通第二管柱22之出口。換句話說，若是光偵測器62偵測到從第一管柱20之出口流出之液體含有血紅素，則光偵測器62會啟動流向切換器64，使得第二管柱22之入口連通第一管柱20之出口，而讓從第一管柱20之出口流出之液體接續流至第二管柱22中；而若是藉由光偵測器62偵測從第一管柱20之出口流出之液體不含有血紅素，則光偵測器62不會啟動流向切換器64，因此從第一管柱20之出口流出之液體則會直接流至收集槽38中。同理地，從第二管柱22之出口流出之液體也可以藉由光偵測器62來決定是否啟動流向切換器64，以決定是否直接將液體流至收集槽38’中，或者是接續流至第三管柱24中。

或者，請參閱圖8，圖8為本發明中分析切換裝置之第二態樣之示意圖。如圖8所示，分析切換裝置60也可以包含有流向切換器64，且自動化控制裝置50電性連接該流向切換器64，以自動地調控流向切換器64之開關，以令第二管柱22之入口連通第一管柱20之出口，及/或令第三管柱24之入口連通第二管柱22之出口。藉由自動化控制裝置50來決定是否啟動流向切換器64，以決定是否直接將液體流至收集槽38或38’中，或者是接續流至第二管柱22或第三管柱24中。

如圖5及圖6所示，自動化控制裝置50更可例如包含有輸入裝置70，以設定容置槽30, 32, 34或酸性液槽36中的液體流至第一管柱20的順序、流速及流量。輸入裝置70可例如為控制面板。容置槽30, 32, 34中的液體流至第一管柱20的流速為0.5 mL/min至1 mL/min ，較佳為0.5 mL/min ，流量為1 column volume至10 column volume，容置槽32較佳為10 column volume (column volume = 管柱體積)，容置槽34較佳為1 column volume。此外，本發明的純化血紅素之自動化設備更可包含有至少一電泳裝置80連接第一管柱20、第二管柱22及/或第三管柱24之出口，以分析從第一管柱20、第二管柱22及/或第三管柱24之出口流出之液體(為使圖面簡潔，圖中雖未繪示連接第二管柱22及第三管柱24的電泳裝置80，但本發明所屬技術領域中具有通常知識者應能藉由參閱電泳裝置80如何連接第一管柱20之出口而理解電泳裝置如何連接第二管柱22及第三管柱24之出口)。同樣的，如圖3及圖4所示，本發明的純化血紅素之設備也可以包含有至少一電泳裝置80連接第一管柱20、第二管柱22及/或第三管柱24之出口，以分析從第一管柱20、第二管柱22及/或第三管柱24之出口流出之液體。

此外，本發明的純化血紅素之自動化設備更可包含有影像擷取裝置90以擷取電泳裝置80之分析結果並傳送至顯示裝置92及自動化控制裝置50。影像擷取裝置90可例如為攝影機，顯示裝置92可以是任何可以顯示畫面的顯示器(例如電腦螢幕)。其中電泳裝置80之分析結果可例如以無線或是有線方式傳送至顯示裝置92及自動化控制裝置50，在此並不加以限定。在電泳裝置80之分析結果傳送至自動化控制裝置50後，自動化控制裝置50可依據此分析結果決定是否調整容置槽30, 32, 34或酸性液槽36中的液體流至第一管柱20的順序、流速及流量，或者使用者也可以藉由輸入裝置70來自行調整容置槽30, 32, 34或酸性液槽36中的液體流至第一管柱20的順序、流速及流量。

如圖5及圖6所示，本發明的純化血紅素之自動化設備更可包含有至少一酸性液槽36及至少一濃縮裝置94，且酸性液槽36經管線46而連通至收集槽38，並藉由幫浦10的驅動而經由管線46將酸性溶液流至收集槽38 (為使圖面簡潔，圖中雖未繪示酸性液槽36經由管線連通至收集槽38’及38’’，但本發明所屬技術領域中具有通常知識者應能藉由參閱管線46連接酸性液槽36及收集槽38的方式而理解管線如何連通酸性液槽36及收集槽38’及38’’)。酸性液槽36連接第一管柱20、第二管柱22及/或第三管柱24之出口，以於鹼性溶液流過第一管柱20、第二管柱22及/或第三管柱24之出口後將酸性液槽36中的酸性溶液與從第一管柱20、第二管柱22及/或第三管柱24流出之液體進行中和反應，再藉由濃縮裝置94進行濃縮反應。

在獲得高濃度之血紅素溶液或沉澱物後，可藉由血紅素定量方法來量測血紅素之含量。前述的血紅素定量方法藉由下列方式：血紅素當中的亞鐵離子(Fe ²⁺)會與十二烷基磺酸鈉(月桂醯硫酸鈉；sodium lauryl sulfate)氧化，形成SLS-HGB衍生物，在540~555 nm 波長下，可進行比色測定。經標準品比對後，可以進行準確的血紅素濃度測定(r＞0.99)。

如前所述，在本發明中，可以藉由電泳裝置來檢測血紅素之存在，以得知使用本發明之血紅素之純化方法及/或純化血紅素之設備來純化血紅素的效果。使用電泳裝置來檢測血紅素的檢測結果如圖9及圖10所示，圖9及圖10皆為以電泳裝置檢測血紅素之檢測結果之照片圖。圖9所使用的電泳膠體為16.5% tricine SDS-PAGE (三(羥甲基)甲基甘氨酸 聚丙烯醯胺膠體電泳)(M：分子量標準，1：血液樣品，2：流經管柱收集的樣本，3：PBS緩衝液清洗多次收集的樣本，4：氫氧化鈉沖提收集的樣本)，而圖10所使用的電泳膠體為12.5% SDS-PAGE(聚丙烯醯胺膠體電泳) (M：分子量標準，1：血液樣品，2：氫氧化鈉沖提收集的樣本)。其中，tricine SDS-PAGE可用來分離較小分子或小kDa的蛋白質(血紅素的kDa值約為14)。由圖9可知，在血液樣品流過管柱後再以PBS緩衝液清洗管柱多次後收集清洗液進行電泳分析呈現不存在有血紅素(電泳線3)，而PBS緩衝液清洗管柱多次後再接著以氫氧化鈉溶液沖提管柱收集沖提液後進行電泳分析呈現存在有血紅素(電泳線4)。並且，由圖10可知，在血液樣品流過管柱後再以氫氧化鈉沖提管柱並收集沖提液後進行電泳分析呈現存在有血紅素(電泳線2)。由此可知，本發明藉由先將血紅素與管柱中的螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起，再以例如為氫氧化鈉之鹼性溶液沖提管柱而使血紅素溶解於鹼性溶液中的方式，確實可以將血紅素從血液樣品中分離出來，且由圖9中的電泳線4以及圖10中的電泳線2可知，所得之血紅素不具有其他雜質成分。由此顯見，本發明的純化血紅素之方法的純化效果極佳，且純度高達95%以上。

綜上所述，本發明的血紅素之純化方法及其設備可用以將血紅素從血液樣品中分離純化出來，不僅製程簡單、快速，且設備成本低、純化效率高。

上述所揭露的各個實施例僅為例示性，而非為限制性。任何未背離本發明的精神與範疇，而對本發明的所揭露的實施例進行的等效修改或變更，皆應包含於後附的申請專利範圍中。

S10、S20、S30、S40、S50、S60、S70‧‧‧步驟
10‧‧‧幫浦
20‧‧‧第一管柱
22‧‧‧第二管柱
24‧‧‧第三管柱
30、32、34‧‧‧容置槽
36‧‧‧酸性液槽
38、38’、38’’‧‧‧收集槽
40、42、44、46‧‧‧管線
50‧‧‧自動化控制裝置
60‧‧‧分析切換裝置
62‧‧‧光偵測器
64‧‧‧流向切換器
70‧‧‧輸入裝置
80‧‧‧電泳裝置
90‧‧‧影像擷取裝置
92‧‧‧顯示裝置
94‧‧‧濃縮裝置

圖1為本發明的血紅素之純化方法的第一實施例之流程示意圖。

圖2為本發明的血紅素之純化方法的第二實施例之流程示意圖。

圖3為本發明的純化血紅素之設備之第一實施例之示意圖。

圖4為本發明的純化血紅素之設備之第二實施例之示意圖。

圖5為本發明的純化血紅素之自動化設備之第一實施例之示意圖。

圖6為本發明的純化血紅素之自動化設備之第二實施例之示意圖。

圖7為本發明中分析切換裝置之第一態樣之示意圖。

圖8為本發明中分析切換裝置之第二態樣之示意圖。

圖9為以電泳裝置檢測血紅素之檢測結果之照片圖。

圖10為以電泳裝置檢測血紅素之檢測結果之照片圖。

S10、S20、S30、S40、S50‧‧‧步驟

Claims (10)

1. 一種血紅素之純化方法，至少包含： 提供包含有血紅素的一血液樣品； 提供填充有螯合瓊脂糖凝膠(Chelating Sepharose Fast Flow )之一第一管柱； 進行一鍵結步驟，以將該血液樣品流過該第一管柱，使得該血液樣品中的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起； 進行一清洗步驟，藉由將一緩衝溶液流過該第一管柱，以將該血液樣品中非特異性鍵結於螯合瓊脂糖凝膠的雜質從該第一管柱中沖洗出來；以及 進行一沖提步驟，藉由沖提一鹼性溶液以降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的鍵結力而使血紅素從該第一管柱中分離出來。
2. 如申請專利範圍第1項所述之血紅素之純化方法，其中螯合瓊脂糖凝膠包含有交聯瓊脂糖珠(cross-linked agarose beads)及亞胺基二乙酸(iminodiacetic acid)，且交聯瓊脂糖珠之濃度係為6%。
3. 如申請專利範圍第1項所述之血紅素之純化方法，其中該緩衝溶液為磷酸緩衝鹽(phosphate buffer saline，PBS)溶液，且於該清洗步驟之後更進行一檢測步驟，以檢測從該第一管柱中沖洗出來的非特異性鍵結於螯合瓊脂糖凝膠的雜質的OD280吸光值是否為0，若是則進行該沖提步驟。
4. 如申請專利範圍第1項所述之血紅素之純化方法，其中從該第一管柱中分離出來之血紅素係溶解於該鹼性溶液中，且於該沖提步驟後更進行一中和步驟，藉由一酸性溶液來調節溶解有血紅素的該鹼性溶液之酸鹼度，而得包含有血紅素之一中性溶液。
5. 如申請專利範圍第4項所述之血紅素之純化方法，其中該鹼性溶液為氫氧化鈉，該酸性溶液為檸檬酸(citric acid)。
6. 如申請專利範圍第5項所述之血紅素之純化方法，其中氫氧化鈉之濃度為50mM，檸檬酸之濃度為50mM。
7. 如申請專利範圍第4項所述之血紅素之純化方法，更包含對該中性溶液進行一濃縮步驟，以提高該中性溶液中血紅素的濃度。
8. 一種應用於如申請專利範圍第1項所述之血紅素之純化方法的純化血紅素之設備，至少包含： 一幫浦； 填充有螯合瓊脂糖凝膠之一第一管柱； 複數個容置槽，該些容置槽內分別設有血液樣品、鹼性溶液及緩衝溶液；以及 複數個管線，各該些管線之兩端係分別連接各該些容置槽及該第一管柱之入口， 其中該些容置槽中的液體係藉由該幫浦的驅動而經由該些管線依一順序分別流至該第一管柱中。
9. 如申請專利範圍第8項所述之純化血紅素之設備，更包含一第二管柱，其中該第二管柱之入口係連通該第一管柱之出口。
10. 如申請專利範圍第9項所述之純化血紅素之設備，更包含一第三管柱，其中該第三管柱之入口係連通該第二管柱之出口。