JP2016028234A - 緩衝剤組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】一又は複数の実施形態において、緩衝液のｐＨの温度依存性を抑制できる緩衝剤組成物、並びに、該緩衝剤組成物を使用した検体分析方法及び検体分析システムを提供する。【解決手段】一又は複数の実施形態において、温度とｐＨとが正の相関を示す緩衝物質Ａと、温度とｐＨとが負の相関を示す緩衝物質Ｂとを含む緩衝剤組成物、並びに、該緩衝剤組成物を使用した検体分析方法及び検体分析システム。【選択図】なし

Description

本開示は、緩衝剤組成物、それを用いる検体分析方法、及びそれを用いる検体分析システムに関する。

生物・化学の分野においては、溶液中のｐＨを一定に保つために、ｐＨ緩衝液（以下、緩衝液）が広く用いられている。緩衝液は、一般的に、弱酸とその共役塩基、又は、弱塩基とその共役酸を含む、水溶液からなる。この弱酸又は弱塩基の酸解離定数（ｐＫａ）によって、その緩衝液がｐＨ緩衝能を発揮できるｐＨ域が決定される。しかしながら、これらのｐＫａは、温度依存的に変化することが知られており、その結果、緩衝液のｐＨも、温度依存的に変化することが、一般的に知られている。このようなｐＨ変化の傾向や程度は、用いる弱酸又は弱塩基によって異なっている。

非特許文献１には、様々な緩衝液のｐＨに対する温度影響が記載されている。この温度によるｐＨ変化の影響を避けるために、一般的には、使用する（あるいは実験時に想定される）液温にて、ｐＨを調整することが行われている。また、特許文献１には、温度による緩衝液のｐＨ変化をあえて利用し、対象物の分析に用いる方法が記載されている。

また、血液や尿等の検体の成分を分析する検体分析装置や検体分析システムにおいては、分析精度を向上させるため、検体分析方法に用いる検体や緩衝液の温度を調節する温度制御ユニット、恒温装置、温調部などの温調機能が備えられている（特許文献２〜４）。

特開平１１−２８７７８６号公報 特開２００７−３２２３６７号公報 特開２０１０−４８５５４号公報 特開２０１２−２１５４６５号公報

Harumi Fukuoka et al., PROTEINS: Structure, Function, Genetics, 1998年 33巻 159-166頁

検体分析装置や検体分析システムから温調機能を除いた場合、温度による緩衝液のｐＨ変化が分析結果に大きな影響を与えることが見出された。そこで、本開示は、一又は複数の実施形態において、緩衝液のｐＨの温度依存性を抑制できる緩衝剤組成物を提供する。

本開示は、一又は複数の実施形態において、温度とｐＨとが正の相関を示す緩衝物質Ａと、ｐＨとが負の相関を示す緩衝物質Ｂとを含む緩衝剤組成物に関する。

本開示は、一又は複数の実施形態において、所定のｐＨの緩衝溶液にした場合に温度とｐＨとが正の相関を示す緩衝物質Ａと、前記ｐＨの緩衝溶液にした場合に温度とｐＨとが負の相関を示す緩衝物質Ｂとを含む緩衝剤組成物に関する。

本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係る緩衝剤組成物を使用する検体分析方法、又は、検体分析システムに関する。

本開示によれば、一又は複数の実施形態において、緩衝液のｐＨの温度依存性を抑制できる緩衝剤組成物を提供できる。また、本開示によれば、その他の一又は複数の実施形態において、温調の精度が低い場合においても、緩衝液のｐＨの変化を小さくすることができるから、検体分析方法や検体分析システムの分析精度を向上することが可能となる。また、本開示によれば、その他の一又は複数の実施形態において、温度調節機能を除くことができるから、検体分析方法や検体分析システムの小型化や簡素化が可能となる。但し、本開示に係る緩衝剤組成物は、温調の精度に関わらず、温調機能を備える検体分析方法・装置・システムにおいても使用できる。

図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃは、それぞれ、実施例５の１０℃、２５℃、３５℃の各環境温度下の結果を示す。 図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃは、それぞれ、実施例６の１０℃、２５℃、３５℃の各環境温度下の結果を示す。 図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃは、それぞれ、比較例７の１０℃、２５℃、３５℃の各環境温度下の結果を示す。 図４は、キャピラリ電気泳動用チップの一例の概略図である。

本開示は、一又は複数の実施において、温度とｐＨが正の相関を示すである緩衝物質、すなわち、温度が上昇すると緩衝液のｐＨも上昇する性質を示す緩衝物質と、温度とｐＨが負の相関を示すである緩衝物質、すなわち、温度が上昇すると緩衝液のｐＨが低下する性質を示す緩衝物質とを含む緩衝液において、ｐＨの温度依存性が抑制されるという知見に基づく。本開示はまた、一又は複数の実施において、ｐＨの温度依存性が抑制された緩衝液を用いれば、生物・化学分野の分析・測定装置において従来装備されていた温調機構を外すことができ、装置の小型化・簡素化に繋がるという知見に基づく。

すなわち、本開示は、一態様において、温度とｐＨとが正の相関を示す緩衝物質Ａと、温度とｐＨとが負の相関を示す緩衝物質Ｂとを含む緩衝剤組成物（以下、「本開示に係る緩衝剤組成物」ともいう）に関する。

本開示に係る緩衝剤組成物においてｐＨの温度依存性が抑制されることのメカニズムの詳細は明らかではないが、以下のように推測される。すなわち、温度とｐＨとが正の相関を示す緩衝物質Ａと、温度とｐＨとが負の相関を示す緩衝物質Ｂとを有することで、個々の緩衝物質が持つｐＨの温度依存性が互いに打ち消され、ｐＨの温度依存性が抑制されると考えられる。但し、本開示はこのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。

本開示によれば、一又は複数の実施において、従来は制御が困難であったｐＨ緩衝液の温度依存的ｐＨ変動を、抑制することが可能である。これにより、溶液を温調しなくてもｐＨを一定にすることが可能となり、装置の温調機構に頼らなくても、環境温度の影響を受けない測定系を確立できる。さらに、測定装置に温調機構を設ける必要がなくなり、装置の小型化・簡素化に繋がる。本開示は、一又は複数の実施形態において、ＰＯＣＴ（Point of Care Testing）装置の小型化・簡素化に寄与しうる。

［緩衝物質Ａ］
本開示に係る緩衝剤組成物は、温度とｐＨとが正の相関を示す緩衝物質Ａを含有する。本開示において、緩衝物質が「温度とｐＨとが正の相関を示す」とは、該緩衝物質が溶液状態で、すなわち、緩衝溶液の場合に、その緩衝溶液の温度が上昇するとｐＨが増加する傾向を示すことをいう。緩衝物質Ａは、一又は複数の実施形態において、ｐＨ緩衝能が発揮されるｐＨ付近で温度とｐＨとが正の相関を示す。また、緩衝物質Ａは、その他の一又は複数の実施形態において、緩衝物質ＡのｐＫａの付近のｐＨ、或いは、緩衝物質ＡのｐＫａの±２のｐＨ、或いは、緩衝物質ＡのｐＫａの±１．５のｐＨ、或いは、緩衝物質ＡのｐＫａの±１のｐＨにおいて温度とｐＨとが正の相関を示す。さらにまた、緩衝物質Ａは、その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨにおいて、温度とｐＨとが正の相関を示す。

緩衝物質Ａは、一又は複数の実施形態において、カルボキシ基を有する化合物又はその塩である。前記化合物のカルボキシ基の価数としては、一又は複数の実施形態において、１価又は多価であり、多価としては、２価又は３価又は４価以上である。緩衝物質Ａは、その他の一又は複数の実施形態において、カルボキシ基を有する化合物又はその塩であって、少なくとも１つのカルボキシル基のｐＫａが、本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨの±２．０以内、±１．５以内、又は±１．０である化合物である。

緩衝物質Ａは、一又は複数の実施形態において、クエン酸、マレイン酸、酢酸、リンゴ酸、フタル酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸等の酸、これらの塩、及びこれらの組み合わせなどが挙げられる。本開示に係る緩衝剤組成物における緩衝物質Ａは、一種類でもよく、或いは、複数種類であってもよい。

［緩衝物質Ｂ］
本開示に係る緩衝剤組成物は、温度とｐＨとが負の相関を示す緩衝物質Ｂを含有する。本開示において、緩衝物質が「温度とｐＨとが負の相関を示す」とは、該緩衝物質が溶液状態で、すなわち、緩衝溶液の場合に、その緩衝溶液の温度が上昇するとｐＨが低下する傾向を示すことをいう。緩衝物質Ｂは、一又は複数の実施形態において、ｐＨ緩衝能が発揮されるｐＨ付近で温度とｐＨとが負の相関を示す。また、緩衝物質Ｂは、その他の一又は複数の実施形態において、緩衝物質ＢのｐＫａの付近のｐＨ、或いは、緩衝物質ＢのｐＫａの±２のｐＨ、或いは、緩衝物質ＢのｐＫａの±１．５のｐＨ、或いは、緩衝物質ＢのｐＫａの±１のｐＨにおいて温度とｐＨとが負の相関を示す。さらにまた、緩衝物質Ｂは、その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨにおいて、温度とｐＨとが負の相関を示す。

緩衝物質Ｂは、一又は複数の実施形態において、アミン化合物、リン酸、ホウ酸、炭酸、フェノール、及びこれらの塩、並びに、これらの組み合わせが挙げられる。本開示に係る緩衝剤組成物における緩衝物質Ｂは、一種類でもよく、或いは、複数種類であってもよい。前記アミン化合物がアミノ基又はイミノ基を有する場合、その価数としては、一又は複数の実施形態において、１価又は多価であり、多価としては、２価又は３価又は４価又はそれ以上である。緩衝物質Ｂは、その他の一又は複数の実施形態において、アミン化合物又はその塩であって、少なくとも１つのアミノ基又はイミノ基のｐＫａが、本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨの±２．０以内、±１．５以内、又は±１．０である化合物である。

アミン化合物としては、限定されない一又は複数の実施形態において、アミノ基（−ＮＨ₂）を有する化合物、イミノ基（−ＮＨ−）を有する化合物、又は含窒素複素環を有する化合物等が挙げられる。

アミノ基（−ＮＨ₂）を有する化合物としては、一又は複数の実施形態において、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、エタノールアミンが挙げられる。

イミノ基（−ＮＨ−）を有する化合物としては、一又は複数の実施形態において、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、ジエタノールアミンが挙げられる。

本開示における「含窒素複素環」は、一又は複数の実施形態において、環内に−ＮＨ−、−ＮＲ−又は＝Ｎ−を有する複素環をいう。複素環は、脂環式であってもよく、芳香族であってもよい。よって、含窒素複素環を有する化合物は、一又は複数の実施形態において、環内に−ＮＨ−、−ＮＲ−（Ｒは水素以外の基）又は＝Ｎ−を有する複素環式化合物又はその構造を有する化合物をいう。

含窒素複素環を有する化合物としては、一又は複数の実施形態において、ピペラジン、ピリジン、イミダゾール、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）が挙げられる。

その他のアミン化合物としては、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、トリエタノールアミン、ジメチルアミノエタノール、などが挙げられる。

［緩衝物質Ａ及びＢとして使用できる化合物］
カルボキシ基を有するアミン化合物は、本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨによって、緩衝物質Ａと緩衝物質Ｂのいずれか一方として機能しうる。本開示において、「カルボキシ基を有するアミン化合物」とは、一又は複数の実施形態において、カルボキシ基と、アミノ基（−ＮＨ₂）、イミノ基（−ＮＨ−）又は含窒素複素環とを同一分子内に有する化合物をいう。本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨが、該化合物のアミノ基、イミノ基又は含窒素複素環のｐＫａよりもカルボキシル基のｐＫａに近ければ、緩衝物質Ａとして使用できる。本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨが、該化合物のカルボキシル基のｐＫａよりもアミノ基、イミノ基又は含窒素複素環のｐＫａに近ければ、緩衝物質Ｂとして使用できる。このような緩衝物質Ａ及びＢとして使用できる化合物としては、一又は複数の実施形態において、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、トレオニン、セリン、アルギニン、グリシン、アラニン、β‐アラニン、α‐アミノ酪酸、β‐アミノ酪酸、バリン、システイン、メチオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、トリプトファンなどが挙げられる。

一又は複数の実施形態において、ヒスチジンは、カルボキシル基のｐＫａが１．８２、側鎖イミダゾイル基のｐＫａが６．００、α炭素のアミノ基のｐＫａが９．１７であるから、例えば、本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨがｐＨ＝５．０である場合、最も近いｐＫａはアミノ基のものであるから、ヒスチジンは緩衝物質Ｂとして使用できることとなる。その他の緩衝物質Ａ及びＢとして使用できる化合物についても同様にして、緩衝物質Ａ及びＢのいずれかとなるか判断できる。

したがって、緩衝物質Ａは、一又は複数の実施形態において、カルボキシ基及びアミノ基、イミノ基又は含窒素複素環を同一分子内に有する化合物であって、本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨがアミノ基、イミノ基又は含窒素複素環のｐＫａよりもカルボキシル基のｐＫａに近い化合物である。また、緩衝物質Ａは、その他の一又は複数の実施形態において、少なくとも１つのカルボキシル基のｐＫａが、本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨの±２．０以内、±１．５以内、又は±１．０である化合物である。

同様に、緩衝物質Ｂは、一又は複数の実施形態において、カルボキシ基及びアミノ基、イミノ基又は含窒素複素環を同一分子内に有する化合物であって、本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨがカルボキシル基のｐＫａよりもアミノ基、イミノ基又は含窒素複素環のｐＫａに近い化合物である。また、緩衝物質Ｂは、その他の一又は複数の実施形態において、少なくとも１つのアミノ基、イミノ基又は含窒素複素環のｐＫａが、本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨの±２．０以内、±１．５以内、又は±１．０である化合物である。

本開示に係る緩衝剤組成物（液体状態）における緩衝物質Ａ及びＢの含有量としては、一又は複数の実施形態において、それぞれ、０．５ｍＭ〜５００ｍＭ、１ｍＭ〜３００ｍＭ、５ｍＭ〜２００ｍＭ、１０ｍＭ〜１００ｍＭ、又は、２０ｍＭ〜５０ｍＭである。

［ｐＫａ］
緩衝物質Ａ及び緩衝物質Ｂは、一又は複数の実施形態において、ｐＨの温度依存性を抑制する観点から、液体状態の本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨの±２．０以内、±１．５以内、又は±１．０であるｐＫａを有することが好ましい。前記ｐＫａは、緩衝物質Ａの場合、一又は複数の実施形態において、カルボキシル基のｐＫａであることが好ましい。前記ｐＫａは、緩衝物質Ｂの場合、一又は複数の実施形態において、アミノ基、イミノ基又は含窒素複素環のｐＫａであることが好ましい。

［ｐＨ］
本開示に係る緩衝剤組成物（液体状態）のｐＨは、本開示に係る緩衝剤組成物の用途に応じて適宜選択できる。本開示に係る緩衝剤組成物のｐＨは、一又は複数の実施形態において、３．０〜１０．０、３．５〜９．０、４．０〜８．０、４．５〜７．５、又は４．５〜６．５である。なお、本開示に係る緩衝剤組成物は、水を含む液体状態又は溶液状態であってもよく、乾燥状態（例えば、粉末、凍結乾燥、固体）であってもよい。

［温度］
本開示に係る緩衝剤組成物（液体状態）を使用する温度は、一又は複数の実施形態において、ｐＨの温度依存性を抑制する観点から、０℃以上、０℃より上、５℃以上、又は、１０℃以上が好ましい。また、該温度は、一又は複数の実施形態において、ｐＨの温度依存性を抑制する観点から、１００℃以下、１００℃未満、６０℃以下、又は５０℃以下が好ましい。また、該温度は、一又は複数の実施形態において、ｐＨの温度依存性を抑制する観点から、０℃以上１００℃以下、０℃より上１００℃未満、０℃より上６０℃以下、５℃以上５０℃以下、又は、１０℃以上５０℃以下が好ましい。前記「本開示に係る緩衝剤組成物（液体状態）を使用する温度」は、一又は複数の実施形態において、液体状態の本開示に係る緩衝剤組成物がｐＨの温度依存性を抑制できる温度である。

［その他の成分］
本開示に係る緩衝剤組成物は、必要に応じて、その他の成分を含んでもよい。その他の成分としては、検体分析に使用する成分が挙げられる。その他の成分としては、一又は複数の実施形態において、キャピラリ電気泳動法に使用される成分があげられ、一又は複数の実施形態において、非界面活性剤型の両イオン性物質、及び／又は、イオン性の擬似固定相、及び／又は、界面活性剤、及び／又は、防腐剤、が挙げられる。

非界面活性剤型の両イオン性物質は、一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の観点から、非界面活性剤型のベタインが好ましく、より好ましくは非界面活性剤型のスルホベタイン及びカルボキシベタインが挙げられ、さらに好ましくは四級アンモニウムカチオンとスルホ基（−ＳＯ₃ ^-）若しくはカルボキシ基（−ＣＯＯ^-）とを同一分子内の隣り合わない位置に有する非界面活性剤型の物質、さらにより好ましくは非界面活性剤型スルホベタイン（ＮＤＳＢ）である。

イオン性の擬似固定相は、一又は複数の実施形態において、キャピラリ電気泳動法に用いるものであって、試料中の物質を親和性（分配係数の差）に応じて分離することで試料中の分析対象物質を他の物質から分離させる目的、すなわち、分離精度を向上する目的で使用されるイオン性の物質をいう。イオン性の擬似固定相は、一又は複数の実施形態において、試料及び／又は分析対象物質に応じ、すでに使用され又は今後使用され得るイオン性擬似固定相を選択して使用できる。イオン性の擬似固定相は、一又は複数の実施形態において、アニオン性又はカチオン性のポリマーであってもよい。前記ポリマーは、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、多糖類であってもよく、一又は複数の実施形態において、コンドロイチン硫酸、へパリン、へパラン、フコイダン、又はその塩等が挙げられ、中でもコンドロイチン硫酸又はその塩が好ましい。コンドロイチン硫酸としては、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ等が挙げられる。

［調製方法］
本開示に係る緩衝剤組成物の調製方法は、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、緩衝物質Ａ、緩衝物質Ｂ、及び、必要に応じてその他の成分を混合又は水に溶解することで調製できる。本開示に係る緩衝剤組成物は、緩衝液の状態（そのまま使用できる状態）でもよく、濃縮液の状態でもよく、凍結乾燥等による固体又は粉末の状態であってもよい。

本開示に係る緩衝剤組成物は、一又は複数の実施形態において、検体分析方法に用いるための緩衝剤組成物である。本開示において、検体分析方法としては、一又は複数の実施形態において、検体分析のための反応が発熱又は吸熱反応をともなう検体分析方法、及び検体分析時に発熱又は吸熱を生じる検体分析方法が挙げられ、一又は複数の実施形態において、検体の分離分析方法等が挙げられる。分離分析方法としては、一又は複数の実施形態において、検体に含まれる分析対象物を個別に分離しながら分析を行う方法であって、例えば、液体クロマトグラフィ法（ＨＰＬＣ法）、キャピラリ電気泳動法（ＣＥ法）、又はキャピラリ電気クロマトグラフィ法が挙げられる。液体クロマトグラフィ法としては、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィ法、陰イオン交換クロマトグラフィ法、分配クロマトグラフィ法、逆相分配クロマトグラフィ法、ゲルろ過クロマトグラフィ法、及びアフィニティクロマトグラフィ法等が挙げられる。キャピラリ電気泳動法としては、例えば、キャピラリゾーン電気泳動法、キャピラリ等速電気泳動法、キャピラリ等電点電気泳動法、キャピラリ動電クロマトグラフィ法、及びキャピラリゲル電気泳動法、マイクロチップ電気泳動法等が挙げられる。

したがって、本開示に係る緩衝剤組成物は、一又は複数の実施形態において、キャピラリ電気泳動用溶液である。本開示において「キャピラリ電気泳動用溶液」とは、限定されない一又は複数の実施形態において、キャピラリ電気泳動前にキャピラリ流路に充填される泳動液（以下、「ランニングバッファー」ともいう）、試料をキャピラリに導入後に試料に換えて泳動のために用いる泳動液、これらの泳動液を調製するための溶液、又は、試料を調製するための溶液の少なくとも１つとして使用できる溶液をいう。キャピラリ電気泳動前にキャピラリ流路に充填される泳動液（ランニングバッファー）と、試料をキャピラリに導入後に試料に換えて泳動のために用いる泳動液は、同じ液組成でもよいし、異なっていてもよい。

また、本開示に係る緩衝剤組成物は、一又は複数の実施形態において、クロマトグラフィ用溶液である。本開示において「クロマトグラフィ用溶液」とは、限定されない一又は複数の実施形態において、移動相、移動相を調製するための溶液、又は、試料を調製するための溶液の少なくとも１つとして使用できる溶液をいう。

［検体分析方法］
本開示は、一態様において、本開示に係る緩衝剤組成物を使用する検体分析方法に関する。本開示に係る検体分析方法は、一又は複数の実施形態において、温調の精度が低い方法であり、また、一又は複数の実施形態において、温調手段を使用しない方法である。検体分析方法としては、一又は複数の実施形態において、上述した検体の分離分析方法等が挙げられ、一又は複数の実施形態において、ＨＰＬＣ法、ＣＥ法、キャピラリ電気クロマトグラフィ法が挙げられる。

本開示において、検体分析方法の検体としては、一又は複数の実施形態において、ヒト又はヒト以外の動物の生体試料が挙げられ、尿、血液、血液由来試料、体液等が挙げられる。検体分析方法の測定対象としては、前記検体中の成分が挙げられ、血液又は血液由来試料中の測定対象成分としては、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、アルブミンなどが挙げられる。

［検体分析システム］
本開示は、その他の態様において、本開示に係る緩衝剤組成物を使用する検体分析システムに関する。本開示に係る検体分析システムは、一又は複数の実施形態において、本開示の検体分析方法を行うためのシステムであり、また、一又は複数の実施形態において、温調の精度が低いシステムであり、また、一又は複数の実施形態において、温調手段を有さないシステムである。

検体分析システムは、一又は複数の実施形態において、検体分析に用いる分析チップ（分析カートリッジ）、分析固定相（担体）等を含みうる。分析チップとしては、キャピラリを備えるもの、マイクロ流路を備えるもの、測定対象と反応する反応部を備えるもの、及び／又は、測定対象を検出するための検出部を備えるもの、が挙げられる。検体分析システムは、その他の一又は複数の実施形態において、測定対象を検出する機構（検出部、検出装置）、泳動液若しくは移動相を流すための機構（送液部、送液装置、電圧印加部、電圧印加装置）、検出結果を記録するための機構（記憶部、記憶装置）、及び／又は、検出結果を表示するための機構（表示部、表示装置）の１つ又は２つ以上の組み合わせを含みうる。

本開示に係る検体分析方法、検体分析システムは、一又は複数の実施形態において、緩衝剤組成物を使用する、ＨＰＬＣシステム、ＣＥシステム、又はキャピラリ電気クロマトグラフィシステムが挙げられる。

［キット］
本開示は、その他の態様において、緩衝物質Ａと緩衝物質Ｂとの組合せを含むキットに関する。本開示に係るキットは、さらに前述の分析チップ又は分析固定相を含みうる。本開示に係るキットは、本開示に係る緩衝剤組成物の調製に使用でき、また、本開示に係る検体分析方法、検体分析システムに使用できる。

本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
［Ａ１］ 温度とｐＨとが正の相関を示す緩衝物質Ａと、温度とｐＨとが負の相関を示す緩衝物質Ｂとを含む、緩衝剤組成物。
［Ａ２］ 前記緩衝物質Ａが、カルボキシ基を有する化合物又はその塩である、［Ａ１］に記載の緩衝剤組成物。
［Ａ３］ 前記緩衝物質Ｂが、アミン化合物、リン酸、ホウ酸、炭酸、フェノール、及びこれらの塩、並びに、これらの組み合わせからなる群から選択される、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載の緩衝剤組成物。
［Ａ４］ 前記緩衝物質ＡのｐＫａ及び前記緩衝物質ＢのｐＫａが、それぞれ、液体状態の前記緩衝剤組成物のｐＨの±２．０以内、±１．５以内、又は±１．０である、［Ａ１］から［Ａ３］のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
［Ａ５］ 前記緩衝剤組成物が液体であって、そのｐＨが、３．０〜１０．０、３．５〜９．０、４．０〜８．０、４．５〜７．５、又は４．５〜６．５であるである、［Ａ１］から［Ａ４］ のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
［Ａ６］ 検体分析方法に用いるための、［Ａ１］から［Ａ５］のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
［Ａ７］ 前記検体分析方法が、発熱及び／又は吸熱を伴う検体分析方法である、［Ａ６］に記載の緩衝剤組成物。
［Ａ８］ 液体クロマトグラフィ法（ＨＰＬＣ法）、キャピラリ電気泳動法（ＣＥ法）、又はキャピラリ電気クロマトグラフィ法に用いるための、［Ａ１］から［Ａ７］のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
［Ａ９］ さらに、イオン性の擬似固定相を含有する、［Ａ１］から［Ａ８］のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
［Ａ１０］ さらに、非界面活性剤型の両イオン性物質を含有する、［Ａ１］から［Ａ９］のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
［Ａ１１］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載の緩衝剤組成物を使用する、検体分析方法。
［Ａ１２］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載の緩衝剤組成物を使用する、検体分析システム。
［Ａ１３］ 温調手段を有さない、［Ａ１２］に記載の検体分析システム。
［Ａ１４］ 検体分析方法に用いる［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載の緩衝剤組成物、及び、選択的に、検体分析方法に用いる検体分析チップを有する、検体分析キット。

以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。

［実施例１、比較例１，２］
緩衝物質として、マレイン酸（ｐＫａ＝１．９４，６．５４）とＰＩＰＥＳ（piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid）（ｐＫａ＝６．７６）を用い、以下のように、実施例１及び比較例１、２の緩衝液を調製した（ｐＨ７．０）。これらの緩衝液を加熱又は冷却し、１０℃〜５０℃の温度で、ｐＨメータにてｐＨを測定した。なお、ｐＨは、ｐＨメータ（堀場製作所社製）の電極を測定対象に浸漬して２分後の値とした（以下同様）。測定したｐＨの最高値と最低値との差であるΔｐＨ、及び、温度に応じたｐＨ変化の回帰直線の傾きであるΔｐＨ／℃（ＳＬＯＰＥ関数）を算出した。その結果を下記表１に示す。

＜実施例１の緩衝液＞２０ｍＭ マレイン酸、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０、２４℃、ＮａＯＨにて調整）
＜比較例１の緩衝液＞４０ｍＭ マレイン酸（ｐＨ７．０、２４℃、ＮａＯＨにて調整）
＜比較例２の緩衝液＞４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０、２４℃、ＮａＯＨにて調整）

表１のとおり、比較例１及び２の緩衝液に対して、実施例１の緩衝液は、ｐＨの温度依存的変化が小さいことが示された。

［実施例２、比較例３，４］
緩衝物質として、グルタミン酸（ｐＫａ＝２．１９，４．２５，９．６７）とピペラジン（ｐＫａ＝５．６８，９．８２）を用い、以下のように、実施例２及び比較例３、４の緩衝液を調製した（ｐＨ５．０）。これらの緩衝液について、実施例１と同様にΔｐＨ、及び、ΔｐＨ／℃を算出した。その結果を下記表２に示す。

＜実施例２の緩衝液＞３５ｍＭ グルタミン酸、５ｍＭ ピペラジン（ｐＨ５．０、２４℃、ＮａＯＨにて調整）
＜比較例３の緩衝液＞４０ｍＭ グルタミン酸（ｐＨ５．０、２４℃、ＮａＯＨにて調整）
＜比較例４の緩衝液＞４０ｍＭ ピペラジン（ｐＨ５．０、２４℃、ＨＣｌにて調整）この緩衝液について、上記実施例１と同様にしてｐＨを測定した。

表２のとおり、比較例３及び４の緩衝液に対して、実施例２の緩衝液は、ｐＨの温度依存的変化が小さいことが示された。

［実施例３，４、比較例５，６］
緩衝物質として、クエン酸（ｐＫａ＝３．０９，４．７５，６．４１）とヒスチジン（ｐＫａ＝１．８２，６．００，９．１７）又はピペラジン（ｐＫａ＝５．６８，９．８２）を用い、さらに、緩衝物質以外の物質としてコンドロイチン硫酸Ｃナトリウムを用いて、以下のように、実施例３，４及び比較例５、６の緩衝液を調製した（ｐＨ５．０）。これらの緩衝液について、実施例１と同様にΔｐＨ、及び、ΔｐＨ／℃を算出した。その結果を下記表３に示す。

＜実施例３の緩衝液＞４０ｍＭ クエン酸、４０ｍＭ ヒスチジン、１．２５％ｗ／ｖ
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（ｐＨ５．０、２４℃、ＮａＯＨにて調整）
＜実施例４の緩衝液＞４０ｍＭ クエン酸、２０ｍＭ ピペラジン、１．２５％ｗ／ｖ
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（ｐＨ５．０、２４℃、ＮａＯＨにて調整）
＜比較例５の緩衝液＞４０ｍＭ クエン酸、１．２５％ｗ／ｖ コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（ｐＨ５．０、２４℃、ＮａＯＨにて調整）
＜比較例６の緩衝液＞４０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．０、２４℃、ＮａＯＨにて調整）

表３のとおり、比較例５及び６の緩衝液に対して、実施例３及び４の緩衝液は、ｐＨの温度依存的変化が小さいことが示された。

［実施例５］
検体として血液を使用し、血液中のヘモグロビンについて、キャピラリ電気泳動チップを用いた検体分析を行った。

＜キャピラリ電気泳動チップ＞
キャピラリ電気泳動チップとして、図４の概略模式図に示されるチップを使用した。該チップは、内部にマイクロ流路１０を備え、マイクロ流路１０の両端にはそれぞれ試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２が形成されている。試料保持槽１１と泳動液保持槽１２との間であって、マイクロ流路１０の上面には検出部１３が形成されている。チップの材料としてＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）を使用し、流路１０は０．０４ｍｍ×０．０４ｍｍ×３０ｍｍとし、試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２の容量は１０μＬとした。また、検出部１３は、その中心が試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２からそれぞれ２０ｍｍ及び１０ｍｍの位置となるようにした。

＜電気泳動溶液＞
（電気泳動溶液１）
４０ｍＭ クエン酸
１％ｗ／ｖコンドロイチン硫酸Ｃナトリウム
５００ｍＭ ＮＤＳＢ−２０１（非界面活性剤型スルホベタイン、東京化成工業社製）
０．１％ｗ／ｖ エマルゲンＬＳ−１１０（花王社製）
０．０２％ アジ化ナトリウム
ジメチルアミノエタノール（ｐＨ調整用）
ｐＨ６．０
（電気泳動溶液２）
４０ｍＭ クエン酸
２０ｍＭ ヒスチジン
１．２５％ｗ／ｖ コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム
０．１％ｗ／ｖ エマルゲンＬＳ−１１０（花王社製）
０．０２％ アジ化ナトリウム
ジメチルアミノエタノール（ｐＨ調整用）
ｐＨ５．０

＜キャピラリ電気泳動＞
キャピラリ電気泳動は、以下の手順で行った。測定はアークレイ製専用装置を用い、各溶液及びマイクロ流路チップの温調は行わなかった。
１．キャピラリ電気泳動チップを、アークレイ製の電気泳動装置にセットした。
２．電気泳動溶液２を前記チップの泳動液保持槽に９μＬ添加し、毛細管現象によりマイクロ流路を電気泳動溶液２で満たした。
３．ヒト全血を電気泳動溶液１で４１倍に希釈し、試料とした。
４．上記試料を、マイクロ流路チップの試料保持槽に９μＬ添加した。
５．試料保持槽に陽電極、泳動液保持槽に負電極を接触させ、定電流制御にて電気泳動を開始した。
６．検出部にて４１５ｎｍの吸光度を測定し、エレクトロフェログラムを得た。電気泳動は６０秒間行った。
この測定を、１０℃、２５℃、３５℃の各環境温度下で実施した。結果を図１に示す。図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃは、それぞれ、実施例５の１０℃、２５℃、３５℃の各環境温度下の結果を示す。

［実施例６］
上記実施例５における電気泳動溶液２を、下記の電気泳動溶液３に変更したほかは、実施例５と同様に測定を行った。
（電気泳動溶液３）
４０ｍＭ クエン酸
２０ｍＭ ピペラジン
１．２５％ｗ／ｖ コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム
０．１％ｗ／ｖ エマルゲンＬＳ−１１０（花王社製）
０．０２％ アジ化ナトリウム
ジメチルアミノエタノール（ｐＨ調整用）
ｐＨ５．０
その結果を図２に示す。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃは、それぞれ、実施例６の１０℃、２５℃、３５℃の各環境温度下の結果を示す。

［比較例７］
上記実施例５における電気泳動溶液２を、下記の電気泳動溶液４に変更したほかは、実施例５と同様に測定を行った。
（電気泳動溶液４）
４０ｍＭ クエン酸
１．２５％ｗ／ｖ コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム
０．１％ｗ／ｖ エマルゲンＬＳ−１１０（花王社製）
０．０２％ アジ化ナトリウム
ジメチルアミノエタノール（ｐＨ調整用）
ｐＨ５．０
その結果を図３に示す。図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃは、それぞれ、比較例７の１０℃、２５℃、３５℃の各環境温度下の結果を示す。

実施例５及び６の分析では、図１及び２に示すように、全ての温度においてｌ−ＨｂＡ１ｃ、ｓ−ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ１ｄ１の分離が確認でき、環境温度の影響が小さいことが分かる。一方、比較例７では、図３に示すように、２５℃ではｌ−ＨｂＡ１ｃ、ｓ−ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ１ｄ１の分離が確認できたが、１０℃ではＨｂＡ１ｄの分離が確認できず、３５℃ではｓ−ＨｂＡ１ｃ以外の分離が確認できなかった。すなわち、環境温度の影響が大きかった。

Claims (13)

1. 温度とｐＨとが正の相関を示す緩衝物質Ａと、温度とｐＨとが負の相関を示す緩衝物質Ｂとを含む、緩衝剤組成物。
2. 前記緩衝物質Ａが、カルボキシ基を有する化合物又はその塩である、請求項１に記載の緩衝剤組成物。
3. 前記緩衝物質Ｂが、アミン化合物、リン酸、ホウ酸、炭酸、フェノール、及びこれらの塩、並びに、これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の緩衝剤組成物。
4. 前記緩衝物質ＡのｐＫａ及び前記緩衝物質ＢのｐＫａが、それぞれ、液体状態の前記緩衝剤組成物のｐＨの±２．０以内である、請求項１から３のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
5. 前記緩衝剤組成物が液体であって、そのｐＨが、３．０〜１０．０である、請求項１から４のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
6. 検体分析方法に用いるための、請求項１から５のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
7. 前記検体分析方法が、発熱及び／又は吸熱を伴う検体分析方法である、請求項６に記載の緩衝剤組成物。
8. 液体クロマトグラフィ法（ＨＰＬＣ法）、キャピラリ電気泳動法（ＣＥ法）、又はキャピラリ電気クロマトグラフィ法に用いるための、請求項１から７のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
9. さらに、イオン性の擬似固定相を含有する、請求項１から８のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
10. さらに、非界面活性剤型の両イオン性物質を含有する、請求項１から９のいずれかに記載の緩衝剤組成物。
11. 請求項１から１０のいずれかに記載の緩衝剤組成物を使用する、検体分析方法。
12. 請求項１から１０のいずれかに記載の緩衝剤組成物を使用する、検体分析システム。
13. 温調手段を有さない、請求項１２に記載の検体分析システム。

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