KR101989917B1 - 형광검출기가 장착된 모세관 전기영동을 이용한 류마티스 관절염 진단방법 - Google Patents

형광검출기가 장착된 모세관 전기영동을 이용한 류마티스 관절염 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 류마티스 관절염을 진단하기 위한 형광이 라벨링된 CCP 단백질 또는 CCP11A 단백질과 CE-LIF 시스템 및 정량 분석 방법에 의하면 정상인과 관절염 환자의 anti-CCP 양을 비교 분석하여, 환자의 관절염 유무 또는 치료의 예후를 판단할 수 있는 정보를 제공할 수 있다.

Description

형광검출기가 장착된 모세관 전기영동을 이용한 류마티스 관절염 진단방법{METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF RHEUMATOID ARTHRITIS USING CAPILLARY ELECTROPHORESIS WITH LASER INDUCED FLUORESCENCE}
본 발명은 형광검출기가 장착된 모세관 전기영동을 이용하되, CCP 단백질 또는 CCP11A 단백질을 류마티스 관절염 환자의 혈액 또는 소변 시료(분석시료) 내에 첨가하고 시료 내 anti-CCP 항체를 정량 분석하여 류마티스 관절염 진단 및 진행 정도를 확인하기 위한 진단방법에 관한 것이다.
류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis: RA)은 만성 염증성 질환으로, 아직 그 원인이 명확히 밝혀지지 않아 아직까지 치료가 불가능하다. 류마티스 관절염이 발병하면 관절 안의 활막(synovium)에 염증과 통증이 생기게 되고, 염증이 지속되면 염증성 활막 조직이 자라나면서 뼈와 연골까지 파고들어 관절의 변형이 초래되어 활동에 장애가 발생한다. 류마티스 관절염을 완치할 수 있는 약물은 현재 개발되지 않았으며, 발병 후 오랜 기간 방치하게 되면 관절의 변형 및 장기로의 침범에 의한 손상까지 초래하고, 심각한 고통과 일상생활의 어려움에 시달리게 되므로 조기에 류마티스 관절염을 진단하여 치료를 하는 것은 매우 중요하다. 조기에 류마티스 관절염을 진단하면, 병의 진행을 늦출 수 있거나, 통증을 줄여주는 약들은 많이 개발되어 있으므로, 환자의 삶의 질을 훨씬 높일 수 있다.
현재 류마티스 관절염을 확실하게 진단할 수 있는 검사법이 존재하지 않기 때문에 육안으로 보이는 특징적인 증상, 혈액검사 결과 등을 종합하여 RA의 진단을 내리고 있다. 현재 병원에서 사용하고 있는 류마티스 관절염 검사 마커로서 류마티스 인자(rheumatoid factor, RF)와 anti-CCP(anti-Cyclic citrulinated peptide) 항체가 있으며, 이를 이용한 면역학적 어세이가 이용되고 있다. 한국 공개특허 제2014-45409호의 경우 초기 류마티스성 관절염의 진단방법에 관한 것으로 면역학적 어세이가 이용된다.
그러나 이 경우 민감도가 낮고 정량분석의 정확도가 낮아 개인 맞춤형 진단이나 치료 중 질환의 진행 정도에 관한 정보를 제공함에 있어 미흡하다. 더욱 높은 민감도뿐만 아니라 정확도가 높은 분석법의 개발은 향 후 고령화 사회의 건강한 사회를 위한 맞춤형 관절염 유무에 관한 정보제공, 치료 중 질환의 진행 정도에 관한 정보를 제공하는데 꼭 필요한 실정이다.
본 발명에서는 기존의 면역학적 어세이가 아닌 형광검출기가 장착된 모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence: CE-LIF) 시스템을 이용하여 민감하고 정확한 정량분석을 수행하는 것으로, 분석의 정확도를 향상시키는 방법에 역점을 두었다.
한국 공개특허 제2014-45409호
위와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 발명자들은 형광검출기(laser induced fluorescence)가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템을 이용하되, CCP 단백질 또는 CCP11A 단백질을 류마티스 관절염 환자의 혈액 또는 소변 시료(분석시료) 내에 첨가하고 시료 내 anti-CCP 항체를 정량 분석하여 류마티스 관절염 진단 및 진행 정도를 확인하는 경우, 민감도(Sensitivity) 100% 이상, 정량 분석법의 특이도(Specificity) 80% 이상인 매우 정확한 진단이 가능하여, 기존의 류마티스 관절염 진단방법 보다 유용하게 이용될 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 형광검출기가 장착된 모세관 전기영동을 이용한 류마티스 관절염 진단방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 류마티스 관절염 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는데 있다.
위와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 분석시료에 형광물질이 결합된 CCP 단백질 또는 CCP11A 단백질 또는 이들의 혼합물을 첨가하여 시료 내 anti-CCP 항체를 분리하는 단계; (b) 형광검출기(laser induced fluorescence)가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템을 이용하여 분석시료 내의 anti-CCP 항체를 정량적으로 분석하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 결과를 형광검출기로 수집하여 류마티스 관절염 진단 및 진행 정도를 확인하는 단계를 포함하는 형광검출기가 장착된 모세관 전기영동을 이용한 류마티스 관절염 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 류마티스 관절염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자로부터 채취한 분석시료로부터 CCP 단백질 또는 CCP11A 단백질 또는 이들의 혼합물과 anti-CCP 항체의 복합체의 정량곡선을 측정하고, 정상 대조군과 대비하여 류마티스 관절염이 있다고 진단하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명에 따른 류마티스 관절염 진단방법은 개체의 류마티스 관절염을 진단 또는 치료 중 진행정도를 파악하는데 필요한 정보를 효율적으로 얻을 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 류마티스 관절염 진단방법은 형광검출기가 장착된 모세관 전기영동 장치(CE-LIF 장비)를 이용하여 기존에 사용되고 있는 CCP 단백질 뿐만 아니라 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 진단 특이도가 우수한 CCP11A 단백질을 동시에 사용하고, 민감도(Sensitivity) 100% 이상, 정량 분석법의 특이도(Specificity) 80% 이상인 매우 정확한 진단이 가능하여 기존의 류마티스 관절염 진단방법 보다 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 혈액에 존재하는 CCP 항체와 결합시키기 위한 항원으로 FITC가 라벨링된 CCP 단백질(a)와 CCP11A 단백질(b)의 전기영동도(Electropherogram)의 결과이다.
도 2는 F-CCP 단백질(a)와 F-CCP11A 단백질(b)의 정량곡선이다.
도 3은 anti-CCP 와 CCP의 복합체를 검출 시 피크의 특이성을 측정한 전기영동도(Electropherogram)의 결과이다(PBS를 사용하여 시리즈로 희석한 anti-CCP 와 CCP 항원을 반응시킨 결과(a); PBS를 사용하여 시리즈로 희석한 anti-CCP와 human IgG serum 을 반응시킨 결과(b); FBS를 사용하여 시리즈로 희석한 anti-CCP와 CCP 항원을 반응시킨 결과(c); FBS를 시리즈로 희석한 후 CCP 항원을 anti-CCP 없이 반응시킨 결과(d))
도 4는 F-CCP와 anti-CCP 복합체(a)와, F-CCP11A 및 anti-CCP complex 복합체(b)의 정량곡선이다.
도 5는 정상인(n=10)과 류마티스 환자(n=10) 시료를 F-CCP 단백질(a) 또는 F-CCP11A 단백질(b)과 반응 후 시럼 시료 내의 anti-CCP 와 F-CCP 복합체를 측정한 결과이다.
도 6은 F-CCP 단백질(a)과 F-CCP11A 단백질(b)에 대한 민감도(Sensitivity) 와 특이도(Specificity)를 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
먼저, 본 발명의 발명자들은 민감도와 정확도가 높아 류마티스 관절염의 질환 여부 및 진행 정도를 정확하게 진단하기 위해, 형광검출-모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence: CE-LIF) 시스템을 이용하여 CCP 단백질 또는 CCP11A 단백질를 사용하여, 분석시료인 환자의 시료 내에 존재하는 anti-CCP를 정량 분석하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염 진단방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 (a) 분석시료에 형광물질이 결합된 CCP 단백질 또는 CCP11A 단백질 또는 이들의 혼합물을 첨가하여 분석시료 내 anti-CCP 항체를 분리하는 단계; (b) 형광검출기(laser induced fluorescence)가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템을 이용하여 분석시료 내의 anti-CCP 항체를 정량적으로 분석하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 결과를 형광검출기로 수집하여 류마티스 관절염 진단 및 진행 정도를 확인하는 단계를 포함하는 형광검출기가 장착된 모세관 전기영동을 이용한 류마티스 관절염 진단방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 심혈관 질환의 발병 여부를 확인하거나, 나아가 질환의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "형광검출-모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence: CE-LIF)"은 형광검출기가 장착된 모세관 전기영동으로서, 모세관 전기영동을 이용하여 분자를 분리한 후, 분리된 분자들에 빛을 조사한 후 방출되는 형광을 이용하여 분자를 검출하는 것을 의미한다. 여기서, 모세관 전기영동은 전기장에 의해 이온들이 이동하는 현상을 이용하여 전하를 갖는 시료를 모세관에서 분리하는 방법이다. 모세관 전기영동은 당업계에 공지된 방법 및 기기를 이용하여, 기기의 제조사의 메뉴얼에 따라 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 일반적인 전기영동에 비해 신속하고, 효율적이며, 높은 민감성과 재현성을 가지고, 적은 시료의 양으로도 수행할 수 있는 장점이 있다. 그러나 사용되는 버퍼의 종류, 농도, pH, 모세관의 길이, 및 두께 등의 조건에 따라 동일한 시료라 할지라도 결과가 전혀 다르게 나올 수 있다.
본 발명에서는 모세관 전기영동으로 시료를 분리한 후, 분리된 시료를 UV 검출, 형광 검출, 또는 MS 검출 등의 방법을 이용하여 분리 결과를 측정할 수 있다. 상기 검출 방법은 당업계에 공지된 방법 및 기기를 이용하여, 기기의 제조사의 메뉴얼에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, 상기 형광 검출은 모세관에 중수소 램프를 이용하여 UV를 조사한 후, 시료로부터 방출되는 형광 파장을 광전자증배관 (photomultiplier)으로 증폭하여 검출하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 진단하는 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 다른 양상에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은 이미 언급된 설명과 같다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서 사용하는 분석시료는 혈장(plasma) 또는 뇨(urine)일 수 있다. 아울러, CCP 단백질은 서열목록 제1서열의 단백질이고, 상기 CCP11A 단백질은 서열목록 제2서열의 단백질을 사용한다. 서열목록 제2서열은 서열목록 제1서열에서 ‘S’를 ‘A’로 바꾼 것이며, 본 발명에서 anti-CCP와 결합하는 기질은 서열목록 제1서열과 서열목록 제2서열을 포함하는 15 ~ 30개 아미노산의 CCP 단백질이라면 사용될 수 있다([표 1] 참조).
구분 염기서열
CCP(서열목록제1서열) HCHQESTXGRSRGCG
CCP11A(서열목록제2서열) HCHQESTXGRARGCG
아울러, CCP 단백질 또는 CCP11A 단백질은 검출을 위한 라벨링(labeling)이 된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 라벨링(labeling)은 광학적 표지이며, 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오레세인(fluorescein), 로다민, 시아닌, 금속 포르피린 복합체, Cy-5 및 Cy-3로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 플루오레세인 염료는 6-카르복시플루오레세인(6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인(TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민(JOE), 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인, 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인, 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, 사용되는 버퍼는 용도에 따라 검출 분석을 위한 버퍼, 항체-항원 복합체 분리를 위한 버퍼, 또는 세포 용해를 위한 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 버퍼들은 당업계에서 통상적으로 사용되고 상업적으로 구입 가능한 버퍼들일 수 있다. 상기 분석을 위한 버퍼는 MOPS(3-(N-morpholino)propane sulfonic acid), 정제수 (distilled water), H3PO4,소듐 포스페이트, 보릭산(Boric acid) 및 CAPS(N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid)을 포함할 수 있다. 이때 버퍼의 상기 버퍼의 pH는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15, 또는 pH 1 내지 15 사이의 모든 값을 가질 수 있다. 그러나, 상기 검출 분석을 위한 버퍼의 pH는 9 내지 13, 10 내지 12, 또는 약 11일 수 있다.
이에 더욱 바람직하게는 N-시클로헥실-3-아미노프로판설포닉산(CAPS)을 사용하는 것이 좋다. 상기 CAPS의 농도는 0.1 M 내지 2M, 0.5 M 내지 1.5 M, 0.8 M 내지 1.2 M, 또는 0.9 M 내지 1.1 M일 수 있다.
아울러, 상기 검출 분석을 위한 버퍼는 베타인을 더 포함할 수 있다. 이때 상기 베타인은 바람직하게 0.5 M 내지 1.5 M의 농도로 버퍼에 포함될 수 있다. 또한, 분석 조건 중 모세관은 내경이 45 ~ 55 ㎛이고, 길이가 30 ~ 40cm이고, 전압은 모세관 내에 10 ~ 20 kV의 전압을 4분 ~ 5분 동안 적용하여 분리하는 것이 정확도, 정밀도, 재현성 면에서 더욱 우수하다. 이는 후술할 실시예를 통해 확인 가능하다.
아울러, 본 발명은 류마티스 관절염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,대상자로부터 채취한 분석시료로부터 CCP 단백질 또는 CCP11A 단백질 또는 이들의 혼합물과 anti-CCP 항체의 복합체의 정량곡선을 측정하고, 정상 대조군과 대비하여 류마티스 관절염이 있다고 진단하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다. 상기 대상자의 분석시료 내에 CCP 단백질 또는 CCP11A 단백질 또는 이들의 혼합물과 anti-CCP 항체의 복합체의 수치가 정상 대조군에 비하여 높으면 류마티스 관절염이라고 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따른 FITC가 라벨링된 CCP 펩타이드와 FITC가 라벨링된 CCP11A 단백질을 CE-LIF 장비를 사용하여 류마티스 관절염을 효율적으로 진단하는데 사용될 수 있음을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
실시예 1. 분석시료의 준비 및 CE- LIF를 이용한 anti- CCP와 복합체 검출
정상인과 류마티스 관절염 환자(Rheumatoid Arthritis, RA)의 시럼(serum, 분석시료)은 환자의 동의를 얻어 채취하였으며, 강남 성모병원 Institutional Review Board의 승인을 얻었다.
모세관 전기영동-레이저 유도 형광(Capillary electrophoresis-Laser Induced Fluorescence: CE-LIF) 분석을 위한 버퍼는 다음과 같이 제조하였다. 먼저 1M의 베타인(Betaine)을 포함하는 1M의 N-시클로헥실-3-아미노프로판설포닉산(N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid: CAPS, pH 11)을 0.2 μm 공극 크기의 막에 통과시켰다. 이후 초음파 처리로 가스를 제거한 후 분석에 사용하였다.
장비는 Beckman Coulter 사의 PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System (Fullerton, CA, USA)이고, 형광 검출기(Laser Induced Fluorescence detection, 488 nm excitation, 520 emission)을 사용하였다. 측정에 활용한 모세관 컬럼(Capillary column)의 길이는 39 cm, 내경은 50 μm 이었고, 최초 사용 시 1M 소윰 하이드록사이드(sodium hydroxide)로 30 분, 증류수로 30 분, CAPS (pH 11, 1 M Betaine)로 30분 워싱(washing) 및 평형화(equilibration)를 시킨 후 사용하였고, 시료와 시료 사이에는 1 M NaOH(2 분), DW(2 분), 러닝 버퍼(running buffer, 3 분)로 워싱(washing) 및 평형화(equilibration)를 수행하였다. 아울러, 시료의 주입은 0.5 psi로 5초 동안 흘려주었으며, 15 kV 로 9분 동안 시료를 분리 검출하였다. 이동시간과 피크의 면적은 32 KaratTM8.0 Software(P/ACETMMDQ,BeckmanCoulter)로 분석하였다.
측정 결과로서, 도 1은 류마티스 관절염의 바이오 마커인 anti-CCP와 복합체를 형성하여 환자의 질환 유무에 관한 정보를 주기 위한 F-CCP와 F-CCP11A 단백질을 측정한 전기영동도(Elctropherogram) 결과이다. 이동시간(migration time, MT)은 모두 4.2 ± 0.1 분이었다. 도 2는 F-CCP와 F-CCP11A의 정량곡선 결과이다. R2값은 0.99이상으로 매우 직선성이 매우 우수하였다.
도 2는 F-CCP 단백질(a)과 F-CCP11A 단백질(b)의 정량곡선이다. F-CCP와 F-CCP11A 모두 직선성이 0.99 이상으로 매우 높았으며, 선형 동적 영역(linear dynamic range)은 0.012 ~ 1.0 μg/ml 였다. F-CCP의 정량곡선식은 y=527150x-4517 이었고, F-CCP11A의 정량곡선식은 y=425035x-2118이었다.
실시예 2. CE- LIF 분석 조건의 최적화
본 발명에 따른 모세관 전기영동 분석법을 최적화하기 위하여, 분리전압, 버퍼의 종류와 pH를 변화시켜 F-CCP와 F-CCP11A의 흡광도가 높고, 안정성이 높은 조건을 확인하였다. 우선 측정에 사용하는 전압을 테스트하였다. 버퍼의 전기적 흐름의 안정성을 Ohm’s plot 으로 측정하였다. 이때, 테스트한 버퍼의 종류는 MOPS(3-(N-morpholino)propane sulfonic acid), DW(distilled water), H3PO4,소듐 포스페이트, 보릭산(Boric acid), CAPS (N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid)이었으며, pH는 2.15에서부터 11까지(pH 2.15, 3, 7, 8, 9, 10 및 11)를 테스트하였다. 아울러, 100 mM 버퍼에 전기의 전압을 5 kV에서부터 30 kV까지 5 kV씩 올려가면서, 2분 동안의 전기적 흐름의 안정성을 측정한 후, 2분 동안 가장 안정적인 전기적 흐름을 보여주는 분리전압 15 kV를 선택하였다.
그 결과, 버퍼의 종류는 CAPS(pH 11)이 가장 적합한 버퍼로 나타났다. pH가 높고 염도가 높을수록 기질이 안정하고 흡광도가 높았다. 100 mM CAPS 버퍼를 사용하였을 때, 다른 농도의 CAPS 버퍼 보다 50% 향상된 흡광도를 보였다.
아울러, 0.5 M, 1.0 M, 1.5 M의 농도로 베타인을 포함하는 100 mM CAPS 버퍼에 대해서 추가 실험을 하였으며, CAPS(pH 11)을 단독으로 사용하였을 때 보다 베타인을 포함하는 경우 이동시간의 재현성이 2배 이상 향상 되었다. 1.0 M 베타인을 포함하는 경우가 이동시간의 재현성이 최대치로서 2% 미만이었다.
이에, 최적화된 분석 조건 중 버퍼는 0.5 M 내지 1.5 M의 농도로 베타인, 더욱 바람직하게는 1.0 M의 베타인을 포함하는 100 mM CAPS이었으며, 전압은 모세관 내에 10 ~ 20 kV의 전압을 4분 ~ 5분 동안 적용하여 분리하는 것이 정확도, 민감도, 재현성 면에서 더욱 우수함을 알 수 있었다.
실시예 3. CE- LIF를 이용한 류마티스 관절염 마커 분석법 비준
시럼(serum) 내의 anti-CCP 항체의 양을 정량 분석하여, 환자의 류마티스 관절염 유무에 관한 정보를 제공하기 위하여, CE-LIF를 사용한 류마티스 관절염 어세이법을 개발하였다.
이 방법을 비준하기 위하여, 분석대상물질인 F-CCP, F-CCP11A를 1.0 μg/ml에서부터 연속 희석법(serial dilution)으로 LOQ, LOD값을 얻을 때까지 측정하였다.
LOD는 신호 대 잡음 비(signal to noise ratio)가 3, LOQ는 10이 될 때의 값으로 결정하였다. 측정한 LOD는 2 (F-CCP) 또는 4 (F-CCP11A) ng/ml 였다. LOQ는 따라서 각각 6 또는 12 ng/ml 였다. 내부-(Intra-), 상호(Inter-) 검증(validation)을 위해서, 0.012 1 μg/ml 의 다섯 가지 다른 농도의 표준물질로 정량곡선을 만들고, 농도의 동적 범위(dynamic range) 중에서 중고값(medium high) (0.5 μg/ml)과 중저값(medium low) (0.1 μg/ml)을 선택하여, 3일의 서로 다른 날(Interday), 또는 하루 내(Intraday) 세 번, 3중(triplicate)의 시료를 분석하여, 분석법의 정확도, 정밀도, 재현성을 검증하였다. 그 결과는 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다. 인터-유효성 및 인트라-유효성 검증 결과에서 재현성(Reproducibility)은 상대적인 오차의 백분율로 계산하였고, 모든 시료는 세 번 반복 실험하였다.
Intra-validation QC sample (μg/ml) Reproducibility (%) Accuracy(%)
CCP11A 0.5 3.6 ± 1.8 102 ± 0.6
0.1 2.7 ± 1.0 107 ± 4.6
CCP 0.5 1.5 ± 0.4 98 ± 1.2
0.1 4.0 ± 0.4 105 ± 1.0
Inter-validation QC sample (μg/ml) Reproducibility (%) Accuracy (%)
CCP11A 0.5 2.0 ± 1.4 109 ± 4.1
0.1 2.9 ± 0.7 106 ± 1.5
CCP 0.5 1.5 ± 0.6 97 ± 1.2
0.1 4.9 ± 3.9 94 ± 7.5
표 2 및 표 3의 결과를 통해, 재현성과 정확성이 우수함을 알 수 있었다.아울러, 도 2의 (a)는 F-CCP 표준물질의 농도에 따른 피크 면적의 정량 곡선을 나타낸 것이고, 도 2의 (b)는 F-CCP11A 표준물질의 농도에 따른 피크 면적의 정량 곡선을 나타낸 것으로, F-CCP와 F-CCP11A 모두 직선성이 0.99 이상으로 매우 높았다.
실시예 4. 실제 분석시료의 분석
비준한 CE-LIF 장비를 사용한 류마티스 관절염 진단방법을 실제 분석시료에 적용하여 분석하였다.
구체적으로, 정상인(n=10)과 류마티스 환자(n=10)의 시럼(serum) 시료를 F-CCP 또는 F-CCP11A 단백질과 37℃에서 약 20시간 정도 오버나이트(overnight)하여 반응 후 시럼 시료내의 anti-CCP 와 F-CCP 복합체를 측정한 결과, 비특이적인 피크 외에 특이적인 피크를 이동시간 3.1 ± 0.2 분에 관찰할 수 있었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, anti-CCP가 들어 있지 않은 IgG나 FBS에서는 복합체 피크가 검출되지 않았으며, IgG나 FBS와의 비특이적인 결합을 제외함으로써 특이적인 F-CCP 와 anti-CCP의 복합체를 확인할 수 있었다.
아울러, 부분 정제된 anti-CCP 항체를 가지고 F-CCP와 anti-CCP 복합체; 또는 F-CCP11A 와 anti-CCP 복합체의 정량곡선을 측정하여, 도 4에 나타내었다. 이때 제조한 폴리클로날 anti-CCP는 IgG로 일차 정제한 산물(product)이지만, 순도가 낮아(~ 60%) X-축의 anti-CCP 농도는 정확한 항체의 농도가 아니고, 부분 정제된 폴리클로날 anti-CCP 포함 시럼의 총 단백질 농도이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 일정한 양(50 μg/ml)의 F-CCP 또는 F-CCP11A를 사용하였을 때, 결합하는 anti-CCP의 양이 증가하였으며, 선형 동적 영역(linear dynamic range)은 10 ~ 90 μg/ml 이었고, 직선성은 F-CCP의 경우 0.989, F-CCP11A의 경우 0.986 이었다.
또한, 본 발명에 따른 분석법을 정상인(n=10)과 류마티스 환자(n=10) 시료에 적용하였을 때, F-CCP 또는 F-CCP11A 단백질과 반응 후 시럼 시료 내의 anti-CCP 와 F-CCP 복합체 또는 anti-CCP와 F-CCP11A 복합체를 측정하여, 정상인(HT, Healthy control)대 류마티스 관절염 환자(RA, Rheumatoid Arthritis)의 피크 면적을 비하여 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, F-CCP와 F-CCP11A 모두 CE-LIF를 이용하여 류마티스 관절염 진단(RA diagnosis)에 사용할 수 있는 우수한 결과를 보였다. 보다 상세하게, 민감도(Sensitivity)는 공히 100%, 특이도(Specificity)은 F-CCP11A의 경우 80%, F-CCP의 경우 90% 이었다. 시럼 내의 내인성 anti-CCP의 양이 매우 적어서 (< 1 μg/ml), CE-LIF 방법을 사용할 때에는 일정한양의 부분 정제된 anti-CCP(20 μg/ml)를 시럼에 첨가하여 측정하였다.
실시예 5. 통계적 분석
실험결과의 통계적인 분석은 MedCalc ver 7.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium)를 사용하였으며, t-test와, 특이도(specificity), 민감도(sensitivity), 및 ROC(receiver operating curves) 분석을 실시하였다. 계산된 P 값이 0.05 보다 작을 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다. 분석물 이동시간, 피크 높이, 피크 면적은 32 KaratTM8.0Software(P/ACETMMDQ,BeckmanCoulter)로 기록하였다.
표 4에 나타낸 바와 같이, CE-LIF 분석법과 ELISA 분석법의 특이도(specificity), 민감도(sensitivity), 그리고 AUC (area under curve)를 분석한 결과이다.
이때, ELISA 분석법은 상기 실시예 4와 동일한 샘플을 이용하되, 통상의 상업적으로 판매하는 ELISA Kit를 Axis-Shield, Diagnostics limited에서 구매하여 사용하였다(The technology park, Dundee DD2 1 XA, United Kingdom). 아울러, CCP-11A에 대해서는 house made ELISA 를 이용하여 진단하였다. 구체적으로, house made ELISA의 경우, 우선 CCP를 투명한 96 well plate에 고정시키고(CCP 10 ug/ml, 200 ul, RT, 1 hour), BSA(bovine serum albumin)로 비특이적 결합(non-specific binding)을 블로킹(blocking)한 후, PBS(0.1 % Tween 20+PBS)를 사용하여 세 번 워싱(washing) 하였다. 류마티스 관절염 환자와 정상인의 시럼(serum)을 1:200으로 희석하여, 항원에 결합 시킨 후, 샌드위치 어세이를 진행하였다. 마지막에 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(reference 620 nm).
예상대로 CE-LIF 분석법의 민감도(sensitivity)가 가장 높았으며, 상업적으로 판매하는 ELISA Kit의 민감도가 가장 낮았다. 특이도(specificity)의 경우에는 상업적으로 판매하는 ELISA Kit와 CCP-11A를 사용한 house made ELISA 가 가장 높은 결과를 보였다. ROC 분석결과, 새로 셋업한 CE-LIF를 사용한 류마티스 관절염(RA) 진단에 관한 정보를 제공하는 방법이 높은 정확도를 보여 병원에서 사용된다면 관절염환자의 질환 진행 정도를 확인하는데, 유용할 것으로 판단된다.
구분 CE-LIF ELISA (house made) ELISA (commercial)
항원 CCP CCP11A CCP CCP11A CCP 관련 펩타이드
Sensitivity (%) 100 100 93 87 75
Specificity (%) 90 80 89 100 100
AUC 0.98 0.97 0.97 0.98 0.91
따라서, 본 발명에 따른 류마티스 관절염 진단방법은 형광검출이 장착된 모세관 전기영동 장치(CE-LIF 장비)를 이용하여 기존에 사용되고 있는 CCP 단백질 뿐만 아니라 골관절염에 대한 류마티스 관절염의 진단 특이도가 우수한 CCP11A 단백질을 사용하여, 민감도(Sensitivity) 100% 이상, 정량 분석법의 특이도(Specificity) 80% 이상인 매우 정확한 진단이 가능하여, 기존의 류마티스 관절염 진단방법 보다 유용하게 이용될 수 있다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF RHEUMATOID ARTHRITIS USING CAPILLARY ELECTROPHORESIS WITH LASER INDUCED FLUORESCENCE <130> DP-2017-0102 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> CCP <400> 1 His Cys His Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Arg Gly Cys Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> CCP11A <400> 2 His Cys His Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Ala Arg Gly Cys Gly 1 5 10 15

Claims (9)

  1. 하기 단계를 포함하는 형광검출기가 장착된 모세관 전기영동을 이용한 항-시클릭 시트룰리네이티드 펩티드(anti-CCP) 항체의 정량분석 방법 :
    (a) 분석시료에 형광물질이 결합된 CCP 단백질 및 CCP11A 단백질의 혼합물을 첨가하여 분석시료 내 anti-CCP 항체를 분리하는 단계;
    (b) 형광검출기(laser induced fluorescence)가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템을 이용하여 분석시료 내의 anti-CCP 항체를 정량적으로 분석하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 결과를 형광검출기로 수집하는 단계;를 포함하며,
    상기 모세관 전기영동 시스템에서 분석을 위해 사용하는 버퍼는 pH 10.5 내지 11.5인 용액으로서, 0.5 ~ 1.5 M의 베타인을 포함하는 0.1 ~ 2 M의 N-시클로헥실-3-아미노프로판설포닉산(N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid: CAPS)이며,
    상기 분리는 모세관 내에 13 ~ 17 kV의 전압을 4 ~ 5분 동안 적용하여 분리하는 것인,
    항-시클릭 시트룰리네이티드 펩티드(anti-CCP) 항체의 정량분석방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 CCP 단백질은 서열목록 제1서열의 단백질이고, 상기 CCP11A 단백질은 서열목록 제2서열의 단백질인, 항-시클릭 시트룰리네이티드 펩티드(anti-CCP) 항체의 정량분석방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 분석시료는 혈장(plasma) 또는 뇨(urine)인, 항-시클릭 시트룰리네이티드 펩티드(anti-CCP) 항체의 정량분석방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 모세관 전기영동 시스템에서 분석을 위해 사용하는 모세관은 내경이 45 ~ 55 ㎛이고, 길이가 30 ~ 40 cm인, 항-시클릭 시트룰리네이티드 펩티드(anti-CCP) 항체의 정량분석방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
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