JPS59143957A - ヒトヘモグロビンの分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液体クロマ１〜グラフイーによるヒトヘモグ
ロビンの分析方法に関するものである。

ヘモグロビン（以下ｑ１にＩ−Ｉ　１）と記す）は、ヘ
ム核とグロビン蛍白とから成る皿色素蛍白であり、酸素
分圧の変化（こ従って酸素との結合及び酸素の放出をお
こない、動物体内の酸素運搬体として重要な役割を果し
ている。

一方、ヒトＴ−１１）は血液中でグルコースと短時間接
触（クルコース濃度（こ依存するか約３０分程度）する
こと（こより不安定型グルコース化Ｈｌ）（以下ＬＧ１
−１１）と記す）を生成し、さらに長時間グルコースと
接触（数１０１１乃至数か月）することにより安定型グ
ルコース化ＩＩｆ〕（以下５（）ＩＩＩ）と記す）を生
成することが知られている。

このＳ　Ｇ　Ｉ−１１）は、糖尿病患者の血糖制御の指
標とすることができ、これを筒中−にそして迅速に測定
する方法か望まれている。

現在迄に報告されているクロマトグラフィー〇こよるヒ
）　］（ｂの分析法とその結果得られた両分名とを示す
と第１表のとおりである。

第　　　１　　　表 第１表中においてＨＰ　Ｌ　Ｃ法（Ｉｌｉｇｈｐｅｒｆ
ｏｒｍａｎｃｅ　Ｊ、１ｑｕｉｄ　（：ｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｌ＋ｙ　）として示したヒｌ−Ｈｂの分析法は
２本発明者ら番こより発明され既番こ特許出願された方
法である（特開昭５７−１３５３５６号）が、シリカゲ
ルを充填剤とし、溶離液中の塩濃度を連続的に変化させ
ることＯこより、１６個のヒトｌ−１１）分画（二分離
定駄するものであり、　Ｉ−（、ｌ〕、　ＬＧＩ−１１
）及びＳ　ＯＨｌ〕を詳細（こ分離定量する方法である
。

しかし乍ら、上記ＨＰＬＣ法は、得られる結果が精密で
あ゛るカーその反面装置か若干視性であり、操作（こ熟
練を要し２分析に要する時間も比較的長いと言う欠点が
あった。

本発明者らは、−］二起重（Ｌ’　Ｌ　Ｃ法くこよる画
分中■」ｈ　ｕ〜Ｈｂ、Ｇこおいて、　Ｉ（ｂ、ｏ及び
ｌ−Ｉ　１）ｌ　＋の存在量は少数であるところからＬ
ＧＩ−１１：１７及びＬＧ　Ｉ（Ｉ＊、を除去するとと
もζこ、特定のｐ　ｉ（範囲の緩衝液を選択することＱ
こよりＨｌ）６の含有しないＳ　Ｇ　Ｉ−Ｉ　１）、の
量をほぼ正確に検出定量することができること（こ着目
し。

上記欠点を排除する方法を検討し本発明を完成した。

本発明の）°１的は、　ＳＣ）＋４−１）を比較的簡単
な装置及び操作により、比較的単時間で、しかも多数の
試Ａ？゛１を同時Ｑこ分析する方法を提供するものであ
る。

すなわち２本発明は、不安定型グルコース化ヘモグロビ
ンを除去したヒＩ・ヘモグロヒン含有試許１を、セルロ
ース充填カラム（こ吸着させ２次いで該カラム（こ叶１
４．５〜８０の緩衝液を流通させることにより、ヒト安
定型グルコース化ヘモグロビンを分離することを特徴と
するヒ！・ヘモグロビンの分析方法をその要旨とするも
のである。

本発明のセルロ−ス充填カラム（こ（併用するセルロー
ス充ｊ偵剤としては、セルロースにカルボギシアルキル
基を導入したものを挙げることができる。カルボギシア
ルギル基としてはカルボキシエチル基（−（Ｊ（、−Ｃ
ＯＯＨ）、カルボキシエチル基が′好ましく使用される
。

本発明による不安定型グルコーヌ化ヘモグロビン（Ｌ（
）ｌ−ＴＩ））の除去法としては、（１）グルコース酸
化酵素により、グルコースをグルコン酸と過酸化水素と
ζこ分解する方法、（２）ヒドラジン又はヒドラジン誘
導体と反応させることにより。

グルコースをグルコースヒドラゾン（こ変換する方法、
■ｌ−Ｉｂｌ−Ｉｂ含有試食塩水中で透析する方法、あ
るいは■赤＋ｆｎ球を生理食塩水中でぶ置する方法など
を挙げることができる。

グルコース酸化酵素としては、　Ａｓｐｃｒｇｉｌｌｕ
ｓこれらのグルコース酸化酵素を適当な担体に固定した
固定化酵素を使用することもできる。該担体としては例
えば粒状あるいは膜状のものを挙げることができる。

ヒドラジン誘導体としては、抱水ヒドラジン２ヒトロキ
シルアミンセミカルバシノト、チオセミカルバジット等
を挙げることができる。またグルコース上１−ラゾンの
生成に際し、これらの反応液中※こ触媒を加えること（
こより２反応時間を短縮することができるが、該触媒と
しては。

ビリンン、酢酸などを挙げることができる。

本発明は、グルコ−ヌ酸化酵素等と反応させてＩ、Ｇ１
１ｌ）を予め除去した１−１ｂ含有試料を、前記セルロ
ース充填カラム（二流通吸着させ２次いで該カラムＯこ
ｒ）Ｈ４，５〜８０の緩衝液を流通させて。

吸着Ｓ　Ｇ　Ｉ−１１９を溶離させることをこより行わ
れるが。

緩衝液としては燐酸、酢酸、クエン酸、ホウ酸等のカリ
ウノ・塩、ナトリウム塩等を含有する緩衝液を挙げるこ
とができる。

緩衝液としては、１）Ｈが低濃度から高濃度へ段階的に
変化する勾配方式を採用することがでとる。ｐ　Ｉ−Ｉ
勾配の作成法としては、各１）Ｈ値（こなる様な緩衝液
を別個に調製しておき、低１）Ｈ値の緩衝液一定量をカ
ラムに流通させたのち。

次いでよりＩ）Ｈの高い緩衝液を流４させる様な方式を
採用すれば良い。そして、各１）Ｉ−Ｈ値の流出液を各
両分として採取ずればよい。本発明Ｇこ使用する緩衝液
としては燐酸カリウム緩衝液を使用することができるが
、燐酸カリウム濃度とｒ）ｌ−１値とは密接な関係にあ
り、たとえば１０ミリモル濃度の燐酸カリウム緩衝液を
使用する場合（こは、該緩衝液中のＴ）Ｉ−１をＩ）Ｈ
が６２０から７２０を示す範囲で変化させた場合（こ最
も良好な分離が得られる。

本発明に使用する溶離液中に防腐剤としてアジ化すトリ
ウムを添加すること（こより、ｐｉ１ｉ化を防止するこ
とができる。

」−記の様な本発明の溶離方式を採用すること（こより
、今迄はヘモグロビン保持容量が小さいたＷ）（こグル
コース化１−１１）の迅速分析（こは用いられなかった
セルロースを充填剤※こ利用した類カラム（カラム長さ
ｌＱｃｍ以下）で、効率良く迅速ＱこＳ　ＯＪ−１１〕
を分析することが可能となった。

このようにしてヘモグロビン試料のカラムクロマ１〜グ
ラフイーを行ない、溶出させた各ＨＩ）画分の波長４１
５　ｎｍ　における吸光度を測定することにより、直接
的にＳ　Ｇｉ−Ｉ　１）の分離定石をおこなうことがで
きる。

以下実施例（こより本発明を説明するが９本発明は以下
の実施例に限定されるものではない。

実施例　１ イ）　溶血液の調製 ヘパリンナトリウム０．５ｍｇを入れた試験管Ｇこ。

ヒト血液５■］／を加え、混和後８００ＸＧの遠心分離
機を用いて１０分間遠心沈降し、得られた赤血球部分（
３１，５ｍ／の生理的食塩水を加え、充分混和したのち
再び遠心沈降を行ない、洗浄赤血球を得た。

洗浄赤血球１容に対し−（蒸留水４容を加えて充分攪拌
後、遠心沈降を行ない、」二清を溶血液として用いた。

口）　　ＬＧＨ＋）の除去 に］）　　グルコース酸化酵素によるＴ、ｙ（）Ｉ］Ｉ
）の除去」起重イ）＋こより調製した溶血液１容に対し
。

０１モル濃度の酢酸緩衝液ｐｌ（５，０を、１容加え。

さら（こＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｉ１１
来のグルコース酸ｃｘ５ｚＮｕ６Ａ’ｉ、　社製、　Ｇ
　９２５５　）　２００　ｍＵを加え、３７°Ｃで３０
分保温し反応を完結させた。

（１））　　セミカルバジノＦをこよるＬＧＩ−Ｔｌ）
の除去セミカルバ〉ノド試薬の組成 セミカルバジッド塩酸塩１６７ｇを氷酢酸２８６１ｎ／
及び蒸留水４５０１１１／に溶解し、水酸化すトリウム
を加えてｐ　Ｈを５０（こあわせた。この液に蒸留水を
加えて全量を５００ｍ１とした。

−１１記イ）Ｑこより調製した溶血液１容（こ対し。

上記セミカルバジッド試薬１容を加えて混和し、３７°
Ｃで３０分保温し反応を行なった。

ハ）　溶離液の調製 燐酸第一カリウム（ｆ（１（２ＰＯ，）　１．３６　ｇ
およびアシ化すトリウム（ＮａＮ、　）　Ｏ，ｉｇとを
蒸留水１０００ｍ／ｉこ溶解し、水酸化カリウム（ＫＯ
Ｉ−］　）（こて水素イオン濃度を調製した。水素イオ
ン濃度（ｐＩ−Ｉ　）を６４６としたものをＡ液、６８
４としたものを１３液、　６．９７としたものをＣ液と
して使用した。

二）　カラムの調製 カラム充」賞剤として、カルボギンメチル基をイオン交
換基として有するセルロースイオン交換体（ワットマン
社製、ＣＭ５２）を内径６．５ｒｒｕｎ　。

長さ５５　ｍｍのカラムに充填し、前記ノＡ）で調製し
たＡ液を充分流通し飽和させた。

ポ）　クロマトグラフィー操作 前記（ン１）及び（１〕）で調製した試料５０μＺを二
）で調製したカラムの−Ｌ端中心部に添加し１次いで該
カラス・※こ＋＞ｉＪ記ハ）のＢ液２ｍｌを流通させ。

カラム下部からの溶出液を廃棄した。次いで。

同１３液４．　ｍｌを追加流通させ、この溶出液を分取
し画分１とした。

次をこ、同Ｃ液４．５　ｍｌを流通させ、この溶出液を
分取し２画分２とした。

一方力うムＧ二添加した試料と同一のもの５０μ／を蒸
留水で希釈して、金用を５０ｍ１とし。

これを画分３とした。

以−ヒの方法で得た画分１，２及び３を波長４　］、　
５　ｎｍの比色計を用いて吸光度を測定し２次式（こて
各両分のｌｌｌ）含有量を比率として算定した。

計算式 １」的とする両分のヘモグロ、ビン含有量（係）目的と
する画分２の吸光度 画分３の吸光度 ５０　（ｍｌ　） 前記ｆａ）及び（ｂ）　Ｇこより得られた各々の５（３
１１１）の値は次の通りであった。

前記ホ）（こおけるカラム溶出液の吸光度を波長４１．
５　ｎｍで連続的（こ測定したタロマドグラムを第１図
に示した。

図中縦軸はカラム溶出液の吸光度を光学密度（０，［）
、）で示し、横軸は溶出液の試お１添加時からの液量（
ｍｌ　）を示している。図中ピーク（１０２）は画分］
、ピーク（１０３）は画分２゜また（　１０４　）は両
分１０分取開始点、、　（１０５）は両分２０分取開始
点、　（１０６）は両分２０分取終了点をそれぞれ示し
ている。

ヘモグロヒン含有試料として新鮮血液を用いた場合、第
１図中ピーク（：ａｌ）に相当する両分ハ、その可視部
の波長領域でのスペクトログラノ、からほとんどＴ（ｂ
を含有しないことが確認され、主としてＨｌ）以外の血
液中色素（ビリルビンなど）であると考えられる。また
ピーク（＋０２）は第１表カラムクロマｌ−？こよる分
類中Ｈｌ）　Ａ、、、及びｌ−ｌｌ）Ａ＋ｂの混合物に
相当する。

ヒ−／　（＋０３　）　ハ第１表のＩＴＰＬＣ法中＋　
ＳＯＬｌ）ａ　。

Ｈ，，１ｂ１ｎ及ヒＩ−ＴＩ）＋＋　ｉこ相当するが、
カラムクロマトによる分類のＴ（ｌ）Ａ、＋。画分（こ
はト■１）。及びＴｒｙ）■−ＩＩ）が含まれるのに対
し９本発明番こよって得たピーク（１０３）画分は、こ
れを含有しない。しがも。

Ｔ（ｌ）ＩＱ及びｌｌ１）１．はＳ　ＧＴ（Ｉ）−ｋこ
比較し含有量が小さいたｌ／）、ここで得られる両分は
、５ＧＨｌ）８を主とするものと考えて差支えない。

Ｉｊｉｆ記（１））の方法（こより実施したＴ−Ｃ））
［ｂの除去の効果確認を以トーの実験により行なった。

ヒト血液を前記イ）に準して処理し、洗浄赤＋ｆｎ、球
を得た。一方、グルコースを０　、１２５　。

２５０　、５００　（＋ηｇｉｒｌ／）の濃度で含有す
る・１種の等張圧燐酸緩衝液を２日本薬局方番こ準して
作成し、該グルコース溶液Ｇこ５分の１容の４−記洗浄
直球を浮遊させ、３７°Ｃで２時間保温反応させ、溶血
液を作成した。

該溶血液の一部をとり、そのまま前記ホ）のクロマトグ
ラフィー操作（こ基づいて分離定量を行なった。

該溶血液の他の一方は（１））の方法（こ従って処理し
たのち、ホ）のクロマトグラフィー操作に基づいて分離
定量を行なった。

以上の実験結果を第２図に示した。

第２図中縦軸中（２０１，）は画分２のト■１）含量を
百分率（％）で示し、横軸（２０２）は反応液中のグル
コース濃度を示している。また、×印実線（２０３）は
、前記（１））の方法で処理を行なわずに得た溶「■液
をそのまま前記ポ）の分離測定を行ってｌ−１１）−を
除去して得た値であり、○印実線（２０／ｌ　）は溶血
液を（１））の方法にて処理し、］、Ｇ１−１　ｂを除
去したのち該ホ）の分離４１１ｊ定を行って１−１１）
６を除去して得た値を示す。

（２０３）ではグルコース濃度が高い程、測定値の高く
なる傾向が認められるが、　（２０４）では反応液中の
グルコース濃度（二関係なくほぼ一定した値を示した。

すなわち（２０３）で示した増加分は＋　１１ｂとグル
コースとが反応して生成されたＴ、、Ｇ　Ｊ−Ｉ　１）
量（こ相当するものと考えられる。

本発明ＯこよりＬ　ＯＩ（ｂは、前記（１））の方法に
より除去でき、そしてホ）の操作（こより１−ｉｌ）、
が除去できるＳ　ＧＩ−Ｉ　１）の測定が可能であるこ
とが確認された。

−１−記のとおり本発明方法（こよれば、簡単な操作方
法により、一度番こ多数の検体を処理して５ＧＩ（ｌ）
を正確に分析することかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヘモグロビンの溶出曲線である。図中縦軸は溶
出液の４１５ｎｍの波長における吸光度を示し、横軸は
溶出液ｊ１７’、　（＋＋１／）を示している。 図中（１０１，）はＪ（ｌ）に関係ない血液中色素。 （ｉｏ２　）はｌ−１１）Ａ１．及びＪ（ｂＡＩｂ、そ
し、て（１０３）は５ＧＨｂ、を示す。 第２図は画分２のＨｌ）量の変化を示してし・る。 図中縦軸は画分２のｌ−１１，）　ニー？ｔ　（％）を
示し、横軸は緩衝液中のブドウ糖の濃度（ｍｇ　／　ｄ
　ｌ　）を示しティる。図中（２０３）はＩ、ＧＨｌ）
を除去せずに測定した場合のｉ−１１）量変化を示し、
（２０４，）はＬＧＩ−１１）を除去した場合の１−１
ｂ計変化を示す。 特許出願人　　　星　野　忠　夫 （ほか１名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）不安定型グルコース化ヘモグロビンを除去したヒ
   Ｉ・ヘモグロビン含有試料を、セルロース充填カラムに
   吸着させ７次いで該カラムＱこｐＩ−Ｉ　／１．５〜８
   ０の緩衝液を溶離液として流通させることにより、ヒＩ
   ・安定型グルコース化ヘモグロビンを分ｐＸＩＩ；する
   ことを特徴とするヒトヘモグロビンの分析方法。 （２、特許請求の範囲第１項記載のヒトヘモクロビンの
   分析方法Ｑこおいて、不安定型グルコース化ヘモグロビ
   ンの除去方法か、グルコース酸化酵素法、ヒ１−ラシン
   もしくはヒドラジン、透導体法、又は生理食塩水中（こ
   おける透析法もしくは生理食塩水中にふ置する方法であ
   るヒトヘモグロビンの分析方法。 （３）特許請求の範囲第１項記載のヒトヘモグロビンの
   分析方法（こおいて、セルロース充填カラムが、カルホ
   キンアルキル基を有するセルロースを充填したカラムで
   あるヒトヘモグロビンの分析方法。