JPS62857A - 生体試料中のグルタチオンの分析方法 - Google Patents
生体試料中のグルタチオンの分析方法Info
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- JPS62857A JPS62857A JP132886A JP132886A JPS62857A JP S62857 A JPS62857 A JP S62857A JP 132886 A JP132886 A JP 132886A JP 132886 A JP132886 A JP 132886A JP S62857 A JPS62857 A JP S62857A
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- orthophthalaldehyde
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、生体試料中のグルタチオンの分析法に関する
ものである。
ものである。
グルタチオンは、生物界に広く分布しているチオール化
合物で、細胞内に存在し生体の酸化還元状態の調節、解
毒機能に重要な役割を果たしている。又、グルタチオン
は各種疾患、薬物、重金属の中毒、アレルギーなどの治
療に広く用いられている。従って生体試料中のグルタチ
オンを分析することは、医学的、薬学的、生化学的に重
要である。
合物で、細胞内に存在し生体の酸化還元状態の調節、解
毒機能に重要な役割を果たしている。又、グルタチオン
は各種疾患、薬物、重金属の中毒、アレルギーなどの治
療に広く用いられている。従って生体試料中のグルタチ
オンを分析することは、医学的、薬学的、生化学的に重
要である。
現在行われている生体試料中のグルタチオンの分析法と
しては、５．５゛−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
を用いる方法が挙げられる。しかしながらこの方法は生
体試料中に含まれる蛋白質を除くことが必要で、操作が
煩雑であり、又除蛋白操作に伴うグルタチオンの損失等
の誤差を生じ易い欠点を有する。又、グルタチオンＳ−
トランスフェラーゼ等の酵素を用いる方法を挙げること
ができる〔シー・クローリイ他、バイオケミ・メデイ
（Ｃ。
しては、５．５゛−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
を用いる方法が挙げられる。しかしながらこの方法は生
体試料中に含まれる蛋白質を除くことが必要で、操作が
煩雑であり、又除蛋白操作に伴うグルタチオンの損失等
の誤差を生じ易い欠点を有する。又、グルタチオンＳ−
トランスフェラーゼ等の酵素を用いる方法を挙げること
ができる〔シー・クローリイ他、バイオケミ・メデイ
（Ｃ。
Ｃｒｏｗｌｅｙ ａｔ ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｍ
ｅｄ、 ） １３ｔ２８７） ｏこの方法はグルタチオ
ンに対する選択性は高いと言われているが、酵素が非常
に高価であり、日常の臨床検査に用いることは実質的に
不可能である。
ｅｄ、 ） １３ｔ２８７） ｏこの方法はグルタチオ
ンに対する選択性は高いと言われているが、酵素が非常
に高価であり、日常の臨床検査に用いることは実質的に
不可能である。
又、イオン交換カラムを用いて生体試料中のグルタチオ
ンを分析することもできるが〔オウ・ダブリユウ・グリ
フイス、エイ・マイスター、プロス・ナアチル・アカデ
・サイ（０，Ｗ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、 Ａ。
ンを分析することもできるが〔オウ・ダブリユウ・グリ
フイス、エイ・マイスター、プロス・ナアチル・アカデ
・サイ（０，Ｗ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、 Ａ。
Ｍｅｉｓｔｅｒ、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、二ｌ ２２４９（１９８０）
） 、除蛋白操作が必要であり、前述の如き不都合を生
じる可能性が、ある。又、グルタチオンと発螢光物質を
予め反応させた後、ＯＤＳ等の逆相系液体クロマトグラ
フィーカラムを用いて分析する方法を挙げることができ
る〔エイチ・タカハシ他、アゲリカ・パイオル・ケミ（
Ｈ，Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔ ａｌ＋Ａｇｒｉｃ、 Ｂ
ｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、、 ） Ｑ、１４３９ （’７９
） ；ジェー・リーベ他、ジー・クロマトグル（Ｊ
、 Ｒｅｅｖｅ ｅｔ ａｈ Ｊ、 Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒ、＋ ） １９４４２４ （’８０ ） ；デ
ー・ジェー・リード他、アナル・バイオヘミ （Ｄ、Ｊ
、Ｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ＋ Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、＋ ） Ｉ０６ ５５ （’８０）；ジー・エル
・ニュートン他、アナル・バイオヘミ （Ｇ、Ｌ、 Ｎ
ｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ
、）１に４．３８３ （’８１） ） 、これらの方法
はいずれも除蛋白操作を必要とするため、やはり操作が
煩雑になり、誤差を生じる可能性があると同時に低分子
相互を分離する必要があるため時間がかかる。又逆相系
のカラムを用いてグルタチオンを他の低分子化合物と分
離した後、ボストカラムで発螢光反応を行わせて分析す
る方法もあるが（チー・ムラヤマ、チー・キノシタ、ア
ナル・レット（Ｋ、 Ｍｕｒａｙａｍａ＋ Ｔ、 Ｋｉ
ｎｏｓｈｉｔａ＋ Ａｎａｌ、 Ｌｅｔｔ、 ） Ｉ
４，１２２１（’８１ ）；エイチ・ナカムラ、ゼット
・タムラ、アナル・ヘム（Ｉｔ、 Ｎａｋａｍｕｒａ、
Ｚ、Ｔａｍｕｒａ、 Ａｎａｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）刹、
２１９０ （’８１ ） 、二村他、日本臨床化学会
年会記録第２３集（’８３ ’） ） 、この方法にお
いても除蛋白操作が必須であり、前述の如き問題を生じ
る可能性がある。
Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、二ｌ ２２４９（１９８０）
） 、除蛋白操作が必要であり、前述の如き不都合を生
じる可能性が、ある。又、グルタチオンと発螢光物質を
予め反応させた後、ＯＤＳ等の逆相系液体クロマトグラ
フィーカラムを用いて分析する方法を挙げることができ
る〔エイチ・タカハシ他、アゲリカ・パイオル・ケミ（
Ｈ，Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔ ａｌ＋Ａｇｒｉｃ、 Ｂ
ｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、、 ） Ｑ、１４３９ （’７９
） ；ジェー・リーベ他、ジー・クロマトグル（Ｊ
、 Ｒｅｅｖｅ ｅｔ ａｈ Ｊ、 Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒ、＋ ） １９４４２４ （’８０ ） ；デ
ー・ジェー・リード他、アナル・バイオヘミ （Ｄ、Ｊ
、Ｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ＋ Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、＋ ） Ｉ０６ ５５ （’８０）；ジー・エル
・ニュートン他、アナル・バイオヘミ （Ｇ、Ｌ、 Ｎ
ｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ
、）１に４．３８３ （’８１） ） 、これらの方法
はいずれも除蛋白操作を必要とするため、やはり操作が
煩雑になり、誤差を生じる可能性があると同時に低分子
相互を分離する必要があるため時間がかかる。又逆相系
のカラムを用いてグルタチオンを他の低分子化合物と分
離した後、ボストカラムで発螢光反応を行わせて分析す
る方法もあるが（チー・ムラヤマ、チー・キノシタ、ア
ナル・レット（Ｋ、 Ｍｕｒａｙａｍａ＋ Ｔ、 Ｋｉ
ｎｏｓｈｉｔａ＋ Ａｎａｌ、 Ｌｅｔｔ、 ） Ｉ
４，１２２１（’８１ ）；エイチ・ナカムラ、ゼット
・タムラ、アナル・ヘム（Ｉｔ、 Ｎａｋａｍｕｒａ、
Ｚ、Ｔａｍｕｒａ、 Ａｎａｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）刹、
２１９０ （’８１ ） 、二村他、日本臨床化学会
年会記録第２３集（’８３ ’） ） 、この方法にお
いても除蛋白操作が必須であり、前述の如き問題を生じ
る可能性がある。
上述の方法は何れもチオール基を有する還元型グルタチ
オン（ＧＳＨ）のみを分離、検出、定量する方法である
。生体中にはＧＳＨの他にＧＳＨが２分子結合して生じ
る酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）も存在しており、Ｇ
ＳＨのみならずＧ５５Ｇも定量することが好ましい。Ｇ
ＳＨとＧ５５Ｇの両者を同時に定量する方法としては、
イオン交換カラムを用いてＧＳＨとＧ５５Ｇを分離し、
ＧＳＨ及び／又はＧ５５Ｇを含む溶出液に、グルタチオ
ンレダクターゼとニコチンアミド−アデニンジヌクレオ
チドホスフェート還元型（ＮＡＤＰＨ） 、５．５”−
ジチオビス−（２−ニトロベンゾインクアシッド（ＤＴ
ＮＢ）を加えて発色させ、検出定量する方法が知られて
いる〔エイ・ジェイ・アル−パート他、アナル・バイオ
ケム（八、Ｊ、ＡＩｐｅｒｔ。
オン（ＧＳＨ）のみを分離、検出、定量する方法である
。生体中にはＧＳＨの他にＧＳＨが２分子結合して生じ
る酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）も存在しており、Ｇ
ＳＨのみならずＧ５５Ｇも定量することが好ましい。Ｇ
ＳＨとＧ５５Ｇの両者を同時に定量する方法としては、
イオン交換カラムを用いてＧＳＨとＧ５５Ｇを分離し、
ＧＳＨ及び／又はＧ５５Ｇを含む溶出液に、グルタチオ
ンレダクターゼとニコチンアミド−アデニンジヌクレオ
チドホスフェート還元型（ＮＡＤＰＨ） 、５．５”−
ジチオビス−（２−ニトロベンゾインクアシッド（ＤＴ
ＮＢ）を加えて発色させ、検出定量する方法が知られて
いる〔エイ・ジェイ・アル−パート他、アナル・バイオ
ケム（八、Ｊ、ＡＩｐｅｒｔ。
ｅｔ、 ａｌ、＋Ａｎａ１． Ｂｉｏｃｈｅｍ、） １
４４５５３ （’８５ ） ）。
４４５５３ （’８５ ） ）。
この方法はＧＳＨとＧ５５Ｇの両者を定量できる点で優
れているが、発色試薬の一つとして高価でかつ不安定な
酵素（グルタチオンレダクターゼ）を用いるため、分析
のコスト及び再現性の点で問題がある。又、ＤＴＮＢは
グルタチオンのみならず他のチオール基を有する物質、
例えばシスティンとも反応し発色するので、測定結果に
誤差を生じる可能性があり、好ましくない。
れているが、発色試薬の一つとして高価でかつ不安定な
酵素（グルタチオンレダクターゼ）を用いるため、分析
のコスト及び再現性の点で問題がある。又、ＤＴＮＢは
グルタチオンのみならず他のチオール基を有する物質、
例えばシスティンとも反応し発色するので、測定結果に
誤差を生じる可能性があり、好ましくない。
現在行われている分析法は、除蛋白操作を必要とするな
ど操作が煩雑であったり、誤差を生じる可能性がある。
ど操作が煩雑であったり、誤差を生じる可能性がある。
又、酵素を反応試薬として使う場合は、試薬が高価で不
安定である。
安定である。
本発明者らは、上記の如き従来法の欠点を克服すべく鋭
意検討の結果、除蛋白等の前処理操作を必要とせず、か
つ、簡便に短時間で高感度に分析する方法を開発し、本
発明を完成するに至った。
意検討の結果、除蛋白等の前処理操作を必要とせず、か
つ、簡便に短時間で高感度に分析する方法を開発し、本
発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、液体クロマトグラフィーを用いて生体
試料中のグルタチオンを分析する方法において、生体試
料中の高分子成分と、還元型グルタチオン及び／又は酸
化型グルタチオンを含む低分子成分を、全多孔質ゲルを
充填した分離用カラムを用いて分離、溶出させ、次いで
溶出液にオルトフタルアルデヒドを添加し、還元型グル
タチオン及び／又は酸化型グルタチオンとオルトフタル
アルデヒドを反応させ、かかる反応によって生じた物質
の螢光測定を行って還元型グルタチオン及び／又は酸化
型グルクチオンを検出することを特徴とする生体試料中
の還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンの
分析方法に関するものである。
試料中のグルタチオンを分析する方法において、生体試
料中の高分子成分と、還元型グルタチオン及び／又は酸
化型グルタチオンを含む低分子成分を、全多孔質ゲルを
充填した分離用カラムを用いて分離、溶出させ、次いで
溶出液にオルトフタルアルデヒドを添加し、還元型グル
タチオン及び／又は酸化型グルタチオンとオルトフタル
アルデヒドを反応させ、かかる反応によって生じた物質
の螢光測定を行って還元型グルタチオン及び／又は酸化
型グルクチオンを検出することを特徴とする生体試料中
の還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンの
分析方法に関するものである。
本発明においては、分離用カラムは水溶媒系のＧＰＣに
用い得る充填カラムを用いることができるが、全多孔質
ゲルを充填して用いるのが好ましい。
用い得る充填カラムを用いることができるが、全多孔質
ゲルを充填して用いるのが好ましい。
全多孔質ゲルは水酸基を有する非イオン性親水性ゲルが
好ましく、かつ、その排除限界分子量が１０００以上で
あるものが好ましい。排除限界分子量がこの範囲にある
ことにより、蛋白質等の高分子成分とＧＳＨ及び／又は
ｃｓｓｃを効率よく分なすることができる。更に、ＧＳ
ＨとＧ５５Ｇを効率良く分離するには、排除限界分子量
は５万以下が好ましい。
好ましく、かつ、その排除限界分子量が１０００以上で
あるものが好ましい。排除限界分子量がこの範囲にある
ことにより、蛋白質等の高分子成分とＧＳＨ及び／又は
ｃｓｓｃを効率よく分なすることができる。更に、ＧＳ
ＨとＧ５５Ｇを効率良く分離するには、排除限界分子量
は５万以下が好ましい。
全多孔質ゲル中の水酸基としては、ビニルアルコール単
位に由来するものを好ましい例として挙げることができ
る。ビニルアルコール単位に由来する水酸基の量は、１
〜９ｍｅｑ／ｇゲルにするのがよい。ビニルアルコール
単位をこの範囲にすることにより蛋白質等の吸着損失を
生ぜず、かつ、全多孔質ゲルの強度を実用に耐える範囲
に保つことができる。又、保水量で示される微細孔量は
、１．０〜１．８ｍｌ／ｇゲルであることが適当である
。
位に由来するものを好ましい例として挙げることができ
る。ビニルアルコール単位に由来する水酸基の量は、１
〜９ｍｅｑ／ｇゲルにするのがよい。ビニルアルコール
単位をこの範囲にすることにより蛋白質等の吸着損失を
生ぜず、かつ、全多孔質ゲルの強度を実用に耐える範囲
に保つことができる。又、保水量で示される微細孔量は
、１．０〜１．８ｍｌ／ｇゲルであることが適当である
。
微細孔量をこの範囲に保つことにより、分離能と実用に
耐えるゲルの強度が満足される。
耐えるゲルの強度が満足される。
このような特性を有するゲル及び充填カラムの製造法の
一例は、特開昭５７−１６８１５７号公報に示されてい
る。
一例は、特開昭５７−１６８１５７号公報に示されてい
る。
分析に用いる溶離液は一般に生体成分のＧＰＣに用いら
れるものを用いることができるが、好ましい例としては
少なくとも１０ｍＭ〜３００ｎ＋Ｍの緩衝用基剤を含む
水溶液を挙げることができる。
れるものを用いることができるが、好ましい例としては
少なくとも１０ｍＭ〜３００ｎ＋Ｍの緩衝用基剤を含む
水溶液を挙げることができる。
グルタチオンの他に蛋白質が存在する場合には、溶出液
のｐＨが低すぎたり高すぎたりすると、蛋白質等の変質
が生じるおそれがある。従って溶離液のｐＨとして２〜
１２の範囲を好ましい範囲として挙げることができる。
のｐＨが低すぎたり高すぎたりすると、蛋白質等の変質
が生じるおそれがある。従って溶離液のｐＨとして２〜
１２の範囲を好ましい範囲として挙げることができる。
本発明の方法においては、分離用カラムからの溶出液に
オルトフタルアルデヒドを添加し、グルタチオンとオル
トフタルアルデヒドを反応させ、かかる反応（以下単に
反応と称する）によって生じた物質の螢光測定を行って
グルタチオンを検出、定量する。オルトフタルアルデヒ
ドと反応させる場合、ＧＳＨはｐＨ７以上であれば発螢
光物質を生じるが、Ｇ５５ＧはｐＨ１２以上にすること
が必要である。従って、ＧＳＨとＧ５５Ｇを同時に検出
定量する場合、又は、Ｇ５５Ｇのみを検出定量する場合
には、反応時の液のｐＨを１２以上に保ことが必要であ
る。
オルトフタルアルデヒドを添加し、グルタチオンとオル
トフタルアルデヒドを反応させ、かかる反応（以下単に
反応と称する）によって生じた物質の螢光測定を行って
グルタチオンを検出、定量する。オルトフタルアルデヒ
ドと反応させる場合、ＧＳＨはｐＨ７以上であれば発螢
光物質を生じるが、Ｇ５５ＧはｐＨ１２以上にすること
が必要である。従って、ＧＳＨとＧ５５Ｇを同時に検出
定量する場合、又は、Ｇ５５Ｇのみを検出定量する場合
には、反応時の液のｐＨを１２以上に保ことが必要であ
る。
溶離液のｐ旧よ前述の理由により１２以下にするのが好
ましいので、反応時の９Ｈを１２以上にするには、分離
用カラムからの溶出液にオルトフタルアルデヒドを加え
る際に、更にアルカリ性水溶液を添加してオルトフタル
アルデヒドとグルタチオンが反応する際のｐｔｉを１２
以上に保つ方法を好ましい方法の一つとして挙げること
ができる。この場合、オルトフタルアルデヒドをアルカ
リ性水溶液に溶解して溶出液に添加する方法もあるが、
オルトフタルアルデヒドはアルカリ性水溶液中では安定
性にやや問題があるので、上述の方法が好ましい。
ましいので、反応時の９Ｈを１２以上にするには、分離
用カラムからの溶出液にオルトフタルアルデヒドを加え
る際に、更にアルカリ性水溶液を添加してオルトフタル
アルデヒドとグルタチオンが反応する際のｐｔｉを１２
以上に保つ方法を好ましい方法の一つとして挙げること
ができる。この場合、オルトフタルアルデヒドをアルカ
リ性水溶液に溶解して溶出液に添加する方法もあるが、
オルトフタルアルデヒドはアルカリ性水溶液中では安定
性にやや問題があるので、上述の方法が好ましい。
又、ＧＳＨのみを検出定量する場合は、ｐＨ７以上で反
応させるため、前述の如（溶離液にアルカリ性水溶液を
添加してｐＨを７以上に保つ方法を用いることもできる
が、溶離液としてｐＨ７以上のものを用いればカラムか
らの溶出液をそのまま反応させることができるので、ア
ルカリ性水溶液の添加工程が不要となり、システムが簡
便になり好ましい。
応させるため、前述の如（溶離液にアルカリ性水溶液を
添加してｐＨを７以上に保つ方法を用いることもできる
が、溶離液としてｐＨ７以上のものを用いればカラムか
らの溶出液をそのまま反応させることができるので、ア
ルカリ性水溶液の添加工程が不要となり、システムが簡
便になり好ましい。
ＧＳＨ及び／又はＧ５５Ｇを含む試料を分離、溶出する
ための溶離液に含まれる緩衝用基剤としては、エチレン
ジアミン四酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスル
ホン酸トリスヒドロキシメチルアミノメタン、Ｎ、Ｎ−
ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン等を挙げること
ができるが、蛋白質等高分子、グルタチオン、グルタチ
オン以外の低分子成分相互の分離の点から見て、エチレ
ンジアミン四酢酸ナトリウムを好ましい例として挙げる
ことができる。又、これらの）ｉｔｆＥ用基剤用油剤て
、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩を５００ｍＭ以
下の範囲で加えることもできる。
ための溶離液に含まれる緩衝用基剤としては、エチレン
ジアミン四酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスル
ホン酸トリスヒドロキシメチルアミノメタン、Ｎ、Ｎ−
ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン等を挙げること
ができるが、蛋白質等高分子、グルタチオン、グルタチ
オン以外の低分子成分相互の分離の点から見て、エチレ
ンジアミン四酢酸ナトリウムを好ましい例として挙げる
ことができる。又、これらの）ｉｔｆＥ用基剤用油剤て
、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩を５００ｍＭ以
下の範囲で加えることもできる。
検出法としては、オルトフタルアルデヒドを用いる発螢
光検出法を好ましい方法として挙げることができる。紫
外吸収法は、感度が低く、かつ、グルタチオンを他の紫
外吸収を有する低分子量成分と完全に分離する必要があ
り、分析に長時間を要する。又、ダンジルクロライド等
アミノ化合物と反応し発螢光物質を生じる化合物を用い
る方法やニンヒドリン等アミン化合物と反応して発色物
質を生じる化合物を用いる方法は、該化合物が生体中に
多種存在するアミノ酸と反応し、発螢光物質又は発色物
質を生じるため、ＧＳＨ及びＧ５５Ｇとアミノ酸等の低
分子成分を完全に分離する必要があり、従って分析に長
時間を要する欠点を有する。
光検出法を好ましい方法として挙げることができる。紫
外吸収法は、感度が低く、かつ、グルタチオンを他の紫
外吸収を有する低分子量成分と完全に分離する必要があ
り、分析に長時間を要する。又、ダンジルクロライド等
アミノ化合物と反応し発螢光物質を生じる化合物を用い
る方法やニンヒドリン等アミン化合物と反応して発色物
質を生じる化合物を用いる方法は、該化合物が生体中に
多種存在するアミノ酸と反応し、発螢光物質又は発色物
質を生じるため、ＧＳＨ及びＧ５５Ｇとアミノ酸等の低
分子成分を完全に分離する必要があり、従って分析に長
時間を要する欠点を有する。
オルトフタルアルデヒドは生体中に存在する低分子量成
分のなかで実質的にＧＳＨ及びＧ５５Ｇとのみ発螢光物
質を与え、高感度かつ特異的検出が可能である。従って
ＧＳＨ及びＧ５５Ｇとアミノ酸等の低分子成分を完全に
分離する必要がなく、従って迅速な分析が可能である。
分のなかで実質的にＧＳＨ及びＧ５５Ｇとのみ発螢光物
質を与え、高感度かつ特異的検出が可能である。従って
ＧＳＨ及びＧ５５Ｇとアミノ酸等の低分子成分を完全に
分離する必要がなく、従って迅速な分析が可能である。
オルトフタルアルデヒドを反応させる方法としては、例
えばカラムからの溶出液をフラクションコレクターを用
いて分取し、次いで分取された液にオルトフタルアルデ
ヒドを加えて発螢光反応を行わせ分析することもできる
が、より好ましい方法としては、カラムから溶出するグ
ルタチオンを含む溶出液にオルトフタルアルデヒドの溶
液を連続的に導−人し、混合された液が例えばテフロン
、ステンレス等の中空の細管中を移動する間に反応を進
行させる所謂ボスｌ−カラムオンライン反応法を挙げる
ことができる。細管より溶出した液を例えば螢光検出器
に導入し、螢光を測定することによってグルタチオンを
検出することができる。反応に用いる細管の内径は２ｍ
ｍ〜０．１ ｍｍが好ましい。
えばカラムからの溶出液をフラクションコレクターを用
いて分取し、次いで分取された液にオルトフタルアルデ
ヒドを加えて発螢光反応を行わせ分析することもできる
が、より好ましい方法としては、カラムから溶出するグ
ルタチオンを含む溶出液にオルトフタルアルデヒドの溶
液を連続的に導−人し、混合された液が例えばテフロン
、ステンレス等の中空の細管中を移動する間に反応を進
行させる所謂ボスｌ−カラムオンライン反応法を挙げる
ことができる。細管より溶出した液を例えば螢光検出器
に導入し、螢光を測定することによってグルタチオンを
検出することができる。反応に用いる細管の内径は２ｍ
ｍ〜０．１ ｍｍが好ましい。
又、反応の温度は２０℃〜８０℃の範囲であり、好まし
くは３０）〜５０℃である。
くは３０）〜５０℃である。
分析に供する生体試料が組織や細胞のように固体である
場合は、適当な方法で液状にする。試料を液状にする方
法としては公知の方法を用いれば良く、例えば組織片を
適当な調製用試薬の存在下にホモジナイズする。生体試
料が血液の場合ミ固形成分である赤血球は血液に低張液
例えば楕製氷を加えることによって破裂させれば良い。
場合は、適当な方法で液状にする。試料を液状にする方
法としては公知の方法を用いれば良く、例えば組織片を
適当な調製用試薬の存在下にホモジナイズする。生体試
料が血液の場合ミ固形成分である赤血球は血液に低張液
例えば楕製氷を加えることによって破裂させれば良い。
血清又は血漿中のＧＳＨ及び／又はＣ，ＳＳＧを分析す
る場合には、公知の方法で血液中の血清又は血漿と血球
を分離し、得られた血清又は血漿をそのまま分析に供す
ることができる。
る場合には、公知の方法で血液中の血清又は血漿と血球
を分離し、得られた血清又は血漿をそのまま分析に供す
ることができる。
次ぎに液状にした試料に固形物が含まれる場合には、例
えば濾過等の公知の方法で固形物を除去して実質的に均
一な溶液にする。このようにして得られた溶液を除蛋白
等の特別な前処理なしに本発明のカラムに導入し、本発
明の検出方法を用いることによりＧＳＨ又はＧ５５Ｇの
分析が可能である。
えば濾過等の公知の方法で固形物を除去して実質的に均
一な溶液にする。このようにして得られた溶液を除蛋白
等の特別な前処理なしに本発明のカラムに導入し、本発
明の検出方法を用いることによりＧＳＨ又はＧ５５Ｇの
分析が可能である。
本発明の方法を用いれば、生体試料中のグルタチオンの
分析において例えば蛋白質等を除去することなしに分析
が可能である。従来用いられている方法はいずれも除蛋
白操作が必要である。除蛋白操作が伴うと、分析操作が
煩雑になり、臨床検査等多数の検体を分析する場合には
著しい障害となる。又、除蛋白操作に際して試料生成分
が損失する可能性があり、測定に誤差が生じるおそれが
ある。
分析において例えば蛋白質等を除去することなしに分析
が可能である。従来用いられている方法はいずれも除蛋
白操作が必要である。除蛋白操作が伴うと、分析操作が
煩雑になり、臨床検査等多数の検体を分析する場合には
著しい障害となる。又、除蛋白操作に際して試料生成分
が損失する可能性があり、測定に誤差が生じるおそれが
ある。
又、本発明の方法においては、蛋白質、ＧＳＨｌｃｓｓ
ｃの分離溶出は一定組成の溶離液で行うことができ、操
作が簡単で、かつ、装置も安価である。
ｃの分離溶出は一定組成の溶離液で行うことができ、操
作が簡単で、かつ、装置も安価である。
更に本発明の方法においては、検出にオルトフタルアル
デヒドを用いる全螢光反応を用いており、この方法を用
いることによりグルタチオンの高感一度かつ短時間分析
が可能である。従来アミノ基を有する化合物の高感度分
析に用いられてきたニンヒドリン、ダンジルクロライド
等は例えばアミノ酸等のアミノ基を有する化合物と反応
し、発色又は全螢光する。これらの試薬を用いても高感
度分析は可能であるが、生体試料中に多数存在するアミ
ノ酸とグルタチオンを完全に分離カラムで分離する必要
があり、分析に長時間を要した。
デヒドを用いる全螢光反応を用いており、この方法を用
いることによりグルタチオンの高感一度かつ短時間分析
が可能である。従来アミノ基を有する化合物の高感度分
析に用いられてきたニンヒドリン、ダンジルクロライド
等は例えばアミノ酸等のアミノ基を有する化合物と反応
し、発色又は全螢光する。これらの試薬を用いても高感
度分析は可能であるが、生体試料中に多数存在するアミ
ノ酸とグルタチオンを完全に分離カラムで分離する必要
があり、分析に長時間を要した。
本発明においては、反応時のｐＨを選択することにより
、／Ｇ Ｓ Ｈ及び／又はｃｓｓｃを必要に応じてネ食
出定量できる。特−ａ、＝ｐｏを１２以上に保つことに
よりＧＳＨとＧ５５Ｇの両方を同時に検出定量すること
ができる。
、／Ｇ Ｓ Ｈ及び／又はｃｓｓｃを必要に応じてネ食
出定量できる。特−ａ、＝ｐｏを１２以上に保つことに
よりＧＳＨとＧ５５Ｇの両方を同時に検出定量すること
ができる。
即ち、本発明の方法を用いることにより、生体中のグル
タチオンを、除蛋白等の煩雑かつ測定語基に誤差を生じ
得る前処理操作を省略して迅速かつ高感度に分析するこ
とができ、従って本発明の方法は臨床検査を含む医学分
野、生化学分野等に寄与するところが大である。
タチオンを、除蛋白等の煩雑かつ測定語基に誤差を生じ
得る前処理操作を省略して迅速かつ高感度に分析するこ
とができ、従って本発明の方法は臨床検査を含む医学分
野、生化学分野等に寄与するところが大である。
次に実施例を示す。
実施例１
採取した血液５μｌに直ちに１０ｍＭエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム水溶液で５０倍希釈し、溶血させた
。この瀉血液５μｌを以下の方法で分析した。
四酢酸二ナトリウム水溶液で５０倍希釈し、溶血させた
。この瀉血液５μｌを以下の方法で分析した。
分離用カラムとしては、ビニルアルコール単位に由来す
る水酸基の密度６．８ｍｅｑ／ｇゲル、微細孔量（保水
量として） １．３ａ＋ｌ ７ｇゲル、排除限界分子量
（プルラン基準） ４０，０００、平均粒径９μｍのゲ
ルが充填された内径７．６ｍｍ 、長さ２５０ｍｍのカ
ラムのアサヒバツク（Ａｓａｈｉｐａｋ） Ｇ５−３２
０Ｈ（旭化成工業株式会社商標）を用いた。分離用カラ
ム以外の分析条件は以下の通りである。
る水酸基の密度６．８ｍｅｑ／ｇゲル、微細孔量（保水
量として） １．３ａ＋ｌ ７ｇゲル、排除限界分子量
（プルラン基準） ４０，０００、平均粒径９μｍのゲ
ルが充填された内径７．６ｍｍ 、長さ２５０ｍｍのカ
ラムのアサヒバツク（Ａｓａｈｉｐａｋ） Ｇ５−３２
０Ｈ（旭化成工業株式会社商標）を用いた。分離用カラ
ム以外の分析条件は以下の通りである。
溶離液： ４０ｍＭエチレンジアミン四酢酸三ナトリウ
ム（ｐＨ８，０”） 溶離液流速： １．Ｏｍｌ／ｗｉｎ ポストカラム反応試薬＝２０％メタノールを含む精製水
１ｍｌあたりオルトフタルアルデヒド０．８ｍｇを溶解
して用いた ポストカラム反応試薬流量： ０．３ｍｌ ／ｍｉｎボ
ストカラム反応コイル：内径０．５ｎｍ長さ７Ｉ１１の
テフロン製細管 反応温度：４０℃ 検出：螢光検出励起波長３５０ｎｍ 、螢光波長４２０
ｎｍ第１図に瀉血液５μｌを上記の条件で分析したクロ
マトグラムを示す。クロマトグラムのうちピークＡは血
液中の蛋白質、ピークＢは還元型グルタチオン（Ｇ Ｓ
Ｈ）である。第１図のクロマトグラムよりＧＳＨが１
０分以内に分析できることが分かる。又、同じ条件で同
一試料を５００回分析したがクロマトグラムに変化は無
く、同条件で多数検体の分析が可能であることが分かっ
た。
ム（ｐＨ８，０”） 溶離液流速： １．Ｏｍｌ／ｗｉｎ ポストカラム反応試薬＝２０％メタノールを含む精製水
１ｍｌあたりオルトフタルアルデヒド０．８ｍｇを溶解
して用いた ポストカラム反応試薬流量： ０．３ｍｌ ／ｍｉｎボ
ストカラム反応コイル：内径０．５ｎｍ長さ７Ｉ１１の
テフロン製細管 反応温度：４０℃ 検出：螢光検出励起波長３５０ｎｍ 、螢光波長４２０
ｎｍ第１図に瀉血液５μｌを上記の条件で分析したクロ
マトグラムを示す。クロマトグラムのうちピークＡは血
液中の蛋白質、ピークＢは還元型グルタチオン（Ｇ Ｓ
Ｈ）である。第１図のクロマトグラムよりＧＳＨが１
０分以内に分析できることが分かる。又、同じ条件で同
一試料を５００回分析したがクロマトグラムに変化は無
く、同条件で多数検体の分析が可能であることが分かっ
た。
又、本実施例で用いた試料に対し、グルタチオンの添加
回収実験を行ったところ、回収率は９９％で良好であっ
た。
回収実験を行ったところ、回収率は９９％で良好であっ
た。
実施例２
実施例１と同様の分析条件を用いてＧＳＨ分析の定量性
を検討したところ、負荷したＧ Ｓ Ｈｏ、７ｎｇ〜１
０μｇの範囲でＧＳＨ量と螢光強度の間に比例関係があ
り、この範囲で定量可能であることが分かった。
を検討したところ、負荷したＧ Ｓ Ｈｏ、７ｎｇ〜１
０μｇの範囲でＧＳＨ量と螢光強度の間に比例関係があ
り、この範囲で定量可能であることが分かった。
実施例３
溶離液として０．１Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８
，０）を用い、試料としては、血液１容量に対してＧＳ
Ｈの１０−エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム標準溶
液（０，４ｍｇ ／ｍｌ）を１容量加え、更に８容最の
１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを加え溶血
した液５μｌを用いた他は実施例１と同様の方法でＧＳ
Ｈを分析し、第３図のクロマトグラムを得た。
，０）を用い、試料としては、血液１容量に対してＧＳ
Ｈの１０−エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム標準溶
液（０，４ｍｇ ／ｍｌ）を１容量加え、更に８容最の
１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを加え溶血
した液５μｌを用いた他は実施例１と同様の方法でＧＳ
Ｈを分析し、第３図のクロマトグラムを得た。
実施例４
溶離液として０．１ＭのＮ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチルグリシン’） ＋０．０５Ｍ塩化ナトリウム（ｐ
Ｈ８，０）を用いた他は、実施例３と同じ方法でＧＳＨ
の分析を行い、第４図のクロマトグラムを得た。
エチルグリシン’） ＋０．０５Ｍ塩化ナトリウム（ｐ
Ｈ８，０）を用いた他は、実施例３と同じ方法でＧＳＨ
の分析を行い、第４図のクロマトグラムを得た。
実施例５
溶離液として４０ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリ
ウム水溶液（ｐＨｉｏ、０）を用いる他は実施例３と同
じ方法でＧＳＨの分析を行い、実施例３と同様のクロマ
トグラムが得られる。
ウム水溶液（ｐＨｉｏ、０）を用いる他は実施例３と同
じ方法でＧＳＨの分析を行い、実施例３と同様のクロマ
トグラムが得られる。
実施例６
分離用カラムとしてビニルアルコール単位に由来する水
酸基の密度６．８ ｍｅｑ ７ｇゲル、微細孔量（保水
量として） １．１ｍｌ ７ｇゲル、排除限界分子量（
ポリエチレングリコール基準） ３，０００ 、平均粒
径９μｍのゲルが充愼された内径７．６ｍｍ 、長さ５
００ｍｍのカラムのアサヒバツク（＾５ａｈｉｐａｋ）
Ｇ Ｓ−２２０（旭化成工業株式会社商標）を用いた
。分離用カラム以外の分析条件は以下の通りである゛。
酸基の密度６．８ ｍｅｑ ７ｇゲル、微細孔量（保水
量として） １．１ｍｌ ７ｇゲル、排除限界分子量（
ポリエチレングリコール基準） ３，０００ 、平均粒
径９μｍのゲルが充愼された内径７．６ｍｍ 、長さ５
００ｍｍのカラムのアサヒバツク（＾５ａｈｉｐａｋ）
Ｇ Ｓ−２２０（旭化成工業株式会社商標）を用いた
。分離用カラム以外の分析条件は以下の通りである゛。
溶離液： ４０ｍＭエチレンジアミン四酢酸二トリウム
（ｐ１１約４．５） 溶離液流速： ０．７ ｍｌ／ｍｉｎ ポストカラム反応試薬＝５％メタノールを含む水溶液１
ｍｌ当たりＩｍｇのオルトフタルアルデヒドを熔解して
用いた。
（ｐ１１約４．５） 溶離液流速： ０．７ ｍｌ／ｍｉｎ ポストカラム反応試薬＝５％メタノールを含む水溶液１
ｍｌ当たりＩｍｇのオルトフタルアルデヒドを熔解して
用いた。
ボストカラム反応試薬流量： ０．３５ｍ１／ｍ１ｎｐ
Ｈ調整用試薬： ０．８ Ｎ ＮａＯＨ水溶液ｐＨ調整
用試薬流量： ０．３５ｍ１／ｍｉｎポストカラム反応
コイル：内径０．５ｍｍ 、長さ７ｍのテフロン製細管 反応温度：４０℃ 検 出 ：螢光励起波長３５０ｎｍ 螢光波長 ４２０ｎｍ 上記の条件を用いてＧＳＨ及びＧ５５Ｇをそれぞれ２０
０ ｎｇ含む１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム水溶液５μβをカラムに注入し、分析したクロマト
グラムを第５図に示す。第５図に示す如く、ＧＳＨ（Ｂ
）及びＧ５５Ｇ （Ｃ）が分離、検出された。なお本実
施例においてオルトフタルアルデヒドとグルタチオ・ン
の反応時のｐＨは約１３であった。
Ｈ調整用試薬： ０．８ Ｎ ＮａＯＨ水溶液ｐＨ調整
用試薬流量： ０．３５ｍ１／ｍｉｎポストカラム反応
コイル：内径０．５ｍｍ 、長さ７ｍのテフロン製細管 反応温度：４０℃ 検 出 ：螢光励起波長３５０ｎｍ 螢光波長 ４２０ｎｍ 上記の条件を用いてＧＳＨ及びＧ５５Ｇをそれぞれ２０
０ ｎｇ含む１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム水溶液５μβをカラムに注入し、分析したクロマト
グラムを第５図に示す。第５図に示す如く、ＧＳＨ（Ｂ
）及びＧ５５Ｇ （Ｃ）が分離、検出された。なお本実
施例においてオルトフタルアルデヒドとグルタチオ・ン
の反応時のｐＨは約１３であった。
実施例７
実施例５と同じ条件を用いて、ヒト全血を１０ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸二ナトリウム水溶液で２０倍に希釈
した液５μβにＧ Ｓ Ｓ Ｇ８０ｎｇを添加したもの
を全量注入し、第６図のクロマトグラムを得た。第６図
に示す如く、血中蛋白質（Ａ） 、ＧＳＨ（Ｂ） 、Ｃ
，ＳＳＧ （Ｃ）が分離、検出された。
レンジアミン四酢酸二ナトリウム水溶液で２０倍に希釈
した液５μβにＧ Ｓ Ｓ Ｇ８０ｎｇを添加したもの
を全量注入し、第６図のクロマトグラムを得た。第６図
に示す如く、血中蛋白質（Ａ） 、ＧＳＨ（Ｂ） 、Ｃ
，ＳＳＧ （Ｃ）が分離、検出された。
第１図は、実施例１において得られたクロマトグラムで
あり、ビークＡは蛋白質、ビークＢはＧＳＨである。 第２図は、実施例２において得られたＧＳＨ量とビーク
強度の関係を示すグラフである。 第３図は、実施例３において得られたクロマトグラムで
あり、ビークＡは蛋白質、ビークＢはＧＳＨである。 第４図は、実施例４において得られたクロマトグラムで
あり、ビークＡは蛋白質、ビークＢはＧＳＨである。 第５図は、実施例６において得られたクロマトグラムで
あり、ビークＢはＧＳＨ，ビークＣはＧ５５Ｇである。 第６図は、実施例７において得られたクロマトグラムで
あり、ビークＡは蛋白質、ビークＢはＧＳＨ，ビークＣ
はＧ５５Ｇである。
あり、ビークＡは蛋白質、ビークＢはＧＳＨである。 第２図は、実施例２において得られたＧＳＨ量とビーク
強度の関係を示すグラフである。 第３図は、実施例３において得られたクロマトグラムで
あり、ビークＡは蛋白質、ビークＢはＧＳＨである。 第４図は、実施例４において得られたクロマトグラムで
あり、ビークＡは蛋白質、ビークＢはＧＳＨである。 第５図は、実施例６において得られたクロマトグラムで
あり、ビークＢはＧＳＨ，ビークＣはＧ５５Ｇである。 第６図は、実施例７において得られたクロマトグラムで
あり、ビークＡは蛋白質、ビークＢはＧＳＨ，ビークＣ
はＧ５５Ｇである。
Claims (4)
- （１）液体クロマトグラフィーを用いて生体試料中のグ
ルタチオンを分析する方法において、生体試料中の高分
子成分と、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタ
チオンを含む低分子成分を、全多孔質ゲルを充填した分
離用カラムを用いて分離、溶出させ、次いで溶出液にオ
ルトフタルアルデヒドを添加し、還元型グルタチオン及
び／又は酸化型グルタチオンとオルトフタルアルデヒド
を反応させ、かかる反応によって生じた物質の螢光測定
を行って還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチ
オンを検出することを特徴とする生体試料中の還元型グ
ルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンの分析方法。 - （２）オルトフタルアルデヒドとグルタチオンの反応時
のｐＨが７以上であることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の生体試料中の還元型グルタチオンの分析方
法。 - （３）オルトフタルアルデヒドとグルタチオンの反応時
のｐＨが１２以上であることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の生体試料中の還元型グルタチオン及び／
又は酸化型グルタチオンの分析方法。 - （４）分離用カラムに充填された全多孔質ゲルが１〜９
ｍｅｑ／ｇゲルの水酸基を有する非イオン性の親水性ゲ
ルであることを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし
第３項の何れかに記載の生体試料中のグルタチオンの分
析方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2776685 | 1985-02-15 | ||
| JP60-27766 | 1985-02-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62857A true JPS62857A (ja) | 1987-01-06 |
Family
ID=12230112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP132886A Pending JPS62857A (ja) | 1985-02-15 | 1986-01-09 | 生体試料中のグルタチオンの分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62857A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4879083A (en) * | 1988-06-17 | 1989-11-07 | Macmillan Bloedel Limited | Chemically treated wood particle board |
| JPH05312801A (ja) * | 1992-05-13 | 1993-11-26 | Inax Corp | ゲル濾過法を用いた生体成分の測定方法 |
| US5578157A (en) * | 1991-12-23 | 1996-11-26 | Microsensor Technology, Inc. | Method of fabricating connector |
| CN111830178A (zh) * | 2020-07-21 | 2020-10-27 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 谷胱甘肽的检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5957160A (ja) * | 1982-09-28 | 1984-04-02 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 体液成分の分離法 |
-
1986
- 1986-01-09 JP JP132886A patent/JPS62857A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5957160A (ja) * | 1982-09-28 | 1984-04-02 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 体液成分の分離法 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4879083A (en) * | 1988-06-17 | 1989-11-07 | Macmillan Bloedel Limited | Chemically treated wood particle board |
| US5578157A (en) * | 1991-12-23 | 1996-11-26 | Microsensor Technology, Inc. | Method of fabricating connector |
| JPH05312801A (ja) * | 1992-05-13 | 1993-11-26 | Inax Corp | ゲル濾過法を用いた生体成分の測定方法 |
| CN111830178A (zh) * | 2020-07-21 | 2020-10-27 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 谷胱甘肽的检测方法 |
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