JP3351002B2 - 分析用生体試料中の蛋白質分離除去方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は生体試料の分析、例えば
高速液体クロマトグラフィー等において目的成分を定量
する際に定量の妨害となる又はクロマトグラフィーのカ
ラム担体充填剤の劣化の原因となる蛋白質を予め分離除
去する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体試料中の蛋白質の除去方法として
は、酸や溶媒による蛋白質沈澱分離法、被分析成分に抽
出分離法、塩析分離法が知られているが操作が繁雑であ
り、分析用試料の前処理を自動化する方法として適当で
ない。膜を用い除蛋白する方法としては、例えばポリサ
ッカライド系の限外濾過膜を用い血液から除蛋白をして
いる。しかし、この方法は遠心分離操作又は高圧下での
膜透過せねばならず常圧での処理は難しい。

【０００３】一方、担体を用いる方法としては、ウォー
ターズ社の「Ｓｅｐ−Ｐａｋ」のようにシリカゲル系の
担体を用いる方法が知られている。この方法は、Ｗ．Ｒ
ｏｔｈの提唱によるものであるが、溶離液と共にプレカ
ラム中に移送された全血を担体中に保持した後、移送の
方向とは逆方向に溶離液を送り、全血中の被分析成分の
みを溶離液と共に担体から溶出させるプレカラムスイッ
チ法である。Ｔ．Ａｒｖｉｄｓｓｏｎが提唱したプレカ
ラムベンディク法は、蛋白質が溶離液と共にプレカラム
中に移送された後、このカラム中で被分析成分と蛋白質
とが分離して蛋白質が先に担体を通過するので、三方コ
ックの切換により後より溶出した被分析成分のみを含む
溶出液を蛋白質の妨害なく分析し得る方法である。又、
Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａは多孔性のシリカの表面を牛血清ア
ルブミンでコートすることにより、被検物質のみを吸着
し、蛋白質は吸着させずに先に溶出させることで除蛋白
を行っている。北野はホルムアルデヒド−ヒドロキシ樹
脂を用いリン酸緩衝液と共にアルブミン溶液を注入し、
該樹脂に蛋白質を共有結合により吸着させて蛋白を吸着
除去している（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４，
１９８２）。

【０００４】これらの担体を用いる方法は、いずれも、
繁雑な操作と複雑な装置が必要で、分析用試料の前処理
として除蛋白を自動化する手段としては適当でない。し
かも、これらの方法は、いずれも、分析用生体試料を溶
離液に注加するか、又は処理前に希釈している。従っ
て、分析用生体試料中の被分析成分を一度カラムに吸着
したとしても、再溶出する際にその溶出液中の被分析成
分の濃度は相対的に低くなり、回収率の低下にも影響
し、微量分析には必ずしも適当とは言えなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このような技術的背景
下において、分析用生体試料中より蛋白質を分離除去し
て被分析成分の分析時に妨害とならない成分のみを含む
試料液を得るのに、複雑な装置を用いず、繁雑な操作に
よらず、高圧力による分離も必要とせず、汎用型の分析
用試料の前処理システムに組み込みができ、かつ分析用
試料の前処理の自動化も可能なディスポーザルタイプの
カートリッジに充填しうる担体の開発が必要である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者はかかる現状に
鑑み鋭意検討した結果、特開平１−２０１０１５記載の
ヒドロキシアパタイトや、ポリアミノ酸等各種担体が有
効なことを見出し、このような知見に基いて本発明を完
成した。

【０００７】すなわち、本発明は、蛋白質と被分析成分
が共存する分析用生体試料をそのままヒドロキシアパタ
イト担体に負荷した後、アセトニトリル溶離液を用いて
該生体試料を該担体中を移動させ、該分析生体試料中に
存在する保持用量の大きな蛋白質が溶出する以前に保持
容量の小さな被分析成分を溶出させて除蛋白されかつ被
分析成分を含む溶出液を得ることを特徴とする分析用生
体試料中の蛋白質の分離除去方法である。

【０００８】本発明は分析技術の進歩に伴い、微量の分
析用試料量で目的成分を分析できるようになったことに
より、より容易に操作可能となった。

【０００９】本発明の特長は、分析用生体試料を希釈す
ることなく直接担体に負荷し、該担体に浸み込ませた
後、溶離液を該担体に注加し、保持容量の差を利用し被
分析成分を蛋白質より速く溶出させ、この溶出液を試料
としてこの中に含まれる被分析成分を分析することがで
きるということである。

【００１０】以下、本発明を逐次詳細に説明する。

【００１１】本発明に用いられる適当な担体とは、保持
容量が蛋白質についてよりも被分析成分についての方が
より小さな担体である。その具体例としては、ヒドロキ
シアパタイトやポリアミノ酸を挙げることができる。こ
れらの担体は、通常カートリッジ中に充填されて使用さ
れ、本発明方法に従って分析用生体試料を１回処理する
毎にカートリッジごと交換される。充填量は、担体の種
類によっても異なるが、通常０．１〜１ｇである。

【００１２】この場合、担体に負荷する分析用生体試料
の量は、被分析成分及び蛋白質の含有量により一概には
言えないが、少な過ぎると定量下限に達しないこともあ
り、逆に担体の量に比しあまり多過ぎると担体中に一時
保持することができない。通常の生体試料の分析におい
ては、担体量０．２ｇに対し分析用生体試料量は５０〜
５００μｌが適当である。

【００１３】本発明に用いる担体の種類と使用量は、分
析用試料中の蛋白質を完全に吸着するものでなくてもよ
く、分析用試料中に共存する被分析成分と蛋白質とをク
ロマトグラフィー的に相互に分離できれば良い。蛋白質
の保持容量が大きいために、保持容量の小さな被分析成
分より蛋白質の溶出時間が遅れることを利用するものだ
からである。

【００１４】本発明に用いられる溶離液としては、液体
クロマトグラフィーに用いられている通常の溶離液を用
いることができる。そのような溶離液としては、水、食
塩水、アセトニトリル水溶液、リン酸緩衝液等がある。
しかし、担体との組合せで蛋白質の保持容量が被分析成
分の保持容量より小さくなる場合を避けなければならな
い。

【００１５】本発明の方法を用いて定量分析を行う場合
には、担体の種類と量、生体試料の量、溶出速度、溶出
液量と溶出液中に含まれる蛋白質の量との関係、等を予
め調べておく必要がある。被分析成分と蛋白質との保持
容量との差により得られるべき溶出液の量は、液体クロ
マトグラフィーによる定量分析又は定性分析に必要とさ
れる量と同じであって、通常１００〜３００μｌで充分
である。

【００１６】本発明によれば担体に直接分析用生体試料
を負荷するので、担体に一時的に保持された被分析成分
は単体内で拡散されにくく、担体の一部に局所的に高濃
度で存在している。従って、この状態の被分析成分を溶
離液で溶出する場合には、分析用生体試料を他の溶液で
希釈処理又はクロマトグラフィー等の溶離液に直接注加
した場合に比べて被分析成分は拡散することなく存在し
ているので、延いてはこの状態の被分析成分を溶離液で
溶出する場合、効率良く溶出でき、しかも溶出液中に存
在する被分析成分は、分析用生体試料を希釈処理した場
合に比べて高濃度であるため、この溶出液を用いて被分
析成分を定量分析する際には定量下限を下げることがで
きる。又、被分析成分の回収率も良く、微量分析が可能
となる。

【００１７】本発明の方法により得られた除蛋白されし
かも被分析成分を含む溶出液を定量分析又は定性分析に
付するには特別の制限はない。例えば、この溶出液を小
型試験管に分取した後ピペッティング操作により分析機
器に注入することができる。また、この操作は手動でも
自動前処理装置、例えば「ＬＣ−ＲＯＢＯコンポ」（味
の素（株）製）を用いて全自動化することも可能である
（特開平１−２５００７１参照）。また、担体をカート
リッジに充填し、これを予め自動前処理装置にセットし
ておき、分析用生体試料をカートリッジに注入した後、
溶離液を注入し、被分析成分を溶離液と共に溶出し、予
め定められた溶出液量に達したら、自動的に該カートリ
ッジを装置よりはずすという一連の操作を自動的に行わ
しむることもできる（実開平１−９５２０８参照）。

【００１８】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に説明する。

【００１９】実施例１（ヒドロキシアパタイトによる人
血漿中の蛋白質の分離除去） 人血漿１００μｌ（γ−グロブリン２．００６ｍｇ及び
アルブミン６．６９４ｍｇを含有）をヒドロキシアパタ
イト（（株）高研製）０．４ｇを充填したカートリッジ
（充填部分９ｍｍφ×１５ｍｍＬ）上部に注入負荷し
た。

【００２０】第１表に示す各種溶離液をそれぞれカート
リッジに通過させ、溶出液をフラクション毎（各フラク
ション３００μｌ）に採取し、その中に含まれるγ−グ
ロブリン（γ−ＧＬＢ）、トランスフェリン及びアルブ
ミン（ＡＬＢ）を高速液体クロマトグラフ（ガスクロ工
業（株）製「５７６型高速液体クロマトグラフ」および
同社製「ＵＶ検出器５０２型」）を用いて定量した。結
果を第１表に併記した。この結果から、分析に付すべ
き、溶離液の種類による除蛋白できる最適な溶出液量を
決めることができる。

【００２１】

【表１】

【００２２】実施例２（ヒドロキシアパタイトによる人
血漿中の蛋白質の除去） 人血漿３００μｌを用いた他は実施例１と同様にして、
溶離液の種類と除蛋白効果との関係を検査した。結果を
第２表に示した。

【００２３】

【表２】

【００２４】実施例３（人血漿中のカフェインの分析） 人血漿５０μｌをヒドロキシアパタイト（（株）高研
製）０．４ｇを充填したカートリッジ（充填部分９ｍｍ
φ×１５ｍｍＬ）の上部に注入負荷した。このカートリ
ッジの上部より１０％アセトニトリル水溶液３ｍｌを通
液し、除蛋白された溶出液の初流液４００μｌを得た。

【００２５】この初流液２０μｌを用い、高速液体クロ
マトグラフ（「日立６５５Ａ−１２型高速液体クロマト
グラフ」及び「日立Ｌ−４０００型ＵＶ検出器」により
カフェインを分析した。得られたクロマトグラムを図１
に示す。図中、１はカフェインのピークを示す。

【００２６】実施例４（人血漿中のテオフィリンの分
析） テオフィリンを定量するために内部標準物質として７−
（２−ヒドロキシエチル）テオフィリンの２．５％水溶
液を用意した。この溶液１００μｌを実施例３の高速液
体クロマトグラフィーで分析し保持容量を予め求めた。

【００２７】テオフィリン服用後の喘息患者から血液を
採取し、この血漿５０μｌおよび内部標準物質の２．５
％水溶液１００μｌを混合した混合液をヒドロキシアパ
タイト（（株）高研製）０．４ｇを充填したカートリッ
ジ（充填部分９ｍｍφ×１５ｍｍＬ）の上部に注入負荷
した。このカートリッジの上部より１０％アセトニトリ
ル水溶液３ｍｌを通液した。除蛋白された初流液４００
μｌを得た。この初流液２０μｌを用いて実施例３にお
けると同じ高速液体クロマトグラフィーにかけた。得ら
れたクロマトグラムを図２に示す。図中、１はテオフィ
リンの、そして２は内部標準物質のピークを示す。

【００２８】テオフィリンをそのピークの高さによる検
量線法により定量したところ、該人血漿中のテオフィリ
ン量は２５μｇ／ｍｌであった。

【００２９】比較例（人血漿中のアスコルビン酸の分
析） 人血漿２０μｌをヒドロキシアパタイト（（株）高研
製）０．４ｇを充填したカートリッジ（充填部分９ｍｍ
φ×１５ｍｍＬ）の上部に注入した。次に、０．２５％
のシステイン含有の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
８）３ｍｌを通液し、初流液８００μｌを得た。この溶
液２０μｌを高速液体クロマトグラフィー（「日立６５
５Ａ−１２型高速液体クロマトグラフ」及び「電気科学
検出器Σ８７５型」（医理化（株）製）を使用）により
分析した。

【００３０】得られたクロマトグラムを図３に示す。図
中、１はアスコルビン酸のピークを示す。アスコルビン
酸の標準添加法により得られた分析値は７．７９μｇ／
ｍｌであった。

【００３１】実施例５（人血漿中のジアゼパムの分析） ジアゼパムはマイナートランキライザー（抗不安薬）
で、神経症における不安、緊張、抑鬱、脳腎臓疾患に伴
う筋痙攣などに適用され、日本薬局方およびアメリカ薬
局方にも収載されている医薬品である。治療において、
ジアゼパムの血中濃度の迅速簡便な分析法の確立はきわ
めて重要である。

【００３２】ジアゼパムの分析は局方では電位差滴定法
（過塩素酸）で行われている。また、血液中のジアゼパ
ムの測定は主に高速液体クロマトグラフィーで行われて
いる。前処理法としてはBond Elut. Sep.Pak C₁₈又はカ
ラムスイッチ法、溶剤抽出、遠心分離などが用いられ、
必ずしも簡便な方法とは言いがたい。ジアゼパムは血中
濃度が比較的低く（０．１〜１．０μｇ／ｍｌ）、優れ
た分析法の開発が望まれている。

【００３３】本発明によれば、血漿をヒドロキシアパタ
イトを充填した除蛋白用カートリッジ「ＰＣＰｕｒｅカ
ートリッジ」（（株）モリテックス製）に付すだけで除
タンパクでき、溶出液を溶剤抽出、遠心分離などの操作
を付することなしにジアゼパムの分析用試料を調製でき
る。この調製法は、従来法に比べて簡便、迅速に除タン
パクでき、ルーチン分析および自動化分析に適してい
る。

【００３４】本実施例においては、以下に述べるよう
に、主に標準品のジアゼパムおよび内部標準物質の４，
４′−ジフルオロベンゾフェノンを血漿に添加し、種々
の溶離液によるジアゼパムおよび内部標準物質の溶出挙
動を調べ、また従来法と本法との比較を行った。

【００３５】（ａ）試料調製法とジアゼパムの分析法
（概要） 血漿１００μｌにジアゼパム標準液１０μｌ（０．１μ
ｇ）および内部標準物質の４，４′−ジフルオロベンゾ
フェノン標準液１０μｌ（１μｇ）を加えてよく振り混
ぜ、室温で３０分間放置後、この溶液を「ＰＣＰｕｒｅ
カートリッジ」に注入する。次に、溶離液の５０％アセ
トニトリル水溶液２〜３ｍｌを通液して、初流溶出液６
００μｌを分析用試料とする。この溶出液の２０μｌを
高速液体クロマトグラフに注入し、ジアゼパムと内部標
準物質とのピーク高さの比からジアゼパムを分析する。

【００３６】ここに、ジアゼパム標準液は、シアゼパム
１０ｍｇを正確に量り、１０％アセトニトリル水溶液で
１００ｍｌに定容し、この１０ｍｌを正確に取り、１％
アセトニトリル水溶液で１０ｍｌに定容して（１０μｇ
／ｍｌ）調製し、また４，４−ジフルオロベンゾフェノ
ン標準液は、４，４′−ジフルオロベンゾフェノン１０
ｍｇを正確に量り、１０％アセトニトリル水溶液で１０
０ｍｌに定容して（１００μｇ／ｍｌ）調製する。

【００３７】（ｂ）溶離液の決定 次の（ｉ）および（ii）における結果ならびに高速液体
クロマトグラフィーの条件とを考え併せ、（ａ）におけ
る溶離液として５０％アセトニトリル水溶液を選定し
た。

【００３８】（ｉ）各種溶離液による標準品ジアゼパム
および内部標準物質の回収率 標準品のジアゼパム（０．１μｇ）および内部標準物質
の４，４′−ジフルオロベンゾフェノン（１μｇ）を
「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」に注入後、各溶離液２〜
３ｍｌを通液して各フラクション（３００μｌ）毎の回
収率に関する挙動を調べた。結果を第３表に示す。

【００３９】

【表３】

【００４０】第３表に示す結果から、ジアゼパムおよび
４，４′−ジフルオロベンゾフェノンは、いずれも、い
ずれの溶離液を用いても、ほとんど第１フラクションお
よび第２フラクションを合わせた初流液６００μｌで溶
出することが判った。生理食塩水または１０ｍＭリン酸
緩衝液を溶離液に用いると、ジアゼパムは第３フラクシ
ョンにも溶出した。アセトニトリルでは、５０％および
６０％の水溶液を用いると、第１フラクションにシアゼ
パムおよび内部標準物質が全量回収できた。

【００４１】（ii）血漿中の除タンパクの確認 「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」を用いて血漿中のジアゼ
パムを分析する際、溶出液にジアゼパムが含有されてい
る他に、タンパク質が含まれていないことが必要であ
る。本実施例においては、前出実施例１および２におけ
ると同様にして、しかしながら範囲を拡げて、溶離液に
よる除タンパクの条件を調べた。

【００４２】結果は、次の通りであった。

【００４３】（イ）生理食塩水（０．９％，ｐＨ４．５
〜８．０）の場合：血漿５０〜３００μｌをカートリッ
ジに注入後、生理食塩水で溶出し、溶出液の各フラクシ
ョン（３００μｌ）中のタンパク質量を調べた結果、血
漿量２００μｌまでは、第１〜５のいずれのフラクショ
ンにもタンパク質は認められなかった。さらに、血漿量
を増やし、３００μｌをカートリッジに注入すると、第
１フラクションにはタンパク質は認められないが、第２
〜５のフラクションには若干トランスフェリンが検出さ
れたが、除タンパク率は約９９％と高い値であった。

【００４４】（ロ）１０ｍＭリン酸緩衝液の場合：血漿
を５０または１００μｌカートリッジに注入後、ｐＨ
６．８または８．６の緩衝液を通液させ、上記と同様に
して溶出液の各フラクション中のタンパク質の確認を行
った。若干アルブミン、グロブミンおよびトランスフェ
リンが検出されたフラクションもあったが、除タンパク
率は約９９％と高い値であった。溶離液のｐＨによる差
異はほとんどなかった。

【００４５】（ハ）アセトニトリル水溶液の場合：血漿
１００μｌをカートリッジにそれぞれ注入後、種々の濃
度のアセトニトリル水溶液を溶離液として通液して、溶
出液の各フラクション中のタンパク質量を調べた。５％
水溶液を用いると、若干アルブミン、グロブミンおよび
トランスフェリンが検出されたフラクションもあるが、
除タンパク率は約９９％と高い値であった。一方、１０
〜１００％の濃度では、１００％の除タンパク率であっ
た。次に、血漿量３００μｌとして、ジアゼパムの移動
相と同濃度の５０％の溶離液で検討した結果、前記の生
理食塩水の場合とは若干異なり、第１〜５のいずれのフ
ラクションにもタンパク質は認められなかった。

【００４６】（ニ）アルコール水溶液の場合：血漿１０
０μｌをカートリッジにそれぞれ注入後、水、１０％メ
タノールおよびエタノールを溶離液として通液して得た
溶出液の各フラクション中のタンパク質量を調べた。水
では第１フラクション、メタノールでは第１および２フ
ラクションにはタンパク質は検出されなかった。その他
には若干、アルブミンおよびトランスフェリンが検出さ
れ、除タンパク率は約９９％と高い値であった。エタノ
ールでは第１〜５のいずれのフラクションにもタンパク
質は認められなかった。

【００４７】（ホ）システイン含有１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６．８）の場合：クロマトグラム上、システイ
ンの妨害により明確にアルブミンの有無ができなかっ
た。血漿量１００μｌの場合は、グロブリンが検出され
ていることから、アルブミンも溶出されていると考えら
れる。２０μｌの場合は、グロブリンが検出されていな
いことからアルブミンは溶出されていないと考えられ
る。

【００４８】（ヘ）１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
８）＋生理食塩水（１：１）の場合：血漿１００μｌを
カートリッジに注入後、この混合液を溶離液に用いる
と、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を単独に用い
た時よりも除タンパク率は良かった。第３フラクション
に若干アルブミンが検出されたが、除タンパク率は約９
９％であった。

【００４９】因みに、除タンパク確認のために採用した
高速液体クロマトグラフィーの操作条件は、下記第４表
に示す通りであった。

【００５０】

【表４】

【００５１】（ｃ）血漿中のジアゼパムの分析及び従来
法との比較 検量線はジアゼパムと内部標準物質のピークの高さの比
から求めた。検量線は０〜６．６ｎｇの範囲で直線性が
得られた（図４参照）。

【００５２】「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」を用いて血
漿中のジアゼパムを分析する際、アセトニトリル、メタ
ノールなどを使用する従来の除タンパク方との比較をし
ておくことが重要である。また、本実施例においては血
漿にジアゼパムおよび内部標準物質を添加して検討して
いるので、３７℃で３０分間インキュベートして血漿タ
ンパク質とジアゼパムとの結合性について検討し、分析
できるかどうかについても併せて比較検討した。

【００５３】すなわち、血漿１００μｌに標準品のジア
ゼパム０．１μｇおよび内部標準物質１μｇを加え、こ
れを室温および３７℃で３０分間それぞれ放置して試料
とした。

【００５４】ジアゼパムと内部標準物質とのピークの高
さの比からジアゼパムを分析し、比較を行った結果、下
記第５表に示すように、「ＰＣＰカートリッジ」と従来
法とにほとんど差がないことが判った。

【００５５】

【表５】

【００５６】なお、血漿５０μｌを「ＰＣＰｕｒｅカー
トリッジ」による除タンパクに付した場合（溶出液４０
０μｌ）の回収率は約８４％であった。

【００５７】参考までに、図５および６に、このように
して分析した血漿中のジアゼパムのクロマトグラムの例
を示す。すなわち、図５は血漿中のジアゼパムのクロマ
トグラム（ブランク）を示し、そして図６は血漿中のジ
アゼパムのクロマトグラム（実液）を示す。各図におい
いて、１および２は、それぞれ、ジアゼパムおよび４，
４′−ジフルオロベンゾフェノン（内部標準物質）を示
す。

【００５８】因みに、ジアゼパムの分析のために採用し
た高速液体クロマトグラフィーの操作条件は、下記第６
表に示す通りであった。

【００５９】

【表６】

【００６０】（ｄ）総括評価 以上の結果から、血漿中のジアゼパムは本発明の方法を
利用することにより、従来法とほとんど差異なく定量で
きることが判った。回収率は約９３％であった。また、
相対標準偏差（Relative Standard Deviation 、R.S.
D.）は３．２（ｎ＝５）で、血中濃度の高い薬剤テオフ
ィリンの１．２（回収率は約１００％）より若干悪い
が、血中濃度の低い薬剤としては良好であると考えられ
る。なお、テオフィリンについては前出実施例４を参照
のこと。

【００６１】実施例６（人血漿中のアミノ酸の分析） いわゆるアミノ酸輸液の研究開発などにおいて、薬理学
的にも血漿中のアミノ酸を測定することが重要であり、
人血漿中のアミノ酸の迅速簡単な分析法の確立は極めて
重要である。

【００６２】本発明によれば、前実施例におけると同様
に、血漿を「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」に付すだけで
除タンパクでき、溶出液を溶剤抽出、遠心分離などの操
作に付することなしにアミノ酸の分析用試料を調製でき
る。この調製法は、従来の方法と比べて簡便迅速に除タ
ンパクでき、タンパクとの結合性の強いトリプトファン
も定量的に分析できることが判った。ルーチン分析およ
び自動化分析に適している。

【００６３】本実施例においては、以下に述べるよう
に、先ず、「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」を用いて血漿
中のアミノ酸をより正確に分析するために内部標準物質
および溶離液の検討、ならびに溶離液による標準品アミ
ノ酸および内部標準物質の回収率を検討した。次に、血
漿中のアミノ酸を分析し、さらに、除タンパクを従来か
ら用いられているスルホサリチル酸などの方法によった
場合の分析結果とを比較検討した。

【００６４】（ａ）試料調製法とアミノ酸の分析法 血漿１５０μｌと内部標準物質液１０μｌを「ＰＣＰｕ
ｒｅカートリッジ」に注入後、生理食塩水２〜３ｍｌを
通液する。溶出初流液１，０００μｌを１Ｎ塩酸−２０
μｌを加えてｐＨ２に調整し、アミノ酸分析用試料とす
る。この試料のアミノ酸分析は、常法のアミノ酸アナラ
イザー（ニンヒドリン法）を使用して行う。その操作条
件は下記第７表の通りである。

【００６５】

【表７】

【００６６】ここに、内部標準物質液は、Ｓ−カルボキ
シメチル−Ｌ−システイン（ＳＣＭ）４５ｍｇ、Ｄ−フ
ェニルグリシン（ＰＧ）３０ｍｇおよびＳ−アミノエチ
ル−Ｌ−システイン（ＳＡＥ）４５ｍｇをそれぞれ正確
に量り、これらを合して水を加えて５０ｍｌに定容して
調製する。

【００６７】（ｂ）内部標準物質の検討 「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」を用い除タンパクして血
漿中のアミノ酸を正確に分析するため、１０余種におよ
ぶ種々のアミノ酸などの物質が内部標準物質として適当
であるかどうかを検査した。内部標準物質は血漿中には
存在しないもので、クロマトグラム上でアミノ酸と分離
することが必要である。

【００６８】検査した物質のうち、ＳＣＭ、ＰＧおよび
ＳＡＥの３種のアミノ酸が保持時間の点で内部標準物質
として使用するのに適当であることが判った。

【００６９】（ｃ）溶離液の検討 溶離液を検討するため、標準アミノ酸液および内部標準
物質液を「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」に各々１５０μ
ｌおよび１０μｌを注入後、（イ）生理食塩水、（ロ）
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）、（ハ）生理食塩
水＋１０ｍＭリン酸緩衝液（１：１、ｐＨ６．８）、
（ニ）１０％エタノール水溶液、および（ホ）１０％ア
セトニトリル水溶液の５種類の溶離液を用いて検討し
た。ここに、標準アミノ酸液は、先ず、Ｌ−アスパラギ
ン（Ａｓｎ）、Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ）およびＬ−ト
リプトファン（Ｔｒｐ）をそれぞれ４０ｍｇ正確に量
り、これらを合して水を加えて１００ｍｌに定量し（４
０ｍｇ／１００ｍｌ）、次に、Ｂｅｃｋｍａｎ製標準試
薬（ＳＴＤ、ＡＮ＋、Ｂ＋）を各々２ｍｌおよび上の溶
液２ｍｌを正確に量り、これらを合したものに０．２Ｎ
塩酸４ｍｌを加え、最後に、このものの２ｍｌおよび前
記の内部標準物質液の１０倍希釈液２ｍｌを正確に量
り、０．２Ｎ塩酸を加えて２０ｍｌに定容して調製す
る。

【００７０】各溶離液はアミノ酸を迅速に溶出させるこ
との他に、溶出液中にタンパク質が含まれていないこと
が重要である。次に主な結果を記す。（１）いずれの溶
離液を用いても、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｃｉｔ、Ｇ
ＡＢＡ、Ｍｅｔ、ＰＧ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐなどは溶出され
やすかった。一方、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、（Ｃｙｓ）₂ など
は溶出されにくかった。（２）１０％メタノールおよび
１０％アセトニトリルを用いると、内部標準物質のう
ち、ＳＡＥは溶出されにくかった。（３）生理食塩水お
よび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いると、
３種の内部標準物質およびアミノ酸溶出は１０％メタノ
ールおよび１０％アセトニトリルよりも良かった。溶出
液の最初の３つのフラクション（各フラクション３００
μｌ）、すなわち初流液の第１〜３フラクション（初流
液計９００μｌ）でほとんどのアミノ酸が回収できた。
（４）生理食塩水＋１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
８）（１：１）よりも、それぞれを単独に用いた方が良
い結果が得られた。（５）生理食塩水および１０％アセ
トニトリルを用いると、第５フラクションまで、すなわ
ち初流１５００μｌまでタンパクの溶出はなかった。一
方、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）および１０％
メタノールでは第３フラクションからタンパクの溶出が
みられた。

【００７１】以上のアミノ酸およびタンパクの溶出結果
を考え併せて、本実施例においては、生理食塩水を溶離
液とした。生理食塩水を溶離液とした場合、内部標準物
質の回収率を「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」の初流３フ
ラクションをまとめて（計９００μｌ）みた場合、３回
の試行結果は、ＳＭＣについてはそれぞれ９５．８、９
７．２および１２０％、ＰＧについては９７．２、９
５．３および９６．４％、そしてＳＡＥについては９
７．３、９７．３および１０３％と良好であった。な
お、また、生理食塩水を用いると、血漿２００μｌを
「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」に注入しても、溶出液の
初流第５フラクションまでタンパクの溶出はなかった。

【００７２】（ｄ）試料の調製およびその他の分析条件 前項（ｃ）での標準品のアミノ酸を用いての検討結果か
ら、「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」からの溶出初流液９
００μｌを分析用の試料にすれば約９０％のアミノ酸の
回収率が得られることが判ったが、溶出をより良くする
ために、溶出初流液１，０００μｌを分析用試料とし
た。また、「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」への血漿注入
量は５０、１００、１５０および２００μｌを考えた
が、溶出液中でのアミノ酸濃度および除タンパクの点を
考え併せて１５０μｌとした。その他は前出（ａ）を参
照のこと。

【００７３】因みに、「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」は
充填剤がヒドロキシアパタイト（Ｃａ₁₀（ＰＯ₄ ）
₆ （ＯＨ）₂ ）であるため、溶出時に溶出液中に溶け込
むおそれがあり、アミノ酸分析計に影響を与えることも
考えられる。そこで、従来からの除タンパク法であるス
ルホサリルチル酸による方法と本発明の方法との試料液
中のカルシウムの含量を念のため調べたところ、本発明
の方法による試料液に含まれるカルシウムはブランクと
ほとんど同じで、スルホサリチル酸法よりも低値であ
り、分析計に悪影響を与えないと結論された。付言する
と、試料の調製に関しては、「ＰＣＰｕｒｅカートリッ
ジ」法の場合、血漿１５０μｌおよび内部標準物質液１
０μｌをカートリッジに注入後、生理食塩水を通液し
て、初流液１，０００μｌを１Ｎ塩酸２０μｌを加えて
調製し、スルホサリチル酸法の場合は、血漿１５０μｌ
および内部標準物質液１０μｌに３．７５％スルホサリ
チル酸１ｍｌを加え、次に、これを遠心分離（１０，０
００ r.p.m. ）し、上層液を試料とし、それぞれの試料
について原子吸光法によってカルシウムを定量した結果
である。

【００７４】前述の分析方法により血漿中のアミノ酸を
測定したところ、内部標準物質の違いによる著しい測定
値の差異はなかった。一般に、内部標準物質は分析する
物質の近いものを選ぶが、３者の中でＳＣＭおよびＰＧ
はＳＡＥよりもほとんどのアミノ酸の標準偏差値（Ｒ．
Ｓ．Ｄ．）は良い値を示した。この理由は明確でない
が、ＳＡＥの濃度をもう少し高くし、ピークの高さを高
くすれば改善できると考える。ＡｓｐのＲ．Ｓ．Ｄ．は
いずれを用いても悪いが、含量が少ないためによると考
えられる。ＳＣＭおよびＰＧとのＲ．Ｓ．Ｄ．にはほと
んど差異はないが、ＰＧのほうが若干よい値を示した。
ＰＧはクロマトグラム上で、ほぼ中心に溶出し、Ｒ．
Ｓ．Ｄ．も良いので、全アミノ酸の一斉分析用の内部標
準物質として適していると考えられ。そこで、本実施例
においては、以下、ＰＧを用いて、標準添加法による回
収率および従来から用いられている除タンパク法との比
較検討を行った（後出（ｆ）参照）。

【００７５】標準添加法による回収率については、次の
通りであった。すなわち、アミノ酸とタンパク質の結合
性を調べるためにインキュベート（３７℃で３０分間）
したものとしないものについての標準添加法による回収
率（％）を測定した。本発明の方法による平均回収率
は、インキュベートしない場合９３．５％で、インキュ
ベートした場合９４．３％と両者に差異は認められなか
った。特に、Ｔｒｐはタンパク質との結合が強いアミノ
酸であるが、本発明の方法による標準添加法（インキュ
ベートあり）での回収率が９７．９％であることから、
本発明の方法はタンパク質結合のあるアミノ酸にも十分
に適用できるものである。従って、タンパク質と結合の
強い医薬品への適用が期待される。

【００７６】（ｅ）血漿中のアミノ酸の測定結果 ３種の内部標準物質を用いて血漿中のアミノ酸を３回測
定した結果を下記第８表に示す。

【００７７】

【表８】

【００７８】（ｆ）除タンパクの従来法と本発明の方法
との比較 本発明による「ＰＣＰｕｒｅカートリッジ」による除タ
ンパク法と従来からの除タンパク法（スルホサリチル酸
またはエタノールを用いて除タンパクする方法）につい
て、血漿中のアミノ酸分析の結果を比較検討した。

【００７９】従来から用いられている除タンパク法では
内部標準物質を使用していないが、本実施例において
は、本発明の方法との比較のために内部標準物質を加え
て試料調製を行なった。従来から用いられている除タン
パク法は、血漿に試料を加えた後、遠心分離、濾過して
試料調製をする。一方、本発明の方法では、「ＰＣＰｕ
ｒｅカートリッジ」に血漿を注入後、生理食塩水を通液
するだけで試料調製ができ、操作は簡便迅速である。

【００８０】両除タンパク法による結果から、アミノ酸
の分析結果には両者にほとんど差がなく、Ｒ．Ｓ．Ｄ．
もＡｓｐを除いて、きわめて良好であることが判った。
また、ＰＧを内部標準物質に使用することにより、前処
理法が異なってもアミノ酸の分析結果に差異のないこと
が判った。ＰＧはアミノ酸アナライザー法（ニンヒドリ
ン法）の内部標準物質として適したものと言える。

【００８１】

【発明の効果】本発明を利用すれば生体試料に含まれる
被分析成分を効率良く分析でき、その定量分析が容易に
行なわれ得ることとなった。又、担体をカートリッジに
充填して使用する本発明の実施態様により分析用生体試
料を処理すると装置を複雑にすることなく前処理操作を
自動化することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３で得られた、人血漿中のカフェインの
液体クロマトグラムである。

【図２】実施例４で得られた、人血漿中のテオフィリン
の液体クロマトグラムである。

【図３】比較例で得られた、人血漿中のアスコルビン酸
の液体クロマトグラムである。

【図４】実施例５（ｃ）におけるジアゼパムの検量線で
ある。

【図５】実施例５（ｃ）におけるジアゼパム（ブラン
ク）のクロマトグラムの１例である。

【図６】実施例５（ｃ）におけるジアゼパム（実液）の
クロマトグラムの１例である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−116460（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−43959（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−31055（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 30/14 G01N 30/88 G01N 33/48

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 蛋白質と被分析成分が共存する分析用生
   体試料をそのままヒドロキシアパタイト担体に負荷した
   後、アセトニトリル溶離液を用いて該生体試料を該担体
   中を移動させ、該分析生体試料中に存在する保持用量の
   大きな蛋白質が溶出する以前に保持容量の小さな被分析
   成分を溶出させて除蛋白されかつ被分析成分を含む溶出
   液を得ることを特徴とする分析用生体試料中の蛋白質の
   分離除去方法。