CN101241139A - Cea阴性结直肠癌检测和预后判断的质谱试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用磁珠支持基质的方法捕获生物样品中结直肠癌蛋白质组，用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。然后用质谱法进行分析的蛋白指纹法。本发明的方法可用于正常人与CEA阴性结直肠癌检测和预后判断的蛋白指纹或质谱多肽图谱的试剂盒。本方法准确、方便且快捷。

Description

CEA阴性结直肠癌检测和预后判断的质谱试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及一种新的结直肠癌生物样品中蛋白质分析方法的试剂盒。一种通过能与蛋白质结合的基质去捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测CEA阴性结直肠癌生物标志。在此提及的此项发明涉及蛋白质检测领域，为一种新的非侵入性的体外质谱检测方法。本发明可以应用到已经脱离人体的体液中的CEA阴性结直肠癌生物标志组合的检测方法或试剂盒。

背景技术

随着人类基因组计划的实施和完成，科学家们提出了后基因组(post-genome)计划的概念，研究要点转移到功能基因组学上，而生物功能主要体现物质是蛋白质。1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出蛋白质组(proteome)的概念，指的是“一种基因组所表达的全部蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。对于蛋白质组的研究是功能基因组学研究的核心，称为蛋白质组学(proteomics)。蛋白质组学被认为是后基因组研究中最主要的部分。与基因组相比，蛋白质组的组成更复杂，功能更活跃，应用前景更广泛。蛋白质组学从细胞整体水平进行蛋白质属性的研究，如表达水平、翻译后修饰及相互作用等，并由此获得对于疾病过程、细胞生理生化特征和调控网络的广泛完整的认识。所以，蛋白质组学技术正在逐步成为生物学、医学及制药学等的重要研究手段。

不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析。用质谱联合可克服这一技术缺点。

结直肠癌的发生是一个多基因突变导致抑癌基因失活、癌基因活化的过程。基因组学研究由于自身的限制难以完全阐明基因与蛋白质参与过程及其具体作用，而近年来蛋白质组学的发展为人们从整体上了解恶性肿瘤的发生、发展提供了较为理想的技术平台。目前临床上对恶性肿瘤预后评估主要依赖于临床表现、病理学及传统肿瘤标志(tumormarker)，但肿瘤早期复发或转移时常常无明显临床表现，而病理学证据很难得到且重复性差。传统肿瘤标志癌胚抗原(CEA)在结直肠癌预后评估中有重要价值，但临床工作中也发现有相当比例的结直肠癌患者中因癌胚抗原表达阴性而无法检测，同时对于癌胚抗原阴性表达的结直肠癌患者的预后评估则缺乏有效的早期监测手段。但是，我们在进行蛋白质质谱分析时发现没有一个临床CEA阴性结直肠癌质谱标准化的试剂盒。

发明内容：

本发明的目的是建立一种在CEA阴性结直肠癌生物样品中检测的方法。该方法为CEA阴性结直肠癌的早期检测提供了新的途径，并为进一步发现新的CEA阴性结直肠癌生物标志提供了基础。

本发明涉及一种通过生物标志结合的基质表面，并用定量性质谱分析来同时检测多种生物标志状态。

本发明中的生物标志是利用一台质谱仪来发现的。该设备的质量精确度约为+/-0.1％。

基质是任何能与生物标志选择性或特异性结合的物质。举例说明，WCX阴离子，C8/C18疏水作用基质吸附剂，分离生物化学中的这些方法和由这些方法产生的吸附剂具有诊断反面的用途(即阴离子吸附剂捕获阳离子蛋白质)。底基洗去未吸附的物质。任何适宜的洗液均可使用。

生物标志首先能够被具有能与生物标志物结合基质吸附表面捕获，非吸附物能从基质上洗脱，吸附到底基的生物标志物在质谱仪中被检测。生物标志通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。生物标志的检测明显地将与信号强度的检测有关。这样，生物标志的数量与质量都可以被检测出来。

飞行质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而减轻高频噪音。

通过对生物标志的吸附和检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。该计算机程序分析这些数据以显示检测出的生物标志的数量，并显示信号的强度和确定被检测的每个生物标志的分子量。数据分析还能包括一系列的确定生物标志的信号强度和矫正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度，可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的干扰，这可以设置调零。

计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分子量的生物标志物更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的生物标志物和那些高于或低于校准样本的生物标志物。

分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选择，软件是可用的，它可自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇。

发明中使用的生物标志是基质所捕获。这些生物标记是进一步通过质谱(massspectrometry)测定其不同分子量来知道它们特定的身份。

血清质谱多肽蛋白图谱的重复性

同一样本同时做8点重复试验，所有峰值的CV值均＜10％，显示了较好的重复性(图1)。

结直肠癌多肽蛋白检测筛选

用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，通过分析几百种血清蛋白指纹峰，发现下述蛋白指纹或质谱多肽图谱可以用于区分正常与结直肠癌。峰值CV＞30％或者p＜0.05为有显著性差异：结直肠癌患者与健康人群有7种差异多肽蛋白(p＜0.05)，其中3398.3Da多肽蛋白低表达，2424.4、2686.9、2821.4、2901.4、5477.1、8453.9±15Da多肽蛋白高表达(表1)。进一步建立癌胚抗原阴性表达结直肠癌的检验模型，由3398.3、5477.1、8453.9±15Da 3个蛋白峰组成的检验模型对60例癌胚抗原阴性表达结直肠癌患者和60例健康人群盲筛检验的敏感性100％，特异性83％(图2、表2)；即当3398.3Da小于等于7.83；或当3398.3Da大于7.83且5477.1Da大于1.54且8453.9Da大于1.18时为CEA阴性结直肠癌患者，否则为健康人群(图3、表1)。

结直肠癌转移相关多肽蛋白筛选

将结直肠癌患者按照脏器转移情况分组，然后进行组间比较，其中4种多肽、蛋白质在脏器转移组中显著增高(表3)：3622.7、4156.1、5336.2、11683.3±15Da。将结直肠癌患者按淋巴结转移组情况分组，发现2种多肽、蛋白质在淋巴结转移组中显著增高(表4)：3622.7、32341.3±15Da。用同一例代表性患者的11683.3Da峰显示WCX磁珠灵敏性比WCX芯片更高(图4)。

血清CEA测定值与结直肠癌患者多肽蛋白表达差异

将结直肠癌患者按照血清CEA≤5μg/L和＞5μg/L分成2组，进行组间比较，两组间有显著性的差异蛋白质峰，其中4种蛋白质在CEA＞5μg/L组中显著增高(表5)：3489.7、4533.3、9604.9、32341.3±15Da。

结直肠癌患者术前术后个体化多肽蛋白表达差异

对结直肠癌患者在根治性切除术后14天再次进行检测，发现质荷比(m/z)分别为3399.3、4117.3、4964.8±15Da的3种多肽蛋白在血清中的浓度显著降低，接近于健康人群(表6)。根治性切除的患者中显著下降(3399.3Da术前14.5、术后4.6)基本接近于健康人群(图5)；而非根治性切除的患者中其差异并不明显(3399.3Da术前12.0、术后8.9)(图6)。

肿瘤的发生是一个多基因突变过程，单一的癌胚抗原检查有一定的局限性。目前，大约43％的结直肠癌患者由于癌胚抗原表达阴性而不能被早期检测。癌胚抗原(CEA＞5μg/L)在结直肠癌中的阳性检测率为57％，而由3398.3、5477.1、8453.9±15Da 3个差异峰组成的检测模型对癌胚抗原阴性表达结直肠癌的阳性检测率为100％。这是首次发明癌胚抗原阴性表达结直肠癌的检测方法。故用蛋白指纹图谱技术来检测肿瘤标志蛋白指纹，特别是对癌胚抗原阴性表达的结直肠癌患者的早期检测及健康体检尤有意义。

本发明筛选出了几种能够在癌胚抗原阴性表达及阳性表达结直肠癌患者血清中检出的具代表性蛋白质(2424.4、2686.9、2821.4、2901.4、3398.3、5477.1、8453.9±15Da)分子量较小。早期结直肠癌局限于结直肠粘膜组织，肿瘤表达的大分子蛋白不易渗透进入血液，而小分子蛋白则易于进入外周血循环，因此，小分子肿瘤标志的筛选有利于结直肠癌的早期发现。而结直肠癌目前常规肿瘤标志的分子量非常大，如癌胚抗原的分子量为150～300kDa，这可能是常规肿瘤标志在早期结直肠癌中敏感性低下的原因。这些在结直肠癌患者与正常人中差异十分显著的蛋白质可能是早期结直肠癌敏感的肿瘤标志。

结直肠癌的预后取决于是否存在转移，寻找与转移相关的蛋白质分子，积极进行有效的干预措施可以改变一部分结直肠癌患者的命运。本发明发现3489.7、32341.3±15Da2个多肽蛋白与结直肠癌淋巴结转移相关，在淋巴结转移的病例中表达显著上升；3622.7、4156.1、5336.2、11683.3±15Da的4个多肽蛋白与结直肠癌远处脏器转移相关，表达显著上升，为临床正确判断疾病进程提供帮助。

用同一结直肠癌远处脏器转移病人的11683.3Da蛋白峰显示WCX磁珠灵敏性比WCX芯片更高，证明磁珠表面的结合面积大于蛋白质芯片，从而其灵敏性比蛋白质芯片更高。

对结直肠癌患者术前与术后的对比分析，发现3399.3、4117.3、4964.8±15Da 3个多肽蛋白的表达存在显著性差异。在结直肠癌获得根治性切除术后显著下降，基本接近于正常人；而在非根治性切除术的患者中其差异并不明显。这一结果与胃癌术后现象类似，同时证实了这些多肽蛋白在结直肠癌患者中的敏感性，也为早期检测结直肠癌术后复发和转移提供了方向。

常用于结直肠癌的常规肿瘤标志如癌胚抗原CEA、糖蛋白类抗原CA19-9和CA72-4等，其敏感性只有20.9％～56％，在早期结直肠癌中的敏感性则更低。寻找敏感的、早期可出现的、新的蛋白质标记物是目前的重点。本发明通过对血清CEA测定值≤5μg/L与＞5μg/L的结直肠癌患者的对比分析，发现3489.7、4533.3、9604.9、32341.3±15Da的4个多肽、蛋白质存在显著性差异(P＜0.05)，在CEA＞5μg/L的病例中表达显著上升；其中32341.3Da同时又与淋巴结转移相关，这可能为发明结直肠癌早期而敏感的预后相关生物标志提供了一种思路。

本发明利用WCX阴离子基质及利用C8/C18疏水基质磁珠为例对正常人与结直肠癌血清(浆)进行蛋白质对比分析。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。

一种CEA阴性结直肠癌检测和预后判断的质谱试剂盒和方法的具体操作步骤：

以下是用本发明提供的一个操作方案及CEA阴性结直肠癌检测试剂盒实例。

1.样品处理及标准化质控血清(浆)制备

将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中，视需要离心澄清样品。

质谱的标准化质控血清(浆)制备定义符合如下标准：供血者10人，5男5女，血型为O型；年龄为18-30岁；民族汉。生化指标正常，包括：总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功检查、肾功检查；无遗传病家族史；无重大传染病史。女性不能怀孕，男性为不吸烟者。

2.基质与CEA阴性结直肠癌、标准化质控血清(浆)制备、样品上样

抽取O型血的健康受试者(男女各半)的新鲜血液：(a)4℃下待血液凝固后马上离心，4℃离心5min分离血清。(b)4℃下马上离心，4℃离心5min分离血浆。标准化质控或结直肠癌血清(浆)样品分装100μl一小管，于-80℃储存；或取混合血清(浆)1∶2稀释于U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH9.0)一小管，25℃储存。即成为结直肠癌、标准化质控血清(浆)试剂盒。将质谱的标准化质控血清及样品点样在有支持物的基质中的一个位点上。支持物用磁性珠或芯片。基质是用于标记、结合血清(浆)的。标记至液相色谱柱子上的基质可用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)的标准方法去分析。将质谱的标准化质控O血清(浆)用于质谱仪试剂盒的定量方法。

3.洗涤

用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。以下步骤：用0.05％～1％三氟乙酸彻底洗涤整个磁性珠阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有3×3mm圆孔)上，自然干燥金属片，加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制备的饱和标准溶液)。

吸能分子可用Sinapinic acid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid等。

3.质谱的定量控制及测试

用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)标准方法去分析滞留于各位点的生物标志或蛋白质。用计算机分析数据进行数据重叠展示。

定量性质谱调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da等强度调至50％信号强度的最大值。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准。

本发明将蛋白质分成了几大类，即WCX阴离子、C8/C18疏水作用等蛋白。这样，可用质谱仪直接进行分析及定量。

利用C8及C18疏水基质磁珠或芯片的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠或芯片的实验结果一致。

本发明可用于体外细胞和非侵入性的体外结直肠癌质谱检测方法的定量控制，如离体体液的结直肠癌试剂盒用于临床质谱的结直肠癌检测方法。可以检测多个结直肠癌蛋白质生物标志群及质谱多肽图谱。

本发明中的试剂盒及方法与其他非侵入性的体外检测方法比较，具有以下的特点：

(1)准确

质谱直接分析有很强的精确性，一般误差率只有0.1Da。因为蛋白质是由氨基酸组成的，而氨基酸的平均质量是已知的，如果知道了抗原或生物标志的总分子量，那么抗原的变异(指氨基酸变化)就很容易被推测出来。

(2)方便

本方法将蛋白质分成了几大类，即阴离子、疏水作用蛋白。这样，可用质谱仪直接进行分析。支持基质的方法所用吸附剂的支持物是磁珠或芯片。用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。磁珠表面的结合面积大于芯片，从而其灵敏性比芯片更高。这样，可用质谱仪直接进行分析。

(3)快捷

用本发明提供的蛋白指纹法进行检测时，无需对蛋白质进行测序。本发明采用了计算机“条码格式”，信号强度沿着线性轴以暗度强度值显示。此强度可以用扫描仪记录并用分析软件自动分析对比强弱，从而有助于临床复杂的检测，如可用此“蛋白指纹”或条码格式进行医学分析。

说明书附图

图1血清质谱多肽蛋白图谱的重复性

图2癌胚抗原阴性表达结直肠癌及健康人群盲筛的敏感性、特异性及ROC曲线

图3癌胚抗原阴性表达结直肠癌(Cancer)、结直肠管状腺瘤(Control)及健康人群(Normal)的蛋白指纹图谱

图4结直肠癌转移相关蛋白(11683.3Da)的芯片与磁珠检测灵敏性比较

图5一例根治性切除术后患者的蛋白指纹图谱

图6一例非根治性切除术后患者的蛋白指纹图谱

具体实施方式

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1正常与CEA阴性结直肠癌患者的区分及质谱的试剂盒制备

(1)实验方法

60例CEA阴性结直肠癌患者(CEA≤5μg/L)、68例CEA阳性结直肠癌患者(CEA＞5μg/L)，均为腺癌，平均年龄61.5岁；进展期结直肠癌患者仅20例未见淋巴结转移，其余均伴淋巴结转移；伴脏器转移32例：肝转移16例，肺转移12例，卵巢转移4例。由结直肠镜确诊的结直肠良性管状腺瘤患者15例。健康体检者60例，平均年龄59.5岁，来源于肝功能、肾功能等检查均正常的体检人群。受检者空腹采集静脉血1mL，采集后立即于4℃冰箱静置2小时，4℃4000r/min离心10分钟分离血清，将血清于4℃12000r/min再次离心5分钟，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为100μL/管，共5管，保存于-80℃冰箱。避免反复冻融。

蛋白质芯片及磁珠操作步骤

血清样品处理：从-80℃冰箱中取出血清，于4℃，10000rpm离心5min。取10μL血清样品，加20μL U9处理液(9mol/L尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mmol/L Tris-CL，pH9.0)，充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入360μL结合缓冲液(100mmol/L NaAc，pH4.0)，立即混匀。

芯片上样及洗脱：将WCX2芯片(弱阴型离子表面，羧基基团，捕获正电荷基团蛋白)装入bioprocessor中，每孔加入200μL结合缓冲液，室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干。每孔分别加入100μL处理好的样品，振荡孵育1h，甩去样品，用200μl芯片洗脱缓冲液(100mmol/L NaAc，pH4.0)室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干；再用HPLC H2O洗涤一次，立即甩干。取出芯片，每点加2次0.5μL SPA饱和溶液，晾干后上机测量。

磁珠上样及洗脱：将处理好的样品100μL加至已装好WCX磁珠(弱阴离子表面，羧酸基团，捕获正电荷基团蛋白)的PCR管(北京赛尔迪公司)中，置磁性处理器上孵育30min，除去液体。加100μL磁珠结合缓冲液(50mmol/L NaAc，pH 4.0～4.3)至已装好WCX磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作2次。加10μL ElutionBuffer 2min，洗脱标本至上清液。取5μL上清液移至另一个PCR管中，加入5μL SPA饱和溶液充分混匀，取1μL混合溶液加样到Au片上，晾干后上机测量。

数据收集

将处理好的Au片置入MALDI-TOF-MS进行蛋白质谱分析。在读取数据前，用加有all-in-one标准蛋白质的芯片校正质谱仪，使分子量误差＜0.1％。本研究中阅读仪的主要参数设定为，最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围1000～15000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围20～80，收集总数为130次。软件中设定读片程序，以读取数据。用血清中的内标峰4091.1Da或6634.0Da校正原始数据中的蛋白指纹图谱，使分子量误差＜0.01％，从而获得的精确的蛋白指纹图谱。

统计学分析

应用软件分析处理所有峰谱，形成蛋白指纹图谱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1或6634.0Da强度调至40～50％信号强度的最大值，并且用最显著的峰进行了校正，而后又进行了“减少基线”，定义蛋白峰(s/n＞5，最小的峰强度＞1.6)。分析所有1～50kDa之间的蛋白峰，并且仔细检查了每个相应的峰，计算出峰的平均数，标准差(SD)和变异系数(CV％)。用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，计算p值.

结直肠癌CEA检测

取空腹静脉血4mL，离心后提取血清，用i2000全自动免疫定量检测系统(美国，雅培)微粒体发光法测定，按照检测系统步骤进行操作，正常参考值＜5μg/L。

血清质谱多肽蛋白图谱的重复性检验

同一样本同时做8点重复试验，所有峰值的CV值均＜10％，显示了较好的重复性(图1)。

结直肠癌检测多肽蛋白筛选

用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，初步分析筛选出结直肠癌患者与健康人群有7种差异多肽蛋白，其中3398.3Da多肽蛋白低表达，2424.4、2686.9、2821.4、2901.4、5477.1、8453.9±15Da多肽蛋白高表达(表1)。

表1筛选结直肠癌患者与健康人群候选多肽蛋白的结果(P＜0.05，x±sd)

实施例2试剂盒的双盲测试

用从实施例1中筛选出几个特征蛋白峰，3398.3、5477.1、8453.9±15Da 3个差异峰组成的检验模型对癌胚抗原阴性表达结直肠癌患者和健康人群盲筛检验的敏感性100％，特异性83％(表2)；即当3398.3Da小于等于7.83；或当3398.3Da大于7.83且5477.1Da大于1.54且8453.9Da大于1.18时为癌胚抗原阴性表达结直肠癌患者，否则为健康人群(图3、表1、2)。

表2试剂盒的双盲测试

双盲测试	癌胚抗原阴性表达结直肠癌(60)	正常(60)
			癌胚抗原阴性表达结直肠癌	60	10
正常	0	50

敏感性100％                  特异性83％

利用C8及C18疏水基质磁珠或芯片的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠或芯片的实验结果一致。

实施例3结直肠癌转移相关多肽蛋白筛选

将结直肠癌患者按照脏器转移情况分组，然后进行组间比较，其中4种多肽、蛋白质在脏器转移组中显著增高(表3)。将结直肠癌患者按淋巴结转移组情况分组，发现2种多肽、蛋白质在淋巴结转移组中显著增高(表4)。用同一例代表性患者的11683.3Da峰显示WCX磁珠灵敏性比WCX芯片更高(图4)。

表3结直肠癌脏器转移组及非脏器转移组的多肽蛋白丰度差异(P＜0.05，x±sd)

表4结直肠癌淋巴结转移组及非淋巴结转移组的多肽蛋白丰度差异(P＜0.05，x±sd)

实施例4血清CEA测定值与结直肠癌患者多肽蛋白表达差异

将结直肠癌患者按照血清CEA≤5μg/L和＞5μg/L分成2组，进行组间比较，两组间有显著性的差异蛋白质峰，其中4种蛋白质在CEA＞5μg/L组中显著增高(表5)。

表5结直肠癌血清CEA≤5μg/L和＞5μg/L两组的多肽蛋白丰度差异(P＜0.05，x±sd)

实施例5结直肠癌患者术前术后个体化多肽蛋白表达差异

对结直肠癌患者在根治性切除术后14天再次进行检测，发现质荷比(m/z)分别为3399.3、4117.3、4964.8Da的3种多肽蛋白在血清中的浓度显著降低，接近于健康人群(表6)。根治性切除的患者中显著下降(3399.3Da术前14.5、术后4.6)基本接近于健康人群(图5)；而非根治性切除的患者中其差异并不明显(3399.3Da术前12.0、术后8.9)(图6)。

表6结直肠癌根治性切除术前、术后血清多肽蛋白丰度差异(P＜0.05，x±sd)

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1. 一种用磁珠支持基质的方法捕获生物样品中CEA阴性结直肠癌蛋白质组的试剂盒和方法，其特征是采用蛋白指纹法对CEA阴性结直肠癌中蛋白质组或质谱多肽图谱进行鉴别检测。用标准化质控血清(浆)控制下的定量性质谱分析来检测。该方法通过以下步骤实现：

(1)样品处理及质谱标准化质控血清(浆)制备；

(2)基质与血清(浆)结合试剂盒制备、样品上样；

(3)洗涤；

(4)质谱的定量控制及质谱检测；

其中所述步骤(1)将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中。用O型血，男女相等，混合制备质谱的标准化质控血清(浆)；所述步骤(2)将质谱的标准化质控血清(浆)及样品点样在有支持物的基质中的一个位点上。支持物用磁珠或芯片。基质是用WCX阴离子基质及C8/C18疏水基质与血清(浆)选择性结合；所述步骤(3)用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。用三氟乙酸彻底洗涤整个阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片或位点上。所述步骤(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制备的饱和标准溶液)用质谱仪去分析滞留与各位点的生物标志或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用质谱仪去分析。对血液进行蛋白质对比分析，用计算机分析血液中质荷比数据。本试剂盒依据几个特征蛋白峰3398.3、5477.1、8453.9±15Da，双盲测试CEA阴性结直肠癌的敏感性100％，特异性83％。结直肠癌转移相关的蛋白峰为3622.7、4156.1、5336.2、11683.3、3489.7、32341.3±15Da；结直肠癌个体化手术疗效判断的蛋白峰为3399.3、4117.3、4964.8±15Da。

2. 权利要求1所述的蛋白质分析方法，所用的基质包括阴离子、疏水作用吸附剂。

3. 权利要求2中所用吸附剂的支持物是磁珠或芯片。

4. 一种权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，它包括：一容器以及装于容器中的权利要求1所述的生物样品。将生物样品分装100μL一小管，于-80℃储存或取生物样品1∶2稀释于一小管U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH9.0)，25℃储存。

5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征于，所述的生物样品为血清或血浆。

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