CN101303360B

CN101303360B - 人绒毛膜促性腺激素异构体的质谱抗体试剂盒及制备方法

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Publication number: CN101303360B
Application number: CN200810104936A
Authority: CN
Inventors: 许洋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2008-04-25
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2028-04-25
Also published as: CN101303360A

Abstract

本发明涉及人绒毛膜促性腺激素异构体的质谱抗体试剂盒及制备方法，属于蛋白质检测技术领域，该试剂盒包括一小管含U9缓冲溶液的质谱标准化质控血清；一小管含等量1μg的抗hCG、抗hCGβcf、抗hCG-α及抗hCG-β的磁珠；一小管缓冲液；一小管洗脱液；一小管能量吸收分子饱和溶液，上述各小管置于4℃冷藏盒中。本发明可用于体外样品检测和预后判断的质谱抗体试剂盒。本方法准确、方便且快捷。

Description

人绒毛膜促性腺激素异构体的质谱抗体试剂盒及制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质检测技术领域，特别涉及基于质谱技术的用于对异位妊娠生物样品中人绒毛膜促性腺激素异构体分析的试剂盒制备方法。

背景技术

不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析。用质谱联合可克服这一技术缺点。

异位妊娠是导致育龄期妇女发病和死亡的主要原因，占所有妊娠三个月合并死亡病例的9％，并且在所有妊娠者中占2～20％。上世纪60年代后期，腹腔镜检查的引进，对异位妊娠的早期诊断限定其更灵敏和精确的检测做出了相当大的贡献，因为＞80％的异位妊娠要在输卵管破裂后才被诊断。

已有几项生化和影像学标志物，被单个或组合(按照一定模式)研究，来检测隐匿性异位妊娠。这当中最常见的，包括阴道超声和人促绒毛膜性腺激素(hCG)的连续监测。血清中hCG的增长率显示是否存在子宫妊娠：最后一次行经至其后5周，hCG每1.5天增长一倍，而后从第7周开始，每3.5天增长一倍。虽然在大多数的异位妊娠病例中，hCG浓度并不以此速率增长，但是此情况存在于大约1/3的病例中，而且hCG增长动力学方面的不规则性也与自发流产有关系。除了这些问题，对于异位妊娠的诊断，hCG的监测仍旧是不可或缺的。

hCG是醣蛋白的异二聚体。完整hCG由hCG-β和hCG-α亚单位组成。只有完整的hCG才有生物活性，例如α，β异二聚体。hCG异构体和亚单位通常被发现是完整激素的代谢降解产物，但是偶尔游离的亚单位可以被表达且直接释放入血液循环。通常被用于传统检测异位妊娠的hCG试验是检测所谓的总hCG，而不是hCG-β和hCG-α亚单位浓度。传统hCG试验无法同时检测差别性的hCGβcf、hCG-α及hCG-β异构体。

因为传统hCG检测常常是针对门诊病人，异位妊娠的诊断程序在诊断上就需经过几天必须的延迟后连续检测hCG，这样就增加了输卵管破裂的风险性。

传统用于hCG检测试剂盒及制备方法为ELISA等传统免疫分析技术，ELISA等传统免疫分析技术主要依靠间接的化学或放射测定法，因而无法直接鉴定抗原的变异。举例讲，hCG的检测试剂盒制备方法为先将抗hCG抗体(第一个抗体)结合至固相表面(如玻璃)，然后将含hCG的样品(如血清)，加至这个已标有抗hCG抗体的容器中；这样，hCG就会结合至抗体上，然后洗脱未结合的物质。再加上已标有酶、放射性或化学发光性的抗hCG抗体(第二个抗体)，这样就可以检测出hCG的总含量。这种方法学的缺点是无法测出hCG的变异(如hCG的N或C端丢失了一个或数个氨基酸，hCG被甲基，酰基等修饰，hCG的异构体)。即通常被用于传统检测异位妊娠的hCG试验是检测所谓的总hCG，而不是hCG-β和hCG-α等亚单位浓度。传统hCG检测试剂盒无法同时检测差别性的hCGβcf、hCG-α及hCG-β等异构体。

上述hCG检测试剂盒在异位妊娠预后评估中有重要价值，但临床工作中也发现有相当比例的异位妊娠患者中因无法检测hCG异构体、片断及终末降解产物，这对于异位妊娠患者的预后评估则缺乏有效的早期监测手段。

目前在进行蛋白质质谱分析时还没有发现一个用于临床hCG异构体、片断及终末降解产物检测的标准化质谱抗体试剂盒。

发明内容

本发明的目的是克服已有技术的不足之处，提出一种用于检测人绒毛膜促性腺激素异构体的质谱抗体试剂盒及制备方法，该试剂盒为异位妊娠的早期检测提供了新的途径，并为进一步发现新的异位妊娠生物标志提供了基础。

本发明提出的用于检测人绒毛膜促性腺激素异构体的质谱抗体试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

一小管含U9缓冲溶液的质谱标准化质控血清(浆)，10～30μl；

一小管含等量1μg的抗hCG、抗hCGβcf、抗hCG-α及抗hCG-β的磁珠30～50μl；

一小管缓冲液300～500μl，该缓冲液为50～100mM PBS，pH值为7.0～7.4；

一小管洗脱液10～50μl，该洗脱液为1～5％三氟乙酸的水溶液；

一小管能量吸收分子饱和溶液5～10μl，该溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4℃冷藏盒中。

本发明提出的上述质谱抗体试剂盒制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)含U9缓冲溶液的质谱标准化质控血清(浆)的制备：将男性、女性等量的O型血清(浆)稀释在U9缓冲溶液中制成质谱的标准化质控血清(浆)，并将该稀释的血清(浆)分装成10～30μl小管中；其中，血清(浆)∶U9缓冲溶液＝1∶2，所述U9缓冲液为9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH9.0；

2)制备含抗hCG、抗hCGβcf、抗hCG-α及抗hCG-β的磁珠：将合成的变异的hCG免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细胞，按标准的单克隆抗体的制备方法制备；将购买的蛋白A-磁珠(Protein A-磁珠)30～50μl标记上的等量1μg的抗hCG、hCGβcf、hCG-α及hCG-β抗体；

3)将购买的50～100mM PBS(Phosphate-Buffered Saline)，pH值为7.0～7.4缓冲液、1～5％三氟乙酸的洗脱液分别分装成300～500μl小管和10～50μl小管；

4)将能量吸收分子溶解30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中制成能量吸收分子饱和溶液，并分装成5～10μl小管，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；

5)将上述分装好的各小管置于4℃冷藏箱中。

本发明还提出所述的试剂盒对异位妊娠体的预后判断的应用。

所述的检测试剂盒对异位妊娠体预后判断为：判断的23570Da蛋白质是变异的hCG-β、37580Da蛋白质是变异的hCG、10577Da蛋白质是变异的hCGβcf、14509Da蛋白质是变异的hCG-α；

所述试剂盒依据几个特征蛋白峰为10577、14509、23570、37580Da，双盲测试异位妊娠体外样品的敏感性100％，特异性90.1％。

质谱抗体试剂盒检测人绒毛膜促性腺激素异构体的应用实验步骤包括：

1.将生物样品先用缓冲液稀释30～50倍，将样品充分混匀；

2.将上述标本100μl加至已装好磁珠-Protein A-抗体(抗hCG、抗hCGβcf、抗hCG-α及抗hCG-β)的PCR管中，置磁性处理器上，15～25℃孵育20～40分钟，除去液体；

3.加100μl缓冲液至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育1～5分钟，除去液体，重复上述操作两次；

4.加10μl洗脱液1～5分钟，洗脱标本至上清液；

5.取5μl上清液移至另一个PCR管中，加入5μl能量吸收分子饱和溶液充分混匀；

6.取1μl混合溶液加样至质谱专用金属片(有3×3mm圆孔)上，自然干燥金属片；

7.将上述金属片加入质谱仪中，就会生成质谱；

8.外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性，所有样本均进行双份检测以减少实验误差。

上述的生物标志是利用一台质谱仪来检测的。该设备的质量精确度约为+/-1％。

基质是任何能与抗体选择性或特异性结合的物质。举例说明，Protein A、Protein G可选择性或特异性结合抗体的Fc位点。洗去基质未吸附的物质。任何适宜的洗液均可使用。

人绒毛膜促性腺激素异构体首先能够被具有能与人绒毛膜促性腺激素异构体结合的抗体吸附表面捕获，非吸附物能从基质上洗脱，吸附到底基的人绒毛膜促性腺激素异构体在质谱仪中被检测。人绒毛膜促性腺激素异构体通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。人绒毛膜促性腺激素异构体的检测明显地将与信号强度的检测有关。这样，人绒毛膜促性腺激素异构体的数量与质量都可以被检测出来。

质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而减轻高频噪音。

通过对人绒毛膜促性腺激素异构体检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。该计算机程序分析这些数据以显示检测出的人绒毛膜促性腺激素异构体的数量，并显示信号的强度和确定被检测的每个人绒毛膜促性腺激素异构体的分子量。数据分析还能包括一系列的确定人绒毛膜促性腺激素异构体的信号强度和矫正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度，可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的干扰，这可以设置调零。

计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分子量的人绒毛膜促性腺激素异构体更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的人绒毛膜促性腺激素异构体和那些高于或低于校准样本的人绒毛膜促性腺激素异构体。

分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选择，软件是可用的，它可自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇。

发明中使用的人绒毛膜促性腺激素异构体是抗体所捕获。这些人绒毛膜促性腺激素异构体是进一步通过质谱(mass spectrometry)测定其不同分子量来知道它们特定的身份。

异位妊娠检测多肽蛋白筛选。通过Mann-Whitney U检验分析几百种WCX阴离子基质磁珠捕获的血清蛋白指纹峰，发现下述蛋白指纹或质谱图谱可以用于区分正常与异位妊娠的血清。峰值CV＞30％或者p＜0.01为有显著性差异：

表一正常与异位妊娠蛋白指纹或质谱图谱的显著性差异(Da±1％)

1242 5001 8752 14509

1771 5359 9010 23570

2421 5518 9112 37580

2597 5678 9217

3752 5841 9987

4157 6178 10772

4630 6355 10577

4819 7272 13507

从中筛选出几个特征蛋白峰，10577、14509、23570、37580Da 4个差异峰组成的检验模型对异位妊娠患者和健康人群盲筛检验，用此分类法分析71份异位妊娠样本的质谱结果，其中64份区分正确，0份区分错误，敏感性为100％；71份对照样品中64份区分正确，7份区分错误，特异性为90.1％(见表二)：

表二生物样品中检验模型的判别情况

分组异位妊娠健康妊娠人合计

异位妊娠 71 7 78

健康妊娠人 0 64 64

合计 71 71 142

注：敏感性100％(71/71)；特异性90.1％(64/71)

利用C8及C18疏水基质磁珠或芯片的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠或芯片的实验结果一致。

将10577、14509、23570、37580Da生物标志用多级质谱(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白质梯状排序法(protein ladder sequencing)进行排序。通过将分子碎成碎片，可生成蛋白质梯度(protein ladders)。然后，用质谱对此梯度进行分析。

鉴别出14509Da蛋白为变异的hCG-α。其化学结构为(从N端至C端排列的氨基酸)：

1 APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQ

51 KNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS

鉴别出23570Da蛋白为变异的hCG-β。其化学结构为(从N端至C端排列的氨基酸)：

1 SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLP

51 ALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDC

101 GGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ

鉴别出10577Da蛋白为变异的hCGβcf；

鉴别出37580Da蛋白为hCG。

检测280例异位妊娠病人和正常妊娠的血清、尿液：发现异位妊娠的妇女产生的hCG和亚单位(hCG-β)的浓度比那些正常妊娠的妇女要低得多(表三)。

表三、区分正常人、异位妊娠生物标志群

筛选试验抗hCG 抗hCGβcf 抗hCG-α 抗hCG-β

异位妊娠 + + + +

正常妊娠 +++ ++ ++ +++

代表性的抗体-质谱峰见图1和图2；图中横坐标代表分子量(Da)、纵坐标代表质谱峰强度：抗hCG-β磁珠可捕获变异的hCG-β(图1中上图为抗hCG-β捕获的质谱峰，即hCG-β；下图为IgG对照组；图1中箭头指向为分子量23570Da，与hCG-β分子量一致)；抗hCG磁珠可捕获hCG(图2中上图为抗hCG捕获的质谱峰，即hCG；下图为IgG对照组；图2中箭头指向为分子量37580Da，与hCG分子量一致)。

本发明可用于体外细胞和非侵入性的体外异位妊娠质谱检测方法的定量控制，如离体体液的异位妊娠试剂盒用于临床质谱的异位妊娠检测方法。可以检测多个异位妊娠蛋白质生物标志群及质谱多肽图谱。

本发明中的试剂盒及方法与其他非侵入性的体外检测方法比较，具有以下的特点：

(1)准确

质谱直接分析有很强的精确性。因为蛋白质是由氨基酸组成的，而氨基酸的平均质量是已知的，如果知道了抗原或生物标志的总分子量，那么抗原的变异(指氨基酸变化)就很容易被推测出来。

(2)方便

支持基质的方法所用吸附剂的支持物是磁珠或芯片。用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。

(3)快捷

用本发明提供的蛋白指纹法进行检测时，无需对蛋白质进行测序。本发明采用了抗体-质谱分析一次性、同时检测差别性的hCG、hCGβcf、hCG-α及hCG-β。

附图说明

图1为利用本发明得到的变异的hCG-β的一个特征峰的抗体鉴定曲线。

图2为利用本发明得到的hCG的一个特征峰的抗体鉴定曲线。

具体实施方式

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1

本发明提出的人绒毛膜促性腺激素异构体的质谱抗体试剂盒实施例1，包括：

一小管含U9缓冲溶液的质谱标准化质控血清(浆)，10μl；

一小管含等量1μg的抗hCG、抗hCGβcf、抗hCG-α及抗hCG-β的磁珠30μl；

一小管缓冲液300μl，该缓冲液为50mM PBS，pH值为7.0；

一小管洗脱液10μl，该洗脱液为1％三氟乙酸的水溶液；

一小管能量吸收分子饱和溶液5μl，该溶液由能量吸收分子溶解在含30％乙腈和1％三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子采用肉桂酸衍生物；

上述各小管置于4℃冷藏箱中。

上述试剂盒的制备方法实施例包括以下步骤：

1)含U9缓冲溶液的质谱标准化质控血清(浆)的制备：将男性、女性等量的O型血清(浆)稀释在U9缓冲溶液中制成质谱的标准化质控血清(浆)，并将该稀释的血清(浆)分装成10μl小管中；其中，血清(浆)∶U9缓冲溶液＝1∶2，所述U9缓冲液为9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH9.0；

2)制备含抗hCG、抗hCGβcf、抗hCG-α及抗hCG-β的磁珠：将合成的变异的hCG免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细胞，按标准的单克隆抗体的制备方法制备；将购买的蛋白A-磁珠(Protein A-磁珠)30μl标记上的等量1μg抗体：抗hCG、hCGβcf、hCG-α及hCG-β。

3)将购买的50mM PBS(Phosphate-Buffered Saline)，pH值为7.0缓冲液、1％三氟乙酸的洗脱液分别分装成300μl小管和10μl小管；

4)将能量吸收分子饱和溶液溶解30％乙腈和1％三氟乙酸的水溶液中，分装成5μl小管，该能量吸收分子采用肉桂酸衍生物；

5)将上述分装好的各小管置于4℃冷藏箱中。

实施例2

本发明提出的人绒毛膜促性腺激素异构体的质谱抗体试剂盒实施例2，包括：

一小管含U9缓冲溶液的质谱标准化质控血清(浆)，30μl；

一小管含等量1μg的抗hCG、抗hCGβcf、抗hCG-α及抗hCG-β的磁珠50μl；

一小管缓冲液500μl，该缓冲液为100mM PBS，pH值为7.4；

一小管洗脱液50μl，该洗脱液为5％三氟乙酸的水溶液；

一小管能量吸收分子饱和溶液10μl，该溶液由能量吸收分子溶解在含60％乙腈和0.5％三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子采用芥子酸或二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4℃冷藏箱中。

上述试剂盒的制备方法实施例包括以下步骤：

1)含U9缓冲溶液的质谱标准化质控血清(浆)的制备：将男性、女性等量的O型血清(浆)稀释在U9缓冲溶液中制成质谱的标准化质控血清(浆)，并将该稀释的血清(浆)分装成30μl小管中；其中，血清(浆)∶U9缓冲溶液＝1∶2，所述U9缓冲液为9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH9.0；

2)制备含抗hCG、抗hCGβcf、抗hCG-α及抗hCG-β的磁珠：将合成的变异的hCG免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细胞，按标准的单克隆抗体的制备方法制备；将购买的蛋白A-磁珠(Protein A-磁珠)50μl标记上的等量1μg抗体：抗hCG、hCGβcf、hCG-α及hCG-β。

3)将购买的50～100mM PBS(Phosphate-Buffered Saline)，pH值为7.0～7.4缓冲液、1～5％三氟乙酸的洗脱液分别分装成500μl小管和50μl小管；

4)将能量吸收分子饱和溶液溶解60％乙腈和0.5％三氟乙酸的水溶液中，分装成10μl小管，该能量吸收分子采用芥子酸或二羟基苯甲酸之中的任一种；

5)将上述分装好的各小管置于4℃冷藏箱中。

采用本发明方法制备的试剂盒的应用及效果说明如下：

一、材料

1.标本来源：A.280例正常妊娠人对照组的血清及尿液；B.280例异位妊娠病人的血清及尿液。

2.质量控制：A.人标准化质控血清B.质谱激光能量调控：每次测试前，用上述标准化质控血清。

3.磁珠基质含已标记的等量1μg抗体：抗hCG、hCGβcf、hCG-α及hCG-β。将蛋白A(Protein A)用Carbodiimide方法标记在磁珠上(见Gunn DL，et al.J Immunol Methods.1：381-389，1972)；蛋白A(Protein A)可以结合多个标有的抗体。具有吸附剂功能的Protein A与抗体置磁性处理器上，22℃孵育30分钟，除去液体。加100μl缓冲液(50mMPBS，pH 7.0～7.4)至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作两次。

二、方法

1.样品的收集：全血采集后吸取血清及尿液，置于-80℃保存；-80℃冰箱中取出血清及尿液样品，置冰盒上融解；以10,000转/分，4℃离心2分钟；取上清液。

2.样品的准备：每个吸附剂支持物点需要血清及尿液1μl，将血清及尿液用缓冲液稀释，将样品充分混匀。

3.样品检测：上样，将上述标本100μl加至已装好磁珠-Protein A-抗体的PCR管中，置磁性处理器上，22℃孵育30分钟，除去液体。加100μl缓冲液(50mM PBS，pH 7.0～7.4)至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作两次。加10μl洗脱液2分钟，洗脱标本至上清液。取5μl上清液移至另一个PCR管中，加入5μl能量吸收分子饱和溶充分混匀，取1μl混合溶液加样至质谱专用金属片(有3×3mm圆孔)上，自然干燥金属片。所有样本均进行双份检测以减少实验误差。

4.将上述样品加入质谱中，就会生成飞行时间质谱。外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性。

实验结果

用统计学方法，通过分析血清蛋白指纹峰，发现下述生物标志可以用于区分正常人、异位妊娠生物标志群变异表达(表三)。

表三、区分正常人、异位妊娠生物标志群

筛选试验抗hCG 抗hCGβcf 抗hCG-α 抗hCG-β

异位妊娠 + + + +

正常妊娠 +++ ++ ++ +++

检测280例异位妊娠病人和正常妊娠的血清、尿液：发现异位妊娠的妇女产生的hCG和亚单位(hCG-β)的浓度比那些正常妊娠的妇女要低得多。

发现尿液和血清分子量为10577、14509、23570、37580Da生物标志的变化区分正常人、异位妊娠标志群变异表达具有重要意义。

本发明用于异位妊娠检测多肽蛋白筛选实验

(1)实验方法

异位妊娠患者的血清及尿液280例，平均年龄25岁。健康妊娠者280例，平均年龄27岁，来源于肝功能、肾功能等检查均正常的体检人群。受检者空腹采集静脉血1mL，采集后立即于4℃冰箱静置2小时，4℃4000r/min离心10分钟分离血清，将血清于4℃12000r/min再次离心5分钟，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为100μL/管，共5管，保存于-80℃冰箱。避免反复冻融。

血清样品处理：从-80℃冰箱中取出血清，于4℃，10000rpm离心5min。取10μL血清样品，加20μL U9处理液(9mol/L尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mmol/L Tris-CL，pH9.0)，充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入360μL结合缓冲液(100mmol/L NaAc，pH4.0)，立即混匀。

芯片上样及洗脱：将WCX2芯片(弱阴型离子表面，羧基基团，捕获正电荷基团蛋白)装入bioprocessor中，每孔加入200μL结合缓冲液，室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干。每孔分别加入100μL处理好的样品，振荡孵育1h，甩去样品，用200μl芯片洗脱缓冲液(100mmol/L NaAc，pH4.0)室温振荡洗涤2次，每次5min，甩干；再用HPLC H2O洗涤一次，立即甩干。取出芯片，每点加2次0.5μL SPA饱和溶液，晾干后上机测量。

磁珠上样及洗脱：将处理好的样品100μL加至已装好WCX磁珠(弱阴离子表面，羧酸基团，捕获正电荷基团蛋白)的PCR管中，置磁性处理器上孵育30min，除去液体。加100μL磁珠结合缓冲液(50mmol/L NaAc，pH 4.0～4.3)至已装好WCX磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作2次。加10μL Elution Buffer 2min，洗脱标本至上清液。取5μL上清液移至另一个PCR管中，加入5μL SPA饱和溶液充分混匀，取1μL混合溶液加样到Au片上，晾干后上机测量(刘建栋等，血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007，27：193-197)。

数据收集

将处理好的Au片置入MALDI-TOF-MS进行蛋白质谱分析。在读取数据前，用加有all-in-one标准蛋白质的芯片校正质谱仪，使分子量误差＜0.1％。本研究中阅读仪的主要参数设定为，最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围1000～15000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围20～80，收集总数为130次。软件中设定读片程序，以读取数据。用血清中的内标峰4091.1Da或6634.0Da校正原始数据中的蛋白指纹图谱，使分子量误差＜0.01％，从而获得的精确的蛋白指纹图谱。

统计学分析

应用软件分析处理所有峰谱，形成蛋白指纹图谱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1或6634.0Da强度调至40～50％信号强度的最大值，并且用最显著的峰进行了校正，而后又进行了“减少基线”，定义蛋白峰(s/n＞5，最小的峰强度＞1.6)。分析所有1～50kDa之间的蛋白峰，并且仔细检查了每个相应的峰，计算出峰的平均数，标准误差(SD)和变异系数(CV％)。用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，计算p值。异位妊娠检测多肽蛋白筛选。通过Mann-Whitney U检验分析几百种血清蛋白指纹峰，发现下述蛋白指纹或质谱图谱可以用于区分正常与异位妊娠的血清。峰值CV＞30％或者p＜0.01为有显著性差异：

1242 5001 8752 14509

1771 5359 9010 23570

2421 5518 9112 37580

2597 5678 9217

3752 5841 9987

4157 6178 10772

4630 6355 10577

4819 7272 13507

采用本发明对特征蛋白峰的双盲测试

从中筛选出几个特征蛋白峰，10577、14509、23570、37580Da 4个差异峰组成的检验模型对异位妊娠患者和健康妊娠盲筛检验，用此分类法分析71份异位妊娠样本的质谱结果，其中64份区分正确，0份区分错误，敏感性为100％；71份对照样品中64份区分正确，7份区分错误，特异性为90.1％(见表二)：

表二生物样品中检验模型的判别情况

分组异位妊娠健康妊娠人合计

异位妊娠 71 7 78

健康妊娠人 0 64 64

合计 71 71 142

注：敏感性100％(71/71)；特异性90.1％(64/71)

发现异位妊娠的妇女产生的hCG亚单位的浓度比那些正常妊娠的妇女要低得多。利用C8及C18疏水基质磁珠或芯片的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠或芯片的实验结果一致。

采用本发明对特征蛋白峰蛋白的排序鉴定

1 APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQ

51 KNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS

1 SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLP

51 ALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDC

101 GGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ

鉴别出10577Da蛋白为变异的hCGβcf；

鉴别出37580Da蛋白为hCG。

本发明中变异的或修饰的hCG抗体的制备实施例

变异的或修饰的hCG的合成：合成hCG-α及hCG-β。hCG-α及hCG-β序列：

N端

1 APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQ

51 KNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS

C端

N端

1 SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLP

51 ALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDC

101 GGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ

C端

将合成的变异的生物标记免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细胞。用溶血噬菌斑分析法选择并分离出能分泌所需抗体的单个淋巴细胞。将单个细胞扩增至1×10⁷个以上，用Quick mRNA Purification Kit提取mRNA。以提取的mRNA为模板，合成cDNA链。以此cDNA为模板，加入鼠抗体重链可变区(V_H)通用引物，轻链可变区(V_L)通用引物，进行聚合酶链反应，获得扩增的V_H基因片段和V_L基因片段。将扩增产物在15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离。用glass milk回收扩增的V_H基因片段和V_L基因片段。与等摩尔尝试的Limker Primer Mix混合，进行聚合酶链反应，连接V_H和V_L。扩增产物分离纯化后，获得特异性单链抗体(ScFV)。此ScFV可用于制备检测所需DNA片。将此扩增产物两端加限制性酶切位点，纯化定量后，连接到P^UCI9载体上。将连接产物转化感染大肠杆菌TOP10。经蓝白斑筛选及酶切鉴定，筛选出重组质粒。在96孔板形成单克隆抗体。用ELISA法筛选出效价最高的单克隆抗体株，大量制备，并从培养上清中提取所需抗体。此抗体可用于制备检测所需试剂盒。

在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式应当同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种检测人绒毛膜促性腺激素异构体的质谱抗体试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

一小管含U9缓冲溶液的质谱标准化质控血清，10～30μl；

一小管含等量1μg的抗hCG、抗hCGβcf、抗hCG-α及抗hCG-β抗体的磁珠30～50μl；

一小管能量吸收分子饱和溶液5～10μl，该溶液由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中构成，上述各小管置于4℃冷藏盒中。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述能量吸收分子采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种。