CN101354379B - 用质谱检测多发性骨髓瘤特征蛋白的试剂 - Google Patents

Abstract

本发明建立了一种检测多发性骨髓瘤的血清蛋白质谱模型，本发明发现了多发性骨髓瘤的血清蛋白中具有56个特征蛋白，选取其中任意两个或两个以上蛋白，并用质谱分析，可检测多发性骨髓瘤等疾病。本发明根据所述质谱模型，开发了用质谱方法检测生物样品中特异蛋白的试剂和试剂盒。

Description

用质谱检测多发性骨髓瘤特征蛋白的试剂

技术领域：

本发明涉及一种多发性骨髓瘤蛋白的检测试剂，特别是用质谱检测多发性骨髓瘤特征蛋白的试剂。

背景技术：

多发性骨髓瘤(MM)是克隆B细胞紊乱，恶性浆细胞(PC)在骨髓中聚集导致溶骨病变并且产生过多的单克隆蛋白。虽然对于多发性骨髓瘤的治疗已经取得了实质性的进展，预防和早期发现仍是降低多发性骨髓瘤死亡率的有效途径和提高患者成活率的关键。

目前用于筛查多发性骨髓瘤的实验室检测方法敏感性和特异性均较低，已成为多发性骨髓瘤早期检测的一个瓶颈。而且这些方法通常都有侵袭性，且花费昂贵，所以需要一种高敏感性，特异性，非侵袭性，便宜又方便的方法。

已知蛋白质的分离和质谱分析可用于生物标志物的检测。虽然单克隆蛋白(M-蛋白)是重要的检测多发性骨髓瘤的生物标记物，但它没有特异性，因为此蛋白也可以在意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)的血清中找到。临床上仅以单克隆蛋白一种蛋白作为血清学检测指标在敏感性和特异性上是远远不足的。

蛋白质的分离技术在蛋白质组学中应用分离技术有两个目的。第一、通过将蛋白质的混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂的蛋白质混合物；第二、通过标记的方法可以比较两个蛋白质的混合物样品中蛋白质的不同表现。其中主要的技术有双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)、高效液相层析(high-performanceliquid chromatography，HPLC)、毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)、亲和层析(affinity choromatography)、蛋白芯片(protein microarray)、磁性微球(magneticbeads，简称磁珠)和免疫组等。特别是蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术克服了以往技术的缺点，具有高灵敏度、高通量、结果重复性好、可机械化操作和方法灵活等特点。待测样品来源广泛，不需作特殊前处理，可以直接点样检测，如血清、尿液及组织液等；检测快速，一般一例标本的检测时间仅需约5分钟，从标本制备到出结果全过程仅约1小时。蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术有可能在体液中潜在生物标志(biomarker)检测方面创造革命性突破(许洋，蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床医学中的研究进展，基础医学与临床，2007，27：134-142)。基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of fight massspectrometry，MALDI-TOF-MS)与蛋白芯片分离技术联合应用即为表面增强激光解析/电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time of fight massspectrometry，SELDI-TOF-MS)。2-DE最先被用于临床蛋白组学研究，但其对疏水性、强酸性和强硷性蛋白的分辩率不够，而且不能检测低丰度蛋白，故实用价值受限。近来，蛋白芯片与质谱技术(SELDI-TOF-MS)的结合，已被成功地用于肿瘤研究。

由于磁珠表面的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高(刘建栋等，血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007，27：193-197)。磁珠具有优于二维电泳、蛋白芯片和其他质谱方法的特点，已被广泛地用于肿瘤生物标志的筛查等研究(屠世良等，癌胚抗原阴性结直肠癌的检测和结直肠癌预后相关生物标志，基础医学与临床，2007，27：926-931)。该技术具有操作简便、无需离心样品、可直接分析原始生物样本(如血清、尿液等)、样本用量小等特点，同时适合多样品平行检测和直接进行蛋白质全景式的搜索和分析，特别是对小分子量蛋白和低丰度蛋白具有较高的捕获效果，可以与其他蛋白质组学方法互补，目前已被广泛地用于肿瘤标志的筛查和临床检测，并均已获得很好的结果。

但迄今尚未见到采用磁珠捕获生物标志，并用质谱分析技术检测多发性骨髓瘤血清特征蛋白的报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新的检测多发性骨髓瘤的方法和试剂，通过建立检测多发性骨髓瘤特征蛋白的优化质谱模型，提供用质谱法检测多发性骨髓瘤特征蛋白的试剂。

本发明通过能与蛋白质结合的磁珠基质去捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测多发性骨髓瘤生物标志。

本发明建立了一种检测多发性骨髓瘤的血清蛋白质谱模型，其特征在于：包括选自56个特征蛋白中任意两个或两个以上蛋白；所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z＝8139，M≤5.88；m/z＝11682，M≤0.78；m/z＝22778，M≤0.64；单克隆免疫球蛋白疾病к组和λ组分型，在多发性骨髓瘤к类型m/z＝6191，M＞5.20，λ类型m/z＝6191，M≤5.20；分子量(m/z)误差＜0.01％，临界峰值均值M的CV＜5～10％。

从血清中筛选出56蛋白作为特征蛋白；选取上述56个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了多发性骨髓瘤患者与正常人、多发性骨髓瘤相鉴别的患者(POEMS综合症；NHL；MGUS；CRF；风湿病；巨球蛋白血症；或者其他伴有骨转移的肿瘤)两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型。

按照单克隆免疫球蛋白类型疾病分期对多发性骨髓瘤血清的蛋白质组进行分析；根据单克隆免疫球蛋白的轻链，所有的多发性骨髓瘤病人被分成两组，к组和λ组；来自多发性骨髓瘤病人的血清样本被用于分析，在多发性骨髓瘤组的к和λ类型中发现了几个差异峰；对照λ类型上的5190Da、6191Da、6308Da、6364Da、7098Da和11858Da的峰升高了，к类型上的22778Da，、22964Da和23188Da的峰下降了；m/z＞24kDa(24374，24553，24664)的三个峰，在к类型上也升高了，但是没有其他升高的峰升高的那样明显；6191Da的峰可以作为标记蛋白来区分两种类型的多发性骨髓瘤：单克隆免疫球蛋白疾病к组和λ组分型，在多发性骨髓瘤к类型m/z＝6191，M＞5.20，λ类型m/z＝6191，M≤5.20；比较所有类型的多发性骨髓瘤(IgG，IgA，IgD，唯一的к轻链和λ轻链多发性骨髓瘤)和其他类型相比，6364Da和6449Da峰在IgD多发性骨髓瘤患者上呈显著下降(P＝0.002，P＝0.001)。

上述质谱模型是采用以下步骤制备而得的：

1)4℃条件下2小时内收集多发性骨髓瘤患者和健康人的血清两组血清标本，在-80℃低温冷冻备用；

2)采用WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠对所述两组血清标本的蛋白进行吸附；

3)用激光解吸/电离飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的血清蛋白后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)对结合在表面的WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠上的两组血清蛋白进行读取，由此获得两组蛋白质谱图谱；

4)在每次实验数据收集前，用标准蛋白及质谱的标准化质控O型血清校正仪器，使蛋白质分子量误差＜0.01％和临界峰值均值M的CV＜5～10％，并精确地、定量地收集多发性骨髓瘤患者和正常人优化的血清质谱图谱数据；

5)对所得数据进行统计学处理，根据多发性骨髓瘤患者和正常人血清之间蛋白峰的差异，检测出2组血清蛋白质谱图谱之间有56个稳定的差异蛋白及其临界峰值；将所述56个差异蛋白作为多发性骨髓瘤蛋白质谱模型的特征蛋白；

6)选取所述56个特征蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，以各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M构成用于检测多发性骨髓瘤血清特征蛋白质谱模型；其中所述的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z＝8139，M≤5.88；m/z＝11682，M≤0.78；m/z＝22778，M≤0.64；单克隆免疫球蛋白疾病к组和λ组分型，在多发性骨髓瘤к类型m/z＝6191，M＞5.20，λ类型m/z＝6191，M≤5.20；分子量(m/z)误差＜0.01％，临界峰值均值M的CV＜5～10％。

具体操作步骤如下：

1)4℃条件下2小时内收集经病理明确诊断的多发性骨髓瘤患者血清及经体检确定为正常健康者的血清作为两组血清标本，进行-80℃低温冷冻备用；病人和血清样本随后被分成两组：一组为训练集，另一组为盲测组(表1)；

表1用于训练集组和测试集组的血清样本

2)采用阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠对所述多发性骨髓瘤患者及正常人的两组血清标本的蛋白进行吸附；

3)用激光解吸/电离飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)对结合在表面的WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠上的两组血清蛋白进行读取，设定最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围1000～15000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围20～80，激光强度150～180，检测敏感度为7～8，收集总数为130次，由此获得两组蛋白质谱图谱；

4)在每次实验数据收集前，用All-in-one标准蛋白及质谱的标准化质控O型血清校正仪器，用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使分子量误差＜0.01％，从而获得的精确的蛋白质谱图谱；

5)定量性质谱调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da等强度调至50％信号强度的最大值，使临界峰值均值M的CV＜5～10％，并收集精确的质谱图谱数据；

6)对所得数据进行Mann-Whitney U检验统计学处理，根据多发性骨髓瘤患者和正常人血清之间蛋白峰值的差异(共得到260个蛋白峰，认定P值小于0.01时具有统计学意义)，检测出2组血清蛋白指纹质谱图谱之间有56个稳定的差异蛋白，见表2：

表2多发性骨髓瘤和对照组的56个差异峰

m/z表示质荷比

P由多发性骨髓瘤组(MM)和非多发性骨髓瘤组(non-MM)的对照产生

标志着‘▲’的峰被选为多发性骨髓瘤检验模型的标记峰

图1在训练数据组的决定树分类图表：母节点(顶端)的数目，子节点，和终节点1-4代表N组，MM(多发性骨髓瘤组)和non-MM(非多发性骨髓瘤组)总数。在母节点和子节点下面的数目是基于蛋白峰强度值的质量值。比如，在母节点的质量值是8139(Da)，强度≤5.88。

将上述56个差异蛋白作为多发性骨髓瘤质谱检验模型的特征蛋白。

由于多个特征蛋白组合起来才可将多发性骨髓瘤与正常人等完全分开，故选取上述56个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了多发性骨髓瘤患者与正常人、多发性骨髓瘤相鉴别的患者(POEMS综合症；NHL；MGUS；CRF；风湿病；巨球蛋白血症；或者其他伴有骨转移的肿瘤)两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型(图1-5)，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z＝8139，M≤5.88；m/z＝11682，M≤0.78；m/z＝22778，M≤0.64((图2(a)、(b)、(c)的上部是代表MM的校准图(标记为MM1和MM2)；图2(a)、(b)、(c)的中部是non-MM对照[必须要和MM做鉴别诊断的疾病(标记为D1和D2)；图2(a)、(b)、(c)的下部是健康人群(标记为N1和N2)]的图谱，有3个蛋白标记物；图2(a)的m/z为8131；图2(b)的m/z为11660；图2(c)的m/z为22752)。临界峰值均值M的CV＜5～10％。按照单克隆免疫球蛋白类型疾病分期对多发性骨髓瘤血清的蛋白质组进行分析；根据单克隆免疫球蛋白的轻链，所有的多发性骨髓瘤病人被分成两组，к组和λ组。来自多发性骨髓瘤病人的血清样本被用于分析，在多发性骨髓瘤组的к和λ类型中发现了几个差异峰。对照λ类型上的5190Da、6191Da、6308Da、6364Da、7098Da和11858Da的峰升高了，к类型上的22778Da，、22964Da和23188Da的峰下降了。m/z＞24kDa(24374，24553，24664)的三个峰，在к类型上也升高了，但是没有其他升高的峰升高的那样明显。6191Da的峰可以作为标记蛋白(图4)来区分两种类型的多发性骨髓瘤：单克隆免疫球蛋白疾病к组和λ组分型，在多发性骨髓瘤к类型m/z＝6191，M＞5.20，λ类型m/z＝6191，M≤5.20；比较所有类型的多发性骨髓瘤(IgG，IgA，IgD，唯一的к轻链和λ轻链多发性骨髓瘤)和其他类型相比，6364Da和6449Da峰在IgD多发性骨髓瘤患者上呈显著下降(P＝0.002，P＝0.001)(图5)。

利用该质谱模型，只要将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明质谱模型逐一进行对比分析，就可用于多发性骨髓瘤(MM)检验：

表3多发性骨髓瘤对照非多发性骨髓瘤的蛋白谱和决定树分类的标记物统计

利用该质谱模型(图1)，将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明的质谱模型逐一进行对比分析，经临床试用及双盲测试，其鉴别多发性骨髓瘤患者与对照组的敏感性为86.67％，特异性为81.36％：对全盲测试组(30例多发性骨髓瘤和59例对照组)分析，从30例多发性骨髓瘤标本中正确的区分出了26例(86.67％)，在59例作为非多发性骨髓瘤的对照组中正确的区分出了48例(81.36％)(表4)。更重要的是此检测模型从需要和多发性骨髓瘤做鉴别的疾病中成功的区分出了多发性骨髓瘤(比如说MGUS，NHL等等)。

表4多发性骨髓瘤检测模型的预测结果

利用C8及C18疏水基质磁珠的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠的实验结果一致。

本发明采用上述质谱模型可用于多发性骨髓瘤早期检测、单克隆免疫球蛋白疾病к组和λ组分型、IgG，IgA，IgD分类、筛查和复发、转移的评估。

所述质谱模型的应用方法，特征是将待检样品中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与所述选自56个特征蛋白中任意两个或两个以上蛋白逐一进行对比分析。即，只要在56个特征蛋白中任选两个与待检样品中相比，就可以得知样品中是否含有多发性骨髓瘤血清特征蛋白或其它一些疾病的特征蛋白，从而得到样品阳性或阴性的检测结果。

本发明已证实，多发性骨髓瘤血清中的特征蛋白是m/z 6191的特征蛋白。

本发明根据上述质谱模型，还提供了一种用质谱方法检测生物样品中特异蛋白的试剂，其特征在于：含有能与特异蛋白质结合的磁珠基质，所述磁珠是可吸附样品中蛋白质WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠。

所述特异蛋白是多发性骨髓瘤、POEMS综合症、NHL、MGUS、CRF、风湿病、巨球蛋白血症、伴有骨转移的肿瘤，以及单克隆免疫球蛋白疾病IgG，IgA，IgD分类中的蛋白。

本发明的试剂的使用方法如下：

1)取样：4～6℃条件下收集待测者的血清标本，在-80℃低温冷冻备用；

2)用本试剂中的磁珠对血清标本的蛋白进行吸附及用标准的质谱前处理(细见实施例1)；

3)用激光解吸/电离飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的血清蛋白后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)对结合在磁珠上的血清蛋白进行读取，获得蛋白质谱图谱；

4)与特征蛋白质谱模型进行对比

选取蛋白质谱模型中56个特征蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，对比各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M。

本发明用所述的试剂开发了检测试剂盒，按盒中说明书的操作方法可用于检测多发性骨髓瘤、POEMS综合症、NHL、MGUS、CRF、风湿病、巨球蛋白血症、伴有骨转移的肿瘤，以及单克隆免疫球蛋白疾病IgG，IgA，IgD分类。

所述试剂盒中含有通常检测蛋白质常规的其它试剂和设备，这些试剂和设备，本领域普通技术人员均熟知。如试剂盒，还含有可用质谱仪进行分析的阳性对照与阴性对照。

在多发性骨髓瘤检测试剂盒中，所述阳性对照是两个或两个以上的特征蛋白的质谱模型，所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z＝8139，M≤5.88；m/z＝11682，M≤0.78；m/z＝22778，M≤0.64；单克隆免疫球蛋白疾病к组和λ组分型，在多发性骨髓瘤к类型m/z＝6191，M＞5.20，λ类型m/z＝6191，M≤5.20；分子量(m/z)误差＜0.01％，临界峰值均值M的CV＜5～10％。

本发明的特点及效果：

本发明与其他多发性骨髓瘤的检测方法比较，具有以下优点：

第一、本发明采用多发性骨髓瘤患者与正常人具有差异的多个特征蛋白组合起来进行对多发性骨髓瘤血清的检测，提供的质谱模型是多发性骨髓瘤早期检测和筛查的新方法和新途径，并为进一步发现新的多发性骨髓瘤生物标志提供了基础；

第二、与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，是一种在蛋白组学水平上的检测，对多发性骨髓瘤的早期检测提供了新标准；

第三、本发明由于磁珠表面的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高而具有了更高的灵敏度，从而优化了质谱模型；

第四、本发明首创采用了定量性质谱调控，CV＜5～10％，使磁珠的临界峰值均值M比蛋白芯片更可靠及精确；

第五、本发明采用了用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于质谱内标定性的2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da标准峰(分子量)质控标准，使分子量误差＜0.01％，从而获得的精确的蛋白质谱图谱；

第六、本发明质谱模型的构建方法设计精确及合理可行，为降低我国多发性骨髓瘤的病死率、提高多发性骨髓瘤的临床治愈提供了一种新的筛查和复发、转移的评估方法、单克隆免疫球蛋白疾病к组和λ组分型、IgG，IgA，IgD分类。

附图说明

图1在训练数据组的决定树分类图表(母节点(顶端)的数目，子节点(绿色长方形区域)，和终节点1-4(灰色长方形区域)代表N组，MM和non-MM总数。在母节点和子节点下面的数目是基于蛋白峰强度值的质量值。比如，在母节点的质量值是8131Da，强度≤5.88)；

图2多发性骨髓瘤代表性的质谱峰(图2(a)、(b)、(c)的上部是代表MM的校准图(标记为MM1和MM2)；图2(a)、(b)、(c)的中部是non-MM对照[必须要和MM做鉴别诊断的疾病(标记为D1和D2)；图2(a)、(b)、(c)的下部是健康人群(标记为N1和N2)]的图谱，有3个蛋白标记物；图2(a)的m/z为8131；图2(b)的m/z为11660；图2(c)的m/z为22752)；

图3  多发性骨髓瘤类型的鉴别模型的ROC曲线；

图4  κ和λ类型的多发性骨髓瘤的6191Da标记峰(图中横坐标代表分子量(Da)、纵坐标代表质谱峰强度)；

图5  IgD多发性骨髓瘤和其他类型的多发性骨髓瘤病人的6364Da标记峰(图中横坐标代表分子量(Da)、纵坐标代表质谱峰强度)。

图中m/z表示特异蛋白的质荷比，M代表该特异蛋白的临界峰值均值。

具体实施方式

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例中实验材料来源如下：

阴离子的WCX磁珠(爱睦

WCX)、C8及C18的疏水基质磁珠(爱睦

C8及C18)、Elution Buffer(爱睦

EB)和标准化质控O型血清(爱睦

标血O)购买于北京爱睦世健康科技有限公司；

9mol/L尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mmol/L Tris-CL；100mmol/L NaAc；SPA(SinapinicAcid)饱和溶液；all-in-one标准蛋白购买于美国Sigma公司。

实施例1  正常与多发性骨髓瘤患者的区分及质谱的试剂盒制备

(1)实验方法

此研究中应用的所有连续的54个患有多发性骨髓瘤的病人(男性37例，女性17例)。他们的平均年龄是58岁(从46岁到83岁)。新诊断的有25例病人，根据Durie/Salmon分期系统，其中7例是多发性骨髓瘤II期，18例是III期，29例在收集了血液样本后进行了化疗(6例达到了完全缓解，13例部分缓解，5例复发，5例有其他状况)。在29例进行化疗的病人中，抽出了13例在已有2或3次抽样化疗后，进行了第二次化疗。这些病人的血样是从血清收集的。108例非多发性骨髓瘤的对照血清样本，来自于健康志愿者(n＝62)或者有其他疾病的患者，这些疾病必须与多发性骨髓瘤相鉴别(POEMS综合症，n＝4)；NHL，n＝7；MGUS，n＝6；CRF，n＝5，风湿病(n＝14)；巨球蛋白血症，n＝5；或者其他伴有骨转移的肿瘤，n＝5)。

磁珠操作步骤

血清样品处理：从-80℃冰箱中取出血清，于4℃，10000rpm离心5min。取10μL血清样品，加20μL U9处理液(9mol/L尿素，2％CHAPS，1％DTT，50mmol/L Tris-CL，pH9.0)，充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入360μL结合缓冲液(100mmol/L NaAc，pH4.0)，立即混匀。所有样本在分析前仅被冻溶一次(刘建栋等，血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007，27：193-197)。病人和血清样本随后被分成两组：一组为训练集，另一组为盲测组(表5)。

表5用于训练集组和测试集组的血清样本

磁珠上样及洗脱：将处理好的样品100μL加至已装好WCX磁珠(弱阴离子表面，羧酸基团，捕获正电荷基团蛋白)的PCR管中，置磁性处理器上孵育30min，除去液体。加100μL磁珠结合缓冲液(50mmol/L NaAc，pH 4.0～4.3)至已装好WCX磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作2次。加10μL Elution Buffer 2min，洗脱标本至上清液。取5μL上清液移至另一个PCR管中，加入5μL SPA饱和溶液充分混匀，取1μL混合溶液加样到Au或Steel片上，晾干后上机测量。

数据收集

将处理好的Au或Steel片置入MALDI-TOF-MS进行蛋白质谱分析。在读取数据前，用加有all-in-one标准蛋白质的芯片校正质谱仪，使分子量误差＜0.1％。本研究中阅读仪的主要参数设定为，最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围1000～15000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围20～80，收集总数为130次。软件中设定读片程序，以读取数据。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使分子量误差＜0.01％，从而获得的精确的蛋白质谱图谱。

统计学分析

应用软件分析处理所有峰谱，形成蛋白质谱图谱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至40～50％信号强度的最大值，并且用最显著的峰进行了校正，而后又进行了“减少基线”，定义蛋白峰(s/n＞5，最小的峰强度＞1.6)。分析所有1～50kDa之间的蛋白峰，并且仔细检查了每个相应的峰，计算出峰的平均值M，标准误差(SD)和变异系数(CV％)。用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，计算P值。

多发性骨髓瘤检测多肽蛋白筛选

用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，CV＜5～10％；初步分析筛选出P＜0.01的多发性骨髓瘤患者与正常人群有56个差异多肽蛋白，不同峰的分子量(m/z)及特征蛋白的表达变化见表6：

表6多发性骨髓瘤和对照组的56个差异峰

m/z表示质荷比；

P由多发性骨髓瘤组(MM)和非多发性骨髓瘤组(non-MM)的对照产生；

标志着‘▲’的峰被选为多发性骨髓瘤检验模型的标记峰；

图1在训练数据组的决定树分类图表：母节点(顶端)的数目，子节点，和终节点1-4代表N组，MM(多发性骨髓瘤组)和non-MM(非多发性骨髓瘤组)总数。在母节点和子节点下面的数目是基于蛋白峰强度值的质量值。比如，在母节点的质量值是8139(Da)，强度≤5.88。

将上述56个差异蛋白作为多发性骨髓瘤质谱检验模型的特征蛋白；

实施例2临床试用及双盲测试；

由于多个特征蛋白组合起来才可将多发性骨髓瘤与正常人等完全分开，故选取上述56个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了多发性骨髓瘤患者与正常人、多发性骨髓瘤相鉴别的患者(POEMS综合症；NHL；MGUS；CRF；风湿病；巨球蛋白血症；或者其他伴有骨转移的肿瘤)两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型(图1-5)，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z＝8139，M≤5.88；m/z＝11682，M≤0.78；m/z＝22778，M≤0.64((图2(a)、(b)、(c)的上部是代表MM的校准图(标记为MM1和MM2)；图2(a)、(b)、(c)的中部是non-MM对照[必须要和MM做鉴别诊断的疾病(标记为D1和D2)；图2(a)、(b)、(c)的下部是健康人群(标记为N1和N2)]的图谱，有3个蛋白标记物；图2(a)的m/z为8131；图2(b)的m/z为11660；图2(c)的m/z为22752)。临界峰值均值M的CV＜5～10％。按照单克隆免疫球蛋白类型疾病分期对多发性骨髓瘤血清的蛋白质组进行分析；根据单克隆免疫球蛋白的轻链，所有的多发性骨髓瘤病人被分成两组，к组和λ组。来自多发性骨髓瘤病人的血清样本被用于分析，在多发性骨髓瘤组的к和λ类型中发现了几个差异峰。对照λ类型上的5190Da、6191Da、6308Da、6364Da、7098Da和11858Da的峰升高了，к类型上的22778Da，、22964Da和23188Da的峰下降了。m/z＞24kDa(24374，24553，24664)的三个峰，在к类型上也升高了，但是没有其他升高的峰升高的那样明显。6191Da的峰可以作为标记蛋白(图4)来区分两种类型的多发性骨髓瘤：单克隆免疫球蛋白疾病к组和λ组分型，在多发性骨髓瘤к类型m/z＝6191，M＞5.20，λ类型m/z＝6191，M≤5.20；在多发性骨髓瘤к类型的平均峰高是8.218，λ类型的平均峰高是2.365。比较所有类型的多发性骨髓瘤(IgG，IgA，IgD，唯一的к轻链和λ轻链多发性骨髓瘤)和其他类型相比，6364Da和6449Da峰在IgD多发性骨髓瘤患者上呈显著下降(P＝0.002，P＝0.001)(图5)。

利用该质谱模型，只要将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明质谱模型逐一进行对比分析，就可用于多发性骨髓瘤(MM)检验。

表7多发性骨髓瘤对照非多发性骨髓瘤的蛋白谱和决定树分类的标记物统计

利用该质谱模型(图1)，将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明的质谱模型逐一进行对比分析，经临床试用及双盲测试，其鉴别多发性骨髓瘤患者与对照组的敏感性为86.67％，特异性为81.36％：对全盲测试组(30例多发性骨髓瘤和59例对照组)分析，从30例多发性骨髓瘤标本中正确的区分出了26例(86.67％)，在59例作为非多发性骨髓瘤的对照组中正确的区分出了48例(81.36％)(表4)。更重要的是此检测模型从需要和多发性骨髓瘤做鉴别的疾病中成功的区分出了多发性骨髓瘤(比如说MGUS，NHL等等)。

表8多发性骨髓瘤检测模型的预测结果

利用C8及C18疏水基质磁珠的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠的实验结果一致。

为一种新的非侵入性的体外质谱检测方法。本发明可以应用到已经脱离人体的体液中的多发性骨髓瘤生物标志组合的检测方法或试剂盒。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种检测试剂盒，其特征在于：含有能与特异蛋白质结合的磁珠基质，所述磁珠是可吸附样品中蛋白质的WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠；

含有试剂盒操作方法的说明书；

含有阳性对照与阴性对照，所述对照可用激光解吸/电离飞行时间质谱仪进行分析；

检测试剂盒中包括多发性骨髓瘤患者与正常人、多发性骨髓瘤相鉴别的患者两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型，所述质谱模型包括选自56个特征蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，所述阳性对照是将待检样品中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与特征蛋白逐一进行对比分析；

所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z＝8139，M≤5.88；m/z＝11682，M≤0.78；m/z＝22778，M≤0.64；对于单克隆免疫球蛋白疾病κ组和λ组分型，在多发性骨髓瘤κ类型m/z＝6191，M＞5.20，λ类型m/z＝6191，M≤5.20；

质荷比m/z误差＜0.01％，临界峰值均值M的变异系数CV＜5～10％。

2.人体血清样品中特异蛋白的试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)4℃条件下2小时内收集多发性骨髓瘤患者和健康人的两组血清样品，在-80℃低温冷冻备用；

2)采用WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠对所述两组血清样品的蛋白进行吸附；

3)用337nm氮激光仪和80cm或120cm飞行管分析阵列的激光解吸/电离飞行时间质谱仪对结合在表面的WCX阴离子基质磁珠或C8及C18疏水基质磁珠上的两组血清蛋白进行读取，由此获得两组蛋白质谱图谱；

4)在每次实验数据收集前，用标准蛋白及质谱的标准化质控O型血清样品校正仪器，使质荷比m/z误差＜0.01％和临界峰值均值M的变异系数CV＜5～10％，并精确地、定量地收集多发性骨髓瘤患者和正常人优化的血清质谱图谱数据；

5)对所得数据进行统计学处理，根据多发性骨髓瘤患者和正常人两组血清样品之间蛋白峰的差异，检测出两组血清蛋白质谱图谱之间有56个稳定的差异蛋白及其临界峰值；

6)将待检样品中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与特征蛋白逐一进行对比分析，所述特征蛋白质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z＝8139，M≤5.88；m/z＝11682，M≤0.78；m/z＝22778，M≤0.64；对于单克隆免疫球蛋白疾病κ组和λ组分型，在多发性骨髓瘤κ类型m/z＝6191，M＞5.20，λ类型m/z＝6191，M≤5.20；质荷比m/z误差＜0.01％，临界峰值均值M的变异系数CV＜5～10％。

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